JP3574682B2 - 新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アルコール、アルデヒド、ケトンの製造、特に光学活性アルコールの製造に有用な新規な２級アルコール脱水素酵素、該酵素の製造方法、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡにより形質転換された微生物、及び該酵素を用いてアルコール、アルデヒド、ケトン、特に光学活性アルコールを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物が産生する２級アルコール脱水素酵素としては、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ+ と略す）を要求するサーモアナエロビウム・ブロッキー (Thermoanaerobium brockii) 由来のアルコール脱水素酵素（J.Am.Chem.Soc. 108, 162-169 (1986)）が知られている。また、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+ と略す）を要求する２級アルコール脱水素酵素としては、ピキア・エスピー NRRL-Y-11328 （Pichia sp. NRRL-Y-11328: Eur.J.Biochem. 101, 401-406 (1979) ）、シュードモナス・エスピー SPD6 （Pseudomonas sp. SPD6: Bioorg.Chem. 19, 398-417 (1991) ）、シュードモナス・フルオレッセンス NRRL B-1244（Pseudomonas fluorescens NRRL B-1244: 特開昭59-17982号）、シュードモナス・マルトフィラ MB11L（Pseudomonas maltophilia MB11L: FEMS Microbiol.Lett. 93, 49-56 (1992)）、シュードモナス・エスピー PED（Pseudomonas sp. PED: J.Org.Chem. 57, 1526-1532 (1992) ）、シュードモナス・エスピー ATCC 21439 （Pseudomonas sp. ATCC 21439: Eur.J.Biochem. 119, 359-364 (1981)）、キャンディダ・ボイディニー SAHM （Candida boidinii SAHM: Biochim.Biophys.Acta 716, 298-307 (1992) ）、ミコバクテリウム・バカエ JOB-5（Mycobacterium vaccae JOB-5: J.Gen.Microbiol. 131, 2901-2907 (1985)）、ロドコッカス・ロドクロウス PNKb1（Rhodococcus rhodochrous PNKb1: Arch.Microbiol. 153, 163-168 (1990)）、コマモナス・テリゲナ（Comamonas terrigena: Biochim.Biophys.Acta 661, 74-86 (1981) ）、アースロバクター・エスピー SBA（Arthrobacter sp. SBA: 特開昭51-57882号）由来の酵素が報告されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの２級アルコール脱水素酵素の立体選択性は満足できるものではない。例えば、２級アルコール脱水素酵素の基質として最も報告の多い２−ブタノールに対して、（Ｓ）−２−ブタノールを立体選択的に酸化し、２−ブタノンを生成する活性を有する酵素は知られていない（シュードモナス・エスピー ATCC 21439 、シュードモナス・エスピー SPD6 、コマモナス・テリゲナ、キャンディダ・ボイディニー SAHM 又はピキア・エスピー NRRL-Y-11328 が産生する酵素においてはＲ体が優先的に酸化され、シュードモナス・フルオレッセンス NRRL B-1244が産生する酵素においては立体選択性を示さず、ミコバクテリウム・バカエ JOB-5、ロドコッカス・ロドクロウス PNKb1、シュードモナス・エスピー PED又はシュードモナス・マルトフィラ MB11Lが産生する酵素においてはその立体選択性は記載されていない）。なお、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来の１級アルコール脱水素酵素（SADH I）は、２−ブタノールに関してはＳ体を優先的に酸化するという報告があるが（Arch.Biochem.Biophys.,126,933-944(1968) 、J.Biol.Chem.,268,7792-7798(1993)）、その相対活性はエタノールの１％程度と極めて低く、到底実用に耐えられるものではない。
【０００４】
即ち、（Ｓ）−２−ブタノールを優先的に酸化する２級アルコール脱水素酵素はこれまで知られておらず、立体選択性の高い２級アルコール脱水素酵素を見い出すことが強く望まれていた。
【０００５】
また、該酵素の遺伝子をクローニングできれば、遺伝子工学の手法を用いて該酵素を大量に製造することが可能となるので、該酵素をコードする遺伝子をクローニングすることが強く望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、（Ｓ）−２−ブタノールを優先的に酸化する能力を有する微生物を広くスクリーニングし、キャンディダ属に属する微生物、特にキャンディダ・パラプシロシス (Candida parapsilosis）が（Ｓ）−２−ブタノールを優先的に酸化する能力を有することを見いだした。更に、この微生物を培養し、その菌体より（Ｓ）−２−ブタノールを酸化する酵素を精製した。そして、その性質を検討した結果、該酵素が（Ｓ）−２−ブタノールを高い立体選択性を持って酸化すること、更に（Ｓ）−２−ブタノール以外の多くの２級アルコールを立体選択的に酸化することを見いだした。
【０００７】
即ち、本発明は、次の（１）から（９）に示す理化学的性質を有する酵素を提供する。
（１）作用
ＮＡＤ+ を補酵素として、アルコールを酸化し、ケトン又はアルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨを補酵素として、ケトン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生成する。
【０００８】
（２）基質特異性
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とする。１級アルコールに比較して２級アルコールに対して活性が高い。２−ブタノールのＲ体に比較し２−ブタノールのＳ体を優先的に酸化する。
【０００９】
アルデヒド又は芳香族置換を含む脂肪族ケトンを還元反応の基質とする。
【００１０】
（３）分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、４万。
なお、本発明の酵素の上記以外の理化学的性質、及び酵素学的性質は以下の通りである。
【００１１】
（４）至適pH及び安定pH範囲
（Ｓ）−２−ブタノール酸化反応の至適ｐＨは８．５〜９．５である。２−ブタノン還元反応の至適ｐＨは５．５〜６．５である。
【００１２】
ｐＨ８．０〜１０．０で比較的安定である。
【００１３】
（５）作用適温の範囲
２５〜５５℃で活性が高く、５０℃が至適温度である。
【００１４】
（６）温度による失活の条件
４０℃１０分間の熱処理後でも９０％以上の残存活性を有する。
【００１５】
（７）阻害及び安定化
パラヒドロキシ安息香酸、塩化水銀、塩化銅、塩化亜鉛、Ｎ−エチルマレイミドなどのＳＨ試薬で阻害される。還元剤の２ーメルカプトエタノール、ジチオスレイトールで阻害され、ｏ−フェナントロリンで阻害されるが、エチレンジアミン４酢酸では阻害されない。
【００１６】
（８）精製方法
通常のタンパク質の精製方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、菌体を破砕後、プロタミン硫酸沈澱を行い、その遠心分離上清を硫酸アンモニウムを用いて塩析し、更に、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過を組み合わせることにより、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）で単一バンドになるまで精製することができ
る。
【００１７】
（９）等電点
等電点電気泳動に於いていくつかのバンドを生成するが、主要なバンドの等電点は、６．７であった。
【００１８】
なお、本明細書中の実施例を含む全ての２級アルコール脱水素酵素活性の測定は、以下に示す方法により行った。即ち、トリス−塩酸緩衝液（pH9.0 ）50μmol, ＮＡＤ+ 2.5 μmol, （Ｓ）−２−ブタノール50μmol 及び酵素を含む反応液中３０℃で反応させ、ＮＡＤＨの生成に由来する340nm の吸光度の増大を測定した。１Ｕは、１分間に 1μmol のＮＡＤＨの生成を触媒する酵素量とした。
【００１９】
また、本発明は、２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡを提供する。
即ち、本発明者らは、精製した２級アルコール脱水素酵素をリジルエンドペプチダーゼにより消化し、逆相ＨＰＬＣにより切断された断片を精製後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列の一部を決定した。得られたアミノ酸配列をもとにして、ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction) 用プライマーを合成し、キャンディダ・パラプシロシス (Candida parapsilosis）の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、２級アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子の一部を増幅し、その塩基配列（コア配列）を明らかにした。更に、得られたＤＮＡ配列（コア配列）の周辺領域の塩基配列を明らかにするために、キャンディダ・パラプシロシス (Candida parapsilosis）の染色体ＤＮＡをコア配列中にその認識配列が存在しない制限酵素 HaeII により消化し、生成したＤＮＡ断片をＴ４リガーゼにより自己環化し、逆ＰＣＲ（Nucleic Acids Res. 16, 8186 (1988)）用の鋳型ＤＮＡを調製した。次に、コア配列をもとに、コア配列の外側に向かうＤＮＡ合成の開始点となるプライマーを合成し、逆ＰＣＲによりコア配列の周辺領域を増幅した。得られたＤＮＡの塩基配列を明らかにした結果、自己環化したＤＮＡ中に、図６、７、８に示す２級アルコール脱水素酵素の全コード領域が含まれていることを確認した。更に、クローニングした遺伝子の大腸菌宿主中での発現産物が、キャンディダ・パラプシロシス由来の２級アルコール脱水素酵素と同様の活性を有することを確認した。
【００２０】
本願発明の、２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡは、２級アルコール脱水素酵素の活性を有していて、アミノ酸配列が実質的に図６、７、８に示されているおよび配列番号：２に記載の蛋白質をコードする塩基配列を含むことを特徴とする。ここで「実質的」とは、２級アルコール脱水素酵素の活性を有する限り、図６、７、８に示したおよび配列番号：２に記載のアミノ酸配列についてアミノ酸のいくつかの欠失、挿入、置換等があってもよいことを示すものである。本発明のＤＮＡには、図６、７、８に示したおよび配列番号：１に記載の１００８塩基からなるＤＮＡが含まれることはいうまでもないが、本願発明はこれに限られるものではない。なお、ＤＮＡがコードするアミノ酸配列についてアミノ酸のいくつかの欠失、挿入、置換等を生じるようにＤＮＡを改変することは、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異導入法など、周知の方法で適宜行うことができる。また、図６、７、８に示したおよび配列番号：１に記載の１００８塩基を含むＤＮＡまたは該ＤＮＡを適宜改変したＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ法をＭｎ2+イオンの存在下（通常０．５〜１０ｍＭの濃度）または特定のヌクレオチドの濃度を低くして行うことによって、ランダムに変異が導入されたＤＮＡを得ることができる。このようにして得られたＤＮＡのうち、２級アルコール脱水素酵素の活性を有するタンパク質をコードするものが、本願発明に含まれることはいうまでもない。
【００２１】
更に本発明は、アミノ酸配列が実質的に図６、７、８に示されている、および配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡにより形質転換された、２級アルコール脱水素酵素生産能を有する微生物を提供する。
【００２２】
本発明において形質転換の対象となる微生物は、２級アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡにより形質転換され、２級アルコール脱水素酵素活性を発現することができる微生物であればいかなるものでもよく、具体的には、イシェリヒア(Escherichia) 属，バチルス(Bacillus)属，シュードモナス(Pseudomonas) 属，セラチア(Serratia)属，ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属，コリネバクテリイウム(Corynebacterium) 属、ストレプトコッカス(Streptococcu)属、ラクトバチルス(Lactobacillus) 属など宿主，ベクター系の開発されている細菌、サッカロマイセス(Saccharomyces) 属，クライベロマイセス(Kluyveromyces) 属，シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces) 属，チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces) 、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ハンゼヌラ(Hansenula) 属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida) 属などの酵母、ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus) 属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma) 属などに属するカビなどが含まれる。
【００２３】
形質転換体の作製のための手順ないし、方法そのものは、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる。
【００２４】
微生物中において、本発明の遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこの遺伝子を挿入する必要がある。また、本発明のＤＮＡを微生物中で発現させるためには、それが有する遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡの5'- 側上流に、ターミネーターを3'- 側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては「Adv.Biochem.Eng. 43, 75-102 (1990)」又は「Yeast 8, 423-488 (1992) 」 などに詳細に記述されている。
【００２５】
例えば、イシェリヒア属特に大腸菌イシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR, pUC 系プラスミドを利用することが可能であり、lac(β−ガラクトシダーゼ), trp( トリプトファンオペロン), tac(lac, trp の融合), λファージ PL, PR などに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA 由来、ファージ由来 rrnB リボソーマルターミネーターなどを用いることができる。
【００２６】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194 系プラスミドなどが利用可能であり、染色体に直接挿入させることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとして apr( アルカリプロテアーゼ), npr(中性プロテアーゼ), amy( α−アミラーゼ) などが利用できる。
【００２７】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia) などで宿主ベクター系が開発されており、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド TOL プラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010 などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む） pKT240 などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ遺伝子（特開平5-284973号）などが利用できる。
【００２８】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum) においては、pAJ43 (Gene 39, 281 (1985)) などのプラスミドベクターが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００２９】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11 ( 特開昭57-183799 号), pCB101 （Mol.Gen.Genet. 196, 175 (1984)）などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００３０】
ストレプトコッカス(Streptococcu)属においては、pHV1301 (FEMS Microbiol.Lett. 26, 239 (1985)），pGK1（Appl.Environ.MIcrobiol. 50, 94 (1985) ）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００３１】
ラクトバチルス(Lactobacillus) 属においては、ストレプトコッカス属用に開発された pAMβ1 （J.Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されるているものが利用可能である。
【００３２】
サッカロマイセス(Saccharomyces) 属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae) においては、YRp 系，YEp 系，YCp 系，YIp 系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456 など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素), GAPDH( グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素), PHO( 酸性フォスファターゼ), GAL( β−ガラクトシダーゼ), PGK( ホスホグリセレートキナーゼ), ENO( エノラーゼ) などのプロモーター、ターミネーターが利用可能でる。
【００３３】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 2μm 系プラスミド, pKD1 系プラスミド（J.Bacteriol. 145, 382-390 (1981)），キラー活性に関与する pGKl1 由来プラスミド, クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子 KARS 系プラスミド，リボソームＤＮＡなどとの相同組換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456 など）などが利用可能である。また、ADH, PGK などに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００３４】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces) 属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来の ARS (自律複製に関与する遺伝子) 及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol.Cell.Biol. 6, 80 (1986) ）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来の ADH プロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987) ）。
【００３５】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces) においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zygosaccharomyces rouxii) 由来の pSB3 （Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビシエ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素) のプロモーター（Agri.Biol.Chem. 54, 2521 (1990) ）などが利用可能である。
【００３６】
ハンゼヌラ(Hansenula) 属においては、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ハンゼヌラ・ポリモルファ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1, HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991) ）。また、メタノールなどで誘導される AOX（アルコールオキシダーゼ), FDH( ギ酸脱水素酵素) のプロモーターなどが利用可能である。
【００３７】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・パストリス(Pichia pastoris) などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1, PARS2) などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol.Cell.Biol. 5, 3376 (1985) ）、高濃度培養とメタノールで誘導可能な AOX など強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。
【００３８】
キャンディダ(Candida) 属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa) 、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri.Biol.Chem. 51, 51, 1587 (1987) ）、これを利用したベクターが開発されている。
【００３９】
アスペルギルス(Aspergillus) 属においては、カビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989) ）。
【００４０】
トリコデルマ(Trichoderma) 属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989) ）。
【００４１】
本発明の酵素は、キャンディダ(Candida)属に属する下記（１）から（３）に示す性質を有する酵素を産生する微生物もしくはその変異株、又は該酵素をコードする遺伝子を異種の微生物宿主に導入し該酵素生産能を付与された遺伝子組換え体を培養することなどにより製造することができる。
【００４２】
（１）作用
ＮＡＤ+ を補酵素として、アルコールを酸化し、ケトン又はアルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨを補酵素として、ケトン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生成する。
【００４３】
（２）基質特異性
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とする。１級アルコールに比較して２級アルコールに対して活性が高い。２−ブタノールのＲ体に比較し２−ブタノールのＳ体を優先的に酸化する。
【００４４】
アルデヒド又は芳香族置換を含む脂肪族ケトンを還元反応の基質とする。
【００４５】
（３）分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、４万。
【００４６】
更に、本発明の２級アルコール脱水素酵素、又は該酵素を含む微生物（変異株や遺伝子組換え微生物を含む）もしくはその処理物を、芳香族で置換されてもよい脂肪族２級アルコール、例えば、２−ブタノール、２−オクタノール、フェニルエタノール、１，３−ブタンジオール、β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸エチルエステルなどのラセミ体アルコールに作用させ、光学異性体の一方（２−ブタノール、２−オクタノール、フェニルエタノール、１，３−ブタンジオール、β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸エチルエステルにおいてはそのＳ体）のみを酸化することにより、他方の光学活性アルコール（２−ブタノール、２−オクタノール、フェニルエタノール、１，３−ブタンジオール、β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸エチルエステルにおいてはそのＲ体）を生産することができる。この酸化反応により補酵素ＮＡＤ+ は還元され、ＮＡＤＨが生成する。
【００４７】
生成したＮＡＤＨは、例えば、微生物の有するＮＡＤＨをＮＡＤ+ に変換する能力により、ＮＡＤ+ に変換（再生）されることができる。また、グルタミン酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、ＮＡＤＨ脱水素酵素、ＮＡＤＨオキシダーゼなどのＮＡＤＨをＮＡＤ+ に酸化する活性を有する酵素、又はこれら酵素を含有する微生物もしくはその処理物を反応系に添加することにより、ＮＡＤ+ を再生することもできる。また、本発明の酵素の基質特異性を利用して、反応系にアセトン、２−ブタノンなどの安価な本酵素の還元反応の基質を共存させることにより、１種類の酵素でＮＡＤ+ の再生も同時に行うことができる。
【００４８】
また、ケトン体に本発明の２級アルコール脱水素酵素、又は該酵素を産生する微生物（変異株や形質転換微生物を含む）もしくはその処理物を作用させ、光学活性なアルコールを生産することができる。例えば、２−ブタノンから（Ｓ）−２−ブタノール、２−オクタノンから（Ｓ）−２−オクタノール、アセトフェノンから（Ｓ）−１−フェニルエタノール、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから（Ｓ）−１，３−ブタンジオール、アセト酢酸エステルから（Ｓ）−β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸エステルなどを生産することができる。この還元反応により補酵素ＮＡＤＨは酸化され、ＮＡＤ+ が生成する。
【００４９】
生成したＮＡＤ+ は、例えば、微生物の有するＮＡＤ+ をＮＡＤＨに変換する能力により、ＮＡＤＨに変換（再生）されることができる。このＮＡＤ+ 還元活性は、反応系にグルコース、エタノール、ギ酸などを添加することにより促進することが可能である。また、反応系に、ギ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素などのＮＡＤ+ をＮＡＤＨへ還元する能力を有する酵素、又はこれら酵素を含む微生物もしくはその処理物を添加することにより、ＮＡＤ+ の還元を行うこともできる。また、本発明の酵素の基質特異性を利用して、反応系にイソプロパノールやエタノールなどの酸化反応の基質を添加することにより、１種類の酵素でＮＡＤＨの再生反応を同時に行うこともできる。
【００５０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１］（２級アルコール脱水素酵素の精製）
キャンディダ・パラプシロシス IFO 1396 株をＹＭ培地（グルコース１０ｇ，バクトペプトン５ｇ，酵母エキス３ｇ，麦芽エキス３ｇ／Ｌ, pH6.0）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。
【００５２】
得られた湿菌体を超高圧細胞破砕装置により菌体を破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、核酸及びミクロゾームを除去した。遠心分離により得られた上清に、硫安を添加して７０％飽和において沈澱した画分を回収した。更に、Ｑ−セファロースＦＦを用いたアニオン交換クロマトグラフィーを行い、塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行い、２級アルコール脱水素酵素活性を有するピークを回収した。得られた画分を１．６２Ｍ硫安を含む緩衝液で平衡化したフェニル−セファロースに添加し、疎水クロマトグラフィーを行った。硫安濃度を０Ｍまで減少させ、２級アルコール脱水素酵素活性画分を回収した（酵素活性の測定法は前述の方法で行った）。この活性画分をレッド−セファロースのアフィニティーカラムに添加し、素通り画分をスーパーデックス２００のゲルろ過カラムに添加し、ゲルろ過を行った。活性画分を回収し、モノＱカラムに添加し、塩化ナトリウムの濃度勾配を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度検定を行い、単一バンドを示す画分のみを回収した。
【００５３】
得られた２級アルコール脱水素酵素標品は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Native-PAGE ）において１本メジャーなバンドと近接する数本の薄いバンドがみられた。活性染色の結果、全てのバンドが２級アルコール脱水素酵素活性を有しており、この酵素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果、単一バンドであった。
【００５４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるバンドの分子量は、約４００００であった（図１) 。
【００５５】
精製の要約を表１に示したが、精製酵素の比活性は、１３７０Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。
【００５６】
【表１】
［実施例２］（２級アルコール脱水素酵素の至適ｐＨ）
２級アルコール脱水素酵素をカリウム−リン酸緩衝液（ＫＰＢ）、トリス−塩酸緩衝液（Tris-HCl）、ブリットン−ロビンソン緩衝液を用いてｐＨを変化させて（Ｓ）−２−ブタノールの酸化活性、２−ブタノンの還元活性（（Ｓ）−２−ブタノール 酸化活性測定時の条件でＮＡＤ+ をＮＡＤＨ（0.4 μmol ）に代えて測定し、ＮＡＤＨの減少に伴う340nm の吸光度の減少を測定したもの）を測定した。最大活性を１００とした相対活性で表し、図２、図３に示した。反応の至適ｐＨは、（Ｓ）−２−ブタノール酸化反応が８．５〜９．５、２−ブタノンの還元反応が５．５〜６．５であった。
【００５７】
［実施例３］（２級アルコール脱水素酵素の作用至適温度）
２級アルコール脱水素酵素活性を標準反応条件のうち温度だけを変化させて測定した表２に示した。至適温度は５０℃であった。
【００５８】
【表２】
［実施例４］（２級アルコール脱水素酵素のｐＨ安定性）
トリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０−９．０、ブリットン−ロビンソン緩衝液ｐＨ５．０−１２．０中で３０℃, ３０分間処理後の残存活性を測定し図４に示した。ｐＨ８．０〜１０．０において最も安定であった。
【００５９】
［実施例５］（２級アルコール脱水素酵素の耐熱性）
２級アルコール脱水素酵素をｐＨ８．０で１０分間放置した後、残存活性を測定し図５に示した。４０℃、１０分間の熱処理後でも９０％以上の残存活性を有していた。
【００６０】
［実施例６］（２級アルコール脱水素酵素の基質特異性）
２級アルコール脱水素酵素を種々のアルコール、アルデヒドと反応し、その酸化，還元反応の活性を （Ｓ）−２−ブタノールの酸化，２−ブタノンの還元をそれぞれ１００とした相対活性で表し、表３及び表４に示した。
【００６１】
【表３】
【表４】
［実施例７］（２級アルコール脱水素酵素の阻害剤に対する挙動）
２級アルコール脱水素酵素を種々の試薬中で３０℃、３０分間処理し、処理後の活性を、未処理の活性を１００とした残存活性で表し、表５に示した。
【００６２】
【表５】
酵素活性は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ヨードアセトアミド、パラクロロ水銀安息香酸、塩化水銀、塩化亜鉛、高濃度の金属キレーター、２−メルカプトエタノールによって顕著に阻害された。
【００６３】
［実施例８］（２級アルコール脱水素酵素の部分アミノ酸配列の解析）
精製した２級アルコール脱水素酵素 0.153mg を 50mM トリス−塩酸 pH9.0, 4M 尿素中において 0.53 μg のリジルエンドペプチダーゼで30℃, ６時間消化した。切断されたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣ( 東ソー製 TSK ODS-120T カラム) を用い、0.1% トリフルオロ酢酸中におけるアセトニトリルの勾配溶出により分離し、分取した。
【００６４】
分取したペプチドをＡＢＩ製プロテインシーケンサー４７７Ａによりアミノ酸配列を決定した。
【００６５】
プロテインシーケンサーによって決定されたアミノ酸配列は、図６、７、８のアミノ酸配列にアンダーラインで示した。
【００６６】
［実施例９］（２級アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子のＰＣＲクローニング）
２級アルコール脱水素酵素のＮ末端に近い部分のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列を縮重を考慮して合成し混合ＰＣＲプライマー(CpN) とした。また、Ｃ末端に近い部分のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列の相補配列をもう一方の混合ＰＣＲプライマー(CpT10) として合成した。これら配列を図９に示した。なお、ＤＮＡの合成は、ＡＢＩ製ＤＮＡシンセサイザー３８１Ａにより行った。
【００６７】
［実施例１０］（キャンディダ・パラプシロシスからの染色体ＤＮＡの調製）
キャンディダ・パラプシロシス IFO 1396 をＹＥＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）100mL 中で培養し、遠心分離により菌体を回収した。菌体を 25mL の 1M ソルビトール, 0.1M エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）に澱懸し、再度遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体を 10mL の 50mM リン酸カリウム緩衝液 pH7.5, 1M ソルビトール, 0.1M 2- メルカプトエタノールで懸濁し、更に、2.5mg/mL チモリアーゼを0.4mL 添加し、30℃でインキュベートすることによりプロトプラストを形成した。検鏡によりプロトプラスト形成を確認後、遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体を、12mL の 50mM トリス−塩酸 pH7.4, 20mM EDTA に澱懸し、更に、1.2mL の 10% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を添加後よく混合した。この状態で65℃, 30分間インキュベートした後、3.6mL の 5M 酢酸カリウム pH5.0 を添加し、氷上で60分間放置し、タンパク質を変性沈殿させた。
【００６８】
遠心分離により変性タンパク質を分離し、上清を回収後、等量のイソプロパノールを室温で添加し、ゆっくりと混合した。遠心分離により沈殿したＤＮＡを回収し、乾燥後、15mL の 10mM トリス−塩酸緩衝液 pH7.4, 1mM EDTA に溶解し、1mg/mL RNase( リボヌクレアーゼ) 0.75mL を添加し、37℃, 1 時間インキュベートし、夾雑するＲＮＡを分解した。ＲＮＡ分解後、フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を行った後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、実施例１１におけるＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。
【００６９】
［実施例１１］（２級アルコール脱水素酵素遺伝子のＰＣＲ法によるクローニング）
実施例９において合成した２種類の混合ＰＣＲプライマー(CpN 及び CpT10) 100pmol, 実施例１０において調製したキャンディダ・パラプシロシス染色体ＤＮＡ 50ng を含むＰＣＲ用緩衝液（10mM トリス−塩酸緩衝液 pH8.3, 50mM 塩化カリウム, 1.5mM 塩化マグネシウム, 各 0.2mM dNTP, 0.01% ゼラチン, 2U TaqＤＮＡポリメラーゼ( ロシュ社製) ）を調製し、熱変性（94℃, 30秒）、アニーリング（45℃, 30秒）、伸長反応（60℃, 2 分）を30サイクル行い、4 ℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。
【００７０】
［実施例１２］（ＰＣＲ法によって増幅したＤＮＡのサブクローニング）
実施例１１においてＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡを SureClone Ligation Kit （ファルマシア社製）により pUC18 にサブクローニングし、その塩基配列をＡＢＩ製ＤＮＡシーケンサー３７３Ａにより決定した結果、ＰＣＲプライマー配列を含めて 971塩基からなっていた。その配列は図６、７、８に示したＤＮＡのうち、プライマー CpN 及びCpT10 間に当たる部分である。以後この配列を「コア配列」と記す。
【００７１】
［実施例１３］（逆ＰＣＲ法によるコア配列周辺配列のクローニング）
コア配列の5'- 側に近い部分の相補配列 CAATTGACCCGCTTTGGGC (CPA-MUN)、及び、3'- 側に近い部分の配列 TTCGAATCTTGGGATGTTTTTG (CPA-NSP) を化学合成した。２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡにおける合成した逆ＰＣＲプライマーの位置を図６、７、８に示した。
【００７２】
逆ＰＣＲのＤＮＡ鋳型として、まず、キャンディダ・パラプシロシスの染色体ＤＮＡを制限酵素 HaeII により消化し、消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて自己環化した。この自己環化物 50ng 、化学合成したプライマー CPA-MUN 及び CPA-NSP をそれぞれ 20pmol 含むＰＣＲ用緩衝液（実施例１１に記載のもの）を用い、熱変性（94℃, 30秒）、アニーリング（50℃, 30秒）、伸長反応（70℃, 2 分）のサイクルを３０回行った。増幅されたＤＮＡ断片を実施例１２と同様に SureClone Ligation Kit （ファルマシア社製）を用いて pUC18 にサブクローニングし、ＡＢＩ製ＤＮＡシーケンサー３７３Ａにより全塩基配列を決定した。
【００７３】
ＰＣＲ及び逆ＰＣＲにより得られた２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡの全塩基配列及び該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を図６、７、８にまとめた。
【００７４】
［実施例１４］（２級アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子のＰＣＲ法を用いた合成）
まず、プライマーを用いてＰＣＲ法により制限酵素部位の導入を行った。実施例１０において得たＤＮＡを鋳型とし、プライマーとしては、ＥｃｏＲＩの制限酵素部位を含む５´−プライマー「CPA-ATG 」(5'-TCGCGAATTCAATGTCAATTCCATCAAGCCAG-3')とＢｇＩＩＩ部位を含む３´−プライマー「CPA-TAG 」（5'-AGATCTTACTATGGATTAAAAACAACTCTA-3'）により約１０３０ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、遺伝子断片を得た。ＤＮＡの合成は、ＡＢＩ社製ＤＮＡシンセサイザー３８１Ａにより行い、ＰＣＲ反応は実施例１１と同様に行った。
【００７５】
［実施例１５］（ＰＣＲ法によって増幅したＤＮＡのサブクローニング）
実施例１４により増幅されたＰＣＲ断片を SureClone Ligation Kit （ファルマシア社製）にてプラスミドｐＵＣ１８マルチクローニングサイトのＳｍａｌ部位に連結した（図１０）。構築されたプラスミド（ｐＣＰＡ６Ｒ）は、ラクトースプロモーター（図中「ｌａｃＺ」で示す部分に含まれる）とは逆向きに挿入されていた。
【００７６】
［実施例１６］（２級アルコール脱水素酵素遺伝子発現プラスミドｐＫＫ−ＣＰＡ１の構築）
さらに、２級アルコール脱水素酵素を発現ベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシイ社製）にサブクローニングし、ｐＫＫ−ＣＰＡ１を構築した。ｐＫＫ−ＣＰＡ１の構築方法は以下の通りである。ｐＣＰＡ６ＲをＥｃｏｌＣＲＩ（プロメガ社製）消化し、ＨｉｎｄＩＩＩリンカー（タカラ社製）を連結した上でＥｃｏＲＩ（タカラ社製）およびＨｉｎｄＩＩＩ（タカラ社製）で切断後、２級アルコール脱水素酵素を有する断片を抽出し、発現ベクターｐＫＫ２２３−３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したものと連結することにより、２級アルコール脱水素酵素遺伝子発現ベクターｐＫＫ−ＣＰＡ１を構築した（図１１）。
【００７７】
［実施例１７］（２級アルコール脱水素酵素の生産）
イシェリヒア・コリ（Esherichia coli ）JM109 のコンピテントセルを調製し、発現ベクターｐＫＫ−ＣＰＡ１で形質転換することにより、２級アルコール脱水素酵素生産菌株を作成した。この菌株を、0.1mg/mlの濃度でアンピシリンを添加したＬＢ培地（1.0%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH7.2)中で30℃、３時間培養した。最終濃度１mMとなるようにイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えてさらに５時間培養し、培養液を遠心分離し、集菌した。
【００７８】
［実施例１８］（酵素反応での活性評価）
実施例１７に従って調製した菌体を 50mM Tris-HCl pH9.0、0.01%2- メルカプトエタノールに懸濁し、超音波粉砕して粗酵素溶液を得た。該酵素液を 50mm トリス塩酸緩衝液 pH9.0、50mM(S)-1,3-ブタンジオール、2.5mM ＮＡＤ+ から成る30℃の反応液に加え、ＮＡＤ+ の増加に伴う340nm の吸光度を測定することで（Ｓ）−１，３−ブタンジオール酸化活性を測定した。結果を表６に示す。なお、対照として、発現プラスミドｐＫＫ−ＣＰＡ１で形質転換していない宿主イシェリヒア・コリを用い、実施例１８と同様に行った結果を表６に同時に示す。
【００７９】
【表６】
［実施例１９］（遺伝子組換え菌体による（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの生産）
実施例１７に従って調製した菌体に最終濃度５％となるようラセミ１，３−ブタンジオールと0.8%炭酸カルシウム水を加え、直径21mm試験管にて30℃、250rpmで１７時間振とう反応させた。なお、反応開始時における菌体濃度を660nm におけるＯＤが２０となるようにした。反応終了後、遠心分離にて除菌し、得られた上澄液５００μｌを塩化ナトリウムで飽和させた後、酢酸エチル2ml を用いて残存する１，３−ブタンジオールを抽出した。抽出液を脱溶媒後、残渣に塩化アセチル100 μｌを加えて、アセチル化した。これに1ml ｎ−ヘキサンを加えてアセチル化した１，３−ブタンジオールを溶解し、光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー［カラム：キラルセルＯＢ（ダイセル化学工業株式会社製）、溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝19:1、波長220nm 、流速1.0ml/分、温度40℃］にて光学純度を測定した（保持時間：（Ｓ）体15分、（Ｒ）体19.3分）。また、先の上澄液を蒸溜水にて適宜希釈した後、ガスクロマトグラフィー［カラム：Thermon 3000 5% / chromosorb W 80 〜100 メッシュ（内径3mm ×長さ2.1m）（信和化工株式会社製）、温度130 ℃］にて１，３−ブタンジオール濃度を定量した。得られた１，３−ブタンジオールの光学純度、収率を表７に示す。なお、対照として、発現プラスミドｐＫＫ−ＣＰＡ１で形質転換していない宿主イシェリア・コリを用い、実施例１９と同様に行った結果を表７に同時に示す。なお、表７中で、収率とは「最初に添加したラセミ１，３−ブタンジオールに対する、反応終了後残存した１，３−ブタンジオールのモル比」を表す。
【００８０】
【表７】
【００８１】
【発明の効果】
本発明により、新規な、立体特異性を有する２級アルコール脱水素酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該酵素をコードするＤＮＡにより形質転換された微生物を得ることが可能になった。
【００８２】
本酵素又は本酵素を産生する微生物（変異株や形質転換微生物を含む）もしくはその処理物を用いることにより、ラセミ体アルコールからの光学活性アルコールの製造、非対称ケトンからの光学活性アルコールの製造などを効率的に行うことが可能となった。
【００８３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】精製した２級アルコール脱水素酵素のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるパターンを示す図である。
【図２】２級アルコール脱水素酵素の（Ｓ）−２−ブタノール酸化反応のｐＨ依存性を至適ｐＨを１００とした相対活性で示す図である。
【図３】２級アルコール脱水素酵素の２−ブタノン還元反応のｐＨ依存性を至適ｐＨにおける活性を１００とした相対活性で示す図である。
【図４】２級アルコール脱水素酵素を各ｐＨにおいて３０℃、３０分処理した後の残存活性を示す図である。
【図５】２級アルコール脱水素酵素を各温度で１０分処理した後の残存活性を示す図である。
【図６】２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡの塩基配列、該塩基配列から予想されるアミノ酸配列、ＰＣＲプライマー及び逆ＰＣＲプライマーの部位を示す図である。
【図７】２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡの塩基配列、該塩基配列から予想されるアミノ酸配列、ＰＣＲプライマー及び逆ＰＣＲプライマーの部位を示す図である。
【図８】２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡの塩基配列、該塩基配列から予想されるアミノ酸配列、ＰＣＲプライマー及び逆ＰＣＲプライマーの部位を示す図である。
【図９】ＰＣＲ用混合プライマーＣｐＮ、ＣｐＴ１０の構造を示す図である。なお、図中同一部位に複数の塩基が記載してあるものは、混合プライマーがそれら複数の塩基を有するプライマーの混合物になっていることを示す。
【図１０】プラスミドｐＣＰＡ６Ｒの構成を示す図である。
【図１１】発現ベクターｐＫＫ−ＣＰＡ１の構成を示す図である。
【産業上の利用分野】
本発明は、アルコール、アルデヒド、ケトンの製造、特に光学活性アルコールの製造に有用な新規な２級アルコール脱水素酵素、該酵素の製造方法、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡにより形質転換された微生物、及び該酵素を用いてアルコール、アルデヒド、ケトン、特に光学活性アルコールを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物が産生する２級アルコール脱水素酵素としては、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ+ と略す）を要求するサーモアナエロビウム・ブロッキー (Thermoanaerobium brockii) 由来のアルコール脱水素酵素（J.Am.Chem.Soc. 108, 162-169 (1986)）が知られている。また、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+ と略す）を要求する２級アルコール脱水素酵素としては、ピキア・エスピー NRRL-Y-11328 （Pichia sp. NRRL-Y-11328: Eur.J.Biochem. 101, 401-406 (1979) ）、シュードモナス・エスピー SPD6 （Pseudomonas sp. SPD6: Bioorg.Chem. 19, 398-417 (1991) ）、シュードモナス・フルオレッセンス NRRL B-1244（Pseudomonas fluorescens NRRL B-1244: 特開昭59-17982号）、シュードモナス・マルトフィラ MB11L（Pseudomonas maltophilia MB11L: FEMS Microbiol.Lett. 93, 49-56 (1992)）、シュードモナス・エスピー PED（Pseudomonas sp. PED: J.Org.Chem. 57, 1526-1532 (1992) ）、シュードモナス・エスピー ATCC 21439 （Pseudomonas sp. ATCC 21439: Eur.J.Biochem. 119, 359-364 (1981)）、キャンディダ・ボイディニー SAHM （Candida boidinii SAHM: Biochim.Biophys.Acta 716, 298-307 (1992) ）、ミコバクテリウム・バカエ JOB-5（Mycobacterium vaccae JOB-5: J.Gen.Microbiol. 131, 2901-2907 (1985)）、ロドコッカス・ロドクロウス PNKb1（Rhodococcus rhodochrous PNKb1: Arch.Microbiol. 153, 163-168 (1990)）、コマモナス・テリゲナ（Comamonas terrigena: Biochim.Biophys.Acta 661, 74-86 (1981) ）、アースロバクター・エスピー SBA（Arthrobacter sp. SBA: 特開昭51-57882号）由来の酵素が報告されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの２級アルコール脱水素酵素の立体選択性は満足できるものではない。例えば、２級アルコール脱水素酵素の基質として最も報告の多い２−ブタノールに対して、（Ｓ）−２−ブタノールを立体選択的に酸化し、２−ブタノンを生成する活性を有する酵素は知られていない（シュードモナス・エスピー ATCC 21439 、シュードモナス・エスピー SPD6 、コマモナス・テリゲナ、キャンディダ・ボイディニー SAHM 又はピキア・エスピー NRRL-Y-11328 が産生する酵素においてはＲ体が優先的に酸化され、シュードモナス・フルオレッセンス NRRL B-1244が産生する酵素においては立体選択性を示さず、ミコバクテリウム・バカエ JOB-5、ロドコッカス・ロドクロウス PNKb1、シュードモナス・エスピー PED又はシュードモナス・マルトフィラ MB11Lが産生する酵素においてはその立体選択性は記載されていない）。なお、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来の１級アルコール脱水素酵素（SADH I）は、２−ブタノールに関してはＳ体を優先的に酸化するという報告があるが（Arch.Biochem.Biophys.,126,933-944(1968) 、J.Biol.Chem.,268,7792-7798(1993)）、その相対活性はエタノールの１％程度と極めて低く、到底実用に耐えられるものではない。
【０００４】
即ち、（Ｓ）−２−ブタノールを優先的に酸化する２級アルコール脱水素酵素はこれまで知られておらず、立体選択性の高い２級アルコール脱水素酵素を見い出すことが強く望まれていた。
【０００５】
また、該酵素の遺伝子をクローニングできれば、遺伝子工学の手法を用いて該酵素を大量に製造することが可能となるので、該酵素をコードする遺伝子をクローニングすることが強く望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、（Ｓ）−２−ブタノールを優先的に酸化する能力を有する微生物を広くスクリーニングし、キャンディダ属に属する微生物、特にキャンディダ・パラプシロシス (Candida parapsilosis）が（Ｓ）−２−ブタノールを優先的に酸化する能力を有することを見いだした。更に、この微生物を培養し、その菌体より（Ｓ）−２−ブタノールを酸化する酵素を精製した。そして、その性質を検討した結果、該酵素が（Ｓ）−２−ブタノールを高い立体選択性を持って酸化すること、更に（Ｓ）−２−ブタノール以外の多くの２級アルコールを立体選択的に酸化することを見いだした。
【０００７】
即ち、本発明は、次の（１）から（９）に示す理化学的性質を有する酵素を提供する。
（１）作用
ＮＡＤ+ を補酵素として、アルコールを酸化し、ケトン又はアルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨを補酵素として、ケトン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生成する。
【０００８】
（２）基質特異性
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とする。１級アルコールに比較して２級アルコールに対して活性が高い。２−ブタノールのＲ体に比較し２−ブタノールのＳ体を優先的に酸化する。
【０００９】
アルデヒド又は芳香族置換を含む脂肪族ケトンを還元反応の基質とする。
【００１０】
（３）分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、４万。
なお、本発明の酵素の上記以外の理化学的性質、及び酵素学的性質は以下の通りである。
【００１１】
（４）至適pH及び安定pH範囲
（Ｓ）−２−ブタノール酸化反応の至適ｐＨは８．５〜９．５である。２−ブタノン還元反応の至適ｐＨは５．５〜６．５である。
【００１２】
ｐＨ８．０〜１０．０で比較的安定である。
【００１３】
（５）作用適温の範囲
２５〜５５℃で活性が高く、５０℃が至適温度である。
【００１４】
（６）温度による失活の条件
４０℃１０分間の熱処理後でも９０％以上の残存活性を有する。
【００１５】
（７）阻害及び安定化
パラヒドロキシ安息香酸、塩化水銀、塩化銅、塩化亜鉛、Ｎ−エチルマレイミドなどのＳＨ試薬で阻害される。還元剤の２ーメルカプトエタノール、ジチオスレイトールで阻害され、ｏ−フェナントロリンで阻害されるが、エチレンジアミン４酢酸では阻害されない。
【００１６】
（８）精製方法
通常のタンパク質の精製方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、菌体を破砕後、プロタミン硫酸沈澱を行い、その遠心分離上清を硫酸アンモニウムを用いて塩析し、更に、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過を組み合わせることにより、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）で単一バンドになるまで精製することができ
る。
【００１７】
（９）等電点
等電点電気泳動に於いていくつかのバンドを生成するが、主要なバンドの等電点は、６．７であった。
【００１８】
なお、本明細書中の実施例を含む全ての２級アルコール脱水素酵素活性の測定は、以下に示す方法により行った。即ち、トリス−塩酸緩衝液（pH9.0 ）50μmol, ＮＡＤ+ 2.5 μmol, （Ｓ）−２−ブタノール50μmol 及び酵素を含む反応液中３０℃で反応させ、ＮＡＤＨの生成に由来する340nm の吸光度の増大を測定した。１Ｕは、１分間に 1μmol のＮＡＤＨの生成を触媒する酵素量とした。
【００１９】
また、本発明は、２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡを提供する。
即ち、本発明者らは、精製した２級アルコール脱水素酵素をリジルエンドペプチダーゼにより消化し、逆相ＨＰＬＣにより切断された断片を精製後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列の一部を決定した。得られたアミノ酸配列をもとにして、ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction) 用プライマーを合成し、キャンディダ・パラプシロシス (Candida parapsilosis）の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、２級アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子の一部を増幅し、その塩基配列（コア配列）を明らかにした。更に、得られたＤＮＡ配列（コア配列）の周辺領域の塩基配列を明らかにするために、キャンディダ・パラプシロシス (Candida parapsilosis）の染色体ＤＮＡをコア配列中にその認識配列が存在しない制限酵素 HaeII により消化し、生成したＤＮＡ断片をＴ４リガーゼにより自己環化し、逆ＰＣＲ（Nucleic Acids Res. 16, 8186 (1988)）用の鋳型ＤＮＡを調製した。次に、コア配列をもとに、コア配列の外側に向かうＤＮＡ合成の開始点となるプライマーを合成し、逆ＰＣＲによりコア配列の周辺領域を増幅した。得られたＤＮＡの塩基配列を明らかにした結果、自己環化したＤＮＡ中に、図６、７、８に示す２級アルコール脱水素酵素の全コード領域が含まれていることを確認した。更に、クローニングした遺伝子の大腸菌宿主中での発現産物が、キャンディダ・パラプシロシス由来の２級アルコール脱水素酵素と同様の活性を有することを確認した。
【００２０】
本願発明の、２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡは、２級アルコール脱水素酵素の活性を有していて、アミノ酸配列が実質的に図６、７、８に示されているおよび配列番号：２に記載の蛋白質をコードする塩基配列を含むことを特徴とする。ここで「実質的」とは、２級アルコール脱水素酵素の活性を有する限り、図６、７、８に示したおよび配列番号：２に記載のアミノ酸配列についてアミノ酸のいくつかの欠失、挿入、置換等があってもよいことを示すものである。本発明のＤＮＡには、図６、７、８に示したおよび配列番号：１に記載の１００８塩基からなるＤＮＡが含まれることはいうまでもないが、本願発明はこれに限られるものではない。なお、ＤＮＡがコードするアミノ酸配列についてアミノ酸のいくつかの欠失、挿入、置換等を生じるようにＤＮＡを改変することは、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異導入法など、周知の方法で適宜行うことができる。また、図６、７、８に示したおよび配列番号：１に記載の１００８塩基を含むＤＮＡまたは該ＤＮＡを適宜改変したＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ法をＭｎ2+イオンの存在下（通常０．５〜１０ｍＭの濃度）または特定のヌクレオチドの濃度を低くして行うことによって、ランダムに変異が導入されたＤＮＡを得ることができる。このようにして得られたＤＮＡのうち、２級アルコール脱水素酵素の活性を有するタンパク質をコードするものが、本願発明に含まれることはいうまでもない。
【００２１】
更に本発明は、アミノ酸配列が実質的に図６、７、８に示されている、および配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡにより形質転換された、２級アルコール脱水素酵素生産能を有する微生物を提供する。
【００２２】
本発明において形質転換の対象となる微生物は、２級アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡにより形質転換され、２級アルコール脱水素酵素活性を発現することができる微生物であればいかなるものでもよく、具体的には、イシェリヒア(Escherichia) 属，バチルス(Bacillus)属，シュードモナス(Pseudomonas) 属，セラチア(Serratia)属，ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属，コリネバクテリイウム(Corynebacterium) 属、ストレプトコッカス(Streptococcu)属、ラクトバチルス(Lactobacillus) 属など宿主，ベクター系の開発されている細菌、サッカロマイセス(Saccharomyces) 属，クライベロマイセス(Kluyveromyces) 属，シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces) 属，チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces) 、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ハンゼヌラ(Hansenula) 属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida) 属などの酵母、ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus) 属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma) 属などに属するカビなどが含まれる。
【００２３】
形質転換体の作製のための手順ないし、方法そのものは、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる。
【００２４】
微生物中において、本発明の遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこの遺伝子を挿入する必要がある。また、本発明のＤＮＡを微生物中で発現させるためには、それが有する遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡの5'- 側上流に、ターミネーターを3'- 側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては「Adv.Biochem.Eng. 43, 75-102 (1990)」又は「Yeast 8, 423-488 (1992) 」 などに詳細に記述されている。
【００２５】
例えば、イシェリヒア属特に大腸菌イシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR, pUC 系プラスミドを利用することが可能であり、lac(β−ガラクトシダーゼ), trp( トリプトファンオペロン), tac(lac, trp の融合), λファージ PL, PR などに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA 由来、ファージ由来 rrnB リボソーマルターミネーターなどを用いることができる。
【００２６】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194 系プラスミドなどが利用可能であり、染色体に直接挿入させることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとして apr( アルカリプロテアーゼ), npr(中性プロテアーゼ), amy( α−アミラーゼ) などが利用できる。
【００２７】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia) などで宿主ベクター系が開発されており、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド TOL プラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010 などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む） pKT240 などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ遺伝子（特開平5-284973号）などが利用できる。
【００２８】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum) においては、pAJ43 (Gene 39, 281 (1985)) などのプラスミドベクターが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００２９】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11 ( 特開昭57-183799 号), pCB101 （Mol.Gen.Genet. 196, 175 (1984)）などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００３０】
ストレプトコッカス(Streptococcu)属においては、pHV1301 (FEMS Microbiol.Lett. 26, 239 (1985)），pGK1（Appl.Environ.MIcrobiol. 50, 94 (1985) ）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００３１】
ラクトバチルス(Lactobacillus) 属においては、ストレプトコッカス属用に開発された pAMβ1 （J.Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されるているものが利用可能である。
【００３２】
サッカロマイセス(Saccharomyces) 属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae) においては、YRp 系，YEp 系，YCp 系，YIp 系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456 など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素), GAPDH( グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素), PHO( 酸性フォスファターゼ), GAL( β−ガラクトシダーゼ), PGK( ホスホグリセレートキナーゼ), ENO( エノラーゼ) などのプロモーター、ターミネーターが利用可能でる。
【００３３】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 2μm 系プラスミド, pKD1 系プラスミド（J.Bacteriol. 145, 382-390 (1981)），キラー活性に関与する pGKl1 由来プラスミド, クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子 KARS 系プラスミド，リボソームＤＮＡなどとの相同組換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456 など）などが利用可能である。また、ADH, PGK などに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００３４】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces) 属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来の ARS (自律複製に関与する遺伝子) 及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol.Cell.Biol. 6, 80 (1986) ）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来の ADH プロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987) ）。
【００３５】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces) においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zygosaccharomyces rouxii) 由来の pSB3 （Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビシエ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素) のプロモーター（Agri.Biol.Chem. 54, 2521 (1990) ）などが利用可能である。
【００３６】
ハンゼヌラ(Hansenula) 属においては、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ハンゼヌラ・ポリモルファ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1, HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991) ）。また、メタノールなどで誘導される AOX（アルコールオキシダーゼ), FDH( ギ酸脱水素酵素) のプロモーターなどが利用可能である。
【００３７】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・パストリス(Pichia pastoris) などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1, PARS2) などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol.Cell.Biol. 5, 3376 (1985) ）、高濃度培養とメタノールで誘導可能な AOX など強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。
【００３８】
キャンディダ(Candida) 属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa) 、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri.Biol.Chem. 51, 51, 1587 (1987) ）、これを利用したベクターが開発されている。
【００３９】
アスペルギルス(Aspergillus) 属においては、カビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989) ）。
【００４０】
トリコデルマ(Trichoderma) 属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989) ）。
【００４１】
本発明の酵素は、キャンディダ(Candida)属に属する下記（１）から（３）に示す性質を有する酵素を産生する微生物もしくはその変異株、又は該酵素をコードする遺伝子を異種の微生物宿主に導入し該酵素生産能を付与された遺伝子組換え体を培養することなどにより製造することができる。
【００４２】
（１）作用
ＮＡＤ+ を補酵素として、アルコールを酸化し、ケトン又はアルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨを補酵素として、ケトン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生成する。
【００４３】
（２）基質特異性
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とする。１級アルコールに比較して２級アルコールに対して活性が高い。２−ブタノールのＲ体に比較し２−ブタノールのＳ体を優先的に酸化する。
【００４４】
アルデヒド又は芳香族置換を含む脂肪族ケトンを還元反応の基質とする。
【００４５】
（３）分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、４万。
【００４６】
更に、本発明の２級アルコール脱水素酵素、又は該酵素を含む微生物（変異株や遺伝子組換え微生物を含む）もしくはその処理物を、芳香族で置換されてもよい脂肪族２級アルコール、例えば、２−ブタノール、２−オクタノール、フェニルエタノール、１，３−ブタンジオール、β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸エチルエステルなどのラセミ体アルコールに作用させ、光学異性体の一方（２−ブタノール、２−オクタノール、フェニルエタノール、１，３−ブタンジオール、β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸エチルエステルにおいてはそのＳ体）のみを酸化することにより、他方の光学活性アルコール（２−ブタノール、２−オクタノール、フェニルエタノール、１，３−ブタンジオール、β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸エチルエステルにおいてはそのＲ体）を生産することができる。この酸化反応により補酵素ＮＡＤ+ は還元され、ＮＡＤＨが生成する。
【００４７】
生成したＮＡＤＨは、例えば、微生物の有するＮＡＤＨをＮＡＤ+ に変換する能力により、ＮＡＤ+ に変換（再生）されることができる。また、グルタミン酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、ＮＡＤＨ脱水素酵素、ＮＡＤＨオキシダーゼなどのＮＡＤＨをＮＡＤ+ に酸化する活性を有する酵素、又はこれら酵素を含有する微生物もしくはその処理物を反応系に添加することにより、ＮＡＤ+ を再生することもできる。また、本発明の酵素の基質特異性を利用して、反応系にアセトン、２−ブタノンなどの安価な本酵素の還元反応の基質を共存させることにより、１種類の酵素でＮＡＤ+ の再生も同時に行うことができる。
【００４８】
また、ケトン体に本発明の２級アルコール脱水素酵素、又は該酵素を産生する微生物（変異株や形質転換微生物を含む）もしくはその処理物を作用させ、光学活性なアルコールを生産することができる。例えば、２−ブタノンから（Ｓ）−２−ブタノール、２−オクタノンから（Ｓ）−２−オクタノール、アセトフェノンから（Ｓ）−１−フェニルエタノール、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから（Ｓ）−１，３−ブタンジオール、アセト酢酸エステルから（Ｓ）−β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸エステルなどを生産することができる。この還元反応により補酵素ＮＡＤＨは酸化され、ＮＡＤ+ が生成する。
【００４９】
生成したＮＡＤ+ は、例えば、微生物の有するＮＡＤ+ をＮＡＤＨに変換する能力により、ＮＡＤＨに変換（再生）されることができる。このＮＡＤ+ 還元活性は、反応系にグルコース、エタノール、ギ酸などを添加することにより促進することが可能である。また、反応系に、ギ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素などのＮＡＤ+ をＮＡＤＨへ還元する能力を有する酵素、又はこれら酵素を含む微生物もしくはその処理物を添加することにより、ＮＡＤ+ の還元を行うこともできる。また、本発明の酵素の基質特異性を利用して、反応系にイソプロパノールやエタノールなどの酸化反応の基質を添加することにより、１種類の酵素でＮＡＤＨの再生反応を同時に行うこともできる。
【００５０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１］（２級アルコール脱水素酵素の精製）
キャンディダ・パラプシロシス IFO 1396 株をＹＭ培地（グルコース１０ｇ，バクトペプトン５ｇ，酵母エキス３ｇ，麦芽エキス３ｇ／Ｌ, pH6.0）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。
【００５２】
得られた湿菌体を超高圧細胞破砕装置により菌体を破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、核酸及びミクロゾームを除去した。遠心分離により得られた上清に、硫安を添加して７０％飽和において沈澱した画分を回収した。更に、Ｑ−セファロースＦＦを用いたアニオン交換クロマトグラフィーを行い、塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行い、２級アルコール脱水素酵素活性を有するピークを回収した。得られた画分を１．６２Ｍ硫安を含む緩衝液で平衡化したフェニル−セファロースに添加し、疎水クロマトグラフィーを行った。硫安濃度を０Ｍまで減少させ、２級アルコール脱水素酵素活性画分を回収した（酵素活性の測定法は前述の方法で行った）。この活性画分をレッド−セファロースのアフィニティーカラムに添加し、素通り画分をスーパーデックス２００のゲルろ過カラムに添加し、ゲルろ過を行った。活性画分を回収し、モノＱカラムに添加し、塩化ナトリウムの濃度勾配を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度検定を行い、単一バンドを示す画分のみを回収した。
【００５３】
得られた２級アルコール脱水素酵素標品は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Native-PAGE ）において１本メジャーなバンドと近接する数本の薄いバンドがみられた。活性染色の結果、全てのバンドが２級アルコール脱水素酵素活性を有しており、この酵素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果、単一バンドであった。
【００５４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるバンドの分子量は、約４００００であった（図１) 。
【００５５】
精製の要約を表１に示したが、精製酵素の比活性は、１３７０Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。
【００５６】
【表１】
２級アルコール脱水素酵素をカリウム−リン酸緩衝液（ＫＰＢ）、トリス−塩酸緩衝液（Tris-HCl）、ブリットン−ロビンソン緩衝液を用いてｐＨを変化させて（Ｓ）−２−ブタノールの酸化活性、２−ブタノンの還元活性（（Ｓ）−２−ブタノール 酸化活性測定時の条件でＮＡＤ+ をＮＡＤＨ（0.4 μmol ）に代えて測定し、ＮＡＤＨの減少に伴う340nm の吸光度の減少を測定したもの）を測定した。最大活性を１００とした相対活性で表し、図２、図３に示した。反応の至適ｐＨは、（Ｓ）−２−ブタノール酸化反応が８．５〜９．５、２−ブタノンの還元反応が５．５〜６．５であった。
【００５７】
［実施例３］（２級アルコール脱水素酵素の作用至適温度）
２級アルコール脱水素酵素活性を標準反応条件のうち温度だけを変化させて測定した表２に示した。至適温度は５０℃であった。
【００５８】
【表２】
トリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０−９．０、ブリットン−ロビンソン緩衝液ｐＨ５．０−１２．０中で３０℃, ３０分間処理後の残存活性を測定し図４に示した。ｐＨ８．０〜１０．０において最も安定であった。
【００５９】
［実施例５］（２級アルコール脱水素酵素の耐熱性）
２級アルコール脱水素酵素をｐＨ８．０で１０分間放置した後、残存活性を測定し図５に示した。４０℃、１０分間の熱処理後でも９０％以上の残存活性を有していた。
【００６０】
［実施例６］（２級アルコール脱水素酵素の基質特異性）
２級アルコール脱水素酵素を種々のアルコール、アルデヒドと反応し、その酸化，還元反応の活性を （Ｓ）−２−ブタノールの酸化，２−ブタノンの還元をそれぞれ１００とした相対活性で表し、表３及び表４に示した。
【００６１】
【表３】
２級アルコール脱水素酵素を種々の試薬中で３０℃、３０分間処理し、処理後の活性を、未処理の活性を１００とした残存活性で表し、表５に示した。
【００６２】
【表５】
【００６３】
［実施例８］（２級アルコール脱水素酵素の部分アミノ酸配列の解析）
精製した２級アルコール脱水素酵素 0.153mg を 50mM トリス−塩酸 pH9.0, 4M 尿素中において 0.53 μg のリジルエンドペプチダーゼで30℃, ６時間消化した。切断されたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣ( 東ソー製 TSK ODS-120T カラム) を用い、0.1% トリフルオロ酢酸中におけるアセトニトリルの勾配溶出により分離し、分取した。
【００６４】
分取したペプチドをＡＢＩ製プロテインシーケンサー４７７Ａによりアミノ酸配列を決定した。
【００６５】
プロテインシーケンサーによって決定されたアミノ酸配列は、図６、７、８のアミノ酸配列にアンダーラインで示した。
【００６６】
［実施例９］（２級アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子のＰＣＲクローニング）
２級アルコール脱水素酵素のＮ末端に近い部分のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列を縮重を考慮して合成し混合ＰＣＲプライマー(CpN) とした。また、Ｃ末端に近い部分のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列の相補配列をもう一方の混合ＰＣＲプライマー(CpT10) として合成した。これら配列を図９に示した。なお、ＤＮＡの合成は、ＡＢＩ製ＤＮＡシンセサイザー３８１Ａにより行った。
【００６７】
［実施例１０］（キャンディダ・パラプシロシスからの染色体ＤＮＡの調製）
キャンディダ・パラプシロシス IFO 1396 をＹＥＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）100mL 中で培養し、遠心分離により菌体を回収した。菌体を 25mL の 1M ソルビトール, 0.1M エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）に澱懸し、再度遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体を 10mL の 50mM リン酸カリウム緩衝液 pH7.5, 1M ソルビトール, 0.1M 2- メルカプトエタノールで懸濁し、更に、2.5mg/mL チモリアーゼを0.4mL 添加し、30℃でインキュベートすることによりプロトプラストを形成した。検鏡によりプロトプラスト形成を確認後、遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体を、12mL の 50mM トリス−塩酸 pH7.4, 20mM EDTA に澱懸し、更に、1.2mL の 10% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を添加後よく混合した。この状態で65℃, 30分間インキュベートした後、3.6mL の 5M 酢酸カリウム pH5.0 を添加し、氷上で60分間放置し、タンパク質を変性沈殿させた。
【００６８】
遠心分離により変性タンパク質を分離し、上清を回収後、等量のイソプロパノールを室温で添加し、ゆっくりと混合した。遠心分離により沈殿したＤＮＡを回収し、乾燥後、15mL の 10mM トリス−塩酸緩衝液 pH7.4, 1mM EDTA に溶解し、1mg/mL RNase( リボヌクレアーゼ) 0.75mL を添加し、37℃, 1 時間インキュベートし、夾雑するＲＮＡを分解した。ＲＮＡ分解後、フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を行った後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、実施例１１におけるＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。
【００６９】
［実施例１１］（２級アルコール脱水素酵素遺伝子のＰＣＲ法によるクローニング）
実施例９において合成した２種類の混合ＰＣＲプライマー(CpN 及び CpT10) 100pmol, 実施例１０において調製したキャンディダ・パラプシロシス染色体ＤＮＡ 50ng を含むＰＣＲ用緩衝液（10mM トリス−塩酸緩衝液 pH8.3, 50mM 塩化カリウム, 1.5mM 塩化マグネシウム, 各 0.2mM dNTP, 0.01% ゼラチン, 2U TaqＤＮＡポリメラーゼ( ロシュ社製) ）を調製し、熱変性（94℃, 30秒）、アニーリング（45℃, 30秒）、伸長反応（60℃, 2 分）を30サイクル行い、4 ℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。
【００７０】
［実施例１２］（ＰＣＲ法によって増幅したＤＮＡのサブクローニング）
実施例１１においてＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡを SureClone Ligation Kit （ファルマシア社製）により pUC18 にサブクローニングし、その塩基配列をＡＢＩ製ＤＮＡシーケンサー３７３Ａにより決定した結果、ＰＣＲプライマー配列を含めて 971塩基からなっていた。その配列は図６、７、８に示したＤＮＡのうち、プライマー CpN 及びCpT10 間に当たる部分である。以後この配列を「コア配列」と記す。
【００７１】
［実施例１３］（逆ＰＣＲ法によるコア配列周辺配列のクローニング）
コア配列の5'- 側に近い部分の相補配列 CAATTGACCCGCTTTGGGC (CPA-MUN)、及び、3'- 側に近い部分の配列 TTCGAATCTTGGGATGTTTTTG (CPA-NSP) を化学合成した。２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡにおける合成した逆ＰＣＲプライマーの位置を図６、７、８に示した。
【００７２】
逆ＰＣＲのＤＮＡ鋳型として、まず、キャンディダ・パラプシロシスの染色体ＤＮＡを制限酵素 HaeII により消化し、消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて自己環化した。この自己環化物 50ng 、化学合成したプライマー CPA-MUN 及び CPA-NSP をそれぞれ 20pmol 含むＰＣＲ用緩衝液（実施例１１に記載のもの）を用い、熱変性（94℃, 30秒）、アニーリング（50℃, 30秒）、伸長反応（70℃, 2 分）のサイクルを３０回行った。増幅されたＤＮＡ断片を実施例１２と同様に SureClone Ligation Kit （ファルマシア社製）を用いて pUC18 にサブクローニングし、ＡＢＩ製ＤＮＡシーケンサー３７３Ａにより全塩基配列を決定した。
【００７３】
ＰＣＲ及び逆ＰＣＲにより得られた２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡの全塩基配列及び該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を図６、７、８にまとめた。
【００７４】
［実施例１４］（２級アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子のＰＣＲ法を用いた合成）
まず、プライマーを用いてＰＣＲ法により制限酵素部位の導入を行った。実施例１０において得たＤＮＡを鋳型とし、プライマーとしては、ＥｃｏＲＩの制限酵素部位を含む５´−プライマー「CPA-ATG 」(5'-TCGCGAATTCAATGTCAATTCCATCAAGCCAG-3')とＢｇＩＩＩ部位を含む３´−プライマー「CPA-TAG 」（5'-AGATCTTACTATGGATTAAAAACAACTCTA-3'）により約１０３０ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、遺伝子断片を得た。ＤＮＡの合成は、ＡＢＩ社製ＤＮＡシンセサイザー３８１Ａにより行い、ＰＣＲ反応は実施例１１と同様に行った。
【００７５】
［実施例１５］（ＰＣＲ法によって増幅したＤＮＡのサブクローニング）
実施例１４により増幅されたＰＣＲ断片を SureClone Ligation Kit （ファルマシア社製）にてプラスミドｐＵＣ１８マルチクローニングサイトのＳｍａｌ部位に連結した（図１０）。構築されたプラスミド（ｐＣＰＡ６Ｒ）は、ラクトースプロモーター（図中「ｌａｃＺ」で示す部分に含まれる）とは逆向きに挿入されていた。
【００７６】
［実施例１６］（２級アルコール脱水素酵素遺伝子発現プラスミドｐＫＫ−ＣＰＡ１の構築）
さらに、２級アルコール脱水素酵素を発現ベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシイ社製）にサブクローニングし、ｐＫＫ−ＣＰＡ１を構築した。ｐＫＫ−ＣＰＡ１の構築方法は以下の通りである。ｐＣＰＡ６ＲをＥｃｏｌＣＲＩ（プロメガ社製）消化し、ＨｉｎｄＩＩＩリンカー（タカラ社製）を連結した上でＥｃｏＲＩ（タカラ社製）およびＨｉｎｄＩＩＩ（タカラ社製）で切断後、２級アルコール脱水素酵素を有する断片を抽出し、発現ベクターｐＫＫ２２３−３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したものと連結することにより、２級アルコール脱水素酵素遺伝子発現ベクターｐＫＫ−ＣＰＡ１を構築した（図１１）。
【００７７】
［実施例１７］（２級アルコール脱水素酵素の生産）
イシェリヒア・コリ（Esherichia coli ）JM109 のコンピテントセルを調製し、発現ベクターｐＫＫ−ＣＰＡ１で形質転換することにより、２級アルコール脱水素酵素生産菌株を作成した。この菌株を、0.1mg/mlの濃度でアンピシリンを添加したＬＢ培地（1.0%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH7.2)中で30℃、３時間培養した。最終濃度１mMとなるようにイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えてさらに５時間培養し、培養液を遠心分離し、集菌した。
【００７８】
［実施例１８］（酵素反応での活性評価）
実施例１７に従って調製した菌体を 50mM Tris-HCl pH9.0、0.01%2- メルカプトエタノールに懸濁し、超音波粉砕して粗酵素溶液を得た。該酵素液を 50mm トリス塩酸緩衝液 pH9.0、50mM(S)-1,3-ブタンジオール、2.5mM ＮＡＤ+ から成る30℃の反応液に加え、ＮＡＤ+ の増加に伴う340nm の吸光度を測定することで（Ｓ）−１，３−ブタンジオール酸化活性を測定した。結果を表６に示す。なお、対照として、発現プラスミドｐＫＫ−ＣＰＡ１で形質転換していない宿主イシェリヒア・コリを用い、実施例１８と同様に行った結果を表６に同時に示す。
【００７９】
【表６】
実施例１７に従って調製した菌体に最終濃度５％となるようラセミ１，３−ブタンジオールと0.8%炭酸カルシウム水を加え、直径21mm試験管にて30℃、250rpmで１７時間振とう反応させた。なお、反応開始時における菌体濃度を660nm におけるＯＤが２０となるようにした。反応終了後、遠心分離にて除菌し、得られた上澄液５００μｌを塩化ナトリウムで飽和させた後、酢酸エチル2ml を用いて残存する１，３−ブタンジオールを抽出した。抽出液を脱溶媒後、残渣に塩化アセチル100 μｌを加えて、アセチル化した。これに1ml ｎ−ヘキサンを加えてアセチル化した１，３−ブタンジオールを溶解し、光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー［カラム：キラルセルＯＢ（ダイセル化学工業株式会社製）、溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝19:1、波長220nm 、流速1.0ml/分、温度40℃］にて光学純度を測定した（保持時間：（Ｓ）体15分、（Ｒ）体19.3分）。また、先の上澄液を蒸溜水にて適宜希釈した後、ガスクロマトグラフィー［カラム：Thermon 3000 5% / chromosorb W 80 〜100 メッシュ（内径3mm ×長さ2.1m）（信和化工株式会社製）、温度130 ℃］にて１，３−ブタンジオール濃度を定量した。得られた１，３−ブタンジオールの光学純度、収率を表７に示す。なお、対照として、発現プラスミドｐＫＫ−ＣＰＡ１で形質転換していない宿主イシェリア・コリを用い、実施例１９と同様に行った結果を表７に同時に示す。なお、表７中で、収率とは「最初に添加したラセミ１，３−ブタンジオールに対する、反応終了後残存した１，３−ブタンジオールのモル比」を表す。
【００８０】
【表７】
【発明の効果】
本発明により、新規な、立体特異性を有する２級アルコール脱水素酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該酵素をコードするＤＮＡにより形質転換された微生物を得ることが可能になった。
【００８２】
本酵素又は本酵素を産生する微生物（変異株や形質転換微生物を含む）もしくはその処理物を用いることにより、ラセミ体アルコールからの光学活性アルコールの製造、非対称ケトンからの光学活性アルコールの製造などを効率的に行うことが可能となった。
【００８３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】精製した２級アルコール脱水素酵素のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるパターンを示す図である。
【図２】２級アルコール脱水素酵素の（Ｓ）−２−ブタノール酸化反応のｐＨ依存性を至適ｐＨを１００とした相対活性で示す図である。
【図３】２級アルコール脱水素酵素の２−ブタノン還元反応のｐＨ依存性を至適ｐＨにおける活性を１００とした相対活性で示す図である。
【図４】２級アルコール脱水素酵素を各ｐＨにおいて３０℃、３０分処理した後の残存活性を示す図である。
【図５】２級アルコール脱水素酵素を各温度で１０分処理した後の残存活性を示す図である。
【図６】２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡの塩基配列、該塩基配列から予想されるアミノ酸配列、ＰＣＲプライマー及び逆ＰＣＲプライマーの部位を示す図である。
【図７】２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡの塩基配列、該塩基配列から予想されるアミノ酸配列、ＰＣＲプライマー及び逆ＰＣＲプライマーの部位を示す図である。
【図８】２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡの塩基配列、該塩基配列から予想されるアミノ酸配列、ＰＣＲプライマー及び逆ＰＣＲプライマーの部位を示す図である。
【図９】ＰＣＲ用混合プライマーＣｐＮ、ＣｐＴ１０の構造を示す図である。なお、図中同一部位に複数の塩基が記載してあるものは、混合プライマーがそれら複数の塩基を有するプライマーの混合物になっていることを示す。
【図１０】プラスミドｐＣＰＡ６Ｒの構成を示す図である。
【図１１】発現ベクターｐＫＫ−ＣＰＡ１の構成を示す図である。
Claims (16)
- 次の（１）から（７）に示す理化学的性質を有する酵素。
（１）作用
ＮＡＤ+ （酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として、アルコールを酸化し、ケトン又はアルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として、ケトン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生成する。
（２）基質特異性
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とする。１級アルコールに比較して２級アルコールに対して活性が高い。２−ブタノールのＲ体に比較し２−ブタノールのＳ体を優先的に酸化する。
アルデヒド又は芳香族置換を含む脂肪族ケトンを還元反応の基質とする。
（３）分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、４万。
（４）至適 pH 及び安定 pH 範囲
（Ｓ）−２−ブタノール酸化反応の至適ｐＨは８．５〜９．５である。２−ブタノン還元反応の至適ｐＨは５．５〜６．５である。安定 pH 範囲はｐＨ８．０〜１０．０である。
（５）作用適温の範囲
作用適温の範囲は２５〜５５℃である。
（６）温度による失活の条件
４０℃１０分間の熱処理後でも９０％以上の残存活性を有する。
（７）阻害及び安定化
パラヒドロキシ安息香酸、塩化水銀、塩化銅、塩化亜鉛、Ｎ−エチルマレイミドなどのＳＨ試薬で阻害され、還元剤の２ーメルカプトエタノール、ジチオスレイトールで阻害され、ｏ−フェナントロリンで阻害されるが、エチレンジアミン４酢酸では阻害されない。 - キャンディダ(Candida)属に属し請求項１の酵素を産生する微生物を培養し、培養物から該酵素を取得することを特徴とする、請求項１記載の酵素の製造方法。
- 請求項２記載の方法において、キャンディダ属に属する微生物が、キャンディダ・パラプシロシス (Candida parapsilosis) であることを特徴とする方法。
- 配列番号：１に記載された塩基配列で表される請求項１記載の酵素をコードするＤＮＡ。
- 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡ。
- 請求項５記載のＤＮＡにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号：２に記載されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
- 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質。
- 請求項４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
- 請求項４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡによって形質転換された微生物。
- 請求項１０に記載の微生物を培養し、培養物から請求項１記載の酵素を取得することを特徴とする、請求項１記載の酵素の製造方法。
- 請求項１に記載の酵素、又は該酵素を産生する微生物もしくはその処理物を、ケトン又はアルデヒドに作用させ、該ケトン又はアルデヒドを還元してアルコールを製造することを特徴とする、アルコールの製造方法。
- 請求項１に記載の酵素、又は該酵素を産生する微生物もしくはその処理物を、非対称ケトンに作用させ、該非対称ケトンを還元して光学活性アルコールを製造することを特徴とする、光学活性アルコールの製造方法。
- 請求項１に記載の酵素、又は該酵素を産生する微生物もしくはその処理物をアルコールに作用させ、該アルコールを酸化してケトン又はアルデヒドを製造することを特徴とする、ケトン又はアルデヒドの製造方法。
- 請求項１に記載の酵素、又は該酵素を産生する微生物もしくはその処理物をラセミ体アルコールに作用させ、光学異性体の一方を優先的に酸化し、残存する光学活性アルコールを取得することを特徴とする、光学活性アルコールの製造方法。
- 請求項１０に記載の微生物由来の酵素、又は請求項１０に記載の微生物もしくはその処理物を作用させることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
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