JP3193146B2 - Ｃ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎の病因である
Ｃ型肝炎ウイルス（以下、ＨＣＶとも略記する）に対す
る抗体を検出するためのＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反
応試薬に関する。

【０００２】

【従来技術】Ｃ型肝炎はＨＣＶにより引き起こされるも
のであり、輸血後非Ａ非Ｂ型慢性肝炎の９割以上はＨＣ
Ｖの感染により引き起こされる肝炎と言われている。Ｈ
ＣＶの遺伝子の一部がヨーロッパ特許ＥＰ0318216（198
9年公開）、及びヨーロッパ特許ＥＰ0388232（1990年公
開）に報告されている。

【０００３】これまでの研究によると、ＨＣＶは遺伝子
配列全長約10ｋｂ（約１万ヌクレオチド）のＲＮＡウイ
ルスと考えられている。ＨＣＶ遺伝子から生産される蛋
白のうち、抗原活性の高いポリペプチドを抗原としてＣ
型肝炎診断用試薬が開発されてきた。例えば、ヨーロッ
パ特許0318216では非構造蛋白領域をコードする遺伝子
の一部を酵母の発現ベクターに挿入し、この遺伝子を発
現させて、Ｃ100と呼ばれるＨＣＶ抗原活性ポリペプチ
ドを抗原に用いたＣ型肝炎診断用試薬もその一つであ
る。

【０００４】Ｃ型肝炎診断には現在、１種あるいは２種
のＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを抗原として用いた酵素
免疫法（以下、ＥＩＡ法とも略す）及び受身凝集反応
（以下、ＰＡ法とも略す）による検査法が用いられてい
る。上記診断薬は輸血時におけるＣ型肝炎の予防に効果
をあげている。しかしながら、１種及び２種のＨＣＶ原
活性ポリペプチドを抗原として用いているため、偽陰
性、偽陽性が多く且つＨＣＶ感染初期の診断の感度に問
題があるのが現状である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】現在用いられているＣ
型肝炎診断薬は輸血時のＣ型肝炎ウイルスの感染の予防
に大きな効果をあげているが、より感度及び特異性の高
く且つＨＣＶ感染初期に診断可能な診断薬の開発が望ま
れている。本発明者はこの課題を解決すべく鋭意研究を
行い、その結果、加熱したＣ型肝炎ウイルス遺伝子由来
のＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを抗原として使用するこ
とにより診断の感度及び特異性の優れたＣ型肝炎診断用
免疫学的凝集反応試薬が得られることを見い出し、本発
明を完成するに到った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、加熱処理され
たＣ型肝炎ウイルス由来遺伝子のＨＣＶ抗原活性ポリペ
プチドを抗原として使用することを特徴とするＣ型肝炎
診断用免疫学的凝集反応試薬にある。上記ＨＣＶ抗原活
性ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨ
ＣＶ抗原活性ポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列
を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプチド、配列番号３のアミ
ノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプチド、配列番号
４のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを
含むものである。

【０００７】さらに、本発明は、配列番号１のアミノ酸
配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプチド、配列番号２の
アミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプチド、配列
番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプチ
ド及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性
ポリペプチドを不溶性担体粒子に担持してなるＣ型肝炎
診断用免疫学的凝集反応試薬にある。

【０００８】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
おける加熱処理とは、ポリペプチドの混合物を所定の温
度に加熱することにより行うものである。この加熱温度
は20℃以上80℃以下が有効である。好ましくは25℃以上
60℃以下であり、さらに好ましくは35℃以上50℃以下で
ある。ポリペプチドの加熱処理は、緩衝作用のある緩衝
液中で行い、その種類はいずれでもよい。例えば、燐酸
緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等
々である。ｐＨについてもいずれでもよいが中性領域が
望ましい。好ましくは燐酸緩衝液、ｐＨ6.0 から8.0が
望ましい。処理時間は10分間以上であれば、いずれでも
よく、好ましくは１０分間から５時間以下、さらに好ま
しくは３０分間以上２時間以下である。

【０００９】本発明で言うＣ型肝炎ウイルス遺伝子は、
例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.87,pp.9524 〜95
28(1990)に記載されている塩基配列を有する全長約１０
ｋｂ（約１万ヌクレオチド）のＲＮＡである。ＨＣＶは
ＲＮＡウイルスであるが、ＨＣＶ由来のＲＮＡより逆転
写酵素により作り出されたｃＤＮＡも該Ｃ型肝炎ウイル
ス遺伝子に該当する。

【００１０】該Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子は、輸血後非Ａ
非Ｂ肝炎患者の血清からウイルス遺伝子を分離して作製
したｃＤＮＡライブラリーから得ることが出来る。例え
ば、まず患者血清から超遠心によりＣ型肝炎ウイルスを
分離し、次いでウイルスから遺伝子ＲＮＡを調製し、該
ＲＮＡに対して逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを合成
し、しかるのちに該ｃＤＮＡ断片をプラスミドベクター
あるいはファージベクターに挿入して、ｃＤＮＡライブ
ラリーを調製する。次いで、該ｃＤＮＡライブラリー
を、輸血後非Ａ非Ｂ肝炎患者の血清（抗ＨＣＶ抗体を含
有する血清）を用いイムノスクリーニングすることによ
り、目的の遺伝子を得ることができる。また公知のＨＣ
Ｖ遺伝子の塩基配列をもとにＤＮＡプローブを合成し
て、ｃＤＮＡライブラリーをＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダ
イゼーションによりスクリーニングしてもよい。また別
の方法としては Proceedings of the Japan Academy, V
ol.65, Ser.B, No.9, pp.219〜223(1989).に示される方
法、即ち逆転写酵素とＰＣＲ法とを組み合わせたＲＴ−
ＰＣＲ法により目標の領域を遺伝子増幅させて、その増
幅させた遺伝子断片をクローニングする方法も有効であ
る。

【００１１】本発明におけるＨＣＶ抗原活性ポリペプチ
ドはＣ型肝炎患者血清及び血漿に含まれる抗ＨＣＶ抗体
と免疫学的反応性を有する。すなわち、抗ＨＣＶ抗体に
対するエピトープ部位を有し、抗原抗体反応によりＣ型
肝炎患者血清及び血漿中の抗ＨＣＶ抗体と特異的に結合
する特性を有する。該ＨＣＶ抗原活性ポリペプチドはＣ
型肝炎診断用試薬の抗原として用いることが可能であ
る。

【００１２】該ＨＣＶ抗原活性ポリペプチドはＨＣＶの
遺伝子により生産されるポリペプチドである。さらにＨ
ＣＶ抗原活性ポリペプチドの長さはいずれでもよく、好
ましくは３アミノ酸残基以上3000アミノ酸残基以下、さ
らに好ましくは３アミノ酸残基以上2000アミノ酸残基以
下である。該ＨＣＶ抗原活性ポリペプチドは、通常知ら
れている遺伝子発現系、即ち、大腸菌のホスト・ベクタ
ー系、枯草菌のホスト・ベクター系、酵母のホスト・ベ
クター系、昆虫細胞あるいは昆虫のホスト・ベクター
系、動物細胞のホスト・ベクター系等を利用して発現が
可能である。このうち、大腸菌は好適に利用できる。大
腸菌を用いて該ＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを発現する
には、まず大腸菌で発現可能なベクターにＨＣＶの遺伝
子を挿入し組換えベクターを作製する。ベクターは特に
限定されず、大腸菌のベクターとして通常用いられるベ
クターならば如何なるベクターでも利用できるが、特に
遺伝子発現が高頻度で起こるベクターは好適に利用され
る。例えば、一連のｐＵＣベクター（宝酒造（株）製
品）、一連のｐＴＶベクター（宝酒造（株）製品）、一
連のｐＴＺベクター（東洋紡績（株）製品）、一連のｐ
ＥＴ（Methods in enzymology,Vol.185に示される）な
どが利用できる。また、一連のｐＵＥＸベクター（アマ
シャム・ジャパン（株）製品）、一連のｐＥＸベクター
（ベーリンガー・マンハイム山之内（株）製品）を利用
すれば、ＨＣＶ抗原活性ポリペプチドをβ−ガラクトシ
ダーゼとの融合ポリペプチドとして発現させることがで
きる。大腸菌で発現可能なベクターには、通常は大腸菌
内で働く遺伝子発現のためのプロモーターや、それをコ
ントロールするオペレーターが附属している。このよう
なベクターのプロモーターの下流にある適当な制限酵素
部位を利用してＨＣＶ遺伝子を挿入することにより、組
換えベクターが作製される。組換えベクターにより大腸
菌を形質転換し、該形質転換大腸菌を培養し挿入された
ＨＣＶ遺伝子を発現させることによりＨＣＶ抗原活性ポ
リペプチドが生産される。

【００１３】組換えベクターで遺伝子発現を行う場合
は、ポリペプチドのＮ末端あるいはＣ末端にランダムな
配列のアミノ酸が複数個付加する場合がある。しかしな
がら、このようなＮ末端、あるいはＣ末端に付加された
複数個のアミノ酸はランダムなアミノ酸であるから、Ｈ
ＣＶ抗原活性には無関係であり、抗原活性測定には影響
しない。

【００１４】該ＨＣＶ抗原活性ポリペプチドは、上記形
質転換大腸菌を培養し得られた菌体を超音波処理などの
方法で破砕し、この菌体破砕物より公知の方法により分
離される。該ＨＣＶ抗原活性ポリペプチドの精製方法は
公知の方法ならばいずれでもよく塩析、イオン交換樹脂
吸着、ゲル濾過等々である。好ましくは上記方法の組合
せが有効である。また、精製された該ＨＣＶ抗原活性ポ
リペプチドはどの様な溶液に分散されていてもよいが、
好ましくは0.87％塩化ナトリウム水溶液（以下、生理食
塩水とも略記する）あるいは0.87％塩化ナトリウム含
有、20ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ7.2（以下、ＰＢＳとも略
記する）に分散されていることが望ましい。また、精製
純度としては高い方がよい。好ましくは該ＨＣＶ抗原活
性ポリペプチドが全蛋白質中の80％以上が望ましい。

【００１５】本発明でいう第１のＨＣＶ抗原活性ポリペ
プチドとは、優れた抗原活性に必須な、配列番号１に示
すアミノ酸配列を含むポリペプチド（以下、Ｃｏｒｅ抗
原とも略記する）であり、そのＮ末端あるいはＣ末端
に、余分なアミノ酸が複数個付加したものであってもよ
い。該配列は日本型ＨＣＶのＮ末端から１番目ないし１
６８番目までのコア蛋白質のアミノ酸配列に相当する。

【００１６】本発明でいう第２のＨＣＶ抗原活性ポリペ
プチドとは、優れた抗原活性に必須な、配列番号２に示
すアミノ酸配列を含むポリペプチド（以下、ＮＳ−３抗
原とも略記する）であり、そのＮ末端あるいはＣ末端
に、余分なアミノ酸が複数個付加したものであってもよ
い。この配列の１番目から211番目までは、日本型ＨＣ
ＶのＮ末端から数えて、1323番目から1533番目までのＮ
Ｓ−３蛋白質のアミノ酸に相当する。

【００１７】本発明でいう第３のＨＣＶ抗原活性ポリペ
プチドとは、優れた抗原活性に必須な、配列番号３に示
すアミノ酸配列を含むポリペプチド（以下、ＮＳ−４抗
原とも略記する）であり、そのＮ末端あるいはＣ末端
に、余分なアミノ酸が複数個付加したものであってもよ
い。この配列の１番目から194番目までは、日本型ＨＣ
ＶのＮ末端から数えて、1605番目から1798番目までのＮ
Ｓ−４蛋白質のアミノ酸に相当する。

【００１８】本発明でいう第４のＨＣＶ抗原活性ポリペ
プチドとは、優れた抗原活性に必須な、配列番号４に示
すアミノ酸配列を含むポリペプチド（以下、ＮＳ−５抗
原とも略記する）であり、そのＮ末端あるいはＣ末端
に、余分なアミノ酸が複数個付加したものであってもよ
い。この配列の１番目から160番目までは、日本型ＨＣ
ＶのＮ末端から数えて、2111番目から2270番目までのＮ
Ｓ−５蛋白質のアミノ酸に相当する。

【００１９】本発明における不溶性担体粒子としては公
知の凝集法の診断薬に用いることができる担体ならば何
でもよく、例えば、核部となる無機質化合物に染料を被
覆させた高比重複合粒子（特開昭62-115366号、以下、
ＨＤＰとも略記する）、羊赤血球、ポリスチレン粒子、
ゼラチン粒子等である。好ましくはＨＤＰ、羊赤血球、
ポリスチレンが用いられる。さらに好ましくはＨＤＰで
ある。また、本発明で用いる不溶性担体の粒子径も凝集
法診断試薬として用いる範囲のものならば、いずれでも
よく、好ましくは0.01μｍから20μｍまでの粒子径のも
のであり、さらに好ましくは0.01μｍから３μｍのもの
である。また、不溶性担体の比重もいずれのものでもよ
く、好ましくは1.0から2.5である。

【００２０】本発明でいう担持とは、不溶性担体にＨＣ
Ｖ抗原活性ポリペプチドを吸着させる方法で公知の吸着
される方法ならばいずれでもよく、物理的吸着法、化学
的吸着法等々いずれでもよい。例えば、疎水的吸着、塩
化クロム法等々である。好ましくは疎水的吸着法が望ま
しい。前記担持は緩衝作用のある緩衝液中で行い、その
種類はいずれでもよい。例えば、燐酸緩衝液、グリシン
緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等々である。ｐＨに
ついてもいずれでもよいが中性領域が望ましい。好まし
くは燐酸緩衝液、ｐＨ6.0から8.0が望ましい。

【００２１】ＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを担体に担持
させる場合は、蛋白質濃度には特に限定はないが好まし
くは0.1μｇ／ｍｌ以上が適当である。また、不溶性担
体粒子に担持させる時間及び温度には特に限定されない
が、温度は好ましくは１℃以上80℃以下、時間は30分間
以上で、好適に行うことが出来る。本発明のＣ型肝炎診
断用免疫学的凝集反応試薬は、水性懸濁液の状態で使用
されるが、長期の保存においてはこれを凍結乾燥するこ
とが好ましい。本発明の凝集反応用試薬は、かかる凍結
乾燥後、再び水性懸濁液としても前記した保存時の安定
性及び反応時の凝集像の切れが低下することなく、優れ
た性能を示す。 上記凍結乾燥方法は限定的ではなく通
常の方法で行えばよい。例えば感作赤血球の凍結乾燥法
に採用される方法及び条件が用いられる。好ましくは急
速予備凍結し次いで真空凍結乾燥する方法が採用され
る。該急速予備凍結には液体窒素、ドライアイスー メタ
ノール、ドライアイスー アセトンあるいはフルオロカー
ボン等に、上記水性懸濁液の入ったバイアル又はアンプ
ル等の容器を浸漬することにより達成される。

【００２２】また、真空凍結乾燥方法は、一般には、上
記感作担体の浮遊液の入ったバイアル等を急速予備凍結
したのち、予め−40〜−60℃に冷却した凍結乾燥機のチ
ャンバ−内に置き24〜72時間かけて徐々に昇温し真空凍
結乾燥する方法が好適である。この時のチャンバー内の
圧力50〜200μＨｇ、最終乾燥温度は20〜50℃が適当で
ある。ついで真空状態、または不活化ガスを充填して封
栓保存すればよい。但し、真空凍結乾燥方法は前記方法
に限定されるものではない。

【００２３】本発明の凝集反応用試薬は、通常診断に利
用される凝集反応法が何ら制限なく適用される。例え
ば、定性診断の平板法、半定量診断のマイクロタイター
法及び定量診断の比濁法、粒子数計測法等である。その
うち、特にマイクロタイタ−法に適用する場合、本発明
の効果が特に顕著である。本発明でいうＣ型肝炎診断用
免疫学的凝集反応試薬とはＣ型肝炎患者の血清または血
漿中に存在する抗ＨＣＶ抗体を免疫学的凝集反応で検出
することによりＣ型肝炎の診断を行う診断用試薬であ
る。通常診断に利用される凝集反応法が何ら制限なく適
用される。例えば、定性診断の平板法、半定量診断のマ
イクロタイター法及び定量診断の比濁法、粒子数計測法
等である。そのうち、特にマイクロタイタ−法に適用す
る場合、本発明の効果が特に顕著である。

【００２４】

【発明の効果】本発明のＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反
応試薬は従来品に比べて検出感度及び特異性が著しく優
れており、且つ短時間で判定が可能である。また、凝集
反応の判定の基準である抗原抗体反応による凝集形成物
（以下、管底凝集像とも略記する）が極めて明確に形成
される。従って、本発明のＣ型肝炎診断用免疫学的凝集
反応試薬は従来のものに比較して極めて優れたＣ型肝炎
診断試薬である。

【００２５】

【実施例】以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をさ
らに具体的に説明する。但し、これらの実施例により本
発明の技術的範囲が限定されるものではない。本実施例
では特に断わらない限り、遺伝子操作実験の手法は、サ
ムブロックらの方法［Sambrook, J., Fritsch, E. F.,
Maniatis, T., Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press, New York (1989). ］に
従って行った。なお、制限酵素は宝酒造（株）製品を使
用した。

【００２６】（実施例１） Ｃｏｒｅ抗原の製造 （１−１）組換えプラスミドpGC03 の作製 （ＲＮＡの調製）輸血後非Ａ非Ｂ肝炎患者血清3000mlを
19,000rpm で16時間超遠心し、沈澱を得た。該沈澱物を
ＧＩＴＣ溶液（4Mグアニジウムイソチオシアネート（フ
ルカ（株）製），25mMクエン酸ソーダ，0.5 ％サルコシ
ル，0.1Mメルカプトエタノール）100ml に溶解し、該溶
解物100ml に対して、100ml のフェノール−クロロホル
ム(１: １) を加え、15分間室温で振盪後、3000rpm 、1
5分間遠心した。該反応液の水層を取り出し、イソプロ
ピルアルコール100 mlを加え、−20℃に３時間放置した
後、3000rpm で15分間遠心し、沈澱物を得た。

【００２７】該沈澱物に対して、ＧＩＴＣ溶液10mlを加
えて溶解液とした。該溶解液に対して、10mlのフェノー
ル−クロロホルム (１: １) を加え、10分間室温で振盪
後、3000rpm, 15 分間遠心した。該反応液の水層を取り
出し、クロロホルム20mlを加え、５分間振盪した。振盪
後、3000rpm で５分間遠心し、水層10mlを回収した。こ
の水層10mlに対して、5M NaCl 溶液 0.4mlを加えた。

【００２８】その後、30mlの氷冷エタノールを添加し、
−20℃で12時間放置した。放置後、3000rpm で15分間遠
心し、沈澱物を得た。該沈澱物を75％エタノールで洗浄
し、乾燥後、蒸留水200 μl に溶解し、ＲＮＡ溶液を得
た。 （ｃＤＮＡライブラリーの構築）ｃＤＮＡ合成はＢＲＬ
社の合成キットを使用した。その方法はｃＤＮＡ合成マ
ニュアル［ＢＲＬ／コスモバイオ社 Instruction Manua
l, Cat. No8267SA］に従って行った。本実施例の（ＲＮ
Ａの調製）の項で、非Ａ非Ｂ患者血清より調製した１本
鎖ＲＮＡ溶液5 μl にランダムプライマー溶液(100μM)
［宝酒造（株）製品, 製品カタログ番号3810］を5 μl
加え、逆転写酵素反応を行い、ＲＮＡ／ＤＮＡの２本鎖
とした。次いで大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩと、大腸菌
ＲＮＡ分解酵素Ｈとを加え、ＤＮＡ／ＤＮＡ２本鎖とし
た。

【００２９】次に、こうして得られた２本鎖ＤＮＡの両
末端にEcoRI リンカーを結合させた。この処理には宝酒
造の酵素を用い、宝酒造の酵素に添付されている反応条
件で反応を行った。まず２本鎖ＤＮＡ約1 μg を用い
て、EcoRI メチラーゼ処理を行い、その後Ｔ4 ＤＮＡリ
ガーゼ反応によりEcoRI リンカー(dGGAATTCC) を結合さ
せた。最後に得られた反応液をEcoRI で切断し、EcoRI
断片を回収した。

【００３０】最後にこのEcoRI 断片をλgt11のEcoRI 部
位に挿入し、組換えλgt11ファージを作製したが、これ
にはStratagene社のキットGIGAPACKII GOLD を用い、方
法はキットに添付されているマニュアル［Protocol/Ins
truction Manual Cat. #200214, 200215, 200216, Dece
mber 6, 1989］に従った。まずλgt11のEcoRI 部位にEc
oRI 断片を挿入し、これをＴ4 ＤＮＡリガーゼにより結
合させた。得られた組換えファージＤＮＡ溶液をGIGAPA
CKII GOLD のIn Vitro Packaging Kitを用いて、ファー
ジに戻した。この時のタイターを滴定したところ1.0 ×
10⁶ であった。このタイター値は、独立したクローンの
数を示す。 （イムノスクリーニング）λgt11に挿入されたｃＤＮＡ
はフレームが一致すると、λgt11に組み込まれているβ
−ガラクトシダーゼとの融合蛋白として、ｃＤＮＡがコ
ードしているアミノ酸配列が表現される。この融合蛋白
を非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を大腸菌の菌体で吸収したも
のでスクリーニングした。指示菌はE.coli Y1090を使用
した。直径15cmのL-bottom plate（水1 リットル当りBa
cto-tryptone 10g, NaCl 5g, Yeastextract 5g, Bacto-
agar 15g を加え、オートクレーブ滅菌）に１枚のプレ
ート当りプラークが約４万個となるように調製したファ
ージ液とY1090 を37℃で15分インキュベートした。それ
に45℃に温めておいた0.7 ％L-top agarose 2.5ml を混
合し、L-bottom plateにひろげ、固化後42℃で3.5 時間
インキュベートした。一方ニトロセルロースフィルター
を10mMイソプロピルチオ−β−D −ガラクトシド（ＩＰ
ＴＧ）溶液に数分間ひたした後、室温で乾燥した。該フ
ィルターを上該プレートにのせ、37℃で一夜インキュベ
ートした。インキュベート後、フィルターをはがし、Ｔ
ＮＴ緩衝液（10mMトリス−HCl(pH8.0), 150mM NaCl, 0.
05％Tween20 ）にひたし、よくリンスした。再度、新し
いＴＮＴ緩衝液に振盪しながら、30分間ひたした。さら
に該フィルターをブロッキング緩衝液（20％牛胎児血清
含有ＴＮＴ緩衝液）で30分間インキュベートした。次ぎ
にフィルターをブロッキング緩衝液で150 倍希釈した一
次抗体液（非Ａ非Ｂ型肝炎患者プール血清をY1090の超
音波破砕液で吸収したもの）と室温で４時間ゆっくり振
盪しながら反応させた。次いでフィルターを0.1 ％牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＴＮＴ緩衝液、0.1 ％ＢＳ
Ａ＋0.1 ％NP-40 含有ＴＮＴ緩衝液、0.1 ％ＢＳＡ含有
ＴＮＴ緩衝液の順で10分間ずつ洗浄した。次ぎに、10μ
l の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧヤギ
ＩｇＧ（Kirkeguard & Perry Lab社製）を含有する15ml
のブロッキング緩衝液にフィルターをひたし、室温で２
時間反応させた後、0.1 ％ＢＳＡ含有ＴＮＴ緩衝液、0.
1 ％ＢＳＡ＋0.1 ％NP-40 含有ＴＮＴ緩衝液で10分間ず
つ洗浄した。さらにフィルターを10mMトリス−HCl(pH7.
5), 150mM NaClで１分間洗浄後、染色液［60mg 4−クロ
ロ−ナフトールを含むメタノール20mlを使用直前に、30
％Ｈ₂Ｏ₂ の60μl を含む10mMトリス−HCl(pH7.5), 150
mM NaCl溶液100mlと混合したもの］に室温で15分反応
し、２回蒸留水で洗浄した後、紫色に発色した陽性プラ
ークを得た。

【００３１】この組換えファージからファージＤＮＡを
調製し、EcoRI で処理して、ｃＤＮＡの断片をアガロー
ス電気泳動ゲルから回収し、プラスミドベクターpUC18
のEcoRI 部位に挿入した。該プラスミドをpGC03 と命名
し、塩基配列を決定した。このｃＤＮＡ断片には、ＨＣ
Ｖの構造蛋白質遺伝子のコア領域が含まれていることが
明かとなった。 （１−２）大腸菌HB101 ［pHCX01］の作製 pGC03 をHinfI で消化後、ＤＮＡポリメラーゼＩ Kleno
w fragmentにより末端を平滑化した。このＤＮＡとBamH
I リンカー（dCGGATCCG, 宝酒造（株）製）をＴ4 ＤＮ
Ａリガーゼにより連結反応を行い、更にBamHI で消化
し、アガロース電気泳動ゲルからコア領域を含む0.56kb
断片を回収した。この0.56kb断片をプラスミドベクター
pUC19 のBamHI 部位に挿入し、更に該プラスミドをBspH
I （New England Biolabs 社製品）で消化後、Ｔ4 ＤＮ
Ａポリメラーゼにより末端を平滑化した。このＤＮＡを
BamHI で消化し、アガロース電気泳動ゲルから5'側非翻
訳領域を除いた0.51kbのコア領域ＤＮＡ断片を回収し
た。この0.51kb断片をプラスミドベクターpUEX2 （Amer
sham社製）のSmaI〜BamHI 部位に挿入して、組換えベク
ターpHCX01を得た。得られたpHCX01について、プラスミ
ド法による塩基配列の決定〔服部らの方法、Anal. Bioc
hem.,Vol.152, pp.232〜238(1986) をおこなった。この
組換えベクターpHCX01には、ＨＣＶのＮ末端から１番目
ないし１６８番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列
が含まれ、その塩基配列は配列番号５に示すとおりであ
る。次に、組換えベクターpHCX01で宿主大腸菌HB101 を
形質転換し、組換え大腸菌HB101 ［pHCX01］を得た。組
換え大腸菌HB101 ［pHCX01］は、茨城県つくば市東１丁
目１番３号の通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第１３０５６号として寄託されている。
この組換え大腸菌HB101 ［pHCX01］をＬＢ＋Ａｍｐ培地
［Bacto tryptone 1.0%, Yeast extract 0.5%, NaCl0.5
%, アンピシリン(Amp)50 μg ／ml］で30℃で一晩培養
し、最終濃度が15％となるようにグリセリンを添加して
−80℃で凍結保存した。 （１−３）Ｃｏｒｅ抗原の製造 組換え大腸菌HB101 ［pHCX01］を培養し遺伝子発現を行
うことにより、Ｃｏｒｅ抗原はβ−ガラクトシダーゼと
の融合ポリペプチドとして生産される。組換え大腸菌HB
101 ［pHCX01］の凍結保存菌体１mlを、１リットルのＬ
Ｂ＋Ａｍｐ培地に接種し30℃にて一晩培養した。続いて
この培養物を、20リットルのＬＢ＋Ａｍｐ培地に植菌し
30℃でＯＤ540 が1.5 となるまで培養し、培養温度を42
℃に上昇させて引き続き３時間培養した。培養後、遠心
分離により集菌し57g の湿菌体を得た。菌体を２リット
ルの、0.6M尿素を含むTNE 緩衝液（50mM Tris ・ HCl(pH
8.3), 100mM NaCl, 1mM EDTA）に懸濁し、超音波処理に
より破砕した。この菌体破砕物を10,000g 、20分間の遠
心分離により、Ｃｏｒｅ抗原を含む不溶性顆粒を沈澱画
分に回収した。この沈澱を、再び２リットルの0.6M尿素
を含むTNE 緩衝液に懸濁して不溶性顆粒を洗浄し、遠心
分離することにより沈澱を回収した。更にこの沈澱を、
２リットルの3M尿素を含むTNE 緩衝液に懸濁し、室温で
30分間攪はんすることにより不溶性顆粒を十分洗浄した
後、遠心分離することにより不溶性顆粒を沈澱画分に回
収した。この不溶性顆粒の沈澱に、200ml の8M尿素を含
むTNE緩衝液を加え沈澱を可溶化した。これを16,000g
、20分間の遠心分離により上清を分取し、TNE 緩衝液
に対して透析した。透析後、16,000g 、20分間の遠心分
離により上清を分取しＣｏｒｅ抗原を得た。20リットル
の培養液から980mg のＣｏｒｅ抗原が得られた。得られ
たＣｏｒｅ抗原について、ＳＤＳポリアクリルアミド電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分子量を調べ、その
アミノ酸配列より計算される分子量（１３７ｋｄ）と一
致することを確認した。

【００３２】（実施例２） ＮＳ−３抗原の製造 （２−１）組換えプラスミドpHCV7 の作製 優れた抗原活性を示すことが予想されるＨＣＶのＮＳ３
領域の遺伝子断片について、その断片の両側20塩基ずつ
のプライマーをセットとして用い、ＲＴ−ＰＣＲ法によ
る遺伝子増幅を行った。プライマーは、アプライドバイ
オシステムズ社製品、３４０Ａ型機を用いて合成した。
なお、５’上流側プライマーの塩基配列は、（５’）Ｃ
ＣＧＡＣＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＣＣＧＧＧ（３’）、
３’下流側プライマーの塩基配列は、（５’）ＣＴＧＧ
ＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡＡＣＧＣＣＣ（３’）である。

【００３３】まず、実施例１で得られたＲＮＡ溶液4 μ
l に、逆転写酵素反応液［250mM Tris・ HCl (pH8.3), 3
75mM KCl, 50mM DTT, 15mM MgCl2］2 μl 、３’下流側
のアンチセンス鎖プライマー溶液(25ng/μl)1 μl 、４
種類のデオキシヌクレオチド［dATP, dGTP, dCTP, dTT
P、各15mM］を各0.5 μl ずつ加えて、9 μl の溶液を
作った。これにミネラルオイルを加えて、70℃、２分間
加熱し、ついで37℃に冷却し、逆転写酵素1 μl （ＢＲ
Ｌ社製品）を加え、37℃で60分反応させた。この反応液
(10 μl)に、更にＰＣＲ反応液［400mM Tris・ HCl(pH8.
8), 100mM 硫酸アンモニウム, 40mM 塩化マグネシウ
ム, 60mM メルカプトエタノール, 0.1 ％ BSA］8.3 μ
l 、４種類のデオキシヌクレオチド［dATP, dGTP, dCT
P, dTTP, 各15mM］を各5 μl ずつ加えた。次いで、遺
伝子増幅させる目的の領域をはさんで、５’上流側のセ
ンス鎖の塩基配列を持つ20塩基のプライマー溶液(100ng
／μl)5μl と、更に３’下流側のアンチセンス鎖の塩
基配列を持つ20塩基のプライマー溶液5 μl(100ng／μ
l)を加え、最後に水0.7 μl を加え、全量49μl の溶液
とした。この溶液を92℃で５分間処理し、室温に冷却し
てTaq ポリメラーゼ1 μl（２単位、New England Biola
bs 社製品）を加えた。以下、アニール(55 ℃、45秒)
、ポリメリゼーション(72 ℃、２分) 、変性(90 ℃、
１分) を、35回繰り返して、ＤＮＡの増幅を行った。

【００３４】ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した遺伝子産物
のＨ7 断片を、アガロースゲル（２％) で電気泳動し目
的の長さのＤＮＡを回収した。ついでこれをKlenow fra
gment 酵素処理し、ＤＮＡの末端を平滑に揃え、更にＴ
4 ポリヌクレオチドキナーゼにより、５’末端をリン酸
化した。これをプラスミドベクターpTZ19RのHincII部位
に挿入し、遺伝子のクローン化を行った。こうして組換
えプラスミドpHCV7 を得た。

【００３５】組換えプラスミドpHCV7 により形質転換さ
れた大腸菌は、E. coli HCV7と表示し、通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第11831 号と
して寄託されている。 （２−２）大腸菌HB101 ［pCI07 ］の作製 pHCV7 をEcoRI とStuIで消化し、ｃＤＮＡの５’側の33
8bp 断片を得た。この338bp 断片はさらにHinfI で部分
消化後、ＤＮＡポリメラーゼＩ Klenow fragmentにより
末端を平滑化し、263bp 断片を得た。またpHCV7 をStuI
で消化し、CIP処理した後、PstI消化し、ｃＤＮＡの
３’側の400bp 断片を得た。一方pUEX1(Amersham社製)
をSmaIとPstIで消化し、CIP 処理した。このpUEX1 とｃ
ＤＮＡの５’側の263bp 断片、ｃＤＮＡの３’側の400b
p 断片のライゲーション反応を行い、組換えベクターpC
I07 を得た。実施例１と同様にして塩基配列を決定し、
この組換えベクターpCI07 には、ＨＣＶのＮ末端から数
えて、1323番目から1533番目のアミノ酸配列をコードす
る塩基配列が含まれ、その塩基配列は配列番号６に示す
とおりである。次に、組換えベクターpCI07 で宿主大腸
菌HB101 を形質転換し、組換え大腸菌HB101 ［pCI07 ］
を得た。組換え大腸菌HB101 ［pCI07 ］をＬＢ＋Ａｍｐ
培地で30℃で一晩培養し、最終濃度が15％となるように
グリセリンを添加して−80℃で凍結保存した。 （２−３）ＮＳ−３抗原の製造 組換え大腸菌HB101 ［pCI07 ］を培養し遺伝子発現を行
うことにより、ＮＳ−３抗原はβ−ガラクトシダーゼと
の融合ポリペプチドとして生産される。実施例１の（１
−３）Ｃｏｒｅ抗原の製造と同様にして、組換え大腸菌
HB101 ［pCI07］の培養、菌体の破砕、融合ポリペプチ
ドの分離精製を行った。20リットルのＬＢ＋Ａｍｐ培地
にて培養し、1,000mg のＮＳ−３抗原が得られた。得ら
れたＮＳ−３抗原について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分
子量を調べそのアミノ酸配列より計算される分子量（14
1kd)と一致することを確認した。

【００３６】（実施例３） ＮＳ−４抗原の製造 （３−１）組換えプラスミドpHCV10の作製 実施例１で得られたｃＤＮＡライブラリーをプラークハ
イブリダイゼーションによりスクリーニングした。まず
大腸菌 Y1090を宿主とし、直径15cmのプレート10枚に、
ｃＤＮＡライブラリーの組換えλgt11ファージ５×105
相当を出現させた。得られたプラークを、ニトロセルロ
ースに写し取り、ハイブリダイゼーションを行った。こ
うして、ＨＣＶ遺伝子断片をもつクローン６株を選択し
た。そして、このクローンからファージＤＮＡを回収
し、次いでEcoRI で切断して、６種類のＨＣＶ遺伝子断
片、Ｈ1 、Ｈ5 、Ｈ10、Ｈ13、Ｈ20、Ｈ21断片をアガロ
ース電気泳動ゲルより回収した。このうち、優れた抗原
活性に必須なアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む
Ｈ10断片について、該断片をプラスミドベクターpTZ19R
のEcoRI 部位に挿入し、組換えプラスミドpHCV10を得
た。

【００３７】組換えプラスミドpHCV10により形質転換さ
れた大腸菌は、E. coli HCV10 と表示し、通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第11834 号
として寄託されている。 （３−２）大腸菌HB101 ［pCI10 ］の作製 pHCV10をAvaII で消化後、ＤＮＡポリメラーゼＩ Kleno
w fragmentにより末端を平滑化し、さらにBamHI で消化
して583bp 断片を単離した。一方pUEX3 ( Amersham社
製) をSmaIで消化し、CIP 処理し、さらにBamHI で消化
した。その後、電気泳動を行い目的の断片を分離した。
これらをライゲーションし、組換えベクターpCI10 を作
製した。実施例１と同様にして塩基配列を決定し、この
組換えベクターpCI10 には、ＨＣＶのＮ末端から数え
て、1605番目から1798番目のアミノ酸配列をコードする
塩基配列が含まれ、その塩基配列は配列番号７に示すと
おりでる。次に、組換えベクターpCI10 で宿主大腸菌HB
101 を形質転換し、組換え大腸菌HB101 ［pCI10 ］を得
た。組換え大腸菌HB101 ［pCI10 ］をＬＢ＋Ａｍｐ培地
で30℃で一晩培養し、最終濃度が15％となるようにグリ
セリンを添加して−80℃で凍結保存した。 （３−３）ＮＳ−４抗原の製造 組換え大腸菌HB101 ［pCI10 ］を培養し遺伝子発現を行
うことにより、ＮＳ−４抗原はβ−ガラクトシダーゼと
の融合ポリペプチドとして生産される。実施例１の（１
−３）Ｃｏｒｅ抗原の製造と同様にして、組換え大腸菌
HB101 ［pCI10］の培養、菌体の破砕、融合ポリペプチ
ドの分離精製を行った。20リットルのＬＢ＋Ａｍｐ培地
にて培養し、720mg のＮＳ−４抗原が得られた。得られ
たＮＳ−４抗原について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子
量を調べそのアミノ酸配列より計算される分子量（141k
d)と一致することを確認した。

【００３８】（実施例４） ＮＳ−５抗原の製造 （４−１）組換えプラスミドpHCV14の作製 実施例２と同様にしてＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した、
ＨＣＶのＮＳ５領域の遺伝子産物のＨ14断片を、アガロ
ースゲル(2％) で電気泳動し目的の長さのＤＮＡを回収
した。なお、５'上流側プライマーの塩基配列は、
（５'）ＣＧＧＧＣＡＴＧＡＣＣＡＣＴＧＡＣＡＡＣ
（３'）、３'下流側プライマーの塩基配列は、（５'）
ＣＣＧＣＣＴＣＴＡＧＧＡＣＧＣＴＴＴＴＧ（３'）で
ある。ついでこれをKlenow fragment 酵素処理し、ＤＮ
Ａの末端を平滑に揃え、更にＴ4 ポリヌクレオチドキナ
ーゼにより、５’末端をリン酸化した。これをプラスミ
ドベクターpTZ19RのHincII部位に挿入し組換えプラスミ
ドpHCV14を得た。組換えプラスミドpHCV14により形質転
換された大腸菌は、E. coli HCV14 と表示し、通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第1183
8 号として寄託されている。 （４−２）大腸菌HB101 ［pCI14 ］の作製 pHCV14をPstI及びXbaIで消化後、blunting kitにより末
端を平滑化し、484bpを含む断片を単離した。一方pUEX2
をSmaIで消化し、CIP 処理した。その後、電気泳動を
行い目的の断片を分離した。これらをライゲーション
し、組換えベクターpCI14 を作製した。実施例１と同様
にして塩基配列を決定し、この組換えベクターpCI14 に
は、ＨＣＶのＮ末端から数えて、2111番目から2270番目
のアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれ、その塩
基配列は配列番号８に示すとおりである。次に、組換え
ベクターpCI14 で宿主大腸菌HB101 を形質転換し、組換
え大腸菌HB101 ［pCI14 ］を得た。組換え大腸菌HB101
［pCI14 ］をＬＢ＋Ａｍｐ培地で30℃で一晩培養し、最
終濃度が15％となるようにグリセリンを添加して−80℃
で凍結保存した。 （４−３）ＮＳ−５抗原の製造 組換え大腸菌HB101 ［pCI14 ］を培養し遺伝子発現を行
うことにより、ＮＳ−５抗原はβ−ガラクトシダーゼと
の融合ポリペプチドとして生産される。実施例１の（１
−３）Ｃｏｒｅ抗原の製造と同様にして、組換え大腸菌
HB101 ［pCI14］の培養、菌体の破砕、融合ポリペプチ
ドの分離精製を行った。20リットルのＬＢ＋Ａｍｐ培地
にて培養し、750mg のＮＳ−５抗原が得られた。得られ
たＮＳ−５抗原について、得られたＮＳ−４抗原につい
て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量を調べそのアミノ酸
配列より計算される分子量（135kd)と一致することを確
認した。

【００３９】（実施例５） ＨＣＶ抗原活性ポリペプチ
ドを用いたＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬 （加熱操作） Ｃｏｒｅ抗原、ＮＳ−３抗原、ＮＳ−４
抗原及びＮＳ−５抗原の４種のＨＣＶ抗原活性ポリペプ
チドを各々100μｇ／ｍｌずつをＰＢＳに等量分散して
混合抗原溶液とする。該抗原混合溶液を35℃で30分間加
熱して感作用抗原溶液とする （感作）直径１．８μｍのＨＤＰ（徳山曹達（株）製
品）をＰＢＳで５（重量／重量）％になるように懸濁
し、ＨＤＰ懸濁液とした。上記ＨＤＰ懸濁液１ｍｌと加
熱操作を施した感作用抗原溶液１ｍｌを試験管内で混合
して室温で１時間放置してＨＤＰ表面に４種類のＨＣＶ
抗原活性ポリペプチドを疎水的に吸着させた（以下、こ
の吸着操作を感作とも略記する）。

【００４０】（洗浄操作）その後、余剰のＨＣＶ抗原活
性ポリペプチドを除去するために、上記混合液に2,500
ｒｐｍ、５分間遠心分離を施し、遠心上清を除去した。
その遠心沈澱物に洗浄のため、ＰＢＳ２ｍｌを添加、懸
濁後2,500ｒｐｍ、５分間遠心後上清を除去し、３（vol
/vol）％変性ウサギ血清含有ＰＢＳ（以下、Ａ液とも略
記する）に0.5（w/vol）％になるように懸濁した。上
記、ＨＣＶポリペプチドを吸着させたＨＤＰ（以下、感
作粒子とも略記する）をＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反
応試薬（以下、Ｂ液とも略記する）とした。

【００４１】（測定操作）一方、検査に用いる検体をＡ
液で２倍より倍数希釈して、8192倍まで希釈した。次
に、検体の希釈液を９６穴マイクロタイタープレート
（96well micro-titer-plate）に各々25μｌずつ１穴か
ら12穴まで滴下した。ついで、上記で調製したＢ液を各
穴25μｌを滴下した。滴下後、プレートミキサー（plat
e mixer)で振とうして30分間静置したのち、管底凝集像
を観察した。管底凝集像のうち、抗原抗体反応が生じた
ために感作粒子がマイクロプレートの管底に広がったも
のを陽性像とし、抗原抗体反応が生じなかったために感
作粒子がマイクロタイタープレートの管底に沈澱したの
を陰性像とした。一般的にマイクロタイター試薬では検
出感度は陽性像の観察される血清及び血漿の最高希釈倍
率（以下、力価とも略記する）で表示するので以下、Ｃ
型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬の感度は力価で表示
する。なお、この力価は、健常者検体では低く、患者検
体では高ければ高いほど良いとされる。

【００４２】（結果）次にＥＬＩＳＡ法試薬である市販
品Ａと実施例５で調製したＣ型肝炎診断用免疫学的凝集
反応試薬を比較した。検討には健常者検体５検体及び患
者血清５検体を用いた。市販品Ａと本発明のＣ型肝炎診
断用免疫学的凝集反応試薬は良好な相関を示したが、そ
のうち、１検体は本Ｃ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試
薬のみ、陽性を示した。なお、陽性と陰性との判断は32
倍希釈より陽性像を示すものを陽性とした（表１参
照）。

【００４３】健常者検体及び患者検体をさらに30検体を
測定した（表２参照）。実施例５のＣ型肝炎診断用免疫
学的凝集反応試薬で陽性且つ市販品Ａで陰性の判定の出
る検体が２検体検出された。

【００４４】

【表１】

【００４５】

【表２】

【００４６】比較例１ 加熱処理を施さないＨＣＶ抗原
活性ポリペプチドを用いたＣ型肝炎診断用免疫学的凝集
反応試薬 （混合操作）Ｃｏｒｅ抗原、ＮＳ−３抗原、ＮＳ−４抗
原及びＮＳ−５抗原の４種のＨＣＶ抗原活性ポリペプチ
ドを各々100μｇ／ｍｌずつをＰＢＳに等量分散して混
合抗原溶液して感作用抗原溶液とする。

【００４７】（感作）直径1.8μｍのＨＤＰ（徳山曹達
（株）製品）をＰＢＳで５（w/w）％になるように懸濁
し、ＨＤＰ懸濁液とした。上記感作用抗原液１ｍｌを試
験管内に入れ、ＨＤＰ懸濁液と混合して室温で１時間放
置してＨＤＰ表面に混合したＨＣＶ抗原活性ポリペプチ
ドを感作した。

【００４８】（洗浄操作）実施例５と同様の操作で余剰
のＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを除去し、Ａ液にて粒子
濃度0.5（w/vol）％となるように懸濁した。上記、感作
粒子をＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬（以下、Ｃ
液とも略記する）とした。 （測定操作）実施例５と同様に検査に用いる検体をＡ液
で２倍より倍数希釈して、8192倍まで希釈してＣ液、Ｄ
液、Ｅ液及びＦ液を滴下後、管底凝集像を観察した。

【００４９】（結果）検討には実施例５のＣ型肝炎診断
用免疫学的凝集反応試薬で力価が8192倍の検体（以下、
患者検体１とも略記する）及び力価が８倍の検体（以
下、健常者検体１とも略記する）を用いた。上記のＨＣ
Ｖ抗原活性ポリペプチドを感作したＣ型肝炎診断用免疫
学的凝集反応試薬ともに実施例５で調製したＣ型肝炎診
断用免疫学的凝集反応試薬より低い力価を示した（表３
参照）。

【００５０】

【表３】

【００５１】比較例２ １種類のＨＣＶ抗原活性ポリペ
プチドを用いたＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬 （加熱処理）Ｃｏｒｅ抗原、ＮＳ−３抗原、ＮＳ−４抗
原及びＮＳ−５抗原の４種のＨＣＶ抗原活性ポリペプチ
ドを各々100μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに分散し
て、35℃で30分間、加熱処理して感作用Ｃｏｒｅ抗原
液、感作用ＮＳ−３抗原液、感作用ＮＳ−４抗原液及び
感作用ＮＳ−５抗原液をそれぞれ調製した。

【００５２】（感作）直径1.8μｍのＨＤＰ（徳山曹達
（株）製品）をＰＢＳで５（w/w）％になるように懸濁
し、ＨＤＰ懸濁液とした。上記感作用Ｃｏｒｅ抗原液、
感作用ＮＳ−３抗原液、感作用ＮＳ−４抗原液及び感作
用ＮＳ−５抗原液それぞれ１ｍｌを別々の試験管内に入
れ、ＨＤＰ懸濁液と混合して室温で１時間放置してＨＤ
Ｐ表面にそれぞれのＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを感作
した。

【００５３】（洗浄操作）実施例５と同様の操作で余剰
のＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを除去し、Ａ液にて粒子
濃度0.5（w/vol）％となるように懸濁した。上記、感作
粒子をＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬（以下、
Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ液とも略記する）とした。 （測定操作）実施例５と同様に検査に用いる検体をＡ液
で２倍より倍数希釈して、8192倍まで希釈してＤ液、Ｅ
液、Ｆ液及びＧ液を滴下後、管底凝集像を観察した。

【００５４】（結果）検討には患者検体１及び健常者検
体１を用いた。上記のＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを感
作したＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬ともに実施
例５で調製したＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬よ
り低い力価を示した（表４参照）。

【００５５】

【表４】

【００５６】比較例３ ２種類のＨＣＶ抗原活性ポリペ
プチドを用いたＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬 （加熱処理）Ｃｏｒｅ抗原とＮＳ−３抗原、Ｃｏｒｅ抗
原とＮＳ−４抗原、Ｃｏｒｅ抗原とＮＳ−５抗原、ＮＳ
−３抗原とＮＳ−４抗原、ＮＳ−３抗原とＮＳ−５抗原
及びＮＳ−４抗原とＮＳ−５抗原の２種類ずつのＨＣＶ
抗原活性ポリペプチドを各々50μｇ／ｍｌずつをＰＢＳ
に等量分散して35℃、30分間加熱処理をしてそれぞれ感
作用抗原溶液１、２、３、４、５及び６とする。

【００５７】（感作）直径1.8μｍのＨＤＰ（徳山曹達
（株）製品）をＰＢＳで５（ｗ／ｗ）％になるように懸
濁し、ＨＤＰ懸濁液とした。上記ＨＤＰ懸濁液１ｍｌと
感作用抗原溶液１ｍｌを試験管内で混合して室温で１時
間放置してＨＤＰ表面に各々２種類のＨＣＶ抗原活性ポ
リペプチドを感作した。

【００５８】（洗浄操作）実施例５と同様の操作で余剰
のＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを除去し、Ａ液にて粒子
濃度0.5（w/vol)％となるように懸濁した。上記、感作
粒子をＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬（以下、
Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ及びＭ液とも略記する）とした。

【００５９】（測定操作）実施例５と同様に検査に用い
る患者検体１及び健常者検体１をＡ液で２倍より倍数希
釈し、8192倍まで希釈してＨ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ及びＭ液
を滴下後、管底凝集像を観察した。 （結果）各々２種類のＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを感
作したＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬ともに実施
例５で調製したＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬よ
り低い力価を示した（表５参照）。

【００６０】

【表５】

【００６１】比較例４ ３種類のＨＣＶ抗原活性ポリペ
プチドを用いたＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬 （加熱処理）Ｃｏｒｅ抗原とＮＳ−３抗原とＮＳ−４抗
原、Ｃｏｒｅ抗原とＮＳ−３抗原とＮＳ−５抗原、Ｃｏ
ｒｅ抗原とＮＳ−４抗原とＮＳ−５抗原及びＮＳ−３抗
原とＮＳ−４抗原とＮＳ−５抗原の３種類ずつのＨＣＶ
抗原活性ポリペプチドを各々３３μｇ／ｍｌずつをＰＢ
Ｓに等量分散して35℃、30分間の加熱処理を行い感作用
抗原溶液７、８、９及び10とする。

【００６２】（感作）直径1.8μｍのＨＤＰ（徳山曹達
（株）製品）をＰＢＳで５（w/w）％になるように懸濁
し、ＨＤＰ懸濁液とした。上記ＨＤＰ懸濁液１ｍｌと各
々の感作用抗原溶液１ｍｌを試験管内で混合して室温で
１時間放置してＨＤＰ表面に各々３種類のＨＣＶ抗原活
性ポリペプチドを感作した。

【００６３】（洗浄操作）実施例５と同様の操作で余剰
のＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを除去し、Ａ液にて粒子
濃度0.5（w/vol）％となるように懸濁した。上記、感作
粒子をＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬（以下、
Ｎ、Ｏ、Ｐ及びＱ液とも略記する）とした。 （測定操作）実施例５と同様に検査に用いる患者検体１
及び健常者検体１をＡ液で２倍より倍数希釈し、8192倍
まで希釈してＮ、０、Ｐ及びＱ液を滴下後、管底凝集像
を観察した。

【００６４】（結果）各々３種類のＨＣＶ抗原活性ポリ
ペプチドを感作したＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試
薬ともに実施例５で調製したＣ型肝炎診断用免疫学的凝
集反応試薬より低い力価を示した（表６参照）。

【００６５】

【表６】

【００６６】（実施例６） 羊赤血球担体を用いたＣ型
肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬 （羊赤血球の固定）羊赤血球100ｍｌ、オルセバ液100ｍ
ｌを混合し、ガ−ゼ濾過ののち血球濃度測定後、生理食
塩水で洗浄した。上記血球についてホルマリン固定を行
った（Methods in Immunology and Immunochemistory,
vol, pp33-34 (1977) (Williams, C, Hase編 Academic
Press New Yorkによる）） （加熱処理）実施例５と同様にＣｏｒｅ抗原、ＮＳ−３
抗原、ＮＳ−４抗原及びＮＳ−５抗原の４種のＨＣＶ抗
原活性ポリペプチドをＰＢＳで各々100μｇ／ｍｌずつ
等量混合した溶液を35℃、30分間加熱処理を行った（以
下、Ｒ液とも略記する）。

【００６７】（感作）洗浄済み赤血球に３（vol／vol）
％ホルマリンー 生理食塩水液を加え10℃で24時間攪拌し
たのち、さらに40（vol／vol）％ホルマリンー 生理食塩
水液を追加して24時間攪拌した。生理食塩水で洗浄した
のち、2.5（vol／vol）％となるように懸濁し、固定羊
赤血球とした。

【００６８】上記Ｑ液１ｍｌとＰＢＳで５（w/w）％に
希釈した固定羊赤血球溶液１ｍｌを37℃で攪拌しなが
ら、１時間、反応させた。この操作で４種のＨＣＶ抗原
活性ポリペプチドを固定羊赤血球に感作した。 （洗浄操作）次いで実施例５と同様と洗浄操作を行い、
余剰のＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを除去し、Ａ液に粒
子濃度0.5（w/vol）％となるように懸濁した。上記、感
作粒子をＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬（以下、
Ｓ液とも略記する）とした。

【００６９】（測定操作）実施例５と同様に検査に用い
る患者検体１及び健常者検体１をＡ液で２倍より倍数希
釈し、8192倍まで希釈してＲ液を滴下後、管底凝集像を
観察した。 （結果）実施例５と同様に、市販品Ａと実施例６で調製
したＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬を比較した。
検討には健常者検体５検体及び患者血清５検体を用い
た。市販品Ａと本Ｃ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬
は良好な相関を示したが、そのうち、１検体は本Ｃ型肝
炎診断用免疫学的凝集反応試薬のみ、陽性を示した。な
お、陽性と陰性との判断は３２倍希釈より陽性像を示す
ものを陽性とした（表７参照）。

【００７０】

【表７】

【００７１】比較例５ ＥＬＩＳＡ試薬と免疫学的凝集
反応試薬の比較 （加熱処理）Ｃｏｒｅ抗原、ＮＳ−３抗原、ＮＳ−４抗
原及びＮＳ−５抗原を100μｇ／ｍｌになるようにＰＢ
Ｓで分散したのち、35℃、30分間の加熱処理を行った。
それぞれを加熱処理Ｃｏｒｅ抗原、加熱処理ＮＳ−３抗
原、加熱処理ＮＳ−４抗原及び加熱処理ＮＳ−５抗原と
する。また、Ｃｏｒｅ抗原、ＮＳ−３抗原、ＮＳ−４抗
原及びＮＳ−５抗原を25μｇ／ｍｌずつ等量混合したの
ち、35℃、30分間の加熱処理を行い、加熱処理抗原溶液
とする。

【００７２】（マイクロタイタープレートへの吸着）加
熱処理Ｃｏｒｅ抗原、加熱処理ＮＳ−３抗原、加熱処理
ＮＳ−４抗原及び加熱処理ＮＳ−５抗原をマイクロタイ
タープレート（ヌンク社製品）に１穴あたり50μｌずつ
分注した。同様に該加熱処理抗原溶液をマイクロタイタ
ープレートに１穴あたり50μｌずつ分注した。上記マイ
クロタイタープレートを37℃で１時間、吸着させた。吸
着後、ＰＢＳ、200μｌで３回洗浄した。

【００７３】（ブロッキング操作）該マイクロタイター
プレートに１％牛血アルブミン含有ＰＢＳ（以下、ＢＳ
Ａ溶液とも略記する）を各穴に50μｌ分注して37℃で１
時間、ブロッキングした。ブロッキング後、ＢＳＡ溶液
を除去した。 （１次抗体反応）患者検体１及び健常者検体１各々10μ
ｌをＢＳＡ溶液で10倍希釈したのち、各穴に分注して３
７℃で１時間、反応させた。

【００７４】（洗浄操作）１次抗体反応終了後、各検体
の希釈液を除去した。0.5％トゥイーン80（tween80）含
有ＰＢＳ溶液（以下、洗浄液とも略記する）200μｌで
３回洗浄した。 （２次抗体反応）ＢＳＡ溶液で20,000倍に希釈したパー
オキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（カペル社製品）を100
μｌずつ各穴に分注して37℃で１時間反応させた。

【００７５】（洗浄操作）１次抗体反応終了後、各検体
の希釈液を除去した。0.5％トゥイーン80（Tween80）含
有ＰＢＳ溶液（以下、洗浄液とも略記する）200μｌで
３回洗浄した。 （発色操作）過酸化水素水溶液（カペル社製品）とＡＢ
ＴＳ溶液（カペル社製品）の等量混合液を100μｌを添
加したのち、室温で30分間反応させた。反応後、10％ド
デシル硫酸ナトリウム溶液を100μｌを添加して反応を
停止し、該反応液の吸光度（波長414ｎｍ）を測定し
た。

【００７６】（結果）Ｃｏｒｅ抗原、ＮＳ−３抗原、Ｎ
Ｓ−４抗原及びＮＳ−５抗原をそれぞれ吸着させた穴と
４種類の該ＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを混合した穴を
比較したが、いつでも吸光度が同等で凝集反応試薬で見
られたような高感度のＣ型肝炎診断用試薬は調製できな
かった（表８参照）

【００７７】

【表８】

【００７８】

【配列表】

１．配列番号１ （１）配列の長さ：１６８ （２）配列の型：アミノ酸 （３）トポロジー：直鎖状 （４）配列の種類：タンパク質 （５）起源 生物名：ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス） ２．配列番号２ （１）配列の長さ：２１１ （２）配列の型：アミノ酸 （３）トポロジー：直鎖状 （４）配列の種類：タンパク質 （５）起源 生物名：ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス） ３．配列番号３ （１）配列の長さ：１９４ （２）配列の型：アミノ酸 （３）トポロジー：直鎖状 （４）配列の種類：タンパク質 （５）起源 生物名：ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス） ４．配列番号４ （１）配列の長さ：１６０ （２）配列の型：アミノ酸 （３）トポロジー：直鎖状 （４）配列の種類：タンパク質 （５）起源 生物名：ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス） ５．配列番号５ （１）配列の長さ：５０４ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：二本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：cDNA to genomic RNA （６）起源 生物名：ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウィルス） （７）配列の特徴： 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..504 特徴を決定した方法：Ｅ ６．配列番号６ （１）配列の長さ：６３３ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：二本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：cDNA to genomic RNA （６）起源 生物名：ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウィルス） （７）配列の特徴： 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..633 特徴を決定した方法：Ｅ ７．配列番号７ （１）配列の長さ：５８２ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：二本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：cDNA to genomic RNA （６）起源 生物名：ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウィルス） （７）配列の特徴： 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..582 特徴を決定した方法：Ｅ ８．配列番号８ （１）配列の長さ：４８０ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：二本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：cDNA to genomic RNA （６）起源 生物名：ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウィルス） （７）配列の特徴： 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..480 特徴を決定した方法：Ｅ

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/576 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 35℃以上50℃以下で加熱処理されたＣ型
   肝炎ウイルス由来遺伝子のＨＣＶ抗原活性ポリペプチド
   を抗原として使用することを特徴とするＣ型肝炎診断用
   免疫学的凝集反応試薬。
2. 【請求項２】 ＨＣＶ抗原活性ポリペプチドが配列番号
   １のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプチド、
   配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペ
   プチド、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活
   性ポリペプチド及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＨ
   ＣＶ抗原活性ポリペプチドを含むことを特徴とする請求
   項１記載のＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬。
3. 【請求項３】 配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＶ
   抗原活性ポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含
   むＨＣＶ抗原活性ポリペプチド、配列番号３のアミノ酸
   配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプチド及び配列番号４
   のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを不
   溶性担体粒子に担持してなることを特徴とする請求項２
   記載のＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬。