PT86081B - Sondas de acido nucleico para a detencao de citomegalovirus latente humano em produtos sanguineos - Google Patents

Description

A presente invenção refere-se a sondas e vectores po linucleótidos derivados de citomegalovírus (HCMV) humano pai ra detecção da presença de HCMV numa amostra celular do cor po humano, bem como a sua aplicação em sistemas de diagnóstico. As sondas incluem uma sequência polinucleótida que corresponde a um gene de proteína anterior ou a um gene de proteína posterior ligado de modo operativo a um meio indicador.

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-2MEMÓRIÀ DESCRITIVA

Referências cruzadas com pedidos afins

Este pedido é uma continuação em parte do pedido de patente Americano, série n?. 726454 pedido em 29 de Abril de 1985 que por sua vez é uma continuação em parte do pedido de patente Americano, série n®. 607387 pedido em 4 de Maio de 1984, sendo estas divulgações aqui incorporadas, apenas como referência.

Campo Técnico

A presente invenção refere-se à produção de uma sonda de ADN de citomegalovírus humano (HCMV) e à utilização dessa sonda para detectar HCMV numa amostra do corpo. A invenção é particularmente útil no rastreamento de produtos sanguíneos em relação à presença de HCMV antes de transfusão.

Antecedentes

A. Infecção por Citomegalovírus

Doença com inclusões de citomegalovírus (CID), doença do virus da glândula salivar generalizada, citomegalia e doença de inclusão são sinónimos de uma doença provocada por infecção/citomegalovírus (CMV). 0 CMV é um agente específico de espécies com as características electro-microscópicas e fisio-químicas de um vírus herpes. 0 citomegalovírus hurna no (HCMV) foi isolado em primeiro lugar numa cultura de tecido fibroblástico em meados da década de 195c a partir de crianças com CID e a partir de tecido adenoide de crianças em idade escolar. Foi notado na cultura de tecido um efeito citopático que se caracterizou por grandes inclusões intranucleares. A propagação do vírus proporcionou a base para o desenvolvimento de testes serológicos específicos como será descrito.

por

A infecção/citomegalovírus está espalhada pelo mundo inteiro. Contudo, o citomegalovírus não provoca uma infecção altamente transmissível. Deste modo, um número substan66 877

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-3cial de indivíduos permanece susceptível à infecção na vida adulta. 0 CMV tem sido isolado da saliva, do tracto res piratório superior, da urina, do leite, das secreções cervicais, do sémen, das fezes e dos leucócitos que circulam no sangue. 0 vírus é provavelmente transferido por contacto íntimo com um indivíduo infectado ou por infusão do sangue de um dador de sangue assintomático.

C CMV está incluído num espectro largo de doenças clínicas desde infecções não aparentes até doenças congénitas agudas. Weller, T., N> Engl. J. Med., 285, 2C3 e 267 (1971).

Por exemplo, a doença ocorre em doentes em terapia imuno-supressiva e em indivíduos com infecções oportunistas. De facto, o CMV tornou-se a infecção mais vulgar após a trans plantação da medula óssea alógena e é um determinante importante do sucesso ou falha do procedimento de transplante /“Neiman et al., J. Infect. Pis., 13 6, 754 (1977)J7.

De entre os adultos submetidos a terapia imuno-supres^ siva após homotransplantação renal mais de 9C% desenvolvem uma infecção por citomegalovírus activa se oossuirem o anticorpo do citomegalovírus antes da cirurgia. Cerca de metade dos doentes seronegativos, ficam subsquentemente infectados em terapia imuno-supressiva. Os receptores seronegativos ao receberem um rim de um dador seropositivo desenvolvem quase sempre uma infecção pós-operatória e provavelmente desenvolvem sintomas.

Tem sido também referido que a infecção por HCMV provoca encefalite, ocorrendo com mais frequência nos doentes imuno-supressivos £ Dorfman, Neurology, 23, 136 (1974): Kauf fman et al., Am. J, Med,, 67, 724 (1979); Schober et al., Lancet. 1, 962 (1973). A documentação do diagnóstico da infecção por HCMV tem sido entravada pela dificuldade em recuperar o vírus de fluido cerebro —espinal (CSF) ou do tecido do cérebro e em vez disso tem assentado nos exames histológi cos dos tecidos infectados.

Cs exemplos de encefalites provocadas por HCMV variam desde os casos que incluem doentes imuno-supressivos após re

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-4ceberem transplantes de orgãos /Bale, Arch. Neurol. , 41, 310 (19847 incluindo rins //Schneck, J, Neuropathol. Exp. Neurol., 24, 415 (19657 até aos que incluem doentes sofredores do síndroma da imuno-deficiência adquirida (SIDA) /Le vy et al., J. Neurosurgery, 61, 9 (1984); Moskowitz et al., Arch. Pathol. Lab, Med,, 108, 867 (1984); Nielsen et al., Am. J. Clin. Pathol., 82, 678 (1984); Snider et al., Ann. Neurol,, 14, 403 (1984)7.

Tem sido descrito um tipo de infecção por citomegalovírus, especificamente em doentes que receberam transfusões de sangue. Este estado referido como mononucleose por CMV pós-transfusão, ocorre duas ou quatro semanas após a administração do sangue.

A infecção adquirida por citomegalovirus tem sido associada com a doença hemolítica auto-imune, com lesões ulcerativas do tracto gastrintestinal, com pneumonia pós-transplantação e púrpura trombocitopénica. Para a maior parte das infecções por CMV adquiridas após o nascimento, a recuperação não tem, porém, complicações significativas.

Há provas inclirectas no que diz respeito ao papel importante dos linfócitos na infecção por citomegalovirus hurna no (HC?V). Por exemplo, os indivíduos com mononucleose por HCMV têm linfócitos atípicos, e testes in vitro revelam funções de linfócitos diminuídas. /Rinaldo et al., J. Infect. Pis., 136, 667 (1977); Carney et al., J, Infect. Pis,, 144, 47 (1981); e Rinaldo et al., J. Infect. Pis., 141 (1980)7· As infecções por HCt*V podem ser transmitidas por dadores saudáveis/^-Stevens et al., J. Am. Med. Assoe., 221, 1341 (197o); Armstrong et al., Transfusion, _3, 159 (1971); Lang et al., N. Engl. J, Med., 278, 1147 (1968; Lang et al., Ibid, 280, 1149 (1969); Prince et al., Ibid., 284, 1125 (1971); e Lang et al., Transfusion (Philadelphia), 17. 391 (19777 (70% de adultos são seropositivos em relação ao HCMV) por transfusão. Contudo, foi apenas recentemente que se veri ficou que uma pequena percentagem (1-5%) de linfócitos infectados in vitro com HCMV expressam proteínas anteriores e imediatamente anteriores /~^Ri^ce al·» Proc. Natl. Acad.

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Sci. USA, 81, 6134 (1984).7, e que se pode demonstrar uma infecção por CMV latente em linfócitos por expressão de proteína e detecção de ARN Schrier et al., Science, 230, 1048 (Nov. 1985^/.

Tentativas anteriores para definir a infecção de linfócitos por HCMV têm sido dificultadas devido a vários facto res que incluem a utilização de estirpes laboratoriais de HCMV de longo termo que parecem ser menos infecciosas do que as estirpes clínicas isoladas na altura /Rice et al., Proc. Natl, Acad. Sei. USA, 81, 6134 (198447, a natureza criptica da infecção /J. Pagano, J. Infect. Pis., 132, 209 (197547 ^e a falta de métodos sensíveis para detectar níveis baixos de virus numa pequena percentagem de células. Além disso, uma característica dos vírus de herpes é a capacidade do vírus de persistir no tecido do hospedeiro durante muitos anos após a infecção inicial e mais tarde ser reactivado para pro vocar a doença por exemplo, HSV-1, HSV-2 e o virus Zoster da varicela (VZV) em glânglios sensoriais e EBV em linfócitos

B. Smbora o CMV pareça provocar uma infecção que dura a vida inteira o foco da infecção latente é desconhecido. No modelo de CMV do murino o vírus pode ser recuperado a partir de células B activadas, por isso há indicações de que os linfócitos não podem ser apenas incluídos no estado de doença e transmissão desta, mas podem ser também um foco de persistên cia do vírus.

diagnóstico da infecção por citomegalovírus num doente com sintomas semelhantes a mononucleose pode ser estabe lecido através do isolamento do vírus a partir de tecidos in fectados. Os anticorpos produzidos em resposta à infecção com um CMV podem ser detectados por neutralização (NT), fixa ção de complemento (CF), imunofluorescência e procedimentos de aglutinação de plaquetas (PA), /ver Weller, T. Η., N. Sngl. J- Med., 285, 2o3 (197147· Testes serológicos vulgarmente disponíveis, devem ser interpretados, contudo, com cui dado quando se diagnostica a infecção por CMV devido a reacções cruzadas com outros vírus de herpes associados às células, e, por exemplo, a tendência do anticorpo em CF para va-

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-6 — riar em larga escala em indivíduos normais. Em adição, como se verificou na Fig. 9, alguns indivíduos seropositivos a HCMV não apresentam vírus detectáveis no sangue.

Não há tratamento satisfatório para infecçÕes por c_i tomegalovirus. A utilização de corticoesteróides, gama-globulina e drogas anti-virais tais como desoxi-uridina, floxu ridina, arabinósido de citosina e arabinósido de adenina têm sido referidos como tendo efeitos suspeitos, vantajosos ou nulos sobre o curso clínico. Contudo, estas referências são difíceis de avaliar devido ao pequeno número de indivíduos tratados, devido aos múltiplos factores que operam simultaneamente e à variabilidade de excreção de vírus em indivíduos testados em momentos diferentes,

B. 0 Genoma de HCMV genoma da estirpe AD169 de HCMV é uma molécula de ADN linear com hélice dupla, e com um tamanho de aproximadja mente 235 Kpb (Kilo pares de bases). Veja-se Figura 1; Weststrate et al., J. Gen, Virol., 49, 1 (1980) e Fleckenstein et al., Gene, 18, 39 (1982). Esta molécula contém duas únicas cadeias de ADN denominadas U e U que são limitadas por um par de repetições invertidas. Weststrate et al., j, Gen, Virol., 49, 1 (198c). As moléculas de ADN de estirpes de HCMV diferentes apresentam 80% de homologia por cinética de reassociação. Huang et al., Yale J, Biol, Med,_, 49, 29 (1976). Porém, o ADN de HCMV tem menos do que 5% de homologia com os tipos 1 e 2 do vírus herpes simplex (HSV-1 e HSV-2, respecti vamente) e com citomegalovírus simio e murino. Huang et al,, J, Virol,, 13, 642 (1974).

A transcrição da maior parte das estirpes laboratoriais (Davis, Towne e AD169) pode ser dividida em três fases separadas. DeMarchi, Virology, 114, 23 (1981); Wathen et θ1·ζ J« Virol., 41, 462 (1982) e McDonough et al., Virology, 125, 31 (1983). As espécies de ARN transcritas antes da síntese da proteína designam-se por ARN imediatamente anteriores (IE) e são transcritos em áreas restritas do genoma. De66 877

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-7Marchi, Virology, 114, 23 (1981); e Wathen et al., J, Virol. 41, 462 (1982). Após o começo da síntese da proteína virai, transcreve-se uma outra classe de espécies de ARN, ARN ante rior, através do genoma, mas principalmente nas repetições de extremidade invertida, Wathen et al,, j. Virol., 41, 462 (1982). Os últimos ARNs são transcritos após o começo da re plicação do ADN virai, fragmento E de HindIII da estirpe AD169 do HCMV /unidades registadas entre cerca de 0,06 e 0,16, Nelson et al., J, Virol., 43, 83 (1982).7 contém 90% da região de cod_i ficação para transcrição de ARN imediatamente anteriores. Wathen et al., J, Virol., 41, 462 (1982) e McDonough et al., Virology, 41, 462 (1982). Produz-se nesta região 4 ARNs ΙΞ transcritos abundantemente (1,9 Kb, 2,2 Kb, 2,3 Kb e 5,0 Kb) e dois transcritos em menor quantidade, janh et al., j, virol . , 49, 363 (1984). (Veja-se Figura 2).

Um dos genes mais caracterizados no genoma de HCMV é o gene principal IE. Esta unidade de transcrição produz um ARN de 1,9 Kb localizado entre um local SstI e BamHI local! zado no fragmento E de HindIII do genoma de AD169. /Nelson et al., Mol, Cell. Biol., 6_, 452 (1986)_7. Este ARN mensagei^ ro (ARNm) é o transcrito mais abundante na região IE e cod_i fica para a proteína IE principal de 7200 daltons (72 K) co mo é referido por Stinski et al., J. Virol., 46, 1 (1983)/ gue pode ser detectada pelo anticorpo monoclonal L-14. Rice et al,, Proc. Natl, Acad. Sei, USA, 81, 6134 (1984).

anticorpo monoclonal (mab) L-14 reage especificamente com as células infectadas por CMV. Em particular, mab L-14 reage com uma proteína que aparece logo a seguir à infecção por CMV (dentro de 3 horas) e permanece localizada, nos núcleos das células, durante o ciclo infeccioso. 0 hibridoma que produz mab L-14 foi depositado em 3 de Maio, 1984 na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland e foi-lhe atribuído o número de acesso de ATCC, HB8554.

Recentemente, uma análise estrutural deste ARNm de

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-81,9 Kb a partir da estirpe Towne indicou que o transcrito foi uma molécula entrançada contendo 4 exãos de 1341, 185, 88 e 121 nucleótidos, respectivamente. Stenberg et al», J. Virol., 49, 190 (1984). Esta proteína IE está associada de preferência com cromatina e tem-se proposto que esta proteí. na desempenha uma função principal ao influênciar a transcrição de outros genes virais. Stinski et al., J, Virol», 46, 1 (1983). Verificou-se que 2 células de ratazanas micro -injectadas com clones codificando para este gene IS expres; savam rapidamente (dentro de cerca de 2 horas) a proteína de 72 K por imunofluorescência utilizando o anticorpo monoclonal Ξ-3. Goldstein et al», Inject» and immun», 38, 273 (1982).

Estes resultados sugerem, que, mesmo que o HCMV tenha uma pequena gama de hospedeiros a expressão do gene IE principal não está dependente da replicação do vírus. Contudo, durante uma infecção moderada a transcrição do ARN IE de 1,9 Kb não é detectável em 48 horas pós-infecção, demonstrando uma regulação temporal do' gene. Nelson et al., Mol» Cell» Biol. 6, 452 (1986).

C. Métodos de Diagnóstico Virai

Os métodos de diagnóstico virai convencionais consistem, tipicamente, em estudos de isolamento virai e serologia. Quando se utilizam culturas de células sensíveis, certos virus comuns como os virus herpes simplex, enterovirus e vírus da gripe podem ser isolados num período compreendido entre 1 a 4 dias. Contudo outros virus que incluem citomegalovirus podem necessitar de 7 a 14 dias ou mais, para isolamento. Deste modo, embora o isolamento virai, permanece a técnica de referência em relação à qual as outras técnicas de diagnóstico virai são avaliadas, é imperativo desenvolverem-se métodos mais rápidos.

Um método de diagnóstico rápido ideal poderia envolver o exame directo de amostras clínicas com um resultado obtido dentro de horas de recolha. A microscopia electrónica tem sido utilizada para diagnóstico virai rápido, mas é demasiado

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-9dispendiosa, morosa e pouco sensível para ser utilizada na análise de rotina de grande número de amostras. Durante mui tos anos os métodos de diagnóstico virai rápidos centraram-se à volta da detecção de antigénio virai e incluiam imuno fluorescência, radio-imuno-ensaios, imuno-peroxidase e mais recentemente ensaio imuno-sorvente ligado a enzima. Estes métodos têm sido aplicados directamente a amostras clínicas para biópsia e autópsia de tecidos e para culturas de células após inoculação virai e ampliação com vista a obter resultados mais rápidos. De um modo geral, contudo, estes métodos não se têm mostrado tão sensíveis como o isolamento virai quando aplicados directamente a amostras clínicas.

Ao longo dos anos têm-se desenvolvido técnicas de hi bridação de uma variedade de ácido polinucleico (polinucleó^ tido) para investigar a estrutura e a expressão de genes c£ lulares e virais. Nos últimos anos, a tecnologia de híbrida ção do ácido polinucleico foi aplicada à virologia clínica tanto para diagnóstico rápido utilizando amostras clínicas como para estudos de patogénese virai.

As vantagens de hibridação do ácido polinucleico incluem a sua especificidade, as sondas de ácido polinucleico ligam-se a sequências polinucleótidas complementares numa amostra de teste e a sua sensibilidade, baseada numa forte avidez de sequências complementares umas pelas outras.

A hibridação pode também ser utilizada, como se descreveu aqui, para detectar infecções virais não replicantes que são abortivas ou latentes.

A molécula de ADN no seu estado natural é constituída por duas cadeias enroladas em hélice à volta uma da outra, com cada base ligada especificamente por ligações de hidrogénio a uma base complementar da outra cadeia. Por exem pio, a timina está sempre ligada por ligações de hidrogénio à adenina e a guanina está sempre ligada por ligações de hidrogénio à citosina. As ligações de hidrogénio entre as bases podem ser quebradas por aquecimento de forma que as du66 877

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-10as cadeias de ADN sej'am completamente separadas uma da outra. A dissociação de ADN (também chamada desnaturação ou fusão) ocorre a uma temperatura que é característica para cada ADN. A temperatura de fusão (T ) de cada ADN varia de acordo com o conteúdo de guanina juntamente com o conteúdo de citosina e o comprimento do ADN, a força iónica da solução, e a presen ça de solventes orgânicos tais como formamida. Por exemplo, cada 1% de formamida na mistura reaccional reduz geralmente o T em cerca de C,7°C.

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Quando deixada em solução a uma temperatura abaixo de T_m as cadeias sozinhas de ácido polinucleico dissociado coli dem com pares complementares e se as condições estiverem cor rectas formam-se outra vez hélices duplas. A velocidade de reassociação é máxima para cerca de 25°C abaixo de para esse ADN.

A reassociação ou ligação de um polinucleótido é determinada principalmente pela concentração polinucleótida e pelo tempo de incubação. Outros factores que afectam a velocidade de reassociação são a complexidade do polinucleótido (quanto mais complexo mais lenta é a velocidade), a força ió nica da solução (aumentando a força iónica aumenta a velocidade de reassociação) e a presença de polímeros de pesos moleculares elevados tais como sulfato de dextrano, que pode aumentar a velocidade de reassociação de 3 a 100 vezes.

A estabilidade do polinucleótido reassociado, enrolado depende do grau em que as duas cadeias são compostas por sequências de bases complementares, que por sua vez determina como os duas cadeias estão bem ligadas por hidrogénio. Quando a hibridação se processa sob condições severas apenas as cadeias altamente complementares se ligam. Sob condições de baixa severidade pode ocorrer a formação de híbridos com algum grau de má combinação de bases. As condições de baixa severidade podem ser úteis quando se torna vantajoso detectar sequências de ácidos polinucleicos afins mas não idênti cas. Isto tem sido feito com vírus de papiloma humano, vírus de tipos 1 e 2 de herpes simplex, adenovirus, enterovirus e

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-11rotavirus.

Nos processos padrão a sonda de ácido polinucleico de cadeia única, marcada, que contém a sequência ou sequências específicas complementares à sequência ou sequências investigadas é misturada com uma amostra de ΑΌΝ ou ARN desnaturada (dissociada), Sob condições apropriadas, a sonda marcada liga-se na amostra com sequências de ácido nucleico complementares, formando híbridos duplamente enrolados que contêm agora o marcador . Através de vários métodos conhecidos os ácidos polinucleicos única e duplamente enrolados podem ser separados e o 'marcador pode ser quantifiçado.

Ereve Sumário da Invenção

A presente invenção contempla uma sonda polinucleótida para o citomegalovírus humano (HCMV), um processo para a preparação de uma sonda e a utilização dessa sonda para testar a presença de HCMV numa amostra de corpo humano.

Um dos aspectos desta invenção diz respeito a um método para a detecção de citomegalovírus humano latente numa amostra de corpo humano. Esse processo compreende os seguin tes passos: (a) a mistura de uma amostra de corpo celular humano permeabilizada e fixa, tal como células '-ononucleares de sangue periférico (PBMs), como por exemplo, linfócitos, com uma sonda polinucleótida derivada de HCMV recombinante cuja sequência corresponde a qualquer um ou a ambos os genes expressos como um ARN posterior ou imediatamente anterior transcrito pelo virus numa guantidade suficiente pa_ ra ligar qualquer polinucleótido complementar presente; isto é, as células permeabilizadas, fixas são misturadas com um polinucleótido desta invenção que inclui um meio indicador; (b) conservação da mistura sob condições de hibridação duran te um período de tempo suficiente para que ocorra a ligação da sonda a qualquer polinucleótido complementar presente na amostra, (c) separação da sonda complexada e sequência complementar de qualquer sonda não complexada; e (d) análise da presença de um sinal do meio indicador.

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-12Um outro aspecto da presente invenção está relaciona do com um processo para a preparação de uma sonda ou plasmjí deo recombinante derivado de HCMV. Esse processo compreende os passos: (a) digestão do fragmento E de HindIII de um ADN de uma estirpe HCMV com endonuclease de restrição EcoRI para proporcionar segmentos de ADN lineares fragmentados incluin do um fragmento J de EcoRI de cerca de 10 Kb, como se apresenta na Figura 3; (b) ligação do fragmento J de EcoRI no local EcoRI de um plasmídeo para proporcionar um plasmídeo recombinante derivado de HCMV; (c) clonação do plasmídeo re combinante num meio de replicação apropriado, tal como uma bactéria para proporcionar uma quantidade do plasmídeo recombinante suficiente para utilização como sonda; e (d) ligar um meio indicador ao plasmídeo ou ao seu fragmento J de EcoRI para formar a sonda. O plasmídeo recombinante assim formado é depois clonado (replicado) num meio de replicação para produzir uma quantidade maior desse plasmídeo, o plasmídeo recombinante derivado de HCMV, ou o fragmento j de EcoRI, clonados, são recuperados do meio de replicação e ligados aos meios indicadores para utilização como sondas de ADN.

Numa outra forma de realização, esta invenção inclui um processo para a preparação de um plasmídeo recombinante derivado de HCMV ou de uma sonda que compreende os passos de digestão do plasmídeo recombinante derivado de HCMV contendo o fragmento J de EcoRI descrito antes com endonuclease de restrição Pst-I para proporcionar segmentos de ADN li. neares fragmentados que incluem um fragmento m de PstI de cerca de 1,8 Kb como se apresenta na Figura 4 e ligação do fragmento m de PstI ao local PstI de um segundo plasmídeo para proporcionar um segundo plasmídeo recombinante derivado de HCMV. Esse segundo plasmídeo é tipicamente clonado num meio de replicação apropriado para proporcionar mais quantidade do plasmídeo e liga-se um meio indicador ao pla_s mídeo resultante ou pelo menos à porção de fragmento m de PstI correspondente para formar a sonda desejada.

Ainda, numa outra forma de realização desta invenção,

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-13o processo anterior pode incluir ainda os seguintes passos adicionais: digestão do plasmídeo recombinante, derivado de HCMV que contém o fragmento <T de EcoRI, citado em primei ro lugar, com endonucleases de restrição BglII e BamHI para proporcionar segmentos de ADN lineares fragmentados incluindo um fragmento BglII-BamHI de cerca de 475 bases como se apre senta na Figura 4; e ligação do fragmento BglII-BamHI ao lo cal BamHI do poliligante do plasmídeo pUC18 para proporcionar um terceiro plasmídeo recombinante derivado de HCMV. Li ga-se depois um meio indicador ao plasmídeo ou pelo menos à sua porção BglII-BamHI para formar a sonda.

Prepara-se uma sonda de ARN por digestão do terceiro plasmídeo recombinante derivado de HCMV descrito atrás com endonucleases Eco-RI e Pstl para proporcionar um fragmento EcoRI-PstI como se apresenta na Figura 3 que inclui o fragmento BglII-BamHI mencionado atrás de cerca de 475 bases. Esse fragmento EcoRI-PstI é depois ligado aos locais respectivos de um plasmídeo de transcrição in vitro como pSP65 para formar um quarto plasmídeo. 0 quarto plasmídeo é em se guida clonado num meio de replicação apropriado para preparar mais quantidade. 0 plasmídeo resultante é depois linearizado com uma endonuclease apropriada e prepara-se uma son da de ARN a partir do plasmídeo linearizado resultante atra vés de uma reacção de transcrição desenrolada in vitro leva da a efeito na presença de um ou mais trifosfatos do ácido ribonucleico marcados de forma apropriada.

Uma outra forma de realização desta invenção inclui um processo para a preparação de um plasmídeo recombinante derivado de HCMV ou uma sonda que compreende os seguintes passos: (a) digestão do primeiro plasmídeo recombinante derivado de HCMV que contém um fragmento J de EcoRI com endonucleases de restrição BamHI e EcoRI para proporcionar segmentos de ADN lineares fragmentados que incluem um fragmen to BamHI-EcoRl de cerca de 4,2 Kb como se apresenta na Figu ra 3; e (b) ligação dos locais BamHI e EcoRI do poli-ligante de plasmídeo pUC19 para proporcionar um quinto plasmídeo

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-14recombinante derivado de HCMV. Esse quinto plasmídeo é tip_i camente clonado num meio de replicação apropriado para proporcionar mais quantidade de plasmídeo e liga-se um meio in dicador ao plasmídeo resultante ou pelo menos à sua porção de fragmento BamHI-EcoRI para formar a sonda desejada.

Ainda noutra forma de realização desta invenção, con templa-se um processo para a preparação de um plasmídeo recombinante derivado de HCMV e uma sonda relacionada com um produto proteíco do gene posterior que compreende os seguin tes passos: (a) digestão do fragmento D mais A (A-D) de ScoRI de um ADN de uma estirpe de HCMV com o fragmento R da endonuclease de restrição BamHI de cerca de 6,6 Kb como se apresenta na Figura 5; e (b) ligação do fragmento R de BamHI ao local BamHI do poli-ligante do plasmídeo pUC19 para proporcionar um sexto plasmídeo recombinante derivado de HCMV. Esse sexto plasmídeo é tipicamente clonado num meio de replicação apropriado para proporcionar mais quantidade de plasmídeo e liga-se um meio indicador ao plasmídeo resultan te ou pelo menos à sua porção de fragmento R de BamHI para formar a sonda desejada.

Em qualquer uma das formas de realização descritas aqui, a estirpe de HCMV pode compreender uma das estirpes de HCMV frequentemente utilizadas incluindo Davis, Towne e AD169 e os plasmídeos podem ser seleccionados de entre pACYC184, pUC18, pUC19 o chamado vector pSP65 de Ribosonda e outros plasmídeos ou cosmídeos bem conhecidos dos peritos da especialidade.

Cada um dos plasmídeos derivados de HCMV descritos antes é de preferência clonado num meio de replicação tal como um organismo unicelular semelhante a E. coli para produzir uma quantidade maior do plasmídeo no meio. 0 plasmídeo derivado de HCMV clonado é depois recuperado , do meio de replicação.

Para utilização como sondas de ADN, os plasmídeos clonados recuperados são ligados operativamente a um meio indicador, como se referiu, que é capaz de indicar a presen

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-15ça da sonda ligada ao ácido nucleico do HCMV em células a se rem testadas. A ligação de um meio indicador ao plasmídeo pa ra formar a sonda de ADN pode ser realizada de várias maneiras, mas a tradução por corte é o método preferido.

Cutros aspectos desta invenção incluem os plasmídeos recombinantes derivados do HCMV e as sondas. Cs plasmídeos recombinantes iniciais derivados do HCMV preferidos (PJN201 e pCM3) úteis na preparação de plasmídeos e sondas desta invenção têm sido depositados em American Type Culture Collection (aTCC) em Rockville, Maryland e têm sido designados com os números de acesso ATCC _Ê151i_ ® . respectivamente. Esses plasmídeos estavam contidos em E. coli e foram depositados em 22.12.1987 de acordo ao tratado de Bud_a peste.

Um outro aspecto desta invenção á um sistema de ensaio de diagnóstico para a detecção da presença de HCMV numa amostra biológica. Esse sistema de ensaio é particularmente útil na análise dos produtos sanguíneos para o HCMV latente antes da transfusão de um ou mais constituintes do sangue.

sistema compreende pelo menos um recipiente e incui como ingrediente activo uma quantidade de uma sonda recombinante derivada de HCMV, ligada a um meio indicador, de_s ta invenção correspondendo em sequência a um gene de proteína imediatamente anterior suficiente para reagir e ligar-se às sequências complementares de ácido nucleico na amostra. Uma sonda controlada pelo gene imediatamente anterior é particularmente útil para a detecção de uma infecção por HCMV la. tente. Prefere-se uma combinação de sondas, uma controlada pelo gene imediatamente anterior do produto proteico de 72K e a outra controlada pelo gene do produto proteico posterior para detectar infecção num doente em que não é conhecido se a infecção está no estado de transcrição dos genes imediatamente anteriores ou se progrediu para o estado de transcrição em que os genes posteriores e não os imediatamente anteriores estão a ser expressos. Deste modo, outro sistema de diagnóstico compreende, pelo menos, dois recipientes, um dos quais inclui o ingrediente activo anterior e o outro inclui

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-16como ingrediente activo uma quantidade de uma sonda desta invenção, derivada de HCMV ligada a um meio indicador contro lada por um produto proteico de gene posterior suficiente pa ra reagir e ligar-se às sequências complementares do ácido nucleico na amostra.

C meio indicador pode incluir radio-isótopostais como

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Η, P, C e S. Um outro meio indicador particularmente eficaz é a biotina que pode produzir uma sonda marcada com biotina que é estável pelo período máximo de dois anos quando armazenada a -20°C. As sondas que contêm biotina são tipi camente utilizadas com amplificadores que contêm avidina e reagentes de visualização.

Breve Descrição dos Desenhos

Nas Figuras que são parte desta descrição:

A Figura 1 é um diagrama físico dos fragmentos EcoRl de ADN de HCMV, estirpe ÀD169, representando as posições relativas das sequências de fragmentos de ADN virai utilizadas para hibridação in situ, bem como os ARNs transcritos abundantemente produzidos pelos fragmentos A, D e J de EcoRl.

Ilustra-se também na porção inferior da Figura um dia grama compósito que ilustra as posições aproximadas dos locais de clivagem de endonuclease de restrição EcoRl e as letras que designam os fragmentos produzidos por essas clivagens. Este diagrama está representado na direcção oposta da indicada por Fleckstein et al., Gene, 18, 39 (1982), na pág. 44.

A Figura 2 é um diagrama do fragmento Ξ de ADN de HindIII da estirpe AD169 de HCMV, ilustrado da esquerda para a direita e na direcção da extremidade 5’ para a extremidade 3' que inclui a região de codificação para os ARNs imediatamente anteriores que são transcritos antes da síntese de pro teína. As posições aproximadas dos locais de clivagem de endonuclease de restrição EcoRl e BamHI no fragmento E de HindIII são ilustradas bem como as posições aproximadas dos seis transcritos de ARN desta região.

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Ref: EPG:11-SCRF 55.2

-17A Figura 3 é um diagrama esquemático que apresenta a subclonação dos vários segmentos J de EcoRI de HCMV conti dos no fragmento E de HindIII presente no plasmídeo recombi nante pJN2Ol descrito por Nelson et al., J. Virol., 43:83-91 (1982). Neste diagrama o fragmento J de EcoRI de 10 Kb é isolado a partir de pJN201 e clonado no vector pACYC184 para formar o plasmídeo identificado como EcoRI J-5018 representa-se também a clonação sequencial do fragmento J de EcoRI no vector pUC18 para proporcionar um primeiro plasmídeo recombinante de EcoRI J-pUC18 derivado de HCMV; a clona ção de um fragmento m de PstI no vector pUC18 para proporcionar um segundo plasmídeo recombinante PstI-m-pUC18 derivado de HCMV; a clonação de um fragmento de BglII-BamHI no vector pUC18 para proporcionar um terceiro plasmídeo recombinante 1,9 BglII-BamHI-pUC18 derivado de HCMV; a clonação de um fragmento EcoRI—PstI que contém o fragmento BglII-BamHI no vector pSP65 de Ribo-sonda para proporcionar um quarto plasmídeo recombinante derivado de HCMV denominado 1,9 BglII-BamHI-pSP65; e a clonação do fragmento BamHI-EcoRI localizado na extremidade 5’ do fragmento J de EcoRI relativo ao transcrito de ARN ΙΞ de 1,9 Kb no vector pUC19 para proporcionar um quinto plasmídeo recombinante pIEBamHI-RI derivado de HCMV.

A Figura 4 é um diagrama de endonuclease de restrição ilustrado da esquerda para a direita e na direcção da extremidade 5’ para a extremidade 3', apresentando a região de codificação para o fragmento J de ADN de EcoRI do fragmento E de HindIII da estirpe AD169 de HCMV. As posições aproximadas dos locais de clivagem de endonuclease de restrição PstI, SstI, Bglll e BamHI no fragmento J de EcoRI são ilustradas bem como as posições aproximadas do fragmento m de PstI e do fragmento BglII-BamHI.

A Figura 5 é um diagrama esquemático apresentando a clonação de um fragmento de BamHI de 6,6 Kb de HCMV denominado R de BamHI no local BamHI do vector plasmídeo pUC19 pa ra formar o plasmídeo recombinante pCMBamR. 0 fragmento R

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-18de BamHI é derivado do vector plasmídeo pCM3 que contém os fragmentos combinados A mais. D (A-D) de EcoRI 33 Kb de HCMV clonados no cosmídeo pHC79 /Fleckenstein et al,, Gene, 18, 3 9 (1982),7 por reacção com BamHI para proporcionar segmentos de ADN lineares fragmentados incluindo o fragmento R de BamHI de 6,6 Kb. 0 plasmídeo recombinante, pCMBamR, quando ligado a um meio indicador é útil como sonda de ADN para o ARN posterior de HCMV de 4,0 Kb.

A Figura 6 contém úma imagem compósita de oito fotomicrográficos que são marcados com os números de 1 a 8. 0 painel 1 apresenta a hibridação in situde células mononucleares de sangue periférico (PBM) de um dador A seropositi

5 vo de HCMV utilizando uma sonda marcada em S denominada pUC18-EcoRIJ para uma ampliação de 20 vezes. 0 Painel 2 ilus tra uma porção do painel 1 para uma ampliação de 100 vezes. 0 painel 3 representa os resultados de um estudo de uma hibridação in situ utilizando a sonda pUC18-EcoRIJ anterior e PBM de um dador A que foi tratado com NaCH 0,1 M durante um periodo de 30 minutos a 37°C antes da hibridação. 0 painel 4 apresenta PBM de um dador seronegativo para HCMV hibridado com a sonda pUC18-EcoRIJ. 0 painel 5 é semelhante ao painel 1 à excepção de os PBM serem de dadores B seropositivos para HCMV. 0 painel 6 apresenta células de um dador B que foram pré-seleccionadas por FACS para o marcador 0KT4 e depois hibridados como no painel 5. 0 painel 7 apresenta células de um dador B que foram pré-seleccionadas por FACS para o marca dor CKT8 e depois hibridadas com a sonda pUC18-EcoRI J marca ~

da com S. 0 painel 8 apresenta PBM de um dador B hibrida35 dos com pUC18 marcado com S.

A Figura 7 contém uma imagem compósita de trés fotomi crográficos apresentando hibridação in situ para secções finas de rins infectados com HCMV utilizando sondas de genes posteriores ou imediatamente anteriores de HCMV.

Obtiveram-se secções finas de um rim de doente injectado com HCMV, fixou-se com formalina, embeberam-se com parafina e submeteram-se a uma hibridação in situ utilizando

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Ref: EPG:11-SCRF 55.2

-19sondas derivadas de HCMV marcadas com ^Se contaastadas/coloração com hematoxilina como se descreveu na secção de Materiais e Métodos. A imagem A apresenta hibridação utilizando uma son da derivada do gene de HCMV imediatamente anterior EcoRI J (400x); a imagem B apresenta hibridação utilizando a sonda derivada do gene de HCMV posterior, pCM3 (400x); e a imagem C não apresenta hibridação quando se utiliza uma sonda de controlo negativo, pUC18 (250x).

A Figura 8 contém fotomicrográfico que apresenta hibridação in situ para secções finas de cérebro humano infectado com HCMV utilizando sondas de genes imediatamente anteriores de HCMV. As secções embebidas em parafina de tecido periventricular foram hibridadas in situ com a sonda de 35 genes imediatamente anteriores de HCMV marcada com S, EcoRI J e contrastadas com hematoxilina como se descreve a se guir (400x).

A Figura 9 é um gráfico que ilustra as variações na hibridação para PBMs de dadores seropositivos normais para HCMV (G, R, B, P e S) utilizando a sonda EcoRI J imediatamen te anterior como se descreveu na secção de Materiais e Métodos, A análise repetida durante um período de um ano por hibridação in situ de PBMs de dadores seropositivos normais assintomáticos mostrou que os níveis de hibridação podem ser estáveis para um indivíduo determinado como também podem variar com o tempo. A ordenada está em unidades de percentagem de células que exibiram hibridação positiva com a sonda em que a abcissa ilustra os meses de 1985 e 1986 em que as PBMs foram obtidas dos dadores.

Descrição Detalhada da Invenção

I. DEFINIÇÕES

As sondas de ácidos polinucleicos (polinucleétidos) úteis aqui, nesta invenção, são utilizadas juntamente com um meio marcador indicador, meio indicador, grupo indicador ou um marcador, sendo todos estes termos utilizados indistintamente. 0 grupo indicador ou marcador é utilizado em con

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Ref: EPG:11-SCRF 55.2

-20junto com a sonda como um meio para assinalar (determinar) que um ADN ou ARN complementar de HCMV está ligado à sonda.

Os termos anteriores são utilizados aqui para incluir os átomos e moléculas sozinhos que estão ligados à son da se esses .átomos ou moléculas são utilizados isoladamente ou em conjunto com reagentes adicionais. Esses grupos indica dores ou marcadores são eles próprios bem conhecidos em bioquímica e constituem uma parte desta invenção apenas na medi da em que são utilizados com sondas, métodos e/ou sistemas no vos.

marcador, que proporciona o sinal, utilizado está ligado operativamente à sonda como se segue.

termo ligado operativamente é utilizado para indi car que uma entidade está ligada a uma outra entidade de for ma que a função normal de ambas as entidades não esteja substancialmente enfraquecida. Deste modo, onde um marcador es tá ligado operacionalmente a um polinucleótido numa sonda, as funções de polinucleótido ligam-se a um cordão polinucleó tido complementar e as funções de meios indicadores para indicar que ocorre essa junção em pares e ligação à cadeia da sonda e cadeia complementar. Onde uma cadeia polinucleótida está ligada operativamente a um vector por ligação, o vector recombinante resultante é capaz de replicação. Sempre que se descreve uma entidade como estando ligada a uma outra entida de deve-se entender que essas entidades estão ligadas operativamente quer se utilize a palavra operativamente ou não.

C grupo indicador pode ser ou pode utilizar uma enzima activa biologicamente tal como horseradish, peroxidase de rábano,(HRP) ou glicose oxidase ou análogos. Quando o gru po indicador principal é uma enzima tal como HRP ou glicose oxidase, são necessários reagentes adicionais para visualizar o facto de que um complexo se formou entre a sonda e uma cadeia de ácido nucleico complementar. Esses reagentes adicionais para HRP incluem peróxido de hidrogénio e um precursor corante de oxidação , tal como diaminobenzidina. Um reagente adicional útil com glicose oxidase é 2,2' azino-di66 877

Ref: EPG:11-SCRF 55.2

-21-(ácido 3-etilbenzo-tiazolina-6-sulfónico) (ABTS).

Os elementos radioactivos proporcionam uma outra classe de marcadores particularmente preferidos e são utilizados nesta invenção como exemplos de marcadores úteis. Um exemplo de agente de radiomarcação que pode ser utiliza d.o na invenção é um elemento radioactivo que produz radiações beta. Os elementos que emitem eles próprios radiações

14 32 35 beta, tais como H, C, P, e S representam uma classe de grupos indicadores de elementos radioactivos que produzem radiações beta.

termo sonda, 4 utilizado aqui, nesta invenção, para indicar uma sequência polinucleótida de ADN ou ARN qu⁵ contém um meio indicador ligado , como se discutiu atrás, ou seja complementar a um ARN mensageiro ou a uma ca deia de ADN simples que codifica uma proteína tal como proteína posterior ou imediatamente anterior expressa por HCMV. Uma sonda é utilizada como uma cadeia de ácido polinu cleico simplesj/^por conveniência, é algumas vezes referida aqui como a molécula de dupla cadeia, tal como um plasmídeo ligado a um meio indicador. Como se apresenta aqui, a sonda de cadeia simples é tipicamente preparada a partir de uma molécula de dupla cadeia, por aquecimento e rápido arrefeci, mento antes ou depois da mistura da sonda com a amostra bio lógica a ser testada.

A sonda descrita aqui é utilizada num estudo de hibridação polinucleótida em que se liga uma sonda de dupla cadeia a uma cadeia complementar de outro polinucleótido nu ma célula. Esses estudos da hibridação são bem conhecidos da técnica como estudos de hibridação in situ. Nesses proce dimentos de hibridação, a sonda e a sua sequência polinucleótida complementar pesquisada devem ser de cadeia única, como já se referiu.

Quando a sonda contém moléculas de ADN, deve-se fundir para formar moléculas de cadeia única. Quando o polinucleótido complementar pesquisado é também uma molécula de

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Ref: ECG:11-SCRF 55.2

-22ADN, essa molécula deve ser também fundida antes da sonda poder ligar-se a ela. Deste modo, quando a sonda de ADN é utilizada para hibridar um ADN pesquisado, as moléculas de dupla cadeia devem ser fundidas ao mesmo tempo durante o estudo de forma que possa ocorrer a ligação desejada. Esses passos da fusão podem ser realizados independentemente ou após ambas as moléculas de dupla cadeia serem misturadas.

Quando a sonda de ADN é utilizada para pesquisar ARN como se descreve a seguir, apenas a sonda de ADN necessita de ser fundida para ser utilizada. Porém, a sonda de ADN de dupla cadeia e o ARN também de dupla cadeia dentro da célula podem também ser fundidos após a mistura, se se desejar. Não é necessária a fusão quando a sonda de ARN é utilizada para pesquisar um ARN complementar, visto que as sondas de ARN são de cadeia única como o ARN pesquisado.

Em adição, enquanto os polinucleótidos pesquisados nas manchas de hibridação de Southern ou Northern estão relativamente disponíveis para a sonda, os polinucleótidos pesquisados no estudo de uma hibridação in situ estão relativamente protegidos pela parede da célula. Como consequência, as células estudadas são fixas e permeabilizadas antes de se realizar o estudo da hibridação. São conhecidas várias técnicas para permeabilização das células estudadas. Apresenta-se um método específico a seguir. Em adição alguns investigadores tratam as células estudadas com uma protease tal como tripsina, quimotripsina e proteinase K. C método particular de permeabilização utilizado num método de hibridação in situ é tipicamente uma questão de escolha que pode afectar determinações quantitativas mas normalmente não afecta as determinações qualitativas.

A frase condições de hibridação quando utilizada com um período de tempo de conservação é utilizada aqui para significar que uma sonda e a amostra biológica a ser testada são misturadas sob condições que proporcionam células permea bilizadas, moléculas ligantes de cadeia única, como adequado,

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Ref: SPG:11-SCRF 55.2

-23e que a mistura assim formada é mantida sob condições de temperatura e durante um período de tempo suficiente para a sonda e qualquer polinucleótido complementar presentes na amostra se liguem e formem uma molécula de dupla cadeia. Es. se período de tempo e as condições de temperatura são bem conhecidos da técnica e são exemplificados nos estudos de hibridação in situ apresentados a seguir.

termo vector é utilizado aqui como sendo sinónimo de veículo de clonação e inclui um plasmídeo, um cosmídeo, um aDN fago ou outras sequências polinucleótidas que são também capazes de replicar num meio de replicação tal como uma bactéria ou uma levedura. Um vector é caracterizado por conter um ou um número pequeno de locais de reconhecimento de endonucleases de restrição nos quais se pode cortar a sequência polinucleótida de uma forma determinável sem perda de funções biológicas essenciais do vector, por exemplo, replicação, produção de proteínas de revestimento ou perda de promotores ou, locais de ligação e por conter um marcador apropriado para utilização na identificação de células transformadas, por exemplo, resistência à tetraciclina ou à ampicilina.

Cs plasmídeos que são extracromossómlcos e os polinu cleótidos cíclicos são utilizados como exemplo de vectores. Um vector de plasmídeo isento de sequência polinucleótida derivada de HCMV é normalmente referido aqui como um plasmídeo ao passo que um vector de plasmídeo contendo uma sequência derivada de HCMV é normalmente referido aqui como um plasmídeo recombinante.

São utilizados aqui as seguintes abreviaturas e sím-

bolos.
bp	par(es) de base
Kb	1000 bp
K	quilodalton(s)
Mr	massa molecular relativa aparente
ADN	ácido desoxi-ribonucleico
ADNc	ADN complementar

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Ref: EPG:11-SCRF 55.2

ARN

ARNm

Replicação ácido ribonucleico

ARN mensageiro a unidade que controla os actos individuais da replicação; tem uma origem na qual se inicia a replicação e pode ter um terminal no qual a replicação pára.

Quando utilizada num contexto que descreve ou apresen ta sequências de nucleótidos as bases de purina ou pirimidina que formam a sequência de nucleótido são apresentadas como se segue:

desoxiadenil desoxiguanil desoxicitosil desoxitimidil

II. VECTORES PLASMÍDBOS

As infecções por citomegalovírus humano (HCMV) podem ser transmitidas pelo sangue e tem-se verificado que afectam as funções dos linfócitos como se descreveu antes. A infecção dos linfócitos com CMV parece provocar uma infecção latente ou prematura /Rice et al., Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 81, 6134 (1984); e Schrier et al., Science, 230, 1048 (1985)/, cuja natureza não está ainda definida. De acordo com a presente invenção, um método de hibridação in situ (descrito a seguir) proporciona um meio sensível e preciso para detectar uma infecção por CMV prematura nas células mononucleares periféricas humanas (PBM) tais como os linfócitos. A utilização do método permite a definição do estado do vírus e auxilia na avaliação clínica de indivíduos de risco a partir da infecção por CMV evidente. Especificamente, a transcrição de ARN de HCMV (ARNm) que se sabe ser produzida em diferentes estados de replicação virai pode agora ser determinada .

Em particular, para detectar o ácido nucleico virai em células infectadas na forma latente (ou prematura) selec66 877

Ref: EPGíll-SCRF 55.2 “à»*’' .-à/

-25cionaram-se fragmentos virais clonados, como sondas a partir de regiões do genoma de HCMV que são transcritas de forma abundante nestas células durante uma infecção prematura. Os termos estado latente, infecção latente, infecção não tolerada e infecção prematura utilizados aqui nas várias formas gramaticais, significam que o vírus não pode ser dete ctado em tecidos ou secrecçÕes através de ensaios convencionais de cultura de células mas não obstante, persistem num estado de não replicação ou num nível de replicação não dete ctável, possivelmente intermitente.

A maior parte das células infectadas não toleravelmen te por HCMV apresentam um bloqueio na expressão de genes virais posteriores. Rice et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 6134 (1984); DeMarchi, J. M., Virology, 129, 287 (1983) e LaFemina et al., J. Gen. Virol., 64, 373 (1983). Deste modo, as sondas recombinantes de HCMV foram desenvolvidas de forma a conterem regiões de codificação para genes anteriores, como é descrito a seguir.

processo de preparação de plasmídeos recombinantes compreende geralmente a clivagem de um plasmídeo vector isolado num ou mais locais específicos através de uma endonuclease de restrição, por exemplo, EcoRI, PstI, BamHI, BglII e análogos. 0 plasmídeo que é uma molécula de ADN circular, ) é deste modo convertido numa molécula de ADN linear pela enzima que corta as duas cadeias de ADN num local específico. Cutro ADN não-vector é clivado de modo semelhante com a mesma ou uma enzima semelhante. 0 vector linear ou suas porções e os ADN lineares não-vectores podem ser ligados covalentemente para formar um circulo único de um ADN de cadeia de parte dupla/parte simples, dupla ou simples, pela sua mistura e reacção com uma segunda enzima conhecida como ligase po linucleótida, como é bem conhecido.

Inicialmente, os fragmentos clonados da maior parte da região imediatamente anterior de HCMV (fragmento E de HindIII) foram investigados aqui, utilizando a tecnologia de

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-26ADN recombinante anterior. A clonação do fragmento E de HindIII da estirpe AD169 de HCMV foi previamente descrita, /Nelson et al., J. Virol., 43, 83 (1983)J7 e é referida como o plasmídeo pJN201. Porém, o conceito de utilizar o fragmen to clonado com uma porção de uma sonda de ADN para uma infecção PBH prematura ou latente não foi descrito aí.

C fragmento E de ADN de HindIII de HCMV AD169, por exemplo, contém cerca de 21,5 Kb /Fleckenstein et al., Gene, 18, 39 (1982)_/ e cerca de 90% da região de codificação para transcrição de ARN imediatamente anteriores (IE) /Wathen et al., J, Virol., 41, 462 (1982) e McDonough et al., Virology, 125, 31 (1983)-/. Produz-se nesta região quatro ARN IE tran£ critos de modo abundante (1,9 Kb, 2,2 Kb, 2,3 Kb e 5,0 Kb) e dois transcritos menores (4,0 Kb e 7,0 Kb). Jahn et al., J. Virol,, 49,363 (1984). (veja-se Figura 2).

Um sub-fragmento do fragmento Ξ de ADN de HindIII conhecido na técnica como o fragmento J de EcoRI com um tamanho de aproximadamente 10 Kb foi ligado a um vector pACYÇ184 (ATCC 37033) no local EcoRI do gene resistente a cloranfenicol e o vector plasmídeo resultante denominado EcoRI J-5018 foi clonado em E. coli. Como se mostrou na Figura 3, este fragmento J de EcoRI tem também sido ligado ao local EcoRI do vector plasmídeo pUC18 para formar o plasmídeo denominado EcoRI J-pUC18 que proporciona melhores rendimentos de plasmí. deo recombinante seguindo-se o crescimento (clonação) em bactérias tal como E. coli como meio de replicação para preparar quantidades de ADN de plasmídeo úteis como sondas.

Os plasmídeos clonados resultantes ou cs seus fragmen tos J de EcoRI quando ligados a um meio indicador são úteis na análise de ADN e ARN da célula infectada devido a inúmeras razões. Em particular, o fragmento J de EcoRI não contém sequências humanas repetitivas que foram recentemente representadas na forma de diagrama no genoma AD169. Deste modo, este fragmento não proporciona resultados falsos positivos como se pode verificar noutras sequências genómicas. Ruger et al., J. Gen. Virol., 65, 1351 (1984) e McDougall et al.,

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Ref: EPG:11-SCRF 55.2

-27J. Invest. Derma, 83, 725 (1984).

Em adição, o fragmento J de EcoRI contém a região de codificação para o ARN IE principal de 1,9 Kb. Este ARNméotrancrito mais abundante na região IE e codifica pa ra a proteína IE principal que possui um Fír de cerca de 72000 dalton (72 K) /“como descreveu Stinski et al., J. Virol., 46, 1 (1983)_7, detectado pelo anticorpo monoclonal L14. Visto que, como descreveu Huang et al., Yale J. Biol. Med., 49, 29 (1976), as várias estirpes de HCMV partilham 80% da homologia por cinéticas de reassociação (existindo a maior parte da heterogeneidade nas regiões de repetição), uma sonda que inclui uma sequência de nucleótidos codificando para a proteína 72 K é a preferida para análise de tecidos para sequências de HCMV.

Além do mais, como se descreve a seguir, o ADN do fragmento J de EcoRI não hibrida cruzadamente com outros ADN de vírus herpes (por exemplo, HSV-1, HSV-2 ou EBV). 0 fragmento J de EcoRI também contém a sequência de codifica ção para o ARN IE de 2,3 Kb e parte das sequências de codi ficação para os dois transcritos mais pequenos (7,0 Kb e 4,0 Kb). jahn et al., J, Virol., 49, 363 (1984).

Como se mostrou na Figura 3, para aumentar a sensh bilidade desenvolveram-se sondas mais pequenas e mais espe cíficas a partir das sequências codificando para o ARN IE principal de 1,9 Kb. Como se mencionou previamente o ARN IE principal de 1,9 Kb é um transcrito ligado que contém quatro exões de 1341, 185, 88 e 121 nucleótidos, respectivamente. Deste modo, as bases presentes no genoma não estão presentes no ARNm que é traduzido para a proteína. Sten berg et al., J. Virol., 49, 190 (1984). Sub-clonaram-se três fragmentos de endonuclease de restrição a partir do fragmento J de EcoRI para aumentar a sensibilidade na detec ção deste ARNm IE de 1,9 Kb.

Um diagrama de endonuclease de restrição descrevendo a região de codificação para este transcrito está represen66 877

Ref: EPG:11-SCRF 55.2 ¢7 í j »*'

-28tado na Figura 4. Um fragmento de PstI de 1,8 Kb (Pstlm) do fragmento J de EcoRI de HCMV foi ligado ao poli-ligante de outro vector plasmídeo pUC18 para formar o vector plasmídeo denominado PstIm-pUC18. 0 fragmento m de PstI contém a sequência de codificação para um dos exões localizados na extremidade 5* do gene. Este fragmento de restrição tam bém contém uma região promotora para o gene e um elemento melhorador que é tão eficiente como os elementos de melhoramento de SV40 e polioma.

Um outro clone também ilustrado na Figura 4 denominado BglII-BamHI de 1,9 Kb foi preparado a partir da estre midade 3' do gene IE principal de 1,9 Kb. Este fragmento com aproximadamente 475 pares de base foi ligado ao poliligante de um outro vector plasmídeo pUC18 para formar o vector plasmídeo denominado 1,9 BglII-BamHI-pUC18. Ejs se vector plasmídeo contém parte da sequência de codificação para o exão de base 1341 do transcrito.

Em adição, este fragmento BglII-BamHI de 475 Kb poTM de ser clonado no vector pSP65 Ribo-sonda . Green et al., Cell, 32, 681 (1984). Este plasmídeo recombinante permite a síntese in vitro do ARN complementar ao IE de 1,9 Kb.

Um outro clone também ilustrado na Figura 3, denomi nado pIEBamHI-RI, foi preparado a partir da extremidade 5' do fragmento J de EcoRI relativo ao gene ΙΞ principal de 1,9 Kb. Este fragmento de aproximadamente 4,2 Kb foi ligado ao poli-ligante de outro vector plasmídeo pUC19 nos locais dos vectores BamHI e EcoRI para formar o plasmídeo pIEBamHI-RI.

A Figura 3 ilustra a clonação destes fragmentos. Utilizando os clones que contêm estes três fragmentos, isto é, os vectores plasmídeo que contêm o fragmento m de PstI de aproximadamente 1,8 Kb, o fragmento BglII-BamHI de cerca de 475 bases e o fragmento BamHI-EcoRI.de cerca de 4,2 Kb, podem-se preparar sondas que possuem actividades es pecíficas suficientemente altas para detectar o ARN IE principal de 1,9 Kb que é transcrito durante a infecção la

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-29tente não tolerante.

Em adição, como se apresenta na Figura 5, a presente invenção também inclui uma sonda de ADN de HCMV para de_ terminar se os genes posteriores são expressos em amostras de corpo humano, tal como biópsias de tecidos e linfócitos sanguíneos periféricos. A sonda do gene posterior é de pre ferência utilizada em conjunção com uma das sondas ΙΞ discutidas antes para detectar infecção em estádios em adição à infecção latente IE, embora a sonda de gene posterior da invenção possa ser também utilizada isoladamente para descobrir infecção em estádios· ulteriores à transcrição IE, e na ausência de virus recuperável.

Um fragmento BamHI de aproximadamente 6,6 Kb (denominado R de BamHI) da estirpe AD169 de HCMV foi clonado no local BamHI do poli-ligante do vector plasmídeo pUC19 para formar o plasmídeo denominado pCMBamR. Esta parte do genoma de HCMV é transcrita durante a fase posterior da infecção e está inactiva durante a fase anterior da infecção. DeMarchi, Virology, 144, 23 (1981); Wathen et al., J. Virol. 41, 462 (1982) e McDonough et al., Virology, 125 31 (1983), Além do mais os estudos de selecção do híbrido de ARN demons tram que o fragmento R de BamHI codifica para os polipeptídeos posteriores de 61 K e 71 K, Nowak et al,, Virology, 134, 91 (1984).

Utilizando estes clones o ADN de HCMV foi detectado por hibridação in situ de células infectadas de modo tolerante nos cérebros dos doentes com o síndroma da imuno-defi ciência adquirida (SIDA), nos rins dos doentes de transplan te renal e o ARN nas células mononucleares de sangue perifé rico a partir da infecção prematura natural, Schrier et al., Science, 230, 1048 (Nov., 1985), e descrito a seguir.

Deste modo, um objectivo da invenção constitui um ve ctor plasmídeo recombinante novo que consiste essencialmente numa sequência de ADN imediatamente anterior seleccionada de entre o grupo que consiste (1) num fragmento J de EcoRI de aproximadamente 10 Kb do fragmento Ξ de HindIII do genoma de HCMV, (2) no fragmento m de PstI de aproximadamen

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-30te 1,8 Kb do fragmento J de EcoRl do genoma de HCMV, (3) no fragmento BamHI-EcoRI de aproximadamente 4,2 Kb do fragmento J de EcoRl do genoma de HCMV, (4) no fragmento BamHI-BqlII de aproximadamente 475 pb do fragmento J de EcoRl do genoma de HCMV, (5) no fragmento EcoRI-PstI contendo esse fragmento BamHI-BglII de aproximadamente 475 pb e (6) no fragmento R de BamHI de aproximadamente 6,6 Kb do fragmento A-D de EcoRl do genoma de HCMV ligado operativamente ao vector plasmídeo apropriado.

Cs vectores utilizados aqui, nos quais as novas sequências polinucleótidas estão ligadas e replicadas são ve ctores particularmente preferidos. Os vectores particulares utilizados aqui para ligação e replicação estão disponíveis no comércio. Por exemplo, os vectores plasmídeos pUC18 e pUC19 e os vectores cosmídeos pHC79 estão disponíveis em Eethesda Research Laboratories, Life Technologies, Inc., / TM

Gaithersberg, MD; o vector plasmídeo pSP65 de Ribosonda está disponível em Promega Biotec, Madison, WI; e o vector plasmídeo pACYC184 está disponível em American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD. Os mapas de restrição de cada um destes vectores estão publicados e são bem conhe eidos da técnica.

Uma larga gama de vectores úteis adicionalmente estão disponíveis no comércio bem como meios de replicação de hospedeiros apropriados. Exemplos de vectores, plasmídeos e bacteriófagos, e hospedeiros, estão disponíveis em American Type Culture Collection de Rockville, MD, e estão listados em CATALOGUE CF BACTÉRIA, PHAGSS AND rDNA VECTORES, sixteenth ed., 1985. Em adição, os vectores, cosmídeos e de clonação são listados como estando disponíveis em catálogos de Boehringer Mannhein Biochemicals of Indianapolis, IN; Bethes da Research Laboratories, Inc. of Gaethersberg, MD, e Pharma cia, Inc. of Piscataway, NJ,

Outros vectores apropriados aos quais uma das sequências de ADN anteriores podem ser ligadas e em seguida replicadas contêm um ou mais locais de clivagem por enzimas de . -ιτιιΓι· li <e

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Ref: EPG;11-SCRF 55.2

-31restrição de forma a que a sequência de ADN desejada possa ser ligada operativamente. Esses vectores podem ser replicados num meio de replicação tal como um organismo unicelu lar semelhante a E, coli, S. cerevisiae ou análooos. 0 vector contém um replicão que é compatível com o meio de replicação de forma a que a sequência de ADN ligada possa ser propagada pelo vector.

Com este propósito ligam-se operativamente um ou ma is melhoradores transcricionais à sequência de ADN adjacen te ao seu terminal 5'. 0 promotor pode ser endógeno ao veo ctor ou exógeno ao vector assim como/pode ser a sequência melhoradora presente no fragmento m de PstI descrito antes, o que proporcionou, quando esse fragmento foi ligado ao ve ctor plasmídeo pUC18, o vector plasmídeo resultante com um prcmotor e um melhorador.

III. Sondas de Acido Nucleico

Uma sonda de ácido nucleico, isto é, um meio indic_a dor ligado operativamente a uma sequência polinucleótida complementar a uma sequência polinucleótida a ser testada; isto é, uma sequência que codifica para uma proteína imediatamente anterior ou para uma proteína posterior de HCMV, constitui um outro objectivo desta invenção. C ácido polinucleico da sonda pode ser ADN ou ARN como se descreveu atrás, mas para facilidade da descrição as sondas contendo ADN são utilizadas para ilustração.

Uma sonda de ácido nucleico desta invenção compreen de um plasmídeo ou ácido polinucleico que contém um meio indicador ligado operativamente. Esse meio indicador está ligado a uma sequência polinucleótida do próprio plasmídeo recombinante ou à porção polinucleótida do plasmídeo recom binante relacionada com HCMV. Quando esse plasmídeo é excj. sado para utilização como sonda que consiste essencialmente (1) no fragmento J de EcoRI do fragmento E de HindIII do genoma de HCW que contém cerca de 10 Kb, (2) no fragmen to m de PstI desse fragmento J de EcoRI que contém cerca de

877

Ref: EPG:11-SCRF 55.2

-321,8Kb; (3) no fragmento BamHI-EcoRI de aproximadamente 4,2 Kb do fragmento J de EcoRI do genoma de HCMV; (4) no fragmento BamHI-EglII desse fragmento J que contém cerca de 475 pb; (5) no fragmento EcoRI-PstI que contém o fragmento BamHI-BglII flanqueado por restos do local de poli-ligante pUC18; e (6) no fragmento R de BamHI de cerca de 6,6 Kb do fragmento A- d/e coRI de HCMV.

meio indicador ligado é inserido de preferência numa sequência de ADN desejada pelo chamado método Tradução por corte de Rigby et al., J. Mol. Biol., 113, 237 (1977), como é bem conhecido. Nesse método, a sequência de ADN é parcialmente quebrada (cortada) num ou mais locais e depois novamente construída utilizando ADN polimerase I de Ξ. coli juntamente com um ou mais nucleótidos marcados ligados ao meio indicador apropriado.

Nos exemplos específicos que se seguem, os nucleóti dos radio-marcados foram utilizados como meios indicadores. Esses nucleótidos radio-marcados eram trifosfato de 5'3 5

-/alfa- S-tio7 desoxiadenosina e trifosfato de 5*-/alfa35

S-tio/desoxicitosina.

Um outro meio indicador conveniente para as sondas desta invenção utiliza um nucleótido biotinilado e uma enzima tal como peroxidase de rábano (HRP) ligada a avidina. Um sistema de biotina/avidina disponível comercialmente é o que é vendido sob a marca registada Detekl-hrp por Enzo Biochem. Inc. of New York, NY e utiliza trifosfato de 2'-desoxiuridina 5-alilamina-biotina em conjunto com HRP ligado a estrepavidina. A utilização dos derivados de trifos fato de uridina biotinilados anteriores e de outros exemplos desses derivados em sondas de ADN é descrito em Briga tie et al., Virology, 126, 32 (1983).

Quando a sonda utilizada é uma molécula de ARN, o meio indicador para as sondas é incorporado na molécula du rante a transcrição in vitro.Exemplos desses sistemas de rn>/r transcrição in vitro é o vector pSP65 de Ribosonda ¹ de

Promega Biotec (Madison, Wl).

877

Ref: EPG:11-SCRF 55.2

-333 2

Num outro sistema, o fósforo radioactivo, P, pode ser utilizado como o meio indicador. Aqui, o radiomarcador é incorporado no fosfato alfa de um trifosfato nucleótido que está incluído no meio de replicação quando se faz a clonação de um plasmídeo a ser produzido numa sonda de ADN. Pode-se também incorporar um átomo de carbono ^⁴C, ou átomo de hidrogénio ^JH, radioactivos num trifosfato nucleótido desejado que é misturado com o meio de replicação.

A seguir à tradução por corte, à transcrição ou replicação in vitro num meio que contém um radionucleótido apropriado,a sonda resultante é separada dos nucleótidos, meios e detritos de células não incorporados. Um meio típ_i co de separação utiliza colunas giratórias e a passagem através de colunas de calibração, como também se utiliza p£ ra a recuperação de plasmídeos.

Enquanto uma sonda construída por ADN pode hibridar para o ADN numa célula, a quantidade de ADN de um gene par ticular presente, para o qual se deseja a hibridação é tipicamente tão pequena que é dif ícil^etectar, especialmente, se poucas das células presentes contêm o ADN de interesse como é o caso da infecção por HCMV. Porém, no caso de HCMV, o ARNm que codifica para a proteína IE de 72 K é particularmente abundante mesmo nas células infectadas de modo prematuro. Os resultados descritos a seguir ilustram a ligação de uma sonda de ADN descrita com um ARN derivado de HCW em PBM rim e cérebro infectados por HCMV. De modo semelhante, a sonda que corresponde aos ARNm abundantemen te traduzidos, já no decurso da infecção das células infectadas sem restrições também se ligam ao ARN daquelas célu las.

IV. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO E SISTEMAS

Um método para detecção de citomegalovirus latente humano numa amostra celular humana tal como linfócitos semelhante a PBM compreende, de acordo com esta invenção, os passos de misturar uma amostra que contém células humanas

877

Ref: SPG:11-SCRF 55.2

permeabilizadas fixadas tais como PBM com uma sonda recombinante imediatamente anterior derivada de HCMV desta invenção; a conservação da mistura sob condições de hibridação durante um período de tempo suficiente para a ligação da sonda ao ADN complementar e ARN (ácidos polinucleicos) presentes na amostra para ocorrer a formação de um complexo; separação da sonda complexada e da sua seguência complementar a partir de qualquer sonda não complexada; e determinação da presença de um sinal a partir de meios indicadores .

Seguem-se passos semelhantes utilizando uma sonda de gene posterior desta invenção para a situação em que se deve detectar a transcrição de genes posteriores. Ambas as sondas podem ser utilizadas separadamente em amostras para leias tais como amostras de tecidos onde o estado da infe£ ção está a ser determinado.

Os tamanhos das amostras para essa hibridação in situ são bem conhecidos da técnica e são exemplifiçados a se guir. Por exemplo, guando as placas de microscópio são uti lizadas como um substrato no qual os PBM a serem testados estão fixados utilizam-se cerca de 20000 a cerca de 30000 células por placa.

Alternativamente, quando se deve testar tecidos tais como de rim ou cérebro preparam-se secções finas como se descreve na secção de Materiais e Métodos.

A quantidade de sonda utilizada e o período de conservação para hibridação são amplamente uma função do meio indicador e da sua quantidade ligada operativamente na sonda. Por exemplo, Angerer et al., Nuc. Acids Res», 9, 2819 (1981) descreve a utilização de 0,1-1,0 nanomoles de 3 3

H poli U e H poli C a 1,4 Ci/milimoles e 2,0 Ci/milimoles, respectivamente com um tempo de hibridação de uma hora. Por outro lado, Brahic et al., Proc, Natl, Acad» Sei. USA, 75, 6125 (1978) descreveram a utilização de 2 nanogra mas de ^h7 ADNc por placa possuindo uma actividade específica de 2x10 cpm/micrograma para detectar 10 a 20 có66 877

Ref: EPG:11-SCRF 55.2

t.

-35pias de ARN virai para um tempo de hibridação de 48-60 horas. Brigati et al., Virology, 126, 32 (1983) descreveram a utilização em células de alíquotas de 10-20 microlitros contendo 20 microgramas/mililitro de sonda de ADN biotinilado para ADN virai, com um tempo de hibridação de 12-16 horas.

teste para a presença do meio indicador ocorre de pois da separação de qualquer sonda não reagida daquela que reagiu e complexou com uma sequência complementar. Esta separação é tipicamente realizada lavando ou enxaguando com água ou outro líquido apropriado.

Ç próprio teste depende do meio indicador ligado à sonda. Quando o meio indicador é um radiomarcador as técni cas de autoradiografia ou contagem de cintilação são as ferramentas de escolha. Quando o marcador ê uma enzima que é utilizada para formar um produto colorido como nalgumas sondas biotiniladas utiliza-se a fotomicroscopia colorida para proporcionar um registo permanente do teste. Cs indicadores fluorescentes podem também ser ligados à estrepavjL dina que é utilizada com uma sonda biotinilada para propor cionar o teste, em conjunto com fotomicroscopia de fluore_s cência como descreveu Brigati et al., Virology, 126, 32 (1983).

Um outro aspecto desta invenção é um sistema de te£ te de diagnóstico tipicamente na forma de estojo para dete ctar a presença de HCMV numa amostra celular humana tal co mo PBM, rim ou cérebro tal sistema de ensaio é para PBM particularmente útil na análise de produtos sanguíneos em relação a HCMV antes da transfusão.

sistema compreende, pelo menos, um recipiente ou embalagem e inclui como um ingrediente activo uma quantida de de uma sonda recombinante imediatamente anterior deriva da de HCMV desta invenção, suficiente para reagir com e li gar-se às sequências de ácido nucleico complementar na amos tra

877 ?

Ref: EPG:11-SCRF 55.2 ·*/’' //

-36C sistema de diagnóstico descrito atrás é particular mente útil em detectar a presença de uma infecção por HCMV latente em produtos sanguíneos. Quando se pretende testar o estado de uma infecção por HCMV é útil a utilização de um segundo sistema de diagnóstico.

Este segundo sistema de diagnóstico compreende, pelo menos, dois recipientes ou embalagens e inclui como ingredi. entes activos (a) os ingredientes activos do sistema de dija gnóstico discutido atrás e (b) uma quantidade de uma sonda recombinante posterior derivada de HCMV desta invenção, suficiente para reagir com e ligar-se às sequências de ácido nucleico complementares na amostra.

meio indicador para sinalizar a reacção entre o plasmídeo ou a sonda de ADN recombinantes e as sequências de ácido nucleico complementares na amostra podem incluir

2 14 3 3 5 radioisótopos tais como ⁴P, C, H, e S. Um outro meio indicador útil é a biotina, como já se referiu, que pode produzir uma sonda marcada com biotina que é estável até ao máximo de dois anos quando armazenada a -2C°C. As sondas que contêm biotina são tipicamente utilizadas com reagentes de ampliação e visualização que contêm avidina como também já se referiu. Quando um meio indicador que necessita de um ou mais reagentes adicionais tais como HRP é o meio indicador ligado, esses reagentes adicionais podem também ser incluídos no sistema.

V. RESULTADOS

A. Infecção por HCMV nas Células Mononucleares de Sangue Periférico

Cs resultados obtidos utilizando uma sonda e um méto do descritos atrás utilizando linfócitos como amostra ce lular humana indicam qua as células mononucleares de sangue periférico dos dadores assintomáticos, positivos em relação à proliferação de células T e seropositivos em relação a HCMV, sintetizam as sequências de ácido polinucleico que hi

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Ref: EPG:11—SCRF 55.2

-37bridam para: (a) uma porção do genoma transcrito em grande quantidade durante os períodos imediatamente anteriores à infecção e também para (b) fragmentos de áreas transcritas no decorrer do ciclo replicativo. Estas sondas não detectam sequências nos fibroblastos não infectados ou infectados por HSV. A proporção de células sanguíneas que hibridam variou de indivíduo para indivíduo (1/50-1/200) e visto que o sinal foi reduzido por hidrólise do ião hidróxido e ARNase, pode-se concluir que os ARN são sequências de ácido polinu cleico que são sintetizadas por indivíduos cujos PBM foram estudados e são sequências de ácido polinucleico que são de tectadas pelas sondas.

Estas observações implicam um estado, embora latente e não produtivo, relativamente activo para o virus na infec ção natural e indicam um papel para um linfócito como um lo cal de conservação da infecção por HCMV no hospedeiro. As observações são descritas a seguir.

exame de PBM de oito indivíduos que eram seropositivos em relação a HCMV e de doze que eram seronegativos conduziu aos seguintes resultados. Verificou-se uma hibrida ção forte com a sonda pUC18-EcoRi J em 2% dos PBM (analisaram-se os pontos que continham lO^células) de dois dos oito indivíduos seropositivos assintomáticos (Figuras 6, Painéis 1 e 5). Este nível de hibridação foi consistente durante vá rios meses em seis das oito amostras diferentes para cada indivíduo. Nem os plasmídeos vectores pUC18 ou pUC19 (Figura 6, Painel 8) nem uma sonda HSV-2 (fragmento C de BglII) se ligaram a estas células. A hibridação com a sonda que contém EcoRl J foi encontrada em 0,03 a 1% dos PBM dos outros seis indivíduos seropositivos.

As células de 11 dos 12 indivíduos seronegativos não mostraram hibridação com a sonda HCMV acima, mas 0,1% das células do 12^ indivíduo hibridaram com a sonda. 0 anticorpo pode ter estado ausente neste indivíduo porque a proteína virai foi insuficiente para gerar uma resposta ou porque o indivíduo não respondeu a este virus. Uma falha semelhan66 877

Ref: EPG:11-SCRF 55.2 /·’ - ;\₇

-3 8te de anticorpo detectável tem sido observada num subgrupo de doentes infectados com virus linfotrópicos de células T humanas de tipo III (como se determinou pela cultura do vi rus) Salahuddin et al., Lancet 1984-11, 1418 (1984).

tratamento com NaOH O,1M (Figura 6, Painel 3) ou ribonuclease (100 /ig/ml, 30 minutos, 37°C) reduziu de modo significativo o sinal e indicou que a hibridação foi principalmente com ARN de HCMV. 0 tratamento com calor (100°C durante 2 minutos) não aumentou o sinal de hibridação em PBM.

Em contraste o tratamento semelhante de fibroblastos infectados de modo agudo aumentou o sinal, presumivelmente, por hibridação da sonda para desnaturar ADN virai. Λ cultura de linfócitos de dadores positivos, de hibridação em fibroblastos tolerantes não produziu efeitos citopáticos; estes resultados são consistentes com muitas observações em que os linfócitos infectados por HCMV produzem pou cos ou nenhuns viriÕes infecciosos em tais circunstâncias.

para determinar se uma subpopulação específica de PBM continha HCMV utilizou-se um classificador de células activadas de fluorescência (FACS) para separar células de um indivíduo seropositivo (2% positivo de PBM). Os linfóci tos foram corados com anticorpos para detectar as duas sub populações principais de células T 0KT4 e 0KT8. Embora esta técnica proporcione poucas células, a pureza das popula çoes excede 97%.

Os resultados de três desses estudos indicaram que uma percentagem maior de células de hibridação com HCMV fu raram o marcador 0KT4 (2,4%) do que o antigénio 0KT8 (0,8%) (Figura 6, Painéis 6 e 7) (em sangue não separado 44% das células eram 0KT4 e 18% eram 0KT8). Esta observação não só demonstrou alguma selectividade da infecção por HCMV mas confirmou que os linfócitos, especialmente nas preparações de PBM são infectados e contêm ARN de HCMV.

Ficou por determinar se ARN de HCMV está presente

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Ref: EPG:11-SCRF 55.2

noutras subpopulações de PBM. Resultados preliminares indi cam que os monócitos também expressam o transcrito IE de HCMV.

Num outro estudo, os PBM de dadores seropositivos em relação a HCMV normais foram obtidos durante um período de um ano e estudados para determinar se os níveis de hibri dação utilizando uma sonda que contém o fragmento EcoRI J eram estáveis para um determinado indivíduo ou se variaram com o tempo. Como pode ser visto na Figura 9, os PBM de do is dadores (G e R) não mostraram hibridação nem alterações durante o período de tempo estudado. Os PBM de dador S permaneceram relativamente elevados na hibridação enquanto os do dador P começaram com uma percentagem relativamente elevada de hibridação de células e que caiu para um nível não detectável no fim do período de estudo. Os PBM do dador B mostraram um número crescente de células de hibridação.

Os factores que controlam estas variações estão correntemente sob investigação. Os factores de controlo de variação desconhecida não obstante os resultados apresentados nesta secção ilustram ainda que a seropositividade ou seronegatividade isoladas não proporcionam uma descrição completa do estado da doença por HCMV.

A sonda descrita atrás mostrou também detectar polinucleótidos nos fibroblastos infectados por HCMV. A sonda não detectou um polinucleótido em fibroblastos infectados com HSV ou não infectados.

B. Comparação da Transcrição de ARN Posterior e Imediatamente Anterior de Genes de HCMV no Rim

As biópsias de rins foram realizadas durante o curso da terapia de transplantação do rim de receptores de transplante seronegativos em relação a HCMV. Essas amostras de biópsia foram analisadas em relação aos transcritos de ARN posterior e imediatamente anterior de HCMV por hibridação in situ.

Como se mostra no Quadro 1, os rins dos dadores an66 877

Ref: EPG:11-SCRF 55.2

Λ*'Λ -40tes da transplantação (Pré-transplante) não exibem reactividade com quaisquer das sondas utilizadas. Porém, passado 1 mês após a implantação (Pós-transplante) a infecção com HCMV espalhou-se no rim e foi detectada de uma forma diferencial dependendo da sonda utilizada. Além disso, o tecido infectado com HCMV foi detectado em proporções de imediatamente anterior para posterior que eram diferentes do padrão anterior da infecção detectável após cerca de 2 a 3 semanas de terapia experimental anti-HCMV utilizando a dro ga em investigação, Foscarnet (Pós-Foscarnet) .

Quadro 1

Hibridação in situ das Biópsias de Rim com Sondas Imediatamente Anteriores e Posteriores de HCMV'·

Doente	Sonda^	Pré-transplante
A	R1J	0
	PCM3	0
	PUC	0
B	R1J	0
	PCM3	0
	PUC	0
C	R1J	0
	PCM3	0
	PUC	0
D	R1J	0
	PCM3	0
	PUC	0
E	R1J	0
	PCM3	0
	PUC	0

PÓs-Transplante
Pré-Foscarnet Pós-Foscarnet
++++
+++	3
0
+++	+++
+++	+++
0	0
++++	+
++	+++
0	0
++	4
+++	N.D.
0
+	++
0	+++
0	0

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Refí EPG:11-SCRF 55.2

-41F R1J0

PCM30

PUC0

G R1J0

PCM30

PUC0 ++ ++ ++ +++ +

+++ ^Escala de intensidade de hibridação = 0 (nenhum si nal) a ++++ (a mais intensa), medida pelo número de centros infecciosos num determinado campo microscópico da amostra. As amostras de tecidos foram obtidas de doentes e preparadas como se descreveu na Secção de Materiais e Métodos.

Sondas: RIJ = fragmento J de EcoRI do gene imediatamente anterior de HCMV; pCM3 = fragmentos A-D de EcoRI do gene posterior de HCMV; pUC = controlo de plasmídeo pUC18.

indica que nenhuma amostra foi submetida a tes te, para este doente.

*N.D. indica amostra não testada, por conseguinte, nenhum resultado.

Durante um período de tempo, a reactividade padrão da sonda posterior e imediatamente anterior pode alterar-se dependendo do doente. Também em casos particulares os rins infectados exibem uma reactividade maior com a sonda imedia tamente anterior do que com a posterior enquanto nos outros casos se verifica o oposto.

Esta concretização para detecção de HCMV por combina ção de uma sonda imediatamente anterior e posterior é sugerido pelos resultados anteriores em que poucos casos apresentam hibridação para uma sonda e pouca ou nenhuma híbrida ção para a outra. Veja-se, por exemplo, o doente E Pré-Fos carnet ou os doentes C e G PÓs-Foscarnet*’.

Apresenta-se na Figura 7 exemplos do grau de hibrida

877

Ref: EPG:11-SCRF 55.2

-42ção e da extensão da infecção por HCMV nestas biópsias de rim. Secções finas preparadas de doentes infectados com HCMV no estádio Pré-Foscarnet foram hibridados in situ tanto para a sonda imediatamente anterior de HCMV (grelha

A), sonda posterior de HCMV (grelha B) ou sonda de controlo sem HCMV (grelha C). A grelha A contém o grau mais elevado de hibridação (++++), a grelha B contém menos (+++) e a grelha C não contém nenhum.

Estes resultados indicam, que embora as sondas dos genes tanto imediatamente anteriores como posteriores de HCMV sejam eficazes na detecção de transcritos de ARN de HCMV prefere-se uma modalidade combinada que utiliza ambas as sondas de HCMV imediatamente anterior e posterior onde o objectivo é detectar infecção por HCMV em vez de distinguir a infecção latente por HCMV da infecção sem restrição.

C. As InfecçÕes por HCMV no Cérebro são Detectáveis por Hibridação in situ

Analisaram-se secções finas de tecido de cérebro em bebido em parafina, por hibridação in situ utilizando a son da do gene imediatamente anterior de HCMV,EcoRI J, como se descreveu atrás. Como se apresenta na Figura 8,o tecido de cérebro analisado desta forma apresentou numerosas células com precipitados densos de grãos de prata. Estas células eram as mais concentradas à volta da área periventricular, mas encontraram-se também nas zonas mais profundas do cére bro. As hibridações de controlo em que a sonda reconheceuos genes HSV foram uniformemente negativas, bem como as hibri dações que utilizam a sonda de CMV nas secções de cérebros normais.

VI o MATERIAIS E MÉTODOS

A. Culturas e Tecidos Infectados com HCMV

A estirpe AD169 de CMV (ATCC VR-538) foi conservada em 5000 fibroblastos de Flow (Flow Laboratories; McLean, VA) ^{66 877} λ ,.χ

Ref: EPG:11-SCRF 55.2 ‘^r ' *^A' _

-43como descreveram Nelson et al., J, Virol., 43, 83 (1982), incorporado aqui por referência, para a infecção de fibroblastos, sonicaram-se os fibroblastos, os detritos celulares foram removidos por centrifugação e a fase líquida con tendo o vírus foi adicionada às culturas não infectadas a uma multiplicidade de infecção (MOI) de aproximadamente 3:1. Os fibroblastos infectados e não infectados foram uti lizados como controlos para a hibridação in situ e foram processados de modo semelhante ao dos linfócitos. As células mononucleares de sangue periférico humano ( PBM ) foram obtidas a partir de dadores normais seropositivos e seronegativos e foram isoladas em gradientes de Ficol-Hypaque.

A seropositividade foi determinada através de um teste imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), com os fibroblastos infectados exeicados utilizados como antigénio como descreveram Rice et al,, J, Infect. Dis., 147, 1055 (1983). 0 soro que deu uma resposta (medida em unidades de densidade óptica) duas vezes maior para fibroblastos infectados com HCMV do que para fibroblastos não infectados foi definido como seropositivo para CMV. A proliferação de células T para HCMV (2x fundo) após 5 dias de cultura está em correlação com os resultados do ELISA, Os PBM assim obtidos podem ser utilizados directamente e depositados em placas para hibridação in situ ou podem ser cultivados para utilização posterior ou ainda separados por classificação de células activadas por fluorescência (FACS) como se descreveu atrás.

A separação de populações de células de PBM por FACS em subpopulações foi conduzida utilizando anticorpos0KT4 ou 0KT8 biotinilados (Beckton-Dickinson, Mountain View, CA),

Resumidamente conservaram-se 2x10 PBM, durante aproximadamente 40 minutos^zero graus centígrados em anticorpos diluídos a 1:10 em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a cerca de 1x10 células/ml. As células foram lavadas duas vezes em PBS pré-arrefecido a zero graus centígrados e foram a seguir incubadas durante 30 minutos em avidina ligada a isotiocianato fluorescente (Beckton-Dickinson) a uma dilui66 877

Ref: EPG:11-SCRF 55.2

-44ção de 1:50 em PBS, As células foram depois lavadas em PBS, novamente suspensas em 3 ml de PBS e classifiçadas num esto jo de armação de janela de FACS para seleccionar apenas as células coradas de modo muito brilhante (Oldstone et al·, Virology, 127, 426, 1983). As células assim obtidas por FACS foram depois utilizadas para hibridação in situ de forma semelhante à dos linfócitos.

As amostras de tecido de cérebro embebidas em parafina e fixadas em formalina foram retiradas por autópsia de um doente com SIDA e foram cedidas por Dr. C. A. Wiley (Dept. of Pathology, University of Califórnia, San Diego, CA). As biópsias de rim embebidas em parafina foram retiradas de doentes submetidos a terapia de transplantação de rim e foram cedidas por Dr, Lars olding (Department of Pathology, Karolinska Institute, Estocolmo, Suécia), A terapia de transplantação inclui o tratamento,após a implantação de rim, com a droga, fosfonoformato, em investigação (Foscarnet)·

B, Hibridação

A hibridação in situ foi realizada de acordo com os métodos modificados de Brahic et al,, Proc. Natl, Acad, Sei. USA, 75, 6125 (1978), e Angerer et al,, Nucleic Acids Res,, 9, 2819 (1981).

Resumidamente, as células mononucleares de sangue pe riférico humano foram obtidas, de dadores seropositivos e seronegativos e foram isoladas em gradientes de Ficol-Hypaque.

As células que se destinam a ser utilizadas directamente, foram lavadas três vezes em PBS, ajustadas para lOxlO^células por mililitro e depositaram-se quantidades de 5 a 10 microlitros em placa· revestidas com polilisina e la vadas com ácido,preparadas como se descreve a seguir. As placas foram depois conservadas ao ar durante um período de tempo suficiente para que as células revestidas sequem. As células secas ao ar em placas foram depois fixadas durante 15 minutos com periodato-lisina-paraformaldeído (PLP) como

877

Ref: EPG:11-SCRF 55.2 -

-45descreveu McLean et al., J. Histochem. Cytochem,, 22, 1077 (1974), foram lavadas duas vezes em PBS, desidratadas por e lavagens com proporções gradativas entre água/etanol de até 95% de etanol e foram armazenadas a 4°C.

As placas de microscópio de vidro foram limpas com ácido e revestidas com polilisina para utilização como substrato para conter amostras para hibridação in situ. Logo a seguir as placas foram embebebidas 4 a 24 horas em ácido crómico em redes de aço inoxidável para coloração. Após a limpeza,as placas foram exaguadas durante 4 horas com água da torneira e depois lavadas três vezes em água desionizada. As placas lavadas e enxaguadas foram embebidas durante 30 minutos em polilisina a 0,01% (Sigma Chemical Co., St Louis, Mo # P7886), enxaguadas três vezes com água destila da, secas a 37°C e aquecidas a 80°C durante 1 hora.

As secções de tecido de rim ou cérebro embebidas em parafina foram preparadas para hibridação in situ, por cojr te da amostra em fatias de cerca de 5 a 10 micrómetros de espessura. As secções finas resultantes foram postas a flu tuar em água destilada contendo 1% de cola branca de Elmer a 45°C. As amostras flutuantes foram recolhidas utilizando as placas revestidas com polilisina e foram secas durante a noite.

Como uma outra preparação para hibridação in situ, as amostras foram hidratadas e permeabilizadas. As secções de tecido foram desparafinadas por três lavagens em xileno durante 10 minutos cada. Todas as amostras, quer sejam PBM fibroblastos ou secções fixadas foram depois novamente hidratadas por lavagens em proporções gradativas entre etanol e água, durante cerca de 1 minuto por lavagem, na seguinte série: 100%, 95%, 70%, 50% e 30% na qual todas as soluções excepto a de 100% de etanol continham acetato de amónio O,33m.

As amostras foram preparadas por permeabilização através de duas lavagens em água destilada durante cerca de

877

Refí EPGíII-SCRF 55.2 '^:Jl· . tf -46- minuto cada, uma lavagem em HC1 O,2M durante cerca de 10 minutos, duas outras lavagens em água destilada como se descreveu atrás, uma lavagem em Triton X-100 a 1% /outra, fenil octil polixietileno/ durante 1,5 minutos e 2 enxaguamentos finais em água destilada durante 1 minuto cada, tendo sido todos os enxaguamentos anteriores conduzidos à temperatura ambiente.

Os fibroblastos e as secções finas mas não as amostras de PBM foram depois tratados com proteinase K (1 micrograma/ml em Tris HC1 20 mM e CaCI^ 2 mM) durante 20 minutos a 37°c e depois embebidos durante 4 minutos em PLP à temperatura ambiente. Todas as amostras foram depois lavadas em PBS-glicina (2 gramas/litro de glicina), lavadas uma vez em PBS e desidratadas gradualmente até cerca de 100% de etanol, altura em que as amostras estão prontas pa ra se adicionar a mistura de sondas de hibridação.

A mistura de sondas de hibridação consistia em formamida desionizada a 50%, 5x solução de Denhardt , 5x sais de hibridação (NaCl 0,9M, NaH₂PO₄ 50 mM e EDTA 5mM), sulfa to de Dextrano a 10%, heparina (30 unidades/ml), Triton X-100 0,1%, ADN de esperma de salmão (500 microgramas/ml) e ARN de célula BHK (250 microgramas/ml). As sondas marcadas com S foram adicionadas a uma concentração de 0,25 a 5 θ

I microgramas/ml (cerca de 1x10 cpm/microgramas) e a mistu- ra total foi fervida durante 2 minutos e depois arrefecida em gelo. Adicionou-se a seguir ditiotreitol para uma concentração de 10 mM.

A solução foi colocada nas células preparadas atrás, revestida com folhas ou tiras de cobertura de ligação ao Gel (FMC Corporation, Rockland, ME) e selada com cola de borracha. A hibridação foi realizada por incubação (mistura e conservação) da mistura de célula-sonda durante 18 ho ras a 37°C numa câmara humidificada.

A seguir à incubação, as tiras de cobertura foram removidas e as placas foram lavadas com: 2xSSC (NaCl 0,3m,

877

Ref: EPG:11-SCRF 55.2 .__Λ.Φ

-47citrato de sódio 0,03· M) durante 30 minutos a 21°C, 30 minutos com lxSSC a 21°C, 10 minutos com 0,lxSSC a 60°C, 20 minutos com 0,lx SSC a 37°C e 5 minutos com 2xSSC. As células foram depois desidratadas utilizando etanol e foram secas. As placas foram mergulhadas em emulsão Kodak NTB-2, expostas durante 3-4 dias a 4°C e depois reveladas com revelador Kodak D19 e fixador padrão.

Quando indicado, as amostras foram depois contrastadas com hematoxilina.

C. Plasmídeos

Os plasmídeos foram desenvolvidos tanto em bactérias hospedeiras E. coli HB101 (ATCC 33694) para pHC79 como em E, coli JM83 (ATCC 35607).

Os plasmídeos pUC18 e pUC19 foram ofertas do Dr. R. Gelinas (Fred Hutchinson Câncer Research Center, Seattle, WA). 0 plasmídeo pACYC184 foi obtido na American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD, #37033) e o vector

TM pSP65 de Ribosonda foi obtido em Promega, Biotec, Madison, WI. As células que contêm plasmídeos foram cultivadas em caldo de Luria /caldo de triptona a 1,0% (Difco Laboratories), extracto de levedura a 0,5% (Difco) e cloreto de sódio a 1%/e foram amplificados durante um crescimento logarítmico por adição de cloranfenicol (170 microgramas por ml) por mililitro de caldo de Luria (LB).

caldo de cultura incluía geralmente antibióticos para conservar a pressão selectiva nos plasmídeos presentes nas bactérias hospedeiras e a escolha de antibióticos depende do plasmídeo a ser desenvolvido. Os vectores plasmí deos pUC18, pUC19 e pSP65 contendo E. coli foram desenvolvi dos no caldo mencionado atrás que contém ampicilina a 100 mg/ml e os que contêm pACYC184 foram desenvolvidos de modo semelhante com a excepção de se ter usado tetraciclina a 25 mg/ml.

ADN de plasmídeo foi preparado por um método modi66 877 ,

Ref: EPGjll-SCRF 55.2 - .>·#** * r

-48fiçado de lise alcalina /Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).7 e foi ainda purificado por centrifugação de equilíbrio através de gradientes de cloreto de césio conten do brometo de etídio.

A ligação dos fragmentos virais e a transformação das bactérias com plasmídeo ligado foram realizadas como descre veu Jahn et al., J. Virol., 49, 363 (1984), e Nelson et al., J. Virol., 43, 83 (1983). Cada inserção de ADN virai foi identificada após digestão com endonuclease por co-migração electroforética com digeridos de ADN virai clonado com cosmídeo de acordo com o método descrito por Fleckenstein et al., Gene, 18, 39 (1982), e foi verificado, por hibridaçfifes da mancha de Southern, para diferentes fragmentos de ADN de ADN de virião de acordo com o método de Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98, 503 (1975).

1) Clonação do Fragmento J de EcoRI

Referindo a Figura 3, o fragmento J de EcoRI foi subclonado a partir do fragmento E de HindIII da estirpe AD169 de HCMV por digestão de ADN do vector plasmídeo pJN201 (discutido a seguir) cora a endonuclease de restrição EcoRI (New England Biolabs, Inc., Beverly, ME), isolando o ADN da agarose de baixo ponto de fusão (Bethesda Research Laboratories, Life Technologies, Inc., Gaithersberg, MD; da qui em diante BRL) e por ligação do ADN do fragmento J de aproximadamente 10 Kb no local EcoRI tanto do vector plasmí deo pACYC184 bem como pUC18 para formar vectores plasmídeo EcoRI-J5018 e EcoRI J-pUC18 respectivamente.

plasmídeo pJN201 é uma construção do fragmento E de HindIII de HCMV ligado no plasmídeo pHC79 que está dispo nível a partir de BRL e foi preparado como se descreveu em Nelson et al., J. Virology, 43,83 (1982). A construção do plasmídeo pACYC184 é descrita em Chang et al., J. Bacteriol., 134, 1141 (1978), que é aqui incorporado para referência. Esse plasmídeo está disponível na ATCC sob o numero 37033. Os plasmídeos pUC18 e pUC19 estão também disponíveis a par66 877

Refí EPG:11-SCRF 55.2

tir de BRL.

EcoRI é uma endonuclease de restrição isolada a par tir de Escherichia coli Ryl3 que reconhece e provoca a cli vagem do seguinte local de uma sequência nucleótida: G AATTC. Por convenção, as sequências nucleótidas são escritas da esquerda para a direita e na direcção da extremi dade 5' para a extremidade 3'.

As bactérias que contêm o vector plasmídeo recombinante pÀCYC184 de EcoRI J-5018 foram desenvolvidas em meios LB contendo 25 microgramas por mililitro (microgramas/ml) de .tetraciclina enquanto que as bactérias que continham os vectores recombinantes pUC18 foram desenvolvidas em meios que continham 100 microgramas/ml de ampicilina.

2) Clones de PstIm-pUC18 e de 1,9 BglII-BamHI-pUC18

Referindo novamente a Figura 3, o fragmento m de PstI que contém aproximadamente 1,8 Kb foi subclonado a par tir do fragmento J de EcoRI da estirpe AD169 de HCMV por di gestão do plasmídeo EcoRI J-pUC18 com PstI (New England Bio labs, Inc., Beverly, Maine), isolamento do fragmento de ADN de 1,8 Kb denominado m e ligação do fragmento de ADN, m de PstI no local PstI de puC18 adicional para formar PstI m-pUC18 recombinante.

PstI é uma endonuclease de restrição isolada a partir de Providencia stuartii 164 que reconhece e provoca a clivagem do seguinte local de uma sequência nucleótida: CTGCA G.

fragmento BglII-BamHI de 475 pb foi subclonado a partir do fragmento J de EcoRI do vector plasmídeo EcoRI J-pUC18 por digestão de ADN do vector clonado com endonuclea ses BglII e BamHI (New England Biolabs, Inc.). 0 fragmento de 475 pb foi isolado e ligado no local BamHI do poli-ligante do pUC18 adicional para formar o plasmídeo 1,9 BglIIBamHI-pUC18.

BglII é uma endonuclease de restrição que é isolada a partir de Bacillus globigii que reconhece e provoca a cli

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Ref: EPG:11-SCRF 55.2

-50vagem da seguinte sequência nucleótida: A GATCT. V. Pirrot ta, Nucleic Acids Res., 3, 1747 (1976),

Referindo a Figura 3 o fragmento BamHI-EcoRI de apro ximadamente 4,2 Kb foi subclonado a partir do fragmento J de EcoRI do vector plasmídeo EcoRI J-pUC18 por digestão do ADN do vector clonado com as endonucleases BamHI e EcoRI. 0 fragmento de 4,2 Kb foi isolado e ligado nos locais BamHI e EcoRI de pUC19 para formar o pIEBamHI-RI recombinante.

À BamHI é uma endonuclease de restrição isolada a partir de Bacillus atnyloliquef aciens H que reconhece e proI voca a clivagem do seguinte local de uma sequência nucleóti da: G GATCC. Roberts et al., Nature, 265, 82 (1977).

3) Construção de pSP65 1,9 BglII-BamHI plasmídeo pSP65-l,9 BglII-BamHI é construído por digestão do plasmídeo 1,9BgllI-BamHI-pUC18 com EcoRI e pstl. 0 fragmento resultante contém o fragmento BglII-BamHI de 475 pb bem como sequências relativamente curtas do poliligante em qualquer dos lados do local BamHI. 0 fragmento resultante que contém cerca de 515 pares de base é isolado

TM e ligado aos locais EcoRI e Pstl de Ribosonda pSP65. 0 ve ctor plasmídeo resultante denominado pSP65-l,9 BglII-BamHI é linearizado e transcrito com ARN polimerase na presença

I 3 5 3 2

I dos ribonucleótidos marcado» com 5'-alfa- ³s ou alfa- p para formar uma sonda de ARN radiomarcada.

4) Construção do Clone pCMBamR

Referindo a Figura 5, o fragmento R de BamHI da estirpe AD169 de HCMV foi subclonado a partir do cosmídeo pCM3, descrito por Fleckenstein et al., Gene, 18, 39 (1982) e contendo os fragmentos A mais D (A-D) de EcoRI clonados no cosmídeo pHC79, por digestão do clone com BamHI. 0 fragmento BamHI de 6,6 Kb foi isolado e ligado no local BamHI de pUC19 para formar o vector plasmídeo denominado pCMBamR. Foi mostrado por Nowak et al., Virology, 134, 91-104 (1984) que o fragmento de BamHI codifica para os poli66 877

Ref: EPG:11-SCRF 55.2 /

,#·*** í

-51peptídeos posteriores 61 K e 71 K. (Veja-se Figura 1).

D. Sondas Polinucleótidas

As sondas polinucleótidas de ADN foram preparadas a partir dos plasmídeos anteriores como se segue. Um vector plasmídeo apropriado foi traduzido por corte seguindo os procedimentos de Rigby et al., J. Mol. Biol., 113, 237

5 (1977) por incorporação de trifosfato de 5‘-/alfa- S-tio7-desoxiadenosina e trifosfato de 5'-/alfa- S-tio/desoxici tosina (650 Ci/mM) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL). 0 ADN polimerase I foi adquirido em New England Biolabs Inc., Beverly, MÀ.

ADN traduzido por corte resultante foi separado dos nucleótidos em colunas de rotação (Bio-Rad Laboratories Richmond, CA) durante dois minutos e submeteu-se à passagem através de Sepharex G-5o (Pharmacia Fine Chemicals, Piscata way, NJ) a 1200xg. Utilizando a sonda EcoRl J-pUC18, como

O exemplo, obteve-se uma actividade específica de 1x10 cpm por micrograma de ADN.

Foram identicamente preparadas sondas de controlo, a partir do plasmídeo pUC18 ou a partir de um plasmídeo que contém o fragmento C de BglII da estirpe 333 de HSV-2. Este fragmento corresponde ao genoma do HSV entre cerca de 0,43 e 0,58 unidades de mapa como descreveram Jariwalla et al., Proc, Natl. Acad, Sei. USA, 77, 2279 (1980).

que foi apresentado destina-se a ilustrar a presen te invenção mas não a limitá-la. Podem ser efectuadas numerosas variações e modificações sem nos afastarmos do espíri to e do âmbito da invenção.

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Ref: EPG:11-SCRF 55.2

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo para a preparação de um plasmídeo recom binante derivado de HCMV, caracterizado por:

   (a) se fazer a digestão do fragmento E de HindIII do genoma de uma estirpe de HCMV com endonuclease de restrição EcoRI para proporcionar segmentos lineares de ADN fragmentados inclu indo um fragmento J de EcoRI que contém cerca de 10 Kb; e (b) se fazer a ligação do fragmento J de EcoRI no local EcoRI de um plasmídeo para proporcionar um plasmídeo recombinante derivado de HCMV.
2. 2 - Processo para a preparação de um plasmídeo recom binante derivado de HCMV, caracterizado por:

   (a) se proporcionar um primeiro plasmídeo recombinante derivado de HCMV que contém o fragmento J de EcoRI de aproximadamente 10 Kb do genoma HCMV;

   (b) se fazer a digestão da porção de fragmento J de EcoRI do primeiro plasmídeo recombinante derivado de HCMV com endonuclease de restrição Pstl para proporcionar segmentos lineares de ADN fragmentados que incluem um fragmento m de Pstl que contém aproximadamente

   1,8 Kb; e (c) se ligar o fragmento m de Pstl no local Pstl de um plasmídeo para proporcionar um segundo plasmídeo recombinante derivado de HCMV.
3. 3 - Processo para a preparação de um plasmídeo recom binante derivado de HCMV, caracterizado por:

   (a) se proporcionar um primeiro plasmídeo recom-

   66 877

   Ref: EPG:ll-SCRF 55.2

   -53binante derivado de HCMV que contém o fragmen to J de EcoRl de aproximadamente 10 Kb do genoma HCMV;

   (b) se fazer a digestão da porção de fragmento J de EcoRl do primeiro plasmídeo recombinante derivado de HCMV com endonucleases de restrição BglII e BamHI para proporcionar segmentos lineares de ADN fragmentados que incluem um fragmento BamHI-BglII de 475 bp; e (c) se ligar o fragmento BamHI-BqlII no local BamHI de um plasmídeo que contém um local de poli-ligaçã© para proporcionar um segundo plasmídeo recombinante derivado de HCMV.
4. 4 - Processo para a preparação de um plasmídeo recom binante derivado de HCMV, caracterizado por:

   (a) se proporcionar um primeiro plasmídeo recombinante derivado de HCMV que contém o fragmen to BglII-BamHI de aproximadamente 475 bp do fragmento J de EcoRl do genoma de HCMV ligado num local de poli-ligação do plasmídeo, inclu indo o local de poli-ligação locais de clivagem de endonuclease de restrição para endonucleases de restrição BamHI, BglII, EcoRl e PstI?

   (b) se fazer a digestão do referido primeiro pias mídeo recombinante com endonucleases de restrição EcoRl e PstI para proporcionar segmentos lineares de ADN fragmentados incluindo um fragmento EcoRI-PstI que contém o referido fragmento BglII-BamHl; e (c) se fazer a ligação do fragmento EcoRI-PstI nos locais EcoRl e PstI. respectivamente, de um plasmídeo para formar um segundo plasmídeo recombinante derivado de HCMV.

   66 877

   Ref: EPG;11-SCRF 55.2
5. 5 - Processo para a preparação de um plasmídeo recom binante derivado de HCMV, caracterizado por:

   (a) se proporcionar um primeiro plasmídeo recombinante derivado de HCMV que contém a porção de fragmento J de EcoRI de aproximadamente 10 Kb do genoma HCMV;

   (b) se fazer a digestão da porção do fragmento J de EcoRI do primeiro plasmídeo recombinante derivado de HCMV com endonucleases de restrjÍ ção BamHI e EcoRI para proporcionar segmentos lineares de ADN fragmentados incluindo um fragmento BamHI-EcoRI que contém aproxima damente 4,2 Kb; e (c) se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI de aproximadamente 4,2 Kb nos locais BamHI e EcoRI. respectivamente, de um plasmídeo para formar um segundo plasmídeo recombinante derivado de HCMV.
6. 6 - Processo para a preparação de um plasmídeo recom binante derivado de HCMV, caracterizado por:

   (a) se proporcionar um primeiro plasmídeo recombinante derivado de HCMV que contém os fragmentos A + D de aproximadamente 33 Kb de uma estirpe HCMV;

   (b) se fazer a digestão das porções de fragmentos A + D do primeiro plasmídeo recombinante com endonuclease de restrição Bam Hl para proporcionar segmentos lineares de ADN fragmentados incluindo o fragmento R de BamHI que contém aproximadamente 6,6 Kb; e (c) se fazer a ligação do fragmento R de BamHI de aproximadamente 6,6 Kb no local BamHI de um plasmídeo para formar um segundo plasmídeo re combinante derivado de HCMV.

   66 877

   Ref: EPG:11-SCRF 55.2
7. 7 - Plasmídeo recombinante derivado de HCMV caracterizado por conter uma sequência derivada de HCMV que consis te essencialmente numa sequência seleccionada do grupo que consiste no fragmento J de EcoRI de aproximadamente 10 Kb do fragmento E de HindIII do genoma de HCMV, no fragmento PstI de aproximadamente 1,8 Kb do fragmento J de EcoRI do genoma de HCMV, no fragmento BamHI-EcoRI de aproximadamente

   4,2 Kb do fragmento J de EcoRI do genoma de HCMV, no fragmen to BamHI-BglII de aproximadamente 475 bp do fragmento J de EcoRI do genoma de HCMV e no fragmento R de BamHI de aproximadamente 6,6 Kb do fragmento A + D de EcoRI do genoma de HCMV.
8. 8 - Sistema de análise para diagnóstico, para a detec ção de HCMV numa amostra celular do corpo humano, caracterizado por incluir em pelo menos um recipiente, como ingredien te activo, uma quantidade de uma sonda polinucleótida recombinante derivada de HCMV ligada a meios indicadores correspondendo em sequência a um gene de proteína imediatamente an terior, suficiente para reagir com e unir-se a uma sequência complementar de ácido nucleico na amostra.
9. 9 - Sistema de diagnóstico de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a sonda conter o fragmento J de EcoRI de aproximadamente 10 Kb do fragmento E de HindIII.
10. 10 - Sistema de diagnóstico de acordo com a reivindi cação 8, caracterizado por incluir também um segundo recipiente que inclui, como ingrediente activo, uma quantidade de sonda polinucleótida recombinante derivada de HCMV ligada a meios indicadores correspondendo em sequência a um gene de proteína posterior suficiente para reagir com e unir-se a uma sequência complementar de ácido nucleico na amostra .
11. 11 - Método para a detecção de uma infecção latente por citomegalovírus humano numa amostra humana de PMBs, caracterizado por:

    66 877

    Ref: EPG:11-SCRF 55.2 (a) se misturar uma amostra celular do corpo hu mano com uma quantidade de uma sonda polinu cleótida recombinante derivada de HCMV liga da a meios indicadores correspondendo em se quência a um gene de proteína imediatamente anterior ou a um gene de proteína posterior suficiente para reagir com e unir-se a uma sequência complementar de ácido nucleico na referida amostra;

    (b) se manter a mistura sob condições de hibridação durante um período de tempo suficiente para a sonda reagir com e unir-se a ácidos polinucleicos complementares nas células da amostra e formar um complexo;

    (c) se separar o complexo formado pela sonda e pelo ácido polinucleico complementar de qual, quer sonda que não forma complexo; e (d) se determinar a presença do complexo.
12. 12 - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a sonda corresponder a um gene de proteína imediatamente anterior e por a sonda consistir, principalmente, de uma sequência de ácido polinucleico seleccionado do grupo que consiste numa sequência do fragmento J de EcoRI com aproximadamente 10 Kb do genoma de HCMV, no fragmento m de PstI com aproximadamente 1,8 Kb do fragmento J de EcoRI do genoma de HCMV, no fragmento EcoRI-BamHI de aproximadamente 4,2 Kb do fragmento J de EcoRI do genoma de HCMV e no fragmento BamHl-BglII de aproximadamente 475 bp do fragmento J de EcoRI do genoma de HCMV.
13. 13 - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a amostra do corpo humano ser uma amostra de tecido, por uma primeira amostra de tecido ser misturada com uma sonda que corresponde em sequência a um gene de pro teína imediatamente anterior e por se misturar uma segunda

    66 877

    Ref: EPG:11-SCRF 55.2

    -57amostra de tecido, paralela, cem uma sonda que corresponde em sequência a um gene de proteína posterior que consiste essencialmente do fragmento R de BamHI de aproximadamente

    6,6 Kb do fragmento A + D de EcoRI do genoma de HCMV.
14. 14 - Sonda polinucleótida caracterizada por consistir essencialmente numa sequência polinucleótida recombinan te de um gene imediatamente anterior derivado de HCMV ou de um gene posterior ligado a um meio indicador, consistindo a sonda do gene imediatamente anterior numa sequência seleccionada do grupo que consiste no fragmento J de EcoRI de aproximadamente 10 Kb do fragmento E de Hindm do genoma de HCMV, no fragmento m de PstI de aproximadamente 1,8 Kb do fragmento J de EcoRI do genoma de HCMV, no fragmento BamHI-EcoRT de aproximadamente 4,2 Kb do fragmento J de EcoRI do genoma HCMV e no fragmento BamHI-Bqlll de cerca de 475 bp do fragmento J de EcoRI do genoma de HCMV e por a sonda do gene posterior consistir essencialmente no fragmen to R de pamHl de cerca de 6,6 Kb do fragmento A + D de EifiRI do genoma de HCMV.

    Lisboa, 4. M8V. 1987

    Por SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION

    0 AGENTE OFICIAL

    1/9

    FIGURA 1

    SONDAS DE ADN DA ESTIRPE AD169 DE

    HCMV PARA HIBRIDAÇÃO IN SITU ARN IE de 7,0Kb

    ÃRN IE de 4,0Kb Po1i pépt ido

    ÃRN IE de 2,2Kb ARN IE de 1,9Kb de 72 K

    Polipéptidos 61K/71K o

    SCRIPPS ÇLINIC AND RESEARCH FOUNDATION

    2/9

    FIGURA 2

    TRANSCRIÇÃO IMEDIATAMENTE ANTERIOR DO FRAGMENTO E DE Hind III DA

    ESTIRPE AD169 DE HCMV

    5.0Kb IE 2.2Kb IE —— < I ·

    2.3Kb IE

    4.0Kb IE

    ......... 7.0Kb IE 1-9KblE

    ÍCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION

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