JP2945680B2

JP2945680B2 - ペプチド誘導体およびその用途

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Publication number: JP2945680B2
Application number: JP1056350A
Authority: JP
Inventors: 優孝大場; 博道熊谷; 俊策針江; 啓一内田
Original assignee: Asahi Glass Co Ltd
Current assignee: AGC Inc
Priority date: 1988-09-09
Filing date: 1989-03-10
Publication date: 1999-09-06
Anticipated expiration: 2014-09-06
Also published as: DE68921469T2; EP0406428A1; DE68921469D1; EP0406428B1; EP0406428A4; WO1990002751A1; JPH02174797A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は新規な合成環状ペプチドあるいはその塩から
なるペプチド誘導体、およびそれを有効成分とする動物
細胞の接着阻害剤に関するものである。

［従来の技術］動物細胞の細胞外基質に対する接着性に関与する因子
として、フィブロネクチンやビトロネクチンが知られて
いる。これらの細胞接着因子は−Arg−Gly−Asp−なる
接着部位を有する。従って、この接着部位と同じトリペ
プチド残基を有する化合物は細胞接着因子による接着性
を阻害する。即ち、この細胞接着阻害因子は細胞接着因
子が結合する被接着部位に結合するためその後に細胞接
着因子が結合することを阻害する。このような細胞接着
阻害因子としてはたとえばGly−Arg−Gly−Asp−Ser−P
roが知られている。細胞接着阻害因子は動物細胞の接着
性に関連する研究用の試薬として用いられている他、癌
細胞の転移の抑制（転移先での接着固定化の阻止）のた
めの薬剤として期待されている。

［発明の解決しようとする課題］従来公知の細胞接着阻害因子は線状ペプチドであるた
め溶液中で特定の立体構造が安定的に存在し難くその効
果を充分に発揮し難い場合があった。また、アミノ末端
やカルボキシル末端が存在しているためアミノペプチダ
ーゼやカルボキシペプチダーゼなどの酵素による加水分
解を受け易く、これら酸素の存在する液中での安定性が
不充分であった。

細胞接着阻害因子の構造安定性を向上すべく、前記ト
リペプチド残基の他にシスティイン残基を有するポリペ
プチドを合成し、ジスルフィド結合で環化した化合物が
知られている（M.D.Pierschbadhen他、J.Biol.Chem.,26
2,17294−17298（1987））。しかし、ジスルフィド結合
を有する細胞接着阻害因子も上記問題を充分に解決する
までには至っていない。

［課題を解決するための手段］本発明は、前記課題を解決した新規なペプチド誘導
体、およびそれを有効成分とする細胞接着阻害活性を有
する薬剤に関する下記発明である。

ペプチド結合で環化されている下記式［Ｉ］で表わさ
れる合成環状ペプチド、またはその塩、からなるペプチ
ド誘導体。

ただし、Ｒは、アミノ酸残基あるいはオリゴペプチド
残基を示す。

上記ペプチド誘導体を有効成分とする動物細胞の接着
を阻害する薬剤。

本発明において、アミノ酸とはα−アミノ酸は勿論、
他のアミノ酸（β−アミノ酸、γ−アミノ酸など）をも
意味する。α−アミノ酸以外のアミノ酸としては、H₂N
（CH₂）_mCOOH（ｍは２以上の整数）で表わされるアミノ
酸が適当であり、たとえば、３−アミノプロピオン酸、
４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン酸、６−アミ
ノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオク
タン酸などがある。好ましくは、ｍは８以下の整数であ
る。また、α−アミノ酸としては、Ｌ−アミノ酸は勿
論、Ｄ−アミノ酸やDL−アミノ酸であってもよい。本発
明における好ましいアミノ酸はα−アミノ酸であり、特
にその内のＬ−アミノ酸である。以下、特に言及しない
限りアミノ酸とはこのＬ−アミノ酸を意味し、アミノ酸
残基とはアミノ酸の水素原子１個とカルボキシ基のヒド
ロキシ基を除いた残基をいう。

本発明において、Ｒにおけるオリゴペプチドとは上記
のようなアミノ酸が２以上ペプチド結合で連結したもの
をいう。好ましいアミノ酸残基数は16以下である。アミ
ノ酸としてはα−アミノ酸が好ましい。特にオリゴペプ
チドの全アミノ酸残基がα−アミノ酸であることが好ま
しい。しかし、一部のアミノ酸残基は上記H₂N（CH₂）_mC
OOHやβ−アミノ酸などのα−アミノ酸以外のアミノ酸
残基あるいはＤ−アミノ酸残基であってもよい。オリゴ
ペプチドにおけるアミノ酸残基数は、特に２〜10が好ま
しい。以下、オリゴペプチド残基とはアミノ末端側のア
ミノ基の水素原子１個とカルボキシ末端側のカルボキシ
基のヒドロキシ基を除いた残基をいう。

本発明における合成環状ペプチドは後述細胞接着阻害
効果を発揮するためには、−Arg−Gly−Asp−のペプチ
ドブロックが必要である。しかし、このペプチドブロッ
クのみの環状ペプチドでは効果の発揮が充分ではなく、
それ以外に少なくとも１つのアミノ酸残基の存在が必要
である。より好ましくは、このペプチドブロックの前後
（アミノ末端側とカルボキシ末端側）に少なくとも１個
のα−アミノ酸残基が存在することが好ましく、特にア
ミノ末端側にグリシン残基が存在すること（即ち、Ｒの
カルボキシ末端がGlyであること）が好ましい。この合
成環状ペプチドは下記式［II］で表わされる。

式［II］において、R¹はカルボキシ末端側がグリシン
残基であるＲのグリシン残基以外の部分を示す。好まし
いR¹はアミノ酸残基、あるいはアミノ酸残基数９以下の
オリゴペプチド残基である。

また、前記必須の−Arg−Gly−Asp−のペプチドブロ
ックのカルボキシ末端側はセリン残基またはアスパラギ
ン残基であることが好ましい。それに続く２番目のアミ
ノ酸残基はプロリン残基あるいはグリシン残基であるこ
とが好ましい。さらに、３番目のアミノ酸残基はアラニ
ン残基であることが好ましい。従って、また好ましいＲ
は下記式［III］で表わされるオリゴペプチドである。

−Ser（またはAsn）Pro（またはGly）AlaR²
…［III］なお、式［III］内の３個の［］は存在することが
好ましい（場合によっては存在しなくてもよい）残基を
示し、R²はＲから式［III］で示した具体的アミノ酸残
基を除いたオリゴアミノ酸残基あるはアミノ酸残基を示
す。特に好ましいＲは下記式［IV］で表わされるオリゴ
ペプチド残基である。

−Ser（またはAsn）−ProAlaR³Gly− …［IV］式［IV］において２個の［］は存在することが好ま
しい（場合によっては存在しなくともよい）残基を示
す。R³としてはアミノ酸残基、あるいはアミノ酸残基数
２〜７のオリゴペプチド残基であることが好ましい。R³
であるアミノ酸残基あるいはR³中のアミノ酸残基の種類
には制約が少なく、その一部は前記したようにＤ−アミ
ノ酸残基やα−アミノ酸以外のアミノ酸の残基であって
もよい。

式［Ｉ］で表わされる環状ペプチドはＲのカルボキシ
末端とアルギニンのアミノ末端とがペプチド結合で連結
したものである。ただし、式［Ｉ］で表わされる環状ペ
プチドはその合成経路を示すものではない。即ち、この
環状ペプチドはArg−Gly−Asp−Ｒを合成した後にそれ
を環化する方法は勿論、他の任意の位置のペプチド結合
部分を形成することによって環化する方法でも合成でき
るものである。たとえば、Arg−Gly−Gly−Aspあるいは
Asp−Ｒ間のペプチド結合は勿論、Ｒ内の任意のペプチ
ド結合部分を形成して環化することができる。以下に本
発明における環状ペプチドを具体的に例示するが、これ
らに限られるものではない。

なお、下記の環状ペプチドにおけるα−アミノ酸残基
は、一文字記号で表示する。

上記ペプチドの塩としては、酢酸、酒石酸、クエン
酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、硫
酸、硝酸、リン酸などとの有機酸塩または無機酸塩類、
あるいはナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属
塩類、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩類、アン
モニウム、エタノールアミン、トリエチルアミン、ジシ
クロヘキシルアミンなどの有機アミン類などのような無
機塩基、有機塩基との塩類を意味する。

本発明における環状ペプチドは通常のペプチド合成法
によって合成できる。前記のように、環化は線状のペプ
チド合成後に環化反応で行なわれるが、その環化を行な
う部分は隣接アミノ酸残基間の任意のペプチド結合を形
成することによって行なうことができる。

本発明の上記ペプチド誘導体は動物細胞の接着を阻害
するための薬剤として有効である。動物細胞としては哺
乳動物細胞が好ましく、さらに通常の体細胞や生殖細胞
は勿論、癌細胞などがある。また、血小板などの無核細
胞の接着阻害にも有効である。特に対象となる動物細胞
は各種癌細胞である。癌の転移は癌細胞の他の細胞や細
胞外基質に対する接着が関与している。従って、癌細胞
の接着を阻害することは癌の転移防止に有効であると考
えられる。また、血小板の血管内壁への付着を阻害する
ことができれば血栓などの発生を防止することが可能と
なると考えられる。本発明のペプチド誘導体は後述実施
例に示すように動物細胞の接着阻害効果が優れているば
かりでなく、酸素による加水分解を受け難く生体内安定
性に優れている。しかも、たとえ加水分解を受けたとし
ても前記必須のペプチドブロック部分やその近傍が加水
分解を受けない限り加水分解により生じる線状ペプチド
もまたある程度の細胞接着阻害効果を有する。

以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、
本発明はこの実施例に限られるものではない。

なお、以下の実施例においては、アミノ酸、保護基、
活性基などについてIUPAC−IUB Commission on Biologi
cal Nomenclatureに基づく略号および当該分野における
慣用略号で表示する場合があり、それらを例示すると下
記のとおりである。

Ala:アラニン Asp:アスパラギン酸 Gly:グリシン Ile:イソロイシン Lys:リジン Val:バリン Boc:t−ブトキシカルボニル Asn:アスパラギン Arg:アルギニン Thr:スレオニン Leu:ロイシン Pro:プロリン Ser:セリン Bzl:ベンジル OBzl:ベンジルエステル HOBt:p−ヒドロキシベンゾトリアゾール OSu:N−ヒドロキシスクシンイミドエステル OPac:フェナシルエステル WSC・HCl:1−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド塩酸塩 TFA:トリフルオロ酢酸 OPFP:ペンタフルオロフェニルエステル DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド DC urea:シクロヘキシルウレア OcHex:シクロヘキシルエステル Tos:p−トルエンスルホニル基実施例１（１）BocAlaOPacの合成 BocAla 9.5g（50mmol）をメタノール100mlに溶解した
のち25％（W/V）Cs₂CO₃水溶液を33ml加えた。これを減
圧濃縮したのち、トルエン30mlを加え再び減圧下で乾固
した。この操作を３回行なって水分を除いてから、DMF
を150ml加えて固形分を溶解し、そこへフェナシルブロ
ミド10g（50mmol）を加え、室温にて１時間撹拌した。
沈殿物（CsBr）を濾過して除いたのち減圧下でDMFを留
去してから酢酸エチル200mlを加えついで水200ml、1N H
Cl 200ml（２回）、水200ml、５％炭酸水素ナトリウム
水溶液200ml（２回）、水200mlの順で酢酸エチル相を洗
浄した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥してから減圧
乾固すると白色結晶13.4g（143.6mmol、収率87.2％）を
得た。

（２）H₂NAlaOPac・TFAの合成 BocAlaOPac 13g（42.3mmol）を300mlナスフラスコに
入れ、トリフルオロ酢酸（TFA）70mlを加え室温で20分
撹拌したのち減圧濃縮した。ここへエーテル300mlを加
えると白色結晶が析出したので濾過し、エーテルでよく
洗浄したのち乾燥したところH₂NAlaOPac・TFA 13.2g（4
1.1mmol、収率97.1％）を得た。

（３）BocProAlaOPacの合成 BocPro 6.45g（30mmol）、NH₂AlaOPac・TFA 9.21g（3
0mmol）をDMF60mlに溶解し、氷冷下Ｎ−メチルモルホリ
ンでpH6にした、ここへHOBt 4.6gW、SC・HCl 5.8gを加
え再びＮ−メチルモルホリンでpH6にして、終夜撹拌し
た。減圧下でDMFを留去したのち酢酸エチル100mlを加
え、水100ml、1N HCl 100ml（２回）、水100ml、５％炭
酸水素ナトリウム水溶液100ml（２回）、水100mlの順に
酢酸エチル相を洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加え乾燥
した。減圧濃縮してからヘキサンを加えたところ、白色
結晶が析出したので濾取しこれを酢酸エチル／ヘキサン
から再結晶し、BocProAlaOPac 6.5g（16.1mmol、収率54
％）を得た。

アミノ酸分析値:Ala 1.0 Pro 0.96 （４）BocSer（Bzl）ProAlaOPacの合成 BocProAlaOPac 6.5g（16mmol）を30ml TFAに加えて、
30分間室温で撹拌したのち、減圧下でTFAを留去しオイ
ルを得た。このオイルをエーテル200mlで３回洗ったの
ち、減圧下でエーテルを除いた。そこへDMF 40mlを加え
氷冷してＮ−メチルモルホリンでpH6に合わせた。BocSe
r（Bzl）4.72g（16mmol）、HOBt 2.4g、WSC・HCl 3.1g
の順に加え、再びＮ−メチルモルホリンでpH6に合わせ
て、終夜撹拌した。減圧下でDMFを除いたのち、酢酸エ
チル100mlに溶解し、酢酸エチル相を水100ml、1N HCl 1
00ml（２回）、水100ml、５％炭酸水素ナトリウム水溶
液100ml（２回）、水100mlの順で洗浄し、無水硫酸ナト
リウムを加えて乾燥した。減圧下で酢酸エチルを留去し
て白色粉末7.88g（13.5mmol、収率84.4％）を得た。

アミノ酸分析:Ser 0.90 Pro 0.94 Ala 1.0 （５）BocAsp（OBzl）Ser（Bzl）ProAlaOPacの合成 BocSer（Bzl）ProAlaOPac 7.5g（13mmol）を30ml TFA
に加えて室温にて30分間撹拌したのち、減圧下でTFAを
留去してオイル7.66gを得た。このオイルにエーテルを
加えよく洗いエーテルをデカンテーションして除く操作
を３回行ない、減圧下でエーテルを除いたのち、DMF 30
mlに溶解し氷冷した。そこへBocAsp（OBzl）4.2g（13mm
ol）、HOBt 2g、WSC・HCl 3gを加えＮ−メチルモルホリ
ンでpH6に合わせて、終夜撹拌した。減圧下でDMFを留去
して得たオイルを酢酸エチル100mlに溶解し、その酢酸
エチル相を水100ml、1N HCl 100ml（２回）、水100ml、
５％炭酸水素ナトリウム水溶液100ml（２回）、水100ml
の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。
減圧下で酢酸エチルを除き得られた粉末を酢酸エチル／
エーテル／ヘキサンから再結晶したところ白色粉末8.86
g（11.3mmol、収率86.9％）を得た。

アミノ酸分析:Asp 1.02 Ser 0.84 Pro 0.97 Ala
1.0 （６）BocArg（Tos）GlyOBzlの合成 BocArg（Tos）11.3g（26.3mmol）をTHF 50mlに溶解し
氷冷した。そこへGlyOBzlTosOH 8.9g（26.4mmol）、HOB
t 4.0g WSC・HCl 5.1gを加え、トリエチルアミンでpH6
に合わせて、終夜撹拌した。減圧下でTHFを留去して得
たオイルを酢酸エチル100mlに溶解し、その酢酸エチル
相を水100ml、1N HCl 100ml（２回）、水100mlに溶解
し、その酢酸エチル相を水100ml、1N HCl 100ml（２
回）、水100ml、５％炭酸水素ナトリウム水溶液100ml
（２回）、水100ml、５％炭酸水素ナトリウム水溶液100
ml（２回）、水100mlの順で洗浄し、無水硫酸ナトリウ
ムを加えて乾燥した。減圧下で酢酸エチルを留去したの
ち、ヘキサンを加えて白色沈殿13.3g（22.5mmol、収率8
5.5％）を得た。

アミノ酸分析:Ala 0.99 Gly 1.0 （７）BocGlyArg（Tos）GlyOBzlの合成 BocArg（Tos）GlyOBzl 13g（22mmol）にTFA 80mlを加
え室温で15分間撹拌したのち減圧下でTFAを留去し、エ
ーテルを加え沈殿をよく洗浄した。減圧下でエーテルを
除いたのちTHF 100mlに溶解し、氷冷下BocGly 3.85g（2
2mmol）、HOBt 3.4g、WSC・HCl 4.22gを加えトリエチル
アミンでpH6に合わせて、終夜撹拌した。減圧下でTHFを
留去して得たオイルを酢酸エチル100mlに溶解し、酢酸
エチル相を水100ml、1N HCl 100ml（２回）、水100ml、
５％炭酸水素ナトリウム水溶液100ml（２回）、水100ml
の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。
減圧下で酢酸エチルを留去して白色粉末13.5g（21.3mmo
l、収率96.8％）を得た。

アミノ酸分析:Ala 0.99 Gly 2.0 （８）BocGlyArg（Tos）GlyOHの合成 BocGlyArg（Tos）GlyOBzl 13.5g（21.3mmol）をメタ
ノール100mlに溶解し酢酸50ml、水20ml、５％パラジウ
ム炭素を加え水素を３時間通じた。５％パラジウム炭素
を濾過して除いて溶媒を減圧下で留去したのち酢酸エチ
ル100mlに溶解し硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し
たのち、減圧下で酢酸エチルを留去して、白色粉末9.76
g（19.4mmol、91％）を得た。

（９）H₂NAsp（OBzl）Ser（Bzl）ProAlaOPac・TFAの合
成前記（５）で合成したBocAsp（OBzl）Ser（Bzl）ProA
laOPac 8g（10mmol）に50ml TFAを加え室温にて30分撹
拌したのち、減圧下でTFAを留去した。エーテルを加え
−20℃に保温すると、白色結晶が析出したので上清をデ
カンテーションで除き残渣をメタノール／エーテルから
再結晶し、目的物7.9g（9.9mmol、収率99％）を得た。

（10）BocGlyArg（Tos）GlyAsp（OBzl）Ser（Bzl）ProA
laPacの合成 H₂NAsp（OBzl）Ser（Bzl）ProAlaOPac・TFA 1.5g（2m
mol）をDMF 10mlに溶解し、そこへ前記（８）で合成し
たBocGlyArg（Tos）GlyOH 1.2g（2mmol）、HOBt 0.3g、
WSC・HCl 0.5gを加え、Ｎ−メチルモルホリンでpH6に合
わせて、終夜撹拌した。減圧下でDMFを留去して得たオ
イルを酢酸エチル50mlに溶解し、水50ml、1N HCl 50ml
（２回）、水50ml、５％炭酸水素ナトリウム水溶液50ml
（２回）、水50mlの順に洗浄したのち、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥した。減圧下で酢酸エチルを留去して得た白
色粉末をエーテルでよく洗い乾燥して、目的物1.36g
（1.06mmol、収率50％）を得た。

アミノ酸分析:Gly 2.0 Arg 0.97 Asp 0.98 Ser 0.
85 Pro 0.89 Ala 1.0 （11）BocGlyArg（Tos）GlyAsp（OBzl）Ser（Bzl）ProA
laOHの合成 BocGlyArg（Tos）GlyAsp（OBzl）Ser（Bzl）ProAlaOP
ac 1.0g（0.8mmol）を90％酢酸30mlに溶解し、そこへ亜
鉛末3.3g（40mmol）を氷冷下加え、０℃で３時間撹拌し
た。濾過して亜鉛末を除いたのち、減圧下で溶媒を留去
し残渣に1N HCl 30mlを加え、酢酸エチル50mlで抽出し
た。1H NCl 50ml、水50mlの順で洗浄し、無水硫酸ナト
リウムで乾燥した。減圧下で酢酸エチルを減圧濃縮した
のちエーテルを加えて、白色粉末0.85g（0.72mmol、収
率90％）を得た。

BocGlyArg（Tos）GlyAsp（OBzl）Ser（Bzl）ProAlaOH
0.85g（0.72mmol）を5ml DMFに溶解したのち、HOSu 0.
15g（1.3mmol）、WSC・HCl 0.25gを加え、Ｎ−メチルモ
ルホリンでpH6に合わせて、終夜撹拌した。減圧下DMFを
留去したのち水を加えて得たオイルをよく洗い分離して
減圧下で乾燥した。そこへTFA 20mlを加え室温で10分間
撹拌したのち減圧下でTFAを留去した。エーテルを加え
て析出した白色粉末0.79g（0.61mmol、収率84％）を濾
取した。これを5ml DMFに溶解し、60℃に保温したピリ
ジン中に撹拌しながら30分間で滴下した。５時間60℃に
保ち、その後終夜30℃で撹拌した。減圧下ピリジンを留
去し、エーテルを加えて得た白色粉末をアセトン／エー
テルから再結晶して、目的物0.61g（0.57mmol、収率93
％）を得た。

0.6g（0.57mmol）にアニソール11ml、クレゾール1mlを
加え、HF 50mlを加えて０℃１時間撹拌したのち、減圧
下で留去してエーテルを加え、濾過して白色粉末を得
た。これを水100mlに溶解し、凍結乾燥して、固体0.40g
を得た。この固体を0.1％ TFA水溶液10mlに溶解し、セ
ミ分取ODSカラムを用いた高性能液体クロマトグラフィ
ー（HPLC）に供しアセトニトリル10％の画分を集め、凍
結乾燥し40mgの目的物を得た。

アミノ酸分析:Gly 1.96 Arg 0.95 Asp 0.97 Ser
0.82 Pro 0.87 Ala 1.0 （14）線状ペプチド（GRGDSPA）の合成（11）で合成した生成物を（13）と同様の方法で脱保
護し精製してGlyArgGlyAspSerProAlaを得た。

B.ペプチドマップ（13）で合成したペプチドをトリプシンで分解し、環
状ペプチドであることを確認した。即ち、（13）で合成
したペプチドを蒸留水で10mg/mlに溶解し、20μｌに緩
衝液（Tris−HCl 100mM pH8.5）180μｌを加え希釈す
る。これにトリプシン溶液（1mg/ml、5M HCl＋CaCl₂ 10
mM）５μｌを加え37℃に24時間保温した。2N HClを10μ
ｌ添加し、反応を終了させた。そのうち50μｌを高性能
液体クロマトグラフィー（HPLC）に供し分析を行なっ
た。

分析条件 HPLC:ウォターズモデル510 カラム:YMC−ODS 検出:A₂₁₄ 溶出:A液0.1％ TFA水溶液Ｂ液0.1％ TFAアセトニトリル溶液０％Ｂ→30％Ｂ直線濃度勾配（０分）（30分）第１図は実施例１で合成した環状ペプチドの分析結果
を示すグラフである。また、（14）で合成した線状ペプ
チド（GRGDSPA）を上記と同一条件で試験した。その分
析結果を第２図に示す。

第１図および第２図の結果が示すように、実施例１
（13）で得られたペプチドは環状であること、かつ線状
ペプチドと比較してトリプシン処理により開環するがそ
れ以上に分解を受けにくいことが確認された。

実施例２実施例１と同様に環状ペプチドを合成した。以下に、
その合成法の概略を示す。

（４）BocAlaValThr（Bzl）GlyOHの合成上記（３）の生成物2.8g（4.5mmol）をメタノール20m
lに懸濁し、氷浴中にて、1N NaOH水溶液9mlを滴下し
た。３時間撹拌したのち、1N HCl 12mlを加えて、減圧
下でメタノールを留去したところ白色結晶が析出した。
結晶を濾過しよく水洗したのち乾燥して目的物2.2g（4.
2mmol、93％）を得た。

B.ペプチドマップ実施例１のＢと同じ条件で環状ペプチドの分解試験を
行なった。分析条件は下記のとおりである。

分析条件 HPLC:シマズ LC−6A カラム:YMC ODS 検出:A₂₁₄ 溶出:A液 0.1％ TFA水溶液Ｂ液 0.1％ TFA アセトニトリル溶液５％Ｂ→80％Ｂ曲線濃度勾配（０分）（30分）結果を第５図に示す。また、対応する線状ペプチド
（AVTGRGDSPA）を合成し、同じ試験を行なった結果を第
６図に示す。

実施例３（１）BocAsnO・PFPの合成 BocAsn 23.2g（100mmol）をDMF 200mlに溶解し氷冷下
ペンタフルオロフェノール（PFP）22.1g（120mmol）、D
CC 24.7g（120mmol）を加えて、30分間撹拌した。さら
に常温で１時間撹拌したのち、減圧下でDMFを留去し
た。残渣を酢酸エチルに溶解し濾過してDC ureaを除い
たのち、水洗し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥し
た。減圧下で濃縮したのち、エーテルを加えて結晶化
し、目的物16.26g（収率40.8％）を得た。

（２）BocAsnProAlaBzlの合成 BocProAlaOBzl 3.76g（10mmol）にTFA 20mlを加えて
室温で20分間反応させたのち減圧下でTFAを留去したの
ち、エーテルを加えて得た白色沈殿を濾取し、乾燥し
た。これをDMF 20mlに溶解し氷冷下HOBt 1.5gを加え、
Ｎ−メチルモルホリンでpH6に合わせた。そこへ、BocAs
n・OPFP 4gを加え、再びＮ−メチルモルホリンでpH7に
合わせて、終夜撹拌した。減圧下でDMFを留去したの
ち、残渣を酢酸エチルに溶解し、水、1N HCl、水、５％
炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順に洗浄し、無水硫酸
ナトリウムを加えて乾燥した。減圧下で酢酸エチルを留
去したのち、エーテル／ヘキサンから結晶化させ、目的
物3.3g（67.3％）を得た。

アミノ酸分析:Asx 1.01 Ala 1.03 Pro 0.95 （３）BocAsp（OcHex）AsnProAlaOBzlの合成 BocAsnProAlaOBzl 3g（6.1mmol）にTFA 20mlを加え、
室温で20分間撹拌したのち、減圧下でTFAを留去した。
エーテルを加えて得られた白色沈殿を濾取し乾燥したの
ち、DMF 15mlに溶解した。氷冷下Ｎ−メチルモルホリン
でpH6に合わせ、そこへBocAsp（OcHex）OSu 4.12g（10m
mol）を加え、再びＮ−メチルモルホリンでpH7に合わせ
て、終夜撹拌した。減圧下でDMFを留去したのち、残渣
を酢酸エチルに溶解し、1,3−プロパンジアミンを加え
て、室温で１時間撹拌した。酢酸エチル相を水、1N HC
l、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順に洗浄
し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で濃
縮し、酢酸エチル／ヘキサンから結晶化して、目的物3.
63g（87％）を得た。

アミノ酸分析:Asx 1.98 Ala 0.98 Pro 1.02 （４）BocGlyArg（Tos）GlyAsp（OcHex）AsnProAlaOBzl
の合成 BocAsp（OcHex）AsnProProAlaOBzl 3.43g（5m mol）
にTFA 20mlを加えて室温で20分間撹拌した。減圧下でTF
Aを留去したのち、エーテルを加えて得た白色沈殿を濾
取し、乾燥した。ここにDMF 20mlを加え溶解させたの
ち、氷冷下BocGlyArg（ToS）GlyOH 3g（4.9mmol）、HOB
t 0.92g,WSC・HCl 1.2gを加えた。Ｎ−メチルモルホリ
ンでpH6に合わせて、終夜撹拌した。減圧下DMFを留去し
たのち、残渣を酢酸エチルに溶解し、水、1N HCl、水、
５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順に洗浄し、無水
硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去して目的
物の白色粉末4.4g（収率75％）を得た。

アミノ酸分析:Asx 1.84 Gly 2.17 Ala 0.96 Arg
1.04 Pro 0.97 （５）BocGlyArg（Tos）GlyAsp（OcHex）AsnProAlaOHの
合成 BocGlyArg（Tos）GlyAsp（OcHex）AsnProAlaOBz14.4g
（75％）をメタノール 50ml、水 0.5ml、酢酸 0.5mlに
溶解し、５％パラジウム炭素1gを加えて、水素を５時間
通気した。濾過したのち、濾液を減圧下で留去し、残渣
にエーテルを加えて固化させ、濾取し乾燥し目的物4.5g
（4.1mmol）を得た。

BocGlyArg（Tos）GlyAsp（OcHex）AsnProAlaOH 3g
（2.7mmol）をDMF 10mlに溶解し、氷冷下HOSu0.6g、WSC
・HCl 1gを加え終夜撹拌した。減圧下でDMFを留去した
のち、残渣に水を加えて固化させ、よく水洗して濾取し
た。減圧下で乾燥したのち、TFA 15mlを加えて、室温で
15分間撹拌した。減圧下でTFAを留去したのち、エーテ
ルを加えて固化させ濾取し、乾燥した。これをDMF 30ml
に溶解し、53℃に加熱したピリジン1.5リットルに30分
間で滴下し、53℃で９時間、室温で終夜撹拌した。ピリ
ジンを減圧下で留去したのち、よく水洗して乾燥し、目
的物1.05g（63％）を得た。

アミノ酸分析:Asx 2.09 Gly 2.6 Ala 1.06 Arg 1.
21 Pro 0.98 1.03gにアニソール5ml、クレゾール2mlを加えたのちHF
60mlを加えて０℃で１時間反応させた。減圧下でHFを留
去したのち、エーテルを加えて固化させ、その沈殿をエ
ーテルでよく洗浄した。これを10％酢酸に溶解させたの
ち、凍結乾燥し、粗ペプチド0.98gを得た。実施例１（1
3）と同じ条件で精製を行ない、精製物130mgを得た。

（８）GlyArgGlyAspAsnProAlaの合成（比較ペプチドの
合成） BocGlyArg（Tos）GlyAsp（OcHex）AsnProAlaOBzl 1.3
gにアニソール2ml、クレゾール2mlを加えたのち、HF 60
mlを加えて、０℃で１時間反応させた。減圧下でHFを除
いたのち、エーテルを加えて固化させ、エーテルでよく
洗浄した。この白色粉末を10％酢酸に溶解させたのち、
凍結乾燥し粗ペプチド0.99gを得た。これを実施例１（1
3）と同様に精製し、精製物64mgを得た。

実施例４（１）BocValThr（Bzl）GlyArg（Tos）GlyOHの合成 BocValThr（Bzl）GlyArg（Tos）GlyOBzl 2.9g（2.86m
mol）を5mlメタノールに溶解し、1N NaOH 4.3mlを滴下
して、１時間撹拌した。1N HCl 5mlを加えて減圧濃縮
し、酢酸エチル50mlで抽出した。酢酸エチル相を水50ml
で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち、減
圧で溶媒を留去し白色粉末2.3g（2.8mmol）を得た。

（３）BocValThr（Bzl）glyArg（Tos）GlyAsp（OBzl）S
er（Bzl）ProAlaOHの合成 BocValThr（Bzl）GlyArg（Tos）GlyAsp（OBzl）Ser
（Bzl）ProAlaOPac 1.8g（1.2mmol）を90％酢酸に溶解
し亜鉛末4.5gを加え１時間撹拌した。濾過したのち、濾
過液を減圧で乾燥固化した。1N HClを加えたのち、クロ
ロホルムで抽出し、有機相を水で洗浄した。減圧濃縮し
たのち、エーテルを加えて−20℃に保温した。析出した
白色粉末を濾取し乾燥して、目的物1.59g（1.15mmol、9
6％）を得た。

BocValThr（Bzl）GlyArg（Tos）GlyAsp（OBzl）Ser
（Bzl）ProAlaOH 1.4g（1mmol）をDMF 5mlに溶解した。
氷冷下HOSu 0.15g、WSC・HCl 0.25gを加え、Ｎ−メチル
モルホリンを加えてpH6に合わせて、終夜撹拌した。水
を加えて生じた白色粉末を酢酸エチルで抽出し減圧濃縮
した。エーテルを加えて白色粉末を得た。これを水洗
し、乾燥したのち、TFA 20mlを加えて室温で20分間撹拌
し、減圧下でTFAを除いたのち、DMF 20mlを加え溶解
し、これを55℃に保温したピリジン１リットル中に滴下
した。55℃で５時間、30℃で終夜反応させたのち、減圧
濃縮した。残渣にエーテルを加え生じた白色粉末を濾
取、乾燥して、目的物1.12g（89％）を得た。

（４）の生成物1.12gを用い、実施例１（13）と同様
の方法でHFで脱保護し、粗生成物0.74gを得、さらに実
施例１（13）と同じ条件で精製を行ない、精製環状ペプ
チド185mgを得た。

アミノ酸分析:Asp 1.04 Thr 0.88 Ser 0.89 Gly 2
Ala 1.0 Val 0.97 Arg 1.0 Pro 0.93 （６）線状ペプチド（ValThrGlyArgGlyAspSerProAla）
の合成実施例４（１）〜（３）と同様にして（３）の生成物
を合成し、その1.1gを実施例１（13）と同様の方法でHF
で脱保護し、粗生成物0.7gを得、さらに同様に精製して
線状ペプチド140mgを得た。

アミノ酸分析:Asp 1.0 Thr 0.80 Ser 0.80 Gly 2
Ala 1.05 Val 0.96 Arg 0.93 Pro 1.13 実施例５ A.細胞接着阻害活性の測定（１）合成した環状ペプチドが細胞のフィブロネクチン
やビトロネクチンに対する接着を阻害する活性を測定し
た。

フィブロネクチンまたはビトロネクチンをPBS^-（NaH₂
PO₄・0.005M＋NaCl 0.075M）で各々1.0μl/ml、2.0μl/
mlに希釈し、その希釈液0.5mlを24we11のプラスチック
プレートに入れ、37℃で４時間保温して、コーティング
した。次にプラスチックに対する非特異的接着を防ぐた
め、１％ BSA（牛血清アルブミン）を加え、37℃で１時
間保温した。そののち、PBS^-で洗浄し、充分に水切りし
たのち、Ｄ−MEM培地（GIBCO社製）で希釈したペプチド
溶液を0.25ml加え、そこへ４×10⁵cells/mlのヒト扁平
上皮ガンA431細胞懸濁を0.25ml加え、37℃で１時間保温
し、細胞を接着させた。Ｄ−MEM培地で３回洗浄し、未
接着の細胞を除いたのち、0.025％＋0.025％ EDTAトリ
プシン溶液で接着した細胞をはがし、トリパンブルーで
染色して細胞数を計測した。結果を下記第１表に示す。

上記結果を接着阻害パーセントで表わしたグラフを第
３図と第４図に示す。

第３図はフィブロネクチンコートの場合、第４図はビ
トロネクチンコートの試験結果を表わしたものである。

（２）上記と同じ阻害活性試験（ただし、フィブロネク
チンのみ使用）を実施例２で合成した環状ペプチドに対
して行なった。その結果を下記第２表と第７図に示す。

B.血小板凝集阻害活性試験被検薬のin vitro血小板凝集阻害作用をヒト富血小板
血漿を用いて検定した。採血したヒト血液に1/9量の3.8
％クエン酸ナトリウムを加え遠心（1000rpm、10分間）
し、上層を富血小板血漿（PRP）として分取した。PRP 2
00μｌに被検薬25μｌを加え、３分間37℃でインキュベ
ートしたのち、20〜50μM ADP溶液または50〜200μg/ml
のコラーゲン溶液またはトロンビン溶液を25μｌを加
え、アグリゴメーターで透過度を測定することにより、
凝集の様子を測定した。結果を表３に示す。

凝集阻害率（１−T/T₀）×100％ T₀:被検薬非添加時の透過度 T :被検薬添加時の透過度 C.がん転移阻害活性試験マウスにおけるB16メラノーマ細胞の肺への転移に対
するの効果を調べた。１群６〜10匹のC57BLマウスの尾静脈
にB16メラノーマ細胞２×10⁵個を注入し、３週間後に肺
を摘出し、転移結節数を測定した。被検ペプチドは、細
胞注入時に同時に投与した。結果を表４に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で合成した環状ペプチド（コントロ
ール実線）およびそれをトリプシンで24時間処理したも
の（破線）の高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）分
析結果を示すグラフである。第２図は、比較のための洗浄ペプチドの同じくHPLC分析
結果を示すグラフである。第３図は実施例1Cの細胞接着阻害試験の結果（フィブロ
ネクチンコートの場合）を示すグラフである。第４図は同じくビトロネクチンコートの場合の試験結果
を示すグラフである。第５図は実施例２で合成した環状ペプチドの分解試験結
果を示すHPLC分析結果のグラフである。第６図は比較のための線状ペプチドの同じくHPLC分析結
果を示すグラフである。第７図は実施例２で合成した環状ペプチドの細胞接着阻
害試験の結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開平２−62892（ＪＰ，Ａ) 特表平３−501610（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 262，Ｎｏ．36（1987）ｐ．17294− 17298 Ｓｃｉｏｎｃｅ，Ｖｏｌ．233（1986) ｐ．467−470 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 7/64 C07K 5/12 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ペプチド結合で環化されている下記式
［Ｉ］で表わされる合成環状ペプチド、またはその塩、
からなるペプチド誘導体。ただし、Ｒは、アミノ酸残基あるいはオリゴペプチド残
基を示す。
【請求項２】請求項１記載のペプチド誘導体を有効成分
とする動物細胞の接着を阻害する薬剤。