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JP3189000B2 - 特定核酸配列の検出方法 - Google Patents

特定核酸配列の検出方法

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JP3189000B2
JP3189000B2 JP18559995A JP18559995A JP3189000B2 JP 3189000 B2 JP3189000 B2 JP 3189000B2 JP 18559995 A JP18559995 A JP 18559995A JP 18559995 A JP18559995 A JP 18559995A JP 3189000 B2 JP3189000 B2 JP 3189000B2
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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子混合物が存在す
ると予想される試料の中に含まれる、特定の核酸配列を
有する核酸（標的核酸）の検出方法に関するものであ
る。従って本発明は、遺伝子診断、有用遺伝子のクロー
ニング、未知遺伝子の探索等の分野で利用される。また
本発明は、核酸増幅工程における反応条件の最適化を行
う方法としても利用される。
【０００２】
【従来の技術】標的核酸の検出及び定量には、標的核酸
がその中の特定核酸配列、即ち特定の核酸塩基配列と相
補的な配列を有する核酸プローブと相補結合を形成する
性質が利用されている。
【０００３】従来、相互に標的核酸の異なる部位の特定
核酸配列に対して相補結合を形成し得る配列からなる２
種類の核酸プローブを用い、これら核酸プロ−ブで標的
核酸を挟み込む、いわゆるサンドイッチアッセイと呼ば
れる方法が知られている。この方法では、第１の核酸プ
ローブは不溶性担体に固定化されており、一方第２の核
酸プローブは、その一部に可視部に色を持つ色素や蛍光
物質、あるいはそれらを生成し得る酵素で標識されてお
り、試料にこれらの核酸プローブを添加することによっ
て試料中の標的核酸は第１及び第２の核酸プローブと相
補結合し、この結果、これら三者からなる複合体が不溶
性担体上に形成される。複合体の形成に引き続き、反応
液中の上清と不溶性担体とを濾別し、少なくとも上記複
合体の形成に関与しなかった未反応の第２の核酸プロー
ブを試料反応液から除去する（いわゆるＢ／Ｆ分離工
程）。しかる後に、不溶性担体上の複合体の標識物質を
測定することにより、試料中の標的核酸の有無及びその
量が決定される。
【０００４】尚、可視部に色を持つ色素や蛍光物質を生
成し得る酵素を第２の核酸プローブの標識物質として用
いた場合は、上記複合体形成工程及び未反応第２核酸プ
ローブの除去工程の後、それらの前駆体である酵素基質
を反応液に添加し、その反応産物である色素や蛍光物質
等を測定することにより試料中の標的核酸の有無及びそ
の量が決定される。
【０００５】この方法では、不溶性担体を利用すること
から、第２の核酸プローブがこの不溶性担体に非特異的
に吸着してしまい、不溶性担体上の複合体中の標識物質
を測定する段階で、この不溶性担体上に非特異的に吸着
した第２の核酸プローブに由来する信号が測定結果に紛
れ込み、試料中の標的核酸の有無及びその量の決定結果
に誤差を生じ、正しい判定が困難になるという問題が生
じる。
【０００６】そこで従来は、この問題を回避する目的
で、使用する不溶性担体表面の親水化処理や蛋白質等に
よる担体表面の吸着点のブロッキング処理、更にはＢ／
Ｆ分離工程に続いて不溶性担体を十分洗浄する、等によ
る非特異的吸着の低減が試みられている。
【０００７】
【発明が解決しようする課題】しかしながら、例えばＢ
／Ｆ分離工程において不溶性担体の洗浄回数を増やす等
の対処ではこれに要する時間が長くなり、また例えば洗
浄液に界面活性剤を用いて洗浄効率を高める等の対処で
は担体上に形成された複合体の分解を促す可能性を生じ
るため、現実的には困難である。
【０００８】一方、担体表面を化学的に親水化処理する
こと等は、担体の材質にも依存し技術的に必ずしも容易
ではない。更に担体表面を蛋白質等により被覆して吸着
点を予めブロッキングする方法では、その蛋白質が第２
の核酸プローブやその標識物質と相互作用し、新たな非
特異的な吸着を招いてしまう恐れもある。
【０００９】このように、いわゆるサンドイッチアッセ
イでは、標的核酸を特異的に捕捉する目的で核酸プロー
ブを固定化した不溶性担体を使用するが、これが試料中
の標的核酸の検出及び定量を精度良く達成する上で、基
本的課題を生み出している。そこで、このような担体を
使用しない、均一系での一段階の検出法の開発が近年求
められている。
【００１０】一方、近年ポリメレースチェインリアクシ
ョン（ＰＣＲ）法（特公平４−６７９５７号公報、特公
平４−６７９６０号公報）が開発され、試験管内条件下
で核酸を増幅することが可能となっている。
【００１１】そこで、ＰＣＲ法を用いて試料中の標的核
酸の特定の領域を増幅し、その後、増幅反応液等を試料
として前記のサンドイッチアッセイを行い、増幅産物の
測定を通して増幅前の試料中の標的核酸の有無及び量を
検出ことが提案されている。しかしながら、この方法に
おいても、既に説明したようなサンドイッチアッセイに
おいて見受けられる基本的課題を解決し得るものではな
く、精度の高い測定は難しい。
【００１２】また、ＰＣＲ法による標的核酸の増幅の
後、特定配列部分に相補的な配列を有する核酸プローブ
を増幅反応液等に添加し、標的核酸と核酸プローブが相
補結合を形成する条件下においた後、形成された複合体
を電気泳動法等によって未反応の核酸プローブから分離
し、更にその後、核酸プロ−ブの標識物質を測定するこ
とによって増幅後の増幅産物の分析を行い、その結果か
ら増幅前の試料中の標的核酸の有無及ぶ量を決定する方
法も提案されている。
【００１３】しかしながら、このようなＰＣＲ法による
増幅工程を含む標的核酸の測定法においては、いずれも
ＰＣＲ法による増幅工程の後に増幅された試料を反応容
器等から取り出す必要があり、効率性や経済性が要求さ
れる臨床診断の現場に新たな労力と分析時間を要求する
ばかりか、更にはＰＣＲ法の実際的な応用における課題
とされている、増幅産物の飛散（エアロゾルによる）に
由来する擬陽性の惹起という深刻な課題を引き起こす恐
れがある。
【００１４】本出願人は、このような状況の中で、ＰＣ
Ｒ法による増幅産物が二本鎖ＤＮＡであることから、二
本鎖核酸にインターカレーションすることで蛍光強度を
増大する等の性質を有するインターカレーター性蛍光色
素を用い、これをＰＣＲ法によって標的核酸の特定領域
の増幅を開始する前に試料溶液に添加し、反応溶液の蛍
光強度を経時的に測定することによって増幅前の標的核
酸の有無及び量を決定する方法を創作した（特開平５−
２３７０００号公報）。この方法によれば、用いるイン
ターカレーター性蛍光色素の励起波長及び蛍光波長にお
いて光学的に透明な材質からなる反応容器を使用すれ
ば、密閉した反応容器内部の反応液の蛍光強度の測定か
らＰＣＲの進行を追跡することが可能となり、いちいち
試料容器内部から反応液を採取して分析する必要がな
く、増幅産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題
を回避することが可能となる。
【００１５】本出願人が創作した上記方法は、担体を必
要としない均一系での一段階の分析法として優れた特徴
を有するが、インターカレーター性蛍光色素が２本鎖核
酸に非特異的にインターカレーションすることに由来す
る、新たな課題も内包している。すなわち、試料中に標
的核酸以外の、例えば大量のゲノムＤＮＡが混在する場
合には、インターカレーター性蛍光色素がこれらにイン
ターカレーションすることにより大きなバックグラウン
ド蛍光が生じ、標的核酸の増幅に由来する蛍光強度の増
大を充分な精度で測定することが困難となり得る。
【００１６】またＰＣＲ法では、標的核酸の配列に相補
的な一対の核酸を伸張反応用のプライマーとして使用す
るが、プライマ−の核酸配列の選択によってはそれらが
相互に相補結合してしまい、互いに他方のプライマーを
鋳型としてプライマーダイマーが生産されることがあ
る。インターカレーター性蛍光色素は、プライマーダイ
マーへも非特異的にインターカレーションすることか
ら、これに由来するバックグラウンド蛍光の増加が、本
来目標とする標的核酸の増幅にもとづく蛍光強度の変化
を経時的に追跡していく上で、大きな障害となる恐れも
ある。
【００１７】そこで、この解決策として、上記のインタ
ーカレーター性蛍光色素に特定の核酸配列を認識し得る
特異性を付与することが求められることとなる。
【００１８】本発明は、以上に述べた従来技術が内包す
る課題を解決すべくなされたものであり、その目的は試
料の中に含まれる少なくとも一つの特定の核酸配列を有
する核酸（標的核酸）について、従来のサンドイッチア
ッセイ等における相補結合に寄与しなかった余剰の標識
された核酸プローブの分離やＰＣＲ法による増幅におけ
るバックグラウンド蛍光等の増加を生じることなしに、
従ってその存在の有無及び量を高精度に決定することを
可能とする、均一系での簡便な一段階の検出方法であっ
て、遺伝子診断、有用遺伝子のクローニング、未知遺伝
子の探索等の分野、あるいは核酸増幅工程における反応
条件の最適化を行うための方法を提供することにある。
【００１９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる目
的を実現すべく鋭意研究を行った結果、本発明を完成す
るに至った。即ち本発明は、試料の中に含まれる少なく
とも一つの特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）を
測定する方法であって、標的核酸の前記特定核酸配列に
相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを
プローブとして用い、そのプローブを試料に添加し標的
核酸と相補結合を形成させる工程を含む方法において、
前記プローブがインターカレーター性蛍光色素で標識さ
れた一本鎖オリゴヌクレオチドであって、該インターカ
レーター性蛍光色素が標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオ
チドプロ−ブの相補結合部分にインターカレーションす
るものであることを特徴とする特定核酸配列の検出方法
である。
【００２０】また標的核酸が二本鎖核酸である場合にも
核酸プロ−ブはこれと相補結合して三重鎖核酸を形成し
得ることから、本発明は更に、試料の中に含まれる少な
くとも一つの特定の核酸配列を有する二本鎖核酸（標的
核酸）を測定する方法であって、標的核酸の前記特定核
酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレ
オチドをプローブとして用い、そのプローブを試料に添
加し標的核酸と三重鎖核酸を形成させる工程を含む方法
において、前記プローブがインターカレーター性蛍光色
素で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、該
インターカレーター性蛍光色素が標的核酸と一本鎖オリ
ゴヌクレオチドプロ−ブにより形成される三重鎖部分に
インターカレーションするものであることを特徴とする
特定核酸配列の検出方法である。
【００２１】次に本発明は、特定の核酸配列を有する核
酸（標的核酸）中の該特定核酸配列に相補的な核酸配列
を有する一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブ及びインタ
ーカレーター性蛍光色素からなる、標的核酸検出用の標
識核酸プロ−ブであって、インターカレーター性蛍光色
素は、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブと
の相補結合により形成される相補結合部分又は二本鎖標
的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブとにより形
成される三重鎖部分部分にインターカレーションし得る
ように一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブに結合されて
いることを特徴とする標識核酸プロ−ブである。
【００２２】また本発明は、試料の中に含まれる少なく
とも一つの特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）を
測定するために少なくとも当該特定の核酸配列部分を、
例えばポリメラ−ゼチェ−ンリアクション（ＰＣＲ）法
等により増幅する工程を含む方法であって、標的核酸の
前記特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オ
リゴヌクレオチドをプローブとして用い、そのプローブ
を試料に添加し標的核酸と相補結合を形成させる工程を
含む方法において、前記プローブがインターカレーター
性蛍光色素で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであ
って、該インターカレーター性蛍光色素が標的核酸と一
本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブの相補結合部分にイン
ターカレーションするものであることを特徴とする特定
核酸配列の検出方法である。
【００２３】更に本発明は、上述の通り標的核酸が二本
鎖核酸である場合にも核酸プロ−ブはこれと相補結合し
て三重鎖核酸を形成し得ることから、試料の中に含まれ
る少なくとも一つの特定の核酸配列を有する二本鎖核酸
（標的核酸）を測定するために少なくとも当該特定の核
酸配列部分を、例えばポリメラ−ゼチェ−ンリアクショ
ン（ＰＣＲ）法等により増幅する工程を含む方法であっ
て、標的核酸の前記特定核酸配列に相補的な核酸配列を
有する一本鎖オリゴヌクレオチドをプローブとして用
い、そのプローブを試料に添加し標的核酸と相補結合を
形成させる工程を含む方法において、前記プローブがイ
ンターカレーター性蛍光色素で標識された一本鎖オリゴ
ヌクレオチドであって、該インターカレーター性蛍光色
素が標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブの三
重鎖部分にインターカレーションするものであることを
特徴とする特定核酸配列の検出方法である。以下本発明
を詳細に説明する。
【００２４】本発明は、従来知られていない核酸プロ−
ブを使用することにより従来のサンドイッチアッセイ等
における相補結合に寄与しなかった余剰の標識された核
酸プローブの分離を不要とし、又例えばＰＣＲ法等によ
る増幅におけるバックグラウンド蛍光等の増加を生じる
ことなく標的核酸の検出を可能とするものである。即ち
本発明の標識核酸プロ−ブは、標的核酸との親和性を有
する一本鎖オリゴヌクレオチド部分、インタ−カレ−タ
−性蛍光色素からなる標識部分及び必要に応じてこれら
を結合するリンカ−部分からなり、インタ−カレ−タ−
性蛍光色素が標的核酸とプロ−ブにより形成される相補
結合部分又は三重鎖部分にインターカレーションし、更
にその蛍光特性が変化することから、その蛍光特性の変
化から試料中に含まれていた特定の配列からなる核酸の
存在の有無及びその量を定めることを可能とするもので
ある。
【００２５】本発明により提供される標的核酸検出用の
標識核酸プロ−ブは、一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−
ブとインタ−カレ−タ−性蛍光色素を含むものである。
該一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブは、標的核酸中の
特定の核酸配列に完全に相補的な核酸配列を有すること
が好ましいが、一部に塩基のミスマッチがあってもその
特異性及び相補性に支障のない範囲であれば制限はな
い。特定の核酸配列は、例えば１０〜３０塩基程度、好
ましくは１５〜２５塩基程度の一連の塩基配列であっ
て、標的核酸を他の核酸から識別し得るような他の核酸
中には見出だされないものであることが特に好ましい
が、標的核酸のみに存在するような配列である必要は必
ずしもなく、試料中に存在することが予想される他の核
酸との関係で充分に特異的な配列であれば良い。従って
本発明の標識核酸プロ−ブは、上述の特定の核酸配列に
対応して１０〜３０塩基、特に好ましくは１５〜２５塩
基程度の配列を有するものを標的核酸との関連で適宜選
択して使用すれば良い。なお、二本鎖核酸に対してもオ
リゴヌクレオチドプロ−ブが相補結合し得ることを利用
して、本発明を二本鎖標的核酸の検出に適用する場合に
おいては、当該二本鎖核酸のいずれかが特定の核酸配列
を有していれば良い。また本発明において、複数の特定
の核酸配列を設定し、それに対応する複数の標識核酸プ
ロ−ブを使用することも当然に可能である。
【００２６】インターカレーター性蛍光色素は、二本鎖
又は三本鎖核酸にインターカレーションし、インタ−カ
レ−ションによって遊離状態とは蛍光特性が変化する物
質であれば特に制限はない。本発明においては、インタ
ーカレーションにより例えば主としてその蛍光強度が著
しく増加又は減少するアクリジンオレンジ、チアゾール
オレンジ、オキサゾールイエロー等、主として励起光の
吸収スペクトルのピ−ク波長のみが変化するもの、主と
して放射光スペクトルのピ−ク波長のみが変化するビス
ベンチミド等又は主として励起光の吸収スペクトルと放
射光スペクトルのピ−ク波長の両者が変化するもの等、
種々のインタ−カレ−タ−性蛍光色素を使用することが
できるが、検出の容易性等の観点からインターカレーシ
ョンによりその蛍光強度が著しく増加するものが特に好
ましく使用される。このような特に好ましいインタ−カ
レ−タ−性蛍光色素として、例えば、チアゾールオレン
ジやオキサゾールイエローを例示することができる。
【００２７】インタ−カレ−タ−性蛍光色素は、例えば
共有結合によって前述の一本鎖オリゴヌクレオチドプロ
−ブと結合される。この場合、適当な分子長のリンカー
を介して結合しても良い。リンカーとしては、インタ−
カレ−タ−性蛍光色素が一本鎖オリゴヌクレオチドプロ
−ブと標的核酸により形成される相補結合部分、又標的
核酸が二本鎖核酸である場合にはこれらにより形成され
る三重鎖部分にインタ−カレ−トすることを妨げない分
子であれば特に制限はない。結合のための操作の容易性
等の観点から、両末端に官能基を有する二官能性炭化水
素を用いることが好適な一例として例示できる。また、
市販の試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍ
ｏｄｉｆｉｅｒ）等を使用することもできる。
【００２８】本発明の標識核酸プロ−ブは、二本鎖の標
的核酸を検出するために用いることも可能である。この
場合、核酸プロ−ブは二本鎖核酸の一方の核酸が有する
特定核酸配列と特異的に相補結合し、この結果、少なく
とも一部分が三重鎖状態の核酸が生じることになる。こ
の場合インタ−カレ−タ−性蛍光色素は、核酸プロ−ブ
と特定核酸配列を有する核酸とにより形成される相補結
合部分のみならず、標的核酸が形成している相補結合部
分にもインタ−カレ−トするため、このような場合には
前記リンカ−として、比較的長めの分子長を有するもの
を使用することが好ましい。
【００２９】インターカレーター性蛍光色素の一本鎖オ
リゴヌクレオチドプロ−ブとの結合部位は、インタ−カ
レ−タ−性蛍光色素のインターカレーション及び標識核
酸プロ−ブの標的核酸への相補結合を妨げない部位であ
れば制限はなく、プロ−ブの５´末端、３´末端又は中
央部分のいずれであっても良いが、特に５´末端又は３
´末端が好ましい。後に説明するように、本発明の標識
核酸プロ−ブを共存させた状態でＰＣＲ法を実施する場
合において、核酸プロ−ブをＰＣＲにおけるプライマ−
として機能させる場合には、ＤＮＡ合成酵素による核酸
の伸長反応を阻害しないようにインタ−カレ−タ−性蛍
光色素を５´末端に結合させることが好ましい。
【００３０】このように調製された本発明の標識核酸プ
ロ−ブは、標的核酸と相補結合を形成すると結合されて
いるインターカレーター性蛍光色素が相補結合部分又は
三重鎖部分にインタ−カレ−トすることで、蛍光強度が
増加等することから、相補結合に寄与しなかった余剰の
プローブを分離する工程を必要とせずに、その相補結合
の形成の有無の検出及び形成された相補結合体の定量が
可能となる。従って本発明の標識プロ−ブによれば、特
定の核酸配列を有する標的核酸の均一系での簡便な一段
階の検出方法を実施することが可能となる。
【００３１】以上のような特質を有する本発明の標識プ
ロ−ブは、例えば不溶性担体を用いる従来のサンドイッ
チアッセイ等に使用することによっても余剰プローブの
分離工程を排除し得る等、充分に効果的である。しか
し、標的核酸の均一系での簡便な一段階の検出方法を可
能とする本発明の標的プロ−ブによれば、これまで説明
してきたように、単に試料にこれを添加するのみで標的
核酸を検出することが可能である。
【００３２】また本発明は、標的核酸を測定するために
少なくともその中の特定核酸配列部分を例えばＰＣＲ法
等で増幅する工程を含む方法であって、標的核酸の特定
核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌク
レオチドをプローブとして用い、そのプローブを試料に
添加し標的核酸と相補結合を形成させる工程を含む方法
における標識核酸プロ−ブの使用をも提供する。ＰＣＲ
法等によれば試料中の微量の標的核酸を数千倍以上に増
幅し得るため、通常の方法（ＰＣＲ法等を利用しない方
法）では検出し得ない標的核酸の存在の有無の検出及び
形成された相補結合体の定量が可能となる。特にヒト免
疫不全ウイルスやＣ型肝炎等の病原ウイルスに由来する
微量核酸の検出に対しては、ＰＣＲ法を利用する本発明
の検出方法を適用することが好ましい。
【００３３】以下、標的核酸をＰＣＲ法で増幅する工程
を含む方法に対する本発明の適用を詳細の述べるが、標
的核酸を増幅する工程はＰＣＲ法に限定されず、その他
に例えばＬＣＲ法等も例示することができる。また例え
ば、標的核酸を適当な細胞に導入してｍＲＮＡを発現さ
せるような操作も、実質的には標的核酸を増幅する工程
と見なすことができる。従って、これらの操作において
も下記のごとく本発明を適用することが可能である。
【００３４】ＰＣＲ法の操作自体については、例えば前
述の特公平４−６７９５７号公報や特公平４−６７９６
０号公報等を参照して実施することができる。
【００３５】ＰＣＲ法を利用する本発明の検出方法にお
いては、本発明の標的核酸プロ−ブをＰＣＲ法による特
定の核酸配列部分の増幅工程に先だって試料に添加し、
プロ−ブの共存下、例えばプロ−ブ中のインターカレー
ター性蛍光色素の励起波長及び蛍光波長において光学的
に透明な材質からなる密閉可能な反応容器中で温度サイ
クリング等によるＰＣＲ工程を行えば、密閉した反応容
器内部の反応液の蛍光強度から標的核酸の増幅されてい
く様子を経時的に追跡し、かつ、標的核酸の存在の有無
の検出及び形成された相補結合体の定量が可能である。
従って、いちいち試料容器内部から反応液を採取して分
析する必要がなく増幅産物の飛散に由来する擬陽性の惹
起という課題をも回避可能である。
【００３６】ＰＣＲ法を利用する本発明の標的核酸の検
出方法においては、標識核酸プロ−ブをＰＣＲにおける
プライマ−として使用することができる。従って、標識
核酸プロ−ブさえ調製しておけば、同一標的核酸の検出
に際してはＰＣＲ法を利用した検出とＰＣＲを利用しな
い検出を任意に選択して実施することが可能である。ま
た、ＰＣＲ法を利用する本発明の標的核酸の検出方法に
おいて、標識核酸プロ−ブをＰＣＲにおけるプライマ−
として使用しない場合には、標識核酸プロ−ブをプライ
マ−として機能しないように、即ち、ＤＮＡ合成酵素に
よる核酸の伸長反応の進行を阻害するように修飾してお
けば良い。例えば、インタ−カレ−タ−性蛍光色素の結
合部位をＰＣＲにおける伸長反応の進行方向である３´
末端に導入したり、３´末端に適当な化学的修飾を施し
たりして前記伸長反応が生じないようにすれば良い。な
かでも、標識核酸プロ−ブの３´末端に、意図的に標的
核酸とは相補結合を生じない塩基を導入する方法が簡便
で好ましい。この場合、相補結合を生じない塩基は１塩
基以上導入すれば充分である。
【００３７】更に、本発明の標識核酸プロ−ブを用いれ
ば、ＰＣＲ法による核酸の増幅工程に関する至適サイク
ル数等の反応条件を最適化することも容易に実施でき
る。また本発明の標識核酸プロ−ブを利用することによ
り、核酸配列に生じた突然変異等の塩基の変異の存在を
検出することも可能である。即ち本発明の標識核酸は、
特に一本鎖の標的核酸と容易に相補結合し、これにより
標識物質であるインタ−カレ−タ−性蛍光色素の蛍光特
性が変化するため、突然変異等を生じていない場合に当
該蛍光特性の変化が認められる温度等と比較して低温で
蛍光特性の変化が認められれば、その対象となった核酸
中には突然変異等が生じており、その結果これが形成す
る二本鎖核酸の安定性が変化していることになる。また
例えば、任意温度における前記蛍光特性の変化の度合い
を測定し、これを比較することでもその対象となった核
酸中に突然変異等が生じているか否かを知ることができ
る。この場合には、例えば二本鎖核酸のうち５０％が一
本鎖に分離する温度（Ｔｍ）における前記蛍光特性の変
化の割合等を目安とする方法が特に好ましく例示でき
る。
【００３８】
【実施例】以下本発明を実施例により更に詳細に説明す
るが、これら実施例は本発明の一例であり、本発明を限
定するものではない。
【００３９】実施例１ 標識核酸プロ−ブの調製 以下のようにして本発明の核酸プローブを調製した。下
記式の化合物１（７．５６ｇ、５０ｍｍｏｌ）、ヨウ化
メチル（６．２５ｍｌ、１００ｍｍｏｌ）、炭酸カリウ
ム（３．８２ｇ、１００ｍｍｏｌ）及びアセトン（５０
０ｍｌ）の混合物を２時間リフレックス（ｒｅｆｌｕ
ｘ）し、反応混合物を室温で放冷した。その後不溶物を
濾別し、濾液を減圧濃縮した。残査に塩化メチレンを加
え不溶物を濾過により除去し、濾液を減圧濃縮した後、
蒸留により黄色油状物（下記式の化合物２）を６．８３
ｇ得た。収率は８２．３％であった。化合物２は、1Ｈ
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）でδ２．７３にδＣＨ3基のシグ
ナルを示した。
【００４０】
【化１】
【００４１】下記式の化合物３（０．８５６ｇ、５．９
８ｍｍｏｌ）及び１，３−ジヨ−ドプロパン（５．３８
ｇ、２９．９ｍｍｏｌ）を１１０℃にて２０分間加熱し
た。反応混合物を室温まで放冷した後、ヘキサン及びエ
−テルの混合液を加え、析出した黄色固体（下記式の化
合物４）を濾過により集め、２．３６ｇ得た。収率は９
６．７％であった。化合物４は、1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3）でδ２．６７、δ３．４６及びδ５．４５に−Ｃ
Ｈ2ＣＨ2ＣＨ2Ｉの３つのメチレン基のシグナル及びδ
３．０３にＣＨ3基のシグナルを示した。
【００４２】
【化２】
【００４３】前記化合物２（９９０ｍｇ、６ｍｍｏｌ）
にパラトルエンスルホン酸メチル（１１１６ｍｇ、６ｍ
ｍｏｌ）を加え、１１０℃にて５時間加熱した。これに
より下記式の化合物７が生じた反応容器を室温まで放冷
した後、前記化合物４（２６．３４ｍｇ、７．５ｍｍｏ
ｌ）を加え、９０℃にて１時間リフレックス（ｒｅｆｌ
ｕｘ）した。この後、反応溶液を室温まで放冷し、不溶
物を濾過により除去し、濾液を減圧濃縮した。残査にメ
タノ−ルを加えて析出した黄色固体（下記式の化合物
８）を濾過により集め、５１２ｍｇ得た。収率は２９．
９％であった。また化合物８はＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／Ｃ
Ｄ3ＯＤ）でδ５．９５にメチンの特徴的なシグナルを
示した。
【００４４】
【化３】
【００４５】一方、リンカ−として市販のリンカ−（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｃ6−ＴｈｉｏｌＭｏｄｉｆｉｅ
ｒ、カタログ＃５２１１−１）を、プロ−ブ用のオリゴ
ヌクレオチドとしてＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、３９１ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した、（５´）ＡＧＡＧＧ
ＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡ（３´）なる核酸を用い、これら
を結合して下記式のようなリンカ−の結合したオリゴヌ
クレオチドを得た。なお式中前記オリゴヌクレオチド
は、Ｏｌｉｇｏｍｅｒで示されている。
【００４６】
【化４】
【００４７】次に、オリゴヌクレオチド溶液について、
３〜５ ＯＤ（Ａ260）を乾燥させ、０．１Ｍ ＴＥＡ
Ａ（ｐＨ ７．５）４０μｌに溶解し、１．０Ｍ Ａｇ
ＮＯ3を溶液を７．５μｌ加え、ボルテックス（ｖｏｌ
ｔｅｘ）し、室温にて４０分インキュベ−トした。続い
て１．０Ｍ ＤＴＴを１０μｌ加えボルテックス（ｖｏ
ｌｔｅｘ）し、室温にて３０分インキュベ−トした。こ
の後１５分間遠心して上澄を取得し、一方沈殿に０．１
Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ ７．５）４０μｌを加え、ボルテ
ックス（ｖｏｌｔｅｘ）し、５分遠心し前記上澄と合わ
せて全量９７．５μｌの、下記式の化合物９を得た。
【００４８】
【化５】
【００４９】次に、ＤＭＦ ２００μｌ、１．０Ｍ リ
ン酸緩衝液（ｐＨ １０．０）３００μｌ及びＨ2０５
００μｌを混合し、化合物８を添加して飽和させ、その
後アルゴン置換した。一方、高速液体クロマトグファフ
ィ−により精製した前記化合物９の溶液に、０．０１Ｍ
ＤＴＴを２０μｌ加え、ボルテックス（ｖｏｌｔｅ
ｘ）し、アルゴン置換した。ここに前記のようにして調
製した化合物８の溶液を、化合物９の溶液と化合物８の
溶液が２：１〜３：１になるように加え、２時間放置
し、セファデックスＧ−２５を用いたゲル濾過に供し、
取得物を乾燥した後高速液体クロマトグファフィ−によ
り精製し、下記式の化合物１０（前記化合物８として表
されたインタ−カレ−タ−性蛍光色素、３−ｍｅｔｈｙ
ｌ−２−［［１−［３−ｉｏｄｅｐｒｏｐｙｌ］−１，
４−ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎ−４−ｙｌｉｄｅ
ｎｅ］ｍｅｔｈｙｌ］ｂｅｎｚｏ−１，３−ｏｘａｚｏ
ｌｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（オキサゾ−ルイエロ−）を有
する本発明の標識核酸プロ−ブ、以下ＹＯ−ＰＵ−１）
を取得した。なお、高速液体クロマトグファフィ−操作
において使用した緩衝液は０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ
７．０）／５０％アセトニトリルであり、セファデック
スＧ−２５を用いたゲル濾過操作において使用した緩衝
液は０．１Ｍ ＴＥＡＡ （ｐＨ ７．０）／５％アセ
トニトリルである。
【００５０】
【化６】
【００５１】以上のようにして調製された本発明の標識
核酸プロ−ブＹＯ−ＰＵ−１のＵＶスペクトルを図１に
示す。図１によれば、ＹＯ−ＰＵ−１には核酸由来及び
前記つ化合物８由来の吸収が認められる。
【００５２】実施例２ 標的核酸の検出 １ 実施例１で調製したＹＯ−ＰＵ−１を用いて標的核酸の
検出を行った。なお用いた標的核酸ＤＳ１の核酸配列は
以下の通りであり、ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、３９１ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成したものである。
【００５３】 ＤＳ１；（５´）ＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴ （３´） 調製されたＹＯ−ＰＵ−１の３０ｐｍｏｌを０．２Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）０．６ｍｌに溶解
し、その蛍光強度を励起波長４８０ｎｍおよび蛍光波長
５１０ｎｍにて室温下で測定した結果、蛍光強度は、
８．２であった。
【００５４】一方、ＹＯ−ＰＵ−１の３０ｐｍｏｌと標
的核酸ＤＳ１の４５ｐｍｏｌとを２０倍ＳＳＣの２．５
μｌ及び５０μｌのＨ2０に溶解し、９０℃まで加熱後
放冷して室温に戻した。続いて０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）の６０μｌ及び４９０μｌのＨ2Ｏ
を添加し、溶液の蛍光強度を測定した。その結果、測定
値は１７．０であり、有意な蛍光強度の増大が確認され
た。
【００５５】測定された蛍光スペクトルを図２に示す。
【００５６】一方、ＹＯ−ＰＵ−１に対して非相補的な
核酸配列からなる（相補的な核酸配列を含まない）核
酸；（５´）ＴＣＧＡＧＣＣＣＡＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡ
ＧＧＧＡＧＡＴＴＣＣＣＣＴＧＣＣ（３´）の４５ｐｍ
ｏｌとＹＯ−ＰＵ−１の３０ｐｍｏｌとを２０倍ＳＳＣ
の２．５μｌ及び５０μｌのＨ2０に溶解し、９０℃ま
で加熱後放冷して室温に戻した。続いて０．２Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の６０μｌ及び４９０μｌ
のＨ2Ｏを添加し、溶液の蛍光強度を測定した。その結
果、測定値は８．５であった。
【００５７】これらの結果から、ＹＯ−ＰＵ−１につい
ては、その核酸配列と相補的な核酸配列を有するＤＳ１
とのみ相補結合を形成すること及び結合されたインタ−
カレ−タ−性蛍光色素が相補結合部分にインタ−カレ−
トする結果、蛍光強度の増大を有意に増大させることが
分かる。従って、試料中に本発明の標識核酸プローブを
添加するだけで特定核酸の検出を行うことが可能である
ことが確認された。
【００５８】実施例３ 標的核酸の検出 ２ ＹＯ−ＰＵ−１の３０ｐｍｏｌと標的核酸ＤＳ１の０．
１、０．２、０．５、１．０又は１．５当量とを、実施
例２の記載と同様にしてアニ−リングさせ、各標的核酸
濃度における各蛍光強度を励起波長４８０ｎｍおよび蛍
光波長５１０ｎｍにて室温下で測定した。
【００５９】結果を図３に示す。図３からは、試料中の
標的核酸の量に比例して、反応液からの蛍光強度が増加
していることが分かる。従って、試料に核酸プローブを
添加しその蛍光強度を測定するだけで試料中の特定核酸
の量（濃度）を決定することが可能であることが確認さ
れた。
【００６０】実施例４ 標的核酸の検出 ３ 標的核酸ＤＳ２をＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、３９１ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００６１】 ＤＳ２；（５´）ＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＣＣ（３´） ＹＯ−ＰＵ−１の３０ｐｍｏｌと標的核酸ＤＳ２の各
０．１、０．２、０．５、１．０又は１．５当量とを、
実施例２の記載と同様にしてアニ−リングさせ、各標的
核酸濃度における各蛍光強度を励起波長４８０ｎｍおよ
び蛍光波長５１０ｎｍにて室温下で測定した。
【００６２】結果を図４に示す。図４からは、試料中の
標的核酸の量に比例して、反応液からの蛍光強度が増加
していることが分かる。従って、試料に核酸プローブを
添加しその蛍光強度を測定するだけで試料中の特定核酸
の量（濃度）を決定することが可能であることが確認さ
れた。
【００６３】実施例５ ＹＯ−２７１の調製 図５の通り、化合物１（１０ｍｍｏｌ）と化合物２（１
０ｍｍｏｌ）を混合し、１５０度Ｃで３時間加熱し、Ａ
ｒｂｕｚｏｖ反応により化合物３を生成した。その後、
加水分解することによって化合物４を収率７０％で得
た。ここで、Ｚ（ＯＭｅ）は保護基でパラメトキシベン
ジルオキシカルボニル基を指す。
【００６４】デオキシヌクレオシドは、化式７
【００６５】
【化７】
【００６６】で一般的に示されるが、これを以下、
【００６７】
【化８】
【００６８】化式８の如く略記する。尚、Ｂはアデニン
（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン
（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）の塩基の任意の一つを意味す
る。
【００６９】図６の通り、化合物４（７ｍｍｏｌ）と化
合物５（７ｍｍｏｌ）とを無水ピリジン７０ｍｌに溶か
しＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）３５ｍｍ
ｏｌを加え、４５度Ｃにて１日反応させた。生成するジ
シクロヘキシルウレアを反応液から濾去して、化合物６
を得た（収率６０％）。ここで、ＤＭＴは保護基でジメ
トキシトリチル基を指す。
【００７０】図７の通り、化合物６（４ｍｍｏｌ）と化
合物７（４ｍｍｏｌ）とを無水ピリジン４０ｍｌに溶か
しＤＣＣ（２０ｍｍｏｌ）を加え、４５度Ｃにて１日反
応させた。生成するジシクロヘキシルウレアを反応液か
ら濾去して、化合物８を得た（収率７０％）。ここで、
Ａｃは保護基でアセチル基を指す。
【００７１】図８の通り、化合物８（２．５ｍｍｏｌ）
とパラトルエンスルホン酸（５ｍｍｏｌ）とをアセトニ
トリルーアセトン（１：１）混合液５０ｍｌに溶かし、
室温にて１日反応し、化合物９を得た（収率８５％）。
【００７２】図９の通り、化合物９（２ｍｍｏｌ）と化
合物１０（２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍｌ）溶液を０
度Ｃに冷却し、この溶液にＤＣＣ（２．４ｍｍｏｌ）と
１−ヒドロキシベンズトリアゾール（ＨＯＢｔ）４ｍｍ
ｏｌを添加した。０度Ｃにて１時間、さらに室温で１時
間反応した後、生成するジシクロヘキシルウレアを反応
液から濾去して、化合物１１を得た（収率８０％）。こ
こで、Ｔｒｔは保護基でトリチル基を指す。
【００７３】図１０の通り、化合物１１（１ｍｍｏｌ）
をメタノール−濃アンモニア水（１：１）５０ｍｌに溶
かし，室温で１日反応させ、化合物１２を得た。これを
真空で乾燥させ水分を充分除いた後、無水ＴＨＦ（１０
ｍｌ）に溶解した。さらにここへジイソプロピルエチル
アミン（５ｍｍｏｌ）及び化合物１３（５ｍｍｏｌ）を
加え、室温で１時間反応させ化合物１４を得た（収率８
０％）。
【００７４】Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃを塩基とする３｀−Ｏ−ホ
スホアミダイト型ヌクレオシドとともに化合物１４を原
料の一部として、ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、３９１ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒ）を用いて、以下の塩基配列を有するプロー
ブ用合成オリゴヌクレオチドＹＰＦ−２７１を合成し
た。
【００７５】 ＹＰＦ−２７１：（５’）ＣＴＣＧＣ＊ＧＧＧＧＧＣＴＧ（３’） ただし、配列中の「＊」の位置のリン酸エステルのリン
原子に以下に示す修飾を有する。
【００７６】Ｐ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ
２）２−Ｓ−Ｔｒｔ この合成オリゴヌクレオチドＹＰＦ−２７１から実施例
１で述べた手順に従ってトリチル基を除去し、実施例１
中の化合物８と反応させ、図１１に示す標識核酸プロー
ブＹＯ−２７１を得た。
【００７７】実施例６ 標的核酸の検出 ４ 以下に示す標的合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴ
ｙｐｅ １およびＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ ２を、ＤＮＡ
合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製、３９１ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて
合成した。
【００７８】Ｔａｒｇｅｔ Ｔｙｐｅ１： （５’）ＴＴＴＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＡＡＧＡ
ＣＴＧＣＴＡＧＣＣ（３’） Ｔａｒｇｅｔ Ｔｙｐｅ２： （５’）ＴＴＴＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＡ
ＣＴＧＣＴＡＧＣＣ（３’） これらの標的合成オリゴヌクレオチドは実施例５で得た
標識核酸プローブＹＯ−２７１に対して、図１２のよう
に部分的に２本鎖を形成することが可能である。
【００７９】ただし、図中「＊」は標識核酸プローブＹ
Ｏ−２７１における標識部位を表す。また、同じく式中
「｜」は標的合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴｙ
ｐｅ１およびＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ２と標識核酸プロー
ブＹＯ−２７１との間の相補部分を示し、「＃」は標的
合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ１と標識
核酸プローブＹＯ−２７１との間にのみ生じる１塩基ミ
スマッチ部位を表している。
【００８０】２０ｐｍｏｌの標識核酸プローブＹＯ−２
７１と、０、５、１０、２０、または３０ｐｍｏｌの標
的合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ１また
はＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ２を７５μｌの１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ ＫＣｌ／２．
２ｍＭ ＭｇＣｌ２中で混合し、５０℃で保温してアニ
ーリングさせた。各反応液の蛍光強度を励起波長４８８
ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで５０℃にて測定した。
【００８１】結果を図１３に示す。図１３からは、反応
液中の標的合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴｙｐ
ｅ２の量に依存して蛍光強度が増大し、標的合成オリゴ
ヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ２の量が２０ｐｍｏ
ｌ（等量）となったところで蛍光強度の増大が飽和に達
することがわかる。また、標的合成オリゴヌクレオチド
ＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ１を用いた場合、その量を３０ｐ
ｍｏｌまで増加させても反応液の蛍光強度はほとんど増
加しなかった。したがって、標識核酸プローブＹＯ−２
７１は標的核酸を量依存的に認識し、かつ標的核酸中の
１塩基ミスマッチの識別が可能であることが確認され
た。
【００８２】実施例７ 標的核酸の調製 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの５’非翻訳領域を
ＰＣＲにて増幅するためのプライマーとして、以下の式
に示す合成オリゴヌクレオチドを実施例６と同様に機械
合成した。
【００８３】Ｕ２５：（５’）ＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧ
ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣ（３’） Ｌ２９６：（５’）ＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣ
ＴＡＴ（３’） 米国人Ｃ型肝炎患者のプール血清、および日本人Ｃ型肝
炎患者のプール血清それぞれ１００μｌから「ＴＯＳＯ
Ｈ核酸抽出キット」（東ソー（株）製）を用いてＨＣＶ
ＲＮＡを抽出し、抽出ペレットを１２μｌの１００μ
ｇ／ｍｌのｙｅａｓｔ ＲＮＡを含むＴＥ（Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解
した。得られたＨＣＶ ＲＮＡ溶液１０μｌと逆転写反
応液５μｌを混合し、終濃度１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ ＫＣｌ／４．５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2／各１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ／１．１Ｕ／μｌ
ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）／
２Ｕ／μｌ ＭＭＬＶＲＴａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ社）／１ｍＭ ＤＴＴ／１．２μＭ
Ｌ２９６の反応液１５μｌ中４２℃にて１０分間逆転写
反応を行い、さらに９９℃にて６分間加熱して逆転写酵
素を失活させた。
【００８４】上記逆転写反応液１５μｌとＰＣＲ反応液
６０μｌを混合し、終濃度１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ ＫＣｌ／２．２ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2／各０．２８ｍＭ ｄＮＴＰｓ／０．０３Ｕ／μ
ｌ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造
（株）製）／１ｍＭ ＤＴＴ／０．２４μＭ Ｕ２５／
０．２４μＭ Ｌ２９６の反応液７５μｌ中で９５℃３
０秒、６５℃３０秒、７２℃１分の温度サイクルを４０
サイクル行うことにより、ＰＣＲ反応を行った。
【００８５】得られた反応液より、ＰＣＲ産物を「Ｓｐ
ｉｎＢｉｎｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｕｎｉ
ｔｓ」（宝酒造（株）製）を用いて精製した。得られた
精製ペレットをそれぞれ１０μｌのＴＥに溶解した後、
「ＤＮＡ ＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｔ」（宝酒造（株）
製）を用いて平滑末端化した。その後、常法によりフェ
ノール処理・エタノール沈澱を行い、得られた沈澱物を
それぞれ１０μｌのＴＥに再溶解した。
【００８６】一方、市販のプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＩＩＳＫ＋（東洋紡績（株）製）２μｇを制限酵
素ＨｉｎｃＩＩ（宝酒造（株）製）により酵素添付の反
応バッファー中で酵素消化した後、さらにＣａｌｆ ｉ
ｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａ
ｔａｓｅ（宝酒造株式）で脱リン酸化を行い、常法によ
りフェノール処理・エタノール沈澱を行い、得られた沈
澱物を１０μｌのＴＥに再溶解した。
【００８７】上記のようにして得られたプラスミド消化
物１μｌと米国人血清または日本人血清由来のＰＣＲ産
物２μｌを混合し、「ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ」（宝酒造（株）製）を用いて連結反応を行わせ、
「ＪＭ１０９ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ」（宝酒
造（株）製）に導入し、５０μｇ／μｌのアンピシリン
を含むＬＢプレート上で組換え体コロニーを形成させ
た。得られた組換え体コロニーを５０μｇ／μｌのアン
ピシリンを含むＬＢ培地で培養後、常法によりプラスミ
ドＤＮＡを抽出した。「Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔ
ｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ」（ＡＢＩ製）及びＤＮＡシーケンサー（ＡＢ
Ｉ製、３７３Ａ）を用いて塩基配列決定を行い、文献上
のＨＣＶＲＮＡの塩基配列と一致するクローンをそれぞ
れ得た。得られた米国人血清由来のクローンをＳＫＰ／
ＳＣ１−１、日本人血清由来のクローンをＳＫＰ／ＳＲ
１Ｐ２−６と命名した。いずれのクローンもプラスミド
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の有するＴ７プロモ
ーターの転写方向にＨＣＶ ＲＮＡの塩基番号２５→３
１４の２９０ｂｐが挿入されていた（塩基番号は文献Ｃ
ｈｏｏ，Ｑ．ｅｔａｌ、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８８巻、ｐ２
４５１−２４５５、１９９１年に従った）。
【００８８】それぞれのクローンの塩基配列中、実施例
５で得た標識核酸プローブＹＯ−２７１に対応する領域
は、図１４のように部分的に相補的な２本鎖を形成する
ことが可能である。
【００８９】ただし、図中「＊」は標識核酸プローブＹ
Ｏ−２７１における標識部位を表す。また、同じく図中
「｜」はＳＫＰ／ＳＣ１−１およびＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２
−６と標識核酸プローブＹＯ−２７１との間の相補部分
を示し、「＃」はＳＫＰ／ＳＣ１−１と標識核酸プロー
ブＹＯ−２７１との間にのみ生じる１塩基ミスマッチ部
位を表している。
【００９０】ＳＫＰ／ＳＣ１−１、およびＳＫＰ／ＳＲ
１Ｐ２−６それぞれ１ｍｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩに
より酵素添付の反応バッファー中で酵素消化した。その
後、常法によりフェノール抽出・エタノール沈澱を行
い、沈澱物を５００μｌのＴＥに再溶解した。
【００９１】上記ＳＫＰ／ＳＣ１−１、およびＳＫＰ／
ＳＲ１Ｐ２−６のＨｉｎｄＩＩＩ消化物それぞれ３μｌ
（約６μｇ）を、終濃度４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）／８ｍＭ ＭｇＣｌ2／２ｍＭ ｓｐｅ
ｒｍｉｄｉｎｅ／５ｍＭ ＤＴＴ／各０．４ｍＭ ＮＴ
Ｐｓ／１Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
（宝酒造（株）製）／５Ｕ／μｌ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅの反応液それぞれ２７５μｌ中３７℃
にて１時間反応させてｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写を
行わせた。その後、２８μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓ
ｅＩ（ナカライテスク製）を加え、３７にて３０分間反
応させて鋳型ＤＮＡを分解し、常法にてフェノール抽出
・エタノール沈澱を行った。得られた沈澱物を２５０μ
ｌのＴＥに再溶解し、波長２６０ｎｍにおける吸光度よ
りいずれも約１０１２分子／μｌの濃度と見積もられ
た。
【００９２】上記ＲＮＡ溶液をそれぞれ１００μｇ／ｍ
ｌのｙｅａｓｔ ＲＮＡを含むＴＥにてそれぞれ１０７
倍および１０９倍希釈し、それぞれ約１０５分子／μｌ
および約１０３分子／μｌ濃度の標的核酸液を得た。
【００９３】実施例８ 標的核酸の検出 ５ ＨＣＶ ＲＮＡの５’非翻訳領域をＰＣＲにて増幅する
ためのプライマーとして、以下の合成オリゴヌクレオチ
ドを、ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ社製、３９１ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ
ｒ）を用いて合成した。
【００９４】Ｕ２３：（５’）ＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴ
ＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣ（３’） Ｌ２９４：（５’）ＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡ
ＴＣＡ（３’） 実施例７で得られた１０５分子／μｌ濃度のＳＫＰ／Ｓ
Ｃ１−１由来のＲＮＡ溶液および１０３分子／μｌおよ
び１０５分子／μｌ濃度のＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６由来
のＲＮＡ溶液それぞれ１０μｌと逆転写反応液５μｌを
混合し、終濃度１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）／５０ｍＭ ＫＣｌ／４．５ｍＭＭｇＣｌ2／各
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ／１．１Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）／２Ｕ／μｌ
ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ社製）／１ｍＭ ＤＴＴ／０．０５μＭ Ｌ２
９４の反応液１５μｌ中４２℃にて１０分間逆転写反応
を行い、さらに９９℃にて６分間加熱して逆転写酵素を
失活させた。
【００９５】上記逆転写反応液１５μｌとＴａｑ ＤＮ
Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外の反応成分を含むＰＣＲ
反応液５０μｌを混合し、７２℃まで加温した。これに
７２℃に加温したＰＣＲ酵素液（０．５Ｕ／μｌ Ｔａ
ｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造（株）製）
１０μｌを混合し、終濃度１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ ＫＣｌ／２．２ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2／各０．２８ｍＭ ｄＮＴＰｓ／１ｍＭ ＤＴＴ
／０．５μＭ Ｕ２３／０．０１μＭ Ｌ２９４／０．
０６７Ｕ／μｌの反応液７５μｌ中で、９５℃３０秒、
６５℃３０秒、７２℃１分の温度サイクルを５０サイク
ル行うことにより、（＋）鎖を過剰増幅する非対称ＰＣ
Ｒ反応を行った。
【００９６】非対称ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを２％
アガロースゲル電気泳動にかけ、１０μｇ／ｍｌのエチ
ジウムブロミド液で染色し、近紫外光下でバンドを観察
した。その結果、いずれの場合も目的の位置にバンドが
観察され、非対称ＰＣＲ増幅が起こっていることが確認
された。
【００９７】２０ｐｍｏｌの標識核酸プローブＹＯ−２
７１を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
／５０ｍＭ ＫＣｌ／２．２ｍＭ ＭｇＣｌ2液１０μ
ｌと、上記非対称ＰＣＲ反応液６５μｌを混合し、９９
℃にて６分間加熱後、４５℃で保温してアニーリングさ
せた。各反応液の蛍光強度を励起波長４８８ｎｍ、蛍光
波長５１０ｎｍで４５℃にて測定した。結果を図１５に
示す。図１５からは、ＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６由来のＲ
ＮＡからの（＋）鎖過剰の非対称ＰＣＲ産物に対して蛍
光強度が増大していることがわかる。また、ＳＫＰ／Ｓ
Ｃ１−１由来のＲＮＡからの（＋）鎖過剰の非対称ＰＣ
Ｒ産物に対して蛍光強度は増加しなかった。したがっ
て、標識核酸プローブＹＯ−２７１は特異的な（＋）鎖
過剰の非対称ＰＣＲ産物を認識でき、その１塩基ミスマ
ッチの識別が可能であることが確認された。
【００９８】実施例９ 標的核酸の検出 ６ 実施例７で得られた１０３分子／μｌおよび１０５分子
／μｌ濃度のＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６由来のＲＮＡ溶液
それぞれ１０μｌを用いて、実施例８と同様に（＋）鎖
過剰増幅非対称ＰＣＲを行った。ただし、あるＰＣＲ反
応液中には２０ｐｍｏｌの標識核酸プローブＹＯ−２７
１を非対称ＰＣＲ開始時に加えた。
【００９９】また、同様に１０５分子／μｌ濃度のＳＫ
Ｐ／ＳＲ１Ｐ２−６由来のＲＮＡ溶液１０μｌを用い
て、実施例８と同様に（−）鎖過剰増幅非対称ＰＣＲを
行った。この場合には、ＲＴ反応液には終濃度２．５μ
ＭとなるようにプライマーＬ２９４を加え（ＰＣＲ時に
は０．５μＭとなる）、ＰＣＲ反応時には終濃度０．０
１μＭとなるようにプライマーＵ２３を加えた。ただ
し、あるＰＣＲ反応液中には２０ｐｍｏｌの標識核酸プ
ローブＹＯ−２７１を非対称ＰＣＲ開始時に加えた。各
非対称ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを２％アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、１０μｇ／ｍｌのエチジウムブロミ
ド液で染色し、近紫外光下でバンドを観察した。その結
果、いずれの場合も目的の位置にバンドが観察され、非
対称ＰＣＲ増幅が起こっていることが確認された。
【０１００】非対称ＰＣＲ時に標識核酸プローブＹＯ−
２７１を加えなかった反応液の場合には、２０ｐｍｏｌ
の標識核酸プローブＹＯ−２７１を含む１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ ＫＣｌ／２．
２ｍＭ ＭｇＣｌ2液１０μｌと、上記非対称ＰＣＲ反
応液６５μｌを混合し、９９℃にて６分間加熱後、４５
℃で保温してアニーリングさせた。非対称ＰＣＲ時に標
識核酸プローブＹＯ−２７１を加えた反応液の場合に
は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／５０
ｍＭ ＫＣｌ／２．２ｍＭ ＭｇＣｌ2液１０μｌと、
上記非対称ＰＣＲ反応液６５μｌを混合し、同様にアニ
ーリングさせた。各反応液の蛍光強度を励起波長４８８
ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで４５℃にて測定した。
【０１０１】結果を図１６に示す。図１６からは、非対
称ＰＣＲ開始時に標識核酸プローブＹＯ−２７１を加え
なかった場合、ＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６由来のＲＮＡか
らの（＋）鎖過剰増幅非対称ＰＣＲ産物に対して蛍光強
度が増大しているが、（−）鎖過剰増幅非対称ＰＣＲ産
物に対しては蛍光強度が増大していないことがわかる。
したがって、標識核酸プローブＹＯ−２７１は特異的な
非対称ＰＣＲ産物の認識が可能であることが確認され
た。さらに、非対称ＰＣＲ開始時に標識核酸プローブＹ
Ｏ−２７１を加えた場合も、同様の結果が得られている
ことがわかる。したがって、特異的な非対称ＰＣＲ産物
の検出を行おうとする場合、後処理の操作手順を省略す
るために非対称ＰＣＲ開始時にあらかじめ標識核酸プロ
ーブＹＯ−２７１を加えておくことが可能であることが
確認された。
【０１０２】実施例１０ インビトロ転写系における転
写産物量のモニター インビトロ転写の鋳型ＤＮＡとして、実施例７で構築し
たＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６を制限酵素で切断した直鎖状
ＤＮＡを用いた。図１７はその構造を示したものであ
る。制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断したものはＴ７プ
ロモーターから転写を行わせる場合の、制限酵素Ｘｈｏ
Ｉで切断したものはＴ３プロモーターから転写を行わ
せる場合の鋳型とした。それぞれの鋳型ＤＮＡを含み、
以下に示した組成の反応液５００μｌを蛍光測定用セル
に入れ、蛍光分光光度計内で４０℃にて反応させた。
【０１０３】反応液組成 ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ８ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＤＴＴ ０．４ｍＭ ＮＴＰｓ ７ｎＭ 鋳型ＤＮＡ（センスあるいはアンチセンス） ２５ｎＭ ＹＯ−２７１ ２Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒビター ０．１Ｕ／μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ あるいは
Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ 反応させるのと同時に、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長
５１０ｎｍで蛍光を３０分間モニターした結果が図１８
で、反応後の転写産物１０μｌを電気泳動した結果が図
１９である。いずれの場合も転写産物が生成されている
が、蛍光として検出されるのはセンスのみである。この
結果から転写産物を特異的に測定することが可能である
といえる。
【０１０４】さらに、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼとセン
ス鋳型ＤＮＡを用いて上と同条件で反応させ、反応液１
０μｌを経時的に採取し、電気泳動した結果が図２０
で、図２０の結果のバンド濃度をデンシトメーターで測
定した結果が図２１である。図１８の反応曲線は図２１
の曲線とよく相関しており、産物量に応じた蛍光が得ら
れていることが確認できた。したがって、この測定系に
よって試料を取り出すことなく、ＲＮＡ産物量の特異的
な定量が可能であることが証明された。
【０１０５】
【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば、例えば遺伝子混合物からなると予想される試
料の中に含まれる少なくとも一つの特定の核酸配列を有
する標的核酸について、ＰＣＲ法による増幅後の反応液
の分析や相補結合に関与していない余剰プローブの分離
を行うことなしに、標的核酸の存在の有無及び量を決定
することを可能とする均一系での簡便な一段階の方法が
提供される。従って本発明によれば、遺伝子診断、有用
遺伝子のクローニング、未知遺伝子の探索等の分野でよ
り簡便に標的核酸に標的核酸を検出することが可能とな
り、更にはＰＣＲ法による増幅工程に関するサイクル数
等の反応条件の最適化を行うことが可能となる。
【０１０６】本発明によれば、標識核酸プローブが標的
核酸と相補結合を形成するとプローブに結合されたイン
ターカレーター性蛍光色素の蛍光強度が増加することを
利用することにより、相補結合に関与しなかった余剰プ
ローブを分離する工程等を必要とせずに、その相補結合
の形成の有無の検出及び形成された相補結合体の定量が
可能となり、特定の核酸配列からなる核酸の均一系での
簡便な一段階の分析方法が提供される。特に本発明で
は、不溶性担体を使用する必要がないため、これに対す
る標識核酸プロ−ブの非特異的吸着等の課題を生じ得な
い。
【０１０７】また本発明によれば、標識核酸プローブを
ＰＣＲ法による標的核酸の増幅に先だって試料に添加す
ることにより、増幅工程中の反応液の蛍光強度を測定す
ることで標的核酸の増幅されていく様子を経時的に追跡
することが可能となる。仕上って、増幅前の試料中の標
的核酸の有無の判定及び量の決定を、増幅後の反応液の
分析を行うこと無しに決定することが可能となる。
【０１０８】本発明によれば、更に、出願人が先に創作
した、遊離のインタ−カレ−タ−性蛍光色素共存下でＰ
ＣＲを実施する方法（特開平５−２３７００号）におけ
る、遊離インタ−カレ−タ−性蛍光色素が二本鎖核酸に
非特異的にインタ−カレ−トすることに由来するバック
グランドの増加を排除することが可能となる。即ち、本
発明の標識核酸プロ−ブは、標識物質であるインタ−カ
レ−タ−性蛍光色素にいわば特異性を付与するものだか
らである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の標識核酸プローブＹＯ−ＰＵ
−１の吸収スペクトルを示す図である。
【図２】図２中の１は、本発明の標識核酸プローブＹＯ
−ＰＵ−１と標的核酸ＤＳ１とからなる水溶液につい
て、相補結合を形成する条件下において測定された蛍光
スペクトルであり、２はＹＯ−ＰＵ−１水溶液の蛍光ス
ペクトルである。いずれも励起波長は４８０ｎｍであ
る。
【図３】図３は、本発明の標識核酸プローブＹＯ−ＰＵ
−１の３０ｐｍｏｌに対して標的核酸ＤＳ１の添加量を
変化させた場合の各反応液の蛍光強度を示し、いずれも
励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで測定したも
のである。
【図４】図４は、本発明の標識核酸プローブＹＯ−ＰＵ
−１の３０ｐｍｏｌに対して標的核酸ＤＳ２の添加量を
変化させた場合の各反応液の蛍光強度を示し、いずれも
励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで測定したも
のである。
【図５】実施例５における、化合物の反応を示す図であ
る。
【図６】実施例５における、化合物の反応を示す図であ
る。
【図７】実施例５における、化合物の反応を示す図であ
る。
【図８】実施例５における、化合物の反応を示す図であ
る。
【図９】実施例５における、化合物の反応を示す図であ
る。
【図１０】実施例５における、化合物の反応を示す図で
ある。
【図１１】実施例５における、化合物の反応を示す図で
ある。
【図１２】実施例６における合成オリゴヌクレオチドと
実施例５におけるプローブが形成する２本鎖を示す図で
ある。
【図１３】標識核酸プローブＹＯ−２７１の２０ｐｍｏ
ｌに対して標的合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴ
ｙｐｅ１およびＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ２の添加量を変化
させた場合の各反応液の蛍光強度を励起波長４８８ｎ
ｍ、蛍光波長５１０ｎｍで５０℃にて測定し、標的核酸
非存在下を１としたときの蛍光強度の比を示したもので
ある。
【図１４】実施例７におけるクローン中の塩基配列と、
実施例５におけるプローブが形成する２本鎖を示す図で
ある。
【図１５】標識核酸プローブＹＯ−２７１の２０ｐｍｏ
ｌに対して（＋）鎖過剰増幅非対称ＰＣＲ産物を初期分
子数を変化させた場合の各反応液の蛍光強度を励起波長
４８８ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで５０℃にて測定し、
標的核酸非存在下を１としたときの蛍光強度の比を示し
たものである。
【図１６】（＋）鎖過剰増幅または（−）鎖過剰増幅非
対称ＰＣＲに際して、標識核酸プローブＹＯ−２７１の
２０ｐｍｏｌを非対称ＰＣＲ開始時あるいは終了時に添
加した場合の各反応液の蛍光強度を励起波長４８８ｎ
ｍ、蛍光波長５１０ｎｍで５０℃にて測定し、標的核酸
非存在下を１としたときの蛍光強度の比を示したもので
ある。
【図１７】ＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６を制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで切断した直鎖状ＤＮＡはＴ７プロモーターか
ら転写を行わせる場合の鋳型（センス）とし、制限酵素
Ｘｈｏ Ｉで切断したものはＴ３プロモーターから転写
を行わせる場合の鋳型（アンチセンス）とした。
【図１８】センスおよびアンチセンスのそれぞれについ
て、反応液を蛍光測定用セルに入れ、分光光度計内で反
応させると同時に励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０
ｎｍで３０分間測定した結果である。
【図１９】図１８のそれぞれの産物１０μｌを２％アガ
ロースにて、電気泳動しエチジウムブロマイドで染色し
た結果である。サイズマーカーはφＸ１７４／Ｈａｅ
ＩＩＩである。
【図２０】Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼとセンス鋳型を用
い、図１８と同条件で反応を行い、経時的に反応液１０
μｌを採取し、３％アガロースにて電気泳動し、エチジ
ウムブロマイドで染色した。コントロールＲＮＡは、転
写産物と同じＲＮＡを精製し、２６０ｎｍの吸光度から
濃度決定したもので、サイズマーカーはφＸ１７４／
Ｈａｅ ＩＩＩである。
【図２１】図２０について、バンドの黒化度をデンシト
メーターで測定し、コントロールＲＮＡと比較定量した
結果である。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平６−153999（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−142500（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−40397（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−237000（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開492570（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/50 G01N 33/53 G01N 33/566 G01N 33/58

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試料の中に含まれる少なくとも一つの特定
    の核酸配列を有する核酸（標的核酸）を測定するために
    少なくとも当該特定の核酸配列部分を増幅する工程を含
    む方法であって、標的核酸の前記特定核酸配列に相補的
    な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをプロー
    ブとして用い、そのプローブを試料に添加し標的核酸と
    相補結合を形成させる工程を含む方法において、前記プ
    ローブは、インターカレーター性蛍光色素が、一本鎖オ
    リゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド中のリン酸
    と、リンカーを介して、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレ
    オチドプローブの相補結合部分にインターカレーション
    可能に結合されたものであることを特徴とする特定核酸
    配列の検出方法。
  2. 【請求項２】試料の中に含まれる少なくとも一つの特定
    の核酸配列を有する二本鎖核酸（標的核酸）を測定する
    ために少なくとも当該特定の核酸配列部分を増幅する工
    程を含む方法であって、標的核酸の前記特定核酸配列に
    相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを
    プローブとして用い、そのプローブを試料に添加し標的
    核酸と相補結合を形成させる工程を含む方法において、
    前記プローブは、インターカレーター性蛍光色素が、一
    本鎖オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド中のリ
    ン酸と、リンカーを介して、標的核酸と一本鎖オリゴヌ
    クレオチドプローブにより形成される三重鎖部分にイン
    ターカレーション可能に結合されたものであることを特
    徴とする特定核酸配列の検出方法。
  3. 【請求項３】一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを、特
    定の核酸配列部分の増幅工程に先だって試料に添加する
    ことを特徴とする請求項１又は２の特定核酸配列の検出
    方法。
  4. 【請求項４】試料の中に含まれる特定の核酸配列を有す
    る一本鎖又は二本鎖核酸（標的核酸）を測定するために
    少なくとも当該特定の核酸配列部分を増幅する工程を含
    む方法であり、標的核酸の前記特定核酸配列に相補的な
    核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドプローブで
    あって、インターカレーター性蛍光色素が、一本鎖オリ
    ゴヌクレオチドと、リンカーを介して、標的核酸と一本
    鎖オリゴヌクレオチドプローブの相補結合部分又は標的
    核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブにより形成さ
    れる三重鎖部分にインターカレーション可能に結合され
    たプローブを前記特定核酸配列部分の増幅工程に先立っ
    て試料に添加されることを特徴とする方法。
  5. 【請求項５】特定の核酸配列部分を増幅する工程がＰＣ
    Ｒ（ポリメラーゼチェーンリアクション）法による増幅
    工程であることを特徴とする請求項１、２又は４の特定
    核酸配列の検出方法。
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