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JP3479080B2 - 体重のモジュレーター、対応する核酸およびタンパク質、ならびにそれらの診断および治療用途 - Google Patents

体重のモジュレーター、対応する核酸およびタンパク質、ならびにそれらの診断および治療用途

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JP3479080B2
JP3479080B2 JP50761896A JP50761896A JP3479080B2 JP 3479080 B2 JP3479080 B2 JP 3479080B2 JP 50761896 A JP50761896 A JP 50761896A JP 50761896 A JP50761896 A JP 50761896A JP 3479080 B2 JP3479080 B2 JP 3479080B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、一般に、哺乳動物（動物およびヒトを包含
する）の体重の制御に関する。そしてより詳細には、本
発明は、体重のモジュレーターとして本明細書中に同定
された物質、およびこのようなモジュレーターが適用さ
れ得る診断および治療用途に関する。
発明の背景 肥満症（痩身体重に対する体脂肪過剰と定義される）
は、重要な心理的および医学的な病的状態に関連してい
る。後者は、高血圧、血中脂肪の上昇、およびII型また
は非インスリン依存性真性糖尿病（NIDDM）を包含す
る。米国では600万から1000万人がNIDDMにかかってお
り、この中には65歳齢群の18％を含む［Harrisら,Int.
J.Obes.,11:275−283（1987）］。NIDDMにかかっている
男性の約45％および女性の約70％が肥満症であり、そし
て彼らの糖尿病は、体重を減少させることにより実質的
に改善されるか、または取り除かれる［Harris,Diabete
s Care,14（３）:639−648（1991）］。以下に記載され
るように、肥満症およびNIDDMは両方とも遺伝性が強い
が、素因となる遺伝子は未だ同定されていない。これら
の代謝関連障害の分子遺伝学的基礎は、重要であるがあ
まり理解されていない問題である。
栄養エネルギーの同化、蓄積、および利用は、後生動
物の生存の中心にある複雑な恒常性系を構成している。
陸上生活哺乳動物の間では、トリグリセリドとしての大
量の代謝燃料の脂肪組織中の蓄積が、食物が涸渇したと
きの生存期間にとってきわめて重要である。生物体の大
きさおよび形状に連続的な変化を生じさせることなく固
定レベルのエネルギー貯蔵を維持しようとする要求に
は、エネルギー摂取および消費間の平衡の達成が必要と
される。しかし、エネルギー平衡を調節する分子機構は
まだ解明されていない。栄養情報を変換してエネルギー
平衡の制御を行う分子の単離が、健康および疾患状態の
体重の調節の理解にとって重要である。
脂肪蓄積の個体レベルは、大部分は遺伝的に決定され
る。一卵性および二卵性の双生児または養子とその生物
学的親との間の体重および脂肪蓄積の一致率の試験は、
肥満症の遺伝性（0.4〜0.8）が、実質的遺伝成分を有す
ると一般に考えられている特性（例えば、精神分裂症、
アルコール依存症、およびアテローム性動脈硬化症）の
遺伝性より高いことを示唆した［Stunkardら、N.Engl.
J.Med.,322:1483−1487（1990）］。エネルギー消費率
の家族制の類似もまた報告されている［Bogardusら、Di
abetes,35:1−５（1986）］。地理的に限定した集団内
の遺伝学的解析は比較的少数の遺伝子が身体組成の変動
の30〜50％の原因となり得ることを示唆する［Mollら,A
m.J.Hum.Genet.,49:1243−1255（1991）］。しかし、一
般集団における肥満症の原因となる遺伝子はひとつも明
確な染色体上の位置に対して遺伝学的にマッピングされ
ていない。
肥満症の齧歯類モデルは７つの見かけ上単一遺伝子の
変異を包含する。最も集中的に研究されているマウス肥
満症変異はob（肥満）遺伝子およびdb（糖尿病）遺伝子
である。同一の遺伝系統背景上に存在する場合、obおよ
びdbは識別し得ない代謝および行動表現型を生じ、この
ことは、これらの遺伝子が同一の生理学的経路において
機能し得ることを示唆する［Colemanら,Diabetologia,1
4:141−148（1978）］。いずれかの変異に対して同型接
合性のマウスは過食および代謝低下性であり、１カ月齢
で顕著である肥満表現型となる。これらの動物の体重は
60〜70gで安定する傾向にある（比較してコントロール
マウスでは30〜35gである）。obおよびdb動物は非常に
多くの他のホルモンおよび代謝の変化を発現し、これに
より変異に寄与し得る一次欠損を同定することが困難に
なる［Brayら,Am.J.Clin.Nutr.,50:891−902（198
9）］。
各齧歯類肥満症モデルには、ヒトのII型糖尿病に類似
する炭水化物代謝の変化が伴う。ある場合では、糖尿病
の重篤度は背景マウス系統に部分的に依存する［Leite
r,Endocrinology,124:912−922（1989）］。obおよびdb
の両方に対して、類遺伝子性（congenic）C57BL/Kマウ
スは、極度のβ細胞壊死および小島萎縮を有する重度の
糖尿病を発症し、相対的インスリン不足（relative ins
ulinopenia）を生じる。逆に、類遺伝子性C75BL/6J ob
およびdbマウスは、β細胞肥大により最終的に補償され
る一時的インスリン抵抗性糖尿病を発症し、これはヒト
II型糖尿病に類似する。
obおよびdbマウスの表現型は、糖尿病の進行以外の点
でヒト肥満症に類似する−−変異マウスは、痩身型コン
トロールより食餌量が多くエネルギー消費量が少ない
（肥満者と同様）。この表現型はまた視床下部腹内側部
の病巣を有する動物で見られる表現型とかなり類似して
おり、このことは、両変異が適切に中枢神経系内で栄養
情報を統合するかまたはこれに応答する能力を妨害し得
ることを示唆する。この仮説の支持は並体癒合実験の結
果から生じる［Colemanら,Diabetologia,9:294−298（1
973）］。この実験結果は、obマウスは循環飽食因子が
欠損しており、そしてdbマウスはob因子の影響に対して
抵抗性である（おそらくobレセプター欠損のためと思わ
れる）ことを示唆する。これらの実験は、これらの変異
マウスの肥満症が、身体組成を制御する仮定のフィード
バック機構の輸入ループ（afferent loop）および／ま
たは統合中枢における異なる欠陥から生じ得るという結
論を導いた。
分子マーカーおよび従来の遺伝子マーカーを用いて、
ob遺伝子およびdb遺伝子はそれぞれ、近位の第６染色体
および第４染色体中央部にマッピングされた［Baharら,
Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87:8642−8646（1990）;Freidm
anら,Genomics,11:1054−1062（1991）］。両場合と
も、変異は、ヒトとシンテニー（syntenic）であるマウ
スゲノム領域にマッピングされるので、これにより、ob
およびdbのヒトホモログが存在すれば、それらはそれぞ
れ、ヒト染色体7qおよび1pにマッピングされると思われ
ることが示唆される。db遺伝子の欠損により、他の哺乳
動物種で肥満症が生じ得る:Zucker fa/faラットおよびB
rown Norway＋／＋ラット間の遺伝子交雑において、fa
変異（ラット第５染色体）はマウスのdbに隣接する同じ
遺伝子座により隣接される［Truettら,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,88:7806−7809（1991）］。
体重に影響を及ぼすと思われる非常に多くの因子のた
めに、どの因子が、そしてより詳細にはどの恒常性機構
が体重の主要な決定因子となるのか推定することができ
なかった。従って、本発明の基となる主要な問題は、哺
乳動物の脂肪蓄積および脂肪含量の制御を可能にする体
重のモジュレーターを提供することである。
発明の要旨 本発明に従えば、動物、特に哺乳動物の脂肪蓄積およ
び脂肪含量の制御の問題は、本明細書中に開示されてい
る肥満症（OB）ポリペプチドおよびこれらのポリペプチ
ドをコードする核酸分子の提供を通して解決された。本
発明は、初めて、体重および脂肪蓄積の調整（すなわち
制御および調節）に有用な単離されたポリペプチド、な
らびにOBポリペプチドの組換え生産を可能にするだけで
なくそれ自身体重の調整に有用である、このようなポリ
ペプチドをコードする核酸配列を提供する。
本発明の肥満症（OB）ポリペプチドは、約145〜約167
アミノ酸を有し、動物（特に哺乳動物）において体重を
調整し得、そして同じ生物学的活性を有するそれらの対
立遺伝子変異体またはアナログ（フラグメントを包含す
る）を包含する。このポリペプチドは、組換え方法また
は化学合成方法によって調製され得る。本発明の好まし
いOBポリペプチドは、配列番号２、４、５、または６の
アミノ酸配列を有するOBポリペプチド、あるいはそれら
の対立遺伝子変異体またはアナログ（フラグメントを包
含する）を包含する。
本発明のOBポリペプチドの免疫原性フラグメントは、
以下を包含する:Val−Pro−Ile−Gln−Lys−Val−Gln−
Asp−Asp−Thr−Lys−Thr−Leu−Ile−Lys−Thr（配列
番号18）;Leu−His−Pro−Ile−Leu−Ser−Leu−Ser−L
ys−Met−Asp−Gln−Thr−Leu−Ala（配列番号19）;Ser
−Lys−Ser−Cys−Ser−Leu−Pro−Gln−Thr−Ser−Gly
−Leu−Gln−Lys−Pro−Glu−Ser−Leu−Asp（配列番号
20）；およびSer−Arg−Leu−Gln−Gly−Ser−Leu−Gln
−Asp−Ile−Leu−Gln−Gln−Leu−Asp−Val−Ser−Pro
−Glu−Cys（配列番号21）。
ヒトOBポリペプチドアナログは、配列番号４および６
のヒトアミノ酸配列を有するOBポリペプチドアナログを
含み、ここでアミノ酸53、56、71、85、89、92、95、9
8、110、118、121、122、126、127、128、129、132、13
9、157、159、163、および166（配列番号４の番号付け
に従う）からなる群から選択される１つまたはより多く
のアミノ酸が別のアミノ酸、例えば、配列番号２に記載
のマウスOBポリペプチドの分岐（divergent）アミノ酸
またはアラニンと置換されている。このようなアナログ
はまた、以下のようなアナログを包含する：（ａ）53位
のセリン残基がグリシン、アラニン、バリン、システイ
ン、メチオニン、またはトレオニンと置換される；
（ｂ）98位のセリン残基がグリシン、アラニン、バリ
ン、システイン、メチオニン、またはトレオニンと置換
される；および（ｃ）92位のアルギニン残基がアスパラ
ギン、リジン、ヒスチジン、グルタミン、グルタミン
酸、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、メチオニ
ン、またはシステインと置換される。本発明のOBポリペ
プチドアナログは、好ましくは、配列番号２、４、５、
または６に記載のヒトOBポリペプチドアミノ酸配列と、
83％以上のアミノ酸配列相同性を有する。
本発明の別のヒトOBポリペプチドアナログは、配列番
号４および６のアミノ酸配列を有し、そして以下を有す
る：（ａ）１つまたはより多くのアスパラギン酸残基が
グルタミン酸と置換される；（ｂ）１つまたはより多く
のイソロイシン残基がロイシンと置換される；（ｃ）１
つまたはより多くのグリシンまたはバリン残基がアラニ
ンと置換される；（ｄ）１つまたはより多くのアルギニ
ン残基がヒスチジンと置換される；（ｅ）１つまたはよ
り多くのチロシンまたはフェニルアラニン残基がトリプ
トファンと置換される；（ｆ）121位から128位（配列番
号４の番号付けに従う）の１つまたはより多くの残基が
グリシンまたはアラニンと置換される；および（ｇ）54
位から60位または118位から166位（配列番号４の番号付
けに従う）の１つまたはより多くの残基がリジン、グル
タミン酸、システイン、またはプロリンと置換される。
本発明の好ましいヒトOBポリペプチド短縮型（trunca
ted）アナログは、以下であることを包含する（配列番
号４の番号付けに従う）：（ａ）121位から128位の１つ
またはより多くの残基が欠失される；（ｂ）１〜116位
の残基が欠失される；（ｃ）１〜21位および54〜167位
の残基が欠失される；（ｄ）１〜60位および117〜167位
の残基が欠失される；（ｅ）１〜60位の残基が欠失され
る；（ｆ）１〜53位の残基が欠失される；および（ｇ）
１〜21位の残基が欠失されるサブパート（subpart）
（ａ）のアナログ。21アミノ酸「シグナル」配列（例え
ば配列番号４の１〜21位のアミノ酸）を欠く本発明のOB
ポリペプチドおよびOBポリペプチドアナログは、以下の
ようなＮ末端アミノ酸またはアミノ酸配列を有する：
（１）メチオニン、（２）グリシン−セリン−ヒスチジ
ン−メチオニン配列（配列番号38）、（３）メチオニン
−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン
−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−
セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロリ
ン−アルギニン−グリシン−セリン−ヒスチジン−メチ
オニン配列（配列番号98）、（４）ロイシン−グルタミ
ン酸−リジン−アルギニン−グルタミン酸−アラニン−
グルタミン酸−アラニン配列（配列番号26）、（５）グ
ルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配列
（配列番号27）、（６）ロイシン−グルタミン酸−リジ
ン−アルギニン配列（配列番号28）、（７）メチオニン
−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン
−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−
セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロリ
ン−アルギニン−グリシン−セリン−プロリン配列（配
列番号99）、および（８）グリシン−セリン−プロリン
配列。
本発明のOBポリペプチドの誘導体は、そこに結合して
いる１つまたはそれより多くの化学部分を有し、この化
学部分は、水溶性ポリマー（例えばポリエチレングリコ
ール）を包含する。ポリエチレングリコール誘導体は、
モノPEG化、ジPEG化、トリPEG化、またはテトラPEG化で
あり得、例えばＮ末端モノPEG化であり得る。本発明のO
Bポリペプチドの好ましいＮ末端モノPEG化誘導体は、配
列番号４の22位から167位のアミノ酸残基または配列番
号６の22位から166位の残基を含み、必要に応じて21位
に（PEG化）メチオニンを有するOBポリペプチドであ
る。
本発明により提供される単離された核酸分子は、上記
のようなOBポリペプチド、対立遺伝子変異体、またはア
ナログ（それらのフラグメントを包含する）をコードす
る。哺乳動物の体重を調整する生物学的活性を有するOB
ポリペプチドの発現を得るために用いられるDNA分子で
あって、以下からなる群から選択される、DNA分子が特
に提供される：（ａ）配列番号１および３に記載のDNA
分子またはそれらのフラグメント；（ｂ）（ａ）に定義
したDNA分子とハイブリダイズするDNA分子またはそれら
のハイブリダイズし得るフラグメント；および（ｃ）該
DNA分子のいずれかによりコードされるアミノ酸配列の
発現をコードするDNA分子。このような分子の例示は、
配列番号22および24のヒトゲノムDNA分子である。
本発明の好ましいDNA分子は、以下に記載されるアミ
ノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードする：（ａ）配列番号2;（ｂ）
配列番号２の22位から167位のアミノ酸；（ｃ）配列番
号4;（ｄ）配列番号４の22位から167位のアミノ酸；
（ｅ）配列番号5;（ｆ）配列番号５の22位から166位の
アミノ酸；および（ｇ）配列番号6;および（ｈ）配列番
号６の22位から166位のアミノ酸、ならびに既に記載し
たようなＮ末端アミノ酸またはアミノ酸配列を有するポ
リペプチド。例示的には、好ましいDNA分子は、配列番
号３のタンパク質コード配列として記載される配列、お
よび特に配列番号３の22位から167位のアミノ酸をコー
ドする配列として記載される配列を有する。
本発明のDNA分子にハイブリダイズし得る検出可能な
標識をされた核酸分子もまた提供され、そしてOB核酸の
非コード領域にハイブリダイズし得る核酸分子（非コー
ド領域はイントロン、5'非コード領域、および3'非コー
ド領域からなる群から選択される）を包含する。本発明
はまた、OBポリペプチドをコードするヒトゲノムDNAを
増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供
し、このようなオリゴヌクレオチドは、配列番号29から
32に記載される。
本発明により提供されるベクターは、上記の本発明の
DNA分子を含み、そして好ましくは、発現制御配列と作
動可能に関連されたDNA分子を含む発現ベクターの形態
を有する。本発明の単細胞宿主細胞は、本発明のDNA分
子または上記のベクターでトランスフォームまたはトラ
ンスフェクトされる。好ましい宿主細胞は、細菌、酵
母、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、および組織培
養におけるヒト細胞を包含する。例示的には、このよう
な宿主細胞は、E.coli、Pseudomonas、Bacillus、Strep
tomyces、酵母、CHO、R1.1、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、COS1、CO
S7、BSC1、BSC40、BMT10、およびSf9細胞からなる群か
ら選択される。本発明に好ましい酵母細胞は、Saccharo
myces、Pichia、Candida、Hansenula、およびTorulopsi
sを包含する。OBポリペプチドをコードするDNA配列を含
み、そして該OBポリペプチドをコードする配列に対して
機能的に近接した位置に発現調節配列を挿入することか
らなる相同組換え事象によって、OBポリペプチドの高発
現を可能にするようにインビトロで改変された哺乳動物
細胞もまた提供される。この発現調節配列は、OBポリペ
プチド発現調節配列またはそれ以外であり得、そして細
胞内で変異OBポリペプチド制御配列と置き換え得る。
本発明は、以下の工程を包含するOBポリペプチドを調
製する方法を提供する：（ａ）上記の細胞をOBポリペプ
チドの発現を提供する条件下で培養する工程；および
（ｂ）発現されたOBポリペプチドを回収する工程。この
手順はまた、以下による工程を伴い得る：（ｃ）上記ポ
リペプチドをNiキレートカラムでのクロマトグラフィー
にかける工程；および（ｄ）上記ポリペプチドをゲル濾
過により精製する工程。好ましい実施態様では、工程
（ｃ）後かつ工程（ｄ）前に、この方法は、OBポリペプ
チドを強陽イオン交換カラムでのクロマトグラフィーに
かける工程を包含する。
本発明はまた、本発明のOBポリペプチドに特異的な標
識および非標識モノクローナルおよびポリクローナル抗
体ならびに本発明のモノクローナル抗体を生産する不死
化細胞系を提供する。本発明の抗体調製は、以下の工程
を包含する：（ａ）OBポリペプチドをキャリアタンパク
質に複合体化（conjugate）させる工程；（ｂ）アジュ
バントと混合させた工程（ａ）のOBポリペプチドフラグ
メント−キャリアタンパク質複合体で宿主動物を免疫す
る工程；および（ｃ）免疫された宿主動物から抗体を得
る工程。
本発明はまた、以下の工程を包含する、試料において
OBポリペプチドの存在を測定する方法を提供する：
（ａ）OBポリペプチドを含有すると思われる試料を、該
OBポリペプチドに特異的に結合する抗体と、抗体および
OBポリペプチドを含む反応複合体の形成を可能にする条
件下で接触させる工程；および（ｂ）抗体および試料中
のOBポリペプチドを含む反応複合体の形成を検出する工
程（ここで該反応複合体の形成の検出が該試料における
OBポリペプチドの存在を示す）。以下の工程を包含す
る、生物学的試料におけるOBポリペプチドレベルを評価
するインビトロ方法が、対応して提供される：（ａ）上
記の方法に従って、生物学的試料における反応複合体の
形成を検出する工程；および（ｂ）形成された反応複合
体の量を評価する工程（ここで反応複合体の量は、生物
学的試料におけるOBポリペプチドレベルに対応する）。
本発明によりOBポリペプチドの上昇または低下に関連し
た疾患の存在を検出または診断する場合、上記の評価が
行われ、そして検出されたレベルが、正常被験体または
初期の被験体に存在するOBポリペプチドレベルと比較さ
れる。正常または以前のレベルに比較したOBポリペプチ
ドレベルの上昇はOBポリペプチドレベルの上昇に関連し
た疾患を示し、そして正常レベルに比較したOBポリペプ
チドレベルの低下はOBポリペプチドレベルの低下に関連
した疾患を示す。哺乳動物被験体におけるOBポリペプチ
ドのレベルの上昇または低下と関連した疾患の治療処置
をモニターするインビトロ方法が対応して提供され、こ
れは、上記のようにしてOBポリペプチドの上昇または低
下に関連した疾患について治療処置を受ける哺乳動物被
験体から異なる時点で得られた一連の生物学的試料にお
けるOBポリペプチドレベルを評価する工程を包含する。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリ
アと共に上記のOBポリペプチドを含み、動物の体重を減
少させるための治療方法において有用である。動物の体
重を増大させるための治療方法において有用な本発明の
別の薬学的組成物は、OBポリペプチドのアンタゴニスト
を包含し、このアンタゴニストは、好ましくはOBポリペ
プチドに結合しそしてその活性を中和する抗体、該OBポ
リペプチドのレセプターに結合するがこれを活性化しな
いOBポリペプチドのフラグメント、および該OBポリペプ
チドの小分子アンタゴニストからなる群から選択され
る。本発明はまた、個体の体重を減少または増大させる
ための、対応する体型改善美容組成物を提供し、これ
は、個体の体型を改善するための美容方法において有用
である。このような美容組成物は、個体に、個体の体重
を所望のレベルに調整するに十分な用量で投与される。
動物の体重調整（例えば遺伝子治療）のための医薬品
の製造のための、本発明の核酸分子ならびに本発明OBポ
リペプチドをコードする核酸にハイブリダイズし得るア
ンチセンス核酸分子の使用についても、本発明によって
述べられている。動物の体重を改変するための医薬品の
製造のための本発明のOBポリペプチドまたはアンタゴニ
ストの使用もまた提供される。そのように開発された医
薬品は、糖尿病、高血圧、および高コレステロール症か
らなる群から選択される障害の処置における、およびこ
のような障害の処置のための医薬品との組み合わせ療法
の一部としての、哺乳動物の体重を改変するための医薬
品の製造のために用いられ得る。このような医薬品は、
静脈内送達系、動脈内送達系、腹腔内送達系、筋内送達
系、皮下送達系、鼻内送達系、経口送達系、または肺送
達系において用いられ得る。
本明細書で示したデータは、本発明のOBポリペプチド
はそれら自身の形態で主として哺乳動物脂肪細胞（adip
ocyte）から分泌され、そしてこのポリペプチドはホル
モンとして機能することを示す。
本明細書中の実施例は、OBポリペプチド（あるいは本
明細書中で「レプチン（leptin）」と呼ばれる）がマウ
ス、ラット、およびヒトの血漿中を循環することを示し
ている。レプチンはob/obマウス由来の血漿には存在せ
ず、db/dbマウス由来の血漿では10倍高い濃度で存在
し、そしてfa/faラットでは20倍高い濃度で存在する。
最も重要なことには、組換えレプチンの毎日の注射によ
り、ob/obマウスの体重は劇的に減少し、野生型マウス
の体重は大きな影響を及ぼされ、そしてdb/dbマウスは
全く影響を受けない。
さらなる局面では、１つの種に由来するOBポリペプチ
ドが他の種において生物学的に活性である。特に、ヒト
OBポリペプチドはマウスにおいて活性である。
第１の場合では、本発明のモジュレーターは、本明細
書で定義されたようにそれ自身が体重制御のモジュレー
ターとして働くポリペプチド（このポリペプチドは、図
1A〜Ｅ（配列番号２）、図３（配列番号４）、図５（配
列番号５）、および図６（配列番号６）に記載されるよ
うなアミノ酸配列を有する）、またはそれらの保存的変
異体またはフラグメント、特にシグナルペプチドを欠く
フラグメント（あるいは本明細書中で成熟OBポリペプチ
ドと呼ばれる）をコードする核酸分子を含む。この核酸
分子は、組換えDNA分子（例えばcDNA、またはcDNAまた
は単離されたゲノムDNAを含有するベクター）またはク
ローン化遺伝子（すなわち単離されたゲノムDNA）、あ
るいはそれらの変質性（degenerate）変異体を包含す
る。特定の実施態様では、マウスおよびヒトのOBポリペ
プチドの２つの変異体に対するアミノ酸配列が提供され
る。両ポリペプチドは、49位のグルタミンが欠失した形
態で見出される。これは、mRNAスプライシングの例外か
ら生じ得る。種々の種に由来するOBポリペプチドは高度
に相同性であり得る；図４に示されるように、マウスお
よびヒトのOBポリペプチドは、80％以上相同である。
この核酸分子（組換えDNA分子またはクローン化遺伝
子）は、図1A〜Ｅ（配列番号１）および図2AおよびＢ
（配列番号３）に示されるヌクレオチド配列を有し得る
か、DNAコード配列に相補的であり得る。特に、このよ
うなDNA分子は、cDNAまたは染色体から単離されたゲノ
ムDNAであり得る。本発明の核酸分子はまた、DNAの5'お
よび3'フランキング配列ならびにイントロンDNA配列に
相当し得る。従って、本発明はまた、本願において図1A
〜Ｅ（配列番号１）および図2AおよびＢ（配列番号３）
に示される配列、および変質性変異体、対立遺伝子変
異、ならびに同様の同族分子から選択されるヌクレオチ
ド配列を有する核酸の同定に関する。
本発明の核酸分子は、DNAまたはRNAであり得、これは
リン酸結合またはリン酸アナログ（例えばチオリン酸）
結合を有する合成変異体を包含する。一本鎖および二本
鎖の両配列が、本明細書中で意図される。
本発明はさらに、分子プローブまたはポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）増幅のプライマーとして用いられる核酸
分子、すなわち図1A〜Ｅ（配列番号１）、図2AおよびＢ
（配列番号３）、および図20A〜Ｃ（配列番号22および2
4）に示される配列；またはコード配列の5'および3'フ
ランキング配列；またはゲノムDNAのイントロン配列の
一部分に相当する配列を有する合成または天然のオリゴ
ヌクレオチド、を提供する。特に、本発明は、少なくと
も約10ヌクレオチドを有する核酸分子を意図し、ここで
この核酸分子の配列は、図1A〜Ｅ（配列番号１）、図2A
およびＢ（配列番号３）、および図20A〜Ｃ（配列番号2
2）のヌクレオチド配列中の同じヌクレオチド数のヌク
レオチド配列、またはそれに相補的な配列に相当する。
より好ましくは、この分子の核酸配列は少なくとも15ヌ
クレオチドを有する。最も好ましくは、この核酸配列は
少なくとも20ヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチ
ドがプローブである本発明の実施態様では、オリゴヌク
レオチドは、例えば放射性核種（例えば32P）または酵
素で検出可能に標識される。
さらなる局面では、本発明は、クローニングベクター
（OBポリペプチドをコードする本発明の核酸を含む）；
および細菌発現ベクター、昆虫発現ベクター、または哺
乳動物発現ベクター（発現制御配列と作動可能に関連さ
せて、OBポリペプチドをコードする本発明の核酸分子を
含む）を提供する。従って、本発明はさらに、適切な発
現ベクターでトランスフェクトまたはトランスフォーム
された宿主細胞（例えば細菌細胞、酵母細胞、昆虫細
胞、または哺乳動物細胞）、および対応して、本発明の
モジュレーターの調製における上記構築物の使用に関す
る。
なおさらなる局面では、本発明は、OBポリペプチドに
結合する抗体に関する。このような抗体は、完全長ポリ
ペプチドまたはそれらの抗原性フラグメントに対して生
成され得る。１つの局面では、このような抗体は、OBポ
リペプチドの機能的（すなわち体重および脂肪組成を調
整する）活性を阻害する。別の局面では、抗体は、血漿
または血清中の循環OBポリペプチドレベルを決定するた
めに用いられ得る。なおさらなる局面では、領域特異的
抗体（特にモノクローナル抗体）が、OBポリペプチド構
造のプローブとして用いられ得る。
前述の全ての物質が、体重および脂肪組成のモジュレ
ーターとして考慮されるべきであり、そしてこのような
物質は種々の背景で用いられ得る。詳細には、本発明
は、診断および治療の両適用、ならびに特定の農業適
用、本明細書で定義されるモジュレーター（核酸分子お
よびペプチドを包含する）の使用の可能性のある全てを
意図する。さらに、体重の調整は特定の治療含意および
利益を有する。それは、肥満症または逆に悪液質が望ま
しくない身体状態を示すような状態が、本発明の１つま
たはそれより多くのモジュレーターの投与により治療さ
れ得る状態においてである。
従って、哺乳動物の体重を調整する方法が提案されて
おり、これは、図1A〜Ｅ（配列番号１）の配列、図2Aお
よびＢ（配列番号３）の配列およびそれらの変質性変異
体および対立遺伝子変異体から選択されるヌクレオチド
配列を有する核酸によりコードされるタンパク質の発現
を制御する工程を包含する。このような制御は、遺伝子
治療により目的のヌクレオチドを患者または宿主の脂肪
細胞中に導入し、肥満症を制御または低減させることに
よりもたらされ得る。逆に、ヌクレオチドに対するアン
タゴニスト（例えばアンチセンス分子）の調製および投
与は、過度の体重損失を包含する状態（例えば神経性食
欲不振、癌、またはAIDS）が存在しそしてその治療下に
ある場合においてその必要が示され、続行される。この
ような構築物は、ヌクレオチドの場合と同様に直接脂肪
細胞に導入されて、このような変化を生じさせ得る。
対応して、図1A〜Ｅ、３、５、および６（配列番号
１、配列番号４、配列番号５、および配列番号６）によ
り定義されるタンパク質、それらの保存的変異体、活性
フラグメント、および同族小分子は、治療目的のため
に、直接投与用に処方され、過度の体脂質または体重増
加の減少または制御をもたらし得る。対応して、上述の
タンパク質物質（例えばそれらのフラグメント）に対す
る抗体および他のアンタゴニストが調製され、そして同
様に投与されて、逆の効果を達成し得る。従って、本発
明は、好都合に、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦
形剤と混合して、本発明のOBポリペプチド、または別の
場合はそのアンタゴニストを含む薬学的組成物に関す
る。
さらに、本発明のOBポリペプチドは、その美容効果、
例えば脂肪蓄積を減少させることによる体型改善のため
に投与され得る。OBポリペプチドは、その美容効果のた
めに、独立にまたは他の美容戦略（例えば手術）と併用
して用いられ得る。
本発明のヌクレオチドおよび対応ペプチドの診断用途
は、診断および治療の両適用に有用な活性ヌクレオチド
物質のレパートリーを開発するために、その対立遺伝子
変異体のさらなる変異を同定するためのその核酸の使用
に及ぶ。特に、目的のヌクレオチドの同型接合変異およ
び異型接合変異が同定され、それにより患者の状態をよ
り正確に定量化すると仮定され、肥満症に対する個体の
危険状態潜在性を決定し得る。詳細には、異型接合変異
は現在、軽度から中度の肥満症に関連しているとみなさ
れ、一方、同型接合変異はより顕著な重度の肥満状態に
関連し得る。対応するDNA試験が、次いで上述の確定さ
れた物質を水準基標として用いて行われ、特定の体質に
対する的確な長期予後を容易にし、食事習慣または他の
個人的習慣の変更、あるいは直接治療介入を規定し得、
このような状態を避け得る。
本発明の診断利用は、試験被験体から採取した細胞試
料または生物学的抽出物（または試料）における本発明
のモジュレーターの存在および量を測定する方法に及
び、そこでこのような試験試料における核酸（ゲノムDN
AまたはmRNA）および／またはタンパク質レベルが確定
され得る。ヌクレオチドの活性増大およびその結果生じ
るタンパク質の存在が被験体の肥満症阻害能を反映する
とした場合、肥満性被験体においてこのような結果を観
察する医師は、本発明のヌクレオチドの存在および活性
に関する機能不全以外の要因が肥満状態の原因であると
決定し得る。逆に、ヌクレオチドおよび／または発現タ
ンパク質のレベルの低下は、このような肥満状態を治療
するためにはこのようなレベルが増大しなければならな
いことを示唆し、次いで適切な治療養生法が行われ得
る。
さらに、見出されそして図1A〜Ｅおよび2AおよびＢに
おいて示されたヌクレオチドは、上記で簡単に述べたよ
うに、対応するRNAの測定に有用であるcDNAを表す。同
様に、図1A〜Ｅおよび３のポリペプチドに相当する組換
えタンパク質物質が調製され、そして、例えばOBタンパ
ク質の脂肪および／または血漿レベルの測定、または組
織（例えば視床下部）上のOBに対するレセプターの存在
およびレベルの検出のための、例えばラジオイムノアッ
セイにおける使用のために適切に標識され得る。
さらに、本発明は、本明細書中に示されたヌクレオチ
ドおよび対応するタンパク質の同定だけでなく、このよ
うな物質に対するレセプターの明示もまた意図する。こ
のような背景において、図1A〜Ｅ、３、５、および／ま
たは６のポリペプチドが調製され得、適切な発現ライブ
ラリーをスクリーニングして活性なレセプターを単離す
るために利用され得る。このレセプターはその後クロー
ン化され得、そしてその後レセプター単独で、またはリ
ガンドと併用して、本明細書中のモジュレーターと同様
の活性を有し得る小分子をスクリーニングするのに用い
られ得る。
さらに、本発明は、本明細書において特定のモジュレ
ーター、好ましくはそのような治療が適切である種々の
投与様式の製剤形態において調製された、その配列が配
列番号２、配列番号４、配列番号５、および配列番号６
に示されるポリペプチド、それらの抗体、それらの対応
する小分子アゴニストまたはアンタゴニスト、または活
性フラグメントを含む薬学的組成物に関する。このよう
な製剤形態は、薬学的に受容可能なキャリア、または必
要に応じて他のアジュバントを含み、そして各場合にお
いて臨床医または医師により決定される有効用量範囲で
調製され得る。
従って、本発明の主要な目的は、本明細書中で定義さ
れるような精製形態の体重モジュレーターを提供するこ
とであり、このモジュレーターは、哺乳動物の脂肪蓄積
および脂肪含量の制御および変動に関連した特定の特徴
および活性を示す。
本発明のさらなる目的は、このようなモジュレーター
のレベルの変動が特徴的な性質であるかまたはあり得る
病理学的状態の有効な診断およびモニタリングの手段と
して、本明細書中に記載したような体重制御のモジュレ
ーターの検出および測定方法を提供することである。
本発明の別のさらなる目的は、哺乳動物において本発
明のモジュレーターの活性を模倣または阻害するに潜在
的に有効な物質（例えば、薬剤、因子など）のスクリー
ニングのための方法および関連アッセイシステムを提供
することである。
本発明の別のさらなる目的は、哺乳動物において体重
および脂肪含量を制御し、そして／または体重の異常低
下または異常上昇が特徴的な性質である特定の病理学的
状態を治療するための哺乳動物の処置方法を提供するこ
とである。
本発明のさらなる目的は、遺伝子治療プロトコルにお
いて用いられる遺伝子構築物、および／または１つまた
はそれより多くのモジュレーター、結合パートナー、ま
たはそれらの生産を制御し得るか、またはそれらの活性
を模倣または拮抗し得る因子を含むか、またはこれに基
づく、同等の治療方法のための薬学的組成物を調製する
ことである。
他の目的および利点は、以下の例示の図面に関連して
進行する続く記載を検討することにより、当業者には明
らかである。
図面の簡単な説明 図１（Ａ〜Ｅ）は、マウスOB cDNAについて誘導され
る核酸配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配
列番号２）を示す。39塩基対の5'リーダーの後方に予測
167アミノ酸オープンリーディングフレームおよび約3.7
kbの3'非翻訳配列が続く。（既に1994年11月30日出願の
出願第08/347,563号および1995年５月10日出願の第08/4
38,431号において、さらなる58塩基の5'非コード配列が
続いて決定され、クローニングアーチファクトとされ
た。このアーチファクトは、コード領域、図１に示され
ている39塩基の5'非コード領域、または遺伝子の3'非コ
ード領域とは関係がない。）3'非翻訳配列の約2500塩基
対のすべてを示す。観察およびSigSeqコンピュータプロ
グラムを用いることによる推定タンパク質の分析は、シ
グナル配列の存在を示す（下線）。cDNAの微小不均一性
（microheterogeneity）が認められ、約70％のcDNAがコ
ドン49にグルタミンのコドンを有し、そして30％が有し
なかった（以下の図５および６を参照のこと）。このア
ミノ酸には下線を付し、C57BL/6J ob/obマウス（1Jマウ
ス）内で変異しているアルギニンのコドンにも同様に下
線を付す。
図２（ＡおよびＢ）は、ヒトOB cDNAについて誘導さ
れた核酸配列（配列番号３）を示す。ヌクレオチドには
１〜701の番号を付し、開始部位はヌクレオチド46で終
始はヌクレオチド550である。
図３は、図2AおよびＢの核酸配列に対応するヒトOB遺
伝子について誘導された全推定アミノ酸配列（配列番号
４）を示す。アミノ酸には１〜167の番号を付す。シグ
ナル配列切断部位がアミノ酸21（Ala）の後に位置し、
このため成熟タンパク質がアミノ酸22（Val）からアミ
ノ酸167（Cys）に伸長している。
図４は、マウス（配列番号２）とヒト（配列番号４）
との推定アミノ酸配列間の比較を示す。ヒトOB推定アミ
ノ酸配列の配列は、マウスの配列に対して高度に相同性
である。保存的変化を破線で、そして非保存的変化をア
ステリスクで示す。可変のグルタミンのコドンには下線
を付し、これはC57BL/6J ob/ob（1J）マウスのナンセン
ス変異の位置にも同様に下線を付す。全体的では、アミ
ノ酸レベルで83％の同一性があるが、コドン22のバリン
（シグナル配列切断（overage）のすぐ下流と117位のシ
ステインとの間には８個の置換しか見出されなかった。
図５は、図３に示されたマウスOB遺伝子について誘導
される全長アミノ酸配列（配列番号５）であるが、グル
タミン49を欠失する配列を示す。アミノ酸には１〜166
の番号を付す。シグナル配列切断部位がアミノ酸21（Al
a）の後（つまりグルタミン酸49欠失の前方）に位置
し、このため成熟タンパク質がアミノ酸22（Val）から
アミノ酸166（Cys）に伸長している。
図６は、図４に示されたヒトOB遺伝子について誘導さ
れる全長推定アミノ酸配列（配列番号６）であるがグル
タミン49を欠失する配列を示す。アミノ酸には１〜166
の番号を付す。シグナル配列切断部位がアミノ酸21（Al
a）の後（つまりグルタミン酸49欠失の前方）に位置
し、このため成熟タンパク質がアミノ酸22（Val）から
アミノ酸166（Cys）に伸長している。
図７。（Ａ）マウス染色体におけるobの位置の物理地
図ならびにYACおよびP1クローニング地図。「Ｍおよび
Ｎ」はMul IおよびNot I制限部位に対応する。数字は、
評価された1606減数分裂中のobの領域において組み換え
た個々の動物に対応する。Met、Pax4、D6Rck39、D6Rck1
3、およびCpaは、DNAプローブに結合するobの領域内の
位置を意味する。D6Rack13およびPax−４を用いてYACを
単離し、そしてベクトレット（vectorette）PCRおよび
／またはプラスミドエンドレスキュー（plasmid end re
scue）を用いて末端を回収し、そして順次新たなYACを
単離するために使用した。（Ｂ）得られたYACコンティ
グ（contig）。このコンティグにおけるYACの１つ（Y90
2A0925）はキメラであった。組換え動物の遺伝子型を決
定するために使用したプローブのそれぞれを括弧内に示
す。（６）はYAC107に対応する；（５）はM16（＋）
（またはM16（pLUS））に対応する；（４）はadu（＋）
に対応する；（３）はaad（pICL）に対応する；（２）
は53（pICL）に対応する；そして（１）は53（＋）に対
応する。（Ｃ）選択されたYAC末端プローブにより単離
されるバクテリオファージP1のP1コンティグ。YAC YB6S
2F12の遠位末端（末端（４））（あるいは、本明細書中
においてadu（＋）と呼ぶ）を用いて、単離されたP1ク
ローンにおいてob遺伝子を単離した。
図８は、第４エキソンのトラッピング実験の192個の
個々の単離物（PCRで増幅し、そして特徴付けした）の
エチジウムブロミド染色の写真を示す。
図９は、obを有していると思われるPCR増幅クローン
のエチジウムブロミド染色の写真である。アーチフェク
トを有さない７個のクローンのそれぞれをPCRを用いて
再増幅し、そしてTBE中の１％アガロースゲル上で電気
泳動し、そしてエチジウムブロミドで染色した。サイズ
マーカー（最も左側の番号を付していないレーン）は市
販の「1kBラダー」である。レーン−−「HIV配列」を含
有するクローン1D12。レーン２−−クローン1F1、ob領
域外の新規のクローン。レーン３−−クローン1H3。レ
ーン４−−クローン2B2（1F1と同一）。レーン５−−ク
ローン2G7（obエキソンを含有）。レーン６−−クロー
ン2G11（1F1と同一）。レーン７−−クローン2H1（挿入
物を含有しない）。
図10は、OB遺伝子の一部をコードするエキソンを含む
2G7クローン（配列番号７）の配列を示す。このエキソ
ンの増幅に使用したプライマー配列を図の枠内に示す
（配列番号８および９）。
図11（Ａ）2G7プライマーおよびアクチンプライマー
を用いた同マウスの異なる組織由来のmRNAの逆転写PCR
分析。第１鎖cDNA合成用プライマーとして、オリゴdTを
用いて逆転写した100ngの全RNAを用い、RT−PCR反応を
実施した。PCR増幅を、94℃の熱変性１分間、55℃のハ
イブリダイゼーション１分間、１サイクルあたり１秒間
の自動延長を含む72℃の伸長２分間で35サイクル実施し
た。RT−PCR産物を１×TBE緩衝液中で泳動した２％低融
点アガロースゲル内で分離した。（Ｂ）プローブとして
PCR標識2G7を用いるマウスの異なる器官由来のmRNAのノ
ーザンブロット。各組織由来の全RNAの10μｇを、ホル
ムアルデヒドを含むアガロースゲル上で電気泳動した。
プローブを65℃でRapid Hybe（Amersham）内でハイブリ
ダイズした。暴露の１時間後にオートラジオグラフシグ
ナルが出現した；示す実験は、24時間暴露の結果であ
る。
図12（Ａ）記載される各マウス株由来の脂肪細胞（白
色脂肪組織）RNA上でのRT−PCR反応からのエチジウムブ
ロミド染色。各サンプルに対する全RNA（100ng）を、オ
リゴdTおよび逆転写酵素を用いて逆転写し、そして得ら
れた一本鎖cDNAを2G7プライマー（下のバンド）または
アクチンプライマー（上のバンド）でPCR増幅した。2G7
プライマーおよびアクチンプライマーの両方は、同一の
PCR反応に含まれた。産物を１％アガロースTBEゲル上で
泳動した。（Ｂ）（Ａ）に対応するノーザン分析。示さ
れる各株由来の脂肪細胞（白色脂肪組織）RNAの10μｇ
を泳動し、そして上の図11BのPCR標識2G7プローブで検
出した。2G7 mRNAのレベルにおける約20倍の増加がC57B
L/6J ob/ob（1J）株由来の白色脂肪において、痩身型同
腹子に比較して明白であった。RT−PCRおよびノーザン
実験の両方において、SM/Ckc−＋Dacob2J/ob2J（2J）マ
ウス由来の2G7 RNAの検出し得るシグナルは、２週間の
暴露後でも存在しなかった。24時間のオートラジオグラ
フ暴露が示される。同じフィルターをアクチンプローブ
に対してハイブリダイズした（パネル下部）。
図13は、さらなる2J動物およびコントロール動物のノ
ーザンブロット分析であり、ここで2J動物由来のob mRN
Aがないことを確認している。ノーザン分析は、図11お
よび12の通りに実施した。この場合、コントロールRNA
はap2（脂肪特異的転写物）であった。ap2のバンドの密
度の変化に有意性は認められない。
図14は、変異株のcDNAにおける未成熟な終始コドン
（ナンセンス変異）の導入を引き起こす点突然変異の領
域において、C57BL/6J（正常）マウスとC57BL/6J ob/ob
（1J）マウスのDNA配列を比較している。ob/obマウス
は、105位のアルギニン残基を変化させるＣ→Ｔ変異を
有する。この塩基の変化は、自動DNAシークエンサーか
らの出力として示される。5'および3'非翻訳領域由来の
プライマーを用いて両株（＋／＋およびob/ob）由来の
白色脂肪のRNAを用いるRT−PCRを実施した。PCR反応産
物をゲル精製し、そしてコード配列の両鎖に沿ったプラ
イマーを用いて直接手動で、およびApplied Biosystem
s,Inc.373A自動シークエンサーを用いて配列を決定し
た。
図15（Ａ）記載される各マウス株由来のゲノムDNAの
サザンブロット。約５μｇのDNA（肝臓、腎臓、または
脾臓から調製されるゲノムDNAに由来する）を示された
制限酵素で制限消化した。DNAを、次に１％アガロースT
BEゲル内で電気泳動し、そしてPCR標識2G7プローブで検
出した。Bgl IIによる制限消化は、SM/Ckc−＋Dacob2J/
ob2J（2J）DNAにおいて約9kB（最大）のBgl IIフラグメ
ントのサイズの増大があることを示した。RFLPは、他の
いずれの制限酵素でも検出されなかった。ゲノムDNAの
予備制限マッピングは、多型のBgl II部位が転写開始部
位の約7kB上流にあることを示した。試験を行った他の
いずれの酵素でもmRNA開始部位を越えるものはない。
（Ｂ）SM/Ckc−＋Dacob2J/ob2J株におけるBgl II多型の
分離。（Ａ）に示されたBgl II多型を評価することによ
って、類似遺伝子型のSM/Ckc−＋Dacob2J/ob2J（2J）コ
ロニーの同世代由来の６匹の肥満型の子孫および５匹の
痩身型の子孫の遺伝子型を決定した。表現型上で肥満型
の動物のすべてが、多型Bgl IIフラグメントの大きい方
の対立遺伝子に対してホモ接合型であった。「コントロ
ール」レーンのDNAを、SM/Ckc−＋Dacob2J/ob2Jコロニ
ーとは別に飼育した血縁の無いSM/Ckc−＋Dac＋／＋マ
ウスから調製した。
図16は、記載される種由来のEcoR I消化ゲノムDNAの
サザンブロットであり、プローブとしてOB cDNAを用い
ている（即ち動物ブロット）。中程度にストリンジェン
トなハイブリダイゼーション後でも、すべての脊椎動物
サンプルにおいてハイブリダイゼーションシグナルが検
出された。本実験のネコDNAは僅かに分解していた。制
限されたDNAを１％アガロースTBEゲル上で泳動し、そし
てプローブ分析用にimobilon膜に移した。65℃でフィル
ターをハイブリダイズし、そして２×SSC/0.2％SDS中65
℃で２回、20分間洗浄し、そしてKodak（Rochester,N.
Y.）Ｘ−OMATフィルムを用いて３日間暴露した。
図17は、ベクターpET−15b（Novagen）の発現クロー
ニング領域（配列番号11および12）を示す。
図18は、His−tagに対する組換え成熟マウスob融合体
（Ａ）、およびHis−tagに対する組換え成熟ヒトOB融合
体（Ｂ）に関するHis−結合樹脂（Ni）カラムからの溶
出物の分析を示す。細菌をベクターpETM9およびpETH14
でそれぞれトランスフォームした。至適条件での1mM IP
TGによる誘導において、トランスフォームされた細菌
は、まず封入体（inclusion body）中に、100−300μg/
mlのOB融合タンパク質を生産し得た。インクルージョン
ボディを6Mグアニジン−HClまたは尿素で可溶化し、そ
して融合タンパク質（溶解物上清に存在する）を尿素を
含む10mlの１×結合緩衝液中のHis−結合樹脂（Ni）カ
ラムに添加した。カラムを、5mlアリコートの20μＭ、6
0μＭ、および300μＭイミダゾールで段階的に溶出し、
最後にストリップ（strip）緩衝液で溶出した。そのア
リコートを、15％アクリルアミドゲル上でOBポリペプチ
ド融合体の存在について分析した。各レーンは、100μ
ｌの細菌抽出物の同等物を含む。
図19（Ａ）OB RNAのインビトロ翻訳。ヒトOB cDNAをp
GEMベクターにサブクローニングした。プラスミドを線
状化し、そしてSp6ポリメラーゼを用いて＋鎖RNAを合成
した。インビトロで合成されたRNAを、イヌ膵ミクロソ
ーム膜の存在または非存在下で翻訳した。インビトロ翻
訳後に、約18kDの一次翻訳産物が認められた。ミクロソ
ーム膜を反応物に添加すると、一次翻訳産物より約2kD
小さい第２の翻訳産物が出現した。コードされたシグナ
ル配列を欠くインターロイキン−１αRNAの翻訳産物の
サイズは、ミクロソーム膜の添加によっては変化しなか
った。これらのデータは、機能的シグナル配列の存在を
示す。（Ｂ）プロテイナーゼＫの存在または非存在下で
のインビトロ翻訳。プロテアーゼ処理により、18kD一次
翻訳産物の完全な蛋白質分解を得たが、16kDのプロセス
を受けた形態は影響を受けなかった。0.1％TRITON−X10
0によるミクロソームの透過化は、プロセスを受けた形
態をプロテアーゼ感受性にした。これらの結果は、この
産物がミクロソームの内腔へ翻訳していたことを示す。
図20（Ａ〜Ｅ）ヒトOB遺伝子の配列（配列番号22およ
び24）。（Ｆ）マウスOB遺伝子の概略図。（Ｇ）ヒトOB
遺伝子の概略図。（Ｆ）および（Ｇ）両者においては、
開始コドンおよび終始コドンに下線を付す。ヒト遺伝子
における、マウスの第１イントロンに相同的な第１イン
トロンの証拠は認められないが、その存在は否定できな
い。
図21は、Pichia酵母におけるOBの組換え発現を達成す
るために用いたクローニングストラテジーの一つの概略
図を示す。（Ａ）α−接合因子シグナル配列を有するOB
の発現ベクター。（Ｂ）組換え融合タンパク質構造の概
略図で、Xho I部位、ならびに推定KEX−２およびSTE−1
3切断部位を示したアミノ酸配列（配列番号26）、およ
びKEX−２切断後に存在するＮ末端余剰アミノ酸（配列
番号27）を含む。（Ｃ）成熟OBを生産するための別のス
トラテジーは、成熟obポリペプチド配列のすぐ上流のXh
o I切断部位およびKEX−２切断部位に対応するアミノ酸
配列（配列番号28）を有する構築物を調製する工程を包
含する。
図22 Pichiaにおける別の発現ストラテジー。（Ａ）
α−接合因子シグナル配列制御下で、pET発現系から採
用されたHis−tagを含有するOB融合体の発現ベクター
（配列番号33）。（Ｂ）His−tagを含有する組換えOB融
合タンパク質構造の概略図で、α−接合因子シグナル配
列、推測KEX−２およびSTE−13切断部位、His−tag、お
よびトロンビン切断部位を含み、３つの余剰Ｎ末端アミ
ノ酸残基を伴うOBを産出する。
図23（Ａ）トランスフォームされたpichia酵母におけ
るマウスOB（両微小不均一性形態、即ち、Gln49を含有
する形態および含有しない形態）の発現のPAGE分析。約
16kDの予想バンドが、トランスフォームされた酵母培養
液において認められる（２番目および３番目のレーン）
が、トランスフォームされていない酵母の培養液では認
められない（１番目のレーン）。（Ｂ）カルボキシメチ
ルセルロース（弱い陽イオン交換体）上の部分精製組換
えOBポリペプチドのPAGE分析。約16kDのバンドは、カラ
ムから250mM NaClで溶出された画分３および４において
よく認められる。レーン１−−添加されたサンプル；レ
ーン２−−素通り；レーン３〜５−−250mM NaClによる
溶出画分。
図24は、OBタンパク質がマウス血漿中を循環すること
を示す。（Ａ）マウス血液からの免疫沈降。0.5mlのマ
ウス血漿を非結合型セファロースで予め澄明にし、そし
てセファロース4Bビーズに結合した免疫精製抗OB抗体と
一晩インキュベートした。免疫沈降物を15％SDS−PAGE
ゲル上で分離し、トランスファーし、そして抗OB抗体で
ウエスタンブロットを行った。タンパク質は約16kDの分
子量で、酵母で発現された成熟マウスobタンパク質と同
じ位置まで泳動した。C57BL/6L ob/obマウス由来の血漿
にはこのタンパク質は認められず、そしてC57BLB/Ks db
/dbマウス由来の血漿では、野生型マウスに比較して10
倍増加した。dbマウスは、OBタンパク質を過剰生産する
ことが示唆されており、またそれに伴いその効果に対す
る耐性も示唆されている。（Ｂ）脂肪過多ラットにおけ
るOBレベルの増加。脂肪過多ラットは、ラット第５染色
体の劣性変異の結果、肥満型である。遺伝子データは、
dbマウスにおいて変異した同遺伝子の欠損を示唆してい
る。脂肪過多ラットおよび痩身型の同腹子由来の血漿を
免疫沈降し、そしてウエスタンブロット上で泳動した。
OBの循環レベルの20倍の増加が変異動物内に認められ
た。（Ｃ）。マウス血漿におけるOBタンパク質の定量。
組換えマウスタンパク質の増加量をobマウス由来の100
λの血漿に添加し、免疫沈降を行った。ウエスタンブロ
ットのシグナルの強度を野生型マウス由来の100λの血
漿からのシグナル強度と比較した。組み換えタンパク質
量の増加に伴い、シグナル強度の直線的増加が認めら
れ、本免疫沈降が抗体過剰の条件下で実施されたことが
示された。同様のシグナルが野生型血漿サンプルおよび
2ngの組換えタンパク質を有するサンプルに認められ、
マウス血漿における循環レベルが約20ng/mlであること
が示された。（Ｄ）肥満組織抽出物におけるOBタンパク
質。マウス肥満組織の細胞質抽出物をdbおよび野生型マ
ウスから調製した。ウエスタンブロットは、dbマウスか
ら調製した抽出物において16kDのタンパク質のレベルの
増加を示した。
図25は、OBタンパク質が種々のレベルでヒト血漿中を
循環することを示す。（Ａ）ヒト血漿のウエスタンブロ
ット。６名の痩身体型の志願者から血漿サンプルを得
た。免疫沈降およびウエスタンブロッティングは、免疫
反応性の16kDのタンパク質の存在を示し、このタンパク
質は酵母で発現された組換え型の146アミノ酸ヒトタン
パク質とサイズが同一であった。６つのサンプルのそれ
ぞれにおいて、一定しないレベルのタンパク質が認めら
れた。（Ｂ）ヒトobに対するELlSA（酵素結合イムノア
ッセイ）。マイクロタイタープレートを免疫精製抗ヒト
OB抗体でコートした。既知量の組換えタンパク質をプレ
ートに添加し、そして免疫精製ビオチン化抗ob抗体を用
いて検出した。414nmでの吸光度を既知濃度のOBに対し
てプロットし、標準曲線を作成した。得られた標準曲線
は、このアッセイが1ng/mlまたはそれ以上のヒトOBタン
パク質を検出可能であることを示した。（Ｃ）ヒト血漿
におけるOBタンパク質の定量。ELlSAイムノアッセイ
を、６名の痩身型志願者由来の100スの血漿およびパネ
ルＢで使用した標準物を用いて実施した。HP1の2ng/ml
〜HP6の15ng/mlの範囲のOBタンパク質のレベルが認めら
れた。これらのデータは、パネルＡのウエスタンブロッ
トのデータと相関した。
図26は、OBタンパク質が分子間または分子内のジスル
フィド結合を形成することを示す。（Ａ）還元および非
還元条件下でのウエスタンブロット。マウスおよびヒト
血漿のウエスタンブロットを、還元剤をサンプル緩衝液
に添加するかまたはせずに繰り返した。β−メルカプト
エタノールをサンプル緩衝液から除いた場合は、db血漿
由来の免疫沈降物が見かけの分子量16kDおよび32kDで泳
動する。緩衝液にβ−メルカプトエタノールを添加する
と、32kDの部分が消失する（図24を参照のこと）。この
結果は酵母（Pichia pastoris）でマウスタンパク質を
発現する場合にも再現される。この場合、マウスOBタン
パク質はダイマーの位置まで泳動する。還元状態では、
精製された組換えマウスタンパク質は、見かけの分子量
16kDで泳動することから、32kDの分子形態は１つまたは
２つの分子間ジスルフィド結合の結果であることが示さ
れる。インビボおよびPichia pastorisで発現されたヒ
トタンパク質は、還元および非還元状態で、分子量16kD
で泳動する（データ示さず）。（Ｂ）酵母内で発現され
たヒトタンパク質は、分子内ジスルフィド結合を有す
る。分泌されたタンパク質は、一般にPichia pastoris
発現系で発現された場合でも正確なコンフォーメーショ
ンをとる。146アミノ酸成熟ヒトタンパク質をPichia pa
storisで発現させ、そしてIMACおよびゲル濾過を含む２
工程の精製プロトコールによって酵母培地から精製し
た。臭化シアン分解の前後に、精製組換えタンパク質を
質量分析に供した。臭化シアンはメチオニン残基のカル
ボキシ端で切断する。組換え酵母タンパク質の分子質量
は、16,024±3Da（算出された分子質量＝16,024Da）で
あった。臭化シアンは、タンパク質配列中のアミノ酸7
5、89、および157の３つのメチオニンの後ろを切断す
る。測定された質量8435.6Daを有する臭化シアンフラグ
メントは、cys−117とcys−167との間のジスルフィド結
合で結合したアミノ酸90〜157およびアミノ酸158〜167
に対応する（算出された分子質量＝8434.5Da）。N.D.＝
検出されず。
図27は、生物活性な組換えタンパク質の調製を示す。
145アミノ酸成熟マウスOBタンパク質に対応するヌクレ
オチド配列を、pET15b発現ベクターにクローン化した。
このpETベクターは、固定化金属アフィニティークロマ
トグラフィー（IMAC）を用いた効率的な精製を可能にす
る、ポリヒスチジン領域（His−tag）をクローン化配列
の上流に挿入している。細菌溶解後、この組換え細菌タ
ンパク質は、はじめ不溶性の膜画分に分配された。塩酸
グアニジンを用いて膜画分を可溶化し、そしてIMACカラ
ム上に添加した。示されたように、イミダゾールの濃度
を上昇して段階的にタンパク質を溶出した。記載の通
り、溶出したタンパク質を再フォールディング（refol
d）し、そしてトロンビンで処理してHis−tagを除去し
た。可溶性タンパク質の最終収量は、45ng/ml細菌培養
物であった。
図28は、OBタンパク質の生物学的効果を示す。食物摂
取（パネルＡ〜Ｃ）および体重（パネルＤ〜Ｆ）の時間
的経過。10匹の動物の群が、5mg/kg/日用量でのOBタン
パク質の連日腹腔内注入（黒四角）、PBSの連日注入
（黒丸）、または未処置（黒三角）のいずれかを受け
た。処置グループは、C57Bl/6J ob/obマウス（パネルＡ
およびＤ）、C57Bl/Ks db/dbマウス（パネルＢおよび
Ｅ）、およびCBA/J＋／＋マウス（パネルＣおよびＦ）
を含んだ。示した通り、マウスの食物摂取を、連日測定
し、そして３〜４日間の間隔で記録した。（グラム標示
の体重のスケールは、野生型マウス対obおよびdbマウス
で異なる。）タンパク質を受けたobマウスの食物摂取
は、最初の注入後に減少し、そして４日目には、疑似
（sham）注入したグループで認められたレベルの約40％
のレベルで安定化した（ｐ＜.001）。これらの動物の体
重は平均1.3グラム／日減少し、そして３週間後、開始
時の体重の約60％のレベルで安定化した（ｐ＜.000
1）。dbマウスでは、このタンパク質の効果は示されな
かった。早期の２つの時点でCBA/Jマウスに、体重に対
して少ないが有意な効果が観察された（ｐ＜.02）。画
測定値の標準誤差をバーで示し、そしてこの結果の統計
的有意性を表１に示す。
図29は、obマウスのペアフィーディングの結果を示
す。（Ａ）４匹のC57Bl/6J ob/obマウスの群に、組換え
タンパク質を受けたobマウスの群が消費した量に等しい
量の食物を与えた。両グループに対する重量の消失を、
５、８、および12日後に算出した。食物制限されたマウ
ス（斜線バー）は、タンパク質を受けたobマウス（黒色
バー）よりも少ない重量を消失した（ｐ＜.02）。この
結果は、OBタンパク質の体重滅少効果が、食物摂取およ
びエネルギー消費両者に対する効果の結果であることを
示す。（Ｂ）処置されたobマウスの写真。２匹のC57Bl/
6J ob/obマウスを示す。左側のマウスはPBSを受け、体
重65グラム（開始時の重量）であった。右側のマウス
は、組換えOBタンパク質の連日注入を受けた。この動物
の開始時の重量も65グラムで、そしてタンパク質処理の
３週間後の重量は38グラムであった。（Ｃ）処理および
未処理obマウス由来の肝臓。処理および未処理のC57Bl/
6J ob/obマウス由来の肝臓を示す。PBSを受けたマウス
由来の肝臓は、脂肪過多肝臓の肉眼的外観を有し、そし
て重量は5.04グラムであった。組換えobタンパク質を受
けたマウスは、正常な外観を有し、そして重量は2.23グ
ラムであった。
図30は、脂肪組織に対するobのインサイチュハイブリ
ダイゼーションを示す。センスおよびアンチセンスOB R
NAを、Sp6およびT7ポリメラーゼおよびジゴキシゲニン
（digoxigenin）を用いて、インビトロで標識した。標
識したRNAを、８週齢のC57Bl/Ksマウス（野生型と標
示）およびC57Bl/Ks db/dbマウス（dbと標示）の副睾丸
の脂肪パッド由来の脂肪組織のパラフィン埋包切片にハ
イブリダイズした。この図では、脂質小滴が細胞内の非
染色空砲として認められる。細胞質は細胞周縁部の薄い
縁であり、そして細胞膜と区別できない。アンチセンス
プローブを用いた場合のみ、この範囲におけるすべての
脂肪細胞に対するハイブリダイゼーションが、野生型切
片において検出され、そしてdb/db動物由来の組織切片
において、かなり増加したレベルが認められた。
図31は、OB RNAが、インビボおよびインビトロで発現
されることを示す。いくつかの異なる供給源由来の全RN
A（10マイクログラム）を電気泳動してブロットし、ob
プローブに対してハイブリダイズした。まず、コラゲナ
ーゼ消化後、細胞浮力の差を利用して脂肪細胞を精製し
た。OB RNAは脂肪細胞画分にのみ存在した。レーンＳ
は、間質血管画分を示し、そしてレーンＡは脂肪細胞画
分を示す。さらに、未分化の3T3−442前脂質細胞ではOB
RNAは発現されなかった（レーンＵ）。これらの細胞系
統由来の分化脂質細胞は、明らかに検出可能なレベルの
OB mRNAを発現した（レーンＤ）。
図32は、すべての脂肪組織貯蔵所（depot）においてO
B RNAが発現されたことを示す。試験したすべての脂肪
組織貯蔵所がob RNAを発現した。鼠蹊脂肪パッドは、若
干低いRNAを発現したが、種々の実験においてシグナル
レベルの多様性が認められた（図31A）。レーン（１）
副睾丸脂肪パッド、（２）鼠蹊脂肪パッド、（３）腹部
脂肪パッド、（４）傍子宮脂肪パッド。褐色脂肪も低レ
ベルのOB RNAを発現した（図31B）。褐色脂肪中のOB発
現レベルは、４℃で１週間飼育された動物では変化しな
かったが、褐色特異的UCP RNAの量（低温誘導性で知ら
れる）は５倍に増加した。
図33は、db/dbおよび金チオグルコース処理マウスに
おけるOB RNAの発現を示す。金チオグルコース（GTG）
およびdb/db処理マウスの傍子宮脂肪パッド由来の全RNA
を電気泳動およびノーザンブロットした。単回用量とし
て投与されたGTGは、特異的な視床下部の損傷を誘導す
ることによって、肥満症を引き起こすことが知られてい
る。（Ａ）１月齢CBA雌性マウスをGTG（.2mg/g）で処理
したところ、コントロール動物（＜5gの増加）に比較し
て、処理動物では＞20gの増加が得られた。（Ｂ）db/db
およびGTG処理マウス由来のRNAに対するOBプローブのハ
イブリダイゼーションは、コントロールRNA（アクチン
またはGAPDH）に比較して20倍増加量のob RNAを示し
た。
図34は、ヒトRNAのノーザンブロット分析を示す。ヒ
ト脂肪組織（FAT、パネルＡ）由来の全RNA10mgおよびヒ
ト以外の組織（パネルＢ）由来のポリＡ＋RNA2mgを含む
ノーザンブロットを、示されたヒトobプローブまたはヒ
トβ−アクチンプローブにハイブリダイズした。脂肪組
織全RNAについて、約4.5kbでの強度のシグナルが認めら
れた。ポリＡ＋RNAに対するハイブリダイゼーション
は、心臓（HE）および胎盤（PL）において検出可能なシ
グナルを示したが、脳（BL）、肺（LU）、肝臓（LI）、
骨格筋（SM）、腎臓（KI）、および膵臓（PA）ではOB R
NAは検出されなかった。各場合における、オートラジオ
グラフィー暴露の長さを示す。注：胎盤RNAに認められ
る低分子の方のバンドの起源（例えば、オルタネートス
プライシング（alternate splicing）、RNA分解）につ
いては知られていない。
図35は、ヒトOB遺伝子および８個のマイクロサテライ
トマーカーを含むYACコンティグを示す。ヒトOB遺伝子
を含む第７染色体領域のYACに基づくSTS含有地図を示
し、これは、SEGMAP/バージョン3.29［Greenら、PCR Me
thods Applic.,1:77−90（1991）］から推定した。19個
の独特な順に配列したSTS（表３を参照のこと）を上部
に示す。８個のマイクロサテライト特異的STSを星印で
示す（表４を参照のこと）。Pax4およびOB遺伝子、なら
びにコンティグに対して相対的なセントロメア（CEN）
およびテロメア（TEL）の予想された位置も示す。各43
のYACクローンを、水平の線で示し、左側に名称を付
し、そして括弧内に推定YACのサイズ（kbで、パルスフ
ィールドゲル電気泳動により測定された）を示す。各YA
CにおけるSTSの存在を適切な位置に黒丸で示す。STSがY
ACの挿入末端に対応する場合は、対応する円の周囲（上
部（STSの名称付近）およびSTSが誘導されるYACの末端
の両方）に四角を置いた。下部（水平破線の下）の５つ
のYACについては、（確立されたSTSの順番に基づいて）
存在が予想される１つまたはそれ以上のSTSは検出され
ず（対応するSTS−特異的PCRアッセイで少なくとも２
回、個々のYACを試験することによって評価した）、そ
してこれらを適切な位置で白丸で示す。ほとんどのYAC
をヒト−ハムスターハイブリッド細胞由来ライブラリー
［Greenら、Genomics,25:170−183（1995）］から単離
し、示された通り元の名称を付した。残りのYACを全ヒ
トゲノムライブラリーから単離し、そして元のライブラ
リーの位置を表３に示す。7q31.3に対してFISH分析によ
ってマップすることが見出された３つのYAC（yWSS691、
yWSS999、およびyWSS2935）の名称の周囲に枠を置く。
コンティグは「未計算の」形態で表し、YACのサイズを
用いてはクローンの重複またはSTSスペーシングを概算
せず、従ってすべてのSTSを等間隔で配置した。「計算
された」形態では、YACのサイズを用いて隣接するSTSの
各対を隔てる相対的距離およびクローンの重複の範囲が
概算され、総YACコンティグは全長が2Mbを若干超えるよ
うである。
発明の詳細な説明 本発明は、本明細書においてobポリペプチドまたはレ
プチン（leptin）と呼ばれるタンパク質、本タンパク質
をコードする核酸（例えば、特定の発現系における発現
のための最適コドンを取り込み、ここでタンパク質が哺
乳動物の体重の制御に関与する能力を示す、その核酸の
縮重変異体を含む）の解明および発見に関する。対象と
なる核酸は、マウスおよびヒトOBポリペプチドに対応す
るコード配列を示し、体重および脂肪蓄積の調節に重要
な役割を果たすとされている。本明細書に示されたデー
タは、本発明の核酸のポリペプチド産物は、それを発現
する細胞によって分泌されることを示し、そしてそのポ
リペプチドがホルモンとして機能することを示す。別の
実験データは、OBポリペプチドが、ob遺伝子の変異を有
するマウスの肥満症の治療において非常に有効であるこ
とを示す。さらに、OBポリペプチドの高用量の一回投与
または中程度の継続用量は、正常（野生型）マウスの重
量滅少を起こす。
さらに、本明細書の実施例は、OBポリペプチド（ある
いは本明細書において「レプチン」と呼ばれる）が、マ
ウス、ラットおよびヒト血漿内を循環することを示す。
レプチンはob/obマウス由来の血漿中には存在せず、db/
dbマウス由来の血漿中には10倍高い濃度で存在し、そし
てfa/faラット中には20倍高い濃度で存在した。最も有
意に、組換えレプチンの連日注入は劇的にob/obマウス
の体重を滅少し、野生型マウスの体重に有意に影響し、
そしてdb/dbマウスには影響を及ぼさない。
さらなる局面において、１つの種由来のOBポリペプチ
ドは、別の種においても生物学的に活性である。特に、
ヒトOBポリペプチドは、マウスにおいて活性である。
その主な局面において、本発明は、哺乳動物の体重の
モジュレーターとして機能する物質の同定に関する。詳
細には、本発明は、マウスおよびヒト両者におけるOB遺
伝子およびそのコード領域に対応する特定の核酸ならび
にこれらの核酸によって発現される対応ポリペプチドの
単離、精製、および配列決定に関する。従って、本発明
は、図11A−Ｅ（配列番号１）ならびに図2AおよびＢ
（配列番号３）に記載のヌクレオチド配列を有する核
酸、ならびに縮重変異体、対立遺伝子およびそのフラグ
メントの発見を含み、そのすべては体重および脂肪蓄積
を調製する活性を有する。本核酸のOB遺伝子への対応
は、肥満症ならびに体重の異常が寄与因子となっている
他の疾病および機能不全のような状態に重要な影響を与
えることを予告する。本発明は、本発明の核酸によって
発現されるタンパク質、詳細には図1A−Ｅ（配列番号
２）、図３（配列番号４）、図５（配列番号５）、およ
び図６（配列番号６）ならびに保存された変異体、活性
フラグメント、および同族の小分子にまで拡張する。
前に記載の通り、重量制御モジュレーターペプチド、
またはそれらの結合パートナー、あるいはそれらに対す
る模倣または拮抗あるいはそれらの生産の制御のいずれ
かを示す他のリガンドまたは薬剤は、適切なキャリアと
共に、そして、体重の異常変動または脂肪蓄積（単独、
またはガンまたはAIDSのような有害な医学的状態の一部
として）を患う患者に対する種々の手段による投与に対
して有効な強度で、その治療のために、薬学的組成物中
に調製され得る。種々の投与技術が利用され得、それら
の中には、経口投与、鼻および経粘膜投与の他の形態、
皮下、静脈内注射および腹腔内注射のような非経口技
術、ならびにカテーテル注入などがある。認識因子また
はそれらのサブユニットの平均量は変化し得、とくに資
格を有する医師または獣医の推奨または処方に基づくべ
きである。
上記に従って、体重モジュレーターの活性を模倣また
は拮抗するのに有効な潜在的薬物をスクリーニングする
ためのアッセイシステムを調製し得る。重量モジュレー
ターは、試験システムに導入され得、そして候補薬物も
得られた細胞培養物に導入され得、培養物は細胞の活性
における任意の変化を観察するためにその後に試験さ
れ、それは候補薬物単独の添加、または既知重量モジュ
レーターの添加量の効果による。
上述の通り、本明細書に記載のOB遺伝子の分子クロー
ニングにより、哺乳動物の体重を調整するために分子レ
ベルで機能する物質のクラスの同定が行われた。本発明
のモジュレーターの発見は、栄養疾患の診断および治療
について重要な意味を有し、このような疾患には肥満
症、ガン関連の重量の消失、および高血圧、心臓病、お
よびII型糖尿病のような肥満症に関連する疾患の治療が
含まれるがこれらには限定されない。さらに、家畜の体
重を調整しようとする場合の、その遺伝子産物に対する
潜在的な農業上の用途がある。最後に、本発明の１つま
たはそれ以上のモジュレーターが分泌された分子である
限りは、それらのモジュレーターは、生物学的に使用さ
れ、発現クローニングの技術を用いてそれらのレセプタ
ーを単離し得る。特にOB遺伝子について以下に行われる
考察には、本発明の一部を含有するモジュレーターのク
ラスへの一般的適応性が含まれ、従って解釈の程度およ
び範囲などと一致される。
上記の通り、OBペプチドの機能的活性は、トランスジ
ェニックで評価され得る。この点に関して、トランスジ
ェニックマウスモデルが使用され得る。ob遺伝子は、ト
ランスジェニックマウスを用いる相補試験において使用
され得る。候補遺伝子の野生型位置に対応するウイルス
ベクターまたはコスミドクローン（またはファージクロ
ーン）を含むトランスジェニックベクターは、単離され
たob遺伝子を用いて構築され得る。コスミドは、公表さ
れている手順［Jaenish,Science,240:1468−1474（198
8）］を用いてトランスジェニックマウスに導入され得
る。構築物を、C57BL/6J ob/ob×DBA交雑のF1子孫間の
交雑から誘導された受精卵に導入する。これらの交雑
は、F1動物を作製するためのC57BL/6J ob/ob卵巣移植体
の使用を要する。DBA/2Jマウスは、対比株（counterstr
ain）として使用する。何故なら、このマウスは、卵巣
移植体を用いる際に重要な非アグーティ（nonagouti）
外皮色を有するからである。コスミドトランスジェニッ
クマウス動物のob位置での遺伝子型は、緊密に連鎖した
RFLPまたは変異の側面に位置し、そして先祖株間で多型
であるマイクロサテライトで動物を分類することによっ
て、決定される。相補性は、特定の構築物が遺伝的に肥
満性型のF2動物（RFLP分析により評価されたものとし
て）を痩身型および非糖尿的にする場合に示される。こ
のような環境下では、相補性を決定的に証明するため
に、トランスジーンを有するob/obまたはdb/db動物を、
ob/obまたはdb/db卵巣移植体と交配させる必要がある。
この交配において、トランスジーンを有しないすべての
N2動物は肥満型およびインスリン耐性／糖尿病性になる
が、トランスジーンを有する動物は痩身型となり、そし
て正常なグルコースおよびインスリン血漿中濃度を有す
る。遺伝的意義においては、トランスジーンは抑制変異
として作用する。
あるいは、野生型動物においてアンチセンスの方向で
発現される場合の表現型の効果を調べることによって、
OB遺伝子を試験し得る。このアプローチにおいて、野生
型対立遺伝子の発現は抑制され、変異の表現型が生じ
る。RNA−RNAの二本鎖形成（アンチセンス−センス）
は、mRNAの正常な取り扱いを妨げ、野生型遺伝子の効果
の部分的または完全な消失を引き起こす。この技術を用
いて、組織培養におけるTK合成の阻害ならびにDrosophi
laのKruppel変異およびマウスのShiverer変異の表現型
が生じさせられているIzantら、Cell,36,1007−1015（1
984）;Greenら、Annu.Rev.Biochem.,55:569−597（198
6）;Katsukiら、Science,241:593−595（1988）。この
アプローチの重要な利点は、同種mRNA全体の発現の効果
的な阻害のために、遺伝子の小さい部分の発現しか必要
としないことである。アンチセンストランスジーンを、
それ自身のプロモーターまたは適切な細胞のタイプで発
現される別のプロモーターの制御下に置き、かつSV40の
ポリＡ部位の上流に置く。このトランスジーンを用いて
トランスジェニックマウスを作成する。トランスジェニ
ックマウスはまた、卵巣移植体と接合させて、obヘテロ
接合体が、アンチセンス構築物の効果に対してより感受
性であるかどうかについて試験する。
長期的には、OB遺伝子産物（OBポリペプチドまたはOB
タンパク質）の生化学的機能を解明することが、その活
性に影響する小分子のアゴニストおよびアンタゴニスト
を同定するのに有用である。
本明細書を通して用いられる種々の用語は、例えば以
下の本明細書で設定させる定義を有する。
用語「体重モジュレーター」、「モジュレーター（単
数）」、「モジュレーター（複数）」、および具体的に
列挙されていないいずれの変異体も、本明細書において
相互に入れ換えて用いられ得、そして本出願および請求
の範囲で用いられる通り、一つの例でヌクレオチドおよ
びタンパク質性物質を意味し、後者は単一または多数の
タンパク質を包含する。さらに具体的には、前記用語
は、ヌクレオチドならびに本明細書に記載の配列および
図1A−Ｅ（配列番号１）ならびに図2AおよびＢ（配列番
号３）に示される配列を有するDNAにまで及ぶ。同様
に、本明細書に記載のアミノ酸配列データならびに図1A
〜Ｅ（配列番号２）および図３（配列番号４）に示され
るアミノ酸配列データを有するタンパク質ならびに、本
明細書中および請求の範囲の両方における全ての物質に
ついて記載されている活性のプロフィールも同様に考慮
される。従って、実質的に等価なもしくは変化した活性
を示すヌクレオチドについても同様に考慮され、これは
実質的に相同なアナログおよび対立遺伝子の変異体を包
含する。同様に、実質的に等価なもしくは変化した活性
を示すタンパク質で、例えば部位特異的変異によって意
図的に改変されたタンパク質、またはモジュレーターを
生産する宿主における偶発的な変異によるタンパク質を
包含するタンパク質についても同様に考慮される。
「Ａ」（但し、「Ａ」は、単一のタンパク質、DNA分
子、ベクター、組換え宿主細胞など）を有する組成物に
は、実質的に「Ｂ」（但し、「Ｂ」は、Ａのラセミ体を
除く１つまたはそれ以上の混入タンパク質、DNA分子、
ベクターなどを含む）が存在せず、この場合、組成物に
おいて、重量で少なくとも約75％のタンパク質、DNA、
ベクター（これらは、ＡおよびＢが属する種のカテゴリ
ーに依存する）が、「Ａ」である。好ましくは、「Ａ」
は、組成物においてＡ＋Ｂ種の重量で少なくとも約90％
を含み、最も好ましくは、重量で少なくとも約99％を含
む。また好ましくは、実質的に混入物が存在しない組成
物は、目的の種の活性または特徴を有する単一の分子量
種のみを含有する。
OBポリペプチド 用語「タンパク質」（これは天然に存在するポリペプ
チドを指す）および「ポリペプチド」は、ob遺伝子産物
およびその変異体に関して、本明細書中で交換可能に用
いられる。用語「成熟タンパク質」または「成熟ポリペ
プチド」は特に、シグナル配列（または融合タンパク質
パートナー）が除去されたOB遺伝子産物を指す。
上述したように、特定の実施態様では、本発明のobポ
リペプチドは、本明細書中に記載したアミノ酸配列（例
えば、配列番号２、４、５、６など）を有するポリペプ
チドを包含し、これは保存的アミノ酸置換で改変された
obポリペプチド、ならびにそれらの生物学的に活性なフ
ラグメント、アナログ、および誘導体を包含する。用語
「生物学的に活性」は、ポリペプチドの特定の効果を指
すために本明細書中で用いられ、これは特異的結合（例
えばレセプター、抗体または他の認識分子に対する）；
分子レベルでのシグナル伝達経路の活性化；および／ま
たはインビボで天然obポリペプチドにより仲介される生
理的効果の誘導（またはアンタゴニストによる阻害）を
包含するが、それらに限定されない。OBポリペプチド
（フラグメント、アナログ、および誘導体を包含する）
は、合成により、例えば、固相または液相ペプチド合成
の周知の技術を用いて、調製され得る。好ましくは、固
相合成技術が用いられ得る。あるいは、本発明のOBポリ
ペプチドは、以下に記載されるような周知の遺伝子工学
技術を用いて調製され得る。さらに別の実施態様では、
OBポリペプチドは、例えば免疫アフィニティー精製によ
り、生体液から精製され得る。生体液は、例えば、血
漿、血清、または尿であり、好ましくはヒトの血漿、血
清、または尿であり、そしてより好ましくはポリペプチ
ドを過剰発現している被験者、例えばOBレセプターにお
いて変異を受けている肥満者または「脂肪性」に対応す
る変異に関連した肥満症の肥満者に由来する血漿、血
清、または尿であるが、これらに限定されない。
OBポリペプチドのフラグメント 特定の実施態様では、本発明は、天然に存在するOBポ
リペプチドのフラグメントが重要であり得ることを意図
する。ペプチド配列は、しばしばタンパク質分解切断の
標的となる多くの部位（例えばアルギニン残基）を含
む。完全長ポリペプチドが１つまたはそれより多くの部
位で切断され得て、生物学的に活性なフラグメントを形
成することが可能である。このような生物学的に活性な
フラグメントは、体重を低下させるOBポリペプチドの機
能的活性に対して作動的または拮抗的のいずれかに作用
し得る。
OBポリペプチドのアナログ 本発明は、特定的には、OBペプチドのアナログの調製
を意図する。このアナログは、OBポリペプチドの生物学
的活性を保持し得る、例えばobペプチドの特異的結合パ
ートナー（例えばOBレセプター）に結合し得ることによ
り特徴づけられる。１つの実施態様では、アナログはOB
活性に作動的に作用し、すなわちそれはobペプチドと同
様に機能する。好ましくは、OBアゴニストは天然タンパ
ク質よりもより効果的である。例えば、OBアゴニストア
ナログは、より高い親和性でOBレセプターに結合し得る
か、またはインビボでより長い半減期を示し得るか、ま
たはその両方であり得る。それにも関わらず、天然タン
パク質より有効性が低いOBペプチドアゴニストアナログ
もまた意図される。別の実施態様では、アナログはOB活
性に拮抗的に作用する。例えば、OBレセプターに結合す
るがシグナル伝達を誘導しないOBアナログは、天然OBの
レセプターへの結合を競合的に阻害し得、従ってインビ
ボでOB活性を低下させる。このようなOBアンタゴニスト
アナログはまた、obペプチドと異なる特性を示し得、例
えばインビボでのより長い（または短い）半減期、OBレ
セプターに対するより高い（または低い）結合親和性、
またはその両方を示し得る。
１つの実施態様では、OBペプチドのアナログは、ポリ
ペプチドにおいて構造または機能に必須ではない位置で
のアミノ酸置換により改変されたOBペプチドである。例
えば、ヒトOBペプチドはマウスにおいて生物学的に活性
であるので、マウスアミノ酸配列に比較してヒト配列中
の分岐アミノ酸残基を置換することにより、OBペプチド
の有用なアナログが得られると思われる。例えば、ヒト
の53位または98位、またはその両位置のセリン残基（図
４中に図示されるプロセスされていないペプチド配列）
は、例えばグリシン、アラニン、バリン、システイン、
メチオニン、またはスレオニンと置換され得る。同様
に、92位のアルギニン残基（図４）は、例えば、アスパ
ラギン、リジン、ヒスチジン、グルタミン、グルタミン
酸、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、メチオニ
ン、またはシステインと置換され得る。図４をさらに参
照すると、置換可能であると考えられるヒトOBペプチド
の他のアミノ酸は、118位のヒスチジン、121位のトリプ
トファン、122位のアラニン、126位のグルタミン酸、12
7位のスレオニン、128位のロイシン、132位のグリシ
ン、139位のグリシン、159位のトリプトファン、および
166位のグリシンである。別の実施態様では、121位から
128位（図４中に図示される）のうち１つ以上の残基
を、例えばグリシンまたはアラニンと置換するか、また
は123位のセリンまたは125位のロイシンを除いて一部の
残基を置換することが可能であり得る。
別の実施態様では、OBポリペプチド（好ましくはヒト
OBポリペプチド）のアナログはポリペプチドの短縮型で
ある。例えば、49位のグルタミンは必須ではなく、ペプ
チドから欠失され得ることが既に実証されている。同様
に、121位から128位の分岐アミノ酸残基の一部または全
てを欠失させることが可能であり得る。さらに、本発明
は、生物学的活性に必要な最少アミノ酸配列を有するOB
アナログの提供を意図する。これは、例えば、OBフラグ
メントの活性を、OB特異的抗体に結合する、天然OBポリ
ペプチドの活性を阻害する、または天然OBペプチドの活
性に作動的に作用する能力について試験することによ
り、容易に決定され得る。１つの実施態様では、本発明
は、117位および167位のシステイン残基（図４中に図示
される）間で形成するジスルフィド結合により形成され
たループ構造からなる短縮型OBポリペプチドを提供す
る。別の実施態様では、短縮型アナログは、22位（推定
シグナルペプチド切断部位の後に続く）から53位（限定
タンパク質分解後のOBポリペプチドの質量分析で検出さ
れる可動性ループ領域の直前のアミノ酸残基;Cohenら、
Protein Science,4:1088（1995）を参照のこと）のアミ
ノ酸残基に相当する。別の実施態様では、短縮型アナロ
グは、61位（OBポリペプチドの限定タンパク質分解／質
量分析で検出される可動性ループ領域の直後の残基）か
ら116位（最初のシステイン残基の直前の残基）のアミ
ノ酸に相当する。さらに別の実施態様では、短縮型アナ
ログは、61位から167位のアミノ酸に相当する。
さらに、54位から60位の推定可動性ループの１つ以上
の残基が置換される。例えば、１つ以上の残基が、架橋
結合（例えばポリマーとの）のために、リジン、グルタ
ミン酸、またはシステイン（好ましくはリジン）と置換
され得る。これは、可動性ループ構造はタンパク質の誘
導体化に好ましい部位であるからである。あるいは、可
動性ループ部分の残基が、タンパク質分解に対してより
耐性であるが可動性構造を保持するアミノ酸残基、例え
ば１つ以上のプロリンと置換され得る。さらに別の実施
態様では、さらに誘導体化され得てそれらをより分解
（例えばタンパク質分解）に対し耐性にするアミノ酸残
基での置換が意図される。
上記フラグメントサイズは概算であり、そしてジスル
フィド結合ループアナログにおいてシステイン残基が維
持されねばならないことを除いて、１個から約５個のア
ミノ酸が、ポリペプチドまたはそのフラグメント、列挙
された短縮型アナログの各末端または両末端、あるいは
内部に含められ得るかまたは欠失され得ることが、当業
者により理解される。
マウスOBペプチドは50％のαヘリックス量を含有し、
そしてヒトOBポリペプチドは約60％のαヘリックス量を
含有することが判明している。これらは、生理的条件に
近い条件下における組換えペプチドの円偏光二色性によ
り検出される。従って、別の実施態様では、アミノ酸残
基が他の残基と置換され得て、OBポリペプチドのアナロ
グを形成し、このアナログは、より安定したαヘリック
ス構造を形成する傾向の増加を示すかまたは形成する。
例えば、Glu、Ala、Leu、His、Trpが、天然OBポリペプ
チド中で見出されるアミノ酸残基に対する置換基として
導入される場合、αヘリックス構造をとりやすい。好ま
しくは、保存的アミノ酸置換が用いられ、例えば、29
位、30位、44位、61位、76位、100位、および／または1
06位のアスパラギン酸（図４中に図示される）のグルタ
ミン酸（Glu）での置換；イソロイシンのロイシンでの
置換；グリシンまたはバリンあるいは任意の分岐アミノ
酸のアラニンでの置換（例えばヒトOBポリペプチドの53
位のセリンのアラニンでの置換）；アルギニンまたはリ
ジンのヒスチジンでの置換；およびチロシンおよび／ま
たはフェニルアラニンのトリプトファンでの置換が挙げ
られる。αヘリックス構造の程度、またはより重要なこ
とに、αヘリックス構造の安定性を高めると、より高い
活性、増大された結合親和性、またはより長い半減期を
有するOBアナログが得られ得る。特定の実施態様では、
22位から53位のアミノ酸残基に相当するOBペプチド部分
のヘリックス形成能力が増大される。別の実施態様で
は、61位から116位のアミノ酸残基のヘリックス形成能
力または安定性が増大される。さらに別の実施態様で
は、117位から167位のアミノ酸に相当するジスルフィド
ループ構造のヘリックス形成能力が増大される。また、
上記ドメインの１つより多くにおいて増大されたαヘリ
ックス能力または安定性を含有するOBアナログが意図さ
れる。さらなる実施態様では、短縮型OBポリペプチドア
ナログは、構造形成性（例えばヘリックス形成性）アミ
ノ酸残基を取り込んで、ポリペプチドフラグメントが安
定構造を欠如する傾向がより高いことを補うように生成
される。
フラグメントのようなアナログは、例えば、体重モジ
ュレーターペプチド物質のペプシン消化により生成され
得る。ムテイン（mutein）のような他のアナログは、体
重モジュレーターペプチドコード配列の標準的な部位特
異的変異誘発により生成され得る。プロモーターまたは
インヒビターのいずれとして機能するにせよ、小分子な
どのような「体重モジュレーター活性」を示すアナログ
は、公知のインビボアッセイおよび／またはインビトロ
アッセイにより同定され得る。
OBポリペプチドの小分子アナログおよびペプチド模擬体
（peptidomimetics） obポリペプチド（好ましくはヒトOBポリペプチド）の
構造は、当該分野で公知の種々の方法により分析され得
る。タンパク質配列は親水性分析［例えば、Hoppら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,78:3824（1981）］により特徴づ
けられ得る。親水性プロフィルは、OBポリペプチドの疎
水性領域および親水性領域を同定するのに用いられ得、
フォールディングされたポリペプチドの内部に埋まって
いる領域、およびポリペプチドの外部で接近可能な領域
を示し得る。さらに、二次構造分析［例えば、Chouら、
Biochem.,13:222（1974）］もまた行われ得、特定の二
次構造をとるOBポリペプチドの領域を同定し得る。二次
構造推定を包含する構造の推定または決定の操作は、当
該分野で入手可能なコンピューターソフトウェアプログ
ラムを用いて行われ得る。
組換えOBポリペプチドの豊富な供給源を提供すること
により、本発明は、ポリペプチドの定量的構造決定を可
能にする。特に、核磁気共鳴（NMR）、赤外（IR）、ラ
マン、および紫外（UV）、特に円偏光二色性（CD）分光
分析のために、十分な材料が提供される。特に、NMR
は、溶液中分子の非常に強力な構造分析を提供し、分子
の天然の環境により正確に近づく［Marionら,Biochim.B
iophys.Res.Comm.113:967−974（1983）;Barら,J.Magn.
Reson.,65:355−360（1985）;Kimuraら,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,77:1681−1685（1980）］。他の構造分析方
法もまた用いられ得る。これらは、Ｘ線結晶構造解析
［Engstom、Biochem.Exp.Biol.,11:7−13（1974）］を
包含するが、これに限定されない。
さらに別の実施態様では、OBポリペプチドのアナログ
が、天然OBポリペプチドまたはそれらの特定のフラグメ
ントに対して特異的な抗体と交差反応するか否かを決定
するために試験され得る。交差反応度は、タンパク質の
構造相同性または類似性、あるいはフラグメント特異的
抗体を生成するために用いられるポリペプチド部分に相
当する領域の接近可能性についての情報を提供する。
OBアナログのスクリーニング ポリペプチドのアナログをスクリーニングするため
に、種々のスクリーニング技術が当該分野で知られてい
る。化学物質の種々のライブラリーが利用可能である。
従って、本発明は、このようなライブラリー（例えば、
何年もの研究で生成された合成化合物のライブラリー、
天然化合物のライブラリー、および組合せのライブラリ
ー、以下でより詳細に記載する）を、OBポリペプチドの
アナログについてスクリーニングすることを意図する。
１つの実施態様では、本発明は、このようなライブラリ
ーを抗OBポリペプチド抗体、好ましくは抗ヒトobポリペ
プチド抗体に結合する化合物についてスクリーニングす
ることを意図する。別の局面では、一旦OBレセプターが
同定されれば（以下を参照のこと）、当該分野で公知の
任意のスクリーニング技術がOBレセプターアゴニストま
たはアンタゴニストについてスクリーニングするために
用いられ得る。本発明は、小分子リガンドまたはリガン
ドアナログおよび模倣物についてのスクリーニング、な
らびにインビボでOBレセプターに結合し、そしてその活
性化に作動的または拮抗的に作用する天然リガンドにつ
いてのスクリーニングを意図する。
レセプターの一次配列およびその配列と機能が公知で
あるタンパク質との類似性を認識することにより、タン
パク質のアゴニストまたはアンタゴニストに関する端緒
が提供され得る。アンタゴニストの同定およびスクリー
ニングは、タンパク質の構造特徴を、例えば、Ｘ線結晶
構造解析、中性子回折、核磁気共鳴分光法、および構造
決定のための他の技術を用いて決定することにより、さ
らに容易になる。これらの技術は、アゴニストおよびア
ンタゴニストの合理的な設計または同定を提供する。
別のアプローチは、大きなライブラリーを生成するた
めに組換えバクテリオファージを用いる。「ファージ
法」［Scottら,Science,249:386−390（1990）;Cwirla
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378−6382（1990）;De
vlinら,Science,249:404−406（1990）］を用いて、非
常に大きなライブラリーが構築され得る（106〜108化学
的実在（chemical entities））。第２の方法は、主に
化学的方法を用いる。この方法としては、Geysen法［Ge
ysenら,Molecular Immunology,23:709−715（1986）;Ge
ysenら,J.Immunologic Method,102:259−274（1987）］
およびFodorら、Science,251:767−773（1991）による
最新法が挙げられる。Furkaら14th International Cong
ress of Biochemistry,Volume 5,Abstract FR:013（198
8）;Furka,Int.J.Peptide Protein Res.,37:487−493
（1991）］;Houghton（米国特許第4,631,211号、1986年
12月発行）；およびRutterら（米国特許第5,010,175
号、1991年４月23日発行）は、アゴニストまたはアンタ
ゴニストとして試験され得るペプチドの混合物を生成す
る方法を記載している。
別の局面では、合成ライブラリー［Needelsら,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,90:10700−10704（1993）;Lamら，国
際特許公開第WO92/00252号、それぞれその全体が本明細
書中に参考として援用されている］などが、本発明のOB
レセプターリガンドについてスクリーニングするために
用いられ得る。このようなライブラリーを用いれば、レ
セプターアンタゴニストは、実際にOBレセプターをクロ
ーニングしなくても、レセプターを発現する細胞を用い
て検出され得る。
あるいは、組換え型のOBレセプターリガンド結合ドメ
インを発現する細胞への可溶性リガンドの結合について
のアッセイが行われ得る。この可溶性リガンドは、組換
えまたは合成OBポリペプチドとして容易に提供され得
る。
スクリーニングは、OBレセプターを発現する組換え細
胞を用いて、あるいは精製レセプタータンパク質（例え
ば、組換えにより生成された）を用いて、上述のように
行われ得る。例えば、分子のリガンド結合部分を含む標
識した可溶性または可溶化OBレセプターがリガンドに結
合する能力が、上述の参照において記載されるように、
ライブラリーのスクリーニングのために用いられ得る。
OBポリペプチドの誘導体 一般に、本発明のタンパク質（ここで用語「タンパク
質」は、他に指示されなければ「ポリペプチド」を包含
するように用いられる）は、タンパク質部分への１つ以
上の化学部分の結合により誘導体化され得る。化学修飾
誘導体は、さらに動脈内、腹腔内、筋内、皮下、静脈
内、経口、鼻内、直腸、経頬粘膜（bucal）、舌下、
肺、局所、経皮、または他の投与経路についてさらに処
方され得る。生物学的に活性なタンパク質の化学修飾
は、特定の環境下で付加的な利点を提供することが見出
されている。この利点としては、例えば、治療タンパク
質の安定性および循環時間の増大および免疫原性の低下
が挙げられる。例えば、米国特許第4,179,337号、Davis
ら、1979年12月18日発行を参照のこと。概説について
は、Abuchowskiら、「可溶性ポリマー−酵素付加物」、
Enzyme as Drugs,367〜383頁、HolcenbergおよびRobert
s編、Wiler−Interscience,New York,NY,（1981）を参
照のこと。タンパク質修飾および融合タンパク質につい
て記載の概説的文献は、Francis、Focus on Growth Fac
tors,3:4−10（1992）である。
誘導体化のための化学部分 誘導体化に適切な化学部分は、水溶性ポリマーの中か
ら選択され得る。選択されるポリマーは、それに結合さ
れるタンパク質が生理的環境のような水性環境で沈澱し
ないように、水溶性でなければならない。好ましくは、
最終産物調製物の治療的使用のために、ポリマーは薬学
的に受容可能である。当業者は、ポリマー／タンパク質
複合体が治療的に用いられるかどうかというような考
慮、そしてもし用いられる場合、所望の投与量、循環時
間、タンパク質分解に対する耐性、および他の考慮条件
に基づいて、所望のポリマーを選択し得る。本発明のタ
ンパク質およびペプチドについて、これらは本明細書中
に提供されるアッセイを用いて確かめられ得る。
ポリマー分子 水溶性ポリマーは、例えばポリエチレングリコール、
エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマ
ー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ
ビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3
−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレ
ン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポ
リマーまたはランダムコポリマーのいずれか）およびデ
キストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエ
チレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリ
マー、ポリプリピレンオキシド／エチレンオキシドコポ
リマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビ
ニルアルコールからなる群から選択され得る。ポリエチ
レングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での
安定性のために製造に利点を提供し得る。
ポリマーは、任意の分子量であり得、そして分枝また
は非分枝であり得る。ポリエチレングリコールについ
て、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造に容易であ
るためには約2kDaと約100kDaとの間である（用語「約」
はポリエチレングリコールの調製において、いくらかの
分子の分子量が記された分子量よりも高く、いくらかは
低いことを示す）。他のサイズは、所望の治療プロフィ
ル（例えば所望の徐放期間、（もしあれば生物学的活性
に対する）効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度また
は欠如、および治療タンパク質またはアナログに対する
ポリエチレングリコールの他の既知の効果依存して用い
られ得る。
ポリマー／タンパク質比 そのように結合されるポリマー分子数は変化し得、そ
して当業者は機能に対するその効果を確かめ得る。モノ
誘導体化され得るか、または同一のまたは異なる化学部
分（例えば、ポリマー（例えば異なる分子量のポリエチ
レングリコール））とジ誘導体化、トリ誘導体化、テト
ラ誘導体化、または誘導体化の組合せが提供され得る。
タンパク質（またはペプチド）分子に対するポリマー分
子の割合は、反応混合物におけるそれらの濃度の変化に
つれて変化する。一般に、最適比（過剰な非反応タンパ
ク質またはポリマーが存在しない反応効率に関する）
は、所望の誘導体化程度（例えば、モノ、ジ、トリな
ど）、選択されるポリマーの分子量、ポリマーが分枝で
あるか非分枝であるか、および反応条件のような因子に
より決定される。
タンパク質への化学部分の結合 ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）
は、タンパク質の機能性または抗原性ドメインにおける
効果を考慮してタンパク質に結合されるべきである。当
業者に利用可能な多くの結合方法がある（例えば、本明
細書中に参考として援用されるEP 0 401 384（PEGのＧ
−CSFへのカップリング））。Malikら、Exp.Hematol.,2
0:1028−1035（1992）（塩化トレシルを用いるGM−CSF
のPEG化を報告）もまた参照のこと。例えば、ポリエチ
レングリコールは、反応基（例えば遊離アミノまたはカ
ルボキシル基）を介してアミノ酸残基に共有結合され得
る。反応基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結
合され得る基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残
基は、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含み、遊
離カルボキシル基を有するアミノ酸残基は、アスパラギ
ン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残
基を含む。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリ
コール分子を結合させるための反応基として用いられ得
る。治療目的のために好ましいのは、アミノ基での結
合、例えば、Ｎ末端はまたはリジン基での結合である。
レセプター結合に重要な残基での結合は、レセプター結
合が所望である場合避けられるべきである。
Ｎ末端化学修飾タンパク質 特にＮ末端化学修飾タンパク質を所望し得る。本発明
の組成物の例示としてポリエチレングリコールを用いる
場合、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分
枝などでの）、反応混合物中におけるタンパク質（また
はペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子
の割合、実施されるPEG化反応のタイプ、および選択さ
れたＮ末端PEG化タンパク質を得る方法から選択され得
る。Ｎ末端PEG化調製物を得る（すなわち、必要であれ
ば他のモノPEG化部分からこの部分を分離する）方法
は、PEG化タンパク質分子の集団からＮ末端PEG化物質を
精製することにより行われ得る。選択的Ｎ末端化学修飾
は、還元アルキル化により行われ得、特定のタンパク質
における誘導体化に利用可能な異なるタイプのもとのア
ミノ基（Ｎ末端に対してリジン）の異なる反応性を用い
る。適切な反応条件下で、ポリマーを含むカルボニル基
によるＮ末端でのタンパク質の実施的に選択的な誘導体
化が達成される。例えば、タンパク質のリジン残基のε
アミノ基とＮ末端残基のαアミノ基との間のpKa差を利
用し得るpHで反応を行うことにより、タンパク質を選択
的にＮ末端でPEG化し得る。このような選択的誘導体化
により、水溶性ポリマーのタンパク質への結合が制御さ
れる：ポリマーとの複合体化は、タンパク質のＮ末端で
優勢的に生じ、そして他の反応基（例えばリジン側鎖ア
ミノ基）の有意な修飾は生じない。還元アルキル化を用
いる場合、水溶性ポリマーは上記のタイプであり得、そ
してタンパク質にカップリングするため１つの反応性ア
ルデヒドを有するべきである。ポリエチレングリコール
プロピオンアルデヒド（１つの反応性アルデヒドを含
む）は用いられ得る。
OBポリペプチドに関連する核酸 上記のように、本発明はobポリペプチドをコードする
核酸、およびOB遺伝子関連ゲノムの5'、3'、およびイン
トロンの非コード配列に関する。それゆえ本発明に従っ
て、当該分野の技術範囲において従来の分子生物学、微
生物学、および組換えDNA技術が使用され得る。このよ
うな技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Sa
mbrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、
第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold S
pring Harbor, New York（1989）;Glover編、DNA Cloni
ng:A Practical Approach、第Ｉ巻および第II巻、MRL P
ress, Ltd.,Oxford,U.K.（1985）;Gait編、Oligonucleo
tide Synthesis、Oxford University Press（1984）;Ha
mesら編、Nucleic Acid Hybridization、Springer−Ver
lag（1985）;Hamesら編、Transcription And Translati
on、Oxford University Press（1984）;Freshney編、An
imal Cell Culture、Oxford University Press（198
6）;Immobilized Cells And Enzymes、IRL Press（198
6）;Perbal、A Practical Guide To Molecular Clonin
g、Wiley,New York（1984）を参照のこと。本発明に特
に関連するのは、遺伝子または核酸の、周知のポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）技術に基づいた単離、クローニン
グ、配列決定、解析、および特徴付けのストラテジーで
ある。
「レプリコン」は、インビボにおけるDNA複製の自律
的なユニットとして機能する、すなわちそれ自身の制御
のもとに複製し得る任意の遺伝的要素（例えば、プラス
ミド、染色体、ウイルス）である。
「ベクター」は、プラスミド、ファージ、またはコス
ミドのような、他のDNAセグメントを結合して、結合さ
れたセグメントの複製をもたらし得るレプリコンであ
る。
「カセット」は、特定の制限部位でベクターに挿入し
得るDNAのセグメントを意味する。DNAのセグメントは目
的のポリペプチドをコードし、そしてカセットおよび制
限部位は、転写および翻訳のための適切な読みとり枠
（reading frame）でのカセットの挿入を確実にするよ
うに設計される。
「異種」DNAは、細胞内または細胞の染色体部位に天
然には位置しないDNAを意味する。好ましくは、異種DNA
は細胞にとって外来の遺伝子を包含する。
細胞は外因性または異種DNAによりこのようなDNAが細
胞内に導入されるとき、「トランスフェクト」される。
トランスフェクトされたDNAが表現型の変化をもたらす
とき、細胞は外因性または異種DNAにより「トランスフ
ォーム」される。好ましくはトランスフォームDNAは染
色体DNAに組み込まれて（共有結合で結合されて）細胞
のゲノムを構成するべきである。
「クローン」は単一の細胞または有糸分裂による共通
の祖先に由来する細胞の集団である。
「核酸分子」は一本鎖型または日本鎖ヘリックスにお
けるリン酸エステル重合形態のリボヌクレオシド（アデ
ノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン；「RN
A分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシ
アデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、
またはデオキシシチジン；「DNA分子」）を意味する。
二本鎖のDNA−DNA、DNA−RNA、およびRNA−RNAヘリック
スが可能である。核酸分子という用語（詳細にはDNAま
たはRNA分子）は、分子の１次および２次構造のみを意
味し、そしていずれの特定の３次または４次形態に限定
しない。それゆえ、この用語はとりわけ直鎖または環状
のDNA分子（例えば、制限フラグメント）、プラスミ
ド、および染色体に見出される二本鎖DNAを包含する。
特定の二本鎖DNA分子の構造について記載する場合、配
列は本明細書中で、DNAの非転写ストランド（すなわちm
RNAに相同な配列を有するストランド）に沿って5'から
3'の方向の配列のみを示す通常の慣例にしたがって記載
され得る。「組換えDNA分子」は分子生物学的操作を経
たDNA分子である。
核酸分子は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAのような他
の核酸分子と、核酸分子の一本鎖形態が他の核酸分子と
適切な温度および溶液イオン強度の条件下でアニールし
得るときに「ハイブリダイズし得る」（Sambrookら、
（1989）上記を参照のこと）。温度およびイオン強度の
条件はハイブリダイゼーションの「厳密性（stringenc
y）」を決定する。相同な核酸のための予備スクリーニ
ングには、低い厳密性のハイブリダイゼーション条件
（55℃のTmに相当）が使用され得る（例えば、５×SS
C、0.1％SDS、0.25％ミルク、およびホルムアミドな
し；または30％ホルムアミド、５×SSC、0.5％SDS）。
中程度の厳密性のハイブリダイゼーション条件はより高
いTm値に相当する（例えば、40％ホルムアミド、５×ま
たは６×SSC）。高い厳密性のハイブリダイゼーション
条件は、最も高いTm値に相当する（例えば、50％ホルム
アミド、５×または６×SSC）。ハイブリダイゼーショ
ンには相補的な配列を含有する２種の核酸が必要である
が、ハイブリダイゼーションの厳密性に依存して塩基間
のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズする
ための適切な厳密性は、核酸の長さおよび相補性の程度
に依存し、当該分野に周知の程度で変化をする。２種の
ヌクレオチド配列の類似性または相同性が大きければ大
きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッド形
成のためのTm値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーシ
ョンの相対的安定性（より高いTmに相当する）は以下の
順序で減少する:RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。長さが10
0ヌクレオチドを超えるハイブリッド形成にはTm算出の
ための方程式が導かれている（Sambrookら、（1989）上
記、9.50−0.51を参照のこと）。より短い核酸、すなわ
ちオリゴヌクレオチド、とのハイブリダイゼーションに
はミスマッチの位置がより重要となり、そしてオリゴヌ
クレオチドの長さはその特異性を決定する（Sambrook
ら、（1989）上記、11.7−11.8を参照のこと）。好まし
くは、ハイブリダイズし得る核酸の最小の長さは少なく
とも約10ヌクレオチドである；より好ましくは、少なく
とも約15ヌクレオチドである；最も好ましくは、長さが
少なくとも約20ヌクレオチドである。
「相同的組換え」はベクター中の外来DNAの染色体内
への挿入を意味する。好ましくは、ベクターは特異的な
染色体の部位を相同的組換えの標的とする。特異的な相
同的組換えのために、ベクターは染色体の配列に相同な
十分に長い領域を含むことで、相補的結合およびベクタ
ーの染色体への取り込みを実現させる。相同性の領域が
より長く、そして配列類似性の程度がより大きいと、相
同的組換えの効率が増加し得る。
DNA「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置
かれたときにインビトロまたはインビボにおいて細胞内
でポリペプチドに転写および翻訳される二本鎖のDNA配
列である。コード配列の境界は5'（アミノ）末端の開始
コドンおよび3'（カルボキシル）末端の翻訳終止コドン
によって決定される。コード配列は原核生物の配列、真
核生物のmRNA由来のcDNA、真核（例えば、哺乳類）DNA
由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列をも、包含し
得るがこれらに限定されない。コード配列が真核細胞内
での発現を意図される場合は、ポリアデニル化シグナル
および転写終結配列がコード配列の3'側に通常位置され
る。
OBコード配列およびフランキング配列の単離 本発明により意図される核酸は、記載の通り、本明細
書の図1A〜Ｄ（配列番号２）、図３（配列番号４）、図
５（配列番号５）、および図６（配列番号６）に示すよ
うなペプチドの発現をコードする他の核酸まで及ぶ。し
たがって、ob遺伝子に関連して特異的なDNAが単離およ
び配列決定される一方、いずれの動物細胞も潜在的に本
発明のペプチドをコードする遺伝子の分子クローニング
の核酸供給源として利用し得る。DNAはクローン化DNA
（例えば、「DNAライブラリー」）から、化学合成によ
り、cDNAクローニングにより、もしくは所望の細胞より
精製したゲノムDNA、またはそのフラグメントのクロー
ニングにより得られ得る（例えば、Sambrookら、（198
9）、上記;Glover、（1985）、上記を参照のこと）。ゲ
ノムDNA由来のクローンは調節およびイントロンのDNA領
域、さらにコード領域を含有し得る;cDNA由来のクロー
ンはイントロンの配列を含有しない。供給源が何であ
れ、遺伝子は、その遺伝子の増幅のために適切なベクタ
ーに分子的にクローン化される。
ゲノムDNA由来の遺伝子の分子クローニングでは、ゲ
ノムDNAはcDNA配列から選択されたプライマーを使用し
て増幅され得る。あるいは、DNAフラグメントが作成さ
れ、そのいくつかが所望の遺伝子をコードする。DNAは
特異的な部位で種々の制限酵素を使用して切断され得
る。DNAをフラグメント化するためにDNアーゼをマンガ
ン存在下で使用し得、またはDNAは、例えば超音波処理
によって物理的に剪断され得る。直鎖DNAフラグメント
はサイズに従って標準的な技術により分離され得るこの
ような標準的な技術として、アガロースならびにポリア
クリルアミドゲル電気泳動、およびカラムクロマトグラ
フィーが挙げられるがそれらに限定されない。
いったんDNAフラグメントが作成されると、所望のob
またはob様遺伝子を含有する特異的なDNAフラグメント
の同定は多くの方法によって達成され得る。例えば、一
定量のobまたはob様遺伝子の部分またはその特異的RN
A、あるいはそのフラグメントを入手し得て精製および
標識し得る場合は、生じたDNAフラグメントは標識プロ
ーブに対する核酸ハイブリダイゼーションによりスクリ
ーニングされ得る（Bentonら、Science,196:180（197
7）;Grunsteinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72:3961（1
975））。本発明は、このような核酸プローブを提供
し、これは本明細書中で開示される特異的な配列から容
易に調製され得る。例えば、図1A〜Ｅ（配列番号１）ま
たは図2AおよびＢ（配列番号３）に記載される配列の少
なくとも10、好ましくは15ヌクレオチドフラグメントに
相当するヌクレオチド配列を有するハイブリダイズし得
るプローブがある。好ましくは、フラグメントは本発明
のモジュレーターペプチドに高度に特有であるように選
択される。プローブに対して実質的に相同であるDNAフ
ラグメントがハイブリダイズする。上記のように、相同
性の程度が大きければ大きいほど、より厳密なハイブリ
ダイゼーション条件が使用され得る。１つの実施態様に
おいて、低い厳密性のハイブリダイゼーション条件が相
同性のモジュレーターペプチドを同定するために使用さ
れる。しかし、好ましい局面において、および本明細書
中で実験的に示されるように、本発明のモジュレーター
ペプチドをコードする核酸は、図1A〜Ｅ（配列番号１）
または図2AおよびＢ（配列番号３）に記載されるような
ヌクレオチド配列を有する核酸、または中程度に厳密な
条件でハイブリダイズし得るそのフラグメントにハイブ
リダイズする；より好ましくは、核酸は高い厳密性の条
件でハイブリダイズする。
あるいは、遺伝子の存在は、それが発現される生産物
の物理的、化学的、または免疫学的特性に基づいたアッ
セイにより検出され得る。例えば、cDNAクローン、また
は適切なmRNAをハイブリッドで選択する（hybrid−sele
ct）DNAクローンが選択され得、本発明のモジュレータ
ーペプチドについて既知の特性と類似または同一の、電
気泳動の移動度、等電点電気泳動上の挙動、プロテアー
ゼ切断マップ、チロシンホスファターゼ活性、または抗
原特性を有するタンパク質を生産する。例えば、本発明
の抗体は他の供給源に由来するモジュレーターペプチド
のホモログのスクリーニングに容易に利用され得る。
本発明のモジュレーターペプチドをコードする遺伝子
はまた、mRNA選択、すなわち核酸ハイブリダイゼーショ
ンおよびそれに続くインビトロトランスレーション、に
より同定され得る。この手順において、フラグメント
は、相補的mRNAをハイブリダイゼーションによって単離
するために使用される。そのようなDNAフラグメントは
入手可能な精製されたモジュレーターのDNAを示し得
る。単離されたmRNAの生産物のインビトロトランスレー
ション生産物の、免疫沈降分析または機能的アッセイ
（例えば、チロシンホスファターゼ活性）によりmRNAが
同定され、それゆえ所望の配列を含有する相補的DNAフ
ラグメントが、同定される。さらに、特異的なmRNAは、
細胞から単離されたポリソームの、モジュレーターペプ
チドに対して特異的な固定化抗体への吸着により選択さ
れ得る。
放射性標識されたモジュレーターペプチドcDNAは、
（吸着されたポリソームから）選択されたmRNAを鋳型と
して使用して合成され得る。次に放射性標識されたmRNA
またはcDNAは他のゲノムDNAフラグメントの中から相同
なモジュレーターペプチドDNAフラグメントを同定する
ためのプローブとして使用され得る。
上記のように、本明細書中で開示される体重モジュレ
ーターペプチドをコードするDNA配列は、クローン化に
よらず合成で調製され得る。DNA配列は、体重モジュレ
ーターペプチドのアミノ酸配列に適切なコドンをもって
設計され得る。一般に配列を発現に使用する場合は、意
図する宿主にとって好ましいコドンを選択する。標準的
な方法で調製し、そして完全なコード配列に組み合わせ
た重複するオリゴヌクレオチドから、完全な配列を組み
立てる。例えば、Edge,Nature,292:756（1981）;Nambai
rら、Science,223:1299（1984）;Jayら、J.Biol.Chem.,
259:6311（1984）を参照のこと。
上記のように、合成DNA配列は体重モジュレーターの
アナログを発現する遺伝子の簡便な構築を可能にする。
あるいは、アナログをコードするDNAは天然のOB遺伝子
またはcDNAの部位特異的突然変異によって作製され得、
そしてアナログは従来のポリペプチド合成を使用して直
接作製され得る。
非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的組み込み
のための一般的な方法はNorenら、Science,244:182−18
8（1989）に記載されている。本方法は非天然アミノ酸
をもつobポリペプチドのアナログの作製に使用され得
る。
非コード核酸 本発明は、アンチセンスヌクレオチドおよびリボザイ
ムの調製にまで及び、本発明を用いて体重モジュレータ
ータンパク質の発現を翻訳レベルで妨げ得る。本アプロ
ーチでは、アンチセンス核酸およびリボザイムを利用し
て、特異的なmRNAの翻訳をブロックするが、これは、mR
NAをアンチセンス核酸でマスクするかあるいはリボザイ
ムで切断することによる。
アンチセンス核酸は、特異的なmRNA分子の少なくとも
一部に相補的なDNAまたはRNA分子である（Weintraub,Sc
i.Am.,262:40−46（1990）;Marcus−Sekura,Anal.Bioch
em.,172:289−295（1988）を参照のこと）。細胞内にお
いてアンチセンス核酸はmRNAにハイブリダイズして二本
鎖分子を形成する。細胞はこの二本鎖の形態に複合体化
されたmRNAを翻訳しない。それゆえ、アンチセンス核酸
はmRNAのタンパク質への発現を妨げる。約15ヌクレオチ
ドのオリゴマーおよびAUG開始コドンにハイブリダイズ
する分子は特に効率的である。なぜならそれらは合成が
容易であり、そして体重モジュレーターペプチド産生細
胞に導入する際に生じる問題が、より大きな分子の場合
よりも少ないと思われるからである。アンチセンス法は
多くの遺伝子のインビトロにおける発現を阻害するため
に使用されている（Marcus−Sekura、（1988）、上記;H
amborら、J.Exp.Med.,168:1237−1245（1988））。
リボザイムは、他の一本鎖RNA分子をDNA制限エンドヌ
クレアーゼにいくぶん類似する様式で特異的に切断する
能力を有するRNA分子である。リボザイムは、ある種のm
RNAがそれ自身のイントロンを削除する能力を有すると
いう観察から発見された。これらのRNAのヌクレオチド
配列を改変することにより、研究者らはRNA分子におけ
る特異的なヌクレオチド配列を認識し、そして切断する
分子を設計し得る（Cech,J.Am.Med.Assoc.,260:3030−3
034（1988））。これらのリボザイムは配列特異的であ
るので、特定の配列を有するmRNAのみが不活化される。
研究者らは２タイプのリボザイム、Tetrahymenaタイ
プおよび「ハンマーヘッド」タイプ、を同定した。Tetr
ahymenaタイプリボザイムは４塩基配列を認識し、「ハ
ンマーヘッド」タイプは11〜18塩基配列を認識する。認
識配列が長ければ長いほど、標的mRNA種により限定され
て起こり得る。それゆえ、ハンマーヘッドタイプリボザ
イムはTetrahymenaタイプリボザイムよりも特異的なRNA
種の不活化において好ましく、そして18塩基認識配列は
より短い認識配列よりも好ましい。
それゆえ、本明細書中に記載のDNA配列は、体重モジ
ュレータータンパク質およびそのリガンドのmRNAに対す
るアンチセンス分子およびmRNAを切断するリボザイムの
調製に使用され得、それゆえob遺伝子の発現を阻害し、
そして体重増加および肥満に導く。
他の実施態様において、OB核酸のコード鎖および相補
鎖、またはOB遺伝子の5'、3'、あるいはコード領域の内
部の（イントロンの）非コード領域に相補的な短いオリ
ゴヌクレオチドが本発明により提供される。そのような
核酸は直接標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、ま
たはポリメラーゼ連鎖反応のプライマーのいずれかとし
てプローブに有用であり、ob遺伝子内の突然変異の存
在、またはOB mRNAの発現レベルの評価を目的とする。
好ましくは、本発明の非コード核酸はヒトOB遺伝子由来
である。
特定の実施態様において、非コード核酸は、増幅し得
る遺伝子および／または他の調節配列をOB遺伝子の付近
に組み込ませるための相同的組換えを目的とし、例えば
OBポリペプチドの高レベルの発現、またはOBポリペプチ
ドの適切な発現レベルを妨げるob遺伝子調節配列におけ
る変異の克服を目的とする（国際特許公報第WO 91/0666
6号、1991年５月16日Skoultchiにより公開、；国際特許
公報第WO 91/09955号、1991年７月11日Chappelにより公
開、；また国際特許公報第WO 90/14092号、1990年11月2
9日KucherlapatiおよびCampbellにより公開、を参照の
こと）。
OBポリペプチドの生産：発現および合成 転写および翻訳制御配列はプロモーター、エンハンサ
ー、ターミネーターなどのようなDNA調節配列であり、
宿主細胞におけるコード配列の発現を目的とする。真核
細胞においては、ポリアデニル化シグナルは制御配列で
ある。
RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、次い
でこのmRNAがトランスRNAスプライシングを受け、そし
てコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳さ
れるとき、コード配列は細胞内において転写および翻訳
制御配列の「制御下」にある。
「シグナル配列」は細胞の表面に発現されるタンパク
質のコード配列の始めに含まれる。この配列は成熟ポリ
ペプチドのＮ−末端側にあるシグナルペプチドをコード
し、ポリペプチドの輸送を宿主細胞に指示する。用語
「輸送シグナル配列」もまた本明細書中に用いられ、こ
の種類のシグナル配列を意味する。輸送シグナル配列は
各種の真核生物および原核生物由来のタンパク質に関し
て見出され得、しばしば両方のタイプの生物において機
能的である。
DNA配列は発現制御配列に、発現制御配列がDNA配列の
転写および翻訳を制御および調節するとき、「作動可能
に連結される」。用語「作動可能に連結される」とは、
発現されるDNA配列の前に適切な開始シグナル（例え
ば、ATG）を有すること、および発現制御配列の制御下
でのDNA配列の発現およびDNA配列にコードされる所望の
生産物の生産をもたらすために正しい読みとり枠を維持
することを包含する。組換えDNA分子に挿入しようとす
る遺伝子が適切な開始シグナルを含有しない場合は、こ
のような開始シグナルがその遺伝子の上流（5'）および
その遺伝子を有する読みとり枠内に挿入され得る。
「プロモーター配列」は細胞内でRNAポリメラーゼと
結合して下流（3'方向）のコード配列の転写を開始させ
得るDNA調節領域である。本発明を明確にする目的のた
めには、プロモーター配列はその3'末端で転写開始部位
により境界付けられ、そしてバックグラウンド以上の検
出し得るレベルの転写を開始するために必要な最小数の
塩基または要素を含有するように上流（5'方向）に延長
する。プロモーター配列の内部には、転写開始部位（例
えばS1ヌクレアーゼによるマッピングにより容易に定義
される）、およびRNAポリメラーゼの結合するタンパク
質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。
本発明の別の特徴は、本明細書中で開示されるDNA配
列の発現である。当該分野において公知なように、DNA
配列はそれを適切な発現ベクター内の発現制御配列に作
動可能に連結し、そして発現ベクターを適切な単細胞宿
主にトランスフォームするために使用することによって
発現し得る。
そのような発現制御配列への本発明のDNA配列の作動
可能な連結は、当然、必ずしもDNA配列の一部でない場
合でも、開始コドンであるATGの、DNA配列上流の正しい
読みとり枠への提供を包含する。
多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせが、本発
明のDNA配列の発現に使用され得る。有用な発現ベクタ
ーは、例えば、染色体、非染色体、および合成DNA配列
のセグメントからなり得る。適切なベクターは、SV40の
誘導体および公知の細菌プラスミド、例えば、大腸菌プ
ラスミドcolE1、pCR1、pBR322、pMB9、pUC、またはpUC
プラスミド誘導体、例えば、pGEXベクター、pETベクタ
ー、pmal−ｃ、pFLAGなど、およびそれらの誘導体、RP4
のようなプラスミド；ファージDNA、例えば、多数のλ
ファージの誘導体、例えば、NM989、および他のファー
ジDNA、例えば、M13および線状一本鎖ファージDNA;2μ
プラスミドまたはその誘導体のような酵母プラスミド；
昆虫または哺乳類細胞において有用なベクターのような
真核細胞において有用なベクター；ファージDNAまたは
他の発現制御配列を使用するように改変したプラスミド
のような、プラスミドおよびファージDNAの組み合わせ
から誘導されるベクターなどを含有する。好ましい実施
態様において、obの発現はメチロトロフ酵母、例えば、
Pichia pastoris酵母において達成される（例えば、国
際特許公報第WO 90/03431号、1990年４月５日Brierley
らにより公開；国際特許公報第WO 90/10697号、1990年
９月20日Siegelらにより公開、を参照のこと）。下記の
特定の実施態様において、発現ベクターがα接合因子シ
グナル配列の制御下でのobの発現のために設計される。
任意の多種多様な発現制御配列、作動可能に連結され
たDNA配列の発現を制御する配列、がこれらのベクター
において本発明のDNA配列を発現させるために使用され
得る。そのような有用な発現制御配列は、例えばSV40の
初期または後期プロモーター、CMV、ワクシニア、ポリ
オーマまたはアデノウィルス、lacシステム、trpシステ
ム、TACシステム、TRCシステム、LTRシステム、λファ
ージのメジャーオペレーターおよびプロモーター領域、
fdコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン
酸キナーゼまたはその他の解糖系酵素のプロモーター、
酸性ホスファターゼ（例えば、Pho5）のプロモーター、
メチロトロフ酵母のAOX1プロモーター、酵母α−接合因
子のプロモーター、および原核細胞または真核細胞、あ
るいはそれらのウィルスの遺伝子の発現を制御すること
が公知である他の配列、およびそれらの種々の組み合わ
せを包含する。
多種多様の単細胞宿主細胞もまた、本発明のDNA配列
の発現において有用である。これらの宿主は、E.coli、
Pseudomonas、Bacillus、Streptomyces、；酵母などの
菌類（Saccharomyces、およびPichia、Candida、Hansen
ula、およびTorulopsisのようなメチロトロフ酵母）；
および、CHO、R1.1、Ｂ−Ｗ、およびLM細胞、アフリカ
ミドリザル肝臓細胞（例えば、COS1、COS7、BSC1、BSC4
0、およびBMT10）、昆虫細胞（例えば、Sf9）、および
ヒト細胞のような動物細胞、ならびに組織培養の植物細
胞のような周知の真核性および原核性宿主を包含し得
る。
すべてのベクター、発現制御配列、および宿主が、本
発明のDNA配列を発現するために同等に良好に機能する
わけではないと理解される。いずれの宿主も同一の発現
系に同等に良好に機能するわけではない。しかし、当業
者は適切なベクター、発現制御配列、および宿主を、所
望の発現を達成するために必要以上に実験をしたり、本
発明の範囲を逸脱することなく選択し得る。例えば、ベ
クターの選択において、宿主を考慮する必要がある、な
ぜならベクターはその中で機能するはずであるからであ
る。ベクターのコピー数、コピー数の制御能、および抗
生物質マーカーのようなベクターにコードされる他のい
ずれのタンパク質の発現も考慮され得る。
発現制御配列の選択において、種々の因子が通常考慮
される。これらは例えば、系の相対的な強度、その制御
能、および、特に取り得る２次構造に関して、その発現
される特定のDNA配列または遺伝子との適合性を包含す
る。適切な単細胞宿主は、例えば選択されたベクターと
の適合性、分泌特性、タンパク質を正確にフォールディ
ングする能力、および発酵要求性、ならびに発現される
DNA配列にコードされる生産物の宿主に対する毒性、お
よび発現生産物の精製の容易さを考慮することによって
選択される。
これらおよびその他の因子を考慮して当業者は、本発
明のDNA配列を発酵または大規模動物細胞培養において
発現する種々のベクター／発現制御配列／宿主の組み合
わせを構築し得る。
特定の実施態様において、OB融合タンパク質が発現さ
れ得る。OB融合タンパク質は、少なくとも機能的に活性
なOBポリペプチドの部分にペプチド結合によって結合さ
れた少なくとも機能的に活性な非OBタンパク質の部分を
包含する。非ob配列はOB配列のアミノまたはカルボキシ
末端であり得る。より好ましくは、タンパク質分解的に
不活性なOB融合タンパク質の安定な発現のためには、非
OB融合タンパク質の部分はOBタンパク質のアミノ末端に
ペプチド結合によって結合される。このような融合タン
パク質をコードする組換えDNA分子は、OBコード配列に
読み取り枠内で結合された少なくとも機能的に活性な非
OBタンパク質の部分をコードする配列を含み、好ましく
は、特異的なプロテアーゼ例えば、トロンビンまたは第
X a因子に対する切断部位を、好ましくはOB−非OB連結
部でコードする。特定の実施態様において、融合タンパ
ク質はEscherichia coliまたはP.pastorisにおいて発現
される。
下記の特定の実施態様において、ベクターはマウスお
よびヒトob遺伝子を、gln−49のコドンを有しておよび
有さないで、細菌発現系および酵母（Pichia）発現系に
おいて融合タンパク質として発現するために調製した。
ob遺伝子は例えばPCRおよび新規なプライマーを使用し
て、エンドヌクレアーゼ切断部位を有して調製される。
PCRによって生じた配列を確認するのが望ましい、なぜ
なら本技術に関しては点突然変異を含有する可能性がよ
り高いからである。ヒスチジンtag（His−Tag）および
プロテアーゼ切断部位を含有するプラスミドが使用され
る。ヒスチジンの存在により組換えタンパク質のNi−キ
レートカラムまたはアフィニティー精製により選択的単
離が可能になる。プロテアーゼ切断部位（下記の特定の
実施態様ではトロンビン切断部位）が設計されプロテア
ーゼ（例えばトロンビン）による処理で完全長の成熟
（すなわちシグナル配列を欠く）OBポリペプチドを放出
する。
他の局面において、pGEXベクター（Smithら、Gene 6
7:31−40（1988））が使用され得る。本ベクターは往血
吸虫（schistosoma japonicum）グルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼcDNAを目的の配列に融合する。細菌のタ
ンパク質を回収し、組換えタンパク質を還元型グルタチ
オンアフィニティーカラムで迅速に精製し得る。GSTキ
ャリアーは後に部位特異的プロテアーゼを用いた切断に
よって融合タンパク質から切断され得る。切断の後、キ
ャリアーおよび切断されなかった融合タンパク質はグル
タチオンアガロースへの吸着によって除去され得る。こ
の系は、コードされるタンパク質が水溶液に不溶性であ
る場合、時おり問題が生じる。
細菌系における組換えタンパク質の発現は、発現タン
パク質の不正確なフォールディングを生じ得、再フォー
ルディングが必要である。組換えタンパク質を切断の前
または後に再フォールディングし、機能的に活性なOBポ
リペプチドを形成し得る。OBポリペプチド、は以下の工
程により再フォールディングされる：（ｉ）タンパク質
の還元剤を含有する変成バッファー中でインキュベート
する工程、（ii）タンパク質を酸化剤、好ましくはタン
パク質安定化剤またはカオトロピック剤の一方または両
方もまた含有する緩衝液中でインキュベートする工程。
適切な酸化還元（還元／酸化剤）の対は以下を包含する
がそれに限定されない、還元型グルタチオン／グルタチ
オンジスルフィド、シスチン／システイン、シスタミン
（cystamine）／システアミン、および２−メルカプト
エタノール/2−ヒドロキシエチルジスルフィド。特定の
局面において、融合タンパク質は還元バッファーに交換
する前に尿素のような変成剤中で可溶化され得る。好ま
しい実施態様においては、タンパク質は還元バッファー
に交換する前に例えば、イオン交換クロマトグラフィー
またはNi−キレートクロマトグラフィーによっても精製
される。変成剤は尿素および塩酸グアニジンを含有する
がそれに限定されない。次に組換えタンパク質を少なく
とも約10倍以上に、より好ましくは約100倍に、0.1MTri
s−HCl,pH8.0、1mM EDTA、0.15M NaCl、0.3M酸化型グル
タチオンのような、しかし限定されない、酸化剤を含有
する酸化バッファーに希釈する。次に融合タンパク質は
約１から約24時間、好ましくは約２から約16時間、室温
で酸化バッファー中でインキュベートされる。酸化バッ
ファーは、例えば糖、アルコール、または硫酸アンモニ
ウムのようなタンパク質安定化剤を含み得る。酸化バッ
ファーはさらにカオトロピック剤を低濃度で含有して、
不正確な分子間相互作用を不安定化し、それゆえに適切
なフォールディングを促進する。適切なカオトロピック
剤としては、界面活性剤、ポリオール、Ｌ−アルギニ
ン、塩酸グアニジン、およびポリエチレングリコール
（PEG）が挙げられるがそれに限定されない。十分に低
濃度のカオトロピック剤を使用してタンパク質の変成を
避けることが重要である。再フォールディングしたタン
パク質は少なくとも約10倍以上に、より好ましくは酸化
バッファーに希釈されたもとの量に濃縮される。
細菌発酵方法はまた、受容され得ないレベルのエンド
トキシンを含有するタンパク質調製物を生じさせ得る。
それゆえ、本発明は、例えばエンドトキシン特異的抗体
または他のエンドトキシン結合分子を使用したそのよう
なエンドトキシンの除去を意図する。エンドトキシンの
存在はＥ−TOXATE試薬（Sigma,St.Louis,Missouri）の
使用、またはバイオアッセイのような標準的な技術によ
って決定され得る。
特定の実施例に加え、本発明者はバキュロウィルス、
哺乳類、および酵母発現系のobタンパク質の発現への使
用を意図する。例えば、バキュロウィルス発現系におい
て、pVL941（BamH Iクローニング部位;Summers）、pVL1
393（BamH1、Sma I、Xba I、EcoR1、Not I、Xma III、B
gl II、およびPst Iクローニング部位;Invitrogen）、p
VL1392（Bgl II、Pst I、Not I、Xma III、EcoR I、Xba
I、Sma I、およびBamH1クローニング部位;Summersおよ
びInvitrogen）、およびpBlueBac III（BamH1、Bgl I
I、Pst I、Nco I、およびHind IIIクローニング部位、
青色／白色組換え体スクリーニング可能;Invitrogen）
のような、しかし限定されない非融合トランスファーベ
クター、およびpAc700（BamH IおよびKpn Iクローニン
グ部位、BamH I認識部位は開始コドンから始まる;Summe
rs）、pAc701およびpAc702（pAC700と同様、異なる読み
とり枠を有する）、pAc360（ポリヘドリン開始コドンの
36塩基対下流のBamH Iクローニング部位;Invitrogen（1
95））、およびpBlueBacHisA、Ｂ、Ｃ（３種の異なる読
みとり枠、BamH I、Bgl II、Pst I、Nco I、およびHind
IIIクローニング部位、ProBond精製のためのＮ−末端
ペプチド、およびプラークの青色／白色組換え体スクリ
ーニング;Invitrogen（220））のような、しかし限定さ
れない融合トランスファーベクターの両方が包含され
る。
本発明において使用を意図する哺乳類発現ベクターは
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）プロモーターのよう
な誘導体プロモーターを有するベクターを包含する。そ
れは例えば、DHFR発現ベクター、またはpED（Pst I、Sa
l I、Sba I、Sma I、およびEcoR クローニング部位、ク
ローン化遺伝子およびDHFRの両方を発現するベクター;K
aufmann,Current Protocols in Molecular Biology、1
6.12（1991）を参照のこと）のようなDHFR/メトトレキ
セート共増幅ベクターの任意な発現ベクターである。あ
るいは、pEE14（Hind III、Xba I、Sma I、Sba I、EcoR
I、およびBcl Iクローニング部位、ベクターはグルタ
ミンシンターゼおよびクローン化遺伝子を発現;Celltec
h）のようなグルタミンシンターゼ／メチオニンスルフ
ォキシミン共増幅ベクター。その他の実施態様におけ
る、pREP4（BamH I、Sfi I、Xho I、Not I、Nhe I、Hin
d III、Nhe I、Pvu II、およびKpn Iクローニング部
位、構成的RSV−LTRプロモーター、ヒグロマイシン選択
マーカー;Invitrogen）、pCEP4（BamH I、Sfi I、Xho
I、Not I、Nhe I、Hind III、Nhe I、Pvu II、およびKp
n Iクローニング部位、構成的hCMV即時初期遺伝子、ヒ
グロマイシン選択マーカー;Invitrogen）、pMEP4（Kpn
I、Pvu I、Nhe I、Hind III、Not I、Xho I、Sfi I、Ba
mH Iクローニング部位、誘導性メタロチオネインII a遺
伝子プロモーター、ヒグロマイシン選択マーカー;Invit
rogen）、pREP8（BamH I、Xho I、Not I、Hind III、Nh
e I、およびKpn Iクローニング部位、RSV−LTRプロモー
ター、ヒスチジノール選択マーカー;Invitrogen）、pRE
P9（Kpn I、Nhe I、Hind III、Not I、Xho I、Sfi I、
およびBamh Iクローニング部位、RSV−LTRプロモータ
ー、G418選択マーカー;Invitrogen）、およびpEBVHis
（RSV−LTRプロモーター、ヒグロマイシン選択マーカ
ー、ProBond樹脂で精製可能で、そしてエンテロキナー
ゼで切断されるＮ−末端ペプチド;Invitrogen）などの
ようなエプスタイン−バーウィルス（Epstein Barr Vir
us）（EBV）の制御下でのエピソーム発現に導くベクタ
ー。本発明において使用される選択し得る哺乳類発現ベ
クターは、pRc/CMV（Hind III、BstX I、Not I、Sba
I、およびApa Iクローニング部位、G418選択;Invitroge
n）、pRC/RSV（Hind III、Spe I、BstX I、Not I、Xba
Iクローニング部位、G418選択;Invitrogen）などを含
む。本発明に従って使用されるワクシニアウィルス哺乳
類発現ベクター（Kaufman、（1991）、上記を参照のこ
と）は、pSC11（Sma Iクローニング部位、TK−およびβ
−gal選択）、pMJ601（Sal I、Sma I、Afl I、Nar I、B
spM II、BamH I、Apa I、Nhe I、Sac II、Kpn I、およ
びHind IIIクローニング部;TK−およびβ−gal選択）、
およびpTKgptF1S（EcoR I、Pst I、Sal I、Acc I、Hind
II、Sba I、BamH I、およびHpaクローニング部位、TK
またはXPRT選択）などを含むがそれに限定されない。
酵母発現系もまた本発明に従ってOBポリペプチドの発
現に使用され得る。例えば、非融合pYES2ベクター（Xba
I、Spn I、Sho I、Not I、GstX I、EcoR I、BstX I、B
amH1、Sac I、Kpn1、およびHind IIIクローニング部位;
Invitrogen）または融合pYESHisA、Ｂ、Ｃ（Xba I、Sph
I、Sho I、Not I、BstX I、EcoR I、BamH I、Sac I、K
pn I、およびHind IIIクローニング部位、ProBond樹脂
で精製され、エンテロキナーゼで切断されるＮ−末端ペ
プチド;Invitrogen）の２例のみ挙げるが、本発明に従
って使用され得る。
体重モジュレーターペプチドアナログが、本発明の範
囲に由来するヌクレオチド配列から調製され得ることが
さらに意図される。
OBポリペプチドの組換え発現に加え、本発明は、OBポ
リペプチド、またはそのフラグメントの、周知で高度に
開発された固相ペプチド合成技術を用いての、調製を想
定し完全に可能にする。本発明は一般的なBocおよびFmo
cの両方、およびその他の保護基ストラテジーのobポリ
ペプチドまたはフラグメントの調製への使用を意図す
る。再フォールディングおよびシステイン側鎖の酸化を
してジスルフィド結合を形成する種々の技術もまた当該
分野に周知である。
OBポリペプチドに対する抗体 本発明に従い、組換えまたは化学合成で生産したOBポ
リペプチド、およびそのフラグメントまたはその他の誘
導体あるいはアナログ（融合タンパク質を含む）は、OB
ポリペプチドを認識する抗体を生じさせるための免疫原
として使用され得る。そのような抗体はポリクローナ
ル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fabフラグメン
ト、およびFab発現ライブラリーを含むがそれに限定さ
れない。
分子は、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原レ
セプターのような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互
作用し得るときに「抗原性」である。抗原性のポリペプ
チドは少なくとも約５個、好ましくは少なくとも約10個
アミノ酸を含有する。分子の抗原性部分は、抗体または
Ｔ細胞レセプター認識に免疫優先である部分であり得、
または免疫感作のために抗原性部分をキャリアー分子に
コンジュゲートすることにより分子に対する抗体を生じ
させるのに使用される部分であり得る。抗原性の分子は
それ自身が免疫原性である、すなわちキャリアーなしで
免疫応答を引き起こし得る、必要はない。
「抗体」は特異的なエピトープに結合する任意の免疫
グロブリンであり、この免疫グロブリンには抗体および
そのフラグメントが含まれる。この用語はポリクローナ
ル、モノクローナル、キメラ抗体（米国特許第4,816,39
7号および同第4,816,567号にさらに詳細に記載）、なら
びにFab、Ｆ（ab'）２、およびＦ（ｖ）（一本鎖抗体を
含む）を含む抗体の抗原結合部分を含む。従って、語句
「抗体分子」は、本明細書中で用いられる種々の文法的
形態において、インタクトな（intact）免疫グロブリン
分子および抗体結合部位を含有する免疫グロブリン分子
の免疫的に活性な部分の両方を意図する。「抗体結合部
位」は抗原に特異的に結合するＨ鎖およびＬ鎖の可変お
よび超可変領域から構成され抗体分子の構造的部分であ
る。抗体分子の例としては、インタクトな免疫グロブリ
ン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、お
よび当該分野においてFab、Fab'、Ｆ（ab'）２、および
Ｆ（ｖ）として公知の部分を含むパラトープを含有する
免疫グロブリンの部分が挙げられる。
抗体分子のFabおよびＦ（ab'）２部分はパパインおよ
びペプシンそれぞれのタンパク質分解反応により調製さ
れ、実質的にインタクトな抗体分子については周知の方
法による。例えば、米国特許第4,342,566号、Theofilop
olousらを参照のこと。Fab'抗体分子部分もまた周知で
あり、そしてＦ（ab'）２部分から、メルカプトエタノ
ールで二本のＨ鎖部分を連結しているジスルフィド結合
を還元し、続いて得られたタンパク質メルカプタンをヨ
ードアセトアミドのような試薬でアルキル化して生産さ
れる。インタクトな抗体分子を含む抗体が本明細書中に
おいて好ましい。
語句「モノクローナル抗体」は種々の文法的形態にお
いて、特定の抗原と免疫反応し得る抗体結合部位を１種
類のみ有する抗体を意味する。モノクローナル抗体はそ
れゆえ、それが免疫反応する任意の抗原に対して単一の
結合親和性を典型的に提示する。従って、モノクローナ
ル抗体は、複数の、それぞれが異なる抗原に免疫特異的
な抗体結合部位を有する抗体分子、例えば２特異性（キ
メラ）モノクローナル抗体、を含み得る。
用語「アジュバント」は抗原に対する免疫応答を増強
する化合物または混合物を意味する。アジュバントは、
徐々に抗原を放出する組織貯蔵所として、また免疫応答
を非特異的に増強するリンパ系活性因子として作用し得
る［Hoodら、Immunology、384頁、第２版、Benjamin/Cu
mmings,Menlo Park,California（1984）］。しばしば、
抗原のみによる、アジュバント非存在下の、１次の免疫
は、体液性または細胞性免疫応答を引き起こし得ない。
アジュバントは完全フロイントアジュバント、不完全フ
ロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウム
のようなミネラルゲル、リソレシチンのような表面活性
物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチ
ド、油または炭化水素エマルジョン、キーホールリンペ
ットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG（b
acille Calmette−Guerin）およびCorynebacterium par
vumのような潜在的に有用なヒトアジュバントを包含す
るがそれに限定されない。好ましくは、アジュバントは
薬学的に受容される。
当該分野に公知の種々の工程が、OBポリペプチド、あ
るいはそのフラグメント、誘導体、またはアナログに対
するポリクローナル抗体の生産に使用され得る。抗体の
生産のためには、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤ
ギなどを含むがそれに限定されない種々の宿主動物が、
OBポリペプチドまたはその誘導体（例えば、フラグメン
トまたは融合タンパク質）の注入によって免疫され得
る。１つの実施態様において、OBポリペプチドまたはそ
のフラグメントは、例えばウシ血清アルブミン（BSA）
またはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）の免
疫原性キャリアーに結合され得る。種々のアジュバン
ト、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニ
ウムのようなミネラルゲル、リソレシチンのような表面
活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペ
プチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシ
アニン、ジニトロフェノール、およびBCG（bacille Cal
mette−Guerin）およびCorynebacterium parvumのよう
な潜在的に有用なヒトアジュバントを含むがそれに限定
されない、が宿主種に依存して、免疫学的応答を増加さ
せるために使用され得る。
OBポリペプチド、あるいはそのフラグメント、アナロ
グ、または誘導体に関するモノクローナル抗体の調製の
ためには、培養中の連続的細胞株による抗体分子の生産
を提供する任意の技術が使用され得る。これらの技術
は、Kohlerら（Nature,256:495−497（1975））によっ
て最初に開発されたハイブリドーマ技術、ならびにヒト
Ｂ細胞ハイブリドーマ技術であるトリオーマ技術（Kozb
rら、Immunology Today,4:72（1983））、およびヒトモ
ノクローナル抗体を生産するためのEBV−ハイブリドー
マ技術［Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer T
herapy、77−96頁,Alan R.Liss,Inc.,（1985）］を包含
するがそれに限定されない。不死の抗体生産細胞株は、
Ｂリンパ吸の癌遺伝子DNAによる直接トランスフォーメ
ーション、またはエプスタイン−バーウィルスによるト
ランスフェクションなどの融合以外の技術により作製さ
れ得る（例えば、M.Schreierら、「Hybridoma Techniqu
es」（1980）;Hammerlingら、「Monoclonal Antibodies
And T−cell Hybridomas」（1981）;Kennettら、「Mon
oclonal Antibodies」（1980）を参照のこと；また米国
特許第4,341,761号；同第4,399,121号；同第4,427,783
号；同第4,444,887号；同第4,451,570号；同第4,466,91
7号；同第4,472,500号；同第4,491,632号；および同第
4,493,890号を参照のこと）。
本発明のさらなる実施態様において、モノクローナル
抗体は近年の技術を利用して無菌動物において生産され
得る（PCT/US90/02545）。本発明に従って、ヒト抗体は
使用され得、そしてヒトハイブリドーマを使用して［Co
teら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026−2030（198
3）］、またはヒトＢ細胞をEBVウィルスによりインビト
ロにおいてトランスフォームすることにより（Coleら、
1985、上記）、獲得され得る。実際、本発明に従い、
「キメラ抗体」［Morrisonら、J.Bacteriol.,159−870
（1984）;Neubergerら、Nature,312:604−608（1984）;
Takedaら、Nature,314:452−454（1985）］の生産のた
めに、obポリペプチドに特異的なマウス抗体分子からの
遺伝子と適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝
子とを組み継ぐことによって開発された技術が使用され
得る；そのような抗体は本発明の範囲内である。このよ
うなヒトまたはヒト化キメラ抗体は、ヒトの疾病または
疾患の治療における使用（以下で記載）に好ましい、な
ぜならヒトまたはヒト化抗体は異種移植抗体よりもそれ
自身で免疫応答、特にアレルギー反応を引き起こす可能
性が非常に低いからである。
本発明に従って、一本鎖抗体の生産のために記載され
た技術（米国特許第4,946,778号）が、OBポリペプチド
特異的一本鎖抗体の生産に適応され得る。本発明のさら
なる実施態様は、Fab発現ライブラリーの構築のために
記載される技術［Huseら、Science,246:1275−1281（19
89）］が、obポリペプチド、あるいはその誘導体または
アナログに対する所望の特異性を有するモノクローナル
Fab断片の迅速で容易な同定をもたらすために利用す
る。
抗体分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメン
トを公知の技術により生じさせ得る。例えば、そのよう
なフラグメントは、抗体分子のペプシン消化で生産され
得るＦ（ab'）２フラグメント、Ｆ（ab'）２フラグメン
トのジスルフィド架橋の還元で生じさせ得るFab'フラグ
メント、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理
して生じさせ得るFabフラグメントを含むが、それに限
定されない。
抗体の生産において、所望の抗体のスクリーニングは
当該分野に公知の技術、例えば、ラジオイムノアッセ
イ、ELISA（酵素免疫吸着測定法）、「サンドウィッ
チ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセ
イ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、インサイチュ
イムノアッセイ（例えば、金コロイド、酵素、または放
射性同意元素標識物使用）、ウェスタンブロット、沈降
反応、凝集測定法（例えば、ゲル凝集測定法、血液凝集
測定法）、補体結合測定法、免疫蛍光測定法、プロテイ
ンＡ測定法、および免疫電気泳動測定法など、により達
成され得る。１つの実施態様において、抗体は１次抗体
の標識を検出することにより検出される。他の実施態様
において、１次抗体は２次抗体または試薬の１次抗体の
結合を検出することにより検出される。さらなる実施態
様において、２次抗体は標識される。イムノアッセイに
おける結合の検出のための多くの方法が当該分野におい
て公知であり、本発明の範囲内にある。例えば、OBポリ
ペプチドの特異的なエピトープを認識する抗体を選択す
るために、このようなエピトープを含有するOBポリペプ
チドフラグメントに結合する生産物について、生じたハ
イブリドーマをアッセイし得る。特定の動物種からのOB
ポリペプチドに特異的な抗体の選択のために、動物種の
細胞から発現または単離されるOBポリペプチドとの陽性
結合に基づいて選択し得る。
上記の抗体はOBポリペプチドの位置測定（localizati
on）および活性に関連して、例えば、ウェスタンブロッ
ティング、インサイチュにおけるOBポリペプチドのイメ
ージング、適切な生理学的サンプル中のそのレベルの測
定など、当該分野で公知の方法で使用され得る。
特定の実施態様において、OBポリペプチドの活性を作
動的または拮抗的に作用する抗体を生じ得る。そのよう
な抗体は後述のリガンド同定のためのアッセイを使用し
て試験され得る。
特定の実施態様において、抗体は、タンパク質の配列
から予想された合成ペプチドまたは細菌発現ベクターを
使用して作製された組換えタンパク質でウサギを免疫し
て開発される。合成ペプチドの選択は上記のように、予
想されるタンパク質構造の慎重な解析によりなされる。
特に、推定上の切断部位の間のペプチド配列が選択され
る。合成ペプチドはKLHヘモシアニンまたはBSAのような
キャリアーにカルボジイミドを使用して結合され、フロ
イントアジュバント中でウサギの免疫に使用される。組
換えタンパク質を調製するために、pGEXベクターがポリ
ペプチドの発現に使用され得る（Smithら、1988、上
記）。あるいは、親水性ドメインのみが融合タンパク質
を生じさせるために使用され得る。発現タンパク質は大
量に調製されフロイントアジュバント中でウサギの免疫
に使用される。
他の特定の実施態様において、組換えOBポリペプチド
はニワトリの免疫に使用され、ニワトリ抗OB抗体は卵黄
から、例えば、OBカラムのアフィニティ精製によって、
回収される。好ましくは、免疫に使用されるニワトリは
特定の無病原体（SPF）状態に保たれる。
他の実施態様において、レプチンに対する抗体が、循
環OBタンパク質を欠くob/obマウスにおいて生じ、それ
ゆえ抗OBポリペプチド応答を生じる得ると期待される、
なぜなら、それはポリペプチドおよび野生型マウスにた
いして寛容でないからである。
さらなる実施態様において、組換えOBポリペプチドは
ウサギの免疫に使用され、ポリクローナル抗体は以後の
使用前に免疫精製される。精製された抗体は、半定量的
アッセイ、特に血清または血漿中の循環OBポリペプチド
の存在の検出に、特に有用である。
モジュレーターペプチドに対して生産されたモノクロ
ーナル抗体のパネルは種々の特性、すなわちイソタイ
プ、エピトープ、親和性など、についてスクリーニング
され得る。特に重要なのはモジュレーターペプチドの活
性を中和するモノクローナル抗体である。そのようなモ
ノクローナルは体重モジュレーターの活性アッセイで容
易に同定される。高親和性抗体はまた、天然のまたは組
換えモジュレーターの免疫親和性精製が可能であるとき
に有用である。
好ましくは、本発明の診断および治療方法に使用され
る抗モジュレーター抗体は親和性精製されたポリクロー
ナル抗体である。より好ましくは、抗体はモノクローナ
ル抗体（mAb）である。さらに、本明細書中で使用され
る抗モジュレーター抗体は、抗体分子全体のFab、Fa
b'、Ｆ（ab'）２、またはＦ（ｖ）の形態であることが
好ましい。
診断用途 本発明はまた、本発明の体重モジュレーターに媒介さ
れる活性を引き出すそれらの能力に関連して、体重の異
常または脂肪症に影響を与える状態および／または刺激
の存在を検出する方法を包含する、種々の診断への応用
に関する。上に記載したように、体重モジュレーターペ
プチドは種々の公知の技術により本ペプチドに対する抗
体を産生するために使用され得、次いでこのような抗体
が単離され、そして対象の標的細胞における特定の転写
活性の存在についての試験において使用され得る。ある
いは、本発明の核酸は診断に使用され得る。
抗体に基づいた診断 上に示唆したように、本発明において有用な診断法
は、抗モジュレーター抗体、好ましくはアフィニティー
精製したポリクローナル抗体、より好ましくはモノクロ
ーナル抗体（mAb）のようなモジュレータータンパク質
に対するアンタゴニストの有効量を含むアッセイによっ
て細胞サンプルまたは培養液を試験することを包含す
る。さらに、本明細書中で使用される抗モジュレーター
抗体分子は、好ましくは抗体分子全体のFab、Fab'、Ｆ
（ab'）２、あるいはＦ（ｖ）部分の形態または抗体分
子全体である。既に論じたように、この方法からの利益
を得られ得る患者は癌、AIDS、肥満症または異常な体重
が特徴または因子となる他の状態を患う患者を含む。モ
ジュレーターを単離し、そして抗モジュレーター抗体を
誘導する方法および抗モジュレーター抗体の能力を測定
し、そして最適化して標的細胞の試験を援助する方法は
当該分野に周知である。
また、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両
方を含む抗体、および体重モジュレーターおよび他の認
識因子および／またはそのサブユニットの産生または活
性を調節する薬物は、ある種の診断への応用を有し得、
例えば、体重の異常が発症しているかあるいは発達しそ
うであり得る状態を検出および／または測定する目的の
ために利用され得る。例えば、モジュレーターペプチド
またはその活性なフラグメントは、例えば、融合された
マウス脾臓リンパ球および骨髄腫細胞を利用するハイブ
リドーマ技術のような公知の技術によって、種々の細胞
培地中に自身に対するポリクローナルおよびモノクロー
ナル両方の抗体を産生することに使用され得る。これら
の技術については以下に詳細に記載する。同様に、本発
明のレセプター認識因子の活性を模倣するまたはそれに
拮抗する小分子が発見または合成され得、診断的および
／または治療的プロトコールに使用され得る。
細胞中の体重モジュレーターの存在は、このような測
定に応用され得る通常の免疫学的手順によって確認され
得る。多くの有用な手順が公知である。３つのこのよう
な特に有用な手順は、検出可能な標識で標識されたレセ
プター認識因子、検出可能な標識で標識された抗体A
b1、または検出可能な標識で標識された抗体Ab2を利用
する。手順は以下の式で要約され、ここで式中のアステ
リスク（＊）は粒子が標識されていることを示し、「W
M」は体重モジュレーターを表す。
A. WM＊＋Ab1＝WM＊Ab1 B. WM＋Ab＊ １＝WMAb1 ＊ C. WM＋Ab1＋Ab2 ＊＝Ab1WMAb2 ＊ 手順およびその応用はすべて当業者に周知であり、従っ
て本発明の範囲で利用され得る。「競合」手順、手順
Ａ、は米国特許第3,654,090号および同第3,850,752号に
記載されている。手順Ｂは周知の競合アッセイ技術の典
型である。手順Ｃ、「サンドウィッチ」手順、は米国特
許第RE 31,006号および同第4,016,043号に記載されてい
る。さらに「２重抗体」、または「DASP」手順のような
他の手順が公知である。
各々の場合において、体重モジュレーターは１つまた
はそれ以上の抗体または結合パートナーと複合体を形成
し、複合体の１つのメンバーが検出可能な標識で標識さ
れている。複合体が形成された事実および、所望する場
合その量は、標識の検出に応用され得る公知の方法によ
り測定され得る。
Ab2の特徴的特性はそれがAb1と反応することであるこ
とが上記から理解される。なぜなら、これは１種の哺乳
類種から生じたAb1が、その他の動物種において抗体Ab2
を生じる抗原として使用されたからである。例えばAb2
は、ウサギ抗体を用いて、ヤギ中で生じさせ得る。Ab2
はそれゆえヤギで生じた抗ウサギ抗体である。本明細書
中および特許請求の範囲の目的のために、Ab1は１次ま
たは抗体重モジュレーター抗体を意味し、そしてAb2は
２次または抗Ab1抗体を意味する。
これらの研究のために最も一般的に使用される標識
は、放射性要素、酵素、紫外光線にさらすと蛍光を発す
る化学物質などである。
多くの軽鉱物質が公知であり標識として利用され得
る。これらは例えば、フルオレセイン、ローダミンおよ
びオーラミンを含む。特定の検出物質はヤギで調製され
た抗ウサギ抗体であり、イソチオシアネートによりフル
オレセインと結合される。
体重モジュレーターまたはその結合パートナーは放射
性要素または酵素で標識され得る。放射性標識は任意の
現在入手し得る計数手順により検出され得る。好ましい
同位体元素は、3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57C
o、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、および186Reから選
択され得る。
酵素標識は同様に有用であり、任意の現在利用される
比色、分光光度、蛍光分光光度、電流測定またはガス測
定の技術により検出され得る。酵素は選択された粒子に
カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒ
ドのような架橋分子を用いた反応により結合される。こ
れらの手順で使用され得る多くの酵素が公知であり、そ
して利用され得る。好ましくは、ペルオキシダーゼ、β
−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ＋ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファター
ゼである。米国特許第3,654,090号；同第3,850,752号；
および同第4,016,043号が他の標識物質および方法の開
示例として引用される。
本発明のさらなる実施態様において、医学専門家によ
る使用に適切な試験キットが、対象の標的細胞における
所定の転写活性の有無、あるいは所定の転写活性能を測
定するために調製され得る。上記の試験技術に従って、
このようなキットの１つのクラスは少なくとも標識され
た体重モジュレーターまたはその結合パートナー、例え
ばそれに特異的な抗体、およびもちろん、例えば「競
合」、「サンドウィッチ」、「DASP」などの選択された
方法に依存して、説明書を含有する。キットはバッファ
ー、安定化剤などの周辺試薬もまた含有し得る。
従って、試験キットは所定の転写活性について細胞で
の存在または能力を示すために調製され得、以下のもの
を含有する： （ａ）所定量の少なくとも１つの標識された免疫化学的
に反応性の成分であって、検出されるレベルの本発明の
体重モジュレーターまたはその特異的な結合パートナー
の直接的または間接的な付着により得られる成分； （ｂ）他の試薬；および （ｃ）そのキットの使用説明書 より具体的には、診断試験キットは以下のものを包含し
得る： （ａ）既知の量の上記の体重モジュレーター（または結
合パートナーであって）一般に固相に結合して免疫吸着
剤を形成するか、あるいは適切なタグ、または複数のそ
れらの最終産物など（またはそれらの結合パートナー）
の各々の１つに結合した、体重モジュレーター； （ｂ）必要な場合、他の試薬；および （ｃ）そのキットの使用説明書。
さらなる多様性において、試験キットは上記の目的の
ために調製および使用され、所定のプロトコール（例え
ば、「競合」、「サンドウィッチ」、「２重抗体」な
ど）に従って作用し、以下のものを包含する： （ａ）体重モジュレーターを検出し得る標識に結合して
得られる標識された成分； （ｂ）１つまたはそれ以上の別の免疫化学的試薬であっ
て少なくとも１つの試薬がリガンドまたは固定化された
リガンドであり、リガンドが以下からなる群より選択さ
れる免疫化学的試薬： （ｉ）標識された成分（ａ）に結合可能なリガンド； （ii）標識された成分（ａ）の結合パートナーに結合
可能なリガンド； （iii）測定しようとする単一または複数の成分の少
なくとも１つに結合可能なリガンド；および （iv）測定しようとする少なくとも１つの単一または
複数の成分の少なくとも１つの結合パートナーに結合可
能なリガンド；ならびに （ｃ）体重モジュレーターとその特異的な結合パートナ
ーとの間の免疫化学的反応の１つまたはそれ以上の成分
の検出および／または測定のプロトコールの実施のため
の説明書。
核酸に基づいた診断 下記の実施例に示すように、本発明の核酸は、結果と
して肥満表現型を生じるOBポリペプチドにおける欠陥に
関連する欠陥の検出に使用され得る。例えば、核酸プロ
ーブ（例えば、ノーザン解析またはRT−PCR解析）が肥
満表現型がOBmRNA発現の欠損、または非機能性OBmRNAの
発現、例えば、db/dbマウス（その欠陥はOBレセプター
の欠損から生じる）または突然変異により非転写mRNAを
生じる場合、のいずれと関連するのかを決定するために
使用される。そのうえ、本発明の核酸に基づいた診断技
術は抗体に基づいた技術とともに使用され得、さらなる
肥満または無食欲症の表現型の分子的理解を発展させ
る。
近年単離されたヒトcDNAクローンが本明細書中で示す
ように配列決定された。これによりヒト遺伝子の完全な
配列の決定が容易になった（図20A〜C;配列番号22を参
照のこと）。ヒトOB遺伝子のイントロンからのDNA配列
が得られ（図20）、そしてこれらはOB遺伝子の突然変異
または対立遺伝子変異体（allelic variant）を同定す
るためにヒトゲノムDNAからOB遺伝子のコード配列をPCR
増幅するためのPCRプライマーを調製するために使用さ
れ、すべては本明細書中で上に詳細に記載したプロトコ
ールに従う。ヒトゲノムOBの増幅のための特異的なPCR
プライマーは下記の特定の実施例に記載される。
最新の仮説では、ob遺伝子におけるヘテロ接合体の突
然変異は軽度／中程度の肥満に関連し、一方ホモ接合体
の突然変異は肥満のためのいくつかのDNA配列に基づい
た診断的試験に関連する。これが真実であれば、発症の
おそれのある人々の肥満の進行についての確認が行え、
体重の増加が完全に進行する前に薬物治療および／また
は生活様式の変化の適用が可能になる。
あるいは、変異型ヒトOBとともに分離するマイクロサ
テライト（microsatellite）の存在が診断に使用され得
る。（図20A〜Ｃに提供されるヌクレオチド配列に基づ
いたプライマーを含む）種々のPCRプライマーが、これ
に関して使用され得る。
OB遺伝子はまた、特に栄養障害においてそのコードす
るRNAおよびタンパク質の測定に診断上有用であり得
る。特定の栄養障害において、OB RNAおよび／またはそ
れにコードされるタンパク質が調節されていないかまた
は負の調節がなされているかを知ることは重要である。
それゆえ、肥満型の人がOBレベルの増加を有する場合
は、問題はOBの下流にありそうであり、一方OBが減少し
ていれば、OBの不適切に低いレベルが肥満の原因であり
得る（欠陥がOB遺伝子内であるか否かにかかわらず）。
逆に、体重を落とした癌またはAIDSの患者が上昇したレ
ベルのOBを有する場合は、不適切に高いOBの発現が体重
低下の原因であると結論され得る。
クローン化されたヒトcDNAはヒトOB RNAのレベルの測
定に使用される。さらに、組換えヒトタンパク質は調製
され、そしてOBタンパク質の脂肪およびおそらく血漿レ
ベルの測定を可能にするイムノアッセイの開発に使用さ
れる。
治療用途 本発明のポリペプチド、核酸、および抗体は顕著な治
療能力を有する。
好ましくは、このような試薬の治療有効量を、薬学的に
受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤中で投与す
る。
用語「薬学的に受容可能な」は、ヒトに投与する場
合、生理学的に許容可能であり、代表的にはアレルギー
または同様の厄介な反応（例えば、胃の不調、めまいな
ど）を起こさない分子の実体および組成物を意味する。
好ましくは、本明細書で用いる場合、用語「薬学的に受
容可能な」は、動物における、そしてさらに特定すれば
ヒトにおける使用のために、連邦または州政府の規制局
により認可されていること、もしくは米国薬局方（U.S.
Pharmacopeia）、または他の一般に認められた薬局方に
列挙されていることを意味する。用語「キャリア」は、
化合物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形
剤、またはビヒクルを意味する。このような薬学的なキ
ャリアは、水、および油などの滅菌した液体であり得、
これらは、ピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などのよ
うな石油、動物、植物、または合成起源の液体を含む。
好ましくは、水、または生理食塩水およびデキストロー
ス水溶液およびグリセロール溶液が、キャリアとして、
特に注射液として使用される。適切な薬学的キャリア
は、Martin,Remington's Pharmaceutical Sciens,第18
版、Mack Publishing Co.,Easton,PA,（1990）に記載さ
れている。
本明細書中で用いられる用語「治療有効量」は、宿主
の活性、機能、および応答において、臨床的に重篤な欠
陥を少なくとも約15％、好ましくは少なくとも50％、さ
らに好ましくは少なくとも90％減少するために、そして
最も好ましくは予防するに十分な量を意味する。あるい
は、治療有効量は、宿主の、臨床的に重篤な症状を改善
するに十分である。
組換えOBポリペプチドの投与は、体重減少、特に脂肪
組織の減少をもたらす。本明細書で先に全てを詳細に記
述したように、OBポリペプチドは、標準の、細菌および
／または哺乳動物発現ベクターを用いて、合成的に、調
製され得、または血漿または血清から精製され得る。あ
るいは、天然OBポリペプチドの増加した発現が、上記の
ように相同組換え技術により誘導され得る。
OBポリペプチド活性の減少（アンタゴニスト、インヒ
ビター、中和抗体の使用、またはアンチセンス分子を開
発することによる）は、癌、AIDS、または神経性食欲不
振にともなう体重減少の処置が望まれる場合、体重増加
の結果を生じる。OB活性の調整は、体重の減少（その活
性を増加することによる）または体重の増加（その活性
を減少することによる）に有用であり得る。
ポリペプチドを基礎にした治療処置 最も単純な分析では、OB遺伝子は、哺乳動物、特にマ
ウスおよびヒトで体重を決定する。OB遺伝子産物および
対応して同種の分子は、脂肪組織が脳および他の器官と
連絡するシグナル経路の一部分であるようである。OBポ
リペプチドはそれ自身がシグナル分子、すなわちホルモ
ンであると考えられている。
OBポリペプチド、または機能的に活性なその断片、ま
たはそのアンタゴニストは、経口または非経口、好まし
くは非経口的に投与され得る。なぜなら、代謝恒常性は
連続的なプロセスであり、OBポリペプチドの制御された
放出投与が好ましいからである。例えば、ポリペプチド
は、静脈内注入、移植性浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リ
ポソーム、または他の投与様式を用いて投与され得る。
１つの実施態様では、ポンプが用いられ得る［Langerら
編、Medical Applications of Controlled Release,CRC
Pres.,Boca Raton,Florida（1974）;Sefton,CRC Crit.
Ref.Biomed.Eng.,14:201（1987）;Buchwaldら、Surger
y,88:507（1980）;Saudekら、N.Engl.J.Med.,321:574
（1989）］。別の実施態様では、ポリマー材料が用いら
れ得る［Langer、1974、前出;Sefton,1987、前出;Smole
nら編、Controlled Drug Bioavailability,Drug Produc
t Design and Performance,Wiley,New York（1984）;Ra
ngerら、J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.,23:61（1
983）；以下も参照のこと、Levyら、Science,228:190
（1985）;Duringら、Ann.Neurol.,25:351（1989）;Howa
rdら、J.Neurosurg.,71:105（1989）］。さらに別の実
施態様では、制御された放出系は治療標的（すなわち、
脳）に近接して配置され得、従って、全身投与量の一画
分のみを必要とする［例えば、Goodson,Medical Applic
ations of Controlled Release,第２巻、115−138頁（1
984）参照］。他の制御放出系は、Langer、Science,24
9:1527−1533（1990）による総説で述べられている。別
の実施態様では、治療用化合物は、小胞、特にリポソー
ムを用いて送達され得る（Langer、1990前出，を参
照）;Treatら、Liposomes in the Therapy of Infectio
us Disease and Cancer,Lopez−BeresteinおよびFidler
（編）、Liss,New York,353−365頁（1989）;Lopez−Be
restein,同書、317−327頁；一般に同書を参照）。
さらなる局面において、OB遺伝子でトランスフォーム
された組換え細胞および高レベルのポリペプチドを発現
する細胞は、OBポリペプチドを必要とする被験体に移植
され得る。好ましくは、拒絶を避けるために、OBでトラ
ンスフォームされた自己の細胞が移植される；あるい
は、免疫認識および拒絶を防ぐポリマーマトリックス内
に、可溶性因子を生産する非自己の細胞を防御する技術
が有用である。
OBポリペプチドは、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉
内、または皮下経路の投与により送達され得る。あるい
は、OBポリペプチドは、適切に製剤化され、鼻腔または
経口投与により投与され得る。OBの一定供給は、必要な
間隔で、例えば、毎日、12時間毎に、治療有効投与量
（すなわち、被験体において代謝変化を誘導するために
有効な投与量）を提供することにより確保され得る。こ
れらのパラメーターは、処置されている病状の重篤度、
他の作用（例えば、補充されている食餌改変）、被験体
の体重、年齢、および性別、ならびに他の基準に依存す
るが、それらは、当業者による標準の良好な医療の実践
に従って容易に決定され得る。
薬学的組成物 本発明のさらに別の実施態様では、上記の薬学的組成
物が提供される。このような薬学的組成物は、注射用、
または経口、肺、鼻腔用の投与、または他の形態の投与
用であり得る。一般に、薬学的に受容可能な希釈剤、保
存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／また
はキャリアとともに、本発明の有効量のタンパク質また
は誘導体産物を含有する薬学的組成物が、本発明に包含
される。このような組成物は、種々の緩衝液成分（例え
ば、Tris−HCl、酢酸塩、リン酸塩）、pH、イオン強度
の希釈物；デタージェントおよび可溶化剤のような添加
物（例えば、Tween 80、Polysorbate 80）、抗酸化剤
（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウ
ム）、保存剤（例えば、Thimersol、ベンジルアルコー
ル）、および増量物質（例えば、ラクトース、マンニト
ール）を含み；ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸、ポ
リグリコール酸など）の粒子状調製物中またはリポソー
ム中への材料の取り込みを含む。ヒラウロン酸（hylaur
onic acid）もまた用いられ得る。このような組成物
は、身体の状態、安定性、インビボ放出速度、および本
タンパク質および誘導体のインビボクリアランス速度に
影響し得る。例えば、本明細書中に参考として援用され
るMartin,Remington's Pharmaceutical Sciences,第18
版、（1990、Mack Publishing Co.,Easton,PA 18042）1
435−1712頁を参照。組成物は、液体形態で調製され得
るか、または凍結乾燥形態のような乾燥粉末であり得
る。
経口送達 本明細書における使用には、参考として本明細書に援
用されるMartin,Remington's Pharmaceutical Science
s,第18版、（1990、Mack Publishing Co.Easton PA 180
42）の第89章に一般に記載されている経口固形投与量形
態が意図されている。固形投与形態は、タブレット、カ
プセル、ピル、トローチまたはロゼンジ、カシェ剤また
はペレットを含む。また、リポソームまたはプロテイノ
イドカプセル化（例えば、米国特許第4,925,673号に報
告されているプロテイノイドマイクロスフェアのよう
な）を用いて、本発明の組成物を処方し得る。リポソー
ムのカプセル化が用いられ得、そしてリポソームを種々
のポリマーを用いて誘導体化し得る（例えば、米国特許
第5,013,556号）。治療用の可能な固形投与形態の説明
は、参考として本明細書に援用されるMarshallによる、
Modern Pharmrceutics,第10章、BankerおよびRhodes
編、（1979）に記載されている。一般に、製剤は、タン
パク質（または化学的に改変されたタンパク質）および
胃の環境に対する保護を可能とする不活性成分を含み、
そして腸内に生物学的に活性な物質を放出し得る。
より特定すれば、上記の誘導体化タンパク質の経口投
与形態もまた意図される。タンパク質は化学的に改変さ
れ得、誘導体の経口送達を有効にする。一般に、タンパ
ク質（またはペプチド）分子自身への少なくとも１つの
部分の付着が意図される化学的改変であり、ここで、こ
の部分は、（ａ）タンパク質分解を阻害し得；そして
（ｂ）胃または腸から血流中への取り込みを可能にす
る。タンパク質の全体的な安定性の増加および体内での
循環時間の増加もまた所望される。このような部分の例
は、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプ
ロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチル
セルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポ
リビニルピロリドン、ならびにポリプロリンを含む。Ab
uchowskiら、1981、前出;Newmarkら、J.Appl.Biochem.,
4:185−189（1982）。用いられ得る他のポリマーは、ポ
リ−1,3−ジオキソランおよびポリ−1,3,6−チオキソカ
ン（tioxocane）である。上記に示したような薬学的用
途には、ポリエチレングリコール部分が好ましい。
タンパク質（または誘導体）の放出場所は、胃、小腸
（十二指腸、空腸、または回腸）、または大腸であり得
る。当業者は、胃で溶解せず、十二指腸または腸の他の
場所で物質を放出する入手可能な製剤を有する。好まし
くは、放出は、タンパク質（または誘導体）の保護によ
り、もしくは胃の環境を越えて、例えば腸における生物
学的に活性な物質の放出によるのいずれかにより胃環境
の有害な影響を避ける。
胃腸管における耐性を十分に確実にするために、少な
くともpH5.0までは不浸透性であるコーティングが必須
である。腸溶コーテイング剤として用いられる、より一
般的な不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメ
リテート（CAT）、ヒドロキシプロピルメチルセルロー
スフタレート（HPMCP）、HPMCP50、HPMCP55、ポリビニ
ルアセテートフタレート（PVAP）、Eudragit L30D、Aqu
ateric、セルロースアセテートフタレート（CAP）、Eud
ragit L、Eudragit S、およびShellacである。これらの
コーティング剤は混合フィルムとして用いられ得る。
コーティングまたはコーティング混合物はまた、胃に
対する保護を意図しないで、タブレット上で用いられ得
る。これは、糖コーティング、またはタブレットを飲み
込み易くするコーティングを含み得る。カプセルは乾燥
治療剤、すなわち、粉末の送達には硬い殻（例えば、ゼ
ラチン）からなり；液体形態には、柔軟なゼラチン殻が
用いられ得る。カシェ剤の殻材料は厚いデンプンまたは
他の食用紙であり得る。ピル、ロゼンジ、成形タブレッ
トまたはタブレット粉薬には、湿潤塊状化技術が用いら
れ得る。
治療剤は、粒子サイズ約1mmの顆粒またはペレットの
形態で微細な複数粒子として製剤に含まれ得る。カプセ
ル投与のための物質の製剤はまた、粉末、軽く圧縮され
たプラグ、またはタブレットであり得る。治療剤は圧縮
により調製され得る。
着色料および香料もすべてに含有され得る。例えば、
タンパク質（または誘導体）（例えば、リポソームまた
はマイクロスフェアのカプセル化により）は処方され
得、次いで、食品、例えば、着色料および香料を含有す
る冷却飲料中にさらに含有され得る。
不活性物質を用いて治療剤の容量を希釈または増加し
得る。これらの希釈剤は、炭水化物、特にマンニトー
ル、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、ス
クロース、改変デキストランおよびデンプンを含み得
る。特定の無機塩もまた、カルシウム三リン酸、炭酸マ
グネシウム、および塩化ナトリウムを含有する充填剤と
して用いられ得る。いくつかの市販の希釈剤は、Fast−
Flo、Emdex、STARx 1500、Emcompress、およびAvicell
である。
崩壊剤が、固形投与形態の治療剤の製剤中に含まれ得
る。崩壊剤として使用される物質は、デンプン、Explot
abに基づく市販の崩壊剤を含むデンプンを包含するが、
これに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウ
ム、Amberlite、カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム、ウルトラアミロペクチン（ultramylopectin）、ア
ルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジ皮、酸性カル
ボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナ
イトも全て用いられ得る。崩壊剤の別の形態は、不溶性
カチオン交換樹脂である。粉末化ゴムは崩壊剤および結
合剤として用いられ得、そしてこれらは寒天、Karaya、
またはトラガカントゴムのような粉末化ゴムを含み得
る。アルギン酸およびそのナトリウム塩もまた、崩壊剤
として有用である。
結合剤を用いて、治療剤を一緒に保持し硬いタブレッ
トを形成し得、そして結合剤には、アラビアゴム、トラ
ガカントゴム、デンプン、およびゼラチンのような天然
物由来の物質が含まれる。その他には、メチルセルロー
ス（MC）、エチルセルロース（EC）、およびカルボキシ
メチルセルロース（CMC）が含まれる。ポリビニルピロ
リドン（PVP）およびヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース（HPMC）は、ともにアルコール溶液中で利用し得、
治療剤を顆粒化し得る。
減摩剤が治療剤の製剤に含まれ得、製剤プロセスの
間、粘着を妨ぐ。潤滑剤が治療剤と型版の壁の間の層と
して使用され得、そしてそれらは、ステアリン酸マグネ
シウムおよびステアリン酸カルシウムを含むステアリン
酸、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、液体パラフ
ィン、植物油、およびワックスを含み得るが、それらに
限定されない。可溶性潤滑剤がまた使用され得、これに
は、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウ
ム、種々の分子量のポリエチレングリコール、およびCa
rbowax 4000および6000が含まれる。
製剤の間の薬剤の流動特性を改良し、そして圧縮の間
の転位を補助するために滑材を添加し得る。滑材は、デ
ンプン、タルク、火成シリカ、およびシリコアルミネー
ト水和物を含み得る。
水溶性環境への治療剤の溶解を補助するために、界面
活性剤を湿潤剤として添加し得る。界面活性剤は、アニ
オン性デタージェント、例えば、ラウリル硫酸ナトリウ
ム、ジオクチルスルホスクシネートナトリウム、および
ジオクチルスルホン酸ナトリウムを含み得る。カチオン
性デタージェントが用いられ得、そして塩化ベンザルコ
ニウムまたは塩化ベンゼトミウムを含み得る。界面活性
剤として製剤中に含まれ得る可能な非イオン性デタージ
ェントを列挙すれば、ラウロマクロゴール400、ポリオ
キシル40ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ひまし
油10、50、および60、グリセロールモノステアレート、
ポリソルベート40、60、65および80、スクロース脂肪酸
エステル、メチルセルロース、およびカルボキシメチル
セルロースを含み得る。これらの界面活性剤は、タンパ
ク質または誘導体の製剤中に、単独または異なる割合の
混合物としてのいずれかで存在し得る。
潜在的にタンパク質（または誘導体）の取り込みを促
進する混合剤は、例えば、脂肪酸、オレイン酸、リノー
ル酸、およびリノレン酸である。
制御放出製剤が所望され得る。薬剤は、拡散または浸
出メカニズム（すなわちゴム）のいずれかにより放出を
許容する不活性なマトリックス中に取り込まれ得る。ゆ
っくりと変性するマトリックスもまた処方剤に取り込ま
れ得る。この治療剤の制御放出の他の形態は、Oros治療
系（Alza Corp.）に基づく方法により、換言すれば、薬
剤が半透膜に包まれている。半透膜は、浸透性効果に起
因して、単一な小さな開口部を通じて水を入れ、そして
薬剤を押し出させる。いくつかの腸溶コーティングがま
た、遅延放出効果を有する。
他のコーティングを製剤に用い得る。これらは、コー
ティングパンで付加し得る種々の糖を含む。治療剤はま
た、フィルムでコートされたタブレットであり得；この
例で用いられる物質は、２つのグループに分けられる。
第１のグループは、非腸溶性物質であり、メチルセルロ
ース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロー
ス、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプ
ロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス、カルボキシナトリウム−メチルセルロース、プロビ
ドン、およびポリエチレングリコールを含む。第２のグ
ループは、一般にフタル酸のエステルである腸溶性物質
からなる。
物質の混合物を用いて、最適なフィルムコーティング
を提供し得る。フィルムコーティングは、コーティング
機または流動床でまたは圧縮コーティングにより実施さ
れ得る。
肺送達 本発明のタンパク質（またはその誘導体）の肺送達も
また本明細書中で意図される。タンパク質（または誘導
体）は、吸入する間に哺乳動物の肺に送達され、そして
血流に沿って肺の上皮を横切って移動する。このことを
示す他の報告は、以下を含む： Adjeiら,Pharmaceutical Research,7（６）:565−569
（1990）;Adjeiら,International Journal of Pharmace
utics,63:135−144（1990）（酢酸ロイプロレリン）;Br
aquetら,Journal of Cardiovascular Pharmacology,13
（同上５）:143−146（1989）（エンドセリン−１）;Hu
bbardら,Annals of Internal Medicine,3（３）:206−2
12（1989）（α１−アンチトリプシン）;Smithら,J.Cli
n,Invest.,84:1145−1146（1989）（α１−プロテイナ
ーゼ）;Oswein et al.,“Aerosolization of Protein
s",Proceedings of Symposium on Respiratory Drug De
livery II,Keystone,Colorado,（March 1990）（組換え
ヒト成長ホルモン）;Debs et al.,J.Immunol.,140:3482
−3488（1988）およびPlatzら，米国特許第5,284,656号
（顆粒球コロニー刺激因子）． 本発明の実施ににおける使用には、治療用製品の肺送達
に設計された広範囲の機械的デバイスが意図され、その
全てが当業者によく知られたネブライザー、投与量測定
吸入器、および粉末吸入器を含むがこれらに限定されな
い。
本発明の実施に適切な市販されているデバイスのいく
つかの特定の例は、Mallinckrodt,Inc.、St.Louis,Miss
ouriにより製造されるUltraventネブライザー;Marquest
Medical Products,Englewood,Coloradoにより製造され
るAcorn IIネブライザー;Glaxo Inc.、Research Triang
le Park,North Carolinaにより製造されるVentolin投与
量測定吸入器；およびFisons Corp.、Bedford,Massachu
settsにより製造されるSpinhaler粉末吸入器である。
このようなデバイス全ては、タンパク質（または誘導
体）の調剤に適した製剤の使用を必要とする。代表的に
は、各製剤は、使用したデバイスのタイプに特異的であ
り、そして治療に有用な通常の希釈剤、アジュバント、
および／またはキャリアに加えて適切な推進剤の使用を
含み得る。また、リポソーム、マイクロカプセルまたは
マイクロスフェア、封入複合体、または他のタイプのキ
ャリアの使用が意図される。化学的に改変されたタンパ
ク質もまた、化学的改変のタイプまたは使用するデバイ
スのタイプに依存して異なる製剤中で調製され得る。
ジェットまたは超音波のいずれかのネブライザーでの
使用に適した製剤は、代表的には、溶液1mlにつき約0.1
〜25mgの生物学的に活性なタンパク質の濃度で水に溶解
されたタンパク質（または誘導体）を含む。製剤はま
た、緩衝液および単糖を（例えば、タンパク質の安定化
および浸透圧の調節のために）含み得る。ネブライザー
の製剤はまた、界面活性剤を含み得、エアロゾルの形成
において、溶液の噴霧により生じるタンパク質の表面誘
導凝集を減少または妨ぎ得る。
投与量測定吸入デバイスで用いる製剤は、一般に、界
面活性剤の助けで、推進剤中に懸濁されるタンパク質
（または誘導体）を含有する、微細に分けられた粉末を
含む。この推進剤は、この目的のために用いられる任意
の従来物質であり得、例えば、クロロフルオロカーボ
ン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカ
ーボン、または炭化水素（トリクロロフルオロメタン、
ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエ
タノール、および1,1,1,2−テトラフルオロエタンを含
む）、またはそれらの組合せを含む。適切な界面活性剤
は、ソルビタントリオレートおよび大豆レシチンを含
む。オレイン酸もまた界面活性剤として有用であり得
る。
粉末吸入デバイスから調剤される製剤は、タンパク質
（または誘導体）を含有する、微細に分けられた乾燥粉
末を含み、そしてまた、増量剤、例えば、デバイスから
の粉末の散布を促進する量のラクトース、ソルビトー
ル、スクロース、またはマンニトールを、例えば、製剤
の50〜90重量％で含む。タンパク質（または誘導体）
は、肺末端に最も効率的に送達するために、10μｍ（ま
たはミクロン）以下の、最も好ましくは0.5〜５μｍの
平均粒子サイズで粒子形態で最も有利に調製され得る。
鼻腔送達 タンパク質（または誘導体）の鼻腔送達もまた意図さ
れる。鼻腔送達は、鼻に治療製品を投与した後、肺にお
ける製品の沈着を必要とせずに、直接的に、血流へのタ
ンパク質輸送を可能にする。鼻腔送達のための製剤は、
デキストランまたはサイクロデキストランともにこれら
を含む。
処置方法、薬物の調製法 本発明のさらに他の局面では、処置方法および薬物の
製造方法が提供される。本発明の誘導体の投与による緩
和または調整される症状は、上記の症状である。
投与量 上記の分子の全てについて、さらなる研究が行われ、
種々の患者における種々の症状の処置に対する適切な投
与量レベルについての情報が増え、そして受容体の治療
情況、年齢、および全身的な健康を考慮する当業者は、
適切な投与量を確かめる。一般に、注射または注入につ
いて、投与量は、0.01μｇの生物学的活性タンパク質/k
g体重（化学的改変のないタンパク質のみの量を計算）
と10mg/kg（同様に基づく）との間である。投与量スケ
ジュールは、用いるタンパク質または誘導体の循環半減
期、ポリペプチドがボーラス投与量または連続注入によ
り送達されるかどうか、および用いる製剤に依存して変
化し得る。
他の化合物との投与 肥満症に関連した治療に対しては、本発明のタンパク
質（または誘導体）を、肥満症の他の医療合併症を処置
するために用いられる１つまたはそれ以上の薬学的組成
物、例えば、糖尿病（例えば、インスリン）、高血圧、
高コレステロール、および肥満症に付随する他の有害な
症状の処置に用いられる薬学的組成物とともに投与し得
る。また、他の食欲抑制剤、例えばアンフェタミンが、
ともに投与され得る。投与は同時であり得る（例えば、
本発明のタンパク質およびインスリンの混合物の投与）
か、または逐次であり得る。
核酸を基礎にした治療処置 OB遺伝子は、肥満症の遺伝子治療を開発するために、
ヒト脂肪細胞中に導入され得る。このような治療は、体
重を減少させると予期され得る。反対に、ヒト脂肪細胞
中へのアンチセンス構築物の導入は、活性OBポリペプチ
ドのレベルを減少し得、身体の脂肪症を増加すると予測
され得る。
１つの実施態様では、OBポリペプチドをコードしてい
る遺伝子は、インビボでウイルスベクターで導入され
る。このようなベクターは弱毒化または欠陥DNAウイル
ス、例えば、単純ヘルペスウイルス（HSV）、パピロー
マウイルス、エピスタインバーウイルス（EBV）、アデ
ノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）などを含むが
これらに限定されない。完全にまたはほぼ完全にウイル
ス遺伝子を欠く欠陥ウイルスが好ましい。欠陥ウイルス
は、細胞に導入した後、感染性でない。欠陥ウイルスベ
クターの使用は、ベクターが他の細胞に感染し得ること
を考慮せずに、細胞中の特異的な局在領域に投与するこ
とが可能である。従って、脂肪組織が特異的に標的され
得る。特定のベクターの例は、欠陥ヘルペスウイルス１
（HSV1）ベクター［Kaplittら、Molec.Cell.Neurosci.,
2:320−330（1991）］、弱毒化アデノウイルスベクタ
ー、例えば、Stratford−Perricaudetら、J.Clin.Inves
t.,90:626−630（1992）により記載されるベクター、お
よび欠陥アデノ随伴ウイルスベクター［Samulskiら、J.
Virol.,61:3096−3101（1987）;Samulskiら、J.Virol.,
63:3822−3828（1989）］を含むが、これらに限定され
ない。
もう一つの実施態様では、遺伝子は、例えば以下に記
載されるように、レトロウイルスベクターで導入され得
る:Andersonら、米国特許第5,399,346号;Mannら、Cell,
33:153（1983）;Teminら、米国特許第4,650,764号;Temi
nら、米国特許第4,980,289号;Markowitzら、J.Virol.,6
2:1120（1988）;Teminら、米国特許第5,124,263号;Doug
hertyらによる、1995年３月16日に公開された国際特許
公開第WO95/07358号；およびKuoら、Blood,82:845（199
3）。
あるいは、ベクターはインビボでリポフェクションに
より導入され得る。過去10年間、インビトロで、核酸の
カプセル化およびトランスフェクションのためのリポソ
ームの使用が増加している。リポソームが介在するトラ
ンスフェクションで遭遇する困難性および危険性を限定
するために設計された合成のカチオン性脂質が、マーカ
ーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクション
のためのリポソームを調製するために用いられ得る［Fe
lgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413−7417（198
7）;Mackeyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8027−8031
（1988）参照］。カチオン性脂質の使用は、負に荷電し
た核酸のカプセル化を促進し得、そして負に荷電した細
胞膜との融合も促進する［Felgnerら、Science,337:387
−388（1989）］。外因性遺伝子を、インビボで、特定
の器官に導入するためのリポフェクションの使用は、特
定の実用的な利点を有する。特定細胞へのリポソームの
分子標的は、１つの有益な領域である。特定の細胞タイ
プをトランスフェクションすることは、細胞の不均質性
を有する組織、例えば、膵臓、肝臓、腎臓、および脳で
特に有益であり得る。脂質は、標的の目的のために他の
分子に化学的に結合され得る（Mackeyら、1988、前
出）。標的されたペプチド、例えば、ホルモンまたは神
経伝達物質、および抗体のようなタンパク質、または非
ペプチド分子が化学的にリポソームに結合され得る。
裸のDNAプラスミドとしてインビボでベクターを導入
することも可能である。遺伝子治療のための裸のDNAベ
クターは、当該分野で公知の方法、例えば、トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジ
ェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、
リン酸カルシウム沈澱、遺伝子銃の使用、またはDNAベ
クタートランスポーターの使用により、所望の宿主細胞
に導入され得る（例えば、Wuら、J.Biol.,Chem.,267:96
3−967（1992）;Wuら、J.Biol.,Chem.,263:14621−1462
4（1988）;1990年３月15日に出願されたHartmutら、カ
ナダ特許出願第2,012,311号を参照）。
農業への応用 OB遺伝子はまた、家畜動物から単離され得、そしてそ
れによって相当するOBポリペプチドが得られ得る。下記
の特定の例では、マウスOB遺伝子由来のプローブは、多
数の種の動物由来の相当する相同性のコード配列にハイ
ブリダイズする。ヒトの治療について述べられたよう
に、組換えタンパク質がまた調製され得、そして家畜動
物に投与され得る。ポリペプチドの投与は、より痩身型
の食用動物、例えば、ウシ、ブタ、家禽、ヒツジなどを
生産するために実行され得る。好ましくは、自己のポリ
ペプチドOBポリペプチドが投与されるが、本発明はま
た、抗自己のポリペプチドの投与を意図する。OBポリペ
プチドは約160のアミノ酸残基からなるので、高度に免
疫原性であり得ない。従って、非自己のポリペプチドの
投与は、免疫応答を生じ得ない。
あるいは、トランスジェニック家畜動物へのクローン
化遺伝子の導入は、OBトランスジーンの過剰発現による
トランスジェニック家畜動物の潜在的な体重および脂肪
症の減少を可能にし得る。このことを達成するための最
も簡単な手法は、それ自身のまたは別の脂肪特異的なプ
ロモーターを用いて、OBトランスジーンを脂肪に標的す
ることであり得る。
反対に、体脂肪の増加は、神戸牛またはフォアグラを
つくるための肥大肝臓の開発の目的のような他の情況で
は所望される。これは、アンチセンスなOBトランスジー
ンを脂肪に標的すること、または遺伝子ノックアウト技
法を用いることにより達成され得た。あるいは、体重に
おいて脂肪パーセントの増加が所望される場合、OBポリ
ペプチドのインヒビターまたはアンダコニストが投与さ
れ得る。このようなインヒビターまたはアンタゴニスト
は、ポリペプチドと反応性の抗体、およびOBレセプター
に結合するが活性化しないポリペプチドの断片、すなわ
ちOBポリペプチドのアンタゴニストを含むが、それらに
限定されない。
美容用途 OBポリペプチドは、健康の利益に加えて美容使用に重
要な価値を有する。特に、誘導体およびそのアゴニスト
アナログを含む本発明のOBポリペプチドが、動物の脂肪
細胞沈着の速度および量の調整に有用であるので、目ざ
わりな脂肪組織、例えば、肥満状態に必ずしも達しない
が、やはり個人の外見を損なう腹部、股関節部、腿、
首、および顎での脂肪沈着を減少するために有用であ
る。脂肪減少効果は、部分的には、食欲の減少、すなわ
ち食糧摂取の減少によるか、基礎代謝の増加によるか、
または両方により達成されると考えられている。従っ
て、本発明のOBポリペプチド、もしくはその誘導体また
はアゴニストアナログは、脂肪沈着を調整することによ
り、食欲を減少することにより、またはその両方によ
り、脂肪組織沈着において美容上の変化をもたらすため
に、被験体への投与に有用である。
さらに、本発明の組成物および方法は、脂肪組織のパ
ーセントを減少し、そして身体の外見を改善するための
試み得る方法の例として、種々の手順、例えば、身体の
全体の外見を変えるために設計された美容手術（例え
ば、脂肪組織を吸引または除去することにより体重を減
少するために設計された脂肪吸引（liposuction）また
はレーザー手術）、運動（特に、ランニングおよびウエ
ートトレーニング）、低脂肪食餌、睡眠、生体フィード
バックとともに用いられ得る。
従って、本発明は、個体において美容のために脂肪組
織調整を行う方法に関し、この方法は、OBポリペプチ
ド、もしくは誘導体またはそのアゴニストアナログの脂
肪調整量を、身体全体の外見を改善するために、美容の
ために脂肪組織調整を所望する個体に投与する工程を包
含する。特定の局面では、脂肪組織調整は食欲抑制の結
果である。好ましくは、脂肪組織調整は、脂肪組織の減
少である。
さらなる実施態様では、本発明は、美容のために脂肪
組織損失を行う方法に関し、この方法は、OBポリペプチ
ド、もしくは誘導体またはそのアゴニストアナログの脂
肪調整量を、身体全体の外見を改善するために、美容の
ために脂肪組織調整を所望する個体に投与することによ
り身体の外見を変化させるための手順を組み合わせる工
程を包含する。
OBレセプター OB因子の小分子アゴニストおよびアンタゴニストの開
発は、そのレセプターの単離により大きく促進される。
これは、活性なOBポリペプチドを調製しそしてそれを標
準的な方法を用いて発現ライブラリーをスクリーニング
するために使用して達成され得る。発現ライブラリー中
のレセプターの結合は、細菌または哺乳動物発現ベクタ
ーのいずれかを用いて調製された組換えポリペプチドを
投与する工程、および発現ライブラリーの細胞について
組換えポリペプチドの短期間および連続投与の効果を観
察する工程、または細胞へのOBポリペプチドの結合を直
接検出する工程により試験され得る。
OBレセプターは、現在、視床下部およびおそらく肝臓
に局在するようであると考えられているので、好ましく
は、これらの組織由来のcDNAライブラリーが、標準的な
発現クローニングベクター中で構築される。次に、これ
らのcDNAクローンが、プールとしてCOS細胞に導入され
得、そして得られるトランスフォーマントは、OBレセプ
ターを発現するCOS細胞を同定するために、活性リガン
ドを用いてスクリーニングされ得る。次いで、陽性のク
ローンが、クローン化レセプターを回収するために単離
され得る。クローン化レセプターは、OBリガンド（それ
がホルモンであると仮定して）とともに用いられ、OBの
小分子モジュレーターのスクリーニングに必要な成分を
開発する。
本発明に従って利用されるべき特定のアッセイ系は、
レセプターアッセイとして公知である。レセプターアッ
セイでは、アッセイされるべき物質は、適切に標識さ
れ、次いで、特定の細胞試験コロニーは、所定量の標識
および非標識の両物質が接種され、その後、標識物質が
細胞レセプターに結合する程度を決定するために結合研
究が行われる。このように、物質間の親和性の違いが確
認され得る。
従って、所定量の精製体重モジュレーターが、放射性
標識され得、そして例えば、抗体またはそれらに対する
他のインヒビターと組み合わされ、その後結合研究が実
施された得る。次いで、種々の量の標識および非標識の
組み合わされていない体積モジュレーターを含む溶液が
調製され得、次いで細胞試料が接種され、そしてその後
インキュベートされ得る。得られる細胞の単層を、次い
で洗浄し、可溶化し、そして５％以下の標準誤差を生じ
るに十分な時間の長さの間、ガンマ−カウンターで計測
した。次いで、これらのデータは、スキャッチャード分
析に併せられ、その後、物質の活性についての観察およ
び結論づけが行われ得る。先行する記載は例示であり、
それは、レセプターアッセイが行われ用いられる様式を
例示し、例ではアッセイした物質の細胞結合能力が区別
する特徴として供し得る。あるいは、レセプターアッセ
イは、dbレセプターのような本発明のモジュレーターに
対する特異的レセプターの同定に特に有用である。
本発明による有用なそして意図されたさらなるアッセ
イは、「シス／トランス」アッセイとして知られてい
る。簡単に説明すると、このアッセイは、２つの遺伝子
構築物を使用し、その内の１つは、代表的には、適切な
細胞株にトランスフェクトする場合、目的の特定のレセ
プターを速続的に発現するプラスミドであり、そしてそ
の第２番目は、レセプター／リガンド複合体の制御下
で、ルシフェラーゼのようなレポーターを発現するプラ
スミドである。従って、例えば、特定のレセプターに対
するリガンドとして化合物を評価することが所望される
場合、プラスミドの１つは、選択された細胞株でレセプ
ターの発現を生じる構築物であり得、その一方、第二の
プラスミドは、特定のレセプターに対して応答要素が挿
入されるルシフェラーゼ遺伝子に連結されたプロモータ
ーを所有する。試験される化合物がレセプターに対する
アゴニストである場合、リガンドはレセプターと複合体
化し、そして生じた複合体は応答要素と結合し、そして
ルシフェラーゼ遺伝子の転写を開始する。次いで、生じ
た化学発光を光度計により測定し、投与量応答曲線を
得、そして既知のリガンドの投与量応答曲線と比較す
る。前記のプロトコールは、当業者が参考とする目的の
ために、米国特許第4,981,784号およびPCT国際公開第WO
88/03168号で詳細に記載されている。
一旦、OBレセプター遺伝子配列を発現する組換え体が
同定されると、組換えOBレセプターが分析され得る。こ
れは、レセプターの放射性標識を含むOBレセプターの物
理学または機能的特徴に基づくアッセイとそれに続くゲ
ル電気泳動、イムノアッセイ、リガンド結合などによる
分析により達成される。さらに、OBレセプターに対する
抗体が上記のように生成され得る。
OBレセプターの構造は、当該分野で公知の種々の方法
により分析され得る。好ましくは、種々のドメインの構
造、特にOB結合部位が分析される。構造分析は、他の公
知のタンパク質、特にホルモンおよびタンパク質レセプ
ターとの配列類似性を同定することにより行われ得る。
類似性（または相同性）の程度は、OBレセプターまたは
そのドメインの構造および機能を推定するための基礎を
提供し得る。特定の実施態様では、配列比較は、例え
ば、FASTAおよびFASTPプログラム［Pearsonら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,85:2444−48（1988）］を用いてGenBa
nkで見い出される配列を用いて行われ得る。
タンパク質配列は、親水性分析によりさらに特徴付ら
れ得る（例えば、Hoppら、1981、同上）。親水性プロフ
ィールを用いて、OBレセプタータンパク質の疎水性およ
び親水性領域を同定し得、それはまた、細胞質外、膜結
合性、および細胞質内領域を示し得る。
二次構造の分析（例えば、Chouら、1974、同上）がま
た行われ、特異的な二次構造をとると推定されるOBレセ
プターの領域を同定し得る。
操作、翻訳、および二次構造の推定、ならびにオープ
ンリーディングフレームの推定および製図（plotting）
はまた、当該分野で利用可能なコンピューターソフトウ
エアプログラムを用いても達成され得る。
組換えOBポリペプチドの大量の供給源、およびOBレセ
プター（すなわち、db遺伝子産物）を単離する機会を提
供することにより、本発明は、OBポリペプチドおよびOB
レセプター、またはそのドメインの活性なコンホメーシ
ョンの定量的な構造決定を可能にする。特に、十分量の
物質が、核磁気共鳴（NMR）、赤外（IR）、Raman、およ
び紫外（UV）、特に円二色性（CD）、分光分析のために
提供される。特に、NMRは、溶液中の分子の非常に強力
な構造分析を提供し、それは、それらの天然環境により
緊密に近づける（Marionら、1983、同上:Barら、1985、
同上;Kimuraら、1980、同上）。構造分析の他の方法が
また使用され得る。これらは、Ｘ線結晶学（Engstom,19
74,同上）を含むがこれらに限定されない。
さらに好ましくは、OBポリペプチドおよびOBレセプタ
ーの共結晶（co−crystal）が研究され得る。共結晶の
分析は、結合についての詳細な情報を提供し、それはさ
らに、リガンドアゴニストおよびアンタゴニストの合理
的な設計を可能にする。コンピューターモデリングもま
た使用され得、特にNMRまたはＸ線法［Fletterickら
編、Computer Graphics and Molecular Modeling,in Cu
rrent Communications in Molecular Biology,Cold Spr
ing Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York
（1986）］と組み合わせて使用され得る。
本発明のOBレセプターをコードする遺伝子の同定およ
び単離は、天然供給源から単離され得るより大量に、ま
たは細胞のトランスフェクションまたはトランスフォー
メーション後に発現するレセプターの活性を示すように
特に加工されたインジケーター細胞でレセプターの発現
を提供する。従って、OBポリペプチドの構造に基づくア
ゴニストおよびアンタゴニストの合理的な設計に加え
て、本発明は、当該分野で公知の種々のスクリーニング
アッセイを用いて、OBレセプターの特異的リガンドを同
定する代替の方法を意図する。
本発明は、以下の実施例を参照してより良好に理解さ
れ得、実施例は、本発明の例示であり、そして限定する
ことを意図しない。
実施例セクション 以下は、本発明の例示である遺伝子物質を同定するた
めに使用する方法の概要を述べる。この努力は４つの連
続的な工程を含む:A）遺伝子地図作製、Ｂ）物理地図作
製、Ｃ）候補遺伝子単離、およびＤ）変異検出。目的の
マウス遺伝子が単離された（工程Ｄ）ことの確認の後、
相同なヒト遺伝子が捜され、そしてマウスおよびヒトの
両遺伝子および推定タンパク質が特徴付られた。この工
程は、さらに詳細に以下に要約される。
A.遺伝子地図作製 ob変異は遺伝的交雑で分離し、そして標準の連鎖分析を
用いて、RFLP（制限酵素断片長多型）に対する変異を位
置付けた。これらのデータは、OB遺伝子をマウス第６染
色体近位約5cMに置いた。（5cMは、100匹の動物当たり
の５つのみかけの遺伝的交差に相当する遺伝子距離の測
定値である。）全部で771の情報を与える減数分裂が生
じ、そしてその後の遺伝子地図作製（Friedmanら、199
1、同上）で用いられた。OBに対してマップされた遺伝
子座は、全て先に公開された。記載された最も近い２つ
のRFLPは、カルボキシペプチダーゼおよびmetガン遺伝
子由来のプローブにより定義された。
上記の実験の遺伝子解析は、原理的には、いずれの遺
伝子マーカーも強く連鎖しないので、obをクローン化す
るためには不適当であった。強く連鎖する必要とするRF
LPを同定するために、特別のプローブが単離され、そし
て遺伝的交雑を行った。公知の方法である染色体顕微解
剖を用いて、マウス第６染色体の近位からDNAのランダ
ムな小片を単離した［Baharyら、Mammalian Genome,4:5
11−515（1993）］。個々のクローン化プローブをobに
対する強い連鎖について試験した。これらの研究を基礎
にして、１つのプローブD6Rck13（psd3とも称せられ
る）を、OBに対するその遺伝的近接性によりさらなる解
析のために選択した。
このプローブを、種間および亜種間交雑由来の835のo
b子孫の遺伝子型決定のために用い、D6Rck13が、Bahary
らに報告されているように、835匹全ての動物において
非組換え体であることを示した。物理地図作製の過程
で、新規な多型マーカーを、YAC53A6由来のコスミドの
サブクローンから同定した。この新規マーカーは、D6Rc
k13とOB遺伝子との間に位置し、種間内交雑および戻し
交雑由来の別の771の情報を与える減数分裂の遺伝子型
決定のために用いた。１匹の動物＃167は、obとD6Rck39
との間の組換え交差を保有すると同定された。これらの
研究は、D6Rck39/D6Rck13がobから約0.06cMであること
を示した。別のプローブPax4は、obに0.12cM近接してい
たことが同定された。Pax4は２匹の動物（＃111および
＃420）で組換えられていた。Pax4は、Grussおよび共同
研究者により、マウス第６染色体近位に先にマップされ
た偽遺伝子である［Grussら、Genomics,11:424−434（1
991）］。これを基礎に、OB遺伝子は、Pax4とD6Rck13と
の間の約0.2cM間隔で存在すると決定された。これは、O
Bを単離する成果において介在DNAをクローンする成果を
導く。
B.物理地図作製 この間隔でのDNAのクローニングには、酵母人工染色
体（YAC）を使用した。YACは、比較的新しいクローニン
グベクターであり、しばしば長さが100万塩基対以上の
連続するDNAの長い鎖をクローニングし得る。
酵母人工染色体は、D6Rck13およびPax4を用いて単離
された。これは、精製DNAプローブを調製し、そして対
応するYACを単離するためにそれらを使用することによ
り達成された。これらのYAC（＃８、＃16、＃107、およ
び＃24）を単離し、そして最初に特徴付け、そして得ら
れた分析に基づき、YAC16は最も遠くまで、すなわちob
の最も近くまで伸びたYACであったと結論された。次い
で、YAC＃16の重要な末端を回収し、そしてこの末端がP
ax4よりobに近いと決定された。この末端を16M（＋）と
名付けた。このプローブは動物＃420においては（Pax4
と同様に）組換えられていなかったことが示されたの
で、この結果が得られた。この末端を配列決定し、そし
てPCRアッセイを開発するために用いた。このPCRアッセ
イを用いて、YACライブラリーをスクリーニングした。
４つの陽性のクローンを単離した。続いて、エンド−レ
スキュー法、制限地図作製、パルスフィールドゲル電気
泳動、および遺伝的交雑を用いるサザンブロットによる
これらのYACの特徴付けにより、これらのYACのうちの２
つaduおよびaadが、引き続く研究に重要であることを決
定した。YAC aadは、最も遠くまで伸びた550kBの非キメ
ラYACである。従って、このYAC、aad（pICL）の遠位末
端を用いて物理地図を完成した。YAC aduは370kbの非キ
メラYACであり、そしてその遠位末端adu（＋）は、動物
＃111および＃167を含む遺伝的交雑の全てのob子孫にお
いて非組換え体であることが決定され、OB遺伝子がこの
YACに存在することを示唆した。
これら２つの末端、aad（pICL）およびadu（＋）に対
するPCRアッセイを開発し、物理地図作製を続行するた
めに、さらにYACおよびP1クローンを単離するために用
いた。重要なP1クローンを、498、499、500（aad（pIC
L）由来のプローブを用いて単離された）、ならびに32
2、323、および324（adu（＋）由来のプローブを用い
て）を含むこの成果により単離した。
こうして、D6Rck13により単離されたYAC（53A6、25A
8、25A9、25A10）を特徴付けた。これらの研究により、
53A6がaad YACの近くの方向に最も遠くまで伸びること
が決定された。53A6とaadとの間のギャップのサイズ
は、約70kBであると決定された。次いで、53A6の重要な
末端である53（pICL）を用いて、３つの利用可能なYAC
ライブラリーおよびP1ライブラリーをスクリーニングし
た。重要なP1クローン、325を単離した。このP1クロー
ンは、上記のように、aad（pICL）により単離されたP1
クローンとオーバーラップし、そしてそれ故53（pICL）
とaad（pICL）の間のギャップを近づけるために供され
た。結果として、長さが約2.5百万塩基対のYACおよびP1
クローンを含み、そしてPax4、16M（＋）、adu（＋）、
aad（pICL）、53（pICL）、D6Rck39、およびD6Rck13に
達する全コンティグがクローン化された。動物＃111お
よび＃167における明らかな組換え部位を注意深くマッ
ピングすることにより、OBが400kB間隔で位置していた
と結論された。OB遺伝子を単離するために作用するDNA
の供給源を提供するために、この非組換え領域をカバー
する約500kBを合計24のP1クローンで単離した。これら
のP1クローンは、322および323を含み、それらは後に有
用なクローンであることが見い出され、エキソントラッ
ピングのために用いた。
OBを有する染色体の１部分の物理地図を図7Aに示す。
図7BはYAコンティグを示す。図7CはP1コンティグを示
す。
C.候補遺伝子の単離 この間隔にある遺伝子を単離するために用いた方法
は、エキソントラッピングである。この方法では、市販
のベクターを用い、試験構築物中に導入されたゲノムDN
Aにおける機能的なスプライスアクセプターおよびドナ
ー配列について選択することにより、エキソンDNA（す
なわち、コード配列）を同定した。これらのP1クローン
由来のDNAを増幅し、エキソントラッピングベクター中
にサブクローニングした。これらのクローンは、Bluesc
riptベクターにクローン化された短い挿入物であった。
各クローンを、挿入物に近接するプラスミド配列に対応
するPCRプライマーを用いてPCR増幅した。PCR増幅を、
プラスミドを有する細菌に対し直接行った。反応はBiom
ekロボットを用いてセットアップした。PCR産物は、臭
化エチジウムを含むTBE緩衝液中１％アガロースゲルで
電気泳動した。エキソントラッピング技術を改変し、P1
クローンから混入しているE.coli DNAを除去し、そして
大量の人工エキソンをスクリーニングした。人工エキソ
ンはトラップされた推定エキソンの80〜90％を超えた。
エキソントラッピングベクターは、HIV配列；この人工
産物に対応するこれらベクター配列の短いセグメントを
含む。
エキソントラッピング実験は種々のP1クローンを用い
て行った。次いで、エキソントラッピング産物をPCRに
より増幅し、選択し、そして配列決定した。推定「エキ
ソン」配列を、Blastコンピュータープログラムを用い
て、Genbankの配列と比較した。約15のエキソンを、さ
らなる実験のために、RT−PCR、ノーザン分析、および
対応するRNAまたは保存配列の存在についてのズーブロ
ット（zoo blot）により選択した。15の推定エキソンの
うち７つ、325−２、323−９、322−５、D1−F7、1H3、
および2G7が、RNA転写物をコードすることが見い出され
た。325−２は、精巣に特異的な遺伝子であり;323−８
および323−９は、主に脳および腎臓で発現される同じ
遺伝子由来の２つのエキソンのようである。IH3および3
22−５は、２つの低レベルの脳転写物を示す。D1−F7
は、先にクローン化された遺伝子であるイノシンモノホ
スフェートデヒドロゲナーゼ（IMPDH）由来のエキソン
で、偏在性発現パターンを有する。これらの遺伝子は、
いずれも、OBをコードしないようであった。OBエキソン
である2G7を以下でさらに説明する。
OB遺伝子をエキソントラップできなかった３回の結果
の後に、他の試みを、重要なOB領域由来の全てのP1から
のDNAをプールすることにより行った。これらは、以下
のP1を含む:258、259、322、323、324、325、498、49
9、500、653、655、およびその他。その後、258、260、
322、498、および499のP1をエキソントラッピングベク
ターにサブクローニングし、次にいくつかのプレート
を、推定エキソンを有していた細菌クローンで調製し
た。推定OB候補を示す約192のクローンを得た。上記の
ように、多くの単離物がベクター由来の２つのトラップ
されたエキソン含むことに一致する人工産物が観察され
た。従って、クローンは、それらのサイズによる、およ
びゲルのサザンブロット上の対応するバンドにハイブリ
ダイズするこの人工産物に対応するDNAプローブのハイ
ブリダイゼーションの事実による両方により同定され
た。この方法で、192クローンのうち185をさらなる評価
から除外した。結局、OBに対応するエキソンの排除に至
り得るので、サイズ単独を基礎にした人工産物を排除は
不可能であった。
従って、192のエキソンのうち、合計７つのエキソン
をさらなる研究のために選択した。７つのエキソンの配
列決定のための鋳型を調製し、そして配列決定を行っ
た。７つのエキソンの配列を分析し、そして７つが同一
であり、そして１つが明らかに人工産物であることが見
い出された。特に、クローン1D12は、「HIV配列」、す
なわち人工産物バンドを含んでいた。これは、さらなる
分析のために３つのエキソン:1F1、2G7、および1H3を残
した。1F1が重要領域の外側にマップされたので排除さ
れた。1H3および2G7の両方に対するPCRプライマーを選
択し、そして合成した。
2G7に関するエキソン配列を決定し、図10（配列番号
７）に示す。2G7に対するPCRプライマーを選択し、そし
て合成した。PCRプライマーに対応する配列部分に下線
を引く。用いたプライマーは以下のとおりである： 5'CCA GGG CAG GAA AAT GTG（Tm＝60.0℃） （配列番号:8） 3'CAT CCT GGA CTT TCT GGA TAG G（Tm＝60.0℃） （配列番号９） これらのプライマーは、以下のようなPCR条件でゲノ
ムDNAを増幅した：標準PCR緩衝液中、55℃で２分間のア
ニーリング、72℃で２分間の伸長、94℃で１分間の変性
の25〜30サイクル。これらのプライマーをまた、非放射
能dCTP量を対応して減少させ、PCR反応において、32P−
dCTPを含めることにより標識プローブを生成するために
用いた。
RT−PCRを種々の組織RNAについて行い、そして2G7が
試験された組織の中で白色脂肪において排他的に発現さ
れたと結論された（図11A）。その後、32Pで標識した2G
7を組織RNAのノーザンブロットとハイブリダイズし（図
11B）、そしてそのRNAが脂肪組織で高レベルで発現する
が、他の全ての組織（ここで、シグナルは、組織調製物
中に混入する脂肪の結果であり得る）においては、発現
されないか、または非常に低いレベルで発現されたこと
を示した。列挙された各組織由来の全RNAの10μｇを、
ホルムアルデヒドを含むアガロースゲルで電気泳動し
た。プローブを、標準ハイブリダイゼーション緩衝液Ra
pid Hybe（Amersham）中、65℃で、ブロットにハイブリ
ダイズさせた。RNAのサイズは約4.9kBであった。この時
点で、2G7はOBについての有効な候補遺伝子であると考
えられ、そしてさらに分析された。
D.変異検出。
2G7がOB遺伝子をコードしていたことを確認するため
に、野生型動物と比較して、変異体におけるこの遺伝子
のDNA配列のRNA発現のレベルの違いを示すことが必要で
あった。ob遺伝子の２つの別の変異（C57BL/6J ob/ob
（1J）およびCkc/Smj ob/ob（2J））が、研究に利用可
能である。これらは、以降1Jおよび2Jとそれぞれ呼ばれ
る。（非公式な命名を、研究されるマウス株を呼ぶため
に用いる。本明細書および図面では、C57BL/6Jは、C57B
L/6J ＋／＋を意味し;CKC/smjは、SM/Ckc−＋Dac−＋／
＋を意味し;CKC/smj ob/obは、SM/Ckc−＋Dac−ob2J/ob
2Jを意味することを理解されたい）。RNAは、1J、2J、
およびコントロール動物から単離された脂肪組織から調
製された。各試料由来の全RNAを、DNアーゼで処理し、
次いで、プライマーとしてのオリゴ−dT、および逆転写
酵素を用いて逆転写した。次いで、得られる１本鎖cDNA
を、下方のバンドについて2G7プライマー（上記の条
件）または上方のバンドについて市販のアクチンプライ
マーのいずれかを用いてPCR増幅した。RT−PCR産物を、
臭化エチジウムで染色した１％アガロースTBEゲルで泳
動した（図12a）。RT−PCRを用いて、2G7 mRNAが、1Jお
よび全ての他のコントロールマウスで発現されたが、そ
れは2Jマウスでは完全に見あたらなかったことが見い出
された。30サイクルの増幅後、シグナルは検出されなか
った。この実験は、2G7がOB遺伝子由来のエキソンに対
応する直接的な証拠を提供した。
2J変異は比較的最近であり、そして類似遺伝子型株と
して維持されているので、この結果は、2G7がOB遺伝子
由来のエキソンであることを示した最初に得られた証拠
であった。変異は、mRNA合成の全体的な停止に至るプロ
モーター領域に位置するようである。このRT−PCR実験
における1Jマウスにおけるシグナルの存在は、1JがRNA
試料のサイズに大きな変化を生じない点突然変異を有し
得ることを示唆した。さらに、RT−PCRにより試験され
た場合、2G7 mRNAは、４匹の追加の2J動物には存在しな
かった。
この結果は、ノーザンブロット上で確認された（図12
B）。脂肪細胞RNAを、各株（C571B/6J、1J、CKC/smj、
および2j）から調製した。これらのRNAの10μｇを泳動
してブロットした。このブロットは、PCR反応中に、32P
−dCTPを用いる物質、すなわち図11中のバンドの増幅に
より、PCR標識された2G7プローブで釣った。アクチン
は、付与されたRNAの量に対するコントロールである。
アクチンシグナルは、全ての試料中でほぼ同じである。
mRNAが脂肪細胞に特異的であるので、OBシグナルは脳で
は存在していない。
ノーザン分析の結果は、2G7特異的RNAが2Jマウスでは
存在していないことを確認した。この肥満型変異株にお
いては、RNAが作られないように遺伝子が破壊されてい
るので、ob RNAはCKC/smj ob/obマウスで存在していな
い。さらに、2G7 RNAのレベルは1Jおよびdb/db脂肪で
約10−20倍増加した。これらの結果は、OBが循環ホルモ
ンをコードしている、またはOBが体重を調整する脂肪細
胞からのシグナル発生の原因であるといういずれかの仮
説に適合する。これらの結果は、2G7がOB遺伝子である
という結論を支持し、そして1Jマウスが、点突然変異、
おそらく未成熟翻訳終止に至るナンセンス変異を有する
ことを予測した。
これらのノーザンの結果は、４つの異なる2J動物から
の脂肪細胞RNA調製物を用いても繰り返された（図1
3）。このアッセイでは、ap2は、図12Bのアクチンと全
く同様に、コントロールとして用いた脂肪特異的転写物
である。ap2バンドの変化する濃度には有意差はない。a
p2は、公開されたap2配列からPCRプライマーを設計する
ことにより標識された。次いで、脂肪細胞RNAのRT−PCR
産物は、PCR標識のための同じプロトコールを用いて再
度標識された。この分析は、正常の同型接合（homozygo
us）または異型接合（heterozygous）動物におけるOB m
RNAの存在、および2J変異体動物におけるその不在を示
す。
変異は、1Jマウスで同定された。変異はＣからＴへの
塩基の変化であり、それはアミノ酸108でアルギニンの
見かけ上未成熟終止コドンへの変化を生じ、そして、お
そらくこれがob mRNAの高レベル発現に反する1J変異
（図14）の原因である（図12および13、C57BL/6J ob/ob
レーン参照）。
さらに最近では、サザンブロットを用いて、2J変異
が、RNA発現を完全になくするように見えるOBの5'末端
で検出可能なDNA変化の結果であると結論された。この
可能な再配置の正確な性質は、決定されるべきままであ
る。
４つの異なる制限エンドヌクレアーゼを用いて、CKC/
smj（SM/Ckc−＋Dac）およびC57BL/6Jマウス由来のDNA
のゲノムサザンブロットを、変異obが独特なフラグメン
トパターンを生じるかどうかを決定するために行った
（図15A）。約10μｇのDNA（肝臓、腎臓、または脾臓か
ら調製されたゲノムDNA由来）を、示された制限酵素で
切断した。次いで、DNAを１％アガロースTBEゲルで電気
泳動した。DNAをイモビロン（imobilon）膜にトランス
ファーし、PCR標識2G7プローブにハイブリダイズした。
重要なバンドは、CKC/smj ob/ob（SM/Ckc−＋Dac ob2J/
ob2J）DNAのBgl II消化物中の一番上のバンドである。
このバンドは、他の株におけるより分子量が大きく、こ
の株における変異を示している。
図15Bは、ob2J/＋×ob2J/＋交雑の子孫由来のゲノムD
NAのBgl II消化物のサザンブロットである。いくつかの
DNAは、上方のバンドのみを有し、いくつかは下方のバ
ンドのみを有し、そしていくかは両方のバンドを有す
る。上方のバンドのみを有する動物は、アロ型の肥満型
（allo−obese）、すなわちob2J/ob2Jである。これらの
データは、図15Aに示される多型（すなわち、変異）が
遺伝的意味で（in a genetic sense）分離することを示
す。
実施例1:OBのcDNAクローニングおよび配列決定 標識2G7PCRプローブを用いて、マウス脂肪細胞λgt11
cDNAライブラリー（Swissマウスの睾丸の脂肪パッド由
来のClonetech 5'−STRETCH cDNA、＃ML3005b）からの
合計50のマウスcDNAクローン、およびヒト脂肪細胞λgt
10cDNAライブラリー（腹部由来のClonetech 5'−STRETC
H cDNA、＃HL1108a）からの30のクロスハイブリダイズ
するヒトcDNAクローンを単離した。ライブラリーのスク
リーニングは、プラークリフト手順を用いて行った。プ
ラークリフトからのフィルターを、オートクレーブ法を
用いて変性した。フィルターをPCR標識2G7プローブを用
いて２重（duplicate）ハイブリダイズした（Rapid Hyb
e緩衝液、65℃、一晩）。２〜４時間のプレハイブリダ
イゼーションの後、フィルターを２×SSC、２％SDS中、
65℃で30分間２回洗浄し、そしてｘ線フィルムに感光さ
せた。２重陽性についてプラーク精製した。プラーク精
製したファージを、市販のベクタープライマー、例え
ば、λgt10およびλgt11を用いて増幅した。得られたPC
R産物は、いずれかの末端に小量のベクター配列を有す
る各ファージについてのcDNA挿入物に対応した。バンド
をゲル精製し、そしてABI自動シークエンサーおよびDNA
ポリメラーゼをプローブするためのベクタープライマー
を用いて配列決定した。
次いで、生の配列データは、コンピュータープログラ
ムに由来する誤りを正すために手動で塩基毎に調べた。
正しい配列が利用可能になったので、下流のプライマー
を合成し、配列決定を継続するために用いた。各利用可
能なcDNAクローンが配列決定され、コンティグに合成さ
れるまで、このような実験を繰り返した。現在までのと
ころ、mRNAの5'末端から約3000塩基対が蓄積された。cD
NAクローンの１つは、mRNAの5'末端まで伸長しており、
その配列は脂肪組織RNAの5'RACE産物の配列と同一であ
った（データは示さない）。
配列データは、167アミノ酸のオープンリーディング
フレームが存在することを示した（図１）。Kozak翻訳
開始共通配列は、ATGの３塩基上流のアデノシン残基で
存在した。cDNAの２つのクラスは、１つのグルタミンコ
ドンを含むまたは含まないで異なることが見い出され
た。この残基は、2G7エキソンのスプライスアクセプタ
ーに対して3'側直ぐ近くに位置することが見い出されて
いる。グルタミンのCAGコドンは可能なAGスプライスア
クセプター配列を含むので、下記のようなcDNAのサブセ
ットにおいて見かけ上３塩基対欠失しているスプライス
アクセプター部位でのずれが存在しているようである。
上記の配列の「ag」は、グルタミンコドンの上流の推
定されたイントロン配列に相当し、そしてAGは推定のオ
ルタナティブスプライス部位である。このグルタミン残
基は分子の高度に保存された領域に位置し、そして生物
学的活性についてのその重要性は、未だに知られていな
い。
推定のＮ末端シグナル配列が検出され、そのシグナル
切断部位は、アミノ酸位置21のアラニン残基のカルボキ
シル末端にあると推測される。この推定のシグナル配列
は、von Heijneの方法によるコンピューターアルゴリズ
ムの適用により確認された。この技術を用いて、最も確
からしいシグナル配列はアミノ酸１〜23に相当するポリ
ペプチドコード領域で同定され、以下の配列を有する： MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQA↑VP（配列番号10） ここで、矢印は、推定のシグナル配列切断部位を示す。
アミノ酸配列の残りの部分は非常に親水性であり、そし
て任意の注目すべき構造モチーフまたはＮ末端シグナル
配列以外の膜に達するドメインを有さなかった。特に、
本発明者らは、Ｎ結合型グリコシル化に関する、または
推定のプロセッシングされたタンパク質中のタンパク質
切断を示唆する二塩基性アミノ酸配列の共通配列を（Sa
batiniら、The metabolic basis of inherited diseas
e,pp.177−223,C.V.Scriverら編、McGraw−Hill,New Yo
rk）見出せなかった。BlastおよびBlockプログラムを用
いたデータベース検索は、任意の相同性配列を同定しな
かった。
ヒト脂肪組織RNAをノーザンブロットで分析し、マウ
スob遺伝子と同様のサイズのRNA種を検出した。cDNAク
ローンの配列決定および分析は、ヒトOBがまた、167ア
ミノ酸ポリペプチドをコードすることを示した（図2Aお
よびＢ、図３）。３塩基対の欠失を有するかまたは有さ
ない２つのcDNAクラスが、同様にヒトで見い出された
（図６）。マウスおよびヒトOB遺伝子は、推定のコード
領域において高度に相同性であるが、得られた3'および
5'の非翻訳領域で30％だけの相同性を有する。Ｎ末端シ
グナル配列はまた、ヒトOBポリペプチド中に存在してい
た。ヒトおよびマウスOBポリペプチド配列の比較によ
り、２つの分子はアミノ酸レベルで全体で83％の同一性
を有することを示した（図４）。両方の種由来の成熟タ
ンパク質のＮ末端は、Ｎ末端の100アミノ酸残基のうち
６つの保存および３つの非保存アミノ酸置換だけを有し
て、より高い相同性を共有する。
ゲノムDNAを、マウス、ラット、ウサギ、ハタネズ
ミ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヒト、ニワトリ、ウナ
ギ、およびショウジョウバエから単離し、EcoR1で制限
切断した。切断物を１％アガロースTBEゲルで電気泳動
した。次いで、DNAをイモビロン膜にトランスファー
し、そしてPCR標識2G7プローブで釣った。このフィルタ
ーを、65℃でハイブリダイズし、そして20分間の各洗浄
につき、65℃で、２×SSC、0.2％SDSで２回洗浄した
（すなわち、緩衝液を２回変えた）。これらのデータ
は、OBが脊椎動物間で保存されていることを示した（図
16）。この観点から、ウナギDNAに２＋のシグナルがあ
ること；ウナギは魚であることに留意。
要約すると、得られた証拠は、体重および脂肪症が生
理学的に制御されることを示唆する。７年前、この系の
２つの重要な成分（OBおよびDB遺伝子）を同定する努力
を開始した。この実施例に示すように、OB遺伝子は、今
や、体重を調節する重要な役割を果たす脂肪特異的遺伝
子として同定された。この遺伝子の産物は、分泌ホルモ
ンである可能性が最も高く、ヒトおよびヒト以外の動物
における栄養障害の診断および処置のための重要な用途
を有し得る。
実施例2:細菌におけるOBの発現 obをコードしているマウスおよびヒトの両方のcDNA
を、pET−15b発現ベクター（Novagen）にクローン化し
た。このベクターは、lacオペレーターとともにT7プロ
モーターを含み、そしてヒスチジンtag（His−tag）お
よびコード配列挿入部位の直ぐ上流のトロンビン切断部
位（図17）（配列番号11および12）を含む融合タンパク
質を発現する。
マウスおよびヒトcDNAを、シグナル配列の末端のアラ
ニンをNde I部位に変えるように改変した。これは、別
の配列が3'領域において存在していたからである。Nde
I部位の挿入は、以下の新規なプライマーを用いるPCRを
用いて達成された： プライマーは、PCRフラグメントの各末端にNde I制限
部位を導入する、中央に６塩基対のミスマッチを含む。
マウスまたはヒトcDNAのいずれかを有するファージを、
これらのプライマーを用いてPCR増幅した。PCR産物をNd
e Iで切断し、１％低融点アガロースゲルでゲル精製し
た。ゲル精製したバンドをpETベクターにサブクローニ
ングした。得られるプラスミドを配列決定し、変異がク
ローニングのPCR増幅工程の間に導入されないことを確
実にした。グルタミン49をコードする、およびグルタミ
ン49を欠失するヒトおよびマウスcDNAの構築物を調製し
た。特に、ヒトまたはマウスいずれかのOBコード配列を
含み、シグナル配列がなく、そしてHis−tagと融合した
pET 15b構築物を、PCRクローニング法を用いて作成し
た。この構築物は、配列の誤りがPCR増幅工程の間にOB
遺伝子のコード領域に導入されていないことを確認する
ために配列決定した。
２つの得られたプラスミド構築物であるpETM9およびp
ETH14を細菌発現宿主をトランスフォームするために選
択した。最適条件下で1mM IPTGを用いた誘導に際し、ト
ランスフォームされた細菌は、100−300μg/mlのOB融合
物を生産し得た。大部分のOB融合タンパク質が封入体で
見い出された。6Mグアニジン−HClまたは尿素を用いた
可溶化の後、融合タンパク質は、His結合（Ni−キレー
ト化）樹脂カラムを通して精製された。OB融合タンパク
質のカラム精製のための条件（結合、洗浄、および溶出
を含む）は、実験的に確立された。OB融合タンパク質
は、5mMイミダゾール/6Mグアニジン−HClで樹脂に結合
し、そして20mMまでのイミダゾール/6Mグアニジン−HCl
で結合したままである。タンパク質は、樹脂から60mMイ
ミダゾール/6Mグアニジンで溶出し得る（図18A、Ｂ）。
精製ヒトおよびマウスの両OB融合タンパク質を、PBS中
でさらに透析し、調製物からグアニジン−HClを除去
し、次いでポリクローナル抗体を惹起するために用い
た。
融合タンパク質産物の生物学的活性を試験するため
に、精製タンパク質の再フォールディング条件を試験し
そして開発した。これは、1Mグアニジン溶液中で融合タ
ンパク質を最初に透析し、次いで0.4Mアルギニン溶液を
用いて希釈することを含む。His−tagを、生物学的機能
をアッセイする前に、融合タンパク質から除去した。ta
gの除去は、ヒト胎盤由来のトロンビンで融合タンパク
質を処理することにより達成された。
さらに、シグナル配列のないヒトおよびマウスOB遺伝
子コード配列を、PCRクローニング法を用いてpET12cベ
クターにそれぞれ挿入した。これらの構築物は、細菌宿
主細胞の周辺腔（periplasmic space）に合成したOB融
合タンパク質を指向し得る。周辺腔から回収したOB融合
タンパク質は、他の宿主タンパク質から精製するために
簡単なゲル濾過を必要とするだけで、そしてこのような
プロセスの間変性されない。
実施例3:OBポリペプチドに対する抗体の調製 ポリクローナル抗体を生成するために組換えタンパク
質を用いることに加えて、論理的に推理されたマウスOB
配列由来の４種のペプチド配列のセットを、免疫原性プ
ロットソフトウエア（GCG Package）を用いて同定し
た。４つのカルボキシ末端ペプチドフラグメントは以下
の通りである： これらのペプチドは、KLHと結合し、そしてこのペプ
チド−KLH結合体を用いて、標準的技術を用いてウサギ
を免疫した。各ペプチドに特異的なポリクローナル抗血
清をウサギから回収する。
実施例4:OBポリペプチドのインビトロ転移 機能的シグナル配列の存在を確認するために、オープ
ンリーディングフレーム全体を含むヒトcDNAをpGEMベク
ターにサブクローニングした。この実験にはヒトcDNAの
みを用いた。なぜなら、適切なマウスサブクローンは回
収されなかったからである。ポジティブ鎖であるヒトob
RNAをSp6ポリメラーゼを用いて転写し、イヌ膵臓ミク
ロソーム膜を伴ってまたは伴わずにインビトロ翻訳反応
に用いた。一次翻訳産物は、約18kD（これは、cDNA配列
から予想された分子量と一致する）の見かけの分子量で
移動した。ミクロソーム膜を反応物中に含有することに
より翻訳の全体的な効率が約５倍阻害された。それにも
関わらず、約50〜70％のOBの一次翻訳産物は、膜調製物
の存在下では約2kDに短縮された。このことは、シグナ
ル配列が機能的であることを示唆する（図19A）。イン
ターロイキン−１αRNA（これはシグナル配列をコード
しない）の一次翻訳産物のサイズは、反応物にミクロソ
ーム膜が含まれない場合には、変化しなかった。OBタン
パク質の転移（translocation）が起こったことを確認
するために、インビトロ翻訳産物をプロティナーゼ−Ｋ
で処理した。プロテアーゼ処理の結果、18kDの一次翻訳
産物は完全にタンパク質分解されたが、16kDのプロセス
された形態は酵素処理により影響を受けなかった。この
ことは、それがミクロソームの内腔へ転移したことを示
す（図19B）。これらのデータは、OBが分泌された分子
であるという仮説に適合する。
シグナル配列の開裂後、２つのシステイン残基が予想
されたタンパク質中に残り、この分子が他の分泌ポリペ
プチドの特徴であるジスルフィド結合を含む可能性を高
めた［Shenら、Science,224:168−171（1984）］。
実施例5:OB遺伝子の特徴付け ヒトにおける肥満症とOB遺伝子内の遺伝的改変との関
係を確証するために、ヒトOB遺伝子の配列を決定した
（図20A〜20C）（配列番号22および24）。ヒトコード配
列由来の特定のプライマーを用いてヒトP1ライブラリー
をスクリーニングした。３つの異なるP1クローンを入手
し、増殖させ、そして第１コードエキソンと第２コード
エキソンとの間のスプライシング部位に隣接するプライ
マーを用いてPCR増幅を行った。約2kbの全イントロン領
域を増幅し、部分的に配列決定した（図20A参照；およ
び配列番号22および24に示す）。
マウス遺伝子およびヒト遺伝子の両方の遺伝子構造
を、PCRアッセイおよび他の標準的技術を用いて特徴付
けた。マウスOB遺伝子は、３つのエキソンからなること
が見出され、第２および第３のエキソンがコード配列を
占める（図20D）。ヒトOB遺伝子のコード領域は、同じ
構造を有する；しかし、ヒト遺伝子は5'エキソンおよび
イントロンを欠いている（図20E）。
ヒト遺伝子のイントロン配列から生成された２セット
のプライマーを調製した（図20A〜Ｃ）。プライマーの
配列は以下の通りである（ＦおよびＲはそれぞれフォワ
ードおよびリバースを表す）： DNAサンプルを種々の供給源から入手し、そしてこれ
らのプライマーのセットを用いて深刻な肥満の人由来の
ヒトゲノムDNAを増幅させた。このPCR産物を低融点アガ
ロースゲル上で流し、バンドを切り出してアガラーゼ
（agarase）で消化した。ABI 373A DNAシークエンサー
およびTaqジデオキシターミネーターキット（ABI,Perki
n−Elmer）を用いてその配列を得た。患者サンプル由来
のob遺伝子内に１点変異が現在までに検出された。この
変異は第１エキソン内にあり、アミノ酸配列を変化させ
ない。予備データは、別の患者の第１エキソン内に挿入
配列が存在し得ることを示す。Taq DNAポリメラーゼの
代わりにSequenaseを用いる異なる自動化された配列決
定法が、変異検出のためにより容易に読める配列を得る
ために用いられ得る。
実施例6:酵母におけるOBの発現 OBのポジショナルクローニングに続き、OBタンパク質
が食物の摂取量および体重を減少させる生理学的メカニ
ズムを明らかにすることが重要になった。この方針の第
１段階は、発現系を用いて機能的タンパク質を組換えに
よって産生させることであった。細菌の発現系が好結果
であることに加えて、酵母の発現系もまた選択された。
酵母発現は、OBの発現のためにいくつかの魅力的な特徴
を有する。最も重要なのは、生物学的に活性な真核生物
のタンパク質が産生されやすいということである。OBポ
リペプチドは哺乳動物細胞によって分泌される。タンパ
ク質の分泌は全ての真核生物について非常に類似してい
る。このことは、細菌の分泌経路が似ているよりずっと
酵母の分泌器官が哺乳動物の分泌経路に似ていることを
意味する。特に、哺乳動物細胞で見られるOBのタンパク
質改変は、酵母の分泌系を通じての発現においてもよく
見られる。さらに、タンパク質のフォールディングは分
泌器官を通過中に行われ、従って酵母の分泌器官を介し
てobを送達することは、天然の生物学的活性を有する適
切にフォールディングしたタンパク質を生じやすい。こ
のことは、２つのシステイン残基がジスルフィド結合を
形成し得るのでOBについて著しい。分泌経路とは対照的
に、細胞の細胞質の還元環境は、ジスルフィド結合の形
成を妨げる；従って、インビボでこのジスルフィド結合
が形成されるためにはOBが分泌経路を通過することが必
須である。他の利点は、酵母の操作の簡便性と迅速性、
ベクターおよび株の利用性、ならびに酵母の組換え技術
の膨大な経験に関係する。
Pichia pastoris発現系を以下の４つの理由により選
択した：（１）それが他の酵母の系（例えば、S.cerevi
siae）より高レベルの異種タンパク質の発現を有する；
（２）P.pastorisにおけるタンパク質のグリコシル化が
S.cerevisiaeにおいてより哺乳動物の系に類似している
（もっとも、コンピューターサーチを用いてグリコシル
化部位をobにおいて検出したのではないが、認識されて
いない部位でのグリコシル化の可能性はまだ残ってい
る）；（３）P.pastorisは、天然にはほとんどタンパク
質を分泌しない、従って、一般に発現した外来タンパク
質を精製することが容易である；そして（４）ベクター
および酵母の株が市販されている（Invitrogenから）。
図21および22に酵母発現ベクターを生成する２つのスト
ラテジーを示す。
選択されたベクターはpPIC.9であった。このベクター
は、α−接合因子（α−mating factor）プレプロコー
ド配列のすぐ下流のクローニング部位を含む。この配列
は、分泌経路によって分泌されるクローニング部位にク
ローン化された遺伝子によってコードされるタンパク質
を支配する。このベクターの別の重要な特徴はHIS4遺伝
子である。この遺伝子は、このベクターによって酵母を
トランスフォームした後、ヒスチジン欠損培地で増殖さ
せた酵母の栄養要求性株を用いてこのベクターの取り込
みに関して選択を可能にする。クローニングのストラテ
ジーは以下の通りであった:OBcDNAを5'プライマーを用
いてPCR増幅する。このプライマーは、3'末端部に、予
想されるリーダーペプチド開裂部位のすぐ後ろのOB配列
と相補的な配列を、そしてそのほぼ5'末端部にはベクタ
ーのα−接合因子配列の3'末端部に相補的な配列を含
む。この5'プライマーはまたXho I部位も含む。3'プラ
イマーは、その3'末端部にOBの最後の数個のアミノ酸に
相補的な配列を、その5'末端部にはEcoR I部位を有する
ように設計された。PCR増幅の後、このPCR産物をXho I
およびEcoR Iで消化して同様に消化したpPIC.9にクロー
ニングした。マウスおよびヒトの両OB cDNAをクローニ
ングした後（各々、コドン49位にグルタミンを有するも
のおよび有さないもの）、個々のクローンを４つの構築
物全てについて単離し、配列決定して構築物が正しい方
向、およびフレームにクローニングされたこと、および
PCR増幅工程に由来する変異を含まないことを立証し
た。正しい配列を有するクローンの同定後、これらをP.
pastoris GS115株（ヒスチジン要求株）にトランスフォ
ームした。
２つのマウスOB構築物に関して、トランスフォームさ
れた酵母クローンをタンパク質の発現に関してスクリー
ニングした。トランスフォームされた酵母はOBを含むと
いう証拠として、DNAドット−ブロットアッセイおよび
コロニーハイブリダイゼーションアッセイを行った。こ
れらはどちらもOB配列がトランスフォームされた酵母内
にはあるが、トランスフォームされていない酵母内には
ないことを示した。さらに、トランスフォームされた酵
母は今では16kDaのタンパク質を培養培地に分泌した
が、トランスフォームされていない酵母はこのサイズの
タンパク質を分泌しない（図23A）。これはOBの予想さ
れたサイズである。OBの高い発現体である両方のマウス
の構築物の個々のクローンを同定した。現在、obを均一
に精製するための精製ストラテジーが開発されている。
１つのストラテジーは、OBをカチオン交換カラムで精製
することである（図23B）；予備データは、強いカチオ
ン交換体が有用であり得ることを示唆している。しか
し、カチオン交換クロマトグラフィー後、推定されるob
産物は失われている。このことは、サンプル中のプロテ
アーゼの存在を示す。
この問題を克服する１つのストラテジーは、酵母にお
ける発現のためにob−His−tag融合物を調製することで
ある（図22）。さらなる評価は、His−tagを持たないOB
がNi−キレート化カラムにしっかりと結合していること
を示した。Ni−キレート化とそれに続くゲル濾過による
OBポリペプチドの精製は、質量分析法に十分な純度の産
物を生じた。質量分析は、発現されたタンパク質の分子
量が予想した分子量と同じであることを裏付け、このこ
とはOBがPichiaにおいて成功裡に発現されたことを強く
確証する。
しかし、Ni−キレート化／ゲル濾過精製プロトコル
は、OBポリペプチドを十分に純粋な形態で生じない。別
の小分子が存在する。タンパク質分解活性はNi−キレー
ト化カラムからの排除体積に溶出するようである。従っ
て、３工程の精製プロセスを計画する:Ni−キレート
化、続いてカチオン交換（これは小分子混入物を除
く）、その後ゲル濾過。
SDS−PAGEゲルのクマシーブルー染色による推定発現
レベルは、酵母が振とうフラスコ内で増殖された場合に
は、約10mg/lであることを示す。これらのレベルは発酵
容器内で増加することが期待され、そして本発明者らは
より多量のタンパク質を得るという希望を持って発酵を
開始しようとしている。ヒトOB構築物に関しては、高コ
ピー数のOB遺伝子を含むトランスフォームされた酵母の
クローンが同定され、それらはOBタンパク質を発現する
ことが予想される。抗体が開発されれば、分泌された16
kDaのタンパク質の独自性（identity）の確認のために
それらが用いられるであろう。
実施例7:細菌におけるOb融合ペプチドの高レベルの発現 フリーザー貯蔵物の調製： 炭素供給源を含まない滅菌されたM9ZB培地の２つの4m
lアリコートのそれぞれに、40μｌのストックデキスト
ロース（0.4g/ml、フィルター滅菌済み）、10μｌのア
ンピシリンストック（200mg/ml）、および５μｌのクロ
ラムフェニコールストック（34mg/ml、エタノール中）
を添加した。それらに、Novagen pET−14bベクター内に
クローン化されたマウスおよびヒトOB1 DNAを有するE.c
oliの単一のコロニーそれぞれを用いてこれらを接種し
た。チューブを37℃で一晩インキュベートした。
一晩培養した培養物0.5mlを用いて、デキスロース、
アンピシリン、およびクロラムフェニコールを含む50ml
のM9ZB培地に接種した。これらを30℃でインキュベート
して600nmでの吸光度（A600）を定期的にモニターし
た。A600が約１〜1.2の時点で、175μｌの培養物のアリ
コートを2mlのエッペンドルフチューブ内で25μｌの60
％グリセロールと混合し、液体窒素中で瞬間凍結し−80
℃で保存した。
培養物の増殖： 0.5mlの40％デキストロース、125μｌのアンピシリン
ストックおよび50μｌのクロラムフェニコールストック
を含む50mlのM9ZB培地に1mlの凍結ストックを接種して3
0℃でインキュベートした。A600が１〜1.2の時点で、こ
の培養物10mlを用いて、デキストロース、アンピシリン
およびクロラムフェニコールを含む500mlのM9ZB培地の
入った2Lのフラスコ４本に接種した。これらを、A600が
約１〜1.2の時点で最終濃度0.5mMのIPTGを用いた誘導ま
で30℃でインキュベートした。培養物を一晩インキュベ
ートした。細胞を4000rpmで20分間遠心分離して回収し
た。この発現系は全タンパク質のかなり高い割合（グラ
ム/1リットルE.coliのオーダーで）として組換えOBポリ
ペプチドを生じる。
細胞溶解および封入体の再懸濁： 細胞ペーストを最少容量の20mM HEPES,pH7.2、10％グ
リセロール、0.1M KCl、5mM MgCl2、１％アプロチニ
ン、1mM PMSF、５μg/mlロイペプチン、および50μg/ml
DNase Iに再懸濁した。懸濁物を液体窒素および温湯を
用いて凍結融解を３度行った。溶解した細胞を18000rpm
で30分間遠心分離して、20mM HEPES,pH7.5、0.1M NaCl
に再懸濁した。懸濁物を超音波処理してTriton X100を
最終濃度２％になるように添加した。これを18000rpmで
15分間遠心分離した。このサイクルをさらに２回行った
後、Tritonなしで３サイクル洗浄した。最後に、ペレッ
トを、超音波処理およびそれに続く遠心分離により6M G
dHCl（グアニジン−HCl）、20mM HEPES,pH7.5に溶解し
た。上清をさらなる精製に用いた。
フォールディングされていない状態のOBタンパク質を
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー
（IMAC）により精製した。５カラム容量の50mM NiSO4で
帯電させて6M GdHCl、20mM HEPES,pH7.5で平衡化したPh
armacia chelating fast flow sepharoseの40mlカラム
に溶液をかけた。このカラムを6M GdHCl、30mMイミダゾ
ール、20mM HEPES,pH7.5で洗浄した。最後に、タンパク
質を0.2Mイミダゾールを含む同じ緩衝液で溶出した。6M
GdHCl中のフォールディングされていないタンパク質
を、酢酸ナトリウム（NaAc）を10mMまで添加してpHを酢
酸で約4.5に調整した後、４℃で保存した。
タンパク質の再フォールディングおよび精製： 100mgのタンパク質を含む6M GdHCl溶液を、67μｌの1
Mジチオスレイトール（DTT）で処理し、そして6M GdHC
l、10mM NaAc,pH4.5で約67mlまで希釈した。それを室温
で約１時間撹拌した。それを撹拌しながら4Lの20％グリ
セロール、2.5mM CaCl2、20mM Tris,pH8.4緩衝液に希釈
した。適切に混合した後、この溶液をさらには撹拌せず
に室温に約８時間おいた。次いで、2000単位の精製ウシ
トロンビン（Parke−Davis製品のthrombostat由来）を
添加し、そしてこの溶液を緩やかに撹拌しながら放置し
た。2.5時間後、2000単位のトロンビンを再度投与し、
ヒスチジン−tagの開裂をさらに３時間続けた。トロン
ビンの開裂はPMSFを最終濃度0.1mMまで添加することに
より停止させた。この溶液を濾過して４℃で保存した。
開裂したタンパク質を、1M KCl、20％グリセロール、
20mM HEPES,pH8.4緩衝液で平衡化した上記と同じIMACカ
ラムでさらに精製した。タンパク質溶液をロード後、そ
れを同じ緩衝液で洗浄し、そして開裂したタンパク質を
1M KCl、20％グリセロール、40mMイミダゾール、20mM H
EPES,pH8.4で溶出した。開裂しなかったタンパク質を0.
2Mイミダゾールで溶出した。
精製された開裂タンパク質を濃縮し、50〜100mMのEDT
A、10mMフェリシアン化カリウムで処理して（全ての不
完全な酸化を完全にするため）、superdex 75 16/60カ
ラムでゲル濾過した。この手順を用いた収率は出発ペプ
チドの約50％に近づいた。
一旦精製されると、発現されたタンパク質はいくつか
の方法によって特徴付けられた。物理的な特徴付けは、
構造の均一性を決定するための動的光散乱を含み、そし
て適切なフォールディングの尺度として用いられる。光
散乱データは、ヒトOBポリペプチドは、主に、または専
らモノマーとして発現され、一方、マウスOBポリペプチ
ドは、ダイマーならびにモノマーとして見出され得るこ
とを示した。
Ellman試薬および質量分析法を用いるアッセイは、シ
ステイン残基がタンパク質内でジスルフィド結合を形成
することを確証した。このポリペプチドの酸化型は以下
のようにマウスに投与され、そして生物学的活性を示し
た。
円偏光二色性を用いてこのタンパク質の構造的な形状
を概略で決定した。生理学的緩衝液（pH約８、およそ生
理学的イオン強度）中のCDスペクトルは、ヒトOBポリペ
プチドが約60％のαヘリックス構造および約40％のラン
ダムコイル構造を有することを示す。マウスOBポリペプ
チドは、CD分光学により約50％のαヘリックスおよび50
％のランダムコイルを有することが見出された。
制限タンパク質分解に続く質量分析（Cohenら、199
5、前出）を用いて、タンパク質分解の影響を受けやす
いOBポリペプチドの部分を同定した。この分析はアミノ
酸残基54位〜60位の可動性ループ構造の存在を示した
（図４に図示）。この可動性ループは定義された２゜の
構造（例えば、α−ヘリックス）の２つのドメインに結
合しているようである。
重要なことは、次の実施例で示すように、精製された
タンパク質の生物学的活性を、そのタンパク質を痩身型
齧歯類および肥満型齧歯類の両方に浸透圧ポンプ（例え
ば、Alza Corporation,Palo Alto,CAのALZET浸透圧ポン
プ）を介して投与することにより、または少なくとも２
週間にわたって毎日腹腔内にボーラス投与することによ
りアッセイし、そして摂食行動および体重に及ぼす影響
を観察した。
実施例8:OBポリペプチド（レプチン）の体重減少効果 マウスOB遺伝子座の遺伝子産物は、体重調節に重要な
役割を果たす。この実施例は、マウス、ラット、および
ヒト血漿においてOBタンパク質が循環していることを立
証する。３つの全ての種における循環形態は、SDS−PAG
Eによるとシグナル配列を持たない推定ポリペプチド配
列と同じ分子量を有する。このことは、インビボではこ
のタンパク質がシグナル配列を開裂した後でプロセスさ
れないことを示す。OBタンパク質はC57/B16J ob/obマウ
ス由来の血漿には存在せず、コントロールと比較してdb
/dbマウスの血漿中には10倍高い濃度で存在し、fa/faラ
ットの血漿中には20倍高いレベルで存在した。これらの
肥満動物変異体はOBの効果に耐性であることが示唆され
る。６人の痩身型ヒト被検者の群内でOBタンパク質の血
漿レベルに７倍の差があった。組換えマウスOBタンパク
質の毎日の注射は、ob/obマウスの体重を劇的に減少さ
せ、野生型マウスの体重に対して有意な効果を有した
が、db/dbマウスに対しては影響を示さなかった。これ
らのデータは、OB遺伝子座の遺伝子産物が体重調節のた
めの内分泌機能を提供することを示唆する。
材料および方法 ウサギをフロイントアジュバント（HRP,Inc.）中の組
換えタンパク質で免疫した。免疫精製された抗マウスOB
抗体を、記載されたように組換えタンパク質に結合させ
たsepharose 4Bカラムに抗血清を通過させることにより
調製した［Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manua
l,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring
Harbor,（NY1988）］。マウス血漿の免疫沈降を次のよ
うに行った：約2.5mMのEDTAを含むマウス、ラット、お
よびヒト由来の血漿0.5mlを、結合していないsepharose
−4Bと揺り動かしながら室温で２時間予め明澄化（pre
−cleared）した。スピンによりsepharoseを取り出し、
アフィニティー精製した抗体を1mg/mlのパックされたse
pharoseの濃度で含む抗体結合sepharoseの50％スラリー
50mlを添加した。1/2mlの２×RIPA緩衝液を添加して最
終結合条件を次のようにした:50mM Tris−HCl,pH7.5、1
00mM NaCl、１％ NP−40、0.1％ SDS、0.5％デオキシコ
ール酸ナトリウム、および0.025％アジ化ナトリウム。
反応を揺らしながら４℃で一晩行った。抗体結合sephar
oseをRIPA緩衝液を用いて８回洗浄し、続いて、PBSを用
いて３回濯ぎ、15％のSDS−PAGE上で泳動した。タンパ
ク質をニトロセルロースフィルターに移し、組換えタン
パク質に対するビオチン化した免疫精製抗体でウエスタ
ンブロットした。用いた二次抗体はHRP−ストレプトア
ビジンであり、ECLを検出に用いた。
マウス血清中のOBの量を定量するために、再びフォー
ルディングした（refolded）組換えマウスOBタンパク質
の量を増加させて（0.01、0.1、0.5、2.0、15.0ng）100
λのC57BL/6J ob/ob血漿に添加し、protein A sepharos
eに結合した抗体と共に４℃で３時間インキュベートし
た。緩衝液Ａ（10mMリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.4;100
mM NaCl;1％ Triton X−100、5mM EDTA、1mM PMSF）に
よる多数回の洗浄の後、サンプルをサンプル緩衝液に再
懸濁し、15％SDS−PAGEにロードして、ニトロセルロー
スメンブレンに移した。免疫精製ビオチン化抗アミノ末
端抗体を一次抗体として、HRP−ストレプトアビジンを
二次抗体として用いてウエスタンブロットを行い、続い
てECL検出を行った。
細胞質抽出物は脂肪組織をNDS緩衝液（10mM Tris,pH
7.5、10mM NaCl、60mM ICCI、0.15mMスペルミン、0.5mM
スペルミジン、14mM β−メルカプトエタノール、0.5mM
EGTA、2mM EDTA、0.5％ NP−40）中でpolytronおよびd
ounceホモジナイゼーションによってホモジナイズする
ことにより調製し、そして核の除去は700gでの遠心分離
によって行った。
免疫沈降は、免疫精製抗ヒトOB抗体を用いたこと以外
は、上記のように行った。ELISAに関しては、免疫精製
抗ヒトOB抗体の1mg/ml溶液100mlをホウ酸緩衝PBS溶液に
溶解し、マイクロタイター（Corning cat.＃2595）プレ
ートに入れ一晩４℃でおいた。次いで、このプレートを
0.05％Tween20を含むホウ酸生理食塩水溶液で４回洗浄
し、余分な液体を除いた。プレートを室温で２時間１ウ
ェル当たり240mlの0.3％ゼラチンを含むホウ酸生理食塩
水溶液とともにインキュベートすることによりブロック
し、次いで、洗浄して乾燥した。既知量の再びフォール
ディングしたヒトOBタンパク質または血漿サンプルのい
ずれかを100mlの容量で個々のウェル中４℃で一晩イン
キュベートした。洗浄後、このプレートを100mlのビオ
チン化免疫精製抗ヒト抗体（ゼラチン−ホウ酸緩衝溶液
中0.1mg/ml）とともに室温で４時間インキュベートし
た。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）−ス
トレプトアビジンをこのプレートに添加した（ホウ酸緩
衝液中0.1mg/ml、0.3％ゼラチン）。次いで、HRP基質溶
液（クエン酸中ABTS、0.3mg/mlおよびH2O2、0.01％）を
検出に用いてO.D.を414nmで測定して抗体の結合を定量
した。
マウスおよびヒトOB遺伝子コード配列を、OB cDNA配
列を含むプラスミドからPCR増幅し、pPIC.9プラスミド
（Invitrogen）にサブクローニングした。用いたヒト5'
プライマーは 5'GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG3'（配列
番号34） であり、そして3'プライマーは 5'GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC3'（配列番号35）
であった。
マウスに関しては、5'プライマーは 5'GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG3'（配列
番号36） であり、そして3'プライマーは 5'GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC3'（配列番号37）
であった。
マウスおよびヒトのどちらの5'プライマーも、5'末端
にXho I部位、およびベクターpPIC.9内に存在するα接
合因子シグナル配列の最後の４アミノ酸のコード配列を
含む。このベクターは不均一に発現される遺伝子の細胞
から培養培地への分泌を支配する。5'PCRプライマーは
また、シグナル配列開裂部位の後で21位のアミノ酸アラ
ニンの前のOB遺伝子のオープンリーディングフレームの
最初の19ヌクレオチドを含む。3'プライマーはその5'末
端にEcoR I部位を含む。この部位のすぐ後ろに推定OB停
止コドンと相補的な配列が続いている。PCR条件は次の
通りであった:94℃で１分間の変性、55℃で１分間のア
ニーリング、そして72℃で2.5分間の伸長。低サイクルP
CR（15サイクル）および校正ポリメラーゼPFU（Stratag
ene）を用いてPCRによって生成される変異の数を制限し
た。PCR産物をXho IおよびEcoR Iによって消化し、そし
て同様に消化されたベクターpPIC.9にクローニングし
た。全ての構築物を両方の鎖について配列決定し、PCR
によって生成された変異がないことを確認した。クロー
ンを、スフェロプラスト法によってPichia pastoris（H
is-）にトランスフォームし、ヒスチジン欠損培地で選
択した。コロニーハイブリダイゼーションアッセイによ
って高コピー数の組み込みに関して約200のマウスおよ
びヒトクローンがスクリーニングされた。次いで、高コ
ピー数のクローンを、OB発現についてアッセイした。始
めはクマシー染色によって、トランスフォームされた酵
母の培養培地中に存在する新規な16kDタンパク質の存在
が示された。この16kDのバンドは、細菌で発現されたOB
タンパク質に対して生じた抗体を用いてOBであることが
確証された。この組換えタンパク質は以下に記載する２
段階の精製方法によって精製された。質量分析および臭
化シアン処理をBeavisら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:
6873−6877（1990）に記載のように行った。
マウスおよびヒトOB遺伝子のＣ末端からシグナル配列
までの全OBコード配列をpET15b発現ベクター（Novage
n）にサブクローニングし、そしてEscherichia coli［B
L21（DE3）plYsS］内でT7 RNAポリメラーゼ系を用いて
過剰発現させた［Studierら、Meth.Enzymology,185:80
−89（1990）］。30℃で595nmにおける吸光度が0.7にな
るまで増殖させ、そして0.5mMのイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクト−ピラノシドで一晩誘導した細胞を低速
遠心分離により回収した。溶解を３サイクルの凍結溶解
によって行い、DNA消化はDNase Iを用いて行った。膜抽
出を超音波処理およびデタージェント可溶化（detergen
t solubilization）によって行い、そして最終封入体ペ
レット（final inclusion body pellet）を6Mグアニジ
ン−HCl、20mM HEPE,pH8.4に溶解した。組換えOBタンパ
ク質を、Niイオンアフィニティーカラムを用い、イミダ
ゾールの量を増加させながら洗浄するIMACによって、変
性条件下で精製した。次いで、精製された変性OBタンパ
ク質を6Mグアニジン−HCl、10mM酢酸ナトリウム（NaA
c）,pH5中で貯蔵し、そして1mM DTTを用いて室温で１時
間還元した。還元したタンパク質を20％グリセロール、
5mM CaCl2、5mM NaAc,pH5に希釈し、混合して室温で８
〜12時間インキュベートすることによって変性を行っ
た。変性後、Trisを10mMまで添加することによりpHを8.
4に調整し、そしてヘキサ−ヒスチジンtagをトロンビン
開裂によって除いた。開裂され、復元されたタンパク質
をIMACによって再精製し、トロンビンおよび開裂されな
かった融合タンパク質から生成物を分離した。開裂さ
れ、復元されたタンパク質はNiイオンアフィニティーカ
ラムから40mMイミダゾールで溶出するが、トロンビンは
保持されず、そして開裂されなかった融合タンパク質は
0.2mMイミダゾールで溶出する。次いで、生成物を濃縮
し、100mM EDTAおよび10mMフェリシアン化カリウムで処
理してPharmacia superdex 75 16/60カラムを用いるゲ
ル濾過によってさらに精製した。
EllmanアッセイをEllman,Arch.Biochem.Biophys.,82:
70−77（1959）に記載のように行った。Ellman試薬は、
39.6mgの5,5'−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）
（DTNB）を10mlの0.05Mホスフェート、pH8に溶解するこ
とにより調製した。較正曲線を10〜120mMの遊離スルフ
ヒドリル（還元DTTの1mMストック溶液を用いる）の濃度
範囲で412nmで構成した。各アッセイは0.02mlのEllman
試薬および総反応混合物0.5mlを用いて行った。測定さ
れた消衰係数は遊離スルフヒドリル基に関しては12974M
-1cm-1（相関係数0.99987）であり、これは、先に報告
された値13600M-1cm-1の５％以内である。
50mlの2mg/ml精製ゲル濾過タンパク質（最終反応混合
物中の可能な遊離スルフヒドリル濃度約24mMに相当）を
Ellmanアッセイに供した。得られた溶液はA412が約0.02
であり、このことはタンパク質中の２つのシステイン残
基がシスチンを形成する酸化された状態であるか、また
はそれらの遊離スルフヒドリル基が、フォールディング
したタンパク質の近づきにくいコア内に完全に埋まって
いることを示唆する。同じアッセイを6Mグアニジン−HC
lの存在下でフォールディングされていないタンパク質
に関して行うことによって同じ結果が得られた。
マウスを病原体のない環境で個別にケージに入れ、35
％（w/w）Laboratory Rodent Diet 5001（PMP Feeds,In
c.）、5.9％（w/w）タピオカプリンミックス（General
Foods）、および59.1％水を含む飼料（エネルギー含量
1.30kcal/gm）に順応させた。この飼料はオートクレー
ブで滅菌されそして60mmプラスチック皿（この皿は100m
mのペトリ皿の頂部に固定されている）に詰めた。タピ
オカは飼料に糊状の性質を与え、それにより動物が食物
をケージに散らかすのを困難にする。100mmの蓋により
動物がこぼした少量の食物を回収する。毎朝新鮮な食物
をケージに入れそして前日の皿を取り出して重量を量っ
た。重量の差は毎日の食物消費の尺度を提供する。組換
えタンパク質が食物摂取量および体重に与える影響は３
系統のマウスで測定されたC57Bl/6J ob/ob、C57 Bl/Ks
db/db、およびCBA/J ＋／＋（Jackson Laboratoryから
購入）。30匹の各系統のマウスを10匹ずつの群に分け
た。各系統の１群には毎日300μｌのPBS中5mg/g/日の用
量で再びフォールディングした細菌obタンパク質を腹腔
内（i.p.）に注射した。第２の群には同容量のPBSを腹
腔内注射した。これらのコントロールマウスに組換えタ
ンパク質をPBSで透析したものを注射した。このPBSはAc
ticlean ETOXカラムを用いてエンドトキシンを取り除か
れた。第３群の動物には注射しなかった。食物摂取量を
毎日記録し、そして体重測定値を3.5週間隔で定期的に
記録した。ペアーフィーディング実験については、別の
群のobマウスの食物摂取量は、タンパク質を与えられて
いるobマウスによって消費される食物摂取量と日毎ベー
スで（on a daily basis）一致した。
結果 OBタンパク質はマウス、ラット、およびヒト血漿中を循
環している 組換えマウスおよびヒトOBタンパク質をpET 15b細菌
発現ベクター（Novagen）を用い、そしてPichia pastor
is（酵母の発現系で組換えタンパク質を培養培地に直接
分泌する）にクローニングすることにより調製した。酵
母で発現されるobタンパク質は、カルボキシ末端からシ
グナル配列までの146アミノ酸を含む。ウサギを細菌タ
ンパク質（HRP,Inc.）で免疫した。抗体を免疫精製して
（Research Genetics）、免疫沈降、および血漿および
脂肪組織由来のタンパク質のウエスタンブロットに用い
た。
マウスの血漿由来のOBタンパク質はSDS−PAGEにより
見かけの分子量16kDで移動した。電気泳動による移動性
が、シグナル配列を除去した後の酵母によって分泌され
る組換えOBタンパク質と一致する（図24A）。このタン
パク質は、105位のコドンにナンセンス変異を有するC57
BL/6J ob/obマウス由来の血漿では検出されなかった。
いくつかの異なる抗血清は、cDNA配列から予想された短
縮された105残基ポリペプチド鎖を同定できなかった。
db/dbマウスではコントロール動物に比べて循環タン
パク質のレベルが10倍増大していることが観察された
（図24A）。野生型およびfa/faラット由来の血漿の免疫
沈降は、変異ラットにおけるOBタンパク質のレベルが、
野生型と比較して20倍増加していることを明らかにした
（図24B）。db変異は、結果としてobマウスに見られる
のと同じ肥満型表現型になる（Baharyら、1990、前
出）。fattyのラットは、dbに相同な遺伝子内の劣性変
異の結果として肥満する（Truettら、1991、前出）。マ
ウス血漿中OBのレベルを定量するために、組換えタンパ
ク質の量を増加させながら血清に添加して免疫沈降させ
た（図24C）。組換えタンパク質の量の増加に伴ってウ
エスタンブロットのシグナル強度の直線的増加が見られ
た。マウス血漿中の天然タンパク質のシグナル強度と標
準との比較は、野生型マウスにおいて循環しているOBタ
ンパク質のレベルは約20ng/mlであることを示した。こ
れらのデータは、免疫沈降およびウエスタンブロットが
抗体過剰条件下で行われたことを示す。コントロールと
比較して増加したレベルのOBタンパク質はdb/dbマウス
由来の脂肪組織のタンパク質抽出物においても見られる
（図24D）。分泌されたタンパク質について予想された
ように、脂肪組織由来のタンパク質は粗膜画分と一緒に
分画された（データは示していない）。
体重指数（Body Mass Index）（BMI＝体重／身長２）
が25より小さい６人の痩身型ヒト被検者の血漿サンプル
を、ヒトタンパク質に対する免疫精製抗体を用いて免疫
沈降させた。免疫沈降した物質は、酵母で発現された14
6アミノ酸のヒトタンパク質で見られた電気泳動の移動
度と同じ移動度で移動した。シグナルの強度は６サンプ
ル間で有意に異なった（図25A）。オートラジオグラフ
のデンシトメトリーは、個体HP1およびHP6におけるレベ
ルはおよそ５倍の差があり、他の被検者におけるレベル
は中間にあることを明らかにした。酵素連結免疫アッセ
イ（ELISA）を、免疫精製された抗体およびスタンダー
ドとして再びフォールディングした細菌タンパク質を用
いて行った（下記参照）。得られた標準曲線を図25Bに
示す。このアッセイを用いると、この６人のヒト血漿サ
ンプル中のOBタンパク質血漿レベルは２〜15ng/mlの間
で変化した（図25C）。HP6由来の血漿中のOBタンパク質
のレベルは免疫アッセイの直線範囲の外側にあり、≧15
ng/mlである。これらの量的な差はウエスタンブロット
で見られる差と相関していた。
予備データは、レプチンが少なくとも部分的に別の１
つのまたは複数のタンパク質と複合体化して循環し得る
ことを示唆する。この結論は、組換えスタンダードに比
べて血清の滴定曲線の形の不均一性に基づく。変性条件
および非変性条件下でゲル濾過HPLCによりウサギ抗OBカ
ラムで免疫精製された多量のレプチンの分析（ELISAお
よびSDS−PAGEによりモニターした）は、OBポリペプチ
ドが高分子量複合体のように振る舞うことを示唆した。
しかし、これらのデータは予備的なままである；もし必
要であれば、OB結合タンパク質をさらに特徴付けなけれ
ばならない。
OBタンパク質の構造的特徴 OBタンパク質は２つのシステイン残基を有するので、
インビボの酸化条件下では分子内または分子間ジスルフ
ィド結合を形成し得る。サンプル緩衝液に還元剤を添加
してまたはしなでウエスタンブロットを繰り返した。ど
ちらの条件下でも、ヒト血清中のOBタンパク質はモノマ
ーとして移動した（データは示さない）。非還元条件下
ではdbマウス血清から免疫沈降したタンパク質が、16kD
のモノマーおよび約32kDのダイマーの両方のタンパク質
と一位した位置に検出された（図26A）。高分子量部分
が還元条件下で消失したことは、マウスOB画分が分子間
ジスルフィド結合の形成を通じて高分子量種として循環
していることを示唆する。約80％のマウスOBが約16kDの
タンパク質として循環し、そして20％が約32kDの形態で
循環している。
マウスおよびヒトのタンパク質がPichia pastori中で
発現される場合に、同じ分子形態が見られる［Abrams
ら、Immunol.Rev.,:5−24（1992）］。これらの研究に
おいて、146アミノ酸の成熟OBタンパク質に対応するDNA
配列がpPIC.9ベクター（Invitrogen）内の酵母α接合因
子シグナル配列の下流にクローニングされた。OBタンパ
ク質を、マウスおよびヒトのタンパク質を発現する株の
酵母培地から精製し、そして還元条件および非還元条件
下で電気泳動した（図26A）。マウスのタンパク質は非
還元条件下では主にダイマーとして酵母内で発現され、
還元剤存在下でモノマーとしてのみ発現された。組換え
ヒトタンパク質はどちらの条件下でもモノマーの位置に
移動した（データは示さない）。
Pichia内で発現された精製ヒトタンパク質は、質量分
析1990（Beavis,1990,前出）により測定された16,024±
3Daの分子量を有した。この値は、１個の分子内ジスル
フィド架橋を含むタンパク質のアミノ酸配列から計算し
た質量（16,024Da）と一致する。このタンパク質の臭化
シアン開裂産物のマトリックスアシストレーザー脱着
（Matrix−assisted laser desorption）質量分析は、1
17位のシステインと167位のシステインとが分子内ジス
ルフィド結合を通じて結合していることを示す（図26
B）。臭化シアンはカルボキシ末端からメチオニン残基
までを開裂する。
生物活性な組換えタンパク質の調製および特徴付け マウスOBタンパク質は、E.coli内でpET 15bプラスミ
ドから、トロンビン開裂部位を含む20残基のＮ−末端の
ヘキサ−ヒスチジンtagを有する不溶性融合タンパク質
として発現された。細菌の封入体をグアニジン−HClを
用いて可溶化しそして固定化金属イオンアフィニティー
クロマトグラフィー（IMAC）を用いて変性条件下で精製
した（図27）。精製され、変性された融合タンパク質を
還元、希釈して室温で水溶液中で再びフォールディング
させた。トロンビン開裂に続いて、さらに４つのＮ−末
端残基（Gly−Ser−His−Met;配列番号38）を含む復元
した（renatured）マウスOBタンパク質を、IMACによっ
て（SDS−PAGEおよび質量分析による判定によると）＞9
8％均一まで再精製した。マトリックスアシストレーザ
ー脱着質量分析は、16,414±3Daの質量を測定された
（予想された質量＝16,415Da）。還元および非還元SDS
−PAGEゲルは共に、見かけの分子量が16kDである単一の
分子種を示した（データは示していない）。
DP801 Molecular Size Detector（Protein Solution
s,Inc.）を用いる動的光散乱測定は、復元したマウスOB
タンパク質が主としてモノマー性であり、いくつかはよ
り高次の凝集物であることを示した。このタンパク質を
EDTAで処理して化学的に酸化した。次いで、高分子量種
をゲル濾過により除いた。さらなる動的光散乱測定は、
精製され復元された組換えマウスOBタンパク質が単分散
していることを確証した。リン酸緩衝生理食塩水（PB
S）に対して透析した後、細菌のエンドトキシンをActic
lean ETOXカラム（Stereogene Bioseparations,Inc.）
を用いて除去した。タンパク質の最終収量は45mg/lであ
った。
精製され復元された組換えマウスOBタンパク質につい
てEllmanアッセイを行い、その酸化状態を評価した（El
lman,1959,前出）。復元されたタンパク質も6Mグアニジ
ン−HClによってフォールディングしないタンパク質も
どちらも遊離のスルフヒドリル含有量が＜0.5％である
ことを示し、モノマー産物が分子内ジスルフィド結合を
含むことが示された。このことは再フォールディングし
た細菌性タンパク質の臭化シアン開裂生成物の質量分析
により確かめられた。
OBタンパク質の生物活性。 精製され、復元された組換
えマウスOBタンパク質を、5mg/kg/日の腹腔内注射とし
て10匹のC57B1/6J ob/ob（16週齢）、C57Bl/Ks db/db
（12週齢）、およびCBA/J ＋／＋（８週齢）マウスの群
に毎日投与した。同数の動物にPBSを毎日注射した。コ
ントロール注射に用いたPBSは、タンパク質を平衡化し
た後の透析物に由来した。３種のマウス系統のさらに10
匹の動物は注射を受けなかった。個々の動物の食物摂取
量を毎日モニターし、そしてその動物の体重を３、４日
おきに記録した。９群のマウスのそれぞれの食物摂取量
と体重の累積結果を図28A〜Ｆに示し、そしてデータの
統計学的な有意性を表１に示す。タンパク質を注射した
C57B1/6J ob/obマウスの食物摂取量は、最初の注射の後
有意に減少し、第５日目（すなわち、PBSの注射を受け
た動物の摂取量の約40％と同じレベルに安定したとき）
まで減少し続けた（ｐ＜0.001）。凝注射したOBマウス
は３週間の研究期間を通じて、体重が減少しなかった。
タンパク質を与えたC57Bl/6J ob/obマウスは、５日後に
体重が約10％減少した（ｐ＜0.001）。これらの動物は
３週間の処理を通して体重が減少し続け、その時点で、
タンパク質を与えられていたob動物の体重は、平均でそ
れらの始めの体重の60％まで減少していた（p.＜0.000
1）。別の群のobマウスとタンパク質を与えられているo
bマウスとをペアフィードした。図29Bに示したデータ
は、ペアフィードしたマウスの体重の減少が組換えタン
パク質を与えられた動物より有意に少ないことを示す
（ｐ＜0.02）。タンパク質またはビヒクルのいずれかの
注射を受けた２匹のマウスの写真は、タンパク質処置の
結果として外見に著しい違いを示している（図29B）。
このタンパク質の効果をさらに確かめるために、各群の
２匹のマウスの剖検を行った。タンパク質を与えたobマ
ウスの総合的な視診により、体脂肪および肝臓のサイズ
の劇的な減少が明らかにされた。dbマウスおよび野生型
マウスの肝臓の重量は処置によって変化しなかった。PB
Sの注射を受けたobマウスの肝臓は5.04gおよび5.02gで
あり、これに対して組換えタンパク質を与えた動物のそ
れは2.23gおよび2.03gであった。obマウスに特徴的な色
の薄い脂肪肝とは対照的に、タンパク質を与えたobマウ
スの肝臓は、正常な肝臓の特徴である濃い色をしていた
（図29C）。肝臓の組織切片は、未処置の動物は、タン
パク質で処置した動物では著しく改善された脂肪肝を有
することを示した（データは示していない）。
このobマウスとは対照的に、タンパク質を与えたC57B
L/Ks db/dbマウスの体重または食物摂取量はビヒクルを
与えたコントロール群と比較して有意差はなかった（図
28A〜Ｆ、表１）。db/dbマウスの３て全ての群は処置期
間中に２〜5g体重が減少した。dbマウスの平均血糖値を
グルコメーターを用いて測定し、それは全てのマウスで
≧500mg/dlであった。このことは、これらの動物が肥満
症に続いて糖尿病を発症したことを示す。dbマウスの注
射は、２週間後に終止した。
野生型マウスでは、組換えobタンパク質の投与に続い
て少ないが有意な体重減少があった（図28A〜Ｆ、表
１）。タンパク質注射の５日後、処置したマウスは平均
0.5gの減少があったが、コントロールマウスは0.4g増加
していた（ｐ＜0.02）。続く２回の時点では、タンパク
質を与えたマウスは毎日PBSを注射されたマウスより有
意に軽かった。体重変化の有意性は、後の時点では減少
した。体重の減った動物では、食物摂取量はコントロー
ル動物と有意差はなかった。PBSの注射は、注射を受け
なかったマウスと比較して少ないが有意な影響をob、d
b、および野生型マウスの食物摂取量および体重に及ぼ
した（ｐ＜0.05）。
考察 OB遺伝子座位のタンパク質産物に対する内分泌機能
は、Colemanによって最初に示唆された。彼は、ob/obマ
ウスの体重が正常またはdbマウスに対する並体癒合（pa
rabiotic union）の後減少することを示した（Coleman
ら、1978、前出）。上記に示した結果は、OBタンパク質
が血流中で循環し、組換えタンパク質の注射が体重を減
少させることを示すことによりこの仮説を支持した。OB
遺伝子によってコードされる遺伝子産物の分子量はおよ
そ16kDであり、これは、カルボキシ末端からシグナル配
列までの146アミノ酸配列と等しい。組換えOBタンパク
質はPichia pastoris中で発現される場合には改変され
ない。Pichiaにおける哺乳動物遺伝子の発現は、一般に
結果として、正しいタンパク質構造の形成に至る［Creg
gら、Bio/Technology,11:905−914（1993）］。これら
の知見は、インビボでOBタンパク質がグリコシル化され
ず、そして翻訳後にプロセスされないことを示唆する。
このデータは、OBタンパク質が、それ自身あるいは血漿
または脂肪組織内の他のタンパク質に非共有結合してい
る可能性を排除するものではない。このタンパク質のタ
ンパク質分解性開裂は排除されていないが、低分子量形
態のOBタンパク質は、どのような抗血清（４種の抗ペプ
チド抗体を含む）を用いても検出されなかった。
OBタンパク質は、２つのシステイン残基を有し、ヒト
においてはモノマーとして、マウスにおいてはモノマー
およびダイマーとして循環している。分泌される分子に
典型的な分子内ジスルフィド結合は、ヒトタンパク質が
Pichia pastris内で発現される場合に見出され、このこ
とは、それがインビボで存在しやすいことを示唆する。
このことは、分子内ジスルフィド結合を有する組換え細
菌タンパク質の生物活性によって支持される。マウスOB
タンパク質は、血漿中でモノマーおよびダイマーとして
見出され得る。このモノマーおよびダイマーは、マウス
OBタンパク質が酵母で発現される場合に見られ、このマ
ウスタンパク質がダイマーを形成する傾向は、一次配列
がヒトと比べて異なることに起因することを示す。モノ
マーが生物活性を有することは明らかであるが、ダイマ
ーの機能的活性は不明である。
obマウスにおいてOBタンパク質が食物摂取量および体
重に与える影響は、劇的である。３週間の処置の後、組
換えタンパク質を毎日注射されたobマウスはその体重を
40％減少させ、そしてコントロール動物の40％程度の食
物を消費した。さらに、処置されたobマウスの体重は、
実験を終了した時点でもまだ平衡化していなかった。ペ
アーフィーディング実験の結果は、体重の減少が、食物
摂取量およびエネルギー消費量の両方に対する影響の結
果であることを示す。従って、カロリー摂取量が、タン
パク質を与えられたobマウスの摂取量に制限された別の
群のobマウスは、タンパク質を与えた動物より体重減少
が有意に少なかった。OBタンパク質を与えて１日以内
に、ob/obマウスの食物摂取量が野生型マウスのそれよ
りも低いレベルに減少することは、ob/obマウスがOBタ
ンパク質の効果に対して特に感受性であることを示す。
実際、OBレセプターは、これらの動物においてアップレ
ギュレートされ得る。処置されたobマウスの食物摂取量
は５日間の処置後には比較的一定になった。もしこれが
タンパク質が定常期レベルに達したことの結果なら、こ
のタンパク質が比較的長い半減期を有することが示唆さ
れる［The Pharmacological Basis of Therapuetics,p
p.19−45,GoodmanおよびGilman編、Pergamon Press,New
York,（1990）］。この結論は、並体癒合実験のデータ
に一致する［Colemanら、1978、前出;Weigle,Int.J.Obe
sity,12:567−578（1988）］。
実験の最初の２週間の間に、組換えタンパク質が野生
型マウスの体重に与える影響は小さいが、統計的には有
意であった。タンパク質を与えた野生型マウスとPBSを
与えた野生型マウスとの間の体重の差は後の時点でも維
持されたが、データの統計的有意性は３週間後に著しく
減少した。初期の体重減少は、食物摂取量の違いによる
と説明され得ない。おそらく、食物摂取量の測定は、処
置期間中の体重の1gの差を生じる減少を検出するには正
確さが十分ではなかった。この観察は、先の実験の結果
と異なる。先の実験では、野生型の齧歯類が、dbマウ
ス、faラット、視床下部を損傷したラット、および高カ
ロリーの飼料によって肥満にさせたラットとの並体癒合
によって結合された［Colemanら、1978、前出;Harris
ら、1987、前出;Harrisら、「Physiological and metab
olic changes in parabiotic partners of obese rat
s」、Hormones,Thermogenesis and Obesity,Lardyおよ
びStraatman編、Elsevier Science Publishing Co.,New
York（1989）;Hervey、J.Physiol.,145:336−352（195
9）］。それぞれの場合において、野生型動物は食欲が
減退し大量の体重が減少する。dbマウスおよびfaラット
ではOBタンパク質のレベルが増加し、そして視床下部を
損傷したマウスではOB RNAのレベルが増加するので、野
生型マウスは、OBタンパク質が十分に高いレベルで血漿
中を循環している場合には、OBに応答し得るようであ
る。本明細書で報告される知見は、投与されるタンパク
質のレベルが内因性レベルよりも低かったという可能性
と一致し、それは、僅かに少ない体重で平衡化すること
につながる。処置されたマウスにおいてOBタンパク質の
循環レベルを定量することは、この問題を解決するであ
ろう。マウスタンパク質の免疫アッセイは未だ利用し得
ないが、免疫沈降は、循環OBタンパク質のレベルがタン
パク質を与えた野生型マウスにおいて実質的に上昇しな
いことを示唆した。
このタンパク質が野生型マウスに与える影響の低さお
よびdbマウスにおける応答の欠如により、この処置が非
特異的または有害な影響を有するということはありそう
もない。全てのdbマウスは、それらがobタンパク質を与
えられたか否かに関わらず、処置期間中に少量の体重が
減少した。db動物は明らかに高血糖症であり、体重の減
少は糖尿病の結果であって、実験プロトコルの結果では
ないようである。C57BL/Ks db/dbマウスは、しばしば糖
尿病を発症し、この実験に用いられた動物の年齢で少量
の体重が減少し始める（Colemanら、1978、前出）。同
様な年齢のC57Bl/6J ob/obマウスは、著しい高血糖症を
発症しない。これらの表現型的な違いは、変異を有する
系統間（C57Bl6J対C57Bl/Ks）の遺伝的違いの結果であ
ると考えられる（Colemanら、1978、前出）。
C57lB/6J ob/obマウスにおけるOB遺伝子のcDNA配列か
ら予想された短縮された105アミノ酸タンパク質の検出
の失敗は、変異タンパク質が分解されるか翻訳されない
かのどちらかであることを示唆する。しかし、用いた抗
血清がこの短縮されたタンパク質を検出しないという可
能性は排除され得ない。dbマウスにおけるobタンパク質
のレベルが野生型と比較して10倍増加していることが観
察されたことは、obタンパク質の効果に対して耐性があ
る場合にはobタンパク質が過剰に産生されることを示唆
する。これらのデータは、OB mRNAの研究と相関する。
言及したように、先の実験は、マウスdb遺伝子およびラ
ットfa遺伝子の変異（これらは相同な染色体領域に位置
する）が、体重を抑制する血漿因子の過剰生産に結果と
して至ることを示した（Truettら、1991、前出;Colema
n、1978、前出;Hervey、1959、前出）。どちらの場合に
おいても、変異動物がOBタンパク質の効果に対して耐性
であることが示唆された。この可能性は、OBタンパク質
がdbマウスに投与された場合には体重または食物摂取量
に影響を及ぼさないという観察によって確認される。
ヒトの肥満症は、ホルモンに比較的非応答性である個
人の血漿中のOBタンパク質のレベルの増加と関連し得
る。一方、OBの発現の減少もまた肥満症につながる。こ
の場合、「正常」（すなわち、不適切に低い）レベルの
このタンパク質が見出され得る。したがって、ヒト血漿
中のOBタンパク質のレベルは、肥満症の別の形態のマー
カーであり得る。BMI＜25である痩身型被検者の少人数
の群では、低いナノグラムレベルの循環OBタンパク質が
ELISAによって検出される。重要なのは、種々の濃度が
示されたことにより、発現のレベルおよび／またはタン
パク質に対する感受性が体重の決定にある役割を果たし
得るということが示唆されることである。
このOBタンパク質の作用部位は不明である。このタン
パク質は、食物摂取量およびエネルギー消費量のどちら
にも影響する。これは両システムの変更が、体重の調節
に働くことを示す臨床研究［Leibelら、N.Engl.J.Me
d.、332:621−628（1995）;Keeseyら、「Metabolic def
ense of the body weight set−point（体重セットポイ
ントの代謝的防御）」、Association for Research in
Nervous and Mental Disease、pp.87−96、Stunkardお
よびStellar編、Raven Press,New York.（1984）］と一
致する知見である。視床下部は、体重を制御する経路に
おいてOBの下流にあるようであるが、直接的な影響を種
々の器官に及ぼすことは可能である。
実施例9:視床下部に損傷を受けたマウスおよびdb遺伝子
座に変更を有するマウスにおけるOB RNAの脂肪細胞にお
ける発現の増加 最近クローニングされたマウス肥満遺伝子（OB）の遺
伝子産物は、脂肪組織の量の調節に重要な役割を果た
す。OB RNAは、褐色脂肪を含むいくつかの異なる脂肪細
胞貯蔵部それぞれにおいてインビボでマウス脂肪細胞に
よって特異的に発現される。それはまた、分化に誘導さ
れた培養3T3−442A前脂肪細胞においても発現される。
視床下部に損傷を有するマウスおよびdb遺伝子座に変異
を有するマウスは、脂肪組織中で20倍高いレベルのOB R
NAを発現する。これらのデータは、db遺伝子および視床
下部のどちらも、脂肪組織の量を調節する経路において
OB遺伝子の下流にあることを示唆し、そしてdb遺伝子座
がOBレセプターをコードすることを示唆する先の実験と
一致する。db/dbおよび損傷マウスでは、OB RNAの発現
レベルにおける量的な差が脂肪細胞の脂質含有量と相関
していた。脂肪細胞中でOB遺伝子の発現レベルを調節す
る分子は、OBの作用部位でOBの効果を仲介する分子のよ
うに、体重の決定に重要な役割を果たしているようであ
る。
材料および方法 インサイチュハイブリダイゼーション 野生型（wt）およびdbマウスの同じ腹部領域由来の白
色脂肪（white fat）組織を、Richardsonら、Growth,De
velopment ＆ Aging,56:149−157（1992）によって記載
された改変方法に従って、同時にプロセスした。簡単に
いうと、組織をBouin溶液中で２時間４℃で固定した。
次いで、それらをエタノール濃度を10％から100％まで
増加させる連続処理（４℃で各５分間ずつ）により脱水
した。組織をキシレン（１時間）とそしてパラフィン
（２時間）とともに65℃でさらにインキュベートした。
包埋されたwtおよびdb/db脂肪組織を切片にし、後に同
じ条件によりマウントした。薄切片を65℃で１時間ベイ
クし、そしてキシレン、およびエタノールの100％から5
0％の連続希釈液（室温で各３分間ずつ）で処理した。O
B遺伝子のアンチセンスRNAプローブを、Sp6 RNAポリメ
ラーゼプロモーターの上流の直鎖状化（linearized）さ
れたOB遺伝子コード配列のインビトロ転写により合成し
た。インサイチュハイブリダイゼーションをSchaeren−
Wiemersら、Histochemistry,100:431−440（1993）に正
確に従って行った。
RNA調製および細胞培養 全RNAおよびノーザンブロットを記載されたように調
製した。間質血管細胞および脂肪細胞をRodbellに従っ
て調製し、そしてDaniら、Mol.Cell.Endocrinol.,63:19
9−208（1989）;Rodbell,J.Biol.Chem.239:375−380（1
9）に従って、両画分からRNAを調製した。サブクローニ
ング後、3T3−F442細胞を、10％ウシ胎児血清を含むDul
beccoの改変Eagle培地（標準培地と規定した）中で生育
させた［Daniら、“Molecular biology techniques in
the study of adipocyte differentiation（脂肪細胞の
分化の研究における分子生物学技術）”、Obesity in E
urope vol 88,pp.371−376,BjorntorpおよびRossner
編、Johon Libbey Company Ltd.,London,England（198
9）］。集密時に、細胞を、2nMトリヨードチロニン（T
3）および17nMインスリンを補足した標準培地中で処理
した。12日後、上記のようにRNAを調製した。
金チオグルコース処理（GTG） ２ヶ月齢の雌性CBA/Jマウスをオーロチオグルコース
（aurothioglucose）（Sigma Catalog No.A0632）単回
腹腔内注射（用量0.2mg/g、正常生理食塩水中）で処置
した。コントロール動物には正常生理食塩水を注射し
た。処置の１ヶ月後にマウスの体重を測定した。GTG処
理後に20g以上体重が増加した処置動物由来の脂肪組織R
NAを単離した。
結果 最近、OB遺伝子は脂肪組織で発現されることが見出さ
れた［Zhangら、Nature,372:425−432（1994）］。脂肪
組織は脂肪細胞、前脂肪細胞、線維芽細胞、および血管
細胞を含む多くの細胞タイプから成るので、インサイチ
ュハイブリダイゼーションをセンスおよびアンチセンス
OBリボプローブを用いて正常動物の精巣上体脂肪パッド
の薄切片に対して行った［Richardsonら、1992、前出;W
asserman,“The concept of the fat organ（脂肪器官
の概念）”、Rodhal,Issekutz,fat as a tissue",pp.22
−92,McGraw Hill,New York（1964）］。アンチセンス
プローブを用いる場合、ポジティブシグナルは薄切片中
の全ての脂肪細胞において検出された。（図30、Wtと標
記した）。アンチセンスプローブを脳の薄切片とハイブ
リダイズさせた場合、シグナルは示されなかった（デー
タは示さず）。C57Bl/Ks db/dbマウス由来の脂肪組織の
薄切片へのアンチセンスプローブのハイブリダイゼーシ
ョンは、著しく増加し、そのことは、OB RNAの脂肪細胞
特異的発現を確証し、そしてこれらの動物における脂肪
細胞当たりのOB RNAレベルの大きな増加を示した（図3
0、db/dbと標記した）。db遺伝子座におけるマウスの変
異は、C57Bl/6J ob/obマウスに見られる症候群と表現型
的に同一の症候群の一部としての広範囲の肥満である
（Baharyら、1990、前出）。
OB RNAは、脂肪細胞から分離された脂肪組織間質細胞
によって合成されなかった。予想したように、脂肪細胞
画分中の細胞はノーザンブロットを用いるとOB RNAを発
現していた（図31）。RT−PCRを用いても同じ結果が得
られた（データは示さず）。これらのデータは、脂肪細
胞のみがOB遺伝子を発現するという結論を支持する。培
養された脂肪細胞由来のデータはこの結論を確証する。
これらの研究において、3T3−F442A細胞は、脂肪細胞へ
の分化につながる細胞プログラムの一部としての脂質蓄
積を導く条件を用いて、培養された。OB RNAは指数関数
的に増殖する細胞内で発現されたのでも、集密3T3−F44
2A前脂肪細胞（初期のマーカーを発現する）内で発現さ
れたのでもない。しかし、これらの細胞の脂肪細胞への
分化は、検出可能なレベルのOB RNAの発現につながった
（図31）［Daniら、J.Biol.Chem.,264:10119−10125（1
989）］。OB RNAのレベルは、培養条件に非常に感受性
である。なぜなら、インスリンに曝されなかった後期の
集密度（post−confluent）細胞では、メッセージが観
察されなかったからである。
ハイブリダイゼーション研究は、OB RNAが精巣上体、
子宮傍組織、腹部、腎周囲、および鼠蹊部の脂肪パッド
を含むいくつかの異なる脂肪貯蔵部においてインビボで
発現されることを示した（図32A）。各貯蔵部における
正確な発現レベルはいくらか可変であり、鼠蹊部および
子宮傍組織の脂肪はより低いレベルのOB RNAを発現し
た。OB RNAはまた、褐色脂肪組織でも発現されるが、発
現レベルは他の脂肪組織貯蔵部と比べて褐色脂肪内では
およそ50倍低い。これらの量的な違いは、先に報告され
た異なる脂肪細胞貯蔵部間の細胞サイズの違いと緩やか
に相関している［Johnsonら、J.Lipid Res.,13:2−11
（1972）］。褐色脂肪中のOB RNAの量は低温に曝される
ことによって影響を受けない（図32B）。この実験で
は、カップリングしていないタンパク質RNA（UCP）のレ
ベルは低温に曝された後に褐色脂肪中で増加したが、ob
RNAレベルは変化しなかった［Jacobssonら、J.Biol.Ch
em.,260:16250−16254（1985）］。凝集体において、こ
れらのデータは、全ての脂肪細胞がOB RNAを産生し得、
そして異なる脂肪貯蔵部で種々の発現レベルを示すこと
を確証する。これらのデータは、コードされたタンパク
質のレベルが脂肪組織の総量と相関するという可能性を
支持する。
db/dbマウスおよび視床下部に損傷を受けたマウスに
おけるOB RNAレベルを測定した。腹内側視床下部（VM
H）の損傷は、ob/obマウスおよびdb/dbマウスに見られ
るのと似た症候群の一部としての肥満症に至る［Bray
ら、Metabolism,24:99−117（1975）］。並体癒合実験
は、そのような損傷が結果として血液によって運ばれる
食物摂取量および体重を抑制する因子の過剰発現につな
がることを示唆する（Hervay,1959,前出）。db遺伝子座
に変異を有するマウス変異体を正常マウスと並体癒合さ
せる場合、同様の結果が示され、このことは、OBレセプ
ターがdb遺伝子座によってコードされ得ることを示唆す
る（Coleman等、1978、前出）。従って、VMH損傷および
db変異の結果に由来する肥満症は、OBタンパク質の効果
に対する耐性の結果であり得る。もしそうなら、脂肪組
織中のOB RNAのレベルの二次的な増加が予想される。
化学物質金チオグルコース（GTG）を用いて雌性CBAマ
ウスに視床下部損傷を誘導した（Debonsら、Fed.Proc.,
36:143−147（1977）］。この処置は結果として視床下
部（主として腹内側視床下部（VMH））に特定された損
傷を生じ、続いて、数週間のうちに肥満症が発症した。
通常、単回のGTG腹腔内注射（0.2mg/gm体重）の結果、
４週間以内に肥満症が発症する。１ヶ月齢の雌性CBA/J
マウス（20〜25g）をGTGで処置し、その後の体重増加の
処置およびコントロール動物を示す（表２）。脂肪組織
RNAをdb/dbマウスおよび＞20gm体重増加したこれらGTG
処置動物から調製した。ノーザンブロットは、２ヶ月齢
のdb/dbマウスおよびGTG処置マウスでは正常動物に比べ
てOB RNAレベルが20倍増加していることを示した（図3
3）。
２ヶ月齢の雌性CBA/Jマウスを金チオグルコース（GT
G）で処置した。金チオグルコース（Sigma A0632）を正
常生理食塩水中で2.0mg/gの用量で腹腔内投与した。コ
ントロールおよび処置動物の体重を注射の前および１ヶ
月後に記録した。１つのケージに５匹の動物をいれ、自
由に摂食させた。注射の１ヶ月後に増えた体重の量を表
２に示す。注射１ヶ月後に体重が20g以上増加した動物
を更なる研究用に選択した。
考察 マウスOB遺伝子の遺伝子産物はマウスおよびヒトとの
血漿中で循環する。ここでは、その産物は脂肪組織の質
量を調節するように作用し得る。OBの作用の発現および
メカニズムの調節に関するさらなる研究は、体重を調節
する生理学的経路についての理解にとって重要な示唆を
有するであろう。
この実施例はOB遺伝子産物が脂肪組織貯蔵部中の脂肪
細胞によって著しく発現されることを示す。この結果
は、OB遺伝子のタンパク質産物が身体の脂質貯蔵と相関
するという可能性と一致する。さらに、OB RNAは、dbマ
ウスおよび視床下部損傷を受けたマウスにおいて20倍ア
ップレギュレートされる。これらの動物においては、細
胞当たりのOB RNAレベルの実際の増加は20倍より高いよ
うである。なぜなら、脂肪細胞の細胞サイズはこれらの
動物において約５倍増加しているからである（図30参
照）（Debonsら、1977、前出）。これらのデータはdb遺
伝子および視床下部が体重を調節する経路においてOBの
下流にあると位置づけ、そしてOBレセプターがdb遺伝子
座でコードされるという仮説に一致する［Colemanら、D
iabetologia 14:141−148（1978）］。OBレセプター遺
伝子および／またはdb遺伝子の分子クローニングがこの
問題を解決するであろう。db/dbマウスおよびGTG処置マ
ウスにおけるOB RNAレベルの増加もまた、脂肪細胞にお
けるOB遺伝子産物の非細胞自律機能を示唆する［Ashwel
lら、Proc.R.Soc.Lond.,195:343−353（1977）;Ashwell
ら、Diabetologia,15:465−470］。従って、コードされ
たタンパク質が脂肪細胞に直接作用して成長または分化
を阻害するならば、GTG処置されたマウスにおける野生
型OB遺伝子の過剰発現は、結果として痩身型表現型とな
る。
このデータの最も注意深い（parsimonious）説明は、
OBタンパク質が脂肪細胞によって分泌される内分泌シグ
ナル分子として機能し、視床下部に直接あるいは間接的
に作用するというものである。視床下部への直接の影響
には、OB遺伝子産物が血液脳関門を通過することを可能
にするメカニズムの存在が必要である。脳室周囲器官
（circumventricular organ）および／または特定の輸
送体を含むメカニズムが、OB遺伝子によってコードされ
るサイズの分子を脳へ進入させ得るであろう［Johnson
ら、FASEB J.,7:678−686（1983）;Bauraら、J.Clin.In
vest.,92:1824−1830（1993）;Pardridge,Endocrine Re
views,7:314−330（1986）］。しかし、この仮説は、タ
ンパク質を血液脳関門を通過させ得る手段が同定される
までは注意して考慮されなければならない。さらに、他
の標的器官におよぼす可能な影響が評価されることが必
要であろう。
OB遺伝子の発現レベルの量的な変動の原因である脂肪
細胞シグナルは未だ知られていないが、脂肪細胞の細胞
サイズの差と相関する。db/dbマウスの脂肪細胞は正常
マウスのそれの５倍の大きさであり、細胞サイズはおよ
そ1.0μｇ脂質／細胞である（Johnsonら、1972、前
出）。先の証拠は、脂肪細胞の脂質含有量および／また
はサイズが体重決定の重要なパラメーターであることを
示した［Faustら、Am.J.Physiol.,235:279−286（197
8）;Faustら、Science,197:393−396（1977）］。各脂
肪細胞は、細胞サイズに比例してさらに増加する低レベ
ルのOB RNAを発現し得る。細胞サイズは意味のあるパラ
メーターではなく、db/dbマウスおよびVMH損傷マウスの
脂肪細胞内のOB遺伝子発現を増加させる細胞内シグナル
と単に相関することもあり得る。どの場合も、OB RNAの
合成を調節するシグナル伝達経路の要素が体重の決定に
は重要であるようである。コードされたタンパク質に対
する感受性を減少させる影響が働くにつれ、OBの発現レ
ベルを低下させる遺伝的および環境的影響が働いて体重
を増加させるであろう。OB遺伝子の発現レベルを調節す
る特定の分子は、未だ不明であり、OB RNAのレベルにお
ける量的な変動につながる遺伝子コントロールのレベル
の決定、およびOB遺伝子の調節因子の研究が待たれる。
脂肪細胞におけるOB遺伝子の発現を調節する分子、およ
びコードされたタンパク質の効果をその作用部位で仲介
する分子の同定は、体重を調節する生理学的メカニズム
に対する理解を大いに高めるであろう。
実施例10:RNA発現パターンおよび第７染色体の物理的、
細胞遺伝学的、遺伝学的地図におけるマッピング OB RNAはヒトの脂肪組織において高いレベルで発現
し、そして胎盤および心臓においてはかなり低いレベル
で発現する。ヒトOB遺伝子地図は、染色体7q31.3に由来
する大きな酵母人工染色体（YAC）コンティグに、マッ
ピングされる。マウス−ヒト比較マッピングに基づいて
遺伝子の相対位置を確証することに加えて、この研究
は、ヒトOB遺伝子に物理的に近接した位置にある、８つ
の確立されたマイクロサテライトマーカーを同定した。
マウスOBにおける突然変異は、ヒトの病的肥満に非常に
類似する症候群を生じさせ得るので、これらの遺伝マー
カーは、ヒト肥満症の遺伝形態におけるOB遺伝子の可能
な役割を研究するための重要なツールを表す。
材料と方法 ノーザンブロット分析 全RNAを脂肪組織からChirgwinら、Biochem.,18:5294
−5299（1979）の方法を用いて調製した。ノーザンブロ
ット、放射性標識法、およびハイブリダイゼーションは
記述（Zhangら、1994、上記）に従って行った。ポリA+R
NA（ヒトMTN、ヒトMTN II、およびヒト胎児MTN II）の
ノーザンブロットは、放射性標識化したヒトアクチンプ
ローブを生成するために用いられるPCRプライマーと同
様に、CLONETECH（Palo Alto,CA）から得た。
STS展開 配列タグ部位（STS）特異的PCRアッセイは、本質的に
次の記述に従って展開および最適化した［（Greenら、P
CR Methods Applic.,1991;Greenら、Genomics,11:548−
564（1991）;Green,「ヒト染色体の物理的マッピング：
染色体特異的配列タグ部位の生成」,Methods in Molecu
lar Genetics Vol.1,Gene and Chromosome Analysis（P
art A）,pp.192−210,Adolph編.,Academic Press,Inc.,
San Diego（1993）;Greenら、Hum.Mol.Genet.,3:489−5
01（1994）］。それぞれのSTSは接頭辞「sWSS」の後に
独自の番号をつなげたものを用いて命名する。ここで報
告した19のSTSについての詳細は、表３に示し、追加情
報（例えば、PCR反応条件、完全DNA配列）は、GenBank
および／あるいはGenome Data Base（GDB）で入手可能
である。マイクロサテライト特異的STSについて、PCRア
ッセイに用いたオリゴヌクレオチドプライマー（表３）
は、遺伝子型分析に使用したもの（表４）、あるいはGe
nBankで入手可能なDNA配列を用いて設計されたもの（通
常コンピュータープログラムOSPを用いる）［Hillier
ら、PCR Methods Applic.,1:124−128（1991）］のどち
らかに相当した。表３は、ヒトOB遺伝子を含むYACコン
ティングでのSTSを示す。
ヒトOB遺伝子含有YACコンティグにマッピングされた1
9の第７染色体特異的STS（図35）を列挙する。それぞれ
の場合において、各「sWSS」名、関連別名、GDB指定遺
伝子座名、STS供給源、PCRプライマー配列、STSサイ
ズ、GDB同定番号を示す。STSの供給源は次の通りであ
る：「YAC末端」（YACの単離された挿入物末端）（Gree
n,1993,上記）、「ラムダクローン」（ランダム第７染
色体特異的ラムダクローン）（Greenら、1991,上記;Gre
en,1993,上記）、「遺伝子マーカー」（マイクロサテラ
イトマーカー，表２参照）（Greenら、1994,上記）、
「YAC挿入物」（YAC挿入物由来のランダムセグメン
ト）、および「遺伝子」（遺伝子特異的STS）。注意す
べきことは、いくつかの遺伝マーカー特異的STSについ
て、YACを同定するために用いたPCRプライマー（この表
に示した）は遺伝子型分析を行うために用いられたもの
（表４）と異なっていることであり、この理由として
は、遺伝子マーカーを含むYACの検出には多型領域自体
の増幅を必要としないことが挙げられる。指示したPCR
アッセイは、全て55℃のアニーリング温度を用いた［但
しsWSS494、sWSS883、sWSS1529、およびsWSS2619（50
℃）、sWSS999およびsWSS1174（60℃）、ならびにsWSS8
08（65℃）を除く］。STS特異的PCRアッセイに関する追
加の詳細は、GDBにおいて入手可能である。
ヒトOB遺伝子含有YACコンティグにマッピングされた
８つのマイクロサテライトマーカー（図35）を列挙す
る。それぞれの場合において、マーカー名（表３に別名
として示した）、マイクロサテライトモチーフのタイプ
（テトラヌクレオチド−「Tetra」反復あるいは（CA）
ｎ反復）、GDB指定遺伝子座名、PCRに基づいた遺伝子型
分析で用いたプライマー配列およびGDB同定番号を示
す。PCRアッセイおよび多型性に関する追加の詳細は、G
DBで入手可能である。
ヒトOB特異的STS（sWSS2619）を、cDNAの3'非翻訳領
域から得られたDNA配列を用いて設計した。ヒトPax4特
異的STS（sWSS808）は、次のストラトジーを用いて生成
した。マウスPax4遺伝子（GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA）
（配列番号63）および（GGGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG）
（配列番号93）［Waltherら、1991,Genomics 11:424−4
34）（1991）］に対して特異的なオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて、ヒトゲノムDNA（マウスゲノムDNAか
ら生成されたものと同サイズの産物）由来の204bpフラ
グメントを増幅した。このPCRアッセイは、対応するYAC
を同定するのには適していなかった。これは、同様のサ
イズの産物（200bp）もまた酵母DNAから増幅されたから
である。しかしながら、ヒトDNAから生成されたPCR産物
のDNA配列分析は、分析された156の塩基中20箇所で置換
が生じていることを明らかにした（データは示していな
い）。このヒト特異的配列を用いて、新しいプライマー
（TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC）（配列番号64）を設計
し、また、最初の上記マウスPax4特異的プライマーと共
に用いた（表３を参照のこと）。得られるヒトPax4特異
的PCRアッセイは、酵母DNAからの有意な産物を増幅しな
かったので、このアッセイを対応するYACの同定に用い
た。
PCRに基づくスクリーニングによるYACの同定 図35に示したYACの多くは、PCRに基づくスクリーニン
グストラトジー［Greenら、1995,上記;Greenaら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,87:1213−1217（1990）］を用いた
ヒト第７染色体DNA「第７染色体YAC供給源」（Green
ら、1995,上記）について高く富化されたクローンのコ
レクションに由来した。数例では、クローンは、CEPH
［Daussetら、Behring Inst.Mitt.,91:13−20（1992）;
Albertsenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:4256−4260
（1990）］あるいはICI［Anandら、Nucl.Acids Res.,1
7:3425−3433（1989）;Anandら.,Nucl.Acids Res.18:19
51−1956（1990）］で構築された入手可能な全ヒトゲノ
ムYACライブラリーのPCRに基づくスクリーニング（Gree
naら、1990,上記）により単離された。それぞれのYAC
は、接頭辞「yWSS」の後に独自の番号をつなげたものを
用いて命名する。
結果および考察 ノーザンブロット分析によるヒトOB遺伝子の組織発現
の検査では、OB RNAがヒト脂肪組織において高レベルで
発現し、そして胎盤および心臓においてはかなり低レベ
ルで発現することが示された（図34）。RNAのサイズ
（およそ4.5kb）は、ヒトおよびマウスにおいてならび
に発現している組織のそれぞれにおいて等価であった。
これらの研究では、２μｇのポリA+胎盤RNAにおいてと
同様に、５倍高いシグナルが10μｇの全脂肪組織RNAで
見られた。胎盤と比較して心臓のポリA+RNAでは、５倍
低いシグナルが見られた。OB RNAのレベルは、脂肪組織
よりも胎盤組織の方がおよそ250倍低いと概算される。
この実験では、OB RNAは、脳、肺、肝臓、骨格筋、腎
臓、および膵臓を含む、分析を行った他の組織のいずれ
においても、検出されなかった。追加の実験では、脾
臓、胸腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、結腸、末梢血白
血球、あるいは、胎児の脳、肝臓または腎臓においてOB
RNAを示さなかった（データは示していない）。OBは、
これらの後者の組織あるいは研究されていない他の組織
において、検出できない（ノーザンブロット分析によ
り）レベルで発現している可能性がある。ヒトで観測さ
れた発現パターンは、OB RNAが脂肪組織においてほぼ独
占的に検出されるマウスの場合と幾分異なっている。
マウスおよびヒトゲノムにおけるOB遺伝子領域の比較マ
ッピング。マウスOB遺伝子は、ヒト第７染色体ｑの一部
と相同な領域にある近位の第６染色体上に位置してい
る。このセグメント内の遺伝子は、以下を含んでいる
（近位から遠位へ）:Met癌原遺伝子、嚢胞性線維症膜貫
通伝導調節因子（Cftr）、対合ボックス含有遺伝子４
（Pax4）、OB、およびカルボキシペプチダーゼＡ（Cp
a）（Zhangら、1994,上記;Friedmanら、1991,上記）。
マウスでは、遺伝的マッピングを用いて、Pax4が強くob
に連鎖していることが示された［Waltherら、1991,上
記;Zhangら、1994,上記］。OBおよびPax4間の物理的距
離は、およそ１メガ塩基対（Mb）であることが明らかと
なった（Zhangら、1994、上記）。これらの比較マッピ
ングの研究に基づくと、ヒトOB遺伝子は染色体7q上のPa
x4およびCPA間に存在すると予測された。さらに、ヒトC
FTR［Hengら、Cell Genet.,62:108−109（1993）］およ
びPax4［Tamuraら、Cytogenet.Cell Genet.,66:132−13
4（1994）］は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーシ
ョン（FISH）により、それぞれ、7q31.3および7q32にマ
ッピングされたので、ヒトOB遺伝子の最も考えられる細
胞遺伝的位置は、7q31.3〜q32境界の付近であり得る。
ヒト第７染色体におけるOB遺伝子のマッピング ヒトOB遺伝子の3'非翻訳領域の小セグメントを増幅し
ているSTS（sWSS2619）を、ヒト第７染色体のDNA（Gree
nら、1995a,Genomics 25:170−183）について高く富化
されているYACクローンのコレクションをスクリーンす
るのに用いた。そして、９のYACを同定した（yWSS691、
yWSS1332、yWSS1998、yWSS2087、yWSS3319、yWSS3512、
yWSS4875、yWSS4970、およびyWSS5004）。これらのYAC
が真正ヒトOB遺伝子を含むことを証明するために、二つ
の追加実験を行った。第一に、YACのそれぞれを別のヒ
トOB特異的PCRアッセイでテストした。その結果、全て
が陽性であることが明らかとなった（データは示してい
ない）。第二に、それぞれのクローン由来の酵母DNA
を、EcoR Iで消化し、ヒトOB cDNA−由来プローブを用
いたゲルトランスファーハイブリダイゼーションにより
分析した。全ての例において、単独のハイブリダイズバ
ンドが見られた。そしてこのバンドは、ヒトOB遺伝子を
含むことが既知であるYACおよびP1クローンにおいて同
サイズであった（データは示していない）。
コンピュータープログラムSEGMAP（GreenおよびGree
n,1991,上記）および本発明者らが第７染色体について
生じさせた他のYACに基づくSTS内容データ（Greenら、1
991,上記;Greenら、1994,上記;Greenら、1995,上記）を
用いて、ヒトOB遺伝子が図35に示したYACコンディグ内
に存在することが明らかとなった。特筆すべきは、この
コンティグは、43の重複YACおよび19の独自に整列化し
たSTSから構成されていることである。19のSTSのそれぞ
れについての詳細は、表３に示す。OB特異的STSに加え
て、コンティグはまたヒトPax4遺伝子に対して特異的な
STS（sWSS808）（Tamuraら、1994,上記;Stapletonら、1
993,Nature Genet.3:292−298）、第７染色体特異的YAC
由来の７つのSTS、第７染色体特異的ラムダクローン由
来の２つのSTS、および重要なことに、８つのマイクロ
サテライト特異的STSを含む。遺伝子型分析に用いたプ
ライマーの配列を含む、これらの８つの遺伝マーカーに
ついての追加の詳細は、表２に示す。ここで注意したい
のは、コンティグ全体にわたって多くのYACに基づく連
結性がある（すなわち、STSのそれぞれの隣接対に接続
する２あるいはそれ以上のYACが存在する）ことであ
り、図35に示されるSTSの相対順序に対する強い支持を
与える。
図35に示したように、ヒトOB含有YACコンティグの推
定配位は、sWSS1734は最もセントロメア側（centrometr
ic−most）STS（すなわち、CFTRに最も近接）であり、
一方、sWSS2367は、最もテロメア側（teromeric−mos
t）STS（すなわち、CPAに最も近接）である。この配位
は、主として、比較マッピングデータに基づき、これは
マウスおよびヒトDNAに存在するシンテニックブロック
内のPax4近位およびOB遠位に位置する（Zhangら、1994,
上記）。OB遺伝子は、OB特異的STS（sWSS2619）の配置
に基づくと、コンティグのテロメア末端近傍にマップさ
れる。
図35に示すコンティグは、YACサイズを考慮せずにSEG
MAPより推定した（それにより、STSを互いから等距離で
示す）が、YACサイズについて説明したSEGMAPによるデ
ータの同様の解析は、コンティグによりカバーされた領
域の全サイズがちょうど2Mb強であることを示した（デ
ータは示していない）。このように、８つのマイクロサ
テライト特異的STS（表４）の全てが、概算で2Mbにわた
るゲノム区間間隔内に含まれている一方、コンティグの
テロメア末端に最も近い３つ（sWSS1392、sWSS1148、お
よびsWSS2367）は、特にOB遺伝子自体に近い（おそらく
約500kb程度の小さな間隔内）。実際、後者の３つのSTS
の全ては、ヒトOB含有YACの少なくとも１つに存在す
る。ここで注意したいのは、ヒトPax4（sWSS808）およ
びob（sWSS2619）の間の間隔がおよそ400kbと見積もら
れている一方、この領域はマウスにおいては、約1Mbに
わたると予測されていたことである（Zhangら、1994,上
記）。最後に、コンティグ内の３つのYAC（yWSS691、yW
SS999およびyWSS2935）もまたFISHにより分析されてお
り、そしてそれぞれは、専ら7q31.3とハイブリダイズす
ることが明らかとなった。これらのYACの１つ（yMSS69
1）は、OB特異的STSを含む一方、その他の２つのクロー
ンは、Pax4特異的STSを含む。後者の結果は、一般的に7
q32へのヒトPax4の以前の細胞遺伝的割り当て（Tamura
ら、1994,上記）と一致する。これらのデータに基づい
て、ヒトOB遺伝子は、細胞遺伝的バンド7q31.3に割り当
てられ得る。
実施例11:ヒトOBポリペプチドは、マウスにおいて生物
学的に活性である 10匹のob/obマウスのグループを、10μg/g/日の組換え
（細菌性）ヒトおよびマウスOBポリペプチドあるいは食
塩水の腹腔内注射により処理した。４日後、食塩水を与
えたグループは、0.3g増加した。マウスOBを与えたグル
ープは、3.2g減少した。ヒトOBを与えたグループは、2g
減少した（ｐ〈0.01食塩水コントロールと比較）。これ
らのグループへは、食物摂取のテストも行った。食物摂
取のデータを表５に、体重に対するデータを表６に示
す。
これらのデータは、ヒトOBがマウスにおいて生物学的
に活性であることを実証している。
実施例12:高用量OBが野生型マウスに影響を及ぼす 野生型マウス（C57B16J＋/?）を、10μg/g/日の組換
えマウスOBの腹腔内注射で処理し、４日ごとに体重の測
定を行った。その結果を表７に示す。
これらのデータは、非常に程度が低いとはいえ、OBが
肥満症（ob/ob）マウスと同様、野生型マウスの体重に
影響を及ぼすことを実証している。
実施例13:連続ポンプ注入により投与されたOBポリペプ
チド 本実施例は、OBポリペプチドの連続注入が正常なマウ
スの体重損失をもたらすことを実証している。正常な
（肥満型でない）マウスに浸透ポンプ注入によってマウ
スのobポリペプチドを投与した。0.5mgタンパク質/kg体
重／日の用量が、６日目の注入により、基線体重から4.
62％損失（＋／−1.34％）を生じさせた。
材料および方法 動物 本実施例では、野生型（＋／＋）C57B16マウスを用い
た。マウスには、個室を与えゆったりとした条件下で飼
育した。初期時点におけるマウスの年齢は８週齢であ
り、また、動物の体重は安定していた。各グループ（媒
体（vehicle）対タンパク質）に対して、10匹のマウス
を用いた。
給餌および体重測定 マウスへは、粉末化食物フィーダー（Allentown Cagi
ng and Equipment）で粉末状齧歯類用食物（PMI Feeds,
Inc.）を与え、これにより通常の固形状食物を用いる場
合より正確および鋭敏な食物摂取の測定が可能であっ
た。体重は、６日間、毎日同時刻（午後2:00）に測定し
た。注入前の日の体重を、基線体重として定義した。
マウスOB DNAのクローニング E.coliでの発現のために、マウスOB DNAのクローニン
グを以下のように行った。発行された（Zhangら、1994,
上記，すなわち、実施例1,上記）公開ペプチド配列から
推定したDNA配列をE.coli最適コドンを用いて逆翻訳し
た。末端クローニング部位は、Xba IからBamH Iであっ
た。リボソーム結合エンハンサーおよび強いリボソーム
結合部位は、コード領域の前方に含まれていた。二本鎖
DNA配列を標準的な技法により合成した。正確なクロー
ンは、組換えタンパク質の発現およびレジデント（resi
dent）プラスミド中の正確なOB DNA配列の存在を実証す
ることにより確認した。アミノ酸配列（およびDNA配
列）は、以下の通りである： 組換えマウスmet OB（二本鎖）DNAおよびアミノ酸配
列（配列番号94および95）： 発現ベクターおよび宿主株 タンパク質を生産するために用いたプラスミド発現ベ
クターは、pCFM1656、アメリカンタイプカルチャーコレ
クション（ATCC）受託番号第69576号であった。上記のD
NAを、Xba IおよびBamH Iで線形化した発現ベクターpCF
M1656に連結し、E.coli宿主株FM5をトランスフォームさ
せた。E.coli FM5細胞は、Amgen Inc.,Thousand Oaks,C
Aにおいて、E.coli K−12株［Bachmannら、Bacteriol.R
ev.,40:116−167（1976）］から派生したが、これは組
み込みラムダファージリプレッサー遺伝子cI857［Sussm
anら、C.R.Acad.Sci.,254:1517−1579（1962）］を含ん
でいる。ベクター生産、細胞トランスフォーメーション
およびコロニー選択は標準的な方法（例えば、Sambrook
ら、1989,上記）に従って行った。宿主細胞を、LB培地
で成長させた。
タンパク質あるいは媒体の投与 この実験では、組換えマウスOBポリペプチドを一般的
に約0.9mg/ml濃度でリン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）
中で用いた。用いたアミノ酸配列（およびDNA配列）を
すぐ上に示す。タンパク質あるいは媒体（リン酸緩衝化
生理食塩水、pH7.4）を、浸透ポンプ注入によって投与
した。Alzert浸透ミニポンプ（Alza,Palo Alto,CA,mode
l no.1007D）を、それぞれのマウスの肩甲下領域にある
皮下ポケットへ外科的に配した。ポンプは、0.5mgタン
パク質/kg体重／日の用量のために、１時間当たり0.5ml
の溶液中にタンパク質を投与するように目盛りを付け
た。コントロール動物は、Alzert浸透ミニポンプを用い
てリン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）を注入した。
発酵プロセス：供給バッチプロセスとして知られる三相
発酵プロトコールをタンパク質を調製するために用い
た。培地組成は以下に説明する。
バッチ：窒素およびリン酸塩源を、発酵容器（Biolafit
te,12リットル容量）内で滅菌した（18〜20psiで35分間
122℃まで温度を上昇させることによった）。冷却時
に、炭素源、マグネシウム源、ビタミン源および微量金
属源を、無菌的に添加した。一晩培養（16時間あるいは
それ以上）500mlの上記組換えマウスタンパク質生産細
菌（LB培地内で成長）を、発酵槽に加えた。
供給材I:4.0〜6.0O.D.600間に達した際に、供給材Ｉを
培養物に加えた。その後、グルコースを成長速度（μ）
を制御するために、制限速度で加えた。自動システム
（分布制御システムと呼ばれる）は、0.15世代hr-1に成
長速度を制御するようプログラムした。
供給材II:O.D.が30に達したとき、温度をゆっくり42℃
まで上げ、供給材を以下に記述のように供給材IIに変更
した。その後、発酵を２時間ごとにサンプリングを行い
ながら10時間続けた。10時間後、発酵槽の中身を20℃以
下に冷却した後、遠心分離により採集した。
培地組成： バッチ: 10g/L 酵母エキス 5.25g/L （NH4）2SO4 3.5g/L K2HPO4 4.0g/L KH2PO4 5.0g/L グルコース 1.0g/L MgSO4・7H2O 2.0ml/L ビタミン溶液 2.0ml/L 微量金属溶液 1.0ml/L P2000 Antifoam 供給材I: 50g/L バクトトリプトン 50g/L 酵母エキス 450g/L グルコース 8.75g/L MgSO4・7H2O 10ml/L ビタミン溶液 10ml/L 微量金属溶液 供給材II:200g/L バクトトリプトン 100g/L 酵母エキス 110g/L グルコース ビタミン溶液（バッチ、供給材Ｉ）:0.5gビオチン、
0.4g葉酸、および4.2gリボフラビンを450mlのH2Oおよび
3mlの10N NaOHに溶解し、その後H2Oを加えて500mlとし
た。14gのピリドキシン−HClおよび61gのナイアシンを1
50mlのH2Oおよび50mlの10N NaOHに溶解し、その後をH2O
を加えて250mlとした。54gのパントテン酸を200mlのH2O
に溶解して250mlとした。３つの溶液を混合し、全容積
を10リットルとした。
微量金属溶液（バッチ、供給源Ｉ）： 塩化鉄（FeCl3・6H2O）:27g/L 塩化亜鉛（ZnCl2・4H2O）:2g/L 塩化コバルト（CoCl2・6H2O）:2g/L モリブデン酸ナトリウム（NaMoO4・2H2O）:2g/L 塩化カルシウム（CaCl2・2H2O）:1g/L 硫酸銅（CuSO4・5H2O）:1.9g/L ホウ酸（H3BO3）:0.5g/L 塩化マンガン（MnCl2・4H2O）:1.6g/L クエン酸ナトリウム二水和物:73.5g/L マウスOBポリペプチドの精製プロセス 精製は、以下の工程により行った（もし他に記されて
いなければ、以下の工程は４℃で行った）。
1.細胞ペースト.E.coli細胞ペーストを、５倍容量の7mM
EDTA（pH7.0）で懸濁した。EDTA中の細胞を、マイクロ
フルイダイザー（microfluidizer）の２つの流路によ
り、さらに破壊した。破壊した細胞を、J5−4.2ロータ
ーを用いてBeckman JB−６遠心機において4.2krpmで１
時間遠心分離した。
2.封入体洗浄＃1.上記から上清を除去し、ペレットを５
倍容量の7mMのEDTA（pH7.0）で再懸濁させ、ホモジナイ
ズした。この混合物を、工程１と同様に遠心分離した。
3.封入体洗浄＃2.上記から上清を除去し、ペレットを10
倍容量の20mM Tris（pH8.5）、10mM DTT、１％デオキシ
コール酸塩で再懸濁し、ホモジナイズした。この混合物
を、工程１と同様に遠心分離した。
4.封入体洗浄＃3.上記から上清を除去し、ペレットを10
倍容量の蒸留水で再懸濁し、ホモジナイズした。この混
合物を、工程１と同様に遠心分離した。
5.再フォールディング・ペレットを15倍容量の10mM HEP
ES（pH8.5）、１％ナトリウムサルコシン（Ｎ−lauryl
sarcosine）を用い、室温で再フォールディングさせ
た。60分後、溶液を60mM硫酸銅にし、その後一晩撹拌し
た。
6.サルコシンの除去．再フォールディング混合物を５倍
容量の10mM Tris緩衝液（pH7.5）で希釈し、その後、工
程１と同様に遠心分離した。上清を集め、Dowex 1−X4
樹脂、20〜50メッシュ、塩化物型とともに１時間撹拌し
て混合した（0.066％希釈再フォールディング混合物の
全容量）。次に、この混合物をカラムに通し、その溶出
液を集めた。サルコシンの除去は、HPLCによって確認し
た。
7.酸沈殿．以前の工程からの溶出液を集め、そのpHをpH
5.5に調整した後、室温で30分間インキュベートした。
この混合物を、工程１と同様に遠心分離した。
8.カチオン交換クロマトグラフィー．以前の工程からの
上清のpHをpH4.2に調整し、CMSepharose Fast Flow上に
流した。20カラム容量の塩勾配を、20mM NaOAC、pH4.
2、0M〜1.0M NaClで用いた。
9.HICクロマトグラフィー．上記工程からのピーク画分C
MSepharoseプール（紫外分析から確認）を、0.2Mの硫酸
アンモニウムとなるよう調整した。20カラム容量の逆塩
勾配は、0.4Mから0Mの硫酸アンモニウムを有する5mM Na
OAc,pH4.2で行った。この物質を濃縮し、PBS中へダイア
フィルトレートした。
結果 以下に、C57B16Jマウス（８週齢）の基線体重からの
パーセント（％）差を示す。
見て分かるように、６日間の連続注入処方の終わり
に、OBポリペプチドを与えていた動物では、基線と比較
して体重が４％以上減少した。これは、腹腔内（i.p.）
注射で観測された体重損失よりも、実質的に急速な体重
損失である。10mg/kg用量の組換えマウスOBポリペプチ
ドの毎日のi.p.注射では、受けた野生型（正常）マウス
において、32日注入期間の終わりで、ほんの2.6〜3.0％
の体重損失しか見られなかった。また、投与スケジュー
ル中いかなるときにも、体重損失は４％を超えることは
なかった（データは示していない）。本データは、連続
注入において20倍低い投与量（10mg/kgに対して0.5mg/k
g）が、より短い期間でさらなる体重損失を達成するこ
とを示す。
ここに見られた結果は、統計学的に有意である、例え
ば、−4.62％はｐ＜0.0001である。
実施例14:組換えヒトOBポリペプチドアナログのクロー
ニングおよび発現 本実施例は、OBポリペプチドのアナログ組換えヒト型
の組成および調製方法を提供する。
OB DNAのヒト型は、上記実施例13と同様に、20のコド
ン置換が設計されている２本鎖DNA（合成オリゴヌクレ
オチドから生成）を有するMlu IおよびBamH I部位間の
領域を置換することによってマウスOB DNAから構築し
た。マウス成熟35位のアルギニンおよびマウスの成熟74
位のロイシンに対するコドンは変化しなかった。下記の
配列ではMlu I部位を実線の下に示す。このDNAは、上記
のように、組換えマウスタンパク質と同様の様式で、pC
FM1656ベクター（ATCC受託番号第69576号）中に入れ
た。
組換えヒトmet OB（二本鎖）DNAおよびアミノ酸配列
（配列番号96および97） 発酵 組換えヒトOBポリペプチドを生産するための上記宿主
細胞の発酵を、組換えマウス物質について上述した条件
および組成を用いて行った。結果は、組換えヒトOB物質
（および微量の細菌性タンパク質）の収率（グラム／リ
ットル）（精製前）について解析を行い、そして細菌発
現を解析するために関連づけた。
略語:Ind.＋＿時間は、タンパク質発現の誘導後の時間
を意味し、これはpCFM1656を用いた組換えマウス物質の
ための実施例13の記載と同様である。
O.D.:光学濃度、分光光度計で測定。１リットル当たり1
O.D.当たりミリグラムmg/O.D.・L:1リットル当たり1O.
D.単位当たりタンパク質mgに換算した発現 組換えヒトobポリペプチドの精製 組換えヒトタンパク質は、上記実施例13のように組換
えマウスタンパク質の精製について用いられた方法と同
様の方法を用いて精製され得る。組換えヒトOBポリペプ
チドの調製のために、工程７の上清のpHを5.0に調整す
ることにより工程８を行い、これをCMSepharose fast f
lowカラムへ流した。20カラム容量塩勾配は、20mM NaOA
C,pH5.5,0M〜0.5MのNaClで行った。工程９はCMSepharos
eプールを水で４倍に希釈し、pHを7.5に調整することに
よって行った。この混合物を、0.7Mの硫酸アンモニアに
した。20カラム容量の逆塩勾配を5mMのNaOAc,pH5.5,0.2
Mから0Mの硫酸アンモニアで行った。その他の点では、
上記の工程は同一であった。
実施例15:用量応答研究 追加研究は、OBタンパク質の連続投与に対する用量応
答が存在することを実証した。この研究では、野生型マ
ウス（肥満型でない、体重35〜40gのCD−１マウス）に
実施例12および13と同様の方法を用いて組換えマウスOB
タンパク質を投与した。その結果は次の通りであった
（上記のように測定した、基線と比較した体重損失％を
示す）。
見て分かるように、0.03mg/kg/日から1mg/kg/日まで
用量の増加に伴い、体重損失も3.5％から7.5％へ増加し
た。注目すべきは14日目において、1mg/kg/日投与量の
結果が、14％の体重損失となったことである。
実施例16:ob/obマウスの体組成におけるレプチンの効果 C57Bl/6J ob/ob 16週齢マウスに、５μg/g/日のマウス
レプチン、媒体で処理するか、あるいは33日間いかなる
処理も施さなかった。第二の実験では、、７週齢ob/ob
マウスに10μg/g/日のヒトレプチン、マウスレプチン、
あるいは媒体で12日間処理した。マウスを屠殺し、全体
重、体組成、インスリンレベル、およびグルコースレベ
ルを評価した。これらの実験のデータを表11において報
告する。
体組成データは、以下の体の３つのコンパートメント
におけるレペチンの効果を実証している：脂肪量、痩身
体重、および水分量。データは、レプチンが、体脂肪量
を有意に減少させ、そして痩身体重には最低限の効果を
及ぼすことを示している。しかしながら、痩身体重への
効果は、統計上有意ではなかった。レプチン処理マウス
およびコントロール（未処理）マウスにおけるインスリ
ンおよびグルコースレベルの比較により、レプチンが血
糖およびインスリンレベルを低下させ、従ってこれらの
糖尿病の徴候を改善することが示された。
実施例17:野生型マウスにおけるレプチンの高用量効果 ob/obマウス（C57B1/6J＋/?）の痩身コントロールに、1
0μg/gのマウスレプチンあるいは媒体（PBS）を一日一
度腹腔内注射し、体重および食物摂取を次の二週間にわ
たって測定した。４日目から体重に有意な減少が現れ、
最初の一週間は食物摂取にも有意な減少が現れた。しか
しながら、一週間後には食物摂取のレベルは双方のマウ
スグループ間で区別が付かなくなった。動物を、二週間
後に屠殺し、体組成を測定した。体組成分析の結果を表
12に示す。データは、レプチンを与えた動物対PBSを与
えた動物の体脂肪の減少を示す。
第二の実験は、野生型マウスC57B1/6Jへの12.5μg/gの
マウスレプチンの一日二度の腹腔内注射の効果を示し
た。ポリペプチドの一日二度の注射と関連した体重およ
び食物摂取の有意の減少が見られた。この実験のため
に、動物は代謝室に配した。食物は、粉末状Purina＃50
01チャウダイエットで構成された。この食物は、チャウ
ダイエット、タピオカ、および水で構成された食物を用
いた初期の実験とは異なった。このように代謝室で用い
た食物は、高カロリーであった。これにより、消費した
食物の量が、水分含有食物を与えられたこれらの動物と
は異なることが説明される。
以下は、上記の開示および特に実験手順および考察に関
連する参考文献のリストである。
Baharyら、Genomics,11:33−47（1991）． Baharyら、Genomics,13:761−769（1992）． Baharyら、Molecular mapping of mouse chromosomes 4
and 6:Use of a flowsorted Robertsonian chromosome
（1991）． Blankら、Mammalian Genome,1:s51−s78（1991）． Bogardusら、Annals of the New York Academy of Scie
nses,630:100−115（1991）． Friedmanら、Mammalian Genome,1:130−144（1991）． Harris,FASEB J.,4:3310−3318（1990）． Jacobowitzら、N.Engl.JU.Med.,315:96−100（1986）． Kessey,Obesity,pp.144−166,Stunkard編.,Philadelphi
a,W.B.Sauders Co.（1980）． Kesseyら、Ann.Rev.Psychol.,37:109−133.22（198
6）． Leibelら、「肥満症における遺伝子変化および栄養：肥
満症の分子遺伝学へのアプローチ」Genetic Variation
and Nutrition,pp.90−101.1,SimopoulosおよびChilds
編、S.Karger,Basel（1990）． Siegelら、Cytogenet.Cell Genet.,61（３）:184−185
（1992）． 本発明は、その意図的あるいは不可欠な特性から逸脱
することなく、他の形式で実施され得たり、他の方法で
実行され得る。従って、本開示は、全ての点で例示的で
ありかつ非限定的であり、発明の範囲は添付の請求の範
囲によって示されてると考えられるべきである。また、
意味および等価の範囲内の全ての変化が、本発明中に含
まれることが意図される。
様々な参考文献が本明細書に引用され、それぞれの文
献は、その全体が、本明細書中で参考として援用され
る。
クレームされた発明は、上記の明細書および容易に入
手できる参考文献および開始物質に従って実施可能であ
る。それにも関わらず、出願人は、1995年８月９日に以
下の寄託をアメリカンタイプカルチャーコレクション、
12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,20852−1178,U.S.
A.に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ
タペスト条約の規定に従って行った：プラスミドpETH14
保有E.coli H14、受託番号第69880号；プラスミドpETM9
保有E.coli M9;受託番号第69879号。
配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：ザ ロックフェラー ユニバーシティ
ー （ii）発明の名称：体重のモジュレーター、対応する
核酸およびタンパク質、ならびにその診断および治療用
途 （iii）配列数:99 （iv）連絡住所： （Ａ）名称：クローバー アンド ジャクソン （Ｂ）番地：ハッケンザック アベニュー 411 （Ｃ）市：ハッケンザック （Ｄ）州：ニュー ジャージー （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:07601 （ｖ）コンピューター読み出し形態： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用 （Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃1.0,
バージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先願データ： （Ａ）出願番号:08/483,211 （Ｂ）出願日:1995年６月７日 （Ｃ）分類： （vii）先願データ： （Ａ）出願番号:08/438,431 （Ｂ）出願日:1995年５月10日 （Ｃ）分類： （vii）先願データ： （Ａ）出願番号:08/347,563 （Ｂ）出願日:1994年11月30日 （Ｃ）分類： （vii）先願データ： （Ａ）出願番号:08/292,345 （Ｂ）出願日:1994年８月17日 （Ｃ）分類： （viii）代理人／事務所情報： （Ａ）氏名：ジャクソン エスク.,ディビッド エ
ー． （Ｂ）登録番号:26,742 （Ｃ）照会／記録番号:600−１−087 PCT （ix）電話回線情報： （Ａ）電話:201 487−5800 （Ｂ）テレファックス:201 343−1684 （Ｃ）テレックス:133521 （２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:2793塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（genomic） （Ａ）特徴：マウスob cDNA （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源 （Ａ）生物名：マウス （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:57..560 （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:168アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （Ａ）特徴：マウスobポリペプチド （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:700塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （Ａ）特徴：ヒトob cDNAここで任意のヌクレオチ
ドを表す （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:46..546 （xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:167アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （Ａ）特徴：ヒトobポリペプチド （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:166アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （Ａ）特徴:49位でGlnを欠くマウスobポリペプチド （iv）起源： （Ａ）生物名：マウス （xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:167アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （Ａ）特徴:49位でGlnを欠くヒトobポリペプチド （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号6: （２）配列番号７の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:175塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（genomic） （Ａ）特徴：エクソン2G7 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （xi）配列：配列番号7: （２）配列番号８の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：エクソン2G7に対するPCR 5'プライマ
ー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （xi）配列：配列番号8: （２）配列番号９の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:22塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）エクソン2G7に対するPCR 3'プライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:YES （xi）配列：配列番号9: （２）配列番号10の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:23アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （Ａ）特徴：推定のＮ末端シグナルペプチド （xi）配列：配列番号10: （２）配列番号11の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:287塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ii）配列の種類:DNA（plasmid） （Ａ）特徴：発現ベクターpET−15b （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:T7プロモーター （Ｂ）存在位置:20..37 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:lacオペレーター （Ｂ）存在位置:39..64 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:108..243 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:His−Tag （Ｂ）存在位置:123..137 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：トロンビン切断部位 （Ｂ）存在位置:184..196 （xi）配列：配列番号11: （２）配列番号12の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:45アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号12: （２）配列番号13の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:32塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マウス5'プライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （xi）配列：配列番号13: （２）配列番号14の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:32塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マウス3'プライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列：配列番号14: （２）配列番号15の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:32塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：ヒト5'プライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （xi）配列：配列番号15: （２）配列番号16の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:32塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：ヒト3'プライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列：配列番号16: （２）配列番号17の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:11塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （Ａ）特徴:obにおけるスプライスアクセプター部
位 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：スプライスアクセプター部
位 （xi）配列：配列番号17: （２）配列番号18の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:16アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：ペプチド （Ａ）特徴:obペプチドフラグメント （ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント （vi）起源： （Ａ）生物名：マウス （xi）配列：配列番号18: （２）配列番号19の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:15アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：ペプチド （Ａ）特徴:obペプチドフラグメント （ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント （iv）起源： （Ａ）生物名：マウス （xi）配列：配列番号19: （２）配列番号20の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:19アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：ペプチド （Ａ）特徴:obペプチドフラグメント （ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント （vi）起源： （Ａ）生物名：マウス （xi）配列：配列番号20: （２）配列番号21の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：ペプチド （Ａ）特徴:obペプチドフラグメント （ｖ）フラグメント型：カルボキシル末端 （vi）起源： （Ａ）生物名：マウス （xi）配列：配列番号21: （２）配列番号22の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:414塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（genomic） （Ａ）特徴：第１エキソンの非コード配列上流を含
むヒトob遺伝子の一部分、第１エキソンのコード配列、
および第１イントロンの5'領域 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:38..181 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：第１イントロンの5'領域 （Ｂ）存在位置:182..414 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:HOB 1gF DNAプライマーが生
成されたヒトob遺伝子の5'非コード配列 （Ｂ）存在位置:11..28 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:HOB 1gRプライマーが生成さ
れたヒトob遺伝子のイントロンの配列 （Ｂ）存在位置:241..260 （xi）配列：配列番号22: （２）配列番号23の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:48アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （Ａ）特徴：第１エキソンによりコードされるヒト
obタンパク質のＮ末端部分 （xi）配列：配列番号23: （２）配列番号24の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:801塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（genomic） （Ａ）特徴：第１イントロンの3'領域、第２エキソ
ンのコード配列、および3'非コード配列を含むヒトob遺
伝子の一部分 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:291..648 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：第１イントロンの3' （Ｂ）存在位置:1..290 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:HOB 2gFプライマーが生成さ
れたヒトob遺伝子のイントロンの配列 （Ｂ）存在位置:250..269 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:HOB 2gR DNAプライマーが生
成されたヒトob遺伝子の3'非コード配列 （Ｂ）存在位置:707..728 （xi）配列：配列番号24: （２）配列番号25の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:119アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （Ａ）特徴：第２エキソンによりコードされるヒト
obタンパク質のＮ末端部分 （xi）配列：配列番号25: （２）配列番号26の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:8アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：ペプチド （ｖ）フラグメント型：中間部 （vi）起源： （Ａ）生物名:pichia酵母 （xi）配列：配列番号26: （２）配列番号27の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:4アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：ペプチド （ｖ）フラグメント型：中間部 （vi）起源： （Ａ）生物名:pichia酵母 （xi）配列：配列番号27: （２）配列番号28の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:4アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：ペプチド （ｖ）フラグメント型：中間部 （vi）起源： （Ａ）生物名:pichia酵母 （xi）配列：配列番号28: （２）配列番号29の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：ヒトob遺伝子の5'非コード配列から生
成されたHOB lgF DNAプライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （xi）配列：配列番号29: （２）配列番号30の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：ヒトob遺伝子の第１イントロン配列か
ら生成されたHOB lgR DNAプライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:YES （xi）配列：配列番号30: （２）配列番号31の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：ヒトob遺伝子の第１イントロン配列か
ら生成されたHOB 2gF DNAプライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （xi）配列：配列番号31: （２）配列番号32の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:22塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：ヒトob遺伝子の3'非コード配列から生
成されたHOB 2gR DNAプライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:YES （xi）配列：配列番号32: （２）配列番号33の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:51塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ii）配列の種類:DNA （Ａ）特徴:pPIC.9クローニング部位 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （xi）配列：配列番号33: （２）配列番号34の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:40塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：ヒトob cDNA配列を増幅するためのPCR
5'プライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （xi）配列：配列番号34: （２）配列番号35の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:31塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：ヒトob cDNA配列を増幅するためのPCR
3'プライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:YES （xi）配列：配列番号35: （２）配列番号36の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:40塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マウスob cDNA配列を増幅するためのP
CR 5'プライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （xi）配列：配列番号36: （２）配列番号37の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:31塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マウスob cDNA配列を増幅するためのP
CR 3'プライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:YES （xi）配列：配列番号37: （２）配列番号38の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:4アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （Ａ）特徴：トロンビン切断後の再生マウスobタン
パク質のＮ末端におけるテトラペプチド （vi）起源： （Ａ）生物名：マウス （xi）配列：配列番号38: （２）配列番号39の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:19塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1734 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号39: （２）配列番号40の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1734 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号40: （２）配列番号41の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:19塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS494 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号41: （２）配列番号42の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:22塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS494 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号42: （２）配列番号43の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS883 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号43: （２）配列番号44の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS883 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号44: （２）配列番号45の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS2359 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号45: （２）配列番号46の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:19塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS2359 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号46: （２）配列番号47の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS2336 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号47: （２）配列番号48の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS2336 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号48: （２）配列番号49の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1218 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号49: （２）配列番号50の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1218 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号50: （２）配列番号51の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1402 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号51: （２）配列番号52の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1402 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号52: （２）配列番号53の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS999 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号53: （２）配列番号54の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:19塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS999 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号54: （２）配列番号55の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:22塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1751 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号55: （２）配列番号56の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1751 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号56: （２）配列番号57の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1174 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号57: （２）配列番号58の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1174 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号58: （２）配列番号59の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:19塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS2061 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号59: （２）配列番号60の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS2061 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号60: （２）配列番号61の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS2588 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号61: （２）配列番号62の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS2588 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号62: （２）配列番号63の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:24塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS808 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号63: （２）配列番号64の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:23塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS808 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号64: （２）配列番号65の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1392 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号65: （２）配列番号66の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1392 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号66: （２）配列番号67の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1148 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号67: （２）配列番号68の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:19塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1148 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号68: （２）配列番号69の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1529 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号69: （２）配列番号70の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS1529 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号70: （２）配列番号71の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:21塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS2619 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号71: （２）配列番号72の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS2619 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号72: （２）配列番号73の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS404 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号73: （２）配列番号74の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS404 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号74: （２）配列番号75の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS2367 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号75: （２）配列番号76の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：配列タグ部位に特異的なPCRプライマ
ーsWSS2367 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号76: （２）配列番号77の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーUT528 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号77: （２）配列番号78の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーUT528 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号78: （２）配列番号79の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFMa065zg9 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号79: （２）配列番号80の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:19塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFMa065zg9 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号80: （２）配列番号81の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:19塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFMa125wh1 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号81: （２）配列番号82の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFMa125wh1 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号82: （２）配列番号83の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFM309yf10 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号83: （２）配列番号84の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFM309yf10 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号84: （２）配列番号85の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:16塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFM218xf10 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号85: （２）配列番号86の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFM218xf10 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号86: （２）配列番号87の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:16塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFM106xc1 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号87: （２）配列番号88の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFM206xc1 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号88: （２）配列番号89の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:16塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFM199xh12 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号89: （２）配列番号90の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:17塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFM199xh12 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号90: （２）配列番号91の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFMa345wc9 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号91: （２）配列番号92の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マーカーAFMa345wc9 （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （xi）配列：配列番号92: （２）配列番号93の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:24塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（primer） （Ａ）特徴：マウスPax4遺伝子に対するプライマー （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：マウス （xi）配列：配列番号93: （２）配列番号94の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:491塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （Ａ）特徴：組換えマウスmet ob （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：マウス （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:41..478 （xi）配列：配列番号94: （２）配列番号95の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:146アミノ酸 （Ｂ）型アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （Ａ）特徴：組換えマウスmet obタンパク質 （xi）配列：配列番号95: （２）配列番号96の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:454塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （Ａ）特徴：組換えヒトmet ob （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:4..444 （xi）配列：配列番号96: （２）配列番号97の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:147アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （Ａ）特徴：組換えヒトmet obタンパク質 （xi）配列：配列番号97: （２）配列番号98の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:21アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ｖ）フラグメント型:N−末端His−タグ （xi）配列：配列番号98: （２）配列番号99の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ｖ）フラグメント型:N−末端His−タグ （xi）配列：配列番号99:
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ１２Ｎ 1/19 14/47 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:84 Ｃ１２Ｑ 1/68 1:19 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ０８／４３８，４３１ (32)優先日 平成７年５月10日(1995．5．10) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４８３，２１１ (32)優先日 平成７年６月７日(1995．6．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 早期審理対象出願 (72)発明者 ザン，イイン アメリカ合衆国 ニューヨーク 10010, ニューヨーク，ウォーターサイド プレ イス 30，アパートメント 27エフ (72)発明者 プロエンカ，リカード アメリカ合衆国 ニューヨーク 11102, アストリア，30ティーエイチ ストリー ト 26―62 (72)発明者 マフェイ，マルガリータ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク，イースト 63アールディ ストリート 504，アパートメント 36エス (72)発明者 ハラース，ジェフリー エル. アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク，イースト 70ティーエイ チ ストリート 420，アパートメント ９ジェイ (72)発明者 ガジワラ，ケタン アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク，イースト 63アールディ ストリート 500，アパートメント 11エフ (72)発明者 バーリー，スティーブン ケイ. アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク，イースト 63アールディ ストリート 500，アパートメント 20エイ

Claims (49)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号２、４、５、または６のアミノ酸
    配列を含む、動物において体重を減少させ得る肥満症
    （OB）ポリペプチド、あるいは、体重減少活性を有する
    そのアナログであって、ここで１または数個のアミノ酸
    残基が該アミノ酸配列において欠失、置換または挿入さ
    れている、アナログ。
  2. 【請求項２】アミノ酸53、56、71、85、89、92、95、9
    8、110、118、121、122、126、127、128、129、132、13
    9、157、159、163、および166（配列番号４の番号付け
    に従う）からなる群から選択される１つまたはより多く
    のアミノ酸が別のアミノ酸と置換されている、請求項１
    に記載のヒトOBポリペプチドアナログ。
  3. 【請求項３】前記置換が、配列番号２に記載のマウスOB
    ポリペプチドの対応する位置の分岐アミノ酸とで行われ
    る、請求項２に記載のヒトOBポリペプチドアナログ。
  4. 【請求項４】配列番号２、４、５、または６に記載のOB
    ポリペプチドアミノ酸配列全体と、83％以上のアミノ酸
    配列同一性を有する、請求項１に記載のOBポリペプチド
    アナログ。
  5. 【請求項５】以下のポリペプチドからなる群から選択さ
    れる、請求項１〜４のいずれかに記載のOBポリペプチ
    ド： （ａ）１位から21位の残基が欠失されている：および （ｂ）21位でメチオニン、または18位から21位でグリシ
    ン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列（配列番号3
    8）、または１位から21位でメチオニン−グリシン−セ
    リン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−
    ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン−セリン
    −グリシン−ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン
    −グリシン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列（配
    列番号98）、または14位から21位でロイシン−グルタミ
    ン酸−リジン−アルギニン−グルタミン酸−アラニン−
    グルタミン酸−アラニン配列（配列番号26）、または18
    位から21位でグルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−
    アラニン配列（配列番号27）、または18位から21位でロ
    イシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン配列（配列
    番号28）、または２位から21位でメチオニン−グリシン
    −セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジ
    ン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン−セ
    リン−グリシン−ロイシン−バリン−プロリン−アルギ
    ニン−グリシン−セリン−プロリン配列（配列番号9
    9）、または19位から21位でグリシン−セリン−プロリ
    ン配列をＮ末端に有する（ａ）のポリペプチド。
  6. 【請求項６】請求項１から５のいずれかに記載の組換え
    OBポリペプチド。
  7. 【請求項７】請求項１から５のいずれかに記載の化学合
    成OBポリペプチド。
  8. 【請求項８】前記OBポリペプチドに、安定性の増大、循
    環時間の増大および免疫原性の低下から選択される効果
    を与える１つまたはそれより多くの水溶性ポリマーが結
    合している、請求項１〜７のいずれかに記載のOBポリペ
    プチドの誘導体。
  9. 【請求項９】前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコ
    ールである、請求項８に記載の誘導体。
  10. 【請求項１０】モノPEG化、ジPEG化、トリPEG化、また
    はテトラPEG化されている、請求項９に記載の誘導体。
  11. 【請求項１１】Ｎ末端がモノPEG化されている、請求項1
    0に記載の誘導体。
  12. 【請求項１２】配列番号４の22位から167位のアミノ酸
    残基または配列番号６の22位から166位の残基を含むOB
    ポリペプチドの誘導体であって、該ポリペプチドがＮ末
    端でモノPEG化されている、誘導体。
  13. 【請求項１３】配列番号４の22位から167位のアミノ酸
    残基または配列番号６の22位から166位の残基を含み、
    そして21位にメチオニンを有するOBポリペプチドの誘導
    体であって、該ポリペプチドがＮ末端でモノPEG化され
    ている、誘導体。
  14. 【請求項１４】請求項１から５のいずれかに記載のOBポ
    リペプチドをコードする単離された核酸分子。
  15. 【請求項１５】哺乳動物の体重を減少させる生物学的活
    性を有するOBポリペプチドをコードするDNA分子であっ
    て、以下からなる群から選択される、DNA分子： （ａ）配列番号１および３に記載のDNA分子またはそれ
    らのフラグメント； （ｂ）（ａ）に定義したDNA分子と高い厳密性の条件下
    でハイブリダイズするDNA分子またはそれらのフラグメ
    ント；および （ｃ）該DNA分子のいずれかによりコードされるアミノ
    酸配列の発現をコードするDNA分子。
  16. 【請求項１６】配列番号22および24のヒトゲノムDNA分
    子である、請求項15に記載のDNA分子。
  17. 【請求項１７】以下に記載されるアミノ酸配列からなる
    群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
    コードする、請求項14に記載のDNA分子： （ａ）配列番号2; （ｂ）配列番号２の22位から167位のアミノ酸； （ｃ）配列番号4; （ｄ）配列番号４の22位から167位のアミノ酸； （ｅ）配列番号5; （ｆ）配列番号５の22位から166位のアミノ酸； （ｇ）配列番号6; （ｈ）配列番号６の22位から166位のアミノ酸；および （ｉ）以下からなる群から選択されるアミノ酸配列をＮ
    末端に有する（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、または（ｈ）の
    アミノ酸配列： （１）メチオニン、 （２）グリシン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列
    （配列番号38）、および （３）メチオニン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチ
    ジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジ
    ン−ヒスチジン−セリン−セリン−グリシン−ロイシン
    −バリン−プロリン−アルギニン−グリシン−セリン−
    ヒスチジン−メチオニン配列（配列番号98）。
  18. 【請求項１８】以下からなる群から選択されるアミノ酸
    配列をＮ末端に有する（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、または
    （ｈ）のポリペプチドをコードする、請求項17に記載の
    DNA分子： （１）ロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン−
    グルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配列
    （配列番号26）、 （２）グルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニ
    ン配列（配列番号27）、 （３）ロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン配
    列（配列番号28）、 （４）メチオニン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチ
    ジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジ
    ン−ヒスチジン−セリン−セリン−グリシン−ロイシン
    −バリン−プロリン−アルギニン−グリシン−セリン−
    プロリン配列（配列番号99）、および （５）グリシン−セリン−プロリン配列。
  19. 【請求項１９】配列番号３のタンパク質コード配列とし
    て記載される配列を含む、請求項14に記載のDNA分子。
  20. 【請求項２０】配列番号３の22位から167位のアミノ酸
    をコードする配列として記載される配列を含む、請求項
    14に記載のDNA分子。
  21. 【請求項２１】請求項14から20のいずれかに記載のDNA
    分子を含むベクター。
  22. 【請求項２２】発現制御配列と作動可能に関連された、
    請求項14、15、19、または20のいずれかに記載のDNA分
    子を含む発現ベクター。
  23. 【請求項２３】発現制御配列と作動可能に関連された、
    請求項16または18に記載のDNA分子を含む発現ベクタ
    ー。
  24. 【請求項２４】請求項14に記載のDNA分子または請求項2
    1から23のいずれかに記載の発現ベクターでトランスフ
    ォームまたはトランスフェクトされた単細胞宿主。
  25. 【請求項２５】前記単細胞宿主が細菌、酵母、哺乳動物
    細胞、植物細胞、昆虫細胞、および組織培養におけるヒ
    ト細胞からなる群から選択される、請求項24に記載の単
    細胞宿主。
  26. 【請求項２６】前記単細胞宿主が、E.coliおよび酵母か
    らなる群から選択される、請求項24に記載の単細胞宿
    主。
  27. 【請求項２７】前記単細胞宿主が、Pichiaである、請求
    項24に記載の単細胞宿主。
  28. 【請求項２８】前記単細胞宿主が哺乳動物細胞であり、
    そして前記OBポリペプチドをコードする配列に対して機
    能的に近接した位置に発現調節配列を挿入することから
    なる相同的組換え事象によって、OBポリペプチドの高発
    現を可能にするようにインビトロで改変された、請求項
    25に記載の単細胞宿主。
  29. 【請求項２９】前記発現調節配列がOBポリペプチド発現
    調節配列であり、そして前記相同的組換え事象が変異OB
    ポリペプチド発現制御配列を置き換える、請求項28に記
    載の細胞。
  30. 【請求項３０】前記発現制御配列挿入部がOBポリペプチ
    ド制御配列ではない、請求項29に記載の細胞。
  31. 【請求項３１】以下の工程を包含する、OBポリペプチド
    を調製する方法： （ａ）請求項24から30のいずれかに記載の細胞をOBポリ
    ペプチドの発現を提供する条件下で培養する工程；およ
    び （ｂ）該発現されたOBポリペプチドを回収する工程。
  32. 【請求項３２】前記細胞が細菌または酵母である、請求
    項31に記載の方法。
  33. 【請求項３３】以下の工程をさらに包含する、請求項31
    または32に記載の方法： （ｃ）前記OBポリペプチドをNiキレートカラムでのクロ
    マトグラフィーにかける工程；および （ｄ）前記OBポリペプチドをゲル濾過により精製する工
    程。
  34. 【請求項３４】工程（ｃ）後かつ工程（ｄ）前に、前記
    OBポリペプチドを強陽イオン交換カラムでのクロマトグ
    ラフィーにかける工程をさらに包含する、請求項33に記
    載の方法。
  35. 【請求項３５】請求項１から７のいずれかに記載のOBポ
    リペプチドまたは請求項31から34のいずれかに記載の方
    法により生産されるOBポリペプチドに対して特異的な抗
    体。
  36. 【請求項３６】モノクローナル抗体またはポリクローナ
    ル抗体である、請求項35に記載の抗体。
  37. 【請求項３７】検出可能な標識で標識された、請求項36
    に記載の抗体。
  38. 【請求項３８】請求項36に記載のモノクローナル抗体を
    生産する不死化細胞系。
  39. 【請求項３９】以下の工程を包含する、OBポリペプチド
    に対して特異的な抗体を調製する方法： （ａ）請求項１から７のいずれかに記載のOBポリペプチ
    ドまたは請求項31から34のいずれかに記載の方法により
    生産されたOBポリペプチドを、キャリアタンパク質に複
    合化させる工程； （ｂ）アジュバントと混合させた工程（ａ）のOBポリペ
    プチドフラグメント−キャリアタンパク質複合体で非ヒ
    ト宿主動物を免疫する工程；および （ｃ）該免疫非ヒト宿主動物から抗体を得る工程。
  40. 【請求項４０】以下の工程を包含する、試料においてOB
    ポリペプチドの存在を測定する方法： （ａ）OBポリペプチドを含有すると思われる試料を、請
    求項１から７のいずれかに記載のOBポリペプチドまたは
    請求項31から34のいずれかに記載の方法により生産され
    たOBポリペプチドに特異的に結合する抗体と、該抗体お
    よび該OBポリペプチドを含む反応複合体の形成を可能に
    する条件下で接触させる工程；および （ｂ）該抗体および該試料中の該OBポリペプチドを含む
    反応複合体の形成を検出する工程であって、ここで該反
    応複合体の形成の検出が該試料におけるOBポリペプチド
    の存在を示す、工程。
  41. 【請求項４１】前記抗体が固相支持体に結合される、請
    求項40に記載の方法。
  42. 【請求項４２】以下の工程を包含する、生物学的試料に
    おけるOBポリペプチドレベルを測定するインビトロ方
    法： （ａ）請求項40または41に記載の方法に従って、生物学
    的試料における反応複合体の形成を検出する工程；およ
    び （ｂ）形成された反応複合体の量を測定する工程であっ
    て、ここで該反応複合体の量は、該生物学的試料におけ
    るOBポリペプチドレベルに対応する、工程。
  43. 【請求項４３】以下の工程を包含する、哺乳動物被験体
    におけるOBポリペプチドレベルの上昇または低下を検出
    する方法： （ａ）請求項42に記載の哺乳動物被験体由来の生物学的
    試料におけるOBポリペプチドレベルを測定する工程；お
    よび （ｂ）工程（ａ）において検出されたレベルと、正常被
    験体または初期の該被験体に存在するOBポリペプチドレ
    ベルとを比較する工程。
  44. 【請求項４４】哺乳動物被験体におけるOBポリペプチド
    のレベルの上昇または低下をモニターする方法であっ
    て、請求項42に記載の方法に従って、哺乳動物被験体か
    ら異なる時点で得られた一連の生物学的試料におけるOB
    ポリペプチドレベルを測定する工程を包含する、方法。
  45. 【請求項４５】請求項１から７のいずれかに記載のOBポ
    リペプチドまたは請求項31から34のいずれかに記載の方
    法により生産されたOBポリペプチドと、薬学的に受容可
    能なキャリアとを含む、動物の体重を減少させるための
    薬学的組成物。
  46. 【請求項４６】請求項１から７のいずれかに記載のOBポ
    リペプチドまたは請求項31から34のいずれかに記載の方
    法により生産されたOBポリペプチドと、薬学的に受容可
    能なキャリアとを含む、個体の体重を減少させるための
    体型改善美容組成物。
  47. 【請求項４７】動物の体重を減少させるための医薬品の
    製造のための、請求項１から７のいずれかに記載のOBポ
    リペプチドまたは請求項31から34のいずれかに記載の方
    法により生産されたOBポリペプチドの使用。
  48. 【請求項４８】糖尿病、高血圧、および高コレステロー
    ル症からなる群から選択される障害の処置における哺乳
    動物の体重を減少させるための医薬品の製造のための、
    請求項１から７のいずれかに記載のOBポリペプチドまた
    は請求項31から34のいずれかに記載の方法により生産さ
    れたOBポリペプチドの使用。
  49. 【請求項４９】糖尿病、高血圧、および高コレステロー
    ル症の処置のための医薬品と組み合わせて用いられる哺
    乳動物の体重を減少させるための医薬品の製造のため
    の、請求項１から７のいずれかに記載のOBポリペプチド
    または請求項31から34のいずれかに記載の方法により生
    産されたOBポリペプチドの使用。
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