JP2000506376A

JP2000506376A - トキソプラズマ・ゴンジイ抗原Ｔｇ２０

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Publication number: JP2000506376A
Application number: JP9526569A
Authority: JP
Inventors: ヤコブス，ディルク; サマン，エリック; ファン・ヘオフェルスウィン，ヒューゴ
Original assignee: Fujirebio Europe NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1996-01-26
Filing date: 1997-01-27
Publication date: 2000-05-30
Also published as: AU722103B2; AU1596897A; US6172192B1; CA2242200A1; EP0877809A1; WO1997027300A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、単離され純粋なトキソプラズマ・ゴンジイ（Toxoplasma gondii）の抗原性フラグメント、組み換えポリペプチド、それらをコードしている核酸、それら由来のプライマーおよびプローブ、ならびに哺乳動物（ヒトおよび動物）におけるティー・ゴンジイ（T.gondii）感染の診断および予防方法におけるこれらのポリペプチド、核酸、プライマーおよびプローブの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】トキソプラズマ・ゴンジイ抗原Ｔｇ２０本発明は、単離され純粋なトキソプラズマ・ゴンジイ（Toxoplasma gondii）の抗原性フラグメント、組み換えポリペプチド、それらをコードしている核酸、それら由来のプライマーおよびプローブ、ならびに哺乳動物（ヒトおよび動物）におけるティー・ゴンジイ（T.gondii）感染の診断および予防方法におけるこれらのポリペプチド、核酸、プライマーおよびプローブの使用に関する。トキソプラズマ・ゴンジイは普遍的な細胞内原生動物寄生体であり、哺乳動物および鳥類に寄生する。通常は、トキソプラズマ症は健康な個体においては臨床的に無徴候であるが、妊婦および免疫無防備状態の患者において重大な合併症を引き起こす可能性がある。１次感染が妊娠期間中に起こると、経胎盤伝染により、流産または新生児奇形を誘導する可能性がある(概説は、Remington and Krahe nbuhl,1982;Hughes，1985参照)。ＡＩＤＳ患者において、トキソプラズマは主要な日和見病原体として認識されている。かかる免疫不全個体において、１次感染後に宿主組織中に存続していて、寄生体の増殖性形態を放出するのう胞の破裂は、重大な播種性トキソプラズマ症および／または脳炎引き起こす可能性がある。ＡＩＤＳにかかっているトキソプラズマ抗体陽性患者の約３０％において、潜伏している感染の再活性化によりトキソプラズマ脳炎が発症するであろう。胎児および新生児はトキソプラズマに対して非常に感受性がある。妊娠中の母体の感染および胎児への伝染は、流産、異常な子供の誕生（特に、目および脳の傷害を有する）、あるいは数カ月または数年後に重大な症状（盲、精神遅滞）を発症するであろう見かけ上正常な子供の誕生を引き起こす可能性がある。現在の評価は、新生児の０．１ないし０.９％が先天性トキソプラズマ症にかかっていることを示している。ヒトの健康に対する消極的な衝撃のほかに、当該寄生体は、感染により起こる流産が比較的重大な経済的損失を招くので、ヒツジおよびブタの養殖においても有害である（Beverly，1976）。有効な予防基準の不存在下においては、初期の高感度かつ特異的な診断に対する必要性が高い。感染に応答して、免疫適格宿主は、体液性および細胞性成分の両方を包含する免疫応答の準備にかかる（Remington and Krahenbuhl，1982）。免疫応答は、その後の宿主感染に対する防御を提供する。妊娠前にすでに感染しているという血清学的証拠を有する女性はトキソプラズマ症を胎児に伝染させる危険性はない。インビトロおよびインビボ研究は、細胞により媒介される免疫は防御において必須の役割を果たすことを示し、さらに耐性の主要メディエイタとしてインターフェロン−ガンマを同定している(Frenkel,1967;Nathan et al.,1984;Pfefferkorn ,1984;Sethi et al.，1985;Suzuki and Remington，1988;Suzuki et al.，1988; Suzuki and Remington，1990;Gazinelli et al.，1991)。体液性成分は、トキソプラズマ症の診断に一般的に使用される方法の基盤となっている。他の感染症におけるのと同様に、ＩｇＧクラスの抗体の出現前にＩｇＭクラスの抗体が出現する。この相違を用いて、妊婦の感染が急性であるか慢性であるかを知ることができ、急性の感染のみが胎児への伝染に関して危険である。しかしながら、多くの場合、ＩｇＭクラスの抗体が通常期間よりも長期にわたり高レベルで残存し、分別診断を困難なものにする。トキソプラズマ診断におけるリファレンス試験はトキソプラズマ溶解試験（ＴＬＴ）および免疫蛍光試験（ＩＦ）である。トキソプラズマに対する抗体の検出は、最も頻繁には、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または同じ原理に基づく試験により行われる。これらの試験の特異性および選択性はつねに最適であるとはいえず、使用する抗体標品の品質に左右される。最も頻繁には、使用抗体は全細胞溶解物のフラクションであり、十分な特異性に欠ける。十分に特徴づけられたトキソプラズマ・ゴンジイ組み換え抗原の選択物を用いることはトキソプラズマ診断アッセイのためのより良い道具を提供する可能性がある。いくつかのトキソプラズマの抗体はすでにクローニングされ、組み換え抗原として発現されている。いくつかの排出／分泌抗原は患者由来の血清により認識されることが示されている:それらの抗原はＧＲＡ１(２３ｋＤａ)(Cesbron-Delauw et al.，1989;EP-A-0346430)、ＧＲＡ２（28.5または２８ｋＤａ）（Mercier e t al.，1993;S.F.Parmley et al.，1993;WO93/25689）、ＧＡＲ６（Lecordier e t al.，1995）、ならびにＳＡＧ２（Ｐ２２）（Parmley et al.，1992）、ＳＡＧ１（Ｐ３０）（Kim et al.，1994）、ＲＯＰ２（５４ＫＤａ）（Van Gelder e t al.，1993）のようないくつかの他の細胞性抗原、さらには例えばEP-A-043154 1（Behringwerke）に記載されたような多くのティー・ゴンジイ抗原フラグメントである。この感染性病原体を制御するためのワクチンは大きな価値を有するであろうし、その開発の実行可能性は、トキシプラズマによる１次感染は再感染に対する特異的で長期持続性の免疫を生じるという事実により示唆される（Remington and Kranenbuhl，1982）。しかしながら、現在、ヒトにおけるトキソプラズマ症に対する有効かつ安全なワクチンは利用できていない。非常に毒性のあるＲＨ株の生きた温度感受性変異株はマウスおよびハムスターにおいて防御的免疫を誘導することができる。ｔｓ−４と命名されたこの変異株は、ブラディオゾイトおよびのう胞を形成できないので、宿主中で存続しない（Waldeland and Frenkel，1983; Mc Leod et al.，1988;Suzuki and Remington，1990）。１９８８年以来、ヒツジに対して生きたワクチンが利用可能である。それは組織培養で増殖したＳ４８不完全株のティー・ゴンジイタキゾイトからなる（Toxovax，Ministry of Agric ulture and Fisheries，New Zealand）。研究室のマウスで継代することにより、その株はブラディオゾイト（のう胞）形成能を失う。このワクチンは未感染ヒツジをティー・ゴンジイによる感染に対して防御する（Buxton,1991,1993）。本発明の目的は、動物におけるトキソプラズマ・ゴンジイ感染の診断および／または予防に有用な新たなポリペプチドおよびペプチドを提供することである。より詳細には、ティー・ゴンジイ感染の血清診断に有用な、そして可能には慢性感染および急性感染の判別を可能にするポリペプチドおよびペプチドを提供することが本発明の目的である。さらに、感染宿主の細胞性免疫応答に基づくティー・ゴンジイ感染についての診断アッセイに有用なポリペプチドおよびペプチドを提供することが本発明の目的である。さらのそのうえ、ティー・ゴンジイ感染に対するワクチンの製造に有用なポリペプチドおよびペプチドを提供することが本発明の目的である。精製され単離されたＴｇ２０抗原性フラグメントを提供することが本発明の特別な目的である。より特別には、組み換えＴｇ２０抗原性フラグメントを提供することが本発明の目的である。さらにそのうえ、Ｔｇ２０のアミノ酸配列、およびそれをコードしている核酸配列を提供することが本発明の目的である。Ｔｇ２０蛋白の抗原性フラグメントと特異的に反応するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を提供することも、本発明の目的である。Ｔｇ２０核酸配列を特異的に増幅するプライマー、ならびにＴｇ２０核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブを提供することも、本発明の目的である。上記Ｔｇ２０ポリペプチド、ペプチド、抗体、プライマーおよび／またはプローブを有効成分の１つとして用いて、ティー・ゴンジイ感染に関する診断方法および／またはキットを提供することが本発明のもう１つの目的である。詳細には、ティー・ゴンジイ感染に関する血清診断法またはキットを提供することが本発明の目的であり、有効成分は、他のティー・ゴンジイ抗原と混合された、より詳細にはVan Gelder et al．(1993)により記載されたＴｇ３４抗原（＝Ｒｏｐ２抗原）またはそのフラグメントと混合された本発明Ｔｇ２０ポリペプチドまたはペプチドを含む。最終的には、哺乳動物において、より詳細にはヒトおよび／または家畜においてティー・ゴンジイ感染に対する防御的免疫を提供するワクチン組成物を提供することが本発明の目的である。上記の目的のすべては以下の本発明の具体例により遂行された。実施例セクションにおいてより詳細に説明するように、本発明は、ティー・ゴンジの抗原性フラグメントの同定および配列決定に関する。該抗原性フラグメントは、多くのティー・ゴンジイ感染患者の血清（それらは以前、Ｔｇ３４（Ｒｏｐ２）抗原またはそのフラグメントのようなティー・ゴンジイ抗原と反応しないことが示されていた（Van Gelder et al．1993））との反応性に基づいてティー・ゴンジイのλｇｔ１１発現ライブラリーから選択された。上記のごとく、実際の診断アッセイに使用されている粗ティー・ゴンジイ抗原調合物を、よく定義された単離抗原性（ポリ）ペプチドを選択することによって置き換える必要がある。本発明Ｔｇ２０ポリペプチドおよびペプチドは、実施例のセクションでさらに説明するようにティー・ゴンジイ感染個体の検出において高い特異性および感度があるので、かかる「新世代」の診断アッセイに含めるべき理想的な候補である。そのうえ、Ｔｇ２０ポリペプチドは、Ｔｇ３４抗原（Va n Gelder et al．1993）のようにトキソプラズマ症の診断において有用であることがすでに記載されている他のティー・ゴンジイ抗原性フラグメントに関して相捕的な反応性パターンを示すように選択されている。それゆえ、Ｔｇ２０およびＴｇ３４抗原性ポリペプチドは、診断アッセイにおいて互いに組み合わせて使用するのに特に適している。よって、本発明は、（１）図１ｂ（配列番号：２）に示す配列中のアミノ酸位置ｘからアミノ酸ｙまで伸長しているアミノ酸配列、ここにｘ＝１でありｙ＝１９６、および／またはｘ＝１でありｙ＝１６０、および／またはｘ＝１でありｙ＝１４５、および／またはｘ＝９５でありｙ＝１４５、および／または（２）（１）のいずれかのフラグメントであって、（１）で定義した配列の少なくとも７個の連続したアミノ酸の伸長鎖を含むフラグメント、および／または（３）（１）または（２）の配列中の１個または数個のアミノ酸の置換により生じる（１）または（２）の等価物を含むポリペプチドまたはペプチドであって、ティー・ゴンジイ感染宿主生物の体液性および／または細胞により媒介される免疫応答において重要な反応性エピトープを含むポリペプチドまたはペプチドに関する。上記ポリペプチドのフラグメントは、図１ｂ（配列番号：２）に示す位置１から位置１９６まで伸長しているアミノ酸配列から選択される少なくとも７個の連続したアミノ酸の伸長鎖、可能には８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、５０個またはそれ以上の連続したアミノ酸の伸長鎖を含むべきである。ティー・ゴンジイに感染した個体の血清学的応答において重要なエピトープを含むポリペプチドを、当業者に知られた理論に従って抗原の親水性度プロットから選択してもよい。本発明Ｔｇ２０抗原（配列番号：２）の親水性度プロットを図６に示す。実施例セクション中の実験データは、Ｔｇ２０抗原の大部分の免疫優性エピトープは抗原のアミノ末端部分に、すなわち図１に示す配列のアミノ酸位置１からアミノ酸位置１９６に、より詳細には位置９５から位置１４５まで伸長している領域に存在していることを示す。しかしながら、このＴｇ２０抗原の親水性プロットは、さらなるエピトープが当該蛋白のＣ末端に、例えばアミノ酸位置１９７からアミノ酸位置２３５までに、より詳細には位置２０５から位置２２０まで伸長している領域に存在する可能性があることを明確に示す。用語「ポリペプチド」は、隣接アミノ酸のアルファアミノ基とカルボキシ基間のペプチド結合により互いに結合している一連のアミノ酸をいう。２５個のアミノ酸またはそれ未満の長さのポリペプチドを「ペプチド」という。ポリペプチドは種々の長さであってよく、それらの天然（未荷電）型または塩の形態であってよく、グリコシレーション、側鎖酸化またはリン酸化のような修飾がなくてもよく、これらの修飾を含んでいてもよい。アミノ酸配列が酸性および塩基性基を含み、蛋白が溶液中にある場合、ペプチドにより示される特定のイオン化状態は周囲の媒体のｐＨに依存し、あるいは蛋白が固体状態の場合には、蛋白が得られた媒体のｐＨに依存することが当該分野においてよく理解されている。グリコシル単位、脂質またはリン酸塩のような無機イオンのごときアミノ酸側鎖に結合されたさらなる置換基により修飾された蛋白、ならびにスルフヒドリル基の酸化のような、鎖の化学的変換に関する修飾をされた蛋白も、この定義に包含される。本発明記載のポリペプチドおよびペプチドを、その片方または両方の末端においていわゆる「リンカー」配列により伸長させてもよく、リンカー配列は１個または数個のアミノ酸（または、例えばビオチンのような他の分子）からなり、ポリペプチドにさらなる物理化学的特性を付加し、（ポリ）ペプチドの精製、コーティングおよび提示のごとき特定のプロセスにとり特に望ましいものであってもよい。特別なタイプの「リンカー」配列は本発明（ポリ）ペプチドへのビオチン付加である。ポリペプチド合成の前または後にビオチン分子をポリペプチド配列中に含ませてもよく、ビオチン分子がポリペプチド配列のＮ末端またはＣ末端または内部に存在してもよい。ビオチン化は、上記ポリペプチドが血清診断アッセイに使用される場合に特に有利である。（ポリ）ペプチド中のビオチンの存在は、ビオチン結合分子（例えばストレプトアビジンのごとき）でコーティングされた膜またはプレート上での付着および提示を容易にする。よって、「ポリペプチド」またはその等価な用語は、言及した適当なアミノ酸配列、その機能性を破壊しない上記修飾を有するものについていう。本発明ポリペプチド、および詳細にはペプチドを、古典的な化学合成により製造することができる。均一溶液または固相において合成を行うことができる。例えば、均一溶液において使用可能な合成法は、E.Wunsch編、"Methoden der Organischen Chemie"(Methods of Organic Chemistry)vol.15-IおよびII Thieme ,Stuttgart 974においてHoubenweylにより説明されている。また、"Solid phase peptide synthesis"(IRL Press，Oxfoerd，1989)中、Ath erton and Shepardにより説明された方法に従って、本発明ポリペプチドを固相において製造することもできる。 Maniatis et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，New York，Cold Sprong Harbor Laboratory，1982により説明された組み換えＤＮＡ法を用いて本発明ポリペプチドを製造することもできる。用語「組み換えポリペプチド」は、効果的な細胞宿主中の適当な調節エレメントの制御下の対応ＤＮＡ配列の転写および翻訳によって遺伝子操作により製造されたポリペプチドをいう。天然環境からの単離精製、例えばティー・ゴンジイ溶解物または抽出物からの精製により本発明ポリペプチドを製造することもできる。本発明ポリペプチドの精製に用いる方法は当該分野において知られている。用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体に結合（Ｂ細胞エピープ）またはＴ細胞受容体に結合（Ｔ細胞エピトープ）する抗原性分子の特定の領域をいう。用語「体液性免疫応答」は、抗体により媒介される免疫応答をいい、「細胞により媒介される免疫応答」はｔリンパ球により媒介される。ティー・ゴンジイ感染の場合、大部分の診断アッセイは体液性免疫応答の測定によるものであるが、基本的には疾病に対する防御は細胞により媒介される免疫応答により媒介される。それゆえ、Ｂ細胞エピトープは診断アッセイの重要成分であるが、Ｔ細胞エピトープがワクチンの成分において不可欠であるといえる。実施例セクションに示すように、ティー・ゴンジイ感染個体由来の血清との反応性を示すように、そして／またはティー・ゴンジイ反応性Ｔ細胞を刺激するように、上記ポリペプチドおよびペプチドを選択する。上記用語「等価物」（または「ミューテイン」）は１個またはそれ以上のアミノ酸の置換を含むポリペプチドおよびペプチドであると定義してもよいが、該等価物がもとのポリペプチドの免疫原／抗原特性を保持していることが条件である。かかる等価物の基礎を形成しうるアミノ酸置換の一覧を表１に示す。ＳＤＳ− ＰＡＧＥにより決定した場合にかかる等価物がもとの配列とはわずかに異なる分子量を有していてもよいことは明かなはずである。該「ミューテイン」はトキソプラズマ・ゴンジイＴｇ２０抗原の株間の変化によるものであってもよく、あるいは元のポリペプチド配列に導入された修飾によるものであってもよく、該修飾は所望の副次的影響をポリペプチド分子に及ぼすものであってもよい（例えば、より良好な物理化学的特性、より効果的な精製、より効果的なコーティング特性、さらなる安定性等）。より特別な具体例において、本発明は下記のものを含むポリペプチドまたはペプチドであって、ティー・ゴンジイ感染宿主細胞の体液性および／または細胞により媒介される免疫応答において重要な反応性エピトープを含むポリペプチドおよびペプチドに関する：（１）図１ｂ（配列番号：２）中の位置９５から位置１４５まで伸長しているアミノ酸配列、および／または（２）（１）のフラグメントであって、（１）中の少なくとも７個の連続したアミノ酸の鎖を含むフラグメント、および／または（３）により示されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、および／または（４）（１）、（２）または（３）の配列中の１個または数個のアミノ酸の置換により生じる（１）、（２）または（３）の等価物。好ましくは、上記ポリペプチドおよびそれらのフラグメントおよび／または等価物はティー・ゴンジイ感染個体由来の血清と反応する。本発明のもう１つの具体例は、異種ポリペプチド配列に連結された上記ポリペプチド配列の１つを含む融合蛋白を包含する。用語「異種ポリペプチド配列」は、Ｔｇ２０配列以外のポリペプチド配列をいい、ティー・ゴンジイ由来であてもよく、別の生物由来であってもよい。融合蛋白は非融合蛋白よりも有利な効果を有していてもよく、該効果は例えば、 −組み換え宿主中でのより効果的な発現レベル（例えば、さらに説明するようなｍＴＮＦ融合蛋白）および／または −より簡単な精製系（例えば、さらに説明するようなポリヒスチジンテイル）および／または −異なるティー・ゴンジイ抗原由来のいくつかのエピトープの組み合わせおよび／または −より効果的なエピトープの提示である。該融合蛋白を組み換えＤＮＡ法により製造してもよく、それにより異なるコーディング領域が互いに作動可能に連結され、適当な宿主細胞中で発現される。しかしながら、インビトロカップリング法または化学合成のような他の方法により融合蛋白を製造してもよい。また本発明は下記のものを含む核酸に関する：（１）上記ポリペプチドのいずれかをコードしているポリ核酸配列、および／または（２）図１ｂ（配列番号：１）に示すポリ核酸配列の位置ｘから位置ｙまで伸長しているポリ核酸配列、ここにｘ＝１かつｙ＝５８９および／またはｘ＝１かつｙ＝４８０および／またはｘ＝１かつｙ＝４３４および／またはｘ＝２８７かつｙ＝４３４、および／または（３）ポリ核酸配列（１）または（２）についての遺伝学的コードの縮重の結果としてのポリ核酸配列であって、やはり上記ポリペプチドのいずれかをコードしているポリ核酸配列、および／または（４）（１）ないし（３）において定義したポリ核酸配列のいずれかとハイブリダイゼーションするポリ核酸配列、および／または（５）（１）ないし（４）において定義したポリ核酸配列のいずれかのフラグメントであって、（１）ないし（３）において定義したポリ核酸配列のいずれか由来の少なくとも１０個、好ましくは１１、１２、１３、１４、１５個またはそれ以上の連続したヌクレオチドの鎖を含むフラグメント。用語「核酸」または「ポリ核酸」は、少なくとも１０、２０、３０、４０または５０個の連続したヌクレオチドを含む２本鎖または１本鎖ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたはＲＮＡをいう。１００ヌクレオチド未満の長さの核酸を、しばしば、オリゴヌクレオチドという。本発明においては常に１本鎖ポリ核酸配列を５ ’末端から３末端方向に示す。しかしながら、もちろん、相捕的配列および２本鎖配列も表現に用いる式に含まれることが理解されるはずである。用語「〜にハイブリダイゼーションする」は、互いに少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の相同性を示す配列間のハイブリダイゼーションを可能にする、好ましくは厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションすることをいう。用語「縮重」は、同じアミノ酸に対するコドンの可能な相違により同じ蛋白をコードしているポリ核酸配列における可能な変化をいう。もう１つの具体例によれば、本発明は、上記ポリ核酸配列のいずれかの一部を形成する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドをその配列中に含むオリゴヌクレオチドであって、本発明ポリ核酸を検出するための特異的ハイブリダイゼーションプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドに関する。用語「プローブ」は、検出すべき標的配列にハイブリダイゼーションする十分に相捕的な配列を有する１本鎖配列特異的オリゴヌクレオチドをいう。本発明のこの態様によれば、当該分野において知られた方法によりプローブを選択してもよい。好ましくは、これらのプローブは約１０ないし５０個のヌクレオチドの長さであり、より好ましくは約１５ないし２５個のヌクレオチドの長さである。修飾がプローブの特異性を変化させない条件で、例えば末端（３’または５’ ）において１個または数個のヌクレオチドを付加または欠失することにより、あるいは必須でないいくつかのヌクレオチドを他のもの（修飾ヌクレオチドおよびイノシンを包含）に置換することにより、本発明プローブ配列をわずかに修飾してもよい。これらの修飾は、例えばより高い感度を得るため（例えば、配列の株間変化により）、あるいは改変されたハイブリダイゼーション条件下（バッファー、温度、塩濃度等）で十分な特異性を得るために必要または望ましいものであってもよい。また、より特異的なハイブリダイゼーション結果を得るためには、使用プローブ量の変更も有益でありうる。この点において、同じ長さのプローブは、それらのＧＣ含量にかかわらずＴＭＡＣＩ溶液中ではほぼ同じ温度で特異的にハイブリダイゼーションすることに注意すべきである（Jacobs et al.，1988）。後に述べたことは、本発明において企図される変異プローブを、もとのプローブに関して用いられる条件と異なっていてもあるいは同じであってもよい厳密なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で同じ特異性でハイブリダイゼーションするプローブであると定義することができる。用語「相捕物」は、示された配列に対して正確に相捕的であり、示された配列にハイブリダイゼーションしうるヌクレオチド配列をいう。もう１つの具体例によれば、本発明は、上記ポリ核酸配列のいずれかの一部を形成する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドをその配列中に含むオリゴヌクレオチドであって、本発明ポリ核酸配列のいずれかを特異的に増幅するためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドに関する。用語「プライマー」は、コピーすべき核酸鎖に相捕的な伸長生成物の合成の開始点として作用しうる１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列をいう。プライマー配列の長さは伸長生成物の合成を開始することが可能なものでなくてはならない。好ましくは、プライマーは約１０〜５０個のヌクレオチドの長さであり、より好ましくは１０〜３０個のヌクレオチドの長さである。個々の長さおよび配列は、必要なＤＮＡまたはＲＮＡ標的の複雑性ならびに温度およびイオン強度のごときプライマー使用条件による。正しい増幅を保証するためには増幅プライマーは対応鋳型配列に正確にマッチする必要はないという事実は文献に十分に記載されている（Kwok et al.，1990 ）。使用増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Saiki et al.，1988）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Landgren et al.，1988；Wu & Wallace，1989；Barany ，1991),kakusan配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；Guatelli et al.，1990；Comp ton,1991）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ；Kwoh et al.，1989）、鎖置換増幅（ＳＤＡ；Duck，1990；Walker et al.，1992）またはＱβレプリカーゼを用いる増幅（Lizardi et al.，1988；Lomeli et al.，1989）またはプライマー伸長を用いる他の適当な核酸増幅方法であってよい。便利には、増幅中に標識プライマーを用いてあるいは標識ヌクレオチドを取り込ませることにより増幅生成物を標識することができる。標識は同位元素（³²Ｐ、³⁵Ｓ等）または非同位元素（ビオチン、ジゴキシゲニン等）であってよい。増幅反応を２０ないし８０回、有利には３０ないし５０回繰り返す。プライマーまたはプローブとして用いるオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート（Matsukura et al.，1987）、アルキルホスホロ−チエート（Miller et al.，1979）またはペプチド核酸（Nielsen et al. ，1991；Nielsen et al.，1993）のごときヌクレオチドアナログを含むかまたはそれらからなっていてもよく、あるいは挿入剤を含んでいてもよい(Asseline et al.，1984)。もとの本発明ＤＮＡ配列中に導入される大部分の他の変化または修飾、これらの変化は、オリゴヌクレオチドを用いて必要な特異性および選択性を得るための条件に適合することを要する。しかしながら、ハイブリダイゼーションの最終結果は必然的に修飾オリゴヌクレオチドを用いて得られる結果と同じであろう。これらの修飾の導入は、ハイブリダイゼーション動力学、ハイブリッド精製の可逆性、オリゴヌクレオチド分子の生物学的安定性とのごとき特性に正の影響を与えるために有利である可能性がある。本発明のもう１つの具体例は、クローニングおよび／または発現目的の、上記核酸のいずれかを含む組み換え核酸を提供する。用語「組み換え核酸」は、組み換え法によりインビトロで製造され、互いに連結された異なる源由来の核酸を含んでいてもよい核酸分子をいう。詳細には、本発明は組み換えベクターを提供し、クローニングおよび／または発現目的で、上記核酸の１つがその中に挿入されている。用語「ベクター」は遺伝学的物質を細胞または生物に伝達するのに用いる作用剤（ウイルスまたはプラスミド）をいう。ベクターは、遺伝子クローニングの目的でフラグメントＤＮＡを受容細胞へと運搬するのに用いる「クローニングベクター」であってもよく、あるいはＤＮＡ配列を適当な宿主細胞中に運搬して該ＤＮＡ配列によりコードされた蛋白の合成を指令する「発現ベクター」であってもよい。本発明において、最も適当なベクターはプラスミド、すなわち宿主細胞のゲノムとは独立して複製する小型環状ＤＮＡ分子である。しかしながら、使用宿主細胞によってはコスミド、ウイルスおよびファージのごとき他のベクターを用いてもよい。詳細には、本発明は組み換えベクターに関し、その中において、本発明ポリペプチドのいずれかに関するコーディング配列が特定の宿主によるコーディング配列の発現を提供しうる制御配列に作動可能に連結されている。「〜に作動可能に連結」という表現は、成分が通常の機能を発揮するような配置で並置されていることをいう。よって、コーディング配列に作動可能に連結された調節配列は発現指令し、最終的にはコードしている遺伝子産物の分泌を行うことができる。用語「制御配列」は、遺伝子から蛋白への発現、すなわちその転写および／または翻訳および／または調節および／または成熟に関与する配列をいう。よって、制御配列はプロモーター配列（可能なプロモーター調節配列を包含）、リボソーム結合部位、分泌シグナルをコードしている配列等を含んでいてもよい。もう１つの具体例は、本発明ポリペプチドのコーディング配列がベクター配列の一部である別の異種コーディング配列に作動可能に連結されており、融合蛋白の発現を引き起こすものである。よって、最も広い意味において、用語「制御配列」は、本発明ポリペプチドが融合している異種蛋白のコーディング配列も含む。さらにもう１つの具体例によれば、本発明は、本発明ポリ核酸配列のいずれかを含む組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。好ましくは、該宿主細胞は細菌細胞であり、最も好ましくはイー・コリ（E.co li）であるが、酵母、植物、昆虫または動物細胞のような真核細胞も包含する。イー・コリ中で本発明ポリペプチドの発現を行う方法を実施例セクションでさらに示す。他の宿主細胞中で発現を行う方法は組み換え発現法の分野においてよく知られている。さらなる具体例によれば、本発明は、 −コードされているポリペプチドの発現、および可能には分泌を可能にする条件下で上記の形質転換宿主細胞の培養物を増殖させ、次いで、 −発現したポリペプチドを培養物から回収することによって製造される組み換えポリペプチドを提供する。可能な具体例によれば、該組み換えポリペプチドは、異種（ポリ）ペプチドにインフレーム(in frame)で融合した本発明ポリペプチドからなる融合蛋白であってもよい。上記のごとく、融合蛋白は本発明ポリペプチドに対して可能な所望効果を与えるものであってもよい。本発明のもう１つの具体例は、本発明ポリペプチドと特異的に反応するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を提供する。好ましくは、該抗体は、Saavedra et al．(1990)によりすでに記載されたモノクローナル抗体ＢＡＴＯ２１４とは異なるものである。この好ましい本発明の具体例による抗体は、本発明のティー・ゴンジイのポリペプチドに対して調製され、他のテイー・ゴンジイ蛋白に対しては交差反応を示さないポリクローナル抗血清を包含する。それは、本発明のティー・ゴンジイのポリペプチドに対して調製されたモノクローナル抗体をも包含する。当該分野において知られた古典的方法、すなわち、一方には、ティー・ゴンジイに感染した、あるいは上記の本発明ポリペプチドに対して免疫された動物、詳細にはマウスまたはラットの脾臓細胞と、他方、動物の免疫に最初に使用されたポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマの能力により選択されたミエローマ細胞系の細胞との融合により得られたハイブリドーマにより、本発明モノクローナルを製造することもできる。本発明の好ましい具体例のモノクローナル抗体は、組み換えＤＮＡ法を用いて作成されたマウスモノクローナル抗体のヒト化バージョンであってもよく、ＨおよびＬ鎖をコードしているマウスおよび／またはヒトのゲノムＤＮＡ配列から作られたもの、あるいはＨおよびＬ鎖をコードしているｃＤＮＡクローン由来のものである。また、本来の結合特性を保持しているこれらのモノクローナル抗体由来のフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’₂およびｓｓＦｖ（１本鎖可変フラグメント）も本発明の一部を形成する。通常は、かかるフラグメントは、例えばパパイン、ペプシン、または他のプロテアーゼでの抗体の酵素的消化により得られる。モノクローナル抗体、またはそのフラグメントを種々の用途のために修飾できることは、当業者によく知られている。本発明に用いる抗体を、酵素、蛍光、または放射性タイプの適当な標識により標識することができる。また本発明は、レパートリークローニング法（Perrson et al.，1991）による組み換え抗体の選択のための、本発明蛋白またはそのミューテインまたはそれらのフラグメントの使用にも関する。本発明の好ましい具体例によれば、インビボで感染するトキソプラズマ・ゴンジイによる特定細胞タイプの感染を抑制しうるという点において、上記抗体、または抗原結合フラグメントＦ（ａｂ）’₂、Ｆａｂ、１本鎖Ｆｖならびにすべてのタイプの組み換え抗体がさらに特徴づけられる。もう１つの具体例によれば、本発明は、少なくとも下記工程を含む方法により得ることのできる上記モノクローナル抗体に関する： −トキソプラズマ・ゴンジイに感染したマウスからから得た脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させ、 −ＥＬＩＳＡおよびその後の限界希釈を用いて抗−ティー・ゴンジイハイブリドーマを選択し、 −ＥＬＩＳＡを用いてモノクローナル抗体、特に本発明のティー・ゴンジイのポリペプチドのいずれかに指向されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次いで、 −腹水または選択ハイブリドーマの培養物からモノクローナル抗体を回収する。また本発明は、上記モノクローナル抗体のいずれかを産生するハイブリドーマに関する。さらに本発明は、上記抗体のいずれかに対して生成した抗−イディオタイプ抗体に関する。用語「抗−イディオタイプ抗体」は、トキソプラズマＴｇ２０ポリペプチドに対して生成したモノクローナル抗体自身の可変領域の抗原決定基に対して生成したモノクローナル抗体をいう。免疫グロブリンのこれらの抗原決定基はイディオタイプ（イディオトープのセット）として知られており、それゆえ、抗体の「指紋」と考えられる(概説として、de Preval，1978；Fleishmann and Davie，1984 参照)。モノクローナル抗−イディオタイプ抗体の製造方法はGheuens and McFar lin(1982)により記載されている。モノクローナル抗−イディオタイプ抗体は、イディオタィプのモノクローナル抗体（これに対してモノクローナル抗−イディオタイプ抗体が対抗して生成した）と免疫学的複合体を形成する特性を有する。この点において、しばしばモノクローナル抗体はＡｂ１と呼ばれ、抗−イディオタイプ抗体はＡｂ２と呼ばれる。これらの抗−イディオタイプＡｂ２を、本発明ポリペプチドの置換物または本発明ポリペプチドのそれらの標的への結合の競争物質として用いてもよい。さらに本発明は、上記トキソプラズマポリペプチド由来のアンチセンスペプチドに関する。より詳細には、用語「アンチセンスペプチド」はBlalock(1990)およびRoubos( 1990)により概説されている。この点において、分子認識理論（Balock，1990）は、相捕的核酸配列が相互作用するということのみならず、蛋白中の相互作用部位が相捕的アミノ酸配列（受容体を伴うセンスリガンドまたはアンチセンスペプチドを伴うセンスリガンド）を含んでいると述べている。よって、一方のアミノ末端を他方のカルボキシ末端と並置した場合、同じ読み枠中の相捕的核酸配列由来の２つのペプチドはそれらの疎水性および親水性アミノ酸の全互換種を示すであろう。この逆転したヒドロパシーパターンは２つのかかるペプチドが特定の相互作用に応答可能な相捕的なコンホーメーションとなることを可能にするかもしれない。 Ghiso et al．(1990)に記載されたようにしてアンチセンスペプチドを製造することができる。この方法を用いることにより、相補性に関する簡単なヌクレオチド配列分析により既知ペプチドと重要な相互作用をするペプチドを論理的に構築し、結合部位に相捕的なペプチドを合成することが可能である。さらに本発明は、可能には、抗−ティー・ゴンジイ抗体、ティー・ゴンジイ抗原および／またはティー・ゴンジイ核酸を下記のもの： −免疫学的複合体の形成を可能にする条件下で上記ポリペプチドまたはペプチド、または −ハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にする条件下で上記プローブ（該試料の該核酸は、可能には、上記プライマーを用いてハイブリダイゼーション前に増幅される）、または −免疫学的複合体の形成を可能にする条件下で上記ポリペプチドに特異的に指向された抗体、または −抗体−抗−イディオタイプ複合体の形成を可能にする条件下で上記抗−イディオタイプ抗体、または −抗原−アンチセンスペプチド複合体の形成を可能にする条件下で上記アンチセンスペプチドと接触させ、次いで、形成した複合体を検出する工程を少なくとも含む、ティー・ゴンジイ感染のインビトロ診断方法に関する。用語「試料」は、ティー・ゴンジイ核酸、抗体またはポリペプチドを含有する生物学的試料（組織または液体）をいう。好ましい具体例において、本発明は、抗−ティー・ゴンジイ抗体の検出方法に関し、その場合、好ましい試料は血清または血漿である。より特別な具体例において、本発明は、生物学的試料中に存在するティー・ゴンジイに対する抗体を検出する方法であって、 −免疫学的複合体の形成を可能にする条件下で、分析すべき生物学的試料を上記ポリペプチドのいずれかと接触させ、 −該抗体と該ポリペプチドとの間に形成された免疫学的複合体を検出することを含む方法に関する。免疫学的複合体の形成を可能にする条件は当業者に知られている。特別な具体例において、上記の抗−ティー・ゴンジイ抗体の検出方法に用いられるポリペプチドを、それらの等価物として作用する上記抗−イディオタイプ抗体と置き換えてることができる。抗体−抗−イディオタイプ複合体の形成を可能にする条件は当業者に知られている。さらに本発明は、生物学的試料中のティー・ゴンジイ抗原の存在を検出する方法であって、 −免疫学的複合体の形成を可能にする条件下で、分析すべき生物学的試料を本発明抗体と接触させ、 −該抗体と該抗原との間に形成された免疫学的複合体を検出することを含む方法に関する。特別な具体例において、上記のティー・ゴンジイ抗原の検出方法に用いる抗体を、それらの等価物として作用する上記アンチ−センスペプチドと置き換えてもよい。抗原−アンチセンスペプチド複合体の形成を可能にする条件は当該分野において知られている。免疫アッセイの設計には非常に多くの種類があり、多くのフォーマットが当該分野において知られている。例えば、プロトコールは固体支持体、または免疫沈降を用いるものであってもよい。大部分のアッセイは、標識抗体またはポリペプチドの使用を包含する。標識は、例えば、酵素、蛍光、化学発酵、放射性、または色素分子であってよい。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイも知られており、その例は、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンを用いるもの、ならびに酵素標識およびＥＬＩＳＡのごとき酵素媒介イムノアッセイを用いるものである。１の有利な具体例は、試料中のティー・ゴンジイ抗体の検出方法を提供し、そこでは、本発明（ポリ）ペプチドが固体支持体に、最終的には膜片に固定化される。本発明の異なる（ポリ）ペプチドを一緒に固定化してもよく、別々の位置（例えば、並行線の形に）に逐次固定化してもよい。同じアッセイにおいて本発明ポリペプチドをトキソプラズマ・ゴンジイ由来または他の生物由来の他の抗原と組み合わせてもよい。よって、本発明は、可能には他の（ポリ）ペプチドと一緒に本発明（ポリ）ペプチドが固定化された固体支持体にも関する。本発明のもう１つの具体例は、生物学的試料中に存在するティー・ゴンジイのポリ核酸の存在を検出する方法であって、 −可能には、試料中に含まれるポリ核酸を抽出し、 −少なくとも１つの上記プライマーを用いてティー・ゴンジイのポリ核酸を増幅し、 −可能には、上記プローブとのハイブリダイゼーション後に、増幅された核酸を検出することを含む方法を提供する。ハイブリダイゼーションを可能にする条件は当該分野において知られており、例えば、Maniatis et al．(1982)において説明されている。しかしながら、ハイブリダイゼーション溶液（ＳＳＣ、ＳＳＰＥ等）に応じて使用プローブを適温でハイブリダイゼーションさせて十分な特異性を達成させるべきである（いくつかの場合、１個のヌクレオチドのレベルの相違が識別されよう）。インビトロでの検出前の試料中に存在する核酸の増幅を、当該分野において知られた方法により、まず試料中に存在する核酸を抽出することにより行ってもよい。ＲＮＡの抽出の場合、ｃＤＮＡを得ることが必要であり、さもなくば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを抽出する。増幅方法は上で詳述したものである。本発明オリゴヌクレオチドプローブと試料中の核酸配列との間に形成されたハイブリッドを検出する本発明の目的に適するアッセイ方法は、当該分野において知られたアッセイフォーマットを含む。例えば、ドットブロットフォーマットを用いて検出を行うことができ、未標識増幅試料を膜に結合させ、適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で膜を少なくとも１種の標識プローブとともにインキュベーションし、次いで、結合プローブ量をモニターする。セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合プローブのように、プローブを放射性同位元素または発色もしくは化学発光検出可能な標識で標識することができる。別法は「逆」ドットブロットフォーマットであり、このフォーマットにおいて、増幅配列は標識を含有している。このフォーマットにおいて、未標識オリゴヌクレオチドプローブが固体支持体に結合され、適当な厳密なハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件下で標識試料に曝露される。試料の核酸と本発明オリゴヌクレオチドプローブとの間のハイブリッドの形成に依存する他のアッセイ方法を用いてもよいことが理解されよう。有利な具体例によれば、生物学的試料中に含まれるティー・ゴンジイ核酸配列の検出方法は、増幅された本発明ポリ核酸のフラグメントを、上記のごとくプローブがすでに固定化されている固体支持体と接触させる工程を含む。非常に特別な具体例において、プローブは膜片上に並行線状に固定化される。このタイプの逆ハイブリダイゼーション法はさらにラインプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）として詳述される。よって、本発明は、本発明ポリヌクレオチドが固定化された固体支持体にも関する。もう１つの具体例によれば、本発明は、ティー・ゴンジイ病原体に接触した個体における細胞性免疫応答を測定するために、少なくとも１つの本発明ポリペプチドまたはペプチドを可能には他のティー・ゴンジイポリペプチドと一緒に用いる方法であって、該細胞性免疫がインビボ（例えば、本発明ポリペプチドの皮下注射による遅延タイプの過敏性反応）において、あるいはインビトロ（例えば、免疫応答に応答する細胞によるポリペプチドの認識を可能にする条件下（条件は当業者に知られている）で本発明ポリペプチドを末梢血リンパ球試料に添加することによる末梢血リンパ球の刺激またはインターフェロンガンマの分泌）において測定される方法に関する。また本発明は、上記のいずれかの方法による抗−ティー・ゴンジイ抗体、またはティー・ゴンジイ核酸またはティー・ゴンジイ抗原の検出のためのキットであって、少なくとも１つの上記ティー・ゴンジイのポリペプチドもしくはペプチド、または上記ティー・ゴンジイ核酸のいずれか、より詳細には上記プローブもしくはプライマーのいすれか、または上記抗体のいずれか、または上記抗−イディオタイプ抗体のいずれか、または上記アンチセス−ペプチドのいずれかを含むキットに関する。この具体例によれば、本発明のティー・ゴンジイのポリペプチドに対する抗体の検出は核酸またはポリペプチドの検出よりも好ましい。より詳細には、本発明は、生物学的試料中の上記ティー・ゴンジイのポリペプチド抗体の存在を検出するためのキット（＝血清診断キット／アッセイ）であって、 −可能には、ティー・ゴンジイ由来の他のポリペプチドまたはペプチドと組み合わされた少なくとも１つの上記ポリペプチドまたはペプチド（好ましくは、該ポリペプチドは固体支持体に固定化される）、 −本発明ポリペプチドと可能には生物学的試料中に存在する抗体との間の結合反応を可能にするバッファー、またはバッファーを作成するのに必要な成分、 −上記結合反応において形成された免疫複合体を検出する手段、 −可能には、試料中のティー・ゴンジイ抗体の存在を推断するための自動スキャンニングおよび解析デバイスを含むキットに関する。本発明のこの態様のキットまたは方法は、本発明ペプチドまたはポリペプチド抗原のほかに、当該分野において知られた他のティー・ゴンジイ抗原性蛋白またはペプチド（例えば、外膜蛋白（ＯＭＰ）またはペプチド）、あるいは一般的には他の細菌の抗原性蛋白またはペプチドを含んでいてもよい。上記の１の単独の検出法またはキットにおける異なる抗原の組み合わせはある種の利点を有する可能性があり、例えば利点は以下のものである： −より高い試験感度の達成：例えば、ティー・ゴンジイ由来のいくつかの抗原決定基を組み合わせることにより正確に同定される陽性血清の下図を増加させることができる、および／または −慢性および急性ティー・ゴンジイ感染の識別を可能にする。好ましい具体例において、本発明は、上記血清診断法おおび／またはキットに関し、その中で、本発明ポリペプチドおよびペプチドはvan Gelderらにより記載されたティー・ゴンジイのＴｇ３４抗原またはそのフラグメントと組み合わされる。本発明に包含される組み合わせのもう１つの特別な場合は、本発明ポリペプチドをＴｇ２０蛋白のＣ末端に存在する抗原性フラグメント、すなわち図１ｂ（配列番号：２）に示す配列のアミノ酸位置１９７からアミノ酸位置２３５までの領域と組み合わせることである。さらのに実施例セクションで説明するように、Ｔｇ２０の大部分の免疫優性エピトープは、図１ｂに示すアミノ酸位置１からアミノ酸位置１９７まで伸長している領域、より詳細には、アミノ酸位置９５から位置１４５まで伸長している領域に存在する。しかしながら、ある場合には、本発明ポリペプチドを、より抗原性の低いＴｇ２０のＣ末端部分由来の（ポリ）ペプチドフラグメントと組み合わせることが必要であるかもしれない。用途または試験フォーマットによっては、１のアッセイにおける該組み合わせを異なる方法で行ってもよい。例えば、いくつかのポリペプチド（例えば、本発明Ｔｇ２０よびＴｇ３４）の抗原性フラグメントを固体表面（マイクロタイタープレートまたは膜）上の同じ位置または別の位置に一緒に固定化してもよい。後者の試験フォーマットの好ましい例はラインイムノアッセイ(ＬＩＡ,INNOGENETI CS)であり、このアッセイにおいて、異なる抗原性フラグメントは膜片上に並行線状に固定化され、かくして、異なる抗原性フラグメントとの異なる反応性をモニターすることができる。別法として、本発明ポリペプチドと他のティー・ゴンジイ抗原決定基との組み合わせを分子レベルで、すなわち、異なる抗原性エピトープを１つの分子中に組み合わせてティー・ゴンジイ感染を検出するための「スーパー抗原」を作成することにより行ってもよい。当該分野において知られた組み換えＤＮＡ法により、例えば、異なる抗原部位をコードしており適当な宿主中で発現する異なるＤＮＡ配列を作動可能に連結することにより該「スーパー抗原」を製造してもよい。上記組み合わせは血清診断アッセイにのみ用いられるのではなく、他のタイプの診断アッセイおよび／またはワクチン組成物においても有用であることが理解されよう。非常に特別な具体例において、本発明は、上記生物学的試料中の抗−ティー・ゴンジイ抗体の検出のためのキットに関し、該キットにおいて、本発明ポリペプチドは上記抗−イディオタイプ抗体により置き換えられる。さらに本発明は、生物学的試料中に存在するティー・ゴンジイの抗原の検出のためのキットに関し、該キットは上記抗体を含み、好ましくは、該抗体は固体支持体に結合している。非常に特別な具体例において、本発明は、生物学的試料中に存在するティー・ゴンジイの抗原の検出のためのキットに関し、該キットにおいて上記抗体はアンチセンスペプチドにより置き換えられる。さらに本発明は、試料中に存在するティー・ゴンジイのポリ核酸の検出のためのキットに関し、該キットは上記プローブおよび／または上記プライマーを含む。好ましい具体例によれば、本発明は、詳細には該ポリペプチド、ペプチド、ポリ核酸、抗体、抗−イディオタイプ抗体またはアンチセンスペプチドがインビトロにおけるティー・ゴンジイ慢性感染個体と急性感染個体との識別に有用であることをさらに特徴とする、上記ティー・ゴンジイ感染の診断のためのキットまたは方法に関する。もう１つの具体例によれば、本発明は、ティー・ゴンジイ感染に対する防御免疫を提供するワクチン組成物であって、１種またはそれ以上の本発明ティーゴンジイポリペプチド、あるいは１種またはそれ以上の本発明ポリヌクレオチド配列または組み換えベクターを有効成分として含むワクチン組成物に関し、該有効成分は医薬上許容される担体と混合されている。特別な具体例によれば、上記ワクチン組成物は上記抗−イデイオタイプ抗体の１つを有効成分として含んでいてもよい。一般的には、本発明ティー・ゴンジイ蛋白のほかに、該ワクチン組成物は他のトキソプラズマ免疫原成分（Ｒｐｏ２（Ｔｇ３４）、Ｇｒａ１、Ｇｒａ２、Ｓａｇ１、Ｓａｇ２抗原等）または他の細菌成分または他の免疫原成分を含んでいてもよい。特別な具体例において、上記ポリペプチドのいずれかをコードしているポリ核酸配列を、裸のＤＮＡまたは組み換えベクターの一部としてワクチンとして用いる。この場合、免疫すべき個体に投与される該核酸をin situで発現させて免疫原蛋白／ペプチドとし、かくして免疫された宿主を防御することが目的である。かかるワクチン組成物の有効成分を経口、皮下、結膜から、筋肉内、鼻腔内から、あるいは例えば担体に結合、リポソームに入れる等の当該分野で知られた他の経路により、当該分野で知られたアジュバントを添加することにより投与してもよい。また本発明は、医薬として、より詳細には上記医学的用途（診断または予防）に使用する上記物質（ポリペプチド、抗体、ポリ核酸、抗−イディオタイプ抗体、アンチセンスペプチド）に関する。さらにそのうえ、本発明は、医薬の製造のための、より詳細にはワクチンの製造または診断用組成物の製造のための上記物質（ポリペプチド、抗体、ポリ核酸、抗−イディオタイプ抗体、アンチセンスペプチド）の使用に関する。図面の説明図１１ａクローンＴｇ２０の１２６０塩基対のＥｃｏＲＩフラグメントの制限地図および免疫反応性について分析された異なる欠失クローンの位置。１ｂクローンＴｇ２０の１２６０塩基対のＥｃｏＲＩフラグメントの完全核酸（配列番号：１）およびアミノ酸（配列番号：２）配列。重要な制限部位を示す。矢印は可能なシグナルペプチド開裂部位を示す。図２ベクターｐｍＴＮＦ.ＭＰＨの地図。図３ベクターｐＩＧＦＨ１１１の地図。図４ＴＮＦ.Ｈ６.Ｔｇ２０融合蛋白のアミノ酸配列。普通文字はベクター由来のアミノ酸配列を表す。太字はＴｇ２０抗原配列に対応する。図５組み換えＴｇ２０抗原およびその天然に存在する対応物のＭａｂＢＡＴＯ２１４とのウェスタンブロットにおける反応性。レーン１：ティー・ゴンジイ溶解物レーン２：分子量マーカー（Biolabs）順に、６.５、１６.５、２５.０、３２.５、４７.５、６２.０、８３.０、１７５．０ｋＤａレーン３：精製組み換えＴｇ２０融合蛋白図６Ｔｇ２０抗原（配列番号：２）の親水性度プロット。表の説明表１：本発明ミューテイン（等価物）を形成しうるアミノ酸置換。表２：トキソプラズマ症の診断に用いる古典的な試験（ＩＦ（ＩｇＧおよびＩｇＭ）およびBiomerieux ＥＬＩＳＡ試験）、ならびに本発明Ｔｇ２０抗原またはそのフラグメント（Ｔｇ２０ＢＮ）を用いるＥＬＩＳＡ、Ｔｇ３４ＡＲ抗原、または上記抗原の組み合わせを用いるＥＬＩＳＡにおける異なる（ヒト）血清の反応性（ＯＤ４５０値ｘ１０００）。古典的試験における陽性血清は１ないし９５番である。古典的試験における陰性血清は２０６ないし２５０番である。表３：フルサイズ（full size）のＴｇ２０抗原およびＴｇ２０ＢＮフラグメントと表２のいくつかの血清との反応性の比較。表１実施例実施例１：材料および方法試薬すべての試薬は分析等級のものであり、Merck(Darmstadt，Germany)、Sigma(S t.Louis，Mo.）またはBio-Rad Laboratories（Richmond，Calif.）から得た。制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素はBoehringerMannheim（Brussels，Belgium）から購入し、製造者の指示に従って使用した。ビシンコニン酸法(Pierce，Rockford, II.)により蛋白濃度を決定した。モノクローナル抗体モノクローナル抗体ＢＡＴＯ２１４をSaavadra et al．(1990)の記載のごとく調製した。抗−ＴＮＦモノクローナル抗体をハイブリドーマ培養上清から得た。ヒト血清この研究に使用した血清試料は、常套的スクリーニングまたはトキソプラズマ症の診断に関する臨床生物学研究室から得た。ＩｇＧおよびＩｇＭに関する免疫蛍光（ＩＦ）（BioMerieux，Brussels）を用いてこれらの試料を試験した。陽性血清には１から９５までの番号を付し、陰性血清には２０６から２５０までの番号を付した。BioMerieuxのToxo-IgG Micro EIA（ＥＬＩＳＡ）を用いてそれらの血清を再試験した。ＩＦＡ試験で矛眉した結果を示した２つの陰性血清を削除した。Biomerieuxの古典的対照試験において得られた血清の反応性を表２に示す。寄生体および溶解物 Saavedra et al(1991)により記載されたようにトキソプラズマ・ゴンジイのＲＨ株およびWiktor株を増殖させた。 λｇｔ１１におけるｃ−ＤＮＡライブラリーの構築、スクリーニングおよびリゾゲン（lysogen）の調製 Saavedra et al(1991)に記載。ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング全イー・コリまたはトキソプラズマ抽出物を、Laemmli(1970)により記載されたようにβ−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２.５％）により分析した。最終的に、炭酸塩バッファー（１０ｍＭＮａＨＣＯ₃、３ｍＭＮａ₂ＣＯ₃、２０％（ｖ／ｖ）エタノール）中におけるウェスタンブロッティング法（Towbin et al.,1979）により蛋白をニトロセルロース膜に移した。ＴＮＴ（１０ｍＭＴｒｉｓ）１５０ｍＭＮａＣｌ、０.０５％（ｖ／ｖ）ツイン２０）中５％脱脂乳で膜１時間飽和させ、次いで、ＴＮＴで２回洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＴＮＴで適当に希釈したモノクローナル抗体または血清とともに膜を９０分インキュベーションした。使用前に氷上で３０分、希釈バッファー(ＴＮＴ＋１％ＢＳＡ)中の１０％イー・コリ溶解物を用いて血清を再吸着させた。ＴＮＴで３回洗浄後、ＡＰ標識ウサギ抗−マウスＩｇＧ抱合体（Dako，Denmark）またはウサギ抗−ヒトＩｇＧ抱合体（Dako，Denmark）を用いてバンドを明らかにした。抱合体を１／２０００希釈した。５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ９.５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂バッファー（Blake et al．1984）中の発色性基質ニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−スフェートを用いることによりＡＰ活性を明かにした。組み換え抗原を用いるＥＬＩＳＡ炭酸塩バッファー０.１ＭｐＨ９.５中（抗原Ｔｇ２０（２μｇ／ｍｌ））またはグリシン−ＨＣｌ０.２ＭｐＨ４中（抗原Ｔｇ３４ＡＲ（６μｇ／ｍｌ））の組み換え抗原溶液（１００μｌ／ウェル）とともに３７℃で１時間インキュベーションすることによりＥＬＩＳＡプレート（Immuno Plate Maxisorp F96;Nu nc,Roskilde，Denmark）をコーティングした。０.１％カゼイン含有リン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ）（３００μｌ／ウェル）とともに３７℃で１時間のインキュベーションにより固相のブロッキングを行った。０.０５％ツイン２０含有ＰＢＳ（洗浄バッファー）で３回洗浄後、試料希釈液（ＰＢＳ＋０.１％カゼイン＋０.０１％トリトンＸ−７０５＋１％イー・コリ溶解物（ｖ／ｖ））中に１／１０００希釈したヒト血清を添加した。インキュベーションを３７℃で１.５時間行った。次いで、細胞を４回洗浄し、ＰＢＳ＋０.１％カゼイン中に１／５０００希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆｃフラグメント）(Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，Md.）とともに３７℃で１時間インキュベーションした。４回洗浄後、Ｈ₂Ｏ₂および３，３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジンを用いてペルオキシダーゼ活性を検出した。３０分後に１００μｌのＨ₂ＳＯ₄を添加することにより反応を停止し、Ｏ.Ｄ.を４０５ｎｍにおいて読んだ。実施例２：クローンＴｇ２０の同定および配列決定 Van Gelder et al．1993に記載のごとく、抗原Ｔｇ３４ＡＲ（Ｔｇ３４（＝ＲＯＰ２）のＣ末端フラグメント）は８９％のトキソプラズマ陽性血清を検出する。実施例１記載の血清試料を用いて抗原Ｔｇ３４ＡＲを再試験し、試験感度７７％を得た（カットオフ値＝陰性血清のＯ.Ｄ.平均値＋３標準偏差（ｓｄ）、血清希釈率１／１００）。Ｔｇ３４ＡＲＥＬＩＳＡから逃れた血清、またはボーダーライン陽性の血清を用いて、ＷＢにおいてヒトおよび／またはネズミ抗−ティー・ゴンジイ抗体のプールと中庸の反応をすると以前記載（Saavedra et al．(1991)）されていた多くのラムダｇｔ１１リゾゲンをスクリーニングした。この方法は、Ｔｇ３４ＡＲに「相捕的」な抗原、すなわち、Ｔｇ３４ＡＲ抗原によって検出され得ない大部分の血清と反応する抗原を発現するクローンの同定を導く。異なるハイブリダイゼーション群に属する下記のλｇｔ１１クローンをスクリーニングのために選択した：Ｔｇ６、Ｔｇ１３、Ｔｇ１８、Ｔｇ１９，Ｔｇ２０、Ｔｇ２７、Ｔｇ３４およびＴｇ４６。クローンのリゾゲンを誘導し、β−ガラクトシダーゼ融合蛋白を産生させ、次いで、上記選択血清を用いるウェスタンブロットで分析した。クローンＴｇ１３、Ｔｇ１９およびＴｇ２７は３つの血清（４、２１，３３番）でのみプローブされた。それらは非常に弱い反応性を示し、それゆえ、さらに分析しなかった。クローンＴｇ６、Ｔｇ１８、Ｔｇ２０，Ｔｇ４６、Ｔｇ４７およびＴｇ３４は４、２１，３３、１７、３９、５３、６８、４５、６３、７９、８３および８７番の血清でプローブされた。１８番の血清を陽性対照（ＥＬＩＳＤＡＴｇ３４ＡＲにおいて高力価）として用いた。クローンＴｇ３４はすでに特徴づけられているクローン（Ｒｏｐ２）であり、Ｔｇ３４ＡＲはそのフラグメントである。クローンＴｇ４７はβ−ガラクトシダーゼのみを生成し、負の対照として使用した。クローンＴｇ２０は１０／１３番の血清と反応し、クローンＴｇ６は８／１３番の血清と反応し、クローンＴｇ４６は３／１３番の血清と反応した。１７、４５および６３番の血清はいずれのクローンとも反応しなかった。これらの結果から、さらなる特徴付けおよび配列決定のためにクローンＴｇ２０を選択した。クローンＴｇ２０中に含まれる１２６０塩基対のＥｃｏＲＩフラグメントを、制限分析および配列決定のためにλｇｔ１１からpBluescript KS+に移した。配列決定を容易にするため、３９９塩基対の５’ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含む１のサブクローンを、同様にpBluescript KS+に連結した。クローンの完全配列を調べるためにプライマーを設計した。配列の各部分を少なくとも両鎖について配列決定した。全ＥｃｏＲＩインサート（１２６０塩基対）の配列を図１（配列番号：１）に示す。７０５塩基対の読み枠（１〜７０５）が同定され、それは理論計算分子量２５６９５ｋＤａの蛋白をコードしており、その配列を図１（配列番号：２）に示す。実施例３：組み換えＴｇ２０抗原のイー・コリ中での発現１.組み換えベクターの構築クローンＴｇ２０の１２６０塩基対のＥｃｏＲＩフラグメントを、発現のためにべクターｐｍＴＮＦＭＰＨ（Innogenetics）に移した。このベクター（図２参照）は、イー・コリ中において短いマウス腫瘍壊死因子（ｍＴＮＦ）との融合蛋白としての組み換え蛋白の発現を可能にする。そのうえ、該ベクターは６個の連続したヒスチジン残基からなるポリヒスチジン配列を融合蛋白に付与し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いる迅速かつ効果的な精製を可能にする。ベクターｐｍＴＮＦＭＰＨをＡｐａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。Ｔｇ２０の１２６０塩基対フラグメントをpBluescript KS＋Ｔｇ２０からＥｃｏＲＩ消化により回収し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼでの両フラグメントの連結によりＴｇ２０のＯＲＦとｍＴＮＦ−ｈｉｓ６リーダーペプチドがインフレームで融合する。この融合蛋白は、リーダーペプチドにより提供される３７個のアミノ酸およびトキソプラズマ遺伝子フラグメントによりコードされる２３５個のアミノ酸を含む。融合蛋白の網衣のさん配列を図４（配列番号：８）に示す。２.組み換えＴｇ２０抗原のイー・コリでの発現発現ベクターpｍＴＮＦＭＰＨ中にクローン化された異種遺伝子の転写は、Ｃ１リプレッサーにより制御される初期左方プロモーター（Ｐ１）により開始される。発現用宿主はイー・コリＭＣ１０６１［ｐＡＣ１］株であり、Ｃ１リプレッサーの温度感受性変種をコードしているＣ１−８５７変異遺伝子を担持する適合プラスミドを含んでいる。これにより、温度を２８℃から４２℃にシフトさせることによる異種遺伝子の発現開始が可能となる。ＭＣ１０６１［ｐＡＣ１］株の細胞を発現プラスミドｐｍＴＮＦＰＨ−Ｔｇ２０で形質転換し、２８℃で増殖させた。一晩培養物を用いて、テトラサイクリン（１０μｌ／ｍｌ）を含有する２５ｍｌのＬＢ培地に接種（１／１００）し、さらにＯ.Ｄ.（６００ｎｍ）が０.２に達するまで２８℃で増殖させた。培養物を等しく２つに分け、その一方を４２℃にシフトさせ、もう一方を２８℃に保った。１.５時間間隔で試料を取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗−ｍＴＮＦモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。融合蛋白ｍＴＮＦＴｇ２０はクーマシーブルー染色ゲル上の約２９ｋＤａに位置で検出可能であった。ウェスタンブロットにより、このバンドの同一性が確認され、それは誘導培養物中にのみ存在した。これらの実験から、当該株の大規模発酵のための条件を決定した（実施例４参照）。３.Ｔｇ２０抗原の特徴付け:モノクローナル抗体との反応および対応天然ティー・ゴンジイ抗原の分子量ｍＴＮＦ.Ｈ６.Ｔｇ２０（組み換えＴｇ２０と略称）を発現する細胞の全細胞溶解物をポリアクリルアミド（ＰＡ）ゲルで泳動し、ニトロセルロース膜に移した。Saavedra et al(1990)により記載された低分子量のティー・ゴンジイ蛋白と反応するモノクローナル抗体のセットを、このＷＢに対してプローブした。モノクローナル抗体ＢＡＴＯ２１４のみが、分子量約２９ｋＤａのこの抗原と反応した。１２.５％ＰＡゲル上で、全トキソプラズマ溶解物および組み換えＴｇ２０を平行して泳動し、ニトロセルロース膜に移した。ブロットをＢＡＴＯ２１４でプローブし、天然に存在するティー・ゴンジイ抗原についての分子量２４ｋＤａが明らかとなったが、一方、組み換え抗原は分子量２９ｋＤａである（図５参照）。組み換え抗原（ｍＴＮＦ）のリーダーペプチドは約２ｋＤａであり、そのことは融合蛋白の大きなサイズを部分的に説明する。さらに、Ｔｇ２０の配列を可能な真核開裂部位（分泌のためのシスナルペプチドの開裂）について分析したところ、３つの開裂部位がアミノ酸位置１７〜１８、２０〜２１および２５〜２６間に見いだされた（図１ｂの矢印参照）。これらの位置の１つでの開裂は組み換え体の分子量を２４、２３.７または２３.３ｋＤａに減少させ、それらは天然ティー・ゴンジイ抗原の分子量に対応するであろう。可能なシグナルペプチド中のシステイン残基の存在により、融合蛋白のダイマー（約５８ｋＤａのバンド参照）の形成を説明することができ、ダイマーは天然に存在する（開裂された）Ｔｇ２０抗原には存在しない。実施例４：組み換えＴｇ２０抗原の精製３時間の誘導時間を用いて１５リットルの発酵を行った。低速遠心分離により細胞を集め、使用までペレットを−７０℃で保存した。細胞ペレットの３分の１（９ｇ）を融解し、３０ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１００ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、２５ｍＭ ε−アミノカプロン酸、１mＭＤＴＴ、１ｍＭＰＭＳＦ）に再懸濁し、フレンチプレスに２回通した。溶解物を４℃において２７０００ｇで３０分遠心分離した。次いで、得られたペレットを２０ｍｌの７Ｍグアニジンクロリド、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７.２で抽出した。抽出物を４℃において２７０００ｇで３０分遠心分離した。得られたペレットを同じバッファー１０ｍｌで再抽出した。両方の抽出物をプールした。製造者の説明のごとくＮｉＣｌ₂で活性化したキレーティングセファロースファストフロー（Pharmacia）を用いてＩＭＡＣカラムを調製し、６Ｍグアニジニウムクロリド、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７.２で平衡化した。プールした細胞抽出物（３０ｍｌ）をカラムに負荷した。ランニングバッファー（６Ｍグアニジニウムクロリド、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７.２）で洗浄後、ランニングバッファー中の３０、６０および１００ｍＭイミダゾールでステップ溶離した。溶離したフラクション（６ｍｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷＢで分析した。１００ｍＭのイミダゾールで溶離するフラクションは組み換えＴｇ２０蛋白を含有し、精製度は約９５％であった。かくして、５リットルの培養物から、２９ｍｌ中３６ｍｇの精製蛋白（１.２５ｍｇ／ｍｌ）が得られ，あるいは培養物１リットルあたり７.２５ｍｇとも表現できる。精製組み換え蛋白は、モノクローマル抗体抗−ｍＴＮＦおよびＢＡＴＯ２１４を用いるＷＢにおいて明確な陽性反応を示し、血清群を用いるＥＬＩＳＡにおいてさらに評価した。実施例５：ＥＬＩＳＡにおける組み換えＴｇ２０の評価１.Ｇ−バンク血清に対するＴｇ２０のＥＬＩＳＡＴｇ２０抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングするための最適条件を、２μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル）およびｐＨ９.５（炭酸塩バッファー）と決定した。血清希釈率は１／１００であり、１％のイー・コリ溶解物を添加して抗−イー・コリ抗体に吸着させた。血清群（９５種の陽性血清および４３種の陰性血清）をＴｇ２０抗原に対して試験した（表２参照）。陰性血清の平均Ｏ.Ｄ.値（ｘ）プラス３標準偏差（ｓｄ）をカットオフ値（ｃ.ｏ.）として計算した。ここに、平均値は個々の値の合計を試料数で割ったものである。ＩＦと比較した場合のアッセイの感度および特異性はそれぞれ７９％および９６％であった。さらにそのうえ、免疫蛍光（ＩＦ）力価およびＴｇ２０ＥＬＩＳＡの感度の間に相関関係が見られた。より詳細には、Ｔｇ２０ＥＬＩＳＡはＩＦ力価〉１／１０２４の血清については１００％の感度を示した。ＩＦ力価１／２５６の血清については感度は８５％であったが、一方、Ｔｇ２０ＥＬＩＳＡの感度は、ＩＦ力価１／６４の血清についてわずか５５％となった。２.Ｇ−バンク血清に対するＴｇ３４ＡＲのＥＬＩＳＡＧ−バンクの血清試料（９５種の陽性および４３種の陰性）についても、血清希釈率は１／１００であることを除いてはVan Gelder et al．(1993)により記載された条件を用いてＥＬＩＳＡＴｇ３４ＡＲにおいて試験した。得られた結果を表２に示す。ＩＦ試験と比較した場合のＴｇ３４ＡＲアッセイの感度および特異性はそれぞれ７７％および９８％であった。さらに、高ＩＦ力価〉１／１０２４の血清については感度が高かった。ＩＦ力価〉１／１０２４の血清はＴｇ３４ＡＲＥＬＩＳＡにおいてすべて陽性（１００％）であったが、ＩＦ力価がそれぞれ１／２５６および１／６４の血清についてはわずか８９％および４１％であった。３.ＥＬＩＳＡならびにＴg３４ＡＲおよびＴg２０の組み合わせ通常には、抗原Ｔｇ３４ＡＲはグリシンバッファーｐＨ４中でコーティングされる（Saavedra et al 1991）。Ｔｇ２０抗原コーティングに最適なバッファーは炭酸塩バッファーｐＨ９.５である。両方の抗原につていくつかのバッファーおよびｐＨを試験し、この実験から、両方の抗原について同時に最良なのは炭酸塩バッファーｐＨ９.５であると決定した。両抗原を炭酸塩バッファーで希釈し、Ｔｇ３４ＡＲについては６μｇ／ｍｌ、Ｔｇ２０については２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。さらに、Ｇ−バンクからの９５種の陽性および４３種の陰性血清を用いてＥＬＩＳＡを試験した。実施例１において説明したように、１％のイー・コリ溶解物を希釈（１／１００）した血清に添加した。個々の血清について得られた結果を表２に示す。ＩＦ試験と比較した場合のこの組み合わせＥＬＩＳＡの感度および特異性はそれぞれ９２.５％および９８％であった。結論として、抗原Ｔｇ３４ＡＲのみの場合は群中の７７％の陽性血清が検出されるといえる。Ｔｇ２０は７９％の陽性血清を検出する。両抗原を組み合わせると９２.５％の陽性血清が検出され、互いに部分的に相捕的である。実施例６：Ｔｇ２０の欠失クローンの生成Ｔｇ２０抗原の最も重要なエピトープの局在化を調べるために、蛋白の一部のみを発現する欠失クローンを作成した。クローンＴｇ２０は位置５８５（ＳｔｙＩ）、４３４（ＮａｅＩ）および２８７（Ａｓｐ７００）に独特な制限部位を有する（図１ａ）。それぞれＢａｍＨＩ−ＳｔｙＩ（ＳｔｙＩ部位を平滑末端化）、ＢａｍＨＩ−ＮａｅＩおよびＢａｍＨＩ−Ａｓｐ７００での消化によりｐｍＴＮＦＭＰＨ.Ｔｇ２０からフラグメントを切り出した。ＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩを用いてフラグメントをベクターｐＩＧＦＨ１１１またはｐＩＧＦＨ１０中に連結した。ベクターｐＩＧＦＨ１１１（図３参照）およびｐＩＧＦＨ１０(Innogenetics N.V.)はｐｍＴＮＦＭＰＨの誘導体であり、同じ基本的性質を有する。それらはポリリンカー配列中に多数の独特な制限部位を有し、高い発現レベルを達成するためにε−エンハンサー配列が挿入されている。プラスミドｐＩＧＦＨ１０は、ｐＩＧＦＨ１０のポリリンカー配列中には独特なＡｐａＩ制限部位がないこと以外はｐＩＧＦＨ１１１と同じである。ｐＩＧＦＨ１１１（およびｐＩＧＦＨ１０）中の異種遺伝子を発現させる理論およびプロトコールはｐｍＴＮＦＭＰＨに関するものと同じである（実施例３において説明）。ＳＧ４０４４［ｐＡＣＩ］株を用いた。３つの異なる制限フラグメントに対応する３つの異なるクローンを、対応抗原フラグメントＴｇ２０ＢＳ（ＢａｍＨＩ−ＳｔｙＩ）、Ｔｇ２０ＢＮ（ＢａｍＨＩ−ＮａｅＩ）およびＴｇ２０ＢＡ（ＢａｍＨＩ−Ａｓｐ７００）の発現について試験した。誘導実験から集めた試料をウェスタンブロットで分析し、抗−マウスＴＮＦモノクローナル抗体およびＢＡＴＯ２１４でプローブした。予想されたサイズにおいて（すなわち、Ｔｇ２０ＢＳは約２５ｋＤａ、Ｔｇ２０ＢＮは約２０ｋＤａ（主要分解バンドは約１５ｋＤａ）そしてＴｇ２０ＢＡは約１４ｋＤａ）、すべての欠失クローンは抗−マウスＴＮＦと反応した。欠失クローンＴｇ２０ＢＳは非常に低い発現レベルであった。Ｔｇ２０ＢＮについては多くの「漏れ」発現、すなわち非許容温度２８℃における発現が観察された。ＢＡＴＯ２１４でプローブした場合、２種の最大欠失クローン、すなわちＴｇ２０ＢＳおよびＴｇ２０ＢＮのみが反応した。このことは、抗原Ｔｇ２０上のＢＡＴＯ２１４エピトープ位置、すなわち図１ｂのアミノ酸位置９５（２８７番目の塩基対）とアミノ酸位置１４５（４３４番目の塩基対）との間をうまく示す。ヒト血清を用いる試験は、ヒト血清の認識に重要な主要エピトープもこの領域に存在することを示す（実施例７および８参照）。クローンＴｇ２０ＢＮおよびＴｇ２０ＢＡをさらに精製し、ＥＬＩＳＡにおいて評価した（実施例７および８参照）。精製を目的とした場合、クローンＴｇ２０ＢＳの発現レベルは低すぎた。実施例７：Ｔｇ２０ＢＮの精製およびＥＬＩＳＡにおける評価１.Ｔｇ２０ＢＮ抗原フラグメントの精製Ｔｇ２０の精製について上で説明したようにＴｇ２０ＢＮを精製したが、若干変更を加えた。１５リットルの発酵を行ったが、増殖および発現を２８℃でのみ行った。２８℃における「漏れ」発現レベルは精製目的には十分であり、４２℃ という高温で見られる組み換え蛋白のより著しい分解が回避される。溶解バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭ ε−アミノカプロン酸）中の１の細胞ペレット（５リットル）をフレンチプレスで溶解後、２ｍＭのＰＭＳＦを添加した。溶解物を遠心分離し、可溶性フラクションを精製に使用した。グアニジニウムクロリド粉末を添加して最終濃度６Ｍとし、溶液を再度遠心分離した。イミダゾールを添加して濃度２０ｍＭとした。２０ｍＭイミダゾールで精製を開始することは、ある程度のイー・コリ夾雑物がカラムに結合するのを防止する。製造者の説明のごとくＮｉＣｌ₂で活性化したキレーティングセファロースファストフロー(Pharmacia)を用いてＩＭＡＣカラムを作成し、ランニングバッファー（６Ｍグアニジニウムクロリド、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７.２）で平衡化した。試料（５０ｍｌ）を負荷し、ランニングバッファーで洗浄後、ランニングバッファー中３５、６０および２００ｍＭのイミダゾールでステップ溶離を行った。溶離フラクション（３ｍｌ）をＷＢおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。２００ｍＭフラクションは組み換え精製蛋白を含んでおり、これは十分に純粋(９５％) であった。３つのフラクション（＝９ｍｌ）をプールし、プールは２３０μｇ／ｍｌのＴｇ２０ＢＮを含んでいた。２.Ｔｇ２０ＢＮでのＥＬＩＳＡ炭酸塩バファー中２μｇ／ｍｌの抗原Ｔｇ２０およびＴｇ２０ＢＮでＥＬＩＳＡプレートを別々にコーティングした。試料希釈物に１％イー・コリ溶解物を添加し、血清を１／１００希釈した。Ｇ−バンクの５０種の陽性（１から５０番まで）および３７種の陰性（２０６から２４５番まで）の血清を試験し、Ｔｇ２０およびＴｇ２０ＢＮに関する結果を比較した（表３参照）。いずれの試験についても、カットオフ値（平均値＋３ｓ.ｄ.）において偽陽性は検出されなかった（特異性１００％）。両アッセイの感度については、Ｔｇ２０抗原全体を用いるＥＬＩＳＡは感度９０％であったが、末端切断蛋白Ｔｇ２０ＢＮは７８％の感度を生じた。Ｔｇ２０ＢＮ−ＥＬＩＳＡから逃れた大部分の血清は、欠失クローンＴｇ２０ＢＮを用いて試験した場合に反応性の明確な低下を示す３５番および４０番の血清を除いては、Ｔｇ２０−ＥＬＩＳＡでは境界線上の陽性である（表３参照）。大多数の血清がやはりＴｇ２０ＢＮ抗原により検出されるので、免疫優性エピトープはＴｇ２０抗原のＮ末端部分（アミノ酸１から１４５まで）に存在すると結論できる。少数の血清（３５番および４０番のごとき）については、Ｃ末端上のエピトープが重要であると思われる。よって、これら２つの血清はＴｇ２０ＢＮＥＬＩＳＡから逃れたが、それらがＴｇ３４ＡＲＥＬＩＳＡにより検出されるということに注意することは重要である（表２参照）。実施例８：Ｔｇ２０ＢＡの精製およびＥＬＩＳＡにおける評価１.Ｔｇ２０ＢＡの精製Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（Qiagen）を用いてＴｇ２０ＢＡのＩＭＡＣ−精製を小規模で行った。ｐＩＧＦＨ１０Ｔｇ２０ＢＡで形質転換された、１００ｍｌのＭＣ１０６１［ｐＡＣＩ］株の培養物を２時間誘導（４２℃）した。細胞を集め、６ＭグアニジニウムＨＣｌ、５０ｍＭリン酸塩ｐＨ８.３中で溶解した（４５分振盪）。遠心分離後、透明溶解物を得て、カラムを同じバッファーで平衡化した後、これをスピンカラムに負荷した。６ＭグアニジニウムＨＣｌ、５０ｍＭリン酸塩バッファーpＨ６.３でカラムを２回洗浄した。６ＭグアニジニウムＨＣｌ、５０ｍＭリン酸塩ｐＨ４.３で溶離を行った。この溶離工程を繰り返した。溶離物をＷＢでチェックした。最初の溶離物は精製組み換え蛋白の大部分を含み、純度９５％である。それは６００μｌ中に２６５μｇを含む。２.Ｔｇ２０ＢＡでのＥＬＩＳＡＧ−バンクからの、Ｔｇ２０ＢＮとの陽性反応を示した３１種の血清（さらに８種の陰性血清を含む）を、より小型のフラグメントＴｇ２０ＢＡについて試験した。これらの血清については、Ｔｇ２０ＢＡはカットオフ値以上の反応を示さなかった（結果を示さず）。このことは、Ｔｇ２０ＢＡフラグメント（アミノ酸位置１からアミノ酸位置９５まで）は、感染個体由来のヒト血清の認識に重要なエピトープを含まないことを示す。抗原フラグメントＴｇ２０ＢＮおよびＴｇ２０ＢＡの異なる反応性より、体液性免疫応答の認識に重要な主要エピトープはアミノ酸位置９５からアミノ酸位置１４５まで伸長しているフラグメント中に存在するか、あるいはこの領域が免疫反応性エピトープの構築に重要であると結論できる。重複した合成ペプチドのセットを用いてさらに精密なエピトープのマッピングを行うことができる。実施例９：ＥＬＩＳＡにおけるＴｇ３４ＡＲおよびＴｇ２０ＢＮの組み合わせ抗原フラグメントＴｇ２０ＢＮをＥＬＩＳＡにおいてＴｇ３４ＡＲと組み合わせて、この組み合わせＥＬＩＳＡの結果をＴｇ２０およびＴｇ３４ＡＲの組み合わせで得られた結果と比較した（表２参照）。さらに、Ｔｇ３４ＡＲのコーティング濃度は６μｇ／ｍｌであり、Ｔｇ２０ＢＮについては２μｇ／ｍｌの濃度を用いた。フルサイズの抗原Ｔｇ２０（Ｔｇ２０＋Ｔｇ３４ＡＲ）を用いる組み合わせＥＬＩＳＡの感度は、抗原フラグメントＴｇ２０ＢＮおよびＴｇ３４ＡＲの組み合わせＥＬＩＳＡ(感度９１.５％)と比較した場合、わずかに高いだけであった（９２.５％）。このことより、Ｔｇ２０抗原の最も重要なＢ細胞エピトープはＴｇ２０ＢＮフラグメント中に存在すると結論できる。実施例１０：ペプチドを用いるＴｇ２０ＢＮ上の優性ヒトエピトープの局在化の検討最も重要なＢ細胞エピトープの局在化を、より正確にはＴｇ２０ＢＮフラグメント中での局在化を調べるために、図１ｂのアミノ酸位置９５からアミノ酸位置１４５まで伸長する配列領域をカバーする一連の重複ペプチドを合成した。合成中のビオチン分子をＮ末端に付加した。ペプチドは１０個のアミノ酸の重複部分を有し、下記配列で示される：１００μｌ／ウェルの炭酸塩バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ9.６）中の５μｇ／ｍｌストレプトアビジン溶液を３７℃で１時間インキュベーションすることにより、マイクロタイタープレートをストレプトアビジンでコーティングする。洗浄後、ビオチン化ペプチドをウェルに添加（１００ｎｇ／ウェル）し、各ウェル（２系）は異なるペプチドを含むようにする。３７℃で１時間ペプチドをストレプトアビジンに結合させ、その後、洗浄する。次いで、実施例１においてＴｇ２０ＥＬＩＳＡについて説明したようにＥＬＩＳＡ手順をさらに続行する。５種のペプチドを２種の陽性ヒト血清（１８、２３）、１種の陰性血清（２１０）、ならびにマウスモノクローナルＢＡＴＯ２１４および無関係なモノクローナル抗体（ＢＡＴＯ３５）について試験した。両方のモノクローナル調合物はマウス腹水由来のもので、希釈率１／２０００であった。モノクローナル抗体とともにＥＬＩＳＡで使用した抱合体はウサギ抗マウス抱合体（Sigma、希釈率１／５０００）であった。ヒト血清を用いた結果は、特に１つの血清がより重要であることは示さず、すべてのペプチドが程度の差こそあれ反応することを示す。モノクローナルＢＡＴＯ２１４は配列番号:３および配列番号:４のペプチドと反応する。このことにより、おそらく、ＢＡＴＯ２１４に対するエピトープはアミノ酸１００ないし１１０の間にあると決定される。上で説明したのと同じように試験されたより小さな重複ペプチド（８量体）のセットを用いて、重要なエピトープを含むと思われるペプチドをさらにマッピグする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 7/08 14/45 14/45 16/20 16/20 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファン・ヘオフェルスウィン，ヒューゴベルギー、ベー―9270カルケン、コルマンストラート80番

Claims

【特許請求の範囲】１．（１）図１ｂ（配列番号：２）に示す配列中のアミノ酸位置ｘからアミノ酸ｙまで伸長しているアミノ酸配列、ここにｘ＝１でありｙ＝１９６、および／またはｘ＝１でありｙ＝１６０、および／またはｘ＝１でありｙ＝１４５、および／またはｘ＝９５でありｙ＝１４５、および／または（２）（１）のいずれかのフラグメントであって、（１）で定義した配列の少なくとも７個の連続したアミノ酸の伸長鎖を含むフラグメント、および／または（３）（１）または（２）の配列中の１個または数個のアミノ酸の置換により生じる（１）または（２）の等価物を含むポリペプチドまたはペプチドであって、ティー・ゴンジイ感染宿主生物の体液性および／または細胞により媒介される免疫応答において重要な反応性エピトープを含むポリペプチドまたはペプチド。２．（１）図１ｂ（配列番号：２）中の位置９５から位置１４５まで伸長しているアミノ酸配列、および／または（２）（１）のフラグメントであって、（１）中の少なくとも７個の連続したアミノ酸の鎖を含むフラグメント、および／または（３）により示されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、および／または（４）（１）、（２）または（３）の配列中の１個または数個のアミノ酸の置換により生じる（１）、（２）または（３）の等価物を含むポリペプチドまたはペプチドであって、ティー・ゴンジイ感染宿主細胞の体液性および／または細胞により媒介される免疫応答において重要な反応性エピトープを含むポリペプチドおよびペプチド。３．異種ポリペプチド配列に連結された請求項１または２記載のポリペプチドまたはそのフラグメントからなる融合蛋白。４．（１）上記ポリペプチドのいずれかをコードしているポリ核酸配列、および／または（２）図１ｂ（配列番号：１）に示すポリ核酸配列の位置ｘから位置ｙまで伸長しているポリ核酸配列、ここにｘ＝１かつｙ＝５８９および／またはｘ＝１かつｙ＝４８０および／またはｘ＝１かつｙ＝４３４および／またはｘ＝２８７かつｙ＝４３４、および／または（３）ポリ核酸配列（１）または（２）についての遺伝学的コードの縮重の結果としてのポリ核酸配列であって、やはり上記ポリペプチドのいずれかをコードしているポリ核酸配列、および／または（４）（１）ないし（３）において定義したポリ核酸配列のいずれかとハイブリダイゼーションするポリ核酸配列、および／または（５）（１）ないし（４）において定義したポリ核酸配列のいずれかのフラグメントであって、（１）ないし（３）において定義したポリ核酸配列のいずれか由来の少なくとも１０個、好ましくは１１、１２、１３、１４、１５個またはそれ以上の連続したヌクレオチドの鎖を含むフラグメントを含むポリ核酸。５．請求項４において定義したポリ核酸配列のいずれかの一部を形成する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを配列中に含むオリゴヌクレオチドであって、請求項４において定義したポリ核酸のいずれかを検出するための特異的ハイブリダイゼーションプローブとして、あるいは請求項４において定義されたポリ核酸配列のいずれかを特異的に増幅するためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチド。６．請求項４のポリ核酸またはそのフラグメントの配列ならびに異種ポリ核酸配列を配列中に含む組み換えポリ核酸。７．クローニングおよび／または発現目的で請求項４において定義されたポリ核酸の１つが挿入されている組み換えベクター。８.請求項１または２のポリペプチドのいずれかに関するコーディング配列が、特定の宿主による該コーディング配列の発現を提供しうる制御配列に作動可能に連結されている、請求項７記載の組み換えベクター。９．請求項７または８記載の組み換えベクターで形質転換された宿主細胞。１０．請求項４記載のポリ核酸の少なくとも一部によりコードされる組み換えポリペプチドであって、請求項７または８記載の組み換えベクターを適当な宿主中に入れて形質転換し、コードされているポリペプチドを発現させ、可能には分泌することを可能にする条件下で該形質転換細胞宿主を培養し、次いで、発現されたポリペプチドを培養物から回収することにより製造される組み換えポリペプチド。１1．請求項１または２において定義したポリペプチドと特異的に反応しうるモノクローナルまたはポリクローナル抗体であって、モノクローナル抗体ＢＡＴＯ２１４とは異なる抗体。１２．インビボで感染するトキソプラズマ・ゴンジイによる特定細胞タイプの感染を抑制しうるという点においてさらに特徴づけられる、請求項１１記載の抗体またはそれに由来する抗原結合フラグメントまたは組み換え抗体。１３.請求項１１または１２記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。１４．請求項１１または１２記載のモノクローナル抗体に対して生成する抗− イディオタイプ抗体。１５．請求項１または２のポリペプチド由来のアンチセンスペプチド。１６．生物学的試料中に存在するティー・ゴンジイに対する抗体を検出する方法であって、 −免疫学的複合体の形成を可能にする条件下で、分析すべき生物学的試料を請求項１、２または１０のいずれかに記載の少なくとも１つのポリペプチドまたはペプチドと接触させ、 −該抗体と該ポリペプチドとの間に形成された免疫学的複合体を検出することを含む方法。１７．生物学的試料中に存在するティー・ゴンジイ抗原を検出する方法であって、 −免疫学的複合体の形成を可能にする条件下で、分析すべき生物学的試料を請求項１１または１２記載の少なくとも１つの抗体と接触させ、 −該抗体と該抗原との間に形成された免疫学的複合体を検出することを含む方法。１８．生物学的試料中に存在するティー・ゴンジイのポリ核酸を検出する方法であって、ａ．特異的ハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にする条件下で、分析すべき生物学的試料を請求項５記載の少なくとも１つのプローブと接触させ（可能には、該試料の該核酸は該プローブとのハイブリダイゼーション前に増幅されている）、あるいはｂ．特異的ハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にする条件下で、分析すべき生物学的試料を請求項５記載の少なくとも１つのプライマーと接触させ、次いでｃ．工程ｂで生成した特異的に増幅されたポリ核酸、またはａにおいて特異的にハイブリダイゼーションするポリ核酸を検出することを含む方法。１９．ティー・ゴンジイ病原体と接触した個体における細胞性免疫応答を測定するために、さらに他のティー・ゴンジイのポリペプチドまたはペプチドを含む請求項１６記載の方法（該細胞性免疫応答はインビボまたはインビトロで測定される）。２０．請求項１６または１９記載の方法に従って試料中の抗−ティー・ゴンジイ抗体を検出するためのキットであって、 −所望によりティー・ゴンジイ由来の他のポリペプチドまたはペプチドと組み合わされていてもよい請求項１、２または１０のいずれかに記載の少なくとも１つのティー・ゴンジイのポリペプチドまたはペプチド（好ましくは、該ポリペプチドまたはペプチドはすべて固体支持体に固定化される）、 −所望により、抗体と該試料中に存在する抗原との間の結合反応を可能にするバッファー、またはバッファーを作成するのに必要な成分、 −所望により、形成された免疫複合体を検出する手段、 −所望により、該試料中の該抗体の存在を推断するための自動スキャンニングおよび解析デバイスを含むキット。２１．請求項１７の方法に従って試料中のティー・ゴンジイ抗原を検出するためのキットであって、 −請求項１１または１２記載の少なくとも１つの抗体（好ましくは、該抗体は固体支持体に結合される）、 −所望により、ポリペプチドと該試料中に存在する抗体との間の結合反応を可能にするバッファー、またはバッファーを作成するのに必要な成分、 −所望により、形成された免疫複合体を検出する手段、 −所望により、該試料中の該抗原の存在を推断するための自動スキャンニングおよび解析デバイスを含むキット。２２．請求項１７の方法に従ってティー・ゴンジイのポリ核酸を検出するためのキットであって、 −請求項４記載のティー・ゴンジイポリ核酸の少なくとも１つ、より詳細には請求項５記載のプローブまたはプライマーのいずれか（好ましくは、該プローブは固体支持体上に固定化される）、 −所望により、該ポリ核酸と該プローブもしくは該プライマーとの間のハイブリダイゼーション反応を可能にするバッファー、またはバッファーを作成するのに必要な成分、 −所望により、形成されたポリ核酸複合体を検出する手段、 −所望により、該試料中の該ポリ核酸の存在を推断するための自動スキャンニングおよび解析デバイスを含むキット。２３．ティー・ゴンジイ以外の他の病原体と特異的に反応しうるポリペプチド、抗体またはポリ核酸を含めることによりティー・ゴンジイ以外の他の病原体の検出を可能にすることをさらに特徴とする、請求項２０ないし２２のいずれかに記載のキット。２４．有効成分として請求項１、２または１０のいずれかに記載の１つまたはそれ以上のティー・ゴンジイのポリペプチド、または請求項４、６、７または８記載の１つまたはそれ以上のポリ核酸配列または組み換えベクター、および該有効成分と混合される医薬上許容される担体を含む、哺乳動物におけるティー・ゴンジイ感染に対して防御免疫を提供するワクチン組成物。２５．さらに他のトキソプラズマ免疫原成分または他の細菌または他の免疫原成分が含まれている、請求項２４記載のワクチン組成物。２６．有効成分として請求項４記載の１つまたはそれ以上のティー・ゴンジイのポリ核酸またはその一部を裸のＤＮＡとして、あるいは請求項７または８記載の組み換えベクターの一部を含み、そのことにより接種すべき個体に投与される該ポリ核酸がin situで発現されて免疫原蛋白またはペプチドとなり、かくして接種された宿主に防御を付与するものである、哺乳動物におけるティー・ゴンジイ感染に対して防御免疫を提供するワクチン組成物。２７．医薬として使用される請求項１または２または１０記載のポリペプチド。２８．医薬として使用される請求項４、５または６記載のポリ核酸。２９．医薬として使用される請求項１１または１２記載の抗体。