JP2517813B2 - 生きている細胞に生物学的物質を導入するための改良された方法および装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、生きている細胞または組織またはこれら両
方に生物学的物質を導入するための改良された方法およ
び装置に関する。

発明の背景 生物学的物質、たとえば、異種DNAまたはRNAでの衝撃
（bombardment）による生きている細胞の形質転換が、1
984年11月13日に出願された、Sanford等の米国特許出願
06/670,771「Method For Transporting Substance sInt
o Living Cells」に記載されている。細胞および組織へ
物質を付与するための改良装置が、同じSanford等によ
って1988年２月29日に出願された米国特許出願07/161,8
07「Biolistic Apparatus for Delivering Substances
into Cells and Tissues in a Non−Lethal Manner」に
記載されている。ここに記載されている方法では、適当
なサイズの粒子を、細胞壁または細胞膜あるいはこれら
両方を貫通して細胞の原形質、核あるいは小器官に侵入
するに充分に高い速度まで加速している。粒子が生物学
的物質を担持しており、速度が細胞を壊すことなくその
壁を貫通するに充分であるならば、生物学的物質は細胞
内に導入される。

この方法では、細胞膜に形成される孔は、マイクロイ
ンジェクション操作を用いて形成されるよりも小さくて
よいし、数分の１秒間だけ開いていればよい。RNA、DNA
のような生物学的物質は、Sanford等に記載されている
ように、タングステン球体、ラテックス・ビートあるい
はフェライト結晶のような不活性粒子の表面にDNAを沈
着させるなど種々のメカニズムによって細胞内に運ばれ
得る。液体キャリヤ内のDNAは、ウェルとして用いるこ
とができ、あるいは、固形のDNAは粒子そのものを構成
し得る。この方法は、多数の細胞に同に衝撃を与えるこ
とができ、個々の細胞を操作する必要がないので、特に
有利である。

この方法は、J.Part.Sci.and Tech.5:27〜37（1987）
にSanford等にも記載されており、Trends in Biotechno
logy 6:229〜302（1988）の最近のレビューにSanfordに
よって要約されている。DNAのタマネギ細胞への生物分
解付与が、Klein等によって、Proc.Natl.Acad.Sci.85:4
305〜4309（1988）およびBiotechnology 6:559〜563（1
988）に記載されている。微生物および細胞小器官の形
質転換は、最初、Johnston等によってScience 240:1538
〜1541（1988）、Boynton等によってScience 240:1534
〜1538（1988）およびArmeleoによってCurrent Genetic
s 17:97〜103（1990）に示された。細胞小器官形質転換
は、さらに、Fox等によってPNAS 85:7288〜7292（198
8）、Blowers等によってThe plant Cell 1:123〜132（1
989）およびDaniel1等によってPNAS（in press）（198
9）にも明らかにされている。

この方法の高等植物の形質転換への利用が、Sanford
によってPhysiologia Plantarum（in press）（1989）
において再検討されており、さらに数多くの論文におい
て論証されている。さらに、この衝撃技術を用いるより
高等動物細胞の形質転換が、Zelenin等のFFBS Letters
244:65〜67（1989）の実験、Johnston等の実験（準備
中）、Williams等のNature（提出済み）、そして、最近
では、Johnston等の実験（準備中）およびZelenin等の
実験（準備中）で論証されている。

これら早期の技術に基づいて、生物学的物質を担持し
ている粒子の付与を行う種々の装置が開発されている。

Sanford等による装置は、火薬発射で発生した熱ガス
が熱ガス衝撃波を生成し、これが多くの微小発射体を担
持している微小発射体を加速する火薬駆動装置の形で、
E.I.du Pont de Numours and Company,Wilmington,DEか
ら市販されている。微小発射体が孔を設けた停止版に衝
突したとき、微小発射体は移動し続けて標的細胞に衝突
する。Appl.Microbiol.Biotechnol.31:320〜322（198
9）で、Morikawa等が、微小発射体を駆動するのに加圧
窒素ガスを使用する、Sanford等の技術に基づく装置を
開示している。1987年12月２日に出願されたAgracetus
のヨーロッパ特許出願8731062.4（公告番号0270356）が
微小発射体加速器を記載している。微小発射体が薄い円
板である場合、非常に高い放電を用いて加速され、これ
が水滴を蒸発させて熱ガスを発生させ、この熱ガスが火
薬発射によって生じる熱ガスと同様に発射体を駆動す
る。

Dr.Laurei Metsが、Sanford等の特許出願に記載され
ていると同じ原理に基づいた、すなわち、粒子ガス流巻
き込み式の粒子加速器を開発した。最後にOard等（199
0）が、円筒形の微小発射体を加速すべく圧縮空気を用
いるトウモロコシ、米、コムギの細胞における一時的な
形質発現を達成した。Plant Physiology 92:334〜339
が、DNA被覆微小発射体を推進するためにこのようなエ
アガンを使用することを記載している。ポリカーボネー
ト真空室がエアガン銃身および標的物質を収容してい
る。

これら種々の装置は細胞および組織へ生物学的物質を
移入するにはどのように微小発射体を加速したら最良で
あるかについての問題への様々なアプローチを示してい
るが、すべて、１つまたはそれ以上の欠陥を持ってい
る。まず、このように構成した装置の多くは、使用モー
ドについて融通性がない。弾道法にとっては、種々の能
力、設定、形態等を要求する広範囲にわたる用途があ
る。現存の装置は、単一の使用モードあるいは単一の用
途にとっては最適であるが、複数のニーズに適応するこ
とはできない。次に、一般に入手できる装置では、反復
可能な結果、すなわち、標的毎の結果および日毎の結果
を望むようには得ることができない。現存の加速器は、
性能のばらつきが大きい。また、粒子分散パターンが貧
弱であり、標的面積にわたって均一とならない。現存の
装置は、しばしば、粒子凝集体を効果的にばらすことが
できず、粒子が分散するどんな大きさの面積にわたって
も制御を行うこともできない。

現存の装置のたいていのものは、嵩高であり、一般に
可動性がなく、或る種の獣医学や医学の用途で必要とさ
れるように手持ち式とすることができない。これに関連
して、入手可能な装置のたいていのものは、標的を真空
室内に置く必要があり、このような真空室よりも大きな
標的に用いることができない。用いる標的がどんなもの
であろうとも、この加速器は、或る数の細胞に損傷を与
えたり、殺したりして、細胞分裂あるいは細胞分化を悪
化させる傾向がある。これは、特に、標的までの距離が
短い必要がある場合、たとえば、医学用途に当てはま
る。したがって、より良好な速度制御、より少ないガス
・ブラスト、より少ない音響ショック、より少ない速度
の破砕屑、より低い熱ならびにより低い放射エネルギを
持つことが望ましい。

火薬発射または高電圧放電を用いる装置は、高温を発
生する傾向がある。さらに、高電圧放電は、目つぶし閃
光を発生する。これは、紫外線光その他の電離放射線を
発生する可能性がある。これは、形質転換されつつある
細胞あるいは付与されつつあるDNAに有害である。

発明の概要 細胞または組織あるいはこれら両方の標的に生物学的
物質を担持している粒子を導入する従来の加速法の欠陥
の多くは、本発明の方法を利用して解消される。この方
法は、細胞の表面を貫通し、細胞の内部に組み込まれる
に充分に粒子を細胞を殺すことなく加速する段階と、瞬
間的なガス衝撃波の力を粒子に加えることによって粒子
加速を行う段階とからなり、粒子の加速を行う段階は、
標的側を有する平らなキャリヤ・シートを使用し、この
平らなキャリヤ・シートの標的側に粒子を置き、このシ
ートに冷ガス衝撃波を付与してキャリヤ・シートから細
胞に向かって自由に粒子を加速することを包含し、シー
トがその縁を動けないように固着された弾性膜であり、
冷ガス衝撃波が膜の拡張を生じさせるが破裂を生じさせ
ず、それによって、標的を衝撃波から保護する。平らな
表面がメッシュである場合、粒子は、オプションとし
て、衝撃波内に巻き込まれる。シートが中実であり、そ
の縁で固定されている場合には、冷ガス衝撃波は、拡張
を生じさせるが、膜を破壊することはなく、オプション
として衝撃波から標的を保護しながら粒子を発射する。

あるいは、膜が固定されており、破壊され得る場合、
粒子は標的細胞のより広い範囲にわたって分散させられ
る。あるいは、生物学的物質をガス衝撃波の経路内でス
クリーン上に分散させてもよい。もし拘束されたスクリ
ーンが標的細胞と中実の未固定膜（フライングディス
ク）の間に設置してある場合、ディスクの飛翔が短距離
に制限され、粒子が発射され、標的に向かってスクリー
ンを通して移動することができる。

上述の種々の方法を用いる場合、必要に応じて利用で
きる数多の変更を行うことができる。たとえば、「フラ
イングディスク」の使用は、標的の保護と共に非常に高
い粒子速度を得ることができる。粒子が単に衝撃波内に
捕らえられただけでは、細胞や組織への損傷はより厳し
いものとなる可能性があるが、速度は最高となる。一
方、拡張がスクリーンによって制限される拡張膜を使用
した場合には、細胞損傷は最小となる。破裂可能な膜の
場合には、粒子の分散が良好となるが、細胞損傷を幾分
高める傾向がある。

本発明の方法を実施するための装置は、真空を持続で
きる閉じたハウジングであり、真空を作用させるための
第１ポート、主軸およびこの主軸上に位置する第２ポー
トを有し、第２ポートの反対側で主軸を取り囲むスロー
ト部を構成するハウジングと、第２ポート内に設置した
高圧室であり、そこに収容されたガスを徹底的に解放し
てスロート部に向かってガス衝撃波を送る高圧室と、標
的に向かって衝撃波の力によって加速できるようにスロ
ート部内に粒子を位置決めする手段とを包含する。オプ
ションとして、インタフェースをスロート部に固着し
て、大きな標的を用いるときあるいは真空または衝撃あ
るいはこれら両方に標的がさらされるのを制限しようと
している場合に、標的にスロート部を連結するようにし
てもよい。本発明は、スロート部内に粒子を位置決め
し、発射することについては融通性を与えるが、それぞ
れの構成は種々の利点、欠点を有する。

要約すると、本装置は、５つの部分、（ａ）高圧ガス
給送システム、（ｂ）高圧システムから瞬間衝撃波を発
生させる機構、（ｃ）衝撃波を解放、収容、通気する囲
みおよび（ｄ）いくつかの発散機構によって衝撃波の力
を利用して微小発射体加速へガス衝撃を転換する互換性
のある挿入体を受け入れることのできるスロート領域を
有する。最後に、互換性インタフェースを種々のタイプ
の生物学的標的、小動物あるいは小植物から大型動物あ
るいは植物までの標的に対して、シャーレ等に入れた細
胞に用いることができる。

図面の簡単な説明 本発明は、添付図面を参照してより良く理解して貰え
よう。図面において： 第１図は、本発明に従って構成した細胞または組織あ
るいはこれら両方の標的に生物学的物質を担持している
粒子を導入する装置を含むシステムの概略図である。

第２図は、第１図の装置の詳細を示す展開横断面図で
ある。

第３図は、特に手持ち式装置として有用である、第１
図の装置の別の構造を示す図である。

第４図は、第１図の粒子加速器のスロート部の代替構
造を示す図である。

第5a、5b図は、ガス巻き込みモードで作用するように
構成した粒子加速器の一具体例のための初期状態および
作動状態を示す、粒子加速器のスロート部の横断面図で
ある。

第6a、6b図は、固定膜として作動するように構成した
粒子加速器のスロート部の横断面図である。

第7a、7b図は、捕獲された膜として作動するように構
成した、本発明の粒子加速器のスロート部の横断面図で
あり、初期状態および作動状態の両方を示す図である。

第8a、8b、8c図は、破裂膜として作動するように構成
した粒子加速器の初期、中間、作動状態を示す、粒子加
速器のスロート部の横断面図である。

第9a、9b、9c図は、フライングディスクとして作動す
るように構成した本発明の粒子加速器のスロート部の横
断面図であり、初期、中間および作動状態を示す図であ
る。

第10図は、第１図の粒子加速器のノズル部の３つの代
替構成を示す図である。

第11図は、第１図の粒子加速器のノズル部の別の具体
例を示す横断面図である。

第12図は、本発明の別の具体例に従って構成した、特
に大型の標的と一緒に用いるようになっている粒子加速
器の横断面図である。

第13図は、第12図の粒子加速器で用いられるバッフル
の、線13−13に沿った横断面図である。

第14、14a、14b図は、本発明の別の具体例の付加的な
横断面図である。

好ましい具体例の詳細な説明 第１、２図を参照して、本発明の装置は、５つの部
分、すなわち、（ａ）高圧ガス給送システム10、（ｂ）
高圧システムから瞬間衝撃波を発生させる衝撃機構12、
（ｃ）衝撃波を解放、収容、通気する囲みまたはハウジ
ング14および（ｄ）互換性のある挿入を行うことがで
き、発散機構によってガス衝撃波を微小発射体加速へ転
換することのできるスロート領域16と、（ｅ）種々のタ
イプの生物学的標的を狙うオプションの互換性ノズルま
たはインタフェース機構18とを包含する。

高圧ガス給送システムは、高圧ガス源20を包含する。
代表的には、ガスはヘリウムである。これは、軽くて高
速膨張性があるからである。他の好ましい不活性ガス、
たとえば、窒素ガスも、所望に応じて使用できる。ま
た、空気、水素等も用い得る。ガス源20は、適当なレギ
ュレータ22と圧力インジケータ24を備え、適当な配管26
を通して瞬間ガス衝撃波を発生する室12に接続してあ
る。ブリード弁28と遮断弁30とが用いられている。後に
説明するように、弁30はガス源20をノズルまたはインタ
フェース18へ接続している。

衝撃発生システム12（詳細は第２図により明瞭に示して
ある）は、ガスの流量を制限するように作用する絞り32
を通して配管26からガスを受け取り、それによって、破
裂付勢機構を安定化すると共に所望圧力に達する前の早
期発射を防ぐようになっている。これは、ガス衝撃発生
システムとして作用する。室12、ハウジング14、スロッ
ト挿入体18の構成要素のすべては、特に指定しないかぎ
り、真鍮やステンレス鋼のような、高圧あるいは真空に
耐えることのできる任意適当な材料で作るとよい。絞り
32は、他の閉止機構が故障した場合に、発射後にシステ
ムを通るガス流を制限するのにも役立つ。この絞りがあ
るために、衝撃発生システム12の下部に含まれる高圧室
34を加圧するのに数秒かかる。

反復してこじ開けられる弁を絞りに代え、絞り点を通
る流量を調整するようにしてもよい。衝撃発生システム
12内の加圧ガス室34の寸法は、強力なガス衝撃波を発生
させるに充分な両のガスを収容できるに充分な大きさで
あるが、通気する必要のあるガスの量を制限し、生物学
的標的にガス衝撃を与えるのに貢献するには充分に小さ
いものでなければならない。本質的には、この加圧ガス
室部分は参照符号34で示してある。室34の体積は、所望
に応じて寸法付けることのできるねじ付きスリーブ挿入
体36によって調節できる。

ガス衝撃波発生システム12は、比較的低圧の領域へ自
由に膨張する必要のある非常に明確に定めた衝撃波面を
提供するように設計してある。適切なガス衝撃波を発生
させるに適した解放機構は非常に迅速に開かなければな
らない。これは、膜の瞬間的な破裂かあるいは特殊な超
高速弁を使用するかのいずれかで達成できる。本当に速
い高圧弁を利用しないという点で、第１、２図に示す、
破裂可能な膜38を包含する具体例は好ましい。膜は、衝
撃発生システム12を構成するシリンダに螺合したエンド
キャップ40（第２図）によって保持される。このエンド
キャップ40は、その中央部が開口しており、後述するよ
うに標的42の方向へ下向きにガスが逃げることができる
ようにしている。膜は、任意適当な破裂可能な材料、た
とえば、Kapton（登録商標）ポリイミドフィルムやMyla
r（登録商標）ポリエステルフィルムであってよい。こ
れらのタイプの材料の特性を以下に述べる。５枚の２ミ
ル厚Kapton（登録商標）膜の使用ではうまくいった（一
例として、２ミル厚Kapton（登録商標）膜の４〜５層が
1200psiのヘリウムを含む）。この構成の下では、加圧
された膜は、かなり外方に変形するが、自発的に破裂す
ることはない。あるいは、より弱い膜あるいはより高い
圧力を用いて自発的な破裂を行うこともできる。

膜38の急激な破裂（終局的なものでなければならな
い）を確保するために、ロッド46の形をした能動的な破
裂機構を用いてもよい。ロッドは、衝撃発生システム12
の中心にある孔を貫通している。ロッド46は、鋭い先端
を有し、これが圧力室36内から膜を破裂させ、ガス衝撃
波の外方への自由な膨張と干渉しないようになってい
る。

衝撃発生システムの高圧チューブが中央部に孔または
絞りを有し、両端により広い孔を有するように形成して
もよい。ロッド46は、この絞られた部分を貫通するが、
ガスが下方圧力室領域に通れるように中空か、あるいは
溝付きであるとよい。上端（ガス源に近い端）で、ロッ
ド46はより広くなっており（すなわち、より大きな直径
となっており）、発射の差異に、捕らえられ、絞り領域
を通して下方に飛べないようにしている。このより広い
端領域では、ロッドは、磁気反応金属で作ってあり、電
気付勢機構50によって作動させられるソレノイド48を用
いて下方に駆動することができる。衝撃発生システム12
を形成している高圧チューブは、上述したように真鍮の
ような非磁気反応材料で作ってある。ロッド46の上方拡
大端と絞り部分の間にはスプリングが設けてあり、各発
射サイクルの終わりにロッドがその上方位置へ戻るのを
可能あるいは容易にしている。

ロッド46がソレノイド48によって下方に作動させられ
たとき、その下端（鋭くなっている）は、圧力室34内へ
延び、膜を貫通してガス衝撃波を発生させる。ロッドの
広くなった部分の基部には、リングシール56があり、発
射の際に、ロッドの広くなった部分が絞りをシールし、
その後にいかなるガスも下方圧力室34（膜の破裂により
圧力解放されている）へ逃げるのを止めるようになって
いる。上方のガス圧が解放されると、小さいスプリング
52がロッド46をその当初の上昇位置へ戻し、下方圧力室
34を再び新しい膜で閉ざし、再加圧することができる。

この機構で発生したガス衝撃波は、火薬カートリッジ
が熱および衝撃の瞬間的な解放を行うSanford等の得た
ガス衝撃波と異なっているので、重要である。本発明の
ガス衝撃発生システムの場合、ガス衝撃波は、周囲温度
で加圧ガスから発生するガス衝撃波（以後、「冷」ガス
衝撃波と呼ぶ）であり、紫外線光の観点からも熱の観点
からも（両者共に、生物学的物質を処理するときには望
ましくない）標的領域にある生物学的物質を破壊しない
という点で有利である。ガス衝撃波そのものは、残りの
ガスを通して伝播する段階関数にほぼ匹敵する急激な圧
力増大を生じさせる。一般的には、急激な圧力増大が生
じる伝達領域の幅は、分子平均自由経路、すなわち、１
つの分子が他の分子と衝突する前に移動できる経路であ
る。本発明にとって必要で望ましい短距離内で粒子の急
速加速を行うのに効果があるのがこの急激な破局的（請
求の範囲では「瞬間的」と呼ぶ）圧力増大である。衝撃
波は冷たい。この「冷たい」ということは、組織の生物
学的物質に損傷を生じさせないほど冷たいということを
意味する。

最良のバーストは、自発的な膜破壊から生じる。これ
は引張限度で膜が壊れるからである。これらの膜は、所
与の圧力で自発的に破裂するように均一に作るとよい。
この場合、必要なことのすべては、臨界圧力に達して膜
38が破裂し、ガス衝撃波が発生して標的42の方向に伝播
するまで圧力室34を徐々に加圧することである。膜は層
状であってもよい。各２ミル厚Kapton（登録商標）層
は、多重層を加えた場合に、275〜300psiの圧力で壊れ
る。金属箔も使用できる。

発生したガス衝撃波は、極めて音が大きく、操作員の
聴力にとって潜在的な危険がある。また、ガス衝撃波
は、部分的に抽気されたスペースに自由に膨張できるか
ぎり、幾分減衰される傾向がある。さらに、ガス衝撃波
によって加速される軽量の粒子は、ガス充満領域を通っ
て移動しなければならない場合にはすぐに速度が減衰す
る。これらの理由のために、ハウジング14が、ガス衝撃
波解放領域で部分真空あるいは完全真空を用いることが
できるように設けられる。ハウジングは、円筒形であ
り、２つの部分、上部60と下部62とからなる。これら２
つの部分60、62は、スナップクリップ64と適当なＯリン
グ66とによって結合され、部分間がシールされる。衝撃
発生システム12は、円筒形ハウジング14の主軸に沿って
螺合し、ハウジングの上端に螺合し、ハウジング14内で
システムの位置を垂直方向に調節することができるよう
になっている。さらに詳しくは、ロッド46の軸線で構成
される室の軸線11は、ハウジング軸線11と一致し、スロ
ート16およびインタフェース18を標的42まで延びてお
り、室の軸線の上またはそれを取り囲んでいてガス衝撃
波を標的に伝播できるようにしている。

スロート16は、ハウジング14の下半分62の下部を形成
している。この下部にテーパが付けてあって縮径スロー
ト部16を形成している。この領域において、ガス衝撃波
のエネルギが微小発射体に伝えられて標的まで加速す
る。このエネルギの伝達は本発明によれば種々の機構に
よって生じるため、この領域には、使用モードに応じて
互換性のある挿入体が置かれる。これらの挿入体は、個
々に所定位置に螺合あるいは固定してもよいし、後述す
るように予め組み立てたユニットとしてスロット領域の
所定位置に落としてもよい。使用される代表的な挿入体
は、スロット16内に螺合する２つのリング挿入体82によ
って保持された或る種の粒子キャリヤ80を包含する。粒
子キャリヤ80は、第５図から第９図に関連して後に説明
するように、スクリーン、膜あるいはそれらの組み合わ
せのいずれでもよい。後述するように、ノズル／インタ
フェース18（第１図）または18′（第２図）は、スロッ
ト領域の端に螺合してもよい。インタフェース18′の下
端には、内向きのフランジが設けてあり、第10、11図に
示すように、種々のアタッチメントを受け入れるように
ねじが切ってある。

第４図を参照して、ここに示す代替のスロート部は、
取外可能な挿入体100を包含し、これはスロート部16′
内に滑り込ませ、内向きにフランジ102によって支持さ
れる。挿入体100の内部には、ねじが切ってあり、一対
のリング82′を収容するようになっている。挿入体の上
端には小さいハンドル84が設けてあり、取扱いを便利に
している。挿入体100の下面には、Ｏリング104が設けて
あり、挿入体100まわりの空気の漏洩を防ぐシールを設
ける助けとなっている。挿入体100の外面およびスロー
ト部16の内面にはねじが切ってなく、挿入体の摺動を容
易にしている。この取外可能な挿入体100は、第５図か
ら第９図に示すスロット部に対して代替の粒子加速配置
のうちのいずれの取扱いも容易にするのに用いることが
できる。

図6a、6bに示す粒子加速器の具体例は、スロート部16
のための固定膜構造であり、強いけれども弾力性のある
材料、たとえば、Kapton（登録商標）ポリイミドフィル
ムあるいはMylar（登録商標）ポリエステルフィルムを
包含する。ポリイミドフィルムは、例外的に強くて耐熱
性がある。ポリエステルフィルムも同様の特性を有し、
広い温度範囲にわたってその引張強さを維持する。これ
らのフィルムは、ガス衝撃波の衝撃に耐えるに充分な強
さを有する。ここで用いた「弾力性」なる用語は、必要
な使用限度まで破裂することなくガス衝撃波に耐えるこ
とのできる材料を意味する。膜110は、その周囲まわり
をリング82のような手段によって所定位置に保持され
る。これらのリング82は、対応する溝と隆起（図示せ
ず）を有し、所定位置に膜110を錠止するのを容易にし
てもよい。この錠止は、スロート領域16にリングを位置
させ、間に膜110を挟んで互いに締め付けることによっ
て達成し得る。

微小発射体は、膜110の外面（図で見て、標的に近い
ほうの下面）に接着される。したがって、ガス衝撃波が
膜110に衝突したとき、膜は拡張するが、破裂すること
はなく、微小発射体112を標的42に向かって高速で発射
する（第１図）。この具体例は、標的への駆動ガスの衝
突からの損傷を防ぐのが望ましい場合に、特にく適して
いる。膜は、標的上方で良好なシールを形成し、標的を
衝撃波から隔離する。ガス衝撃波の膜への影響、そし
て、引き続く微小粒子の推進が第6b図に示してあり、こ
こでは、粒子112が標的に向かって飛んでいる。

第7a、7b図を参照して、第6a、6b図の「固定膜」と異
なる「捕獲膜」形態として知られる別の挿入体の具体例
が示してある。この場合、第６図に関連して説明したも
のと非常に似ているが、薄いスペーサ・リング122およ
び好ましくはステンレス鋼または同様の化学的に不活性
で無反応の無毒な材料120で作った剛性のスクリーン120
が捕獲されており、リング82の間に膜110が固定してあ
る。発射の際、すなわち、ガス衝撃波の発生の際、固定
膜110はほぼその最大の範囲まで拡張する。この地点
（たとえば、スペーサ・リング122の厚さによって制御
される）で、固定膜は剛性のスクリーン120に衝突す
る。この急激な停止は、第６図の固定膜具体例で生じる
よりも、膜の表面からのより良好な解放、微小発射体の
より高い速度および微小発射体112のより良好な分散な
らびに解凝集を生じさせる。この機構は、たとえ膜が破
裂した場合でも有効であり、膜およびいかなる膜破片を
も捕獲し、ガス衝撃波の大部分を標的からそらせ、安全
で比較的穏やかな衝撃モードを与える。より小さいディ
スクまたは膜を膜110の背面に取り付け、膜の中央を補
強し、その破裂の機会を減らしてもよいし、あるいは、
破裂が生じたとしても、それがより小さい膜の周縁のと
ころで生じ、標的に直接にガスの衝撃が向けられる可能
性を減らしてもよい。

第8a、8b、8c図に示す具体例は、「破裂膜」として知
られるものであり、より薄いポリイミドあるいはポリエ
ステルのフィルムであるか、あるいは、先に述べたもの
よりも弱い材料（たとえば、アルミ箔）で作ってあっ
て、ガス衝撃波の衝撃で破裂するようになっている膜11
0を利用している。破裂の瞬間に、膜の表面を横切って
猛烈な側方剪断力が生じ、この表面から粒子を解放し、
非常に効率良く粒子を解凝集させ、比較的広い面積にわ
たって粒子を分散させる。しかしながら、ガス衝撃波の
かなりの部分が、なお、抽気された囲い（破裂の前）内
へはね戻され、標的をガス衝撃波の最悪の部分から守
る。この構成は、比較的厳しい衝撃が許される場合、す
なわち、より高い速度が必要とされる場合や広い面積に
わたって微小発射体の優れた解凝集、分散が必要とされ
る場合に望ましい。もし破裂した膜がなんらかの飛翔す
る破砕屑を生じる場合には、捕獲スクリーンを膜110と
標的42の間に設けてもよい。

第9a、9b、9c図に示す別の具体例は、「フライングデ
ィスク」として知られるものである。この具体例では、
粒子112を備えた通常の膜110（第７図の具体例で用いら
れるタイプの破裂可能なものではない）が２つのリング
82の間に置かれ、リングを位置決めすることによって所
望に応じて高さを調節される。本発明によれば、２ミル
厚ポリイミド・ディスクのような比較的剛性の膜または
ディスク130が下方のリング82上に設置されるが、上の
リングには固定されない。この膜は、くぼみを有するリ
ップによって、あるいは、少量の適当な接着剤（すなわ
ち、膜を所定位置に保持するに充分な真空グリースの薄
膜）で所定位置に単に保持されるだけである。所望に応
じて、他のシックナーを用いてもよい。心合わせリング
132がスクリーン134を軸線11（第２図）に沿って位置決
めしており、これらは、共に、スロート16内に螺合した
下方リング133によって支持される。発射の際、ディス
ク110は、下面に置いた粒子112と共に、そのプラットホ
ームを持ち上げ、リング支持体132によってスロート領
域の底で所定位置に固定された剛性スクリーン134に衝
突するまで妨げられることなくスロートへ飛翔する。衝
撃時、粒子は、第７図の捕獲膜の場合と同様に発射され
る。

可能な速度は、第７図の捕獲膜の場合よりも高いが、
飛翔時にディスクの前方でガスが漏れる可能性があるた
め、標的に衝突するガス衝撃波の可能性が存在する。こ
の領域の内径にぴったり嵌合する飛翔ディスクを使用
し、飛翔距離を比較的短くすることによって、ガスの衝
撃を小さくすることができる。飛翔後の衝突時に飛翔デ
ィスクのところよりもかなり小さい開放スクリーン領域
134の支持面にディスク130を着座させ、そこをシールす
ることによって、標的領域に伝えられるガス衝撃波のエ
ネルギが最小限に保たれる。したがって、比較的高い速
度が発生させることができると共に、標的領域でのガス
衝撃を減らすことができる。

第5a、5b図でわかるように「ガス巻き込み」として知
られる別の具体例では、適当なメッシュタイプのスクリ
ーン134を用いており、このようなスクリーンとして適
当なものは、150μｍ開口を有するSwiss Polyester Mon
ofilamentスクリーニングである。このようなスクリー
ンは、Tetko,Inc.,in Elmsford,NY.から部品番号７−15
0/43として入手できる。スクリーン134はスロート部16
内のリング82間に捕獲される。微小発射体は、ガス衝撃
波の経路に設置してあるので、直接にガス衝撃波によっ
て加速される。微小発射体を含む液滴は、スクリーンま
たはメッシュ134の中間に置くことができる。発射時、
ガス衝撃波は、液滴を発射して霧化し、その中に微小発
射体を巻き込む。粒子112およびガス衝撃波は、一緒に
なって標的42に直接衝突する。この形態は、標的がガス
衝撃波の全衝撃を許容できるときに有効である。

５）異なった生物学的標的のための互換性インタフェ
ース−本装置を非損傷動物、人間その他の大型生物につ
いて用いたとき、精密な位置決め（第10図）、標的面ま
での飛翔距離の制御、標的領域にわたるガスまたは真空
の制御、真空または衝撃に抗する柔らかい組織の支え、
この領域へ伝えられ得る任意のガス衝撃波の散逸の可能
性を可能とするインタフェース18が必要である。より小
さい生物、組織あるいは細胞を衝撃するとき、シャーレ
その他の細胞容器を真空を維持し得る室内の適正な距離
のところに設置する普通の機構が必要である。以下のイ
ンタフェース具体例を用い得る。

第10図に示す具体例は、スロート部16に嵌合するように
なっている３段式のものである。これらの具体例は、す
べて、ノズル・インタフェース18（第２図）または18′
（第４図）と螺合するようになっている管状のノズル14
4を有する。ノズルの１バージョン（図の左下）は、通
気チューブ146を備えている。両バージョンは（下の左
と右）は、ノズルの下端にあるテーパ付きくぼみ147と
係合するスナップイン式スクリーン148（第７図のスク
リーン120に類似している）を有する。インタフェース1
8は、真空ポンプ72に通じる接続部140を備えるか、ある
いは、システム内のガスの種類を変え得るように加圧ガ
ス通じる接続部142を備えるとよい。ノズル144の上面に
ある溝149内にはＯリング145が設けてあり、スロート18
の下面に対するシールを行う。この拡張ノズル形態は、
外科手術用途（インタフェースを切開部内に置く必要が
ある）に特に適している。このノズルは、衝撃を与えよ
うとしている大きな表面（たとえば、表皮）上の或る領
域への精密な照準を容易にする。ノズルの先端は、狙っ
た領域に直接押し付けることができる。ノズルの端で、
スクリーンまたはメッシュ148を前述のように設置して
衝撃に抗して組織を支持し、真空がノズルの内部に付与
されたときに組織が上方へ吸引されるのを防ぐことがで
きる。用途に応じて、種々の形態のノズルのうちの任意
のものを所定位置へ螺合させることができる。

第11図に示すように、別の具体例では、Lexan（登録
商標）ポリカーボネートまたは類似の耐破砕性材料で作
った透明な室150を、ねじ取付具によってガンのスロー
ト18の端に取り付けることができる。この具体例（真空
を維持することができる）は、Ｏリング152を有し、こ
のＯリングは、溝153内に嵌合してあって側壁154と基板
156の間のシールを行う。この室は、２つの部分、すな
わち、インタフェース18に螺合し、Ｏリング160によっ
てそれに対してシールされ得る上半分154と、所定位置
に摩擦嵌合し、Ｏリングシール152によってシールされ
得る下方プレート156とからなる。こうして、室は、シ
ャーレプレート158または任意の小サンプルを挿入する
ために容易に開けることができる。この簡単な室は、ベ
ンチトップ実験室モードで使用できる。

第12図でわかるように、インタフェースの別の具体例
は、特に大型動物あるいは大きな表面に対して作業する
ようになっている。この具体例では、ガスブラストの通
気そして標的（42）からのガスブラストのそらせを最大
限に可能とすると共に、粒子発射位置から標的衝撃点ま
での距離を最小にすることができる。この具体例の構成
は、第１、２図に示すものとほぼ同じであり、異なって
いるのは、ハウジング14の下半分がテーパ付きではな
く、一定直径のねじ付きノズル挿入体160を有するとい
うことだけである。しかしながら、所望に応じて室14′
と一緒に用いてもよい。逆ハウジングの形をした副室16
4とカバー170がハウジング14′の周縁に嵌合するように
なっており、副室164の２つの内向きフランジ片の間に
捕獲されたグロメット162によってハウジング14′の周
縁まわりにシールがなされる。副室164の下部すなわち
カバー部170は、突出した比較的剛性があるものとして
形成してあり、第11図の場合と同様に、Lexan（登録商
標）ポリカーボネートまたは同様の耐破砕性材料で形成
した副室であってもよい。突出部材170には、ハウジン
グ14′の軸線に沿って位置するように中央部にオリフィ
ス172が形成してあり、標的組織が副室内へ吸い上げら
れるのを防ぐようにスナップイン式スクリーン174を受
け入れる形態となっている。突出部材170は、適当なね
じ（図示せず）によって副室164に固着してあってもよ
い。Ｏリング176が溝177内に設置してあって真空を維持
するシールとなっている。

突出部材170上には、バッフル・プレート178（第13
図）が設置してあり、これは、矢印182で示すガス衝撃
波の大部分を標的42からそらせるに充分な開口180と閉
じた領域とを有する。第13図は、第12図の線13−13に沿
った断面図である。グロメット162は、副室164がハウジ
ングの軸線に沿って摺動するのを許し、それによって、
標的42の、ガス衝撃波からの距離を調節することができ
る。バッフル178は、ガスが下方オリフィス領域から側
方へ流れ、排出するのを容易にし、オリフィス領域に後
退ガスが捕らえられるのを防ぐ。もしこのバッフルがな
いと、ガスが接近する粒子にはね戻されたり、粘性抗力
により粒子を減速させたりする可能性がある。バッフル
・プレートは、ガスおよびガス衝撃波を下方標的領域か
ら発散させるように作用する。

操作 操作にあたって、細胞、組織を問わず、標的42を選
び、準備する。細胞プレーティング、ヘア除去、組織の
切開等を除いて、なんら特殊な準備は不要である。これ
を行うための特別な手順は本発明の部分ではない。標的
および目的に基づいて、最適な微小発射体タイプ、量お
よび寸法を選んで準備し、所定位置に装填し、所望のス
ロート組立体形態を選んで正しく位置決めする。最後
に、所望のガス圧を22にセットする。標的および目的に
最も適ったインタフェース組立体18を選び、高圧膜を所
定位置にシールし、ハウジングを閉じてシールする。次
に、高圧室12を加圧し、標的をインタフェース組立体に
対して所定位置に位置決めし、囲み内の飛翔領域にガス
環境すなわち真空度をセットする。次に、ソレノイドを
付勢してユニットにガス衝撃波を発生させる。次に、真
空を解放し、高圧室への圧力を排出し、必要に応じてプ
ロセスを繰り返す。

DNA被覆粒子またはDNA含有溶液のような生物学的粒子
の特別の準備方法は、ガス巻き込みのために用いられる
水またはエタノールいずれかのスラリが最良であり、他
の形態にとっては、DNA被覆粒子は、膜面の未端側に塗
り広げ、エタノール内に浮遊させ、乾燥させてから衝撃
を与えるのが最良である。DNA被覆粒子の特別な準備法
は本発明の部分ではない。ここで用いる粒子なる用語
は、生物学的物質そのものであってもよいし、粒子に生
物学的物質を被覆したものであってもよい。たとえば、
Agracetus特許出願あるいはSanford等またはKlein等に
記載されているものを使用できる。

本発明の別の具体例が第３図に示してある。この図で
は、第１、２図に関連して説明したガンの必須部分の多
くが示してあり、第１、２図の部分に対応する部分に
は、二重ダッシュ記号が付けてある。第３図の具体例の
主要な差異は、寸法が小さくなっており、外科手術用途
に用いるのを容易にするピストル形グリップ206を有す
る。手持ち式ピストル形グリップ206は、スイッチ204を
備え、これらのスイッチは、ソレノイド作動器48″と共
に弁28″、30″、200を制御する。

ノズル部18″、スロート部16″は、第１、２図のスロ
ート部16に類似していおり、内ねじが切ってあり、第５
〜９図に示すように種々のディスク、スクリーン等を受
け入れることができる。動物組織にそのまま用いること
ができるように、図示の装置にはこれ以上の取付具は設
けていない。図示していないが、第10図の参照符号148
で示すタイプの拘束スクリーンを用いてもよい。この装
置は、また、真空を制御する弁200を包含し、ユニット
に電力を供給するライン202は、ガス源20および真空ポ
ンプ72から高圧を受け取るアダプタである。このことは
さておき、動作は、第１、２図に関連して説明したのと
同じであり、これ以上の説明は不要と考える。

本発明の冷ガス衝撃波発生器は、E.I.du Pont de
Numours and Company,Wilmington,Delawareが現在販
売しているPDS−1000で用いられる現存の熱ガス衝撃波
発生器の代わりに用いることができる。このPDS−1000
は、ハウジング210として第14図に横断面で示す円筒形
の２室型装置である。装置の上下の部分は真空源140に
接続してある。標的は、プラットホーム220上に置かれ
る。このプラットホームは、フロントドアを開いて室内
にアクセスするときに装置内へ滑り込ませることができ
る。装置の頂部には、中央開口が設けてあり、この中央
開口を貫いて、熱ガス衝撃波を発生させるのに用いられ
るカートリッジを送り込む。現存ユニットのカートリッ
ジ装置は、ガス衝撃波発生器12（第２図）と一緒に、取
り外し、交換される。ガス衝撃波発生器のねじ56は、扁
平なディスク状プレート214、216と螺合する。これらの
プレートは、PDS−1000の現行のバレル組立体を所定位
置に錠止した場合にブラケット18によって所定位置に錠
止される。この組立体が高圧ガス源に接続することにな
っているため、操作方法に制限がある。したがって、プ
レートは、その周縁まわりに多数のノッチ（図示せず）
を有し、たいていの場合と同様に、多数の回転点で所定
位置に錠止され得るようにしてもよい。第２組のプレー
ト214′、216が下方プレート214、216に固着されてい
る。しかしながら、プレート214′、216′はこの方法で
は逆になる。ガス衝撃波発生器は、衝撃波について膜38
（第２図）を取り替えたいときに取り外され、逆にされ
得る。このことは、高圧膜38の交換を非常に容易にす
る。高圧ガス衝撃波発生器の他のすべての特徴は、第
１、２図に関連して先に説明したとほとんど同じのまま
である。室210は、上方プレート220を有し、この上方プ
レートもフロントドアを開けることによって室210に滑
り込ませることができる。この上方プレート220は、通
常は、PDS−1000の停止プレート組立体を保持するよう
になっているが、本発明によれば、スロート部組立体16
に置き換えられる。このスロート部組立体は、代表的に
は、要素82、80（第２図）を含むことになる。一層詳し
くは、スロート部組立体16は、第４図に示す取外自在の
挿入体100を包含する。したがって、この挿入体は、以
前は停止プレート組立体があったプラットホーム内へ落
とし込むだけでよく、プラットホームは、衝撃室210の
上下の部分間の仕切りがシールされるときにその機能を
保持することになる。室の下部は、先のように標的室と
して役立つ。標的はトレイ212によって示してある。こ
れを除いて、この装置の動作は先に説明したのとほぼ同
じである。

上述した方法および装置は、植物、微生物、動物に及
ぶ種々の生きている細胞、組織の形質転換（または医薬
品の付与）を行うのに用いることができる。ここに述べ
た構成は、外科手術用途および大型生物用途のための手
持ち式プローブとしても、または、試験管培養その他の
実験室用途のための不動（ベンチ装着）装置としても使
用するに適している。冷衝撃力源は、生きている生物を
担持している粒子を加速する力を生じさせるのに用いら
れる。この衝撃力源は、真空を保持することのできるハ
ウジング内に収容される。真空は、装置の使用を容易に
し、かつ、発生したガス衝撃波の膨張率を最大にすると
同時に、ガス衝撃で発生した激しい騒音から操作員の聴
力を保護するのを容易にする。最後に、標的それ自体が
潜在的な致命的衝撃から保護される。

本装置は、極端な加熱なしに、膜のが破裂あるいは同
様の手段によって終局的なほぼ瞬間的なガス衝撃を発生
し、所与の容積の高圧室を調節可能な圧力で通気させる
ことができ、したがって、衝撃波の強さおよび速度が任
意特定の生物学的目的に達した速度まで微小発射体を加
速するのに適したものとなる。このような装置は、ガス
衝撃から使用者を保護し、標的細胞または組織へのガス
衝撃を減衰すると同時に、より良好な粒子飛翔特性を得
るために改造した内部ガス環境の使用を可能とするハウ
ジングを包含する。このハウジングは、オプションとし
て、比較的小型の手持ち式「ピストル」または「ワン
ド」形態とすることも可能であり、この場合、大型の生
きている生物の生物分解処理のためにノズルまたは副室
を表皮、真皮または切開した組織に直接押し付けること
ができる。

本装置のスロート領域は、固定膜から捕獲膜、破裂
膜、フライングディスク、ガス巻き込みに及ぶ種々の加
速モードで装置を作動させ得る種々の互換性のある組立
体を収容する。

加速された粒子が標的まで経路に沿って飛翔する標的
インタフェース領域は、大型動物から実験室用途までの
種々の用途に合わせることのできる互換性インタフェー
スを提供する。このインタフェース領域は、粒子がどの
ようなガスまたは真空を通過するかということ、標的ま
での飛翔距離、標的との衝突前のガスおよび衝撃の消散
および標的の物理的な安定性において融通性を与える。

要約すると、本装置および方法は、比較的安全で、高
度の融通性、反復結果を提供する融通性のある形質転換
装置を提供する。本装置は、移動可能であり、正しい挿
入体を利用した場合には標的の損傷が少なくなる。ま
た、本装置は、凝集した粒子の解散と共により良好な粒
子分布、分散を可能とする。

実施例 例１ 細胞または組織あるいはこれら両方の標的に生物学的
物質を担持している粒子を導入するために本発明に従っ
て構成した冷却ガス衝撃波を使用するプロトタイプ装置
（第１、２図）を用いて酵母細胞を形質転換した。こう
してできた変換コロニーの数およびそれらの分散パター
ンをPDS−1000を用いて得た結果と比較した。このPDS−
1000は、現在、E.I.du Pout de Nemours and Comp
any,Wilmington,DEが市販している。火薬駆動式装置
は、生物学的物質を被覆した微小発射体を運ぶマクロ発
射体を駆動するのに熱ガス衝撃波を使用する。マクロ発
射体は、中央オリフィスを有する停止プレートに衝突す
る。この停止プレートは、マクロ発射体を標的に衝突す
る前に停止させ、微小発射体がオリフィスを通過して標
的に衝突するようにしている。

5g酵母エキス、10gペプトン、0.025gアデニンを900mL
の蒸留水に加え、別に100mLの蒸留水に20gのグルコース
を加え、これら両溶液をオートクレーブ処理し、その後
に混合することによって成長培地（液体YEP培地）を調
製した。保存培養物から酵母細胞のコロニーを採取し、
50mLの液体YEP培地を入れた250mLフラスコ内に置いた。
酵母細胞は、72時間、37℃において150ROMで回転する回
転シェーカー上に酵母細胞および液体YEP培地を入れた2
50mLフラスコを置くことによって成長した。次に、細胞
を遠心力でペレット成形し、上澄み液を捨て、10mLの水
に再懸濁させた。細胞の濃度は、600nmで懸濁液の光学
密度を測定することによって決定した（１単位が約2¹⁰
細胞/mLに等しい）。アミノ酸を持たない3.35g酵母窒素
基、0.235gウラシル・ドロップアウト・アミノ酸プレミ
ックス（以下のＤ、Ｌフォームをすり合わせ、混合する
ことによって調製したものである。すなわち、0.4gのア
デニン、0.4gのトリプトファン、0.4gのヒスチジン、0.
4gのアルギニン、0.4gのメチオニン、0.6gのチロシン、
1.2gのロイシン、0.6gのリシン、10gのフェニララニ
ン、4.0gのスレオニンを混合したものである。この混合
物を暗色のしっかり封をしたびん内に室温で保存してあ
る）、7.5gの寒天およびソルビトール、マンニトールを
各々の最終濃度0.75Mとなるまで加え、別に50mLの蒸留
水に10gのグルコースを加え、これら２つの溶液をオー
トクレーブ処理し、これらのオートクレーブ処理済みの
溶液を混ぜ合わせることによって成長培地（ウラシル・
ドロップアウト培地）を調製した。10⁸個の細胞をウラ
シル・ドロップアウト培地を入れたシャーレ皿上に塗布
した。

GTE,Hawes St.,Towanda,PAから得たＭ−10タングステ
ン粒子を、S.A.Johnston,R.Butow,K.Shark,J.C.Sanford
共著の「Mitochodrial Transformation in Yeast by Bo
mbardment with Microprojectiles」、Science 240:153
8〜1541（1988）に記載されている手順を用いて、プラ
スミドDNA YEP352で被覆した。５μＬの形質転換用DNA
（10mMのトリス塩酸塩と1mMのエチレンジアミン四酢酸
とからなる緩衝剤内の１μg/μＬ形質転換用DNA）をＭ
−10タングステン粒子の25μＬ懸濁液（60mg/μＬの
水）と混ぜ合わせ、それに、25μＬの2.5M塩化カルシウ
ムおよび５μＬの0.1Mスペルミジンを添加した。この混
合物を室温で10分間置いた。次に、この混合物を遠心分
離にかけ、10μＬを除いてすべての上澄み液を捨てた。
衝撃の準備の際に、ペレット成形し、被覆した微小発射
体を10μＬの100％エタノール溶液に再懸濁させ、懸濁
液の３μＬを膜上に置き、直径約5mmの均等な層を形成
するように塗り広げた。エタノールは、室温で蒸発し、
乾燥した粉末が残った。

被覆した微小発射体をウラシル・ドロップアウト培地
を含むシャーレ皿上に塗布したと同じ日に、これらの微
小発射体で細胞に衝撃を加えた。この衝撃はPDS−1000
で行った。頂棚部、底棚部の両方を標的のために用い
た。細胞には、本発明の「捕獲膜」、「破裂膜」および
「ガス巻き込み」実施例および第５、７、８図に示し、
「動作」のところで説明した方法を用いても衝撃を与え
た。所望のガス（ヘリウム）圧力は、タンク源で高真空
レギュレータを用いて選び、標的への真空作用の付与は
前述の標準の弁で制御した。標的は、好ましい実施例の
詳細な説明のところに開示し、第10図に示すように真空
ポンプに接続したLexan（登録商標）室内に置いた。

表１は、本発明の装置と火薬駆動式装置とを用いて形
質転換したコロニーの数の比較を示す。その結果は、50
0psi、1000psiでの「破裂膜」実施例を用いて火薬駆動
式装置の約２倍から３倍のコロニーを産生したことを示
している。本発明の装置は、また、シャーレ皿の表面に
わたってより広く、より均等にコロニーを分散させた。
火薬駆動式装置は、代表的には、約直径1cmの、形質転
換コロニーがない「デッドゾーン」があり、寒天がブラ
ストで吹き飛ばされたところが多い状態の分散を呈し
た。

例２ 例１に記載してあるようなプロトタイプの装置を用い
てBacillus megateriumを形質転換した。それによって
生じた形質転換コロニーの数および変換コロニーの分散
パターンをPDS−1000を用いて得たものと比較した。

50mLのLuria−Bertani（LB）ブイヨン培地（10gのト
リプトン、5gの酵母エキスおよび5gのNaClを900mLの蒸
留水に加え、pHをNaOHで7.5に調節し、全体積が1000mL
となるまで蒸留水を追加し、その後にオートクレーブ処
理することによって調製したもの）にBacillus megater
ium株7A17細胞（the Bacillus Genetic Stock Center,S
tate University,Columbus,OHから入手可能）のループ
を接種した。この接種した培養物を24時間、2500RPMで
回転シェーカ内において培養した。培養物は遠心力を受
け、40mLの上澄み液は捨てられ、細胞ペレットを残りの
上澄み液に再懸濁させた。細胞の濃度は、600nmで懸濁
液の光学密度を測定することによって決定した。10gの
トリプトン、5gの酵母エキス、5gのNaClおよび15gの寒
天を900mLの蒸留水に加え、そのpHをNaOHで7.5に調節
し、全体積1000mLまで蒸留水を追加し、182.2gのＤ−ソ
ルビトールおよび136.6gのＤ−マンニトールを加え、オ
ートクレーブ処理した後に最終濃度50μg/mLまでメチオ
ニンの殺菌溶液を加え、さらに、4mLのＤ、Ｌ−メチオ
ニンの溶液（12.5mg/mL）を加えることによって固形成
長培地（固形LB培地プラスメチオニン、オスモチカム）
を調製した。10⁸の細胞を固形LB培地＋メチオニン、オ
スモチカムを含むシャーレ皿に塗り広げた。細胞を寒天
上で乾燥させてから衝撃を与えた。前述の培地は、B. m
egateriumの形質転換の効率に基づいてオスモチカム濃
度（ソルビトールとマンニトール）に関して最適化し
た。オスモチカムの濃度を高めると、衝撃直後の細胞の
生存率が良くなる。

GTE,Hawes St.,Towanda,PAから得たＭ−10タングステ
ン粒子を、Sanford等によって開示され、例１に述べた
ような手順を用いて、the Bacillus Genetic Stock Cen
ter,State University,Columbus,OHから得たプラスミド
DNA DNA pUB110で被覆した。このプラスミドpUB110は、
サイズが4.5kbであり、抗生物質のカナマイシン（Km）
とネオマイシン（Nm）に対する抵抗を示す。プラスミド
pUB 110は、T.Maniatics,E.F.Firtsch,J.Sambrook共著
「Molecular Cloning,A Laboratory Manual」、1982
に記載されている方法を用いて、Bacillus subtilis株1
EGの24時間後の培養物から隔離した。プラスミドpUB 11
0は、次に、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配を用い
て精製した。

本発明の装置と共に用いるマクロ粒子も、Sanford等
に記載された方法を用いて調製した。

細胞は、Sanford等に記載されているPDS−1000で衝撃
を与えた。本発明の「捕獲膜」、「破裂膜」、「フライ
ングディスク」および「ガス巻き込み」実施例を、「動
作」の章で説明し、第５、７、８図に示す手順を用いて
テストした。

静止細胞を上述の培地（固形LB培地プラスメチオニ
ン、オスモチカム）上に置き、Sanford等の火薬駆動式
装置かあるいは本発明の装置で衝撃を与え、15mLのオー
バーレイ培地（4mLのＤ、Ｌ−メチオニンおよび2mLの硫
酸カナマイシン（25mg/mL溶液）を１リットルのオート
クレーブ処理したLBブイヨン培地に各々最終濃度50μg/
mLまで加えることによって調製したもの）で覆う。オー
バーレイ培地が固化した後、シャーレ皿を37℃に維持
し、形質転換株の数を72時間後に計数した。形質転換し
たB.megaterium細胞は、抗生物質カナマイシン、ネオマ
イシンに対して抵抗性を示した。形質転換株は、カナマ
イシンの存在下で成長する能力の有無によって選んだ。

10個の形質転換株を分離し、メチオニンとカナマイシ
ン（10μg/mL）を含む固形LB培地に接種した。このカナ
マイシン濃度は、形質転換株を隔離した衝撃培地および
オーバーレイ培地を含むシャーレ皿内のカナマイシン濃
度とほぼ同じである。プラスミドDNAは、10個の形質転
換株から分離した。精製したプラスミドDNAを制限酵素B
amH1内で切り取り、アガロース・ゲル電気泳動によって
可視化した。プラスミドpUB 110は、１つの場所をBamH1
で切断した。各形質転換株からの消化されたプラスミド
DNAを、HindIIIでラムダファージで消化し、HindIIIお
よびECoR1でラムダファージで消化した既知のマーカと
比較し、また、BamH1で消化したB.subtilis 1E6から隔
離したプラスミドpUB 110と比較した。形質転換株から
の消化されたプラスミドDNAは、BamH1で消化したプラス
ミドpUB 110と同じサイズ（4.5kb）であった。したがっ
て、形質転換の存在が、形質転換株として選んだこれら
の細胞で確認された。

火薬駆動式PDS−1000装置および本発明の装置による
B.megateriumの衝撃の結果が表２に示してある。表３、
４は、本発明の種々の実施例を用いての衝撃実験の結果
を示す。

比較操作： １）細胞をDNAと混ぜた後、上記実施例の各々を用いて
裸の粒子で衝撃を与えた（18個のシャーレ皿で衝撃を与
えが、形質転換コロニーは見出せなかった）。

２）細胞をDNA被覆の粒子と混ぜ、衝撃を与えなかっ
た。18個のシャーレ皿を準備したが、形質転換コロニー
は見出せなかった。

比較操作： 細胞未処理。DNAと混ぜ合わせ、裸の粒子で衝撃を与
えた。細胞に裸の粒子で衝撃を与え、次いで粒子および
DNAと混ぜ合わせた。細胞をDNAと混ぜ合わせてからヘリ
ウム衝撃を当てた（粒子無し）。細胞にヘリウム衝撃を
与え、DNAと混ぜ合わせた。20個のシャーレ皿をテスト
した。形質転換コロニーはなんら見出せなかった。

表２は、本発明の種々の具体例ではいくつかの形質転
換株が観察されたが、PDS−1000では形質転換株がまっ
たく観察されなかったことを示す。表２、３、４は、本
発明の装置では、時には比較的高い率（シャーレ皿あた
りのコロニー）で形質転換株を生成するのに成功した
が、PDS−1000では不可能であったことを示している。
さらに、最適の条件下では、数千以上までの形質転換率
向上が可能である。このような高い形質転換率を達成す
るための好ましい条件としては、15時間経過Bacillus培
養物を使用、108細胞／シャーレ皿の細胞密度、フライ
ングディスク具体例の900psiでの使用、細胞のための浸
透支援として1.0Mソルビタールと0.75Mマンニトールを
含む細胞成長培地である。これらの条件の下では、本発
明は、Sanford等の火薬駆動式装置よりも、シャーレ皿
あたりの形質転換株の増大を約1000倍とする。

例３ 本発明に従って構成した、細胞または組織あるいはこ
れら両方の標的に生物学的物質を担持する粒子を導入す
るプロトタイプ装置を用いて、NT1 Nicotiana tabacum
タバコ細胞を形質転換した。その結果生じた形質転換細
胞の数およびこれら形質転換細胞の分散パターンを、PD
S−1000を用いて得たものと比較した。

NT1 Nicotiana tabacum細胞は、旋回シェイカ上に液
体成長培地（Daniell等PNAS、87:88〜92、1990）内の浮
遊物として成長した。NT1細胞系統は、the University
of WashingtonでG.Anから得た（Daniell等PNAS、87:88
〜92、1990）。NT1細胞は、植物に再生する能力を失っ
ているが、それらの均一性および急速成長の故に有用な
モデル系統である。これらの細胞は、一般に、３ないし
４の細胞培養物のそれぞれに見出された。衝撃の準備に
おいて、１から5mLの細胞懸濁液をブーフナー漏斗を用
いてフィルタ紙ディスクに集めた。

GTE,Hawes St.,Towanda,PAから得たＭ−10タングステ
ン粒子を、T.M.Klein,M.E.Fromm,A.Weissinger,D.Tome
s,S.Schaaf,M.Sleeten,and J.C.Sanford,Proc.Natl.Aca
d.Sci.,85:4305〜4309,1988、T.M.Klein,E.Fromm,T.Gra
dziel,and J.C.Sanford,Biotechnology 6:559〜563,198
8、T.M.Klein,E.C.Harper,Z.Svab,J.C.Sanford,M.E.Fro
mm,P.Maliga,Proc.Natl.Acad.Sci.85:8502〜8503,198
8、およびSanford等に記載されている手順を用いる形質
転換DNAとして、プラスミドDNA pIB1505（Molecular Ge
netics Plant Biotechnology,Institute,NRC Saskatoo
n,CanadaでDr.Bill Crosbyから得たもの）で被覆した。

本発明の装置と一緒に用いるための微小粒子は、例１
と同じ手順を用いて調製した。

β−グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）遺伝子をリポー
タ遺伝子として用い、プラント細胞における形質転換の
率を分析するのに用いた。GUS遺伝子は、バクテリアE.c
oli（R.A.Jefferson等、EMBO,6:3901〜3907,1987）から
クローン生成した。GUS遺伝子は、プラント種に通常は
存在しない蛋白質β−グルクロニダーゼの遺伝情報を指
定する。GUSで形質転換した植物細胞は、物質ｘ−gluc
の存在の下に青色になる。GUS分析を用いて、衝撃付与
済みのNT1植物培養物における過渡的形質発現を検出し
た。細胞は、衝撃後、２日で着色した。着色手順は、Mc
Cabe等、Biotechnology 6:923（1988）に記載されてい
る方法を用いて細胞に1mLのｘ−gluc溶液を添加するこ
とからなるものであった。溶液は、DMSOに溶解した0.5m
g/mLのｘ−gluc、10mMのEDTA、100mMの燐酸なトリウ
ム、0.5mMのフェロシアン化カリウム、0.1％トリトンＸ
−100からなるものであった。細胞は、24時間、37℃で
培養し、青色斑点の数を記録した。

細胞を、Sanford等に開示され、また、T.M.Klein,M.
E.Fromm,A.Weissinger,D.Tomes,S.Schaaf,M.Sleeten,an
d J.C.Sanford,Proc.Natl.Acad.Sci.,85:4305〜4309,19
88、T.M.Klein,E.Fromm,T.Gradziel,and J.C.Sanford,B
iotechnology 6:559〜563,1988、およびT.M.Klein,E.C.
Harper,Z.Svab,J.C.Sanford,M.E.Fromm,P.Maliga,Proc.
Natl.Acad.Sci.85:8502〜8503,1988に記載されているよ
うにPDS−1000で衝撃を与えた。本発明の「フライング
ディスク」および「ガス巻き込み」具体例を、「操作」
の章に記載され、第５、７、８図に示されている手順を
用いて、テストした。

表５は、PDS−1000および本発明の装置を用いてのNT1
細胞の形質転換の比較を示す。

表５は、本発明の装置が、PDS−1000による熱ガス衝
撃波装置と比べて、優れた形質転換率を与えることを示
している。

NT1タバコ細胞の形質転換について説明したと同じ手
順およびプラスミドを用いてモモ胚子カルスを形質転換
した。モモ・カルスについて用いた成長培地（DKW培
地）は、4.4μＭのBAP、0.05μＭのIBA、25％のサッカ
ロース、pH5.8、寒天（0.6〜0.7％）またはGirlite（0.
25％）からなるものであった。モモ・カルスは、USDAの
Dr.Ralph Scorzaによって提供された。モモ・カルス
は、未熟胚嚢から得た５年経過培養物から採取したもの
であり、自己栄養体であり、成長調整物質依存であり、
体細胞を生成し続けることができるものであった。この
場合、モモ・カルスはPDS−1000の３倍の衝撃を受け
た。モモ・カルスは、本発明の装置を用いて一回だけ衝
撃を与えた。その結果を表６に示す。

表６は、本発明の装置が、PDS−1000で３回連続衝撃
によって得ることのできるよりも大きい、遺伝子付与率
をただ一回の衝撃で得ることのできることを示してい
る。さらに、分散の均一性および被覆面積は、PDS−100
0を用いて達成したものよりも優れていることが観察さ
れた。

例４ 第１図に説明したようなプロトタイプ装置を用いた。
その結果生じた形質転換細胞数および形質転換細胞の分
散ぱたあんを、PDS−1000を用いて得たものと比較し
た。

GTE,Hawes St.,Towanda,PAから得たＭ−10タングステ
ン粒子を、Sanford等の手順を用いて、R.S.Williams,Du
ke University,Durham,North Carolinaから得たプラス
ミドDNA pHBlucで被覆した。プラスミドpHBlucは、筋
管の試験管での形質転換に、そして耳、皮膚および肝臓
のその場での形質転換に使用した。これは、puc19ベー
ス・ベクトル内で人間ベーターアクチン・プロモータに
溶融させた発光性飛翔昆虫ルシフェラーゼ遺伝子を含有
する（ole Wet,J.R.等，Mol.Cell Biol.,7:725〜727（1
987）、Leavitt,J.等、Mol.Cell Biol.4:1961〜69（198
4）。

本発明の装置と一緒に用いるための微小粒子は、Alfa
Johnson,Mathy,Danvers,MA）から販売されており、San
ford等に記載されている方法を用いて調製した。

筋管（mytotubes）は、鶏胚から調製した。鶏胚を卵
から取り出し、胸筋を解剖によって取り出し、市販の溶
液（Saline G）の液滴内に置いた。筋肉は、細断し、9m
LのSaline G、1mLのトリプシンの10x溶液（緩衝食塩水
内の2.5％溶液）で稀釈した。この混合物に５分間振動
を与え、次に、混合物をピペットに吸い込んだり、吐き
出したりすることによって攪拌した。次に、混合物をさ
らに15分間振動させ、細胞を濾過によって収集した。細
胞は、20mLのCKI成長培地（0.584g/LのＬ−グルタミ
ン、1g/Lのグルコース、3.7g/Lの重炭酸ナトリウム、15
％ウマ血清および５％胚子エキスからなる市販のダルベ
ツコ改質イーグル培地）に再浮遊させてから計数した
（胚子エキスは、100gの鶏胚を卵から取り出し、断頭
し、121.12g/Lの塩化ナトリウム、15.5g/Lの塩化カリウ
ム、12.72g/Lの塩化マグネシウム、7.8g/Lの塩化カルシ
ウム、2g/Lの第二燐酸ナトリウムおよび5.19g/Lの燐酸
二水素ナトリウムからなる培地100mL内で均質化する。
このホモジネートを、10000単位のハイルロニダーゼを
追加した後に１時間冷室で攪拌した。この混合物を遠心
分離にかけて破砕屑を除去し、脂質を上澄み液から除去
した。次に、この上澄み液を濾過によって減菌した）。
次に、細胞を、１×10⁶細胞/mLの密度で50mmシャーレ皿
上に置いた。筋管は、５日間保存してから衝撃を与え
た。

細胞は、標準プロトコルを用いてPDS−1000で衝撃を
与えた。この手順は、筋管を覆っている液体培地を衝撃
の直前に除去したという点でのみ改変した。本発明の
「捕獲膜」具体例を、「動作」の章に記載し、第５図に
示した手順を用いてテストした。培地は、衝撃付与の直
後に交換した。細胞は、37℃で24時間培養し、ルシフェ
ラーゼ活性度について分析した。

ルシフェラーゼ活性を分析するために、1mLの抽出緩
衝剤（100mMの燐酸カリウム緩衝剤、pH7.8、3mMの塩化
マグネシウムおよび1mMのDTTからなる）内でプレートか
ら細胞を掻き落とし、次に、遠心力によってペレット成
形した。上澄み液を除き、100μＬの抽出緩衝剤および5
0μＬの崩壊緩衝剤（8.9mLの0.25Mトリス緩衝剤、pH7.
8、10mg/mL濃度の1.0mLの大豆トリプシン抑制剤、0.1mL
のアプロチニンからなる）を加え、細胞を６秒間、音波
破砕によって崩壊させた。細胞屑を遠心力でペレット成
形し、上澄み液をルシフェラーゼ活性度について分析し
た。

ルシフェラーゼ活性度の分析では、基体、ルシフェリ
ンの存在の下にルシフェラーゼ酵素との触媒反応から生
じた光（光子）の出力を測定する。こうして生じた光量
（光子数）は、組織から抽出したルシフェラーゼの量に
比例する。ルシフェラーゼの量は、形質転換細胞の数お
よび各形質転換細胞の生成するルシフェラーゼの量によ
って決定される。ルシフェラーゼ活性度が大きければ、
それだけ形質転換がより効率よく行われる。ショット面
積あたりの光子の数は、市販の精製ルシフェラーゼを用
いて基準曲線を作成することによってショット面積あた
りのルシフェラーゼピコグラム数に変換し得る。

表７は、本発明装置とPDS−1000の形質転換効率の比
較結果を示す。

表７は、本発明の装置が、筋管について、平均で火薬
駆動式装置の約11倍のルシフェラーゼ活性度、したがっ
て、形質転換率を得られることを示している。

別のテストでは、微小粒子のコーティングおよび生き
ている組織のその場での形質転換のためのDNAでの衝撃
の準備を、PDS−1000を用いて行った。タングステンの
代わりに、金の微小粒子を用いた。用いた金微小粒子
は、球形であり、直径が１〜３μあるいは２〜５μであ
った（Alpha productsから入手した製品番号00766）。
さらに、装置の構成を改造し、真空室の代わりに、装置
の端にノズル（第10図）を設置して微小粒子を小パッチ
の組織に送るようにした。皮膚および耳組織について
は、ノズルを真空ポンプに接続し、微小粒子が真空中を
移動するようにした。肝臓組織は、真空で損傷を受けて
いたので、真空にさらすことはなかった。

本発明の装置と一緒に用いるための微小粒子は、Alf
a,Johnson,Mathey,Danvers,MAから購入し、Sanford等に
記載の方法を用いて準備した。

衝撃用の皮膚、耳を調製するために、動物に麻酔をか
け、衝撃を加えようとしている領域から脱毛剤でヘアを
除去した。次に、直径約6mmの領域に衝撃を加え、動物
の麻酔を解いた。24時間で、動物を犠牲にして衝撃を加
えた領域を切り取った。この組織を、140μＬの抽出緩
衝剤、50μＬの崩壊緩衝剤および10μＬの２％NP−40洗
剤（市販物）の混合物中で、細断した。細胞屑を、次
に、遠心力でペレット成形し、上澄み液をルシフェラー
ゼ活性度について分析した。

肝臓組織を形質転換するために、マウスに麻酔をか
け、腹部を切開して１つの肝臓葉を露出させた。次に、
10mm面積に衝撃を加えた（真空を付与していないことを
除いて皮膚、耳と同じ）。次に、切開部を閉じ、麻酔を
解いた。24時間以内に、動物を犠牲にして衝撃付与領域
を取り出し、200μＬの抽出緩衝剤内で細断し、細胞屑
を遠心力でペレット成形し、上澄み液をルシフェラーゼ
活性度について分析した。

本発明の要旨およびその実施態様を以下に要約して示
す。

1.細胞の標的に生物学的物質を担持している粒子を導入
する方法であって、 標的側を有する平らなキャリヤ・シートを用意する段
階と、 細胞の標的を用意する段階と、 平らなキャリヤ・シートの標的側に生物学的物質を担
持している粒子を置く段階と、 前記シートを瞬間的な冷ガス衝撃波の力にさらし、粒
子をキャリヤ・シートから自由に加速し、粒子をして細
胞の表面を貫通させ、細胞を殺すことなく細胞の内部に
組み込む段階 を包含することを特徴とする方法。

2.前項１に記載の方法において、前記シートが、衝撃波
により拡張はするが破裂しない弾性膜であり、前記方法
が、さらに、 細胞の標的と膜との間に拘束スクリーンを設置する段階
を包含し、 前記拘束スクリーンが、前記冷ガス衝撃波に応答して
完全に拡張する前に膜を拘束し、粒子がスクリーンを通
過して標的に移動できるように設置してある。

ことを特徴とする方法。

3.前項１に記載の方法において、前記シートが弾性膜で
あり、前記方法が、さらに、 前記冷ガス衝撃波をして膜の拡張および破裂を生じさ
せ、それによって、標的細胞の広い領域にわたって粒子
を発射、解凝集、分散させる段階を包含することを特徴
とする方法。

4.前項１に記載の方法において、シートが非弾性であ
り、前記方法が、さらに、 前記冷ガス衝撃波をして膜の拡張および破裂を生じさ
せ、それによって、標的細胞の広い領域にわたって粒子
を発射、解凝集、分散させる段階を包含することを特徴
とする方法。

5.前項１に記載の方法において、シートがスクリーンで
あることを特徴とする方法。

6.前項５に記載の方法において、さらに、スクリーンを
通過した後の衝撃波を邪魔して衝撃波の力の若干量を標
的細胞からそらせる段階を包含することを特徴とする方
法。

7.前項１に記載の方法において、前記シートが弾性膜で
あり、この膜の標的側に平らなディスクが設置してあ
り、このディスクの標的側に粒子が設置してあり、前記
方法が、さらに、 前記冷ガス衝撃波をして膜の拡張、破裂を生じさせ、
それによって、ディスクを標的細胞に向かって駆動する
段階 を包含することを特徴とする方法。

8.前項１に記載の方法において、前記シートが弾性膜で
あり、この膜の標的側に平らなディスクが設置してあ
り、このディスクの標的側に粒子が設置してあり、前記
方法が、さらに、 前記冷ガス衝撃波をして破裂させずに前記膜の拡張を
生じさせ、それによって、ディスクを標的細胞に向かっ
て駆動する段階と、 細胞に衝突する前にディスクを止めるバリヤを設ける
段階 を包含することを特徴とする方法。

9.細胞の標的に生物学的物質を担持している粒子を導入
する方法であって、 加圧ガス源およびこのガス源と接続した破裂可能な膜
シールを用意する段階と、 標的側を有する平らなキャリヤ・シートを用意する段
階と、 細胞の標的を用意する段階と、 平らなキャリヤ・シートの標的側に生物学的物質を担
持している粒子を設置する段階と、 シールを破裂させてガスを破局的に解放し、瞬間的な
ガス衝撃波を発生させる段階と、 前記シートをこの瞬間的な冷ガス衝撃波にさらしてキ
ャリヤ・シートから自由に粒子を加速し、細胞を殺すこ
となく粒子に細胞の表面を貫通させ、細胞の内部に入ら
せる段階 を包含することを特徴とする方法。

10.前項９に記載の方法において、さらに、シートと細
胞の標的の間にバリヤを設ける段階を包含し、シートを
所定位置にしっかりと固定されないように設置し、バリ
ヤによって拘束されるまでにシートを標的細胞の方向へ
自由に移動するように加速し、粒子を標的細胞に向かっ
て移動させることを特徴とする方法。

11.前項９に記載の方法において、前記シートが、縁を
動かないように固定された弾性膜であり、前記方法が、
さらに、 シールを機械的に破裂させて源からのガスを急速に解
放し、瞬間的なガス衝撃波を発生させ、このガス衝撃波
が膜を拡張させるが破裂はさせず、それによって、標的
を衝撃波から保護する段階 を包含することを特徴とする方法。

12.前項11に記載の方法において、さらに、 細胞の標的と膜との間に拘束スクリーンを設置し、前記
ガス衝撃波に応答して完全に拡張する前に膜がスクリー
ンによって拘束されるようにする段階と、 粒子を標的に向かってスクリーンを通過させる段階を包
含することを特徴とする方法。

13.前項９に記載の方法において、前記シートが、縁を
動けないように固着された弾性膜であり、前記方法が、
さらに、 前記冷ガス衝撃波をして膜の拡張および破裂を生じさ
せ、それによって、標的細胞の広い領域にわたって粒子
を発射、解凝集、分散させる段階を包含することを特徴
とする方法。

14.細胞または組織またはこれら両方の標的に生物学的
物質を担持している粒子を導入する装置であって、 真空を維持することのできる密閉したハウジング14で
あり、真空を供給する第１ポート70と、主軸線と、この
軸線上に位置する第２、第３のポートとを有し、第３ポ
ート16が、粒子を加速するスロート部を構成し、第３ポ
ートがハウジングの標的側に設けてあるハウジングと、 第２ポート内に設けてあり、スロート部に向いて位置
した部分を有する高圧室12であり、その中に蓄積された
ガスを解放してガス衝撃波をスロート部に向かわせるよ
うになっており、スロート部に向いた高圧室の部分が、
破裂して衝撃波を発生させる破裂可能な膜38によってシ
ールされている高圧室12と、 第３ポートを通って標的に向かう高圧室によって発生
させられた衝撃波の力によって加速できるようにスロー
ト部内に粒子を設置する設置手段80 を包含することを特徴とする装置。

15.前項14に記載の装置において、さらに、破裂可能な
膜38を機械的に破裂させて前記ガス衝撃波を発生させる
手段46を包含することを特徴とする装置。

16.前項14に記載の装置において、設置手段80が、スロ
ート部内に設置した標的側を有するキャリヤ・シート11
0を包含し、粒子をキャリヤ・シートの標的側に設置で
きるようになっており、それによって、衝撃波の力によ
って粒子を標的に向かって推進できるようになっている
ことを特徴とする装置。

17.前項14に記載の装置において、さらに、スロート部
を標的に連結するようにスロート部に固着されたインタ
フェース18を包含することを特徴とする装置。

18.前項16に記載の装置において、キャリヤ・シート110
が弾性であり、さらに、このキャリヤ・シートの周縁を
把持することによってキャリヤ・シートをスロート部内
に固着する固定手段82を包含し、この固定手段が、軸線
に沿って種々の位置に設置できるようになっていること
を特徴とする装置。

19.前項18に記載の装置において、設置手段80が、さら
に、その縁をキャリヤ・シートと標的の間に固着され、
キャリヤ・シートの移動を拘束するが、衝撃波に応答し
てキャリヤ・シートが部分的に拡張できるようにするス
クリーン120を包含することを特徴とする装置。

20.前項16に記載の装置において、キャリヤ・シート110
が、衝撃波に応答して破裂可能であり、さらに、キャリ
ヤ・シートの周縁を把持することによってスロート部内
にキャリヤ・シートを固着する固定手段82を包含し、こ
の固定手段が軸線に沿って種々の位置に設置できるよう
になっていることを特徴とする装置。

21.前項20に記載の装置において、キャリヤ・シート
が、平らなディスク130を包含し、このディスク上に標
的細胞に隣接して粒子を配置し、このディスクが自由に
飛翔できるようにスロート部に固着、固定されておら
ず、また、弾性のキャリヤ・シートと標的との間に固定
バリヤ132が設置してあり、ディスクを停止させるが、
粒子は標的に移動させ続け得るようにしたことを特徴と
する装置。

22.細胞または組織またはこれら両方の標的に生物学的
物質を担持している粒子を導入する装置であって、 真空を維持することのできる密閉したハウジング14で
あり、真空を供給する第１ポート70と、主軸線と、この
軸線上に位置する第２、第３のポートとを有し、第３ポ
ート16が、粒子を加速するスロート部を構成し、第３ポ
ートがハウジングの標的側に設けてあるハウジングと、 第２ポート内に設置してあり、スロート部に向かう冷
ガス衝撃波を発生するようにガスを解放する手段12と、 標的に向かって冷ガス衝撃波の力によって加速できる
ようにスロート部内に粒子を設置する設置手段80と、ス
ロート部を標的に連結するようにスロート部に固着した
インタフェース18とを包含し、設置手段が、スロート部
内に設置された標的側を有する使い捨てのキャリヤ・シ
ート110を包含し、粒子をキャリヤ・シートの標的側に
設置できるようになっており、それによって、冷ガス衝
撃波の力によって粒子を標的に向かって推進できるよう
にしたことを特徴とする装置。

23.前項22に記載の装置において、キャリヤ・シート110
が弾性であり、さらに、このキャリヤ・シートの周縁を
把持することによってキャリヤ・シートをスロート部内
に固着する固定手段を包含し、この固定手段が、軸線に
沿って種々の位置に設置できるようになっていることを
特徴とする装置。

24.前項22に記載の装置において、キャリヤ・シート110
が、衝撃波に応答して破裂可能であり、さらに、キャリ
ヤ・シートの周縁を把持することによってスロート部内
にキャリヤ・シートを固着する固定手段82を包含し、こ
の固定手段が軸線に沿って種々の位置に設置できるよう
になっていることを特徴とする装置。

25.前項22に記載の装置において、 インタフェースが、さらに、スロート部に取り付けて
あり、標的の限られた領域に粒子を通すように構成した
ノズル170と、 このインタフェース・ノズル内に設置してあって標的
がインタフェース内に吸い込まれるのを防ぐスクリーン
174 を包含することを特徴とする装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 999999999 デユーク・ユニバーシテイ アメリカ合衆国ノースカロライナ州ダラ ム．アーウインロード （番地なし) (72)発明者 ブルーナー，ロナルド・エフ アメリカ合衆国ニユージヤージー州 08080．シユーエル．フリーダムロード 93 (72)発明者 デ・ビツト，マイクル・ジエイ アメリカ合衆国ニユーヨーク州 14456. ジエニーバ．ジエニシーストリート36 (72)発明者 ジヨンストン，ステイーブン・エイ アメリカ合衆国ノースカロライナ州 27701．ダラム．ノースグレグソンスト リート309 (72)発明者 サンフオード，ジヨン・シー アメリカ合衆国ニユーヨーク州 14456. ジエニーバ．サンセツトドライブ43

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞の標的に生物学的物質を担持している
   粒子を導入する方法であって、 標的側を有する平らなキャリヤ・シートを用意する段階
   と、 細胞の標的を用意する段階と、 平らなキャリヤ・シートの標的側に生物学的物質を担持
   している粒子を置く段階と、 前記シートを瞬間的な冷ガス衝撃波の力にさらし、粒子
   をキャリヤ・シートから自由に加速し、粒子をして細胞
   の表面を貫通させ、細胞を殺すことなく細胞の内部に組
   み込む段階 を包含することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】細胞または組織またはこれら両方の標的に
   生物学的物質を担持している粒子を導入する装置であっ
   て、 真空を維持することのできる密閉したハウジング14であ
   り、真空を供給する第１ポート70と、主軸線と、この軸
   線上に位置する第２、第３のポートとを有し、第３ポー
   ト16が、粒子を加速するスロート部を構成し、第３ポー
   トがハウジングの標的側に設けてあるハウジングと、 第２ポート内に設けてあり、スロート部に向いて位置し
   た部分を有する高圧室12であり、その中に蓄積されたガ
   スを解放してガス衝撃波をスロート部に向かわせるよう
   になっており、スロート部に向いた高圧室の部分が、破
   裂して衝撃波を発生させる破裂可能な膜38によってシー
   ルされている高圧室12と、 第３ポートを通って標的に向かう高圧室によって発生さ
   せられた衝撃波の力によって加速できるようにスロート
   部内に粒子を設置する設置手段80を包含することを特徴
   とする装置。