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JP4106026B2 - 選択的な核酸の単離方法および組成物 - Google Patents

選択的な核酸の単離方法および組成物 Download PDF

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Description

（優先権データ）
本出願は、アメリカ合衆国仮特許出願第６０／３３４，０２９号（２００１年１１月２８日出願）の利益を主張する。仮特許出願第６０／３３４，０２９号は、任意の目的で、その全体が本明細書中に参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、核酸を単離および／または同定するための方法に関する。本発明は、核酸を単離および／または同定するためのキットも提供する。
（発明の背景）
生物学サンプルから核酸を単離することが、望まれ得る。特定の例において、このような生物学サンプルからの選択的なＤＮＡ単離は、有用である。特定の例において、生物学サンプルからの選択的なＤＮＡ単離および選択的なＲＮＡ単離は、有用である。ＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの単離のための代表的なプロトコールは、選択的な酵素的分解を、望まない核酸の除去のために使用してきた。
（発明の要旨）
特定の実施形態に従い、生物学サンプルからのＤＮＡ単離の方法が、提供される。特定の実施形態において、生物学サンプルからのＤＮＡ単離の方法は、以下を包含する：選択的にＤＮＡを結合する条件下での、生物学サンプルの固相との接触による、固相への選択的ＤＮＡ結合；固相と結合ＤＮＡの、生物学サンプルの非結合部分からの分離；および固相からの結合ＤＮＡの単離。
特定の実施形態に従い、選択的にＤＮＡを結合する条件は、以下を含む結合緩衝液の使用を含む：アルカリｐＨ；および大型のアニオン。この場合の大型のアニオンとは、少なくともブロミドイオンの大きさである。
特定の実施形態に従い、生物学サンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡの単離の方法が、提供される。この方法は、以下を包含する：選択的にＤＮＡを結合する条件下での、生物学サンプルの第一固相との接触による、第一固相への選択的なＤＮＡの結合；第一固相と結合ＤＮＡの、生物学サンプルの第一非結合部分からの分離；第一固相からのＤＮＡの単離；および生物学サンプルの第一非結合部分からのＲＮＡの単離。
特定の実施形態に従い、生物学サンプルの第一非結合部分からのＲＮＡの単離は、以下を包含する：ＲＮＡを第二固相に結合させる条件下において、生物学サンプルの第一非結合部分を、第二固相に晒す工程；第二固相と結合ＲＮＡの、生物学サンプルの第二部分からの分離；および第二固相からの結合ＲＮＡの単離。
特定の実施形態に従い、生物学サンプルからの核酸の単離の方法が、提供される。この方法は、以下を包含する：ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を結合する条件下での、生物学サンプルの第一固相との接触による、第一固相への核酸の結合；第一固相と結合核酸の、生物学サンプルの第一非結合部分からの分離；選択的にＤＮＡを結合する条件下での、第一固相と結合核酸からのＲＮＡの溶出；第一溶出物からの第一固相とＤＮＡの除去；および第一固相からの結合ＤＮＡの単離。
特定の実施形態に従い、選択的にＤＮＡを結合する条件は、以下を含む結合緩衝液の使用を含む；アルカリｐＨ；および大型のアニオン。この場合の大型のアニオンとは、少なくともブロミドイオンの大きさである。
特定の実施形態に従い、生物学サンプルからの核酸の単離の方法は、さらに以下を包含する：ＲＮＡが第二固相に結合する条件下において、第一溶出物を第二固相に晒す工程；第二溶出物からの、第二固相と結合ＲＮＡの分離；および第二固相からの結合ＲＮＡの単離。
特定の実施形態に従い、固相からの核酸の単離は、固相からの核酸の溶出を包含する。
特定の実施形態に従い、生物学サンプルにおいてＤＮＡを同定する方法が、提供される。特定の実施形態に従い、生物学サンプルにおいてＤＮＡを同定する方法は、以下を包含する：選択的にＤＮＡを結合する条件下での、生物学サンプルの固相との接触による、固相への選択的ＤＮＡ結合；固相と結合ＤＮＡの、生物学サンプルの非結合部分からの分離；および固相に結合したＤＮＡの同定。特定の実施形態に従い、固相上の核酸の同定は、固相に結合する核酸の増幅を包含する。
特定の実施形態に従い、以下を含むキットが提供される：アルカリｐＨの緩衝液；大型のアニオン；および固相。この場合の大型のアニオンとは、少なくともブロミドの大きさである。
特定の実施形態に従い、以下を含むキットが提供される：固相；核酸結合緩衝液により生み出された条件下において、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が固相に結合するような、核酸結合緩衝液；ならびに選択的ＤＮＡ結合緩衝液により生み出された条件が、ＤＮＡを選択的に固相に結合させるような、選択的ＤＮＡ結合緩衝液。
（特定の実施形態の詳細な説明）
上述の一般的記載および以下の詳細な記載の両方は、ただ代表的および説明的なものであり、そして、特許請求されるような発明を限定するものではないことを理解されたい。本出願において、単数形の使用は、特に述べない限り、複数形を含む。本出願において、「または」の使用は、特に述べない限り、「および／または」を意味する。なお、「含む」という用語の使用、ならびにその活用形（「含んだ」および「含んでいる」のような）の使用は、限定しない。
本明細書中で使用される節の見出しは、編集目的だけのためのものであり、記載した主題を限定すると解釈されるべきではない。本明細書中に引用される全文書、または文書の一部（特許、特許出願、記事、本、および専門書を含むがこれらに限定されない）は、その全体が、任意の目的のために、本明細書中で参考として完全に援用される。
（定義）
「生物学サンプル」という用語は、広義に使用されており、そして核酸を含む種々の生物学供給源を含むことを意図する。これらの供給源としては、限定されることなく、以下が挙げられる：生検材料および吸引液を含む全組織；一次および二次細胞、形質転換細胞系統、ならびに組織および細胞外植体を含むインビトロ培養細胞；全血、赤血球、白血球、およびリンパ球；尿、痰、精液、分泌物、眼洗浄液および眼吸引液、肺洗浄液、脳脊髄液、膿瘍液、および膿瘍吸引液のような体液。この「生物学サンプル」の定義に含まれるサンプルは、生物学供給源から取り出されるサンプルであり、細胞溶解産物および核酸含有抽出物を含むが、これらに限定されない。核酸を含む任意の生物は、生物学サンプルの供給源になり得る。任意の生物には、以下が含まれるが、限定されない：任意の真核生物、真正細菌、古細菌、またはウイルス。真菌類ならびに、葉、根、茎、および傘のような植物組織。これらもまた本発明の範囲内である。
「緩衝液」という用語は、本明細書内で使用されるように、酸または塩基が溶液に加えられた場合にｐＨの変化に抵抗する、水溶液または組成物を意味する。このｐＨ変化に対する抵抗は、溶液の緩衝作用による。緩衝作用を示す溶液は、緩衝液または緩衝化溶液と呼ばれる。一般的に、緩衝液は、溶液または組成物のｐＨを保持する無制限の能力を有しない。むしろ一般的に、緩衝液はｐＨを例えば、ｐＨ５とｐＨ７の間のような、特定の範囲内で保持し得る。一般例として、Ｃ．Ｍｏｈａｎ，Ｂｕｆｆｅｒｓ，Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，１９９９を参照せよ。代表的な緩衝液としては以下が挙げられるが、これらに限定されない；ＭＥＳ（［２−（Ｎ−モルフィノ）エタンスルホン酸］）、ＡＤＡ（Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸）、およびＴｒｉｓ（［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］；Ｔｒｉｚｍａとしても知られる）；Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ；ＡＣＥＳ；ＰＩＰＥＳ；およびＭＯＰＳ。
ｐＨを特定のｐＨの範囲（例えばｐＨ５とｐＨ７との間）で保持する緩衝液、および本明細書内で使用されるような同様の用語は、述べられたｐＨの範囲内のある点における緩衝作用を示す、任意の緩衝液を含むことを意図する。従ってこの用語は、述べられた範囲全体における緩衝能力を示さない緩衝液、および述べられた範囲を超える緩衝能力を有する緩衝液を含む。例えば、溶液ＡはｐＨ５．２とｐＨ６．７との間の緩衝能力を示し得、溶液ＢはｐＨ６．０とｐＨ８．０との間の緩衝能力を示し得る。本発明の目的のためには、これらの両溶液は、ｐＨ５．０からｐＨ７．０の範囲内のｐＨを保持する緩衝液とみなされる。当業者は、特定の範囲の間のｐＨを保持するために適切な緩衝液を、緩衝液表を使用して同定し得る。緩衝液表は、とりわけ、以下において見出され得る；ｔｈｅ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ２０００−２００１ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃａｔａｌｏｇの８１〜８２頁において；およびｔｈｅ Ｓｉｇｍａ ２０００−２００１ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔａｌｏｇの１８７３頁において。これらは両者とも、特に参考として援用される。
核酸を「単離する」という用語は、核酸分子の供給源からの回収を意味する。常に最適ではないが、核酸の回収のプロセスは、タンパク質のような何らかの不純物の回収も含み得る。供給源からの核酸分子の物理的富化も、含むが、限定はされない。「単離する」という用語はまた、核酸分子の複製または増幅を意味し得、これは必ずしも供給源から核酸分子を除去しない。
「塩」という用語は、本明細書で使用されるように、酸と塩基の相互作用によって産生される化合物を意味する。代表的な塩としては以下が挙げられるが、これらに限定されない；塩化ナトリウム（食塩）、ヨウ化ナトリウム、臭化ナトリウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、リン酸カリウム、重炭酸ナトリウム、など。水および他の水溶液において、塩は通常溶解して「アニオン」すなわち負電荷を帯びた小成分、および「カチオン」すなわち正電荷を帯びた小成分を生じる。例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が水に溶解する場合、溶解してナトリウムカチオン（Ｎａ＋）および塩化物アニオン（Ｃｌ−）を生じる。代表的な塩は、例えば、Ｗａｓｅｒ，Ｊｕｒｇ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｘｔ，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１６０頁（１９６６）において議論される。
「核酸」という用語は、本明細書中で使用されるように、リボヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシドのポリマーを意味し、一般には、サブユニット間にホスホジエステル結合を含む。サブユニット間の他の結合としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：メチルホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、およびペプチド結合。このような核酸としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、断片化された核酸、ミトコンドリアまたは葉緑体のような細胞下小器官を有する核酸、および生物学サンプル上または生物学サンプル内に存在し得る。微生物から得られた核酸またはＤＮＡもしくはＲＮＡウイルス。
生物サンプルから解放された核酸を結合させ得る固相成分（固相とも呼ぶ）は、適切な安定条件下で核酸を結合させ得る種々の物質を含む。代表的な固相成分としては以下が挙げられるが、これらに限定されない；シリカ粒子、二酸化ケイ素、珪藻土、ガラス、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム、ボロシリケート、ニトロセルロース、ジアゾ化紙、ヒドロキシアパタイト、ナイロン、金属酸化物、ジルコニア、アルミナ、ジエチルアミノエチル由来支持体およびトリエチルアミノエチル由来支持体（Ｃｈｒｏｍｅｇａｂｏｎｄ ＳＡＸ、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ−ＡＮ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ＳＢ、Ｐａｒｔｉｓｉｌ ＳＡＸ、ＲＳＬ Ａｎｉｏｎ、Ｖｙｄａｃ ＴＰ Ａｎｉｏｎ、Ｚｏｒｂａｘ ＳＡＸ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ＮＭｅ２、Ａｍｉｎｅｘ Ａシリーズ、Ｃｈｒｏｍｅｘ、およびＨａｍｉｌｔｏｎ ＨＡ Ｉｏｎｅｘ ＳＢ、ＤＥＡＥ セファロース、ＱＡＥ セファロース）、疎水性クロマトグラフィー樹脂（フェニルセファロースまたはオクチルセファロースのような）など。
「選択的結合」という用語は、核酸に関しては、ある型または種の核酸（例えば、ＤＮＡ）の固相への結合であって、他の型または種の核酸（例えば、ＲＮＡ）がより低い効率で結合するような条件下での結合をいう。例えば、結合条件がＤＮＡ選択的であると言い得るのは、固相へ結合したＤＮＡの量がＲＮＡ量より多い場合で、ＤＮＡおよびＲＮＡが溶液中に等モル比で存在しているような場合である。さらに、固相へのＤＮＡ結合条件が選択的であると言い得るのは、固相へのＤＮＡ結合の効率が、ＤＮＡを含む溶液中のＲＮＡ量によって影響を受けない場合である。
（例示的な実施形態）
Ａ．特定の実施形態に従い、生物学サンプルからのＤＮＡ単離の方法が、提供され、この方法は、以下の工程を包含する：選択的にＤＮＡに結合する条件下で、生物学サンプルを固相と接触させることによって、この固相にＤＮＡを選択的に結合する工程；結合ＤＮＡを含む固相を、生物学サンプルの未結合部分から分離する工程；および固相からＤＮＡを単離する工程。
特定の実施形態に従って、生物学サンプルにおけるＤＮＡの同定方法が、提供される。特定の実施形態において、生物学サンプルにおけるＤＮＡの同定方法は、以下の工程を包含する：選択的にＤＮＡに結合する条件下で、生物学サンプルを固相と接触させることによって、この固相にＤＮＡを選択的に結合する工程；結合ＤＮＡを含む固相を、生物学サンプルの未結合部分から分離する工程；および固相に結合したＤＮＡを同定する工程。特定の実施形態に従い、固相に結合したＤＮＡを同定する工程は、固相に結合したＤＮＡを増幅する工程を包含する。
特定の実施形態に従って、固相は、ケイ酸含有物質である。特定の実施形態において、ケイ酸含有物質は、以下を含む群から選択される：シリカ、二酸化ケイ素、珪藻土、ガラス、セライト、およびシリカゲル。特定の実施形態において、固相は、以下を含む群から選択される形状である：粒子、ビーズ、膜、フリット（ｆｒｉｔ）、および容器の側面。代表的には、限定はされないが、固相の例は以下において議論される：米国特許出願第４，６４８，９７５号；同第４，９２３，９７８号；同第５，０７５，４３０号；同第５，１７５，２７１号；同第５，２３４，８０９号；同第５，４３８，１２９号；同第５，６５８，５４８号；同第５，８０４，６８４号；および同第５，８０８，０４１号；欧州特許出願ＥＰ０３９１６０８号および同ＥＰ０７５７１０６号、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ８７／０６６２１号；同ＷＯ９１／００９２４号；同ＷＯ９２／１８５１４号；同ＷＯ９７／３００６２号；同ＷＯ９９／５１７３４号および同ＷＯ９９／４００９８号。
特定の実施形態に従って、選択的にＤＮＡを結合する条件は、以下を含む結合緩衝液の使用を包含する：アルカリ性ｐＨ；および大型のアニオン。この場合の大型のアニオンとは、少なくともブロミドイオンの大きさである。特定の実施形態において、大型のアニオンは、以下を含む少なくとも１つの群から選択される：ピクレート、タンネート、タングステート、モリブデート、パークロレート、およびスルホサリチレート。特定の実施形態において、大型のアニオンは、以下を含む少なくとも１つの群から選択される：トリクロロアセテート、トリブロモアセテート、チオシアネート、およびニトレート。特定の実施形態において、大型のアニオンは、以下を含む少なくとも１つの群から選択される：ヨージドまたはブロミド。特定の実施形態において、アルカリ性ｐＨは、ｐＨ８．０以上である。特定の実施形態において、アルカリ性ｐＨは、ｐＨ９．０以上である。特定の実施形態において、アルカリ性ｐＨは、ｐＨ１０．０以上である。特定の実施形態において、アルカリ性ｐＨは、ｐＨ８．０とｐＨ１２．０との間の、任意の範囲または点である。
特定の実施形態において、固相からＤＮＡを単離する工程は、ＤＮＡを溶出する工程を包含する。
Ｂ．特定の実施形態に従って、生物学サンプルからＤＮＡおよびＲＮＡを単離する方法が、提供され、この方法は、以下の工程を包含する：選択的にＤＮＡに結合する条件下で、生物学サンプルを第一の固相と接触させることによって、第一の固相にＤＮＡを選択的に結合する工程；結合ＤＮＡを含む第一の固相を、生物学サンプルの第一の未結合部分から分離する工程；第一の固相からＤＮＡを単離する工程；および生物学サンプルの第一の未結合部分からＲＮＡを単離する工程。特定の実施形態において、第一の固相からＤＮＡを単離する工程は、ＤＮＡを溶出する工程を包含する。
特定の実施形態に従って、生物学サンプルにおいてＤＮＡおよびＲＮＡを同定する方法が、提供され、この方法は、以下の工程を包含する：選択的にＤＮＡを結合する条件下で、生物学サンプルを第一の固相と接触させることによって、この第一の固相にＤＮＡを選択的に結合する工程；結合ＤＮＡを含む第一の固相を、生物学サンプルの第一の未結合部分から分離する工程；第一の固相に結合したＤＮＡを同定する工程；および生物学サンプルの第一の未結合部分からＲＮＡを同定する工程。特定の実施形態において、第一の固相からＤＮＡを単離する工程は、ＤＮＡを溶出する工程を包含する。特定の実施形態に従い、第一の固相に結合したＤＮＡを同定する工程は、第一の固相に結合したＤＮＡを増幅する工程を包含する。
当業者は、特定の実施形態に従い、固相に結合した核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方）を同定する多くの方法が存在することを理解する。このような方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：標識プローブへのハイブリダイゼーション、逆転写、質量分析法、および結合ＤＮＡと標識の反応による検出（例えば、ＤＮＡ結合発蛍光団の添加後の蛍光検出）。
特定の実施形態に従って、生物学サンプルの第一の未結合部分からのＲＮＡの単離は、以下の工程を包含する：ＲＮＡを第二の固相に結合させる条件下で、生物学サンプルの第一の未結合部分を第二の固相に晒す工程；結合ＲＮＡを含む第二の固相を、生物学サンプルの第二の部分から分離する工程；およびＲＮＡを溶出することによって、第二の固相からＲＮＡを単離する工程。
特定の実施形態に従って、ＲＮＡが第二の固相と結合する条件は、中性および酸性のｐＨを含む。特定の実施形態において、ＲＮＡが第二の固相と結合する条件は、ｐＨを８．０以下に下げることを含む。特定の実施形態において、ＲＮＡが第二の固相と結合する条件は、ブロミドより小さいアニオンとの塩の使用を含む。
特定の実施形態に従って、第二の固相は、上のＡでの第一の固相について上記したように議論した任意の物質から選択される。第二の固相は、第一の固相と同じ物質または異なった物質であり得る。
特定の実施形態に従って、選択的にＤＮＡを結合する条件は、以下を含む結合緩衝液の使用を包含する：アルカリ性ｐＨ；および大型のアニオン。この場合の大型のアニオンとは、少なくともブロミドイオンの大きさである。これらの方法についての選択的ＤＮＡ結合の条件は、Ａ節における選択的ＤＮＡ結合について上記された条件を含み得る。
非限定的な例として、緩衝液または塩を、細胞溶解物に加え、この細胞溶解物を、強アルカリ性にし得る。次いで、シリカビーズのような固相を、アルカリ性の溶解物に晒す。ＤＮＡが、選択的にビーズに結合し、次いで、除去される。他の緩衝液または塩を、アルカリ性の溶解物に加え、この溶解物を中性のｐＨにする。第二の固相を、中性の溶解物に加え、そして溶解物中のＲＮＡが、第二の固相に結合する。第一の固相に結合したＤＮＡを、次いで、中性またはアルカリ性の低塩緩衝液で溶出する。第二の固相を中性の溶解物から除去し、そしてＲＮＡを、第二の固相から中性またはアルカリ性の低塩緩衝液で溶出する。
Ｃ．特定の実施形態に従って、生物学サンプルから核酸を単離する方法が、提供され、この方法は、以下の工程を包含する：ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を結合する条件下で、生物学サンプルを第一の固相と接触させることによって、第一の固相に核酸を選択的に結合する工程；結合核酸を含む第一の固相を、生物学サンプルの第一の未結合部分から分離する工程；選択的にＤＮＡを結合する条件下で、未結合核酸を含む第一の固相からＲＮＡを溶出する工程；第一の溶出物から結合ＤＮＡを含む第一の固相を除去する工程；および第一の固相からＤＮＡを単離する工程。
特定の実施形態に従って、第一の固相からＤＮＡを単離する工程は、第一の固相からＤＮＡを溶出する工程を包含する。
特定の実施形態に従って、生物学サンプルにおける核酸の同定方法が、提供され、この方法は、以下の工程を包含する：ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を結合する条件下で、生物学サンプルを第一の固相と接触させることによって、第一の固相に核酸を結合；結合核酸を含む第一の固相を、生物学サンプルの第一の未結合部分から分離する工程；選択的にＤＮＡを結合する条件下で、結合核酸を含む第一の固相からＲＮＡを溶出する工程；生物学サンプルの第一の溶出物から結合ＤＮＡを含む第一の固相を除去する工程；および第一の固相に結合するＤＮＡを同定する工程。特定の実施形態に従い、第一の固相に結合するＤＮＡを同定する工程は、この第一の固相に結合するＤＮＡを増幅する工程を包含する。
当業者は、特定の実施形態に従い、固相に結合した核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方）を同定する多くの方法が存在することを理解する。このような方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：標識プローブへのハイブリダイゼーション、逆転写、質量分析法、および結合ＤＮＡと標識の反応による検出（例えば、ＤＮＡ結合発蛍光団の添加後の蛍光検出）。
特定の実施形態に従って、第一の固相は、上のＡでの第一の固相について上記したように議論した任意の物質から選択される。
特定の実施形態に従って、選択的にＤＮＡを結合する条件は、以下を含む結合緩衝液の使用を包含する：アルカリ性ｐＨの緩衝液；および大型のアニオン。この場合の大型のアニオンとは、少なくともブロミドイオンの大きさである。これらの方法についての選択的ＤＮＡ結合の条件は、Ａ節における選択的ＤＮＡ結合について上記された条件を含み得る。
特定の実施形態に従って、生物学サンプルからＲＮＡを単離する方法は、以下の工程をさらに包含する：ＲＮＡを第二の固相に結合させる条件下において、第一の溶出物を第二の固相に晒す工程；結合ＲＮＡを含む第二の固相を、生物学サンプルの第二の溶出物から分離する工程；および第二の固相からＲＮＡを単離する工程。
特定の実施形態に従って、第二の固相からＲＮＡを単離する工程は、ＲＮＡを溶出する工程を包含する。特定の実施形態に従い、第二の固相からＲＮＡを単離する工程は、第二の固相に結合するＲＮＡを増幅する工程を包含する。
特定の実施形態に従い、第二の固相は、上のＡでの第一の固相について上記したように議論した任意の物質から選択される。第二の固相は、第一の固相と同じ物質または異なった物質であり得る。
特定の実施形態に従い、選択的にＤＮＡを結合する条件は、以下を含む結合緩衝液の使用を包含する：アルカリ性ｐＨ；および大型のアニオン。この場合の大型のアニオンとは、少なくともブロミドイオンの大きさである。これらの方法についての選択的ＤＮＡ結合の条件は、Ａ節における選択的ＤＮＡ結合について上記された条件を含み得る。特定の実施形態において、ＲＮＡを第二の固相に結合する条件は、中性または酸性のｐＨを含む。
特定の実施形態において、ＲＮＡが第二の固相と結合する条件は、ｐＨを８．０以下に下げることを含む。特定の実施形態において、ＲＮＡが第二の固相と結合する条件は、ブロミドより小さいアニオンとの塩の使用を含む。
非限定的な例として、シリカビーズのような固相を、アルカリ性の溶解物に晒す。次いで、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方）が、固相に結合し、次いで、除去される。次いで、固相をｐＨの高い緩衝液中に入れ、固相からＲＮＡを溶出させるが、固相に結合しているＤＮＡは維持する。次いで、固相を取り除き、そして低塩緩衝液中に入れ、ＤＮＡを溶出する。
Ｄ．特定の実施形態に従って、キットが提供される。このキットは、以下を含む：アルカリ性ｐＨの緩衝液；大型のアニオン（この場合の大型のアニオンとは少なくともブロミドイオンの大きさである）；および固相。特定の実施形態において、大型のアニオンは、Ａ節において議論された任意の大型のアニオンより選択される。特定の実施形態において、このアルカリ性ｐＨは、ｐＨ８．０以上である。特定の実施形態において、このアルカリ性ｐＨは、９．０以上である。特定の実施形態において、このアルカリ性ｐＨは、１０．０以上である。特定の実施形態に従い、この固相は、上のＡでの第一の固相について上記したように議論した任意の物質から選択される。
Ｅ．特定の実施形態において、キットが、提供される。このキットは、以下を含む：固相；核酸結合緩衝液（核酸結合緩衝液の作り出した状況下で、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方がその固相と結合する）；および選択的ＤＮＡ結合緩衝液（この選択的ＤＮＡ結合緩衝液によりつくり出された条件によって、ＤＮＡをその固相へ選択的に結合させることが可能となる）。選択的ＤＮＡ結合条件は、上でＡ節において議論されたものである。特定の実施形態において、キットは、さらにＲＮＡ結合緩衝液を含む。ここで、このＲＮＡ結合緩衝液によってつくり出された条件によって、ＲＮＡが固相に結合することが可能になる。ＲＮＡの結合を可能にする条件は、上でＢ節において議論されたものである。特定の実施形態において、この選択的結合緩衝液は、ｐＨ８．０以上のｐＨを有する。特定の実施形態において、この選択的結合緩衝液は、９．０以上のｐＨを有する。特定の実施形態において、この選択的結合緩衝液は、１０．０以上のｐＨを有する。特定の実施形態に従い、この固相は、上のＡで固相について議論した任意の物質から選択される。特定の実施形態において、核酸結合緩衝液は、ｐＨ８．０以下である。
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明し、そして、本発明の範囲をいかなる手段においても限定しない。
以下の用語、略称、および供給源は、実施例１から４を通じて議論される物質に適用する。
これらの基質を、以下の供給源から取得し得た：シリカ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ，製品番号８２９５１，Ｌｏｔ ０００３０３０２）、珪藻土（Ｓｉｇｍａ，製品番号Ｄ−３８７７，Ｌｏｔ １２８Ｈ３７０２）、Ｅｍｐｏｒｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ａｉｄ ４００（３Ｍ，製品番号５６２２１−７４６，Ｌｏｔ ９９００２０）、シリカゲル（ＪＴ Ｂａｋｅｒ，製品番号３４０５−０１，Ｌｏｔ ３６３３８）二酸化ケイ素（Ｓｉｇｍａ，製品番号Ｓ−５６３１，Ｌｏｔ ５８Ｈ０１５４）、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ（ＢＩＯ−１０１，製品番号６５４０−４０８，ロット番号６５４０−４０８−０Ｂ１３）、Ｇｌａｓｓｍｉｌｋ Ｓｐｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＃４（ＢＩＯ １０１，製品番号２０７２−２０４，ロット番号２０７２−２０４−８Ａ１７）、Ｄａｖｉｓｉｌ Ｇｒａｄｅ ６４３ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，製品番号Ｓｉｌ ６６，Ｌｏｔ ＮＥ ０３８７）、およびＵｎｉｆｏｒｍ Ｓｉｌｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．カタログコードＳＳ０５Ｎ，Ｉｎｖ＃Ｌ０００２１８８）。
以下の試薬およびそれらの供給源の略称または名称は、以下である：グアニジン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ，Ｌｏｔ ３８Ｈ５４３２）、グアニジンチオシアネート（Ｓｉｇｍａ，製品番号Ｇ−９２７７）、ヨウ化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，製品番号３８，３１１−２，Ｌｏｔ Ｎｕｍｂｅｒ０７００４ＴＳ）、過塩素酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，製品番号４１，０２４−１，Ｌｏｔ ＫＵ ０６９１０ＨＵ）、臭化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ，製品番号３１０５０−６，Ｌｏｔ １１８０５ＫＲ）、塩化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，製品番号３３，２５１−４，ロット番号１６５２４ＣＳ）、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ，トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン、Ｓｉｇｍａ，製品番号Ｔ−６７９１，ロット番号１２６１−１５７３８）−ｐＨ８、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸、Ｓｉｇｍａ，製品番号Ｍ−５２８７，ロット番号５８Ｈ５４１１）−ｐＨ６．０、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、Ｓｉｇｍａ，製品番号２２１）−ｐＨ１０、ＨＥＰＥＳ（ｎ−［２ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］，Ｓｉｇｍａ，製品番号Ｈ−４０３４，ロット番号１９Ｈ５４１０１）エタノール（エチルアルコール、無水、Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号Ｅ７０２−３）、ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ，製品番号Ｈ−７０２０，ロット番号９７Ｈ３５６２）、水酸化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，製品番号Ｓ−８０４５，ロット番号１２７Ｈ０５３１および６９Ｈ１２６４）、重フッ化アンモニウム（フッ化水素アンモニウム、Ａｌｄｒｉｃｈ 製品番号２２，４８２−０）、硝酸（Ａｌｄｒｉｃｈ，製品番号２２５７１−１，ロット番号００２６１ Ａ１）、および水酸化アンモニウム（Ａｌｄｒｉｃｈ 製品番号２２，１２２−８，ロット番号０２３０８ＫＲ）。
核酸および組織サンプルならびにそれらの供給源は、以下である：仔ウシ胸腺ゲノムＤＮＡ（デオキシリボ核酸、タイプ１、仔ウシ胸腺由来で高い重合度、Ｓｉｇｍａ，製品番号Ｄ−１５０１，Ｌｏｔ ８７Ｈ７８４０）；ラット肝臓全ＲＮＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ロット番号Ａ３０４０５７，Ａ３０５０６２，またはＡ３０６０７３）；および全血（Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｃｉｆｉｃ）。
分光光度法は、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ８４５３ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して行った。
実施例１２から１４における核酸サンプルのゲル電気泳動は、以下を使用して行った：ＳｅａＫｅｍ（登録商標）アガロース（Ｔｅｋｎｏｖａ）、１×ＴＢＥ（８９ｍＭ Ｔｒｉｓ、８９ｍＭ ホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｔｅｋｎｏｖａ，カタログ番号０２７８−１Ｌ，ロット番号１７Ｆ８０１）；および０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド緩衝液（ＢＩＯ−ＲＡＤ）。電気泳動において使用した分子量マーカーは、ＡｍｐｌｉＳｉｚｅ ＤＮＡ分子量標準物質（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、およびＲＮＡ ｌａｄｄｅｒ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）であった。
（実施例１）
種々の業者からのシリカマトリックスおよびガラスマトリックスは、ｐＨ８での種々の塩を用いてゲノムＤＮＡに結合する能力によって評価した。
シリカ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）、珪藻土、Ｅｍｐｏｒｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ａｉｄ ４００、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ、二酸化ケイ素、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ、およびＧｌａｓｓｍｉｌｋ Ｓｐｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＃４を、以下の実施例のために使用した。使用前に、全ての粒子を（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ製のシリカを除き）、以下のように調製した：粒子を、４〜８容量の１Ｎ ＨＣｌで１回、４〜８容量の水で２回、４〜８容量の１Ｎ ＮａＯＨで１回、４〜８容量の水で２回、４〜８容量のエタノールで１回、および４〜８容量の水で４回洗浄した。本明細書中で使用されるように、「一容量」の水またはエタノールは、洗浄される粒子の質量と、質量が等しい水またはエタノールの量をいう。ＢＩＯ−１０１製Ｂｉｎｄｉｎｇ ＭａｔｒｉｘおよびＧｌａｓｓｍｉｌｋを、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、およびエタノールで（上述のように）処理する前に、少なくとも４容量の水で４回洗浄した。シリカ粒子を、供給された状態で使用した。珪藻土、Ｅｍｐｏｒｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ａｉｄ ４００、シリカゲル、および二酸化ケイ素を、２００ｍｇ／ｍｌ（２０％）水中スラリーとして保存した。Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ粒子を、５８０ｍｇ／ｍｌ（５８％）水中スラリーとして保存し、そしてＧｌａｓｓｍｉｌｋ粒子は、３７３ｍｇ／ｍｌ（３７％）水中スラリーとして保存した。
仔ウシ胸腺ＤＮＡを、ゲノムＤＮＡの供給源として使用した。以下の実施例において使用した剪断ゲノムＤＮＡを、以下のように調製した。ＤＮＡを、およそ１０ｍｇ／ｍｌで水に再懸濁した。次いで、ＤＮＡを、２０Ｇ １ １／２の注射針に４回、２１Ｇ １ １／２ゲージの注射針に３回、２２Ｇ １ １／２ゲージの注射針に３回、そして２６Ｇ １ １／２ゲージの注射針に１回通すことによって剪断した。
図１に示す各固相と緩衝液との組み合わせを、１回評価した。剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡ（ＤＮＡ２５μｇ、濃度０．５ｍｇ／ｍｌの５０μｌ）を、以下の緩衝液のうち１つを０．４５ｍｌ含む１．５ｍｌ微量遠心チューブに加えた：（１）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍグアニジンチオシアネート；（２）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８）；４．７５Ｍグアニジン塩酸塩；（３）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８）；４．７５Ｍ塩化ナトリウム；（４）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍ臭化ナトリウム；（５）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍヨウ化ナトリウム；または（６）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍ過塩素酸ナトリウム。核酸を、周囲の温度で１０分まで、緩衝化溶液内において、時々攪拌しながらインキュベートした。これらとの混合物を、周囲の温度で１０分間、時々攪拌しながらインキュベートした。結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（１５，８００×ｇ、１分）して、そして結合インキュベーションに用いた結合緩衝液０．５ｍｌで２回洗浄した。続いて、粒子を、０．５ｍｌの７０％エタノールで、３回から４回洗浄した。
最後のエタノール洗浄に続けて、粒子を、周囲の温度または５６℃で５〜１０分間風乾させた。結合した核酸は、５６℃で５分間、常に攪拌しつつ０．２５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）での第一溶出を行い、溶出した核酸を回収した。続けて、粒子に結合された任意の残余核酸を、５６℃で５分間、常に攪拌しつつ０．２５ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨでの溶出を行い、溶出した核酸を回収した。核酸量を、分光光度法で定量した。結果を図１に示す。
ｐＨ８において、ＤＮＡ結合に対する塩の組成の効果が、固相の供給源の機能であるように見える。特定のマトリックスに対し、塩の選択に依存して、ＤＮＡの回収量は４３倍にまで変化した。本研究において、大抵のマトリックスに対して好ましいアニオンは、かさ高いアニオンであるチオシアネート、ブロミド、ヨード、パークロレートであった。一般的に、よりかさ高さが小さいクロリドアニオンを含む塩によるＤＮＡの回収量は、少なかった。ＧｕＨＣｌおよびＧｕＳＣＮの、ＤＮＡ結合に対する効果の比較により、より大きいチオシアネートアニオンの存在下でのより多くのＤＮＡの結合が、証明された。
（実施例２）
本実施例において使用した固相を、実施例１で記載したように調製した。仔ウシ胸腺由来の剪断ゲノムＤＮＡを、実施例１で記載したように調製した。
各固相と緩衝液との組み合わせを、１回アッセイした。剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡ（ＤＮＡ２５μｇ、濃度０．５ｍｇ／ｍｌの５０μｌ）を、以下の緩衝液のいずれかを０．４５ｍｌ含む１．５ｍｌ微量遠心チューブに加えた：（１）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍグアニジンチオシアネート；または（２）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および４．７５Ｍグアニジン塩酸塩。核酸を、周囲の温度で１０分まで、時々攪拌しながら緩衝化溶液内において、インキュベートした。７種の固相（１０〜１８７ｍｇ）それぞれを、２種の緩衝化核酸溶液それぞれに別々に加え、その結果、それぞれ個々の固相と個々の緩衝液との組み合わせを含む、１４の容器を得た。これらの混合物を、周囲の温度で１０分間、時々攪拌しながらインキュベートした。結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（１５，８００×ｇ、１分）して、そして結合インキュベーションに用いた結合緩衝液０．５ｍｌで２回洗浄した。続いて、粒子を、０．５ｍｌの７０％エタノールで、３回から４回洗浄した。
最後のエタノール洗浄に続けて、粒子を、周囲の温度または５６℃で５〜１０分間風乾させた。結合した核酸は、常に攪拌しつつ、５６℃で５分間０．２５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）での第一溶出を行い、溶出した核酸を回収した。続けて、粒子に結合された任意の残余核酸を、常に攪拌しつつ、５６℃で５分間０．２５ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨでの溶出を行い、溶出した核酸を回収した。核酸量を、分光光度法で定量した。結果を図２に示す。一般的に、チオシアネート存在下での回収量は、クロリドイオン存在下での回収量を上回るように見えた。
（実施例３）
種々の業者からのシリカ固相およびガラス固相へのＲＮＡの結合特性を、種々の塩を用いてｐＨ８においてアッセイした。
シリカ、珪藻土、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ、およびＧｌａｓｓｍｉｌｋ Ｓｐｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＃４を、以下の実施例のために使用した。固相粒子を、実施例１で記載したように調製した。
１． 各固相と緩衝液との組み合わせを、１回アッセイした。ラット肝臓全ＲＮＡ（ＲＮＡ１５μｇ、水中において濃度２．５ｍｇ／ｍｌの６μｌ）を、以下の緩衝液の１つを０．４５ｍｌ含む１．５ｍｌ微量遠心チューブに加えた：（１）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍグアニジンチオシアネート；（２）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８）；４．７５Ｍグアニジン塩酸塩（３）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８）；４．７５Ｍ塩化ナトリウム；（４）または５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）；４．７５Ｍヨウ化ナトリウム。核酸を、時々攪拌しながら、緩衝化溶液内において、周囲の温度で５分までインキュベートした。これらの混合物を、時々攪拌しながら、周囲の温度で１０分間インキュベートした。
結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（１５，８００×ｇ、１分）して、そして結合インキュベーションに用いた結合緩衝液０．５ｍｌで２回洗浄した。続いて、粒子を、０．５ｍｌの７０％エタノールで、２回または４回洗浄した。エタノールで２回洗浄した粒子を、次に０．５ｍｌのアセトンで１度洗浄し、５６℃５分で乾かした。結合した核酸は、５６℃で５分間、常に攪拌しつつ０．２５ｍｌまたは０．２７５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）での第一溶出を行い、溶出した核酸を回収した。任意の残余核酸を、５６℃で５分間、常に攪拌しつつ０．２５ｍｌまたは０．２７５ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで溶出し、溶出した核酸を回収した。核酸量は、分光光度法で定量した。結果を図３に示す。
ＤＮＡで見出された結果と対照的に、ｐＨ８で固相に結合した場合のＲＮＡの回収量は、塩の組成に強く依存しないことが示されないように見える。塩の選択は、特定のマトリックスに対するＲＮＡの回収量に、３倍未満の変化しかもたらさなかった。
ｐＨ８における結合の場合、多くのマトリックスは、ＲＮＡと比較して適度に高いＤＮＡの結合を示した。ＤＮＡ結合への選択性は、ヨウ化ナトリウムにより増加した（図４参照）。
（実施例４）
ＤＮＡ結合と固相の間の関係を調査するため、ＤＮＡを、種々の塩組成とｐＨレベルの緩衝液を使用して、幾つかの固相に結合させた。
本研究において使用された以下の固相を、実施例１で記載したように調製した：シリカ、珪藻土、およびＧｌａｓｓｍｉｌｋ Ｓｐｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＃４。これらの研究で、剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡを実施例１で記載したように調製し、ゲノムＤＮＡの供給源として使用した。
各固相と緩衝液との組み合わせを、１回アッセイした。剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡ（２５μｇ、濃度０．５ｍｇ／ｍｌの５０μｌ）を、以下の緩衝液のうち１つの０．４５ｍｌを含む異なった１．５ｍｌ微量遠心チューブに加えた：（１）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）、４．７５Ｍグアニジンチオシアネート；（２）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、４．７５Ｍグアニジン塩酸塩；（３）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、４．７５Ｍ臭化ナトリウム；（４）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、４．７５Ｍヨウ化ナトリウム；（５）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍグアニジンチオシアネート；（６）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍ塩化ナトリウム；（７）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍ臭化ナトリウム；（８）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍヨウ化ナトリウム；（９）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍグアニジンチオシアネート；（１０）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍ塩化ナトリウム；（１１）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍ臭化ナトリウム；または（１２）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍヨウ化ナトリウム。
核酸を、周囲の温度で５〜１０分間、緩衝化溶液内において、時々攪拌しながらインキュベートした。３種の固相（１０ｍｇ）それぞれを、緩衝核酸溶液それぞれに別々に加えた。これらの混合物を、周囲の温度で１０分間、時々攪拌しながらインキュベートした。結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（４０００×ｇ、１分）して、そして結合インキュベーションに用いた結合緩衝液０．５ｍｌで２回洗浄した。次いで、粒子を、０．５ｍｌの７０％エタノールで、３回洗浄した。
最後のエタノール洗浄に続けて、粒子を、周囲の温度で５〜１０分間風乾させた。結合した核酸は、常に攪拌しつつ、５６℃で５分間０．２５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）で第一溶出し、溶出した核酸を回収した。粒子に結合された任意の残余核酸を、０．２５ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで常に攪拌しつつ、５６℃で５分間溶出し、溶出した核酸を回収した。核酸量は、分光光度法で定量した。それぞれの実験セットの結果は、図５（ａ）〜（ｋ）に示す。
以前の調査により、シリカに対するＤＮＡの結合は、緩衝液のｐＨが７より高くなる場合に減少することが示された（Ｍｅｌｚａｋ，Ｋａｔｈｒｙｎ Ａ．ら（１９９６），Ｄｒｉｖｉｎｇ Ｆｏｒｃｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｉｌｉｃａ ｉｎ Ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １８１：６３５−６４４）。この実験の結果は、塩組成がＤＮＡ結合に対するｐＨの効果に対して影響を及ぼすことを示した。この結果は、固相の供給源が、塩の効果の大きさおよび結合していた核酸の絶対量を変えたことも証明した。ＤＮＡ結合のｐＨ感受性に対する塩の効果は、以下のｐＨ感受性の順序で示される：
ＮａＣｌ＞ＧｕＳＣＮ＞ＮａＢｒ＞ＮａＩ
（実施例５）
ＲＮＡの結合に対するｐＨおよび特定の塩の効果もまた、評価した。Ｂｉｎｄｉｎｇ ＭａｔｒｉｘおよびＧｌａｓｓｍｉｌｋ粒子の固相を、実施例１で記載したように調製した。ラット肝臓全ＲＮＡは、ＲＮＡの供給源であった。
各固相と緩衝液との組み合わせを、１回アッセイした。ラット肝臓全ＲＮＡ（ＲＮＡ１５μｇ、濃度２．５ｍｇ／ｍｌを６μｌ）を、以下の緩衝液のうち１つを０．４５ｍｌ含む１．５ｍｌ微量遠心チューブに加えた：（１）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍグアニジンチオシアネート；（２）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍ塩化ナトリウム；（３）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍヨウ化ナトリウム；（４）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）、４．７５Ｍグアニジンチオシアネート；（５）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）、４．７５Ｍヨウ化ナトリウム；（６）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）、４．７５Ｍ塩化ナトリウム；（７）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍグアニジンチオシアネート；（８）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍヨウ化ナトリウム；または（９）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍ塩化ナトリウム。核酸を、時々攪拌しながら、緩衝化溶液内において、周囲の温度で５分までインキュベートした。２種の固相（１０〜１８７ｍｇ）それぞれを、緩衝化核酸溶液に別々に加えた。これらの混合物を、時々攪拌しながら、周囲の温度で１０分間インキュベートした。結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（１５，８０００×ｇ、１分）して、そして結合インキュベーションに用いた結合緩衝液０．５ｍｌで２回洗浄した。続いて、粒子を、０．５ｍｌの７０％エタノールで、２回または４回洗浄した。エタノールで２回洗浄した粒子を、次に０．５ｍｌのアセトンで１回洗浄し、そして５６℃５分で乾かした。結合した核酸は、０．２５ｍｌまたは０．２７５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）で、常に攪拌しつつ５６℃で５分間第一溶出を行い、溶出した核酸を回収した。粒子に結合された任意の残余核酸を、続いて０．２５ｍｌまたは０．２７５ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで、常に攪拌しつつ５分間、溶出し、溶出した核酸を回収した。核酸量は、分光光度法で定量した。
結果を、図６に示す。評価された２種の固相へのＲＮＡの結合は、ｐＨへの大きな依存性を示した。緩衝液のｐＨが上昇した場合に、全ての塩とのＲＮＡの結合に有意の減少があった。
（実施例６）
Ｇｌａｓｓ Ｍｉｌｋの選択性を、結合の間のｐＨおよびイオン組成の関与として、さらに評価した。Ｇｌａｓｓｍｉｌｋ Ｓｐｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＃４を、実施例１に記載したように調製した。剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡを、実施例１に記載したように調製した。ラット肝臓全ＲＮＡが、ＲＮＡの供給源であった。
各核酸と緩衝液との組み合わせを、１回アッセイした。２５μｇの剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡ（５０μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ水溶液）または１５μｇのラット肝臓全ＲＮＡ（６μｌの２．５ｍｇ／ｍｌ水溶液）のいずれかを、以下の緩衝液のうち１つを０．４５ｍｌ含む別々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに別々に加えた：（１）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、４．７５Ｍ塩化ナトリウム；（２）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、４．７５Ｍヨウ化ナトリウム；（３）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍ塩化ナトリウム；（４）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍヨウ化ナトリウム；（５）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍヨウ化ナトリウム；または（６）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍ塩化ナトリウム。従って、ＤＮＡまたはＲＮＡと個々の緩衝液との組み合わせそれぞれを含む別個の１２の容器が存在した。固相（１８６ｍｇ）を、緩衝化核酸溶液に加え、これらの混合物を、時々攪拌しながら、周囲の温度で１０分間インキュベートした。結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（１５，８０００×ｇ、１分）して、そして結合インキュベーションに用いた結合緩衝液０．５ｍｌで２回洗浄した。続いて、粒子を、０．５ｍｌの７０％エタノールで、４回洗浄した。結合した核酸を、常に攪拌しつつ、０．２５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）で５６℃で５分間、第一溶出を行い、溶出した核酸を回収した。粒子に結合された任意の残余核酸を、常に攪拌しつつ、０．２５ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで５分間、溶出し、溶出した核酸を回収した。核酸量を、分光光度法で定量した。
結果を、図７に示す。結合用塩としてのヨウ化ナトリウムにより、ｐＨが上昇した時に、ＤＮＡ結合の選択性は、増加した。対照的に、塩化ナトリウム存在下での結合は、アルカリｐＨにおける特異性の増加を示さなかった。
（実施例７）
ヨウ化ナトリウム存在下でのＤＮＡおよびＲＮＡの結合に対するｐＨの効果を、幾つかの固相で評価した。二酸化ケイ素（Ｓｉｇｍａ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ Ｓ−５６３１，Ｌｏｔ ５８Ｈ０１５４）、Ｄａｖｉｓｉｌ Ｇｒａｄｅ ６４３ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ Ｓｉｌ ６６， Ｌｏｔ ＮＥ ０３８７）およびＵｎｉｆｏｒｍ Ｓｉｌｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｔａｌｏｇ Ｃｏｄｅ ＳＳ０５Ｎ，Ｉｎｖ＃Ｌ０００２１８８）を、以下の研究に使用した。使用前に、二酸化ケイ素粒子およびＤａｖｉｓｉｌ Ｇｒａｄｅ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ粒子を、以下のように調製した。粒子を水で１回、５００ｍＭアンモニウムバイオフルオリドで１回、１００ｍＭ硝酸で１回、１００ｍＭ水酸化アンモニウムで２回、３００ｍＭ水酸化アンモニウムで２回、エタノールで１回、そして水で９回洗浄した。３種の固相の全粒子は、２００ｍｇ／ｍｌ（２０％）水中スラリーとして調製し、保存した。
全ラット肝臓ＲＮＡが、ＲＮＡの供給源であった。ゲノムＤＮＡについて、剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡを、実施例１に記載したように調製した。
各固相と核酸と緩衝液との組み合わせを、３連で行った。剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡ（３０μｇ、５９０μｇ／ｍＬストックを５０μＬ添加）または全ラット肝臓ＲＮＡ（３０μｇ、６００μｇ／ｍＬストック溶液を５０μＬ添加）のいずれかを、０．４５ｍｌの以下の緩衝液のうち１つと共に５０μＬのシリカ粒子（１０ｍｇ）を含む、別々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに別々に加えた：（１）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、４．８Ｍ ＮａＩ；（２）５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、４．８Ｍ ＮａＩ；（３）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、４．８Ｍ ＮａＩ；（４）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）、４．８Ｍ ＮａＩ；または（５）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．８Ｍ ＮａＩ。３種の固相それぞれに対し、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの結合を、３連の５種の緩衝液のそれぞれで評価し、その結果、一固相につき合計３０の容器を得た。核酸を、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ−２ ｍｉｘｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を設定７で使用して常に攪拌しながら、緩衝化溶液内において、周囲の温度で５〜３０分、インキュベートした。
結合に続き、粒子を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、そして上清を取り除いた。粒子を、次に、１ｍＬの７０％エタノールで、４回洗浄した。続けて、２５０μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）を加え、粒子を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｉｅｒ Ｒ上で、常に振とう（１４００ｒｐｍ）しながら、５６℃で５〜６分間、インキュベートした。粒子を、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、そして溶出した核酸を含む上清を回収した。残余の結合核酸の存在を検出するため、２５０μＬの１００ｍＭ ＮａＯＨを加え、粒子を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｉｅｒ Ｒ上で常に振とう（１４００ｒｐｍ）しながら、５６℃で５〜７０分間インキュベートし、溶出した核酸を回収した。それぞれの分画の核酸量を、分光光度法で定量した。
結果を図８（ａ）〜（ｃ）に示す。試験したほぼ全てのケイ酸含有固相は、ヨウ化ナトリウムが結合用塩である場合に、アルカリｐＨでＤＮＡ結合選択性の増加を示した。ヨウ化ナトリウム存在下でのＳｉｇｍａ ＳｉｌｉｃａへのＤＮＡ結合は、比較的ｐＨ感受性が低かった。対照的に、同固相へのＲＮＡ結合においては、ｐＨが上昇することで劇的な減少がもたらされた。従って、ＤＮＡ選択性が、ＮａＩ存在下のアルカリｐＨにおいて見られた。
（実施例８）
ヨウ化ナトリウムが結合用塩である場合に、ＤＮＡ選択性に対するｐＨの影響を、幾つかの固相を使用して、試験した。シリカ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）、珪藻土、二酸化ケイ素（Ｓｉｇｍａ Ｓｉｌｉｃａ）、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ、およびＧｌａｓｓｍｉｌｋを、実施例１で記載したように調製した。結合は、剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡ（実施例１で記載）またはラット肝臓全ＲＮＡの存在下で行った。結合は、以下の結合緩衝液内で行った：（１）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍ ＮａＩ；または（２）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍ ＮａＩ。
各固相と核酸と緩衝液との組み合わせを、１〜３回アッセイした。剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡ（２５μｇ）または全ラット肝臓ＲＮＡ（１５〜２５μｇ）のいずれかを、以下の緩衝液のうち１つを０．４５ｍｌ含む別々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに加えた：（１）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍ ＮａＩ；または（２）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍ ＮａＩ。
５種の固相（１０〜１８６ｍｇ）それぞれを、ＲＮＡまたはＤＮＡと個々の緩衝液との組み合わせに、別々に加えた。図９におけるデータは、以下のＲＮＡ実験およびＤＮＡ実験のそれぞれを反映している：（１）ｐＨ８のＧｌａｓｓｍｉｌｋを入れた３つの別々の容器およびｐＨ１０のＧｌａｓｓｍｉｌｋを入れた２つの容器；（２）ｐＨ８のＢｉｎｄｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘを入れた２つの別々の容器およびｐＨ１０のＢｉｎｄｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘを入れた１つの容器；（３）ｐＨ８のＳｉｇｍａ Ｓｉｌｉｃａを入れた１つの独立した容器およびｐＨ１０のＳｉｇｍａ Ｓｉｌｉｃａを入れた１つの容器；（４）ｐＨ８のシリカ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）を入れた１つの独立した容器；ならびに（５）ｐＨ８の珪藻土を入れた２つの別々の容器およびｐＨ１０の珪藻土を入れた１つの容器。従って、ＲＮＡについての固相と緩衝液との取り得る組み合わせそれぞれを含む異なった１４の容器、そしてＤＮＡについての固相と緩衝液との取り得る組み合わせそれぞれを含む異なった１４の容器が、存在した。混合物を、時々混合しながら、周囲温度で１０分間インキュベートした。結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（１５，８００×ｇ、１分間）して、結合インキュベーションに使用した結合緩衝液０．５ｍｌで２回洗浄した。次に粒子を、０．５ｍｌの７０％エタノールで、３〜４回洗浄した。
最後のエタノール洗浄に続けて、粒子を、周囲温度または５６℃で５〜１０分間風乾させた。結合した核酸を、一定の混合で、０．２５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）で、５６℃で５分間最初に溶出し、溶出した核酸を回収した。粒子に結合した任意の残余核酸を、一定の混合で、０．２５ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで、５６℃で５分間溶出し、溶出した核酸を回収した。核酸量は、分光光度法で定量した。
結果を図９に示す。試験した固相はそれぞれ、アルカリｐＨにおいてより大きなＤＮＡ結合選択性を示した。アルカリｐＨにおいて、ＲＮＡへの親和性が減少するようであった。固相の飽和量未満の濃度におけるＤＮＡの結合が、効率的だった。加えたＤＮＡのほぼ全てが、ケイ素含有固相に結合し、そこから回収された。対照的に、これらの条件下でのＲＮＡ結合は、量を多く加えた場合であっても、効率が低かった。
（実施例９）
二酸化ケイ素へのＤＮＡ結合とＲＮＡ結合との間の相違、および飽和のレベルを測定するため、以下の実験を行った。試験した固相は、二酸化ケイ素であり、これは、実施例１で記載したように調製した。研究した核酸は、剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡ（実施例１で記載したように調製）およびラット肝臓全ＲＮＡであった。
剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡ（１２６μｇ、６０μｇ、３０μｇ、１５μｇ、または５μｇ）または全ラット肝臓ＲＮＡ（１２５μｇ、６０μｇ、３０μｇ、１５μｇ、または５μｇ）を５０μＬで、４５０μｌの結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、４．８Ｍ ヨウ化ナトリウム）および１０ｍｇのＳｉｇｍａ二酸化ケイ素粒子（Ｓｉｇｍａ、実施例７で記載したように調製）を含む別々のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ（１．５ｍｌ）に加えた。実験は３連で行ったので、５種の異なった量のＤＮＡの容器１５個、および５種の異なった量のＲＮＡの容器１５個が、存在した。サンプルを、設定７のＶｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ−２ ｍｉｘｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）上で、周囲温度で５〜１０分間インキュベートした。
結合に続き、粒子を、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、そして上清を取り除いた。次に粒子を、１ｍｌの７０％エタノールで、４回洗浄した。２５０μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）を加えた後、粒子を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒ上で常に振とう（１４００ｒｐｍ）しながら、５６℃で５〜１０分間インキュベートした。粒子を、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、そして溶出した核酸を含む上清を回収した。残余の結合核酸の存在を検出するため、２５０μＬの１００ｍＭ ＮａＯＨを加え、粒子を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｉｅｒ Ｒ上で常に振とう（１４００ｒｐｍ）しながら、５６℃で５〜１０分間インキュベートし、溶出した核酸を回収した。それぞれの分画中の核酸量を、分光光度法で定量した。
結果を図１０に示す。本研究に使用した結合条件下では、１０ｍｇの二酸化ケイ素粒子は、ゲノムＤＮＡに対する約２５μｇの受容能（ｃａｐａｃｉｔｙ）を有していた。飽和未満の濃度で加えたゲノムＤＮＡのほぼ完全な回収が見られ、ＤＮＡの回収が効率的であることが示された。対照的に、ＲＮＡ回収は、添加したＲＮＡ量の全範囲にわたり、低かった。事実、低いＲＮＡ回収量は、最初の調製におけるＲＮＡの混入の結果であり得た。
（実施例１０）
選択性が、結合緩衝液のアルカリ度に起因するＲＮＡ分解の結果もたらされたか否かを試験するため、ＲＮＡを、ｐＨ６またはｐＨ１０のいずれかにおいてインキュベートしてから、以下のようなＲＮＡ結合に適合した条件下で、シリカと結合させた。全ラット肝臓ＲＮＡ（全容量１０μＬ中に２５μｇ）を、２連で、１００μＬの、５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０、４．８Ｍ ＮａＩを含む）、または５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６、４．８Ｍ ＮａＩを含む）のいずれかの中で、周囲温度で５分間、１０分間、１５分間、３０分間、または６０分間、インキュベートした。示した時間の最後に、１ｍＬの、４．８Ｍ ＮａＩ含有５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を、各チューブに加え、シリカへのＲＮＡ結合に適合した条件にした。反応物を混合し、１０ｍｇのＳｉｇｍａ二酸化ケイ素（実施例１で記載されたように調製）を、全容量５０μＬで加えた。サンプルを、設定７のＶｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ−２ ｍｉｘｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）上で、周囲温度で１０分間インキュベートした。
結合に続き、粒子を、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、そして上清を取り除いた。次に粒子を、１ｍｌの４．８Ｍ ＮａＩ含有５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）で２回、続けて１ｍＬの７０％エタノールで４回、洗浄した。２５０μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）を加えた後、粒子を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒ上で常に振とう（１４００ｒｐｍ）しながら、５６℃で５〜１０分間インキュベートした。粒子を、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、溶出した核酸を含む上清を回収した。残余の結合核酸の存在を検出するため、２５０μＬの１００ｍＭ ＮａＯＨを加え、粒子を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｉｅｒ Ｒ上で常に振とう（１４００ｒｐｍ）しながら、５６℃で５〜１０分間インキュベートし、溶出した核酸を回収した。それぞれの分画中の核酸量を、分光光度法で定量した。
図１６で示すように、ＲＮＡの半減期は、ｐＨ１０およびｐＨ６において、それぞれ８６分および２６０分である。これらの半減期に基づき、ｐＨ１０およびｐＨ６において、加えたＲＮＡのそれぞれ７．７％および２．６％だけが、１０分間の結合インキュベーションの間に、分解されると予測される。
（実施例１１）
タンパク質の結合に対するｐＨの影響を、試験した。各条件を、１回アッセイした。精製ウシ血清アルブミン（１ｍｇ、１００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ水溶液、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ，Ｌｏｔ ９３８）を、以下を１ｍｌ含む１．５ｍｌ微量遠心チューブに加えた：（１）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、４．７５Ｍ ＮａＩ；（２）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４．７５Ｍ ＮａＩ；または（３）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍ ＮａＩ。固相（１０ｍｇ）を、別々の緩衝化タンパク質溶液に加え、これらの混合物を、時々混合しながら、周囲温度でインキュベートした。
結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（１５，８００×ｇ、１分）して、そして次に０．５ｍｌの７０％エタノールで、４回洗浄した。最後のエタノール洗浄に続けて、粒子を、周囲温度で１０分間風乾させた。結合したタンパク質を、一定の混合で、０．２５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）で、５６℃で５分間、最初に溶出し、溶出した核酸を回収した。粒子に結合した任意の残余タンパク質を、一定の混合で、０．２５ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで、５６℃で５分間溶出し、溶出したタンパク質を回収した。タンパク質の回収を、分光光度法で定量した。
結果を図１１に示す。ＲＮＡ結合と同様に、結合緩衝液のｐＨが高まるにつれ、タンパク質のシリカへの結合は減少した。
（実施例１２）
ＤＮＡおよびＲＮＡのシリカへの結合に対する塩組成の影響を、アルカリｐＨにおいて試験した。二酸化ケイ素（Ｓｉｇｍａ Ｓｉｌｉｃａとも呼ばれる）を、実施例１で記載したように調製した。剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡを、実施例１に従って調製した。ラット肝臓全ＲＮＡを、ＲＮＡの供給源とした。
各核酸と緩衝液との組み合わせを、１回アッセイした。２５μｇ（５０μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ水溶液）の剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡまたは２５μｇ（１０μｌの２．５ｍｇ／ｍｌ水溶液）のラット肝臓全ＲＮＡを、以下の緩衝液のうちの１つを０．５ｍｌ含む別々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに別々に加えた：（１）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、３．６５Ｍ塩化リチウム；（２）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、３．６５Ｍ臭化リチウム；（３）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、３．６５Ｍヨウ化リチウム；（４）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、３．６５Ｍ塩化ナトリウム；（５）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、３．６５Ｍ臭化ナトリウム；（６）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、３．６５Ｍヨウ化ナトリウム；（７）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、３．６５Ｍ塩化カリウム；（８）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、３．６５Ｍ臭化カリウム；または（９）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、３．６５Ｍヨウ化カリウム。
固相（１０ｍｇ）を、１８種の緩衝化核酸溶液それぞれに加え、これらの混合物を、時々混合しながら、周囲温度で１０分間インキュベートした。結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（１５，８００×ｇ、１分）して、そして０．５ｍｌの７０％エタノールで、４回洗浄した。結合した核酸を、一定の混合で、０．２５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）で、５６℃で５分間、最初に溶出し、溶出した核酸を回収した。粒子に結合された任意の残余核酸を、一定の混合で、０．２５ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで、５６℃で５分間溶出を行い、溶出した核酸を回収した。核酸の回収は、分光光度法で定量した。
結果を図１２（ａ）〜（ｆ）に示す。分析を容易にするため、データはカチオンまたはアニオンで分類して示される。
ｐＨ１０において、ＤＮＡの結合はアニオンの組成に影響された。二酸化ケイ素（Ｓｉｇｍａ ｓｉｌｉｃａ）へのＤＮＡ結合は、一価のアニオンの半径が増大するにつれ増加した。一価のカチオンの半径は、その影響の大きさに影響を及ぼした。対照的に、シリカへのＲＮＡの結合は、アニオンの半径が増大するにつれ減少する傾向を示した。カチオンの大きさの減少は、両核酸種に対する二酸化ケイ素の受容能を増加した。結果として、ＤＮＡ結合の選択性は、塩組成の特定の選択により改善され得た。これらの結果は、アニオンが大きくなるほど、選択性が大きくなることを示した。カチオンの半径と選択性との間には、相関関係はなかった。ナトリウムは、ＤＮＡ結合への高い程度の選択性を実証した。
（実施例１３）
ＤＮＡ単離のための選択的条件の識別能力を実証するために、高濃度ＲＮＡがゲノムＤＮＡの結合を阻害する能力を試験した。二酸化ケイ素およびゲノムＤＮＡは、実施例１で記載したように調製した。ラット肝臓全ＲＮＡを、ＲＮＡの供給源とした。
各条件を、１回アッセイした。１：１（１５μｇ：１５μｇ）、１０：１（１５μｇ：１μｇ）、３０：１（１５μｇ：０．５μｇ）、または１００：１（２０μｇ：０．２μｇ）のＲＮＡ：ＤＮＡ比で、５つの独立したＲＮＡとＤＮＡとの混合物１０μｌを、以下の緩衝液のうちの１つを０．４５ｍｌ含む別々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに加えた：（１）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍ ＮａＩ；または（２）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、４．７５Ｍ臭化リチウムＮａＩ。固相（１０ｍｇ）を、１０の緩衝化核酸溶液の組み合わせそれぞれに加え、そしてこれらの混合物を、時々混合しながら、周囲温度で１０分間インキュベートした。
結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（１５，８００×ｇ、１分）して、そして０．５ｍｌの７０％エタノールで、４回洗浄した。最後のエタノール洗浄に続けて、粒子を、０．５ｍＬのアセトンで１回洗浄した。一旦アセトンを除去して、ペレットを、５６℃で５分間乾燥させた。結合した核酸を、一定の混合で、５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）で、５６℃で５分間溶出し、溶出した核酸を回収した。
核酸の回収を、アガロースゲル電気泳動により可視化した（図１３参照）。電気泳動を、２μｌの核酸ストック混合物または５μｌの単離した溶出物にて行った。サンプルを、１％ＳｅａＫｅｍ（登録商標）（Ｔｅｋｎｏｖａ）、１×ＴＢＥを使用する０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドゲル、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド緩衝液（ＢＩＯ−ＲＡＤ）にて、８Ｖ／ｃｍで３０分〜１時間、電気泳動した。エチジウム染色された物質を、短波長の紫外線下で可視化および撮影した。分子量マーカーは、ＡｍｐｌｉＳｉｚｅ ＤＮＡ分子量標準（ＢＩＯ−ＲＡＤ）およびＲＮＡラダー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）からなった。
ＮａＩ中ｐＨ１０において、シリカは、ＲＮＡよりもＤＮＡに対して、少なくとも４０倍より高く選択的であった。ｐＨ６においては、添加したＲＮＡをほぼ完全に捕捉した。ＲＮＡ添加の最高レベル（２０μｇ）において、ｐＨ１０で回収されたＲＮＡは、検出できなかった。対照的に、０．５μｇのゲノムＤＮＡを添加した場合、検出可能なＤＮＡが回収された。従って、ｐＨ１０において、ヨウ化ナトリウム存在下で、シリカは、ＲＮＡに対するよりもＤＮＡに対して４０倍高い選択性を示した。
（実施例１４）
高レベルのＲＮＡが固相への結合においてＤＮＡと競合するかどうかを評価するため、高レベルのＲＮＡを、ゲノムＤＮＡと混合し、非選択的条件および選択的条件の両条件下で結合させた。Ｓｉｇｍａ二酸化ケイ素および剪断ゲノムＤＮＡを、実施例１で記載したように調製した。ラット肝臓全ＲＮＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ロット番号Ａ３０４０５７、ロット番号Ａ３０５０６２またはロット番号Ａ３０６０７３）を、ＲＮＡの供給源とした。
各核酸と緩衝液との組み合わせを、２回アッセイした。（ａ）５μｇ（０．５ｍｇ／ｍｌの１０μｌ）の剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡおよび５μｇ（２．５ｍｇ／ｍｌの２μｌ）のラット肝臓全ＲＮＡ、または（ｂ）５μｇ（０．５ｍｇ／ｍｌの１０μｌ）の剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡおよび５０μｇ（２．５ｍｇ／ｍｌの２０μｌ）のラット肝臓全ＲＮＡのいずれかを、以下の緩衝液のうちの１つを０．４５ｍｌ含む別々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに別々に加え、そして混合した：（１）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、３．５Ｍ ＮａＩ；または（２）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、３．５Ｍ ＮａＩ。これらの溶液を、周囲温度で５分インキュベートした。
固相（１０ｍｇ）を、４種の緩衝化核酸溶液の組み合わせそれぞれに加え、混合物を、時々混合しながら、周囲温度で１０分間インキュベートした。結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（１５，８００×ｇ、１分）して、そして０．５ｍｌの７０％エタノールで、３回洗浄した。結合した核酸を、一定の混合で、１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）で、５６℃で５分間溶出し、溶出した核酸を回収した。
核酸の回収を、アガロースゲル電気泳動により可視化した（図１４参照）。単離した溶出物の１０μｌを、０．８％のＳｅａＫｅｍアガロースゲルで、実施例１３で記載したように電気泳動した。エチジウム染色された物質を、短波長の紫外線下で可視化し、撮影した。
過剰なＲＮＡ濃度ですら、ＤＮＡ選択的条件下では、ＲＮＡはほとんど単離されなかった。データは、選択的条件を使用した場合、ＲＮＡ混入量が検出限界より低いことを示した。非選択的条件下では、高濃度の核酸で、限定数の核酸結合部位は、ＤＮＡ回収の全体量を減少させ得る。
（実施例１５）
以下のように、ヒト全血から、ゲノムＤＮＡを単離した。二酸化ケイ素を、実施例１で記載したように調製した。
各条件を、１回アッセイした。２５μｌまたは１００μｌの全血（Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｃｉｆｉｃ）を、以下の緩衝液のうちの１つを（それぞれ）０．２５ｍｌまたは０．９ｍｌ含む別々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに別々に加えた：（１）５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、４．７５Ｍ ＮａＩ；または（２）５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、４．７５Ｍ ＮａＩ。核酸を、時々混合しつつ、緩衝化溶液内で、周囲温度で１０分インキュベートした。
固相（１０ｍｇ）を、４種の緩衝化核酸溶液の組み合わせに加え、これらの混合物を、時々混合しながら、周囲温度で１０分間インキュベートした。結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（１５，８００×ｇ、１分）して、そして結合インキュベーションに用いた結合緩衝液０．５ｍｌで、２回洗浄した。次に、粒子を、７０％エタノールで４回洗浄した。結合した核酸を、一定の混合で、５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）で、５６℃で５分間溶出し、溶出した核酸を回収した。
核酸の回収量は、アガロースゲル電気泳動により可視化した（図１５参照）。単離した溶出物の２μｌまたは１０μｌを、１．０％のＳｅａＫｅｍアガロースゲルで、実施例１３で記載したように電気泳動した。エチジウム染色物質を、短波長の紫外線下で可視化し、撮影した。
ｐＨ６で、ＮａＩ含有緩衝液中で全血にシリカを加えた場合、粒子は凝集した。これは、タンパク質も粒子に吸着していることを示唆している。結果として、ＤＮＡ回収量は乏しかった。対照的に、ｐＨ１０で全血に加えた場合、シリカ粒子は懸濁状態に留まった。粒子へのタンパク質の吸着がない場合、ＤＮＡ回収率は高かった。
（実施例１６）
特定の実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を、連続的選択的結合（連続的選択的結合）により、サンプル混合物から単離し得る。代表的な連続的選択的結合を、図１７に示す。連続的選択的結合にて、サンプルを、選択的ＤＮＡ結合に適合した条件下で、固相に接触させた。結合核酸を含む固相を、非結合物質から分離し、そして非結合画分における条件を、固相へのＲＮＡ結合に適合した条件に調節した。この第二画分に第二固相を加え、ＲＮＡを吸着させた。ＤＮＡおよびＲＮＡを、次にそれぞれの固相から単離した。
ＤＮＡおよびＲＮＡの連続的選択的結合の実施形態を評価するため、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物を、連続的選択的結合条件下で処理した。最初に、ＤＮＡを、ＤＮＡ選択的条件下で固相に結合させ、そして次に非結合ＲＮＡ画分を除去し、そして非選択的結合条件を用いて、ＲＮＡを同じ固相に結合させた。Ｓｉｇｍａ二酸化ケイ素および剪断ゲノムＤＮＡを、実施例１で記載したように調製した。ラット肝臓全ＲＮＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）が、ＲＮＡの供給源であった。
各核酸と緩衝液との組み合わせを、２回アッセイした。５μｇのＤＮＡ、５μｇのＲＮＡおよび５μｇのＤＮＡと５μｇのＲＮＡとの混合物それぞれを、それぞれ５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、３．５Ｍ ＮａＩ；５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、３．５Ｍ ＮａＩ；５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、３．５Ｍ ＮａＩを含む別々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに加えた。緩衝溶液を、周囲温度で５分インキュベートした。１０ｍｇの固相を、６種の緩衝核酸溶液の組み合わせそれぞれに加え、混合物を、時々攪拌しながら、周囲温度で１０分間インキュベートした。
結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（１５，８００×ｇ、１分）して、そして０．５ｍｌの７０％エタノールで、３回洗浄した。エタノールを除去したら、粒子を、周囲温度で少なくとも１０分間乾燥させた。
ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物の結合反応物から取った上清を、１ｍＬの５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、３．５Ｍ ＮａＩを含む別々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに加えた。これらのチューブに、１０ｍｇの固相を加え、混合物を、時々攪拌しながら、周囲温度で１０分間インキュベートした。
結合インキュベーションに続き、粒子を、遠心分離（１５，８００×ｇ、１分）して、そして０．５ｍＬの７０％エタノールで、３回洗浄した。いったんエタノールを除去し、粒子を、周囲温度で少なくとも１０分間乾燥させた。
結合した核酸は、常に攪拌しつつ、０．１ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）を用いて、５６℃で５分間、全粒子から溶出し、溶出した核酸を回収した。
核酸の回収物を、アガロースゲル電気泳動により可視化した。単離した溶出物の１０μＬに対して、電気泳動を行った。サンプルを、０．８％のＳｅａＫｅｍ（登録商標）、０．５μｇ／ｍＬエチジウムブロマイドゲルを通して、１×ＴＢＥ、０．５μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド緩衝液（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、７Ｖ／ｃｍで３０分から１時間、電気泳動した。エチジウム染色物質を、短波長の紫外線下で可視化し、撮影した。分子量マーカーは、Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ （ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）からなるものであった。結果を図１８に示す。
（実施例１７）
特定の実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を、最初に固相へこれらの両種を結合させて、適切な条件下で連続的に各核酸型を放出させること（連続的特異的溶出）により、サンプル混合物から単離し得る。代表的な連続的選択的溶出を、図１７に示す。連続的選択的溶出において、サンプルをＤＮＡおよびＲＮＡの両方に結合する条件下で固相と接触させる。洗浄に続き、このＲＮＡを、ＤＮＡとのみ結合する条件下で解放する。固相を除去し、ＤＮＡおよびＲＮＡを、次に両画分から連続的に精製する。
連続的選択的溶出の実施形態を評価するため、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を、両方と結合する条件下で固相と接触させた。ＲＮＡを、ＤＮＡとのみ結合する条件下で溶出し、続いてＤＮＡを、低イオン強度緩衝液を用いて溶出する。Ｓｉｇｍａ二酸化ケイ素および剪断ゲノムＤＮＡを、実施例１で記載したように調製した。ラット肝臓全ＲＮＡ（Ｂｉｏｃｈｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）が、ＲＮＡの供給源であった。
各核酸と緩衝液との組み合わせを、２回アッセイし、そしてＤＮＡおよびＲＮＡを、以下のように処理した。（１）１０μｇの剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡ、あるいは（２）１０μｇのラット肝臓全ＲＮＡ、または（３）１０μｇの剪断仔ウシ胸腺ＤＮＡおよび１０μｇのラット肝臓全ＲＮＡのいずれかを、０．２ｍｌの５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）、３．５Ｍ ヨウ化ナトリウムを含む別々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに加え、周囲温度で、時々攪拌しつつ、５分インキュベートした。固相（１０ｍｇ）を、各緩衝化核酸溶液に加え、混合物を、攪拌しながら周囲の温度で１０分間インキュベートした。
結合インキュベーションに続き、粒子（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が結合した粒子の複製セットを除く）を、遠心分離（１５，８００×ｇ、１分）して、そして結合核酸を、常に攪拌しつつ、０．２ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）で、５６℃で５分間溶出し、溶出した核酸を、回収した。
ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が結合した粒子の１複製セットを、０．２ｍｌの５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０）、３．５Ｍ ＮａＩで、時々攪拌しながら、周囲温度で５分間洗浄し、ＲＮＡを溶出して回収した。粒子は、次に０．２ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）で、常に攪拌しながら、５６℃で５分間洗浄し、結合ＤＮＡを溶出し、回収した。
核酸の回収を、アガロースゲル電気泳動により、可視化した。単離した溶出物の１０μＬを、１％のＳｅａＫｅｍ（登録商標）、０．５μｇ／ｍＬエチジウムブロマイドゲルで、１×ＴＢＥ、０．５μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド緩衝液（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用し、７Ｖ／ｃｍで３０分から１時間、電気泳動した。エチジウム染色物質を、短波長の紫外線下で可視化し、撮影した。分子量マーカーは、Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ （ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）からなるものであった。結果を図１９に示す。
図１は、種々の塩が、ｐＨ８において、ＤＮＡの種々の固相への結合に及ぼす影響を示す。 図２は、塩化物またはチオシアン酸塩のいずれかの存在下でのＤＮＡの種々の固相への結合を、ｐＨ８において、比較する。 図３は、種々の塩が、ｐＨ８において、ＲＮＡの種々の固相への結合に及ぼす効果を示す。 図４は、種々の塩が、種々の固相へのＤＮＡ結合の選択性に及ぼす効果を、ＤＮＡ対ＲＮＡの回収率によって表す。 図５（ａ）は、種々の塩およびｐＨが、ゲノムＤＮＡのＯｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｓｉｌｉｃａへの結合に及ぼす効果を示す。 図５（ｂ）は、種々の塩およびｐＨが、ゲノムＤＮＡのＳｉｇｍａ Ｄｉａｔｏｍａｃｅｏｕｓ Ｅａｒｔｈへの結合に及ぼす効果を示す。 図５（ｃ）は、種々の塩およびｐＨが、ゲノムＤＮＡのＢｉｏ１０１ Ｇｌａｓｓｍｉｌｋへの結合に及ぼす効果を示す。 図５（ｄ）は、ＮａＣｌ存在下において、ｐＨが、ゲノムＤＮＡの種々の固相への結合に及ぼす効果を示す。 図５（ｅ）は、ＧｕＳＣＮ存在下において、ｐＨが、ゲノムＤＮＡの種々の固相への結合に及ぼす効果を示す。 図５（ｆ）は、ＮａＢｒ存在下において、ｐＨが、ゲノムＤＮＡのＯｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｓｉｌｉｃａへの結合に及ぼす効果を示す。 図５（ｇ）は、ＮａＩ存在下において、ｐＨが、ゲノムＤＮＡの種々の固相への結合に及ぼす効果を示す。 図５（ｈ）は、ＮａＣｌ存在下において、ｐＨが、ゲノムＤＮＡの種々の固相にへの結合に及ぼす効果を示す（結果は、ｐＨ６における回収率により標準化された種々のｐＨレベルにおける相対効率として、示す）。 図５（ｉ）は、ＧｕＳＣＮ存在下において、ｐＨが、ゲノムＤＮＡの種々の固相への結合に及ぼす効果を示す（結果は、ｐＨ６における回収率により標準化された種々のｐＨレベルにおける相対効率として、示す）。 図５（ｊ）は、ＮａＢｒ存在下において、ｐＨが、ゲノムＤＮＡのＯｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｓｉｌｉｃａへの結合に及ぼす効果を示す（結果は、ｐＨ６における回収率により標準化された種々のｐＨレベルにおける相対効率として、示す）。 図５（ｋ）は、ＮａＩ存在下において、ｐＨが、ゲノムＤＮＡの種々の基板への結合に及ぼす効果を示す（結果は、ｐＨ６における回収率により標準化された種々のｐＨレベルにおける相対効率として、示す）。 図６は、塩およびｐＨが、ＲＮＡのＯｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ ＳｉｌｉｃａまたはＧｌａｓｓｍｉｌｋのいずれかへの結合に及ぼす効果を示す。 図７は、ＮａＩまたはＮａＣｌのいずれかの存在下において、塩およびｐＨが、Ｇｌａｓｓｍｉｌｋへの核酸の結合の選択性に及ぼす効果を示す。 図８（ａ）は、ｐＨが、Ｓｉｇｍａ Ｓｉｌｉｋａへの核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡの両方）の結合の選択性に及ぼす効果を示す。結合は、４．８Ｍ ＮａＩにおいて、以下のそれぞれの緩衝液を使用して行った：５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）；５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）；または５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０．０）。 図８（ｂ）は、ｐＨが、Ｂａｎｇｓ ２．２８μｍ粒子への核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡの両方）の結合の選択性に及ぼす効果を示す。結合は、４．８Ｍ ＮａＩにおいて、以下のそれぞれの緩衝液を使用して行った：５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）；５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）；または５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０．０）。 図８（ｃ）は、ｐＨが、Ｄａｖｉｓｉｌ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌへの核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡの両方）の結合の選択性に及ぼす効果を示す。結合は、４．８Ｍ ＮａＩにおいて、以下のそれぞれの緩衝液を使用して行った：５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）；５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）；または５０ｍＭ ＡＭＰ（ｐＨ１０．０）。 図９は、ＮａＩ存在下のｐＨ８またはｐＨ１０において、ＤＮＡ対ＲＮＡの、種々の固相に対する結合選択性を示す。 図１０は、ＤＮＡ選択的結合条件が、ＤＮＡおよびＲＮＡのＳｉｇｍａ Ｓｉｌｉｃａへの結合に及ぼす効果を示す。ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの濃度を増加することで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、および４．８Ｍ ＮａＩを使用して、Ｓｉｇｍａ Ｓｉｌｉｃａへ結合した。 図１１は、種々のｐＨレベルにおける、タンパク質（ウシ血清アルブミン）のシリカへの結合を示す。 図１２（ａ）は、種々のアニオンおよびカチオンが、ｐＨ１０におけるＤＮＡのＳｉｇｍａ Ｓｉｌｉｃａへの結合に及ぼす効果を示す（カチオンによって分類した）。 図１２（ｂ）は、種々のアニオンおよびカチオンが、ｐＨ１０におけるＲＮＡのＳｉｇｍａ Ｓｉｌｉｃａへの結合に及ぼす効果を示す（カチオンによって分類した）。 図１２（ｃ）は、種々のアニオンおよびカチオンが、ｐＨ１０におけるＤＮＡのＳｉｇｍａ Ｓｉｌｉｃａへの結合に及ぼす効果を示す（アニオンによって分類した）。 図１２（ｄ）は、種々のアニオンおよびカチオンが、ｐＨ１０におけるＲＮＡのＳｉｇｍａ Ｓｉｌｉｃａへの結合に及ぼす効果を示す（アニオンによって分類した）。 図１２（ｅ）は、種々のアニオンおよびカチオンが、ｐＨ１０におけるＳｉｇｍａ Ｓｉｌｉｃａへの結合選択性に及ぼす効果を示す（カチオンによって分類した）。 図１２（ｆ）は、種々のアニオンおよびカチオンが、ｐＨ１０におけるＳｉｇｍａ Ｓｉｌｉｃａへの結合選択性に及ぼす効果を示す（アニオンによって分類した）。 図１３は、ｐＨ６またはｐＨ１０における、種々の濃度のＤＮＡを用いた選択的結合実験の結果を示す。 図１４は、選択的および非選択的条件下での、異なったＤＮＡ対ＲＮＡ比を用いたＤＮＡおよびＲＮＡの回収の結果を示す。 図１５は、ｐＨ６およびｐＨ１０におけるＳｉｇｍａ Ｓｉｌｉｃａを用いた、全血からのＤＮＡの抽出結果を示す。 図１６は、種々のインキュベーション時間の後のＲＮＡの、ＲＮＡ分解のテストのための回収を示す。 図１７は、選択的結合および溶出を使用した、核酸を単離する特定の方法の図を示す。 図１８は、代表的な連続の選択的結合方法により単離されたＲＮＡおよびＤＮＡを示す染色したアガロースゲルを示す。 図１９は、代表的な連続の選択的溶出方法により単離されたＲＮＡおよびＤＮＡを示す染色したアガロースゲルを示す。

Claims (27)

  1. 生物学サンプルからゲノムＤＮＡを単離する方法であって、該方法は、以下：
    該生物学サンプルを、選択的ゲノムＤＮＡ結合条件下で固相と接触させることにより、ゲノムＤＮＡを、該固相に選択的に結合させる、工程；
    該固相と該結合ゲノムＤＮＡを、該生物学サンプルの非結合部分から分離する工程；および
    該ゲノムＤＮＡを、該固相から単離する工程、
    を、包含し、
    該選択的ゲノムＤＮＡ結合条件が、以下：
    アルカリ性ｐＨ；および
    少なくともブロミドイオンの大きさである大型アニオン、
    を含む結合緩衝液の使用を含み、
    該アルカリ性ｐＨが１０またはそれより高い、
    方法。
  2. 前記固相からの前記ゲノムＤＮＡの単離が、該ゲノムＤＮＡの溶出を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記固相がケイ酸含有物質である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ケイ酸含有物質が、シリカ、二酸化ケイ素、珪藻土、ガラス、セライト、およびシリカゲルの少なくとも１つから選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記固相が、粒子、ビーズ、膜、フリット、チャンバの表面、および容器の壁の少なくとも１つから選択される形状である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記大型アニオンが、ピクレート、タンネート、タングステート、モリブデート、パークロレート、およびスルホサリチレートの少なくとも１つから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記大型アニオンが、トリクロロアセテート、トリブロモアセテート、チオシアネート、およびニトレートの少なくとも１つから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記大型アニオンが、ヨードイオンおよびブロミドイオンの少なくとも１つから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  9. 生物学サンプルからゲノムＤＮＡおよびＲＮＡを単離するための方法であって、該方法は、以下：
    該生物学サンプルを、選択的ゲノムＤＮＡ結合条件下で、第一固相と接触させることにより、ゲノムＤＮＡを、該第一固相へ選択的に結合させる工程；
    該第一固相と該結合ゲノムＤＮＡを、該生物学サンプルの非結合部分から分離する工程；
    該ゲノムＤＮＡを、該第一固相から単離する工程；および
    ＲＮＡを、該生物学サンプルの該第一非結合部分から単離する工程、
    を、包含し、
    該選択的ゲノムＤＮＡ結合条件が、以下：
    アルカリ性ｐＨ；および
    少なくともブロミドイオンの大きさである大型アニオン、
    を含む結合緩衝液の使用を含み、
    該アルカリ性ｐＨが１０またはそれより高い、
    方法。
  10. 前記第一固相からの前記ゲノムＤＮＡの前記単離が、該ゲノムＤＮＡの溶出を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 請求項９に記載の方法であって、前記ＲＮＡを前記生物学サンプルの前記第一非結合部分から単離する工程が、以下：
    該生物学サンプルの該第一非結合部分を、ＲＮＡが第二固相に結合する条件で、該第二固相に晒すこと；
    該第二固相と結合ＲＮＡを、該生物学サンプルの第二非結合部分から分離すること；および
    ＲＮＡの溶出により、ＲＮＡを、該第二固相から単離すること、
    を、包含する、方法。
  12. ＲＮＡが前記第二固相へ結合する前記条件が、中性または酸性ｐＨを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記第二固相がケイ酸含有物質である、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記ケイ酸含有物質が、シリカ、二酸化ケイ素、珪藻土、ガラス、セライト、およびシリカゲルの少なくとも１つから選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記第二固相が、粒子、ビーズ、膜、フリット、チャンバの表面、および容器の壁の少なくとも１つから選択される形状である、請求項１１に記載の方法。
  16. 前記大型アニオンが、ピクレート、タンネート、タングステート、モリブデート、パークロレート、およびスルホサリチレートの少なくとも１つから選択される、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記大型アニオンが、トリクロロアセテート、トリブロモアセテート、チオシアネート、およびニトレートの少なくとも１つから選択される、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記大型アニオンが、ヨードイオンおよびブロミドイオンの少なくとも１つから選択される、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  19. ＲＮＡが前記第二固相へ結合する前記条件が、中性およびアルカリ性ｐＨを含む、請求項１６に記載の方法。
  20. 生物学サンプルにおけるゲノムＤＮＡを同定する方法であって、該方法は、以下：
    該生物学サンプルを、選択的ゲノムＤＮＡ結合条件下で固相と接触させることにより、ゲノムＤＮＡを、該固相に選択的に結合させる、工程；
    該固相と該結合ゲノムＤＮＡを、該生物学サンプルの非結合部分から分離する工程；および
    該固相に結合した該ゲノムＤＮＡを、同定する工程、
    を、包含し、
    該選択的ゲノムＤＮＡ結合条件が、以下：
    アルカリ性ｐＨ；および
    少なくともブロミドイオンの大きさである大型アニオン、
    を含む結合緩衝液の使用を含み、
    該アルカリ性ｐＨが１０またはそれより高い、
    方法。
  21. 前記固相に結合した前記ゲノムＤＮＡの同定が、該固相に結合した該ゲノムＤＮＡの増幅を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 生物学サンプルにおけるゲノムＤＮＡおよびＲＮＡを同定する方法であって、該方法は、以下：
    該生物学サンプルを、選択的ゲノムＤＮＡ結合条件下で、第一固相と接触させることにより、ゲノムＤＮＡを、該第一固相へ選択的に結合させる工程；
    該第一固相と該結合ゲノムＤＮＡを、該生物学サンプルの第一非結合部分から分離する工程；
    該第一固相に結合した該ゲノムＤＮＡを、同定する工程；および
    該生物学サンプルの該第一非結合部分からＲＮＡを同定する工程、
    を、包含該選択的ゲノムＤＮＡ結合条件が、以下：
    アルカリ性ｐＨ；および
    少なくともブロミドイオンの大きさである大型アニオン、
    を含む結合緩衝液の使用を含み、
    該アルカリ性ｐＨが１０またはそれより高い、方法。
  23. 前記第一固相に結合した前記ゲノムＤＮＡの同定が、該第一固相に結合した該ゲノムＤＮＡの増幅を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 以下：
    １０またはそれより高いアルカリ性ｐＨの緩衝液；
    少なくともブロミドイオンの大きさである大型アニオン；および
    固相、
    を、含む、生物学サンプルからゲノムＤＮＡを単離するためのキット。
  25. 前記大型アニオンが、ピクレート、タンネート、タングステート、モリブデート、パークロレート、およびスルホサリチレートの少なくとも１つから選択される、請求項２４に記載のキット。
  26. 前記大型アニオンが、トリクロロアセテート、トリブロモアセテート、チオシアネート、およびニトレートの少なくとも１つから選択される、請求項２４に記載のキット。
  27. 前記大型アニオンが、ヨードイオンおよびブロミドイオンの少なくとも１つから選択される、請求項２４に記載のキット。
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