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JP2022514010A - 核酸分子の回収率を改善するための方法、組成物、およびシステム - Google Patents

核酸分子の回収率を改善するための方法、組成物、およびシステム Download PDF

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Abstract

一態様では、本開示は、ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法であって（ａ）断片サイズ対照分子のサブセットを核酸分子に添加し第１のスパイクイン試料を産生するステップ（ｂ）第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ（ｃ）抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し処理された試料を産生するステップであって処理することが第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含むステップ（ｄ）処理された試料の少なくともサブセットを富化し富化された試料を産生するステップ（ｅ）富化された試料の少なくともサブセットをシーケンシングして複数の配列リードを生成するステップ（ｆ）配列リードを分析して断片サイズ対照分子のサブセットの断片サイズスコアを生成するステップならびに（ｇ）断片サイズスコアを断片サイズ閾値と比較するステップを含む方法を提供する。

Description

相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０１８年１２月２０日に提出された米国仮特許出願第６２／７８３，０４６号に基づく利益および優先権を主張する。
背景
現行の無細胞核酸（例えば、無細胞ＤＮＡまたは無細胞ＲＮＡ）のがん診断アッセイの方法は、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）、コピー数変異（ＣＮＶ）、融合体、およびインデル（すなわち、挿入または欠失）を含む腫瘍関連体細胞バリアントの検出に集中しており、これらは全てリキッドバイオプシーの主流の標的である。無細胞ＤＮＡにおけるサイズ分布および断片化パターンは、無細胞ＤＮＡの起源および疾患レベルに関する情報を提供することができるという証拠が増えつつある。無細胞ＤＮＡのサイズ分布および断片化パターンを体細胞突然変異のコーリングと組み合わせると、いずれかのアプローチ単独から得られる評価よりも包括的な腫瘍の状況の評価を得ることができる。
要旨
本開示は、断片サイズ分子を使用して核酸を分析するための方法、組成物、およびシステムを提供する。
一態様では、本開示は、ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法であって、ａ）断片サイズ対照分子のサブセットを無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；ｂ）第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；ｃ）抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；ｄ）処理された試料の少なくともサブセットを富化し、それによって富化された試料を産生するステップ；ｅ）富化された試料の少なくともサブセットをシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびにｆ）複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子のサブセットの複数の断片サイズスコアを生成するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、ｃ）の前に、断片サイズ対照分子の第２のサブセットを添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｄ）の前に、断片サイズ対照分子の第３のサブセットを添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｅ）の前に、断片サイズ対照分子の第４のサブセットを添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップを含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ポリヌクレオチドの試料である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ＤＮＡの試料および無細胞ＲＮＡの試料からなる群から選択される。一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ＤＮＡである。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡは、１ｎｇ～５００ｎｇの間である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の濃度は、１アトモル～１０ピコモルの間である。
別の態様では、本開示は、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含む断片サイズ対照分子のセットであって、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットが、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む、断片サイズ対照分子のセットを提供する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、識別子領域をさらに含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットは、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、識別子領域をさらに含む。一部の実施形態では、サブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。
一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じ長さの領域である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の第１の群における断片サイズ領域の長さは、断片サイズ対照分子の第２の群における断片サイズ領域の長さとは異なる。
一部の実施形態では、識別子領域は、断片サイズ領域の片側または両側に存在する。一部の実施形態では、識別子領域は分子バーコードを含む。
一部の実施形態では、複数の断片対照分子は、１つまたは複数のプライマー結合部位を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のプライマー結合部位は識別子領域に存在する。
一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、少なくとも２つの区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の第１のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、既定の断片サイズ対照分子の第２のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域のオリゴヌクレオチド配列と区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、または少なくとも１０００ｂｐである。一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは１０ｂｐ～１０００ｂｐの間である。
一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットの各サブセットは、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットの各サブセットは、等しくないモル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等しくないモル濃度で存在する。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等しくないモル濃度で存在する。一部の実施形態では、サブセットにおける断片サイズ対照分子の群の各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、サブセットにおける断片サイズ対照分子の群の各々は、等しくないモル濃度で存在する。
別の態様では、本開示は、無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子の分析における断片サイズバイアスを評価するための方法であって：ａ）断片サイズ対照分子の第１のサブセットをポリヌクレオチドの試料中の核酸分子に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；ｂ）第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；ｃ）断片サイズ対照分子の第２のサブセットを抽出された核酸に添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップ；ｄ）第２のスパイクイン試料の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第２のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；ｅ）断片サイズ対照分子の第３のサブセットを処理された試料に添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップ；ｆ）第３のスパイクイン試料の少なくともサブセットを富化し、それによって富化された試料を産生するステップ；ｇ）断片サイズ対照分子の第４のサブセットを富化された試料の少なくともサブセットに添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップ；ｈ）第４のスパイクイン試料をシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびにｉ）複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子の第１のサブセット、断片サイズ対照分子の第２のサブセット、断片サイズ対照分子の第３のサブセット、および／または断片サイズ対照分子の第４のサブセットの複数の断片サイズスコアを生成するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、複数の断片サイズスコアを複数の断片サイズ閾値と比較するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、複数の断片サイズスコアに基づいてポリヌクレオチドの試料中の核酸分子の分析を最適化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、複数の断片サイズスコアを使用して無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子の分析における断片サイズバイアスを補正するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、方法を、（ｉ）複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが複数の断片サイズ閾値の対応する断片サイズ閾値内にある場合、成功である；または（ｉｉ）複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが複数の断片サイズ閾値の対応する断片サイズ閾値内にない場合、失敗であると分類するステップをさらに含む。
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染を検出する方法であって、第１の試料および第２の試料の各々に関して：（ａ）断片サイズ対照分子のサブセットを添加して、第１のスパイクイン試料を生成するステップであって、第１の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットが、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットと区別され得る、ステップ；（ｂ）第１のスパイクインから核酸を抽出するステップ；（ｃ）抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；（ｄ）処理された試料の少なくともサブセットを富化するステップ；（ｅ）富化された試料の少なくともサブセットをシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびに（ｆ）複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子のサブセットの１つまたは複数の汚染スコアを生成するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、ｃ）の前に、断片サイズ対照分子の第２のサブセットを添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップであって、第１の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットが、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットと区別され得る、ステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｄ）の前に、断片サイズ対照分子の第３のサブセットを添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップであって、第１の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットが、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットと区別され得る、ステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｅ）の前に、断片サイズ対照分子の第４のサブセットを添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップであって、第１の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットが、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットと区別され得る、ステップをさらに含む。
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染を検出する方法であって、第１の試料および第２の試料の各々に関して：（ａ）断片サイズ対照分子の第１のサブセットを添加して、第１のスパイクイン試料を生成するステップであって、第１の試料に添加された断片サイズ対照分子の第１のサブセットが、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の第１のサブセットと区別され得る、ステップ；（ｂ）第１のスパイクインから核酸を抽出するステップ；（ｃ）断片サイズ対照分子の第２のサブセットを抽出された核酸に添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップであって、第１の試料に添加された断片サイズ対照分子の第２のサブセットが、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の第２のサブセットと区別され得る、ステップ；（ｄ）抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；（ｅ）断片サイズ対照分子の第３のサブセットを抽出された核酸に添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップであって、第１の試料に添加された断片サイズ対照分子の第３のサブセットが、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の第３のサブセットと区別され得る、ステップ；（ｆ）処理された試料の少なくともサブセットを富化するステップ；（ｇ）断片サイズ対照分子の第４のサブセットを抽出された核酸分子に添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップであって、第１の試料に添加された断片サイズ対照分子の第４のサブセットが、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の第４のサブセットと区別され得る、ステップ；（ｈ）富化された試料の少なくともサブセットをシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびに（ｉ）複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子のサブセットの１つまたは複数の汚染スコアを生成するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つまたは複数の汚染スコアを、少なくとも１つまたは複数の汚染閾値と比較するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、第１の試料を、（ｉ）汚染スコアの少なくとも１つまたは複数が１つまたは複数の汚染閾値の対応する汚染閾値内にない場合、第２の試料によって汚染されている；または（ｉｉ）汚染スコアの少なくとも１つまたは複数が１つまたは複数の汚染閾値の対応する汚染閾値内にある場合、第２の試料によって汚染されていないと分類するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、分画することは、第２のスパイクイン試料の少なくともサブセットの核酸分子を複数の分画化セットに分画することを含む。一部の実施形態では、複数の分画化セットは、第２のスパイクイン試料の核酸分子のエピジェネティック修飾のレベルに基づいて分画された第２のスパイクイン試料の核酸分子を含む。
一部の実施形態では、タグ付けすることは、タグのセットを核酸に付着させて、タグ付けされた核酸の集団を産生することであって、タグ付けされた核酸が１つまたは複数のタグを含む、ことを含む。一部の実施形態では、分画化に起因する複数の分画化セットの第１の分画化セットにおいて使用されるタグのセットは、複数の分画化セットの第２の分画化セットにおいて使用されるタグのセットとは異なる。一部の実施形態では、タグのセットは、アダプターの核酸へのライゲーションによって核酸に付着され、アダプターは１つまたは複数のタグを含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ポリヌクレオチドの試料である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ＤＮＡの試料および無細胞ＲＮＡの試料からなる群から選択される。一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ＤＮＡである。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡは、１ｎｇ～５００ｎｇの間である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の濃度は、１アトモル～１０ピコモルの間である。
別の態様では、本開示は、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含む断片サイズ対照分子のセットであって、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットが、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む、断片サイズ対照分子のセットを提供する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、識別子領域をさらに含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットは、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、識別子領域をさらに含む。一部の実施形態では、サブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。
一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じ長さの領域である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の第１の群における断片サイズ領域の長さは、断片サイズ対照分子の第２の群における断片サイズ領域の長さとは異なる。
一部の実施形態では、識別子領域は、断片サイズ領域の片側または両側に存在する。一部の実施形態では、識別子領域は分子バーコードを含む。
一部の実施形態では、複数の断片対照分子は、１つまたは複数のプライマー結合部位を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のプライマー結合部位は識別子領域に存在する。
一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、少なくとも２つの区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の第１のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、既定の断片サイズ対照分子の第２のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域のオリゴヌクレオチド配列とは区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、または少なくとも１０００ｂｐである。一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは１０ｂｐ～１０００ｂｐの間である。
一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットの各サブセットは、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットの各サブセットは、等しくないモル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等しくないモル濃度で存在する。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等しくないモル濃度で存在する。一部の実施形態では、サブセットにおける断片サイズ対照分子の群の各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、サブセットにおける断片サイズ対照分子の群の各々は、等しくないモル濃度で存在する。
別の態様では、本開示は、無細胞ポリヌクレオチドの試料のシーケンシングライブラリを産生するための方法であって：ａ）断片サイズ対照分子のサブセットを試料に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；ｂ）第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；ｃ）抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；ならびにｄ）処理された試料の少なくともサブセットを富化するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、ｃ）の前に、断片サイズ対照分子の第２のサブセットを添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｄ）の前に、断片サイズ対照分子の第３のサブセットを添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｅ）断片サイズ対照分子の第４のサブセットを添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットは、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、識別子領域をさらに含む。一部の実施形態では、サブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。
一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じ長さの領域である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の第１の群における断片サイズ領域の長さは、断片サイズ対照分子の第２の群における断片サイズ領域の長さとは異なる。
一部の実施形態では、識別子領域は、断片サイズ領域の片側または両側に存在する。一部の実施形態では、識別子領域は分子バーコードを含む。
一部の実施形態では、複数の断片対照分子は、１つまたは複数のプライマー結合部位を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のプライマー結合部位は識別子領域に存在する。
一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、少なくとも２つの区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の第１のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、既定の断片サイズ対照分子の第２のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域のオリゴヌクレオチド配列とは区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、または少なくとも５００ｂｐである。一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは１０ｂｐ～１０００ｂｐの間である。
一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットの各サブセットは、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットの各サブセットは、等しくないモル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等しくないモル濃度で存在する。
なお別の態様では、本開示は、（ａ）既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含む断片サイズ対照分子のセットであって、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットが、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む、断片サイズ対照分子のセット；および（ｂ）対象からのポリヌクレオチドの試料中の核酸分子のセットを含む、核酸の集団を提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じ長さの領域である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の第１の群における断片サイズ領域の長さは、断片サイズ対照分子の第２の群における断片サイズ領域の長さとは異なる。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、識別子領域をさらに含む。一部の実施形態では、識別子領域は、断片サイズ領域の片側または両側に存在する。一部の実施形態では、識別子領域は分子バーコードを含む。一部の実施形態では、複数の断片対照分子は、１つまたは複数のプライマー結合部位を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のプライマー結合部位は識別子領域に存在する。一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、少なくとも２つの区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の第１のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、既定の断片サイズ対照分子の第２のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域のオリゴヌクレオチド配列とは区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、または少なくとも１０００ｂｐである。一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは１０ｂｐ～１０００ｂｐの間である。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットの各サブセットは、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等しくないモル濃度で存在する。
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合に方法を実施する非一時的コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むか、またはそれにアクセスすることが可能なコントローラを含むシステムであって、方法が：ａ）断片サイズ対照分子のサブセットをポリヌクレオチドの試料中の核酸分子に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；ｂ）第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；ｃ）抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；ｄ）処理された試料の少なくともサブセットを富化し、それによって富化された試料を産生するステップ；ｅ）富化された試料の少なくともサブセットをシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびにｆ）複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子のサブセットの複数の断片サイズスコアを生成するステップを含む、システムを提供する。一部の実施形態では、方法は、ｃ）の前に、断片サイズ対照分子の第２のサブセットを添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｄ）の前に、断片サイズ対照分子の第３のサブセットを添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｅ）の前に、断片サイズ対照分子の第４のサブセットを添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ポリヌクレオチドの試料である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ＤＮＡの試料および無細胞ＲＮＡの試料からなる群から選択される。一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ＤＮＡである。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡは、１ｎｇ～５００ｎｇの間である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の濃度は、１アトモル～１０ピコモルの間である。
別の態様では、本開示は、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含む断片サイズ対照分子のセットであって、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットが、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む、断片サイズ対照分子のセットを提供する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、識別子領域をさらに含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットは、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、識別子領域をさらに含む。一部の実施形態では、サブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。
一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じ長さの領域である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の第１の群における断片サイズ領域の長さは、断片サイズ対照分子の第２の群における断片サイズ領域の長さとは異なる。
一部の実施形態では、識別子領域は、断片サイズ領域の片側または両側に存在する。一部の実施形態では、識別子領域は分子バーコードを含む。
一部の実施形態では、複数の断片対照分子は、１つまたは複数のプライマー結合部位を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のプライマー結合部位は識別子領域に存在する。
一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、少なくとも２つの区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の第１のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、既定の断片サイズ対照分子の第２のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域のオリゴヌクレオチド配列と区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、または少なくとも１０００ｂｐである。一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは１０ｂｐ～１０００ｂｐの間である。
一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットの各サブセットは、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットの各サブセットは、等しくないモル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等しくないモル濃度で存在する。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等しくないモル濃度で存在する。一部の実施形態では、サブセットにおける断片サイズ対照分子の群の各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、サブセットにおける断片サイズ対照分子の群の各々は、等しくないモル濃度で存在する。
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合に方法を実施する非一時的コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むか、またはそれにアクセスすることが可能なコントローラを含むシステムであって、方法が：ａ）断片サイズ対照分子の第１のサブセットをポリヌクレオチドの試料中の核酸分子に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；ｂ）第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；ｃ）断片サイズ対照分子の第２のサブセットを抽出された核酸に添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップ；ｄ）第２のスパイクイン試料の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第２のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；ｅ）断片サイズ対照分子の第３のサブセットを処理された試料に添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップ；ｆ）第３のスパイクイン試料の少なくともサブセットを富化し、それによって富化された試料を産生するステップ；ｇ）断片サイズ対照分子の第４のサブセットを富化された試料の少なくともサブセットに添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップ；ｈ）第４のスパイクイン試料をシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびにｉ）複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子の第１のサブセット、断片サイズ対照分子の第２のサブセット、断片サイズ対照分子の第３のサブセット、および／または断片サイズ対照分子の第４のサブセットの複数の断片サイズスコアを生成するステップを含む、システムを提供する。一部の実施形態では、方法は、複数の断片サイズスコアを複数の断片サイズ閾値と比較するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、複数の断片サイズスコアに基づいてポリヌクレオチドの試料中の核酸分子の分析を最適化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、複数の断片サイズスコアを使用してポリヌクレオチドの試料中の核酸分子の分析における断片サイズバイアスを補正するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、方法を、（ｉ）複数の断片サイズスコアの各々が複数の断片サイズ閾値の対応する断片サイズ閾値内にある場合、成功である；または（ｉｉ）複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが複数の断片サイズ閾値の対応する断片サイズ閾値内にない場合、失敗であると分類するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、複数の断片サイズスコアの少なくとも１つを、複数の汚染閾値の少なくとも１つと比較するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、試料を、（ｉ）複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが複数の汚染閾値の対応する汚染閾値内にない場合、別の試料によって汚染されている；または（ｉｉ）複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが複数の汚染閾値の対応する汚染閾値内にある場合、別の試料によって汚染されていないと分類するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ポリヌクレオチドの試料である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ＤＮＡの試料および無細胞ＲＮＡの試料からなる群から選択される。一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ＤＮＡである。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡは、１ｎｇ～５００ｎｇの間である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の濃度は、１アトモル～１０ピコモルの間である。
別の態様では、本開示は、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含む断片サイズ対照分子のセットであって、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットが、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む、断片サイズ対照分子のセットを提供する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、識別子領域をさらに含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットは、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、識別子領域をさらに含む。一部の実施形態では、サブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。
一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じ長さの領域である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の第１の群における断片サイズ領域の長さは、断片サイズ対照分子の第２の群における断片サイズ領域の長さとは異なる。
一部の実施形態では、識別子領域は、断片サイズ領域の片側または両側に存在する。一部の実施形態では、識別子領域は分子バーコードを含む。
一部の実施形態では、複数の断片対照分子は、１つまたは複数のプライマー結合部位を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のプライマー結合部位は識別子領域に存在する。
一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、少なくとも２つの区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の第１のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、既定の断片サイズ対照分子の第２のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域のオリゴヌクレオチド配列とは区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、または少なくとも１０００ｂｐである。一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは１０ｂｐ～１０００ｂｐの間である。
一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットの各サブセットは、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットの各サブセットは、等しくないモル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等しくないモル濃度で存在する。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等しくないモル濃度で存在する。一部の実施形態では、サブセットにおける断片サイズ対照分子の群の各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、サブセットにおける断片サイズ対照分子の群の各々は、等しくないモル濃度で存在する。
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合に方法を実施する非一時的コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むか、またはそれにアクセスすることが可能なコントローラを含むシステムであって、方法が：ａ）断片サイズ対照分子のサブセットを試料に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；ｂ）第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；ｃ）抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；ならびにｄ）処理された試料の少なくともサブセットを富化するステップを含む、システムを提供する。一部の実施形態では、方法は、ｃ）の前に、断片サイズ対照分子の第２のサブセットを添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｄ）の前に、断片サイズ対照分子の第３のサブセットを添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｅ）断片サイズ対照分子の第４のサブセットを添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ポリヌクレオチドの試料である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ＤＮＡの試料および無細胞ＲＮＡの試料からなる群から選択される。一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ＤＮＡである。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡは、１ｎｇ～５００ｎｇの間である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の濃度は、１アトモル～１０ピコモルの間である。
別の態様では、本開示は、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含む断片サイズ対照分子のセットであって、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットが、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む、断片サイズ対照分子のセットを提供する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、識別子領域をさらに含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットは、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、識別子領域をさらに含む。一部の実施形態では、サブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。
一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じ長さの領域である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の第１の群における断片サイズ領域の長さは、断片サイズ対照分子の第２の群における断片サイズ領域の長さとは異なる。
一部の実施形態では、識別子領域は、断片サイズ領域の片側または両側に存在する。一部の実施形態では、識別子領域は分子バーコードを含む。
一部の実施形態では、複数の断片対照分子は、１つまたは複数のプライマー結合部位を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のプライマー結合部位は識別子領域に存在する。
一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、少なくとも２つの区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の第１のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、既定の断片サイズ対照分子の第２のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域のオリゴヌクレオチド配列とは区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、または少なくとも１０００ｂｐである。一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは１０ｂｐ～１０００ｂｐの間である。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、合成分子である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、ＰＣＲ増幅によってアンプリコンとして生成される。
一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットの各サブセットは、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットの各サブセットは、等しくないモル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群の各群は、等しくないモル濃度で存在する。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等しくないモル濃度で存在する。一部の実施形態では、サブセットにおける断片サイズ対照分子の群の各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、サブセットにおける断片サイズ対照分子の群の各々は、等しくないモル濃度で存在する。
本開示はまた、上記の方法のいずれかを実施するためのキットも提供する。例示的なキットは：（ａ）既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含む断片サイズ対照分子のセットであって、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットが、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む、断片サイズ対照分子のセットを含む。
一部の実施形態では、方法またはシステムは、必要に応じて核酸分子の分析に関する情報、および／またはそれに由来する情報を含む報告書を作成するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステムおよび／または方法の結果を、インプットとして使用して報告書を作成する。報告書は、書面または電子フォーマットであり得る。例えば、本明細書に開示される方法またはシステムによって決定された核酸分子の分析に関する情報および／または分析に由来する情報を、そのような報告書に表示することができる。本明細書に開示される方法またはシステムは、試料が由来する対象または医療従事者などの第３者に報告書を伝達するステップをさらに含み得る。
本明細書に開示される方法の様々なステップまたは本明細書に開示されるシステムによって実行されるステップは、同じ時間もしくは異なる時間、および／または同じ地理的場所もしくは異なる地理的場所、例えば国で実行され得る。本明細書に開示される方法の様々なステップは、同じ人または異なる人々が実施することができる。
本開示のさらなる態様および利点は、本開示の単なる例示的な実施形態を示し、記載する以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかとなるであろう。認識されるように、本開示は、他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、いずれも本開示から逸脱することなく、様々な明白な点で、改変することが可能である。したがって、図面および説明は、本質的に例示的であり、制限的ではないと考えるべきである。
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、ある特定の実施形態を例証し、書かれている説明と共に本明細書で開示される方法、コンピュータ可読媒体、およびシステムのある特定の原理を説明するために役立つ。本明細書に提供される説明は、限定ではなく例として含まれる添付の図面と併せて読むとよりよく理解される。文脈により特に示していない限り、図面全体を通して類似の参照記号は類似の構成成分を特定すると理解される。同様に、図の一部または全ては、説明目的のための概略図であり得、実際の相対的なサイズまたは示された要素の位置を必ずしも描写していないと理解される。
図１Ａは、本開示の実施形態に従うポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法の概略図である。図１Ｂは、図１Ａに示す実施形態に従うポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法のフローチャート図である。 図１Ａは、本開示の実施形態に従うポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法の概略図である。図１Ｂは、図１Ａに示す実施形態に従うポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法のフローチャート図である。
図２Ａは、本開示の実施形態に従うポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法の概略図である。図２Ｂは、図２Ａに示す実施形態に従うポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法のフローチャート図である。 図２Ａは、本開示の実施形態に従うポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法の概略図である。図２Ｂは、図２Ａに示す実施形態に従うポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法のフローチャート図である。
図３は、本開示の一部の実施形態との使用に適した断片サイズ対照分子の概略図である。
図４は、本開示の一部の実施形態との使用に適した断片サイズ対照分子の概略図である。
図５は、本開示の一部の実施形態との使用に適したシステムの例の模式図である。
定義
本開示をより容易に理解するために、ある特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、本明細書を通して記載され得る。以下に記載される用語の定義が、参照により組み込まれる出願または特許における定義と一貫しない場合、本出願に記載される定義を使用して、用語の意味を理解すべきである。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によりそれ以外であることが明確に規定されない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「１つの（ａ）方法」への言及は、本明細書に記載のタイプのおよび／または本開示を読むことにより明らかになる１つまたは複数の方法および／またはステップなどを含む。
同様に、本明細書で使用される用語法は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、限定することを意図していないことも理解される。さらに、特に定義されていない限り、本明細書に使用される全ての科学技術用語は、本開示が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。方法、コンピュータ可読媒体、およびシステムの説明および特許請求では、以下の用語法およびその文法上の変化形は以下に記載の定義に従って使用される。
約：本明細書で使用される場合、目的の１つまたは複数の値または要素に適用される場合の「約」または「およそ」は、明記された参照値または要素と類似である値または要素を指す。ある特定の実施形態では、用語「約」または「およそ」は、特に明記されていない限り、または文脈からそれ以外であることが明らかでない限り、明記された参照値または要素のいずれかの方向に（より大きいまたはより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満以内に入る値または要素の範囲を指す（そのような数が、可能性がある値または要素の１００％を超える場合を除く）。
アダプター：本明細書で使用される場合、「アダプター」は、典型的に少なくとも部分的に二本鎖である短い核酸（例えば、約５００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、または約５０ヌクレオチド未満の長さ）を指し、アダプターは、所定の試料核酸分子の一方または両方の末端に付着することができる。アダプターは、両末端にアダプターが隣接する核酸分子の増幅を可能にするための核酸プライマー結合部位、および／またはシーケンシング適用、例えば様々な次世代シーケンシング（ＮＧＳ）適用のためのプライマー結合部位を含むシーケンシングプライマー結合部位を含み得る。アダプターはまた、フローセル支持体などに付着したオリゴヌクレオチドなどの捕捉プローブの結合部位も含み得る。アダプターはまた、本明細書に記載される核酸タグも含み得る。核酸タグは典型的には、核酸タグが所定の核酸分子のアンプリコンおよび配列リードに含まれるように、増幅プライマーおよびシーケンシングプライマー結合部位に対して配置される。同じまたは異なる配列のアダプターを、核酸分子のそれぞれの末端に連結することができる。一部の実施形態では、核酸タグが異なることを除いて、同じ配列のアダプターは、核酸分子のそれぞれの末端に連結される。一部の実施形態では、アダプターは、一方の末端が平滑末端であるかまたは１つもしくは複数の相補的ヌクレオチドによるテールを有する核酸分子に接合するために、本明細書に記載されるように一方の末端が平滑末端であるかまたはテールを有するＹ字形状のアダプターであり、Ｙ字形状のアダプターの他方の末端は、ハイブリダイズして二本鎖を形成しない非相補配列を含む。なお他の例としての実施形態では、アダプターは、分析される核酸分子に接合するための平滑またはテールを有する末端を含むベル形状のアダプターである。アダプターの他の例としては、ＴテールおよびＣテールアダプターが挙げられる。
増幅する：本明細書で使用される場合、核酸の文脈における「増幅する」または「増幅」は、典型的には、増幅産物またはアンプリコンが一般的に検出可能である少量のポリヌクレオチド（例えば、単一のポリヌクレオチド分子）から始まるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部の複数のコピーの産生を指す。ポリヌクレオチドの増幅は多様な化学的および酵素的プロセスを包含する。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない。
がんの型：本明細書で使用される場合、「がんの型」は、例えば組織病理学によって定義されたがんの型または亜型を指す。がんの型は、任意の従来の基準によって、例えば所定の組織における発生（例えば、血液のがん、中枢神経系（ＣＮＳ）、脳がん、肺がん（小細胞および非小細胞）、皮膚癌、鼻のがん、喉のがん、肝がん、骨がん、リンパ腫、膵がん、腸がん（ｂｏｗｅｌ ｃａｎｃｅｒ）、直腸がん、甲状腺がん、膀胱がん、腎臓がん、口腔がん、胃がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、腸がん（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、軟部組織がん、神経内分泌がん、消化器がん、頭頸部がん、婦人科がん、結腸直腸がん、尿路上皮がん、固形状態のがん、不均一性がん、均一性がん）、原発不明など、ならびに／または同じ細胞系列（例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、胆管癌、白血病、中皮腫、黒色腫、または神経膠芽腫）、ならびに／または、例えばＨｅｒ２、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ－１２５、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ホルモン受容体、およびＮＭＰ－２２などの、しかしこれらに限定されないがんマーカーを示すがんに基づいて定義することができる。がんはまた、ステージ（例えば、ステージ１、２、３、または４）、および原発性であるか続発性であるかによっても分類することができる。
無細胞核酸：本明細書で使用される場合、「無細胞核酸」は、細胞内に含有されていないもしくはそうでなければ細胞に結合してない核酸、または一部の実施形態では、インタクト細胞の除去後に試料中に残っている核酸を指す。無細胞核酸は、例えば対象からの体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）など）を供給源とする全ての封入されていない核酸を含み得る。無細胞核酸は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、循環ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、循環ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｃＲＮＡ）、および／またはこれらのいずれかの断片を含む、ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、およびそのハイブリッドを含む。無細胞核酸は、二本鎖、一本鎖、またはそのハイブリッドであり得る。無細胞核酸は、分泌または細胞死プロセス、例えば細胞の壊死、アポトーシスなどを通して体液に放出され得る。一部の無細胞核酸、がん細胞、例えば循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）から体液に放出される。他は、健康な細胞から放出される。ＣｔＤＮＡは、封入されていない腫瘍由来断片化ＤＮＡであり得る。無細胞核酸は、１つまたは複数のエピジェネティック修飾を有することができ、例えば無細胞核酸は、アセチル化、５－メチル化、および／またはヒドロキシメチル化され得る。
細胞核酸：本明細書で使用される場合、「細胞核酸」は、核酸がその後所定の分析プロセスの一部として除去される（例えば、細胞溶解を介して）場合であっても、少なくとも試料が対象から採取または収集された時点で、核酸が起源とする１つまたは複数の細胞内に配置されている核酸を意味する。
汚染：本明細書で使用される場合、用語「汚染」または「試料の汚染」は、１つの試料の別の試料による任意の化学的なまたはデジタルの汚染を指す。汚染は、試料間の液体の物理的キャリーオーバー（例えば、ピペッティング、試料調製またはシーケンサーシステムを介した自動液体取り扱い、増幅された材料の操作）；逆多重化アーチファクト（例えば、限定されたペアワイズハミング距離を有するベースコールエラー交絡試料インデックス；限定されたペアワイズ編集距離を有する挿入／欠失交絡試料インデックス）、および試薬不純物（例えば、別の試料インデックスを含有するオリゴによって汚染された（合成エラーのいずれかのキャリーオーバーを通して）試料インデックスオリゴ）を含むがこれらに限定されない多様な起源によるものであり得る。
汚染スコア：本明細書で使用される場合、「汚染スコア」は、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の存在を表す第１の試料中のスコアを指す。一部の実施形態では、１つの試料中の１つのサブセットにおいて使用されるサブセット識別子バーコードは、同じ試料の他のサブセットおよび他の試料のサブセットにおいて使用されるサブセット識別子とは異なり得る。これらの実施形態では、断片サイズ対照分子に存在するサブセット識別子バーコードの配列から、異なる第２の試料に属する断片サイズ対照分子の存在を識別することができる。一部の実施形態では、汚染スコアは、サブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の各型／群に対して特異的であり得るか（すなわち、サブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の異なる長さ／群に関して個別の汚染スコア）、または断片サイズ対照分子の異なる長さ／群を表す総スコアであり得る。一部の実施形態では、汚染スコアは、異なる第２の試料に属する断片サイズ対照分子の数に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、汚染スコアは、異なる第２の試料に属する断片サイズ対照分子のシーケンシングリードの数に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、試料の汚染スコアは、他の試料に属する断片サイズ対照分子のシーケンシングリードの数の、その試料に添加された断片サイズ対照分子のシーケンシングリードの数に対する画分または百分率に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、試料の汚染スコアは、他の試料に属する断片サイズ対照分子の分子の数の、その試料に添加された断片サイズ対照分子の分子の数に対する画分または百分率に基づいて推定することができる。これらの実施形態では、その分子に添加された断片サイズ対照分子は、断片サイズ対照分子のサブセット識別子バーコードから識別することができる。
汚染閾値：本明細書で使用される場合、「汚染閾値」は、試料中の核酸分子の分析において試料の汚染を評価するために使用される既定の閾値の値または範囲を指す。これらの閾値はまた、抽出、ライブラリ調製、富化、洗浄／浄化、およびシーケンシングなどのステップのいずれかにおいてアッセイを最適化するためにも使用することができる。一部の実施形態では、汚染閾値は、サブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の各型／群に関して特異的（すなわち、サブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の異なる長さ／群に関して個別の汚染閾値）であり得る。一部の実施形態では、汚染閾値は、サブセットにおける断片サイズ対照分子の異なる長さ／群の総閾値、またはアッセイで添加した１つもしくは複数のサブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の総閾値であり得る。一部の実施形態では、サブセットにおける各群は、特定の汚染閾値を有する。例えば、断片サイズ対照分子のセットは、２つのサブセット、サブセット１およびサブセット２を含む。各サブセットが２つの群、Ｇ１１およびＧ１２（サブセット１に関して）ならびにＧ２１およびＧ２２（サブセット２に関して）を含む場合には、４つの群の各々は、断片サイズ対照分子の回収率に基づいて汚染スコア（Ｓ）、Ｇ１１に関してＳ１１、Ｇ１２に関してＳ１２、Ｇ２１に関してＳ２１、およびＧ２２に関してＳ２２を有し得る。サブセットにおける各群は、個別の既定の汚染閾値を有し得る。この例では、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｔ２１、およびＴ２２はそれぞれ、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ２１、およびＧ２２の汚染閾値である。閾値は、百分率または画分に関する閾値であり得、閾値は、特定の閾値の値の代わりに閾値の範囲であってもよい。方法が成功であると考えられるためには、これらの汚染スコアの少なくとも１つは、その対応する汚染閾値内でなければならない。一部の実施形態では、複数の汚染スコアの各々が対応する汚染閾値内にある場合には、方法は実施に成功したと分類される。
カバレッジ：本明細書で使用される場合、用語「カバレッジ」、「総分子数」、または「総対立遺伝子数」は、互換的に使用される。それらは、所定の試料中の特定のゲノム位置でのＤＮＡ分子の総数を指す。
デオキシリボ核酸またはリボ核酸：本明細書で使用される場合、「デオキシリボ核酸」または「ＤＮＡ」は、糖部分の２’位に水素基を有する天然または改変ヌクレオチドを指す。ＤＮＡは典型的に、４つの型のヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）を含むヌクレオチドの鎖を含む。本明細書で使用される場合、「リボ核酸」または「ＲＮＡ」は、糖部分の２’位にヒドロキシル基を有する天然または改変ヌクレオチドを指す。ＲＮＡは典型的に、４つの型のヌクレオチド塩基；Ａ、ウラシル（Ｕ）、Ｇ、およびＣを含むヌクレオチドの鎖を含む。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、天然のヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを指す。ある特定のヌクレオチドの対は互いに相補的な様式で特異的に結合する（相補的塩基対形成と呼ばれる）。ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と対を形成し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と対を形成する。ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）と対を形成し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と対を形成する。第１の核酸鎖が第１の鎖のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドで構成される第２の核酸鎖に結合すると、２つの鎖は結合して二本鎖を形成する。本明細書で使用される場合、「核酸シーケンシングデータ」、「核酸シーケンシング情報」、「配列情報」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ゲノム配列」、「遺伝子配列」、または「断片配列、または「核酸シーケンシングリード」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の分子（例えば、全ゲノム、全トランスクリプトーム、エクソーム、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または断片）中のヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンまたはウラシル）の順序および同一性を示す任意の情報またはデータを指す。本教示は、キャピラリー電気泳動、マイクロアレイ、ライゲーションに基づくシステム、ポリメラーゼに基づくシステム、ハイブリダイゼーションに基づくシステム、直接または間接的ヌクレオチド識別システム、パイロシーケンシング、イオンまたはｐＨに基づく検出システム、および電子シグネチャーに基づくシステムを含むがこれらに限定されない、全ての利用可能な多様な技法、プラットフォーム、または技術を使用して得られる配列情報を企図すると理解すべきである。
ＤＮＡ配列：本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ配列」または「配列」は、「未加工配列リード」、および／または「コンセンサス配列」を指す。未加工配列リードは、ＤＮＡシーケンサーの出力であり、典型的には、例えば増幅後の同じ親分子の重複配列を含む。「コンセンサス配列」は、元の親分子の配列を表すことが意図される親分子の重複配列に由来する配列である。コンセンサス配列は、投票（ｖｏｔｉｎｇ）（配列の中で、各大多数のヌクレオチド、例えば所定の塩基位置で最も一般的に観察されるヌクレオチドは、コンセンサスヌクレオチドである）、または参照ゲノムと比較するなどの他のアプローチによって産生することができる。コンセンサス配列は、元の親分子を一意的または非一意的分子タグによってタグ付けすることによって産生することができ、これによりタグの追跡および／または配列リード内部情報の使用によって子孫配列（例えば、増幅後）の追跡が可能となる。タグ付けまたはバーコード化、およびタグまたはバーコードの使用の例は、例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０３６８７０８号、第２０１５／０２９９８１２号、第２０１６／００４０２２９号、および第２０１６／００４６９８６号に提供される。
エピジェネティック修飾：本明細書で使用される場合、「エピジェネティック修飾」は、その特定の核酸配列の調節および／または遺伝子発現に影響を及ぼす核酸分子におけるヌクレオチドの塩基の修飾を指す。修飾は、ヌクレオチドの塩基の化学修飾であり得る。一部の例では、修飾は、ヌクレオチドの塩基のメチル化であり得る。例えば、修飾はシトシンのメチル化であり得、それによって５－メチルシトシンをもたらす。
エピジェネティック状態：本明細書で使用される場合、「エピジェネティック状態」は、核酸分子のエピジェネティック修飾のレベル／程度を指す。例えば、エピジェネティック修飾がＤＮＡメチル化（またはヒドロキシメチル化）である場合には、エピジェネティック状態は、ＤＮＡ塩基（例えば、シトシン）におけるメチル化の存在もしくは非存在、または核酸配列におけるメチル化の程度（例えば、高度のメチル化、低度のメチル化、中程度のメチル化、または非メチル化核酸分子）を指し得る。エピジェネティック状態はまた、エピジェネティック修飾を有するヌクレオチドの数も指し得る。例えば、エピジェネティック修飾がＤＮＡメチル化である場合には、エピジェネティック状態はまた、核酸分子のメチル化ヌクレオチドの数を指し得る。
富化された試料：本明細書で使用される場合、「富化された試料」は、目的の特定の領域が富化されている試料を指す。試料は、目的の領域を選択的に増幅することによって、または二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡプローブ（例えば、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのプローブ）もしくは目的の核酸分子にハイブリダイズすることができる一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡプローブ（例えば、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）プローブ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ）を使用することによって富化することができる。一部の実施形態では、富化された試料は、富化される処理された試料のサブセットであって、富化される処理された試料のサブセットが、無細胞ポリヌクレオチドの試料、ならびに断片サイズ対照分子の第１および／または第２のサブセットからの核酸分子を含有する、サブセットを指す。他の実施形態では、富化された試料は、富化される第３のスパイクイン試料のサブセットであって、富化される第３のスパイクイン試料のサブセットが、無細胞ポリヌクレオチドの試料からの、ならびに断片サイズ対照分子の第１、第２、および／または第３のサブセットからの核酸分子を含有する、サブセットを指す。
第１のスパイクイン試料：本明細書で使用される場合、「第１のスパイクイン試料」は、断片サイズ対照分子の第１のサブセットが、対象からの無細胞ポリヌクレオチドの試料に添加されている試料である。
第４のスパイクイン試料：本明細書で使用される場合、「第４のスパイクイン試料」は、断片サイズ対照分子の第４のサブセットが、富化された試料のサブセットに添加されている試料を指す。
断片サイズバイアス：本明細書で使用される場合、「断片サイズバイアス」は、アッセイにおいて分析される核酸分子の断片の長さまたはサイズにおける任意の人為的バイアスを指す。アーチファクトバイアスは、オペレーターの取り扱いまたはアッセイに使用した試薬および／もしくはステップが原因であり得る。このバイアスは、健康な対象と疾患を有する対象の間で観察される断片サイズの真の生物学的バイアスを含まない。アッセイは、液体の取り扱い、抽出、ライブラリ調製、富化、洗浄／浄化、およびシーケンシングなどの、しかしこれらに限定されない１つまたは複数のステップを含み得る。一部の実施形態では、試料毎に異なる断片サイズバイアスが存在し得る。反応条件およびこれらのステップの各々の手順に基づいて、特定の断片サイズに属する核酸分子の回収率はバイアスを受け得る。フラグメントーム分析では、特定のサイズのｃｆＤＮＡ分子の正確な定量的測定を有することは、無細胞ＤＮＡの断片長分布および断片化パターンの推定において有用である。アッセイにおける断片サイズバイアスを推定することによって、アッセイワークフローにおける各ステップによって導入される断片サイズバイアス（人為的バイアス）を補正し、ｃｆＤＮＡ分子の元の断片サイズ分布（真の生物学的バイアスを反映する）のより良好な推定値を有することができる。
断片サイズ対照分子：本明細書で使用される場合、「断片サイズ対照分子」は、試料中の核酸分子の分析を評価および／または最適化するためにポリヌクレオチドの試料に添加される核酸分子のセットを指す。断片サイズ対照分子は、２つの領域、断片サイズ領域および識別子領域を有し得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、断片サイズ領域のみからなる。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、断片サイズ領域および識別子領域の両方を有し得る。断片サイズ対照分子のセットを、断片サイズ対照分子のサブセットに分類することができ、断片サイズ対照分子の各サブセットを、断片長分布、ＱＣ指標、ならびに／またはポリヌクレオチド試料の抽出、ライブラリ調製、富化、および／もしくはシーケンシングのいずれかのステップにおける試料の汚染を評価するために、アッセイにおける１つまたは複数の異なるステップで添加することができる。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子を使用して、試料中のポリヌクレオチドの元の末端がアッセイワークフローを通してどのように良好に保存されているかを推定することができる。これらの断片サイズ対照分子の長さは既定であり、無細胞ＤＮＡの天然のサイズ分布を模倣することができる。断片サイズ対照分子の各サブセットは、断片サイズ領域の長さに基づいて断片サイズ対照分子の群にさらに分類することができ、各群は異なる長さの断片サイズ領域を有し得る。例えば、断片サイズ対照分子のサブセットを断片サイズ領域の長さに基づいて３つの群に分類することができ、第１の群は、長さ１２０ｂｐの断片サイズ領域を有し得、第２の群は、長さ１６０ｂｐの断片サイズ領域を有し得、第３の群は、長さ３２０ｂｐの断片サイズ領域を有し得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、合成分子であり得、すなわち酵素を使用してまたは使用せずにｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができる。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、天然に存在しない核酸配列を有し得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、天然に存在する核酸配列を有し得る。一部の実施形態では、任意のゲノム、プラスミド、もしくはベクター、またはその一部における特定の領域（すなわち、特定の長さの）の増幅を介して生成されたアンプリコンを、断片サイズ対照分子として使用することができる。一部の実施形態では、プラスミド、ベクター、または任意のゲノムを、制限酵素を使用して消化することができ、消化産物を、断片サイズ対照分子として使用することができる。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、非ヒトゲノムに対応する核酸配列を有し得る。例えば、これらの分子は、（ｉ）ラムダファージＤＮＡの領域に対応する配列、（ｉｉ）天然に存在しない配列、および／または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組合せのいずれかを有し得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、天然に存在しないヌクレオチドアナログを含み得る。
断片サイズ領域：本明細書で使用される場合、用語「断片サイズ領域」は、断片サイズ対照分子の長さを表す断片サイズ対照分子の領域を指す。断片サイズ対照分子の各群は、断片サイズ領域の長さが異なる。例えば、断片サイズ対照分子のサブセットを、断片サイズ領域の長さに基づいて３つの群に分類することができ、第１の群は、長さ１２０ｂｐの断片サイズ領域を有し得、第２の群は、長さ１６０ｂｐの断片サイズ領域を有し得、第３の群は、長さ３２０ｂｐの断片サイズ領域を有し得る。断片サイズ領域の長さは１０ｂｐ～１０００ｂｐの間であり得る。
断片サイズスコア：本明細書で使用される場合、「断片サイズスコア」は、特定の群および特定のサブセットに属する断片サイズ対照分子の回収率を表すスコアを指す。断片サイズ対照分子および断片サイズ対照分子が属するサブセットの同一性は、バーコードの使用を通して維持される。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定の群および特定のサブセットに属する断片サイズ対照分子の数に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定の群および特定のサブセットに属する断片サイズ対照分子のシーケンシングリードの数に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定のサブセットにおける特定の群に関して推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、あらゆるサブセットにおける群の各々に関して推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定のサブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の総スコア（すなわち、サブセット内の断片サイズ対照分子を表す全ての単一スコアに関して）、またはアッセイの１つもしくは複数のステップで添加された断片サイズ対照分子の総スコア（すなわち、アッセイで添加した１つまたは複数のサブセットにおける断片サイズ対照分子を表す単一スコア）であり得る。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定のステップで添加された断片サイズ対照分子のサブセットの量と、異なるステップで添加された断片サイズ対照分子の別のサブセットの量との差として測定することができ、一部の実施形態では、量は、質量（例えば、ｆｇ、ｐｇ、ｎｇ、μｇ）、シーケンシングリードの数または断片サイズ分子の数（サブセットに属する、または特定の群に属する）のいずれかに関する量であり得る。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、断片サイズ対照分子（サブセットに属する、または特定の群に属する）の回収率（画分または百分率）として測定することができ、回収率は、試料に添加された特定のサブセット内の断片サイズ対照分子の相対的存在量のオルトゴナル測定を利用して計算することができる。一部の実施形態では、オルトゴナル測定は、ゲル電気泳動、ｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、またはＰＣＲフリーシーケンシングから得ることができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定の長さの断片サイズ対照分子の量と、異なる長さの断片サイズ対照分子の量との差として測定することができる。
断片サイズ閾値：本明細書で使用される場合、「断片サイズ閾値」は、試料中の核酸分子の分析における断片サイズバイアスを評価するために使用される既定の閾値の値または範囲を指す。これらの閾値を使用して、抽出、ライブラリ調製、富化、洗浄／浄化、およびシーケンシングなどのステップのいずれかにおける任意の断片長分布を補正することもできる。一部の実施形態では、断片サイズ閾値は、特定のサブセットにおける特定の群に関して推定することができる。一部の実施形態では、サブセットにおける各群は、特定の断片サイズ閾値を有する。一部の実施形態では、断片サイズ閾値は、あらゆるサブセットにおける群の各々に関して推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズ閾値は、特定のサブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の総閾値（すなわち、サブセット内の断片サイズ対照分子の全ての単一閾値に関して）、またはアッセイの１つもしくは複数のステップで添加された断片サイズ対照分子の総閾値（すなわち、アッセイで添加した１つまたは複数のサブセットにおける断片サイズ対照分子の単一閾値）であり得る。例えば、断片サイズ対照分子のセットは、２つのサブセット、サブセット１およびサブセット２を含む。各サブセットが２つの群、Ｇ１１およびＧ１２（サブセット１に関して）ならびにＧ２１およびＧ２２（サブセット２に関して）を含む場合には、４つの群の各々は、断片サイズ対照分子の回収率に基づいて断片サイズスコア（Ｓ）、Ｇ１１に関してＳ１１、Ｇ１２に関してＳ１２、Ｇ２１に関してＳ２１、およびＧ２２に関してＳ２２を有し得る。サブセットにおける各群は、個別の既定の断片サイズ閾値を有し得る。この例では、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｔ２１、およびＴ２２はそれぞれ、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ２１、およびＧ２２の断片サイズ閾値である。閾値は、百分率または画分に関する閾値であり得、閾値は、特定の閾値の値の代わりに閾値の範囲であり得る。方法が成功であると考えられるためには、これらの断片サイズスコアの少なくとも１つは、その対応する断片サイズ閾値内でなければならない。一部の実施形態では、複数の断片サイズスコアの各々が対応する断片サイズ閾値内にある場合には、方法は実施に成功したと分類される。
ゲノム領域：本明細書で使用される場合、「ゲノム領域」は、ゲノム、例えば全ゲノム、染色体、遺伝子、またはエクソンの任意の領域（例えば、塩基対位置の範囲）を指す。ゲノム領域は、連続または不連続領域であり得る。「遺伝子座」（または「座」）は、ゲノム領域の一部または全体（例えば、遺伝子、遺伝子の一部、または遺伝子の単一ヌクレオチド）であり得る。
識別子領域：本明細書で使用される場合、「識別子領域」は、断片サイズ対照分子を他の断片サイズ対照分子から区別するために使用される断片サイズ対照分子の領域を指す。識別子領域はまた、１つのサブセットからの断片サイズ対照分子を、別のサブセットからの断片サイズ対照分子と区別するためにも使用される。識別子領域は、分子バーコードを有し得る。識別子領域は、断片サイズ領域の片側または両側に存在し得る。識別子領域は、連続または不連続のいずれかであり得る。分子バーコードは、断片サイズ対照分子の識別子として役立つ。識別子領域は、１つまたは複数のプライマーの結合を容易にする追加の領域（プライマー結合部位）を有し得る。一部の実施形態では、識別子領域はまた、断片サイズ対照分子が次世代シーケンサー（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサー）のフローセル表面に付着するのを可能にする追加のフローセル結合部位、例えばＰ５およびＰ７も有し得る。一部の実施形態では、識別子領域は、（ｉ）分子識別子バーコード、例えば各断片サイズ対照分子を識別し、１つの断片サイズ対照分子を別の断片サイズ対照分子と識別するために使用されるバーコード、および（ｉｉ）サブセット識別子バーコード、例えば断片サイズ対照分子が属するサブセットを識別するために使用されるバーコード（すなわち、断片サイズ対照分子がサブセット１またはサブセット２のいずれに属するか）として作用するバーコードを含む。サブセット識別子バーコードは、サブセットにおける全ての断片サイズ対照分子に関して同じであってもよく、１つのサブセットのサブセット識別子バーコードは、他のサブセットのサブセット識別子バーコードとは異なっていてもよい。一部の実施形態では、１つの試料中の１つのサブセットのサブセット識別子バーコードは、他の試料中の対応するサブセットのサブセット識別子バーコードとは異なり得る。例えば、断片サイズ対照分子を使用して試料の汚染を評価する場合、１つのサブセットのサブセット識別子バーコードは、同じフローセル／バッチ内の全ての他の試料において使用されるその対応するサブセットのサブセット識別子バーコードとは異なる。一部の実施形態では、識別子領域は、１つの試料の断片サイズ対照分子を他の試料の断片サイズ対照分子と区別するための試料インデックス、およびシーケンサーのフローセルに付着させるための配列を含み得る。例えば、富化ステップの後に添加される断片サイズ対照分子のサブセットの識別子領域は、試料インデックス配列を含み得る。一部の実施形態では、識別子領域を、ライゲーションを介して断片サイズ領域に付着させることができる。一部の実施形態では、識別子領域を、ＰＣＲを介して断片サイズ領域に付加することができる。
突然変異：本明細書で使用される場合、「突然変異」は、公知の参照配列からの変異を指し、例えば単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）などの突然変異、および挿入または欠失（インデル）を含む。突然変異は、生殖系列または体細胞突然変異であり得る。一部の実施形態では、比較目的のための参照配列は、試験試料を提供する対象の種の野生型ゲノム配列、典型的にはヒトゲノムである。
新生物：本明細書で使用される場合、用語「新生物」および「腫瘍」は互換的に使用される。それらは、対象における細胞の異常な成長を指す。新生物または腫瘍は、良性、潜在的に悪性、または悪性であり得る。悪性腫瘍は、がんまたはがん性腫瘍と呼ばれる。
次世代シーケンシング：本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング」または「ＮＧＳ」は、従来のサンガーおよびキャピラリー電気泳動に基づくアプローチと比較して増加したスループットを有し、例えば何十万もの比較的小さい配列リードを一度に生成する能力を有するシーケンシング技術を指す。次世代シーケンシング技法の一部の例としては、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、およびハイブリダイゼーションによるシーケンシングが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、次世代シーケンシングは、単一分子をシーケンシングすることが可能な機器の使用を含む。
核酸タグ：本明細書で使用される場合、「核酸タグ」は、核酸を、異なる試料からの核酸（例えば、試料インデックスを表す）または同じ試料中の異なる核酸分子（例えば、分子バーコードを表す）、異なる型の核酸、または異なる処理を受けている核酸と区別するために使用される短い核酸（例えば、約５００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約５０ヌクレオチド未満、または約１０ヌクレオチド未満の長さ）を指す。核酸タグは、既定の、固定された、ランダムでない、ランダムな、またはセミランダムなオリゴヌクレオチド配列を含む。そのような核酸タグを使用して、異なる核酸分子または異なる核酸試料またはサブサンプルを標識することができる。核酸タグは、一本鎖、二本鎖、または少なくとも部分的に二本鎖であり得る。核酸タグは、必要に応じて同じ長さまたは多様な長さを有する。核酸タグは、１つもしくは複数の平滑末端を有する二本鎖分子を含み、５’もしくは３’一本鎖領域（例えば、オーバーハング）を含み、および／または所定の分子内の他の位置に１つもしくは複数の他の一本鎖領域を含み得る。核酸タグは、他の核酸（例えば、増幅および／またはシーケンシングされる試料核酸）の一方の末端または両方の末端に付着させることができる。核酸タグを復号して、所定の核酸の起源試料、形態、または処理などの情報を明らかにすることができる。例えば、核酸タグを使用して、異なる分子バーコードおよび／または試料インデックスを有する核酸を含む複数の試料のプールおよび／または並行処理を可能にすることもでき、この場合、その後、核酸タグを検出すること（例えば、読み取ること）によって核酸をデコンボリューションする。核酸タグ（分子バーコード）はまた、識別子（例えば、分子識別子、試料識別子）とも呼ばれ得る。加えてまたはあるいは、核酸タグを分子識別子として使用することができる（例えば、同じ試料またはサブサンプル中の異なる分子または異なる親分子のアンプリコンを区別するために）。これは、例えば、所定の試料中の異なる核酸分子を一意的にタグ付けすること、またはそのような分子を非一意的にタグ付けすることを含む。非一意的にタグ付けする適用の場合、有限数のタグ（すなわち、分子バーコード）を使用して各核酸分子をタグ付けすることができ、その結果、異なる分子を、少なくとも１つの分子バーコードと組み合わせたそれらの内因性配列情報（例えば、選択された参照ゲノムにそれらがマッピングされる開始および／もしくは終止位置、配列の一方もしくは両方の末端の部分配列、および／または配列の長さ）に基づいて区別することができる。典型的には、任意の２つの分子が同じ内因性配列情報（例えば、開始および／または終止位置、配列の一方もしくは両方の末端の部分配列、および／または長さ）を有し、同じ分子バーコードも有し得る確率が低くなるように（例えば、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．１％未満の可能性）、十分な数の異なる分子バーコードを使用する。
分画化：本明細書で使用される場合、「分画化」および「エピジェネティック分画化」は、互換的に使用される。この用語は、核酸分子を、核酸分子の特徴（例えば、エピジェネティック修飾のレベル／程度）に基づいて分離または分別することを指す。分画化は、分子の物理的分画化であり得る。分画化は、エピジェネティック修飾のレベル（すなわち、エピジェネティック状態）に基づいて、核酸分子を群またはセットに分離することを伴い得る。例えば、核酸分子のメチル化のレベルに基づいて核酸分子を分画することができる。一部の実施形態では、分画化のために使用される方法およびシステムは、その全体が参照によって組み込まれるＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６８３２９号に見出され得る。
分画化セット：本明細書で使用される場合、「分画化セット」は、核酸分子の結合剤に対する示差的な結合親和性に基づいてセット／群に分画された核酸分子のセットを指す。結合剤は、エピジェネティック修飾を有するヌクレオチドを含む核酸分子に優先的に結合する。例えば、エピジェネティック修飾がメチル化である場合、結合剤は、メチル結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質であり得る。一部の実施形態では、分画化セットは、特定のレベル／程度のエピジェネティック修飾（すなわち、エピジェネティック状態）に属する核酸分子を含み得る。例えば、核酸分子を３つのセット：高メチル化分画化セットまたは高分画化セットと呼ぶことができる高度にメチル化された核酸分子（または高メチル化核酸分子）の１つのセット、低メチル化分画化セットまたは低分画化セットと呼ぶことができる低度にメチル化された核酸分子（または低メチル化核酸分子）の別のセット、および中程度にメチル化された分画化セットまたは中分画化セットと呼ぶことができる中程度にメチル化された核酸分子の第３のセットに分画することができる。別の例では、核酸分子を、エピジェネティック修飾を有するヌクレオチドの数に基づいて分画することができ、１つの分画化セットは、９個のメチル化ヌクレオチドを有する核酸分子を有し得、別の分画化セットは、非メチル化核酸分子（ゼロ個のメチル化ヌクレオチド）を有し得る。
ポリヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシド間連結によって接合したヌクレオシドの直鎖状ポリマー（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはその類似体を含む）を指す。典型的には、ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオシドを含む。オリゴヌクレオチドのサイズは、多くの場合、数個の単量体単位、例えば３～４個から数百の単量体単位の範囲である。ポリヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字列によって表される場合は常に、特に明記していない限り、ヌクレオチドは左から右に５’→３’の順序であること、およびＤＮＡの場合では、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はデオキシチミジンを示すことが理解される。文字Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴは、塩基そのもの、ヌクレオシド、または塩基を含むヌクレオチドを指すために使用され得る。
処理：本明細書で使用される場合、「処理」は、シーケンシングに適した核酸のライブラリを生成するために使用されるステップのセットを指す。ステップのセットは、核酸の分画化、末端修復、シーケンシングアダプターの付加、タグ付け、および／またはＰＣＲ増幅を含み得るがこれらに限定されない。
処理された試料：本明細書で使用される場合、「処理された試料」は、本明細書において他所で記載されるように処理されている試料を指す。一部の実施形態では、処理された試料は、処理された第１のスパイクイン試料から抽出された核酸のサブセットを指し得、第１のスパイクイン試料から抽出された核酸のサブセットは、無細胞ポリヌクレオチドの試料からの、および断片サイズ対照分子の第１のサブセットからの核酸分子を含有する。他の実施形態では、処理された試料は、処理された第２のスパイクイン試料のサブセットを指し、処理された第２のスパイクイン試料のサブセットは、無細胞ポリヌクレオチドの試料からの、ならびに断片サイズ対照分子の第１のサブセットおよび第２のサブセットからの核酸分子を含有する。
定量的測定：本明細書で使用される場合、「定量的測定」は、絶対的または相対的測定を指す。定量的測定は、数、統計学的測定（例えば、頻度、平均値、中央値、標準偏差、また四分位数）、または程度もしくは相対量（例えば、高い、中等度、または低い）であり得るがこれらに限定されない。定量的測定は、２つの定量的測定の比であり得る。定量的測定は、定量的測定の線形の組合せであり得る。定量的測定は、正規化された測定であり得る。
参照配列：本明細書で使用される場合、「参照配列」は、実験により決定された配列との比較目的のために使用される公知の配列を指す。例えば、公知の配列は、全ゲノム、染色体、またはそれらの任意のセグメントであり得る。一部の実施形態では、参照配列は、少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約１０００、または１０００よりも多くのヌクレオチドであり得る。参照配列は、ゲノムもしくは染色体の単一の連続した配列と整列することができるか、またはゲノムもしくは染色体の異なる領域と整列する不連続のセグメントを含み得る。一部の実施形態では、参照配列は全ゲノムであり得る。参照配列の例としては、例えば、ｈＧ１９およびｈＧ３８などのヒトゲノムが挙げられる。
試料：本明細書で使用される場合、「試料」は、本明細書に開示される方法および／またはシステムによって分析することが可能な任意のものを意味する。
第２のスパイクイン試料：本明細書で使用される場合、「第２のスパイクイン試料」は、断片サイズ対照分子の第２のサブセットが、第１のスパイクイン試料から抽出された核酸に添加されている試料であり、第１のスパイクイン試料から抽出された核酸は、無細胞ポリヌクレオチドの試料からの、および断片サイズ対照分子の第１のサブセットからの核酸分子を含有する。
シーケンシング：本明細書で使用される場合、「シーケンシング」は、生体分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の配列（例えば、単量体単位の同一性および順序）を決定するために使用されるいくつかの技術のいずれかを指す。シーケンシング方法の例としては、標的化シーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、エクソンまたはエキソームシーケンシング、イントロンシーケンシング、電子顕微鏡に基づくシーケンシング、パネルシーケンシング、トランジスタ媒介性シーケンシング、直接シーケンシング、ランダムショットガンシーケンシング、サンガージデオキシターミネーションシーケンシング、全ゲノムシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、パイロシーケンシング、２重鎖シーケンシング、サイクルシーケンシング、一塩基伸長シーケンシング、固相シーケンシング、ハイスループットシーケンシング、大規模並列処理シグネチャーシーケンシング、エマルジョンＰＣＲ、低変性温度での共増幅－ＰＣＲ（ＣＯＬＤ－ＰＣＲ）、多重ＰＣＲ、可逆的ダイターミネーターによるシーケンシング、ペアエンドシーケンシング、短期シーケンシング、エキソヌクレアーゼシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ショートリードシーケンシング、単一分子シーケンシング、合成によるシーケンシング、リアルタイムシーケンシング、リバースターミネーターシーケンシング、ナノポアシーケンシング、４５４シーケンシング、Ｓｏｌｅｘａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンシング、ＳＯＬｉＤ（商標）シーケンシング、ＭＳ－ＰＥＴシーケンシング、およびこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、シーケンシングは、例えば、多くの他のものの中でも、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている遺伝子分析機器などの遺伝子分析機器によって実施することができる。
配列情報：本明細書で使用される場合、核酸ポリマーの文脈における「配列情報」は、そのポリマー内の単量体単位（例えば、ヌクレオチドなど）の順序および同一性を意味する。
体細胞突然変異：本明細書で使用される場合、用語「体細胞突然変異」または「体細胞変異」は、互換的に使用される。これらの用語は、受胎後に起こるゲノム内の突然変異を指す。体細胞突然変異は、生殖細胞以外の体の任意の細胞において起こり得、したがって、後代には受け渡されない。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」は、哺乳動物種（例えば、ヒト）もしくは鳥類（例えば、トリ）の種などの動物、または植物などの他の生物体を指す。より具体的には、対象は、脊椎動物、例えば、マウス、霊長類、サルまたはヒトなどの哺乳動物であり得る。動物は、農場動物（例えば、肉用牛、乳牛、家禽、ウマ、ブタなど）、競技動物、およびコンパニオン動物（例えば、愛玩動物または支援動物）を含む。対象は、健康な個体、疾患もしくは疾患に対する素因を有するもしくはそれを有することが疑われる個体、または治療を必要とするもしくは治療を必要とすることが疑われる個体であり得る。用語「個体」または「患者」は、「対象」と互換的であると意図される。
例えば、対象は、がんを有すると診断されている、がん治療を受ける予定の、および／または少なくとも１つのがん治療を受けたことがある個体であり得る。対象は、がんが寛解した状態であり得る。別の例として、対象は、自己免疫疾患を有すると診断された個体であり得る。別の例として、対象は、疾患、例えば、がん、自己免疫疾患を有すると診断されているかまたはそれを有することが疑われ得る妊娠中または妊娠する計画がある女性個体であり得る。
第３のスパイクイン試料：本明細書で使用される場合、「第３のスパイクイン試料」は、断片サイズ対照分子の第３のサブセットが処理された試料に添加されている試料である。
Ｉ．概要
循環無細胞ＤＮＡにおける断片サイズ分布および断片化パターンは、無細胞ＤＮＡの起源に関する情報、および疾患レベルに関する情報も提供することができる。しかし、断片長およびパターンを読み取るまたは分析する（例えば、次世代シーケンシングのライブラリ調製）ために使用される様々な抽出プロセスおよび方法を通して、断片サイズ分布および断片化パターンにバイアスが導入され得る。したがって、バイアスの起源、プロセスのどのステップでバイアスが起こるかを理解するために使用することができる対照を有すること、ならびにまたバイアスを補正するためまたは試料毎におよびバッチレベルの断片サイズバイアスに関して正規化するためにこれらの対照を使用することが必須である。
本開示は、断片長の回収率を正規化するための、所望のサイズの断片の全て／大部分を回収するためにアッセイを最適化するための、およびＱＣ指標としての方法、組成物、およびシステムを提供する。そのような方法は、例えばシーケンシングを通しての抽出からの異なるステップで無細胞ポリヌクレオチドの試料に添加することができる対照として断片サイズ対照分子を使用することを含み得る。これらの対照は、無細胞ＤＮＡの天然のサイズ分布を模倣するために既定の断片長を有し得る。異なるステップで添加される断片サイズ対照分子の同一性は、特定のステップで断片サイズバイアスを把握することができるように、異なるバーコードを使用することによって維持することができる。これらの対照分子は、これらに限定されないが、以下などの多くの適用において使用することができる：（ｉ）断片サイズバイアスのモニタリング、（ｉｉ）断片サイズバイアスを低減するためのプロセスの最適化、（ｉｉｉ）断片サイズ対照分子の回収率を分析することによってプロセス中に導入された断片サイズバイアスの補正または正規化、（ｉｖ）ＱＣ指標としての断片サイズ対照分子の回収率に基づくアッセイの性能の評価、（ｖ）試料の任意の汚染の分析するためのＱＣ指標として、および（ｖ）任意の汚染を最小限にするためのアッセイの最適化。
がんの形成および進行は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の遺伝子修飾およびエピジェネティック修飾の両方から生じ得る。本開示は、ＤＮＡ、例えば無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のエピジェネティック修飾の分析方法を提供する。そのようなエピジェネティック分析は、断片長分布の変化またはゲノム位置にマッピングされる断片エンドポイントの頻度を測定することにより識別可能なメチル化およびＤＮＡ断片パターンを含む。そのような「フラグメントーム」分析を単独でまたは既存の技術と組み合わせて使用して、疾患もしくは状態の有無、診断される疾患もしくは状態の予後、診断される疾患もしくは状態の治療的処置、または疾患もしくは状態の予想される処置の転帰を決定することができる。そのような疾患または状態の例はがんである。
循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、死につつある組織細胞から体液、例えば末梢血（血漿または血清）中に脱落した主に短いＤＮＡ断片（例えば、長さ約１００～４００塩基対、最頻値約１６５ｂｐを有する）であり得る。ｃｆＤＮＡの分析により、がん関連遺伝子バリアントに加えて、死につつある細胞のエピジェネティックフットプリントおよび食細胞による除去のシグネチャーが明らかとなり得、これによって本悪性腫瘍（例えば、腫瘍）ならびにその微小環境構成成分の凝集ヌクレオソーム占有プロファイルがもたらされ得る。
血漿フラグメントームシグナル（例えば、ｃｆＤＮＡ断片の分析から得たシグナル）に寄与し得る構成成分または要因としては、悪性の固形腫瘍が腫瘍関連の正常胞、上皮、および間質細胞、免疫細胞、ならびに血管細胞を含み、そのありとあらゆるものがｃｆＤＮＡ試料（例えば、対象の体液から得られ得る）に寄与し、その中で表され得ることから、（ｉ）ＤＮＡの破壊中の細胞死の型および関連するクロマチン凝縮事象、（ｉｉ）対象の免疫系によって調節される様々な型の貪食の仕組みを伴い得るクリアランス機構、（ｉｉｉ）循環中の細胞型の基礎となる組合せによって影響を受け得る血液組成の非悪性の変異、（ｉｖ）所定の型の臓器または組織における非悪性の細胞死の複数の起源または原因、ならびに（ｖ）がん内の細胞型の不均一性が挙げられる。
ヒストン保護複合体の形態での無細胞ＤＮＡは、好中球、マクロファージ、好酸球、ならびに腫瘍細胞を含む様々な宿主細胞によって放出され得る。循環ＤＮＡは、典型的に半減期が短く（例えば、約１０～１５分）、肝臓は、典型的に循環ＤＮＡ断片を血液循環から除去する主要な臓器である。循環中のｃｆＤＮＡの蓄積は、細胞死および／もしくは活性化の増加、ｃｆＤＮＡのクリアランス障害、ならびに／または内因性のＤＮアーゼ酵素レベルの減少に起因し得る。対象の血流中を循環する無細胞ＤＮＡは、典型的には膜で覆われた構造（例えば、アポトーシス体）に充填され得るか、または生体高分子（例えば、ヒストンまたはＤＮＡ結合血漿タンパク質）と複合体を形成し得る。ＤＮＡ断片化およびその後の輸送のプロセスを、フラグメントーム分析によって検出される無細胞ＤＮＡシグナルの特徴に対するその効果に関して分析することができる。
細胞核（例えば、ヒトの）において、ＤＮＡは典型的にはヌクレオソームに存在し、これはコアヒストン８量体の周囲を包む約１４５塩基対（ｂｐ）のＤＮＡを含む構造へと組織化される。ＤＮＡおよびヌクレオソームの静電気的および水素結合相互作用は、タンパク質表面上でのＤＮＡのエネルギー的に不都合な湾曲をもたらし得る。そのような湾曲は、他のＤＮＡ結合タンパク質の立体障害を引き起こすことがあり得、したがって細胞核におけるＤＮＡに対するアクセスを調節するために役立ち得る。細胞におけるヌクレオソームの位置決めは、動的に（例えば、時間と共におよび様々な細胞状態および条件にわたって）、例えばＤＮＡのアンラッピングおよびリラッピングによって変動し得る。フラグメントームシグナルは、ヌクレオソーム単位によって影響を受ける立体配置に由来するヌクレオソーム保護ＤＮＡ断片を反映し得ることから、ヌクレオソームの安定性およびダイナミクスは、そのようなフラグメントームシグナルに影響を及ぼし得る。これらのヌクレオソームダイナミクスは、多様な要因、例えば：（ｉ）ＡＴＰ加水分解のエネルギーを使用して、ヌクレオソームをスライドさせ、クロマチン繊維からヒストンを交換または排除し得るＡＴＰ依存的リモデリング複合体、（ｉｉ）正規のヒストンの特性とは異なる特性を有し、クロマチン繊維内で局所的な特異的ドメインを作製し得るヒストンバリアント、（ｉｉｉ）遊離のヒストンの供給を制御し、ヒストン沈着および排除においてクロマチンリモデル剤と協調し得るヒストンシャペロン、（ｉｖ）クロマチンの構造に直接または間接的に影響を及ぼし得るヒストンの翻訳後修飾（ＰＴＭ）（例えば、アセチル化、メチル化、リン酸化、およびユビキチン化）、ならびに（ｖ）転写因子およびＲＮＡポリメラーゼによる能動的転写に由来し得る。
したがって、ｃｆＤＮＡにおける断片化シグナルまたはパターンは、ゲノム全体のクロマチン組織化の不均一性に関連する複数の事象に由来する凝集したｃｆＤＮＡシグナルを示し得る。そのようなクロマチン組織化は、死につつある細胞における全体的な細胞の同一性、代謝状態、限局的調節状態、局所遺伝子活性、およびＤＮＡクリアランスの機構などの要因に応じて異なり得る。その上、無細胞ＤＮＡフラグメントームシグナルは、寄与する細胞の基礎となるクロマチン構造に部分的にのみ起因し得る。そのようなｃｆＤＮＡフラグメントームシグナルは、細胞死の間にクロマチンの圧縮のより複雑なフットプリントおよび酵素消化からのＤＮＡ保護を示し得る。したがって、所定の細胞型または細胞系列型に対して特異的なクロマチンマップは、細胞死または破片の輸送の様々な段階でのヌクレオソームの安定性、立体構造、および組成の変化により、ＤＮＡのアクセシビリティの固有の不均一性に部分的にのみ寄与し得る。その結果、一部のヌクレオソームは、無細胞ＤＮＡに優先的に存在するまたは存在しないようになり得るが（例えば、ｃｆＤＮＡクリアランスに影響を及ぼし、血液循環に放出する濾過機構が存在し得る）、これらは死の様式および機構ならびに細胞死体のクリアランスなどの要因に依存し得る。
フラグメントームシグナルは、細胞において生成され、アポトーシスおよび壊死などの細胞プロセス中の核ＤＮＡ断片化の結果として血液循環にｃｆＤＮＡとして放出され得る。そのような断片化は、細胞の異なる段階におけるＤＮＡに作用する異なるヌクレアーゼ酵素の結果として産生され、ｃｆＤＮＡフラグメントームシグナルにおいて分析され得る配列特異的ＤＮＡ切断パターンをもたらし得る。そのような切断パターンを分類することは、細胞環境の臨床的に関連するマーカー（例えば、腫瘍の微小環境、炎症、疾患状態、腫瘍形成など）であり得る。
本開示は、ポリヌクレオチド（一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは無細胞ポリヌクレオチドであり得る）の試料中の核酸分子の分析における断片サイズバイアスを評価および補正するための方法、組成物、およびシステムを提供する。これらの方法は、様々な適用において、例えば、疾患の予後判定、診断、および／またはモニタリングのために使用することができる。
ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子の分析は、断片サイズ対照分子の回収率を測定することから断片サイズバイアスに関して最適化および補正することができる。断片サイズ対照分子は、既定の断片長を有する合成核酸分子であり得る。断片サイズ対照分子のセットは、特定のステップでポリヌクレオチドの試料に添加された断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含む核酸分子を含み得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のセットは、断片サイズ対照分子の２つまたはそれより多くのサブセットを含み得、各サブセットは、アッセイの異なるステップで添加される。各サブセットは、断片サイズ対照分子の１つまたは複数の群を含み、各群は、異なる断片長またはサイズを有する。例えば、断片サイズバイアスを分析すべきアッセイにおいて３つのステップが存在する場合、断片サイズ対照分子のセットは、断片サイズ対照分子の３つのサブセット（Ｓ１、Ｓ２、およびＳ３）を含み得、各サブセットは、各ステップの前に試料に添加される（すなわち、Ｓ１はステップ１の前に添加され、Ｓ２はステップ２の前に添加され、Ｓ３はステップ３の前に添加される）。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、合成核酸分子であり得る。一部の実施形態では、任意のゲノム、プラスミド、もしくはベクター、またはそれらの一部における特定の領域（すなわち、特定の長さの）を増幅することを介して生成されたアンプリコンを、断片サイズ対照分子として使用することができる。断片サイズ対照分子の配列および長さは、分析の前に公知であり得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、これらの分子がいかなる二次構造も形成しないように設計される。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の配列は、いかなるヒトゲノム領域とも重複しないように設計される。したがって、断片サイズ対照分子をポリヌクレオチドの試料に添加することによって、およびサブセットにおける断片サイズ対照分子を追跡することによって、断片サイズ対照分子の回収率を分析し、それによって一部の実施形態では、断片サイズバイアスを推定することができる。
したがって、一態様では、本開示は、ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析する方法であって：（ａ）断片サイズ対照分子のサブセットをポリヌクレオチドの試料中の核酸分子に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｂ）第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；（ｃ）抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；（ｄ）処理された試料の少なくともサブセットを富化し、それによって富化された試料を産生するステップ；（ｅ）富化された試料の少なくともサブセットをシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびに（ｆ）複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子のサブセットの複数の断片サイズスコアを生成するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ポリヌクレオチド（例えば、無細胞ＤＮＡ）の試料であり得る。
一部の実施形態では、方法は、複数の断片サイズスコアを複数の断片サイズ閾値と比較するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、複数の断片サイズスコアに基づいてポリヌクレオチドの試料中の核酸分子の分析を最適化するために使用することができる。一部の実施形態では、方法は、複数の断片サイズスコアを使用してポリヌクレオチドの試料中の核酸分子の分析における断片サイズバイアスを補正するために使用することができる。一部の実施形態では、方法は、品質管理（ＱＣ）指標を使用することができ、方法は、（ｉ）複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが複数の断片サイズ閾値の対応する断片サイズ閾値内にある場合、成功である；または（ｉｉ）複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが複数の断片サイズ閾値の対応する断片サイズ閾値内にない場合、失敗であると分類される。
図１Ａは、本開示の実施形態に従う無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法の概略図である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のセットは、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含み得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のセットは、断片サイズ対照分子の１つのサブセットを含み得る。１０１Ａでは、断片サイズ対照分子のサブセット（サブセット１）は、その断片サイズバイアスを分析することができるポリヌクレオチドの試料に添加されて、ポリヌクレオチドの抽出前に第１のスパイクイン試料を生成することができる。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、サブセット内の各個々の断片サイズ対照分子（分子識別子）および同様にそれが属するサブセット、すなわちサブセット１（サブセット識別子）を識別するために役立ち得る１つまたは複数のタグまたは分子バーコードによってタグ付けされる。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットは、断片サイズ対照分子の１つまたは複数の群を含み得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の１つまたは複数の群は、異なる長さおよび／または異なる配列の核酸分子を含み得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の群は、同じ長さおよび同じ配列の断片サイズ対照分子を含み得る。一部の実施形態では、各群は、同じ長さであるが異なる配列の断片サイズ対照分子を含み得る。
１０２Ａでは、第１のスパイクイン試料の核酸分子を抽出する。１０３Ａでは、抽出された核酸分子を処理して、末端修復、シーケンシングアダプターの付加、タグ付け、および／またはＰＣＲ増幅などの、しかしこれらに限定されないステップを含むシーケンシングに適した核酸分子のライブラリを生成する。一部の実施形態では、核酸分子のライブラリを生成するための抽出された核酸分子の処理は、分画化、末端修復、シーケンシングアダプターの付加、タグ付け、洗浄／浄化、および／またはＰＣＲ増幅などの、しかしこれらに限定されないステップを含む。１０４Ａでは、処理された試料中の核酸は、（ｉ）目的の特定の領域に属する無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸、および（ｉｉ）サブセット１の断片サイズ対照分子に関して富化される。１０５Ａでは、サブセット１における断片サイズ対照分子の回収率を分析することができるように、富化された試料をシーケンシングする。１０６Ａでは、シーケンサーから生成された配列リードを分析して、サブセット１断片サイズ対照分子の回収率を測定する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の回収率は、試料に添加される特定のサブセット内の断片サイズ対照分子の相対的存在量のオルトゴナル測定を利用して計算することができる。一部の実施形態では、オルトゴナル測定は、ゲル電気泳動、ｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、またはＰＣＲフリーシーケンシングから得ることができる。
図１Ｂは、ポリヌクレオチドの試料（例えば、試料は無細胞ＤＮＡ試料であり得る）中の核酸分子を分析するための方法１００Ｂの例としての実施形態を例証する。１０１Ｂでは、断片サイズ対照分子のサブセット（サブセット１）を、抽出ステップの前にポリヌクレオチドの試料に添加して、第１のスパイクイン試料を生成する。断片サイズ対照分子は、ステップのいずれかにおいて導入され得る断片サイズバイアスをモニターするために試料に添加される。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子を使用して推定された断片サイズバイアスを使用して、試料中のポリヌクレオチドの計算された断片長分布を最適化することができる。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のセットは、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含み得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のセットは、断片サイズ対照分子の１つのサブセット（例えば、サブセット１）を含み得る。一部の実施形態では、各サブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。一部の実施形態では、各群は、同じ長さおよび同じ配列の断片サイズ対照分子を含む。一部の実施形態では、１つの群の断片サイズ対照分子の長さは、他の群の断片サイズ対照分子の長さとは異なる。一部の実施形態では、各群は、同じ長さであるが異なる配列の断片サイズ対照分子を含む。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、サブセット内の各個々の断片サイズ対照分子（分子識別子）、および同様にそれが属するサブセット、すなわちサブセット１（サブセット識別子）を識別するために役立ち得る１つまたは複数のタグまたは分子バーコードによってタグ付けされる。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等しくないモル濃度で存在する。
１０２Ｂでは、第１のスパイクイン試料の核酸分子を抽出する。１０３Ｂでは、抽出された核酸を処理して処理された試料を生成し、処理された試料は、（ｉ）無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子、および（ｉｉ）サブセット１の断片サイズ対照分子を含む。
核酸分子は、１０３Ｂにおいて処理されて、シーケンシング（例えば、次世代シーケンサーによる）に適した核酸のライブラリを生成する。処理は、核酸の末端修復、シーケンシングアダプターの付加、タグ付け、洗浄／浄化、および／または増幅などの、しかしこれらに限定されないステップを含み得る。一部の実施形態では、処理は、核酸の分画化、末端修復、シーケンシングアダプターの付加、タグ付け、洗浄／浄化、および／または増幅などの、しかしこれらに限定されないステップを含み得る。
一部の実施形態では、分画化は、化学修飾（例えば、メチル化）を有するヌクレオチドを含む核酸分子に優先的に結合する結合剤に対する核酸分子の示差的結合親和性に基づいて核酸分子を分画することを含む。結合剤の例としては、メチル結合ドメイン（ＭＢＤ）およびメチル結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書において企図されるＭＢＰの例としては：
（ａ）非修飾シトシンよりも５－メチル－シトシンに優先的に結合するタンパク質であるＭｅＣＰ２；
（ｂ）非修飾シトシンよりも５－ヒドロキシメチル－シトシンに優先的に結合するＲＰＬ２６、ＰＲＰ８、およびＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭＨＳ６；
（ｃ）非修飾シトシンよりも５－ホルミル－シトシンに好ましくは結合するＦＯＸＫ１、ＦＯＸＫ２、ＦＯＸＰ１、ＦＯＸＰ４、およびＦＯＸＩ３（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｕｒｌａｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． １４， Ｒ１１９ （２０１３）に記載される）；ならびに
（ｄ）１つまたは複数のメチル化ヌクレオチド塩基に対して特異的な抗体
が挙げられるがこれらに限定されない。
分画化は、核酸分子の特徴に基づく核酸分子の分離または分別を指し得る。分画化は、分子の物理的分画化であり得る。分画化は、エピジェネティック修飾（例えば、エピジェネティック状態）のレベルに基づいて核酸分子を群またはセットに分離することを伴い得る。例えば、核酸分子を、核酸分子のメチル化のレベルに基づいて分画することができる。一部の実施形態では、分画化のために使用される方法およびシステムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６８３２９号に見出され得る。それらの実施形態では、核酸は、メチル化の異なるレベル（メチル化ヌクレオチドの異なる数）に基づいて分画される。一部の実施形態では、核酸は、２つまたはそれより多くの分画化セット（例えば、少なくとも３、４、５、６、または７つの分画化セット）に分画することができる。一部の実施形態では、分画化セットは、異なる程度の修飾を有する（修飾の過剰提示または過小提示）核酸を表す。過剰提示および過小提示は、集団における鎖当たりの修飾の数の中央値と比較して核酸が有する修飾の数によって定義することができる。例えば、試料中の核酸分子における５－メチルシトシンヌクレオチドの数の中央値が２である場合、２つより多くの５－メチルシトシン残基を含む核酸分子は、この修飾で過剰提示され、１またはゼロ個の５－メチルシトシン残基を有する核酸は、過小提示される。親和性分離の効果は、結合相中の修飾で過剰提示される核酸および非結合相中（すなわち、溶液中）の修飾で過小提示される核酸を富化することである。結合相中の核酸は、その後の処理の前に溶出させることができる。一部の実施形態では、複数の分画化セットの各々は、示差的にタグ付けされる。次いで、タグ付けされた分画化セットを集合的な試料調製、富化、および／またはシーケンシングのために共にプールする。分画化セットの示差的タグ付けは、特定の分画化セットに属する核酸分子を把握するために役立つ。タグは、アダプターの構成成分として提供され得る。異なる分画化セットにおける核酸分子は、１つの分画化セットのメンバーを別のメンバーと区別することができる異なるタグを与えられる。同じ分画セットの核酸分子に連結されたタグは、互いに同じまたは異なり得る。しかし、互いに異なる場合であっても、タグは、それらが付着する分子が特定の分画化セットの分子であると識別されるように、その配列の一部を共通に有し得る。例えば、スパイクイン試料の分子が２つの分画化セット、Ｐ１およびＰ２に分画されている場合には、Ｐ１内の分子をＡ１、Ａ２、Ａ３などでタグ付けすることができ、Ｐ２内の分子にＢ１、Ｂ２、Ｂ３などでタグ付けすることができる。そのようなタグ付けシステムは、分画化セットおよび分画化セット内の分子間を区別することを可能にする。
１０４Ｂでは、処理された試料を富化して、富化された試料を生成する。富化された試料は、（ｉ）目的の特定の領域に属する無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子、および（ｉｉ）サブセット１の断片サイズ対照分子を含む。１０５Ｂでは、断片サイズバイアスを計算するために、富化された試料をシーケンシングして複数の配列リードを生成し、サブセット１における断片サイズ対照分子の回収率を分析することができる。得られた配列情報は、核酸分子および核酸分子に付着したタグの配列を含む。断片サイズ対照分子に付着したタグの配列から、タグを、個々の断片サイズ対照分子および断片サイズ対照分子が属するサブセットと相関させることができる。この情報を使用して、サブセットにおける断片サイズ対照分子の回収率を分析する。
１０６Ｂでは、配列リードを分析して、断片サイズ対照分子の断片サイズスコアを生成する。断片サイズスコアは、特定の群および特定のサブセットに属する断片サイズ対照分子の回収率を表す。断片サイズ対照分子および断片サイズ対照分子が属するサブセットの同一性は、タグまたはバーコードの使用を通して維持される。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定の群および特定のサブセットに属する断片サイズ対照分子の数に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定の群および特定のサブセットに属する断片サイズ対照分子のシーケンシングリードの数に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定のサブセットにおける特定の群に関して推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、あらゆるサブセットにおける群の各々に関して推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定のサブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の総スコア（すなわち、サブセット内の断片サイズ対照分子を表す全ての単一スコアに関して）、またはアッセイの１つもしくは複数のステップで添加された断片サイズ対照分子の総スコア（すなわち、アッセイで添加した１つまたは複数のサブセットにおける断片サイズ対照分子を表す単一スコア）であり得る。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定のステップで添加された断片サイズ対照分子のサブセットの量と、異なるステップで添加された断片サイズ対照分子の別のサブセットの量との差として測定することができ、一部の実施形態では、量は、質量（例えば、ｆｇ、ｐｇ、ｎｇ、μｇ）、シーケンシングリードの数または断片サイズ分子の数（サブセットに属する、または特定の群に属する）のいずれかに関する量であり得る。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、断片サイズ対照分子（サブセットに属する、または特定の群に属する）の回収率（画分または百分率）として測定することができ、回収率は、試料に添加された特定のサブセット内の断片サイズ対照分子の相対的存在量のオルトゴナル測定を利用して計算することができる。一部の実施形態では、オルトゴナル測定は、ゲル電気泳動、ｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、またはＰＣＲフリーシーケンシングから得ることができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定の長さの断片サイズ対照分子の量と、異なる長さの断片サイズ対照分子の量との差として測定することができる。
１０７Ｂでは、断片サイズスコアを、アッセイにおける断片サイズバイアスを決定するために対応する断片サイズ閾値と比較する。断片サイズ閾値は、試料中の核酸分子の分析における断片サイズバイアスを評価または最適化するために使用される既定の閾値の値または範囲である。これらの閾値を使用して、抽出、ライブラリ調製、富化、洗浄／浄化、およびシーケンシングなどのステップのいずれかにおける任意の断片長分布を補正することもできる。一部の実施形態では、断片サイズ閾値は、特定のサブセットにおける特定の群に関して推定することができる。一部の実施形態では、サブセットにおける各群は、特定の断片サイズ閾値を有する。一部の実施形態では、断片サイズ閾値は、あらゆるサブセットにおける群の各々に関して推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズ閾値は、特定のサブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の総閾値（すなわち、サブセット内の断片サイズ対照分子の全ての単一閾値に関して）、またはアッセイの１つもしくは複数のステップで添加された断片サイズ対照分子の総閾値（すなわち、アッセイで添加した１つまたは複数のサブセットにおける断片サイズ対照分子の単一閾値）であり得る。例えば、断片サイズ対照分子のセットは、２つのサブセット、サブセット１およびサブセット２を含む。各サブセットが２つの群、Ｇ１１およびＧ１２（サブセット１に関して）ならびにＧ２１およびＧ２２（サブセット２に関して）を含む場合には、４つの群の各々は、断片サイズ対照分子の回収率に基づいて断片サイズスコア（Ｓ）、Ｇ１１に関してＳ１１、Ｇ１２に関してＳ１２、Ｇ２１に関してＳ２１、およびＧ２２に関してＳ２２を有し得る。サブセットにおける各群は、個別の既定の断片サイズ閾値を有し得る。この例では、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｔ２１、およびＴ２２はそれぞれ、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ２１、およびＧ２２の断片サイズ閾値である。閾値は、百分率または画分に関する閾値であり得、閾値は、特定の閾値の値の代わりに閾値の範囲であり得る。方法が成功であると考えられるためには、これらの断片サイズスコアの少なくとも１つは、その対応する断片サイズ閾値内でなければならない。一部の実施形態では、複数の断片サイズスコアの各々が対応する断片サイズ閾値内にある場合には、方法は実施に成功したと分類される。一部の実施形態では、断片サイズ閾値は、百分率または画分に関する閾値であり得る。一部の実施形態では、断片サイズ閾値は、特定の閾値の値の代わりに閾値の範囲であり得る。
一部の実施形態では、１０３Ｂの前に、断片サイズ対照分子の第２のサブセット（サブセット２）を抽出された核酸に添加して、第２のスパイクイン試料を生成してもよい。これらの実施形態では、第２のスパイクイン試料を処理して、処理された試料を生成する。処理された試料は、（ｉ）無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子、ならびに（ｉｉ）サブセット１およびサブセット２の断片サイズ対照分子を含む。一部の実施形態では、１０４Ｂの前に、断片サイズ対照分子の第３のサブセット（サブセット３）を処理された試料に添加して、第３のスパイクイン試料を生成してもよい。これらの実施形態では、第３のスパイクイン試料を富化して、富化された試料を生成する。富化された試料は、（ｉ）目的の特定の領域に属する無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子、ならびに（ｉｉ）サブセット１、サブセット２、およびサブセット３の断片サイズ対照分子を含む。一部の実施形態では、１０５Ｂの前に、断片サイズ対照分子の第４のサブセット（サブセット４）を富化された試料に添加して、第４のスパイクイン試料を生成してもよい。第４のスパイクイン試料は、（ｉ）目的の特定の領域に属する無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子、ならびに（ｉｉ）サブセット１、サブセット２、サブセット３、およびサブセット４の断片サイズ対照分子を含む。これらの実施形態では、第４のスパイクイン試料をシーケンシングして、複数の配列リードを生成する。
別の態様では、本開示は、ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法であって：（ａ）断片サイズ対照分子の第１のサブセットをポリヌクレオチドの試料中の核酸分子に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｂ）第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；（ｃ）断片サイズ対照分子の第２のサブセットを抽出された核酸に添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｄ）第２のスパイクイン試料の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第２のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；（ｅ）断片サイズ対照分子の第３のサブセットを処理された試料に添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｆ）第３のスパイクイン試料の少なくともサブセットを富化し、それによって富化された試料を産生するステップ；（ｇ）断片サイズ対照分子の第４のサブセットを富化された試料の少なくともサブセットに添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｈ）第４のスパイクイン試料をシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；（ｉ）複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子の第１のサブセット、断片サイズ対照分子の第２のサブセット、断片サイズ対照分子の第３のサブセット、および／または断片サイズ対照分子の第４のサブセットの複数の断片サイズスコアを生成するステップ；ならびに（ｊ）複数の断片サイズスコアを複数の断片サイズ閾値と比較するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、方法は、複数の断片サイズスコアを複数の断片サイズ閾値と比較するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、複数の断片サイズスコアに基づいてポリヌクレオチドの試料中の核酸分子の分析を最適化するために使用することができる。一部の実施形態では、方法は、複数の断片サイズスコアを使用してポリヌクレオチドの試料中の核酸分子の分析における断片サイズバイアスを補正するために使用することができる。一部の実施形態では、方法は、品質管理（ＱＣ）指標を使用することができ、方法は、（ｉ）複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが複数の断片サイズ閾値の対応する断片サイズ閾値内にある場合、成功である；または（ｉｉ）複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが複数の断片サイズ閾値の対応する断片サイズ閾値内にない場合、失敗であると分類される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ポリヌクレオチド（例えば、無細胞ＤＮＡ）の試料であり得る。
図２Ａは、本開示の実施形態に従うポリヌクレオチド（例えば、無細胞ポリヌクレオチド）の試料中の核酸分子を分析するための方法の概略図である。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のセットは、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含み得る。２０１Ａでは、断片サイズ対照分子の第１のサブセット（サブセット１）を、その断片サイズバイアスを分析すべきであるポリヌクレオチドの試料に添加して、ポリヌクレオチドの抽出前に第１のスパイクイン試料を生成する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、サブセット内の各個々の断片サイズ対照分子（分子識別子）および同様にそれが属するサブセット、すなわちサブセット１（サブセット識別子）を識別するために役立ち得る１つまたは複数のタグまたはバーコードによってタグ付けされる。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットは、断片サイズ対照分子の１つまたは複数の群を含み得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の１つまたは複数の群は、異なる長さおよび／または異なる配列の核酸分子を含み得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の群は、同じ長さおよび同じ配列の断片サイズ対照分子を含み得る。一部の実施形態では、各群は、同じ長さであるが異なる配列の断片サイズ対照分子を含み得る。
２０２Ａでは、第１のスパイクイン試料の無細胞核酸分子を抽出する。２０３Ａでは、断片サイズ対照分子の第２のサブセット（サブセット２）を抽出された核酸分子に添加して、第２のスパイクイン試料を生成する。２０４Ａでは、第２のスパイクイン試料を処理し、末端修復、シーケンシングアダプターの付加、タグ付け、洗浄／浄化、および／またはＰＣＲ増幅などの、しかしこれらに限定されないステップを含むシーケンシングに適した核酸分子のライブラリを生成する。一部の実施形態では、核酸分子のライブラリを生成するための第１のスパイクイン試料の処理は、分画化、末端修復、シーケンシングアダプターの付加、タグ付け、洗浄／浄化、および／またはＰＣＲ増幅などの、しかしこれらに限定されないステップを含む。２０５Ａでは、断片サイズ対照分子の第３のサブセット（サブセット３）を処理された試料に添加して、第３のスパイクイン試料を生成する。２０６Ａでは、第３のスパイクイン試料中の核酸を、（ｉ）目的の特定の領域に属する無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子、ならびに（ｉｉ）サブセット１、サブセット２、およびサブセット３の断片サイズ対照分子に関して富化する。２０７Ａでは、断片サイズ対照分子の第４のサブセット（サブセット４）を富化された試料に添加して、第４のスパイクイン試料を生成する。２０８Ａでは、断片サイズバイアスを決定するために、第４のスパイクイン試料をシーケンシングして、サブセット１、サブセット２、サブセット３、およびサブセット４における断片サイズ対照分子の回収率を分析することができる。２０９Ａでは、シーケンサーから生成された配列リードを分析して、サブセット１、サブセット２、サブセット３、およびサブセット４断片サイズ対照分子の回収率を測定する。
図２Ｂは、ポリヌクレオチド（例えば、無細胞ポリヌクレオチド）の試料中の核酸分子を分析するための方法２００Ｂの例としての実施形態を例証する。２０１Ｂでは、断片サイズ対照分子のサブセット（サブセット１）を、抽出ステップの前に無細胞ポリヌクレオチドの試料に添加して、第１のスパイクイン試料を生成する。断片サイズ対照分子を、ステップのいずれかで導入された断片サイズバイアスをモニターおよび／または補正するために、試料に添加する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のセットは、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含み得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のセットは、断片サイズ対照分子の１つのサブセット（例えば、サブセット１）を含み得る。一部の実施形態では、各サブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。一部の実施形態では、各群は、同じ長さおよび同じ配列の断片サイズ対照分子を含む。一部の実施形態では、１つの群における断片サイズ対照分子の長さは、他の群における断片サイズ対照分子の長さとは異なる。一部の実施形態では、各群は、同じ長さであるが異なる配列の断片サイズ対照分子を含む。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、サブセット内の各個々の断片サイズ対照分子（分子識別子）および同様にそれが属するサブセット、すなわちサブセット１（サブセット識別子）を識別するために役立ち得る１つまたは複数のタグまたはバーコードによってタグ付けされる。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等しくないモル濃度で存在する。
２０２Ｂでは、第１のスパイクイン試料の核酸分子を抽出する。２０３Ｂでは、断片サイズ対照分子の第２のサブセット（サブセット２）を抽出された核酸分子に添加して、第２のスパイクイン試料を生成する。一部の実施形態では、第１のサブセットにおける断片サイズ対照分子は、異なるタグを使用することによって第２のサブセットにおける断片サイズ対照分子から識別され、すなわちサブセット１における断片サイズ対照分子のタグ（サブセット識別子）は、サブセット２における断片サイズ対照分子のタグとは異なる。例えば、サブセット１における断片サイズ対照分子は全て、サブセット識別子タグ（Ｓ１）を有し得、サブセット２における断片サイズ対照分子は全て、サブセット識別子タグ（Ｓ２）を有し得る。サブセット識別子タグとは別に、各断片サイズ対照分子は、各個々の断片サイズ対照分子を識別するために使用される分子識別子タグを含む。
２０４Ｂでは、第２のスパイクイン試料を処理して、処理された試料を生成し、処理された試料は、（ｉ）無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子、ならびに（ｉｉ）サブセット１およびサブセット２の断片サイズ対照分子を含む。第２のスパイクイン試料を２０４Ｂにおいて処理して、シーケンシング（例えば、次世代シーケンサーによる）に適した核酸のライブラリを生成する。処理は、核酸の末端修復、シーケンシングアダプターの付加、タグ付け、洗浄／浄化、および／または増幅などの、しかしこれらに限定されないステップを含み得る。
一部の実施形態では、処理は、核酸の分画化、末端修復、シーケンシングアダプターの付加、タグ付け、洗浄／浄化、および／または増幅などの、しかしこれらに限定されないステップを含み得る。一部の実施形態では、分画化は、化学修飾（例えば、メチル化）を有するヌクレオチドを含む核酸に優先的に結合する結合剤に対する核酸分子の示差的な結合親和性に基づいて核酸分子を分画することを含む。一部の実施形態では、核酸を、２つまたはそれより多くの分画化セット（例えば、少なくとも３、４、５、６、または７つの分画化セット）に分画することができる。一部の実施形態では、複数の分画化セットの各々は、複数の分画化セットの第１の分画化セットにおいて使用したタグのセットが、複数の分画化セットの第２の分画化セットにおいて使用したタグのセットとは異なるように、示差的にタグ付けされる。次いで、タグ付けされた分画化セットを、集合的な試料調製、富化、および／またはシーケンシングのために共にプールする。分画化セットの示差的タグ付けは、特定の分画化セットに属する核酸分子を把握するために役立つ。タグは、一部の実施形態では、アダプターの構成成分として提供され得る。異なる分画化セットにおける核酸分子は、１つの分画化セットのメンバーを別のメンバーと区別することができる異なるタグを与えられる。同じ分画セットの核酸分子に連結されたタグは、互いに同じまたは異なり得る。しかし、互いに異なる場合であっても、タグは、それらが付着する分子が特定の分画化セットの分子であると識別されるように、その配列の一部を共通に有し得る。
一部の実施形態では、タグ付けすることは、タグのセットを核酸に付着させて、タグ付けされた核酸の集団を産生することであって、タグ付けされた核酸が１つまたは複数のタグを含む、ことを含む。一部の実施形態では、タグのセットを、アダプターの核酸へのライゲーションによって核酸に付着させ、アダプターは１つまたは複数のタグを含む。
２０５Ｂでは、断片サイズ対照分子の第３のサブセット（サブセット３）を処理された試料に添加して、第３のスパイクイン試料を生成する。２０６Ｂでは、第３のスパイクイン試料を富化して、富化された試料を生成する。富化された試料は、（ｉ）目的の特定の領域に属する無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子、ならびに（ｉｉ）サブセット１、サブセット２、およびサブセット３の断片サイズ対照分子を含む。２０７Ｂでは、断片サイズ対照分子の第４のサブセット（サブセット４）を富化された試料に添加して、第４のスパイクイン試料を生成する。２０８Ｂでは、断片サイズバイアスを計算するために、第４のスパイクイン試料をシーケンシングして、複数の配列リードを生成し、サブセット１、サブセット２、サブセット３、およびサブセット４における断片サイズ対照分子の回収率を分析することができる。得られた配列情報は、核酸分子および核酸分子に付着したタグの配列を含む。断片サイズ対照分子に付着したタグの配列から、タグを、個々の断片サイズ対照分子および分子が属するサブセットと相関させることができる。この情報を使用して、サブセットにおける断片サイズ対照分子の回収率を分析する。
２０９Ｂでは、配列リードを分析して、断片サイズ対照分子の断片サイズスコアを生成する。断片サイズスコアは、特定の群および特定のサブセットに属する断片サイズ対照分子の回収率を表す。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の回収率は、試料に添加された特定のサブセット内の断片サイズ対照分子の相対的存在量のオルトゴナル測定を利用して計算することができる。一部の実施形態では、オルトゴナル測定は、ゲル電気泳動、ｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、またはＰＣＲフリーシーケンシングから得ることができる。断片サイズ対照分子、ならびに断片サイズ対照分子が属する群およびサブセットの同一性は、タグまたはバーコードの使用を通して維持される。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定の群および特定のサブセットに属する断片サイズ対照分子の数に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定の群および特定のサブセットに属する断片サイズ対照分子のシーケンシングリードの数に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定のサブセットにおける特定の群に関して推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、あらゆるサブセットにおける群の各々に関して推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定のサブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の総スコア（すなわち、サブセット内の断片サイズ対照分子を表す単一スコア）、またはアッセイの１つもしくは複数のステップに添加された断片サイズ対照分子の総スコア（すなわち、アッセイで添加した１つまたは複数のサブセットにおける断片サイズ対照分子を表す単一スコア）であり得る。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定のステップで添加された断片サイズ対照分子のサブセットの量と、異なるステップで添加された断片サイズ対照分子の別のサブセットの量との差として測定することができ、一部の実施形態では、量は、質量（例えば、ｆｇ、ｐｇ、ｎｇ、μｇ）、シーケンシングリードの数または断片サイズ分子の数（サブセットに属する、または特定の群に属する）のいずれかに関する量であり得る。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、断片サイズ対照分子（サブセットに属する、または特定の群に属する）の回収率（画分または百分率）として測定することができ、回収率は、試料に添加された特定のサブセット内の断片サイズ対照分子の相対的存在量のオルトゴナル測定を利用して計算することができる。一部の実施形態では、オルトゴナル測定は、ゲル電気泳動、ｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、またはＰＣＲフリーシーケンシングから得ることができる。一部の実施形態では、断片サイズスコアは、特定の長さの断片サイズ対照分子の量と、異なる長さの断片サイズ対照分子の量との差として測定することができる。
２１０Ｂでは、断片サイズスコアを、アッセイにおける断片サイズバイアスを決定するために、対応する断片サイズ閾値と比較する。断片サイズ閾値は、試料中の核酸分子の分析における断片サイズバイアスを評価または最適化するために使用される既定の閾値の値または範囲である。これらの閾値を使用して、抽出、ライブラリ調製、富化、洗浄／浄化、およびシーケンシングなどのステップのいずれかにおける任意の断片長分布を補正することもできる。一部の実施形態では、断片サイズ閾値は、特定のサブセットにおける特定の群に関して推定することができる。一部の実施形態では、サブセットにおける各群は、特定の断片サイズ閾値を有する。一部の実施形態では、断片サイズ閾値は、あらゆるサブセットにおける群の各々に関して推定することができる。一部の実施形態では、断片サイズ閾値は、特定のサブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の総閾値（すなわち、サブセット内の断片サイズ対照分子の単一閾値）、またはアッセイの１つもしくは複数のステップで添加された断片サイズ対照分子の総閾値（すなわち、アッセイで添加した１つまたは複数のサブセットにおける断片サイズ対照分子の単一閾値）であり得る。例えば、断片サイズ対照分子のセットは、２つのサブセット、サブセット１およびサブセット２を含む。各サブセットが２つの群、Ｇ１１およびＧ１２（サブセット１に関して）ならびにＧ２１およびＧ２２（サブセット２に関して）を含む場合には、４つの群の各々は、断片サイズ対照分子の回収率に基づいて断片サイズスコア（Ｓ）、Ｇ１１に関してＳ１１、Ｇ１２に関してＳ１２、Ｇ２１に関してＳ２１、およびＧ２２に関してＳ２２を有し得る。サブセットにおける各群は、個別の既定の断片サイズ閾値を有し得る。この例では、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｔ２１、およびＴ２２はそれぞれ、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ２１、およびＧ２２の断片サイズ閾値である。閾値は、百分率または画分に関する閾値であり得、閾値は、特定の閾値の値の代わりに閾値の範囲であり得る。方法が成功であると考えられるためには、これらの断片サイズスコアの少なくとも１つは、その対応する断片サイズ閾値内でなければならない。一部の実施形態では、複数の断片サイズスコアの各々が対応する断片サイズ閾値内にある場合には、方法は実施に成功したと分類される。一部の実施形態では、断片サイズ閾値は、百分率または画分に関する閾値であり得る。一部の実施形態では、断片サイズ閾値は、特定の閾値の値の代わりに閾値の範囲であり得る。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子を使用して推定される断片サイズバイアスに関する核酸分子の分析を使用して、試料中のポリヌクレオチドの計算された断片長分布を最適化することができる。一部の実施形態では、複数の断片サイズスコアを使用して、核酸分子の分析における断片サイズバイアスを補正する。一部の実施形態では、断片サイズバイアスを補正するステップは、断片サイズスコアの、サブセット内の群の断片サイズ閾値に対する比に由来する定量的測定を使用するステップ、ならびに／またはサブセット内の２つの群の断片サイズスコアの比および／もしくは２つのサブセットの断片サイズスコアの比に由来する定量的測定を使用するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、（ｉ）複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが複数の断片サイズ閾値の対応する断片サイズ閾値内にある場合、成功である；または（ｉｉ）複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが複数の断片サイズ閾値の対応する断片サイズ閾値内にない場合、失敗であると分類される。
一部の実施形態では、全てのサブセットにおける全ての群に関する断片サイズ対照分子の断片サイズスコアが、全ての群に関する対応する断片サイズ閾値内にある場合には、核酸分子を分析する方法は成功であると分類され得る。それ以外の場合、断片サイズスコアのいずれか１つがその対応する断片サイズ閾値の外側である場合、核酸分子を分析する方法は失敗であると分類され得る。例えば、断片サイズ対照分子のセットは、断片サイズ対照分子の２つのサブセット、サブセット１およびサブセット２を含む。各サブセットが２つの群、Ｇ１１およびＧ１２（サブセット１に関して）ならびにＧ２１およびＧ２２（サブセット２に関して）を含む場合には、４つの群の各々は、断片サイズ対照分子の回収率に基づいて断片サイズスコア（Ｓ）、Ｇ１１に関してＳ１１、Ｇ１２に関してＳ１２、Ｇ２１に関してＳ２１、およびＧ２２に関してＳ２２を有し得る。サブセットにおける各群は、個別の断片サイズ閾値を有する。この例では、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｔ２１、およびＴ２２はそれぞれ、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ２１、およびＧ２２の断片サイズ閾値である。Ｓ１１＜Ｔ１１、Ｓ１２＜Ｔ１２、Ｓ２１＜Ｔ２１、およびＳ２２＜Ｔ２２である場合には、方法は成功であると分類され得る。断片サイズスコアのいずれか１つがその対応する断片サイズ閾値の外側である（すなわち、内部にない）場合には、方法は失敗であると分類され得る。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、真の生物学的原因ではなく技術的原因（人為的バイアス）に起因する観察された断片長分布における断片サイズバイアスを補正するために、個々の試料内で使用され得る。例えば、腫瘍細胞に由来するｃｆＤＮＡ分子は、典型的に造血細胞に由来する断片よりも短い平均長を示すことから、断片長分布の平均値、中央値、最頻値、およびＩＱＲを含むがこれらに限定されない要約統計量を、単独または他の特色との組合せのいずれかで悪性腫瘍の検出のための特色として使用してもよい。しかし、これらの要約統計量は、技術的要因、輸送、試料および液体取り扱い、ならびにステップのいずれか（例えば、抽出、分画化、タグ付け、増幅、洗浄／浄化、富化およびシーケンシング）中に導入される人為的バイアスによって影響を受け得、これらの影響は、悪性腫瘍の検出を交絡させ得る。この潜在的交絡源を回避するために、観察された断片長分布を、異なる長さの断片サイズ対照分子の相対的回収率に基づいて調整してもよい。例えば、特定の長さの断片サイズ対照分子の予想される回収率が７５％であるが、所定の試料中のその特定の長さの断片サイズ対照分子の観察された回収率がわずか２５％である場合、断片サイズ対照分子の長さに対応する試料ポリヌクレオチドの断片長分布の構成成分の密度を３倍増加させて、低い回収率を補正してもよい。逆に、特定の長さの断片サイズ対照分子の予想される回収率が６０％であるが、所定の試料中のその特定の長さの断片サイズ対照分子の観察された回収率が８０％である場合、試料ポリヌクレオチドの断片長分布の密度を、断片サイズ対照分子の長さに対応して２５％減少させてもよい。
観察された断片長分布に対する調整は、回収された断片サイズ対照分子の長さ周囲のウィンドウで起こり得る。例えば、断片サイズ対照分子が２００塩基対の長さを有する場合、観察された長さの分布密度を、１８０ｂｐ～２２０ｂｐ、または１７０ｂｐ～２３０ｂｐの間の長さの試料ポリヌクレオチドに対して調整してもよい。ウィンドウは、対称性である必要はなく、適用される調整は、ウィンドウ内に入るポリヌクレオチドのあらゆる長さに関して同じである必要はない。一例として、適用される調整は、均一なカーネルではなく、断片サイズ対照分子の長さを中心とするガウスカーネルを使用し得る。
異なる長さの断片サイズ対照分子の予想される回収率は、１つまたは複数の対照実験を実施することによって決定することができる。断片サイズ閾値を、特定の長さの任意の断片サイズ対照分子の回収率に関して設定してもよい。断片サイズ対照分子の観察された回収率が、断片サイズ閾値の値より下であるか、または断片サイズ閾値の範囲内に入らない場合、試料は品質管理不良であると考えられ得る。これらの断片サイズ閾値は、異なる長さの断片サイズ対照分子に関して異なり得る。
別の態様では、本開示は、無細胞ポリヌクレオチドの試料のシーケンシングライブラリを産生するための方法であって：（ａ）断片サイズ対照分子のサブセットを試料に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｂ）第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；（ｃ）抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；ならびに（ｄ）処理された試料の少なくともサブセットを富化するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、処理することの前に、断片サイズ対照分子の第２のサブセットを添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、富化するステップの前に、断片サイズ対照分子の第３のサブセットを添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｅ）断片サイズ対照分子の第４のサブセットを添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む。
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染を検出するための方法であって、各第１の試料および第２の試料に関して：（ａ）断片サイズ対照分子のサブセットを添加して、第１のスパイクイン試料を生成するステップであって、第１の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットが、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットと区別され得る、ステップ；（ｂ）第１のスパイクインから核酸を抽出するステップ；（ｃ）抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；（ｄ）処理された試料の少なくともサブセットを富化するステップ；（ｅ）富化された試料の少なくともサブセットをシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびに（ｆ）複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子のサブセットの１つまたは複数の汚染スコアを生成するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、処理することの前に、断片サイズ対照分子の第２のサブセットを添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップであって、第１の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットが、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットと区別され得る、ステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、富化するステップの前に、断片サイズ対照分子の第３のサブセットを添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップであって、第１の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットが、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットと区別され得る、ステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、シーケンシングするステップの前に、断片サイズ対照分子の第４のサブセットを添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップであって、第１の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットが、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットと区別され得る、ステップをさらに含む。一部の実施形態では、第１の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットは、他の試料において使用されるサブセット識別子バーコードとは異なる第１の試料中のサブセット識別子バーコードを使用することによって、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子のサブセットと区別することができる。
汚染スコアは、第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の存在を表す第１の試料におけるスコアを指す。一部の実施形態では、１つの試料中の１つのサブセットにおいて使用されるサブセット識別子バーコードは、他の試料中の他のサブセットにおいて使用されるサブセット識別子とは異なり得る。これらの実施形態では、断片サイズ対照分子に存在するサブセット識別子バーコードの配列から、異なる第２の試料に属する断片サイズ対照分子の存在を識別することができる。一部の実施形態では、汚染スコアは、サブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の各型／群に対して特異的であり得るか（すなわち、サブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の異なる長さ／群に関して個別の汚染スコア）、または断片サイズ対照分子の異なる長さ／群を表す総スコアであり得る。一部の実施形態では、汚染スコアは、異なる第２の試料に属する断片サイズ対照分子の数に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、汚染スコアは、異なる第２の試料に属する断片サイズ対照分子のシーケンシングリードの数に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、汚染スコアは、異なる第２の試料に属する断片サイズ対照分子のシーケンシングリードの数に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、試料の汚染スコアは、他の試料に属する断片サイズ対照分子のシーケンシングリードの数の、その試料に添加された断片サイズ対照分子のシーケンシングリードの数に対する画分または百分率に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、試料の汚染スコアは、他の試料に属する断片サイズ対照分子の分子の数の、その試料に添加された断片サイズ対照分子の分子の数に対する画分または百分率に基づいて推定することができる。これらの実施形態では、その分子に添加された断片サイズ対照分子は、断片サイズ対照分子のサブセット識別子バーコードから識別することができる。
一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つまたは複数の汚染スコアを少なくとも１つまたは複数の汚染閾値と比較するステップをさらに含む。汚染閾値は、試料中の核酸分子の分析における試料の汚染を評価するために使用される既定の閾値の値または範囲を指す。これらの閾値を使用して、抽出、ライブラリ調製、富化、洗浄／浄化、およびシーケンシングなどのステップのいずれかにおいてアッセイを最適化することもできる。一部の実施形態では、汚染閾値は、サブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の各型／群に対して特異的であり得る（すなわち、サブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の異なる長さ／群に関する個別の汚染閾値）。一部の実施形態では、汚染閾値は、サブセットにおける断片サイズ対照分子の異なる長さ／群の総閾値、またはアッセイで添加した１つもしくは複数のサブセットにおいて使用される断片サイズ対照分子の総閾値であり得る。一部の実施形態では、サブセットにおける各群は、特定の汚染閾値を有する。例えば、断片サイズ対照分子のセットは、２つのサブセット、サブセット１およびサブセット２を含む。各サブセットが２つの群、Ｇ１１およびＧ１２（サブセット１に関して）ならびにＧ２１およびＧ２２（サブセット２に関して）を含む場合には、４つの群の各々は、断片サイズ対照分子の回収率に基づいて汚染スコア（Ｓ）、Ｇ１１に関してＳ１１、Ｇ１２に関してＳ１２、Ｇ２１に関してＳ２１、およびＧ２２に関してＳ２２を有し得る。サブセットにおける各群は、個別の既定の汚染閾値を有し得る。この例では、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｔ２１、およびＴ２２はそれぞれ、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ２１、およびＧ２２の汚染閾値である。閾値は、百分率または画分に関する閾値であり得、閾値は、特定の閾値の値の代わりに閾値の範囲であり得る。方法が成功であると考えられるためには、これらの汚染スコアの少なくとも１つは、その対応する汚染閾値内でなければならない。一部の実施形態では、複数の汚染スコアの各々が対応する汚染閾値内にある場合には、方法は実施に成功したと分類される。一部の実施形態では、方法は、第１の試料を、（ｉ）汚染スコアの少なくとも１つまたは複数が１つまたは複数の汚染閾値の対応する汚染閾値内にない場合、第２の試料によって汚染されている；または（ｉｉ）汚染スコアの少なくとも１つまたは複数が１つまたは複数の汚染閾値の対応する汚染閾値内にある場合、第２の試料によって汚染されていないと分類するステップをさらに含む。
ＩＩ．断片サイズ対照分子
断片サイズ対照分子は、試料中の核酸分子の分析を評価および／または最適化するためにポリヌクレオチドの試料に添加される核酸分子である。断片サイズ対照分子は２つの領域、断片サイズ領域および識別子領域を有し得る。断片サイズ対照分子のセットを、断片サイズ対照分子のサブセット（複数可）に分類することができ、断片サイズ対照分子の各サブセットを、無細胞ポリヌクレオチドの試料の断片長分布、ＱＣ指標、ならびに／またはステップの、抽出、ライブラリ調製、富化、および／もしくはシーケンシングのいずれかでの試料の汚染を評価するために、アッセイにおける１つまたは複数の異なるステップで添加することができる。これらの断片サイズ対照分子の長さは既定であり、一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡの天然のサイズ分布を模倣することができる。断片サイズ対照分子の各サブセットを、断片サイズ領域の長さに基づいて断片サイズ対照分子の群にさらに分類することができ、各群は、異なる長さの断片サイズ領域を有し得る。例えば、断片サイズ対照分子のサブセットを、断片サイズ領域の長さに基づいて３つの群に分類することができ、第１の群は、長さ１２０ｂｐの断片サイズ領域を有し得、第２の群は、長さ１６０ｂｐの断片サイズ領域を有し得、第３の群は、長さ３２０ｂｐの断片サイズ領域を有し得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、合成オリゴヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、天然に存在しない核酸配列を有し得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、天然に存在する核酸配列を有し得る。一部の実施形態では、任意のゲノム、プラスミド、もしくはベクター、またはその一部における特定の領域（すなわち、特定の長さの）を増幅することを介して生成されたアンプリコンを、断片サイズ対照分子として使用することができる。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、非ヒトゲノムに対応する核酸配列を有し得る。例えば、これらの分子は、（ｉ）ラムダファージＤＮＡの領域に対応する配列、（ｉｉ）天然に存在しない配列、および／または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組合せのいずれかを有し得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、天然に存在しないヌクレオチドアナログを含み得る。
別の態様では、本開示は、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含む断片サイズ対照分子のセットであって、既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットが、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む、断片サイズ対照分子のセットを提供する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、識別子領域をさらに含む。断片サイズ領域は、断片サイズ対照分子の長さを表す断片サイズ対照分子の領域である。一部の実施形態では、少なくとも１つのサブセットは、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む。一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じ長さの領域である。断片サイズ対照分子の各群は、断片サイズ領域の長さが異なり得る。例えば、断片サイズ対照分子のサブセットを、断片サイズ領域の長さに基づいて３つの群に分類することができ、第１の群は、長さ１２０ｂｐの断片サイズ領域を有し得、第２の群は、長さ１６０ｂｐの断片サイズ領域を有し得、第３の群は、長さ３２０ｂｐの断片サイズ領域を有し得る。断片サイズ領域の長さは１０ｂｐ～１０００ｂｐの間であり得る。一部の実施形態では、群における断片サイズ領域の長さは、他の群における断片サイズ領域の長さとは異なる。
識別子領域は、断片サイズ対照分子を他の断片サイズ対照分子と区別するために使用される断片サイズ対照分子の領域である。識別子領域はまた、１つのサブセットからの断片サイズ対照分子を別のサブセットからの断片サイズ対照分子と区別するためにも使用される。一部の実施形態では、識別子領域は、断片サイズ領域の片側または両側に存在する。一部の実施形態では、識別子領域は分子バーコードを含む。分子バーコードは、断片サイズ対照分子の識別子として役立つ。識別子領域は、断片サイズ領域の片側または両側に存在し得る。分子バーコードは、断片サイズ対照分子の識別子として役立つ。一部の実施形態では、識別子領域は、（ｉ）分子識別子バーコード、例えば各断片サイズ対照分子を識別し、１つの断片サイズ対照分子を別の断片サイズ対照分子と識別するために使用されるバーコード、および（ｉｉ）サブセット識別子バーコード、例えば断片サイズ対照分子が属するサブセットを識別するために使用されるバーコード（すなわち、断片サイズ対照分子がサブセット１またはサブセット２のいずれに属するか）として作用するバーコードを含む。サブセット識別子バーコードは、サブセットにおける全ての断片サイズ対照分子に関して同じであってもよく、１つのサブセットのサブセット識別子バーコードは、他のサブセットのサブセット識別子バーコードと異なっていてもよい。例えば、サブセット１における全ての断片サイズ対照分子が、サブセット識別子タグＳ１を有することができ、サブセット２における全ての断片サイズ対照分子が、サブセット識別子タグＳ２を有することができる。一部の実施形態では、１つの試料中の１つのサブセットのサブセット識別子バーコードは、他の試料中の対応するサブセットのサブセット識別子バーコードとは異なり得る。例えば、断片サイズ対照分子を使用して試料の汚染を評価する場合、１つのサブセットのサブセット識別子バーコードは、同じフローセル／バッチ内の全ての他の試料において使用されるその対応するサブセットのサブセット識別子バーコードとは異なる。一部の実施形態では、識別子領域は、１つの試料の断片サイズ対照分子を他の試料の断片サイズ対照分子と区別するための試料インデックスを含み得る。例えば、富化ステップ後に添加された断片サイズ対照分子のサブセットの識別子領域は、試料インデックス配列を含み得る。一部の実施形態では、識別子領域は、ライゲーションを介して断片サイズ領域に付着させることができる。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、１つまたは複数のプライマー結合部位を含む。一部の実施形態では、プライマー結合部位は識別子領域に存在する。一部の実施形態では、識別子領域はまた、断片サイズ対照分子を次世代シーケンサー（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサー）のフローセル表面に付着させるＰ５およびＰ７などの追加のフローセル結合部位を有し得る。
一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、群における断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、少なくとも２つの区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、第２のサブセットにおける断片サイズ対照分子の断片サイズ領域のオリゴヌクレオチド配列と区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、断片サイズ領域は、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、または少なくとも１０００ｂｐの長さであり得る。一部の実施形態では、断片サイズ領域の長さは１０ｂｐ～１０００ｂｐの間であり得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子のサブセットの各々は、等しくないモル濃度で存在する。一部の実施形態では、サブセットにおける断片サイズ対照分子の群の各々は、等モル濃度で存在する。一部の実施形態では、サブセットにおける断片サイズ対照分子の群の各々は、等しくないモル濃度で存在する。
図３は、本開示の一部の実施形態との使用に適した断片サイズ対照分子の概略図である。ここで記載される断片サイズ対照分子のセットは、無細胞ＤＮＡの天然のサイズ分布のそれと類似の長さを有する。図３では、一例として、断片サイズ対照分子のセットは、２つのサブセット、サブセット１およびサブセット２に大別されている。図３における断片サイズ対照分子は、二本鎖ＤＮＡ分子である。説明目的のために、二本鎖断片サイズ対照分子の１つの鎖のみを示す。この実施形態では、各サブセットは、３つの群、群１、群２、および群３に大別される。図３では、各群内の全ての断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は同じ配列を有し、１つの群における断片サイズ領域の長さは他の群における断片サイズ領域の長さとは異なる。図３では、「－－－－－－」の領域は、断片サイズ対照分子の断片サイズ領域を表す。この実施形態では、識別子領域は、断片サイズ領域の両側に存在する。識別子領域は、断片サイズ領域の両末端にプライマー結合部位を有する。同様に、本明細書において、サブセット１における群１の断片サイズ領域の配列は、サブセット２における群１の断片サイズ領域の配列と同じである。同様に、サブセット１における群２および群３の断片サイズ領域の配列はそれぞれ、サブセット２における群２および群３の断片サイズ領域の配列と同じである。
断片サイズ領域の両側の識別子領域は、分子識別子バーコード（ＭＢ）を有するが、サブセット識別子バーコード（Ｓ）は片側のみに存在する。分子バーコードは、個々の断片サイズ対照分子の識別子として使用され、各断片サイズ対照分子は、一意的な分子バーコードを有する（すなわち、分子１はＭＢ１およびＭＢ２を有し、分子２はＭＢ３およびＭＢ４を有し、分子３はＭＢ５およびＭＢ６を有するなど）。サブセット識別子バーコードは、断片サイズ対照分子が属するサブセットの識別子として使用され得る。ここでは、サブセット１およびサブセット２の全ての断片サイズ対照分子はそれぞれ、Ｓ１およびＳ２のサブセット識別子バーコードを有する。この例では、サブセット識別子バーコードは、断片サイズ領域の片側に存在する。
一部の実施形態では、分子バーコードは、断片サイズ領域の片側または両側に存在し得る。一部の実施形態では、サブセット識別子バーコードは、断片サイズ領域の片側または両側に存在し得る。
本実施形態では、識別子領域は、断片サイズ領域の両側にプライマー結合部位を有する。ここでは、サブセット１に関して、群１、群２、および群３の断片サイズ対照分子はそれぞれ、断片サイズ領域の両側にＰｒ１およびＰｒ２、Ｐｒ３およびＰｒ４、ならびにＰｒ５およびＰｒ６プライマー結合部位を有する。一部の実施形態では、識別子領域は、１つまたは複数のプライマーの結合を容易にする追加の領域（プライマー結合部位）を有し得る。一部の実施形態では、１つのサブセットにおける識別子領域のプライマー結合部位は、他のサブセットにおけるプライマー結合部位とは異なる。一部の実施形態では、これらのプライマー結合部位は、断片サイズ対照分子の回収率を分析するために使用される。一部の実施形態では、シーケンシングによって断片サイズ対照分子の回収率を分析する代わりに、断片サイズ対照分子の回収率を、これらのプライマー結合部位に結合するプライマーを使用して、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、定量的ｑＰＣＲ、またはゲル電気泳動によって分析することができる。
図４は、本開示の一部の実施形態との使用に適した断片サイズ対照分子の概略図である。図４では、一例として、断片サイズ対照分子のセットは、２つのサブセット、サブセット１およびサブセット２に大別されている。図４における断片サイズ対照分子は、二本鎖ＤＮＡ分子である。例示目的のために、二本鎖断片サイズ対照分子の１つの鎖のみを示す。この実施形態では、各サブセットは３つの群、群１、群２、および群３に大別される。図４では、各群内の全ての断片サイズ対照分子の断片サイズ領域は、同じ長さの領域であるが、群内の断片サイズ領域の配列は異なり得る。図４では、「－－－－－－」および「～～～～」領域は、断片サイズ対照分子の断片サイズ領域を表す。「－－－－」および「～～～～」領域は、各群が２つの異なる配列を含むが、それらが同じ長さの配列であることを示す。１つの群における断片サイズ領域の長さは、他の群における断片サイズ領域の長さとは異なる。この実施形態では、識別子領域は、断片サイズ領域の両側に存在する。同様に、ここでは、サブセット１における群１の断片サイズ領域の２つの配列は、サブセット２における群１の断片サイズ領域の２つの配列と同じである。同様に、サブセット１における群２および群３の断片サイズ領域の２つの配列はそれぞれ、サブセット２における群２および群３の断片サイズ領域の２つの配列と同じである。
両側の識別子領域は分子識別子バーコード（ＭＢ）を有するが、サブセット識別子バーコード（Ｓ）は片側のみに存在する。分子バーコードは、個々の断片サイズ対照分子の識別子として使用され、各断片サイズ対照分子は、一意的な分子バーコードを有する（すなわち、分子１はＭＢ１およびＭＢ２を有し、分子２はＭＢ３およびＭＢ４を有し、分子３はＭＢ５およびＭＢ６を有するなど）。サブセット識別子バーコードは、断片サイズ対照分子が属するサブセットの識別子として使用され得る。ここでは、サブセット１およびサブセット２の全ての断片サイズ対照分子はそれぞれ、Ｓ１およびＳ２のサブセット識別子バーコードを有する。この例では、サブセット識別子バーコードは、断片サイズ領域の片側に存在する。
一部の実施形態では、分子バーコードは、断片サイズ領域の片側または両側に存在し得る。一部の実施形態では、サブセット識別子バーコードは、断片サイズ領域の片側または両側に存在し得る。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、天然に存在しない核酸配列を有し得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、天然に存在する核酸配列を有し得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、非ヒトゲノムに対応する核酸配列を有し得る。例えば、これらの分子は、（ｉ）ラムダファージＤＮＡの領域に対応する配列、（ｉｉ）天然に存在しない配列、および／または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組合せのいずれかを有し得る。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子は、天然に存在しないヌクレオチドアナログを含み得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、ＤＮＡの試料、ＲＮＡの試料、無細胞ポリヌクレオチドの試料、無細胞ＤＮＡの試料、または無細胞ＲＮＡの試料である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの試料は、無細胞ＤＮＡの試料である。
一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡは、少なくとも１ｎｇ、少なくとも５ｎｇ、少なくとも１０ｎｇ、少なくとも１５ｎｇ、少なくとも２０ｎｇ、少なくとも３０ｎｇ、少なくとも５０ｎｇ、少なくとも７５ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも１５０ｎｇ、少なくとも２００ｎｇ、少なくとも２５０ｎｇ、少なくとも３００ｎｇ、少なくとも３５０ｎｇ、少なくとも４００ｎｇ、少なくとも４５０ｎｇ、または少なくとも５００ｎｇである。
一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の量は、少なくとも１アトモル、少なくとも２アトモル、少なくとも５アトモル、少なくとも１０アトモル、少なくとも１５アトモル、少なくとも２０アトモル、少なくとも５０アトモル、少なくとも７５アトモル、少なくとも１００アトモル、少なくとも１フェムトモル、少なくとも２フェムトモル、少なくとも５フェムトモル、少なくとも１０フェムトモル、少なくとも１５フェムトモル、少なくとも２０フェムトモル、少なくとも５０フェムトモル、少なくとも７５フェムトモル、少なくとも１００フェムトモル、少なくとも１２５フェムトモル、少なくとも１５０フェムトモル、または少なくとも２００フェムトモル、少なくとも３００フェムトモル、少なくとも４００フェムトモル、少なくとも５００フェムトモル、少なくとも６００フェムトモル、少なくとも７００フェムトモル、少なくとも８００フェムトモル、少なくとも９００フェムトモル、少なくとも１ピコモル、少なくとも２ピコモル、少なくとも５ピコモル、または少なくとも１０ピコモルである。一部の実施形態では、断片サイズ対照分子の量は、１アトモル～１０ピコモルの間であり得る。
本開示の追加の実施形態は、サイズ断片対照分子が添加されている組成物を含む。例えば、サイズ断片対照分子が添加されている無細胞ＤＮＡ試料は、本開示の一実施形態である。同様に、本方法の実践の間に産生されたサイズ断片対照分子の１つまたは複数の異なるサブセットを含む多数の組成物が、本開示の実施形態であると考えられる。
ＩＩＩ．方法の全般的特色
Ａ．試料
試料は、対象から単離された任意の生体試料であり得る。試料は、体組織、全血、血小板、血清、血漿、便、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）または白血球（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ）、内皮細胞、組織生検（例えば、固形腫瘍であることが公知のまたは疑われる生検）、脳脊髄液、滑液、リンパ液、腹水、間質液または細胞外液（例えば、細胞間隙からの滲出液）、歯肉滲出液、歯肉溝滲出液、骨髄、胸水、脳脊髄液、唾液、粘液、喀痰、精液、汗、および尿を含み得る。試料は、血液およびその画分、ならびに尿などの体液であり得る。そのような試料は、腫瘍から放出された核酸を含み得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み得、二本鎖および一本鎖形態であり得る。試料は、対象から最初に単離された形態であり得るか、または細胞などの構成成分を除去もしくは添加する、１つの構成成分を別の構成成分と比べて富化させる、もしくは１つの形態の核酸を別の形態に変換する、例えば、ＲＮＡをＤＮＡにもしくは一本鎖核酸を二本鎖に変換するさらなる処理に供されたものであり得る。このように、例えば、分析用の体液は、無細胞核酸、例えば、無細胞離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含有する血漿または血清であり得る。
一部の実施形態では、対象から採取した体液の試料体積は、シーケンシングされる領域に対する所望のリードの深さに依存する。体積の例は、約０．４～４０ミリリットル（ｍＬ）、約５～２０ｍＬ、約１０～２０ｍＬである。例えば、体積は、約０．５ｍＬ、約１ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約２０ｍＬ、約３０ｍＬ、約４０ｍＬ、またはそれよりも多くであり得る。試料採取された血漿の体積は、典型的に約５ｍＬ～約２０ｍＬの間である。
試料は、様々な量の核酸を含み得る。典型的には、所定の試料中の核酸の量は多数のゲノム等価物と同等とみなされる。例えば、ＤＮＡ約３０ナノグラム（ｎｇ）の試料は一倍体ヒトゲノム等価物を約１０，０００（１０４）個、ｃｆＤＮＡの場合では、個々のポリヌクレオチド分子を約２０００億（２×１０１１）個含有し得る。同様に、ＤＮＡ約１００ｎｇの試料は、一倍体ヒトゲノム等価物を約３０，０００個、ｃｆＤＮＡの場合では、個々の分子を約６０００億個含有し得る。
一部の実施形態では、試料は、異なる供給源由来、例えば、細胞由来および無細胞供給源（例えば、血液試料など）由来の核酸を含む。典型的には、試料は、突然変異を有する核酸を含む。例えば試料は、必要に応じて、生殖細胞系列突然変異および／または体細胞突然変異を有するＤＮＡを含む。典型的には試料は、がん関連突然変異（例えば、がん関連体細胞突然変異）を有するＤＮＡを含む。
増幅前の試料中の無細胞核酸の例としての量は、典型的には約１フェムトグラム（ｆｇ）～約１マイクログラム（μｇ）、例えば、約１ピコグラム（ｐｇ）～約２００ナノグラム（ｎｇ）、約１ｎｇ～約１００ｎｇ、約１０ｎｇ～約１０００ｎｇの範囲である。一部の実施形態では、試料は、無細胞核酸分子の最大約６００ｎｇ、最大約５００ｎｇ、最大約４００ｎｇ、最大約３００ｎｇ、最大約２００ｎｇ、最大約１００ｎｇ、最大約５０ｎｇ、または最大約２０ｎｇを含む。必要に応じて、量は、無細胞核酸分子の少なくとも約１ｆｇ、少なくとも約１０ｆｇ、少なくとも約１００ｆｇ、少なくとも約１ｐｇ、少なくとも約１０ｐｇ、少なくとも約１００ｐｇ、少なくとも約１ｎｇ、少なくとも約１０ｎｇ、少なくとも約１００ｎｇ、少なくとも約１５０ｎｇ、または少なくとも約２００ｎｇである。一部の実施形態では、量は、無細胞核酸分子の最大約１ｆｇ、約１０ｆｇ、約１００ｆｇ、約１ｐｇ、約１０ｐｇ、約１００ｐｇ、約１ｎｇ、約１０ｎｇ、約１００ｎｇ、約１５０ｎｇ、または約２００ｎｇである。一部の実施形態では、方法は、試料から約１ｆｇ～約２００ｎｇの間の無細胞核酸を得るステップを含む。
無細胞核酸は、典型的には、約１００ヌクレオチド長～約５００ヌクレオチド長の間のサイズ分布を有し、約１１０ヌクレオチド長～約２３０ヌクレオチド長の分子が試料中の分子の約９０％を表し、最頻値は約１６８ヌクレオチド長（ヒト対象からの試料中）および第２の軽微なピークは約２４０ヌクレオチド～約４４０ヌクレオチド長の範囲である。一部の実施形態では、無細胞核酸は、約１６０ヌクレオチド～約１８０ヌクレオチド長、または約３２０ヌクレオチド～約３６０ヌクレオチド長、または約４４０ヌクレオチド～約４８０ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、無細胞核酸は、溶液中で見出される無細胞核酸がインタクト細胞および体液の他の不溶性の構成成分から分離される分画化ステップを通して体液から単離される。一部の実施形態では、分画化は、遠心分離または濾過などの技法を含む。あるいは、体液中の細胞を溶解し得、無細胞および細胞核酸を共に処理してもよい。一般的には、緩衝液の添加および洗浄ステップの後、無細胞核酸を例えばアルコールによって沈殿させてもよい。一部の実施形態では、シリカに基づくカラムなどの追加の浄化ステップを使用して、夾雑物または塩を除去する。例えば非特異的な大量の担体核酸を必要に応じて反応全体に添加して、例としての手順の態様、例えば収量を最適化する。そのような処理後、試料は、典型的には、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、および／または一本鎖ＲＮＡを含む様々な形態の核酸を含む。必要に応じて、一本鎖ＤＮＡおよび／または一本鎖ＲＮＡは、その後の処理および分析ステップに含まれるように、二本鎖型に変換される。
Ｂ．タグ付け
一部の実施形態では、核酸分子（ポリヌクレオチドおよび断片サイズ対照分子の試料から）を、試料インデックスおよび／または分子バーコード（一般的に「タグ」と呼ばれる）によってタグ付けしてもよい。タグは、他の方法の中でも化学合成、ライゲーション（例えば、平滑末端ライゲーションまたは付着末端ライゲーション）、またはオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってアダプターに組み込まれ得るか、またはそうでなければ接合される。そのようなアダプターは、標的核酸分子に最終的に接合され得る。他の実施形態では、増幅サイクルの１つまたは複数のラウンド（例えば、ＰＣＲ増幅）を一般的に適用して、従来の核酸増幅法を使用して試料インデックスを核酸分子に導入する。増幅は、１つまたは複数の反応混合物（例えば、アレイ中の複数のマイクロウェル）中で実施され得る。分子バーコードおよび／または試料インデックスは、同時に、または任意の順序で導入してもよい。一部の実施形態では、分子バーコードおよび／または試料インデックスを、配列捕捉ステップを実施する前および／または後に導入する。一部の実施形態では、分子バーコードのみをプローブ捕捉の前に導入し、試料インデックスは配列捕捉ステップを実施した後に導入する。一部の実施形態では、分子バーコードおよび試料インデックスの両方を、プローブに基づく捕捉ステップを実施する前に導入する。一部の実施形態では、試料インデックスを、配列捕捉ステップを実施した後に導入する。一部の実施形態では、分子バーコードを、ライゲーション（例えば、平滑末端ライゲーションまたは付着末端ライゲーション）を介してアダプターを通して試料中の核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ分子）に組み込む。一部の実施形態では、試料インデックスを、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通して試料中の核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ分子）に組み込む。典型的には、配列捕捉プロトコールは、標的化核酸配列、例えばゲノム領域のコード配列と相補的な一本鎖核酸分子を導入するステップを伴い、そのような領域の突然変異は、がんの型に関連する。
一部の実施形態では、タグは、試料核酸分子の一方の末端または両方の末端に位置し得る。一部の実施形態では、タグは、既定の、またはランダムもしくはセミランダム配列オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、タグは、約５００、２００、１００、５０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチド長未満であり得る。タグは、試料核酸にランダムにまたは非ランダムに連結され得る。
一部の実施形態では、各試料は、試料インデックスまたは試料インデックスの組合せによって一意的にタグ付けされる。一部の実施形態では、試料またはサブサンプルの各核酸分子は、分子バーコードまたは分子バーコードの組合せによって一意的にタグ付けされる。他の実施形態では、分子バーコードが必ずしも複数の中で互いに対して一意的ではないように（例えば、非一意的分子バーコード）、複数の分子バーコードを使用してもよい。これらの実施形態では、分子バーコードを、一般的に、個々の分子に（例えば、ライゲーションによって）付着させて、その結果、分子バーコードとそれを付着させ得る配列の組合せにより、個別に追跡することができる一意的な配列が作製される。非一意的にタグ付けされた分子バーコードの、内因性配列情報（例えば、試料中の元の核酸分子の配列に対応する始まりの（開始）および／または終わりの（終止）ゲノム場所／位置、一方もしくは両方の末端における配列リードの部分配列、配列リードの長さ、ならびに／または試料中の元の核酸分子の長さ）と組み合わせた検出により、典型的には、一意的な同一性の、特定の分子への割り当てが可能となる。一部の実施形態では、非一意的にタグ付けされた分子バーコードの、内因性配列情報（例えば、配列リードの参照配列へのアライメントの始まりの（開始）および／または終わりの（終止）領域、一方もしくは両方の末端における配列リードの部分配列、配列リードの長さ、および／または試料中の元の核酸分子の長さ）と組み合わせた検出により、典型的には、一意的な同一性の、特定の分子への割り当てが可能となる。一部の実施形態では、始まりの領域は、シーケンシングリードの５’末端が参照配列に対する整列を開始することが決定されるシーケンシングリードのゲノム開始位置を含み、終わりの領域は、シーケンシングリードの３’末端が参照配列に対する整列を終止することが決定されるシーケンシングリードのゲノム終止位置を含む。一部の実施形態では、始まりの領域は、参照配列に対して整列するシーケンシングリードの５’末端の最初の１、最初の２、最初の５、最初の１０、最初の１５、最初の２０、最初の２５、最初の３０、または少なくとも最初の３０塩基位置を含む。一部の実施形態では、終わりの領域は、参照配列に対して整列するシーケンシングリードの３’末端の最後の１、最後の２、最後の５、最後の１０、最後の１５、最後の２０、最後の２５、最後の３０、または少なくとも最後の３０塩基位置を含む。
個々の配列リードの長さまたは塩基対の数もまた、一意的な同一性を所定の分子に割り当てるために必要に応じて使用される。本明細書に記載されるように、一意的な同一性が割り当てられている核酸の一本鎖由来の断片により、その後の親鎖および／または相補鎖由来の断片の識別が可能となり得る。
一部の実施形態では、分子バーコードは、識別子のセット（例えば、一意的または非一意的分子バーコードの組合せ）の試料中の分子に対する予想される比で導入される。一例のフォーマットは、標的分子の両末端にライゲーションされた約２～約１，０００，０００個の異なる分子バーコード配列、または約５～約１５０個の異なる分子バーコード配列、または約２０～約５０個の異なる分子バーコード配列を使用する。あるいは、約２５～約１，０００，０００個の異なる分子バーコード配列を使用してもよい。例えば、２０～５０×２０～５０個の分子バーコード配列（すなわち、２０～５０個の異なる分子バーコード配列のうちの１つを標的分子の各末端に付着させることができる）を使用することができる。そのような識別子の数は、典型的には、同じ開始点および終止点を有する異なる分子が、識別子の異なる組合せを受ける確率が高くなる（例えば、少なくとも９４％、９９．５％、９９．９９％、または９９．９９９％）ために十分である。一部の実施形態では、分子の約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％が分子バーコードの同じ組合せを有する。
一部の実施形態では、反応における一意的または非一意的分子バーコードの割り当ては、例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００１００５３５１９号、第２００３０１５２４９０号、および第２０１１０１６００７８号、ならびに米国特許第６，５８２，９０８号、第７，５３７，８９８号、第９，５９８，７３１号、および第９，９０２，９９２号に記載される方法およびシステムを使用して実施される。あるいは、一部の実施形態では、内因性配列情報（例えば、開始および／または終止位置、配列の一方または両方の末端の部分配列、および／または長さ）のみを使用して、試料の異なる核酸分子を識別してもよい。
サブセット識別子バーコードは、断片サイズ対照分子の識別子領域の一部であり得る。サブセット識別子バーコードを使用して、断片サイズ対照分子が属するサブセット（すなわち、断片サイズ対照分子がサブセット１またはサブセット２のいずれに属するか）を識別する。サブセット識別子バーコードは、サブセットにおける全ての断片サイズ対照分子に関して同じであり得、同様に、１つのサブセットのサブセット識別子バーコードは、同じ試料中および／または同じバッチ中で使用される他の試料中の他のサブセットのサブセット識別子バーコードとは異なり得る。一部の実施形態では、１つの試料中の１つのサブセットのサブセット識別子バーコードは、他の試料中の対応するサブセットのサブセット識別子バーコードとは異なり得る。例えば、断片サイズ対照分子を使用して試料の汚染を評価する場合、１つのサブセットのサブセット識別子バーコードは、同じフローセル／バッチ内の全ての他の試料において使用されるその対応するサブセットのサブセット識別子バーコードとは異なる。一部の実施形態では、識別子領域は、１つの試料の断片サイズ対照分子を他の試料の断片サイズ対照分子と区別するために試料インデックスを含み得る。例えば、富化ステップの後に添加された断片サイズ対照分子のサブセットの識別子領域は、試料インデックス配列を含み得る。
一部の実施形態では、反応における一意的または非一意的分子バーコードの割り当ては、例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００１００５３５１９号、第２００３０１５２４９０号、および第２０１１０１６００７８号、ならびに米国特許第６，５８２，９０８号、第７，５３７，８９８号、第９，５９８，７３１号、および第９，９０２，９９２号に記載される方法およびシステムを使用して実施される。
Ｃ．増幅
試料核酸および断片サイズ対照分子を、アダプターに隣接させ、増幅されるＤＮＡ分子に隣接するアダプター中のプライマー結合部位に結合する核酸プライマーを使用してＰＣＲおよび他の増幅方法によって増幅することができる。一部の実施形態では、増幅方法は、サーモサイクリングに起因する伸長、変性、およびアニーリングのサイクルを伴うか、または例えば転写媒介増幅において等温的であり得る。必要に応じて利用され得る増幅方法の他の例としては、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸配列に基づく増幅、および自家持続配列に基づく複製が挙げられる。
典型的には、増幅反応は、約１５０ヌクレオチド（ｎｔ）～約７００ｎｔ、２５０ｎｔ～約３５０ｎｔ、または約３２０ｎｔ～約５５０ｎｔの範囲のサイズの、分子バーコードおよび試料インデックスを有する複数の非一意的または一意的にタグ付けされた核酸分子を生成する。一部の実施形態では、アンプリコンは約１８０ｎｔのサイズを有する。一部の実施形態では、アンプリコンは約２００ｎｔのサイズを有する。
Ｄ．富化
一部の実施形態では、配列は核酸をシーケンシングする前に富化される。富化は、必要に応じて特異的標的領域についてまたは非特異的に行われる（「標的配列」）。一部の実施形態では、目的の標的化領域は、示差的タイリングおよび捕捉スキームを使用して１つまたは複数のベイトセットパネルのために選択された核酸捕捉プローブ（「ベイト」）によって富化され得る。示差的タイリングおよび捕捉スキームは一般的に、様々な相対的濃度のベイトセットを使用して、一連の制約（例えば、シーケンシング負荷などのシーケンサーの制約、各ベイトの有用性）を受けながら、ベイトに関連するゲノム領域にわたって示差的にタイリングし（例えば、異なる「分解能」で）、下流のシーケンシングのために所望のレベルで標的化核酸を捕捉する。目的のこれらの標的化ゲノム領域は、必要に応じて核酸構築物の天然または合成ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の目的の領域に対するプローブを有するビオチン標識ビーズを使用して、標的配列を捕捉し、必要に応じて、その後それらの領域を増幅させて、目的の領域を富化することができる。
配列捕捉は、典型的には、標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を伴う。一部の実施形態では、プローブセット戦略は、目的の領域にわたってプローブをタイリングすることを伴う。そのようなプローブは、例えば、約６０～約１２０ヌクレオチド長であり得る。セットは、約２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１５×、２０×、５０×、または５０×を超える深さ（例えば、カバレッジの深さ）を有し得る。配列捕捉の有効性は一般的に、一部にはプローブの配列と相補的な（またはほぼ相補的な）標的分子内の配列の長さに依存する。
Ｅ．シーケンシング
必要に応じてアダプターに隣接させ、予め増幅させたまたはさせていない試料核酸および断片サイズ対照分子を、一般的にシーケンシングに供する。必要に応じて利用されるシーケンシング方法または市販のフォーマットとしては、例えば、サンガーシーケンシング、ハイスループットシーケンシング、パイロシーケンシング、合成によるシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアに基づくシーケンシング、半導体シーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、大規模並列シーケンシング、Ｃｌｏｎａｌ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｒｒａｙ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガンシーケンシング、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｇｅｎｉａ、Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング、プライマーウォーキング、ＰａｃＢｉｏ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、またはＮａｎｏｐｏｒｅプラットフォームを使用するシーケンシングが挙げられる。シーケンシング反応は、複数の試料セットを実質的に同時に処理する複数のレーン、複数のチャネル、複数のウェル、または他の手段を含み得る多様な試料処理装置で実施することができる。試料処理装置は、複数の動作を同時に処理することを可能にするために複数の試料チャンバーも含み得る。
シーケンシング反応は、がんまたは他の疾患のマーカーを含有する１つまたは複数の核酸断片型または領域に対して実施することができる。シーケンシング反応はまた、試料中に存在する任意の核酸断片に対して実施することもできる。シーケンシング反応は、ゲノムの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または１００％について実施することができる。他の場合では、シーケンシング反応を、ゲノムの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または１００％未満について実施することができる。
同時シーケンシング反応を、マルチプレックスシーケンシング技法を使用して実施することができる。一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドを、少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、または１００，０００のシーケンシング反応でシーケンシングする。他の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドを、約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、または１００，０００未満のシーケンシング反応でシーケンシングする。シーケンシング反応は、典型的には、逐次的または同時に実施される。その後のデータ分析は、一般的に、シーケンシング反応の全部または一部について実施される。一部の実施形態では、データ分析を、少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、または１００，０００のシーケンシング反応について実施する。他の実施形態では、データ分析を、約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、または１００，０００未満のシーケンシング反応について実施してもよい。リードの深さの例は、座（例えば、塩基位置）当たり約１０００～約５００００リードである。
Ｆ．分析
シーケンシングにより、複数の配列リードまたはリードが生成され得る。シーケンシングリードまたはリードは、約１５０塩基未満の長さ、または約９０塩基未満の長さのヌクレオチド配列データを含み得る。一部の実施形態では、リードは、約８０塩基～約９０塩基の間、例えば、約８５塩基の長さである。一部の実施形態では、本開示の方法を非常に短いリード、例えば、約５０塩基未満または約３０塩基の長さに適用する。配列リードデータは、配列データならびにメタ情報を含み得る。配列リードデータは、例えば、ＶＣＦファイル、ＦＡＳＴＡファイル、またはＦＡＳＴＱファイルを含む任意の適切なファイルフォーマットに保存することができる。
ＦＡＳＴＡは、配列データベースを検索するためのコンピュータプログラムを指し得、ＦＡＳＴＡという名称は、標準ファイルフォーマットも指し得る。ＦＡＳＴＡは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， １９８８， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ， ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８によって記載されている。ＦＡＳＴＡフォーマットの配列は、一行の説明行で始まり、その後に配列データの行が続く。説明行は最初の列の大なり（「＞」）記号によって配列データと区別される。「＞」記号に続くワードが配列の識別子であり、行の残りは説明である（いずれも必要に応じて）。「＞」と識別子の最初の文字の間にスペースがなくてもよい。文字列の全ての行が８０文字未満であることが推奨される。「＞」から始まる別の行が出現すると配列が終わり、これは、別の配列の始まりを示す。
ＦＡＳＴＱフォーマットは、生物学的配列（通常ヌクレオチド配列）およびその対応するクオリティスコアの両方を保存するためのテキストに基づくフォーマットである。ＦＡＳＴＱフォーマットはＦＡＳＴＡフォーマットと同様であるが、配列データの後にクオリティスコアが続く。簡潔にするために配列文字およびクオリティスコアの両方を単一のＡＳＣＩＩ文字で符号化する。ＦＡＳＴＱフォーマットは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（“Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ ＦＡＳＴＱ ｆｉｌｅ ｆｏｒｍａｔ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅｓ， ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＦＡＳＴＱ ｖａｒｉａｎｔｓ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８ （６）： １７６７－１７７１， ２００９）によって記載されるように、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒなどのハイスループットシーケンシング機器の出力を保存するための事実上の標準である。
ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＱファイルに関しては、メタ情報は説明行を含み、配列データの行は含まない。一部の実施形態では、ＦＡＳＴＱファイルに関して、メタ情報はクオリティスコアを含む。ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＱファイルに関して、配列データは説明行の後に始まり、一般的には、ＩＵＰＡＣ多義性コードのいくつかのサブセットを使用し、必要に応じて「－」を伴って存在する。ある実施形態では、配列データは、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＮ文字を使用することができ、必要に応じて「－」または必要であればＵを含む（例えば、ギャップまたはウラシルを表すために）。
一部の実施形態では、少なくとも１つのマスター配列リードファイルおよび出力ファイルは、プレーンテキストファイルとして保存される（例えば、ＡＳＣＩＩ；ＩＳＯ／ＩＥＣ ６４６；ＥＢＣＤＩＣ；ＵＴＦ－８；またはＵＴＦ－１６などのエンコーディングを使用する）。本開示によって提供されるコンピュータシステムは、プレーンテキストファイルを開くことが可能なテキストエディタプログラムを含み得る。テキストエディタプログラムは、テキストファイル（例えば、プレーンテキストファイルなど）の内容をコンピュータスクリーン上に提示することが可能で、人がテキストを編集することができる（例えば、モニター、キーボード、およびマウスを使用して）コンピュータプログラムを指し得る。テキストエディタの例としては、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄ、ｅｍａｃｓ、ｐｉｃｏ、ｖｉ、ＢＢＥｄｉｔ、およびＴｅｘｔＷｒａｎｇｌｅｒが挙げられるがこれらに限定されない。テキストエディタプログラムは、プレーンテキストファイルをコンピュータスクリーン上に表示し、メタ情報および配列リードを人が読むことが可能なフォーマット（例えば、バイナリコードされているのではなく、印刷または人が書く場合に使用され得る英数字を使用する）で示すことが可能であり得る。
方法を、ＦＡＳＴＡまたはＦＡＳＴＱファイルに関連して考察してきたが、本開示の方法およびシステムを使用して、例えば、Ｖａｒｉａｎｔ Ｃａｌｌ Ｆｏｒｍａｔ（ＶＣＦ）フォーマットのファイルを含む任意の適切な配列ファイルフォーマットを圧縮することができる。典型的なＶＣＦファイルは、ヘッダーセクションおよびデータセクションを含み得る。ヘッダーは、任意の数のメタ情報行を含有し、各々は「＃＃」文字で始まり、ＴＡＢで区切られるフィールド定義行が単一の「＃」文字で始まる。フィールド定義行により８つの必須列が指名され、本文セクションは、フィールド定義行によって定義される列を集合させたデータの行を含有する。ＶＣＦフォーマットは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｎｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（“Ｔｈｅ ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌ ｆｏｒｍａｔ ａｎｄ ＶＣＦ ｔｏｏｌｓ，” Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２７（１５）：２１５６－２１５８， ２０１１）によって記載されている。ヘッダーセクションは圧縮されたファイルに書き込むためのメタ情報として扱うことができ、データセクションは行として扱うことができ、その各々が、一意的な場合に限りマスターファイルに保存され得る。
一部の実施形態は、配列リードのアセンブリを提供する。アライメントによるアセンブリでは、例えば、配列リードを互いに整列させるかまたは参照配列に対して整列させる。各リードを参照ゲノムに対して順番に整列させることにより、リードの全てが互いに関連して配置されて、アセンブリを作出する。加えて、配列リードを参照配列に対して整列またはマッピングすることを使用して、配列リード内のバリアント配列を識別することもできる。疾患もしくは状態の診断もしくは予後判定をさらに補助するため、または処置決定を手引きするために、バリアント配列を識別することを、本明細書に記載の方法およびシステムと組み合わせて使用することができる。
一部の実施形態では、ステップのいずれかまたは全てを自動化する。あるいは、本開示の方法を、例えば、各々が必要に応じてＣ＋＋などのコンパイル型言語で書かれた１つまたは複数の専用プログラムに完全にまたは部分的に具体化し、次いで、コンパイルし、バイナリとして配布することができる。本開示の方法は、完全にまたは部分的に、既存の配列分析プラットフォーム内のモジュールとして、または既存の配列分析プラットフォーム内のファンクションを呼び出すことによってインプリメントすることができる。一部の実施形態では、本開示の方法は、全て単一の開始キュー（例えば、人による作業、別のコンピュータプログラム、または機械から供給される誘発事象の１つまたは組合せ）に応答して自動的に呼び出されるいくつかのステップを含む。このように、本開示は、任意のまたはステップまたはステップの任意の組合せがキューに応答して自動的に起こり得る方法を提供する。「自動的に」とは、一般に、人による入力、影響、または相互作用を介さないことを意味する（例えば、元のまたはキュー前の人による作業にのみ応答する）。
本開示の方法は、対象の核酸試料に関する正確かつ高感度の解釈を含む、様々な形態の出力も包含し得る。検索の出力は、コンピュータファイルのフォーマットで提供することができる。一部の実施形態では、出力は、ＦＡＳＴＡファイル、ＦＡＳＴＱファイル、またはＶＣＦファイルである。出力を処理して、参照ゲノムの配列に対して整列させた核酸の配列などの配列データを含有するテキストファイル、またはＸＭＬファイルを作成することができる。他の実施形態では、処理により、参照ゲノムと比較して対象核酸における１つまたは複数の突然変異を記述する座標またはストリングを含有する出力がもたらされる。アライメントストリングは、Ｓｉｍｐｌｅ ＵｎＧａｐｐｅｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔ（ＳＵＧＡＲ）、Ｖｅｒｂｏｓｅ Ｕｓｅｆｕｌ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｇａｐｐｅｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔ（ＶＵＬＧＡＲ）、およびＣｏｍｐａｃｔ Ｉｄｉｏｓｙｎｃｒａｔｉｃ Ｇａｐｐｅｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔ（ＣＩＧＡＲ）（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１ （１０）： １７２５－９， ２００１によって記載されている）を含み得る。これらのストリングは、例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈｉｎｘｔｏｎ，ＵＫ）のＥｘｏｎｅｒａｔｅ配列アライメントソフトウェアにおいてインプリメントすることができる。
一部の実施形態では、例えば、ＣＩＧＡＲストリングを含む、配列アライメントマップ（ＳＡＭ）またはバイナリアライメントマップ（ＢＡＭ）ファイルなどの配列アライメントを作成する（ＳＡＭフォーマットは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ ｆｏｒｍａｔ ａｎｄ ＳＡＭｔｏｏｌｓ，” Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ２５ （１６）： ２０７８－９， ２００９によって記載されている）。一部の実施形態では、ＣＩＧＡＲは、行当たり１つのギャップを有するアライメントを表示するかまたは含む。ＣＩＧＡＲは、ＣＩＧＡＲストリングとして報告される圧縮されたペアワイズアライメントフォーマットである。ＣＩＧＡＲストリングは、長い（例えば、ゲノム）ペアワイズアライメントを表すために有用であり得る。ＣＩＧＡＲストリングをＳＡＭフォーマットで使用して、参照ゲノム配列に対するリードのアライメントを表してもよい。
ＣＩＧＡＲストリングは、確立されたモチーフに従い得る。各文字の前には、事象の塩基数を与える数が示される。使用される文字は、Ｍ、Ｉ、Ｄ、Ｎ、およびＳを含み得る（Ｍ＝マッチ；Ｉ＝挿入；Ｄ＝欠失；Ｎ＝ギャップ；Ｓ＝置換）。ＣＩＧＡＲストリングは、マッチおよび／またはミスマッチおよび欠失（またはギャップ）の配列を定義する。例えば、ＣＩＧＡＲストリング２ＭＤ３Ｍ２Ｄ２Ｍは、アライメントが２つのマッチ、１つの欠失（スペースを節約するために数字の１は省略される）、３つのマッチ、２つの欠失、および２つのマッチを含有することを示し得る。
一部の実施形態では、一方の末端または両方の末端に一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸上に平滑末端を酵素により形成することによって、核酸集団をシーケンシングのために調製する。これらの実施形態では、集団を典型的には、ヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴまたはＵ）の存在下で、５’－３’ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によって処理する。必要に応じて使用することができる酵素またはその触媒断片の例としては、クレノウ大断片およびＴ４ポリメラーゼが挙げられる。５’オーバーハングでは、酵素は典型的に、反対鎖上の陥凹３’末端を５’末端と平滑になるまで伸長させて平滑末端を産生する。３’オーバーハングでは、酵素は一般的に、３’末端から反対鎖の５’末端まで、および時にはそれを越えて消化する。この消化が反対鎖の５’末端を越えて進行する場合、５’オーバーハングのために使用される同じポリメラーゼ活性を有する酵素によってギャップを埋めることができる。二本鎖核酸上での平滑末端の形成により、例えば、アダプターの付着およびその後の増幅が容易となる。
一部の実施形態では、核酸集団を、一本鎖核酸から二本鎖核酸への変換および／またはＲＮＡからＤＮＡ（例えば、相補ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）への変換などの追加的な処理に供する。これらの形態の核酸もまた、必要に応じてアダプターに連結し、増幅させる。
事前の増幅の有無にかかわらず、上記の平滑末端を形成するプロセスに供された核酸および必要に応じて試料中の他の核酸をシーケンシングして、シーケンシングされた核酸を産生することができる。シーケンシングされた核酸は、核酸の配列（例えば、配列情報）またはその配列が決定されている核酸のいずれかを指し得る。シーケンシングは、試料中の個々の核酸分子の配列データを直接、または試料中の個々の核酸分子の増幅産物のコンセンサス配列から間接的に提供するように実施することができる。
一部の実施形態では、平滑末端形成後の試料中の一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸を、両末端でバーコードを含むアダプターに連結し、シーケンシングにより、核酸配列ならびにアダプターによって導入されたインラインバーコードを決定する。平滑末端ＤＮＡ分子を必要に応じて少なくとも部分的に二本鎖のアダプター（例えば、Ｙ字形状またはベル形状アダプター）の平滑末端にライゲーションする。あるいは、ライゲーションを容易にするために（例えば、付着末端ライゲーションのために）、試料核酸の平滑末端およびアダプターに、相補的ヌクレオチドによるテールを付加することができる。
核酸試料は、典型的には、同じ核酸の任意の２つのコピーが、両末端に連結したアダプター由来のアダプターバーコードの同じ組合せを受ける確率が低い（例えば、約１％または０．１％未満）、十分数のアダプターと接触させる。アダプターのこのような使用により、参照核酸における開始点および終止点が同じであり、バーコードの同じ組合せに連結された核酸配列のファミリーの識別が可能になり得る。そのようなファミリーは、増幅前の試料中の核酸の増幅産物の配列を表し得る。ファミリーメンバーの配列をコンパイルして、平滑末端形成およびアダプター付着によって修飾された元の試料中の核酸分子のコンセンサスヌクレオチドまたは完全なコンセンサス配列を導出することができる。言い換えれば、試料中の核酸の特定の位置を占有するヌクレオチドを、ファミリーメンバー配列のその対応する位置を占有するヌクレオチドのコンセンサスであると決定することができる。ファミリーは、二本鎖核酸の一方または両方の鎖の配列を含み得る。ファミリーのメンバーが二本鎖核酸の両方の鎖の配列を含む場合、配列をコンパイルしてコンセンサスヌクレオチド（複数可）または配列を導出する目的で、１つの鎖の配列をその相補体に変換することができる。一部のファミリーは、単一のメンバー配列のみを含む。この場合、この配列を、増幅前の試料中の核酸の配列とみなすことができる。あるいは、単一のメンバー配列のみを有するファミリーをその後の分析から除外することができる。
シーケンシングされた核酸におけるヌクレオチド変異（例えば、ＳＮＶまたはインデル）は、シーケンシングされた核酸を参照配列と比較することによって決定することができる。参照配列は、多くの場合、公知の配列、例えば、対象由来の公知の全または部分的ゲノム配列（例えば、ヒト対象由来の全ゲノム配列）である。参照配列は、例えばｈＧ１９またはｈＧ３８であり得る。シーケンシングされた核酸は、上記のように、試料中の核酸について直接決定された配列、またはそのような核酸の増幅産物の配列のコンセンサスを表し得る。比較は、参照配列の１つまたは複数の指定位置で実施することができる。それぞれの配列を最大限に整列させた場合に、参照配列の指定位置に対応する位置を含むシーケンシングされた核酸のサブセットを識別することができる。そのようなサブセット内では、もしあれば、どのシーケンシングされた核酸が指定位置にヌクレオチド変異を含むか、および必要に応じて、もしあれば、どれが参照ヌクレオチド（例えば、参照配列におけるものと同じ）を含むかを決定することができる。ヌクレオチドバリアントを含むサブセットにおけるシーケンシングされた核酸の数が選択された閾値を超える場合には、指定位置でバリアントヌクレオチドをコールすることができる。閾値は、ヌクレオチドバリアントを含むサブセット内のシーケンシングされた核酸の単純な数、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個であり得るか、または他の可能性の中でも、ヌクレオチドバリアントを含むサブセット内のシーケンシングされた核酸の比、例えば、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、もしくは２０であり得る。参照配列内の目的の任意の指定位置について比較を繰り返すことができる。時には、参照配列の少なくとも約２０、１００、２００、または３００の連続した位置、例えば、約２０～５００、または約５０～３００の連続した位置を占有する指定位置について比較を実施することができる。
本明細書に記載されるフォーマットおよび適用を含む核酸シーケンシングに関する追加の詳細はまた、例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １７： ９５－１１５ （２０１６）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２０１２， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ２５１３６４：１－１１ （２０１２）、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．， ５５： ６４１－６５８ （２００９）、ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７： ２８７－２９６ （２００９）、Ａｓｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．， １２８（５）：１７０５－１０ （２００６）、米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許第６，２５８，５６８号、米国特許第６，８３３，２４６号、米国特許第７，１１５，４００号、米国特許第６，９６９，４８８号、米国特許第５，９１２，１４８号、米国特許第６，１３０，０７３号、米国特許第７，１６９，５６０号、米国特許第７，２８２，３３７号、米国特許第７，４８２，１２０号、米国特許第７，５０１，２４５号、米国特許第６，８１８，３９５号、米国特許第６，９１１，３４５号、米国特許第７，５０１，２４５号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，１７０，０５０号、米国特許第７，３０２，１４６号、米国特許第７，３１３，３０８号、および米国特許第７，４７６，５０３号にも提供される。
ＩＶ．コンピュータシステム
本開示の方法は、コンピュータシステムを使用してまたはその助けを借りてインプリメントすることができる。例えば、（ａ）断片サイズ対照分子の第１のサブセットを、無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｂ）第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；（ｃ）断片サイズ対照分子の第２のサブセットを抽出された核酸に添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｄ）第２のスパイクイン試料の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第２のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；（ｅ）断片サイズ対照分子の第３のサブセットを処理された試料に添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｆ）第３のスパイクイン試料の少なくともサブセットを富化し、それによって富化された試料を産生するステップ；（ｇ）断片サイズ対照分子の第４のサブセットを富化された試料の少なくともサブセットに添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｈ）第４のスパイクイン試料をシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；（ｉ）複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子の複数の断片サイズスコアを生成するステップ；ならびに（ｊ）複数の断片サイズスコアを複数の断片サイズ閾値と比較するステップ、を含み得るそのような方法は、コンピュータプロセッサーによって実施することができる。この実施形態では、システムは、断片サイズ対照分子を付加する、分画する、増幅する、富化する、およびシーケンシングするための構成成分を含む。
図５は、本開示の方法をインプリメントするようにプログラムされたまたはそれ以外の方法で構成されたコンピュータシステム５０１を示す。コンピュータシステム５０１は、試料調製、シーケンシング、および／または分析の様々な態様を調節することができる。一部の例では、コンピュータシステム５０１は、核酸シーケンシングを含む試料調製および試料分析を実施するように構成される。
コンピュータシステム５０１は、中央演算処理装置（ＣＰＵ、本明細書において同様に「プロセッサー」、および「コンピュータプロセッサー」）５０５を含み、これは、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサー、または並列処理のための複数のプロセッサーであり得る。コンピュータシステム５０１はまた、メモリまたはメモリ位置５１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子ストレージユニット５１５（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース５２０（例えば、ネットワークアダプター）、ならびにキャッシュ、他のメモリ、データストレージ、および／または電子ディスプレイアダプターなどの周辺機器５２５も含む。メモリ５１０、ストレージユニット５１５、インターフェース５２０、および周辺機器５２５は、ＣＰＵ５０５と通信ネットワークまたはマザーボードなどのバス（実線）を通して通信する。ストレージユニット５１５は、データを記憶するためのデータストレージユニット（またはデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム５０１は、通信インターフェース５２０の助けを借りてコンピュータネットワーク５３０に作動可能にカップリングすることができる。コンピュータネットワーク５３０は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信するイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。コンピュータネットワーク５３０は、一部の場合では、電気通信および／またはデータネットワークである。コンピュータネットワーク５３０は、１つまたは複数のコンピュータサーバーを含むことができ、それにより、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる。コンピュータネットワーク５３０は、一部の場合では、コンピュータシステム５０１の助けを借りてピアツーピアネットワークをインプリメントすることができ、それにより、コンピュータシステム５０１にカップリングしたデバイスがクライアントまたはサーバーとして動作することが可能となり得る。
ＣＰＵ５０５は、プログラムまたはソフトウェアに具体化することができる一連の機械可読命令を実行することができる。命令は、メモリ５１０などのメモリ位置に記憶させることができる。ＣＰＵ５０５によって実施される操作の例は、フェッチ、復号、実行、およびライトバックを含み得る。
ストレージユニット５１５は、ドライバー、ライブラリ、および保存されたプログラムなどのファイルを記憶し得る。ストレージユニット５１５は、ユーザーによって作成されたプログラムおよび記録されたセッション、ならびにプログラムに関連する出力（複数可）を記憶し得る。ストレージユニット５１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザーの好みおよびユーザープログラムを記憶し得る。コンピュータシステム５０１は、一部の場合では、例えば、イントラネットまたはインターネットを通じてコンピュータシステム５０１と通信する遠隔サーバー上に位置するものなど、コンピュータシステム５０１に対して外付けの１つまたは複数の追加的なデータストレージユニットを含み得る。例えば通信ネットワークまたは物理的なデータ移行（例えば、ハードドライブ、サムドライブ、または他のデータストレージ機構を使用する）を使用して、データを１つの場所から別の場所に移行することができる。
コンピュータシステム５０１は、ネットワーク５３０を通して１つまたは複数の遠隔コンピュータシステムと通信することができる。具体化のために、コンピュータシステム５０１は、ユーザー（例えば、オペレーター）の遠隔コンピュータシステムと通信することができる。遠隔コンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ（例えば、携帯型ＰＣ）、スレートまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話機、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、または携帯情報端末が挙げられる。ユーザーは、ネットワーク５３０を介してコンピュータシステム５０１にアクセスすることができる。
本明細書に記載の方法は、コンピュータシステム５０１の電子ストレージ位置、例えば、メモリ５１０または電子ストレージユニット５１５などに記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサー）により実行可能なコードによってインプリメントすることができる。機械により実行可能なまたは機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用中、コードは、プロセッサー５０５により実行することができる。一部の場合では、コードをストレージユニット５１５から検索し、プロセッサー５０５による容易なアクセスのためにメモリ５１０に記憶させることができる。いくつかの状況では、電子ストレージユニット５１５を除外することができ、機械により実行可能な命令はメモリ５１０に記憶される。
一態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、方法の少なくとも一部を実施する、コンピュータで実行可能な命令を含む非一時的コンピュータ可読媒体であって、方法が（ａ）断片サイズ対照分子の第１のサブセットを、無細胞ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｂ）第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；（ｃ）断片サイズ対照分子の第２のサブセットを核酸に添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｄ）第２のスパイクイン試料の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、処理することが、第２のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；（ｅ）断片サイズ対照分子の第３のサブセットを処理された試料に添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｆ）第３のスパイクイン試料の少なくともサブセットを富化し、それによって富化された試料を産生するステップ；（ｇ）断片サイズ対照分子の第４のサブセットを富化された試料の少なくともサブセットに添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップ；（ｈ）第４のスパイクイン試料をシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；（ｉ）複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子の複数の断片サイズスコアを生成するステップ；ならびに（ｊ）複数の断片サイズスコアを複数の断片サイズ閾値と比較するステップを含む、非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。
コードを、プリコンパイルし、コードを実行するように適合させたプロセッサーを有する機械での使用のために構成することができるか、または実行時間の間にコンパイルすることができる。コードは、コードをプリコンパイル様式またはそのつどコンパイル（ａｓ－ｃｏｍｐｉｌｅｄ）様式で実行することが可能になるように選択することができるプログラミング言語で供給され得る。
コンピュータシステム５０１などの本明細書に提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングに具体化することができる。技術の様々な態様は、典型的には、機械可読媒体の一種で行われるまたは具体化される機械（またはプロセッサー）により実行可能なコードおよび／または関連データの形態の「製品」または「製造品」と考えることができる。機械により実行可能なコードは、電子ストレージユニット、そのようなメモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクに記憶させることができる。「ストレージ」型媒体は、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的ストレージを提供し得る、コンピュータ、プロセッサーなどのいずれかもしくは全ての有形メモリ、または例えば様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどのそれに関連するモジュールを含み得る。
ソフトウェアの全てまたは一部を、時にインターネットまたは種々の他の電気通信ネットワークを通じて通信させることができる。そのような通信により、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサーから別のコンピュータまたはプロセッサーに、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームにソフトウェアをロードすることが可能となり得る。このように、ソフトウェア要素を有し得る別の型の媒体としては、有線および光固定電話ネットワークを通じて、ならびに様々なエアリンクによってローカルデバイス間で物理的インターフェースを横切って使用される媒体などの光波、電波、および電磁波が挙げられる。例えば有線または無線リンク、光リンクなどの、そのような波を運ぶ物理的要素もソフトウェアを有する媒体とみなされ得る。本明細書で使用される場合、非一時的な有形「ストレージ」媒体に制限される場合を除き、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のための命令をプロセッサーに提供することに関与する任意の媒体を指す。
したがって、コンピュータで実行可能なコードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理的伝送媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態を取り得る。非揮発性記憶媒体としては、例えば光学または磁気ディスク、例えば図面に示されているデータベースなどをインプリメントするために使用することができるものなどの、任意のコンピュータなどにおけるストレージデバイスのいずれかが挙げられる。揮発性記憶媒体としては、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリが挙げられる。有形伝達媒体としては、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを含む電線を含む銅線および光ファイバーが挙げられる。搬送波伝送媒体は、高周波（ＲＦ）および赤外（ＩＲ）データ通信中に生成するものなどの、電気シグナルもしくは電磁気シグナル、または音波もしくは光波の形態を取り得る。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレシキブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、搬送波伝達データもしくは命令、そのような搬送波を輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み取ることができる任意の他の媒体が挙げられる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、実行のためにプロセッサーに１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスを運ぶことに関与し得る。
コンピュータシステム５０１は、例えば、試料分析の１つまたは複数の結果を提供するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）を含む電子ディスプレイを含むか、またはそれと通信することができる。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブに基づくユーザーインターフェースが挙げられるがこれらに限定されない。
コンピュータシステムおよびネットワーク、データベース、およびコンピュータプログラム製品に関する追加的な詳細は、例えば、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ： Ａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍｏｒｇａｎ Ｋａｕｆｍａｎｎ， ５ｔｈ Ｅｄ． （２０１１）、Ｋｕｒｏｓｅ， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋｉｎｇ： Ａ Ｔｏｐ－Ｄｏｗｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｐｅａｒｓｏｎ， ７ｔｈ Ｅｄ． （２０１６）、Ｅｌｍａｓｒｉ， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ， ６ｔｈ Ｅｄ． （２０１０）、Ｃｏｒｏｎｅｌ， Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ： Ｄｅｓｉｇｎ， Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ， ＆ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ， Ｃｅｎｇａｇｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， １１ｔｈ Ｅｄ． （２０１４）、Ｔｕｃｋｅｒ， Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｌａｎｇｕａｇｅｓ， ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｍａｔｈ， ２ｎｄ Ｅｄ． （２００６）、およびＲｈｏｔｏｎ， Ｃｌｏｕｄ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｅｄ： Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｐｒｅｓｓ （２０１１）においても提供される。
Ｖ．適用
Ａ．がんおよび他の疾患
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法およびシステムを使用して、カスタマイズされたまたは標的化治療を識別して、核酸バリアントが体細胞または生殖細胞系列起源であるかの分類に基づいて、患者における所定の疾患または状態を処置することができる。典型的には、考慮される疾患は、がんの一種である。そのようながんの非限定的な例としては、胆道がん、膀胱がん、移行上皮癌、尿路上皮癌、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、乳癌、化生性癌、子宮頸がん、子宮頸部扁平上皮癌、直腸がん、結腸直腸癌、結腸がん、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がん、結腸直腸腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、食道がん、食道扁平上皮癌、食道腺癌、眼内黒色腫、ブドウ膜黒色腫、胆嚢癌、胆嚢腺癌、腎細胞癌、腎明細胞癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、ウィルムス腫瘍、白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、肝がん、肝癌、ヘパトーマ、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌（ＮＰＣ）、神経芽細胞腫、中咽頭がん、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、膵がん、膵管腺癌、偽乳頭状新生物、腺房細胞癌、前立腺がん、前立腺腺癌、皮膚がん、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、小腸癌、胃がん、胃癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮がん、または子宮肉腫が挙げられる。
本明細書に開示される方法およびシステムを使用して必要に応じて評価される他の遺伝子に基づく疾患、障害、または状態の非限定的な例としては、軟骨無形成症、アルファ１アンチトリプシン欠損症、抗リン脂質症候群、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、ネコ鳴き症候群、クローン病、嚢胞性線維症、ダーカム病、ダウン症候群、デュアン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、第Ｖ因子ライデン血栓形成傾向、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、全前脳症、ハンチントン病、クラインフェルター症候群、マルファン症候群、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、ヌーナン症候群、骨形成不全症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポーランド異常、ポルフィリン症、早老症、網膜色素変性症、重症複合免疫不全症（ｓｃｉｄ）、鎌状赤血球症、脊髄性筋萎縮症、テイ・サックス病、サラセミア、トリメチルアミン尿症、ターナー症候群、口蓋心臓顔面症候群、ＷＡＧＲ症候群、ウィルソン病などが挙げられる。
Ｂ．治療および関連する投与
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、体細胞または生殖細胞系列起源である核酸バリアントの状況を考慮して、患者に対するカスタマイズされた治療を識別し、投与することに関する。一部の実施形態では、本質的に任意のがん治療（例えば、外科療法、放射線療法、化学療法、および／または同様のもの）が、これらの方法の一部として含まれ得る。典型的には、カスタマイズされた治療は、少なくとも１つの免疫療法（または免疫療法剤）を含む。免疫療法は一般的に、所定のがんの型に対する免疫応答を増強する方法を指す。ある特定の実施形態では、免疫療法は、腫瘍またはがんに対するＴ細胞応答を増強する方法を指す。
ある特定の実施形態では、体細胞または生殖細胞系列起源である対象の試料由来の核酸バリアントの状況を、参照集団からの対照薬の結果のデータベースと比較して、その対象に関するカスタマイズされたまたは標的化治療を識別することができる。典型的には、参照集団は、試験対象と同じがんもしくは疾患の型を有する患者、および／または試験対象と同じ治療を受けているもしくは受けたことがある患者を含む。核バリアントおよび対照薬の結果がある特定の分類基準を満たす（例えば、実質的にまたはほぼマッチする）場合、カスタマイズされたまたは標的化治療（または複数の治療）が識別され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のカスタマイズされた治療は、典型的には非経口投与される（例えば、静脈内または皮下）。免疫療法剤を含有する医薬組成物は、典型的には静脈内投与される。ある特定の治療剤は経口投与される。しかし、カスタマイズされた治療（例えば、免疫療法剤など）をまた、例えば頬側、舌下、直腸、膣、尿道内、局部、眼内、鼻腔内、および／または耳介内などの方法によって投与してもよく、投与は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、水性懸濁剤、ゲル剤、噴霧剤、坐剤、膏薬、軟膏剤などを含み得る。
本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されているが、そのような実施形態が単に例として提供されていることは当業者には明白であろう。本発明が、本明細書内に提供される特定の実施例によって限定されることは意図されない。本発明を前述の明細書に関連して説明してきたが、本明細書の実施形態の説明および図表は、限定の意味で解釈されることを意味するものではない。当業者は、本発明から逸脱することなく多数の変形形態、変化および置換をすぐに思いつくであろう。さらに、本発明の全ての態様は、多様な条件および変数に依存する本明細書に記載の特定の描写、構成または相対的な割合に限定されないと理解すべきである。本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な代替を本発明の実施に用いることができると理解すべきである。したがって、本開示はまた、任意のそのような代替、改変、変形形態、または均等物も網羅するものとすることが企図される。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれにより網羅されると意図される。
前述の開示は、明瞭さおよび理解の目的のために実例としておよび例としていくぶん詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、形態および詳細の様々な変化を本開示の真の範囲から逸脱することなく行うことができ、添付の特許請求の範囲の範囲内で実施することができることが当業者には明らかであろう。例えば、方法、システム、コンピュータ可読媒体、および／または構成要素の特色、ステップ、要素、またはそれらの他の態様は全て、様々な組合せで使用することができる。
本明細書において引用されている特許、特許出願、ウェブサイト、他の刊行物または文書、受託番号などは全て、各個々の項目が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されるのと同程度に、全ての目的に関してその全体が参照により組み込まれる。異なるバージョンの配列が異なる時期に受託番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日に受託番号に関連付けられたバージョンが意図される。有効な出願日とは、実際の出願日または該当する場合には受託番号を参照する優先出願の出願日のいずれか早いほうを意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが異なる時期に公開されている場合、特に指定のない限り、本出願の有効な出願日に最も近い日に公開されたバージョンが意図される。

Claims (131)

  1. 既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含む断片サイズ対照分子のセットであって、既定の断片サイズ対照分子の前記少なくとも１つのサブセットが、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む、断片サイズ対照分子のセット。
  2. 前記少なくとも１つのサブセットが、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む、請求項１に記載の断片サイズ対照分子のセット。
  3. 群における前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、同じ長さの領域である、請求項２に記載の断片サイズ対照分子のセット。
  4. 断片サイズ対照分子の第１の群における前記断片サイズ領域の長さが、断片サイズ対照分子の第２の群における前記断片サイズ領域の長さとは異なる、請求項２または３に記載の断片サイズ対照分子のセット。
  5. 前記断片サイズ対照分子が、識別子領域をさらに含む、請求項１に記載の断片サイズ対照分子のセット。
  6. 前記識別子領域が、前記断片サイズ領域の片側または両側に存在する、請求項５に記載の断片サイズ対照分子のセット。
  7. 前記識別子領域が分子バーコードを含む、請求項５に記載の断片サイズ対照分子のセット。
  8. 前記複数の断片対照分子が、１つまたは複数のプライマー結合部位を含む、上記請求項のいずれかに記載の断片サイズ対照分子のセット。
  9. 前記１つまたは複数のプライマー結合部位が、前記識別子領域に存在する、請求項８に記載の断片サイズ対照分子のセット。
  10. 群における前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、同じオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２～４のいずれかに記載の断片サイズ対照分子のセット。
  11. 群における前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、少なくとも２つの区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２～９のいずれかに記載の断片サイズ対照分子のセット。
  12. 既定の断片サイズ対照分子の第１のサブセットにおける前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、既定の断片サイズ対照分子の第２のサブセットにおける前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域のオリゴヌクレオチド配列とは区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む、上記請求項のいずれかに記載の断片サイズ対照分子のセット。
  13. 前記断片サイズ領域の長さが、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、または少なくとも１０００ｂｐである、上記請求項のいずれかに記載の断片サイズ対照分子のセット。
  14. 前記断片サイズ領域の長さが、１０ｂｐ～１０００ｂｐの間である、上記請求項のいずれかに記載の断片サイズ対照分子のセット。
  15. 既定の断片サイズ対照分子の前記少なくとも１つのサブセットの各サブセットが、等モル濃度で存在する、上記請求項のいずれかに記載の断片サイズ対照分子のセット。
  16. 既定の断片サイズ対照分子の前記少なくとも１つのサブセットの各サブセットが、等しくないモル濃度で存在する、上記請求項のいずれかに記載の断片サイズ対照分子のセット。
  17. 前記少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の前記少なくとも１つの群の各群が、等モル濃度で存在する、上記請求項のいずれかに記載の断片サイズ対照分子のセット。
  18. 前記少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の前記少なくとも１つの群の各群が、等しくないモル濃度で存在する、請求項２～１６のいずれかに記載の断片サイズ対照分子のセット。
  19. ａ．既定の断片サイズ対照分子の少なくとも１つのサブセットを含む断片サイズ対照分子のセットであって、既定の断片サイズ対照分子の前記少なくとも１つのサブセットが断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む、断片サイズ対照分子のセット；および
    ｂ．対象からのポリヌクレオチドの試料中の核酸分子のセット
    を含む、核酸の集団。
  20. 前記少なくとも１つのサブセットが、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む、請求項１９に記載の核酸の集団。
  21. 群における前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、同じ長さの領域である、請求項２０に記載の核酸の集団。
  22. 断片サイズ対照分子の第１の群における前記断片サイズ領域の長さが、断片サイズ対照分子の第２の群における前記断片サイズ領域の長さとは異なる、請求項２０または２１に記載の核酸の集団。
  23. 前記断片サイズ対照分子が、識別子領域をさらに含む、請求項１９に記載の核酸の集団。
  24. 前記識別子領域が、前記断片サイズ領域の片側または両側に存在する、請求項２３に記載の核酸の集団。
  25. 前記識別子領域が分子バーコードを含む、請求項２３に記載の核酸の集団。
  26. 前記複数の断片対照分子が、１つまたは複数のプライマー結合部位を含む、請求項１９～２５のいずれかに記載の核酸の集団。
  27. 前記１つまたは複数のプライマー結合部位が、前記識別子領域に存在する、請求項２６に記載の核酸の集団。
  28. 群における前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、同じオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２０～２２のいずれかに記載の核酸の集団。
  29. 群における前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、少なくとも２つの区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２０～２７のいずれかに記載の断片サイズ対照分子のセット。
  30. 既定の断片サイズ対照分子の第１のサブセットにおける前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、既定の断片サイズ対照分子の第２のサブセットにおける前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域のオリゴヌクレオチド配列と区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１９～２９のいずれかに記載の核酸の集団。
  31. 前記断片サイズ領域の長さが、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、または少なくとも１０００ｂｐである、請求項１９～３０のいずれかに記載の核酸の集団。
  32. 前記断片サイズ領域の長さが、１０ｂｐ～１０００ｂｐの間である、請求項１９～３１のいずれかに記載の核酸の集団。
  33. 既定の断片サイズ対照分子の前記少なくとも１つのサブセットの各サブセットが、等モル濃度で存在する、請求項１９～３２のいずれかに記載の核酸の集団。
  34. 既定の断片サイズ対照分子の前記少なくとも１つのサブセットの各サブセットが、等しくないモル濃度で存在する、請求項１９～３３のいずれかに記載の核酸の集団。
  35. 前記少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の前記少なくとも１つの群の各群が、等モル濃度で存在する、請求項１９～３４のいずれかに記載の核酸の集団。
  36. 前記少なくとも１つのサブセットにおける断片サイズ対照分子の前記少なくとも１つの群の各群が、等しくないモル濃度で存在する、請求項２０～３４のいずれかに記載の核酸の集団。
  37. ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法であって：
    ａ）断片サイズ対照分子のサブセットをポリヌクレオチドの前記試料中の前記核酸分子に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；
    ｂ）前記第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；
    ｃ）前記抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、前記処理することが前記第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；
    ｄ）前記処理された試料の少なくともサブセットを富化し、それによって富化された試料を産生するステップ；
    ｅ）前記富化された試料の少なくともサブセットをシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびに
    ｆ）前記複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子の前記サブセットの複数の断片サイズスコアを生成するステップ
    を含む方法。
  38. ｃ）の前に、断片サイズ対照分子の第２のサブセットを添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  39. ｄ）の前に、断片サイズ対照分子の第３のサブセットを添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
  40. ｅ）の前に、断片サイズ対照分子の第４のサブセットを添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  41. ポリヌクレオチドの試料中の核酸分子を分析するための方法であって：
    ａ．断片サイズ対照分子の第１のサブセットをポリヌクレオチドの前記試料中の前記核酸分子に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；
    ｂ．前記第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；
    ｃ．断片サイズ対照分子の第２のサブセットを前記抽出された核酸に添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップ；
    ｄ．前記第２のスパイクイン試料の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、前記処理することが、前記第２のスパイクイン試料の前記少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；
    ｅ．断片サイズ対照分子の第３のサブセットを前記処理された試料に添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップ；
    ｆ．前記第３のスパイクイン試料の少なくともサブセットを富化し、それによって富化された試料を産生するステップ；
    ｇ．断片サイズ対照分子の第４のサブセットを前記富化された試料の少なくともサブセットに添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップ；
    ｈ．前記第４のスパイクイン試料をシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびに
    ｉ．前記複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子の前記第１のサブセット、断片サイズ対照分子の前記第２のサブセット、断片サイズ対照分子の前記第３のサブセット、および／または断片サイズ対照分子の前記第４のサブセットの複数の断片サイズスコアを生成するステップ
    を含む方法。
  42. 前記複数の断片サイズスコアを複数の断片サイズ閾値と比較するステップをさらに含む、請求項３７または４１に記載の方法。
  43. 前記複数の断片サイズスコアに基づいてポリヌクレオチドの前記試料中の核酸分子の前記分析を最適化するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記複数の断片サイズスコアを使用して、ポリヌクレオチドの前記試料中の核酸分子の前記分析における断片サイズバイアスを補正するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
  45. 前記方法を、（ｉ）前記複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが前記複数の断片サイズ閾値の対応する断片サイズ閾値内にある場合、成功である；または（ｉｉ）前記複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが前記複数の断片サイズ閾値の前記対応する断片サイズ閾値内にない場合、失敗であると分類するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
  46. 第１の試料の第２の試料による汚染を検出する方法であって、前記第１の試料および前記第２の試料の各々に関して：
    ａ．断片サイズ対照分子のサブセットを添加して第１のスパイクイン試料を生成するステップであって、前記第１の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記サブセットが、前記第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記サブセットと区別され得る、ステップ；
    ｂ．前記第１のスパイクインから核酸を抽出するステップ；
    ｃ．前記抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、前記処理することが、前記第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；
    ｄ．前記処理された試料の少なくともサブセットを富化し、それによって富化された試料を産生するステップ；
    ｅ．前記富化された試料の少なくともサブセットをシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびに
    ｆ．前記複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子の前記サブセットの１つまたは複数の汚染スコアを生成するステップ
    を含む方法。
  47. ｃ）の前に、断片サイズ対照分子の第２のサブセットを添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップであって、前記第１の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記サブセットが、前記第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記サブセットと区別され得る、ステップをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
  48. ｄ）の前に、断片サイズ対照分子の第３のサブセットを添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップであって、前記第１の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記サブセットが、前記第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記サブセットと区別され得る、ステップをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
  49. ｅ）の前に、断片サイズ対照分子の第４のサブセットを添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップであって、前記第１の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記サブセットが、前記第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記サブセットと区別され得る、ステップをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 第１の試料の第２の試料による汚染を検出する方法であって、前記第１の試料および前記第２の試料の各々に関して：
    ａ．断片サイズ対照分子の第１のサブセットを添加して第１のスパイクイン試料を生成するステップであって、前記第１の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記第１のサブセットが、前記第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記第１のサブセットと区別され得る、ステップ；
    ｂ．前記第１のスパイクインから核酸を抽出するステップ；
    ｃ．断片サイズ対照分子の第２のサブセットを前記抽出された核酸に添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップであって、前記第１の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記第２のサブセットが、前記第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記第２のサブセットと区別され得る、ステップ；
    ｄ．前記抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、前記処理することが、前記第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；
    ｅ．断片サイズ対照分子の第３のサブセットを前記抽出された核酸に添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップであって、前記第１の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記第３のサブセットが、前記第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記第３のサブセットと区別され得る、ステップ；
    ｆ．前記処理された試料の少なくともサブセットを富化するステップ；
    ｇ．断片サイズ対照分子の第４のサブセットを前記抽出された核酸分子に添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップであって、前記第１の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記第４のサブセットが、前記第２の試料に添加された断片サイズ対照分子の前記第４のサブセットと区別され得る、ステップ；
    ｈ．前記富化された試料の少なくともサブセットをシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびに
    ｉ．前記複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子の前記サブセットの１つまたは複数の汚染スコアを生成するステップ
    を含む方法。
  51. 少なくとも１つまたは複数の汚染スコアを少なくとも１つまたは複数の汚染閾値と比較するステップをさらに含む、請求項４６～５０に記載の方法。
  52. 前記第１の試料を、（ｉ）前記汚染スコアの少なくとも１つまたは複数が前記１つまたは複数の汚染閾値の対応する汚染閾値内にない場合、前記第２の試料によって汚染されている；または（ｉｉ）前記汚染スコアの少なくとも１つまたは複数が前記１つまたは複数の汚染閾値の前記対応する汚染閾値内にある場合、前記第２の試料によって汚染されていないと分類するステップをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 断片サイズ対照分子の前記サブセットが、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む、請求項３７～５２のいずれかに記載の方法。
  54. 前記断片サイズ対照分子が、識別子領域をさらに含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記サブセットが、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む、請求項５３または５４に記載の方法。
  56. 群における前記複数の断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、同じ長さの領域である、請求項５５に記載の方法。
  57. 断片サイズ対照分子の第１の群における前記断片サイズ領域の長さが、断片サイズ対照分子の第２の群における前記断片サイズ領域の長さとは異なる、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記識別子領域が、前記断片サイズ領域の片側または両側に存在する、請求項５４に記載の方法。
  59. 前記識別子領域が分子バーコードを含む、請求項５４に記載の方法。
  60. 前記断片サイズ対照分子が、１つまたは複数のプライマー結合部位を含む、上記請求項のいずれかに記載の方法。
  61. 前記プライマー結合部位が、前記識別子領域に存在する、請求項６０に記載の方法。
  62. 群における前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、同じオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項３７～６１のいずれかに記載の方法。
  63. 群における前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、少なくとも２つの区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項５５に記載の方法。
  64. 断片サイズ対照分子の第１のサブセットにおける前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、断片サイズ対照分子の第２のサブセットにおける前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域のオリゴヌクレオチド配列と区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項３７～６３のいずれかに記載の方法。
  65. 前記断片サイズ領域の長さが、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、または少なくとも１０００ｂｐである、請求項３７～６４のいずれかに記載の方法。
  66. 前記断片サイズ領域の長さが、１０ｂｐ～１０００ｂｐの間である、請求項３７～６４のいずれかに記載の方法。
  67. 前記断片サイズ対照分子の前記サブセットの各々が、等モル濃度で存在する、請求項３８～６６のいずれかに記載の方法。
  68. 前記断片サイズ対照分子の前記サブセットの各々が、等しくないモル濃度で存在する、請求項３８～６６のいずれかに記載の方法。
  69. 前記サブセットにおける前記断片サイズ対照分子の前記群の各々が、等モル濃度で存在する、請求項３７～６８のいずれかに記載の方法。
  70. 前記サブセットにおける前記断片サイズ対照分子の前記群の各々が、等しくないモル濃度で存在する、請求項３７～６８のいずれかに記載の方法。
  71. 前記分画することが、前記第２のスパイクイン試料の前記少なくともサブセットの前記核酸分子を複数の分画化セットに分画することを含む、請求項３７または４１に記載の方法。
  72. 前記複数の分画化セットが、前記第２のスパイクイン試料の前記核酸分子のエピジェネティック修飾レベルに基づいて分画された前記第２のスパイクイン試料の核酸分子を含む、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記タグ付けすることが、タグのセットを前記核酸に付着させて、タグ付けされた核酸の集団を産生することであって、前記タグ付けされた核酸が１つまたは複数のタグを含む、ことを含む、請求項３７または４１に記載の方法。
  74. 前記分画化に起因する複数の分画化セットの第１の分画化セットにおいて使用されるタグの前記セットが、前記複数の分画化セットの第２の分画化セットにおいて使用されるタグの前記セットとは異なる、請求項７３に記載の方法。
  75. タグの前記セットが、アダプターの前記核酸へのライゲーションによって前記核酸に付着され、前記アダプターが１つまたは複数のタグを含む、請求項７４に記載の方法。
  76. ポリヌクレオチドの試料のシーケンシングライブラリを産生するための方法であって：
    ａ）断片サイズ対照分子のサブセットを前記試料に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；
    ｂ）前記第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；
    ｃ）前記抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、前記処理することが、前記第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；ならびに
    ｄ）前記処理された試料の少なくともサブセットを富化するステップ
    を含む方法。
  77. ｃ）の前に、断片サイズ対照分子の第２のサブセットを添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
  78. ｄ）の前に、断片サイズ対照分子の第３のサブセットを添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
  79. ｅ）断片サイズ対照分子の第４のサブセットを添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記断片サイズ対照分子の濃度が、１アトモル～１０ピコモルの間である、請求項３７～７９のいずれかに記載の方法。
  81. ポリヌクレオチドの前記試料が、無細胞ポリヌクレオチドの試料である、請求項３７～８０のいずれかに記載の方法。
  82. 無細胞ポリヌクレオチドの前記試料が、無細胞ＤＮＡの試料および無細胞ＲＮＡの試料からなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
  83. 無細胞ポリヌクレオチドの前記試料が、無細胞ＤＮＡの試料である、請求項８１に記載の方法。
  84. 前記無細胞ＤＮＡが、１ｎｇ～５００ｎｇの間である、請求項８１に記載の方法。
  85. 少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合に方法を実施する非一時的コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むか、またはそれにアクセスすることが可能なコントローラを含むシステムであって、前記方法が：
    ａ．断片サイズ対照分子のサブセットをポリヌクレオチドの試料中の核酸分子に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；
    ｂ．前記第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；
    ｃ．前記抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、前記処理することが、前記第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；
    ｄ．前記処理された試料の少なくともサブセットを富化し、それによって富化された試料を産生するステップ；
    ｅ．前記富化された試料の少なくともサブセットをシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびに
    ｆ．前記複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子の前記サブセットの複数の断片サイズスコアを生成するステップを含む、システム。
  86. ｃ）の前に、断片サイズ対照分子の第２のサブセットを添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む、請求項８５に記載のシステム。
  87. ｄ）の前に、断片サイズ対照分子の第３のサブセットを添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む、請求項８６に記載のシステム。
  88. 前記方法が、ｅ）の前に、断片サイズ対照分子の第４のサブセットを添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む、請求項８７に記載のシステム。
  89. 少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合に方法を実施する非一時的コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むか、またはそれにアクセスすることが可能なコントローラを含むシステムであって、前記方法が：
    ａ．断片サイズ対照分子の第１のサブセットをポリヌクレオチドの試料中の核酸分子に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；
    ｂ．前記第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；
    ｃ．断片サイズ対照分子の第２のサブセットを前記抽出された核酸に添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップ；
    ｄ．前記第２のスパイクイン試料の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、前記処理することが、前記第２のスパイクイン試料の前記少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；
    ｅ．断片サイズ対照分子の第３のサブセットを前記処理された試料に添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップ；
    ｆ．前記第３のスパイクイン試料の少なくともサブセットを富化し、それによって富化された試料を産生するステップ；
    ｇ．断片サイズ対照分子の第４のサブセットを前記富化された試料の少なくともサブセットに添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップ；
    ｈ．前記第４のスパイクイン試料をシーケンシングして、複数の配列リードを生成するステップ；ならびに
    ｉ．前記複数の配列リードを分析して、断片サイズ対照分子の前記第１のサブセット、断片サイズ対照分子の前記第２のサブセット、断片サイズ対照分子の前記第３のサブセット、および／または断片サイズ対照分子の前記第４のサブセットの複数の断片サイズスコアを生成するステップ
    を含む、システム。
  90. 前記方法が、前記複数の断片サイズスコアを複数の断片サイズ閾値と比較するステップをさらに含む、請求項８５または８９に記載のシステム。
  91. 前記方法が、前記複数の断片サイズスコアに基づいてポリヌクレオチドの前記試料中の核酸分子の前記分析を最適化するステップをさらに含む、請求項９０に記載のシステム。
  92. 前記方法が、前記複数の断片サイズスコアを使用してポリヌクレオチドの前記試料中の核酸分子の前記分析における断片サイズバイアスを補正するステップをさらに含む、請求項９０に記載のシステム。
  93. 前記方法が、前記方法を、（ｉ）前記複数の断片サイズスコアの各々が前記複数の断片サイズ閾値の対応する断片サイズ閾値内にある場合、成功である；または（ｉｉ）前記複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが前記複数の断片サイズ閾値の前記対応する断片サイズ閾値内にない場合、失敗であると分類するステップをさらに含む、請求項９０に記載のシステム。
  94. 前記方法が、前記複数の断片サイズスコアの少なくとも１つを複数の汚染閾値の少なくとも１つと比較するステップをさらに含む、請求項８５または８９に記載のシステム。
  95. 前記試料を、（ｉ）前記複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが前記複数の汚染閾値の対応する汚染閾値内にない場合、別の試料によって汚染されている；または（ｉｉ）前記複数の断片サイズスコアの少なくとも１つが前記複数の汚染閾値の前記対応する汚染閾値内にある場合、別の試料によって汚染されていないと分類するステップをさらに含む、請求項９４に記載のシステム。
  96. 断片サイズ対照分子の前記サブセットが、断片サイズ領域を含む複数の断片サイズ対照分子を含む、請求項８５～９５のいずれかに記載のシステム。
  97. 前記断片サイズ対照分子が、識別子領域をさらに含む、請求項９６に記載のシステム。
  98. 断片サイズ対照分子の前記サブセットが、断片サイズ対照分子の少なくとも１つの群を含む、請求項９６に記載のシステム。
  99. 群における前記複数の断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、同じ長さの領域である、請求項９８に記載のシステム。
  100. 断片サイズ対照分子の第１の群における前記断片サイズ領域の長さが、断片サイズ対照分子の第２の群における前記断片サイズ領域の長さとは異なる、請求項９８に記載のシステム。
  101. 前記識別子領域が、前記断片サイズ領域の片側または両側に存在する、請求項９７に記載のシステム。
  102. 前記識別子領域が分子バーコードを含む、請求項９７に記載のシステム。
  103. 前記断片サイズ対照分子が、１つまたは複数のプライマー結合部位を含む、請求項８５～１０２のいずれかに記載のシステム。
  104. 前記プライマー結合部位が前記識別子領域に存在する、請求項１０３に記載のシステム。
  105. 群における前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、同じオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項８５～１０４のいずれかに記載のシステム。
  106. 群における前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、少なくとも２つの区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項９６に記載のシステム。
  107. 断片サイズ対照分子の第１のサブセットにおける前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域が、断片サイズ対照分子の第２のサブセットにおける前記断片サイズ対照分子の前記断片サイズ領域のオリゴヌクレオチド配列とは区別可能なオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項９６に記載のシステム。
  108. 前記断片サイズ領域の長さが、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、または少なくとも１０００ｂｐである、請求項８５～１０７のいずれかに記載のシステム。
  109. 前記断片サイズ領域の長さが、１０ｂｐ～１０００ｂｐの間である、請求項８５～１０７のいずれかに記載のシステム。
  110. 前記断片サイズ対照分子の前記サブセットの各々が、等モル濃度で存在する、請求項８５～１０９のいずれかに記載のシステム。
  111. 前記断片サイズ対照分子の前記サブセットの各々が、等しくないモル濃度で存在する、請求項８５～１０９のいずれかに記載のシステム。
  112. 前記サブセットにおける前記断片サイズ対照分子の前記群の各々が、等しくないモル濃度で存在する、請求項８５～１１１のいずれかに記載のシステム。
  113. 前記サブセットにおける前記断片サイズ対照分子の前記群の各々が、等モル濃度で存在する、請求項８５～１１１のいずれかに記載のシステム。
  114. 前記分画することが、前記第２のスパイクイン試料の前記少なくともサブセットの前記核酸分子を、複数の分画化セットに分画することを含む、請求項８５または８９に記載のシステム。
  115. 前記複数の分画化セットが、前記第２のスパイクイン試料の前記核酸分子のエピジェネティック修飾レベルに基づいて分画された前記第２のスパイクイン試料の核酸分子を含む、請求項１１４に記載のシステム。
  116. 前記タグ付けすることが、タグのセットを前記核酸に付着させて、タグ付けされた核酸の集団を産生することであって、前記タグ付けされた核酸が１つまたは複数のタグを含む、ことを含む、請求項８５または８９に記載のシステム。
  117. 前記分画化に起因する複数の分画化セットの第１の分画化セットにおいて使用されるタグの前記セットが、前記複数の分画化セットの第２の分画化セットに使用されるタグの前記セットとは異なる、請求項１１６に記載のシステム。
  118. タグの前記セットがアダプターの前記核酸へのライゲーションによって前記核酸に付着され、前記アダプターが１つまたは複数のタグを含む、請求項１１６に記載のシステム。
  119. 少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合に方法を実施する非一時的コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むか、またはそれにアクセスすることが可能なコントローラを含むシステムであって、前記方法が：
    ａ．断片サイズ対照分子のサブセットをポリヌクレオチドの試料に添加し、それによって第１のスパイクイン試料を産生するステップ；
    ｂ．前記第１のスパイクイン試料から核酸を抽出するステップ；
    ｃ．前記抽出された核酸の少なくともサブセットを処理し、それによって処理された試料を産生するステップであって、前記処理することが、前記第１のスパイクイン試料の少なくともサブセットを分画、タグ付け、および／または増幅することを含む、ステップ；ならびに
    ｄ．前記処理された試料の少なくともサブセットを富化するステップ
    を含む、システム。
  120. 前記方法が、ｃ）の前に、断片サイズ対照分子の第２のサブセットを添加し、それによって第２のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む、請求項１１９に記載のシステム。
  121. 前記方法が、ｄ）の前に、断片サイズ対照分子の第３のサブセットを添加し、それによって第３のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む、請求項１２０に記載のシステム。
  122. 前記方法が、ｅ）断片サイズ対照分子の第４のサブセットを添加し、それによって第４のスパイクイン試料を産生するステップをさらに含む、請求項１２１に記載のシステム。
  123. 前記断片サイズ対照分子の濃度が、１アトモル～１０ピコモルの間である、請求項８５～１２２のいずれかに記載のシステム。
  124. ポリヌクレオチドの前記試料が、無細胞ポリヌクレオチドの試料である、請求項８５～１２３のいずれかに記載のシステム。
  125. ポリヌクレオチドの前記試料が、無細胞ＤＮＡの試料および無細胞ＲＮＡの試料からなる群から選択される、請求項１２３に記載のシステム。
  126. 無細胞ポリヌクレオチドの前記試料が、無細胞ＤＮＡの試料である、請求項１２３に記載のシステム。
  127. 前記無細胞ＤＮＡが、１ｎｇ～５００ｎｇの間である、請求項１２６に記載のシステム。
  128. 必要に応じて、前記核酸分子の分析に関する情報および／または分析に由来する情報を含む報告書を作成するステップをさらに含む、または請求項３７～１２７いずれか１つに記載のシステムまたは方法。
  129. 試料が由来する対象または医療従事者などの第３者に報告書を伝達するステップをさらに含む、請求項１２８に記載の方法またはシステム。
  130. 前記断片サイズ対照分子が合成分子である、上記請求項のいずれかに記載の方法またはシステム。
  131. 前記断片サイズ対照分子が、ＰＣＲ増幅によってアンプリコンとして生成される、上記請求項のいずれかに記載の方法またはシステム。

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