JP2960628B2 - 標識サイロニンハプテン類似体を用いたイムノアッセイ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床化学、特にイムノ
アッセイに関する。

【０００２】

【従来の技術】自然の免疫反応を利用するイムノアッセ
イは、臨床化学における分析技術として広範な用途が見
出されている。その反応の特異性のために、生物学的流
体中に極めて低濃度で存在する生物学的分析物を定量す
る際に特に有利である。そのような分析物としては（本
明細書中ではリガンドと称する）、例えば、抗体、治療
薬、麻酔薬、酵素、ホルモン、タンパク質等が挙げられ
る。

【０００３】競合結合イムノアッセイでは、標識ハプテ
ン類似体が固定量の適当な抗体との反応を目当てにした
未標識ハプテンとの競合状態に置かれる。結合したまた
は未結合の（即ち遊離の）標識ハプテン類似体のいずれ
かの測定シグナルから、ハプテンの未知濃度を決定する
ことができる。

【０００４】常用の標識としては、放射性標識、酵素、
発色団、蛍光団、安定なラジカル、並びに酵素補因子、
阻害剤およびアロステリックエフェクターが挙げられ
る。

【０００５】サイロニン、例えばサイロキシンについて
の競合イムノアッセイにおける、標識サイロニンハプテ
ン類似体（以後ＬＤＨとも称する）に対する特別な必要
条件としては、1)過剰の固定化抗体によりＬＤＨの少な
くとも60％が結合できること；2)固定化抗体に対するＬ
ＤＨの親和力が、療法的に適切な濃度範囲において固定
量のＬＤＨと薬剤との競争が起こるようなものであるこ
と；3)ＬＤＨを調製するのに用いる工程が数段階のみを
必要とすること；および4)貯蔵条件下でのその酵素標識
の加水分解に対するＬＤＨの安定性、が挙げられる。サ
イロニンハプテン類似体に課せられる必要条件として
は、1)酵素標識との接合後の固定化抗体への該類似体の
近づきやすさ；2)薬剤に対する抗体による標識類似体の
特異的認識；および3)酵素活性に不利な影響を及ぼさな
い条件下での、そのままのまたは酵素もしくは類似体の
活性化後のいずれかでの酵素標識との該薬剤類似体の十
分な反応性、が挙げられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】米国特許第 4,786,591
号明細書は、活性エステル基を有するサイロキシン（Ｔ
４）核を含んで成るハプテンを開示している。課題は、
それらのハプテンが少なくとも60％免疫反応性である標
識ハプテン類似体を提供しないことである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、 （Ａ）アミン基またはスルフヒドリル基を有する、イム
ノアッセイで使う型の標識； （Ｂ）サイロニン核；並びに （Ｃ）(i) 前記サイロニン核のアミノ基またはカルボキ
シル基と(ii)前記標識のアミン基またはスルフヒドリル
基とを介して前記サイロニン核を前記標識に結合してい
る鎖原子数10〜22個の結合鎖であって、(iii) １，４−
ピペラジニレン；２，５−ジメチル−１，４−ピペラジ
ニレン；１，３−イミダゾリジニレンおよび１，３−ヘ
キサヒドロジアゼピニレンから成る群から選ばれた少な
くとも１つの環基；並びに(iv)１または複数のＣ₁ 〜Ｃ
₆ アルキレン基を含む結合鎖であるが、但し、基(iii)
と基(iv)は、−Ｏ−、−Ｓ−、イミノ、アミド、カルボ
キシルおよびカルボニルから成る群から選ばれた１また
は複数の基を介して互いに連結している前記結合鎖を含
んで成る標識薬剤ハプテン類似体を提供する。本発明は
また、サイロニン誘導体についてのイムノアッセイであ
って、 Ａ．サイロニン誘導体を含有する液体試料と、上記の前
記誘導体の標識サイロニンハプテン類似体とを、前記サ
イロニン誘導体に対する抗体の存在下、抗体−サイロニ
ン免疫複合体の生成を促進する条件下で接触せしめる段
階；そして Ｂ．前記液体中のサイロニン誘導体の結合量または未結
合量を測定する段階を含んで成るイムノアッセイを提供
する。さらに本発明は、上記の標識サイロニンハプテン
薬剤類似体の層、区画または被膜を有するイムノアッセ
イ要素を提供する。サイロキシンは本発明を使ってアッ
セイすることができるサイロニンの一例である。

【０００８】

【具体的な態様】標識類似体はサイロニンハプテン類似
体から作製される。後者は次のようにして下記の手順に
従って作製される。

【０００９】サイロキシン上には２つの便利な反応性部
位が存在し、それらは結合鎖と、続いて本発明の新規ハ
プテンの場合には反応性活性エステル基とまたは続いて
本発明より得られる新規標識を作製する時には活性エス
テル基の代わりに酵素成分との付加を可能にする。この
２つの便利な部位は第一アミン基とカルボン酸基であ
る。どちらの部位を選んでも、使用するその後の反応に
よる干渉を防ぐために他方の部位をまずブロックしてお
き、次いで所望の結合鎖を構築しそしてそれを活性エス
テル基で終わらせ、最後には酵素で終わらせて所望の標
識を作製する。

【００１０】好ましくは、結合鎖は第一アミン基の方か
ら付加され、そして調製の第一段階はカルボン酸基をブ
ロックすることである。これは、常用のエステル化反
応、例えば酸または塩基触媒を使った酸とアルコールと
の縮合、好ましくはメタノールとの縮合により、遊離酸
をエステルに変換し、そしてこのエステル、例えばメチ
ルエステルを分離することによって達成することができ
る。続いて、常用のアミド形成縮合技術によりアミンを
ジカルボン酸無水物と縮合せしめてアミド結合を形成さ
せ、次いでカルボン酸をＮ−ヒドロキシイミド、例えば
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと縮合させて活性エステ
ルハプテンを形成させるか、または好ましくは、２つの
アミン基のうちの１つが保護（ブロック）されているジ
アミンまたはアミノアルコールのいずれかと新規末端カ
ルボキシ基とを縮合せしめ、該アミンを脱保護し、そし
てジカルボン酸無水物を新規末端脱保護アミン基または
ヒドロキシ基と縮合せしめることを続けることにより、
連結鎖を更に伸長する。それらの縮合は所望の鎖長が得
られるまで連続的に続けられる。使用するジアミンは、
好ましくは１つのアミン基が常用の保護基、例えばブト
キシカルボニル(BOC)またはベンジルオキシカルボニル
基により保護（ブロック）されている。よって、結合鎖
上への各保護ジアミンの付加後、次のジカルボン酸無水
物により鎖を伸長する前に、脱保護段階、例えばそれぞ
れトリフルオロ酢酸またはHBr/HOAcを使ったBOC または
ベンジルオキシカルボニル基の除去が必要である。

【００１１】本発明によれば、次の構造：

【化１】

【００１２】（ここでＲ⁶ は水素またはメチルであり、
Ｒ⁷ は１〜３個の炭素原子を有するメチル置換アルキレ
ン中のアルキレン、例えばメチレン、エチレン、プロピ
レンおよびトリメチレンである）を有する少なくとも１
つの環状ジアミン（好ましくは該環状ジアミンはピペラ
ジンである）は必ずブロックされ、そしてジアミンにつ
いて記載したように結合鎖中に組み込まれる。新規サイ
ロニンハプテン類似体の調製の最終段階は、上述したよ
うな反応性活性エステルを生成するための末端カルボキ
シ基とＮ−ヒドロキシイミドとの縮合である。生じた新
規活性エステルをアミノまたはスルフヒドリル基を含有
する酵素と縮合させて標識サイロニンハプテン類似体を
得る。

【００１３】あるいは、最初にサイロニン上の第一アミ
ン基を例えば上述のアミン保護基によりブロックし、そ
して上述の縮合、保護および脱保護反応を所望の順序で
使ってサイロニン成分上のカルボン酸基に結合基を付加
することができる。

【００１４】中間体の調製１：Ｎ−〔４−（３−スクシ
ンイミドキシカルボニルプロピオニル）ピペラジノカル
ボニルメトキシアセチル〕サイロキシンメチルエステル
の調製

【００１５】

【化２】

【００１６】段階１ サイロキシンのメチルエステル メタノール(500 ml)中のサイロキシン(37 g, 0.047モ
ル) の混合物に無水塩化水素酸ガスを導入した。数分後
にスラリーが透明になり、氷／水浴中で混合物を冷却し
ながらHCl の導入を30分間続けた。温度を 0〜10℃に維
持しながら攪拌を２時間続けた。白色固体を濾過し、濾
液を約100 mlに濃縮し、冷凍庫に一晩入れておき、濾過
し、吸引乾燥し、そして前の材料と合わせて39 gを得
た。この固体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド(100 ml)
中に溶かし、攪拌しながら水(1500 ml) 中の炭酸水素ナ
トリウム(27 g)にゆっくり添加した。混合物を更に１時
間攪拌し、酢酸エチル(200ml×5)で抽出し、合わせた有
機溶液を飽和NaCl溶液（200 ml) で洗浄し、無水硫酸マ
グネシウム上で乾燥し、濾過し、そして該溶液を400 ml
に濃縮した。この溶液に200 mlの石油エーテルを添加
し、混合物を冷凍庫に16時間入れておいた後で濾過する
と31.4 gを得た。¹H-NMR (CDCl₃) δ 2.8 & 3.0 (m,2
H, CH₂), 3.85 (m & s,4H, CH & CH₃ ), 7.1& 7.7 (s,4
H, 芳香族Ｈ) 。

【００１７】段階２ Ｎ−（カルボキシメトキシアセ
チル）サイロキシンモノメチルエステル。段階１由来の
アミンとジグリコール酸無水物との反応。 アセトン（350 ml）中のサイロキシンメチルエステル
（31.4 g, 0.04モル）とジグリコール酸無水物（11.6
g, 0.1 モル）の混合物を湯浴中で50〜60℃に加熱し、
次いで周囲温度で１時間攪拌した。真空中でロータリー
エバポレーター上で溶媒を留去し、この残渣にクロロホ
ルム（400 ml）を添加した。有機溶液を水（100 ml×2
）で洗浄し、5% HCl（100 ml×2 ）で洗浄し、飽和NaC
l溶液（100 ml）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で
乾燥し、濾過し、そして溶媒を留去した。その残渣にク
ロロホルム（100 ml）を添加し、該溶液を冷凍庫に一晩
入れておいた。混合物を濾過して31.4 gを得た。m.p. 1
57-162℃。¹H-NMR (CDCl₃) δ 2.9 & 3.05 (m,2H, T4-
CH₂), 3.6 (s,3H, CH₃ ), 3.95 (ABq,2H, NHCOCH₂ ), 4.0
2 (ABq,2H, CH₂CO), 4.6 (m,1H, CH), 7.0 & 7.75 (s,4
H,芳香族Ｈ), 8.25 (d,1H,NH), 9.1 (ブロードs, 1H,
酸Ｈ) 。

【００１８】段階３ Ｎ−（スクシンイミドキシカル
ボニルメトキシアセチル）サイロキシンメチルエステ
ル。段階２由来の酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドと
の反応。 アセトン（200 ml）中のＮ−（カルボキシメトキシアセ
チル）サイロキシンモノメチルエステル（27.2 g, 0.03
モル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（3.8g, 0.033
モル）およびＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（7.2 g, 0.033モル）の混合物を室温で20時間攪拌し
た。この混合物を濾過し、クロロホルム（300 ml）を加
えた。有機溶液を水（100 ml×3 ）、飽和NaCl溶液（10
0 ml）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾
過し、そして真空下でロータリーエバポレーター上で溶
媒を留去して30 gを得た。この物質を更に精製せずに直
接次の段階に使用した。¹ H-NMR (CDCl₃) δ 2.85 (s,4H, CH₂CH₂ ), 3.05 (m,2
H, Ar-CH₂), 3.8 (s,3H,CH₃), 4.2 (ABq,2H, NHCOCH₂ ),
4.58 (ABq,2H, CH₂ CO), 4.85 (m,1H,CH), 7.1 &7.65
(2s,4H, Ar-H) 。

【００１９】段階４ Ｎ−〔４−（ベンジルオキシカ
ルボニル）ピペラジノカルボニルメトキシアセチル〕サ
イロキシンメチルエステル。反応性エステルと１−ピペ
ラジンカルボン酸ベンジルとの反応。 クロロホルム（200 ml）中のＮ−（スクシンイミドキシ
カルボニルメトキシアセチル）サイロキシンメチルエス
テル（5.1 g, 0.005モル）の溶液に、１−ピペラジンカ
ルボン酸ベンジル（1.5 g, 0.0068 モル）を10分間に渡
り滴下添加した。生じた混合物を湯浴中で15分間50〜60
℃に加熱し、次いで周囲温度で16時間攪拌した。混合物
を5% HCl溶液（100 ml×2 ）、水（100 ml×2 ）、飽和
NaCl溶液（100 ml）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上
で乾燥し、濾過し、そして溶媒を留去した。残渣をSiO₂
上でのクロマトグラフィーにかけて固体を得た。¹H-NMR
(CDCl₃) δ 3.1 (m,2H, Ar- CH₂), 3.25-3.7 (m,8H,
ピペラジンＨ), 3.75 (s,3H,CH₃), 4.1 (ABq,2H, NHCOC
H₂ ), 4.3 (ABq, 2H, CH₂ CO−ピペラジン),4.82 (m,1H,C
H), 5.15 (s,2H,OCH₂ Ph), 7.05 & 7.7 (2s,4H, Ar-H),
8.1 (d,1H, NH) 。

【００２０】段階５ Ｎ−（ピペラジノカルボニルメ
トキシアセチル）サイロキシンメチルエステル臭化水素
酸塩。段階４由来の保護アミンの30% HBr/HOAc処理。 段階４由来のＮ−〔４−（ベンジルオキシカルボニル）
ピペラジノカルボニルメトキシアセチル〕サイロキシン
メチルエステル（11.0 g, 0.01モル）と30〜35％臭化水
素−酢酸溶液（80ml）を室温で１時間攪拌した。次いで
この混合物を酢酸エチル（1.0 L ）中に注ぎ、１時間攪
拌し、濾過し、そして固体を酢酸エチル（500 ml）で洗
浄した。次いでこの固体を真空オーブン中で45〜50℃に
て乾燥し、更に精製せずに次の段階に使用した。

【００２１】段階６ Ｎ−〔４−（３−カルボキシプ
ロピオニル）ピペラジノカルボニルメトキシアセチル〕
サイロキシンモノメチルエステル。段階５由来のアミン
臭化水素酸塩とコハク酸無水物との反応。 クロロホルム（400 ml）中の段階５由来のＮ−（ピペラ
ジノカルボニルメトキシアセチル）サイロキシンメチル
エステル臭化水素酸塩（9.5 g, 0.01 モル）およびコハ
ク酸無水物（2.0 g, 0.02 モル）にトリエチルアミン
（3.3 g, 0.033モル）を添加した。スラリーは即座に溶
解し始め、この混合物を室温で一晩攪拌した。翌日には
固体は全部溶けており、その溶液を5% HCl溶液（100 ml
×3 ）、水（100 ml）、飽和NaCl溶液（100 ml）で洗浄
し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして
ロータリーエバポレーター上で溶媒を真空留去した。こ
の物質をSiO₂を使ったクロマトグラフィーにより更に精
製した。¹ H-NMR (CDCl₃) δ 2.6-2.8 (m,4H, CH₂CH₂ ), 3.0-3.2
(m, 2H, Ar-CH₂), 3.3-3.8 (m,8H,ピペラジンＨ), 4.0
(s,3H, CH₃), 4.1 (ABq,2H, NHCOCH₂ ), 4.3 (ABq, 2H,
CH₂ COピペラジン), 4.85 (m,1H,CH), 7.1 & 7.7 (s,4
H, Ar-H), 8.05 (m,1H,NH) 。

【００２２】段階７ Ｎ−〔４−（３−スクシンイミ
ドキシカルボニルプロピオニル）ピペラジノカルボニル
メトキシアセチル〕サイロキシンメチルエステル。段階
６由来の酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応。 クロロホルム（70ml）中の段階６由来のＮ−〔４−（３
−カルボキシプロピオニル）ピペラジノカルボニルメト
キシアセチル〕サイロキシンモノメチルエステル（4.3
g, 0.004モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド（0.824g, 0.004モル）およびＮ−ヒドロキシス
クシンイミド（0.46 g, 0.004 モル）の混合物を室温で
20時間攪拌し、次いで50〜60℃に30分間加熱した。反応
液を0 〜5 ℃に冷却し、濾過し、そしてその濾液にクロ
ロホルム（100 ml）を添加した。有機溶液を水（50ml×
3 ）、飽和NaCl溶液（50ml）で洗浄し、無水硫酸マグネ
シウム上で乾燥し、濾過し、そして真空下でロータリー
エバポレーター上で溶媒を留去した。この物質の一部を
クロマトグラフィーにより精製して純粋な物質を得た。¹ H-NMR (CDCl₃) δ 2.8 (m,2H, ピペラジノCOCH ₂C
H₂）, 2.82 (s,4H, CH₂CH₂ ）, 2.95-3.2 (m,2H, CH₂CH₂
CO₂), 3.3-3.8 (m,8H,ピペラジンＨ), 3.8 (s,3H, C
H ₃), 4.1 (ABq,2H, NHCOCH₂ ), 4.3 (ABq, 2H, CH₂ COピ
ペラジン), 4.85 (m,1H,CH), 7.1 & 7.7 (s,4H, Ar-H),
8.1 (m,1H, NH) 。

【００２３】中間体の調製２： Ｎ−〔４−（スクシンイミドキシカルボニルメトキシア
セチル）ピペラジノカルボニルメトキシアセチル〕サイ
ロキシンメチルエステル

【００２４】

【化３】

【００２５】段階１ Ｎ−（ピペラジノカルボニルメ
トキシアセチル）サイロキシンメチルエステル。中間体
の調製１の段階５由来のアミン臭化水素酸塩からの遊離
アミンの生成。 段階５由来のＮ−（ピペラジノカルボニルメトキシアセ
チル）サイロキシンメチルエステル臭化水素酸塩（3.6
g, 0.0034 モル）をＤＭＦ（25ml）に溶かし、水（200
ml）中の炭酸水素ナトリウム（1.5 g, 0.017モル）にゆ
っくり注ぎ、そして室温で１時間攪拌した。この水性ス
ラリーをクロロホルム（50ml×10）で抽出した。合わせ
た有機溶液を水（100 ml）、飽和NaCl溶液（100 ml）で
洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そ
して真空下でロータリーエバポレーター上で溶媒を留去
した。この物質を直接次の段階に使用した。

【００２６】段階２ Ｎ−〔４−（カルボキシメトキ
シアセチル）ピペラジノカルボニルメトキシアセチル〕
サイロキシンモノメチルエステル。段階１由来の遊離ア
ミンとジグリコール酸無水物との反応。 クロロホルム（ 200ml）中の段階１由来のＮ−（ピペラ
ジノカルボニルメトキシアセチル）サイロキシンメチル
エステル（3.1 g, 0.0034 モル）とジグリコール酸無水
物（0.6 g, 0.0046 モル）を50〜60℃に加熱し（湯
浴）、次いで周囲温度で16時間攪拌した。クロロホルム
（200 ml）を加えた。この混合物を5% HCl溶液（100 ml
×2 ）、水（100 ml）、飽和NaCl溶液（100 ml）で洗浄
し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして
真空下でロータリーエバポレーター上で溶媒を留去し
た。この物質を直接次の段階に使用した。¹H-NMR (CDCl
₃) δ 3.0-3.2 (m, 2H, Ar-CH₂), 3.3-3.75 (m,8H, ピ
ペラジンＨ), 3.8 (s,3H, CH₃), 4.0-4.4 (m, 8H, 2 ×
CH₂OCH₂), 4.85 (m,1H, CH), 7.1 &7.7 (s,4H, Ar-H),
8.0 (s,1H, NH) 。

【００２７】段階３ Ｎ−〔４−（スクシンイミドキ
シカルボニルメトキシアセチル）ピペラジノカルボニル
メトキシアセチル〕サイロキシンメチルエステル。段階
２由来の酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応。 クロロホルム（50ml）中の段階２由来のＮ−〔４−（カ
ルボキシメトキシアセチル）ピペラジノカルボニルメト
キシアセチル〕サイロキシンモノメチルエステル（2.2
g, 0.002モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド（0.52 g, 0.0025モル）およびＮ−ヒドロキシス
クシンイミド（0.35 g, 0.003 モル）の混合物を50〜60
℃に加熱し（湯浴）、次いで室温で16時間攪拌した。こ
の混合物を濾過し、クロロホルム（100 ml）を加えた。
溶液を水（100 ml×2 ）、5% HCl溶液（100 ml）、飽和
NaCl溶液（100 ml）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上
で乾燥し、濾過し、そして真空下でロータリーエバポレ
ーター上で溶媒を留去した。¹ H-NMR (CDCl₃) δ 2.85 (s,4H,CH₂CH₂ ), 3.0-3.2 (m,
2H, CH₂), 3.3-3.75 (m,8H, ピペラジンＨ), 3.8 (s,3
H, CH₃), 4.0-4.4 (m, 8H, 2 ×CH₂OCH₂), 4.82 (m,1H,
CH), 7.1 & 7.7 (s,4H, Ar-H), 8.1 (d,1H, NH) 。

【００２８】中間体の調製３： Ｎ−｛３−〔４−（３−スクシンイミドキシカルボニル
プロピオニル）ピペラジノカルボニル〕プロピオニル｝
サイロキシンメチルエステルの調製

【００２９】

【化４】

【００３０】段階１ Ｎ−（３−カルボキシプロピオ
ニル）サイロキシンモノメチルエステル。中間体の調製
１のサイロキシンメチルエステルとコハク酸無水物との
反応。 この物質は、ジグリコール酸無水物の代わりにコハク酸
無水物を使うこと以外は中間体の調製１において概説し
た手順を使って調製した。生成物をアセトン／アセトニ
トリル １：１から再結晶した。¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ 2.3 (m,4H, CH₂CH₂ ), 2.78-3.02
(m,2H, ArCH₂), 3.6 (m,3H,CH₃), 4.05 (m,1H, CH),
7.0 & 7.8 (s,4H, Ar-H), 8.4 (d,1H, NH) 。

【００３１】段階２ Ｎ−（３−スクシンイミドキシ
カルボニルプロピオニル）サイロキシンメチルエステ
ル。段階１由来の酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドと
の反応。 この物質は、段階１由来の酸Ｎ−（３−カルボキシプロ
ピオニル）サイロキシンモノメチルエステルを使用する
こと以外は中間体の調製１において概説した手順を使っ
て調製し、そしてこの生成物を精製せずに直接次の段階
に使用した。

【００３２】段階３ Ｎ−〔３−（４−ベンジルオキ
シカルボニルピペラジノカルボニル）プロピオニル〕サ
イロキシンメチルエステル。段階２由来の反応性エステ
ルと１−ピペラジンカルボン酸ベンジルとの反応。 この物質は、段階２由来のエステルであるＮ−（３−ス
クシンイミドキシカルボニルプロピオニル）サイロキシ
ンメチルエステルを使用すること以外は中間体の調製１
の段階４において概説した手順を使って調製した。この
物質をカラムクロマトグラフィー（SiO₂）により精製し
た。¹ H-NMR (CDCl₃) δ 2.5-2.7 (m,4H, CH₂CH₂ ), 2.9-3.1
(m,2H, ArCH₂), 3.4-3.7 (m,8H,ピペラジンＨ), 3.75
(s,3H,CH ₃), 4.8 (m,1H,CH), 5.15 (s,2H,ArCH₂O), 6.7
(d,1H, NH), 7.1 & 7.65 (s,4H,Ar-H) 。

【００３３】段階４ Ｎ−（３−ピペラジノカルボニ
ルプロピオニル）サイロキシンメチルエステル臭化水素
酸塩。段階３由来の保護アミンの30% HBr/HOAc処理 この物質は、段階３の保護アミンであるＮ−〔３−（４
−ベンジルオキシカルボニルピペラジノカルボニル）プ
ロピオニル〕サイロキシンメチルエステルを使うこと以
外は中間体の調製１の段階５において概説した手順を使
って調製し、クリーム色の固体を得た。

【００３４】段階５ Ｎ−｛３−〔４−（３−カルボ
キシプロピオニル）ピペラジノカルボニル〕プロピオニ
ル｝サイロキシンモノエチルエステル。段階４由来のア
ミン臭化水素酸塩とコハク酸無水物との反応。 この物質は、段階４由来のアミン臭化水素酸塩であるＮ
−（３−ピペラジノカルボニルプロピオニル）サイロキ
シンメチルエステル臭化水素酸塩をコハク酸無水物と反
応させること以外は中間体の調製１の段階６において概
説した手順を使って調製した。この物質をカラムクロマ
トグラフィー（SiO₂）により精製した。 ¹ H-NMR (CDCl₃) δ 2.5-2.75 (m,8H, 2×CH₂CH₂ ), 2.9
-3.2 (m,2H, CH₂), 3.45-3.75 (m,8H,ピペラジンＨ),
3.75 (s,3H,CH ₃), 4.8 (m,1H,CH), 6.9 (m,1H, NH), 7.
1 & 7.65 (s,4H,Ar-H) 。

【００３５】段階６ Ｎ−｛３−〔４−（３−スクシ
ンイミドキシカルボニルプロピオニル）ピペラジノカル
ボニル〕プロピオニル｝サイロキシンメチルエステル。
段階５由来の酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反
応。 この物質は、段階５由来の酸であるＮ−｛３−〔４−
（３−カルボキシプロピオニル）ピペラジノカルボニ
ル〕プロピオニル｝サイロキシンモノエチルエステルを
使うこと以外は中間体の調製１の段階７において概説し
た手順を使って調製した。この物質をカラムクロマトグ
ラフィー（SiO₂）により精製した。¹ H-NMR (CDCl₃) δ 2.5-2.8 (m,6H, 3 ×CH₂ ), 2.8
(s,4H, スクシンイミドCH ₂CH₂ ), 2.9-3.2 (m,4H, ArCH
₂ & CH ₂CO₂), 4.8 (m,1H, CH), 6.8 (d,1H, NH), 7.1 &
7.65 (s,4H,Ar-H) 。

【００３６】中間体の調製４： Ｎ−｛４−〔４−（４−スクシンイミドキシカルボニル
ブチリル）ピペラジノカルボニル〕ブチリル｝サイロキ
シンメチルエステル

【００３７】

【化５】

【００３８】段階１ Ｎ−（４−カルボキシブチリ
ル）サイロキシンモノメチルエステル。中間体の調製１
の段階１由来のアミンとグルタル酸無水物との反応。 この物質は、ジグリコール酸無水物の代わりにグルタル
酸無水物を使用すること以外は中間体の調製１の段階２
に概説した手順を使って調製した。¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ 1.6 (m,2H,CCH ₂C), 2.0-2.2 (m,
4H, CH₂CCH ₂), 2.75-3.1(m,2H, ArCH₂ ), 3.6 (s,3H, C
H ₃), 4.45 (m,1H, CH), 7.0 & 7.8 (s,4H, Ar-H), 8.35
(d,1H,NH) 。

【００３９】段階２ Ｎ−（４−スクシンイミドキシ
カルボニルブチリル）サイロキシンメチルエステル。段
階１由来の酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反
応。 この物質は、段階１由来の酸Ｎ−（４−カルボキシブチ
リル）サイロキシンモノメチルエステルを使うこと以外
は中間体の調製３に概説した手順を使って調製した。¹ H-NMR (CDCl₃) δ 2.15 (m,2H, CCH ₂C), 2.38 (m,2H,
NHCOCH₂ C), 2.65 (m,2H, CCH₂ CO₂), 2.85 (s,4H, CH₂C
H₂ ), 2.9-3.15 (m,2H, ArCH₂ ), 3.78 (s,3H,CH ₃), 4.
82 (m,1H, CH), 6.5 (d,1H, NH), 7.1-7.65 (s,4H, Ar-
H)。

【００４０】段階３ Ｎ−｛４−〔４−（ベンジルオ
キシカルボニル）ピペラジノカルボニル〕ブチリル｝サ
イロキシンメチルエステル。段階２由来の反応性エステ
ルと１−ピペラジンカルボン酸ベンジルとの反応。 この物質は、段階２由来の反応性エステルであるＮ−
（４−スクシンイミドキシカルボニルブチリル）サイロ
キシンメチルエステルを使うこと以外は中間体の調製１
の段階４に概説した手順を使って調製した。この物質を
カラムクロマトグラフィー（SiO₂）を使って精製した。¹ H-NMR (CDCl₃) δ 1.95 (m,2H, CCH ₂C), 2.3-2.5 (m,
4H, CH₂CCH ₂), 2.95-3.2(m,2H, ArCH₂ ), 3.4-3.65 (m,
8H,ピペラジンＨ), 3.78 (s,3H,CH ₃), 4.8 (m,1H,CH),
6.6 (d,1H, NH), 7.1 & 7.65 (s,4H, Ar-H)。

【００４１】段階４ Ｎ−（４−ピペラジノカルボニ
ルブチリル）サイロキシンメチルエステル。段階３由来
の保護アミンの30% HBr/HOAc処理。 この物質は、段階３由来の保護アミンであるＮ−｛４−
〔４−（ベンジルオキシカルボニル）ピペラジノカルボ
ニル〕ブチリル｝サイロキシンメチルエステルを使うこ
と以外は中間体の調製１の段階５に概説した手順を使っ
て調製した。

【００４２】段階５ Ｎ−｛４−〔４−（４−カルボ
キシブチリル）ピペラジノカルボニル〕ブチリル｝サイ
ロキシンモノメチルエステル。段階４由来のアミン臭化
水素酸塩のグルタル酸無水物での処理。 この物質は、グルタル酸無水物を段階４由来のＮ−（４
−ピペラジノカルボニルブチリル）サイロキシンメチル
エステルと反応させること以外は中間体の調製１の段階
６に概説した手順を使って調製した。この物質をカラム
クロマトグラフィー（SiO₂）により精製した。¹ H-NMR (CDCl₃) δ 1.95 (m,4H, 2× CCH ₂C), 2.3-2.5
(m,8H, 2 ×CH₂CCH ₂),2.9-3.2 (m, 2H, ArCH₂ ), 3.4-
3.7 (m, 8H,ピペラジンＨ), 3.78 (s,3H,CH ₃),4.8 (m,1
H,CH), 6.7 (d,1H, NH), 7.05 & 7.65 (s, 4H, Ar-H)。

【００４３】段階６ Ｎ−｛４−〔４−（４−スクシ
ンイミドキシカルボニルブチリル）ピペラジノカルボニ
ル〕ブチリル｝サイロキシンメチルエステル。段階５由
来の酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応。 この物質は、段階５由来の酸であるＮ−｛４−〔４−
（４−カルボキシブチリル）ピペラジノカルボニル〕ブ
チリル｝サイロキシンモノメチルエステルを使用するこ
と以外は中間体の調製１の段階７に概説した手順を使っ
て調製した。この物質をカラムクロマトグラフィー（Si
O₂）により精製した。¹ H-NMR (CDCl₃) δ 1.95 (m,2H, CCH ₂CCO₂), 2.1 (m,
2H, CCH₂ CCON), 2.2-2.6(m,6H, CH₂CCH ₂, NCOCH ₂CCH₂),
2.75 (m,2H, CH₂CCH ₂CO₂), 2.82 (s,4H,CH₂CH₂ ), 2.9-
3.2 (m,2H, ArCH₂ ), 3.4-3.7 (m, 8H,ピペラジンＨ),
3.78 (s,3H,CH ₃), 4.8 (m,1H,CH), 6.6 (d,1H, NH), 7.
1 & 7.65 (s,4H, Ar-H)。

【００４４】

【更なる具体的な態様】本発明の類似体は、次のような
構造１を有するものを包含する：

【００４５】

【化６】

【００４６】上式中、−Ｚ−は１，４−ピペラジニレ
ン、２，５−ジメチル−１，４−ピペラジニレン、１，
３−イミダゾリジニレン、１，３−ヘキサヒドロジアゼ
ピニレン、１，４−ピペラジニレンカルボニル、２，５
−ジメチル−１，４−ピペラジニレンカルボニル、１，
３−イミダゾリジニレンカルボニル、１，３−ヘキサヒ
ドロジアゼピニレンカルボニル、オキサ（−Ｏ−）、チ
ア（−Ｓ−）、イミノ（−ＮＲ¹−）から選ばれ、ここ
でＲ¹ は水素または１〜６個の炭素原子を有するアルキ
ルであり； Ｌ¹ およびＬ² は各々その中に10〜22個の鎖原子を有す
る結合鎖であって、(i) Ｚと一緒になって、１，４−ピ
ペラジニレン；２，５−ジメチル−１，４−ピペラジニ
レン；１，３−イミダゾリジニレンおよび１，３−ヘキ
サヒドロジアゼピニレンから選ばれた少なくとも１つの
環基；並びに(ii)１または複数のＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキレン
基を含み、基(i) と(ii)が−Ｏ−、−Ｓ−、イミノ、カ
ルボニル、アミド（-OCNR¹- および -NR¹CO-）およびエ
ステル（-COO- および-OCO- ）から選ばれた１または複
数の基を介して互いに連結している結合鎖であり； Ｒ³ は１〜10個の炭素原子を有するアルキル、ヒドロキ
シアルキルまたはアルコキシであり； Ｒ⁴ は１〜10個の炭素原子を有するアルキルであり；そ
してｍは０または１である。

【００４７】代表的な標識サイロニンハプテン類似体は
下記の手順に従ってサイロニンハプテン類似体から調製
した。標識調製例において使用した乾燥ジメチルスルホ
キシドはAldrich #27,685-5 であった。サイロキシンを
含む全ての反応は黄色光下で実施した。

【００４８】比較調製例： 標識Ａの調製 ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識された中
間体の調製１の段階３由来のＮ−（スクシンイミドキシ
カルボニルメトキシアセチル）サイロキシンメチルエス
テル（標識Ａ）の調製。 この調製は比較のためであって、本発明のイムノアッセ
イにおいて用いる例ではない。

【００４９】中間体の調製１の段階３由来のサイロキシ
ンハプテン（49mg）を2.176 mlの乾燥ジメチルスルホキ
シド（DMSO）中に溶かした。この溶液 (200 μl)をDMSO
で最終容量1.0 mlにした。Ｎ−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピペラジン−Ｎ′−（３−プロパンスルホン酸）緩
衝液（EPPS, 0.1M, pH 8）を用いて西洋ワサビペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）の溶液を調製した。この溶液を希釈
して最終濃度9.0 mg/ml にした後、403 nmにおいてタン
パク質吸光度を測定した。（Ａ₄₀₃ 1 mg/ml＝2.24）

【００５０】ＨＲＰ溶液（１ml）を渦動攪拌しながら滴
下添加して500 μl のDMSOと混合し、2400 rpmの速度に
設定された振盪器中に室温で15分間置いた。サイロキシ
ン／ＨＲＰのモル比が10/1になるように、使用直前に調
製した上記サイロキシンハプテン溶液（500 μl ）を渦
動攪拌下でＨＲＰに滴下添加した。この反応液を前記振
盪器に戻し、４時間インキュベーションした。この反応
液を、反応容器を洗うために使用した更に１mlの３−モ
ルホリノプロパンスルホン酸（MOPS, 0.2M, pH7）と一
緒にSpectrapor #2 透析チューブに入れた。

【００５１】反応液を3 L の0.2M MOPS, pH 7 に対して
8 ℃にて16時間透析した。緩衝液交換の間を少なくとも
４時間あけて前記透析緩衝液をもう３回交換した。透析
後、試料を0.8 μm のMillipore フィルターを通して濾
過し、保存剤として濃度0.02％となるようにメルチオレ
ートを添加し、そして標識を凍結保存した。

【００５２】

【実施例】実施例１ 標識Ｂ： Ｎ−〔４−（３−スクシンイミドキシカルボ
ニルプロピオニル）ピペラジノカルボニルメトキシアセ
チル〕サイロキシンメチルエステル−ＨＲＰ（標識Ｂ）
の調製

【００５３】中間体の調製１由来のＮ−〔４−（３−ス
クシンイミドキシカルボニルプロピオニル）ピペラジノ
カルボニルメトキシアセチル〕サイロキシンメチルエス
テル（19.3 mg ）を1.332 mlのDMSOに溶かした。この溶
液（217 μl ）を325 μl のDMSOに加えた。ＨＲＰ溶液
を0.1M EPPS 緩衝液, pH 8を用いて調製した。この溶液
を希釈して最終濃度10.0 mg/mlにした後、403 nmにおい
てタンパク質吸光度を測定した。

【００５４】ＨＲＰ溶液（１ml）を渦動攪拌しながら滴
下添加して500 μl のDMSOと混合し、室温で2400 rpmの
速度に設定された振盪器中に置いた。振盪を約30分間続
けた。サイロキシン／ＨＲＰのモル比が10/1になるよう
に、使用直前に調製した上記サイロキシンハプテン溶液
（500 μl ）を渦動攪拌下でＨＲＰに滴下添加した。こ
の反応液を前記振盪器に戻し、４時間インキュベーショ
ンした。この反応液を、反応容器を洗うために使用した
１mlの透析緩衝液と一緒にSpectrapor #2 透析チューブ
に入れた。

【００５５】反応液を3 L の0.2M MOPS, pH 7 に対して
8 ℃にて16時間透析した。緩衝液交換の間を少なくとも
４時間あけて前記透析緩衝液をもう３回交換した。透析
後、試料を0.8 μm のMillipore フィルターを通して濾
過し、保存剤として濃度0.02％となるようにメルチオレ
ートを添加し、そして標識を凍結保存した。

【００５６】実施例２ 標識Ｃ： Ｎ−〔４−（スクシンイミドキシカルボニル
メトキシアセチル）ピペラジノカルボニルメトキシアセ
チル〕サイロキシンメチルエステル−ＨＲＰの調製

【００５７】中間体の調製２由来のＮ−〔４−（スクシ
ンイミドキシカルボニルメトキシアセチル）ピペラジノ
カルボニルメトキシアセチル〕サイロキシンメチルエス
テル（18.4 mg ）を1.225 mlのDMSOに溶かした。この溶
液（217 μl ）を325 μl のDMSOに加えた。ＨＲＰ溶液
を0.1M EPPS 緩衝液, pH 8を用いて調製した。この溶液
を希釈して最終濃度10.0 mg/mlとなるようにした後、40
3 nmにおいてタンパク質吸光度を測定した。

【００５８】ＨＲＰ溶液（1 ml）を渦動攪拌しながら滴
下添加により500 μl のDMSOと混合し、次いで室温で24
00 rpmに設定された振盪器中に置いた。振盪を約30分間
続けた。サイロキシン／ＨＲＰのモル比が10/1になるよ
うに、使用直前に調製した上記サイロキシンハプテン溶
液（500 μl ）を渦動攪拌下でＨＲＰに滴下添加した。
この反応液を上記の振盪器に戻し、４時間インキュベー
ションした。該反応液を、反応容器を洗うために使用し
た１mlの透析緩衝液と一緒にSpectrapor #2 透析チュー
ブに入れた。

【００５９】反応液を3 L の0.02M MOPS, pH 7に対して
8 ℃にて16時間透析した。緩衝液交換の間を少なくとも
４時間あけて前記透析緩衝液をもう３回交換した。透析
後、試料を0.8 μm のMillipore フィルターを通して濾
過し、保存剤として濃度0.02％となるようにメルチオレ
ートを添加し、そして標識を凍結保存した。

【００６０】実施例３ 標識Ｄ： Ｎ−｛３−〔４−（３−スクシンイミドキシ
カルボニルプロピオニル）ピペラジノカルボニル〕プロ
ピオニル｝サイロキシンメチルエステル−ＨＲＰ（標識
Ｄ）の調製

【００６１】中間体の調製３由来のＮ−｛３−〔４−
（３−スクシンイミドキシカルボニルプロピオニル）ピ
ペラジノカルボニル〕プロピオニル｝サイロキシンメチ
ルエステル（5.8 mg）を1 mlのDMSOに溶かした。ＨＲＰ
溶液を0.1M EPPS 緩衝液, pH 8を用いて調製した。この
溶液を希釈して最終濃度10.0 mg/mlにした後、403 nmに
おいてタンパク質吸光度を測定した。

【００６２】ＨＲＰ溶液（1 ml）を渦動攪拌しながら滴
下添加により500 μl のDMSOと混合し、室温で20分間転
倒回転させた。サイロキシン／ＨＲＰのモル比が10/1に
なるように、使用直前に調製した上記サイロキシンハプ
テン溶液（500 μl ）を渦動攪拌下でＨＲＰに滴下添加
した。この反応容器をホイルで覆い、室温で４時間転倒
回転させた。この反応液を、反応容器を洗うために使用
した１mlの透析緩衝液と一緒にSpectrapor #2 透析チュ
ーブに入れた。

【００６３】反応液を3 L の0.02M MOPS, pH 7に対して
8 ℃にて16時間透析した。緩衝液交換の間を少なくとも
４時間あけて前記透析緩衝液をもう３回交換した。透析
後、試料を0.22μm のMillipore フィルターを通して濾
過し、保存剤として濃度0.02％となるようにメルチオレ
ートを添加し、そして標識を凍結保存した。

【００６４】実施例４ 伸長したピペラジンリンカーから調製したサイロキシン
−ＨＲＰ（標識Ｂ＆標識Ｃ）の比較 活性化剤として塩化１−（１−ピロリジニルカルボニ
ル）ピリジニウムを使って、サイロキシンモノクローナ
ル抗体（Beckman T4AS12）をポリ〔スチレン−コ−３−
（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕のカルボキ
シル基含有ビーズに共有結合せしめることにより（モル
比 97.6/2.4 ；重量比 95/5 ）、固定化抗体ビーズを調
製した。前記コポリマーは米国特許第 5,147,777号明細
書に記載された手順に従って調製した。前記抗体を米国
特許第 5,155,166号明細書に記載の通りに固定化せしめ
た。

【００６５】サイロキシン−ＨＲＰ標識を結合する固定
化サイロキシン抗体の能力を下記に指摘の如く測定し
た：抗体ビーズを、0.1 ％ウシγグロブリン（ＢＧＧ）
と 0.87mM ８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸ア
ンモニウム塩（ＡＮＳ）とを含有するＰＢＳ（リン酸緩
衝溶液，pH 7.4）で連続希釈して2000〜0.63 nM 抗体結
合部位の濃度を与えた。これらのビーズ希釈液を同容量
の10×10^-11 Ｍのサイロキシン−ＨＲＰ標識と混合し
た。１時間のインキュベーション後、遠心によってビー
ズをペレット化した。上清の試料を100 μl の基質（ｏ
−フェニレンジアミン／H₂O₂）と混合した。450 nmにお
ける発色速度を標準物のそれと比較し、溶液中に残って
いるサイロキシン−ＨＲＰ標識の量を算出した。試験し
た最大抗体濃度（1000 nM 結合部位）における固定化抗
体に結合した標識の量を報告する。

【００６６】 標識 1000 nM 結合部位における結合した標識の％ Ｂ ６３ Ｃ ６１ 試験した両標識の大部分が固定化抗体により結合され
た。

【００６７】実施例５ 伸長したピペラジンリンカーから調製したサイロキシン
−ＨＲＰ接合体（標識Ｄ）の免疫適格 標識Ｄを結合する固定化サイロキシン抗体の能力を本発
明の実施例４に記載の通りに測定した。試験した最大抗
体濃度（1000 nM 結合部位）における固定化抗体に結合
した標識の量を報告する。

【００６８】 標識 1000 nM 結合部位における結合した標識の％ Ｄ ７８ 試験した該標識の大部分が固定化抗体により結合され
た。

【００６９】実施例６ グリコレートリンカーを有するサイロキシン−ＨＲＰ接
合体（標識Ａ）とピペラジンリンカーを有する接合体
（標識Ｄ）との比較 標識ＡおよびＤを結合する固定化サイロキシン抗体(Ab
1) の能力を実施例４に記載の通りに測定した。固定濃
度のそれらの標識（最終濃度 5×10^-11 Ｍ）の50％を結
合するのに要する固定化抗体結合部位の量を報告する。
第二のサイロキシン抗体（Ab2, T7-3.1,コダック社で調
製したもの）もこの実験で評価した。

【００７０】 標識 標識の50％を結合するのに要する結合部位 Ab1 Ab2 Ａ 7 ×10^-8Ｍ 1 ×10^-6Ｍ Ｄ 3 ×10^-8Ｍ 3 ×10^-7Ｍ それらの結果は、伸長したピペラジンリンカーから調製
した接合体の方が２つの固定化サイロキシン抗体をより
一層強固に結合することを示す。

【００７１】本発明のイムノアッセイは、溶液中でまた
は乾式分析要素上で実施することができる。アッセイを
乾式要素上で実施するのが好都合である。該要素は単層
もしくは多層またはそのような層の中に区画を有する層
の組合せであることができる。一般に該要素は、輻射線
透過性支持体、１または複数の試薬層、好ましくは特定
のサイロニンに対する抗体が上に固定化されているビー
ズを含む粒状展開層を含んで成ることができる。

【００７２】それらの層は当業界で周知の塗布技術を使
って塗布することができる。少なくとも１つの層が固定
化抗体ビーズを有する重合体粒子から成る複数の層の同
時塗布には、例えば米国特許第 2,761,417号明細書に記
載された型のスライド押出機ホッパーがしばしば有利で
ある。より詳細には、ビーズを含む塗布用組成物をスラ
イド押出機ホッパーの押出スロットから注ぎ、そして同
時に、所望であれば更にビーズを含んでもよい第二の塗
布用組成物の層をスライド押出機ホッパーのスライド面
を下って流すことにより、多層要素を塗布することがで
きる。

【００７３】サイロニン抗体が固定化される粒状層は多
孔質である。そのような層に使われる材料は乾式分析要
素を製造する業界において周知である。好ましい粒状層
はビーズ展開層（ＢＳＬ）である。この層は、希釈され
たまたは未希釈の試験試料（例えば１〜100 ml）を収容
するため本発明の要素における使用に適する多孔度を有
するように容易に作製することができる。好ましくは、
展開層は等方性多孔質であり、この特性は区画を含む粒
子の間の不連続空間により造られる。等方性多孔質と
は、展開層が適用された流体を層全体に放射状に均質に
広げることを意味する。ビーズ展開層を包含する有用な
粒状展開層は、米国特許第 4,670,381号；同第4,258,00
1号および同第4,430,436 号明細書において開示されて
いる。

【００７４】該要素の粒状層は適当な支持体上に担持さ
れる。そのような支持体は、任意の適当な寸法安定性
の、好ましくは非孔質で且つ約200 〜約900 nmの波長の
電磁線を透過する透明な（すなわち輻射線透過性の）材
料である。特定要素についてより抜きの支持体は、意図
する検出方式（反射、透過または蛍光分光法）と適合性
であるべきである。有用な支持体材料としては、ポリス
チレン、ポリエステル〔例えば、ポリ（エチレンテレフ
タレート）〕、ポリカーボネート、セルロースエステル
（例えばセルロースアセテート）等が挙げられる。

【００７５】該要素は１または複数の追加の層、例え
ば、他の必要な添加剤、カップリング酵素等を含有する
別々のまたは組み合わせた試薬／展開層およびゼラチン
／緩衝剤層を含んで成ることができる。

【００７６】該要素のゼラチン／緩衝剤層または試薬層
もしくは展開層は、１または複数の合成もしくは天然の
バインダー材料、例えばゼラチン、または他の天然に存
在するコロイド、ホモポリマーおよびコポリマー、例え
ばポリ（アクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリド
ン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ
（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）
および同様なコポリマー中に分散された１または複数の
試薬を含んで成る指示薬組成物を含有することができ
る。

【００７７】所望であれば、他の随意の層、例えば下
層、輻射線遮断層等を含めることができる。該要素の全
ての層は互いに流体接触状態にあり、この流体接触状態
とは、流体並びに流体中の試薬および未結合の反応生成
物が隣接層の重なった領域間を通過することができるこ
とを意味する。

【００７８】該要素の層は、望ましいが随意である他の
様々な成分、例えば界面活性剤、増量剤、緩衝剤、硬化
剤、酸化防止剤、カプラー溶剤、および当業界で既知の
他の物質を含有することができる。それらの成分の量は
当業者の技量の範囲内である。

【００７９】該要素は液体、例えば生物学的流体（例え
ば全血、血清、血漿、尿、脊髄液、ヒトおよび動物組織
の懸濁液、糞便、唾液、リンパ液等）中の低濃度のサイ
ロニンを測定するのに利用することができる。サイロニ
ン、特にサイロキシンは約10 ^-15 モルほどの低濃度、最
も一般的には約10^-10 〜約10^-4モルの濃度において測定
することができる。

【００８０】該アッセイは、定義されたサイロニン誘導
体に取りつけることができる任意の適当な標識を使って
実施することができる。有用な標識としては、放射性標
識、色素、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素阻害剤、アロ
ステリックエフェクター、補因子および他の既知の酵素
モジュレーターが挙げられる。酵素、例えばグルコース
オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペ
ルオキシダーゼおよびアミン富化西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ並びにガラクトシダ
ーゼが好ましい標識である。

【００８１】酵素標識を使用する時、酵素基質は要素中
に存在するかまたは顕色液中において該要素に添加され
る。基質は液体試料の前もしくは同時に、または結合反
応の完了後に該要素に添加することができる。特定の標
識に対して適当な基質を決定することは臨床化学の当業
者の技量の範囲内である。基質は、酵素標識により直接
作用を受ける物質、または標識の酵素的反応を含む一連
の反応に関与する物質であることができる。例えば、酵
素標識がペルオキシダーゼである場合、基質は過酸化水
素である。一例としてグルコースオキシダーゼを使った
時、基質であるグルコースは通常試薬層に存在するかま
たは顕色液中に添加されて約0.01モル／m²、好ましくは
約0.001 〜約0.1 モル／m²を与える。当業者はアッセイ
において使用する酵素標識の量に対して特定基質の量を
調整する方法を知っているだろう。

【００８２】ある種の標識、例えば酵素、補因子、酵素
基質または酵素モジュレーターを使用する時、試薬層
は、標識の反応の結果として検出可能な種を提供する１
または複数の試薬を含んで成る指示薬組成物を含有す
る。好ましくは、指示薬組成物は、酵素標識されたリガ
ンド類似体と基質との酵素反応の結果として比色法によ
り検出可能な種を提供する比色指示薬組成物である。

【００８３】指示薬組成物は酵素反応により検出可能な
色素を生成する単一化合物であるかまたは色素を生成す
る試薬の組合せであることができる。例えば、グルコー
スを基質として使用し、グルコースオキシダーゼを酵素
標識として使用する時、比色指示薬組成物は、反応する
と色素を提供するカプラーと酸化性化合物を含むことが
できる。あるいは、該組成物は、グルコースオキシダー
ゼがグルコースをグルコン酸に変換する時に生じる過酸
化水素の形成の結果として検出可能な色素を生成するロ
イコ色素とペルオキシダーゼまたは他の適当な過酸化性
化合物を含むことができる。有用なロイコ色素は当業界
で既知であり、例えば、米国特許第 4,089,747号明細書
と米国特許出願第612,509 号明細書に記載されたものが
挙げられる。比色指示薬組成物およびそれの種々の成分
の特定量は当業者の技量の範囲内である。

【００８４】本発明のアッセイは、手動または自動であ
ることができる。一般に、要素を供給ロール、チップパ
ケットまたは他の供給源から取り、そして展開層の限定
領域を液体の試料、例えば 1〜100 mlと物理的に接触せ
しめることにより、液体中のリガンドの量が決定され
る。接触させる限定領域は通常約100 mm ² 以下である。

【００８５】リガンドの量は、複合体を形成したリガン
ド類似体を直接的にまたは酵素標識と基質との酵素反応
の結果として形成される検出可能な種を検出するための
適当な装置に該要素を通過させることにより決定され
る。例えば、前記種は、一般に既知の手順を使って適当
な放射線測定装置、蛍光測定装置または分光光度装置を
用いて検出することができる。酵素反応では、生じた生
成物は、例えば、試験試料と接触させた限定領域の中心
における反射もしくは透過濃度または蛍光を測定するこ
とにより決定される。測定される領域は、競合アッセイ
については通常直径約３〜約５ mm である。液体試料中
のリガンドの量は、限定領域の中心において測定された
標識の量に反比例する。好ましい態様では、複合体を形
成したリガンドと複合体を形成していないリガンドとの
分離を最大にするために別個の顕色段階を必要とする。
一般的に、試料接触と展開または顕色液の適用から約 5
〜約180 秒後に標識測定が実施される。

【００８６】次の実施例は、乾式イムノアッセイ要素上
でイムノアッセイを都合良く実施する際の標識サイロニ
ン誘導体の実用性を具体的に示している。これらの例の
各々では実用性はサイロニン誘導体のサイロキシン態様
を用いて具体的に示される。

【００８７】次の実施例では、アッセイ手順は次のプロ
トコールに従って段階的に実施した。試料10 ml を本発
明の乾式イムノアッセイ要素の最上面にスポットした。
このスポットした試料を有する要素を37℃で５分間イン
キュベーションした。本発明の要素ではビーズ展開層中
のレセプター結合部位を目当てにした標識リガンドと未
標識リガンドとの間の競争の平衡はわずか５分後に完了
するだろうと予想される。このインキュベーション期間
後、要素をインキュベーターから取り出し、10μl の酵
素基質溶液を使って顕色する。これらの実施例で使用す
るアッセイでは、標識が西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）であり、そして顕色液中に使われる基質は約
0.03重量％のH₂O₂である。顕色液はリン酸ナトリウム緩
衝剤（pH 6.8）0.01M 、４′−ヒドロキシアセトアニリ
ド（電子移動剤）0.005M、ジエチレントリアミン五酢酸
10mM および界面活性剤も含有する。顕色液は検出可能
な種の発色を引き起こす。結合したＨＲＰ標識リガンド
は無色のロイコ色素から着色形への酸化を触媒する。そ
のような色素は乾式分析要素技術において公知であるの
でここでは詳細に記載しない。ここに与えられる実施例
では、ロイコ色素はトリアリールイミダゾールである。
触媒反応速度は、37℃での一定期間に渡る反射濃度の変
化から測定される。反射濃度を測定する方法および手段
は当分析技術において公知である。

【００８８】実施例７ この実施例は、分析要素の調製およびサイロキシンを検
出するための競合結合イムノアッセイにおける新規標識
サイロニンハプテン類似体を有する該要素の使用を具体
的に示す。該要素は次の構造を有するように既知の技術
を使って調製した：

【００８９】

【表１】

【００９０】サイロキシンを含む一連のヒト血清ベース
のキャリブレーターおよびサイロキシン−ＨＲＰ標識
（調製実施例１由来の標識Ｂまたは調製実施例３由来の
標識Ｄ）を調製した。サイロキシン−ＨＲＰ標識は該要
素の層または区画中に含めることもできた。サイロキシ
ンの濃度は0.25〜31.1μg/dlの範囲であった。サイロキ
シン−ＨＲＰ標識を添加し、最終濃度1.5 nMとなるよう
にした。一連のサイロキシン標準物（10μl アリコー
ト）を一連の分析要素の展開層上にスポットした。37℃
で５分間インキュベーションした後、過酸化水素（0.03
％）、リン酸ナトリウム緩衝剤（0.01M, pH 6.8 ）、
４′−ヒドロキシアセトアニリド（5 mM）、ジエチレン
トリアミン五酢酸（10μM ）および塩化ヘキサデシルピ
リジニウム（0.1 ％）を含んで成る洗浄溶液（10μl ）
を添加して検出区画から未結合の複合体を洗い流し、色
素生成を開始させた。約40秒後、反射濃度（Ｄ_r ）を領
域の中心において37℃にて680 nmで測定した。Ｄ_r 値を
クラッパー−ウイリアムズ（Clapper-Williams）変換に
よりＤｔに変換した。60秒間に渡るＤｔの変化を計算し
た。結果を下に示す。

【００９１】 上記の結果は、試験したどちらの伸長したピペラジンリ
ンカー標識についても、所望のダイナミックレンジに渡
り速度に有意な変化があることを示す。

【００９２】

【発明の効果】イムノアッセイにおいて使用する標識サ
イロニンハプテン類似体は免疫反応性が60％まで再現性
である。標識は良好な流失性を有する。それらは比較的
低い置換率のために低い非特異的結合を有する。また結
合基の構造は、得られる用量応答に良好な影響をもたら
し、従ってサイロニンアッセイの性能に良好な影響を与
える。この良好な影響は、サイロニンの所望の測定範囲
に渡る結合した標識類似体の量の変化の割合が一層大き
いことに由来する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パトリシア ネジェマン タイミンスキ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14580, ウェブスター，ペン クリーク ドライ ブ 112 (72)発明者 イグナツィオ サルバトレ ポンティセ ロ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14534, ピッツフォード，コッパー ウッズ 21 (56)参考文献 特開 昭59−104554（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−500731（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/532 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （Ａ）アミン基またはスルフヒドリル基
   を有する、イムノアッセイで使う型の標識； （Ｂ）サイロニン核；並びに （Ｃ）(i) 前記サイロニン核のアミノ基またはカルボキ
   シル基と(ii)前記標識のアミン基またはスルフヒドリル
   基とを介して前記サイロニン核を前記標識に結合してい
   る鎖原子数10〜22個の結合鎖であって、(iii) １，４−
   ピペラジニレン；２，５−ジメチル−１，４−ピペラジ
   ニレン；１，３−イミダゾリジニレンおよび１，３−ヘ
   キサヒドロジアゼピニレンから成る群から選ばれた少な
   くとも１つの環基；並びに(iv)１または複数のＣ₁ 〜Ｃ
   ₆ アルキレン基を含む結合鎖であるが、但し、基(iii)
   と基(iv)は、−Ｏ−、−Ｓ−、イミノ、アミド、カルボ
   キシルおよびカルボニルから成る群から選ばれた１また
   は複数の基を介して互いに連結している前記結合鎖を含
   んで成る標識薬剤ハプテン類似体。
2. 【請求項２】 サイロニン誘導体についてのイムノアッ
   セイであって、 Ａ．サイロニン誘導体を含有する液体試料と、請求項１
   に記載の前記誘導体の標識サイロニンハプテン類似体と
   を、前記サイロニン誘導体に対する抗体の存在下、抗体
   −サイロニン免疫複合体の生成を促進する条件下で接触
   せしめる段階；そして Ｂ．前記液体中のサイロニン誘導体の結合量または未結
   合量を測定する段階を含んで成るイムノアッセイ。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の標識サイロニンハプテ
   ン薬剤類似体の層、区画または被膜を有するイムノアッ
   セイ要素。