JPH04231873A - バルビツレート検定法、トレーサー、免疫抗原、抗体およびキット - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明はバルビツレート検定法、
トレーサー、免疫抗原、抗体およびキット、詳しくは、
流体、特に血清、血漿または尿などの生物学的流体中の
バルビツレートの量を測定する蛍光偏光免疫学的検定操
作のための方法および試薬、並びに該試薬の製造法に関
する。更に詳しくは、本発明は、（１）試料中のバルビ
ツレートの量を測定する試薬（トレーサーおよび抗体、
およびトレーサーと抗体を含有するキット）、（２）抗
体を発生させるのに用いる免疫抗原化合物、（３）トレ
ーサーおよび免疫抗原化合物を製造する合成法、および
（４）当該検定を行う分析法に関する。 【０００２】 【従来の技術と発明が解決しようとする課題】バルビツ
レートは中枢神経系抑制薬である。治療上、バルビツレ
ートは鎮静薬、催眠薬および抗けいれん薬として用いら
れている。バルビツレートの法的利用可能性は衰退しつ
つあるが、バルビツレートは頻繁に乱用される鎮静薬あ
るいは催眠薬であって、一般に自殺をするために用いら
れている。 【０００３】バルビツレートの生理学的吸収、作用およ
び毒性は、広範囲に変化し、かつ５−置換基およびイミ
ノ−水素の性質に左右される。血液中の約３５％のバル
ビツレートは血漿プロテインと結合する。バルビツレー
トは各種の組織や器官に分布する。バルビツレートは主
に肝臓で代謝し、そして数種のものを除き、一般に主に
非活性代謝産物として尿の中に排泄される。 【０００４】最も普通に乱用されるバルビツレートは、
短時間作用乃至中間時間作用型の、セコバルビタール、
ペントバルビタール等である。これらのバルビツレート
は、刺激薬の使用に基づく興奮状態を和らげるのに広く
用いられている。これら薬物に対する耐性は、慢性使用
によって進行し、そして該薬物の過剰投与量あるいは突
然の退薬のいずれかによって死を招くことがある。 【０００５】従来、尿中のバルビツレート量は一般的に
、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスク
ロマトグラフィー（ＧＣ）、酸素免疫学的検定法（ＥＩ
Ａ）、基質−結合蛍光免疫学的検定法（ＳＬＦＩＡ）お
よび放射免疫学的検定法（ＲＩＡ）によって測定されて
いた。これらの方法は、薬物量の検出に対してかなり特
異的であるが、欠点を否定できない。すなわち、ＨＰＬ
ＣおよびＧＣ法には試料の抽出操作が必要で、かつ検定
時間が長い。ＥＩＡおよびＳＬＦＩＡでは共に酵素反応
が必然的に伴い、かつ以下の欠点を有する。 １）試薬が比較的に不安定である。 ２）ＥＩＡまたはＳＬＦＩＡの酵素反応に影響を及ぼし
うる、生物学的試料中のいずれかの成分（たとえば酵素
インヒビターまたは類する反応を触媒促進する酵素）が
検定結果に影響を及ぼす。 ３）ＥＩＡおよびＳＬＦＩＡは吸収度または蛍光のいず
れかを測定し、そして吸収度または蛍光に影響を及ぼし
うる、生物学的試料中のいずれかの成分（たとえば脂質
、ヘモグロビン、ビリルビンまたは他の発色団もしくは
発光団）が該検定から得られる結果の正確さに影響を及
ぼす。 一方、ＲＩＡの試薬は以下の欠点を有する。 ｉ）　　半減期が短い。 ｉｉ）　放射能が生命を危険にさらす。 ｉｉｉ）放射性物質の貯蔵および廃棄に問題が付随する
。 【０００６】一般に、試験試料中のリガンドを測定する
のに、競合結合免疫学的検定法が使用されている。ここ
で、“リガンド”は、競合結合免疫学的検定法で定量的
に測定される。生物学的に興味のある物質である。リガ
ンドは標識試薬、または“リガンド類縁体”もしくは“
トレーサー”と競合するが、これはリガンドおよびリガ
ンド類縁体に対し特有の抗体における限られた数の結合
部位においてである。試料中のリガンド濃度は、抗体に
結合するリガンド類縁体の量を決定する。結合するリガ
ンド類縁体の量は、試料中のリガンド濃度に反比例する
が、これはリガンドおよびリガンド類縁体がそれぞれ、
その濃度に比例して抗体に結合するからである。 【０００７】蛍光偏光は、競合結合免疫学的検定法にお
いて生じるトレーサー−抗体接合の量を測定するのに定
量手段を付与する。蛍光偏光法は、蛍光標識化合物が、
平面偏光によって励起されるとき、分子回転の速度に対
して逆比的に関係する偏光率を持つ蛍光を発するという
原理に基づく、従って、トレーサー−抗体接合を有する
蛍光標識が平面偏光と共に励起されると、発光団（ｆｌ
ｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）は光が吸収されおよび発射される
時間の間で回転するのを抗体によって抑制されるため、
発射した光は高偏光の状態のままで残存する。これに対
し、未結合トレーサーが平面偏光によって励起されると
、その回転は対応するトレーサー−抗体接合の回転より
はるかに速くなる。その結果、未結合トレーサー分子か
ら発した光は偏光しなくなる。 【０００８】これまで、尿におけるバルビツレートや他
の“乱用薬物”の蛍光偏光法による正確な測定が妨げら
れてきた問題は、リボフラビン干渉にある。リボフラビ
ン、あるいはビタミンＢ２は多くの食品や商業上入手し
うるビタミン補給品の一般的成分である。リボフラビン
は主に尿中に排泄され、かつフルオレセインに極めて類
する蛍光スペクトルを有する。その結果、尿試料中にた
とえ大したことのない量でもリボフラビンが存在すると
、間違った結果をもたらしうる干渉が起る。リボフラビ
ンの正常な消費では、痕跡量を越えるリボフラビンを尿
中に生成させるとは思われないが、バルビツレート使用
の発覚の阻止を望む人による過剰量のビタミン補給品の
消費によって、試験結果が容易にゆがめられる。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明の特徴は、一般に
用いられるバルビツレートに対するより均一なクロス反
応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）にある。さ
らに本発明は、特にリボフラビン干渉を伴わないバルビ
ツレートの測定に対し、トレーサー、該トレーサーの製
造法、および該トレーサーを用いる検定法を提供するこ
とによって、当該技術の進歩を図るものである。 【００１０】すなわち、本発明はバルビツレートの蛍光
偏光検定法、該検定法に用いるトレーサー、免疫抗原お
よび抗体、試薬キット、並びに上記トレーサー、免疫抗
原および抗体の製造法に関連する。 【００１１】本発明の第１の観点は、新規構造を有する
ユニークなトレーサーおよび免疫抗原の発見に関係する
。この第１観点によれば、当該トレーサーおよび免疫抗
原はそれぞれ、式： 【化１１】 および 【化１２】 で示され、式中、トレーサー［２７］の場合、Ｗは酸素
または硫黄；Ｒ１は直鎖または分枝鎖状に配列され、か
つ１個以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、トータ
ル１〜１２個の炭素原子および０〜１個のハロゲン原子
を有する、アルキル、アルケニル、アリール、またはア
ルキニル基；Ｒ３はＲ４−Ｆｌ；Ｆｌはフルオレセイン
またはフルオレセイン誘導体；およびＲ４は（ａ）直鎖
または分枝鎖状に配列され、かつ１個以下の脂肪族また
は芳香族環構造を持ち、トータル０〜１５個の炭素原子
およびＯ、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＦのヘテロ原子を有する結
合基、または（ｂ）トータル０〜５個のヘテロ原子を有
する結合基である。また免疫抗原［２］の場合、Ｗは酸
素または硫黄；Ｒ１は１個以下の脂肪族または芳香族環
構造を持ち、トータル１〜１２個の炭素原子および０〜
１個のハロゲン原子を有する、アルキル、アルケニル、
アリール、またはアルキニル基；Ｒ２はＲ−Ｑ；Ｑはポ
リ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体、または他の
免疫抗原的に活性な担体；および する結合基、（ｂ）直鎖または分枝鎖状に配列され、か
つ１個以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、トータ
ル０〜２０個の炭素原子およびＯ、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＦ
のヘテロ原子を有する結合基、または（Ｃ）トータル０
〜７個のヘテロ原子を有する結合基である。 【００１２】本発明の第２の観点は、新規な免疫抗原に
対して製造される単クローン性または多クローン性抗体
に関係する。この第２観点によれば、該抗体は免疫抗原
［２］に応じて製造される。本発明の最も好ましい抗体
は、式： 【化１３】 で示される新規な免疫抗原［２９］に応じて製造される
。 【００１３】本発明の第３の観点によれば、免疫抗原は
、式［２］において、Ｗが酸素または硫黄；Ｒ１が直鎖
または分枝鎖状に配列され、かつ１個以下の脂肪族また
は芳香族環構造を持ち、トータル１〜１２個の炭素原子
を有する、アルキル、アルケニル、アリールまたはアル
キニル基；Ｒ２がＣＨ２−Ｒ−Ｘ； 【化１４】 ；およびＲが直鎖または分枝鎖状に配列され、かつ１個
以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、７個以下のヘ
テロ原子またはトータル０〜２０個の炭素原子およびヘ
テロ原子を有する結合基である化合物［２］を、ポリ（
アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または他の免疫抗
原的に活性な担体とカップリング反応させる工程から成
る方法によって合成することができる。 【００１４】本発明の第４の観点によれば、式［２７］
において、Ｗが酸素または硫黄；Ｒ１が直鎖または分枝
鎖状に配列され、かつ１個以下の脂肪族または芳香族環
構造を持ち、トータル１〜１２個の炭素原子を有するア
ルキル、アルケニルまたはアルキニル基；Ｒ３がＣＨ２
−Ｒ−Ｙ；ＹがＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＣｌ、ＳＯ３Ｈ
、ＳＯ２Ｃｌ、ＳＨ、ＣＨＯ、ＣＮ、ＯＨまたはＩ；お
よびＲが直鎖または分枝鎖状に配列され、かつ１個以下
の脂肪族または芳香族環構造を持ち、１０個以下のヘテ
ロ原子またはトータル０〜２０個の炭素原子およびヘテ
ロ原子を有する結合基である化合物［２７］を、フルオ
レセインまたはフルオレセイン誘導体とカップリング反
応させることによる、トレーサーの製造法が提供される
。 【００１５】好ましくは、トレーサーは、式［２７］に
おいて、ＷおよびＲ３が前記と同意義；Ｒ１が分枝鎖状
に配列され、かつ環構造を持たない、４または５個の炭
素原子を有するアルキル基；ＹがＮＨ２またはＣＯＯＨ
；およびＲが直鎖または分枝鎖状に配列され、かつ環構
造を持たない、３個以下のヘテロ原子またはトータル３
〜５個の炭素原子およびヘテロ原子を有する結合基であ
る前駆体［２７］をカップリング反応させることによっ
て製造される。 【００１６】好ましいフルオレセイン誘導体としては、
アミノ、アミド、アミジノ、尿素、チオ尿素、カルバミ
ド、チオカルバミドまたはトリアジニルアミノ誘導体が
挙げられる。現時点で最も好ましい誘導体はアミノ誘導
体、特にアミノメチルフルオレセインである。 【００１７】本発明の第５の観点は、リボフラビンによ
る潜在的蛍光干渉の排除に関係する。当該検定法で用い
る各試料または１種以上の試薬のいずれかに、直接リボ
フラビン結合プロテイン（ＲＢＰ）を加えると、ＲＢＰ
は存在する全リボフラビンと結合してＲＢＰ−リボフラ
ビン錯体となり、このようにして蛍光干渉が排除される
。 この目的に、他の蛍光消光物質も利用することができる
。 【００１８】本発明の第６の観点によれば、バルビツレ
ート濃度の検出または測定法が提供される。試料を、バ
ルビツレート抗血清と、およびバルビツレート抗血清の
存在に対して検知しうる蛍光偏光応答をもたらすことが
できるフルオレセイン含有バルビツレート誘導体と接触
せしめる。得られる溶液に平面偏光を通して、蛍光偏光
応答を得、次いでこの蛍光偏光応答を、試料中のバルビ
ツレートの量の測度として検出する。 【００１９】本発明の第７の観点は、単一検定法で一般
使用のバルビツレートを検出するのに有用な安定化した
試薬キットに関係する。この試薬キットは、本発明の新
規方法で試薬として用いる新規トレーサー、またはその
塩を含有する。本発明に係る試薬キットの他の成分とし
ては、リボフラビンによる蛍光干渉を減少させるのに有
効量のリボフラビン結合プロテインおよび一般使用のバ
ルビツレートを明確に認知しかつ該バルビツレートに結
合しうる免疫抗原に対して産生する抗体試薬および本発
明の新規トレーサー試薬を含有する溶液が挙げられる。 【００２０】本発明の他の目的および付随利点について
は、以下の詳細な説明および実施例の記載から容易に理
解されるだろう。 【００２１】下記に示す式中、記号「Ｆｌ」はフルオレ
セイン成分を表わし、他の各種記号については後記で説
明する。式： 【化１５】 は、本発明に従って準定量的に測定される各種バルビツ
レートの一般構造式を示す。式： 【化１６】 は、本発明の免疫抗原並びに該免疫抗原の製造に用いる
各種反応体の一般構造式を示す。式： 【化１７】 は、本発明のトレーサーに含まれるフルオレセイン成分
の交互構造式を示す。式： 【化１８】 は、式［２］がトレーサーの前駆体を表わすとき、フル
オレセイン成分を式［２］の前駆体にカップリングさせ
る各種結合基を示す。式： 【化１９】 【化２０】 【化２１】 【化２２】 【化２３】 【化２４】 【化２５】 【化２６】 【化２７】 【化２８】 【化２９】 【化３０】 【化３１】 【化３２】 【化３３】 は、本発明に係るトレーサーの各種具体例の構造式を示
す。式： 【化３４】 【化３５】 【化３６】 【化３７】 【化３８】 【化３９】 【化４０】 は、本発明で用いる免疫抗原の形成に使用するハプテン
反応体の各種具体例の構造式を示す。式：【化４１】 は、本発明のトレーサー並びに該トレーサーの製造に用
いる各種反応体の一般構造式を示す。式：【化４２】 は、本発明の好ましい免疫抗原を示す。式：【化４３】 は、本発明の最も好ましい免疫抗原を示す。式：【化４
４】 は、本発明の最も好ましいトレーサーを示す。式：【化
４５】 は、本発明の好ましいトレーサーを示す。 【００２２】本発明は、フルオレセインおよびフルオレ
セイン誘導体の使用を要する。特に、本発明のトレーサ
ー化合物の有用性に対してフルオレセインおよびその誘
導体の必要な性質は、フルオレセインの蛍光である。フ
ルオレセインは式［３］で示されるように、環境の酸濃
度（ｐＨ）に基いて２つの互変異性体で存在する。開環
（酸）型において、多数の共役二重結合が存在し、開環
型のフルオレセイン（およびフルオレセイン成分を含有
する化合物）は、約４×１０−９秒の励起状態寿命後に
、ブルー光を吸収し、かつグリーン蛍光を発することが
可能となる。開環型と閉環（ラクトン）型が共存すると
、開環および閉環型の分子の相対濃度は、ｐＨレベルの
調整によって容易に変えられる。一般に、本発明のトレ
ーサー化合物は、生理学的に許容しうる塩（たとえばナ
トリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等）の溶液で
存在することにより、本発明の分析法で使用する場合、
開環蛍光型で存在することが可能となる。存在する特定
の塩は、ｐＨレベルの調整に用いる緩衝剤に左右される
。たとえば、リン酸ナトリウム緩衝剤が存在すると、本
発明のトレーサー化合物は一般に、ナトリウム塩の開環
型で存在する。 【００２３】なお、本明細書において個々の化合物また
はより大なる化合物の一成分として用いる語句“フルオ
レセイン”は、蛍光の点を除き、個々の分子に存在する
場合、開環および閉環型の両方を含むことを意味する。 開環型は蛍光を起す上で必要である。 【００２４】フルオレセイン分子の炭素原子の番号付け
は、該分子の開環型または閉環型のいずれを考慮するか
によって変化する。すなわち、フルオレセインおよびそ
の化合物に関する文献において、炭素原子の番号付けは
一定していない。閉環型において、フェニル環上のラク
トンのカルボニルに対しパラ位の炭素の番号は６である
。開環型において、フェニル環上のカルボン酸基に対す
るパラ位の炭素の番号は５である（式［３］参照）。こ
の開示において、閉環型での番号付けを採用するが、そ
れは合成に用いられる原料が最も一般的に、かかるシス
テムで番号付けされているからである。従って、フルオ
レセインおよびその化合物のカルボキシル基と反対側の
炭素原子の番号を“６”とする。 【００２５】抗体と複合しない溶液状態のトレーサーは
、蛍光の吸収および再発射に必要な時間より少ない時間
で自由に回転しうる。その結果、再発射した光は比較的
ランダムに配向するので、抗体と複合しないトレーサー
の蛍光偏光は低く、ゼロに近づく。特定抗体と共に複合
すると、形成されるトレーサー−抗体錯体は、比較的小
さなトレーサー分子より遅い、抗体分子の回転を装うこ
とにより、偏光の増大が観察される。従って、リガンド
が抗体部位に対しトレーサーと競合するとき、得られる
自由トレーサーとトレーサー−抗体錯体の混合物の蛍光
の観察される偏光は、トレーサーの値とトレーサー−抗
体錯体の値の中間値を呈示する。試料が高濃度のリガン
ドを含有する場合、観察される偏光値は自由トレーサー
の値に接近、すなわち低くなる。試験試料が低濃度のリ
ガンドを含有する場合は、偏光値は結合トレーサーの値
に接近、すなわち高くなる。免疫学的検定の反応混合物
を、垂直そして水平に偏光する光で連続的に励起し、次
いで発射光の垂直成分のみを分析することにより、反応
混合物中の蛍光の偏光を正確に測定することができる。 測定されるリガンドの偏光と濃度の明確な関係は、キャ
リブレータの偏光値を公知濃度のリガンドで測定するこ
とによって確立される。試料中のリガンド濃度は、この
方法で作成した標準曲線から外挿することができる。 【００２６】本発明によって形成される特定の抗体およ
びトレーサーは、極めて良好な検定法をもたらすことが
わかった。 【００２７】本発明の記載に先立って、広範なバルビツ
レート特異性を持つ免疫学に基づく診断試験を開発する
問題（すなわち、式［１−１〜６］で示されるような一
般使用のバルビツレートに対し、免疫学的検定法で用い
られ、かつリガンドおよびトレーサーに対し特異的な抗
体の特異性の欠如またはより不均一なクロス反応性）は
、１つのバルビツレートに対してそれぞれ特効薬である
数種の抗血清を患者の試料と混合することにより解決さ
れた。しかし、この異なるバルビツレート特異性を持つ
抗体の混合によって、感度が低く、クロス反応性が乏し
く、かつロットからロットの抗血清ブレンドの変異性が
大きいという重大な欠点を持つ検定法をもたらす。 【００２８】本発明は上記問題を解決した。驚くべきこ
とに、広範なバルビツール特異性を持つ免疫学に基づく
診断試験の開発は、免疫競合環境において、たった１つ
のバルビツール構造に対し産生するモノクローン性また
は多クローン性抗体を、適当なトレーサー（蛍光−標識
バルビツレート誘導体）との組合せで使用した場合に可
能であることがわかった。最適な組合せは、免疫抗原と
５員環構造を含有するトレーサーであることがわかった
。本発明の検定法において、この広範なバルビツレート
特異性は、抗血清中に含有される抗体を産生するのに用
いるトレーサーおよび免疫抗原を以下の条件を満足する
よう設計することによって達成される。すなわち、（１
）トレーサーおよび免疫抗原は共に、一般使用のバルビ
ツレートに類する化学構造を有すること、および（２）
抗血清中に含有される抗体は、トレーサーに対し特異的
であるよりはむしろクロス反応性を示し、このためトレ
ーサーとの結合親和力が小さく、抗体とトレーサーの結
合の置換を可能ならしめること。試料中の各種バルビツ
レートは、同様に抗体からトレーサーを置換する能力を
有するため、一般使用の各種バルビツレートのためのよ
り等価な検出システムがもたらされる。広範なバルビツ
ール特異性を持つ免疫学に基づく診断試験をもたらす、
抗体とトレーサーのいずれの組合せも、全く予測しえる
ものではない。すなわち、他の組合せではなく上記組合
せを必然的に伴う一定の実験から得られる有利な結果は
、全く予想外のものである。 【００２９】従って、本発明の方法は以下の点で、当該
分野で記載の関連技術とは著しく相違する。すなわち、
免疫学検定法の免疫学試薬の多特異性は一般に該検定法
の２つの重要な免疫学試薬（トレーサーおよび抗体）を
産生するのに、２種のバルビツレート誘導体を使用する
ことによって達成される点である。本発明は、広範なバ
ルビツレートに対し同等に応答する異常な能力を有する
。 より等価なバルビツレート検出システムを提供する。加
えて、本発明は、数種の免疫学試薬の混合から生じる上
記免疫学反応性に関して、当該分野で記載の検定法の不
確実性を解消する。さらに、本発明の免疫学的検定法の
広い特異性は、現在市場に出ており、かつ生物学的試料
のバルビツレートを検定するキットに含まれる、検定法
の特異性より優れている。すなわち、本発明の免疫学的
検定法は、当該分野で記載の方法あるいは社会一般に公
開される他の方法と比べて、より急速でかつ正確なバル
ビツレート検定法を付与するが、その理由は以下の通り
である。 （１）分析前に検体処理の必要がないこと、（２）広ス
ペクトルのバルビツレート特異性を有すること、 （３）抗体特異性はバルビツレートに類する化合物以外
の実質的全ての化合物の検出を阻止するため、試料中の
１種以上のバルビツレートの存在を正確に測定すること
、（４）一般使用のバルビツレート間のクロス反応性が
乏しいため、高濃度過大評価に基づき確認できないバル
ビツレート濃度を持つ試料の別途分析を阻止すること、
および （５）不均質な免疫学的検定操作と異なる均質な検定法
であって、最終偏光表示数値を読む前に、結合トレーサ
ーを未結合トレーサーから分離する必要がないこと。 【００３０】このように、本発明の免疫学的検定法は特
に、以下の点で有利である。すなわち、当該分野で記載
の問題（低感度、乏しいクロス反応性、および抗血清ブ
レンドのロットからロットの広い変異性）を有すること
なく、身体流体中の広範なバルビツレート薬物を検出す
るのに使用しうる点である。かかる免疫学的検定法は、
スクリーニング検定の使用が望ましい。何故なら、バル
ビツレートスクリーニング検定において、使用する抗体
をバルビツレートに類するどの化合物にも同等に反応さ
せることが望しく、かつ当該検定法が法医学、臨床医学
および産業界において広い適用性を有するからである。 【００３１】試薬および試薬キット 　　本発明の免疫抗原およびトレーサーは共に、前記の
一般構造式で示すことができる。試料中のバルビツレー
トの存在またはその量を測定する本発明の新規方法の目
的は、抗体の認知部位に対しバルビツレートとトレーサ
ーを競合させることである。この目的達成において、ヘ
プテンおよびトレーサーの構造における大きな変動が可
能となる。本発明の目的において、“ハプテン”は免疫
抗原の前駆体であって、一般に、免疫学的活性な担体に
結合するのに適当な基を持つ置換バルビツレート誘導体
からなる。 【００３２】生物学的流体中のバルビツレートの存在ま
たはその量を測定する本発明の新規な試薬キットは、前
記式［２７］（式中、Ｗ，Ｒ１，Ｒ３、ＦｌおよびＲ４
は前記と同意義）の第１トレーサーの塩、および前記式
［２］（式中、Ｗ，Ｒ１，Ｒ２，ＱおよびＲは前記と同
意義）の構造を有する免疫抗原に対して産生する単クロ
ーン性または多クローン性抗体を包含する。一般に、抗
体は一般使用のバルビツレートに類する構造を持つ免疫
抗原に対して産生し、トレーサーは一般使用のバルビツ
レートに類する構造を有するが、免疫抗原の構造に類し
ない構造を有する。好ましくは、試薬キットはリボフラ
ビンによる蛍光干渉を減少させるのに有効量のリボフラ
ビン結合プロテインをも含有する。試薬キットでの使用
に最も好ましいトレーサーは、前記式［３０］のトレー
サーであるが、試薬キットでの使用に最も好ましい抗体
は、前記式［２９］の免疫抗原に産生する抗体である。 試薬キットでの使用に最も好ましいトレーサーと抗血清
の組合せは、前記式［３０］のトレーサーと前記式［２
９］の免疫抗原に対して産生する単クローン性または多
クローン性抗体の組合せである。 【００３３】免疫抗原の構成 　　使用できる抗体は、多種のバルビツレート誘導体か
ら産生することができる。環上の５位に官能基を持つ化
合物から作られる免疫抗原は、動物の抗体を産生するこ
とができ、かかる抗体は適当なトレーサーと組合せるこ
とにより、本発明に係るバルビツレート検定法で用いら
れる。 【００３４】本発明の免疫抗原は、前記式［２］の一般
構造式で示され、本発明の好ましい型において、免疫抗
原は前記式［２］の一般構造式からも誘導される。本発
明の最も好ましい免疫抗原は、前記式［２９］で示され
る。免疫抗原は、下記合成法および実施例の記載から説
明されるように、前記式［２］の化合物をポリ（アミノ
酸）もしくはポリ（アミノ酸）誘導体または他の免疫抗
原的に活性な担体とカップリング反応させることによっ
て製造することができる。 【００３５】本発明の免疫抗原の最も好ましい型におい
て、使用するポリ（アミノ酸）はサイログロブリンであ
るが、アルブミン類、血清プロテイン、たとえばグロブ
リン類、接眼レンズ（ｏｃｕｌａｒ　　ｌｅｎｓ）プロ
テイン、リポプロテインなどを含む各種のプロテイン担
体を使用しうることを理解すべきである。プロテイン担
体の具体例としては、サイログロブリン以外に、チロキ
シン結合グロブリン、牛血清アルブミン、キーホールか
さ貝（ｋｅｙｈｏｌｅ　　ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン
、卵オボアルブミン、牛ガンマグロブリン等が挙げられ
る。別法として、アスパラテートなどの、十分な数の有
効カルボキシレート基を有する合成ポリ（アミノ酸）を
使用することができ、同様に反応性官能基を持つ他の合
成または天然ポリマー物質も使用できる。 【００３６】本発明の免疫抗原のほとんどは、免疫抗原
的に活性な担体にハプテンを結合させる、−ＣＨ２−、
−ＣＨ＝または しやすいＲを前記式［２］の化学式の変化しやすいＱへ
直接結合させる。当該分野で公開されていないこれらの
免疫抗原の１つの利点は、本発明の免疫抗原の免疫抗原
的活性担体成分へ、免疫抗原のハプテン成分を直接結合
させる非ペプチド結合が極めて安定であることである。 すなわち、本発明の免疫抗原は、たとえばヤマオカらの
「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ
」（２８、５１、１９７９年）に記載の免疫抗原より安
定である。ヤマオカらが記載するペプチド結合とは異な
り、本発明の多くの新規免疫抗原で採用する結合基は、
生物学的環境における加水分解に対する感受性が著しく
少ない。たとえば、前記式［２１］、［２２］および［
２３］に官能基を持った新規ハプテンが示されており、
かかるハプテンはヨードアセタミドの基を含有し、かつ
塩基性ｐＨにて、免疫抗原的活性担体にカップリング反
応することができ、これによって非ペプチド結合が形成
される。また前記式［２４］、［２５］および［２６］
のそれぞれに示されるハプテンは、還元アミノ化法によ
って、免疫抗原的活性担体にカップリング反応すること
ができ、この結果、非ペプチド結合が形成される。 【００３７】本発明の好ましい免疫抗原は、前記式［２
８］の構造を有する。本発明の最も好ましい免疫抗原は
、前記式［２９］で示される。 【００３８】トレーサーの構成 本発明のトレーサーの構造の可能な変動は、ハプテンの
構造の可能な変動と比べてはるかに大きい。本発明のト
レーサーは、前記式［２７］（式中、Ｗ，Ｒ１，Ｒ３，
ＦｌおよびＲ４は前記と同意義）の一般構造式で示され
る。本発明の好ましい型において、トレーサーは前記式
［５］〜［３１］のいずれかの構造式で示される。本発
明の最も好ましいトレーサーは、前記式［３０］で示さ
れる。 【００３９】トレーサーは、たとえば前記式［４−１〜
１２］で示されるアミノ、アミジノ、トリアジニルアミ
ノ、カルバミド、チオカルバミド、カルバモイル、チオ
カルバモイルまたはスルホニルカルバモイル基によって
、フルオレセイン誘導体に結合するバルビツレート誘導
体である。トレーサーは、下記合成法および実施例の記
載から説明されるように、アミノ基、カルボン酸基、ス
ルホン酸基、メルカプト基、ヒドロキシル基、イミデー
ト基、ヒドラジド基、イソシアネート基、チオイソシア
ネート基、クロロホルメート基、クロロチオホルメート
基、カルボン酸クロリド基、クロロスルホニルカルバモ
イル基などを含有するバルビツレート誘導体に、適当な
フルオレセイン誘導体を結合させることによって製造さ
れる。 【００４０】具体例として、以下に示すフルオレセイン
誘導体のいずれかを使用することができる。 Ｆｌ−ＣＨ２−ＮＨ２，アミノメチルフルオレセインＦ
ｌ−ＮＨ２，フルオレセインアミン Ｆｌ−ＣＯ２Ｈ，カルボキシフルオレセインＦｌ−ＮＨ
ＣＯＣＨ２Ｉ，α−ヨードアセタミドフルオレセイン Ｆｌ−ＮＨＣＯＣＨ２Ｂｒ，α−ブロモアセタミドフル
オレセイン 式： 【化４６】 の２，４−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イ
ルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）式：【化４７】 の４−クロロ−６−メトキシ−１，３，５−トリアジン
−２−イルアミノフルオレセイン Ｆｌ−ＮＣＳ、フルオレセインチオイソシアネート【０
０４１】本発明の新規トレーサーにおける、フルオレセ
イン成分とバルビツレート環部間の炭素−炭素二重結合
の存在は、抗体との最適相互作用となるようトレーサー
を有利に配向することが、予想外にもわかった。すなわ
ち、本発明のトレーサーは、トレーサーのフルオレセイ
ンとリガンド成分間にエチレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）結合
基を有することにより、以下に示す２つの予期しえない
有利な特性を具備する。 （１）安定性が大きいこと、および （２）トレーサーのフルオレセイン（またはフルオレセ
イン誘導体）とリガンド成分間の相互作用が減少する結
果、抗体への結合力が増大すること。 【００４２】本発明のトレーサーが結合基の二重結合に
基づき、驚くべき安定性に高いという最初の特性は、下
記表１に示すデータによって証明される。 表１ 【表１】 表１（つづき） 【表２】 【００４３】上記表１のデータによれば、トレーサーの
フルオレセインとリガンド成分間にエチレン（−ＣＨ＝
ＣＨ−）結合基を有するトレーサー（表１つづき）は、
かかるエチレン結合基を欠くトレーサー（表１）と比べ
、各種の温度での安定性がかなり大きいことが認められ
る。 エチレン結合基を含有するトレーサーの安定性は、２〜
８℃および４５℃の両温度において、１日目と７日目と
でほぼ同等であるが、かかるエチレン結合基を欠くトレ
ーサーでは、２〜８℃の温度において７日目には安定性
が３０％減少し、しかも温度４５℃における７日目では
、実質的に全ての結合能力を失う（偏光値の８０％以上
）。 【００４４】二重結合を欠く化合物は約１２時間の寿命
を有するため、合成後１２時間で不安定となるが、二重
結合を含有する化合物では、かなり長い期間にわたって
安定のままで存在する。下記表２（ａ）および２（ｂ）
に示すデータによれば、トレーサーのフルオレセインと
リガンド成分間にエチレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）結合基を
有するトレーサーは、各種の温度において、少なくとも
１年および１年半にわたって安定のままで存在しうるこ
とが認められる。なお、表２（ａ）に示すデータを作成
するのに、前記式［５］の化学構造を持つトレーサーを
使用し、一方、表２（ｂ）に示すデータを作成するのに
、前記式［３０］の化学構造を持つトレーサーを使用し
た。これらのデータから、当該トレーサーは長期間にわ
たって安定であることが認められる。 【００４５】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　表２（ａ）　　期間　　　　　　　　温度（℃）　　
　　　　　　　　偏光値　　　　　　　　　　平均純強
度　　０日　　　　　　　　２−８　　　　　　　　　
　２０９．１７　　　　３４００−５０００　　１日　
　　　　　　　２−８　　　　　　　　　　２０６．６
１　　　　３２９０−４７３３　　２日　　　　　　　
　２−８　　　　　　　　　　２０７．０７　　　　３
２００−４６７０　　３日　　　　　　　　−２０　　
　　　　　　　　２０７．３８　　　　３３９５−４９
６５　　　　　　　　　　　　　　２−８　　　　　　
　　　　２０８．０５　　　　３３６７−４８９５　　
　　　　　　　　　　　　　　３７　　　　　　　　　
　２０７．６０　　　　３４００−４９１０　　　　　
　　　　　　　　　　　４５　　　　　　　　　　２０
５．５１　　　　３４００−４９５０　　１週間　　　
　　　−２０　　　　　　　　　　２０８．４６　　　
　３３００−４８００　　　　　　　　　　　　　　２
−８　　　　　　　　　　２０８．２５　　　　３４０
０−４９００　　　　　　　　　　　　　　　　３７　
　　　　　　　　　２０２．７８　　　　３５００−５
０００　　　　　　　　　　　　　　　　４５　　　　
　　　　　　２００．１１　　　　３５５０−５２００
　　２週間　　　　　　−２０　　　　　　　　　　２
０８．８５　　　　３１８０−４６３５　　　　　　　
　　　　　　　２−８　　　　　　　　　　２１０．４
１　　　　３１００−４５９０　　４週間　　　　　　
２−８　　　　　　　　　　２１０．３５　　　　３３
９５−４９８８　　２ケ月　　　　　　２−８　　　　
　　　　　　２０７．２１　　　　３２８２−４７７７
　　４ケ月　　　　　　２−８　　　　　　　　　　２
０５．５９　　　　３２１０−４７７５　　８ケ月　　
　　　　２−８　　　　　　　　　　２０６．８５　　
　　３１５０−４６７７　　１年　　　　　　　　２−
８　　　　　　　　　　２０４．８５　　　　３１６１
−４６１５１８ケ月　　　　　　２−８　　　　　　　
　　　１９９．２９　　　　３３０４−４７９８　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　表２
（ｂ）　　期間　　　　　　　　温度（℃）　　　　　
　　　　　偏光値　　　　　　　　　　平均純強度　　
０日　　　　　　　　２−８　　　　　　　　　　１７
７．２９　　　　　　　　２６８６　　１日　　　　　
　　　２−８　　　　　　　　　　１７７．２３　　　
　　　　　２７３２　　２日　　　　　　　　２−８　
　　　　　　　　　１７８．３２　　　　　　　　２６
９８　　３日　　　　　　　　−２０　　　　　　　　
　　１７８．４８　　　　　　　　２７０６　　　　　
　　　　　　　　　２−８　　　　　　　　　　１７６
．４５　　　　　　　　２６６４　　４日　　　　　　
　　　　３７　　　　　　　　　　１７６．５３　　　
　　　　　２６４９　　　　　　　　　　　　　　　　
４５　　　　　　　　　　１７６．５６　　　　　　　
　２６９０　　１週間　　　　　　２−８　　　　　　
　　　　１７８．６９　　　　　　　　２７０５　　　
　　　　　　　　　　　　　３７　　　　　　　　　　
１８０．０２　　　　　　　　２７１０　　　　　　　
　　　　　　　　　４５　　　　　　　　　　１７５．
９６　　　　　　　　２６８１　　２週間　　　　　　
２−８　　　　　　　　　　１７８．０１　　　　　　
　　２６４２　　　　　　　　　　　　　　　　３７　
　　　　　　　　　１７９．８１　　　　　　　　２６
５２　　　　　　　　　　　　　　　　４５　　　　　
　　　　　１７２．６９　　　　　　　　２７６０　　
４週間　　　　　　２−８　　　　　　　　　　１８４
．１６　　　　　　　　２６６９２．５ケ月　　　　２
−８　　　　　　　　　　１７６．４７　　　　　　　
　２６９２　　４ケ月　　　　　　２−８　　　　　　
　　　　１７５．５３　　　　　　　　２６６５６．５
ケ月　　　　２−８　　　　　　　　　　１７６．９０
　　　　　　　　２７４１　　９ケ月　　　　　　２−
８　　　　　　　　　　１７４．３４　　　　　　　　
２８１６【００４６】二重結合を含有する化合物に関し
、かかる二重結合を欠く化合物と比較しての第２の重要
な利点がある。二重結合を含有しない化合物の場合、該
化合物のフルオレセイン（またはフルオレセイン誘導体
）とリガンド成分間にかなりの相互作用が起り、免疫学
的検定法において抗体に対し結合するリガンド成分の能
力が損うという不都合な結果となる。これに対し、二重
結合を含有する化合物は結果的に厳正な立体化学を具備
する。すなわち、フルオレセイン（またはフルオレセイ
ン誘導体）とリガンド成分間に相互作用はほとんどなく
、免疫学的検定法においてリガンド成分は抗体に対し自
由に結合する状態となる。 【００４７】抗体 本発明の抗体は、上記免疫抗原に対する羊の応答を喚起
することによって製造される。当業者にとって周知の方
法で、動物またはインビトロ培養の免疫反応能細胞に免
疫抗原を一連の接種で投与する。理解すべき点は、本明
細書で詳述する実験において、バルビツレート免疫抗原
に対し羊が好ましい免疫性宿主であるが、上述の化学構
造に抗体を産生しうるインビボまたはインビトロ宿主も
使用できることである。本発明の最も好ましい抗体は、
前記式［２９］の免疫抗原に対し産生する抗体である。 【００４８】免疫抗原の合成 本発明の免疫抗原は、前記式［２］（Ｘがクロロホルメ
ート、アルデヒド、カルボキシル、アミノ、クロリド、
ブロミド、ヨージドまたはヒドロキシのとき）の一般構
造式で示されるようなハプテンを、ポリ（アミノ酸）ま
たは他の免疫抗原的活性担体にカップリング反応させる
ことによって作られる。ポリ（アミノ酸）または他の担
体成分はハプテンに対し、カルバメート、アミド、チオ
エーテル、エーテル、ジアゾまたはアミノ結合基によっ
て結合させることができる。最も好ましい具体例におい
て、ポリ（アミノ酸）はサイログロブリンで、免疫抗原
は前記式［２９］の構造を有する。 【００４９】免疫抗原は、アルデヒド、カルボキシル、
アミノ、塩素、臭素、ヨウ素、ヒドロキシドまたはヨー
ドアセトニル基を含有するハプテンを、ポリ（アミノ酸
）または他の免疫学的活性担体にカップリング反応させ
ることによって製造される。アルデヒドは、ポリ（アミ
ノ酸）または他の免疫学的活性担体のアミノ基と共にシ
ッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）塩基を形成することにより、カッ
プリング反応を行うことができる。シッフ塩基を直ぐに
シアノホウ水素化ナトリウムで還元して、安定なアミノ
メチル結合基を形成する。ポリ（アミノ酸）のカルボキ
シル基の活性化は、ハプテンおよびポリ（アミノ酸）を
、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）
カルボ−ジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキ
シルカルボジイミド（ＤＤＣ）、１−シクロヘキシル−
３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド、メチル
−ｐ−トルエンスルホネートなどと混合することにより
行うことができる。ヒドラジドの場合は、非芳香族アミ
ノの場合と同様な方法でカップリング反応を行う。アル
キル、クロロ、ブロモおよびヨード誘導体とスルホネー
トエステルは、強アルカリ性条件下でチロシン残基のフ
ェノール性ヒドロキシル基をアルキル化して、アルキル
アリールエーテルを形成し、またシステインの遊離スル
フヒドリル基の硫黄をアルキル化してチオエーテルを形
成する。これらの反応において、好ましい誘導体はヨー
ドアセトニル類およびヨージド類である。 【００５０】上記ハプテン（免疫抗原前駆体）の合成は
、２つの一般法の一方で行う。前記式［２］に、本発明
方法の好ましい具体例に係る免疫抗原前駆体が示されて
いる。この製法は、適当な置換マロネートまたはシアノ
アセテートエステルを、保護されたアルコール官能基を
有するブロモアルキルアルコール、好ましくはテトラヒ
ドロピラニルアルコールでアルキル化することにより進
行する。かかる中間体を尿素で環化するには、上記反応
体の溶液混合物を、マグネシウムメトキシド、マグネシ
ウムエトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエ
トキシド、またはカリウムｔ−ブトキシドなどの塩基で
処理することによって行うことができる。保護された官
能基を暴露し、化合物をポリ（アミノ酸）または他の担
体にカップリング反応させる。 【００５１】免疫抗原の５−ヨードアセトニルバルビツ
レート前駆体は、末端二重結合を持つ５−アルケン基を
有する、適当な５，５−ジ置換バルビツレート（前記式
［２］）を、ヨージド／水と反応させることによって製
造される。この方法で、３−ヒドロキシ−ヨードバルビ
ツレートを製造する。対応するα−ヨードアセトニルバ
ルビツレートは、これらの化合物をクロム系酸化剤（た
とえばジョーンズ試薬など）で酸化することによって得
られる。 【００５２】末端二重結合を有する適当な５−アルケニ
ルバルビツレート（前記式［２］）をメタノール中、−
７８℃にてオゾン分解することにより、アルデヒドを製
造することができる。アルデヒド（前記式［２］）を得
る他の好ましい方法は、適当な置換マロネートエステル
またはシアノアセテートエステルを、好ましくはアセタ
ルとしての、保護されたアルデヒド官能基を有するブロ
モアルキルアルデヒド反応させることによる。かかる中
間体を尿素で環化するには、上記反応体の溶液混合物を
、ナトリウムエトキシド、ナトリウムメトキシド、カリ
ウムメトキシド、またはカリウムｔ−ブトキシドなどの
塩基で処理することによって行うことができる。保護さ
れた官能基を暴露し、化合物をポリ（アミノ酸）または
他の担体にカップリング反応させる。 【００５３】適当なアルデヒドをクロム系酸化剤（たと
えばジョーンズ試薬など）で酸化することにより、カル
ボン酸を得る。カルボキシアルキルバルビツレートまた
はカルボキシアルケンバルビツレートの好ましい合成法
は、適当な５−置換バルビツレート（前記式［２］）を
トリエチルアミン、水素化ナトリウム、カリウムｔ−ブ
トキシドなどの塩基の存在下、ハロゲンアルキルエステ
ルまたはハロゲンアルケニルエステルと反応させた後、
適当なバルビツレートエステルを濃塩酸、４０％硫酸な
どの鉱酸で加水分解することによる。 【００５４】アルキルハライドは、アルコールを塩化水
素、臭化水素またはヨウ化水素で処理するか、あるいは
塩化チオニルなどのハロゲン化試薬で処理することによ
り製造することができる。これらのハライドは、比較的
中性条件下で直接、遊離スルフヒドリル基または担体に
、または強塩基性条件下でポリ（アミノ酸）のチロシル
残基などにおけるようなフェノール類にカップリングす
る。 【００５５】トレーサーの合成 本発明の２つの好ましいトレーサーの構造は、前記式［
５］および［３１］に示される。本発明の最も好ましい
トレーサーの構造は、前記式［３０］に示される。 【００５６】本発明のトレーサーは、フルオレセイン成
分またはフルオレセイン誘導体を、前記式［２７］（式
中、Ｗ，Ｒ１，Ｒ３，ＦｌおよびＲ４は前記と同意義）
の一般構造にカップリング反応させることによって作ら
れる。 【００５７】フルオレセイン成分は、前記式［４−１〜
１２］で示されるアミド、アミン、尿素、チオ尿素、カ
ルバメート、チオカルバメート、トリアジニルアミノま
たはスルホニルカルバメート結合基によって、アミノ、
カルボキシル、アルデヒド、酸クロリド、イミデートま
たはアルコキシ官能基に結合させることができる。好ま
しい具体例において、フルオレセイン誘導体はアミノメ
チルフルオレセインであって、これを前記式［２７］（
式中、Ｒ１は（メチル）ブチルまたは１−メチルプロピ
ルおよびＲ３は−ＣＨ２、−ＣＯＯＨまたは−ＣＨ２−
ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ２Ｈである）で示される前駆体にカッ
プリング反応させる。最初に、バルビツレートのカルボ
ン酸を用いて混合無水物を形成することにより、適当な
カルボキシアルケニルバルビツレートをアミノエチルフ
ルオレセインにカップリング反応させる。混合無水物は
イソブチルクロロホルメートを用いて製造される。好ま
しい方法では、ジメトキシエタンを用いる。 【００５８】他の活性化基、たとえば酸クロリド、１−
ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド、ｐ−ニトロフェノール、および２−エチル−
５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネートを
使用でき、また他の溶剤、たとえばテトラヒドロフラン
、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、およびヘキサメチレンホスホルアミドを使用できる
。反応体はアミド結合を形成する条件下でカップリング
反応させることが好ましく、また混合無水物法を用いる
ことが最も好ましい。使用できるトレーサーは、各種の
バルビツレートから製造することができる。 【００５９】アミノ、ヒドラジニル、ヒドラジドなどの
末端アミノ基を有する全てのバルビツレートを、活性エ
ステル法または混合無水物法によりカルボキシフルオレ
セインにカップリング反応させ、また単に両物質を溶液
状態で混合することによって、フルオレセインイソチオ
シアネート、ＤＴＡＦ、またはアルコキシＤＴＡＦにカ
ップリング反応させる。アミノ基は、ホスゲンまたはチ
オホスゲンと反応させることにより、それぞれイソシア
ネート基またはチオイソシアネート基に変換することが
できる。次いでこれらをアミノメチルフルオレセインと
縮合して、トレーサーを製造する。 【００６０】末端アルデヒド基を有する全てのバルビツ
レートを、ホウ水素化ナトリウムによる還元アミノ化で
アミノメチルフルオレセインにカップリング反応させる
。 【００６１】末端ヒドロキシル基を有する全てのバルビ
ツレートを、ホスゲンと反応させた後、溶液状態のアミ
ノメチルフルオレセイン、ＤＴＡＦ、α−ヨードアセタ
ミドフルオレセイン、α−ブロモアセタミドフルオレセ
イン、またはフルオレセインイソチオシアネートと反応
させることにより、フルオレセインにカップリング反応
させることができる。５−ヨードアセトニル基を有する
全てのバルビツレートをアミノメチルフルオレセインに
カップリング反応させて、トレーサーを製造する。 【００６２】注目すべき点は、本発明の観点の中に、フ
ルオレセイン成分とバルビツレート環間の炭素−炭素二
重結合の存在が、抗体との最適相互作用が得られるよう
にトレーサーを配向させるといった知見が含まれること
である。 【００６３】検定法 本発明の個々のトレーサーおよび抗体は、バルビツレー
トの蛍光偏光検定法において驚くべき良好な結果をもた
らすことがわかった。 【００６４】前記式［１−１〜６］に、本発明に従って
定量的または定性的に測定されるバルビツレートの幾つ
かの一般構造が示されている。 【００６５】本発明の検定法は、分析前にいかなる検体
処理も必要とせず、かつ該検定法によって広範なスペク
トルバルビツレート特異性が示されることから、従来法
のほとんどと比べて、より急速かつ正確なバルビツレー
ト検定法を付与する。かかる検定システムは試料中のバ
ルビツレートの存在を正確に測定するが、それは抗体特
異性がバルビツレート類似化合物以外のほとんどの化合
物の検出を阻止するからである。 【００６６】本発明の生物学的流体中のバルビツレート
の存在またはその量を測定する新規な方法は、（Ａ）試
料を、前記式［２］（式中、Ｗ，Ｒ１，Ｒ２，Ｑおよび
Ｒは前記と同意義）の構造を有する免疫抗原に体して産
生する単クローン性または多クローン性抗体を含有する
バルビツレート抗血清と、および前記式［２７］（式中
、Ｗ，Ｒ１，Ｒ３，ＦｌおよびＲ４は前記と同意義）の
構造を有し、バルビツレート抗血清の存在に対し検出し
うる蛍光偏光応答をもたらすことができるトレーサー化
合物と接触せしめる工程、 （Ｂ）工程（Ａ）から得られる溶液に平面偏光を通して
、蛍光偏光応答を得る工程、次いで （Ｃ）工程（Ｂ）の溶液の蛍光偏光応答を、試料中のバ
ルビツレートの存在またはその量の測度として検出する
工程から成る。 【００６７】この方法の最も好ましい型では、前記式［
２９］の構造を有する免疫抗原に対して製せられる単ク
ローン性または多クローン性抗体を、前記式［３０］の
構造を有するトレーサーと共に使用する。しかしながら
、これらの抗体と共に使用する他の好ましいトレーサー
は、前記式［３１］の構造を有するトレーサーである。 【００６８】本発明の分析法、すなわち、本発明のトレ
ーサー化合物および免疫抗原を用いる蛍光免疫学的検定
法によってバルビツレートを測定する方法によれば、バ
ルビツレートを含有するまたはバルビツレートを含有し
ているのではないかと思われる試料を、トレーサーの生
理学的に許容しうる塩およびバルビツレートに対し特異
的な抗体と混合する。抗体は上述の免疫抗原を用いて製
造される。バルビツレートとトレーサーは限られた抗体
結合部位で競合する結果、錯体が形成する。トレーサー
および抗体の濃度を一定に維持することにより、バルビ
ツレート−抗体錯体と形成されるトレーサー−抗体錯体
の比率は、試料中のバルビツレートの量に正比例する。 従って、混合物を平面偏光で励起し、次いでトレーサー
およびトレーサー−抗体錯体によって発せられる蛍光の
偏光値を測定すると、試料中のバルビツレートの存在を
測定することができる。 【００６９】結果は、純ミリ偏光単位およびスパン（ミ
リ偏光単位において）の観点から定量化することができ
る。純ミリ偏光単位の測定は、バルビツレートの非存在
下、最大量のトレーサーが抗体に結合したとき、最大偏
光を表示する。純ミリ偏光単位が高くなればなるほど、
抗体に対するトレーサーの結合がよくなる。スパンは、
トレーサーがバルビツレートの非存在下で抗体に対し最
大に結合したときの純ミリ偏光と、トレーサーが明示濃
度のバルビツレートの存在下で抗体に対し結合したとき
の純ミリ偏光との較差である。最大スパンは、当該検定
法が検出しうるリガンド濃度の範囲を規定する。大きな
スパンは、データの良好な数的分析をもたらす。好まし
い抗体−トレーサー組合せは、少なくとも８０ミリ偏光
単位のスパンを有する。小さなスパンは、各環境に応じ
て許容することができる。 【００７０】本発明方法を実施するときのｐＨは、トレ
ーサーのフルオレセイン成分を開環型で存在せしめうる
のに十分なｐＨでなければならない。ｐＨは通常約３〜
１２、より一般的には約５〜１０、最も好ましくは約６
〜９の範囲であってよい。種々の緩衝剤を用いることに
より、検定操作中のｐＨを維持することができる。代表
的な緩衝剤としては、ボレート、ホスフェート、カーボ
ネート、トリス（ｔｒｉｓ）、バルビタールなどが挙げ
られる。 本発明にとって、特定緩衝剤の使用に限定されるもので
ないが、トリスおよびホスフェート緩衝剤が好ましい。 緩衝剤のカチオン部は一般に、溶液状態のトリス塩のカ
チオン部を決定する。 【００７１】試料中に存在するリボフラビンに結合して
、リボフラビン結合プロテイン（ＲＢＰ）−リボフラビ
ン錯体とするため、試料または１種以上の検定試薬へＲ
ＢＰを加えて、リボフラビンによる潜在的な蛍光干渉を
削除してもよい。ＲＢＰはＭ．Ｗ．（分子量）約３２０
００のプロテインで、通常卵白から単離される。卵白か
ら単離すると、ＲＢＰの各分子は１分子のリボフラビン
を含有する。このホロプロテイン型のＲＢＰは、酸性条
件下の透析でアポプロテイン型に変換して、結合リボフ
ラビンを除去しなければならない。本発明で用いるＲＢ
Ｐアポプロテインは、ミズーリ州セントルイス市のシグ
マ・ケミカル・カンパニーから商業上入手可能である。 使用量に制限はないが、試料中の実質的に全ての遊離リ
ボフラビンを結合させるのに十分な量を条件とする。 【００７２】以下、本発明の好ましい改良した検定法に
ついて、詳しく説明する。この検定法は“均質検定法”
であって、結合トレーサーと未結合トレーサーを分離し
ていない溶液から最終偏光値を読み取ることを意味する
。このことは、数値の読み取り可能前に未結合トレーサ
ーから結合トレーサーを分離しなければならないような
、不均質免疫学的検定法にない優れた別異の利点である
。 【００７３】本発明の蛍光偏光検定法に用いる試薬は、
バルビツレート用抗体とバルビツレートトレーサーから
成る。付加的に、予備処理溶液、希釈緩衝剤、バルビツ
レートキャリブレータおよびバルビツレート対照を含む
極めて通常の溶液の調製が望まれる。これらの試薬の代
表的溶液の幾つかは以下に記載され、かつイリノイ州ア
ボット・パークのアボット・ラボラトリーズから検定用
“キット（ｋｉｔｓ）”で商業上入手することができる
。 【００７４】本発明の最も好ましい検定法の場合、本明
細書で示す全ての百分率は、他に特別明示しない限り重
量／容量である。現時点で好ましいトレーサー配合は、
ｐＨ６．２の０．１モルホスフェート緩衝剤、５％５−
スルホサリチル酸ナトリウム、０．１％ナトリウムアジ
ド、および０．０１％牛ガンマグロブリンの１５０ナノ
モルトレーサーである。抗血清配合は、ｐＨ７．５の０
．１モルトリス緩衝剤、０．１％ナトリウムアジド、０
．１％牛ガンマグロブリンおよび２％エチレングリコー
ル（ｖ／ｖ）で希釈した羊血清から成る。希釈緩衝剤は
、ｐＨ７．５の０．１モルリン酸ナトリウム、０．１％
ナトリウムアジドおよび０．０１％牛ガンマグロブリン
から成る。予備処理溶液は、０．０１％牛ガンマグロブ
リン、ｐＨ７．５の０．１モルトリス緩衝剤、０．１％
ナトリウムアジドおよび１０ｍｇ／ｍｌリボフラビン結
合プロテインから成る。バルビツレートカリブレータは
、濃度０．０、２００、４００、７００、１２００、お
よび２０００ナノグラム／ｍｌの正常なヒトの尿中のセ
コバルビタールから成り、保存剤として０．１％ナトリ
ウムアジドが有用である。正常なヒトの尿中のセコバル
ビタールから成るバルビツレート対照は、濃度３００、
８００および１５００ナノグラム／ｍｌで供給され、保
存剤として０．１％ナトリウムアジドもまた有用である
。 【００７５】好ましい操作は特に、イリノイ州アボット
・パークのアボット・ラボラトリーズから共に入手しう
る、アボット・ＴＤｘ（登録商標）クリニカル・アナラ
イザー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　　Ａｎａｌｙｚｅｒ、臨床
分析器）やアボットＡＤｘ（登録商標）ドラッグス・オ
ブ・アブュース・システム（Ｄｒｕｇｓ　　ｏｆ　　Ａ
ｂｕｓｅ　　Ｓｙｓｔｅｍ、乱用系の薬物）と共に使用
するようになっている。最小５０μｌの尿が必要である
。ＴＤｘまたはＡＤｘ試料カートリッジの試料容器の中
へ直接、キャリブレータ、対照または未知試料をピペッ
トで計量して入れる。この操作の利点の１つは、試料に
特別な調製を要しないことである。この点から、本発明
の検定操作は十分な自動制御方式である。 【００７６】手動で検定が行われている場合、試料を希
釈緩衝剤中予備処理溶液と混合し、バックグラウンド値
を読む。次いでトレーサーおよび抗体で試験溶液に混入
する。培養後、蛍光偏光値を読む。 【００７７】各カリブレータ、対照または試料の純蛍光
偏光値を測定し、アボットＴＤｘアナライザーなどの計
器の出力テープにプリントする。非直線回帰分析を用い
、各キャリブレータ対その濃度の偏光値をプロットする
ことにより、標準曲線を予め計器に生成しておく。記憶
したキャリブレーション曲線から各対照または試料の濃
度を読み、出力テープにプリントする。 【００７８】上記好ましい操作に関し、注目すべき点は
、トレーサー、抗体、予備処理溶液、キャリブレータお
よび対照を約２〜８℃に貯蔵し、一方、希釈緩衝剤を周
囲温度で貯蔵すべきである。標準曲線および対照は２週
間毎に処理し、各キャリブレータおよび対照は二回重複
で処理すべきである。全ての試料を二回重複で処理する
ことができる。 【００７９】なお、理解すべき点は、上記本発明の詳細
な説明および以下に挙げる実施例はあくまで例示であっ
て、本発明の技術的範囲を限定するものではない。各種
の改変は当業者にとって自明であり、従って、本発明の
技術的範囲は特許請求の範囲およびその法的均等範囲の
みによって制限されるものである。 【００８０】 【実施例】実施例１〜３は、本発明に従って行った実験
を示す。実施例１〜３および２５は抗体の産生に用いる
免疫抗原の製造に関し、実施例４〜８は免疫抗原および
トレーサーの前駆体の合成に関し、および実施例９〜２
４および２６はトレーサーの製造に関する。なお、実施
例２４には本発明の最も好ましいトレーサーの製造が、
また実施例２５には本発明の最も好ましい免疫抗原の製
造が記載されている。 【００８１】実施例１ ５−（１−メチルブチル）−５−（β−ヒドロキシ−ｖ
−ヨードプロピル）バルビツール酸：５ｇ（０．０２２
モル）の５−（１−メチルブチル）−５−（アリル）バ
ルビツール酸を１８０ｍｌの水中にて、還流コンデンサ
ー下で７５〜８５℃に加熱し、反応混合物に６ｇのヨー
ジドを２時間にわたって少量づつ加える。反応混合物を
７時間攪拌加熱する。反応混合物を冷却して沈澱せしめ
る。結晶をブフナー漏斗で濾別し、水洗する。生成物を
エタノール（５０ｍｌ）より晶出させて、５．５７ｇの
所望物質を得る。 【００８２】５−（１−メチルブチル）−５−ヨードア
セトニルバルビツール酸：１ｇの５−（１−メチルブチ
ル）−５−（β−ヒドロキシ−ｖ−ヨードプロピル）バ
ルビツール酸を７５ｍｌのアセトンに溶解する。１０％
硫酸中の重クロム酸カリウムの０．３３モル溶液３０ｍ
ｌを加える。 反応混合物を室温で２時間攪拌し、次いで２００ｍｌの
酢酸エチルで抽出し、塩水、水で洗い、有機層を硫酸マ
グネシウム上で乾燥する。酢酸エチルを減圧除去し、粗
固体物質を７０％エタノールより晶出させる。無色結晶
の所望生成物の収量５１９ｍｇ。 【００８３】５−（１−メチル）ヨードアセトニルバル
ビツール酸と牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のカップリン
グ反応：２２６ｍｇのＢＳＡを４７ｍｌのホスフェート
（０．１Ｍ緩衝剤、ｐＨ８）および５２０μｌのＮ，Ｎ
’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解する。この
溶液に、５３０ｍｌのＤＭＦ中の１５２ｍｇの５−（１
−メチルブチル）−５−ヨードアセトニルバルビツール
酸を加える。反応混合物を室温で３６時間攪拌する。得
られる溶液を水に対して徹底的に透析し、凍結乾燥して
２０８ｍｇの所望複合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を得る
。 【００８４】実施例２ １−ブロモメチルテトラヒドロピラニルエーテル：氷浴
で冷却した２−ブロモエタノール（１２５ｇ、１．０当
量）に、ｐ−トルエンスルホン酸（触媒量）を加える。 アルゴン雰囲気下攪拌しながら、ジヒドロピラン（９３
ｇ、１．１当量）を滴下する。滴下終了時、反応液を室
温で１時間攪拌する。残渣を短路蒸留で精製して、約１
２５ｇの生成物を得る。 【００８５】フェニル−テトラヒドロピラニルオキシエ
チルジエチルマロネート：ＤＭＦ中のジエチルフェニル
マロネート（７６ｍｌ、１．０当量）に、ＮａＨ（１３
．１ｇ、１．０当量、６４．１４％鉱油分散体）を加え
る。反応液を５０℃で０．５時間攪拌し、次いで１−ブ
ロモ−２−テトラヒドロピラニルエタノール（８０ｍｌ
、１．５当量）を加え、反応液を６０℃で１８時間攪拌
する。反応混合物を中和し、溶媒を減圧除去する。残渣
を短路蒸留で精製し、約４６ｇの生成物を得る。 【００８６】ＴＨＰ−ヒドロキシエチルフェノバルビタ
ール：マグネシウム削りくず（３．７ｇ、１．２当量）
をアルゴン雰囲気下、乾燥メタノールに溶解する。ＴＨ
Ｐ−マロネート（４６ｇ、１．０当量）および尿素（９
．９ｇ、１．３当量）をいっしょに乾燥メタノールに溶
解し、次いでこれを上述のマグネシウム溶液に加える。 ４８時還流後、さらに尿素（９．９ｇ、１．３当量）と
マグネシウムメトキシド（Ｍｇ３．７ｇ、１．２当量）
を加える。さらに２４時間還流後、溶媒を除去し、残渣
を５％ＨＣｌ水溶液に溶かし、次いでエーテルで抽出す
る。エーテル層から生成物を取出し、エーテル／ヘキサ
ンより晶出させて、約１３ｇの物質を得る。 【００８７】５−フェニル−５−ヒドロキシエチルバル
ビツール酸：ＴＨＰ−ヒドロキシエチルフェノバルビタ
ール（１９ｇ）を酢酸／水（５０：５０）に加熱下で溶
解する。溶液を還流し、脱保護をＴＬＣ（シリカゲル、
メタノール／塩化メチレン＝１０：９０）で監視する。 反応の終了時、溶媒を減圧除去し、残渣をエタノール／
水より晶出させる。白色粉末の生成物の収量８．７ｇ。 【００８８】５−フェニル−５−ヒドロキシエチルバル
ビツール酸とＢＳＡの複合（接合）ヒドロキシエチルフ
ェニルバルビタール（５００ｍｇ）を乾燥した新蒸留Ｔ
ＨＦ（１０ｍｌ）に懸濁する。溶液に攪拌下ホスゲンを
１５分間吹込んだ後、溶液にアルゴンを吹込み、過剰の
ホスゲンを除去する。１５分後、ＴＨＦを減圧除去し、
残渣をエチルエーテルと共にトリチュレートする。乾燥
後、白色粉末の生成物の収量約５２０ｍｇ。 【００８９】０．１Ｎ（ｐＨ８）のホスフェート緩衝剤
（７ｍｌ）中のＢＳＡ（５００ｍｇ、１．０当量）の溶
液に先ずＤＭＦ（３ｍｌ）を加え、次いで得られる溶液
に、予めＴＨＦ（１ｍｌ）に溶解したヒドロキシエチル
フェノバルビタールのクロロホルメート（５０ｍｇ）を
加える。クロロホルメートは激しく攪拌しながら加え、
反応液をさらに３時間攪拌する。 【００９０】溶液を、蒸留水で溶離するＰＩＤカラムに
て精製する。２つのピークを集め、最初のは１００ｍｇ
の生成物、２つ目は４００ｍｇの生成物を含有する。紫
外線で調べると、両試料ともプロテインとフェノバルビ
タールを含有することがわかった。 【００９１】実施例３ 　　ジエチル−２−（１−メチルブチル）マロネート：
ナトリウム金属（５．２４ｇ、０．２３ｇ原子）を２５
ｍｌの無水エタノールと反応させる。この溶液に攪拌下
、ジエチルマロネート（３６．０ｍｌ、０．２４モル）
を滴下する。溶液を加熱還流し、２−ブロモペンタン（
２９．０ｍｌ、０．２３モル）を滴下する。一夜還流後
、反応液を冷却し、エタノールを回転エバポレータにて
除去する。生成物を水洗し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、分留
して３５．７ｇの所望生成物を得る。 【００９２】ジエチル−２−（１−メチルブチル）−２
−（５−ペンテニル）−マロネートカリウム金属（１．
７１ｇ、０．０４ｇ原子）を３０ｍｌの無水ｔ−ブチル
アルコールと反応させる。次いで反応液を７５℃に加熱
し、ジエチル−２−（１−メチルブチル）−マロネート
（１０．０３ｇ、０．０４モル）を滴下する。４時間還
流後、攪拌しながら１−ブロモ−５−ペンテン（６．４
ｇ、０．０４モル）を滴下する。反応液を一夜還流し、
次いで水に注ぎ、エーテルで抽出する。エーテル抽出物
をＭｇＳＯ４で乾燥し、エーテルを回転エバポレータに
て蒸発させて、所望物質を得る。 【００９３】５−（１−メチルブチル）−５−（ペンテ
ニル）−バルビツール酸：ナトリウム金属（０．９８ｇ
、０．０４ｇ原子）をメタノール（１５ｍｌ）と反応さ
せた後、尿素（５．１４ｇ、０．０９モル）を加える。 次いでジエチル２−（１−メチルブチル）−２−（５−
ペンテニル）−マロネート（６．０８ｇ。０．０２モル
）を加える。２日間還流後、メタノールを留去する。残
渣を１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に溶解し、エーテルで抽
出し、次いで塩酸で酸性化して、白色沈澱のバルビツー
ル酸化合物を得る。 【００９４】５−（４−ブタナール）−５−（１−メチ
ルブチル）−バルビツール酸：上記バルビツレートのメ
タノール溶液に−７８℃でオゾンを通す。溶液がブルー
となった後、窒素を吹込んで過剰のオゾンを除去する。 次いでジメチルスルフィドを加え、溶液を室温で一夜攪
拌する。溶媒を減圧除去して、０．６２ｇの所望アルデ
ヒドを得る。 【００９５】上記アルデヒドとＢＳＡの複合：２５ｍｌ
の水、５ｍｌのジメチルホルムアミドおよび５ｍｌのエ
タノールの溶液に、１８８ｍｇのＢＳＡを加える。溶液
のｐＨを６．２に調整し、上記アルデヒド（１８．６ｍ
ｇ、０．０７ミリモル）を加える。１時間攪拌後、シア
ノホウ水素化ナトリウム（４７２ｍｇ、７．５ミリモル
）を加え、反応液を一夜攪拌する。次いで物質を、ｐＨ
９の水に対して透析し、そしてｐＨ７の水に対して透析
する。物質を凍結乾燥して、１１３ｍｇのバルビツール
酸−ＢＳＡ複合物を得る。 【００９６】実施例４ 　　５−（１−メチルブチル）−５−ホルミルメチルバ
ルビツール酸：ナトリウム・セコバルビタール（５．３
０ｇ、２２．２ミリモル）のメタノール溶液に、溶液が
ブルー色に変わるまで、オゾン流を通す。反応液に窒素
を通して過剰のオゾンを除去した後、ジメチルスルフィ
ド（１４ｍｌ）を加える。反応液を室温で一夜攪拌した
後、溶媒を回転エバポレータにて除去する。次いでアル
デヒドをシリカプレッププレート（ｐｒｅｐ　　ｐｒａ
ｔｅ）にて、酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を用いて
精製する。 【００９７】実施例５ ジメチル−２−（３−メチルシクロヘキシル）−マロネ
ート：ナトリウム金属（７．０２ｇ、０．３０ｇ原子）
を無水メタノール（２５０ｍｌ）と反応させる。次いで
これにジメチルマロネート（７０ｍｌ）を滴下し、その
間反応温度を５０℃に維持する。次いでこの溶液に、３
−メチルシクロヘキシルブロミド（５４．０ｇ、０．３
０モル）を滴下し、反応液を一夜還流する。メタノール
を回転エバポレータにて除去し、残った物質をエーテル
と水間に分配する。エーテル層を分離し、ＭｇＳＯ４で
乾燥し、蒸発して黄色油状物を得る。この物質を９５〜
１０６℃および１．２ｍｍＨｇ圧の蒸留に付し、透明油
状物を得る。 【００９８】ジメチル２−（５−ヘキセニル）−２−（
３−メチルシクロヘキシル）−マロネート：無水Ｎ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド（５０ｍｌ）中の水素化ナトリ
ウム（２．５３ｇ、０．０６モル）のスラリーに、ジメ
チル２−（３−メチルシクロヘキシル）−マロネート（
１４．４６ｇ、０．０６モル）を滴下する。滴下終了後
、もはや水素が発生しなくなるまで、反応液を攪拌する
。次いで反応液に、１−ブロモ−６−ヘキセン（１０．
３３ｇ、、０．０６モル）を滴下した後、攪拌する。反
応の進行に伴って、シリカプレートにて酢酸エチル／ヘ
キサン（４０：６０）を用いる分析クロマトグラフィー
に付す。反応の終了後、水（２０ｍｌ）を加え、溶媒の
ほとんどを高減圧下で除去する。残った物質を水とエー
テル間に分配し、エーテル層を２回水洗する。エーテル
溶媒をＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発して粘稠黄色油状物を
得る。次いで生成物を１２７〜１３４℃および０．４４
ｍｍＨｇ圧にて蒸留し、透明油状物を得る。 【００９９】５−（３−メチルシクロヘキシル）−５−
（５−ヘキセニル）バルビツール酸：ナトリウム金属（
１．２４ｇ、０．０５ｇ原子）を無水エタノール（７５
ｍｌ）と反応させる。反応の終了後、尿素（５．１６ｇ
、０．０８モル）を加え、次いで上記マロネート（６．
６７ｇ、０．０２モル）を加える。６０時間還流後、エ
タノールを蒸発し、物質を水（ｐＨ４）と酢酸エチル間
に分配する。酢酸エチル層をＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発
して白色ゴム状物質を得る。次いでこの物質をシリカプ
レッププレートにて、酢酸エチル／ヘキサン（４０／６
０）で精製して、純粋なバルビツール酸化合物を得る。 【０１００】５−（３−メチルシクロヘキシル）−５−
ホルミルブチルバルビツール酸：メタノール（２０ｍｌ
）に溶解した上記バルビツール酸化合物（４０ｍｇ、０
．１３ミリモル）の溶液に、溶液がブルーになるまでオ
ゾンを通す。溶液に窒素を通して過剰オゾンを除去し、
ジメチルスルフィド（２ｍｌ）を加える。一夜攪拌後、
溶媒を除去して、所望アルデヒドを白色ゴム状物質で得
る。 【０１０１】実施例６ 　　ｓｅｃ−ブチルジメチルマロネート：ナトリウム金
属（６．９ｇ）を１２０ｍｌの無水メタノールと反応さ
せる。 この溶液に３９．６ｇ（０．３モル）のジメチルマロネ
ートを加える。反応混合物を還流し、２−ブロモブタン
（４１．１ｇ。０．３モル）を加える。１６時間還流後
、反応混合物を冷却し、メタノールを減圧除去する。生
成物をエチルエーテルで抽出し、次いで水および半飽和
塩水で洗う。有機物を硫酸マグネシウム上で乾燥する。 減圧蒸発でエチルエーテルを除去後、粗油状物を分留し
て、２４ｇの所望生成物を得る（ｂ．ｐ．９５−１０５
℃／１５ｍｍＨｇ）。 【０１０２】５−ｓｅｃ−ブチルバルビツール酸：１１
０ｍｌの無水エタノールを７．７２ｇのナトリウム金属
と反応させる。次いで１７．６ｇ（０．１モル）のジメ
チルｓｅｃ−ブチルマロネートを加えた後（約５分後）
、尿素（６．７２ｇ）を加える。反応混合物を１５時間
還流し、６０ｍｌのエタノールを留去する。残渣に２０
０ｍｌの水を加えた後、２０ｍｌの濃硫酸を加える。沈
殿した結晶を濾別する。次いで生成物を水より再結晶し
て、８ｇの無色結晶を得る。 【０１０３】５−ｓｅｃ−ブチル−５−（カルベトキシ
−１−プロピレン）バルビツール酸：二ッ首１００ｍｌ
フラスコに、２６５ｍｇ（６．６２５ミリモル）の水素
化ナトリウム（６０％油状分散体）を入れる。水素化ナ
トリウムをヘキサンで洗い、次いで５ｍｌのＴＨＦ中の
１２１９ｍｇの５−ｓｅｃ−ブチルバルビツール酸を加
えた後、５０ｍｌのジメチルホルムアミドを加える。反
応混合物を室温で１．５時間攪拌し、９１２μｌのエチ
ルブロモクロトネートを加えた後、９００ｍｇの無水ヨ
ウ化ナトリウムを加える。 反応混合物を４８時間還流し、次いで回転蒸発で乾燥す
る。残渣を酢酸エチルで抽出し、水、５％重亜硫酸ナト
リウム、塩水で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥する。 溶媒を除去し、粗物質をシリカゲルにて、溶離剤として
酢酸エチルを用いるカラムクロマトグラフィーで精製す
る。所望生成物の収率７８％。 【０１０４】５−ｓｅｃ−ブチル−５−（カルボキシ−
１−プロピレン）バルビツール酸：１５２ｍｇの５−ｓ
ｅｃ−ブチル−５−カルベトキシ−１−プロピレンバル
ビツール酸を１５ｍｌの濃塩酸中で、４５分間還流する
。反応混合物を蒸発乾固して、所望生成物を無色結晶で
得る（収率９５％、ｍ．ｐ．１６８〜１７１℃）。 【０１０５】実施例７ ２５０ｍｇの５−（１−メチルブチル）−５−カルベト
キシメチルバルビツール酸を２５ｍｌの濃塩酸中で、４
５分間還流する。反応混合物を冷却し、沈殿した結晶を
濾別する。水より再結晶して、１９０ｍｇの無色結晶を
得る（ｍ．ｐ．２３８〜２４０℃）。 【０１０６】実施例８ ２００ｍｇの５−（１−メチルブチル）−５−カルベト
キシプロピルバルビツール酸を２５ｍｌの濃塩酸と共に
、１時間還流する。反応混合物を減圧蒸発し、固体残渣
を水より晶出させる。無色結晶（ｍ．ｐ．１８９〜１９
２℃）の収量１２０ｍｇ。 【０１０７】実施例９ ５−ｓｅｃ−ブチル−５−カルボキシ−１−プロピレン
バルビツール酸とアミノメチルフルオレセインのカップ
リング反応：２６．８ｍｇ（０．１ミリモル）の５−ｓ
ｅｃ−ブチル−５−カルボキシ−１−プロピレンバルビ
ツール酸を０．３ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、この溶液
に、０．３ｍｌのＤＭＦに溶解した２０ｍｇのジシクロ
ヘキシルカルボジイミドを加えた後、０．３ｍｌのＤＭ
Ｆ中の１１．５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを
加える。反応混合物を室温で攪拌する。３０分後、４２
ｍｇのアミノメチルフルオレセインを加える。２０時間
後、反応混合物を回転蒸発で乾燥し、シリカゲルにて溶
離剤として酢酸エチル／酢酸（１００：０．２）を用い
るカラムクロマトグラフィーで精製する。 【０１０８】実施例１０ ５−（１−メチルブチル）−５−カルボキシ−１−プロ
ピレンバルビツール酸とアミノメチルフルオレセインの
カップリング反応：本例では、出発物質として２８．２
ｍｇ（０．１ミリモル）の５−（１−メチルブチル）−
５−カルボキシクロトニルバルビツール酸、１１．５ｍ
ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２０ｍｇのジシク
ロヘキシルカルボジイミドおよび４２ｍｇのアミノメチ
ルフルオレセインを用い、実施例９の操作に従って製造
を行う。生成物をシリカゲルにて、溶離剤として酢酸エ
チル／酢酸（１００：０．２）を用いる分取薄層クロマ
トグラフィーで精製する。 【０１０９】実施例１１ ５−イソプロピル−５−（カルボキシ−１−プロピレン
）バルビツール酸とアミノメチルフルオレセインのカッ
プリング反応：本例では、出発物質として２１．４ｍｇ
の５−エチル−５−カルボキシメチルバルビツール酸、
１１．５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２０ｍ
ｇのジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４２ｍｇの
アミノメチルフルオレセインを用い、実施例９の操作に
従って製造を行う。生成物をシリカゲルにて、溶離剤と
して酢酸エチル／酢酸（１００：０．２）を用いる分取
薄層クロマトグラフィーで精製する。 【０１１０】実施例１２ ５−エチル−５−カルボキシメチルバルビツール酸とア
ミノメチルフルオレセインのカップリング反応：本例で
は、出発物質として２１．４ｍｇの５−エチル−５−カ
ルボキシメチルバルビツール酸、１１．５ｍｇのＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド、２０ｍｇのジシクロヘキシル
カルボジイミドおよび４２ｍｇのアミノメチルフルオレ
セインを用い、実施例９の操作に従って製造を行う。生
成物をシリカゲルにて、溶離剤として酢酸エチル／酢酸
（１００：０．２）を用いるクロマトグラフィーで精製
する。 【０１１１】実施例１３ 　　５−ｓｅｃ−ブチル−５−カルボキシメチルバルビ
ツール酸とアミノメチルフルオレセインのカップリング
反応：本例では、出発物質として２４ｍｇの５−ｓｅｃ
−ブチル−５−カルボキシメチルバルビツール酸、１１
．５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２０ｍｇの
ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４２ｍｇのアミ
ノメチルフルオレセインを用い、実施例９の操作に従っ
て製造を行う。 生成物をシリカゲルにて、溶離剤として酢酸エチル／酢
酸（１００：０．２）を用いる分取薄層クロマトグラフ
ィー（ＰＴＬＣ）で精製する。 【０１１２】実施例１４ ｓｅｃ−ブチル−５−カルボキシエチルバルビツール酸
とアミノメチルフルオレセインのカップリング反応：本
例では、出発物質として２６ｍｇの５−ｓｅｃ−ブチル
−５−カルボキシエチルバルビツール酸、１１．５ｍｇ
のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２０ｍｇのジシクロ
ヘキシルカルボジイミドおよび４２ｍｇのアミノメチル
フルオレセインを用い、実施例９の操作に従って製造を
行う。生成物をシリカゲルにて、溶離剤として酢酸エチ
ル／酢酸（１００：０．２）を用いるＰＴＬＣで精製す
る。 【０１１３】実施例１５ ５−ｓｅｃ−ブチル−５−カルボキシプロピルバルビツ
ール酸とアミノメチルフルオレセインのカップリング反
応：本例では、出発物質として２８ｍｇの５−ｓｅｃ−
ブチル−５−カルボキシプロピルバルビツール酸、１１
．５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２０ｍｇの
ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４２ｍｇのアミ
ノメチルフルオレセインを用い、実施例９の操作に従っ
て製造を行う。生成物を溶離剤として酢酸エチル／酢酸
（１００：０．２）を用いるＰＴＬＣで精製する。 【０１１４】実施例１６ ５−ｓｅｃ−ブチル−５−カルボキシブチルバルビツー
ル酸とアミノメチルフルオレセインのカップリング反応
：本例では、出発物質として２９ｍｇの５−ｓｅｃ−ブ
チル−５−カルボキシブチルバルビツール酸、１１．５
ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２０ｍｇのジシ
クロヘキシルカルボジイミドおよび４２ｍｇのアミノメ
チルフルオレセインを用い、実施例９の操作に従って製
造を行う。生成物を溶離剤として酢酸エチル／酢酸（１
００：０．２）を用いるＰＴＬＣで精製する。 【０１１５】実施例１７ ５−（１−メチルブチル）−５−カルボキシジメチルバ
ルビツール酸とアミノメチルフルオレセインのカップリ
ング反応：本例では、出発物質として２４ｍｇの５−（
１−メチルブチル）−５−カルボキシメチルバルビツー
ル酸、１１．５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、
２０ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４２
ｍｇのアミノメチルフルオレセインを用い、実施例９の
操作に従って製造を行う。生成物をシリカゲルにて溶離
剤として酢酸エチル／酢酸（１００：０．２）を用いる
ＰＴＬＣで精製する。 【０１１６】実施例１８ ５−（１−メチルブチル）−５−カルボキシエチルバル
ビツール酸とアミノメチルフルオレセインのカップリン
グ反応：本例では、出発物質として２５ｍｇの５−（１
−メチルブチル）−５−カルボキシエチルバルビツール
酸、１１．５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２
０ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４２ｍ
ｇのアミノメチルフルオレセインを用い、実施例９の操
作に従って製造を行う。生成物をシリカゲルにて、溶離
剤として酢酸エチル／酢酸（１００：０．２）を用いる
ＰＴＬＣで精製する。 【０１１７】実施例１９ ５−（１−メチルブチル）−５−カルボキシプロピルバ
ルビツール酸とアミノメチルフルオレセインのカップリ
ング反応：本例では、出発物質として２６．５ｍｇの５
−（１−メチルブチル）−５−カルボキシプロピルバル
ビツール酸、１１．５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド、２０ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミドおよ
び４２ｍｇのアミノメチルフルオレセインを用い、実施
例９の操作に従って製造を行う。生成物をシリカゲルに
て溶離剤として酢酸エチル／酢酸（１００：０．２）を
用いるＰＴＬＣで精製する。 【０１１８】実施例２０ ５−（１−メチルブチル）−５−カルボキシブチルバル
ビツール酸とアミノメチルフルオレセインのカップリン
グ反応：本例では、出発物質として２８ｍｇの５−（１
−メチルブチル）−５−カルボキシブチルバルビツール
酸、１１．５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、２
０ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４２ｍ
ｇのアミノメチルフルオレセインを用い、実施例９の操
作に従って製造を行う。生成物をシリカゲルにて溶離剤
として酢酸エチル／酢酸（１００：０．２）を用いるＰ
ＴＬＣで精製する。 【０１１９】実施例２１ ５−（１−メチルブチル）−５−カルボキシメチルバル
ビツール酸とフルオレセインアミド（異性体）の複合：
５−（１−メチルブチル）−５−カルボキシメチルバル
ビツール酸（５８．３ｍｇ）に、塩化チオニル（２ｍｌ
）を加え、溶液を１．５時間還流する。過剰の塩化チオ
ニルを減圧除去し、油状物を冷却する。これに、乾燥ピ
リジン（１ｍｌ）中のフルオレセインアミド（異性体１
）の溶液を加える。物質をシリカプレッププレートにて
、酢酸エチル／酢酸（１００：０．２）を用いるクロマ
トグラフィーに付し、所望トレーサーを得る。 【０１２０】実施例２２ ５−（３−メチルシクロヘキシル）−５−カルボキシブ
チルバルビツール酸の複合：本例では、出発物質として
２１ｍｇの５−（３−メチルシクロヘキシル）−５−カ
ルボキシブチルバルビツール酸、６．９ｍｇのＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド、１９．９ｍｇのジシクロヘキシ
ルカルボジイミドおよび２４ｍｇのアミノメチルフルオ
レセインを用い、実施例９の操作に従って製造を行う。 【０１２１】実施例２３ ５−（１−メチルブチル）−５−ホルミルメチルバルビ
ツール酸とアミノメチルフルオレセインの複合：２ｍｌ
の水およびｐＨ６の２ｍｌのメタノールの溶液に、５−
（１−メチルブチル）−５−ホルミルメチルバルビツー
ル酸（１４１ｍｇ、０．５８ミリモル）およびアミノメ
チルフルオレセイン（２１０ｍｇ、０．５８ミリモル）
を加える。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを滴下して溶
解を完了する。１時間攪拌後、直ちにシアノホウ水素化
ナトリウム（３８．８ｍｇ）を加える。一夜攪拌後、溶
媒を蒸発し、物質を逆相分取プレート（シリカゲル）に
て、溶離剤としてメタノール／水／トリフルオロ酢酸を
用い精製する。 【０１２２】実施例２４ ジエチルシクロペンチルマロネート（最も好ましいトレ
ーサー、前記式［３０］の製造）：８０ｍｌの無水エタ
ノール中の４．６ｇ（０．２モル）のナトリウム金属の
溶液に、３０．４ｍｌ（０．２モル）のジエチルマロネ
ートを加える。得られる混合物を少し攪拌して、粘稠白
色沈殿物を生成する。この懸濁液に、２１．４ｍｌ（０
．２モル）のシクロペンチルブロミドを加える。混合物
を１２時間加熱し、次いで周囲温度に冷却する。回転蒸
発でエタノールのほとんどを除去し、得られる残渣を２
５０ｍｌの水で希釈し、ジエチルエーテル（１００ｍｌ
×３）で抽出する。コンバインした抽出物をＭｇＳＯ４
上で乾燥し、濾過し、濃縮する。６インチのビグレウク
ス（Ｖｉｇｒｅａｕｘ）カラムにて、６ｍｍＨｇで蒸留
を行い、３２．２３２ｇの無色液体（ｂ．ｐ．１２２〜
１２５℃）を得る。 【０１２３】５−シクロペンチルバルビツール酸：５０
ｍｌの無水エタノール中の３．４８ｇ（１５１ミリモル
）のナトリウム溶液に、３．０２ｇ（５０ミリモル）の
尿素および上記製造したジエチルシクロペンチルマロネ
ート１０ｇ（４４ミリモル）を加える。形成する粘稠白
色スラリーを、１２時間還流する。回転蒸発でエタノー
ルのほとんどを除去し、残渣を１００ｍｌの水で希釈し
、１００ｍｌの９８％Ｈ２ＳＯ４で酸性化する。形成す
る白色固体を濾取し、真空ポンプで乾燥する。固体を水
より再結晶し、さらに５％水／エタノールより２回目の
再結晶を行って、７．００６ｇの無色板状結晶（ｍ．ｐ
．２２２〜２２３℃）を得る。 【０１２４】５−シクロペンチル−５−［（エトキシカ
ルボニル）−２−プロペニル］バルビツール酸：１．０
ｍｌのテトラヒドロフランおよび１．０ｍｌのジメチル
ホルムアミドの混合物中の、上記製造した２００ｍｇ（
１．０２ミリモル）のバルビツール酸化合物の溶液を、
１．０ｍｌのジメチルホルムアミド中の３２ｍｇ（８０
％鉱油分散体、１．０７ミリモル）の水素化ナトリウム
（予め５ｍｌのペンタンで３回洗っておく）の懸濁液に
加える。周囲温度で１時間攪拌後、１６８μｌ（１．２
２ミリモル）のエチル４−ブロモクロトネートを加え、
反応液を７０℃に加温し、１２時間攪拌する。溶液を冷
却し、回転エバポレータにて濃縮し、酢酸エチルで希釈
し、水（１ｍｌ×２）で洗う。溶液をＭｇＳＯ４上で乾
燥し、濃縮する。ヘキサンを詰めた１×１８ｃｍカラム
にて、それぞれ５０ｍｌの１０％，２０％，３０％，５
０％および７０％酢酸エチル／ヘキサンで溶離するクロ
マトグラフィーを行って、２９７ｍｇの透明淡黄色油状
物を得る。 【０１２５】５−シクロペンチル−５−［３−カルボキ
シ−２−プロペニル］バルビツール酸：１．０ｍｌのジ
メトキシエタン中の前記実験で製造した２９２ｍｇ（０
．９４ミリモル）のエステルの溶液に、５．０ｍｌの１
５％Ｈ２ＳＯ４水溶液を加える。混合物を４５分間還流
し、冷却する。溶液を濃縮して粘稠油状物とし、酢酸エ
チルで希釈し、水（１ｍｌ×２）で洗う。ＭｇＳＯ４上
で乾燥し、溶媒除去を行って２４６ｍｇのオフホワイト
固体を得る。固体を６ｍｌの水中で煮沸し、冷却して１
３２ｍｇの白色固体（ｍ．ｐ．２２６〜２２７℃）を得
、晶出させ、次いで濾過で単離する。 【０１２６】５−［３−［（２ａ−フルオレセイニル）
メチルアミノカルボニルオキシ］−２−プロペニル］−
５−シクロペンチル−バルビツール酸：３００μｌのジ
メトキシエタン中の前記実験で製造した７．８ｍｇ（２
７μモル）の酸化合物の冷却（０℃）溶液に、３．６μ
ｌ（２７μモル）のイソブチルクロロホルメートを加え
る。溶液を周囲温度に加温し、１．３時間攪拌する。該
溶液を０℃に再冷却し、これに２００μｌのジメチルホ
ルムアミド中の１０．９ｍｇ（２７μモル）のアミノメ
チルフルオレセイン塩酸塩および７．６μｌ（５４μモ
ル）のトリエチルアミンの第２溶液を加え、次いで溶液
を周囲温度に加温し、１２時間攪拌する。溶媒をポンプ
減圧で除去し、残渣を溶離剤として８０％メタノール／
クロロホルムを用いる分取薄層クロマトグラフィーで精
製する。主要な蛍光バンドを１０％メタノール／クロロ
ホルムで溶離し、濃縮してから１０．２ｍｇのオレンジ
色固体を得る。 【０１２７】実施例２５ ジエチルシクロペンテニルマロネート（最も好ましい免
疫抗原、前記式［２９］の製造）：−７８℃に冷却維持
した１７４ｇ（２．６３モル）の新しい解重合したシク
ロペンタジエンに、８７．５ｇ（２．５０モル）のＨＣ
ｌガスを加える。その間に、４００ｍｌの無水エタノー
ル中の２１．４ｇ（０．９３モル）のナトリウムの溶液
に、１５２ｍｌ（１．０モル）のジエチルマロネートを
加える。ＨＣｌの添加終了後、該マロネート溶液に−７
８℃に維持した粗黄色クロリドを１ｍｌ部づつ加える。 かなりの熱が発生し、黄色が消え、そして各部を加える
毎に、多量の白色沈澱が形成する。次いで懸濁液を１７
時間攪拌し、回転蒸発でエタノールのほとんどを除去し
、２００ｍｌの水を加えて反応を抑え、ジエチルエーテ
ル（１００ｍｌ×５）で抽出する。コンバインした抽出
物をＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮して透明黄色
油状物とする。この物質の一部を０．５ｍｍＨｇで蒸留
して、１９．０９１ｇの透明グリーン油状物（ｂ．ｐ．
９１〜９４℃）を得る。 【０１２８】５−（２−シクロペンテニル）バルビツー
ル酸：このバルビツール酸化合物は、上記５−シクロペ
ンチルバルビツール酸の場合に記載した操作に従って合
成した。 【０１２９】５−（２−シクロペンテニル）−５−［３
−（エトキシカルボニル）プロピル］バルビツール酸：
４ｍｌのテトラヒドロフランおよび１７ｍｌのジメチル
ホルムアミドの混合物中の、４３４ｍｇ（３．７９ミリ
モル）の水素化カリウム（予めヘキサン５ｍｌで３回洗
っておく）の懸濁液に、上記製造した７００ｍｇ（３．
６０ミリモル）の５−（２−シクロペンテニル）バルビ
ツール酸を加える。混合物を１時間攪拌した後、０．５
１ｍｌ（３．９６ミリモル）のエチル２−ブロモプロピ
オネートおよび１７８ｍｇ（１．１８ミリモル）の無水
ヨウ化ナトリウムを加える。 溶液を１２時間還流し、周囲温度に冷却せしめ、７２時
間攪拌する。回転蒸発で溶媒のほとんどを除去し、水を
加えて反応を抑え、１０ｍｌの酢酸エチルで４回抽出す
る。コンバインした抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾
過し、濃縮する。シリカゲルにて、５％メタノール／ク
ロロホルムで溶離するクロマトグラフィーに付して、９
１７ｍｇの淡黄色油状物を得る。 【０１３０】５−（２−シクロペンテニル）−５−（３
−カルボキシプロピル）バルビツール酸：２ｍｌのテト
ラヒドロフラン中の前記実験で製造した７３７ｍｇ（２
．５１ミリモル）のエステルの溶液に、６ｍｌの５％硫
酸／水の溶液を加える。混合物を周囲温度で数日間攪拌
する。反応液を回転エバポレータで濃縮し、残渣をシリ
カゲルにて、２％，５％および１０％メタノール／クロ
ロホルムで溶離するクロマトグラフィーに付し、２１５
ｍｇの白色結晶物質を得る。 【０１３１】５−（２−シクロペンテニル）−５−カル
ボキシプロピルバルビツール酸とサイログロブリンのカ
ップリング反応：１２．６５ｍｇ（４．７×１０−５モ
ル）の５−（２−シクロペンテニル）−５−カルボキシ
プロピルバルビツール酸を１．０ｍｌのｐ−ジオキサン
に溶解して、５−（２−シクロペンテニル）−５−カル
ボキシプロピルバルビツール酸を、混合無水物のサイロ
グロブリンにカップリング反応させる。この混合物に、
８×１０−５モルのトリエチルアミンおよび８×１０−
５モルのイソブチルクロロホルメートを加える。反応液
を室温で２時間攪拌し、その間、微細な白色沈殿物が形
成する。この懸濁液を、１１．０ｍｌの０．００５Ｍホ
ウ酸ナトリウム（ｐＨ９．５）に溶解した牛サイログロ
ブリン（２００ｍｇ）の急攪拌溶液に加える。室温で２
時間攪拌後、混合物を４交替（それぞれ２ｌ）の０．０
５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）に対して透析する
。なお、透析は２〜８℃で実施し、各透析緩衝剤を交替
する間隔を少なくとも８時間とした。透析後、最終プロ
テイン濃度をロウリィ法（Ｌｏｗｒｙ　　Ｍｅｔｈｏｄ
）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１９３、２６
５−２７５頁（１９５１年）参照］で測定し、かつ置換
度をＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホネート）滴定
で測定した。 【０１３２】実施例２６ ジエチル［３−メチル−２−ブテニル］マロネート（好
ましいトレーサー、前記式［３１］の製造）：１０ｍｌ
のテトラヒドロフランおよび５ｍｌのジメチルホルムア
ミドの混合物中の、４２２ｍｇの水素化ナトリウム（８
０％鉱油分散体、１４．１ミリモル、予めペンタン３ｍ
ｇで３回洗っておく）の冷却（０℃）懸濁液に、２．０
４ｍｌ（１３．４ミリモル）のジエチルマロネートを加
える。混合物を周囲温度に加温し、０．６時間撹拌する
。次いでプレニルブロミド（２．００ｇ、１３．４ミリ
モル）を注入し、溶液を周囲温度で３０分間、次いで還
流温度で１時間撹拌する。次に溶液を周囲温度まで冷却
せしめ、１２時間撹拌する。水を加えて反応を抑え、１
０％水性硫酸でｐＨ３に酸性化し、エーテル（１０ｍｌ
×２）で抽出する。コンバインした洗液を無水硫酸マグ
ネシウム上で乾燥し、濃縮する。シリカゲルにて、４％
，　７％および１０％エーテル／ヘキサンで溶離するク
ロマトグラフィーを行い、濃縮して２．７３４ｇの透明
無色油状物を得る。 【０１３３】５−［３−メチル−２−ブテニル］バルビ
ツール酸：１．０ｍｌの無水エタノール中の７０ｍｇ（
３．０３ミリモル）のナトリウムの溶液に、６１ｍｇの
尿素（１．０１ミリモル）を加えた後、前記実験で製造
した２００ｍｇのジエチルフェニルマロネート（０．８
８ミリモル）を加える。溶液を１２時間静かに還流する
。回転蒸発でエタノールのほとんどを除去し、残渣を水
に希釈する。溶液をｐＨ３に酸性化し、酢酸エチル（１
０ｍｌ×２）で抽出する。コンバインした有機相を無水
硫酸マグネシウム上で乾燥し、濃縮して２１４ｍｇのオ
フホワイト固体とする。 【０１３４】５−［３−メチル−２−ブテニル］−５−
アリルバルビツール酸：前記反応で製造した固体を、０
．５ｍｌのテトラヒドロフランおよび１．０ｍｌのジメ
チルホルムアミドの混合物に溶解し、３３ｍｇの水素化
ナトリウム（８０％鉱油分散体、１．０９ミリモル）を
加え、混合物を１時間撹拌する。次いでアリルブロミド
（０．１１ｍｌ、１．１３ミリモル）を加え、溶液を周
囲温度で７２時間撹拌する。希塩酸をｐＨ３まで加えて
反応を抑え、酢酸エチル（１０ｍｌ×３）で抽出する。 コンバインした抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥
し、濃縮する。シリカゲルにて、２０％，　３０％およ
び４０％酢酸エチル／ヘキサンで溶離するクロマトグラ
フィーを行い、１００ｍｇの無色油状物を得る。 【０１３５】５−［４−ヒドロキシ−３−メチル−２−
ブテニル］−５−アリルバルビツール酸：１．０ｍｌの
ジクロロメタン中の前記実験で製造したバルビツール酸
誘導体（１００ｍｇ、０．４２ミリモル）の溶液に、６
ｍｇ（４２μモル）のサリチル酸および９ｍｇ（８４μ
モル）の二酸化セレンを加える。懸濁液を水浴に置き、
ｔ−ブチルハイドロパーオキシドの３．８Ｍベンゼン無
水溶液０．２９ｍｌ（１．０９ミリモル）を加える。次
いで懸濁液を周囲温度で１２時間激しく撹拌する。反応
混合物を濃縮し、シリカゲルカラムにて直接、４０％，
　５０％，　６０％および７０％酢酸エチル／ヘキサン
で溶離するクロマトグラフィーに付す。幾つかの出発物
質および他の生成物に加えて、２１ｍｇの無色油状物を
単離する。 【０１３６】５−［４−［（２ａ−フルオレセイニル）
メチルアミノカルボニルオキシ］−３−メチル−２−ブ
テニル］−５−アリルバルビツール酸：２００μｌのテ
トラヒドロフラン中の前記実験で製造した５ｍｇ（２０
μモル）の油状物の冷却（０℃）溶液に、２００μｌの
ホスゲンの１２％ベンゼン溶液を加える。溶液を周囲温
度に加温し、０．６時間撹拌する。回転蒸発で溶媒を除
去し、残渣を１００μｌのジメチルホルムアミドに再溶
解し、２００μｌのジメチルホルムアミドおよび５．６
μｌ（４０μモル）のトリエチルアミンの混合物中の、
８ｍｇ（２０μモル）のアミノメチルフルオレセイン塩
酸塩の溶液を加える。溶液を周囲温度で１２時間撹拌す
る。溶媒を減圧ポンプで除去し、残渣を１０％メタノー
ル／クロロホルムで溶離する薄層クロマトグラフィーで
精製する。主要バンドを８０％メタノール／クロロホル
ムで溶離し、濃縮して６．６ｍｇのオレンジ色固体を得
る。 【０１３７】前記式［２８］の構造を持つ免疫抗原に対
し産生するバルビツレート用抗体および前記式［５］の
バルビツレートトレーサーは、バルビツレートの蛍光偏
光免疫学的検定法において、驚くべき良好な結果をもた
らすことがわかった。しかしながら、トレーサーを抗体
の最も好ましい組合せは、前記式［３０］の構造を持つ
トレーサーと、前記式［２９］の構造を持つ免疫抗原に
対し産生する単クローン性または多クローン性抗体との
組合せである。 【０１３８】本発明方法の別の利点は、ゼロと区別でき
る分析物の最低測定可能濃度を９５％の信頼で規定する
。当該検定法の感度がセコバルビタールに対する測定で
約６０ｎｇ／ｍｌであることである。 【０１３９】さらに本発明方法の重要な利点は、一般使
用の多数のバルビツレートに対するクロス反応性である
。本発明方法によって、一般使用のバルビツレートのク
ロス反応性が試験される。それぞれの場合において、正
常なヒトの無薬物尿に既知量（２００ｎｇ／ｍｌ）のバ
ルビツレート試験化合物を加えた後、アボット・ラボラ
トリーズのＴＤｘクリニカル・アナライザーまたはＡＤ
ｘドラッグス・オブ・アブュース・システムで、化合物
を検定する。 【０１４０】トレーサーが前記式［５］の構造を有し、
抗体が前記式［２８］の構造を持つ免疫抗原に対して産
生する、本発明検定法による、一般使用のバルビツレー
トの代表的なクロス反応性データを下記表３（ａ）に示
す。なお、表中の５つの欄は、以下の情報を示す。 （１）欄１は、検定する個々のバルビツレートを示す。 （２）欄２は、無薬物尿に加えるバルビツレート試験化
合物の量を示す。 （３）欄３は、得られるヒト尿中に検出されるバルビツ
レート試験化合物の量を示す。 （４）欄４は、検定する個々のバルビツレートを過大評
価（１．０より大、たとえば１．３３）または過小評価
（１．０より小、たとえば０．８３）するファクターを
示す。 （５）欄５は、クロス反応率を示す。 【０１４１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表３（ａ）　　　　　　１　　　　
　　　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　
３　　　　　　　　　　　　４　　　　　　　　　　　
　５　　　　セコバルビタール　　　　　２００　ｎｇ
／ｍＬ　　　　２００　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　　１．
００　　　　　　　　１００％アモバルビタール　　　
　　２００　ｎｇ／ｍＬ　　　　３１０　ｎｇ／ｍＬ　
　　　　　　１．５５　　　　　　　　１５５％ブタル
ビタール　　　　　　　２００　ｎｇ／ｍＬ　　　　２
０１　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　　１．００　　　　　　
　　１００％ペントバルビタール　　　２００　ｎｇ／
ｍＬ　　　　２１０　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　　１．０
５　　　　　　　　１０５％フェノバルビタール　　　
２００　ｎｇ／ｍＬ　　　　２１０　ｎｇ／ｍＬ　　　
　　　　１．０５　　　　　　　　１０５％タルブター
ル　　　　　　　　　２００　ｎｇ／ｍＬ　　　　１８
０　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　　０．９０　　　　　　　
　　９０％【０１４２】表に挙げたバルビツレートのそ
れぞれを、標準として使用され、かつクロス反応率１０
０％（評価ファクター１．０）を有すると判定されたセ
コバルビタールと比較する。ファクター１．０とは、当
該検定法が正常なヒトの無薬物尿に最初に添加した試験
化合物の実際濃度を過大評価または過小評価のいずれも
しないことを示す。換言すれば、正常なヒトの無薬物尿
に２００ｎｇのセコバルビタールを加えたときに、得ら
れる尿試料中に約２００ｎｇのセコバルビタールが検出
されることを示す。すなわち、ファクターが１．０に近
づくにつれて、分析される個々の試験化合物に対する検
定法がより正確となる。このファクターおよびクロス反
応性は共に、アボット・ラボラトリーズのＴＤｘクリニ
カル・アナライザーまたはＡＤｘドラッグス・オブ・ア
ブュース・システムの数値を読むことによって測定する
ことができ、またこれらの測定器は、検定中に実際に検
出されるバルビツレートの量を下記の数式から測定する
のに使用しうるものである。 【０１４３】 【０１４４】欄５に示されるクロス反応率は、下記の数
式から算出される。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　得ら
れるヒト尿中に検出される試験化合物の濃度　　クロス
反応率（％）＝　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　正常なヒトの無薬物尿に添加される試験化合物の
濃度　　×１００ 【０１４５】しかしながら、本発明の検定法の最も好ま
しい具体例において、トレーサーが前記式［３０］の構
造を有し、抗体が前記式［２９］の構造を持つ免疫抗原
に対して産生する、一般使用のバルビツレートの代表的
クロス反応性データを下記表３（ｂ）に示す。 【０１４６】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表３（ｂ）　　　　　　１　　　　　　
　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　３　
　　　　　　　　　　　４　　　　　　　　　　　　５
　　　　セコバルビタール　　　　　２００　ｎｇ／ｍ
Ｌ　　　　２００　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　　１．００
　　　　　　　　１００％アモバルビタール　　　　　
２００　ｎｇ／ｍＬ　　　　　８５　ｎｇ／ｍＬ　　　
　　　　０．４３　　　　　　　　　４３％アプロバル
ビタール　　　２００　ｎｇ／ｍＬ　　　　１２３　ｎ
ｇ／ｍＬ　　　　　　　０．６２　　　　　　　　　６
２％ブタルビタール　　　　　　　２００　ｎｇ／ｍＬ
　　　　２２７　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　　１．１３　
　　　　　　　１１３％ブタバルビタール　　　　　２
００　ｎｇ／ｍＬ　　　　４８９　ｎｇ／ｍＬ　　　　
　　　２．２４　　　　　　　　２２４％ブラロバルビ
タール　　　２００　ｎｇ／ｍＬ　　　　１８８　ｎｇ
／ｍＬ　　　　　　　０．９４　　　　　　　　　９４
％ペントバルビタール　　　２００　ｎｇ／ｍＬ　　　
　１２９　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　　０．６５　　　　
　　　　　６５％フェノバルビタール　　　２００　ｎ
ｇ／ｍＬ　　　　１４０　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　　０
．７０　　　　　　　　　７０％タルブタール　　　　
　　　　　２００　ｎｇ／ｍＬ　　　　５３１　ｎｇ／
ｍＬ　　　　　　　２．６５　　　　　　　　２６５％
【０１４７】本発明の他の利点は、非バルビツレート化
合物との低クロス反応性である。クロス反応性はまた、
一般使用のバルビツレートに類する化学構造を有する化
合物を用いて試験する。一般使用のバルビツレートに類
する化学構造を有する化合物に対する低クロス反応性を
示す代表的クロス反応性データを、下記表４（ａ）（前
記式［５］の構造を持つトレーサーの場合）および表４
（ｂ）（前記式［３０］の構造を持つトレーサーの場合
）に示す。なお、表４（ａ）および４（ｂ）中の５つの
欄は、前記表３（ａ）の場合に記載したのと同じ情報を
示す。 【０１４８】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表４（ａ）　　　　　　１　　　　　　
　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　３　
　　　　　　　　　　　４　　　　　　　　　　５　　
　　　　グルテチミド　　　　　　　　１０　μｇ／ｍ
Ｌ　　　　　１８０　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　０．０１
８　　　　　　　１．８０％　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１　μｇ／ｍＬ　　　　　　ＮＤｐ
−ヒドロキシ フェニトイン　　　　　　　１００　μｇ／ｍＬ　　　
　１２００　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　０．０１２　　　
　　　　１．２０％　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１０　μｇ／ｍＬ　　　　　３４０　ｎｇ／ｍ
Ｌ　　　　　　０．０３４　　　　　　　３．４０％　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　μｇ／
ｍＬ　　　　　　ＮＤフェニトイン　　　　１００　μ
ｇ／ｍＬ　　　　１０２０　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　０
．０１０２　　　　　　１．０２％　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１０　μｇ／ｍＬ　　　　　３
２０　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　０．０３２　　　　　　
　３．２０％　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１　μｇ／ｍＬ　　　　　　ＮＤプリミドン　　　
　　　　　　１００　μｇ／ｍＬ　　　　　３２０　ｎ
ｇ／ｍＬ　　　　　　０．００３２　　　　　　０．３
２％　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　
μｇ／ｍＬ　　　　　　９０　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　
０．００９　　　　　　　０．９０％　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１　μｇ／ｍＬ　　　　　
　ＮＤイブプロフェン　　　　　１００　μｇ／ｍＬ　
　　　　　７０　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　０．０００７
　　　　　　０．０７％　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１０　μｇ／ｍＬ　　　　　　ＮＤ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　μｇ／ｍＬ
　　　　　　ＮＤＯＨ−イブブロフェン　１０００　μ
ｇ／ｍＬ　　　　　　６０　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　０
．００００６　　　　　０．００６％　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１００　μｇ／ｍＬ　　　　　
　ＮＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
　μｇ／ｍＬ　　　　　　ＮＤ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１　μｇ／ｍＬ　　　　　　ＮＤ
フェノプロフェン　　　４３０　μｇ／ｍＬ　　　　　
２９０　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　０．０００６７　　　
　　０．０６７％　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２１５　μｇ／ｍＬ　　　　　１８０　ｎｇ／ｍＬ
　　　　　　０．０００８４　　　　　０．０８４％ナ
プロキセン　　　　　　　１００　μｇ／ｍＬ　　　　
　　７０　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　０．０００７　　　
　　　０．０７％　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１０　μｇ／ｍＬ　　　　　　ＮＤ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ＮＤ＝非検出：　該検定法の感度（６０ｎｇ
／ｍｌ）より小さい濃度【０１４９】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表４（ｂ）　　　　　　１　　　　　　
　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　３　
　　　　　　　　　　　４　　　　　　　　　　５　　
　　　　グルテチミド　　　　　　　　１０　μｇ／ｍ
Ｌ　　　　　４８０　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　０．０４
８　　　　　　　４．８０％　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１　μｇ／ｍＬ　　　　　　８９　
ｎｇ／ｍＬ　　　　　　０．０８９　　　　　　　８．
９０％ｐ−ヒドロキシ フェニトイン　　　　　　　５００　μｇ／ｍＬ　　　
　　２１８　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　０．００００４　
　　　　０．０４％　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１００　μｇ／ｍＬ　　　　　１０１　ｎｇ／ｍ
Ｌ　　　　　　０．０００１０　　　　　０．１０％　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　μｇ／
ｍＬ　　　　　　ＮＤプリミドン　　　　　　　　　１
００　μｇ／ｍＬ　　　　　１９５　ｎｇ／ｍＬ　　　
　　　０．０００１９　　　　　０．１９％　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１０　μｇ／ｍＬ　　
　　　　ＮＤアミノグルテチミド　１００　μｇ／ｍＬ
　　　　　４１２　ｎｇ／ｍＬ　　　　　　０．０００
４１　　　　　０．４１％　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１０　μｇ／ｍＬ　　　　　１１７　ｎ
ｇ／ｍＬ　　　　　　０．００１１７　　　　　１．１
７％　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
μｇ／ｍＬ　　　　　　ＮＤ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　【０１
５０】数種の一般使用のバルビツレート、並びに他のバ
ルビツレートおよびバルビツレート類似構造に類する化
学構造を有する化合物に対する低クロス反応性を示す代
表的クロス反応性データを、下記表５に示す。この場合
、免疫抗原は前記式［２９］の構造を持ち、トレーサー
は前記式［３０］および［３１］の構造を持つ。 【０１５１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表５　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　前記式［３１］　　　　
　　　　　　　　　　前記式［３０］　　化合物　　　
　　　　　添加濃度　　検出濃度　　クロス反応率　　
検出濃度　　クロス反応率　　　　　　　　　　　　　
　　　（ｎｇ／ｍＬ）　　（ｎｇ／ｍＬ）　　　　　　
（％）　　　　　　（ｎｇ／ｍＬ）　　　　　　（％）
　　　　アルフェナール　　　　　１２００　　　　　
　　ＨＩ　　　　　　　　＞１６７　　　　　　　　１
１３０　　　　　　　　　　９４アモバルビタール　　
　１２００　　　　　　８７０　　　　　　　　　　７
３　　　　　　　　　４９０　　　　　　　　　　４１
アプロバルビタール　１２００　　　　　１６７０　　
　　　　　　　１３９　　　　　　　　　９２０　　　
　　　　　　　７７ブラロバルビタール　１２００　　
　　　１９１０　　　　　　　　　１５９　　　　　　
　　１４００　　　　　　　　　１１７ブタバルビター
ル　　　１２００　　　　　　　ＨＩ　　　　　　　　
＞１６７　　　　　　　　　　ＨＩ　　　　　　　　＞
１６７ブタルビタール　　　　　１２００　　　　　　
　ＨＩ　　　　　　　　＞１６７　　　　　　　　２０
００　　　　　　　　　１６７ブトバルビタール　　　
１２００　　　　　　　ＮＡ　　　　　　　　　　ＮＡ
　　　　　　　　　５８０　　　　　　　　　　４８シ
クロペント バルビタール　　　　　　　１２００　　　　　　　Ｈ
Ｉ　　　　　　　　＞１６７　　　　　　　　　　ＨＩ
　　　　　　　　＞１６７ペントバルビタール　１２０
０　　　　　　７７０　　　　　　　　　　６４　　　
　　　　　　７４０　　　　　　　　　　６２フェノバ
ルビタール　１２００　　　　　１２８０　　　　　　
　　　１０７　　　　　　　　　７４０　　　　　　　
　　　６２タルブタール　　　　　　　１２００　　　
　　　　ＨＩ　　　　　　　　＞１６７　　　　　　　
　　　ＨＩ　　　　　　　　＞１６７ＮＡ＝入手不可　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　【０１５２】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　表５（つづき）　　　　　　　　　　　　　　　
　　　クロス反応性の望ましくない化合物 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　前記式［３１］　　　　　　　　　　　　　　前
記式［３０］　　化合物　　　　　　　　添加濃度　　
検出濃度　　クロス反応率　　検出濃度　　クロス反応
率　　　　　　　　　　　　　　　　（ｎｇ／ｍＬ）　
　（ｎｇ／ｍＬ）　　　　　　（％）　　　　　　（ｎ
ｇ／ｍＬ）　　　　　　（％）　　　　フェニトイン　
　　　　　　　１００　　　　　　　９０　　　　　　
　０．０９　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　
　０．０４ＨＰＰＨ（フェニトイン 代謝産物）　　　　　　　　　　　５００　　　　　　
２９０　　　　　　　　０．０５８　　　　　　　　　
２００　　　　　　　　０．００１イブプロフェン　　
　　　１０００　　　　　　　５０　　　　　　　　０
．００５　　　　　　　　　　２０　　　　　　　　０
．００２ナプロキセン　　　　　　　　１００　　　　
　　　２０　　　　　　　　０．０２　　　　　　　　
　　　２０　　　　　　　　０．０２フェノプロフェン
　　　　２００　　　　　　　４０　　　　　　　　０
．０２　　　　　　　　　　　３０　　　　　　　　０
．０１５グルテチミド　　　　　　　　　１０　　　　
　　４７０　　　　　　　　４．７０　　　　　　　　
　　４７０　　　　　　　　４．７０プリミドン　　　
　　　　　　　１００　　　　　　２４０　　　　　　
　　０．２４　　　　　　　　　　１８０　　　　　　
　　０．１８　　 【０１５３】さらに、下記表６（ａ）に記載の化合物は
、１．０、１０．０および１００．０μｇ／ｍｌで試験
したとき、前記式［５］の構造を持つトレーサーに対し
、０．０６μｇ／ｍｌ以下のクロス反応性結果を示す。 【０１５４】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　表６（ａ）アセタミノフェン　　　　　　　
　アセチルサリチル酸　　　　　　アルプラゾラムアミ
ノピリン　　　　　　　　　　　　アミトリプチリン　
　　　　　　　アモキシリンｄ，ｌ−アンフェタミン　
　　　　アンピシリン　　　　　　　　　　　　アンタ
ブュースアポモルフィン　　　　　　　　　　アテノロ
ール　　　　　　　　　　　　フトロフィンベンゾカイ
ン　　　　　　　　　　　　ベンゾイルエクゴニン　　
　　カフェイン次亜塩素酸カルシウム　　　　カルバマ
ゼピン　　　　　　　　　　セファレキシンクロルジア
ゼポキシド　　　　クロロキノン　　　　　　　　　　
　　クロルフェニラミンクロルプロマジン　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　クロルプロパミドシメチジン　　　　　　　　　　　
　　　クロニジン　　　　　　　　　　　　　　コカイ
ンコデイン　　　　　　　　　　　　　　　　シクリジ
ン　　　　　　　　　　　　　　デキストロメトルファ
ンジアゼパム　　　　　　　　　　　　　　ジフルニザ
ール　　　　　　　　　　ジゴキシンエクゴニン　　　
　　　　　　　　　　　エフェドリン　　　　　　　　
　　　　エピネフリンエリスロマイシン　　　　　　　
　エストリオール　　　　　　　　　　エストロン−３
−スルフェ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ートフルラゼパム　　　　　　　　　　　　フロ
セミド　　　　　　　　　　　　　　ゲンチシン酸グア
ヤコールグリセリル　　ヒドロクロロチアジド　　　　
４−ＯＨ−ＰＩＰ−フェンエーテル　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　シクリジンイミプラミン　　　　　　　　
　　　　インドメタシン　　　　　　　　　　レボチロ
キシンロキサピン　　　　　　　　　　　　　　メペリ
ジン　　　　　　　　　　　　　　メフェニトインメプ
ロバメート　　　　　　　　　　メタドン　　　　　　
　　　　　　　　　　ｄ，ｌ−メタムフェタミンメタク
ワロン　　　　　　　　　　　　メチルドーパ　　　　
　　　　　　　　メチプリロンメトプロロール　　　　
　　　　　　モルフィン　　　　　　　　　　　　　　
ナフィシリンナロキソン　　　　　　　　　　　　　　
ナロルフィン　　　　　　　　　　　　ナルトレキソン
ニコチン　　　　　　　　　　　　　　　　ニコチン酸
　　　　　　　　　　　　　　ニフェジピンノルエチン
ドロン　　　　　　　　オキサゼパム　　　　　　　　
　　　　ペニシリンフェンシクリジン　　　　　　　　
フェンメトラジン　　　　　　　　フェノチアジンフェ
ンテルミン　　　　　　　　　　フェニルブタゾン　　
　　　　　　フェニルプロパノラミンピロキシカム　　
　　　　　　　　　　塩化カリウム　　　　　　　　　
　　　プロメタジンプロマジン　　　　　　　　　　　
　　　プロポキシフェン　　　　　　　　プロプラノロ
ールキニーネ　　　　　　　　　　　　　　　　二硫酸
キニーネ　　　　　　　　　　キニジンテルブタリン　
　　　　　　　　　　　テトラシクリン　　　　　　　
　　　デルタ−８−テトラヒドロ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　カンナビノールカルボン酸
デルタ−９−テトラヒ　　　　テトラヒドロゾリン　　
　　　　テオフィリンドロカンナビノールカ ルボン酸 チオプロパゼート　　　　　　　　トリアムテレン　　
　　　　　　　　トリフルオペラジントリメトプリム　
　　　　　　　　　尿酸　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ゾメピラック【０１５５】下記表６（ｂ）
に記載の化合物は、１００．０μｇ／ｍｌで試験したと
き、前記式［３０］の構造を持つトレーサーに対し、６
０ｎｇ／ｍｌ以下のクロス反応性結果を示す。 【０１５６】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　表６（ｂ）アセタミノフェン　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　アセトプロマジンＮ−アセ
チル−１−システィン　　　　　　　　アセチルサリチ
ル酸アルファプロジン　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　アルプラゾラムアルプレノロール　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　アマンタジンアミノピ
リン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　アミトリプチリンシス−１０−ＯＨ−アミトリプチリ
ン　　　　トランス−１０−ＯＨ−アミトリプチリンア
モキシリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ｄ，ｌ−アンフェタミンｐ−ＯＨ−アンフェタ
ミン　　　　　　　　　　　　　アンピシリンアニレリ
ジン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　アンタビュースアポモルフィン　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　アプロバルビタールアスパル
ターメ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
アテノロールアトロピン　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　アザタジンベクロメタゾン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ベナクチ
ジンベンゾカイン　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　安息香酸ベンゾイルエクゴイニン　　　
　　　　　　　　　　　ベンズトロピンベンジルペニシ
リン　　　　　　　　　　　　　　　　　　ブロモクリ
プチンメシレートブロムフェニラミン　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ブピバカインブスピロン　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ブトル
ファノールカフェイン　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　次亜塩素酸カルシウムカルバマ
ゼピン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
カルバマゼピン−１０，１１−エポキシドカリソプロド
ール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　カルフ
ェナジンセファレキシン　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　セファロリジンクロラール水和物　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　クロラムフェニ
コールクロルシアゼポキシド　　　　　　　　　　　　
　　　　エフェドリンクロロキン　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　クロロチアジドクロ
ルフェニラミン　　　　　　　　　　　　　　　　　　
クロルプロマジンクロルプロパミド　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　クロルゾキサゾンコレステロー
ル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　シメ
チジンシプロフロキサシン　　　　　　　　　　　　　
　　　　　クレマスチンクリンダマイシン　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　クロミプラミンクロニジ
ン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　コカインコデイン　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　コルチゾンβ−コルトール
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　シクラ
ゾシンシクリジン　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　シクロベンザプリンシクロゾシン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　シプ
ロヘプタジンデオキシコルチコステロン　　　　　　　
　　　　　デシプラミンデキストロメトロファン　　　
　　　　　　　　　　　ジアセチルモルフィンジアゼパ
ム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　ジベンゼピンジブカイン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ジエチルプロピオンジフ
ルニザール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　ジギトキシンジゴキシン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ジヒドロコデインジヒド
ロモルフィン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
０，１１−ジヒドロキシカルバマゼピンジルチアゼム　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ジフ
ェンヒドラミンジフェノキシレート　　　　　　　　　
　　　　　　　　　ジフェニルヒダントインジピリダモ
ール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ド
パミンドチェピン　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　ドキセピンドキシラミン　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　エクゴニンエ
フェドリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　エピネフリンエリスロマイシン　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　エストラジオールエストリ
オール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
エストロン−３−スルフェートエタンブトール　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　エチナメート４
−エチル−２，５−ジメトキシ　　　　　　　エチルモ
ルフィンアンフェタミン（ＤＯＥＴ） フェンカムファミン　　　　　　　　　　　　　　　　
　　フェンフルラミンフェノプロフェン（＊）　　　　
　　　　　　　　　　　　フェンタニルフルフェナム酸
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　フルオ
キセチンフルフェナジン　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　フルラゼパムフル−ビプロテン　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　フロセミドゲンチ
シン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　グリコピロレートグアヤコールグリセリルエーテル
　　　　　　ハロペリドール馬尿酸　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ヒスタミ
ンヒドララジン　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ヒドロクロロチアジドヒドロコドン　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ヒドロコ
ルチゾンヒドロモルホン　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　５−ヒドロキシインドール−３−酢酸
５−ヒドロキシインドール−２−　　　　　　ヒドロキ
シジンカルボン酸 イブプロフェン（＊＊）　　　　　　　　　　　　　　
　　ＣＯＯＨ−イブプロフェン（＊＊）ＯＨ−イブプロ
フェン（＊＊）　　　　　　　　　　イミノスチルベン
イミノプラミン　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　インドール−３−酢酸インドール−３−酪酸　
　　　　　　　　　　　　　　　インドメタシンイプロ
ニアジド　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　イソプロテレノールイソクスプリン　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ケタミンケトプロフェン
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ラベタ
ロールレバロルファン　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　レボルファノールレボチロキシン　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　リドカインロ
ペラミド　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ロラタジンロラゼパム　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ロクサピンＬＳＤ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　マプロチリンメフェナム酸　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　メラニンメペリジン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
メフェニトインメピバカイン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　メプロバメートメスカリン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
メタドンメタドン一次代謝産物　　　　　　　　　　　
　　　　　ｄ−メタンフェタミンｄ，ｌ−メタンフェタ
ミン　　　　　　　　　　　　　　　メタピリレンメタ
クワロン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　メトカルバモールメトトリメプラジン　　　　　
　　　　　　　　　　　　　メトキシフェナミンメトキ
シプロマジン　　　　　　　　　　　　　　　　　　メ
トスクシミド４−メチル−２，５−ジメトキシ　　　　
　　　３，４−メチレンジオキシアンフェタミアンフェ
タミン（ＤＯＭ）　　　　　　　　　　　　　　ン（Ｍ
ＤＡ）３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−　　　　　　　
３，４−メチレンジオキシ−メタンフェエチルアンフェ
タミン（ＭＤＥ）　　　　　　　　タミン（ＭＤＭＡ）
メチルフェニデート　　　　　　　　　　　　　　　　
　　メチプリロンメトクロプラミド　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　メトプロロールメトロニダゾー
ル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６−モノ
アセチルモルフィンモノエチルグリシンキシリジド　　
　　　　　　モルフィン（ＭＥＧＸ） モルフィン−３β−Ｄ−グルクロニド　　ナフシリンナ
ルブフィン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ナロルフィンナロキソン　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ナルトレキソンナフ
ァゾリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ナプロキセン（＊）ニコチンアミド　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ニコチンニコチン酸
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ニフェジピンｐ−ニトロフェノール　　　　　　　　
　　　　　　　　　ノミフェンシンノルクロリアゼポキ
シド　　　　　　　　　　　　　　Ｎ−ノルコデインノ
ルドキセピン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ノルエチンドロンＮ−ノルモルフィン　　　　　
　　　　　　　　　　　　　Ｎ−ノロキシモルホンＮ−
ノルプロポキシフェン　　　　　　　　　　　　ノルト
ロポキシフェンノルトリプチリン　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　シス−１０−ＯＨ−ノルトリプチ
リントランス−１０−ＯＨ−ノルトリプチ　　　　ニリ
ドリンリン オクトパミン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　オピプラモールオロチン酸　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　オルフェナドリ
ンオキサゼパム　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　オキシコドンオキシメタゾリン　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　オキシモルホンオキシ
フェンブタゾン　　　　　　　　　　　　　　　　パー
ネートペモリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ペニシリンＧペンタゾシン　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　フェナセ
チンフェンシクリジン　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　４−ＯＨピップフェンシクリジン１−フェン
シクロヘキシルアミン　　　　　　フェンジメトラジン
フェネルジン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　フェネチルアミンフェンホルミン　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　フェニラミンフェ
ンメトラジン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　フェノチアジンフェンテルミン　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　フェニルブタゾンフェニルプ
ロパノールアミン　　　　　　　　　　フェニルトロキ
サミンフェニトイン　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ピセナドールピペラセタジン　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１−ピペラジノ
シクロヘキシフェンピロキシカム　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　塩化カリウムプラゾシン
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　プレドニソロンプレドニゾン　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　プレグネノロンプリロカイ
ン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
プロベネシドプロカインアミド　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　プロカインプロクロルペラジン　　
　　　　　　　　　　　　　　　　プロゲステロンプロ
リンタン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　プロマジンプロメタジン　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　プロポキシフェンプロプラ
ノロール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　プ
ロピルヘキセドリンプロトリブチリン　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　プソイドエフェドリンピリラ
ミン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　キニジンキニン　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　ラニチジンサリチル酸
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　スコポラミンセロトニン　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　ストリキニンスドキシカム
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ス
ルファメタジンスルファメトキサゾール　　　　　　　
　　　　　　　スルファチアゾールスルインダック　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ターブタリ
ンテストステロン　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　テトラカインテトラシクリン　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１１−ノル−デルタ−
９−テトラヒドロ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　カンナビノー
ルカルボン酸−９（＊＊＊）テトラヒドロコルチゾン　
　　　　　　　　　　　　　テトラヒドロゾリンテバイ
ン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　テニルジアミンテオフィリン　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　チオプロパゼートチ
オリダジン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　チオチキセントルブタミド　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　トラゾドントリアムテ
レン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ト
リフルオペラジントリフルプロマジン　　　　　　　　
　　　　　　　　　　トリヘキスフェニジルトリメトプ
リム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ト
リミプラミントリペレナミン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　トリプロリジントロパ酸　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ト
ロピントリプタミン　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　チラミン尿酸　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ワルファ
リンゾメピラック 　　＊）　　５００μｇ／ｍｌで試験 　　＊＊）　　１０００μｇ／ｍｌで試験　　＊＊＊）
　　１０μｇ／ｍｌで試験【０１５７】本発明方法の他
の利点は、尿中に普通に検出される化合物による干渉が
無いことである。本発明の検定法（トレーサーは前記式
［５］の構造を有し、抗体は前記式［２８］の構造を持
つ免疫抗原に対して産生する）では、正常なヒトのバル
ビツレート含有尿へ薬物を添加したとき、該添加薬物（
下記表７に記載の濃度の化合物で、尿に普通に検出され
、かつ本発明の検定法の如き全ての免疫学的検定法を干
渉する能力を有し、このため、潜在的に検定法の結果を
不正確にする化合物）の検出誤差が１０％以下である。 本発明の検定法の最も好ましい具体例（トレーサーは前
記式［３０］の構造を有し、抗体は前記式［２９］の構
造を持つ免疫抗原に対して産生する）は、尿に普通に検
出される化合物による干渉が同様に無くなることを明ら
かにした。 【０１５８】 　　表７ 　　化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　試験濃度　　アセトン　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１．０　ｇ／ｄＬ　　
アスコルビン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
．５　ｇ／ｄＬ　　ビリルビン　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．２５０ｍｇ／ｄＬ　　クリアチニン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　５００．０ｍｇ／ｄＬ　
　エタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１．０　ｇ／ｄＬ　　グルコース　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２．０　ｇ／ｄＬ　　Ｎａ
Ｃｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　６．０　ｇ／ｄＬ　　シュウ酸　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１００．０ｍｇ／ｄＬ　　プロテ
ィン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５
　ｇ／ｄＬ　　リボフラビン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　７．５ｍｇ／ｄＬ　　溶解赤血球　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１１５．０ｍｇ／ｄＬ　
　（Ｈｇｂ　濃度） 　　尿素　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　６．０　ｇ／ｄＬ【０１５９】本発明方法
の他の利点は、各試料間（１つの試料から他の試料へ）
の薬物から生じるキャリオーバーが少ないことである。 前記式［５］の構造を有するトレーサーおよび前記式［
２８］の構造を持つ免疫抗原に対して産生する抗体を用
い、アボット・ラボラトリーズのＡＤｘドラッグス・オ
ブ・アブュース・システムで１１９５μｇ／ｍｌの正常
なヒトの尿中のセコバルビタール溶液を検定し、次いで
クリニカル・アナライザーの同じキャロウセル（ｃａｒ
ｏｕｓｅｌ）で正常なヒトの無薬物尿の試料を検定した
後、下記数式からキャリオーバーを算出した。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　無
薬物尿中に検出されるセコバルビタールの測定濃度　　
キャリオーバー率（％）＝　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　セコバルビタール
溶液の濃度　　×１００ 【０１６０】キャリオーバーを測定したところ、０．０
２％以下であった。前記式［３０］の構造を有するトレ
ーサーおよび前記式［２９］の構造を持つ免疫抗原に対
して産生する抗体を用い、５００μｇ／ｍｌの正常なヒ
トの尿中のセコバルビタール溶液を検定した後、同様に
キャリオーバーを測定したところ、０．０３％以下であ
った。 【０１６１】さらに、本発明方法の他の利点は、薬物測
定の正確さである。本発明の、前記式［５］の構造を有
するトレーサーおよび前記式［２８］の構造を持つ免疫
抗原に対して産生する抗体を用いる検定法の正確さも、
極めて好都合のものであった。検定法の再現性は、２週
間に及ぶ１３回の検定操作において、４つの複製をそれ
ぞれ正常なヒトの尿中の０．４、０．６および１．０μ
ｇ／ｍｌのセコバルビタールで検定することにより判断
した。 各複製の濃度は、実験の１日目のシングルでの標準曲線
操作から判定した。これらの実験の結果として、たとえ
ば変動率は６％以下であった。代表的データを下記表８
（ａ）に示す。 【０１６２】 　　表８（ａ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
濃度（μｇ／ｍＬ）　　標的値（ｎ＝５２）　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．４　　
　　　　０．６　　　　　　１．００　　平均　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．４１　　　　０．６０　　　　１．
００　　操作内の標準偏差　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　０．０２　　　　０．０２　　
　　０．０３　　操作内の変動率（％）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　５．１０　　　　２．
９５　　　　３．０５　　操作間の標準偏差　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０２　　
　　０．０２　　　　０．０４　　操作間の変動率（％
）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．
２８　　　　３．４８　　　　３．８３【０１６３】前
記式［３０］の構造を有するトレーサーおよび前記式［
２９］の構造を持つ免疫抗原に対して産生する抗体を用
いる検定法の再現性は、２週間に及ぶ１０回の検定操作
において、５つの複製をそれぞれ正常なヒトの尿中３０
０、８００および１５００ｎｇ／ｍｌのセコバルビター
ルで検定することにより判断した。これらの実験結果と
して、たとえば変動率は７％以下であった。代表的デー
タを下記表８（ｂ）に示す。 【０１６４】 　　表８（ｂ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　濃度
（μｇ／ｍＬ）　　標的値（ｎ＝５０）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　３００　　　　
　　　８００　　　　　　１５００　　平均　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２８６．３１　　　　８０４．７７　　　
１４４８．０４　　操作内の標準偏差　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　８．４１　　　
　　３７．８８　　　　　３７．９９　　操作内の変動
率（％）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２．９４　　　　　　４．７１　　　　　　２．
６２　　操作間の標準偏差　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１７．７３　　　　　４０．
８３　　　　　４５．１２　　操作間の変動率（％）　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．
１９　　　　　　５．０７　　　　　　３．１２ 【０１６５】加えて、両組合せおよびパネルモードの３
つの複製において、乱用薬物検定用のアボット・ラボラ
トリーズのＡＤｘシステムズ・マルチコンスチチューエ
ント・ロウ・コントロールを操作することにより、正確
さを測定した。代表的データを下記表９（ａ）（トレー
サーは前記式［５］の構造を有し、抗体は前記式［２８
］の構造を持つ免疫抗原に対して産生する）および表９
（ｂ）（トレーサーは前記式［３０］の構造を有し、抗
体は前記式［２９］の構造を持つ免疫抗原に対して産生
する）に示す。 【０１６６】 　　表９（ａ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　濃度
（μｇ／ｍＬ）　　標的値（ｎ＝５４）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　０．６　　平均　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．５９　　操作内の標準偏差　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．０３　　操作内の変動率（％）　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　４．５１　　操作間の標準偏差　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
０．０３　　操作間の変動率（％）　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．
７３【０１６７】 　　表９（ｂ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　濃度
（μｇ／ｍＬ）　　標的値（ｎ＝５４）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　３００　　平均　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２７３　　操作内の標準偏差　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
６．８８　　操作内の変動率（％）　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
６．１８　　操作間の標準偏差　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６
．９０　　操作間の変動率（％）　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６
．１９【０１６８】さらに、本発明方法の利点は検定法
の正確さである。本発明の検定法の回復の正確さは、正
常なヒトの尿および希釈緩衝剤に、既知量のセコバルビ
タールを表１０（ａ）では０．２、０．４、０．７、１
．２および２．０μｇ／ｍｌのレベルまで、また表１０
（ｂ）では２００、４００、７００、１２００および２
０００ｎｇ／ｍｌのレベルまで加えて、２組のキャリブ
レータを調製することによって判定した。尿キャリブレ
ータを用いてキャリブレーションを行い、このキャリブ
レーションに対し、アボット・ラボラトリーズのＴＤｘ
クリニカル・アナライザーで２組のキャリブレータを検
定した。回復率は、下記数式に従って算出した。 　　代表的データを下記表１０（ａ）（トレーサーは前
記式［５］の構造を有し、抗体は前記式［２８］の構造
を持つ免疫抗原に対して産生する）および表１０（ｂ）
（トレーサーは前記式［３０］の構造を有し、抗体は前
記式［２９］の構造を持つ免疫抗原に対して産生する）
に示す。 【０１６９】 　　表１０（ａ） 　　標的濃度　　　　　　緩衝剤中の濃度　　　　尿中
の濃度　　　　　　　　　　回復率　　（μｇ／ｍＬ）
　　　　　　（μｇ／ｍＬ）　　　　　　（μｇ／ｍＬ
）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　０．２　　　　　　　　　　０．１８
　　　　　　　　　　０．２０　　　　　　　　　　１
１１．１　　　　０．４　　　　　　　　　　０．３８
　　　　　　　　　　０．４１　　　　　　　　　　１
０７．９　　　　０．７　　　　　　　　　　０．６９
　　　　　　　　　　０．７２　　　　　　　　　　１
０４．４　　　　１．２　　　　　　　　　　１．１６
　　　　　　　　　　１．２２　　　　　　　　　　１
０５．２　　　　２．０　　　　　　　　　　１．９６
　　　　　　　　　　２．０２　　　　　　　　　　１
０３．１　　平均回復率＝１０６．３±３．２％【０１
７０】 　　表１０（ａ） 　　標的濃度　　　　　　緩衝剤中の濃度　　　　尿中
の濃度　　　　　　　　　　　　回復率　　（μｇ／ｍ
Ｌ）　　　　　　（μｇ／ｍＬ）　　　　　　（μｇ／
ｍＬ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　２００　　　　　　　　　　１８
５　　　　　　　　　　　　２００　　　　　　　　　
　　　９２．５　　　　４００　　　　　　　　　　３
９８　　　　　　　　　　　　４１２　　　　　　　　
　　　　９６．６　　　　７００　　　　　　　　　　
６９９　　　　　　　　　　　　６９２　　　　　　　
　　　１０１．０　　１２００　　　　　　　　１２３
１　　　　　　　　　　１２５６　　　　　　　　　　
　　９８．０　　２０００　　　　　　　　２０４７　
　　　　　　　　　２０６８　　　　　　　　　　　　
９９．０　　平均回復率＝９７．１±２．５％ 【０１７１】また本発明の検定法を以下の方法により、
他のバルビツレートの検出法、たとえばガスクロマトグ
ラフィー（ＧＣ）／マススペクトロ（ＭＳ）、同位元素
標識免疫定量法（ＲＩＡ）およびＥＭＩＴ（登録商標）
と比較した。すなわち、この比較で無薬物尿検体とバル
ビツレート含有尿検体とバルビツール代謝産物を検定し
た。代表的データを下記表１１（ａ）（トレーサーは前
記式［５］の構造を有し、抗体は前記式［２８］の構造
を持つ免疫抗原に対して産生する）、表１１（ｂ）（ト
レーサーは前記式［３０］の構造を有し、抗体は前記式
［２９］の構造を持つ免疫抗原に対して産生する。ＥＭ
ＩＴと比較）、および表１１（ｃ）（トレーサーは前記
式［３０］の構造を有し、抗体を前記式［２９］の構造
を持つ免疫抗原に対して産生する。ＲＩＡと比較）に示
す。 【０１７２】 　　表１１（ａ） 　　試料タイプ　　試料の数　　　　本発明　　　　　
　試験法（ＧＣ／ＭＳ）　　　　ＥＭＩＴ／ｄ．ａ．ｕ
． 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（
Ｐｏｓ／Ｎｅｇ）　　　　　　（Ｐｏｓ／Ｎｅｇ）　　
　　　　　　　　（Ｐｏｓ／Ｎｅｇ）　　　　＞０．５
０μｇ／ｍＬ　　　　１４９　　　　　　１４９／０　
　　　　　　　　　１４９／０　　　　　　　　　　　
　　　１４９／０ 【０１７３】 　　表１１（ｂ） 　　試料タイプ　　試料の数　　　　ＴＤｘ　　　　　
　ＡＤｘ　　　　ＥＭＩＴ　　　　ＧＣ／ＭＳ　　　　
　　　　　　　　　　　　（Ｎ）　　　　（Ｐｏｓ／Ｎ
ｅｇ）　　（Ｐｏｓ／Ｎｅｇ）　　（Ｐｏｓ／Ｎｅｇ）
　　　　（Ｐｏｓ／Ｎｅｇ）　　　　＜２００ｎｇ／ｍ
Ｌ　　　　　１２８　　　　　　　０／１２８　　　　
　　０／１２８　　　　　　０／１２８　　　　　　　
２１，　２／０＞２００ｎｇ／ｍＬ　　　　　１０１　
　　　　　　１０１／０　　　　　　１０１／０　　　
　　　１００／１　　　　　　　９９／２３，　４　　
試料Ｎｏ．　　ＴＤｘ　　　　　ＡＤｘ　　　　　ＥＭ
ＩＴ　　　　　ＧＣ／ＭＳ　　　同定化合物　　　　　
　　　　　ｎｇ／ｍＬ　　　ｎｇ／ｍＬ　　Ｐｏｓ／Ｎ
ｅｇ　　　ｎｇ／ｍＬ　　　　１　　　　　１１０．６
２　　　　　　７３　　　　　ＰＯＳ　　　　　　　２
２６　　　　フェノバルビタール　　　　２　　　　　
１５６．６９　　　　　１５０　　　　　ＮＥＧ　　　
　　　　２３０　　　　フェノバルビタール　　　　３
　　　　１９１１．９３　　　　　　高　　　　　ＰＯ
Ｓ　　　　　　　　　０　　　　グルテチミド　　　　
４　　　　　２４５．１３　　　　　２８３　　　　　
ＮＥＧ　　　　　　　１９３　　　　フェノバルビター
ル【０１７４】 　　表１１（ｃ） 　　試料タイプ　　試料の数　　　　ＴＤｘ　　　　　
　ＡＤｘ　　　　　ＲＩＡ　　　　　ＧＣ／ＭＳ　　　
　　　　　　　　　　　　　（Ｎ）　　　　（Ｐｏｓ／
Ｎｅｇ）　　（Ｐｏｓ／Ｎｅｇ）　　（Ｐｏｓ／Ｎｅｇ
）　　　　（Ｐｏｓ／Ｎｅｇ）　　　　＜２００ｎｇ／
ｍＬ　　　　　１０８　　　　　　　０／１０８　　　
　　１１／１０７　　　　　　０／１０８　　　　　　
　２１，　２／９＞２００ｎｇ／ｍＬ　　　　　　９１
　　　　　　　９１／０　　　　　　９１／０　　　　
　　　　７８／１３　　　　　　　９７　ＮＴ，　９１
／０　　試料Ｎｏ．　　ＴＤｘ　　　　　ＡＤｘ　　　
　　　ＲＩＡ　　　　　ＧＣ／ＭＳ　　　同定化合物　
　　　　　　　　　ｎｇ／ｍＬ　　　ｎｇ／ｍＬ　　Ｐ
ｏｓ／Ｎｅｇ　　　ｎｇ／ｍＬ　　　　１　　　　　１
８４．１３　　　　　２０３　　　　　ＮＥＧ　　　　
　　　２０２　　　　フェノバルビタール　　　　２　
　　　　１２５．００　　　　　１２７　　　　　ＮＥ
Ｇ　　　　　　　２０７　　　　フェノバルビタール【
０１７５】本発明について上述の如く個々の場合につい
て説明したが、当業者であれば本発明の精神に即して多
くの改変や変更を適宜に成しうるであろう。これらの改
変や変更は、特許請求の範囲および発明の詳細な説明に
基づく技術的範囲に属するものである。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　式、 【化１】 （式中、Ｗは酸素または硫黄；Ｒ１は直鎖または分枝鎖
   状に配列され、かつ１個以下の脂肪族または芳香族環構
   造を持ち、トータル１〜１２個の炭素原子および０〜１
   個のハロゲン原子を有する、アルキル、アルケニル、ア
   リール、またはアルキニル基；Ｒ３はＲ４−Ｆｌ；Ｆｌ
   はフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体；および
   Ｒ４は（ａ）直鎖または分枝鎖状に配列され、かつ１個
   以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、トータル０〜
   １５個の炭素原子およびＯ、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＦのヘテ
   ロ原子を有する結合基、または（ｂ）トータル０〜５個
   のヘテロ原子を有する結合基である）で示されるトレー
   サー。
2. 【請求項２】　　Ｒ１がトータル２〜７個の炭素原子を
   有するアルキル基、およびＲ４がトータル０〜１０個の
   炭素原子およびヘテロ原子を有する結合基である請求項
   １に記載のトレーサー。
3. 【請求項３】　　式、 【化２】 で示される請求項１に記載のトレーサー。
4. 【請求項４】　　式、 【化３】 で示される請求項１に記載のトレーサー。
5. 【請求項５】　　生物学的流体中のバルビツレートの存
   在もしくはその量を測定する方法であって、（Ａ）試料
   を、式： 【化４】 （式中、Ｗは酸素または硫黄；Ｒ１は１個以下の脂肪族
   または芳香族環構造を持ち、トータル１〜１２個の炭素
   原子および０〜１個のハロゲン原子を有する、アルキル
   、アルケニル、アリール、またはアルキニル基；Ｒ２は
   Ｒ−Ｑ；Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導
   体、または他の免疫抗原的に活性な担体；およびする結
   合基、（ｂ）直鎖または分枝鎖状に配列され、かつ１個
   以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、トータル０〜
   ２０個の炭素原子およびＯ、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＦのヘテ
   ロ原子を有する結合基、または（ｃ）トータル０〜７個
   のヘテロ原子を有する結合基である）の免疫抗原に対し
   て産生する単クローン性または多クローン性抗体を含有
   するバルビツレート抗血清と、およびバルビツレート抗
   血清の存在に対して検知しうる蛍光偏光応答をもたらす
   ことができる、請求項１に記載のトレーサー化合物と接
   触せしめ、（Ｂ）工程（Ａ）から得られる溶液に平面偏
   光を通して、蛍光偏光応答を得、次いで（Ｃ）工程（Ｂ
   ）の溶液の蛍光偏光応答を、試料中のバルビツレートの
   存在もしくはその量の測度として検出することを特徴と
   するバルビツレートの測定法。
6. 【請求項６】　　抗体が式： 【化５】 の免疫抗原に対して産生する請求項５に記載の測定法。
7. 【請求項７】　　トレーサー化合物が式：【化６】 の化合物である請求項５に記載の測定法。
8. 【請求項８】　　トレーサー化合物が式：【化７】 の化合物である請求項６に記載の測定法。
9. 【請求項９】　　生物学的流体中のバルビツレートの存
   在もしくはその量を測定する試薬キットであって、（Ａ
   ）請求項１に記載のトレーサー、および（Ｂ）式：【化
   ８】 （式中、Ｗは酸素または硫黄；Ｒ１は１個以下の脂肪族
   または芳香族環構造を持ち、トータル１〜１２個の炭素
   原子および０〜１個のハロゲン原子を有する、アルキル
   、アルケニル、アリール、またはアルキニル基；Ｒ２は
   Ｒ−Ｑ；Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導
   体、または他の免疫抗原的に活性な担体；およびする結
   合基、（ｂ）直鎖または分枝鎖状に配列され、かつ１個
   以下の脂肪族または芳香族環構造を持ち、トータル０〜
   ２０個の炭素原子およびＯ、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＦのヘテ
   ロ原子を有する結合基、または（ｃ）トータル０〜７個
   のヘテロ原子を有する結合基である）の免疫抗原に対し
   て産生する単クローン性または多クローン性抗体を包含
   することを特徴とする試薬キット。
10. 【請求項１０】　　リボフラビンによる蛍光干渉を減少
    させるのに有効量のリボフラビン結合プロテインをさら
    に包含する請求項９に記載の試薬キット。
11. 【請求項１１】　　抗体が式： 【化９】 の免疫抗原に対して産生する請求項９または１０に記載
    の試薬キット。
12. 【請求項１２】　　トレーサーが式： 【化１０】 のトレーサーである請求項９または１０に記載の試薬キ
    ット。