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CN114641302A - 生物样本中微生物rna的快速分离和收集 - Google Patents

生物样本中微生物rna的快速分离和收集 Download PDF

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CN114641302A
CN114641302A CN202080075454.9A CN202080075454A CN114641302A CN 114641302 A CN114641302 A CN 114641302A CN 202080075454 A CN202080075454 A CN 202080075454A CN 114641302 A CN114641302 A CN 114641302A
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molecules
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J·赖特
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Pollution Source Identification Co ltd
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Abstract

微生物物种的检测和鉴定使用液相色谱作为从生物样本中快速分离并收集微生物RNA的粗过滤工艺。在各种实施方案中，来自生物样本的微生物RNA分子的基因测序通过以下而得到增强：获得生物样本并随后将生物样本制备为液相色谱的测试样品，所述液相色谱用于从测试样品中的RNA分子混合物中粗过滤微生物RNA分子，以在两个或更多个馏分输出中分离并收集微生物RNA分子，其中两个或更多个馏分输出中的至少一者是液相色谱的空隙体积内的馏分，制备一个或多个馏分输出用于基因测序，包括空隙体积内的馏分输出，并对一个或多个制备的输出进行基因测序以检测生物样本中的微生物RNA。

Description

生物样本中微生物RNA的快速分离和收集
技术领域
本公开涉及从生物样本中分离核酸。更具体地，本公开涉及通过使用液相色谱作为从生物样本中快速分离并收集微生物RNA的粗过滤(bulk filtration)工艺，而更高效且有效地检测并鉴定微生物物种。
背景技术
微生物物种的检测和鉴定对于诊断和治疗疾病，以及对于在各种临床、环境或生产环境中鉴别污染源和预防感染是重要的。微生物物种可以包括细菌、病毒、原生动物、真菌、藻类、变形虫和黏菌。
具体微生物物种的检测和鉴定可以用于患者和产品以及设施和环境(诸如，像医院或诊所的医疗相关设施和像制造厂或厨房的食品生产环境)的评估和治疗。例如，在医护办公室中利用具体微生物物种的检测，以便确定导致患者感染的病原体的存在和特征(identity)，从而允许适当的治疗和补救。同样的方法也用于医疗保健、食品行业、长期护理行业、酒店业、国土安全部、航空航天业，甚至私营部门。
不幸的是，从这样的临床、环境或生产背景中获得的生物样本中微生物物种的检测不同于在理论或研究背景中使用的受控生物样本中微生物物种的检测。来自这样的临床、环境或生产背景的原始生物样本不受控制或提纯(refined)，并且从理论或研究背景中的生物样品获得可用结果所花费的时间和费用明显多于从临床、环境或生产环境中的生物样本获得结果所花费的时间和费用。
生物样本是独特复杂的，并且可以包括范围从尿液和粪便到全血和血清到完整组织的生物材料。生物样本可以包括脂质、蛋白质、细胞核和线粒体DNA、RNA(即tRNA、rRNA、mRNA)，并且将包含样本的哺乳动物来源以及存在于样品中并感染宿主生物体的任何单细胞生物体(即微生物物种)的所有上述大分子。典型地，病原体的生物标记物(例如DNA和RNA)的水平以明显低于生物样本来源的水平存在，使得分离和检测变得困难。在理论和研究背景下，当前的微生物检测技术依赖于应用于生物样本的培养和/或纯化技术，以便形成适用于遗传分析的相关且可操作的生物样本。
在可以分析样本之前，培养技术可能需要长达30个小时，从而延迟了对具体微生物物种的检测结果采取行动以获得有利且及时的结果的能力。用于扩增基因序列的这样的培养技术的示例描述于例如第8,313,931号美国专利(培养20小时)和第9,435,739号美国专利(培养18-24小时)，以及3MTM分子检测系统(培养长达30小时，如https://multimedia.3m.com/mws/media/1353351O/3m-molecular-detection-assay-2-l-monocytogenes-update.pdf上可获得的链接和第2017/0219577A1号美国公开申请所述)。
通过过滤、洗脱或结合技术分离并检测微生物物种的生物标记物的纯化技术描述于例如第9,062,303号美国专利和第8,383,340号美国专利。诸如DNase的离液剂已被用于降解临床样品中除RNA以外的蛋白质(Tan等人，J Biomed and Biotech,2009，TurboDnase，可从ThermoFisher获得，第10,077,439号美国专利)；然而，这些方法不允许从非微生物RNA中分离微生物RNA。类似地，已经公开了使用不同裂解缓冲剂的共纯化从人血液中提取大肠杆菌的方法(Brennecke等人，J Med Micro，2017，66:301)，但是这些方法依赖于首先从生物样本中提取靶RNA，然后降解并去除任何残留的DNA。使用专门制备的无菌平板来分离具体的细菌菌株已被用于研究背景中，以获得适合于遗传分析的每种细菌菌株的相关的和可操作的生物样品。参见https://www.wrightlabs.org/metatranscriptomics_2、https://aac.asm.org/content/60/8/4722、https://www.nature.com/articles/s41598-018-21841-9上的链接中的材料。不幸的是，这些类型的纯化技术需要对生物样本进行进一步的处理和操作，这可能会导致关注的遗传生物标记物的降解。
用于检测微生物DNA的各种方法和系统，特别是在理论或研究背景下，在本领域中也是已知的。然而，这些技术依赖于对微生物DNA的检测，并且不能区分是活的还是死的微生物物种的存在。此外，因为生物样本中的其他种类DNA一般压制(overwhelm)该生物样本中微生物DNA的相对量，所以使用常规DNA鉴定来检测微生物DNA需要培养或制备生物样本，在该生物样本中生长足够数量的关注的微生物物种以可靠地检测并鉴定那些微生物。
需要一种技术，该技术可以从生物样本中快速分离并检测微生物物种的生物标记物，而不需要显著的、有意的培养或纯化，以便有助于更有效、高效且快速地鉴定这样的生物样本中的微生物物种，用于评估并治疗患者和产品，以及设施和环境。
发明内容
本公开的一个方面是一种通过粗过滤将生物样本快速地转化为微生物RNA过滤样品的方法，该方法通过在液相色谱工艺中使用空隙体积而无需降解是病原生物体的生物标记物的微生物RNA，以提高可通过随后的基因测序技术检测这样的病原生物体的存在的效率。
本公开的另一个方面涉及一种用于快速过滤从生物样本中获得的测试样品以分离并收集微生物RNA(活的(live)或有活力的(viable)微生物物种的生物标记物)的方法，其中该方法基本上没有设计成有意生长遗传材料的步骤。在各种实施方案中，本公开包括以下步骤：获得生物样本，消化或制备生物样本以产生供液相色谱使用的测试样品，以及通过液相色谱使用粗过滤以从测试样品中分离并收集微生物RNA分子。
在本发明的一些方面，用于快速过滤从生物样本中获得的测试样品以分离并收集微生物RNA的方法消除了培养或纯化遗传材料的步骤，这通过使用液相色谱以通过仅使用液相色谱的空隙体积输出从包括宿主RNA分子的RNA分子混合物中粗过滤微生物RNA分子，以便相对于宿主RNA分子有效地扩增来自测试样品的微生物RNA分子。
在一个实施方案中，一种用于从生物样本中过滤微生物RNA分子以分离微生物RNA的方法包括以下步骤：(a)获得生物样本；(b)通过使试剂与样本相互作用来消化生物样本以产生测试样品；和(c)使用液相色谱从测试样品中的RNA分子混合物中粗过滤微生物RNA分子，以从测试样品中分离并收集微生物RNA分子。
在一个实施方案中，一种从至少哺乳动物单链核酸序列和微生物单链核酸序列中的一者的混合物中过滤微生物单链核酸序列的方法通过从液相色谱方法的空隙体积中收集微生物RNA分子来进行，其中微生物单链核酸序列是蛋白质合成的催化剂。
在一个实施方案中，一种用于从生物样本中过滤微生物RNA分子以分离微生物RNA的方法包括：获得生物样本；通过使试剂与样本相互作用来制备生物样本以产生测试样品；以及使用液相色谱仪从测试样品中的RNA分子混合物中粗过滤微生物RNA分子，以从液相色谱仪的空隙体积中的测试样品中分离并收集微生物RNA分子。
在一些方面，液体流动相的流速为约0.5mL/min.至约3.5mL/min.，在一些方面为约550μL/min.至约2mL/min.，在某些方面为约600μL/min.至约1mL/min.，在一些其他方面为约650μL/min至约850μL/min。
在一些方面，空隙体积的保留时间在大于0秒至小于约6分钟之间，在一些方面小于约5分钟，在一些方面小于约4分钟，在一些方面小于约3分钟，在一些其他方面小于约2分钟。
在一些方面，具有任何过滤样品材料的流动相的多个馏分使用液相色谱洗脱，并收集约5秒至约1分钟之间的一段时间，在一些方面约10秒至约45秒之间的一段时间，并且在一些方面约15秒至约30秒之间的一段时间，其中每个等分试样包括约100μL至约1mL之间，在一些方面约125μL至约750μL之间，在一些方面约150μL至约500μL之间，在一些方面约175μL至约250μL之间。
在一个实施方案中，从使用液相色谱洗脱的一个或多个馏分中检测微生物RNA，其中使用对馏分中的一个或多个馏分的基因测序来检测微生物RNA。在一些方面，所述一个或多个馏分包括使用液相色谱洗脱的空隙体积的一个或多个馏分，其中使用对包含空隙体积的一个或多个馏分的基因测序来检测微生物RNA。
在一些方面，在基因测序之前对每个馏分进行脱水，其中将每个等分试样脱水至约15μL至约500μL之间的体积，在一些方面，脱水至约20μL至约100μL之间的体积，在一些方面，脱水至约25μL至约75μL之间的体积，在一些优选的方面，脱水至约35μL至约65μL之间的体积。
以上概述并不旨在描述每个所示实施方案或其主题的每个实施。下面的附图和详细描述更特别地举例说明了各种实施方案。
附图说明
结合附图考虑以下各种实施方案的详细描述，可以更全面地理解本发明的主题，其中：
图1示出了根据本发明的粗过滤方法的一个实施方案的代表性工作流程图。
图2示出了微生物RNA分离的代表性色谱图。
图3示出了微生物RNA分离的代表性色谱图。
图4示出了整体工作流程的一个实施方案的代表性框图，该整体工作流程并入了作为用于用于鉴定生物样本中微生物RNA的整体工艺的一部分的粗过滤方法。
图5A示出了根据本发明的某些实施方案，具有组合到智人RNA中的大肠杆菌RNA的样品的分离的代表性色谱图，其中每15秒收集馏分，并且保留时间与15秒馏分重叠，其示出了每个馏分内的峰，包括空隙体积。
图5B是图5A的色谱图，其中保留时间没有重叠每个15秒馏分。
图6A示出了根据本发明的某些实施方案，具有组合到智人RNA中的大肠杆菌RNA的样品的分离的另一个代表性色谱图，该色谱图是可再现的，使得每15秒收集的馏分在每个馏分中具有非常相似的峰，包括空隙体积。
图6B是图6A的色谱图，其中保留时间没有重叠每个15秒馏分。
图7是根据本发明的某些实施方案，对原始样品和使用液相色谱过滤成馏分1-23然后进行基因测序的样品的原始智人读取计数的条形图。
图8是根据本发明的某些实施方案，原始样品和使用液相色谱过滤成馏分1-23然后进行基因测序的样品的原始内标ERCC计数的条形图。
图9是根据本发明的某些实施方案，原始样品和使用液相色谱过滤成馏分1-23然后进行基因测序的样品的对数转换的ERCC归一化肠杆菌目/智人比率的条形图。
图10是根据本发明的某些实施方案，原始样品和使用液相色谱过滤成馏分1-23然后进行基因测序的样品的微生物读数和智人读数的相对丰度的条形图。
虽然各种实施方案可以修改为各种改进和可替换形式，但是其细节已在附图中通过示例的方式示出，并且将被详细描述。然而，应该理解，不旨在将要求保护的发明限制于所描述的特定实施方案。相反，旨在覆盖落入权利要求所限定的主题的精神和范围内的所有改进、等同物和替换物。
具体实施方案
在描述本公开中阐述的各种实施方案时，以下定义和约定(convention)用于理解各种实施方案的公开。在理解本公开时，将认识到本公开描述了将微生物学家使用的某些技术和设备与分析化学家使用的那些技术和设备整合或组合的各种实施方案。以下定义和约定提供了一组通用的术语，这些术语对于理解本公开是有用的和有帮助的，因为微生物学家和分析化学家这两个领域对术语的理解或使用可能不一致。
术语“哺乳动物”、“非微生物物种”或“非微生物群体”被理解为涵盖在实验室或自然环境中不是细菌、病毒、真菌或酵母群体或其组合或其任何混合物并且包括多细胞生物体的所有物种。
术语“微生物”、“微生物群体”或“微生物物种”被理解为涵盖实验室或自然环境中的细菌、病毒、真菌或酵母群体或其组合或其任何混合物，并且包括单细胞生物体。
术语“生物样本”是指未经处理且来源于哺乳动物物种的原始生物样本，包括全血、血浆、粘液、血清、尿液、粪便、完整组织、脑脊液、滑液；环境拭子；食物来源；和从表面获得的未知粉末。因此，提及生物样本可以包括提及上述来源中的一者或多者。
术语“测试样品”是指在制备或预处理后用于引入至液相色谱仪的生物样本，制备或预处理可以包括执行去除蛋白质、脱氧核糖核酸(DNA)、脂质和其他大分子的步骤。
术语“双链核酸序列”是指DNA。
术语“单链核酸序列”是指“核糖核酸”或“RNA”，并且应理解为涵盖转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)、大RNA、小RNA、变性和非变性RNA、片段化和完整RNA。
术语“液相色谱”、“HPLC”、“HPLC仪”等是同义词，是指根据各种实施方案用于从非微生物RNA中分离并收集微生物RNA的机器、仪器和/或技术。
术语百分比(％)、重量百分比(％w/w)、重量-体积百分比(％w/v)、按重量计％、按体积计％等是同义词，是指物质的浓度为标准室温和压力下该物质的重量除以总重量或体积，再乘以100。
修饰本公开组合物中成分的量或本公开方法中使用的时间的术语“约”是指数值的变化，其可以例如通过以下而发生：通过在现实世界中制备浓缩物或溶液的典型测量和处理程序；通过程序中的疏忽错误；通过用于制造这些组合物的成分的制造、来源或纯度以及方法的差异；通过仪器(机器)设置的差异。
术语“约”还涵盖由于特定初始混合物产生的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否被术语“约”修饰，权利要求都包括该数量的等价物。除了在操作示例中，或者另外指出的，本文使用的表示成分或反应条件的量的所有数字应理解为在所有情况下被术语“约”修饰。
分子生物学的中心法则解释，信息可以从核酸传递到核酸，或者从核酸传递到蛋白质，但是从蛋白质到蛋白质或者从蛋白质到核酸的信息传递是不可能的。在哺乳动物和微生物系统二者中，RNA都是负责合成蛋白质、运输氨基酸用于合成或催化蛋白质合成的一种核酸序列。本公开利用了RNA是DNA与蛋白质之间的过渡分子的事实，并利用微生物RNA的粗过滤作为鉴定生物样本中关注的物种和蛋白质功能的手段。
RNA有三种“类型”，所述三种“类型”称为mRNA、tRNA和rRNA。mRNA负责蛋白质合成，tRNA负责转运氨基酸用于合成，而rRNA负责催化或启动蛋白质合成。mRNA经常被研究，因为它比rRNA的片段相对更大，并且直接负责编码蛋白质。从信息的角度来看，mRNA在历史上被认为对科学研究最有意义。
尽管对RNA感兴趣，但这类分子很难分析。与在理想条件下可以持续数百万年的DNA不同，RNA典型地会在生物体死亡的几分钟内降解。然而，由于其半衰期短，RNA的检测典型地表明在分析时存在有活力的生物体。
传统的分子生物学或生化技术依赖的策略包括但不限于：酶联免疫吸附测定(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)、酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取(AGPC)和液-液提取，以从复杂的生物系统中分离RNA分子。(Molecular Cell Biology，第四版，Lodish等人，W.H.Freeman，1999)。然而，这些技术的关键限制是样品中存在的RNAase可以降解关注的RNA分子。此外，需要靶RNA结构的在先知识来利用ELISA和PCR技术。(BioanalyticalChemistry，第二版，Manz等人，Imperial College Press，2015)。虽然AGPC和液-液提取可以分离RNA分子，但这些技术可以分离所有的RNA，无论关注的类型或物种是什么。
与传统的分子生物学或生物化学技术相比，传统的分析化学技术被开发用于小分子的分析，且传统上还不适用于核酸或其他生物聚合物的分析。(BioanalyticalChemistry，第二版，Manz等人，Imperial College Press，2015)
一个混合技术领域已经发展起来，即生物分析化学，它解决了对包括RNA在内的大而复杂的生物分子进行分析的独特挑战。二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)凝胶、基质辅助激光解吸/电离-飞行时间(MALDI-TOF)、毛细管电泳和生物传感器的使用，都可以对关注的生物分子进行定量、结构阐明、定性分析以及分离，其比传统的分子生物学和生物化学策略具有更高的特异性和速度。
通过这些生物分析方法，高效液相色谱(HPLC)已被用于允许分析大的生物分子。(Principles of Instrumental Analysis，第五版，Skoog and Holler，Harcourt Brace，1998)。HPLC依赖于基于柱(称为固定相)与液体(称为流动相)之间的相互作用的混合物的化学分离。典型的HPLC柱由填充有聚苯乙烯或硅烷醇微珠的钢制外壳制成，并且当含有关注的样品的流动相被泵送通过柱时，样品(混合物)的组分在固定相内外分配。组分越“像”固定相，保留的组分就越多，且组分从柱中离开或洗脱的时间就越长。当检测到组分时，每个组分都会在称为“色谱图”的图上指定“保留时间”。每个柱都有“t0”，其指的是没有被柱保留在称为“空隙体积”中的所有分子。色谱人员认为空隙体积在很大程度上与信息无关；因为色谱图的这个区域包含未被化学分离的分子的混合物，色谱图的这个区域传统上未被利用，并且在这个区域中发现的分子传统上未被研究或关注。
在本发明的一些方面，空隙体积代表从使用液相色谱将样品引入柱中时起直到约6分钟(在一些方面直到约5分钟，在一些方面直到约4分钟，在一些方面直到约3分钟，在一些其他方面直到约2分钟)的时间段的时间，其中流动相的流速在约0.5mL/min.至约3.5mL/min.之间，在一些方面，在约550μL/min.至约2mL/min.之间，在一些方面，在约600μL/min.至约1mL/min.之间，在一些其他方面，在约650μL/min.至约850μL/min.之间。
在生物分析中，有两种常见的HPLC模式：反相液相色谱(RPLC)和离子交换液相色谱(IE-LC)。RPLC的柱填充有疏水性固定相，并且分子根据大小和极性二者从柱洗脱。疏水分子保留延长的时间，而亲水分子大部分不保留。最疏水的分子在柱的空隙体积中洗脱。在RPLC中，空隙体积由一种或多种不同大小的亲水分子的混合物制成，这些分子无法与柱固定相相互作用。
与RPLC不同，IE-LC根据总的净电荷化学分离分子。柱固定相由带净正电荷的微球制成，并且当流动相的盐含量或pH增加时，分子会吸附到柱固定相上，并从其上解吸。分子从柱洗脱并被检测。使用IE-LC，尺寸增加或负电荷增加的分子保留时间最长，并且从柱洗脱的时间也最长；相反，电中性分子或带正电荷的分子在空隙体积中洗脱。这种方法以前曾用于从总RNA混合物中化学分离mRNA；然而，这种方法从未研究或利用空隙体积作为RNA收集的手段。
传统上，mRNA被研究得最多，因为它比rRNA的片段相对更大，这使得科学家能够更准确且快速地获得信息。这样的用于分析mRNA的传统方法已经去除并丢弃了rRNA和tRNA，而不是保留这些类型的RNA用于后续分析。与这样的传统方法不同，本公开的各种实施方案利用分子生物学的中心法则来快速过滤并分离微生物RNA，而不是化学分离微生物RNA，特别强调rRNA，用于通过收集在液相色谱工艺的空隙体积中发现的所有RNA片段来进行进一步的生物信息学研究。
本公开涉及一种用于快速过滤从生物样本中获得的测试样品以分离并收集微生物RNA(活的或有活力的微生物物种的生物标记物)的方法，其中该方法基本上没有被设计成有意生长遗传材料的步骤。在各种实施方案中，本公开包括以下步骤：获得生物样本，消化或制备生物样本以产生供色谱的测试样品，以及通过液相色谱使用粗过滤来从测试样品中分离并收集微生物RNA分子。
在本发明的一些方面，本发明的方法通过使用液相色谱从RNA分子的混合物中粗过滤微生物RNA分子，例如来自获得生物样本的宿主的RNA分子，以便从测试样品中扩增微生物RNA分子，从而消除了培养或纯化遗传物质的需要。因此，在一些方面，本发明的方法没有通过仅使用液相色谱的空隙体积输出来培养测试样品以生长遗传材料从而有效地扩增微生物RNA分子的步骤。在一些方面，本发明的方法没有通过仅使用液相色谱的空隙体积输出来纯化测试样品以有效地扩增微生物RNA分子的步骤。
如图1所述，获得了临床样本100。在一个实施方案中，临床样本是来自硬表面的环境拭子，其中拭子在测试瓶中的缓冲溶液中提取。缓冲溶液可以包括0.1X至2.5X磷酸盐缓冲盐水(PBS)、0.05M至1.5M蛋白胨水或30％至50％具有0.1％至1％马来酸的盐酸胍。
在另一个实施方案中，生物样本是哺乳动物物种的组织或排泄物，包括但不限于人类和家养动物物种。生物样本包括但不限于全血、血浆、粘液、血清、尿液、粪便、脑脊液、滑液和完整组织。除了用于收集特定形式的生物样本的任何其他既定方案之外，临床样本可以通过抽血、穿孔活检、粪便培养、鼻拭子、唾液样本、尿液分析、皮肤医学刮擦来获得。生物样本包含大RNA分子、小RNA分子、tRNA分子、rRNA分子、mRNA分子、变性和非变性RNA分子、微生物RNA分子、非微生物RNA分子、基因组DNA分子、蛋白质分子和其他大分子。
可以使用本领域已知的方法适当地对生物样本进行机械匀浆、氮气空化或超声处理，以制备用于后续消化步骤的样品，从而产生测试样品。生物样本然后经历消化步骤200。消化临床样本可以包括酶、离液剂、表面活性剂、去污剂和本领域已知的其他添加剂。消化生物样本的工艺去除基因组DNA分子、蛋白质分子和非RNA大分子，并且可以在低温下发生以防止生物样本的降解，并且可以任选地包括已知用于保存靶分子的添加剂，如表1中所述。
表1.保存靶分子同时消化临床样本的添加剂。
Figure BDA0003618248430000111
在一个实施方案中，消化生物样本始于通过将生物样本与硫氰酸胍盐(Guainidinium thiocyanate)、N-月桂酰肌氨酸和乙醇相互作用来裂解临床样品。在一个实施方案中，将55％至85％硫氰酸胍和1％至20％N-月桂酰肌氨酸的缓冲溶液与70％至100％乙醇溶液等体积混合。在一个实施方案中，将65％至75％硫氰酸胍和1％至10％N-月桂酰肌氨酸的缓冲溶液与70％至100％乙醇溶液等体积混合。在另一个实施方案中，将65％至75％硫氰酸胍和1％至10％N-月桂酰肌氨酸的缓冲溶液与90％至100％乙醇溶液等体积混合。
在一个实施方案中，通过向一定体积的临床样本中加入1至3体积的缓冲溶液和乙醇混合物，继续通过裂解样本来消化生物样本。在一个实施方案中，将2体积的缓冲溶液和乙醇混合物加入到一定体积的临床样本中。在另一个实施方案中，将200μL至400μL的缓冲溶液和乙醇混合物加入到一定体积的临床样本中。在一个实施方案中，将250μL至350μL的缓冲溶液和乙醇混合物加入到一定体积的临床样本中。
通过手动倒置、涡旋或本领域已知的其他方式将上述混合物与生物样本混合，然后通过以500g至2000g离心15秒至90秒而转移通过二氧化硅或聚丙烯过滤器。在一个实施方案中，采用15秒至45秒的离心。通过过滤器的材料被丢弃，并且留在过滤器上的DNA和RNA进行进一步的制备步骤。
一旦生物样本被消化，制备和洗涤生物样本的下一步骤可以包括将临床样本与至少氯化胍、乙醇、2-氨基-2-(羟甲基)-丙烷-1,3-二盐酸盐和乙二胺四乙酸二钠中的一者相互作用。在一个实施方案中，将含有25％至55％氯化胍的70％至100％乙醇的混合物以300μL至500μL的体积加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以500g至2000g离心15秒至90秒。通过过滤器的材料被丢弃。在另一个实施方案中，制备12mg/m3至790mg/m3的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和20mg/m3至2,000mg/m3的乙二胺四乙酸二钠的混合物，并以400μL至900μL的体积加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以500g至2000g离心15秒至60秒。通过过滤器的物质被丢弃。在又一个实施方案中，制备12mg/m3至790mg/m3的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和20mg/m3至2,000mg/m3的乙二胺四乙酸二钠的第二混合物，并以400μL至900μL的体积加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以500g至2000g离心30秒至180秒。在另一个实施方案中，将水加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以50g至2000g离心15秒至60秒。通过过滤器的材料是生物样本并被保留。
在一个实施方案中，将含有30％至47％氯化胍的80％至100％乙醇的混合物加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以500g至2000g离心15秒至60秒。在又一个实施方案中，将含有35％至45％氯化胍的90％至100％乙醇的混合物加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以500g至2000g离心15秒至45秒。通过过滤器的材料是生物样本并被保留。
在另一个实施方案中，制备25mg/m3至600mg/m3的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和50mg/m3至1,000mg/m3的乙二胺四乙酸二钠的混合物，并以200μL至500μL的体积加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以500g至2000g离心15秒至60秒。在另一个实施方案中，制备25mg/m3至600mg/m3的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和50mg/m3至1,000mg/m3的乙二胺四乙酸二钠的混合物，并以200μL至500μL的体积加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以500g至2000g离心15秒至60秒。在另一个实施方案中，制备25mg/m3至600mg/m3的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和50mg/m3至1,000mg/m3的乙二胺四乙酸二钠的混合物，并以200μL至500μL的体积加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以500g至2000g离心15秒至45秒。
在另一个实施方案中，制备25mg/m3至600mg/m3的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和50mg/m3至1,000mg/m3的乙二胺四乙酸二钠的第二混合物，并以400μL至900μL的体积加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以500g至2000g离心30秒至180秒。在又一个实施方案中，制备25mg/m3至600mg/m3的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和50mg/m3至1,000mg/m3的乙二胺四乙酸二钠的第二混合物，并以600μL至800μL的体积加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以500g至2000g离心30秒至180秒。在又一个实施方案中，制备25mg/m3至600mg/m3的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和50mg/m3至1,000mg/m3的乙二胺四乙酸二钠的第二混合物，并以600μL至800μL的体积加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以500g至2000g离心90秒至150秒。
在另一个实施方案中，将水加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以50g至2000g离心15秒至45秒。在另一个实施方案中，将水加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以1,500g至2,000g离心15秒至45秒。在另一个实施方案中，水是不含DNase/RNase的水。
消化生物样本进行到通过使生物样本与至少蛋白酶K、硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸、乙醇、2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和乙二胺四乙酸二钠中的一者相互作用来洗涤生物样本的步骤。在一个实施方案中，将4U至12U蛋白酶K加入到洗涤过的生物样本中，并在45℃至65℃中保持15分钟至60分钟。在一个实施方案中，将4U至8U蛋白酶K加入到洗涤的生物样本中，并在45℃至65℃中保持15分钟至60分钟。在另一个实施方案中，将4U至8U蛋白酶K加入到洗涤过的生物样本中，并在50℃至60℃中保持15分钟至60分钟。在另一个实施方案中，将4U至8U蛋白酶K加入到洗涤过的生物样本中，并在50℃至60℃中保持20分钟至40分钟。在另一个实施方案中，对于固体组织或复杂基质，培养进行1至3小时。在另一个实施方案中，将1至3体积的55％至85％硫氰酸胍和1％至20％N-月桂酰肌氨酸的混合物加入到所保持的生物样本中。在一个优选实施方案中，将1至2体积的55％至85％硫氰酸胍和1％至20％N-月桂酰肌氨酸加入到保持的生物样本中。在另一个优选实施方案中，将1至2体积的65％至75％硫氰酸胍和1％至10％N-月桂酰肌氨酸加入到保持的生物样本中。
在一个实施方案中，将55％至85％硫氰酸胍和1％至20％N-月桂酰肌氨酸的缓冲溶液与70％至100％乙醇溶液等体积混合。在一个实施方案中，将65％至75％硫氰酸胍和1％至10％N-月桂酰肌氨酸的缓冲溶液与70％至100％乙醇溶液等体积混合。在另一个实施方案中，将65％至75％硫氰酸胍和1％至10％N-月桂酰肌氨酸的缓冲溶液与90％至100％乙醇溶液等体积混合。在实施方案中，现在清洁生物样本并且准备好以从生物样本中消化并分离测试样品。
消化生物样本进行到通过将生物样本与至少55％至85％硫氰酸胍、1％至20％N-月桂酰肌氨酸、70％至100％乙醇、DNase I、2-氨基-2-(羟甲基)-丙烷-1,3-二盐酸盐和乙二胺四乙酸二钠中的一者相互作用来从生物样本中分离测试样品的步骤。在一个实施方案中，生物样本首先以≥10,000g离心1分钟。在另一个实施方案中，将离心的生物样本的上清液转移到新的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以≥10,000g离心1分钟。通过过滤器的材料是生物样本并被保留。
在另一个实施方案中，将1至3体积的70％至100％乙醇加入到25％至85％硫氰酸胍和1％至20％N-月桂酰肌氨酸的混合物中的生物样本中；将所得溶液通过手动倒置或涡旋或本领域已知的其他方法充分混合。在一个优选实施方案中，将1至2体积的90％至100％乙醇加入到65％至76％硫氰酸胍和1％至10％N-月桂酰肌氨酸的混合物中的临床样本中，并将所得溶液充分混合。
在另一个实施方案中，将所得溶液转移至二氧化硅或聚丙烯过滤器，并以10,000g至16,000g离心15至60秒。在一个优选实施方案中，将所得溶液离心15秒至45秒。通过过滤器的材料被丢弃。
在另一个实施方案中，将200μL至600μL的25％至85％硫氰酸胍和1％至20％N-月桂酰肌氨酸的混合物加入到二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并将过滤器以10,000g至16,000g离心15至60秒。在一个优选实施方案中，将65％至75％硫氰酸胍和1％至10％N-月桂酰肌氨酸加入到二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并将过滤器以10,000g至16,000g离心15至45秒。通过过滤器的材料被丢弃。
在另一个实施方案中，将1U至15U DNaseI加入到二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并在室温下保持10分钟至25分钟。在一个优选实施方案中，将3U至8U DNaseI加入到二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并在室温下保持10分钟至25分钟。在另一个优选实施方案中，将3U至8UDNaseI加入到二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并在室温下保持12分钟至20分钟。在另一个实施方案中，将200μL至700μL的25％至55％氯化胍和70％至99％乙醇的混合物加入到二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以10,000g至16,000g离心15至60秒。在一个优选实施方案中，将300μL至500μL的35％至45％氯化胍和95％至99％乙醇的混合物加入到二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以10,000g至16,000g离心15至45秒。在另一个实施方案中，将400μL至900μL的12mg/m3至790mg/m3的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和20mg/m3至2,000mg/m3的乙二胺四乙酸二钠的混合物加入到二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并在10,000g至16,000g下离心15至60秒。在一个实施方案中，将600μL至800μL的25mg/m3至600mg/m3的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和50mg/m3至1,000mg/m3的乙二胺四乙酸二钠的混合物加入到二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以10,000g至16,000g离心15至45秒。在另一个实施方案中，将200μL至700μL的12mg/m3至790mg/m3的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和20mg/m3至2,000mg/m3的乙二胺四乙酸二钠的混合物的第二混合物加入到二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以10,000g至16,000g离心60至180秒。在一个实施方案中，将300μL至500μL的25mg/m3至600mg/m3的2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和50mg/m3至1,000mg/m3的乙二胺四乙酸二钠的混合物的第二混合物加入到二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以10,000g至16,000g离心90至150秒。在另一个实施方案中，将水加入到相同的二氧化硅或聚丙烯过滤器中，并以10,000g至16,000g离心15秒至450秒。通过过滤器的材料是测试样品并被保留。
来自生物样本的测试样品可以任选地通过煮、用变性剂处理或在-70℃储存来进一步完成。在一个实施方案中，测试样品可以通过在100℃至120℃煮10分钟至30分钟来完成；在另一个实施方案中，测试样品可以通过在100℃至105℃下煮10分钟至20分钟来完成。在另一个实施方案中，测试样品可以通过用变性剂处理测试样品来完成，所述变性剂具有25％至50％的至少聚山梨醇酯20；聚山梨醇酯80；(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、聚乙二醇叔辛基苯基醚；和4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇叔辛基苯基醚中的一者。
在另一个实施方案中，测试样品可以通过在-70℃储存来完成。测试样品包含大RNA分子、小RNA分子、tRNA分子、rRNA分子、mRNA分子、变性和非变性RNA分子、微生物RNA分子、非微生物RNA分子，并且现在准备好进行使用液相色谱300从测试样品中分离并收集微生物RNA分子的步骤。
使用液相色谱从测试样品中粗过滤微生物RNA分子是通过将测试样品注入到液相色谱仪310的样品口中进行的。在一个实施方案中，注入体积为0.1mL至2mL。在一个实施方案中，注入体积为0.5至1.5mL。在液相色谱仪310内，使用被称为流动相的液体混合物通过泵以规定的流速将测试样品运送到多孔固定相柱上。该过程由计算机320控制。测试样品传统上由液相色谱仪310处理，以分离成具有相似性质的组分和关注的组分。典型地，测试样品的所有组分穿过液相色谱仪310到达废物管线。然而，在本公开的各种实施方案中，自动地或手动地，具有关注的组分的区域330被转移到收集容器用于进一步鉴定。在各种实施方案中，使用二极管阵列、UV-Vis或折射率检测器来检测微生物RNA形式的关注的组分330。没有关注的组分的区域340被检测为平整线(flat line)(“基线”)。
液相色谱仪从非微生物RNA分子中过滤微生物RNA分子，以通过减少然后增加流动相中有机缓冲剂相对于所述流动相中水性缓冲剂的量来分离并收集这些分子。在一个实施方案中，流动相中有机缓冲剂的量在20％至100％之间变化，如表2所示。
表2.用于分离并收集微生物RNA的流动相组成。
时间 ％水性缓冲剂 ％有机缓冲剂
0 60-80 20-40
1 50-70 30-50
16 40-60 40-60
22 30-50 50-70
22.5 20-40 60-80
23 0-20 80-100
24 0-20 80-100
25 60-80 20-40
27 60-80 20-40
在一个实施方案中，流动相中有机缓冲剂的量在30％与100％之间变化，如表3所示。
表3.用于分离并收集微生物RNA的流动相组成。
时间 ％水性缓冲剂 ％有机缓冲剂
0 60-70 30-40
1 55-65 35-45
16 35-45 55-65
22 30-40 60-70
22.5 25-35 65-75
23 0-10 90-100
24 0-10 90-100
25 60-70 30-40
27 60-70 30-40
在一些方面，当水性缓冲剂的百分比大于约40％，在一些方面大于约45％，在一些方面大于约50％，在一些方面大于约55％，和在一些方面大于约60％时，空隙体积在液相色谱流动相中洗脱。在一些方面，当有机缓冲剂的百分比小于约60％，在一些方面小于约55％，在一些方面小于约50％，在一些方面小于约45％，和在一些方面小于约40％时，空隙体积在液相色谱流动相中洗脱。
在一个实施方案中，由泵输送的液相色谱流动相的流速为0.5mL/min.3.5mL/min.。在一个实施方案中，由泵输送的液相色谱流动相的流速为1mL/min.至2.5mL/min.。在又一个实施方案中，由泵输送的液相色谱流动相的流速为1mL/min.至1.5mL/min.。
在一些方面，液体中流动相的流速为约0.5mL/min.至大约3.5mL/min.，在一些方面约为550μL/min.至约2mL/min.，在一些方面约为600μL/min.至约1mL/min.，并且在一些其他方面，约为650μL/min.至约850μL/min.。
流动相作为两种缓冲剂(一种是有机缓冲剂，另一种是水性缓冲剂)的混合物输送。在一个实施方案中，水性缓冲剂包括至少0.05至0.9M三乙基乙酸铵、磷酸、柠檬酸、碳酸氢铵、甲酸、乳酸、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸、马来酸、二乙醇胺、哌啶、乙醇胺和三乙醇胺中的至少一者。特别地，使用0.05M至0.5M的缓冲剂，该缓冲剂包括三乙基乙酸铵、甲酸、乳酸、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸、马来酸、三乙醇胺和哌啶中的至少一者；更优选使用三乙基乙酸铵、甲酸、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸、马来酸和三乙醇胺中的至少一者的0.05M至0.2M的水性缓冲溶液。
在另一个实施方案中，有机缓冲剂包括在至少5％至60％乙腈、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、丙酮和四氢呋喃中的一者中的0.05M至0.9M水性缓冲溶液的混合物；特别地，有机缓冲剂包括在7％至50％乙腈、甲醇、乙醇、1-丙醇和丙酮中的至少一者中的0.05M至0.5M水性缓冲溶液的混合物。在一个实施方案中，有机缓冲剂包括在10％至40％乙腈、甲醇和丙酮中的至少一者中的0.05M至0.5M水性缓冲溶液的混合物。
在根据各种实施方案的方法中，非极性化合物用作多孔固定相柱，其形式为聚合物珠、聚合物微球或聚合块。不管其精确形式如何，聚合物固定相柱本质上是多孔的，这意味着聚合物固定相柱的特征在于孔隙。固定相柱材料可以是商业上可获得的，并且是未涂覆的或涂覆有专门的聚合化合物，该聚合化合物被设计成覆盖珠或微球表面上的孔，以防止微生物RNA不可逆地与固定相柱材料相互作用。在固定相柱的外部结构内的是聚合物微球，其优选包括烷基化的无孔聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。固定相柱提供有8.0μm至50μm，优选8.0μm至25μm的微球粒径。固定相柱的所得孔径为
Figure BDA0003618248430000191
至
Figure BDA0003618248430000192
特别是
Figure BDA0003618248430000193
至
Figure BDA0003618248430000194
更优选
Figure BDA0003618248430000195
至
Figure BDA0003618248430000196
或
Figure BDA0003618248430000197
至
Figure BDA0003618248430000198
固定相柱可以具有4mm至30mm宽×40mm至150mm长的尺寸，优选5mm至10mm宽×40mm至100mm长的尺寸，甚至更优选7mm至9mm宽×40mm至60mm长的尺寸。根据一个实施方案，固定相柱可以在环境温度下操作，或者更优选地控制在20℃至27℃的温度下。
通过与流动相和固定相柱微球和孔的选择性相互作用，微生物RNA在固定相柱中过滤并与非微生物RNA分离。随着过滤和分离的进行，微生物和非微生物RNA在不同的时间从固定相柱中离开或洗脱，并被检测器检测，其中微生物RNA在柱的空隙体积中洗脱。在一个实施方案中，分离的微生物RNA的检测是用UV-Vis或二极管阵列检测器在200nm至220nm，特别是在203nm至217nm，更优选在205nm至215nm下完成，所述检测器在固定相柱出口处与液相色谱仪偶联。在另一个实施方案中，分离的微生物RNA的检测是用UV-Vis或二极管阵列检测器在250nm至270nm，特别是257nm至267nm，更优选255nm至265nm下完成的，所述检测器在固定相柱出口处与液相色谱仪偶联。在另一个实施方案中，分离的微生物RNA的检测是用折光率检测器完成的，所述检测器在固定相柱的出口处与液相色谱仪偶联，设定的折光率默认范围为0.75RI至2.00RI，特别是默认范围为0.9RI至1.90RI，更优选默认范围为1.00RI至1.75RI。
分离的微生物RNA在被称为色谱图的数据痕迹中被检测。分离的微生物RNA的示例性色谱图见图2和图3。在0分钟至3分钟的窗口中观察到的峰对应于分离的微生物RNA。如Ketterer等人(参见US 8,383,340)所公开的，非微生物RNA将在7分钟至15分钟的窗口内被检测到。当检测到微生物RNA时，含有关注的化合物(例如微生物RNA)的流动相从废物管线转移到样品收集瓶中，用于将来的鉴定或实验。
在一些方面，来自液相色谱的流动相样品收集包括空隙体积和对应于非微生物RNA相关峰的流动相的至少一部分。在一些方面，包含关注的化合物(例如，微生物RNA)的流动相可以在洗脱样品的一个或多个馏分中收集。在一些方面，当含有任何关注的化合物的流动相从柱中洗脱时，基于时间、体积或两者来收集洗脱样品的多个馏分。
在一些方面，在约5秒和约1分钟之间的时间段内，在一些方面，在约10秒至约45秒之间的时间段内，在一些方面，在约15秒至约30秒之间的时间段内，从柱中收集每个馏分。在一些方面，收集的每个馏分的体积在约100μL至约1mL之间，在一些方面在约125μL至约750μL之间，在一些方面在约150μL至约500μL之间，在一些方面在约175μL至约250μL之间。
在一些方面，空隙体积的至少一部分可以以至少1个馏分至最多约72个馏分之间、在一些方面以至少1个馏分至最多约36个馏分之间、在一些其他方面以至少1个馏分至最多约24个馏分之间的所需馏分的量收集。
在从液相色谱中以一个或多个馏分收集样品体积后，可以对一个或多个馏分中的每一者进行基因测序。
在一个实施方案中，使用液相色谱从从空隙体积中洗脱的一个或多个馏分中检测微生物RNA，其中使用基因测序从从空隙体积中洗脱的一个或多个馏分的至少一者中检测微生物RNA。
在一些方面，在基因测序之前对每个馏分进行脱水，其中将每个馏分脱水至约15μL至约500μL之间的体积，在一些方面，脱水至约20μL至约100μL之间的体积，在一些方面，脱水至约25μL至约75μL之间的体积，在一些优选的方面，脱水至约35μL至约65μL之间的体积。
在一些方面，可以将对照引入生物样品中，以相对于非微生物RNA标准化和/或监测微生物RNA。在一些方面，可以在消化生物样本的步骤之前、在生物样本被消化之后、随着测试样品引入到液相色谱中、或者当期望的样品进行基因测序时，将对照引入到生物样品中。优选地，选择对照，以便在空隙体积和正常样品分离体积内从柱中洗脱。对照可以选自任何不干扰微生物RNA或样品RNA的期望来源。在一些优选的方面，对照是合成衍生的RNA，诸如ERCC RNA对照，诸如购自ThermoFisher Scientific的ERCC RNA control AmbionTM。
使用根据本公开的各种实施方案，有可能同时分离并收集所有关注的微生物RNA，从而允许将来鉴定生物样本内所有活力的(活的)微生物物种，或者微生物RNA的后续结构阐明、定量或定性分析。本公开的各种实施方案允许从革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、细菌孢子、有包膜病毒、无包膜病毒、RNA病毒、真菌、酵母和原生动物中同时分离并收集微生物RNA。使用本公开的方法过滤、分离并收集的作为微生物RNA的测试样品中的示例性微生物物种见表4。
表4.通过从临床样本中分离并收集RNA来检测微生物物种。
Figure BDA0003618248430000211
Figure BDA0003618248430000221
图4示出了整体工作流程的一个实施方案的代表性框图，该整体工作流程并入了作为用于鉴定生物样本中微生物RNA的整体工艺的一部分的粗过滤方法。在410，从临床、生产或环境背景中采样并收集生物样本402。尽管生物样本可以根据设备位于其被采样的环境附近的各种实施方案进行处理，但是在其他实施方案中，生物样本402在420被运送到不同的设施以执行根据各种实施方案的过滤方法。通过各种实施方案，将生物样本转化为测试样品，以允许使用液相色谱分离并收集微生物RNA。在430，根据各种实施方案，在HPLC的空隙体积中产生包含分离并收集的微生物RNA的测试样品404。然后在440对仅含有微生物RNA的测试样品404进行测序，以鉴定测试样品中所有有活力的(活的)微生物物种。在其他实施方案中，440可以包括微生物RNA的结构阐明、定量或定性分析。来自生物样本的有活力的微生物物种的鉴定结果可以被收集在数据库450中，并通过用户界面460呈现或报告，用户界面460通过安全网络接口可访问的。
实施例
进行了使用液相色谱过滤微生物RNA和人类RNA的混合物的试验，随后制备用于基因测序的文库。使用的材料包括作为人RNA的通用人类参考(Thermofisher QS0639；批号244273)、作为微生物RNA的大肠杆菌总RNA(Thermofisher am 7940；批号2219538)、RoboSep柱、Wave Optimized A、Wave Optimized B、Wave Optimized C和超纯无核酸酶水(NFW)。
HPLC(Agilent 1260 Infinity II)设置为0.75mL/min.的恒定流速，在整个运行过程中，柱保持在大约75℃的温度，DAD设置为在260nm(带宽为1nm)处检测，馏分收集器设置为收集0:30与12分钟之间的15秒馏分，并注入50μL样品。HPLC被设置为具有表5所示的流动相梯度。
表5.流动相洗脱梯度(流速0.75mL/min.)。
时间 ％缓冲剂A ％缓冲剂B
0 62 38
1 60 40
16 40 60
22 34 66
22:30 30 70
23 0 100
25 62 38
通过用190μL冷冻NFW稀释全部10μL储备液，用超纯无核酸酶水将人RNA从1,000ng/μL稀释至50ng/μL。用NFW将大肠杆菌RNA稀释到10ng/μL，其包括两个步骤：(i)将10μL 1000ng/μL大肠杆菌RNA储备液稀释到90μL冷冻NFW中，得到100ng/μL的等分试样，和(ii)将10μL100ng/μL稀释水平稀释到90μL冷冻NFW中——得到10ng/μL的等分试样。将19μL的50ng/μL人类RNA(950ng)与5μL的10ng/μL大肠杆菌RNA(50ng)混合，以产生相对于人类RNA具有5％大肠杆菌RNA的样品。用76μL冷冻NFW使混合物为100μL。
然后在HPLC上过滤混合的RNA样品，其中通过将混合物样品铺在新的无菌PCR平板的位置A1收集馏分，并装载到保持在40℃的HPLC中。开始该方法，并将50μL样品(～500ng)注入到柱上。以15秒的间隔将0:30与12分钟之间的馏分收集在新的无菌PCR平板中(即每30秒收集2个馏分)。每15秒钟收集的每个馏分约为0.188mL。这个时间与基于采用该方案运行的RiboRubler高范围Ladder的～0-6000nt之间的大小一致。为样品获得了图4、图5A-5B中的色谱。如图5A-5B中每15秒馏分的色谱图所示，小峰在大约1.3、2.1和2.7分钟的保留时间在空隙体积中从柱中洗脱，而主峰在8分钟直到约12分钟后从柱中洗脱。
0:30与6分钟之间的峰具有低的RN吸光度。不希望受理论束缚，据信空隙体积中的这些馏分可能包括小RNA分子、RNA馏分、具有二级和三级特征的RNA分子和/或mRNA。在空隙体积之后(例如，在8至12分钟的保留时间内)，有两个大峰，其不希望被理论所束缚，其可能包括较大的mRNA转录物或rRNA转录物。
将另外50μL样品(～500ng)注入柱中来重复该方法。图6中的色谱图是针对重复样品获得的。图5和图6中的色谱图实际上是相同的，证实了该方法的可重复性。
然后在用Zymo Clean and Concentrate-5试剂盒定量RNA之前，浓缩收集的馏分。将时间在0:30与12分钟之间的15秒收集馏分中的两者(例如，0:30-0:45和0:45-1分钟，1-1:15和1:15-1:30等)合并到无菌、无核酸酶的5mL试管中，以提供约375μL的合并馏分。将750μL(2X馏分体积)的RNA结合缓冲剂加入到每个馏分中，然后通过摇动充分混合。向混合物中加入1.125μL的200标准酒精(1X馏分+缓冲剂体积)，然后通过摇动充分混合。然后将高达800μL的混合物应用到二氧化硅过滤器上，并以10,000x g旋转结合30秒，这需要3个步骤。结合所有RNA后，将400μL RNA制备缓冲剂应用到过滤器上，然后以10,000x g洗涤30秒。然后，在去除先前的流过物(flow through)后，将700μL RNA洗涤缓冲剂应用于过滤器，并以10,000x g洗涤30秒。倾倒流过物，然后将400μL RNA洗涤缓冲剂应用到过滤器上，以10,000x g洗涤1分钟。然后将该柱小心地转移到新鲜、无菌、无核酸酶的微量离心管中。一旦在新鲜的、相同标记的试管中，将15μL无核酸酶水应用到过滤器上，并且所有RNA以10,000x g洗脱1分钟。
对应于基因测序所得馏分的馏分浓度在表6中提供。
表6.HPLC馏分与测定馏分之间的馏分表。
Figure BDA0003618248430000251
Figure BDA0003618248430000261
然后使用Quanti-T RNA HS测定对洗脱的RNA馏分进行定量，该测定将6,766μLQuant-iT RNA缓冲剂加入到15mL锥形管中，然后将34μL Quant-iT RNA试剂加入到缓冲剂中，并通过涡旋混合10秒钟。将表6中每种测定馏分的3μL等分试样与柱12中的标准品一起铺板(3μL RNA输入)。然后在30秒的轨道振荡和2分钟的培养后，在Tecan infinite pro200平板阅读器上阅读平板。定量结果如表7所示。
表7.RNA定量结果。
Figure BDA0003618248430000271
如表7中所提供的，馏分的浓度在0.1-69.1ng/μL之间。这些浓度被用作文库制备的输入，以制备用于测序的RNA。将7μL具有1μL(15pg)合成ERCC内部对照掺料(spike)的纯化RNA输入到用于Illumina的NEBBEXT单细胞/低输入RNA文库制备方案，其具有用于Illumina的NEBBEXT多重寡核苷酸(96个独特的双指数引物对)，该方案概括地包括：(i)在用于稍后比较的位置制备7μL原始5％大肠杆菌RNA，(ii)在具有3.5μL预运行HPLC流过物和3.5μL来自Zymo Concentrator试剂盒的NFW的位置加入无模板对照(NTC)，(iii)馏分18和19各自具有1μL RNA输入物，并用NFW使其达到7μL，因为它们的浓度比其他馏分高得多，以及(iv)这两个馏分18和19与色谱图中的大峰对齐。在每个RNA样品中加入1μL的引物后，RT引物退火为RNA。然后使用15个循环的cDNA扩增和6个循环的文库PCR将引物RNA逆转录成cDNA。然后用Ampure XP珠将扩增的cDNA纯化两次以提高纯度。然后使用Quant-iT dsDNA1X测定对纯化的cDNA进行定量，其浓度如表8所示。
表8.扩增的cDNA的浓度。
Figure BDA0003618248430000281
Figure BDA0003618248430000291
定量后，对于每个样品将cDNA归一化为40ng输入(除了馏分1、馏分15和馏分23之外，因为它们的浓度不能输入该量，所以按照制造商方案加入全部体积)。然后将归一化的cDNA片段化并进行末端修复。然后将末端修复的cDNA与Illumina衔接子连接。然后用Ampure XP珠清理连接的cDNA以除去未连接的衔接子。纯化后，然后对于20-100ng cDNA输入用6个循环的文库PCR对cDNA进行PCR富集。PCR后，扩增的文库用Ampure XP珠纯化，然后用Quant-iT dsDNA 1X测定进行定量，归一化浓度见表8。
将每个样品与25ng的每个样品汇集(除了馏分23之外，因为它没有足够的输入，所以加入全部体积)。使用0.9x体积的Ampure XP珠对汇集的样品进行额外的纯化，以去除任何残留的杂质并浓缩样品。纯的汇集的样本的浓度为9.88ng/uL(预期大小为300bp时～50nm)。然后按照Immunia方案将该纯化的测序文库稀释并变性至加载浓度，并以150次循环V2高输出化学在NextSeq 550上使用表9中提供的索引(indices)进行测序。
表9.序列的索引。
Figure BDA0003618248430000292
Figure BDA0003618248430000301
在HPLC分馏之前，为每个单独的HPLC馏分以及原始样品创建了单端FASTQ文件。然后，通过并行进行质量过滤和FASTQ文件的序列注释，对所有FASTQ文件进行处理。使用手动管理的数据库对过滤后的读数进行注释。使用平台过滤所有数据库序列中的任何污染读数，该平台查询参考基因组核酸序列中常见污染读数，并屏蔽这样的区域以防止系统性的错误注释。完成后，对由微生物、智人和ERCC内部控制注释计数组成的数据框架进行整理，如表10所示。
表10.序列号读取计数。
Figure BDA0003618248430000311
Figure BDA0003618248430000321
原始样品和馏分1-23的原始智人读取计数示出在图7提供的条形图中，其示出了馏分11以下相对最小的智人读取计数。在馏分11以下相对缺乏智人读取计数增强了这些馏分中对应于空隙体积的微生物RNA的存在。
原始样品和馏分1-23的原始内标ERCC计数示出在图8中提供的条形图中，其示出了液相色谱洗脱液的分馏对于某些RNA进行了选择。直到馏分14，智人馏分相对消减。
观察到的微生物和智人注释计数通过在每个样品中观察到的ERCC序列计数进行归一化，并随后乘以因子1,000,000。然后提取计算的肠杆菌目和智人ERCC归一化计数，以计算原始样品和馏分1-23中每一者的肠杆菌目∶智人归一化计数的比率，如图9所示。图9的条形图示出了遍及每一馏分的ERCC与智人的比率对于微生物含量进行过滤，使得液相色谱基于微生物含量不排除。
原始样品和馏分1-23的微生物读数(每个条的顶部)和智人读数(每个条的底部)的相对丰度示出在图10提供的条形图中。注释读数的分布示出了空隙体积馏分中微生物读数的相对放大。具体地，馏分2中约5％的读数和馏分3中约8％的读数归因于微生物读数(大肠杆菌RNA)，其中原始样品中的微生物读数约为0.03％。与原始样品中1/1,000,000的相比，液相色谱的空隙体积输出有效地将来自测试样品的微生物RNA分子相对于宿主RNA分子扩增了约1/20至约1/10。本方法的某些实施方案的有效扩增允许在皮克(pictogram)至纳克范围的遗传材料中进行RNA检测。
实施方案
以下实施方案仅作为示例给出，并不旨在限制所附权利要求书中提供的要求保护的发明的范围。
一.一种用于从生物样本中过滤微生物RNA分子以分离微生物RNA的方法，该方法包括：
(a)获得生物样本；
(b)通过使试剂与样本相互作用来消化生物样本以产生测试样品；以及
(c)使用液相色谱从测试样品中的RNA分子混合物中粗过滤微生物RNA分子，以从测试样品中分离并收集微生物RNA分子。
二.根据实施方案一所述的方法，其中生物样本是哺乳动物样本。
三.根据实施方案一所述的方法，其中所述生物样本包括以下中的至少一种：大RNA分子、小RNA分子、tRNA分子、rRNA分子、mRNA分子、变性和非变性RNA分子、微生物RNA分子、非微生物RNA分子、基因组DNA分子、蛋白质分子和其他大分子。
四.根据实施方案三所述的方法，其中消化生物样本的步骤去除基因组DNA分子、蛋白质分子和其他大分子。
五.根据实施方案一所述的方法，其中微生物RNA分子包括真菌、病毒、原生动物、阿米巴原虫或细菌RNA。
六.根据实施例一所述的方法，其中获得生物样本的步骤在临床环境中使用无菌技术或防腐技术中的至少一者来执行。
七.根据实施方案一所述的方法，其中消化生物样本的步骤使用裂解试剂作为试剂。
八.根据实施方案一所述的方法，其中使用液相色谱的步骤包括将测试样品注入液相色谱仪的样品口。
九.根据实施方案八所述的方法，其中液相色谱仪通过减少然后增加流动相中有机缓冲剂相对于流动相中水性缓冲剂的量来分离微生物RNA分子。
十.根据实施方案九所述的方法，其中流动相中有机缓冲剂的量在30％至100％之间。
十一.根据实施方案八所述的方法，其中在液相色谱仪中在205nm至215nm的波长下检测微生物RNA分子。
十二.根据实施方案八所述的方法，其中在液相色谱仪中在255nm至265nm的波长下检测微生物RNA分子。
十三.根据实施方案八所述的方法，其中通过从废物管线转移流动相来收集液相色谱仪分离的微生物RNA分子。
十四.根据实施方案八所述的方法，其中液相色谱仪的流速为1mL/min.至2.5mL/min.。
十五.根据实施方案九所述的方法，其中水性缓冲剂包括至少0.05M至0.2M的三乙基乙酸铵、磷酸、柠檬酸、碳酸氢铵、甲酸、乳酸、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸、马来酸、二乙醇胺、哌啶、乙醇胺和三乙醇胺溶液中的一者。
十六.根据实施方案九所述的方法，其中有机缓冲剂包括在至少10％至40％乙腈、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、丙酮和四氢呋喃中的一者中的0.05M至0.2M水性缓冲溶液的混合物。
十七.根据实施方案七所述的方法，其中消化生物样本的步骤包括以下步骤：
(a)通过使生物样本与至少硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和乙醇中的一者相互作用来裂解生物样本；
(b)通过使生物样本与至少氯化胍、乙醇、2-氨基-2-(羟甲基)-丙烷-1,3-二盐酸盐和乙二胺四乙酸二钠中的一者相互作用来洗涤生物样本；
(c)通过使生物样本与至少蛋白酶K、硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸、乙醇、2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和乙二胺四乙酸二钠中的一者相互作用来清洁生物样本；
(d)通过使生物样本与至少55％至85％硫氰酸胍、1％至20％N-月桂酰肌氨酸、70％至100％乙醇、DNase I、2-氨基-2-(羟甲基)-丙烷-1,3-二盐酸盐和乙二胺四乙酸二钠中的一者相互作用而从生物样本中分离测试样品。
十八.根据实施方案十七所述的方法，其中裂解生物样本的步骤通过使生物样本与至少55％至85％硫氰酸胍、1％至20％N-月桂酰肌氨酸和70％至100％乙醇中的一者相互作用来完成。
十九.根据实施方案十七所述的方法，其中使生物样本与至少25％至55％氯化胍、70％至99％乙醇、12mg/m3至790mg/m3 2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和20mg/m3至2,000mg/m3乙二胺四乙酸二钠中的一者相互作用来完成洗涤生物样本的步骤。
二十.根据实施方案十七所述的方法，其中清洁生物样本的步骤通过使临床样品与至少4U至12U蛋白酶K、55％至85％硫氰酸胍、1％至20％N-月桂酰肌氨酸和70％至100％乙醇中的一者相互作用来完成。
二十一.根据实施方案十七所述的方法，其中从生物样本中分离测试样品的步骤通过使生物样本与至少1U至15U DNase I、25％至85％硫氰酸胍、1％至20％N-月桂酰肌氨酸、70％至100％乙醇、DNase I、12mg/m3至790mg/m3 2-氨基-2-(羟甲基)-丙烷-1,3-二盐酸盐和20mg/m3至2,000mg/m3中的一者相互作用来完成。
二十二.根据实施方案二十一所述的方法，其中从生物样本中分离测试样品的步骤通过以下步骤完成：煮测试样品、用变性剂处理测试样品或储存测试样品中的至少一者。
二十三.根据实施方案二十一所述的方法，其中从临床样本中分离测试样品的步骤通过在100℃至120℃煮测试样品10分钟至30分钟来完成。
二十四.根据实施方案二十二所述的方法，其中用变性剂处理测试样品的步骤通过使测试样品与25％至50％的至少聚山梨醇酯20；聚山梨醇酯80；(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、聚乙二醇叔辛基苯基醚；和4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇叔辛基苯基醚中的一者相互作用来完成。
二十五.根据实施方案八所述的方法，其中在0分钟至3分钟的洗脱时间检测液相色谱仪分离的微生物RNA分子。
二十六.一种通过从液相色谱方法的空隙体积中收集微生物RNA分子从至少哺乳动物单链核酸序列和微生物单链核酸序列中的一者的混合物中过滤微生物单链核酸序列的方法，其中微生物单链核酸序列是蛋白质合成的催化剂。
二十七.根据实施方案二十六所述的方法，其中空隙体积由色谱图中的初始时间段表示。
二十八.根据实施方案二十七所述的方法，其中初始时间段是0分钟至6分钟。
二十九.根据实施方案二十八所述的方法，其中空隙体积中的微生物RNA分子带正电荷。
三十.根据实施方案二十八所述的方法，其中空隙体积中的微生物RNA分子携带零净电荷。
三十一.根据实施方案二十八所述的方法，其中空隙体积中的微生物RNA分子具有1个核苷酸至280个核苷酸的大小。
三十二.一种用于从生物样本中过滤微生物RNA分子以分离微生物RNA的方法，该方法包括：
获得生物样本；
通过使试剂与样本相互作用来制备生物样本以产生测试样品；以及
使用液相色谱仪从测试样品中的RNA分子的混合物中粗过滤微生物RNA分子，以从液相色谱仪的空隙体积中的测试样品中分离并收集微生物RNA分子。
三十三.根据实施方案三十二所述的方法，其中生物样本是哺乳动物样本。
三十四.根据实施方案三十二所述的方法，其中生物样本包含以下至少一者：大RNA分子、小RNA分子、tRNA分子、rRNA分子、mRNA分子、变性和非变性RNA分子、微生物RNA分子、非微生物RNA分子、基因组DNA分子、蛋白质分子和其他大分子。
三十五.根据实施方案三十二所述的方法，其中制备生物样本的步骤纯化样本以改变遗传材料的相对特征。
三十六.根据实施方案三十五所述的方法，其中制备生物样本的步骤基本上不含遗传材料的有意生长。
三十七.根据实施方案三十四所述的方法，其中制备生物样本的步骤纯化样本以允许通过液相色谱过滤。
三十八.根据实施方案三十四所述的方法，其中制备生物样本的步骤纯化样品以去除基因组DNA分子、蛋白质分子和其他大分子。
三十九.根据实施方案三十二所述的方法，其中制备生物样本的步骤没有遗传材料的有意生长。
四十.根据实施方案三十二所述的方法，其中微生物RNA分子包括真菌、病毒、原生动物、阿米巴原虫或细菌RNA。
四十一.根据实施方案三十二所述的方法，其中获得生物样本的步骤在临床环境中使用无菌技术或防腐技术中的至少一者来进行。
四十二.根据实施方案三十二所述的方法，其中消化生物样本的步骤使用裂解试剂作为试剂。
四十三.根据实施方案三十二所述的方法，其中使用液相色谱的步骤包括将测试样品注入到液相色谱仪的样品口中。
四十四.根据实施方案四十三所述的方法，其中液相色谱仪通过减少然后增加流动相中有机缓冲剂相对于流动相中水性缓冲剂的量来分离微生物RNA分子。
四十五.根据实施方案四十四所述的方法，其中流动相中有机缓冲剂的量在30％至100％之间。
四十六.根据实施方案四十三所述的方法，其中在液相色谱仪中在205nm至215nm的波长下检测微生物RNA分子。
四十七.根据实施方案四十三所述的方法，其中在液相色谱仪中在255nm至265nm的波长下检测微生物RNA分子。
四十八.根据实施方案三十二所述的方法，其中通过从废物管线转移流动相，将液相色谱仪分离的微生物RNA分子收集在空隙体积中。
作为对本公开的某些方面的背景和理解，参考以下附件，它们通过引用并入于此：
1.Stewart,D.B.；Write,J.R.；Fowler,M.；McLimans,C.J.；Tokarev,V.；Amaniera,I.；Baker,O.；Wong,H.；Brabec,J.；Drucker,R.；Lamendella,R.“IntegratedMeta Omics Reveals a Fungus-Associated Bacteriome and Distinct FunctionalPathways in Clostridioides difficile Infection”,Clinical Science andEpidemiology,4(4),1-16.
2.Goswami,K.；Purtill,J.J.；Shope,A.J.；Wright,J.；Lamendella,R.“ShotgunMetatranscriptomics for PJI diagnosis:A Novel Prospective Investigation,2019Abstract submission,AAHKS Annual Meeting.
3.Goswami,K.；Purtill,J.J.；Shope,A.J.；Wright,J.；Lamendella,R.“ShotgunMetatranscriptomics for PJI diagnosis:A Novel Prospective Investigation,2019Slide deck presentation,AAHKS Annual Meeting.
4.Slide deck for CSI Compendium,Confidential Investor Presentation,unpublished work(2019).
本文已经描述了系统、装置和方法的各种实施方案。这些实施方案仅作为示例给出，并不旨在限制所要求保护的发明的范围。此外，应当理解，已经描述的实施方案的各种特征可以以各种方式组合，以产生许多附加的实施方案。此外，尽管各种材料、尺寸、形状、配置和位置等已经被描述用于所公开的实施方案，但是在不超出所要求保护的发明的范围的情况下，可以利用除了所公开的材料、尺寸、形状、配置和位置之外的其他材料、尺寸、形状、配置和位置。
相关领域的普通技术人员将认识到，本文的主题可以包括比上述任何单个实施方案中阐述的特征更少的特征。本文描述的实施方案并不意味着是对可以组合其主题的各种特征的方式的详尽呈现。因此，实施方案不是特征的互斥组合；相反，如本领域普通技术人员所理解的，各种实施方案可以包括从不同的单个实施方案中选择的不同的单个特征的组合。此外，除非另有说明，否则关于一个实施方案描述的元素可以在其他实施方案中实现，即使在这些实施方案中没有描述。
尽管从属权利要求在权利要求书中可能指的是与一个或多个其他权利要求的特定组合，但是其他实施方案也可以包括从属权利要求与每个其他从属权利要求的主题的组合，或者一个或多个特征与其他从属或独立权利要求的组合。本文提出了这样的组合，除非声明不意指具体的组合。
应该注意的是，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物，除非内容清楚地表明不是这样。因此，例如，包含“微生物物种”的临床样本可以包括两种或更多种微生物物种的混合物。还应该注意的是，术语“或”通常以其包括“和/或”的含义使用，除非内容另有明确规定。
任何通过引用对上述文献的并入都受到限制，因此不会引入与本文明确公开内容相反的主题。任何通过引用对上述文献的并入都受到进一步的限制，使得文献中包括的任何权利要求都不通过引用并入本文。任何通过引用对上述文献的并入还都受到进一步的限制，使得文献中提供的任何定义都不通过引入并入本文，除非明确包括在本文中。
出于解释权利要求的目的，除非权利要求中引用了具体术语“用于……的装置”或“用于……的步骤”，否则明确表示不援引35 U.S.C.112(f)的规定。

Claims (15)

1.一种用于增强对来自生物样本的微生物RNA分子的基因测序的方法，所述方法包括：
(a)获得所述生物样本；
(b)将所述生物样本制备为液相色谱的测试样品；
(c)使用液相色谱从所述测试样品中的RNA分子的混合物中粗过滤微生物RNA分子，以在所述液相色谱的两个或更多个馏分输出中分离并收集所述微生物RNA分子，其中所述两个或更多个馏分输出中的至少一者是所述液相色谱的空隙体积内的馏分输出；
(d)制备用于基因测序的一个或多个馏分输出，其中所述一个或多个馏分输出是所述空隙体积内的馏分输出；以及
(e)对所述一个或多个制备的输出进行基因测序，以检测来自所述生物样本的微生物RNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样本是哺乳动物样本。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样本包括以下中的至少一者：大RNA分子、小RNA分子、tRNA分子、rRNA分子、mRNA分子、变性和非变性RNA分子、微生物RNA分子、非微生物RNA分子、基因组DNA分子、蛋白质分子和其他大分子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中制备所述生物样本包括通过使试剂与所述生物样本相互作用来消化所述生物样本以产生所述测试样品。
5.根据权利要求4所述的方法，其中消化所述生物样本包括：
(i)通过使所述生物样本与至少硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和乙醇中的一者相互作用来裂解所述生物样本；
(ii)通过使所述生物样本与至少氯化胍、乙醇、2-氨基-2-(羟甲基)-丙烷-1,3-二盐酸盐和乙二胺四乙酸二钠中的一者相互作用来洗涤所述生物样本；
(iii)通过使所述生物样本与至少蛋白酶K、硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸、乙醇、2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和乙二胺四乙酸二钠中的一者相互作用来清洁所述生物样本；以及
(iv)通过使所述生物样本与至少55％至85％硫氰酸胍、1％至20％N-月桂酰肌氨酸、70％至100％乙醇、DNase I、2-氨基-2-(羟甲基)-丙烷-1,3-二盐酸盐和乙二胺四乙酸二钠中的一者相互作用来从所述生物样本中分离所述测试样品。
6.根据权利要求4所述的方法，其中消化所述生物样本移除基因组DNA分子、蛋白质分子和其他大分子。
7.根据权利要求5所述的方法，其中裂解所述生物样本通过使所述生物样本与至少55％至85％硫氰酸胍、1％至20％N-月桂酰肌氨酸和70％至100％乙醇中的一者相互作用来完成；其中洗涤所述生物样本通过使所述生物样本与至少25％至55％氯化胍、70％至99％乙醇、12mg/m3至790mg/m32-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二盐酸盐和20mg/m3至2,000mg/m3乙二胺四乙酸二钠中的一者相互作用来完成；其中清洁所述生物样本通过使临床样本与至少4U至12U蛋白酶K、55％至85％硫氰酸胍、1％至20％N-月桂酰肌氨酸和70％至100％乙醇中的一者相互作用来完成；并且其中从所述生物样本中分离所述测试样品通过使所述生物样本与至少1U至15UDNase I、25％至85％硫氰酸胍、1％至20％N-月桂酰肌氨酸、70％至100％乙醇、DNase I、12mg/m3至790mg/m3 2-氨基-2-(羟甲基)-丙烷-1,3-二盐酸盐和20mg/m3至2,000mg/m3乙二胺四乙酸二钠中的一者相互作用来完成。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物RNA分子包括真菌、病毒、原生动物、阿米巴原虫或细菌RNA。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述液相色谱通过在流动相中利用水性缓冲剂相对于有机缓冲剂的浓度梯度以约0.550mL/min至约2mL/min的流速分离所述微生物RNA分子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述水性缓冲剂包括至少0.05M至0.2M的三乙基乙酸铵、磷酸、柠檬酸、碳酸氢铵、甲酸、乳酸、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸、马来酸、二乙醇胺、哌啶、乙醇胺和三乙醇胺溶液中的一者。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述有机缓冲剂包括在至少10％至40％的乙腈、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、丙酮和四氢呋喃中的一者中的0.05M至0.2M水性缓冲溶液的混合物。
12.根据权利要求1所述的方法，其中来自所述液相色谱的两个或更多个输出馏分中的每一者在约10秒至约45秒之间的时间段内收集，并且具有在约125μL至约750μL之间的体积。
13.根据权利要求1所述的方法，其中使用液相色谱从所述测试样品中的RNA分子的混合物中过滤所述微生物RNA分子，而无需培养所述生物样本。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述液相色谱仪分离的所述微生物RNA分子在具有小于约6分钟且优选小于约4分钟的洗脱时间的空隙体积中进行检测。
15.根据权利要求1所述的方法，其中制备用于基因测序的一个或多个馏分输出包括：
(i)浓缩一个或多个馏分输出中的每一者，以提供一个或多个浓缩的馏分输出；
(ii)在所述一个或多个浓缩的馏分输出的每一者中引发RNA材料，以提供一个或多个引物RNA馏分输出；以及
(iii)将所述一个或多个引物RNA馏分输出中的每一者逆转录成一个或多个cDNA馏分输出。
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