JP2024533174A - Ａａｖカプシド組成物及び送達方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、新規アデノ随伴ウイルス(AAV)カプシド配列及びその機能断片を含む様々な組成物を提供する。また提供されるのは、本開示によって提供される組成物を用いる送達、治療、及び製造の方法である。【選択図】図１
Description
(1.関連出願の相互参照及び引用による組込み)
本出願は、本明細書中に完全に組み込まれる2021年9月3日に出願された米国仮特許出願第63/240,788号の恩典を主張する。
本出願は、本明細書中に完全に組み込まれる2021年9月3日に出願された米国仮特許出願第63/240,788号の恩典を主張する。
本明細書で言及される特許、特許出願、及び刊行物は全て、引用により本明細書中に完全に組み込まれる。本出願における任意の参考文献の引用又は特定は、そのような参考文献が本出願に対する先行技術として利用可能であるという承認ではない。
(2.配列表)
本出願は、その内容全体が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、本出願とともにXMLファイル形式で提出されているコンピュータで読み取り可能な配列表を含有する。本出願とともに提出された配列表のXMLファイルは、「11808-477-228_SEQ_LISTING.xml」と題され、2022年8月24日に作成されたものであり、かつ482,536バイトのサイズである。
本出願は、その内容全体が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、本出願とともにXMLファイル形式で提出されているコンピュータで読み取り可能な配列表を含有する。本出願とともに提出された配列表のXMLファイルは、「11808-477-228_SEQ_LISTING.xml」と題され、2022年8月24日に作成されたものであり、かつ482,536バイトのサイズである。
(3.背景)
組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベースのベクターを送達に用いる遺伝子療法アプローチは、いくつかの臨床試験において安全性及び長期有効性を示している。こうした成功の後、Glybera(AAV-1を使用)、Luxturna(AAV-2を使用)、及びZolgensma(AAV-9を使用)などの少数のAAVベースの遺伝子療法製品が米国食品医薬品局(Food and Drug Administration)及び/又は欧州医薬品庁(European Medicine Agency)によって承認されている。
組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベースのベクターを送達に用いる遺伝子療法アプローチは、いくつかの臨床試験において安全性及び長期有効性を示している。こうした成功の後、Glybera(AAV-1を使用)、Luxturna(AAV-2を使用)、及びZolgensma(AAV-9を使用)などの少数のAAVベースの遺伝子療法製品が米国食品医薬品局(Food and Drug Administration)及び/又は欧州医薬品庁(European Medicine Agency)によって承認されている。
こうしたAAVベースの遺伝子療法の進展にもかかわらず、これらの研究はまた、血液中に存在するAAV中和抗体の回避の増加を伴うAAVベクターの必要性、及び指向性と呼ばれる、増強された組織特異性を有するAAVベクターの必要性などの、AAVベースのベクターを治療モダリティとしてより幅広く使用することに対するいくつかの技術的障害を明らかにした。
したがって、治療モダリティとしてのAAVベースのベクターのより幅広い応用を可能にする改善された機能的特性を有するAAVベースのベクターに対する継続中の満たされていない必要性が依然として存在している。
(4.概要)
本開示は、中和抗体を回避する増強された能力、増強された組織特異性、及び/又は増大した細胞形質導入を有し、それにより、送達及び/又は疾患の治療へのAAVベースのベクターのより幅広い使用を可能にする新規AAVカプシド配列を含む様々な組成物を提供する。本明細書に記載される実施態様は、生体分子(例えば、治療的生体分子)を送達するための新規AAVカプシド配列及び/又はその機能断片、AAVクレード、AAV分岐(AAV branch)(すなわち、AAVクレードの群)、組換えAAVウイルス粒子、ベクター、rAAVベクターゲノムコンストラクト、宿主細胞、並びに医薬組成物に関する。特に、本開示の組成物は、筋肉、心臓、脳、血漿、腎臓、肝臓、及び/又は癌細胞へのインビトロ、インビボ、及び/又はエクスビボ送達に使用することができる。いくつかの実施態様において、本開示の組成物は、筋肉、心臓、脳、血漿、腎臓、肝臓、耳、及び/又は癌細胞へのインビトロ、インビボ、及び/又はエクスビボ送達に使用することができる。本明細書に記載される実施態様はまた、治療を必要としている対象に、本明細書に提供される新規AAVカプシド配列、rAAVベクターゲノム、組換えAAV(rAAV)ウイルス粒子、宿主細胞、又は医薬組成物のいずれかを投与することを含む、治療方法に関する。本明細書に記載される実施態様はまた、治療を必要としている対象に、本明細書に提供される新規AAVカプシド配列、rAAVベクターゲノム、組換えAAV(rAAV)ウイルス粒子、宿主細胞、又は医薬組成物及び生体分子(例えば、治療的生体分子)のいずれかを投与することを含む、治療方法に関する。本開示の新規rAAVウイルス粒子を製造する方法も提供される。
本開示は、中和抗体を回避する増強された能力、増強された組織特異性、及び/又は増大した細胞形質導入を有し、それにより、送達及び/又は疾患の治療へのAAVベースのベクターのより幅広い使用を可能にする新規AAVカプシド配列を含む様々な組成物を提供する。本明細書に記載される実施態様は、生体分子(例えば、治療的生体分子)を送達するための新規AAVカプシド配列及び/又はその機能断片、AAVクレード、AAV分岐(AAV branch)(すなわち、AAVクレードの群)、組換えAAVウイルス粒子、ベクター、rAAVベクターゲノムコンストラクト、宿主細胞、並びに医薬組成物に関する。特に、本開示の組成物は、筋肉、心臓、脳、血漿、腎臓、肝臓、及び/又は癌細胞へのインビトロ、インビボ、及び/又はエクスビボ送達に使用することができる。いくつかの実施態様において、本開示の組成物は、筋肉、心臓、脳、血漿、腎臓、肝臓、耳、及び/又は癌細胞へのインビトロ、インビボ、及び/又はエクスビボ送達に使用することができる。本明細書に記載される実施態様はまた、治療を必要としている対象に、本明細書に提供される新規AAVカプシド配列、rAAVベクターゲノム、組換えAAV(rAAV)ウイルス粒子、宿主細胞、又は医薬組成物のいずれかを投与することを含む、治療方法に関する。本明細書に記載される実施態様はまた、治療を必要としている対象に、本明細書に提供される新規AAVカプシド配列、rAAVベクターゲノム、組換えAAV(rAAV)ウイルス粒子、宿主細胞、又は医薬組成物及び生体分子(例えば、治療的生体分子)のいずれかを投与することを含む、治療方法に関する。本開示の新規rAAVウイルス粒子を製造する方法も提供される。
一態様において、本明細書に提供されるのは、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバーである。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、表2のいずれか1つのクレードのメンバーである。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるVP1アミノ酸配列、(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるVP2アミノ酸配列、又は(c)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるVP3アミノ酸配列:を含む。一実施態様において、AAVクレードメンバーは、(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む。ある実施態様において、AAVクレードメンバーは、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するVP1アミノ酸配列を含む。ある実施態様において、VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列は、可変領域配列を含み、ここで、該可変領域配列は、配列番号6～78及び193のうちの少なくとも1つの可変領域から選択される。具体的な実施態様において、VP1アミノ酸配列は、GBS領域配列をさらに含み、ここで、該GBS領域配列は、配列番号6～78及び193:のうちの少なくとも1つのGBS領域配列から選択される。別の実施態様において、VP1アミノ酸配列は、GHループ配列をさらに含み、ここで、該GHループ配列は、配列番号6～78及び193:のうちの少なくとも1つのGHループから選択される。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列であるVP2アミノ酸配列を含む。ある実施態様において、AAVクレードメンバーは、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列であるVP3アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列であるVP1アミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、AAVクレードメンバーのVP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列は、表2に掲載されているアミノ酸修飾のうちの1つ又は複数を含む。具体的な実施態様において、AAVクレードメンバーのVP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列のアミノ酸修飾の1つ又は複数は、表2に掲載されているものに限定される。具体的な実施態様において、AAVクレードメンバーは、インビトロアッセイで決定されるAAV液性免疫を回避する能力をさらに含む。具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、パーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該％形質導入は、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、中和抗体(Nab)力価を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NAb力価は、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、NC50を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NC50は、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列に対して少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるVP3アミノ酸配列:を含む。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む。ある実施態様において、AAVクレードメンバーは、「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するVP1アミノ酸配列を含む。ある実施態様において、VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列は、可変領域配列を含み、ここで、該可変領域配列は、「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列の可変領域から選択される。具体的な実施態様において、VP1アミノ酸配列は、GBS領域配列を含み、ここで、該GBS領域配列は、「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のGBS領域配列から選択される。別の実施態様において、VP1アミノ酸配列は、GHループ配列を含み、ここで、該GHループ配列は、「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のGHループから選択される。例えば、いくつかの実施態様において、同じ表の「BCD_」という接頭辞を有するカプシドタンパク質のVP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるVP1アミノ酸配列を含む表2のいずれか1つ(例えば、表2.23、2.24、2.25、2.26、2.27、2.28、2.29、2.30、2.31、2.31(a)、又は2.32)における特定のクレードのメンバーは、同じ表の「BCD_」という接頭辞を有するカプシドタンパク質のVP1アミノ酸配列に見られるGBS領域又はGHループと同一である可変領域配列(例えば、GBS領域又はGHループ)を含む。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列であるVP2アミノ酸配列を含む。ある実施態様において、AAVクレードメンバーは、「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列であるVP3アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列のVP1アミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、AAVクレードメンバーのVP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列は、表2に掲載されているアミノ酸修飾のうちの1つ又は複数を含む。具体的な実施態様において、AAVクレードメンバーのVP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列のアミノ酸修飾のうちの1つ又は複数は、表2に掲載されているものに限定される。例えば、いくつかの実施態様において、同じ表の「BCD_」という接頭辞を有するカプシドタンパク質のVP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるVP1アミノ酸配列を含む表2のいずれか1つ(例えば、表2.23、2.24、2.25、2.26、2.27、2.28、2.29、2.30、2.31、2.31(a)、又は2.32)における特定のクレードのメンバーは、その表で特定されるアミノ酸修飾の1つ又は複数を含む。具体的な実施態様において、AAVクレードメンバーは、インビトロアッセイで決定されるAAV液性免疫を回避する能力をさらに含む。具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、パーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該％形質導入は、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、中和抗体(Nab)力価を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NAb力価は、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、NC50を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NC50は、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、AAVクレードの代表的VP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するVP1アミノ酸配列:を含み、ここで、該代表的配列が、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14:のいずれか1つから選択される、AAVクレードのメンバーである。一実施態様において、VP1アミノ酸配列は、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14:のいずれか1つに対して少なくとも95％の同一性を有する。別の実施態様において、VP1アミノ酸配列は、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14:のいずれか1つに対して少なくとも98％の同一性を有する。別の実施態様において、VP1アミノ酸配列は、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14:のいずれか1つに対して少なくとも99％の同一性を有する。具体的な実施態様において、VP1アミノ酸配列は、表2に掲載されているアミノ酸修飾のうちの1つ又は複数を含む。具体的な実施態様において、VP1アミノ酸配列修飾は、表2に掲載されているものに限定される。具体的な実施態様において、AAVクレードメンバーは、インビトロアッセイで決定されるAAV液性免疫を回避する能力をさらに含む。具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、パーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該％形質導入は、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、中和抗体(Nab)力価を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NAb力価は、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、NC50を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NC50は、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、可変領域アミノ酸配列を有するVP1アミノ酸配列:を含み、ここで、該可変領域アミノ酸配列が配列番号6～78及び193:のいずれか1つにおける可変領域アミノ酸配列に対する実質的な配列類似性又は同一性を有する、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバーである。一実施態様において、可変領域アミノ酸配列は、VRI～VRIXのいずれか1つ、GBS領域、もしくはGHループ、又はこれらの組合せから選択される。ある実施態様において、VRI～VRIXの配列のいずれか1つは、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVRI～VRIXのいずれか1つに対して少なくとも90％の配列類似性又は同一性を有する。いくつかの実施態様において、GBS領域配列は、配列番号6～78及び193のいずれか1つのGBS領域に対して少なくとも90％の配列類似性又は同一性を有する。ある実施態様において、GHループ配列は、配列番号6～78及び193のいずれか1つのGHループに対して少なくとも90％の配列類似性又は同一性を有する。具体的な実施態様において、AAVクレードメンバーは、インビトロアッセイで決定されるAAV液性免疫を回避する能力をさらに含む。具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、パーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該％形質導入は、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、中和抗体(Nab)力価を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NAb力価は、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、NC50を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NC50は、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、近隣結合法によって決定したとき、第二のVP1アミノ酸配列と系統発生的に関連している第一のVP1アミノ酸配列:を含み、ここで、該第一のVP1アミノ酸配列が、該第二のVP1アミノ酸配列に対して、表3に提供されるような遺伝的距離を有する、AAVクレードのメンバーである。一実施態様において、遺伝的距離は、表3に提供されるような同じAAVクレード内の平均遺伝的距離である。別の実施態様において、遺伝的距離は、表3に提供されるような、同じクレード内の約最小遺伝的距離から同じクレード内の約最大遺伝的距離までの範囲である。ある実施態様において、第二のVP1アミノ酸配列は、配列番号1～96及び193:のいずれか1つのVP1アミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、AAVクレードメンバーは、インビトロアッセイで決定されるAAV液性免疫を回避する能力をさらに含む。具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、パーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該％形質導入は、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、中和抗体(Nab)力価を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NAb力価は、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、NC50を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NC50は、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、近隣結合法によって決定したとき、第二のVP1アミノ酸配列と系統発生的に関連している第一のVP1アミノ酸配列:を含み、ここで、該第一のVP1アミノ酸配列が、該第二のVP1アミノ酸配列に対して、表3に提供されるような遺伝的距離を有する、AAV分岐のメンバーである。一実施態様において、遺伝的距離は、表3に提供されるような同じ分岐内の平均遺伝的距離である。別の実施態様において、遺伝的距離は、表3に提供されるような、同じ分岐内の約最小遺伝的距離から同じ分岐内の約最大遺伝的距離までの範囲である。ある実施態様において、第二のVP1アミノ酸配列は、配列番号1～96及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、AAV分岐メンバーは、インビトロアッセイで決定されるAAV液性免疫を回避する能力をさらに含む。具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、パーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該％形質導入は、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、中和抗体(Nab)力価を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NAb力価は、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、NC50を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NC50は、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも91％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも91％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列に対して少なくとも91％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも92％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも92％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列に対して少なくとも92％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも93％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも93％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列に対して少なくとも93％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも94％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも94％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列に対して少なくとも94％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質である。いくつかの実施態様において、表9に示されているアミノ酸は、下の実施例の節で論じられているものである。いくつかの実施態様において、表9に示されているアミノ酸配列は、BCD_0388、BCD_0132、BCD_0147、又はBCD_0202である。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも96％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも96％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列に対して少なくとも96％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも97％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも97％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列に対して少なくとも97％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列に対して少なくとも99％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも99％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列に対して少なくとも99％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているVP1アミノ酸配列を含むVP1アミノ酸配列、(b)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP2アミノ酸配列を含むVP2アミノ酸配列、又は(c)「BCD_」という接頭辞によって特定される表9に示されているアミノ酸配列のVP3アミノ酸配列を含むVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質である。いくつかの実施態様において、表9に示されているアミノ酸は、下の実施例の節で論じられているものである。いくつかの実施態様において、表9に示されているアミノ酸配列は、BCD_0388、BCD_0132、BCD_0147、又はBCD_0202である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質である。一実施態様において、AAVカプシドタンパク質は、(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む。別の実施態様において、AAVカプシドタンパク質は、(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む。別の実施態様において、AAVカプシドタンパク質は、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列であるVP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列を含む。ある実施態様において、VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列は、可変領域アミノ酸配列を含み、ここで、該可変領域アミノ酸配列は、配列番号6～78及び193:のいずれか1つのVRI～VRIXである。具体的な実施態様において、VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列は、GBS領域アミノ酸配列を含み、ここで、該GBS領域アミノ酸配列は、配列番号6～78及び193:のいずれか1つのGBS領域である。別の具体的な実施態様において、VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列は、GHループアミノ酸配列を含み、ここで、該GHループアミノ酸配列は、配列番号6～78及び193:のいずれか1つから選択されるGHループである。具体的な実施態様において、AAVカプシドタンパク質は、インビトロアッセイによって決定されるAAV液性免疫を回避する能力をさらに含む。具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、パーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該％形質導入は、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、NC50を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NAb力価は、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、NC50を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NC50は、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号4～57及び137～142のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号4～57及び137～142のいずれか1つのVP2配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)配列番号4～57及び137～142のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含み、ここで、該VP1アミノ酸配列、VP2アミノ酸配列、又はVP3アミノ酸配列の1以上の可変領域が、該VP1アミノ酸配列、VP2アミノ酸配列、又はVP3アミノ酸配列が90％の同一性を有するアミノ酸配列の1以上の可変領域と同一である、AAVカプシドタンパク質である。一実施態様において、AAVカプシドタンパク質は、(a)配列番号4～57及び137～142のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号4～57及び137～142のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、及び(c)配列番号4～57及び137～142のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含み、ここで、該VP1アミノ酸配列、VP2アミノ酸配列、又はVP3アミノ酸配列の1以上の可変領域は、該VP1アミノ酸配列、VP2アミノ酸配列、又はVP3アミノ酸配列が95％の同一性を有するアミノ酸配列の1以上の可変領域と同一である。別の実施態様において、AAVカプシドタンパク質は、(a)配列番号4～57及び137～142のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号4～57及び137～142のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、及び(c)配列番号4～57及び137～142のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含み、ここで、該VP1アミノ酸配列、VP2アミノ酸配列、又はVP3アミノ酸配列の1以上の可変領域は、該VP1アミノ酸配列、VP2アミノ酸配列、又はVP3アミノ酸配列が98％の同一性を有するアミノ酸配列の1以上の可変領域と同一である。いくつかの実施態様において、1以上の可変領域は、VRI～VRIXのうちの1つ又は複数である。いくつかの実施態様において、1以上の可変領域は、VRI～VRIXのうちの2つ、3つ、4つ、5つ、又はそれより多くである。いくつかの実施態様において、1以上の可変領域は、VRI～VRIXのうちの6つ、7つ、又は8つである。いくつかの実施態様において、1以上の可変領域は、VRI～VRIXである。いくつかの実施態様において、1以上の可変領域は、GBS領域である。いくつかの実施態様において、1以上の可変領域は、GHループである。いくつかの実施態様において、1以上の可変領域は、GBS領域及びGHループである。いくつかの実施態様において、1以上の可変領域は、VRI～VRIXのうちの1つ又は複数、及びGBS領域である。いくつかの実施態様において、1以上の可変領域は、VRI～VRIXのうちの1つ又は複数、及びGHループである。いくつかの実施態様において、1以上の可変領域は、VRI～VRIXのうちの1つ又は複数、GBSループ、及びGHループである。具体的な実施態様において、AAVカプシドタンパク質は、インビトロアッセイによって決定されるAAV液性免疫を回避する能力を含む。具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、パーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該％形質導入は、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、NC50を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NAb力価は、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、NC50を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NC50は、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるAAVカプシドタンパク質は、VP1アミノ酸配列、VP2アミノ酸配列、及びVP3アミノ酸配列を含む。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるAAVクレードメンバー、本明細書に記載されるAAV分岐メンバー、又は本明細書に記載されるAAVカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。具体的な実施態様において、AAVクレードメンバー、AAV分岐メンバー、又はAAVカプシドタンパク質は、「BCD_」という接頭辞を付して本明細書(例えば、表9)に提供されるカプシドタンパク質のVP1アミノ酸配列、VP2アミノ酸配列、又はVP3アミノ酸配列のVP1アミノ酸配列、VP2アミノ酸配列、又はVP3アミノ酸配列である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるAAVクレードメンバー、本明細書に記載されるAAV分岐メンバー、又は本明細書に記載されるAAVカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターである。具体的な実施態様において、ベクターは、宿主細胞におけるカプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列をさらに含む。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)本明細書に記載されるAAVクレードメンバーのVP1アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び(b)宿主細胞におけるカプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列:を含むベクターである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)本明細書に記載されるAAV分岐メンバーのVP1アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び(b)宿主細胞におけるカプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列:を含む、ベクターである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列;並びに(b)宿主細胞におけるカプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列:を含む、ベクターである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3に対して少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％の同一性を有するVP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列;並びに(b)宿主細胞におけるカプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列:を含む、ベクターである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3に対して少なくとも95％の同一性を有するVP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列;並びに(b)宿主細胞におけるカプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列:を含む、ベクターである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3に対して少なくとも98％の同一性を有するVP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列;並びに(b)宿主細胞におけるカプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列:を含む、ベクターである。ある実施態様において、ベクターは、宿主細胞におけるカプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子をさらに含む。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるVP1、VP2、もしくはVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるVP1、VP2、もしくはVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は本明細書に記載されるベクターを含むインビトロ又はエクスビボの宿主細胞である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるAAVクレードメンバー、AAV分岐メンバー、又は本明細書に記載されるAAVカプシドタンパク質を含むAAVウイルス粒子である。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)カプシド(ここで、該カプシドは、本明細書に記載されるAAVクレードメンバーのVP1アミノ酸配列を含む);及び(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノム:を含む、組換えAAVウイルス粒子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)カプシド(ここで、該カプシドは、本明細書に記載されるAAV分岐メンバーのVP1アミノ酸配列を含む);及び(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノム:を含む、組換えAAVウイルス粒子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)本明細書に記載されるAAVカプシドタンパク質;及び(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノム:を含む、組換えAAVウイルス粒子である。いくつかの実施態様において、組換えAAVウイルス粒子は、(a)カプシド(ここで、該カプシドは、本明細書に記載されるAAVクレードメンバーのVP1アミノ酸配列、VP2アミノ酸配列、又はVP3アミノ酸配列を含む);及び(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノムを含む。具体的な実施態様において、組換えAAVウイルス粒子は、(a)カプシド(ここで、該カプシドは、本明細書に記載されるAAVクレードメンバーのVP1アミノ酸配列、VP2アミノ酸配列、及びVP3アミノ酸配列を含む);並びに(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノムを含む。具体的な実施態様において、rAAVベクターゲノムは、AAV逆向き末端反復又はその断片を含む。具体的な実施態様において、AAV逆向き末端反復は、表4から選択される5'AAV逆向き末端反復である。別の具体的な実施態様において、AAV逆向き末端反復は、表4から選択される3'AAV逆向き末端反復である。ある実施態様において、rAAVベクターゲノムは、5'AAV逆向き末端反復又はその断片、及び3'AAV末端反復又はその断片を含む。具体的な実施態様において、5'AAV逆向き末端反復及び3'AAV逆向き末端反復は、それぞれ、表4に提供される5'AAV末端反復及び3'AAV末端反復から選択される。ある実施態様において、生体分子は、治療的タンパク質、酵素、ペプチド、RNA、CRISPR遺伝子編集系の構成要素、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)、AON媒介性エキソンスキッピング、ポイゾンエキソン、又はドミナントネガティブ突然変異体タンパク質から選択される。いくつかの実施態様において、治療的タンパク質は、対象の筋肉、心臓、脳、血漿、腎臓、肝臓、耳、又は癌細胞のうちの1つ又は複数で内在性に発現される。具体的な実施態様において、治療的タンパク質は、内在性に発現されたタンパク質の機能的バージョンである。ある実施態様において、組換えAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、筋肉細胞に対する増強された指向性を有する。いくつかの実施態様において、組換えAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、心臓細胞に対する増強された指向性を有する。ある実施態様において、組換えAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、脳細胞に対する増強された指向性を有する。いくつかの実施態様において、組換えAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、形質細胞に対する増強された指向性を有する。ある実施態様において、組換えAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、腎臓細胞に対する増強された指向性を有する。いくつかの実施態様において、組換えAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、肝臓細胞に対する増強された指向性を有する。ある実施態様において、組換えAAVウイルス粒子は、該rAAVが増強された指向性を有する細胞以外の対象の細胞を標的から外す。具体的な実施態様において、標的から外される細胞は、筋肉細胞、心臓細胞、脳細胞、形質細胞、腎臓細胞、又は肝臓細胞のうちの1つ又は複数から選択される。具体的な実施態様において、組換えAAVウイルス粒子は、インビトロアッセイによって決定されるAAV液性免疫を回避する能力を有する。具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、パーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該％形質導入は、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、NC50を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NAb力価は、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している。別の具体的な実施態様において、インビトロアッセイは、NC50を決定するIVIgアッセイであり、ここで、該NC50は、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えAAVウイルス粒子を含むインビトロの細胞又は組織である。別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えAAVウイルス粒子を含むエクスビボの細胞又は組織である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるAAVカプシドタンパク質をコードする組換え核酸分子を含む培養宿主細胞である。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1タンパク質を含む配列;又は(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1カプシドタンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列:を含むAAV VP1カプシドタンパク質をコードする組換え核酸分子を含み、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP2タンパク質を含む配列;又は(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP2カプシドタンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列:を含むAAV VP2カプシドタンパク質をコードする組換え核酸分子を含み、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP3タンパク質を含む配列;又は(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP3カプシドタンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列:を含むAAV VP3カプシドタンパク質をコードする組換え核酸分子を含み、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞である。具体的な実施態様において、配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質中で様々に変化するアミノ酸残基は、表2から選択される。具体的な実施態様において、異種配列は、AAVカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して異種である異種ヌクレオチド配列である。具体的な実施態様において、異種配列は、AAVカプシドタンパク質に対して異種であるアミノ酸配列をコードする、異種ヌクレオチド配列である。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長AAV VP1カプシドタンパク質のヌクレオチド;又は(b)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長VP1カプシドタンパク質のヌクレオチドに対して少なくとも95％同一の配列:を含む組換え核酸分子を含有し、ここで、該組換え核酸分子が異種ヌクレオチド配列をさらに含む、培養宿主細胞である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長AAV VP2カプシドタンパク質のヌクレオチド;又は(b)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長VP2カプシドタンパク質のヌクレオチド配列に対して少なくとも95％同一のヌクレオチド配列:を含む組換え核酸分子を含有し、ここで、該組換え核酸分子が異種ヌクレオチド配列をさらに含む、培養宿主細胞である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長AAV VP3カプシドタンパク質のヌクレオチド;又は配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長VP3カプシドタンパク質のヌクレオチド配列に対して少なくとも95％同一のヌクレオチド配列:を含む組換え核酸分子を含有し、ここで、該組換え核酸分子が異種ヌクレオチド配列をさらに含む、培養宿主細胞である。具体的な実施態様において、配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質中で様々に変化するアミノ酸残基は、表2の様々に変化するアミノ酸残基をコードするヌクレオチドから選択される。具体的な実施態様において、異種配列は、AAVカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して異種である異種ヌクレオチド配列である。具体的な実施態様において、異種配列は、AAVカプシドタンパク質に対して異種であるアミノ酸配列をコードする異種ヌクレオチド配列である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えAAVウイルス粒子を含む組成物である。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)本明細書に記載される組換えAAVウイルス粒子;及び(b)生理学的に許容し得る担体:を含む、組成物である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、生体分子をインビトロの細胞に送達する方法であって、該細胞を本明細書に記載される組換えAAVウイルス粒子で形質導入すること:を含む、方法である。いくつかの実施態様において、細胞は、筋肉細胞、心臓細胞、脳細胞、形質細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、耳細胞、又は癌細胞のうちの1つ又は複数である。ある実施態様において、細胞は、筋肉細胞、心臓細胞、脳細胞、形質細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、又は癌細胞のうちの1つ又は複数である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、生体分子をエクスビボの細胞に送達する方法であって、該細胞を本明細書に記載される組換えAAVウイルス粒子で形質導入すること:を含む、方法である。いくつかの実施態様において、細胞は、筋肉細胞、心臓細胞、脳細胞、形質細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、耳細胞、又は癌細胞のうちの1つ又は複数である。ある実施態様において、細胞は、筋肉細胞、心臓細胞、脳細胞、形質細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、又は癌細胞のうちの1つ又は複数である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、生体分子を対象の細胞に送達する方法であって、本明細書に記載される組換えAAVウイルス粒子を該対象の細胞に投与すること:を含む、方法である。いくつかの実施態様において、細胞は、筋肉細胞、心臓細胞、脳細胞、形質細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、耳細胞、又は癌細胞のうちの1つ又は複数である。ある実施態様において、細胞は、筋肉細胞、心臓細胞、脳細胞、形質細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、又は癌細胞のうちの1つ又は複数である。ある実施態様において、対象は、ヒト対象である。他の実施態様において、対象は、非ヒト対象である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、疾患又は障害を治療する方法であって、本明細書に記載される組換えAAVウイルス粒子を対象に投与することを含む、方法である。ある実施態様において、対象は、ヒト対象である。他の実施態様において、対象は、非ヒト対象である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えAAVウイルス粒子を産生する方法である。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、組換えAAVウイルス(rAAV)粒子を産生する方法であって、rAAVウイルス粒子を生成させるための1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムを含む宿主細胞を培養することを:を含み、ここで、該1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムが本明細書に記載されるAAVカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、方法である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、rAAVウイルス粒子を産生する方法であって、rAAVウイルス粒子を生成させるための1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムを含む宿主細胞:を培養することを含み、ここで、該1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムが本明細書に記載されるAAVクレードメンバーのVP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、方法である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、rAAVウイルス粒子を産生する方法であって、rAAVウイルス粒子を生成させるための1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムを含む宿主細胞:を培養することを含み、ここで、該1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムが本明細書に記載されるAAV分岐メンバーのVP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、方法である。ある実施態様において、1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムは、rAAVウイルス粒子を生成させるために宿主細胞によって使用されるヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、該ヌクレオチド配列は、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結されている。いくつかの実施態様において、培養する工程の前に、宿主細胞は、1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムでトランスフェクトされる。ある実施態様において、rAAVウイルス粒子は、宿主細胞から単離される。
(5.図面の簡単な説明)
図1は、新規AAVカプシド配列を発見及び/又は産生するために使用されたアプローチの概略を示している。
(6.詳細な説明)
(6.1 全体的な概要)
本開示は、新規AAVカプシド配列(核酸及びアミノ酸配列)並びにその機能断片を提供する。また本明細書に提供されるのは、以前に記載されているAAVベースのベクターよりも改善された機能的特徴を提供する、生物医学的用途、例えば、遺伝子療法におけるAAVベースのベクターのより幅広い使用のための新規AAV分離株、クレード、及び分岐である。
(6.1 全体的な概要)
本開示は、新規AAVカプシド配列(核酸及びアミノ酸配列)並びにその機能断片を提供する。また本明細書に提供されるのは、以前に記載されているAAVベースのベクターよりも改善された機能的特徴を提供する、生物医学的用途、例えば、遺伝子療法におけるAAVベースのベクターのより幅広い使用のための新規AAV分離株、クレード、及び分岐である。
本開示はまた、rAAVウイルス粒子、ベクター、rAAVベクターゲノムコンストラクト、宿主細胞、及び医薬組成物を提供する。新規AAVカプシドベースのベクター及び/又はrAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、増強されたAAV液性免疫の回避、増強された指向性、増強された細胞形質導入、及び/又は増強された導入遺伝子発現を提供する。
また本明細書に提供されるのは、生体分子(例えば、治療的生体分子)の送達方法である。いくつかの実施態様において、本方法は、インビボ、インビトロ、又はエクスビボ送達である。いくつかの実施態様において、本方法は、生体分子(例えば、治療的生体分子)を1以上の細胞に、特に、増強された送達/指向性を筋肉細胞、心臓細胞、肝臓細胞、形質細胞、腎臓細胞、脳細胞、及び/又は癌細胞に送達すると同時に、他の細胞を標的から外す。
本開示はまた、本明細書に提供される新規AAVカプシド配列/機能断片、rAAVベクターゲノムコンストラクト、rAAV粒子、宿主細胞、又は医薬組成物のいずれかを必要としている対象に投与することを含む治療方法を提供する。該治療方法は、筋肉、心臓、肝臓、血漿、腎臓、脳、又は/及び癌細胞への送達によって治療することができる疾患又は障害に使用することができる。
さらに本明細書に提供されるのは、本開示の新規rAAVウイルス粒子を製造し、かつ新規rAAVウイルス粒子を用いて生体分子(例えば、治療的生体分子)を産生する方法である。
(6.2 定義)
具体的に明記されないか又は文脈から明白でない限り、本明細書で使用される場合、「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」という用語は、単数又は複数であることが理解される。
具体的に明記されないか又は文脈から明白でない限り、本明細書で使用される場合、「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」という用語は、単数又は複数であることが理解される。
別途具体的に指示されない限り、「含む」又は「などの」という用語及び同類のものは、限定するものではないが、包含を伝達することが意図される。
「又は(or)」及び「及び(and)」という用語は、互換的に使用することができ、かつ「及び/又は(and/or)」を意味するものと理解することができる。
「約」という用語は、当技術分野における正規許容の範囲内、例えば、平均の2標準偏差以内と理解される。約は、明記された値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、又は0.01％以内と理解することができる。別途文脈から明らかでない限り、本明細書に提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
本明細書で使用される場合、「異種遺伝子」又は「異種調節配列」という用語は、言及された遺伝子又は調節配列がAAVベクター又は粒子中に天然には存在せず、その中に人工的に導入されたものであることを意味する。
「異種導入遺伝子」又は「導入遺伝子」という用語は、異種遺伝子と宿主細胞におけるその遺伝子の発現を制御する異種遺伝子に機能的に連結されている異種調節配列の両方を含む核酸を指す。本明細書中の導入遺伝子は、生体分子(例えば、治療的生体分子)、例えば、タンパク質(例えば、酵素)、ポリペプチド、ペプチド、RNA(例えば、tRNA、dsRNA、リボソームRNA、触媒RNA、siRNA、miRNA、プレ-miRNA、lncRNA、snoRNA、小ヘアピンRNA、トランス-サイレンシングRNA、及びアンチセンスRNA)、遺伝子もしくは塩基編集系、例えば、CRISPR遺伝子編集系の1以上の構成要素、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)媒介性エキソンスキッピング、ナンセンス媒介性分解(NMD)を誘発するポイゾンエキソン、又はドミナントネガティブ突然変異体をコードすることができることが企図される。
「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと関連しているときに複製することができ、かつ細胞間で遺伝子配列を転移することができる、任意の遺伝的エレメント、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、バクミド、ミニプラスミド(例えば、細菌エレメントを欠くプラスミド)、Doggybone DNA(例えば、最小の閉線状コンストラクト)、染色体、ウイルス、ビリオン(例えば、バキュロウイルス)などを指すことが理解される。
「AAVベクターゲノム」又は「rAAVベクターゲノム」は、AAVウイルスゲノムに対して異種である転写調節エレメント、例えば、1以上のプロモーター及び/又はエンハンサー並びに任意に、ポリアデニル化配列及び/又はタンパク質コード配列のエキソン間に挿入される1以上のイントロンに機能的に連結された生体分子(例えば、治療的生体分子)又は導入遺伝子に隣接するAAV逆向き末端反復(ITR)(例えば、AAV 5'逆向き末端反復(ITR)配列及びAAV 3'ITR)を含む、一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸を指す。一本鎖AAVベクターゲノムは、AAVウイルス粒子のゲノム中に存在し、かつ本明細書に開示される核酸配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかであることができる核酸を指す。そのような一本鎖核酸のサイズは、塩基の単位で提供される。二本鎖AAVベクターゲノムは、AAVベクターゲノム核酸を発現させるか又は転移するために使用される二本鎖ベクター又はウイルス、例えば、バキュロウイルスによって提供されることができる。そのような二本鎖核酸のサイズは、塩基対(bp)の単位で提供される。具体的な実施態様において、AAVベクターゲノムは、組換えAAVベクターゲノムである。
本明細書で使用される「AAV rep遺伝子」又は「rep」は、ウイルスゲノムを複製するために及び不顕性感染中にウイルスゲノムを宿主ゲノムに挿入するために必要とされるウイルスの複製タンパク質をコードするAAVゲノムの当技術分野で認識されている領域を指す。AAV repコード領域のさらなる説明については、例えば、その開示が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、Muzyczkaらの文献、Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129(1992); Kotinらの文献、Human Gene Therapy 5:793-801(1994)を参照されたい。本明細書で使用されるrepコード領域は、本明細書に記載されるAAV血清型などの任意のウイルス血清型に由来することができる。この領域は、AAV血清型の野生型遺伝子の全てを含む必要はなく、rep遺伝子が、好適なレシピエント細胞で発現されたときに、所望の機能的特徴(例えば、感染時にウイルスゲノム複製及びパッケージングを提供する能力)を保持する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、及び/又は置換によって改変されていてもよい。
本明細書で使用される「AAV cap遺伝子」又は「cap」は、ウイルスゲノムのパッケージングに必要とされるウイルスのコートタンパク質をコードするAAVゲノムの当技術分野で認識されている領域を指す。capコード領域のさらなる説明については、例えば、その開示が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、Muzyczkaらの文献、Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129(1992); Kotinらの文献、Human Gene Therapy 5:793-801(1994)を参照されたい。本明細書で使用されるAAVキャップコード領域は、本明細書に記載される任意のAAV血清型に由来することができる。この領域は、AAV血清型の野生型cap遺伝子の全てを含む必要はなく、遺伝子がAAVベクターとともに宿主細胞に存在するときに十分なパッケージング機能を提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換によって改変されていてもよい。
「AAVビリオン」又は「AAVウイルス粒子」又は「AAV粒子」又は「AAVベクター粒子」又は「AAVウイルス」は、少なくとも1つのAAVカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、もしくはVP3、又はこれらの組合せ)から構成されるウイルス粒子を指す。具体的な実施態様において、「AAVビリオン」又は「AAVウイルス粒子」又は「AAVベクター粒子」又は「AAVウイルス」は、少なくとも1つのAAVカプシドタンパク質及びカプシド化されたポリヌクレオチドAAVベクターゲノムから構成されるウイルスを指す。粒子が異種ヌクレオチド配列(例えば、AAVベクターゲノム)(すなわち、野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳動物細胞に送達されることになる導入遺伝子)を含む場合、それは、通常、「AAVベクター粒子」と呼ばれる。したがって、AAVベクター粒子の産生は、AAVベクターゲノムの産生を必然的に含むが、それは、そのようなベクターゲノムがAAVベクター粒子内に含まれるためである。具体的な実施態様において、AAVウイルス粒子は、組換えAAVウイルス粒子である。
「可変領域」又は「VR」又は「VRs」は、カプシドウイルスタンパク質(「VP」、VP1、VP2、又はVP3)内で様々に変化し、かつ保存されたコア構造の一部ではないアミノ酸領域を指す。通常、可変領域は、カプシドウイルスタンパク質内の表面ループ立体構造を含有する。VRは、AAVカプシド配列内で最も高い配列及び構造変異を示し、また、受容体付着、導入遺伝子の転写活性化、組織形質導入、及び抗原性において役割を有し得る。表8は、可変領域VRI～VRIX、GBS領域、及びGHループの例を提供している。ある実施態様において、これらの領域のN-末端及び/又はC-末端の位置は、本明細書(特に、表8)に明示的に記載されているように、これらの領域のアミノ酸位置から最大1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、又は5アミノ酸だけ異なり得る。
「グリカン結合配列(GBS)」又は「GBSドメイン」又は「GBS領域」は、ウイルスカプシドのグリカン結合特異性を支配するVR IVとVR Vの間に位置するアミノ酸配列を指す。様々なAAV VP1アミノ酸配列におけるGBS領域の位置は、本明細書に記載されており、他のAAV VP1アミノ酸配列由来のものは、当技術分野で公知であり、かつ/又は日常的に同定することができる。表8は、GBS領域の例を提供している。ある実施態様において、GBS領域のN-末端及び/又はC-末端の位置は、本明細書(特に、表8)に明示的に記載されているように、GBS領域のアミノ酸位置から最大1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、又は5アミノ酸だけ異なり得る。
「GHループ」という用語は、カプシドタンパク質の内部β-バレル内でβ-鎖Gとβ-鎖Hが隣接しているループ配列を指す。「GHループ」配列は、包含されるGBS配列及びドナー由来の全ての散在する保存された骨格配列を含め、可変領域VR IVからVR VIIIまでを含む。様々なAAV VP1アミノ酸配列におけるGHループ領域の位置は、本明細書に記載されており、他のAAV VP1アミノ酸配列由来のものは、日常的に同定することができる。表8は、GHループの例を提供している。ある実施態様において、GHループのN-末端及び/又はC-末端の位置は、本明細書(特に、表8)に明示的に記載されているように、GHループのアミノ酸位置から最大1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、又は5アミノ酸だけ異なり得る。
当業者に公知の技法を、2つのアミノ酸配列間又は2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを決定するために使用することができる。通常、2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を最適比較目的で整列させる(例えば、第二のアミノ酸配列又は核酸配列との最適なアラインメントのために、第一のアミノ酸配列又は核酸配列の配列にギャップを導入することができる)。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列中のある位置が第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、これらの配列によって共有される同一位置の数の関数である(すなわち、同一性％＝重複する同一位置の数/位置の総数×100％)。一実施態様において、2つの配列は、同じ長さである。ある実施態様において、同一性パーセントは、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の全長にわたって決定される。いくつかの実施態様において、配列同一性比較の長さは、比較されている2つの配列の全長にわたるものであってもよく、遺伝子コード配列の全長、又は少なくとも約500～5000ヌクレオチドの断片が望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約9ヌクレオチド、通常、少なくとも約20～24ヌクレオチド、少なくとも約28～32ヌクレオチド、少なくとも約36ヌクレオチド以上のより小さい断片間の同一性が望ましい場合もある。同様に、「配列同一性パーセント」を、アミノ酸配列について、タンパク質の全長、又はその断片にわたって容易に決定することができる。具体的な実施態様において、断片は、少なくとも約8アミノ酸の長さであり、かつ最大約700アミノ酸であり得る。好適な機能的断片の例は、本明細書(例えば、下の第6.3.1.3節)に記載されている。
2つの配列(例えば、アミノ酸配列又は核酸配列)間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin及びAltschul文献、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268をKarlin及びAltschulの文献、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877のように修正した、アルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschulらの文献、1990, J. Mol. Biol. 215:403のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み入れられている。BLASTヌクレオチド検索を、例えば、スコア＝100、ワード長＝12に設定されたNBLASTヌクレオチドプログラムパラメータを用いて実施して、本明細書に記載される核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、例えば、スコア50、ワード長＝3に設定されたXBLASTプログラムパラメータを用いて実施して、本明細書に記載されるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップアラインメントを得るために、ギャップBLASTをAltschulらの文献、1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402に記載されているように利用することができる。或いは、PSI BLASTを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる(同上)。BLAST、ギャップBLAST、及びPSI Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの(例えば、XBLAST及びNBLASTの)デフォルトパラメータを使用することができる(例えば、ワールドワイドウェブ上の米国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)、ncbi.nlm.nih.govを参照)。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers及びMillerの文献、1988, CABIOS 4:11 17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み入れられている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12、及びギャップペナルティ4を使用することができる。
2つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容するかしないかを問わず、上記のものと同様の技法を用いて決定することができる。同一性パーセントの計算においては、通常、完全一致のみがカウントされる。
具体的な実施態様において、少なくとも2つの配列(例えば、アミノ酸配列又は核酸配列)間の同一性パーセントは、ClustalWを用いて達成される。ある具体的な実施態様において、コストマトリックスBLOSUM、ギャップオープンコスト10、及びギャップ伸長コスト0.1のClustalWが、少なくとも2つの配列(例えば、アミノ酸配列又は核酸配列)間の同一性パーセントを決定するために使用される。
アミノ酸又はその断片に言及する場合の「実質的な同一性」という用語は、適切なアミノ酸の挿入又は欠失を伴って、別のアミノ酸(又はその相補鎖)と最適に整列させたときに、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)を用いて、整列した配列の少なくとも約90～99％においてアミノ酸配列の同一性があることを示す。好ましくは、同一性は、比較されている2つの配列の全長、又は少なくとも8アミノ酸、より望ましくは、少なくとも15アミノ酸の長さのその断片にわたるものである。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの「断片」は、少なくとも8アミノ酸の長さの配列を指す。具体的な実施態様において、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの断片は、少なくとも約15アミノ酸の長さ、少なくとも約18アミノ酸の長さ、少なくとも約20アミノ酸の長さ、少なくとも約25アミノ酸の長さ、少なくとも約30アミノ酸の長さ、少なくとも約35アミノ酸の長さ、少なくとも約40アミノ酸の長さ、少なくとも約18アミノ酸の長さ、少なくとも約45アミノ酸の長さ、少なくとも約50アミノ酸の長さ、少なくとも約55アミノ酸の長さ、又は少なくとも約60アミノ酸の長さである。具体的な実施態様において、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの断片は、少なくとも約65アミノ酸の長さ、少なくとも約70アミノ酸の長さ、少なくとも約80アミノ酸の長さ、少なくとも約85アミノ酸の長さ、少なくとも約90アミノ酸の長さ、少なくとも約95アミノ酸の長さ、少なくとも約100アミノ酸の長さ、少なくとも約105アミノ酸の長さ、少なくとも約110アミノ酸の長さ、少なくとも約115アミノ酸の長さ、少なくとも約120アミノ酸の長さ、又は少なくとも約125アミノ酸の長さである。具体的な実施態様において、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの断片は、少なくとも約150アミノ酸の長さ、少なくとも約200アミノ酸の長さ、少なくとも約250アミノ酸の長さ、少なくとも約300アミノ酸の長さ、少なくとも約350アミノ酸の長さ、少なくとも約400アミノ酸の長さ、少なくとも約450アミノ酸の長さ、少なくとも約500アミノ酸の長さ、少なくとも約550アミノ酸の長さ、又は少なくとも約600アミノ酸の長さである。具体的な実施態様において、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの断片は、約9～約25アミノ酸の長さ、約15～約25アミノ酸の長さ、約20～約50アミノ酸の長さ、約25～約50アミノ酸の長さ、約50～約75アミノ酸の長さ、約50～約100アミノ酸の長さ、又は約75～約100アミノ酸の長さである。具体的な実施態様において、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの断片は、約100～約150アミノ酸の長さ、約100～約200アミノ酸の長さ、約150～約200アミノ酸の長さ、約150～約300アミノ酸の長さ、約200～約300アミノ酸の長さ、約250～約300アミノ酸の長さ、又は約300～約400アミノ酸の長さである。具体的な実施態様において、断片は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの連続するアミノ酸残基の一部を含む。
核酸配列の断片は、少なくとも9ヌクレオチドの長さの配列を指す。具体的な実施態様において、核酸配列の断片は、少なくとも約15ヌクレオチドの長さ、少なくとも約18ヌクレオチドの長さ、少なくとも約20ヌクレオチドの長さ、少なくとも約25ヌクレオチドの長さ、少なくとも約30ヌクレオチドの長さ、少なくとも約35ヌクレオチドの長さ、少なくとも約40ヌクレオチドの長さ、少なくとも約18ヌクレオチドの長さ、少なくとも約45ヌクレオチドの長さ、少なくとも約50ヌクレオチドの長さ、少なくとも約55ヌクレオチドの長さ、又は少なくとも約60ヌクレオチドの長さである。具体的な実施態様において、核酸配列の断片は、少なくとも約65ヌクレオチドの長さ、少なくとも約70ヌクレオチドの長さ、少なくとも約80ヌクレオチドの長さ、少なくとも約85ヌクレオチドの長さ、少なくとも約90ヌクレオチドの長さ、少なくとも約95ヌクレオチドの長さ、少なくとも約100ヌクレオチドの長さ、少なくとも約105ヌクレオチドの長さ、少なくとも約110ヌクレオチドの長さ、少なくとも約115ヌクレオチドの長さ、少なくとも約120ヌクレオチドの長さ、又は少なくとも約125ヌクレオチドの長さである。具体的な実施態様において、核酸配列の断片は、少なくとも約150ヌクレオチドの長さ、少なくとも約200ヌクレオチドの長さ、少なくとも約250ヌクレオチドの長さ、少なくとも約300ヌクレオチドの長さ、少なくとも約350ヌクレオチドの長さ、少なくとも約400ヌクレオチドの長さ、少なくとも約450ヌクレオチドの長さ、少なくとも約500ヌクレオチドの長さ、少なくとも約550ヌクレオチドの長さ、又は少なくとも約600ヌクレオチドの長さである。具体的な実施態様において、核酸配列の断片は、約9～約25ヌクレオチドの長さ、約15～約25ヌクレオチドの長さ、約20～約50ヌクレオチドの長さ、約25～約50ヌクレオチドの長さ、約50～約75アミノ酸の長さ、約50～約100アミノ酸の長さ、又は約75～約100アミノ酸の長さである。具体的な実施態様において、核酸配列の断片は、約100～約150アミノ酸の長さ、約100～約200アミノ酸の長さ、約150～約200アミノ酸の長さ、約150～約300アミノ酸の長さ、約200～約300アミノ酸の長さ、約250～約300アミノ酸の長さ、又は約300～約400アミノ酸の長さである。具体的な実施態様において、断片は、核酸配列の連続するヌクレオチドの一部を含む。
内在性核酸又はタンパク質との関連における「機能的バージョン」という用語は、それが、培養細胞で発現させた場合にはインビトロで、又は細胞もしくは身体組織で発現させた場合にはインビボで、参照核酸配列又はタンパク質の機能を有することを意味する。例えば、タンパク質の機能的バージョンは、内在性タンパク質の1つ、2つ、3つ、又はそれより多くの機能を保持することができる。特定の例において、酵素の機能的バージョンは、細胞又は器官において、その酵素活性、タンパク質結合/シグナル伝達、輸送、又は構造的特性を保持するであろう。別の例において、機能的バージョンは、コドン最適化された遺伝子、目的の機能に必要とされないイントロン又はコドンなどの遺伝子のセグメントを除去しているミニ遺伝子であることもできる。
「AAVクレード」又は「クレード」という用語は、そのカプシドウイルスタンパク質(VP1、VP2、及び/又はVP3)の1以上の共通の構造的特徴、例えば、第6.3.2.1節～第6.3.2.4節に提供されているものによって定義されるAAV分離株のグループを意味する。AAVクレードは、指向性又はAAV液性免疫を回避する能力などの1以上の共通の機能的特徴によってさらに定義することができる。或いは、例えば、クレードを、Gaoらの文献、J Virol.(2004) Jun;78(12):6381-6388に見られるように、異なる組織源(例えば、2以上、3以上のAAVメンバー)由来の冗長ではないが系統発生的に類似するAAVメンバー(例えば、分離株)を含有する系統群を示す最大節約及び最大尤度を用いる近隣結合樹解析によって記載することができる。
(6.3 組成物)
(6.3.1 新規AAVカプシド配列)
本開示は、それぞれ、本明細書で個別に「新規AAVカプシド核酸配列」及び「新規AAVカプシドアミノ酸配列」と呼ばれ、かつ本明細書でまとめて「新規AAVカプシド配列」と呼ばれる、核酸配列(DNA、cDNA、及びRNA)並びに該核酸配列及びその断片によってコードされるアミノ酸配列を含む新規AAVカプシド配列を提供する。本開示はまた、修飾されたAAVカプシド配列を提供する。第6.3.1.4節を参照されたい。文脈から明示的に明らかでない限り、「新規AAVカプシド配列」という語句は、修飾された新規AAVカプシド配列を包含する。
(6.3.1 新規AAVカプシド配列)
本開示は、それぞれ、本明細書で個別に「新規AAVカプシド核酸配列」及び「新規AAVカプシドアミノ酸配列」と呼ばれ、かつ本明細書でまとめて「新規AAVカプシド配列」と呼ばれる、核酸配列(DNA、cDNA、及びRNA)並びに該核酸配列及びその断片によってコードされるアミノ酸配列を含む新規AAVカプシド配列を提供する。本開示はまた、修飾されたAAVカプシド配列を提供する。第6.3.1.4節を参照されたい。文脈から明示的に明らかでない限り、「新規AAVカプシド配列」という語句は、修飾された新規AAVカプシド配列を包含する。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、「BCD_」という接頭辞を付して本明細書(例えば、表9)に提供されるカプシドのVP1配列、VP2配列、又はVP3配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるVP1配列、VP2配列、又はVP3配列を含む新規AAVカプシド配列である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、「BCD_」という接頭辞を付して本明細書(例えば、表9)に提供されるカプシドのVP1配列、VP2配列、又はVP3配列と同一のVP1配列、VP2配列、又はVP3配列を含むを含む新規AAVカプシド配列である。具体的な実施態様において、新規AAVカプシド配列は、VP1配列、VP2配列、及びVP3配列を含む。
AAVカプシドは、VP1、VP2、及びVP3という3つのカプシドタンパク質を含む。多くの場合、本開示の新規AAVカプシドヌクレオチド配列は、ウイルスタンパク質: VP1、VP2、及びVP3と呼ばれる、3つのタンパク質をコードする(encode)又はコードする(code)ヌクレオチド配列を含む。VP2及びVP3は、VP1よりも小さい。VP2及びVP3コード領域は、VP1コード領域に由来し、VP1コード領域のサブセットを含む。AAVカプシドは、定常領域及び可変領域を含むと記載される場合もある。新規AAVカプシドアミノ酸配列は、VP1、VP2、及びVP3、並びに定常領域及び可変領域を含む。図面及び配列表に提供される新規AAVカプシド配列は、VP1及びVP1コード領域のものである。
当業者は、例えば、新規AAVカプシドタンパク質の提供されたVP1配列を使用し、それらを密接に関連するAAVのVP1領域と比較することにより、VP2及びVP3領域、可変領域、並びに定常領域の位置を容易に決定することができる。例えば、新規AAVカプシド配列のVP2及びVP3領域の位置は、新規AAVカプシド配列のVP1領域を新規AAVカプシド配列のVP1と密接に関連するVP1領域を有するAAVのVP2及びVP3領域(例えば、既知のVP2及びVP3領域)と比較することにより決定することができる。実施例9及び図4～10を参照されたい。
(6.3.1.1 新規AAVカプシドアミノ酸配列)
本明細書に提示される新規AAVカプシドVP1アミノ酸配列は、「BCD_」という接頭辞並びに配列番号6～78及び193で特定される表9に示されている。新規AAVカプシドVP1配列の同定の考察については、下の実施例1を参照されたい。本明細書に開示されているように、存在する場合、VP2及びVP3領域を新規カプシドVP1領域と密接に関連するAAVと比較することにより、本開示の新規VP2及びVP3タンパク質の位置を決定することができる。
本明細書に提示される新規AAVカプシドVP1アミノ酸配列は、「BCD_」という接頭辞並びに配列番号6～78及び193で特定される表9に示されている。新規AAVカプシドVP1配列の同定の考察については、下の実施例1を参照されたい。本明細書に開示されているように、存在する場合、VP2及びVP3領域を新規カプシドVP1領域と密接に関連するAAVと比較することにより、本開示の新規VP2及びVP3タンパク質の位置を決定することができる。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、下の実施例に記載されているカプシドタンパク質のVP1領域のアミノ酸配列である。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0388のVP1アミノ酸配列である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0132のVP1アミノ酸配列である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0147のVP1アミノ酸配列である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0202のVP1アミノ酸配列である。
本開示はまた、新規AAVカプシドアミノ酸配列の機能的断片を提供する。本開示の新規AAVカプシドアミノ酸配列の機能的断片の例としては、例えば、実施例(例えば、実施例9)に提供されるVP1、VP2、及び/又はVP3タンパク質の定常領域及び可変領域配列(すなわち、VR、GBS、及び/又はGHループ)が挙げられる。
本開示のアミノ酸配列、タンパク質、ペプチド、及び断片は、組換え産生、化学合成産生、合成産生、又は当技術分野で公知の任意の他の手段を含む、任意の好適な手段によって産生することができる。
(6.3.1.2 新規AAVカプシド核酸配列)
本明細書に提示される新規AAV VP1核酸配列は、「BCD_」という接頭辞並びに配列番号102～174及び194で特定される表9に記載されている。新規AAVカプシドVP1配列の同定の考察については、下の実施例1を参照されたい。本開示のAAVカプシド核酸配列は、相補的核酸配列である鎖、並びに配列に対応するRNA及びcDNA配列、並びにその相補鎖を包含する。コドンの縮退のため、複数のコドンが同じアミノ酸をコードし得る。したがって、本明細書に提供されるのは、配列番号6～78及び193における新規AAV VP1アミノ酸配列の各々をコードする核酸配列である。ある実施態様において、本明細書に提示される新規AAV VP1アミノ酸配列をコードする核酸配列は、意図される宿主細胞用にコドン最適化されており、例えば、ヒト細胞用にコドン最適化されている。
本明細書に提示される新規AAV VP1核酸配列は、「BCD_」という接頭辞並びに配列番号102～174及び194で特定される表9に記載されている。新規AAVカプシドVP1配列の同定の考察については、下の実施例1を参照されたい。本開示のAAVカプシド核酸配列は、相補的核酸配列である鎖、並びに配列に対応するRNA及びcDNA配列、並びにその相補鎖を包含する。コドンの縮退のため、複数のコドンが同じアミノ酸をコードし得る。したがって、本明細書に提供されるのは、配列番号6～78及び193における新規AAV VP1アミノ酸配列の各々をコードする核酸配列である。ある実施態様において、本明細書に提示される新規AAV VP1アミノ酸配列をコードする核酸配列は、意図される宿主細胞用にコドン最適化されており、例えば、ヒト細胞用にコドン最適化されている。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、下の実施例に記載されているカプシドタンパク質のVP1領域をコードする核酸配列である。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0338のVP1アミノ酸配列をコードする核酸配列である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0132のVP1アミノ酸配列をコードする核酸配列である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0147のVP1アミノ酸配列をコードする核酸配列である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0202のVP1アミノ酸配列をコードする核酸配列である。
本明細書に開示されているように、存在する場合、VP2及びVP3領域を新規カプシドVP1領域に対する実質的な同一性又は類似性を有するAAVと比較することにより、タンパク質をコードするVP2及びVP3核酸配列の位置を容易に決定することができる。比較は、本明細書に提供されているように行うことができる。したがって、本明細書に提供されるのは、配列番号6～78及び193における新規AAV VP1アミノ酸配列のVP2領域をコードする核酸配列である。また本明細書に提供されるのは、配列番号6～78及び193における新規AAV VP1アミノ酸配列のVP3領域をコードする核酸配列である。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、下の実施例に記載されているカプシドタンパク質のVP2領域をコードする核酸配列である。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0338のVP1アミノ酸配列のVP2領域をコードする核酸配列である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0132のVP1アミノ酸配列のVP2領域をコードする核酸配列である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0147のVP1アミノ酸配列のVP2領域をコードする核酸配列である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0202のVP1アミノ酸配列のVP2領域をコードする核酸配列である。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、下の実施例に記載されているカプシドタンパク質のVP3領域をコードする核酸配列である。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0338のVP1アミノ酸配列のVP3領域をコードする核酸配列である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0132のVP1アミノ酸配列のVP3領域をコードする核酸配列である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0147のVP1アミノ酸配列のVP3領域をコードする核酸配列である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0202のVP1アミノ酸配列のVP3領域をコードする核酸配列である。
本開示のAAVカプシド核酸配列の範囲に含まれるのは、新規AAVカプシドをコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、新規AAVカプシドをコードするヌクレオチド配列の全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、「BCD_」という接頭辞を有する、表9に示されているVP1カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号102～174及び194に示されているヌクレオチド配列のいずれか1つの全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、実施例に記載されているカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0338、BCD_0132、BCD_0147、又はBCD_0202のカプシドタンパク質をコードする、下の表9に提供されるヌクレオチド配列の全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。他の実施態様において、本明細書に提供されるのは、新規AAVカプシドをコードするヌクレオチド配列の断片にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、「BCD_」という接頭辞を有する、表9に示されているVP1カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の断片にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号102～174及び194に示されているヌクレオチド配列のいずれか1つの断片にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、実施例に記載されているカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の断片にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、BCD_0338、BCD_0132、BCD_0147、又はBCD_0202のVP1アミノ酸配列をコードする、下の表9に提供されるヌクレオチド配列の断片にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。選択的である(すなわち、本発明のポリヌクレオチドのいずれか1つに特異的にハイブリダイズする)、例えば、15、16、17、18、19、もしくは20ヌクレオチドの又はそれを上回る断片が企図される。ある実施態様において、断片は、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも75ヌクレオチド、又は少なくとも100ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、断片は、15～30ヌクレオチド、25～50ヌクレオチド、25～75ヌクレオチド、50～75ヌクレオチド、50～100ヌクレオチド、又は75～100ヌクレオチドの長さである。ある実施態様において、断片は、100～125ヌクレオチド、100～150ヌクレオチド、125～150ヌクレオチド、150～175ヌクレオチド、150～200ヌクレオチド、又は175～200ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、断片は、AAVカプシドの可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。
本開示のAAVカプシド核酸配列の範囲に含まれるのは、新規AAVカプシドをコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列断片であり、この断片は、約9ヌクレオチドよりも大きく、約12ヌクレオチドよりも大きく、約15ヌクレオチドよりも大きく、約27ヌクレオチドよりも大きく、約39ヌクレオチドよりも大きく、約51よりも大きく、又は約462ヌクレオチドよりも大きい。選択的である(すなわち、本開示のポリヌクレオチドのいずれか1つに特異的にハイブリダイズする)、例えば、9、12、15、27、39、51、もしくは462ヌクレオチドの又はそれを上回る断片が企図される。ストリンジェントな条件下でポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるプローブは、本開示のポリヌクレオチド配列と他のポリヌクレオチド配列を識別することができる。
ハイブリダイゼーションとの関連における「ストリンジェント」という用語は、ストリンジェントであると当技術分野で一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、及びホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーション及び洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、65～68℃の0.015M塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウム又は42℃の0.015M塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウム、及び50％ホルムアミドである。Green, M.及びSambrook, J.の文献、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第4版、Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring Harbor, N.Y. 2012)を参照されたい。
よりストリンジェントな条件(例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、又は他の変性剤)が使用される場合、ハイブリダイゼーションの速度は影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関係する場合、さらなる例示的でストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、6×SSC、0.05％ピロリン酸ナトリウム中、37℃(14塩基のオリゴの場合)、48℃(17塩基のオリゴの場合)、55℃(20塩基のオリゴの場合)、及び60℃(23塩基のオリゴの場合)での洗浄を含む。
非特異的ハイブリダイゼーション及び/又はバックグラウンドハイブリダイゼーションを低下させる目的で、他の薬剤をハイブリダイゼーション及び洗浄バッファーに含めることができる。他の薬剤の例は、0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％ポリビニル-ピロリドン、0.1％ピロリン酸ナトリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、NaDodS04(SDS)、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理したサーモン精子DNA(又は他の非相補的DNA)、及び硫酸デキストランであるが、他の好適な薬剤を使用することもできる。これらの添加物の濃度及び種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的な影響を及ぼすことなく変更することができる。ハイブリダイゼーション実験は、通常、pH 6.8～7.4で実施されるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、pHにほとんど依存しない。Andersonらの文献、核酸ハイブリダイゼーション:実践的アプローチ(Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach)、第4章、IRL Press Limited(Oxford, England)を参照されたい。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数に対応し、異なる配列近縁性のDNAがハイブリッドを形成することが可能となるように当業者によって調整されることができる。
AAVカプシド核酸配列は、組換え産生、化学合成産生、合成産生、又は当技術分野で公知の任意の他の手段を含む、任意の好適な手段によって産生することができる。
(6.3.1.3 新規AAVカプシドタンパク質の機能的断片)
本開示はまた、本明細書に開示される新規AAV VP1カプシド配列の機能的断片を提供する。
本開示はまた、本明細書に開示される新規AAV VP1カプシド配列の機能的断片を提供する。
新規AAVカプシドVP1配列の機能的断片は、VP2、VP3、定常領域、可変領域、GBSドメイン、GHループ、又はこれらの組合せを含む。いくつかの実施態様において、本開示によって提供される機能的断片は、1以上の保存的アミノ酸置換を有する。例えば、表1を参照されたい。AAVカプシドVP1配列の断片における保存的アミノ酸置換のいくつかの非限定的な例は、表2及び図4～11に提供されている。表2への言及は、副表2.26～2.33(2.31aを含む)を指す。
新規VP1アミノ酸配列の可変領域機能的断片は、本明細書に提供される情報を用いて決定することができる。実施例9を参照されたい。カプシドVP1タンパク質のそのような機能的断片は、単独で、他のAAV配列もしくは断片、例えば、本明細書に記載される他の新規AAVカプシド配列由来のAAV配列もしく断片と組み合わせて、又は他のAAV(例えば、参照AAV)もしくは他のウイルス配列(例えば、送達ビヒクルなどの非AAV配列)由来のエレメントと組み合わせて使用することができる。
AAVカプシドへの本開示の1以上の機能的断片の包含により、以下のこと:パッケージング収率の増強、形質導入効率の増強、遺伝子移入効率の増強、翻訳効率の増強、組織特異性(すなわち、指向性)の増強、及び/又は非修飾AAVウイルス粒子もしくは天然に存在する配列(例えば、下の表4の参照配列)と比較した免疫回避能力の増強のうちの1つ、2つ、3つ以上、もしくはそれ以上、又は全てを有するAAVウイルス粒子又は送達ビヒクル(例えば、脂質ナノ粒子などのナノ粒子)をもたらすことができる。AAV粒子又はナノ粒子の活性の増強は、インビトロ又はインビボアッセイで評価することができる。インビトロ又はインビボアッセイは、AAVウイルス粒子又は送達ビヒクルの収率、形質導入効率、遺伝子移入効率、翻訳効率、組織特異性(すなわち、指向性)、及び/又は免疫回避能力を評価するための本明細書(例えば、実施例)に記載されているもの又は当技術分野で公知の他のものであってもよい。
(6.3.1.4 修飾された新規AAVカプシド)
本開示はまた、新規AAVカプシド配列の修飾を提供する。具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列(すなわち、VP1、VP2、又はVP3)は、新規AAVカプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193又は配列番号102～174及び194のうちの1つ)の全配列のわずか約10％だけが変化している少なくとも1つの核酸又はアミノ酸残基突然変異(新規AAVカプシド配列に対する変化、例えば、置換、挿入、及び/又は欠失)を有する新規AAVカプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193又は配列番号102～174及び194のいずれか1つ)を含む。いくつかの実施態様において、新規AAVカプシド配列の全配列の約1％～約4％が変化している。いくつかの実施態様において、新規AAVカプシド配列の全配列の約4％～6％が変化している。いくつかの他の実施態様において、新規AAVカプシド配列の全配列の約6％～約8％が変化している。しかし、いくつかの他の実施態様において、新規AAVカプシド配列の全配列の約8％～約10％が変化している。新規AAVカプシド配列に対して行うことができる非限定的な置換、挿入、及び/又は欠失修飾は、表2及び図4～10に提供されている。図4～10に関して、コロンマーク(:)は、強く類似した特性を有するアミノ酸残基置換を示し、ピリオドマーク(.)は、弱く類似した特性を有するアミノ酸残基置換を示し、アスタリスクマーク(*)は、ClustalΩ(別名、「Clustal O」又は「Clustal Omega」としても知られている)によって決定された完全に保存されたアミノ酸残基置換を示す。
本開示はまた、新規AAVカプシド配列の修飾を提供する。具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列(すなわち、VP1、VP2、又はVP3)は、新規AAVカプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193又は配列番号102～174及び194のうちの1つ)の全配列のわずか約10％だけが変化している少なくとも1つの核酸又はアミノ酸残基突然変異(新規AAVカプシド配列に対する変化、例えば、置換、挿入、及び/又は欠失)を有する新規AAVカプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193又は配列番号102～174及び194のいずれか1つ)を含む。いくつかの実施態様において、新規AAVカプシド配列の全配列の約1％～約4％が変化している。いくつかの実施態様において、新規AAVカプシド配列の全配列の約4％～6％が変化している。いくつかの他の実施態様において、新規AAVカプシド配列の全配列の約6％～約8％が変化している。しかし、いくつかの他の実施態様において、新規AAVカプシド配列の全配列の約8％～約10％が変化している。新規AAVカプシド配列に対して行うことができる非限定的な置換、挿入、及び/又は欠失修飾は、表2及び図4～10に提供されている。図4～10に関して、コロンマーク(:)は、強く類似した特性を有するアミノ酸残基置換を示し、ピリオドマーク(.)は、弱く類似した特性を有するアミノ酸残基置換を示し、アスタリスクマーク(*)は、ClustalΩ(別名、「Clustal O」又は「Clustal Omega」としても知られている)によって決定された完全に保存されたアミノ酸残基置換を示す。
具体的な実施態様において、修飾された新規AAVカプシドタンパク質は、表2.26に列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.26の番号0～43のいずれか1つのAAVカプシドのアミノ酸配列を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシド(例えば、表2.26の番号1及び9)をもたらさない。具体的な実施態様において、修飾された新規AAVカプシドタンパク質は、表2.27に列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.27の番号0～21のいずれか1つのAAVカプシドのアミノ酸配列を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシド(例えば、表2.27の番号0、1、及び4～21)をもたらさない。具体的な実施態様において、修飾された新規AAVカプシドタンパク質は、表2.28に列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.28の番号0～12のいずれか1つのAAVカプシドのアミノ酸配列を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシドをもたらさない。具体的な実施態様において、修飾された新規AAVカプシドタンパク質は、表2.30に列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.30の番号0～3のいずれか1つのAAVカプシドのアミノ酸配列を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシドをもたらさない。具体的な実施態様において、修飾された新規AAVカプシドタンパク質は、表2.31に列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.31の番号0～2のいずれか1つのAAVカプシドのアミノ酸配列を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシドをもたらさない。具体的な実施態様において、修飾された新規AAVカプシドタンパク質は、表2.31aに列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.31aの番号0～2のいずれか1つのAAVカプシドのアミノ酸配列を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシドをもたらさない。具体的な実施態様において、修飾された新規AAVカプシドタンパク質は、表2.33に列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.33の番号0～1のいずれか1つのAAVカプシドの突然変異(例えば、アミノ酸配列)を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシドをもたらさない。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、少なくとも1つのアミノ酸残基又は核酸置換を有するが、該新規AAVカプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193又は配列番号102～174及び194のいずれか1つ)の全配列のわずか約10％だけが変化している新規AAVカプシド配列、例えば、配列番号6～78及び193又は配列番号102～174及び194のいずれか1つを含む。いくつかの実施態様において、新規AAVカプシド配列の全配列の約1％～約4％が変化している。いくつかの実施態様において、新規AAVカプシド配列の全配列の約4％～約6％が変化している。いくつかの他の実施態様において、新規AAVカプシド配列の全配列の約6％～約8％が変化している。しかし、いくつかの他の実施態様において、新規AAVカプシド配列の全配列の約8％～約10％が変化している。新規AAVカプシド配列に対して行うことができるいくつかの非限定的なアミノ酸修飾は、表2及び図4～10に提供されている。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)中に1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個、又は1～10個のアミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)中に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、又は32個のアミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のうちの1つ)中に32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、又は50個のアミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)中に50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、又は80個のアミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)中に1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)中に11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)を有する表2の代表的配列のAAVカプシドアミノ酸配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列)を含み、ただし、修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、既知のAAVカプシドタンパク質ではない。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30個のアミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)を有する表2の代表的配列のAAVカプシドアミノ酸配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列)を含み、ただし、修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、既知のAAVカプシドタンパク質ではない。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40個、又はそれを上回るアミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)を有する表2の代表的配列のAAVカプシドアミノ酸配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列)を含み、ただし、修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、既知のAAVカプシドタンパク質ではない。具体的な実施態様において、アミノ酸置換は、表2に提供されているものである。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、表2の代表的配列のAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列を含み、ただし、該修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、既知のAAVカプシドタンパク質ではない。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、表2の代表的配列のAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列に対して少なくとも91％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列を含み、ただし、該修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、既知のAAVカプシドタンパク質ではない。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、表2の代表的配列のAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列に対して少なくとも92％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列を含み、ただし、該修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、既知のAAVカプシドタンパク質ではない。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、表2の代表的配列のAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列に対して少なくとも93％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列を含み、ただし、該修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、既知のAAVカプシドタンパク質ではない。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、表2の代表的配列のAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列に対して少なくとも94％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列を含み、ただし、該修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、既知のAAVカプシドタンパク質ではない。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、表2の代表的配列のAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列を含み、ただし、該修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、既知のAAVカプシドタンパク質ではない。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、表2の代表的配列のAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列に対して少なくとも96％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列を含み、ただし、該修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、既知のAAVカプシドタンパク質ではない。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、表2の代表的配列のAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列に対して少なくとも97％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列を含み、ただし、該修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、既知のAAVカプシドタンパク質ではない。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、表2の代表的配列のAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列を含み、ただし、該修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、既知のAAVカプシドタンパク質ではない。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、表2の代表的配列のAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列に対して少なくとも99％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列を含み、ただし、該修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、既知のAAVカプシドタンパク質ではない。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、少なくとも1つのアミノ酸残基又は核酸突然変異(例えば、置換、挿入、及び/又は欠失)を有するが、新規AAV配列の断片(例えば、配列番号6～78及び193又は配列番号102～174及び194のいずれか1つの断片)の全配列のわずか約10％だけが変化している新規AAVカプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193又は配列番号102～174及び194のいずれか1つ)の断片を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、少なくとも1つのアミノ酸残基又は核酸置換を有するが、新規AAVカプシド配列の断片(例えば、配列番号6～78及び193又は配列番号102～174及び194のいずれか1つの断片)の全配列のわずか約10％だけが変化している新規AAVカプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193又は配列番号102～174及び194のいずれか1つ)の断片を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、変化した新規AAVカプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193又は配列番号102～174及び194のいずれか1つ)中に1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193又は配列番号102～174及び194のいずれか1つ)の断片を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)中に1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の断片を含む。
本明細書に提供される新規AAV VP1アミノ酸配列と、様々なAAV参照(表4を参照)に対する他のVP1アミノ酸配列とのアラインメントを用いて、新規AAV VP1カプシドタンパク質の保存領域及び可変領域を同定することができる。そのような解析を用いて、カプシドタンパク質中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、又はそれより多くの可変領域(GBS及びGHループを含む)を同定することができる。ある実施態様において、本明細書に提示されるのは、保存領域及び又は可変領域の1つ又は複数に突然変異を含む修飾された新規AAVカプシド配列である。
いくつかの実施態様において、9つのVRがカプシドタンパク質中に存在する(本明細書においてVRI～VRIXと表記される)。ある実施態様において、修飾された新規AAVカプシド配列は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域に突然変異(例えば、置換、挿入、及び/又は欠失)を有する新規AAVカプシド配列を含む。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、新規AAVアミノ酸カプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域に1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域に11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域に1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の断片を含む。
ある実施態様において、修飾された新規AAVカプシド配列は、GBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方に突然変異(例えば、置換、挿入、及び/又は欠失)を有する新規AAVカプシド配列を含む。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、新規AAVアミノ酸カプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方に1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方に11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方に1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の断片を含む。
ある実施態様において、修飾された新規AAVカプシド配列は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域及びGBSに突然変異(例えば、置換、挿入、及び/又は欠失)を有する新規AAVカプシド配列を含む。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、新規AAVアミノ酸カプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域及びGBSに1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域及びGBSに11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域及びGBSに1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の断片を含む。
ある実施態様において、修飾された新規AAVカプシド配列は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域及びGHループに突然変異(例えば、置換、挿入、及び/又は欠失)を有する新規AAVカプシド配列を含む。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、新規AAVアミノ酸カプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域及びGHループに1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域及びGHループに11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域及びGHループを有する1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の断片を含む。
ある実施態様において、修飾された新規AAVカプシド配列は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域、GHループ、及びGBSに突然変異(例えば、置換、挿入、及び/又は欠失)を有する新規AAVカプシド配列を含む。別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、新規AAVアミノ酸カプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域、GHループ、及びGBSに1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域、GHループ、及びGBSに11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含む。
別の具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域、GHループ、及びGBSに1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の保存的アミノ酸残基置換を有する新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)の断片を含む。
ある実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、異なるAAV血清型)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域を有する第一の新規AAVカプシドタンパク質(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二の新規AAVカプシドタンパク質の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域を有する第一の新規AAVカプシドタンパク質(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、第二の新規AAVカプシドタンパク質)は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、第二の新規AAVカプシドタンパク質)は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質中の可変領域の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全てが異なる。
ある実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、異なるAAV血清型)の1以上の可変領域を有する第一の新規AAVカプシドタンパク質(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二の新規AAVカプシドタンパク質の1以上の可変領域を有する第一の新規AAVカプシドタンパク質(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、第二の新規AAVカプシドタンパク質)は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、第二の新規AAVカプシドタンパク質)は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質中の1以上の可変領域は異なる。
ある実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、異なるAAV血清型)のGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方を有する第一の新規AAVカプシドタンパク質(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質中のGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方は異なる。
具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二の新規AAVカプシドタンパク質のGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方を有する第一の新規AAVカプシドタンパク質(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二の新規AAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二の新規AAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二の新規AAVカプシドタンパク質中のGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方は異なる。
ある実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、異なるAAV血清型)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域及びGBSを有する第一の新規AAVカプシドタンパク質(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質中の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全ての可変領域及びGBSは異なる。
具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二の新規AAVカプシドタンパク質の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域及びGBSを有する第一のAAVカプシドタンパク質(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二の新規AAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二の新規AAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二の新規AAVカプシドタンパク質中の可変領域の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全て及びGBSは異なる。
ある実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、異なるAAV血清型)の1以上の可変領域及びGBSを有する第一のAAVカプシドタンパク質(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質中の1以上の可変領域及びGBSは異なる。
具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二の新規AAVカプシドタンパク質の1以上の可変領域及びGBSを有する第一のAAVカプシド(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二の新規AAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二の新規AAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二の新規AAVカプシドタンパク質中の1以上の可変領域及びGBSは異なる。
ある実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、異なるAAV血清型)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域(例えば、VRI～VRIXのいずれか1つ、その組合せ、又は全て)、及びGHループを有する第一の新規AAVカプシドタンパク質(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質中の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域、及びGHループは異なる。
具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二の新規AAVカプシドタンパク質の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域(例えば、VRI～VRIXのいずれか1つ、その組合せ、又は全て)、及びGHループを有する第一の新規AAVカプシド(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二の新規AAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二の新規AAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二の新規AAVカプシドタンパク質中の可変領域の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全て及びGHループは異なる。
ある実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、異なるAAV血清型)の1以上の可変領域及びGHループを有する第一の新規AAVカプシドタンパク質(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二の新規AAVカプシドタンパク質の1以上の可変領域及びGHループを有する第一の新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、第二の新規AAVカプシドタンパク質)は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、第二の新規AAVカプシドタンパク質)は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質中の1以上の可変領域及びGHループは異なる。
ある実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、異なるAAV血清型)の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域(例えば、VRI～VRIXのいずれか1つ、その組合せ、又は全て)、GBS、及びGHループを有する第一の新規AAVカプシドタンパク質(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質中の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域、GBS、及びGHループは異なる。
具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二の新規AAVカプシドタンパク質の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全ての可変領域(例えば、VRI～VRIXのいずれか1つ、その組合せ、又は全て)、GBS、及びGHループを有する第一のAAVカプシドタンパク質(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二の新規AAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二の新規AAVカプシドタンパク質は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二の新規AAVカプシドタンパク質中の可変領域の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ全て(例えば、VRI～VRIXのいずれか1つ、その組合せ、又は全て)、GBS、及びGHループは異なる。
ある実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、異なるAAV血清型)の1以上の可変領域(例えば、VRI～VRIXのいずれか1つ、その組合せ、又は全て)、GBS、及びGHループを有する第一の新規AAVカプシド(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。具体的な実施態様において、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列は、第二の新規AAVカプシドタンパク質の1以上の可変領域(例えば、VRI～VRIXのいずれか1つ、その組合せ、又は全て)、GBS、及びGHループを有する第一の新規AAVカプシド(例えば、配列番号6～78及び193のいずれか1つ)のAAVカプシドアミノ酸配列を含み、ここで、第一及び第二のAAVカプシドタンパク質は異なる。ある実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、第二の新規AAVカプシドタンパク質)は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と異なるクレードのメンバーである。いくつかの実施態様において、第二のAAVカプシドタンパク質(例えば、第二の新規AAVカプシドタンパク質)は、第一の新規AAVカプシドタンパク質と同じクレード内の異なるAAV血清型である。具体的な実施態様において、第一及び第二の新規AAVカプシドタンパク質中の1以上の可変領域、GBS、及びGHループは異なる。
保存されたアミノ酸交換の例示的な例は、アミノ酸の側鎖の構造的及び/又は機能的特性を維持するアミノ酸置換であり、例えば、芳香族アミノ酸は、別の芳香族アミノ酸に置き換えられ、酸性アミノ酸は、別の酸性アミノ酸に置き換えられ、塩基性アミノ酸は、別の塩基性アミノ酸に置き換えられ、脂肪族アミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸に置き換えられる。いくつかの実施態様において、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。標準化され、許容されている機能的に等価なアミノ酸置換は、表1に提示されている。対照的に、非保存アミノ酸交換の例は、アミノ酸の側鎖の構造的及び/又は機能的特性を維持しないアミノ酸置換であり、例えば、芳香族アミノ酸は、塩基性、酸性、又は脂肪族アミノ酸に置き換えられ、酸性アミノ酸は、芳香族、塩基性、又は脂肪族アミノ酸に置き換えられ、塩基性アミノ酸は、酸性、芳香族、又は脂肪族アミノ酸に置き換えられ、脂肪族アミノ酸は、芳香族、酸性、又は塩基性アミノ酸に置き換えられる。
表1.保存的アミノ酸置換
いくつかの実施態様において、修飾された新規AAV核酸カプシド配列は、天然にコードされていないアミノ酸をコードするコドンを含む。ある実施態様において、修飾された新規AAVアミノ酸カプシド配列は、ビリオンアセンブリ後のカプシドの修飾を可能にするアミノ酸突然変異(例えば、置換)を含む。いくつかの実施態様において、修飾された新規AAV配列は、カプシドシャッフリングに起因するアミノ酸変化を含む。
様々な実施態様において、修飾された新規AAVカプシド配列は、新規AAVカプシド配列(例えば、配列番号6～78及び193又は配列番号102～174及び194のいずれか1つ)に対して、1以上のさらなる結合部分を含む。結合部分の例は、標的化ペプチド(例えば、受容体)、モノクローナル抗体、二重特異性F(ab')2、及び抗原結合断片、例えば、Fab断片、Fv、scFv、タンデムscFvなどである。いくつかの実施態様において、修飾された新規AAVカプシド配列は、体内の特定の組織又は細胞型へのAAVの送達を改善する組織特異的標的化ペプチドを含む。
AAVカプシドの修飾は、以下のこと:パッケージング収率の増強、形質導入効率の増強、遺伝子移入効率の増強、翻訳効率の増強、組織特異的感染性(すなわち、指向性)の増強、及び/又は非修飾AAVウイルス粒子もしくは天然に存在する配列(例えば、下の表4の参照配列など)と比較した免疫回避能力の増強のうちの1つ、2つ、3つ以上、もしくはそれ以上、又は全てを有するAAVウイルス粒子をもたらすことができる。AAV粒子の活性の増強は、当業者に公知の又は本明細書に記載されるインビトロ又はインビボアッセイで評価することができる。例えば、パッケージング収率の増強は、アルカリゲル電気泳動、ddPCR、qPCR、SEC-MALS(その全体が本明細書中に組み込まれるWO2021/062164号を参照)によって評価することができる。形質導入効率の増強は、例えば、インビトロの細胞ベースのアッセイ、例えば、実施例5のqPCR、又はRNA次世代シークエンシングによって評価することができる。導入遺伝子の翻訳効率の増強は、例えば、RT-ddPCR、液体クロマトグラフィー-質量分析によるか、又は酵素、X線、比色定量、蛍光、もしくは他の分光学的アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ(FACS)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射免疫アッセイ(RIA)、及び免疫組織化学(IHC)アッセイを含む免疫学的アッセイによって検出可能である導入遺伝子及び/もしくはレポーターを関連付けることにより評価することができる。組織特異的感染性(すなわち、指向性)の増強は、例えば、インビボイメージングシステム(IVIS)、例えば、その各々が完全にかつ特に、その組織特異的AAV感染性アッセイ及び開示について本明細書中に組み込まれるWO2018/022608又はWO2019/222136号に記載されているものによって評価することができる。簡潔に説明すると、試験カプシドを含み、かつ1以上の検出可能な導入遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ導入遺伝子(例えば、FlucもしくはFluc2遺伝子)及び/又は緑色蛍光タンパク質(GFP)導入遺伝子を発現するAAVを生成させ、該AAVを1以上の濃度で試験動物に導入することにより、動物、例えば、マウスで試験することができ、感染後の適切な時点で(例えば、感染後3及び5週間で)、検出可能マーカー(単数又は複数)の測定、例えば、イメージングを実施することができる。ルシフェラーゼマーカーの場合、例えば、標準的な生物発光基質及びイメージング装置を使用する、インビボ生物発光イメージングを利用することができる。動物全体のイメージング及び/又は臓器イメージングは、リビングイメージソフトウェアを用いて解析することができる。目的の領域を各々の動物及び個々の臓器を囲んでトレースして、放出されている全フラックス(光子/秒)を定量することができる。全フラックス活性は、AAV感染性/指向性の代用である。免疫(宿主に予め存在する免疫)を回避する能力の増強は、例えば、細胞ベースのインビトロTIアッセイ、インビボTIアッセイ(例えば、マウス)、及び酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)ベースの全抗カプシド抗体(TAb)検出アッセイによって評価することができ、又はIVIg細胞ベースのインビトロ形質導入阻害アッセイは、培養細胞におけるインビトロ形質導入を阻止する血漿の能力を試験する。例えば、実施例4を参照されたい。
(6.3.1.4.1 コドン最適化)
いくつかの実施態様において、新規AAVカプシド核酸配列は、特定の宿主細胞又は送達細胞型のための代替の又は好ましいコドン使用によって最適化される。AAV核酸配列は、当技術分野で公知の任意のソフトウェアを用いてコドン最適化することができる。例えば、AAV骨格は、//https://github.com/CMRI-TVG/AAVcodons//などのソフトウェアを用いてコドン最適化することができる。
いくつかの実施態様において、新規AAVカプシド核酸配列は、特定の宿主細胞又は送達細胞型のための代替の又は好ましいコドン使用によって最適化される。AAV核酸配列は、当技術分野で公知の任意のソフトウェアを用いてコドン最適化することができる。例えば、AAV骨格は、//https://github.com/CMRI-TVG/AAVcodons//などのソフトウェアを用いてコドン最適化することができる。
(6.3.2 新規AAVクレード及びAAV分岐)
AAV血清型のクレードは、引用により本明細書中に完全に組み込まれるGao, Gらの文献、J Virol.(2004) Jun;78(12):6381-6388によって以前に提唱され、100を上回るAAV分離株に基づき、かつそのウイルスタンパク質(VP)の系統発生の類似性によって分類された。本開示は、以前に記載されたAAV参照分離株及び300を上回る新たなAAV分離株に基づき、かつ第6.3.2.1節～第6.3.2.4節に提供される様々な構造的特徴及び/又は第6.3.2.5節～第6.3.2.6節に提供される機能的特徴によって分類された新規AAVクレードを提供する。
AAV血清型のクレードは、引用により本明細書中に完全に組み込まれるGao, Gらの文献、J Virol.(2004) Jun;78(12):6381-6388によって以前に提唱され、100を上回るAAV分離株に基づき、かつそのウイルスタンパク質(VP)の系統発生の類似性によって分類された。本開示は、以前に記載されたAAV参照分離株及び300を上回る新たなAAV分離株に基づき、かつ第6.3.2.1節～第6.3.2.4節に提供される様々な構造的特徴及び/又は第6.3.2.5節～第6.3.2.6節に提供される機能的特徴によって分類された新規AAVクレードを提供する。
新規AAVクレードは、限定されないが、天然のAAV、非天然のAAV、例えば、組換えAAV、修飾AAV、キメラAAV、ハイブリッドAAV(すなわち、2以上の異なるAAVに由来するもの)、合成AAV、又は人工AAVなどを含む、全ての構造的に関連するAAVメンバーを包含する。
具体的な実施態様において、本開示は、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1配列などの、当技術分野で公知であるAAVカプシドタンパク質、又はそれに由来するVP2及びVP3カプシドタンパク質を包含しない。具体的な実施態様において、本開示は、表4又は項目A又は項目Bに掲載されているAAVのいずれかのAAVカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、及び/又はVP3)を包含しない。
(6.3.2.1 VP1、VP2、及びVP3カプシドタンパク質の構造的相同性)
本開示はまた、VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質のその構造的相同性によって分類されたAAVクレードを提供する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのAAVメンバーは、VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列の間で、本開示によって提供される別の新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、「新規参照カプシド」)との構造的相同性を有する。
本開示はまた、VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質のその構造的相同性によって分類されたAAVクレードを提供する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのAAVメンバーは、VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列の間で、本開示によって提供される別の新規AAVカプシドアミノ酸配列(例えば、「新規参照カプシド」)との構造的相同性を有する。
新規参照カプシドに対する相同なタンパク質は、BLAST(Altschulらの文献(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, units 3.3 and 3.4)、PSI-BLAST(同上)、SSEARCH(Smith及びWatermanの文献(1981) Mol. Biol. 147:195-197; Pearsonの文献(1991) Genomics 11:635-650, unit 3.10)、FASTA(Pearson及びLipmanの文献(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-2448, unit 3.9)、並びにHMMER3(Johnsonらの文献(2010) BMC Bioinformatics. 11:431)などの配列類似性検索を用いて同定することができ、これらの配列類似性検索は、正確な統計的推定をもたらし、有意な類似性を共有するタンパク質配列が類似した構造も有することを保証する。構造的相同性は、例えば、BLAST、FASTA、SSEARCH、HMMER、又はClustalW検索における統計的に有意な類似性から推測することができる。BLAST、SSEARCH、FASTA、HMMER、ClustalWによって計算された局所配列アラインメントは、2つの配列間の最も類似した領域を同定することができる。BLOSUM(例えば、BLOSUM62又はBLOSUM50)などのスコアリングマトリックスは、非常に遠い類似性を検出するために使用することができ、ミスマッチ残基に対する比較的低いペナルティを有する。いくつかの実施態様において、2つのアミノ酸配列の類似性は、類似性スコアの観点から記載される。具体的な実施態様において、2つのアミノ酸配列の類似性は、類似性パーセントの観点から記載される。いくつかの他の実施態様において、2つのアミノ酸配列の類似性は、同一性パーセントの観点から記載される。
具体的な実施態様において、少なくとも2つのアミノ酸配列間の類似性は、ClustalWを用いて達成される。ある具体的な実施態様において、コストマトリックスBLOSUM、ギャップオープンコスト10、及びギャップ伸長コスト0.1のClustalWが、少なくとも2つのアミノ酸配列間の類似性を決定するために使用される。
カプシドタンパク質の構造相同性は、カプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)が実質的な相同性(例えば、実質的なアミノ酸類似性及び/又はアミノ酸類似性)を有するかどうかを決定するための本明細書に記載される方法を用いて決定することができる。いくつかの実施態様において、実質的な相同性(例えば、実質的なアミノ酸同一性及び/又はアミノ酸類似性)は、カプシドタンパク質の全長(例えば、2つのVP1カプシドタンパク質、2つのVP2カプシドタンパク質、又は2つのVP3カプシドタンパク質)にわたるものである。ある実施態様において、実質的な相同性(例えば、実質的なアミノ酸同一性及び/又はアミノ酸類似性)は、カプシドタンパク質の断片(例えば、2つのVP1カプシドタンパク質の断片、2つのVP2カプシドタンパク質の断片、又は2つのVP3カプシドタンパク質の断片)にわたるものである。
具体的な実施態様において、カプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約90％～99％の類似性及び/又は同一性がある場合、実質的な相同性を有する。
いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約90％～99％の類似性及び/又は同一性がある場合、実質的な相同性を有する。具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、「BCD_」という接頭辞を付して表9に提供されているものである。
別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約90％～99％の類似性及び/又は同一性がある場合、実質的な相同性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約90％～99％の類似性及び/又は同一性がある場合、実質的な相同性を有する。
いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約90％～99％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約90％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約91％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約92％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約93％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約94％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約95％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約96％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約97％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約98％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約99％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。
いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約90％～99％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約90％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約91％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約92％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約93％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約94％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約95％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約96％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約97％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約98％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約99％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、「BCD_」という接頭辞を付して表9に提供されているものである。
別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約90％～99％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約90％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約91％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約92％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約93％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約94％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約95％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約96％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約97％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約98％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約99％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。具体的な実施態様において、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して実質的な類似性を有するVP1カプシドタンパク質は、既知のAAVではない。
別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約90％～99％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約90％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約91％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約92％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約93％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約94％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約95％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約96％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約97％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約98％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約99％の類似性がある場合、実質的な類似性を有する。具体的な実施態様において、表2のいずれか1つの番号0のVP1カプシドタンパク質に対して実質的な類似性を有するVP1カプシドタンパク質は、既知のAAVではない。
いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約90％～99％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約90％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約91％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約92％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約93％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約94％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約95％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約96％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約97％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約98％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、別のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)に対して約99％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。具体的な実施態様において、実質的な同一性を有するカプシドタンパク質は、既知のAAVカプシドではない。具体的な実施態様において、実質的な同一性を有するカプシドタンパク質は、「BCD_」という接頭辞を付して本明細書(例えば、表9)に提供されるカプシドタンパク質である。
いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約90％～99％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約90％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約91％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約92％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約93％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約94％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約95％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約96％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約97％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約98％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表9のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約99％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、「BCD_」という接頭辞を付して表9に提供されているものである。具体的な実施態様において、実質的な同一性を有するカプシドタンパク質は、既知のAAVカプシドではない。
別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約90％～99％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約90％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約95％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約96％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約97％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約98％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約99％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。具体的な実施態様において、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対するVP1カプシドタンパク質に対して実質的な同一性を有するVP1カプシドタンパク質は、既知のAAVではない。表9は、表2のいずれか1つに列挙されているVP1カプシドタンパク質の配列を提供している。具体的な実施態様において、表2のVP1カプシドタンパク質は、「BCD_」という接頭辞を有するものである。
別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約90％～99％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約90％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約95％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約96％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約97％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約98％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。別の具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約99％の同一性がある場合、実質的な同一性を有する。具体的な実施態様において、表2のいずれか1つの番号0のVP1カプシドタンパク質に対して実質的な同一性を有するVP1カプシドタンパク質は、既知のAAVではない。
いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約90％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質との構造的相同性を有する。具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約91％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質番号0との構造的相同性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約91％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質との構造的相同性を有する。具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約91％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質番号0との構造的相同性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約92％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質との構造的相同性を有する。具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約92％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質番号0との構造的相同性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約93％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質との構造的相同性を有する。具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約93％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質番号0との構造的相同性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約94％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質との構造的相同性を有する。具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約94％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質番号0との構造的相同性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約95％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質との構造的相同性を有する。具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約95％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質番号0との構造的相同性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約96％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質との構造的相同性を有する。具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約96％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質番号0との構造的相同性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約97％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質との構造的相同性を有する。具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約97％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質番号0との構造的相同性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約98％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質との構造的相同性を有する。具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約98％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードの番号0のVP1カプシドタンパク質との構造的相同性を有する。いくつかの実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約99％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードのVP1カプシドタンパク質との構造的相同性を有する。具体的な実施態様において、VP1カプシドタンパク質は、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、VP1カプシドアミノ酸配列間に少なくとも約99％の同一性がある場合、表2のいずれか1つのAAVクレードの番号0のVP1カプシドタンパク質との構造的相同性を有する。具体的な実施態様において、表2のいずれか1つのAAVクレードの番号0のVP1カプシドタンパク質との構造的相同性を有するVP1カプシドタンパク質は、既知のAAVではない。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質に対して約90％～99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質は、VP1 AAVカプシドタンパク質が、当技術分野で公知のもの、例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1配列、又はそれに由来するVP2及びVP3カプシドタンパク質であった場合、本開示によって包含されない。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、表2のいずれか1つのVP1カプシドタンパク質番号0に対して約90％～99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質は、VP1 AAVカプシドタンパク質が表4又は項目A又は項目B)に掲載されているものである場合、本開示によって包含されない。
表2:副表2.26～2.33におけるAAVクレード、AAV分岐、及び代表的配列
いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、新規参照カプシドのVP1、VP2、又はVP3(例えば、表2のいずれか1つのAAV VP1カプシドタンパク質番号0のVP1カプシドタンパク質、又はそれに由来するVP2もしくはVP3カプシドタンパク質)に対して少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、又は少なくとも94％の同一性のアミノ酸同一性を有するカプシドタンパク質である。ある実施態様において、AAVクレードメンバーは、新規参照カプシドのVP1、VP2、又はVP3(例えば、表2のいずれか1つのAAV VP1カプシドタンパク質番号0のVP1カプシドタンパク質、又はそれに由来するVP2もしくはVP3カプシドタンパク質)に対して少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、少なくとも99％の同一性、又は100％の同一性のアミノ酸同一性を有するカプシドタンパク質である。これらの実施態様に従って、具体的な実施態様において、当技術分野で公知であるAAVクレードメンバーは、本開示によって包含されない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。
いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、新規参照カプシドのVP1(例えば、表2のいずれか1つのAAV VP1カプシドタンパク質番号0のVP1カプシドタンパク質)に対して少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、又は少なくとも94％の同一性のアミノ酸同一性を有するカプシドタンパク質である。ある実施態様において、AAVクレードメンバーは、新規参照カプシドのVP1(例えば、表2のいずれか1つのAAV VP1カプシドタンパク質番号0のVP1カプシドタンパク質)に対して少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、少なくとも99％の同一性、又は100％の同一性のアミノ酸同一性を有するカプシドタンパク質である。これらの実施態様に従って、具体的な実施態様において、当技術分野で公知であるAAVクレードメンバーは、本開示によって包含されない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。
いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、新規参照カプシドのVP2(例えば、表2のいずれか1つのAAV VP1カプシドタンパク質番号0のVP2カプシドタンパク質)に対して少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、又は少なくとも94％の同一性のアミノ酸同一性を有するカプシドタンパク質である。ある実施態様において、AAVクレードメンバーは、新規参照カプシドのVP2(例えば、表2のいずれか1つのAAV VP1カプシドタンパク質番号0のVP2カプシドタンパク質)に対して少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、少なくとも99％の同一性、又は100％の同一性のアミノ酸同一性を有するカプシドタンパク質である。これらの実施態様に従って、具体的な実施態様において、当技術分野で公知であるAAVクレードメンバーは、本開示によって包含されない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。
いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、新規参照カプシドのVP3(例えば、表2のいずれか1つのAAV VP1カプシドタンパク質番号0のVP3カプシドタンパク質)に対して少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、又は少なくとも94％の同一性のアミノ酸同一性を有するカプシドタンパク質である。ある実施態様において、AAVクレードメンバーは、新規参照カプシドのVP3(例えば、表2のいずれか1つのAAV VP1カプシドタンパク質番号0のVP3カプシドタンパク質)に対して少なくとも95％の同一性、少なくとも96％の同一性、少なくとも97％の同一性、少なくとも98％の同一性、少なくとも99％の同一性、又は100％の同一性のアミノ酸同一性を有するカプシドタンパク質である。これらの実施態様に従って、具体的な実施態様において、当技術分野で公知であるAAVクレードメンバーは、本開示によって包含されない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。
いくつかの実施態様において、AAVカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の構造的相同性は、SSM(二次構造マッチング)プログラムを用いる構造アラインメントによって決定することができる。Krissinel E, Henrick K.の文献、二次構造マッチング(SSM)、三次元での高速タンパク質構造アラインメントのための新しいツール(Secondary-structure matching(SSM), a new tool for fast protein structure alignment in three dimensions). Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004 Dec;60(Pt 12 Pt 1):2256-68. doi: 10.1107/S0907444904026460を参照されたい。例えば、AAVカプシドウイルスタンパク質(VP)の結晶構造を決定し、AAVクレードの代表的メンバーのVPの結晶構造と比較することができる。AAVカプシドタンパク質の結晶構造は、低温EM(X線結晶学)又は低温再構築を用いて決定することができる。
(6.3.2.2 代表的配列)
本開示はまた、代表的配列と実質的に関連しているそのVP1配列によって分類されたAAVクレードを提供する。そのようなAAVクレードの代表的配列は、表2に記載されており、番号「0」と表記されている。
本開示はまた、代表的配列と実質的に関連しているそのVP1配列によって分類されたAAVクレードを提供する。そのようなAAVクレードの代表的配列は、表2に記載されており、番号「0」と表記されている。
新規AAVクレードの代表的配列は、ClustalW(例えば、コストマトリックスBLOSUM、ギャップオープンコスト10、及びギャップ伸長コスト0.1のClustalW)などのアルゴリズム、並びに引用により組み込まれる以下の論文、Weizhong Li、Lukasz Jaroszewski、及びAdam Godzikの文献、Bioinformatics(2001) 17:282-283、Weizhong Li、Lukasz Jaroszewski、及びAdam Godzikの文献、Bioinformatics(2002) 18: 77-82, PDF, Pubmed; Weizhong Li及びAdam Godzikの文献、Bioinformatics(2006) 22:1658-165に記載されているCD-HIT又はUSEARCHなどのクラスタリングアルゴリズムを用いて決定することができる。簡潔に説明すると、クラスタリングアルゴリズムは、アミノ酸配列の組を長さによって選別する。典型的には、最も長い配列がクラスターの代表的配列になる。その後、その組の各々の残りの配列を代表的配列と比較する。代表的配列と比較して、各々の残りの配列の配列類似性又は同一性が目的の閾値内である場合、そのクラスターのメンバーとして含まれる。
代表的配列を用いて、新規クレードを同定した。2以上のメンバーを有する全てのAAVクレードについてのVP1カプシドタンパク質のアラインメントは、図4～10に提供されている。これまで同定されたメンバーが1つだけのAAVクレードについては、アラインメントは提供されていないが、表2に示されている。ある実施態様において、クレードメンバーは、表2.26～2.33のいずれか1つに掲載されているAAVクレードメンバーのうちの1つ又は複数を含むことができる。具体的な実施態様において、クレード2の新規AAVカプシドタンパク質は、表2.26の番号0、2～8、又は10～43のいずれか1つ又は全てを含む。具体的な実施態様において、クレード5の新規AAVカプシドタンパク質は、表2.27の番号2～21のいずれか1つ又は両方を含む。具体的な実施態様において、クレード8の新規AAVカプシドタンパク質は、表2.28の番号0～12のいずれか1つ又は全てを含む。具体的な実施態様において、クレード20の新規AAVカプシドタンパク質は、表2.29の番号1及び2のいずれか1つ又は両方を含む。具体的な実施態様において、クレード14の新規AAVカプシドタンパク質は、表2.30の番号0～3のいずれか1つ又は全てを含む。具体的な実施態様において、クレード19の新規AAVカプシドタンパク質は、表2.31の番号0～2のいずれか1つ又は全てを含む。具体的な実施態様において、クレード39の新規AAVカプシドタンパク質は、表2.31aの番号0～1のいずれか1つ又は全てを含む。具体的な実施態様において、クレード30の新規AAVカプシドタンパク質は、表2.32の番号0を含む。具体的な実施態様において、クレード31の新規AAVカプシドタンパク質は、表2.32の番号0を含む。具体的な実施態様において、クレード41の新規AAVカプシドタンパク質は、表2.32の番号0を含む。具体的な実施態様において、クレード44の新規AAVカプシドタンパク質は、表2.32の番号0を含む。具体的な実施態様において、クレード27の新規AAVカプシドタンパク質は、表2.33の番号0及び1のいずれか1つ又は両方を含む。
具体的な実施態様において、クレード2のメンバーは、表2.26に列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.26の番号0～43のいずれか1つのAAVカプシドのアミノ酸配列を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシド(例えば、表2.26の番号1及び9)をもたらさない。具体的な実施態様において、クレード5のメンバーは、表2.27に列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.27の番号0～21のいずれか1つのAAVカプシドのアミノ酸配列を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシド(例えば、表2.27の番号0、1、及び4～21)をもたらさない。具体的な実施態様において、クレード8のメンバーは、表2.28に列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.28の番号0～12のいずれか1つのAAVカプシドのアミノ酸配列を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシドをもたらさない。具体的な実施態様において、クレード14のメンバーは、表2.30に列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.30の番号0～3のいずれか1つのAAVカプシドのアミノ酸配列を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシドをもたらさない。具体的な実施態様において、クレード19のメンバーは、表2.31に列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.31の番号0～2のいずれか1つのAAVカプシドのアミノ酸配列を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシドをもたらさない。具体的な実施態様において、クレード39のメンバーは、表2.31aに列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.31aの番号0～1のいずれか1つのAAVカプシドのアミノ酸配列を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシドをもたらさない。具体的な実施態様において、クレード30、31、41、又は44のメンバーは、1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.32の番号0のAAVカプシドの突然変異(例えば、アミノ酸配列)を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシドをもたらさない。具体的な実施態様において、クレード27のメンバーは、表2.33に列挙されている1以上の突然変異、例えば、1以上のアミノ酸置換(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又はそれより多く)を有する表2.33の番号0～1のいずれか1つのAAVカプシドの突然変異(例えば、アミノ酸配列)を含み、ただし、該突然変異(例えば、アミノ酸置換)は、既知のAAVカプシドをもたらさない。
具体的な実施態様において、本開示の新規AAVクレードのAAVカプシドメンバーは、新規AAVクレードの代表的アミノ酸配列と実質的に関連しているVP1アミノ酸配列を有する。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約90％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約91％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約92％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約93％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約94％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約95％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約96％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約97％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約98％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、クレード2のメンバーである。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、5のメンバーである。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、8のメンバーである。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、クレード20のメンバーである。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、クレード14のメンバーである。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、クレード19のメンバーである。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、クレード39のメンバーである。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、クレード30のメンバーである。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、クレード31のメンバーである。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、クレード41のメンバーである。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、クレード44のメンバーである。いくつかの実施態様において、AAVクレードメンバーは、クレード27のメンバーである。
いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.26のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約90％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.26のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約91％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.26のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約92％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.26のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約93％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.26のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約94％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.26のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約95％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.26のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約96％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.26のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約97％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.26のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約98％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.26のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、既知のAAVカプシドではない。
いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.27のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約90％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.27のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約91％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.27のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約92％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.27のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約93％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.27のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約94％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.27のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約95％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.27のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約96％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.27のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約97％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.27のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約98％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.27のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、既知のAAVカプシドではない。
いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.28のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約90％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.28のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約91％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.28のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約92％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.28のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約93％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.28のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約94％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.28のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約95％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.28のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約96％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.28のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約97％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.28のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約98％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.28のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、既知のAAVカプシドではない。
いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.29のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約90％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.29のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約91％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.29のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約92％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.29のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約93％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.29のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約94％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.29のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約95％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.29のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約96％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.29のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約97％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.29のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約98％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.29のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、既知のAAVカプシドではない。
いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.30のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約90％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.30のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約91％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.30のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約92％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.30のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約93％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.30のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約94％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.30のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約95％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.30のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約96％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.30のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約97％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.30のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約98％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.30のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、既知のAAVカプシドではない。
いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約90％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約91％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約92％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約93％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約94％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約95％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約96％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約97％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約98％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、既知のAAVカプシドではない。
いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31aのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約90％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31aのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約91％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31aのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約92％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31aのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約93％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31aのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約94％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31aのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約95％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31aのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約96％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31aのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約97％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31aのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約98％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.31aのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、既知のAAVカプシドではない。
いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.32のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約90％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.32のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約91％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.32のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約92％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.32のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約93％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.32のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約94％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.32のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約95％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.32のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約96％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.32のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約97％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.32のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約98％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.32のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、既知のAAVカプシドではない。
いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.33のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約90％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.33のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約91％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.33のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約92％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.33のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約93％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.33のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約94％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.33のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約95％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.33のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約96％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.33のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約97％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.33のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約98％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2.33のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、既知のAAVカプシドではない。
具体的な実施態様において、本開示の新規AAVクレードのAAVカプシドメンバーは、新規AAVクレードの代表的アミノ酸配列と実質的に関連しているVP1アミノ酸配列を有し、かつ該VP1アミノ酸配列の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)は、新規AAVクレードの代表的アミノ酸配列の対応する1以上の可変領域と同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約90％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)は、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域と同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約91％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)は、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域と同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約92％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)は、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域と同一である。具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約93％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)は、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域と同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約94％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)は、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域と同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約95％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)は、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域と同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約96％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)は、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域と同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約97％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)は、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域と同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約98％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の対応する1以上の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)は、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域と同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)は、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域と同一である。
具体的な実施態様において、本開示の新規AAVクレードのAAVカプシドメンバーは、新規AAVクレードの代表的アミノ酸配列と実質的に関連しているVP1アミノ酸配列を有し、かつ該VP1アミノ酸配列の対応するVRI～VRIXのうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかは、新規AAVクレードの代表的アミノ酸配列の対応するVRI～VRIXのうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかと同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約90％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかは、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかと同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約91％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかは、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかと同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約92％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかは、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかと同一である。具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約93％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の対応する1以上の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかは、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかと同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約94％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかは、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかと同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約95％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかは、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかと同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約96％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかは、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかと同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約97％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかは、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかと同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約98％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかは、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかと同一である。別の具体的な実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、かつ該VP1カプシドタンパク質の可変領域のうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかは、クレードメンバー0の対応する1以上の可変領域、及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかと同一である。
ある実施態様において、本開示の新規AAVクレードのAAVカプシドメンバーは、新規AAVクレードの代表的アミノ酸配列と実質的に関連しているVP1アミノ酸配列を有し、ただし、該AAVカプシドメンバーは、当技術分野で公知ではない。すなわち、本開示は、当技術分野で公知であるAAVカプシドメンバーを包含しない。例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない。
ある実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約90の％同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、ただし、AAVカプシドメンバーは、当技術分野で公知ではない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約91の％同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、ただし、AAVカプシドメンバーは、当技術分野で公知ではない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。ある実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約92％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、ただし、AAVカプシドメンバーは、当技術分野で公知ではない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約93の％同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、ただし、AAVカプシドメンバーは、当技術分野で公知ではない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。ある実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約94の％同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、ただし、AAVカプシドメンバーは、当技術分野で公知ではない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約95の％同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、ただし、AAVカプシドメンバーは、当技術分野で公知ではない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。ある実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約96の％同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、ただし、AAVカプシドメンバーは、当技術分野で公知ではない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約97の％同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、ただし、AAVカプシドメンバーは、当技術分野で公知ではない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約98の％同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、ただし、AAVカプシドメンバーは、当技術分野で公知ではない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。いくつかの実施態様において、本開示によって包含されるAAVクレードメンバーは、表1のAAVクレードメンバー番号0のVP1に対して少なくとも約99％の同一性を有するVP1カプシドタンパク質を含み、ただし、AAVカプシドメンバーは、当技術分野で公知ではない(例えば、「BCD」以外の接頭辞を付して、表2のいずれか1つに開示されているAAV VP1カプシド配列及び表4又は項目A又は項目B)に掲載されているAAVのいずれかのVP1カプシド配列は、本開示によって包含されない)。
(6.3.2.3 共通の可変領域)
本開示はまた、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)に基づいて分類されたAAVクレードを提供する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのAAVメンバーは、1以上の共通の可変領域を有する。すなわち、可変領域がAAVクレードメンバー間で実質的な配列類似性又は同一性を有するように、ウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)にわたる1以上の共通の可変領域のアミノ酸配列。
本開示はまた、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)に基づいて分類されたAAVクレードを提供する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのAAVメンバーは、1以上の共通の可変領域を有する。すなわち、可変領域がAAVクレードメンバー間で実質的な配列類似性又は同一性を有するように、ウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)にわたる1以上の共通の可変領域のアミノ酸配列。
いくつかの実施態様において、カプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域は、無関係な又は関連するAAVカプシドのカプシドウイルスタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)とのアミノ酸配列の多重配列アラインメントによって決定することができる。例えば、AAV-9のVP1カプシドタンパク質にまたがる可変領域は、それをAAV-2又はAAV-4のVP1カプシドタンパク質と比較することにより同定することができ;そのような多重配列アラインメントは、AAV-2及びAAV-4と比べたAAV9 VP1カプシドウイルスタンパク質中の可変領域(様々に変化するアミノ酸残基)を決定する。
いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約90％～99％の類似性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約90％の類似性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約91％の類似性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約92％の類似性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約93％の類似性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約94％の類似性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約95％の類似性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約96％の類似性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約97％の類似性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約98％の類似性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約99％の類似性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。
いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約90％～99％の同一性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約90％の同一性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約91％の同一性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約92％の同一性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約93％の同一性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約94％の同一性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約95％の同一性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約96％の同一性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約97％の同一性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約98％の同一性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVクレードのメンバーは、本明細書に記載される技法(例えば、ClustalW)又は当業者に公知の技法を用いて、AAVクレードメンバーのウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域と別のAAVクレードメンバー(例えば、表2のいずれか1つのAAVクレードメンバー番号0)のウイルスカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域の間に約99％の同一性がある場合、共通の可変領域(例えば、VRI～VRIX、GBS、又はGHループ)を有する。
他の実施態様において、カプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)の可変領域は、SSM(二次構造マッチング)プログラムを用いる構造アラインメントによって決定することができる。引用により本明細書中に完全に組み込まれる、Krissinel E, Henrick K.の文献、二次構造マッチング(SSM)、三次元での高速タンパク質構造アラインメントのための新しいツール(Secondary-structure matching(SSM), a new tool for fast protein structure alignment in three dimensions). Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004 Dec;60(Pt 12 Pt 1):2256-68. doi: 10.1107/S0907444904026460を参照されたい。例えば、新規AAVカプシドウイルスタンパク質(VP)の結晶構造を決定し、高分解能結晶構造が利用可能であるAAV-2、AAV-3b、AAV-4、AAV-6、又はAAV-8などのAAVのVPと比較することができる。AAVカプシドタンパク質の結晶構造は、低温EM(X線結晶学)又は低温再構築を用いて決定することができる。いくつかの実施態様において、クレード特異的ループ立体構造は、引用により本明細書中に完全に組み込まれる、Mietzsch Mらの文献、Viruses. 2021; 13(1):101. doi.org/10.3390/v13010101に開示されているように、AAVクレードを決定するのに使用される。
具体的な実施態様において、新規AAVカプシドVP1タンパク質の可変領域の位置は、実施例9の表8に記載されているように同定することができる。ある実施態様において、可変領域のN-末端及び/又はC-末端の位置は、決定された可変領域のアミノ酸位置と最大1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、又は5アミノ酸だけ異なり得る。
(6.3.2.4 系統発生)
本開示はまた、そのVP1の系統発生的類似性によって分類されたAAV分離株(すなわち、AAVメンバー)のAAVクレードを提供する。また提供されるのは、系統発生的に無関係であるVP1カプシド配列を有するAAVメンバーを含む異なるAAVクレードである。いくつかの実施態様において、AAVクレードは、1つのAAVメンバーを含む。他の実施態様において、AAVクレードは、少なくとも2つのAAVメンバーを含む。本開示の系統発生的に関連するAAVクレード及び系統発生的に異なるAAVクレードの例は、図3～11に提供されている。
本開示はまた、そのVP1の系統発生的類似性によって分類されたAAV分離株(すなわち、AAVメンバー)のAAVクレードを提供する。また提供されるのは、系統発生的に無関係であるVP1カプシド配列を有するAAVメンバーを含む異なるAAVクレードである。いくつかの実施態様において、AAVクレードは、1つのAAVメンバーを含む。他の実施態様において、AAVクレードは、少なくとも2つのAAVメンバーを含む。本開示の系統発生的に関連するAAVクレード及び系統発生的に異なるAAVクレードの例は、図3～11に提供されている。
AAV VP1アミノ酸配列の系統発生は、例えば、Clustal(例えば、Clustal W)などのアラインメントプログラムを用いるVP1カプシドタンパク質との多重配列アラインメントによって決定することができる。使用することができるアミノ酸配列用の他の非限定的な多重配列アラインメントプログラムは、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」、及び「Match-Box」プログラムである。通常、これらのプログラムはいずれも、デフォルト設定で使用されるが、当業者は、必要に応じて、これらの設定を変更することができる。或いは、参照されたアルゴリズム及びプログラムによって提供されるもののような少なくともパーセント同一性又はアラインメントを提供する任意の他のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを使用することができる。例えば、J. D. Thomsonらの文献、Nucl. Acids. Res.、「多重配列アラインメントの包括的比較(A comprehensive comparison of multiple sequence alignments)」、27(13):2682-2690(1999)を参照されたい。
多重配列アラインメントを行った後、系統樹の遺伝的距離を、例えば、Geneious Primeなどのバイオインフォマティクスソフトウェアを使用する近隣結合法又はUPGMA法を用い、Jukes-Cantorなどの適切な遺伝的距離モデルを選択して生成させることができる。AAV VP1アミノ酸配列の系統発生は、それが本開示の新規AAVクレードと系統発生的に関連している場合、そのような系統発生的出力によって決定される。本開示の系統発生的なAAVクレード及びAAV分岐の例は、図3～12に提供されている。
本開示のAAVクレードの遺伝的距離は、表3に提供されている。同じAAVクレード内のAAVメンバー、同じAAV分岐内の他のAAVクレード、又は無関係なAAV分岐内の他のAAVクレードと比較したときの平均、最小、及び最大遺伝的距離は、下の表3に提供されている。
表3:新規AAVクレード及びAAV分岐の遺伝的距離
いくつかの実施態様において、AAVクレードは、少なくとも2つのAAVメンバーを含み、ここで、各々のAAVメンバーは、近隣結合法を用いて、そのVP1アミノ酸配列を比較することにより決定したとき、系統発生的に関連しており、ここで、AAVメンバーのVP1アミノ酸配列は、各々の他のAAVメンバーのVP1アミノ酸配列に対して、表3に提供される遺伝的距離(すなわち、クレード内の平均、最小、又は最大遺伝的距離)を有する。ある実施態様において、AAVクレードの少なくとも1つのAAVメンバーは、配列番号1～96及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列を含む。
新規AAV分岐
新規AAVクレードに加えて、本開示はまた、共通の系統発生(例えば、遺伝的距離もしくはカプシド配列同一性)及び/又は共通の機能に基づく、新規AAV分岐(すなわち、異なるAAVクレードの群)を提供する。いくつかの実施態様において、AAV分岐は、表3に記載されているような最小、最大、及び平均遺伝的距離によって定義される。いくつかの実施態様において、AAV分岐は、ヒト血清による中和を回避する(すなわち、AAV液性免疫を回避する)AAVクレードプロファイルによって定義される。例えば、実施例4及び図12A～Bを参照されたい。いくつかの実施態様において、AAV分岐は、遺伝的距離及びAAV液性免疫を回避するプロファイルによって定義される。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、系統発生的に関連しているAAVカプシド配列の分岐である。いくつかの実施態様において、AAV分岐は、少なくとも2つのAAVメンバーを含み、ここで、各々のAAVメンバーは、近隣結合法を用いて、そのVP1アミノ酸配列を比較することにより決定したとき、系統発生的に関連しており、ここで、AAVメンバーのVP1アミノ酸配列は、表3に提供される遺伝的距離(すなわち、同じ分岐の他のクレードとしての平均又は範囲最小又は最大遺伝的距離)を有する。いくつかの実施態様において、AAV分岐の少なくとも1つのAAVメンバーは、配列番号1～96及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様において、アデノ随伴ウイルス(AAV)分岐は、少なくとも2つのAAVメンバーを含み、ここで、各々のAAVメンバーは、近隣結合法を用いて、そのVP1アミノ酸配列を比較することにより決定したとき、系統発生的に関連しており、ここで、AAVメンバーのVP1アミノ酸配列は、各々の他のAAVメンバーのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも40％の同一性を有し、かつここで、AAV分岐の少なくとも1つのAAVメンバーは、表2の番号0のVP1アミノ酸配列を含む。ある実施態様において、AAV分岐の各々のAAVメンバーは、表2の番号0のVP1アミノ酸配列の対応する1以上の可変領域と同一であるVP1アミノ酸配列の1以上の可変領域(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ)を含む。いくつかの実施態様において、AAV分岐の各々のAAVメンバーは、表2の番号0のVP1アミノ酸配列のGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方と同一であるVP1アミノ酸配列のGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方を含む。ある実施態様において、AAV分岐の各々のAAVメンバーは、表2の番号0のVP1アミノ酸配列の対応するVRI～VRIXのうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれか1つと同一であるVP1アミノ酸配列のVRI～VRIXのうちの1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は全て)及びGBS、GHループ、又はGBSとGHループの両方のいずれかを含む。
(6.3.2.5 指向性)
本開示を検討したとき、本開示の特定の新規AAVクレード、AAV分岐、及び/又は個々のAAVカプシド配列が、その細胞/組織特異性、例えば、指向性に基づく特定の生物医学用途のためのrAAVベースのベクター及び/又はrAAVウイルス粒子として特に有用であることが当業者に容易に明らかであろう。
本開示を検討したとき、本開示の特定の新規AAVクレード、AAV分岐、及び/又は個々のAAVカプシド配列が、その細胞/組織特異性、例えば、指向性に基づく特定の生物医学用途のためのrAAVベースのベクター及び/又はrAAVウイルス粒子として特に有用であることが当業者に容易に明らかであろう。
例えば、クレードの新規AAV配列を用いて作製されたウイルス粒子は、生体分子(例えば、治療的生体分子)又は薬剤を、心筋を含む筋肉組織に送達するのに有用である。一方、異なるクレードのAAVカプシド配列を用いて作製されたウイルス粒子は、生体分子(例えば、治療的生体分子)又は薬剤を肝臓、脳、又はCNSに送達するのに有用である。クレードを含む新規AAV配列のそのような使用は限定されず、当業者は、これらを他の細胞型、組織、又は器官への送達に利用することができる。
いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、細胞型又は組織に対する同様又は同等の指向性を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、細胞型又は組織に対する増強された/増加した指向性を有する。参照AAVは、天然に存在するAAV血清型(例えば、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-rh10、AAV-11、AAV-12、又はAAV-13)であってもよい。或いは、参照AAVは、キメラカプシド、人工カプシド、又はハイブリッドカプシドを含む既知のAAVであってもよい。いくつかの実施態様において、参照AAVは、下の実施例に記載されているものである。いくつかの実施態様において、参照AAVは、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAVrh.43、又はAAV9である。新規rAAVウイルス粒子が修飾されたAAVカプシド配列(例えば、上の第6.3.1.4節に記載されているもの)を含む場合、対応する未修飾AAVカプシド配列を有する新規rAAVウイルス粒子が参照AAVとして使用されてもよい。さらに、参照AAVは、本開示の別の新規ウイルス粒子と比較される本開示のある新規rAAVウイルス粒子であってもよい。
いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、CNS、心臓、肺、気管、食道、筋肉、骨、軟骨、胃、膵臓、腸、肝臓、膀胱、腎臓、尿管、尿道、子宮、ファローピウス管、卵巣、精巣、前立腺、目、血液、リンパ、又は口腔粘膜由来の細胞又は組織に対する指向性を有する。ある実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、筋肉細胞(例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、横隔膜筋細胞、及び/もしくは心筋細胞)又は筋肉組織(例えば、骨格筋、平滑筋、横隔膜筋、及び/もしくは心筋)に対する指向性を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、肝臓細胞又は肝臓組織に対する指向性を有する。ある実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、脊髄細胞又は脊髄組織に対する指向性を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、CNS細胞又はCNS組織(例えば、脳組織を含む)に対する指向性を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、耳細胞又は耳組織に対する指向性を有する。ある実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、以下の細胞:ニューロン、グリア細胞、アストロサイト、オリゴデンドログリア、ミクログリア、シュワン細胞、上衣細胞、星状脂肪蓄積細胞、クッパー細胞、肝細胞、肝臓内皮細胞、眼細胞、上皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、膵臓細胞、肺細胞、T細胞、B細胞、造血幹細胞、及び胚性幹細胞のうちの1つ、2つ、又はそれより多くに対する指向性を有する。具体的な実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子の生体分布は、当業者に公知の又は本明細書(例えば、下の実施例(例えば、実施例6もしくは7))に記載される技法を用いて評価される。別の具体的な実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子の脳組織における生体分布は、当業者に公知の又は本明細書に記載される技法(例えば、下の実施例(例えば、実施例8))に記載される技法を用いて評価される。
いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAV(例えば、AAV-1、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10)と比較して、増強された筋肉指向性(例えば、ヒト骨格筋指向性又は平滑筋指向性)を有する。他の実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAV(例えば、AAV-1、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10)と比較して、同様又は同等の筋肉指向性(例えば、ヒト骨格筋指向性又は平滑筋指向性)を有する。ある実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAV(例えば、AAV-1、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-9、AAV-9-PHP.eB、又はAAV-rh10)と比較して、増強された中枢神経系(CNS)指向性を有する。他の実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAV(例えば、AAV-1、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-9、AAV-9-PHP.eB、又はAAV-rh10)と比較して、同様又は同等の中枢神経系(CNS)指向性を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAV(例えば、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAVrh.43、もしくはAAV-9、又はAAV-9-PHP.eB)と比較して、増強された脳指向性を有する。他の実施態様において、本開示の新規AAVは、参照AAV(例えば、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAVrh.43、AAV-9、又はAAV-9-PHP.eB)と比較して、同様又は同等の脳指向性を有する。ある実施態様において、本開示の新規AAVは、参照AAV(例えば、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh.10)と比較して、増強された心臓指向性を有する。他の実施態様において、本開示の新規AAVは、参照AAV(例えば、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10)と比較して、同様又は同等の心臓指向性を有する。ある実施態様において、本開示の新規AAVは、参照AAV(例えば、AAV-2、AAV-3、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10)と比較して、増強された肝臓指向性を有する。他の実施態様において、本開示の新規AAVは、参照AAV(例えば、AAV-2、AAV-3、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10)と比較して、同様又は同等の肝臓指向性を有する。他の実施態様において、本開示の新規AAVは、参照AAV(例えば、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-5、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10)と比較して、より低い肝臓指向性を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規AAVは、参照AAV(例えば、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-9-PHP.B、又はAAV-rh10)と比較して、同様又は同等の耳指向性を有する。他の実施態様において、本開示の新規AAVは、参照AAV(例えば、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-9-PHP.B、又はAAV-rh.10)と比較して、同様又は同等の耳指向性を有する。指向性は、本明細書(例えば、下の実施例)に記載される技法又は当業者に公知の技法によって評価することができる。ある実施態様において、本開示の新規AAVは、参照AAV(例えば、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10)と比較して、増強された癌指向性を有する。他の実施態様において、本開示の新規AAVは、参照AAV(例えば、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10)と比較して、同様又は同等の癌指向性を有する。
いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、特定の細胞型又は組織に対する約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％大きい指向性を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、特定の細胞型又は組織に対する少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％大きい指向性を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、特定の細胞型又は組織に対する約55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又は100％大きい指向性を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、特定の細胞型又は組織に対する少なくとも約55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又は100％大きい指向性を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、特定の細胞型又は組織に対する約125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、又は500％大きい指向性を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、特定の細胞型又は組織に対する少なくとも約125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、又は500％大きい指向性を有する。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は筋肉である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は筋肉であり、参照AAVは、AAV-1、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は心臓である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は心臓であり、参照AAVは、AAV-1、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は脳である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は脳であり、参照AAVは、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAVrh.43、AAV-9、AAV-9-PHP.eBである。いくつかの実施態様において、細胞型はニューロンである。いくつかの実施態様において、細胞型はニューロンであり、参照AAVは、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAVrh.43、AAV-9、又はAAV-9-PHP.eBである。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は血漿である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は血漿であり、参照AAVは、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は腎臓である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は腎臓であり、参照AAVは、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は肝臓である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は肝臓であり、参照AAVは、AAV-2、AAV-3、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh.10である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は耳である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は耳であり、参照AAVは、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-9-PHP.B、又はAAV-rh10である。
いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、特定の細胞型又は組織に対する5％～25％、15％～30％、25％～50％、又は40％～50％大きい指向性を有する。ある実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、特定の細胞型又は組織に対する55％～75％、70％～85％、75％～95％、90％～99％、又は75％～100％大きい指向性を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、特定の細胞型又は組織に対する約125％～200％、200％～250％、150％～300％、200％～400％、250％～500％、又は400％～500％大きい指向性を有する。具体的な実施態様において、特定の細胞型又は組織に対する指向性は、当業者に公知の又は本明細書に記載される技法を用いて評価される。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は筋肉である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は筋肉であり、参照AAVは、AAV-1、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh.10である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は心臓である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は心臓であり、参照AAVは、AAV-1、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh.10である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は脳である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は脳であり、参照AAVは、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAVrh.43、AAV-9、又はAAV-9-PHP.ebである。いくつかの実施態様において、細胞型はニューロンである。いくつかの実施態様において、細胞型はニューロンであり、参照AAVは、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAVrh.43、もしくはAAV-9、又はAAV9-PHP.ebである。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は血漿である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は血漿であり、参照AAVは、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は腎臓である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は腎臓であり、参照AAVは、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh.10である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は肝臓である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は肝臓であり、参照AAVは、AAV-2、AAV-3、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh.10である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は耳である。いくつかの実施態様において、細胞型又は組織は耳であり、参照AAVは、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-9-PHP.B、又はAAV-rh10である。
いくつかの実施態様において、参照AAVと比較して特定の細胞型又は組織に対する増加した指向性を有する本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVに組み込まれる同じ導入遺伝子によってコードされる同じ遺伝子産物の発現と比較して、新規rAAVウイルス粒子に組み込まれる導入遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現が増加している。ある実施態様において、新規rAAVウイルス粒子に組み込まれる導入遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現は、参照AAVに組み込まれる同じ導入遺伝子によってコードされる同じ遺伝子産物の発現よりも5％～25％、15％～30％、25％～50％、又は40％～50％大きい。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子に組み込まれる導入遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現は、参照AAVに組み込まれる同じ導入遺伝子によってコードされる同じ遺伝子産物の発現よりも55％～75％、70％～85％、75％～95％、90％～99％、又は75％～100％大きい。ある実施態様において、新規rAAVウイルス粒子に組み込まれる導入遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現は、参照AAVに組み込まれる同じ導入遺伝子によってコードされる同じ遺伝子産物の発現よりも125％～200％、200％～250％、150％～300％、200％～400％、250％～500％、又は400％～500％大きい。いくつかの実施態様において、遺伝子産物の発現は、当業者に公知の技法(例えば、ノーザンブロット、RT-PCRなど)又は本明細書に記載される技法によってRNAレベルで測定される。ある実施態様において、遺伝子産物の発現は、当業者に公知の技法(例えば、ウェスタンブロット、ELISA、もしくは別の免疫アッセイ)又は本明細書に記載される技法によってタンパク質レベルで測定される。
いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、特定の細胞又は組織(例えば、肝臓細胞又は肝臓)に対する減少した指向性を有する。いくつかの実施態様において、減少は、参照AAVと比較した特定の細胞型又は組織(例えば、肝臓細胞又は肝臓)に対する指向性の約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％の減少である。
いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、増加した形質導入効率を有する。ある実施態様において、新規rAAVウイルス粒子の形質導入効率は、参照AAVと比較して、約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、又は50倍よりも大きく増加している。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子の形質導入効率は、参照AAVと比較して、少なくとも約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、又は50倍よりも大きく増加している。ある実施態様において、新規rAAVウイルス粒子の形質導入効率は、参照AAVと比較して、約1倍～3倍、2倍～5倍、5倍～10倍、又は10倍～20倍増加している。具体的な実施態様において、形質導入効率は、当業者に公知の又は本明細書(例えば、下の実施例(例えば、実施例5))に記載される技法によって決定される。
いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、増加した形質導入効率を有する。ある実施態様において、新規rAAVウイルス粒子の形質導入効率は、参照AAVと比較して、約0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、3log、又はそれよりも大きく増加している。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子の形質導入効率は、参照AAVと比較して、少なくとも約0.5log、少なくとも約1log、少なくとも約1.5log、少なくとも約2log、少なくとも約2.5log、少なくとも約3log、又はそれよりも大きく増加している。ある実施態様において、新規rAAVウイルス粒子の形質導入効率は、参照AAVと比較して、約0.5log～3log、0.5log～2.5log、0.5log～2log、0.5log～1.5log、又は0.5log～1log増加している。ある実施態様において、新規rAAVウイルス粒子の形質導入効率は、参照AAVと比較して、約1log～3log、1log～2.5log、1log～2log、又は1log～1.5log増加している。ある実施態様において、新規rAAVウイルス粒子の形質導入効率は、参照AAVと比較して、約2log～2.5log又は2log～3log増加している。具体的な実施態様において、形質導入効率は、当業者に公知の又は本明細書(例えば、下の実施例(例えば、実施例5))に記載される技法によって決定される。
いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、当業者に公知の又は本明細書に記載される(例えば、実施例7、8、もしくは10に記載される)技法によって評価したとき、参照AAV(例えば、AAV-1、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh.10)と比べて、特定の細胞又は組織に対する増加した指向性を有する一方、別の細胞又は組織を標的から外す。具体的な実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、当業者に公知の又は本明細書に記載される(例えば、実施例6及び7に記載される)技法によって評価したとき、参照AAVと比べて、心臓に対する増加した指向性を有する一方、肝臓を標的から外す。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、又は少なくとも70％大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも0.5log、少なくとも1log、少なくとも1.5log、少なくとも2log、少なくとも2.5log、又は少なくとも3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、又は3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも0.5log～3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも0.5log～2log、0.5log～2.5log、0.5log～3log、1log～3log、又は1log～2log大きい増加である。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、下の実施例7の「BCD_」という接頭辞を有するカプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAV粒子は、BCD_0388カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAV粒子は、BCD_0132カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAV粒子は、BCD_0147カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAV粒子は、BCD_0202カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAV(例えば、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAVrh.43、もしくはAAV-9、又はAAV9-PHP.eb)と比べて、脳組織に対する増加した指向性を有する。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAV(例えば、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAVrh.43、AAV-9、又はAAV-9-PHP.eb)と比べて、脳ニューロンに対する増加した指向性を有する。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、又は少なくとも70％大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも30％～50％又は50％～75％大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも0.5log、少なくとも1log、少なくとも1.5log、少なくとも2log、少なくとも2.5log、又は少なくとも3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、又は3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも0.5log～3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも0.5log～2log、0.5log～2.5log、0.5log～3log、1log～3log、又は1log～2log大きい増加である。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、下の実施例6又は8の「BCD_」という接頭辞を有するカプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、BCD_0132カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、BCD_0147カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAV(例えば、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh.10)と比べて、筋肉に対する増加した指向性を有する。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、下の実施例6の「BCD_」という接頭辞を有するカプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、BCD_0388カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAV(例えば、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-PHP.B、又はAAV-rh.10)と比べて、耳に対する増加した指向性を有する。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、下の実施例10の「BCD_」という接頭辞を有するカプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、BCD_0202カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、当業者に公知の又は本明細書に記載される技法によって評価したとき、参照AAV(例えば、AAV-1、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10)と比べて、特定の細胞又は組織における増加した活性(例えば、導入遺伝子の発現)を有する。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、当業者に公知の又は本明細書に記載される技法によって評価したとき、参照AAV(例えば、AAV-1、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10)と比べて、心臓細胞又は心臓組織における増加した活性(例えば、導入遺伝子の発現)を有する。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、又は少なくとも70％大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも0.5log、少なくとも1log、少なくとも1.5log、少なくとも2log、少なくとも2.5log、又は少なくとも3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、又は3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも0.5log～3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも0.5log～2log、0.5log～2.5log、0.5log～3log、1log～3log、又は1log～2log大きい増加である。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、下の実施例4～8及び10のいずれか1つに示された「BCD_」という接頭辞を有するカプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、BCD_0388カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAV粒子は、BCD_0132カプシドタンパク質を含む。別の具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、BCD_0147カプシドタンパク質を含む。別の具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、BCD_0202カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAV(例えば、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAVrh.43、AAV-9、又はAAV-9-PHP.eb)と比べて、脳ニューロン又は脳組織における増加した活性(例えば、導入遺伝子の発現)を有する。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、又は少なくとも70％大きい増加である。ある実施態様において、増加は、高い神経細胞脳指向性/感染性(例えば、下の実施例8に記載されている)を有するエクスビボ脳スライスアッセイにおいて約30％～約50％高い平均正規化発現となる増加である。ある実施態様において、増加は、高い神経細胞脳指向性/感染性(例えば、下の実施例8に記載されている)を有するエクスビボ脳スライスアッセイにおいて約50％以上高い平均正規化発現となる増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも0.5log、少なくとも1log、少なくとも1.5log、少なくとも2log、少なくとも2.5log、又は少なくとも3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、又は3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも0.5log～3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも0.5log～2log、0.5log～2.5log、0.5log～3log、1log～3log、又は1log～2log大きい増加である。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、下の実施例6又は8に示された「BCD_」という接頭辞を有するカプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、BCD_0132カプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、BCD_0147カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAV(例えば、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10)と比べて、筋肉における増加した活性(例えば、導入遺伝子の発現)を有する。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、又は少なくとも70％大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも0.5log、少なくとも1log、少なくとも1.5log、少なくとも2log、少なくとも2.5log、又は少なくとも3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、又は3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも0.5log～3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも0.5log～2log、0.5log～2.5log、0.5log～3log、1log～3log、又は1log～2log大きい増加である。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、下の実施例6に示された「BCD_」という接頭辞を有するカプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、BCD_0388カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAV(例えば、AAV-2、AAV-3、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、又はAAV-rh10)と比べて、耳における増加した活性(例えば、導入遺伝子の発現)を有する。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、又は少なくとも70％大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも0.5log、少なくとも1log、少なくとも1.5log、少なくとも2log、少なくとも2.5log、又は少なくとも3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、又は3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも少なくとも0.5log～3log大きい増加である。いくつかの実施態様において、増加は、AAV参照よりも0.5log～2log、0.5log～2.5log、0.5log～3log、1log～3log、又は1log～2log大きい増加である。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、下の実施例10に示された「BCD_」という接頭辞を有するカプシドタンパク質を含む。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、BCD_0202カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施態様において、参照AAVは、AAV-1、AAV-2、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、及び/又はAAV-13である。ある実施態様において、参照AAVは、AAV-rh.10(AAVrh10)、AAV-DJ(AAVDJ)、AAV-DJ8(AAVDJ8)、AAV-1、AAV-2、AAV-2G9、AAV-3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV-5、AAV-6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV-7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突然変異体、AAVrh8R R533A突然変異体、AAAV、BAAV、ヤギAAV、ウシAAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-プレ-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAVシャッフル100-1、AAVシャッフル100-3、AAVシャッフル100-7、AAVシャッフル10-2、AAVシャッフル10-6、AAVシャッフル10-8、AAVシャッフル100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV10、もしくは日本AAV10血清型、AAV_po.6、AAV_po.、AAV_po.5、AAV_LK03、AAV_ra.1、AAV_コウモリ_YNM、AAV_コウモリ_ブラジル、AAV_mo.1、AAV_鳥類_DA-1、又はAAV_マウス_NY1である。この段落は、本明細書において、「項目A」と呼ばれることもある。
当業者に公知の技法を用いて、特定の細胞型又は組織型に対する新規rAAVの指向性を評価することができる。例えば、細胞、組織、又は対象におけるIVISアッセイ、イムノアッセイ(例えば、免疫染色又は免疫組織化学)を用いて、指向性を決定することができる。実施例6～8及び10も参照されたい。
(6.3.2.6 既存のAAV液性免疫の回避)
本開示は、AAVに対するポリクローナル血漿又は血清中の既に存在する抗体(NAb)による認識、結合、及び/又は中和を回避するその能力(すなわち、プロファイル)に基づく、特定の生物医学用途のためのAAVベースのベクター及び/又はrAAVウイルス粒子として特に有用であるrAAVウイルス粒子を提供する。NAbは、主に、AAVカプシドの露出した表面に結合し、細胞形質導入に不可欠なプロセスを遮断することにより機能する。したがって、既存のAAV液性免疫(AAV液性免疫とも呼ばれる)を回避する能力は、結合、IVIg中和、又は細胞形質導入などのインビトロアッセイのうちの1つ又は複数を用いて、新規AAVカプシドについて決定することができる。例えば、Giles, A. R.らの文献(2018). Journal of virology, 92(20), 1011-18を参照されたい。
本開示は、AAVに対するポリクローナル血漿又は血清中の既に存在する抗体(NAb)による認識、結合、及び/又は中和を回避するその能力(すなわち、プロファイル)に基づく、特定の生物医学用途のためのAAVベースのベクター及び/又はrAAVウイルス粒子として特に有用であるrAAVウイルス粒子を提供する。NAbは、主に、AAVカプシドの露出した表面に結合し、細胞形質導入に不可欠なプロセスを遮断することにより機能する。したがって、既存のAAV液性免疫(AAV液性免疫とも呼ばれる)を回避する能力は、結合、IVIg中和、又は細胞形質導入などのインビトロアッセイのうちの1つ又は複数を用いて、新規AAVカプシドについて決定することができる。例えば、Giles, A. R.らの文献(2018). Journal of virology, 92(20), 1011-18を参照されたい。
既存のAAV液性免疫を回避するrAAVウイルス粒子の能力は、プール血漿又は血清(すなわち、細胞株用の適切な培地中に正常対象からプールされたIgG)中の所与の細胞株における細胞形質導入のパーセンテージ(％形質導入)を決定することにより評価することができる。例えば、実施例4を参照されたい。
いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい範囲の形質導入を有する。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、細胞における少なくとも約2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％大きい形質導入を有する。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、細胞における少なくとも約20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％大きい形質導入を有する。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、細胞における少なくとも約55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又は100％大きい形質導入を有する。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、細胞における少なくとも約110％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、又は500％大きい形質導入を有する。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、細胞における少なくとも約250％、300％、350％、400％、又は500％大きい形質導入を有する。
いくつかの他の実施態様において、AAV液性免疫を回避するrAAVウイルス粒子の能力は、参照AAVと比較して、中和抗体(NAb)力価低下をもたらす新規AAVカプシドの効果的なIgG中和力価を決定することにより評価することができる。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍の範囲のNAb力価低下を有し、例えば、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、約10倍～約25倍、約25倍～約50倍、約50倍～約75倍、約75倍～約100倍、約100倍～約150倍、約150倍～約200倍、約200倍～約250倍、約250倍～約300倍、少なくとも約350倍、少なくとも約400倍、約400倍～約450倍、約450倍～約500倍、約500倍～約550倍、約550倍～約600倍、約600倍～約700倍、約700倍～約800倍、約800倍～約900倍、約900倍～約1000倍、約1,000倍～約2,000倍、約2,000倍～約3,000倍、約3,000倍～約4,000倍のNAb力価低下を有する。
いくつかの実施態様において、新規AAVカプシド、AAVクレード、又はAAV分岐メンバーがAAV液性免疫を回避する能力は、線形目盛の参照AAVに対して対数目盛のデータをプロットすること(片対数プロット)により新規AAVカプシドのNC50の最良適合線を決定し、その後、例えば、GraphPad Prismなどの科学的グラフ作成プログラムを用いて最良適合線を決定することにより評価することができる。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍の範囲のNC50の増加を有し、例えば、新規rAAV粒子は、参照AAVと比較して、約10倍～約25倍、約25倍～約50倍、約50倍～約75倍、約75倍～約100倍、約100倍～約150倍、約150倍～約200倍、約200倍～約250倍、約250倍～約300倍、少なくとも約350倍、少なくとも約400倍、約400倍～約450倍、約450倍～約500倍、約500倍～約550倍、約550倍～約600倍のNC50の増加を有する。いくつかの実施態様において、新規AAVカプシド、AAVクレード、又はAAV分岐メンバーがAAV液性免疫を回避する能力は、新規AAVカプシド、AAVクレード、又はAAV分岐メンバーのNC50を異なるAAVカプシド、AAVクレード、及び/又はAAV分岐の1以上の他のメンバーと比較することにより評価することができる。例えば、カプシドタンパク質AAV-6は、例えば、実施例4に記載されているIVIgアッセイからの約0.0476mg/mLのNC50を有していたが、分岐1のカプシドタンパク質の平均NC50は、約0.5722mg/mLである。同じNC50解析をクレード及び/又は分岐レベルで実施することができる。NC50値の違いは、本明細書に提供される新規カプシドタンパク質が集団(例えば、ヒト集団)内のAAV液性免疫を回避する能力の増強を示す。他の実施態様において、新規カプシドは、限定されないが、例えば、実施例4に記載されているIVIgアッセイからの約0.5263mg/mLのNC50を有するAAV-12、例えば、実施例4に記載されているIVIgアッセイからの約0.0476mg/mLのNC50を有するAAV-6、例えば、実施例4に記載されているIVIgアッセイからの約0.0441mg/mLのNC50を有するAAV-7、例えば、実施例4に記載されているIVIgアッセイからの約0.0610mg/mLのNC50を有するAAV-8、例えば、実施例4に記載されているIVIgアッセイからの約0.0513mg/mLのNC50を有するAAV-9、例えば、実施例4に記載されているIVIgアッセイからの約0.2326mg/mLのNC50を有するAAV-5、例えば、実施例4に記載されているIVIgアッセイからの約＜0.0305mg/mLのNC50を有するAAV-2、又はもう1つのAAVの組合せなどのAAVカプシドタンパク質と比較されることができ、ここで、未満(「＜」)のNC50のAAV-2は、IVIgがアッセイにおける試験限界よりも低いという事実から推定される。
(6.3.3 新規組換えAAVウイルス粒子)
本開示は、本開示の新規AAVカプシド配列を含む組換えAAV(rAAV)ウイルス粒子及びシュードタイプ化された新規rAAVウイルス粒子を提供する。そのような粒子は、本明細書に記載される組換えAAVベクターゲノム及び/又は1以上のベクター(例えば、プラスミド、バクミド、コスミドなど)及び適切な宿主細胞から作製されることができる。
本開示は、本開示の新規AAVカプシド配列を含む組換えAAV(rAAV)ウイルス粒子及びシュードタイプ化された新規rAAVウイルス粒子を提供する。そのような粒子は、本明細書に記載される組換えAAVベクターゲノム及び/又は1以上のベクター(例えば、プラスミド、バクミド、コスミドなど)及び適切な宿主細胞から作製されることができる。
本開示はまた、修飾された新規AAVカプシドアミノ酸配列を含む新規rAAVウイルス粒子及びシュードタイプウイルス粒子を提供する。第6.3.1.4節を参照されたい。新規rAAVウイルス粒子の産生は、以下に提供されている。実施例3も参照されたい。
(6.3.3.1 ベクター及びrAAVベクターゲノムコンストラクト)
本開示はまた、本開示の新規AAVカプシド配列を含むベクター(例えば、プラスミド、バクミド、コスミドなど)及びrAAVベクターゲノムを提供する。
本開示はまた、本開示の新規AAVカプシド配列を含むベクター(例えば、プラスミド、バクミド、コスミドなど)及びrAAVベクターゲノムを提供する。
細胞がrAAVベクターゲノムから生成させるベクターは、プロモーターと目的の1以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするプロモーターの下流の制限部位とを含有することができ、ここで、プロモーター及び制限部位は、5'AAV ITRの下流かつ3'AAV ITRの上流に位置する。ベクターは、制限部位の下流かつ3'AAV ITRの上流の転写後調節エレメントを含有することもできる。ウイルスコンストラクトは、制限部位に挿入され、かつプロモーターと機能的に連結されたポリヌクレオチドをさらに含むことができ、この場合、該ポリヌクレオチドは、目的のタンパク質のコード領域を含む。
本開示の新規rAAVウイルス粒子は、1つ、2つ、3つ、又は4つの別々のベクター中のRep及びCap(例えば、配列番号102～174及び194のいずれか1つ)遺伝子並びに/又は導入遺伝子とともに、rAAVベクターゲノムを好適な宿主細胞に提供し、それにより、完全なrAAVベクターゲノムを宿主細胞に送達することを含む方法によって生成させることができる。使用されるベクター構成及び使用されるベクターの数は、使用される生産系のタイプによって決まる。
本開示のrAAVベクターゲノムを作製するために使用されるエレメントは、以下でより詳細に記載されている。当業者は、用途に応じて、適切なエレメントを選択することになる。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子を作製するために使用されるrAAVベクターゲノムは、(a)(i)AAV逆向き末端反復(ITR)配列及び(ii)AAV 3'ITRの一方又は両方、(b)特定の細胞型における発現のための異種調節エレメント、並びに(c)導入遺伝子(例えば、治療的導入遺伝子又は生体分子)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含む。例えば、それは、AAV-2の5'及び3'ITRの一方又は両方、組織特異的プロモーター(例えば、肝臓特異的プロモーター又は筋肉特異的プロモーター)、並びに導入遺伝子を含むことができる。例示的なITRについては、第6.3.3.1節A、導入遺伝子については、第6.3.3.1節C、及び調節エレメントについては、第6.3.3.1節Dを参照されたい。用途に応じて、適切なプロモーターを使用することができる。
いくつかの実施態様において、rAAVベクターゲノムは、異種発現制御エレメント、例えば、プロモーター又はエンハンサー;任意に、イントロン;及び任意に、宿主細胞における発現(すなわち、標的細胞への送達)を可能にするポリアデニル化(ポリA)シグナルに機能的に連結されたタンパク質(例えば、内在性タンパク質)の機能的バージョンをコードする核酸配列を含む治療的導入遺伝子を含む。
本開示のベクター及び/又はrAAVベクターゲノムの作製は、限定するものではないが、例えば、Green, M.及びSambrook, J.の文献、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第4版、Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring Harbor, N.Y. 2012)に記載されている、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、及びDNAシークエンシングの標準的な技法を含む、当技術分野で周知の任意の好適な遺伝子工学的技法を用いて行うことができる。
例えば、コドン最適化されたミニ遺伝子などの、rAAVベクターゲノムの導入遺伝子(例えば、治療的導入遺伝子)を含むポリヌクレオチドは、当業者に公知の様々な標準的なクローニング、組換えDNA技術、細胞発現又はインビトロ翻訳を介するもの、及び化学合成技法を用いて作製することができる。Green, M.及びSambrook, J.の文献、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第4版、Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring Harbor, N.Y. 2012) を参照されたい。
(A.逆向き末端反復(ITR))
本開示のrAAVベクターゲノムは、多くの場合、AAV逆向き末端反復エレメント(ITR)を含む。いくつかの実施態様において、rAAVベクターゲノムは、1つのITR又はその断片を含む。いくつかの実施態様において、rAAVベクターゲノムは、5'又は3'ITRを含む。具体的な実施態様において、rAAVベクターゲノムは、2つのITR又はそれらの断片を含む。いくつかの実施態様において、rAAVベクターゲノムは、5'ITR及び3'ITRを含む。AAV ITRは、Repコード領域とともに、2つの隣接するITRの間に介在する治療的導入遺伝子などのヌクレオチド配列からの効率的な切除及びレスキュー、並びに該ヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノムへの組み込みをもたらす。特定のAAV関連ITRの配列は、Yanらの文献、J. Virol. 79(1):364-379(2005)によって開示されている。具体的な実施態様において、AAV ITR配列は、AAV cap配列と異なるAAV血清型又は異なるAAVクレード由来のものである。いくつかの実施態様において、AAV ITR配列は、AAV cap配列と同じAAV血清型又はAAVクレード由来のものである。いくつかの実施態様において、AAV ITR配列は、AAV rep配列と異なるAAV血清型又はAAVクレード由来のものである。いくつかの実施態様において、AAV ITR配列は、AAV rep配列と同じAAV血清型又はAAVクレード由来のものである。別の具体的な実施態様において、AAV ITR配列は、AAV cap配列及びrep配列と異なるAAV血清型又は異なるAAVクレード由来のものである。いくつかの実施態様において、AAV ITR配列は、AAV cap配列及びrep配列と同じAAV血清型又はAAVクレード由来のものである。AAVの様々な血清型のゲノム配列、並びにネイティブな末端反復(TR)、Repタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列は、当技術分野で公知である(例えば、そのような配列は、文献中又はGenBankなどの公的データベース中に見出すことができる)。例えば、AAVの様々な血清型のゲノム配列を提供するGenBankアクセッション番号としては、NC_002077.1(AAV1)、AF063497.1(AAV1)、NC_001401.2(AAV2)、AF043303.1(AAV2)、J01901.1(AAV2)、U48704.1(AAV3A)、NC_001729.1(AAV3A)、AF028705.1(AAV3B)、NC_001829.1(AAV4)、U89790.1(AAV4)、NC_006152.1(AA5)、AF085716.1(AAV-5)、AF028704.1(AAV6)、NC_006260.1(AAV7)、AF513851.1(AAV7)、AF513852.1(AAV8)、NC_006261.1(AAV-8)、AY530579.1(AAV9)、AAT46337(AAV10)、AAO88208(AAVrh10)、AY631966.1(AAV11)、DQ813647.1(AAV12)、及びEU28SS62.1(AAV13)が挙げられ、引用により本明細書中に組み込まれる各々の全体は、核酸及びアミノ酸配列を開示している。これらのGenBank配列のITR配列を本明細書に記載されるrAAVベクターゲノム中で使用することができる。ある実施態様において、表4に開示されているAAVのITR配列を本明細書に記載されるrAAVベクターゲノム中で使用することができる。具体的な実施態様において、rAAVベクターゲノムは、AAV-2のITR又はその断片を含む。この段落は、本明細書において、「項目B」と呼ばれることもある。
本開示のrAAVベクターゲノムは、多くの場合、AAV逆向き末端反復エレメント(ITR)を含む。いくつかの実施態様において、rAAVベクターゲノムは、1つのITR又はその断片を含む。いくつかの実施態様において、rAAVベクターゲノムは、5'又は3'ITRを含む。具体的な実施態様において、rAAVベクターゲノムは、2つのITR又はそれらの断片を含む。いくつかの実施態様において、rAAVベクターゲノムは、5'ITR及び3'ITRを含む。AAV ITRは、Repコード領域とともに、2つの隣接するITRの間に介在する治療的導入遺伝子などのヌクレオチド配列からの効率的な切除及びレスキュー、並びに該ヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノムへの組み込みをもたらす。特定のAAV関連ITRの配列は、Yanらの文献、J. Virol. 79(1):364-379(2005)によって開示されている。具体的な実施態様において、AAV ITR配列は、AAV cap配列と異なるAAV血清型又は異なるAAVクレード由来のものである。いくつかの実施態様において、AAV ITR配列は、AAV cap配列と同じAAV血清型又はAAVクレード由来のものである。いくつかの実施態様において、AAV ITR配列は、AAV rep配列と異なるAAV血清型又はAAVクレード由来のものである。いくつかの実施態様において、AAV ITR配列は、AAV rep配列と同じAAV血清型又はAAVクレード由来のものである。別の具体的な実施態様において、AAV ITR配列は、AAV cap配列及びrep配列と異なるAAV血清型又は異なるAAVクレード由来のものである。いくつかの実施態様において、AAV ITR配列は、AAV cap配列及びrep配列と同じAAV血清型又はAAVクレード由来のものである。AAVの様々な血清型のゲノム配列、並びにネイティブな末端反復(TR)、Repタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列は、当技術分野で公知である(例えば、そのような配列は、文献中又はGenBankなどの公的データベース中に見出すことができる)。例えば、AAVの様々な血清型のゲノム配列を提供するGenBankアクセッション番号としては、NC_002077.1(AAV1)、AF063497.1(AAV1)、NC_001401.2(AAV2)、AF043303.1(AAV2)、J01901.1(AAV2)、U48704.1(AAV3A)、NC_001729.1(AAV3A)、AF028705.1(AAV3B)、NC_001829.1(AAV4)、U89790.1(AAV4)、NC_006152.1(AA5)、AF085716.1(AAV-5)、AF028704.1(AAV6)、NC_006260.1(AAV7)、AF513851.1(AAV7)、AF513852.1(AAV8)、NC_006261.1(AAV-8)、AY530579.1(AAV9)、AAT46337(AAV10)、AAO88208(AAVrh10)、AY631966.1(AAV11)、DQ813647.1(AAV12)、及びEU28SS62.1(AAV13)が挙げられ、引用により本明細書中に組み込まれる各々の全体は、核酸及びアミノ酸配列を開示している。これらのGenBank配列のITR配列を本明細書に記載されるrAAVベクターゲノム中で使用することができる。ある実施態様において、表4に開示されているAAVのITR配列を本明細書に記載されるrAAVベクターゲノム中で使用することができる。具体的な実施態様において、rAAVベクターゲノムは、AAV-2のITR又はその断片を含む。この段落は、本明細書において、「項目B」と呼ばれることもある。
表4: AAV参照配列及びITR配列
(B. AAV Rep及びCap遺伝子配列)
本開示の新規rAAVベクターゲノムは、それぞれ、複製及びカプシド化タンパク質をコードするAAV「rep」及び「cap」ヌクレオチド配列を含むことができる。AAV capヌクレオチド配列は、本明細書に記載される新規AAVカプシドのヌクレオチド配列を含む。
本開示の新規rAAVベクターゲノムは、それぞれ、複製及びカプシド化タンパク質をコードするAAV「rep」及び「cap」ヌクレオチド配列を含むことができる。AAV capヌクレオチド配列は、本明細書に記載される新規AAVカプシドのヌクレオチド配列を含む。
多くの場合、遺伝子療法及び/又は送達用途のために、rep及びcap遺伝子は、rAAVベクターゲノム(例えば、本開示の新規rAAVベクターゲノム)と一緒に、別々のベクターに提供される。具体的な実施態様において、AAV rep配列は、AAV cap配列と異なるAAV血清型又は異なるAAVクレード由来のものである。具体的な実施態様において、AAV rep配列は、AAV cap配列と同じAAV血清型又は異なるAAVクレード由来のものである。別の具体的な実施態様において、AAV rep配列は、AAV cap配列及びITR配列と異なるAAV血清型又は異なるAAVクレード由来のものである。別の具体的な実施態様において、AAV rep配列は、AAV cap配列及びITR配列と同じAAV血清型又は異なるAAVクレード由来のものである。AAV rep配列の例としては、上の表4のAAV血清型のAAV rep配列が挙げられる。同じ及び異なるAAVクレード又は血清型の例は、本明細書(図3～11、表4、及び表2)に提供されている。
AAV cap遺伝子は、rep及びヘルパー機能(例えば、アデノヘルパー機能)の存在下でAAVベクターゲノムをパッケージングすることができ、かつ標的細胞に結合することができるcapタンパク質(第6.3.1節を参照)をコードする。いくつかの実施態様において、ヘルパー機能は、宿主細胞によって提供されることができる。「AAVヘルパー」という用語は、AAV遺伝子産物を提供するために発現させることができ、その結果、生産的なAAV複製のためにトランスで機能するAAV由来のコード配列を指す。したがって、AAVヘルパー機能は、主要なAAVオープンリーディングフレーム(ORF)であるrepとcapの両方を含む。Rep発現産物は、とりわけ: DNA複製のAAV起点の認識、結合、及びニッキング; DNAヘリカーゼ活性;並びにAAV(又は他の異種)プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を保有することが示されている。カプシド(Cap)発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。AAVヘルパー機能は、AAVベクターゲノムから失われているAAV機能をトランスで補完するために本明細書で使用される。様々な実施態様において、AAVヘルパー機能を提供するベクターは、Capタンパク質又はRepタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
(C.導入遺伝子)
本開示の組換え新規rAAVウイルス粒子は、多くの場合、異種導入遺伝子(例えば、治療的導入遺伝子)を含む。新規rAAVウイルス粒子に組み込まれる導入遺伝子は、限定されるものではなく、目的の任意の異種ヌクレオチド配列(例えば、目的の異種遺伝子)であってもよい。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、又は他の産物をコードする導入遺伝子に隣接するベクターゲノム配列に対して異種の核酸配列である。核酸コード配列は、宿主細胞における導入遺伝子の転写、翻訳、及び/又は発現を可能にする様式で、1以上の調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ-A、導入遺伝子発現を制限及び又は増強するかのいずれかのマイクロRNA結合エレメント、3'UTR、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE))に機能的に連結される。異種導入遺伝子配列の組成は、用途(例えば、治療用途又は治療されることになる適応症)に応じて決まる。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、2以上の異種導入遺伝子、例えば、2つ、3つ、4つ、又は5つの異種導入遺伝子を含む。他の実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、rAAVウイルス粒子に組み込まれた1つの異種導入遺伝子を含む。
本開示の組換え新規rAAVウイルス粒子は、多くの場合、異種導入遺伝子(例えば、治療的導入遺伝子)を含む。新規rAAVウイルス粒子に組み込まれる導入遺伝子は、限定されるものではなく、目的の任意の異種ヌクレオチド配列(例えば、目的の異種遺伝子)であってもよい。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、又は他の産物をコードする導入遺伝子に隣接するベクターゲノム配列に対して異種の核酸配列である。核酸コード配列は、宿主細胞における導入遺伝子の転写、翻訳、及び/又は発現を可能にする様式で、1以上の調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ-A、導入遺伝子発現を制限及び又は増強するかのいずれかのマイクロRNA結合エレメント、3'UTR、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE))に機能的に連結される。異種導入遺伝子配列の組成は、用途(例えば、治療用途又は治療されることになる適応症)に応じて決まる。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、2以上の異種導入遺伝子、例えば、2つ、3つ、4つ、又は5つの異種導入遺伝子を含む。他の実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、rAAVウイルス粒子に組み込まれた1つの異種導入遺伝子を含む。
導入遺伝子のヌクレオチド配列のサイズは、様々に異なり得る。例えば、治療的タンパク質をコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は、少なくとも約1.4kb、少なくとも約1.5kb、少なくとも約1.6kb、少なくとも約1.7kb、少なくとも約1.8kb、少なくとも約2.0kb、少なくとも約2.2kb、少なくとも約2.4kb、少なくとも約2.6kb、少なくとも約2.8kb、少なくとも約3.0kb、少なくとも約3.2kb、少なくとも約3.4kb、少なくとも約3.5kbの長さ、少なくとも約4.0kbの長さ、少なくとも約5.0kbの長さ、少なくとも約6.0kbの長さ、少なくとも約7.0kbの長さ、少なくとも約8.0kbの長さ、少なくとも約9.0kbの長さ、又は少なくとも約10.0kbの長さであることができる。いくつかの実施態様において、治療的タンパク質をコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は、少なくとも約1.4kbの長さである。ある実施態様において、治療的タンパク質をコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は、約1.4kb～5kbの長さである。いくつかの実施態様において、治療的タンパク質をコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は、1.4kb～5kb又は5kb～10kbである。或いは、導入遺伝子のヌクレオチド配列は、少なくとも約30ヌクレオチド、少なくとも約40ヌクレオチド、少なくとも約50ヌクレオチド、少なくとも約75ヌクレオチドの長さ、少なくとも約100ヌクレオチドの長さ、少なくとも約150ヌクレオチドの長さ、少なくとも約200ヌクレオチドの長さ、少なくとも約250ヌクレオチドの長さ、少なくとも約300ヌクレオチドの長さ、少なくとも約350ヌクレオチドの長さ、少なくとも約400ヌクレオチドの長さ、少なくとも約500ヌクレオチドの長さ、少なくとも約600ヌクレオチドの長さ、少なくとも約700ヌクレオチドの長さ、少なくとも約800ヌクレオチドの長さ、少なくとも約900ヌクレオチドの長さ、少なくとも約1000ヌクレオチドの長さ、又は少なくとも約1200ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、導入遺伝子のヌクレオチド配列は、約30～150ヌクレオチドの長さ又は約150～500ヌクレオチドの長さである。ある実施態様において、導入遺伝子のヌクレオチド配列は、約100～500ヌクレオチドの長さ又は500～1000ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、導入遺伝子のヌクレオチド配列は、500ヌクレオチド～1200ヌクレオチドの長さである。
具体的な実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、治療的導入遺伝子を含む。本開示の治療的導入遺伝子は、典型的には、疾患の生物学及び治療において有用である生体分子(例えば、治療的生体分子)、例えば、タンパク質(例えば、酵素)、ポリペプチド、ペプチド、RNA(例えば、tRNA、dsRNA、リボソームRNA、触媒RNA、siRNA、miRNA、プレ-miRNA、lncRNA、snoRNA、小ヘアピンRNA、トランス-サイレンシングRNA、及びアンチセンスRNA)、遺伝子もしくは塩基編集系、例えば、CRISPR遺伝子編集系の1以上の構成要素、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)媒介性エキソンスキッピング、ナンセンス媒介性分解(NMD)を誘発するポイゾンエキソン、又はドミナントネガティブ突然変異体をコードする配列である。
ある実施態様において、導入遺伝子は、遺伝子療法用途に有用な配列をコードする核酸配列を含む。例えば、ある種の疾患は、遺伝子内の1以上の機能喪失型突然変異(例えば、ヌル突然変異及び/又はハプロ不全)が遺伝子によってコードされるタンパク質の量又は活性を低下又は消失させるときに生じる。ある実施態様において、本明細書で使用される導入遺伝子は、タンパク質の機能的バージョンをコードする。いくつかの実施態様において、タンパク質の機能的バージョンは、内在性タンパク質(例えば、ヒト又は非ヒト動物に見られるタンパク質)の1つ、2つ、又はそれより多くの活性を保持する。
他の実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、遺伝子サイレンシングから恩恵を受ける遺伝子療法用途に有用な配列をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含む。例えば、ある種の疾患は、遺伝子内の1以上の機能獲得型突然変異が遺伝子によってコードされるタンパク質の異常な量又は活性をもたらすときに生じる。ある実施態様において、本明細書で使用される導入遺伝子は、阻害性ポリヌクレオチド、例えば、miRNAもしくはsiRNAなどの阻害性RNA、又は遺伝子編集系、例えば、CRISPR遺伝子編集系の1以上の構成要素をコードする。いくつかの実施態様において、導入遺伝子は、標的化遺伝子破壊又は修正のためのCRISPR-Cas系をコードする核酸を含む。
他の実施態様において、核酸配列を含む導入遺伝子は、遺伝子付加から恩恵を受ける遺伝子療法用途に有用な配列をコードする。ある実施態様において、本明細書で使用される導入遺伝子は、遺伝子療法のレシピエント、例えば、ヒト対象に存在しない遺伝子産物、例えば、タンパク質をコードする。
いくつかの実施態様において、導入遺伝子は、例えば、tRNA、dsRNA、リボソームRNA、触媒RNA、siRNA、miRNA、プレ-miRNA、lncRNA、snoRNA、小ヘアピンRNA、トランス-サイレンシングRNA、及びアンチセンスRNAなどの、生物学及び医学において有用なRNA配列をコードする核酸配列を含む。有用なRNA配列の1つの例は、治療を受ける対象における標的化核酸配列の発現を阻害し又は消滅させる配列である。好適な標的核酸配列としては、腫瘍に関する配列及びウイルス配列を挙げることができる。いくつかの実施態様において、導入遺伝子は、エキソンスキッピングを誘導する小核RNA(snRNA)コンストラクトをコードする核酸配列を含む。ある実施態様において、RNAi剤は、ヌクレオチド配列内の単一ヌクレオチド多型(SNP)又は変異体の位置の目的の遺伝子を標的とする。
いくつかの実施態様において、RNAi剤は、siRNA二重鎖であり、ここで、該siRNA二重鎖は、一緒にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するアンチセンス鎖(ガイド鎖)及びセンス鎖(パッセンジャー鎖)を含有し、ここで、該アンチセンス鎖は、標的化遺伝子の核酸配列に少なくとも部分的に相補的であり、かつここで、該センス鎖は、標的化遺伝子の核酸配列と少なくとも部分的に相同である。いくつかの実施態様において、アンチセンスの5'末端は、5'リン酸基を有し、センス鎖の3'末端は、3'水酸基を含有する。いくつかの実施態様において、0、1、又は2個のヌクレオチド突出が一方又は両方の鎖の3'末端にある。いくつかの実施態様において、アンチセンス鎖及び/又はセンス鎖の1つ又は複数のヌクレオチドが修飾される。ヌクレオチド修飾の非限定的な例としては、2'デオキシ、2'-フルオロ、2'O-メチル、2'デオキシ-2'フルオロ、ホスホロチオエート、5'-モルフォリンノ、汎用塩基修飾ヌクレオチド、3'-末端、5'-末端、もしくは3'末端と5'-末端の両方の末端キャップ分子、反転脱塩基、又は5'-末端及び/もしくは3'末端の反転脱塩基ロックト核酸修飾が挙げられる。
いくつかの実施態様において、目的の遺伝子を標的とするsiRNA二重鎖の各々の鎖は、約19～25、19～24、又は19～21ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、siRNA又はdsRNAは、互いに相補的である少なくとも2つの配列を含む。dsRNAは、第一の配列を有するセンス鎖及び第二の配列を有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施態様において、アンチセンス鎖は、標的遺伝子をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、かつ相補性の領域は、30ヌクレオチド以下、及び少なくとも15ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、dsRNAは、19～25、19～24、又は19～21ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、dsRNAは、約15～約25ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、dsRNAは、約25～約30ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、dsRNAは、約、少なくとも約、又は多くても約15ヌクレオチドの長さ、16ヌクレオチドの長さ、17ヌクレオチドの長さ、18ヌクレオチドの長さ、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチド、25ヌクレオチドの長さ、26ヌクレオチドの長さ、27ヌクレオチドの長さ、28ヌクレオチドの長さ、29ヌクレオチドの長さ、又は30ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、対象の遺伝子欠損又は他の異常を修正又は改善するタンパク質、ペプチド、又は他の産物をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含む。そのような遺伝子欠損としては、遺伝子産物が特定の対象(例えば、ヒト対象)について正常と考えられるレベル未満で発現される欠損又は機能的な遺伝子産物が発現されない欠損を挙げることができる。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、例えば、マルチサブユニットタンパク質によって引き起こされる遺伝子欠陥を修正又は改善するための複数の導入遺伝子を含む。場合により、異なる導入遺伝子を用いて、タンパク質の各々のサブユニットをコードするか、又は異なるペプチドもしくはタンパク質をコードすることができる。これは、タンパク質サブユニットをコードする核酸配列のサイズが大きいときに望ましい場合があり、非限定的な例としては、例えば、免疫グロブリン、血小板由来成長因子、又はジストロフィンタンパク質についてのものが挙げられる。宿主細胞に、導入遺伝子を含有する本開示の新規rAAVウイルス粒子を感染させることができ、ここで、各々の導入遺伝子は、マルチサブユニットタンパク質を産生するために、マルチサブユニットタンパク質の異なるサブユニットをコードする核酸配列を含む。或いは、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、マルチサブユニットタンパク質の異なるサブユニットをコードする核酸配列を含む単一の導入遺伝子を含むことができる。この場合、単一の導入遺伝子は、サブユニットの各々をコードする核酸配列を含み、各々のサブユニットをコードする核酸配列を内部リボザイム侵入部位(IRES)によって隔てることができる。これは、サブユニットの各々をコードする核酸配列のサイズが小さいときに望ましい場合があり、例えば、サブユニット及びIRESをコードする核酸配列の全体的なサイズは、5キロベース未満である。IRESの代替案として、核酸配列を翻訳後事象で自己切断するペプチド、例えば、例えば、2Aペプチドをコードする配列によって隔てることができる。例えば、Donnellyらの文献、J. Gen. Virol., 78(Pt 1): 13-21(January 1997); Furlerらの文献、Gene Ther., 8(l l):864-873(June 2001); Klumpらの文献、Gene Ther., 8(10):811-817(May 2001)を参照されたい。2AペプチドはIRESよりも顕著に小さいので、スペースが限定要因である場合の使用に適している。より頻繁には、導入遺伝子が大きい場合、マルチサブユニットからなる場合、又はその両方の場合、各々所望の導入遺伝子を保有する2以上のAAVウイルス粒子(本開示の新規rAAVウイルス粒子を含む)を共投与して、それらをインビトロ又はインビボでコンカテマー化し、単一のベクターゲノムを形成させることができる。例えば、AAVのコンカテマー化に関する情報については、Yangらの文献、J Virol. 1999 Nov; 73(11): 9468-9477を参照されたい。例えば、第一のAAVウイルス粒子は、単一の導入遺伝子を含んでいてもよく、第二のAAVウイルス粒子は、宿主細胞で共発現させるための異なる導入遺伝子を含んでいてもよい。
いくつかの実施態様において、導入遺伝子は、AAVに対して異種のタンパク質(例えば、治療的タンパク質)をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施態様において、導入遺伝子は、対象の筋肉、心臓、脳、血漿、腎臓、耳、又は肝臓細胞/組織のうちの1つ又は複数で内在性に発現される治療的タンパク質をコードする核酸配列を含む。ある実施態様において、導入遺伝子は、対象の筋肉、心臓、脳、血漿、腎臓、又は肝臓細胞/組織のうちの1つ又は複数で内在性に発現される治療的タンパク質をコードする核酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、導入遺伝子は、発現時に、検出可能なシグナルを産生する核酸配列を含む。場合により、そのような核酸配列は、酵素(例えば、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ(LacZ)、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、及びルシフェラーゼなど)、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質、及び赤色蛍光タンパク質など)、膜結合タンパク質(例えば、CD2、CD4、CD8、インフルエンザ血球凝集素タンパク質、及びそれに対する高親和性抗体が存在するかもしくは従来の手段によって産生されることができる当技術分野で周知の他のものなど)、又はとりわけ、ヘマグルチニンもしくはMyc由来の抗原タグドメインに適切に融合された膜結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードする。これらの核酸配列は、その発現を駆動する調節エレメントに関連付けられているとき、酵素、X線、比色定量、蛍光、もしくは他の分光学的アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、並びに酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射免疫アッセイ(RIA)、及び免疫組織化学(IHC)アッセイを含む免疫学的アッセイを含む、従来の手段によって検出可能なシグナルをもたらす。例えば、核酸配列がLacZをコードする場合、LacZを発現するAAVベクターゲノムの存在は、β-ガラクトシダーゼ活性のアッセイによって検出することができる。別の例において、導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼをコードする核酸配列を含む場合、緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼを発現するAAVベクターゲノムは、ルミノメーターでの色又は光の生成によって視覚的に検出することができる。検出可能なシグナルを有する産物をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むAAVウイルス粒子は、下で論じられている選択可能マーカーとして使用されてもよく、又はウイルスを追跡するために使用されてもよい。
(D.調節性制御エレメント)
用途に応じて、本開示のAAVベクターゲノムは、1以上の調節性制御エレメント(例えば、転写開始配列、終結配列、プロモーター、エンハンサー、調節性結合部位、ポリ-A、マイクロRNA結合エレメント、3'UTR、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE))を含むことができる。
用途に応じて、本開示のAAVベクターゲノムは、1以上の調節性制御エレメント(例えば、転写開始配列、終結配列、プロモーター、エンハンサー、調節性結合部位、ポリ-A、マイクロRNA結合エレメント、3'UTR、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE))を含むことができる。
多くの場合、調節性制御エレメントは異種であり、かつ本開示の新規rAAVベクターゲノムでトランスフェクトされた宿主細胞におけるその転写、翻訳、及び/又は発現を可能にする様式で、導入遺伝子(例えば、治療的導入遺伝子)に機能的に連結される。本明細書で使用される場合、「機能的に連結される」は、目的の遺伝子と隣接している発現制御配列と目的の遺伝子を制御するようにトランスで又は少し離れて作用する発現制御配列(例えば、エンハンサー)の両方を含む。
使用することができる調節性制御エレメントの例としては、転写開始、終結、プロモーター、及び/又はエンハンサー配列;スプライシング及びポリアデニル化(ポリA)シグナルなどの効率的なRNAプロセシングシグナル;細胞質mRNAを安定化する配列;翻訳効率を増強する配列(すなわち、コザックコンセンサス配列);タンパク質安定性を増強する配列;並びに望ましい場合、コードされる産物の選択を増強する配列が挙げられるが、これらに限定されない。AAVベクターゲノムが、治療的タンパク質又はペプチドに翻訳されることになる治療的導入遺伝子であるコード配列を含む場合、プロモーターがAAVベクターゲノムに含まれる。
用途及び必要とされる発現のレベルに応じて、当業者は、AAVベクターゲノムが送達されることになる細胞型又は対象にとってネイティブであるプロモーターを使用することができる。いくつかの実施態様において、プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び/又は組織特異的プロモーターである。さらに、AAVベクターゲノムで使用することができる調節性制御エレメントの組合せは、ベクター及びその用途によって決まる。
ある実施態様において、調節性制御エレメントは、筋肉組織で特異的に遺伝子発現を調節する調節性制御エレメントを含む。ある実施態様において、調節性制御エレメントは、心臓で特異的に遺伝子発現を調節する調節エレメントを含む。
ある実施態様において、調節性制御エレメントは、脳で特異的に遺伝子発現を調節する調節エレメントを含む。いくつかの実施態様において、調節性制御エレメントは、中枢神経系で特異的に遺伝子発現を調節する調節エレメントを含む。例えば、ある実施態様において、調節性制御エレメントは、使用され得るシナプシン1遺伝子(hSyn1)、ヒト伸長因子1α(hEF1α)、又はラットカルシウム/カルモジュリン依存的タンパク質キナーゼタイプIIアルファ(CaMKIIα)プロモーターを含む。
ある実施態様において、調節性制御エレメントは、血漿で特異的に遺伝子発現を調節する調節エレメントを含む。ある実施態様において、調節性制御エレメントは、腎臓で特異的に遺伝子発現を調節する調節エレメントを含む。ある実施態様において、調節性制御エレメントは、耳で特異的に遺伝子発現を調節する調節エレメントを含む。ある実施態様において、調節性制御エレメントは、下の実施例で特定されている組織又は細胞で特異的に遺伝子発現を調節する調節エレメントを含む。
いくつかの実施態様において、調節性制御エレメントは、肝臓組織で特異的に遺伝子発現を調節する調節エレメントを含む。肝臓特異的調節エレメントの例としては、マウスサイレチンプロモーター(mTTR)、内因性ヒト因子VIIIプロモーター(F8)、ヒトアルファ-1-アンチトリプシンプロモーター(hAAT)及びその活性断片、ヒトアルブミン最小プロモーター、並びにマウスアルブミンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Enh1とともに、EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6などの肝臓特異的転写因子結合部位に由来するエンハンサーも企図される。
(E.選択可能マーカー又はレポーター遺伝子)
いくつかの実施態様において、rAAVベクターゲノム(例えば、新規rAAVベクターゲノム)は、選択可能マーカー又はレポーター遺伝子をさらに含む。選択可能マーカー又はレポーター遺伝子の例としては、とりわけ、ジェネティシン、ハイグロマイシン、又はプリマイシン耐性をコードする配列を挙げることができる。そのような選択可能レポーター又はマーカー遺伝子(好ましくは、本発明の方法によってレスキューされることになるウイルスゲノムの外側に位置する)を用いて、細菌細胞におけるプラスミド、例えば、アンピシリン耐性の存在を知らせることができる。プラスミドの他の構成要素としては、複製起点を挙げることができる。これらの及びその他のプロモーター及びベクターエレメントの選択は慣習的であり、多くのそのような配列が利用可能である。例えば、Green, M.及びSambrook, J.の文献、分子クローニング(Molecular Cloning)及び本明細書中で引用されている他の参考文献を参照されたい。
いくつかの実施態様において、rAAVベクターゲノム(例えば、新規rAAVベクターゲノム)は、選択可能マーカー又はレポーター遺伝子をさらに含む。選択可能マーカー又はレポーター遺伝子の例としては、とりわけ、ジェネティシン、ハイグロマイシン、又はプリマイシン耐性をコードする配列を挙げることができる。そのような選択可能レポーター又はマーカー遺伝子(好ましくは、本発明の方法によってレスキューされることになるウイルスゲノムの外側に位置する)を用いて、細菌細胞におけるプラスミド、例えば、アンピシリン耐性の存在を知らせることができる。プラスミドの他の構成要素としては、複製起点を挙げることができる。これらの及びその他のプロモーター及びベクターエレメントの選択は慣習的であり、多くのそのような配列が利用可能である。例えば、Green, M.及びSambrook, J.の文献、分子クローニング(Molecular Cloning)及び本明細書中で引用されている他の参考文献を参照されたい。
(6.3.3.2 新規のシュードタイプ化されたAAVウイルス粒子)
本開示はまた、本明細書に記載される新規AAVカプシド配列又は本明細書に記載される修飾された新規AAVカプシド配列並びに異なるAAV(例えば、異なるAAV血清型及び/又はクレード)のゲノムエレメント(すなわち、Rep又はITR配列)を用いて、様々な新規のシュードタイプ化されたAAVウイルス粒子を提供する。
本開示はまた、本明細書に記載される新規AAVカプシド配列又は本明細書に記載される修飾された新規AAVカプシド配列並びに異なるAAV(例えば、異なるAAV血清型及び/又はクレード)のゲノムエレメント(すなわち、Rep又はITR配列)を用いて、様々な新規のシュードタイプ化されたAAVウイルス粒子を提供する。
一実施態様において、本開示の新規のシュードタイプ化されたAAVウイルス粒子は、本明細書に記載される新規AAVカプシド配列又は本明細書に記載される修飾された新規AAVカプシド配列、異なるAAVのRepもしくはITR配列又はこれらの断片、及び導入遺伝子(例えば、治療的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子)のうちの1つ又は複数を含む。別の実施態様において、本開示の新規のシュードタイプ化されたAAVウイルス粒子は、本明細書に提供される新規AAVカプシド配列又は本明細書に提供される修飾された新規AAVカプシド配列、異なるAAVのRep及びITR配列、並びに導入遺伝子(例えば、治療的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子)のうちの1つ又は複数を含む。新規のシュードタイプ化されたAAVウイルス粒子を作製するために使用することができる異なるAAVの例は、本明細書(例えば、表4又は項目A又は項目B)に提供される参照AAVのいずれか1つを含む。
(6.3.3.3 他のAAVカプシドベースのベクター)
本開示の新規AAVカプシド配列は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボ遺伝子送達のための他のウイルスベクター系で使用するために適合させることができる。例えば、新規AAVカプシド配列を用いて、AAV以外のパルボウイルスの発現カセットを含むハイブリッドベクターを構築することができる。例えば、ハイブリッドベクターは、パロウイルス由来(例えば、自律性パルボウイルスH1由来又はパロウイルスB19由来)発現カセット、プロモーター(例えば、p4プロモーター)、目的のタンパク質をコードする遺伝子、及びAAV ITRが隣接し、かつ本開示の新規カプシドにパッケージングされる別のプロモーター(例えば、p38プロモーター)を含むことができる。AAVカプシドを含むハイブリッドベクターを産生する方法の考察については、例えば、Krugerらの文献、Cancer Gene Therapy volume 15、252-267ページ(2008)を参照されたい。さらに、本開示の新規AAVカプシド配列を用いて、AAVウイルス様粒子(VLP)を作製することができる。AAV VLPを産生する方法については、例えば、Leらの文献、Sci Rep 9, 18631(2019)を参照されたい。
本開示の新規AAVカプシド配列は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボ遺伝子送達のための他のウイルスベクター系で使用するために適合させることができる。例えば、新規AAVカプシド配列を用いて、AAV以外のパルボウイルスの発現カセットを含むハイブリッドベクターを構築することができる。例えば、ハイブリッドベクターは、パロウイルス由来(例えば、自律性パルボウイルスH1由来又はパロウイルスB19由来)発現カセット、プロモーター(例えば、p4プロモーター)、目的のタンパク質をコードする遺伝子、及びAAV ITRが隣接し、かつ本開示の新規カプシドにパッケージングされる別のプロモーター(例えば、p38プロモーター)を含むことができる。AAVカプシドを含むハイブリッドベクターを産生する方法の考察については、例えば、Krugerらの文献、Cancer Gene Therapy volume 15、252-267ページ(2008)を参照されたい。さらに、本開示の新規AAVカプシド配列を用いて、AAVウイルス様粒子(VLP)を作製することができる。AAV VLPを産生する方法については、例えば、Leらの文献、Sci Rep 9, 18631(2019)を参照されたい。
(6.3.4 宿主細胞)
本開示はまた、本開示の新規AAVカプシド配列、修飾されたAAVカプシド配列、又は新規rAAVウイルス粒子、及び異種配列(例えば、治療的生体分子もしくは導入遺伝子及び/又は調節エレメント)をさらに含む組換え核酸分子を含む宿主細胞(例えば、インビボ又はインビトロ宿主細胞)を提供する。いくつかの実施態様において、本開示は、新規AAVカプシド配列又は修飾されたAAVカプシド配列を含む宿主細胞(例えば、インビボ又はインビトロ宿主細胞)を提供する。いくつかの実施態様において、本開示は、本開示の新規rAAVウイルス粒子を含む宿主細胞(例えば、インビボ又はインビトロ宿主細胞)を提供する。いくつかの実施態様において、本開示は、異種配列(例えば、治療的生体分子もしくは導入遺伝子及び/又は調節エレメント)をさらに含む組換え核酸分子を含む宿主細胞(例えば、インビボ又はインビトロ宿主細胞)を提供する。
本開示はまた、本開示の新規AAVカプシド配列、修飾されたAAVカプシド配列、又は新規rAAVウイルス粒子、及び異種配列(例えば、治療的生体分子もしくは導入遺伝子及び/又は調節エレメント)をさらに含む組換え核酸分子を含む宿主細胞(例えば、インビボ又はインビトロ宿主細胞)を提供する。いくつかの実施態様において、本開示は、新規AAVカプシド配列又は修飾されたAAVカプシド配列を含む宿主細胞(例えば、インビボ又はインビトロ宿主細胞)を提供する。いくつかの実施態様において、本開示は、本開示の新規rAAVウイルス粒子を含む宿主細胞(例えば、インビボ又はインビトロ宿主細胞)を提供する。いくつかの実施態様において、本開示は、異種配列(例えば、治療的生体分子もしくは導入遺伝子及び/又は調節エレメント)をさらに含む組換え核酸分子を含む宿主細胞(例えば、インビボ又はインビトロ宿主細胞)を提供する。
本明細書で使用される場合、「宿主」という用語は、本開示の核酸分子もしくはAAVウイルス粒子を有する生物(例えば、昆虫、動物(ヒト及び非ヒト動物を含む)、酵母、細菌など)並びに/又は細胞、並びに組換え遺伝子又はタンパク質を発現する際に使用するのに好適である生物(例えば、ヒト及び非ヒト動物)並びに/又は細胞を指す。本開示が任意の特定のタイプの細胞又は生物に限定されることは意図されない。実際、任意の好適な生物及び/又は細胞が宿主として本明細書で使用されることが企図される。宿主細胞は、単一の細胞、類似した又は異なる細胞の集団の形態のもの、例えば、培養物(例えば、液体培養物又は固体基板上の培養物)の形態のもの、生物又はその一部であってもよい。宿主細胞には、本明細書に記載される新規rAAVウイルス粒子に感染した細胞の子孫が含まれる。AAVの複製及び/又はAAVにおける治療的導入遺伝子の産生を可能にし、かつ培養下で維持することができる任意の宿主細胞は、本開示の一部である。
したがって、本開示の宿主細胞は、例えば、細菌、酵母、昆虫、もしくは哺乳動物細胞、又はヒト細胞であることができる。好ましい昆虫細胞の例は、High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5、又はAo38である。好ましい哺乳動物細胞の例は、HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19、又はMRC-5細胞である。宿主細胞は、本明細書(例えば、第6.4.3節、又は実施例)に記載されているものであってもよい。具体的な実施態様において、宿主細胞は、非ヒト哺乳動物細胞である。他の実施態様において、宿主細胞は、細菌、酵母、又は昆虫細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、ヒト細胞である。具体的な実施態様において、ヒト細胞は、ヒト対象(例えば、遺伝子療法で治療されることになる対象)から単離された初代細胞である。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、細胞株由来のものである。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、インビトロ又は細胞培養下のもの(すなわち、培養宿主細胞)である。他の実施態様において、宿主細胞は、インビボのものである。具体的な実施態様において、宿主細胞は、組織から単離されている。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の新規AAVカプシド配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3)を含む宿主細胞である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の新規AAVカプシド配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3)を発現する宿主細胞である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の新規AAVカプシド配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3)及びベクターを含む宿主細胞である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の新規AAVカプシド配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3)、Rep遺伝子、及びベクターを含む宿主細胞である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の新規AAVカプシド配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3)、Rep遺伝子、及びrAAVベクターゲノムを含む宿主細胞である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の新規rAAVウイルス粒子を産生する宿主細胞である。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3)を含む宿主細胞である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3)を発現する宿主細胞である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3)及びベクターを含む宿主細胞である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3)、Rep遺伝子、及びベクターを含む宿主細胞である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の修飾された新規AAVカプシド配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3)、Rep遺伝子、及びrAAVベクターゲノムを含む宿主細胞である。
本開示のrAAVウイルス粒子、宿主細胞、及び方法/使用は、導入遺伝子(例えば、治療的生体分子)を宿主細胞に送達する方法において有用である。本開示の宿主細胞は、多くの場合、新規rAAVウイルス粒子の製造に使用される。具体的な実施態様において、本明細書(例えば、実施例;特に、実施例3)に記載される宿主細胞は、新規rAAVウイルス粒子の産生において使用される。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される宿主細胞は、インビトロで培養される。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の新規AAVカプシド配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3)を含む宿主(例えば、昆虫、動物(ヒト及び非ヒト動物を含む)、酵母、細菌など)である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の新規rAAVウイルス粒子を含む宿主(例えば、昆虫、動物(ヒト及び非ヒト動物を含む)、酵母、細菌など)である。具体的な実施態様において、宿主は、非ヒト動物、酵母、又は細菌である。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の新規AAVカプシド配列(例えば、VP1、VP2、又はVP3)を含む宿主(例えば、昆虫、動物(ヒト及び非ヒト動物を含む))組織である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の新規rAAVウイルス粒子を含む宿主由来の宿主(例えば、昆虫、動物(ヒト及び非ヒト動物を含む))組織である。具体的な実施態様において、いくつかの実施態様において、宿主は、非ヒト動物組織である。他の実施態様において、宿主組織は、ヒト組織である。
(6.3.5 医薬組成物)
本開示は、新規AAVカプシド配列又はrAAVウイルス粒子を含む組成物(例えば、医薬組成物)を提供する。一実施態様において、組成物は、本明細書に記載される新規AAVカプシド配列又は第6.3.3.1節に記載されているような配列を含むベクターを含む。ある実施態様において、組成物は、本明細書中の実施例に記載される新規AAVカプシド配列を含む。いくつかの実施態様において、組成物は、修飾された新規AAVカプシド配列又はそのような配列を含むベクターを含む。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、新規rAAVウイルス粒子を含む組成物(例えば、医薬組成物)である。医薬組成物は、本明細書に記載される任意の新規rAAVウイルス粒子を含むことができる。いくつかの実施態様において、組成物(例えば、医薬組成物)は、本明細書に記載される2以上の新規rAAVウイルス粒子を含む。
本開示は、新規AAVカプシド配列又はrAAVウイルス粒子を含む組成物(例えば、医薬組成物)を提供する。一実施態様において、組成物は、本明細書に記載される新規AAVカプシド配列又は第6.3.3.1節に記載されているような配列を含むベクターを含む。ある実施態様において、組成物は、本明細書中の実施例に記載される新規AAVカプシド配列を含む。いくつかの実施態様において、組成物は、修飾された新規AAVカプシド配列又はそのような配列を含むベクターを含む。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、新規rAAVウイルス粒子を含む組成物(例えば、医薬組成物)である。医薬組成物は、本明細書に記載される任意の新規rAAVウイルス粒子を含むことができる。いくつかの実施態様において、組成物(例えば、医薬組成物)は、本明細書に記載される2以上の新規rAAVウイルス粒子を含む。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、第6.3.3.1節Cに記載されている生体分子又は導入遺伝子を含む新規rAAVウイルス粒子を含む医薬組成物である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、遺伝的障害に苦しむ対象への投与に有用な治療的タンパク質をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含む新規rAAVウイルス粒子を含む医薬組成物である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、RNA(例えば、siRNA、アンチセンスRNA、miRNAなど)の核酸配列を含む導入遺伝子を含む新規rAAVウイルス粒子を含む医薬組成物である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、CRISPR系の構成要素を含む導入遺伝子を含む新規rAAVウイルス粒子を含む医薬組成物である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、CRISPR系の様々なエレメントをコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含む複数のrAAVウイルス粒子(例えば、本開示の新規AAVカプシドタンパク質)を含む医薬組成物である。いくつかの実施態様において、第一のAAVウイルス粒子は、CRISPR-Cas(CRISPR-Cas9酵素)をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含み;かつ第二のAAVウイルス粒子は、標的遺伝子の破壊を可能にするための標的遺伝子のガイドRNA配列をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、第一のAAVウイルス粒子は、CRISPR-Cas(CRISPR-Cas9酵素)をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含み;第二のAAVウイルス粒子は、標的遺伝子のガイドRNA配列をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含み;かつ第三のAAVウイルス粒子は、標的遺伝子の修正又は置換のためのドナー核酸配列をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、第一のAAVウイルス粒子は、CRISPR-Cas(CRISPR-Cas9酵素)及び標的遺伝子のガイドRNA配列をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含み;かつ第二のAAVウイルス粒子は、標的遺伝子の修正又は置換のためのドナー核酸配列をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、単一のAAVウイルス粒子は、CRISPR-Cas(CRISPR-Cas9酵素)及び標的遺伝子の破壊を可能にするための標的遺伝子のガイドRNA配列をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含む。
Casタンパク質の非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(別名、Csn1及びCsx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、これらのホモログ、又はこれらの修飾バージョンが挙げられる。いくつかの実施態様において、CRISPR酵素は、標的配列の位置での、例えば、標的配列内及び/又は標的配列の相補体内での一方又は両方の鎖の切断を導く。いくつかの実施態様において、CRISPR酵素は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500、又はそれを上回る塩基対内での一方又は両方の鎖の切断を導く。
ある実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、新規rAAVウイルス粒子を含む液体組成物である。他の実施態様において、新規rAAVウイルス粒子を含む本明細書に提供される医薬組成物は、凍結乾燥組成物である。ある実施態様において、組成物中の新規組換えAAVビリオンの濃度は、1×1012vg/ml～2×1016vg/mlの範囲であり得る。他の用量については、第6.4.2節を参照されたい。
本明細書に記載される組成物は、賦形剤又は担体、例えば、緩衝剤を含むことができる。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、新規AAVカプシド配列又はウイルス粒子並びに医薬として許容し得る担体及び/又は他の薬剤、医薬品、もしくはアジュバントなどを含む様々な医薬組成物である。ある実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物は、本開示の新規rAAVウイルス粒子及び例えば、第6.3.5節に記載されている1以上の他の薬剤を含む。
いくつかの実施態様において、「医薬として許容し得る」及び「生理的に許容し得る」という用語は、互換的に使用される。通常、薬剤(例えば、賦形剤又は担体)は、それが、安全で、無毒であり、生物学的にもその他の形でも望ましくないものではなく、かつ獣医学的用途及びヒト製剤用途で許容し得る場合、医薬として許容し得る。
ある実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、保存及び/又は遺伝的障害の治療のための対象への投与のための有利な特性を組成物に提供するために、1以上の医薬として許容し得る賦形剤を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、検出可能な安定性の変化を伴わずに、少なくとも2週間、一実施態様においては、少なくとも4週間、別の実施態様においては、少なくとも6週間、及びさらに別の実施態様においては、少なくとも約8週間の期間、-65℃で保存することができる。これに関して、「安定な」という用語は、組成物中に存在する組換えAAVウイルスが、保存中にその物理的安定性、化学的安定性、及び/又は生物学的活性を本質的に保持することを意味する。例えば、ある実施態様において、医薬組成物中に存在する組換えAAVウイルスは、ヒト患者におけるその生物学的活性の少なくとも約80％を、決められた期間(例えば、1～6カ月、3～6カ月、3～9カ月、又は6～12カ月)の保存中、-65℃で保持し;他の実施態様において、組換えAAVウイルスの生物学的活性の少なくとも約85％、90％、95％、98％、又は99％がヒト対象において保持されている。一実施態様において、対象は、年少のヒト対象(例えば、18歳未満のヒト対象)である。いくつかの実施態様において、医薬組成物中に存在する組換えAAVウイルスは、宿主細胞におけるインビトロアッセイで評価されるその生物学的活性の少なくとも約80％を、決められた期間(例えば、1～6カ月、3～6カ月、3～9カ月、又は6～12カ月)の保存中、-65℃で保持し;他の実施態様において、組換えAAVウイルスの生物学的活性の少なくとも約85％、90％、95％、98％、又は99％が宿主細胞におけるインビトロアッセイで評価したときに保持されている。
ある態様において、新規rAAVウイルス粒子を含む医薬組成物は、1以上の緩衝化剤をさらに含む。例えば、様々な実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、約0.1mg/ml～約3mg/ml、約0.5mg/ml～約2.5mg/ml、約1mg/ml～約2mg/ml、又は約1.4mg/ml～約1.6mg/mlの濃度のリン酸二ナトリウムを含む。一実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、約1.42mg/mlのリン酸二ナトリウム(無水)を含む。本明細書に提供される医薬組成物で使用され得る別の緩衝剤は、リン酸一ナトリウム一水和物であり、これは、いくつかの実施態様において、約0.1mg/ml～約3mg/ml、約0.5mg/ml～約2.5mg/ml、約1mg/ml～約2mg/ml、又は約1.3mg/ml～約1.5mg/mlの濃度で使用される。一実施態様において、本実施態様の医薬組成物は、約1.38mg/mlのリン酸一ナトリウム一水和物を含む。別の実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、約1.42mg/mlのリン酸二ナトリウム及び約1.38mg/mlのリン酸一ナトリウム一水和物を含む。
別の実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、一実施態様においては、約1mg/ml～約20mg/ml、例えば、約1mg/ml～約10mg/ml、約5mg/ml～約15mg/ml、又は約8mg/ml～約20mg/mlの濃度の1以上の等張剤、例えば、塩化ナトリウムを含むことができる。別の実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、約8.18mg/mlの塩化ナトリウムを含む。当技術分野で公知の他の緩衝化剤及び等張剤は好適であり、かつ本明細書に提供される組成物中での使用のために日常的に利用することができる。
別の実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、1以上の充填剤を含むことができる。例示的な充填剤としては、マンニトール、スクロース、デキストラン、ラクトース、トレハロース、及びポビドン(PVP K24)が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、マンニトールを含み、これは、約5mg/ml～約40mg/ml、又は約10mg/ml～約30mg/ml、又は約15mg/ml～約25mg/mlの量で存在し得る。別の実施態様において、マンニトールは、約20mg/mlの濃度で存在する。
また別の実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、非イオン性界面活性剤であり得る1以上の界面活性剤を含むことができる。例示的な界面活性剤としては、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及びこれらの組合せが挙げられる。例えば、界面活性剤は、限定するものではないが、TWEEN（商標）80(別名、ポリソルベート80、又はその化学名であるポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート)、TWEEN（商標）20(別名、ポリソルベート20)、ドデシル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、TRITON（商標）AG 98(Rhone-Poulenc)、ポロキサマー407、ポロキサマー188など、及びこれらの組合せであることができる。一実施態様において、本実施態様の医薬組成物は、ポロキサマー188を含み、これは、約0.1mg/ml～約4mg/ml、又は約0.5mg/ml～約3mg/ml、約1mg/ml～約3mg/ml、約1.5mg/ml～約2.5mg/ml、又は約1.8mg/ml～約2.2mg/mlの濃度で存在し得る。別の実施態様において、ポロキサマー188は、約2.0mg/mlの濃度で存在する。
本明細書に提供される医薬組成物は安定であり、かつ許容し得ない品質、効力、又は純度の変化を伴わずに、長時間保存することができる。一態様において、該組成物は、約5℃(例えば、2℃～8℃)の温度で、少なくとも1カ月間、例えば、少なくとも1カ月間、少なくとも3カ月間、少なくとも6カ月間、少なくとも12カ月間、少なくとも18カ月間、少なくとも24カ月間、又はそれよりも長い間安定である。別の実施態様において、該組成物は、約-20℃以下の温度で、少なくとも6カ月間、例えば、少なくとも6カ月間、少なくとも12カ月間、少なくとも18カ月間、少なくとも24カ月間、少なくとも36カ月間、又はそれよりも長い間安定である。別の実施態様において、該組成物は、約-40℃以下の温度で、少なくとも6カ月間、例えば、少なくとも6カ月間、少なくとも12カ月間、少なくとも18カ月間、少なくとも24カ月間、少なくとも36カ月間、又はそれよりも長い間安定である。別の実施態様において、該組成物は、約-60℃以下の温度で、少なくとも6カ月間、例えば、少なくとも6カ月間、少なくとも12カ月間、少なくとも18カ月間、少なくとも24カ月間、少なくとも36カ月間、又はそれよりも長い間安定である。
医薬組成物は、通常、製造及び保存の条件下で滅菌されている。医薬組成物は、高い薬物濃度を入れるのに好適な溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は他の秩序のある構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、並びにこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合は必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。いくつかの実施態様において、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムが組成物に含まれる。注射可能組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを該組成物に含めることによりもたらすことができる。ある実施態様において、本明細書に提供される新規rAAVウイルス粒子は、時間放出又は制御放出組成物中で、例えば、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む、化合物を急速放出から保護する徐放性ポリマー又は他の担体を含む組成物中で投与することができる。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、及びポリ乳酸とポリグリコール酸のコポリマー(PLG)などの、生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。
いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、ナノカプセル、マイクロ粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、エクソソーム、エクソソーム様粒子、又はナノ粒子などの送達ビヒクルを介して投与することができる。新規rAAVウイルス粒子を、そのような送達ビヒクルに封入することができる。新規rAAVウイルス粒子が封入された送達ビヒクルは、緩衝剤又は他の担体などの賦形剤を含む医薬組成物中にあってもよい。
いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子を含む医薬組成物は、対象への投与経路のために製剤化される。使用することができる投与経路の例としては、選択された器官への直接的な送達、経口、吸入、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、鼻腔内、髄腔内、膵臓内、腹腔内、腫瘍内、及び他の非経口の投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子を含む医薬組成物は、導入遺伝子(例えば、治療的生体分子)を宿主細胞に移入するために使用される。用途及び治療されることになる疾患に応じて、移入は、インビトロ、エクスビボ、インビボ、又はこれらの組合せであることができる。
(6.4 方法)
本開示はまた、本開示の新規AAVカプシド配列(例えば、新規rAAVウイルス粒子又はその組成物)を含む様々な使用及び治療方法を提供する。
本開示はまた、本開示の新規AAVカプシド配列(例えば、新規rAAVウイルス粒子又はその組成物)を含む様々な使用及び治療方法を提供する。
(6.4.1 送達方法)
また提供されるのは、生体分子、例えば、治療的生体分子を細胞、組織、及び/又は器官に送達するために、本開示の新規rAAVウイルス粒子又は組成物を使用する方法である。本送達方法は、インビボ、インビトロ、又はエクスビボ送達であることができる。
また提供されるのは、生体分子、例えば、治療的生体分子を細胞、組織、及び/又は器官に送達するために、本開示の新規rAAVウイルス粒子又は組成物を使用する方法である。本送達方法は、インビボ、インビトロ、又はエクスビボ送達であることができる。
本方法は、細胞を第6.3.3節に提供されているAAVウイルス粒子と接触させることを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、生体分子(例えば、治療的生体分子)及び/又は組成物を特定の細胞、組織、又は器官型に送達するために使用される。例えば、本方法は、生体分子(例えば、治療的生体分子)及び/又は組成物を筋肉、心臓、肝臓、血漿、腎臓、脳、耳、もしくは癌細胞、又はこれらの組合せに送達するために使用することができる。或いは、送達の方法は、第6.3.2.5節に提供されている1以上の細胞/組織特異性、例えば、指向性を含むことができる。
いくつかの実施態様において、本方法は、治療剤を、分裂細胞又は非分裂細胞を含む幅広いインビボ細胞に送達するために使用される。いくつかの実施態様において、本方法は、治療的遺伝子をインビトロ細胞に送達するために、例えば、エクスビボ遺伝子療法のためにそのような治療的導入遺伝子によってコードされるポリペプチドを産生するために使用される。本開示によって提供される送達の方法は、インビボ、インビトロ、及び/又はエクスビボ遺伝子療法アプローチのためのものであり得ることが企図される。
本送達方法は、疾患又は障害を治療するために使用することができる。本明細書に提示される新規AAVカプシド配列の構造的及び/又は機能的特徴は、以下でより詳細に論じられているような1以上の共通の欠陥又は治療ニーズを有する複数の疾患適応症に対するAAV-カプシドプラットフォームアプローチを可能にする。
(6.4.2 治療方法)
本開示は、特定の組織又は細胞型(例えば、筋肉、心臓、脳/CNS、血漿、腎臓、肝臓、耳、又は癌細胞)への生体分子の送達によって治療することができる疾患又は障害の治療の方法であって、治療的導入遺伝子又は分泌性治療的タンパク質を含む本開示の新規rAAVウイルス粒子、AAVベクターコンストラクト、宿主細胞、又は医薬組成物を、それを必要としている対象(例えば、哺乳動物又はヒト対象)に投与することを含む、方法を提供する。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、疾患又は障害を治療する方法であって、それを必要としている対象(例えば、ヒト対象)に、治療有効量の新規rAAVウイルス粒子又はその医薬組成物を投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、治療される疾患又は障害は、筋肉、心臓、脳、CNS、血漿、腎臓、肝臓、耳、又は細胞増殖(例えば、癌又は良性疾患)関連の疾患又は障害であることができる。いくつかの実施態様において、該疾患又は障害は、遺伝子によってコードされるタンパク質の量又は活性を低下又は消失させる、遺伝子内の1以上の機能喪失型突然変異と関連するものである。いくつかの実施態様において、該疾患又は障害は、遺伝子内の1以上のハプロ不全突然変異と関連するものである。いくつかの実施態様において、該疾患又は障害は、遺伝子によってコードされるタンパク質の異常な量又は活性をもたらす、遺伝子内の1以上の機能獲得型突然変異と関連するものである。
本開示は、特定の組織又は細胞型(例えば、筋肉、心臓、脳/CNS、血漿、腎臓、肝臓、耳、又は癌細胞)への生体分子の送達によって治療することができる疾患又は障害の治療の方法であって、治療的導入遺伝子又は分泌性治療的タンパク質を含む本開示の新規rAAVウイルス粒子、AAVベクターコンストラクト、宿主細胞、又は医薬組成物を、それを必要としている対象(例えば、哺乳動物又はヒト対象)に投与することを含む、方法を提供する。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、疾患又は障害を治療する方法であって、それを必要としている対象(例えば、ヒト対象)に、治療有効量の新規rAAVウイルス粒子又はその医薬組成物を投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、治療される疾患又は障害は、筋肉、心臓、脳、CNS、血漿、腎臓、肝臓、耳、又は細胞増殖(例えば、癌又は良性疾患)関連の疾患又は障害であることができる。いくつかの実施態様において、該疾患又は障害は、遺伝子によってコードされるタンパク質の量又は活性を低下又は消失させる、遺伝子内の1以上の機能喪失型突然変異と関連するものである。いくつかの実施態様において、該疾患又は障害は、遺伝子内の1以上のハプロ不全突然変異と関連するものである。いくつかの実施態様において、該疾患又は障害は、遺伝子によってコードされるタンパク質の異常な量又は活性をもたらす、遺伝子内の1以上の機能獲得型突然変異と関連するものである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象にAAVウイルス粒子を再投与(readministering)又は再投与(redosing)する方法であって、2以上の異なるAAVウイルス粒子を投与することを含み、ここで、第二の又は後続の投与のために投与されるAAVウイルス粒子が第一のAAVウイルス粒子と異なるAAVカプシドを含み、かつここで、該AAVウイルス粒子のうちの少なくとも1つが本明細書に記載される新規rAAVウイルス粒子である、方法である。いくつかの実施態様において、第一及び第二のAAVウイルス粒子は、各々、カプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)を含み、これらのカプシドタンパク質は、互いに、77％、75％、70％、65％、60％、55％、又は50％以下の配列同一性を有する。いくつかの実施態様において、第一及び第二のAAVウイルス粒子は、各々、カプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)を含み、これらのカプシドタンパク質は、互いに、50％、55％、60％、65％、70％、75％、又は80％の配列同一性を有する。いくつかの実施態様において、第一及び第二のAAVウイルス粒子は、各々、カプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、又はVP3)を含み、これらのカプシドタンパク質は、互いに、50％～80％、50％～75％、50％～70％、50％～65％、又は50％～60％の配列同一性を有する。AAVウイルス粒子は、同じ又は異なる導入遺伝子を含むことができる。理論によって束縛されることを望むものではないが、低いカプシド配列同一性を有する第一及び第二のAAVウイルス粒子の使用は、同じ第一のAAVウイルス粒子の再投与と比較して、例えば、本明細書に記載されるアッセイ(例えば、実施例5に記載されているアッセイ)又は当業者に公知のアッセイにおいて低下する第二のAAVウイルス粒子に対するより低い免疫応答をもたらし、それにより、対象におけるより良好な形質導入効率及び導入遺伝子発現を可能にするという仮説が立てられる。
様々な実施態様において、第一及び第二のカプシドは、系統発生的に異なる。様々な実施態様において、系統発生的な相違は、配列相同性の閾値レベルに基づく。様々な実施態様において、カプシド又はカプシドタンパク質の配列相同性は、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％以下、又はそれより低い配列相同性であることができる。様々な実施態様において、カプシド又はカプシドタンパク質の配列相同性は、約30％～90％相同、約45％～87％相同、約40％～86％相同、約50％～85％相同、もしくは約60％～80％相同、又は約65％～75％相同であることができる。例えば、図3～11に提供されている系統発生的に異なるカプシドを参照されたい。
いくつかの実施態様において、対象(例えば、哺乳動物又はヒト対象)における第一のカプシド及び/又は第二のカプシドに対する既存免疫は低い。具体的な実施態様において、対象は、第一のカプシド、第二のカプシド、又は第一のカプシドと第二のカプシドの両方のいずれかに対する低い既存免疫を示す。いくつかの実施態様において、AAVカプシドに対する中和抗体を測定するインビトロアッセイは、対象が、第一のカプシド、第二のカプシド、又は第一のカプシドと第二のカプシドの両方に対する既存免疫を示すかどうかを決定するために使用される。具体的な実施態様において、当業者に公知の又は本明細書(例えば、下の実施例)に記載される技法は、対象における既存免疫を評価するために使用される。
様々な実施態様において、第一のカプシドは、表2のいずれか1つのあるクレードのAAVカプシド由来であることができ、第二のAAVカプシドは、異なるクレードから選択され、ここで、該ウイルス間の十分な系統学的遺伝距離及び/又は第一のAAVカプシドと第二のAAVカプシドの間のVP1タンパク質のアミノ酸配列同一性が存在する。例えば、第一のAAVカプシドは、クレード2のAAVカプシドから選択することができ、第二のAAVカプシドは、本開示のクレード5、8、14、19、20、27、30、31、39、41、及び44のいずれか1つのAAVカプシドから選択することができ、又はその逆も同じである。
対象に投与されるAAVウイルス粒子の投薬量は、治療されている疾患又は障害、治療されている疾患又は障害の重症度、治療されている対象の年齢、治療されている対象の体重、及び治療されている対象の年齢などの、種々の因子によって決まる。具体的な実施態様において、新規AAV粒子又はその組成物は、対象に、約1×109vg/kg体重～約6×1016vg/kg体重の用量で投与される。いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子又はその組成物は、参照AAV(例えば、参照AAVの例については、上の表4又は項目A又は項目Bを参照)の用量よりも低い用量で投与される。例えば、より低い用量の本開示の新規rAAVウイルス粒子又はその組成物は、参照の用量と比較して、同じ又はより良好な治療効果を得るために必要とされるか又は必要である(例えば、参照AAVの例については、上の表4又は項目A又は項目Bを参照)。
使用することができる投与経路の例としては、選択された器官への直接的な送達、経口、吸入、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、鼻腔内、髄腔内、膵臓内、腹腔内、及び他の非経口の投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。
(6.4.3 製造方法)
本開示は、本開示の新規AAVカプシド配列を用いて、新規rAAVウイルス粒子又は生体分子(例えば、治療的タンパク質)を産生する製造方法を提供する。用途に応じて、生体分子(例えば、治療的タンパク質)は、インビトロ又はインビボで産生することができる。
本開示は、本開示の新規AAVカプシド配列を用いて、新規rAAVウイルス粒子又は生体分子(例えば、治療的タンパク質)を産生する製造方法を提供する。用途に応じて、生体分子(例えば、治療的タンパク質)は、インビトロ又はインビボで産生することができる。
(6.4.3.1 新規rAAVウイルス粒子の産生)
当技術分野で公知の任意の方法は、本開示の新規rAAVウイルス粒子の調製のために使用することができる。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、哺乳動物細胞(例えば、HEK293)で産生される。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、昆虫細胞(例えば、Sf9)で産生される。いくつかの実施態様において、AAVウイルス粒子は、宿主細胞に、Rep及びCap遺伝子とともに、導入遺伝子を含むAAVベクターゲノムを提供することにより調製される。いくつかの実施態様において、AAVベクターゲノムは、導入遺伝子、AAV Rep遺伝子、及びAAV Cap遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、rAAVウイルス粒子は、宿主細胞に、2以上のベクターを提供することにより調製される。例えば、いくつかの実施態様において、導入遺伝子を含むAAVベクターゲノムは、AAV Rep遺伝子及びAAV Cap遺伝子を含むベクター(例えば、プラスミド又はバキュロウイルス)とともに細胞に導入される(例えば、トランスフェクト又は形質導入される)。いくつかの実施態様において、細胞に、導入遺伝子を含むAAVベクターゲノム、AAV Rep遺伝子を含むベクター(例えば、プラスミド又はバキュロウイルス)、及びAAV Cap遺伝子を含むベクター(例えば、プラスミド又はバキュロウイルス)をトランスフェクト又は形質導入する。いくつかの実施態様において、rAAVウイルス粒子を産生する方法は、rAAVベクターゲノム、Repタンパク質、及びCap遺伝子を含む宿主細胞を培養することを含み、ここで、該Cap遺伝子は、本明細書に記載されるカプシドタンパク質をコードする。いくつかの実施態様において、本方法は、rAAVウイルス粒子を宿主細胞から単離することをさらに含む。
当技術分野で公知の任意の方法は、本開示の新規rAAVウイルス粒子の調製のために使用することができる。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、哺乳動物細胞(例えば、HEK293)で産生される。いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、昆虫細胞(例えば、Sf9)で産生される。いくつかの実施態様において、AAVウイルス粒子は、宿主細胞に、Rep及びCap遺伝子とともに、導入遺伝子を含むAAVベクターゲノムを提供することにより調製される。いくつかの実施態様において、AAVベクターゲノムは、導入遺伝子、AAV Rep遺伝子、及びAAV Cap遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、rAAVウイルス粒子は、宿主細胞に、2以上のベクターを提供することにより調製される。例えば、いくつかの実施態様において、導入遺伝子を含むAAVベクターゲノムは、AAV Rep遺伝子及びAAV Cap遺伝子を含むベクター(例えば、プラスミド又はバキュロウイルス)とともに細胞に導入される(例えば、トランスフェクト又は形質導入される)。いくつかの実施態様において、細胞に、導入遺伝子を含むAAVベクターゲノム、AAV Rep遺伝子を含むベクター(例えば、プラスミド又はバキュロウイルス)、及びAAV Cap遺伝子を含むベクター(例えば、プラスミド又はバキュロウイルス)をトランスフェクト又は形質導入する。いくつかの実施態様において、rAAVウイルス粒子を産生する方法は、rAAVベクターゲノム、Repタンパク質、及びCap遺伝子を含む宿主細胞を培養することを含み、ここで、該Cap遺伝子は、本明細書に記載されるカプシドタンパク質をコードする。いくつかの実施態様において、本方法は、rAAVウイルス粒子を宿主細胞から単離することをさらに含む。
AAVウイルス粒子を作製する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許US6204059号、US5756283号、US6258595号、US6261551号、US6270996号、US6281010号、US6365394号、US6475769号、US6482634号、US6485966号、US6943019号、US6953690号、US7022519号、US7238526号、US7291498号、及びUS7491508号、US5064764号、US6194191号、US6566118号、US8137948号;又は国際公開WO1996039530号、WO1998010088号、WO1999014354号、WO1999015685号、WO1999047691号、WO2000055342号、WO2000075353号、WO2001023597号、WO2015191508号、WO2019217513号、WO2018022608号、WO2019222136号、WO2020232044号、WO2019222132号;分子生物学の方法(Methods In Molecular Biology)、Richard編、Humana Press, NJ(1995); O'Reillyらの文献、バキュロウイルス発現ベクター、実験室アニュアル(Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual)、Oxford Univ. Press(1994); Samulskiらの文献、J. Vir.63:3822-8(1989); Kajigayaらの文献、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50(1991); Ruffingらの文献、J. Vir.66:6922-30(1992); Kimbauerらの文献、Vir., 219:37-44(1996); Zhaoらの文献、Vir.272:382-93(2000)に記載されており;これらの各々の内容は、引用により本明細書中に完全に組み込まれる。
いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、新規rAAV粒子の産生及び複製を可能にする宿主細胞で産生される。例えば、宿主細胞は、細菌細胞又は例えば、昆虫細胞、酵母細胞、及び哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞もしくは非ヒト哺乳動物細胞)などの真核生物細胞であることができる。具体的な実施態様において、宿主細胞は、細胞株由来のものである。rAAVウイルス粒子の産生に一般に使用される宿主細胞としては、HEK293細胞、COS細胞、HeLa細胞、KB細胞、並びにその各々の内容が引用により本明細書中に完全に組み込まれる米国特許第US6156303号、US5387484号、US5741683号、US5691176号、及びUS5688676号;米国特許出願公開第2002/0081721号、並びに国際特許公開WO 2000047757号、WO 2000024916号、及びWO 1996017947号に記載されている他の哺乳動物細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、HEK293細胞は、HEK-293T細胞であることができる。AAVウイルス粒子の産生のために使用することができる哺乳動物細胞の他の例としては、A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、HepG2、並びに哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞、及び筋芽細胞が挙げられる。いくつかの実施態様において、AAVウイルス粒子の産生のために使用される宿主細胞は、限定されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、及びハムスターを含む、哺乳動物種に由来する細胞である。いくつかの実施態様において、AAVウイルス粒子の産生のために使用される宿主細胞は、限定されないが、線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞、細胞株、形質転換細胞などを含む、細胞型に由来する細胞である。
いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、昆虫細胞で産生される。培養下の昆虫細胞の成長条件、及び培養下の昆虫細胞における異種産物の産生は、当技術分野で周知であり、その内容が引用により本明細書中に完全に組み込まれる米国特許第6,204,059号を参照されたい。
パルボウイルスの複製を可能にし、かつ培養下で維持することができる任意の昆虫細胞を本開示に従って使用することもできる。限定されないが、Sf9もしくはSf21細胞株を含む、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)、ショウジョウバエ(Drosophila)細胞株、又は蚊細胞株、例えば、ヒトスジシマカ由来細胞株由来の細胞株を使用することができる。異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は、ベクター、例えば、昆虫細胞に適合するベクターなどの核酸を、そのような細胞に導入する方法及びそのような細胞を培養下で維持する方法と同様に、十分に文書化されている。例えば、その各々の内容が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、分子生物学の方法(Methods in Molecular Biology)、Richard編、Humana Press, NJ(1995); O'Reillyらの文献、バキュロウイルス発現ベクター、実験室マニュアル(Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual)、Oxford Univ. Press(1994); Samulskiらの文献、J. Vir.63:3822-8(1989); Kajigayaらの文献、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50(1991); Ruffingらの文献、J. Vir. 66:6922-30(1992); Kimbauerらの文献、Vir.219:37-44(1996); Zhaoらの文献、Vir.272:382-93(2000);及びSamulskiらの文献、米国特許第6,204,059号を参照されたい。
限定されないが、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞を含む昆虫細胞においてウイルス粒子を産生するためのバキュロウイルス発現ベクターは、高力価のウイルス粒子産物を提供する。一次感染から放出された感染性バキュロウイルス粒子は、培養下のさらなる細胞に二次的に感染し、初期の感染多重度の関数である所定回数の感染サイクルで細胞培養集団全体に指数関数的に感染する。その内容が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、Urabe, M.らの文献、J. Virol. 2006 Feb; 80(4):1874-85を参照されたい。
昆虫細胞系におけるバキュロウイルスを用いる新規rAAVウイルス粒子の産生は、既知のバキュロウイルスの遺伝的及び物理的不安定性に対処し得る。いくつかの実施態様において、産生システムは、力価のない(titerless)感染細胞の保存及びスケールアップシステムを利用することにより、複数継代にわたるバキュロウイルスの不安定性に対処する。いくつかの実施態様において、ウイルス産生細胞の小規模種培養物を、ウイルス粒子の構造的、非構造的成分をコードするウイルス発現コンストラクトでトランスフェクトする。バキュロウイルスに感染したウイルス産生細胞を採取して、液体窒素中で凍結保存することができるアリコートにし;このアリコートは、大規模なウイルス産生細胞培養物の感染のための生存性及び感染性を保持する。その内容が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、Wasilko DJらの文献、Protein Expr Purif. 2009 Jun; 65(2):122-32。
いくつかの実施態様において、遺伝的に安定なバキュロウイルスは、無脊椎動物細胞でAAVウイルス粒子を産生するための構成要素のうちの1つ又は複数の供給源として使用される。いくつかの実施態様において、欠陥のあるバキュロウイルス発現ベクターは、昆虫細胞でエピソーム的に維持される。いくつかの実施態様において、バクミドベクターは、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、及び/又は細胞周期調節性複製エレメントを含む、複製制御エレメントを伴って人為作製される。
いくつかの実施態様において、バキュロウイルス感染を許容する安定宿主細胞は、限定されないが、AAVゲノム全体、Rep及びCap遺伝子、Rep遺伝子、Cap遺伝子、別個の転写カセットとしての各々のRepタンパク質、別々の転写カセットとしての各々のVPタンパク質、AAP(アセンブリ活性化タンパク質)、又はネイティブもしくは非ネイティブプロモーターを有するバキュロウイルスヘルパー遺伝子の少なくとも1つを含む、AAV複製及びウイルス粒子産生に必要なエレメントのいずれかの少なくとも1つの安定な組み込まれたコピーを伴って人為作製される。
いくつかの実施態様において、本開示の新規rAAVウイルス粒子は、3重トランスフェクションもしくはバキュロウイルス媒介ウイルス産生、又は当技術分野で公知の任意の他の方法によって産生される。当技術分野で公知の任意の好適な許容細胞又はパッケージング細胞を利用して、該粒子を産生することもできる。いくつかの実施態様において、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失した機能を提供するトランス相補パッケージング細胞株、例えば、293細胞又は他のE1aトランス相補細胞が使用される。cap及び/又はrep遺伝子を発現するように安定に形質転換されているパッケージング細胞株を使用することができる。或いは、AAVウイルス粒子アセンブリに必要なヘルパーコンストラクトを発現するように安定に形質転換されているパッケージング細胞株を使用することができる。
いくつかの実施態様において、新規rAAVウイルス粒子産生は、産生の規模を増加させるように修飾される。本開示による大規模ウイルス産生方法は、その各々の内容が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、米国特許第5,756,283号、第6,258,595号、第6,261,551号、第6,270,996号、第6,281,010号、第6,365,394号、第6,475,769号、第6,482,634号、第6,485,966号、第6,943,019号、第6,953,690号、第7,022,519号、第7,238,526号、第7,291,498号、及び第7,491,508号、又は国際公開WO1996039530号、WO1998010088号、WO1999014354号、WO1999015685号、WO1999047691号、WO2000055342号、WO2000075353号、及びWO2001023597号に開示されているもののいずれかである。いくつかの実施態様において、ウイルス粒子産生の規模を増加させる方法は、宿主細胞の数を増加させることを含む。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、接着細胞を含む。接着性ウイルス複製細胞によるウイルス粒子産生の規模を増加させるために、より大きい細胞培養表面が必要とされる。場合により、大規模産生法は、細胞培養表面を増加させるためのローラーボトルの使用を含む。表面積が増加した他の細胞培養基材は、当技術分野で公知である。表面積が増加したさらなる接着細胞培養産物の例としては、CELLSTACK(登録商標)、CELLCUBE(登録商標)(Corning Corp., Corning, NY)、及びNUNC(商標) CELL FACTORY(商標)(Thermo Scientific, Waltham, MA)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、大規模な接着細胞培養表面は、約1,000cm2～約100,000cm2を含む。いくつかの実施態様において、大規模な接着細胞培養物は、約107～約109細胞、約108～約1010個の細胞、約109～約1012個の細胞、又は少なくとも1012個の細胞を含む。いくつかの実施態様において、大規模な接着細胞培養物は、約109～約1012、約1010～約1013、約1011～約1014、約1012～約1015、又は少なくとも1015個のAAVウイルス粒子を産生する。
いくつかの実施態様において、本開示の大規模ウイルス産生方法は、懸濁細胞培養の使用を含む。懸濁細胞培養は、細胞数の顕著な増加を可能にする。典型的には、約10～50cm2の表面積で増殖させることができる数の接着細胞を、懸濁下、約1cm3の容積で増殖させることができる。
いくつかの実施態様において、大規模な培養フォーマットでの宿主細胞のトランスフェクションは、当技術分野で公知の任意の方法に従って実施される。いくつかの実施態様において、大規模な接着細胞培養について、トランスフェクション法は、無機化合物(例えば、リン酸カルシウム)、有機化合物(例えば、ポリエチレンイミン(PEI))の使用、又は非化学的方法(例えば、エレクトロポレーション)の使用を含むが、これらに限定されない。懸濁液下で増殖させる細胞の場合、トランスフェクション法は、リン酸カルシウムの使用及びPEIの使用を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、大規模懸濁培養物のトランスフェクションは、その内容が引用により本明細書中に完全に組み込まれるFeng, L.らの文献、2008. Biotechnol Appl. Biochem.50:121-32に記載されている「トランスフェクション手順」という表題の節に従って実施される。いくつかの実施態様において、PEI-DNA複合体は、トランスフェクトされるプラスミドを導入するために形成される。いくつかの実施態様において、PEI-DNA複合体でトランスフェクトされる細胞に、トランスフェクション前に「ショック」を与える。これは、約1時間、細胞培養温度を4℃に低下させることを含む。いくつかの実施態様において、細胞培養物に、約10分～約5時間、ショックを与える。いくつかの実施態様において、細胞培養物に、約0℃～約20℃の温度でショックを与える。
具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、それが産生される宿主細胞から単離される。具体的な実施態様において、新規rAAVウイルス粒子は、実施例(例えば、実施例3)に開示されている方法によって産生される。
(6.4.3.2 生体分子のインビトロ産生)
非限定的な例として、本明細書に開示される新規rAAVウイルス粒子を用いて、目的の生体分子(例えば、目的のタンパク質)を、インビトロで、例えば、細胞培養物中で産生することができる。1つの非限定的な例として、いくつかの実施態様において、目的のタンパク質をインビトロで産生する方法、ここで、該方法は、生体分子(例えば、異種タンパク質)をコードするヌクレオチド配列を含む新規rAAVウイルス粒子を細胞培養物中の細胞と接触させることを含み、それにより、該AAVウイルス粒子は、細胞内で生体分子(例えば、目的のタンパク質)を発現する。
非限定的な例として、本明細書に開示される新規rAAVウイルス粒子を用いて、目的の生体分子(例えば、目的のタンパク質)を、インビトロで、例えば、細胞培養物中で産生することができる。1つの非限定的な例として、いくつかの実施態様において、目的のタンパク質をインビトロで産生する方法、ここで、該方法は、生体分子(例えば、異種タンパク質)をコードするヌクレオチド配列を含む新規rAAVウイルス粒子を細胞培養物中の細胞と接触させることを含み、それにより、該AAVウイルス粒子は、細胞内で生体分子(例えば、目的のタンパク質)を発現する。
(6.4.3.3 生体分子のインビボ産生)
本明細書に開示される新規rAAVウイルス粒子を用いて、目的の生体分子(例えば、目的のタンパク質)を、インビボで、例えば、哺乳動物などの動物で産生することができる。いくつかの実施態様は、目的の生体分子(例えば、目的のタンパク質)をインビボで産生する方法を提供し、ここで、該方法は、生体分子(例えば、目的のタンパク質)をコードする導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む新規rAAVウイルス粒子を対象に投与することを含み、それにより、該AAVウイルス粒子は、目的の生体分子(例えば、目的のタンパク質)を対象で発現する。対象は、いくつかの実施態様において、非ヒト哺乳動物、例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、又はウシであることができる。具体的な実施態様において、対象は、ヒトである。投与経路及び用量については、第6.4.2節を参照されたい。
本明細書に開示される新規rAAVウイルス粒子を用いて、目的の生体分子(例えば、目的のタンパク質)を、インビボで、例えば、哺乳動物などの動物で産生することができる。いくつかの実施態様は、目的の生体分子(例えば、目的のタンパク質)をインビボで産生する方法を提供し、ここで、該方法は、生体分子(例えば、目的のタンパク質)をコードする導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む新規rAAVウイルス粒子を対象に投与することを含み、それにより、該AAVウイルス粒子は、目的の生体分子(例えば、目的のタンパク質)を対象で発現する。対象は、いくつかの実施態様において、非ヒト哺乳動物、例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、又はウシであることができる。具体的な実施態様において、対象は、ヒトである。投与経路及び用量については、第6.4.2節を参照されたい。
本開示の他の態様及び利点は、以下の例示的実施例を考慮して理解されるであろう。
(6.5 実施例)
(6.5.1 実施例1:動物組織源からの新規AAVカプシドタンパク質の同定)
新規AAVカプシドタンパク質を同定するために、ゲノムDNAを様々な動物組織から収集し、図1～2に示されており、かつ以下でより詳細に説明されているように、公的に利用可能なNGS配列データベースを評価した。
(6.5.1 実施例1:動物組織源からの新規AAVカプシドタンパク質の同定)
新規AAVカプシドタンパク質を同定するために、ゲノムDNAを様々な動物組織から収集し、図1～2に示されており、かつ以下でより詳細に説明されているように、公的に利用可能なNGS配列データベースを評価した。
ゲノムDNA調整及び単離:
ゲノムDNAを、DNeasy Blood & Tissueキット(Qiagenカタログ#69504)を用いて、収集された試料から調製した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を、rep中のヘリカーゼドメインに相補的なフォワードプライマー及びcapタンパク質中のいくつかのDNA結合ドメインのうちの1つに相補的なリバースプライマーを用いて、ゲノムDNAに対して実施した。PCR断片の予想されるサイズは、以下の条件下で1.5kbである:初期インキュベーション: 97℃、120秒、変性工程: 97℃、15秒、アニーリング工程: 58℃、60℃、又は62℃、15秒、伸長工程: 72℃、120秒。変性、アニーリング、及び伸長工程を42サイクル行った。その後、反応液を72℃で、7分間インキュベートし、解析するまで4℃で保存した。
PCR産物をFlashGel System(Lonzaカタログ#57034)で電気泳動により分離し、PCR産物をSelect-a-Size DNA Clean and Concentratorキット(Zymoカタログ#D4080)により精製し、製造元の指示に従って、pCR4-TOPO-TA(Invitrogenカタログ# 450030)にクローニングした。大腸菌NEB5a細胞の形質転換の後、DNAをアンピシリン耐性コロニーから調製し、両末端からシークエンシングして、挿入物がAAV関連配列をコードするかどうかを決定した。
pCR4-TOPO TA中の挿入物がAAV配列と関連している場合、様々な方法をカプシド配列の単離に使用した。PCRベースの単離方法には、最良推測3プライムUTRプライマー設計、ゲノムウォーキング、又はエピソーム周辺PCRが含まれた。ある方法では、配列特異的プライマーを配列のrep部分に設計し、「エピソーム周辺PCR」(以後、「ATE PCR」)を実施して、完全なカプシド遺伝子を得た。ATE PCRは、持続性AAVゲノムが動物組織内で環状エピソームを形成するという考えに基づいている。したがって、rep遺伝子の配列に対応するプライマーの「多岐にわたる」セットを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、そのエピソーム中に存在し得る任意のAAV配列のほとんど又は全てを単離することができ、特に、完全な連続カプシド遺伝子を単離することができる。エピソームの多量体は、例えば、相同組換えによって形成されることがあり、その場合、単一のATE PCR反応から複数のカプシド遺伝子(これは、通常、同じではない)を単離することが可能である。
PCR増幅DNA配列のコンピュータ解析:
ひとたび完全な配列が決定されると、BLASTアルゴリズム(NCBIウェブサイトで入手可能)を用いて、それらがAAVカプシド遺伝子であることを確認した。以前に発表されたAAVとの関係は、Geneious Prime、Clustal Omega(EBIウェブサイトで入手可能)、又はVector NTI(Invitrogen社)などの様々なアラインメントプログラムを用いて決定した。
ベクター及びrAAVウイルス粒子の産生:
AAVを産生するために、AAVカプシド遺伝子を発現プラスミド(pAAV-RC; Agilent社)にサブクローニングし、その後、ベクター(pAAVルシフェラーゼ)及びアデノウイルスヘルパープラスミド(pHELPER; Agilent社)とともに、HEK293細胞にトランスフェクトした。AAV産生を3日間生じさせておき、その後、この細胞を3回凍結解凍することにより、粗溶解物を作製した。残屑をペレット化し、上清(粗AAV)をQ-PCRにより力価測定して、ゲノム力価(これにより、カプシドがアセンブリ及びDNAパッケージング可能であることが確認される)を決定し、その後、様々な細胞でのAAVによる形質導入を評価するために使用した。
NGSデータベースにおけるAAVの同定:
公的に利用可能なNGSデータベースのShort Read Archive(SRA)を使用し、Magic-BLASTを用いて、SRAを整列させ、様々な動物源由来の公表されているAAVから構築及びアセンブルされた多様なAAV参照配列と比較した。
その後、Magic-BLAST出力を解析し、多様なAAV参照配列と比較して、該AAV参照配列と一致する配列を同定した。次に、Megablast解析を行って、この一致が任意の公表されているAAV配列と整列しないかどうかを決定した。整列され、かつ上記の基準を満たしたSRA一致は、全長カプシドVP1タンパク質をアセンブルするために使用される。
新規AAVカプシド配列は、「BCD_」という接頭辞によって示される。表9を参照されたい。記載されているアミノ酸及び核酸配列は、VP1タンパク質についてのものである。VP2及びVP3タンパク質並びに定常及び可変領域の配列は、本明細書に記載される通りに、当業者によって容易に決定されることができる。
(6.5.2 実施例2:ベクター及びrAAVベクターゲノムの作製)
使用されるアッセイ及び産生系に応じて、ベクター及び/又はrAAVベクターゲノムを下記の通りに作製した。
使用されるアッセイ及び産生系に応じて、ベクター及び/又はrAAVベクターゲノムを下記の通りに作製した。
簡潔に説明すると、cap遺伝子(配列番号1～96及び193)、rep遺伝子、少なくとも1つのITR、例えば、AAV-2(表4を参照)、プロモーター、1以上の調節性制御エレメント、並びに導入遺伝子又はレポーター遺伝子の核酸配列を有するコンストラクトを、従来のクローニング技法を用いて調製した。Green, M.及びSambrook, J.の文献、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第4版、Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring Harbor, N.Y. 2012)を参照されたい。
使用される産生系、HEK293細胞及び/又はバキュロウイルスに応じて、ベクター及び/又はrAAVベクターゲノムは、ベクターゲノムに構成されたか、又は例えば、rAAVベクターゲノム/のために、AAV及び導入遺伝子発現のための必要な遺伝的エレメント(例えば、ITR、rep、cap、調節エレメント、導入遺伝子、及び/もしくはアデノウイルスヘルパー機能)を含む2つ、3つ、もしくは4つの別々のベクターのいずれかが存在することができる。
新規AAVカプシド配列を含むrAAVウイルス粒子を実施例3に提供されている通りに産生した。
(6.5.3 実施例3: HEK293及びバキュロウイルス感染昆虫細胞における新規rAAVウイルス粒子の産生)
実施例2に記載されているベクター及び/又はrAAVベクターゲノムを用いて、下記のようにHEK293細胞及び/又はバキュロウイルス感染昆虫細胞産生系を用いて、rAAVウイルス粒子を産生した。
実施例2に記載されているベクター及び/又はrAAVベクターゲノムを用いて、下記のようにHEK293細胞及び/又はバキュロウイルス感染昆虫細胞産生系を用いて、rAAVウイルス粒子を産生した。
組換えバクミドの作製:
DH10 Bacコンピテント細胞を氷上で解凍した。組換えシャトルプラスミド(例えば、pFB-GFP)を添加し、該コンピテント細胞と穏やかに混合し、氷上で30分間インキュベートした。その後、該コンピテント細胞を約42℃の温度で30秒間熱処理し、その後、氷上で2分間冷やした。該コンピテント細胞に、42℃で30秒間、熱でショックを与え、氷上で2分間冷やした。SOCを細胞に添加し、該細胞を撹拌しながら37℃で4時間インキュベートしておき、組換えを生じさせた。インキュベーション期間中、形質転換のために、X-galを2つのLB-プレート(様々な抗生物質(例えば、カナマイシン、ゲンタマイシン、及びテトラサイクリンをさらに含有する)に塗り、次いで、IPTGを塗った。
一定量のインキュベーション混合物を取得し、希釈し、その後、2つのLB-プレートに塗り、37℃で約30～48時間インキュベートした。いくつかの白いコロニーを各々のプレートから選択し、LB-プレート中に提供される同じ組合せの抗生物質を含有するLB培地中で一晩培養した。次に、バクミドDNA及びグリセロールストックを調製し、－80℃で保存した。
組換えバクミドDNAの精製:
一定量のバクミドグリセロールストックを取り除き、選択用の抗生物質の組合せを含有するLB培地中に播種した。培養物を振盪させながら37℃で一晩増殖させた。次に、一定量の培養物を、微量遠心分離機中、全速力で約30秒間スピンした。
ペレットを、ピペットを用いて、再懸濁バッファー、次いで、溶解バッファーに再懸濁させ、チューブを数回反転させて、バッファーを混合し、その後、室温で約5分間インキュベートした。例示的な再懸濁バッファーは、50mM Tris-CL、pH 8.0、10mM EDTA、及び100ug/mL RNアーゼAを含む。例示的な溶解バッファーは、200mM NaOH及び1％SDSを含む。一定量の沈殿バッファー(例えば、3.0M酢酸カリウム、pH 5.5を含むバッファー)をゆっくりと添加し、チューブを数回反転させて、バッファーを混合し、その後、氷上で約10分間インキュベートした。該チューブを全速力で約10分間遠心分離し、上清をイソプロパノールを含有するチューブに注いだ。該チューブを数回反転させて、溶液を混合した。
次に、該溶液を、全速力で、室温で約15分間遠心分離し、上清を、遠心分離後すぐに、ピペットで除去した。
一定量の70％エタノールを添加して、ペレットをすすぎ、全速力で1分間、再度スピンした。その後、エタノールを除去し、溶液を再度スピンして、微量のエタノールを除去した。一定量のTE/EBバッファーを各々のチューブに添加し、ペレットをピペットで注意深く溶解させた。すぐに使用しない場合、溶液を-20℃で保存した。
組換えバキュロウイルスのPOストックの産生:
Sf9細胞を約1×106細胞/ウェルで6-ウェルプレートに(又は6×106細胞を10-cmプレートに又は1.7×107細胞を15-cmディッシュに)播種し、細胞を、トランスフェクション前に、少なくとも1時間付着させておいた。
トランスフェクション溶液A及びBは、次のように調製した:溶液A:一定量のバクミドを15-mLチューブ中の抗生物質を含まない一定量の無血清培地に希釈した。溶液B:一定量のCellFectinを15-mLチューブ中の抗生物質を含まない一定量の無血清培地に希釈した。溶液Bを溶液Aに添加し、ピペットで約3回ピペットで穏やかに混合し、室温で30～45分間インキュベートした。次に、プレートからの培地を吸引し、抗生物質を含まない一定量の無血清培地を添加して、細胞を洗浄した。抗生物質を含まない一定量のSF900IIを、脂質-DNA混合物を含有する各々のチューブに添加した。
細胞からの培地を吸引し、トランスフェクション溶液を該細胞に添加し、該細胞を28℃で約5時間インキュベートした。トランスフェクション溶液を除去し、抗生物質を含まない一定量の無血清培地を添加し、28℃で約4日間インキュベートした。組換えバキュロウイルスを含有する培地を収集し、1000rpmで約5分間スピンして、細胞残屑を除去した。バキュロウイルスを暗所4℃で保存した。
バキュロウイルス(P1)の増幅:
Sf9細胞を約4×106細胞/mLに増殖させ、振盪フラスコ中の新鮮な培地で約2×106細胞/mLに希釈した。一定量のSf9細胞に、一定量のPOストックバキュロウイルスを感染させた。感染多重度(MOI)は、約0.1であった。
Sf9細胞を約3日間インキュベートし、バキュロウイルスを採取した。細胞を2,000rpmで5分間スピンして、該細胞をペレット化し、上清を回収し、暗所4℃で保存した。バキュロウイルスの力価をClontechのRapid Titer Kitのプロトコルに従って決定した。
P1組換えバキュロウイルスを用いたAAVの産生:
Sf9細胞を約1×107細胞/mLに増殖させ、約5×106細胞/mLに希釈した。一定量の希釈したSf9細胞に、Bac-ベクター(5Moi)及びBac-ヘルパー(15Moi)を3日間感染させた。細胞生存率を3日目に評価した(約50％～70％の死細胞が観察された)。
細胞ペレットを3000rpmで10分間の遠心分離により回収した。培地を除去し、細胞を溶解させた(又はすぐに使用しない場合、細胞ペレットを-20℃で保存した)。
溶解及びバンディングプロトコル:
一定量のSf9溶解バッファー＋Benzonaseを各々の細胞ペレットに添加し、徹底的にボルテックス処理して、細胞を再懸濁させた。再懸濁したSf9細胞を氷上で約10分間インキュベートして、溶解物を冷却した。該溶解物を約20秒間超音波処理して、細胞を徹底的に溶解させ、その後、37℃で約30分間インキュベートした。
一定量の5M NaClを添加し、混合物をボルテックス処理し、その後、37℃でさらに30分間インキュベートした。一定量のNaClを添加して、塩濃度を約500mMにし、ボルテックス処理し、8,000rpmで、15℃で20分間遠心分離して、清澄化された溶解物を生じさせた。
清澄化された溶解物は、超遠心分離工程に移る。清澄化された溶解物を最初に添加し、その後、1.32g/ccの量のCsCl溶液と1.55g/ccの量のCsCl溶液を長い針の付いたシリンジに通して添加することにより、CsCl勾配を調製した。CsCl溶液の界面に印を付けた。PBSを遠心分離チューブの上端まで添加し、チューブのバランスを慎重に取って、密閉した。
チューブを、55,000rpmで、15℃で約20時間遠心分離した。各々のチューブの上部に穴を空け、2つのCsCl溶液の界面マークよりもわずかに上に位置するAAVバンドに印を付けた。
2回目のCsCl遠心分離は、AAV溶液を70.1 Tiローター用の遠心分離チューブに移すことにより行い、一定量のCsCl溶液をチューブの上端近くまで添加した。チューブのバランスを取り、密閉した。チューブを65,000rpmで約20時間遠心分離し、AAVバンド(下側のバンド、上側のバンドは空のカプシドである)を収集した。
3つの別々のベクター及び/又はrAAVベクターゲノムを選択し、HEK293細胞及び/又はバキュロウイルス感染昆虫細胞でrAAVウイルス粒子を産生する能力について試験した。選択されたクローンの大部分は、HEK293細胞及び/又はバキュロウイルス感染昆虫細胞のいずれかでウイルス粒子を産生した(データは示さない)。選択されたrAAVウイルス粒子を、以下の実施例で提供されるようなさらなる解析のために選んだ。
(6.5.4 実施例4:新規rAAVウイルス粒子のヒト血清中和の評価)
選択されたrAAV及び新規rAAVウイルス粒子を中和するヒト血清中の抗体の能力を下記の通りに評価した。
選択されたrAAV及び新規rAAVウイルス粒子を中和するヒト血清中の抗体の能力を下記の通りに評価した。
静脈内免疫グロブリン(IVIg)中和アッセイ:
HEK293T細胞を4E4細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。IVIgの連続希釈液(0～20mg/mL)と1:1で1時間混合した後、精製されたrAAVを2E6vg/uLの最終力価まで希釈した。組換えAAVを10μMエトポシドとともに1000のMOIでHEK293T細胞に添加し、37℃でインキュベートした。ウイルス添加から72時間後、パーセント形質導入を、ベクター＋BSAのみの対照形質導入と比べた相対発光単位(RLU)で測定されたルシフェラーゼ活性により評価した。
表5及び図12A～Bは、プールされた健常ヒト血清由来の増加する濃度の精製ヒト免疫グロブリン(IVIg)の存在下における各々の個々のrAAVについてのHEK293T細胞での中和アッセイのデータを示している。ルシフェラーゼ発現を定量し、データを2連の平均からのパーセント「％」形質導入として表した。ルシフェラーゼ発現を定量し、データを平均RLUとして表した。
図12Bは、NC50データを示している。NC50は、形質導入が50％に等しくなるIVIgの濃度(線上の点のx-値)を計算することにより決定され、その場合、線は、50％形質導入の上下の2点を結ぶことにより作成される。
表5:(％)形質導入で示されたIVIg中和データ
他のAAVと比較した新規rAAVウイルス粒子を中和するヒト血清中の抗体の能力は、表5及び図12A～Bに提供されている。図12Bは、AAVカプシドタンパク質を含むいくつかのrAAVウイルス粒子を含む様々なカプシドについて、IVIgアッセイから、本明細書に提供されているように計算されたNC50を提供している。新規rAAVウイルス粒子のNC50とAAVカプシドのNC50との倍数の差は、開示された新規カプシドがAAV液性免疫を回避する能力の増強を示している。例えば、AAVカプシドのIVIgアッセイにおいてAAV-12は、約0.5263mg/mLのNC50を有し、AAV-6は、約0.0476mg/mLのNC50を有し、AAV-7は、約0.0441mg/mLのNC50を有し、AAV-8は、約0.0610mg/mLのNC50を有し、AAV-9は、約0.0513mg/mLのNC50を有し、AAV-5は、約0.2326mg/mLのNC50を有し、AAV-2は、約＜0.0305mg/mL未満の推定NC50を有していた。分岐6のrAAVカプシドは、0.2103mg/mLの平均NC50を有し、一方、新規rAAVカプシドは、約0.1190mg/mL～約0.2941mg/mLの範囲を有する0.2059mg/mlの平均NC50を有していた。これらのデータは、新規カプシドタンパク質を含むいくつかの新規rAAVウイルス粒子がヒト血漿/血清中の抗体による認識、結合、及び/又は中和を回避することができ、それゆえ、AAV液性免疫を回避する増強された能力を有することを示している。
(6.5.5 実施例5:新規rAAVウイルス粒子のインビトロ細胞形質導入の評価)
選択された新規rAAVウイルス粒子をヒト細胞株に形質導入するその能力について調べた。
選択された新規rAAVウイルス粒子をヒト細胞株に形質導入するその能力について調べた。
rAAVウイルス粒子の産生及び精製:
rAAVウイルス粒子は、リン酸カルシウムとともに、rAAVベクターゲノムプラスミド、rep及びcapプラスミド、並びにAAVヘルパープラスミドを用いるHEK293細胞の3重トランスフェクションによって産生される。AAVウイルス粒子を2重塩化セシウム勾配超遠心分離により精製した。AAVウイルス力価をqPCRにより決定した。
HEK293及びHepG2細胞アッセイ:
HEK293及びHepG2細胞を96-ウェルプレートに4.5×104細胞/ウェルで播種し、一晩インキュベートした。エトポシドを、感染当日に、それぞれ、HEK293細胞及びHepG2細胞について、4μM及び20μMの最終濃度まで添加した。次に、精製AAVウイルス粒子を2000のMOIで添加し、形質導入データを感染後72時間の相対ルシフェラーゼ単位(RLU)で測定した。
U87MG細胞アッセイ:
ヒト膠芽腫U87MG細胞を96-ウェルプレートに4.5×104細胞/ウェルで播種し、一晩インキュベートした。エトポシドを、感染当日に、4μMの最終濃度まで添加した。精製AAV粒子を2000のMOIで添加し、形質導入データを感染後72時間のRLUで測定した。
表6において、HEK293、HepG2、及びU87MGインビトロ細胞株形質導入データが試験された各々の新規rAAVウイルス粒子について提示されている。平均細胞形質導入効率が平均RLU単位(AVG)として示され、標準偏差(SD)が表示されている。空白のセルは、アッセイがまだ実施されていないことを示している。
表6:平均RLU単位(AVG)及び標準偏差(SD)で提示されたインビトロ細胞形質導入データ
空白のセルは、アッセイがまだ実施されていないことを示している。可能な場合、形質導入効率を別のAAVカプシドと比較した。これらの結果は、新規rAAVウイルス粒子の大部分が、HEK293、HepG2、及び/又はU87MG細胞のいずれかに様々な効率で形質導入することができるという点で機能的であることを示している。
(6.5.6 実施例6:マウスにおける新規rAAVウイルス粒子のインビボ指向性の評価)
インビボイメージングシステム(IVIS)アッセイを、マウスにおける選択された新規rAAVウイルス粒子の指向性を調べるために行った。
インビボイメージングシステム(IVIS)アッセイを、マウスにおける選択された新規rAAVウイルス粒子の指向性を調べるために行った。
レポーター遺伝子を有するrAAVウイルス粒子の産生:
新規VP1、VP2、及びVP3カプシド配列を含み、かつルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するrAAV(AAV-RSV-efp-T2A-Fluc2)を生成させた。
インビトロ組織発現アッセイ:
雄Balb/C又はC57BLマウスは、Charles River Breeding Laboratoriesから購入した。2×1013vg/kgの用量のAAV-RSV-egfp-T2A-Fluc2ベクターを8週齢のマウスの尾静脈に注射した。
IVIS Lumina LTイメージング:
注射から3及び5週間後に、インビボイメージング装置(PerkinElmer社、Waltham, MAから入手されたIVIS Lumina LT)を用いて、インビボ生体発光イメージングを実施した。簡潔に説明すると、マウスに2％イソフルオラン及び酸素で麻酔をかけた。150μlの30mg/mlのRediJect D-ルシフェリン生体発光基質を腹腔内注射した。基質注射から10分後、動物を、冷却電荷結合素子(CCD)カメラを搭載したIVIS Lumina LTシステムでイメージングした。画像は、動物の背側の位置で撮影した。麻酔は、遮光したイメージングチャンバー内でのイソフルオラン-酸素供給によって、イメージングセッションの全体を通して維持した。マウスは、AAV注射から5週間後のイメージングセッションの後に屠殺した。動物の臓器を直ちに採取し、IVIS Lumina LTシステムを用いてイメージングした。測定条件は、インビボイメージングで使用されたものと同じであった。
イメージングのために、動物のグレースケール写真を取得し、その後、生体発光画像を取得した。画像データは、Living Image software(登録商標)バージョン4.5.2(PerkinsElmer Waltham, MA)を用いて処理及び解析した。各々の動物及び個々の臓器を囲む目的の領域をトレースして、ルシフェラーゼ活性によって放出される全フラックス(TF)(光子/秒)を定量した。結果を下の表7に示す。空白のセルは、アッセイがまだ実施されていないことを示している。
表7:組織における全フラックス(光子/秒/cm2/ラジアン)として提示された:標準偏差(SD)付きの平均AVGで提示されたIVIS生体分布データ
表7で観察される全フラックス活性は、AAVウイルス指向性(すなわち、組織/臓器感染性)の代用である。別のAAVと比較した、特定の組織型/臓器の平均(光子/秒/cm2/ラジアン)のlog以上の差は、指向性/感染性の有意な増加又は減少を示す。これらのデータは、特定の新規カプシドタンパク質を保有するAAVが異なる組織特異性/指向性プロファイルを示すことを示している。
(6.5.7 実施例7:非ヒト霊長類における新規rAAVウイルス粒子の評価)
非ヒト霊長類試験をカニクイザル(Macaca fascicularis)を用いて行い、新規rAAVウイルス粒子が様々な器官及び組織型で形質導入及び発現する能力を評価する。
非ヒト霊長類試験をカニクイザル(Macaca fascicularis)を用いて行い、新規rAAVウイルス粒子が様々な器官及び組織型で形質導入及び発現する能力を評価する。
新規rAAVウイルス粒子:
新規カプシドタンパク質配列(表9を参照)、及びβCG導入遺伝子を含むrAAVウイルス粒子を上の実施例3に提供されている通りに産生する。
試験プロトコル:
試験群(n=3)には、ビヒクル並びに遺伝子のコード配列を含有する様々な用量、高用量「HD」及び低用量「LD」のAAVビリオンが含まれる。有効性評価項目には、各々の動物のベースライン読み取りにおける3～4週間の週1回の採血(血漿)、その後、8～13週間の試験での週1回の採血の実行が含まれる。有効性は、血漿及び組織の目的の遺伝子の活性及びタンパク質レベルによって評価される。
臨床病理学的検査及び血液学的検査をモニタリングする。安全性評価項目には、週1回の身体検査、及び体重測定、並びに抗AAV抗体及び抗遺伝子応答(例えば、治療的導入遺伝子又はその標的)、並びにALTなどの肝酵素レベルのモニタリングが含まれる。霊長類を有害な臨床徴候についてモニタリングし、見られた場合は、追加の解析を実施する。試験終了時に、肉眼的剖検を実施し、全ての主要臓器を、目的の遺伝子の活性、タンパク質、及び病態について、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)及び免疫組織化学検査(IHC)により評価する。
qPCRとIHCアッセイの両方から、新規カプシドタンパク質を含むrAAVウイルス粒子は、新規AAVカプシドが増強された指向性/送達を示す臓器で高いβCG陽性発現をもたらし、標的から外された細胞では低いβCG陽性発現をもたらすことが示される。
(6.5.8 実施例8A:脳組織における新規rAAVウイルス粒子指向性のエクスビボ評価)
本開示の選択されたrAAV及び/又は新規rAAVウイルス粒子を用いる試験をエクスビボの脳スライスを用いて行い、脳に対するその指向性を評価する。
本開示の選択されたrAAV及び/又は新規rAAVウイルス粒子を用いる試験をエクスビボの脳スライスを用いて行い、脳に対するその指向性を評価する。
動物及び新規AAVベクター又はrAAVベクターゲノム:
非ヒト霊長類(ミナミブタオザル(Macaca nemestrina))、C57BL/6マウスのいずれかを本試験に使用する。表9の新規AAVカプシド配列及び/又は他のAAV、hSyn1プロモーターを含む新規AAVベクター又はrAAVベクターゲノムを、GFP又はYFPのいずれかでタグ付けし、上の実施例に記載されているように調製する。
培地及び試薬:
NMDG-HEPES aCSF(単位はmM): 92 NMDG、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25グルコース、2チオウレア、5 Na-アスコルビン酸塩、3 Na-ピルビン酸塩、0.5 CaCl2・2H2O、及び10 MgSO4・7H2O。17mL+/-0.5mLの5M塩酸でpHを7.3～7.4に滴定する。
HEPES保持aCSF(単位はmM): 92 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25グルコース、2チオウレア、5 Na-アスコルビン酸塩、3 Na-ピルビン酸塩、2 CaCl2・2H2O、及び2 MgSO4・7H2O。10Nの濃NaOHでpHを7.3～7.4に滴定する。
記録aCSF(単位はmM): 124 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、24 NaHCO3、12.5グルコース、5 HEPES、2 CaCl2・2H2O、及び2 MgSO4・7H2O。10Nの濃NaOHでpHを7.3～7.4に滴定する。
Na+スパイクイン溶液(2M): 580mgのNaClを5mLの新たに調製されたNMDG-HEPES aCSFに溶解させる。
組織包埋用の2％アガロース: 2gのアガロースタイプ1Bを100mLの1×PBSに溶解させ、沸騰直前まで電子レンジで加熱し、旋回させて、混合する。混合液を滅菌した10cmペトリ皿に注ぎ、固化させておく。アガロースプレートを、使用するまで、密封したプラスチックバッグに4℃で保存する。
注射用麻酔薬作業ストック溶液: 2.5gの2,2,2-トリブロモエタノールを5mLの2-メチル-2-ブタノールと混合する。次に、この混合物を200mLのPBS、pH 7.0～7.3に徐々に溶解させ、使用前に0.22μmのフィルターで濾過し、遮光して4℃で保存する。
スライシングステーション:
250mLのビーカーに、200mLのNMDG-HEPES aCSFを満たし、一定のカルボゲン化(培地中に浸漬させたガス拡散石を介して適用される)を伴って、氷上で＞10分間予冷する。最初の脳スライス回収チャンバーに、150mLのNMDG-HEPES aCSFを満たし(一定のカルボゲン化を維持する)、このチャンバーを32～34℃に維持された加熱水浴に入れる。Edwards及びKonnerthの文献(1992) Methods Enzymol. 207:208-22の設計に因んだスライスチャンバーを使用する。網を液面下約1cmに沈める。リザーバに、450mLのHEPES aCSFを満たし、使用するまで、一定のカルボゲン化の下、室温まで温める。
溶融アガロースを組織包埋用に調製する。50mL円錐バイアルの開口端を用いて、予め準備されたディッシュから2％アガロースのブロックを切り出す。アガロースがちょうど溶けるまで、円錐バイアルを電子レンジで加熱する。溶融アガロースを1.5mLチューブに注ぐ。42℃に設定されたサーモミキサーを激しく振盪させながら用いて、アガロースを溶融状態に保つ。
経心腔的灌流:
マウスを麻酔薬作業ストック溶液(250mg/kg:体重10g当たり0.2mLの1.25％麻酔薬作業ストック溶液)の腹腔内注射により深麻酔する。2～3分後、麻酔の十分な深化を足趾ピンチ反射試験により確認する。
30mLシリンジに、予冷した(2～4℃) 250mLビーカーからの25mLのカルボゲン化NMDG-HEPES aCSFを充填する。25 5/8ゲージの針を取り付ける。30mLシリンジの針を左心室に挿入し、右心房を細いハサミで切って、血液が心臓から出るようにする。シリンジのプランジャーを一定の圧力を用いて押し下げ、冷やしたNMDG-HEPES aCSFを～10mL/分の割合で動物に灌流する。
脳の解剖及びスライシング:
動物の頭部を切断する。次に、メスを用いて、頭部の皮膚を切開し、頭蓋冠を露出させる。細いスーパーカット鋏を用いて、頭蓋冠上の皮膚を切り離し、頭蓋骨の尾側/腹側基部の両側で横方向に小さな切り込みを入れる。頭蓋骨の尾側/背側から吻側方向に背側正中線を上って移動して、さらに浅い切り込みを入れる。最後に、嗅球の位置で正中線に垂直に「T字」の切り込みを入れる。
先端の丸い鉗子を用いて、頭蓋骨を吻側-内側面から把持し、尾側-外側方向に向かってめくる。この工程を両側で繰り返して、頭蓋冠の背側半分を割って取り除き、脳を露出させる。無傷の脳をすくい取り、予冷したNMDG-HEPES aCSFのビーカーに入れ、約1分間冷却させておく。
大きなヘラを用いて、脳をビーカーから引き上げ、濾紙で覆ったペトリ皿の上に乗せる。脳をトリミングし、好ましいスライス角度及び対象となる所望の脳領域に合わせてブロック化する。
脳ブロックを接着糊を用いて標本ホルダーに固定する。次に、標本ホルダーの内側を引き込み、脳ブロックを完全に内側に引く。脳ブロックがアガロースに完全に覆われるまで、溶融アガロースをホルダーに直接注ぐ。アガロースが固化するまで、予冷した付属の冷却ブロックを標本ホルダーの周囲に～10秒間固定する。
標本ホルダーをスライサー機のレセプタクルに挿入し、適切なアライメントを確認する。リザーバに、残りの予冷した酸素添加NMDG-HEPES aCSFを満たし、スライスの期間中、バブルストーンを内部に入れて、十分な酸素供給を確保する。
マイクロメータを調整して、包埋された脳標本をスライスする。スライサーを前進速度及び発振周波数について実験的に調整し、目的の領域を完全に薄片にするまで、組織を300μm刻みでスライスする。
NMDG保護回復手順の最適化:
スライスを、切り取ったプラスチック製パスツールピペットを用いて収集し、150mLのNMDG-HEPES aCSFを満たした予熱した(34℃)初期回収チャンバーに移す。全てのスライスを次々に移し、全てのスライスが回収チャンバーに移動したらすぐに、タイマーをスタートさせる。
次に、段階的なNa+スパイクイン手順を、指示された量のNa+スパイクイン溶液を指示された時間に初期回収チャンバーのバブラーチムニーに直接添加することにより行う。
スライスをHEPES aCSF長期保持チャンバーに移し、その後、室温に維持する。実験を開始する前に、スライスをHEPES保持チャンバーでさらに1時間回復させておく。脳スライスにおけるYFP又はGFP発現の可視化は、YFP又はGFPタンパク質の落射蛍光顕微鏡観察及び/又はIHC検出によって行う。
陽性対照及び陰性対照と比較したときの、落射蛍光顕微鏡観察及び/又はIHC検出のいずれかによる陽性のYFP又はGFP発現神経細胞は、選択された新規rAAVウイルス粒子が脳組織で神経細胞指向性を有することを示す。
(6.5.9 実施例8B:脳組織における新規rAAVウイルス粒子指向性のエクスビボ評価)
脳に対するその推定上の指向性をさらに評価するために、本開示の新規rAAVウイルス粒子を含む選択されたrAAVをエクスビボ脳スライスとともに用いて、試験を行った。
脳に対するその推定上の指向性をさらに評価するために、本開示の新規rAAVウイルス粒子を含む選択されたrAAVをエクスビボ脳スライスとともに用いて、試験を行った。
動物及び新規AAVベクター又はrAAVベクターゲノム:
非ヒト霊長類(ミナミブタオザル(Macaca nemestrina))、C57BL/6マウス、又はヒト脳組織のいずれかをこの試験に使用した。表10の新規AAVカプシド配列を含むrAAVベクター及びベクターゲノム又はCN1839-rAAV-hSyn1-SYFP2-10aa-H2B-WPRE3-BGHpA(Addgeneプラスミド# 163509; http://n2t.net/addgene:163509; RRID:Addgene_163509)というベクターを有する選択されたrAAVを上の実施例に記載されている通りに調製した。
培地及び試薬:
NMDG-HEPES aCSF(単位はmM): 92 NMDG、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25グルコース、2チオウレア、5 Na-アスコルビン酸塩、3 Na-ピルビン酸塩、0.5 CaCl2・2H2O、及び10 MgSO4・7H2O。17mL+/-0.5mLの5M塩酸でpHを7.3～7.4に滴定する。
HEPES保持aCSF(単位はmM): 92 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25グルコース、2チオウレア、5 Na-アスコルビン酸塩、3 Na-ピルビン酸塩、2 CaCl2・2H2O、及び2 MgSO4・7H2O。10Nの濃NaOHでpHを7.3～7.4に滴定する。
記録用aCSF(単位はmM): 124 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、24 NaHCO3、12.5グルコース、5 HEPES、2 CaCl2・2H2O、及び2 MgSO4・7H2O。10Nの濃NaOHでpHを7.3～7.4に滴定する。
Na+スパイクイン溶液(2M): 580mgのNaClを5mLの新たに調製されたNMDG-HEPES aCSFに溶解させた。
組織包埋用の2％アガロース: 2gのアガロースタイプ1Bを100mLの1×PBSに溶解させ、沸騰直前まで電子レンジで加熱し、旋回させて、混合した。混合液を滅菌した10cmペトリ皿に注ぎ、固化させておいた。アガロースプレートを、使用するまで、密封したプラスチックバッグに4℃で保存した。
注射用麻酔薬作業ストック溶液: 2.5gの2,2,2-トリブロモエタノールを5mLの2-メチル-2-ブタノールと混合した。次に、この混合物を200mLのPBS、pH 7.0～7.3に徐々に溶解させ、使用前に0.22μmのフィルターで濾過し、遮光して4℃で保存した。
スライシングステーション:
250mLのビーカーに、200mLのNMDG-HEPES aCSFを満たし、一定のカルボゲン化(培地中に浸漬させたガス拡散石を介して適用される)を伴って、氷上で＞10分間予冷した。最初の脳スライス回収チャンバーに、150mLのNMDG-HEPES aCSFを満たし(一定のカルボゲン化を維持する)、このチャンバーを32～34℃に維持された加熱水浴に入れた。Edwards及びKonnerthの文献(1992) Methods Enzymol. 207:208-22の設計に因んだスライスチャンバーを使用した。網を液面下約1cmに沈めた。リザーバに、450mLのHEPES aCSFを満たし、使用するまで、一定のカルボゲン化の下、室温まで温めた。
溶融アガロースを組織包埋用に調製した。50mL円錐バイアルの開口端を用いて、予め準備されたディッシュから2％アガロースのブロックを切り出した。アガロースがちょうど溶けるまで、円錐バイアルを電子レンジで加熱した。溶融アガロースを1.5mLチューブに注いだ。42℃に設定されたサーモミキサーを激しく振盪させながら用いて、アガロースを溶融状態に保った。
経心腔的灌流:
マウスを麻酔薬作業ストック溶液(250mg/kg:体重10g当たり0.2mLの1.25％麻酔薬作業ストック溶液)の腹腔内注射により深麻酔する。2～3分後、麻酔の十分な深化を足趾ピンチ反射試験により確認した。
30mLシリンジに、予冷した(2～4℃) 250mLビーカーからの25mLのカルボゲン化NMDG-HEPES aCSFを充填した。25 5/8ゲージの針を取り付けた。30mLシリンジの針を左心室に挿入し、右心房を細いハサミで切って、血液が心臓から出るようにした。シリンジのプランジャーを一定の圧力を用いて押し下げ、冷やしたNMDG-HEPES aCSFを～10mL/分の割合で動物に灌流した。
脳の解剖及びスライシング:
動物の頭部を切断した。次に、メスを用いて、頭部の皮膚を切開し、頭蓋冠を露出させた。細いスーパーカット鋏を用いて、頭蓋冠上の皮膚を切り離し、頭蓋骨の尾側/腹側基部の両側で横方向に小さな切り込みを入れた。頭蓋骨の尾側/背側から吻側方向に背側正中線を上って移動して、さらに浅い切り込みを入れた。最後に、嗅球の位置で正中線に垂直に「T字」の切り込みを入れた。
先端の丸い鉗子を用いて、頭蓋骨を吻側-内側面から把持し、尾側-外側方向に向かってめくった。この工程を両側で繰り返して、頭蓋冠の背側半分を割って取り除き、脳を露出させた。無傷の脳をすくい取り、予冷したNMDG-HEPES aCSFのビーカーに入れ、約1分間冷却させておいた。
大きなヘラを用いて、脳をビーカーから引き上げ、濾紙で覆ったペトリ皿の上に乗せた。脳をトリミングし、好ましいスライス角度及び対象となる所望の脳領域に合わせてブロック化した。
脳ブロックを接着糊を用いて標本ホルダーに固定した。次に、標本ホルダーの内側を引き込み、脳ブロックを完全に内側に引いた。脳ブロックがアガロースに完全に覆われるまで、溶融アガロースをホルダーに直接注いだ。アガロースが固化するまで、予冷した付属の冷却ブロックを標本ホルダーの周囲に～10秒間固定した。
標本ホルダーをスライサー機のレセプタクルに挿入し、適切なアライメントを確認した。リザーバに、残りの予冷した酸素添加NMDG-HEPES aCSFを満たし、スライスの期間中、バブルストーンを内部に入れて、十分な酸素供給を確保した。
マイクロメータを調整して、包埋された脳標本をスライスした。スライサーを前進速度及び発振周波数について実験的に調整し、目的の領域を完全に薄片にするまで、組織を300μm刻みでスライスした。
NMDG保護回復手順の最適化:
スライスを、切り取ったプラスチック製パスツールピペットを用いて収集し、150mLのNMDG-HEPES aCSFを満たした予熱した(34℃)初期回収チャンバーに移した。全てのスライスを次々に移し、全てのスライスが回収チャンバーに移動したらすぐに、タイマーをスタートさせた。
次に、段階的なNa+スパイクイン手順を、指示された量のNa+スパイクイン溶液を指示された時間に初期回収チャンバーのバブラーチムニーに直接添加することにより行った。
スライスをHEPES aCSF長期保持チャンバーに移し、その後、室温に維持した。実験を開始する前に、スライスをHEPES保持チャンバーでさらに1時間回復させておいた。脳スライスにおけるYFP発現の可視化は、YFPタンパク質の落射蛍光顕微鏡観察及び/又はIHC検出によって行った。
AAV陽性対照及び陰性対照と比較したときの、落射蛍光顕微鏡観察及び/又はIHC検出のいずれかによる陽性のYFP発現神経細胞は、選択された新規rAAVウイルス粒子が脳組織で神経細胞指向性を有することを示す。
表10に示されているのは、少なくとも2連及び/又は3連で実行された指定されたAAVカプシドタンパク質(例えば、AAV_ID)を含む表示されたrAAVビリアル粒子についての各々のrAAVの形質導入プロファイルである。rAAVウイルス粒子の発現をAAV-9.PHPebに対して正規化し、その場合、AAV-9.PHPebを試験された所与のエクスビボモデル脳組織スライス(例えば、マウス、NHP、ヒト)に対して100％に設定した。空白のセルは、まだ試験されていない。
表10:平均正規化rAAV脳発現
表10で観察される発現は、AAVウイルス指向性(すなわち、脳における組織/臓器感染性)の代用である。エクスビボ脳スライスアッセイにおいて約30％～約50％又はそれよりも高い平均正規化発現を有するrAAVが特に興味深い。或いは、エクスビボ脳スライスアッセイにおいて約50％以上の平均正規化発現を有するrAAVが特に興味深い。
(6.5.10 実施例9:新規AAV VP1カプシドタンパク質の可変領域の決定)
新規AAV VP1カプシドタンパク質配列の関連する可変領域、VR1～VRIX、GBS、及びGHループを決定する。
新規AAV VP1カプシドタンパク質配列の関連する可変領域、VR1～VRIX、GBS、及びGHループを決定する。
簡潔に説明すると、本開示の新規AAVカプシドタンパク質のVP1アミノ酸配列を様々な参照AAV血清型(例えば、表4を参照)とともに用いて、本明細書に提供される配列アラインメントソフトウェアを用いて、多重配列アラインメントを行う。
下の表8は、国際出願WO 2018/022608号で公開されている、先に記載されたAAVカプシド可変領域の例を提供している。表に示された番号は、そのVP1アミノ酸配列にまたがる表示されたAAVカプシド配列の各々の可変領域(「VR」)、GBS、及びGHループ領域を表すアミノ酸残基を指す。
VR、GBS、及びGHループ領域のアミノ酸記載位置に関して、それらの領域のN-末端及び/又はC-末端の位置は、本明細書(特に、表8)に明示的に記載されているそれらの領域のアミノ酸位置から最大1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、又は5アミノ酸だけ異なる可能性があることに留意されたい。
表8:関連するAAVカプシド可変領域
(6.5.11 実施例10:耳における新規rAAVウイルス粒子指向性のインビボ評価)
新規rAAVウイルス粒子を耳に送達し、発現させることができるかどうかを決定するために、試験を行った。
新規rAAVウイルス粒子を耳に送達し、発現させることができるかどうかを決定するために、試験を行った。
ウイルスベクター産生:新規カプシド及びeGFP導入遺伝子を含むrAAVを本明細書に記載されている通りに産生した。ウイルスアリコートを-80℃で保存し、インビボ注射に使用する直前に解凍した。
マウス:野生型C57BL/6J(Jackson Laboratories)マウスをこの試験に使用した。P1～P2齢のマウスを、承認されたプロトコルに従って、ウイルスベクターのインビボ送達に使用した。
インビボのウイルス内耳注射:
簡潔に説明すると、P1～2マウスを氷水への3分間の曝露による低体温法で麻酔した。手術中(10～15分)、マウスを氷パッドの上に保持した。実体顕微鏡(Stemi 2000, Zeiss, Oberkochen, Germany)を可視化に用いて、小さな耳介後部切開を行い、蝸牛胞と卵形嚢周囲の三半規管とを露出させた。側頭骨を穿刺した後、ガラス製マイクロピペットを穿刺部に挿入し、手動で1～1.2uL(1～2×1014gc/mL)のAAVを一定の速度で注入した。処置後、マウスを完全に回復するまで37℃の加温パッド上に置き、標準的な術後ケアを適用した。動物処置は全て、動物飼育使用委員会の承認を得たものであり、実験動物の飼育及び使用に関するNIH指針(NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals)に準拠している。
P10マウスの安楽死は、CO2吸入により行った。側頭骨を摘出し、円窓、卵円窓、及び蝸牛孔に穿刺し、4％パラホルムアルデヒド中、室温で1時間固定した。その後、組織を120mM EDTA中で16～24時間脱灰した。蝸牛を、先端部、中間部、及び基底部に切り分けた。コルチ器官を単離し、側壁、螺旋板縁、及び蓋膜の除去により、ホールマウント処理に備えた。
組織処理及び画像解析:
組織を0.25％Triton（商標）X-100中で1時間透過処理し、2.5％正常ロバ血清中で1時間ブロッキングし、ウサギ抗ミオシン7a(有毛細胞マーカー)一次抗体(1:500 Proteus Biosciences, Ramona, CA, USA #25-6790)で4Cで一晩染色した。PBSで洗浄した後、試料を蛍光コンジュゲートロバ抗ウサギ二次抗体(1:400 Alexa Fluor 647: Thermo Fisher #A31573)及び蛍光コンジュゲートファロイジン(1:400 Alexa Fluor Plus 405: Thermo Fisher #A30104)とともに3～4時間インキュベートした。その後、組織をVectashield封入剤(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)を用いて、ガラスカバースリップ上に固定した。共焦点イメージングは、LSM 800(Carl Zeiss)顕微鏡を用いて実施した。最大強度投影画像は、ImageJで作成した。
耳のeGFP陽性細胞を手動で評価し、次のように強度でスコア化した:「-」は無発現、「*」は低発現、「**」は中発現、「***」は高発現、及び/又は「****」は極めて高発現を意味する。未注射の対照試料を用いて、自家蛍光を除外した。結果を下の表11に示す。
表11:耳におけるeGFP陽性細胞の強度
表11で観察された強度は、AAVウイルス指向性(すなわち、耳における組織/臓器感染性)の代用である。この結果は、BCD_0202が耳における高い感染性/指向性を有することを示している。
本明細書に記載される実施態様は、単に例示的であることが意図されており、当業者は、特定の化合物、材料、及び手順の多数の等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを用いて確認することができるであろう。そのような等価物は全て、本開示の範囲内にあると考えられる。本開示の全範囲は、添付の特許請求の範囲を参照することにより、より良く理解される。
(6.6 配列)
表9: AAVカプシド配列－分岐6及び分岐7のAAVカプシド配列
(7.実施態様)
1.(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバー。
2.(a)前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するか、(b)前記VP2アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するか、又は(c)前記VP3アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有する、実施態様1のAAVクレードメンバー。
3.前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有する、実施態様1のAAVクレードメンバー。
4.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列が可変領域配列を含み、ここで、該可変領域配列が配列番号6～78及び193のうちの少なくとも1つの可変領域から選択される、実施態様1、2、又は3のAAVクレードメンバー。
5.前記VP1アミノ酸配列がGBS領域配列を含み、ここで、該GBS領域配列が配列番号6～78及び193:のうちの少なくとも1つのGBS領域配列から選択される、実施態様1～4のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
6.前記VP1アミノ酸配列がGHループ配列を含み、ここで、該GHループ配列が配列番号6～78及び193:のうちの少なくとも1つのGHループから選択される、実施態様1～5のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
7.前記VP2アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列である、実施態様1～6のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
8.前記VP3アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列である、実施態様1～6のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
9.前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列である、実施態様1～6のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
10.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列が表2に掲載されているアミノ酸修飾のうちの1つ又は複数を含む、実施態様1～8のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
11.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列のアミノ酸修飾のうちの1つ又は複数が表2に掲載されているものに限定される、実施態様10のAAVクレードメンバー。
12. AAVクレードの代表的VP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するVP1アミノ酸配列:を含み、ここで、該代表的配列が、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14:のいずれか1つから選択される、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバー。
13.前記VP1アミノ酸配列が、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14:のいずれか1つに対して少なくとも95％の同一性を有する、実施態様12のAAVクレードメンバー。
14.前記VP1アミノ酸配列が、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14:のいずれか1つに対して少なくとも98％の同一性を有する、実施態様12のAAVクレードメンバー。
15.前記VP1アミノ酸配列が、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14:のいずれか1つに対して少なくともの99％同一性を有する、実施態様12のAAVクレードメンバー。
16.前記VP1アミノ酸配列が表2に掲載されているアミノ酸修飾のうちの1つ又は複数を含む、実施態様12～15のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
17.前記VP1アミノ酸配列修飾が表2に掲載されているものに限定される、実施態様16のAAVクレードメンバー。
18.可変領域アミノ酸配列を有するVP1アミノ酸配列:を含み、ここで、該可変領域アミノ酸配列が配列番号6～78及び193:のいずれか1つにおける可変領域アミノ酸配列に対する実質的な配列類似性又は同一性を有する、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバー。
19.前記可変領域アミノ酸配列が、VRI～VRIXのいずれか1つ、GBS領域、もしくはGHループ、又はこれらの組合せから選択される、実施態様18のAAVクレードメンバー。
20.前記VRI～VRIXの配列のいずれか1つが配列番号6～78及び193のいずれか1つのVRI～VRIXのいずれか1つに対して少なくとも90％の配列類似性又は同一性を有する、実施態様19のAAVクレードメンバー。
21.前記GBS領域配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのGBS領域に対して少なくとも90％の配列類似性又は同一性を有する、実施態様19のAAVクレードメンバー。
22.前記GHループ配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのGHループに対して少なくとも90％の配列類似性又は同一性を有する、実施態様19のAAVクレードメンバー。
23.近隣結合法によって決定したとき、第二のVP1アミノ酸配列と系統発生的に関連している第一のVP1アミノ酸配列:を含み、ここで、該第一のVP1アミノ酸配列が、該第二のVP1アミノ酸配列に対して、表3に提供されるような遺伝的距離を有する、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバー。
24.前記遺伝的距離が、表3に提供されるような同じAAVクレード内の平均遺伝的距離である、実施態様23のAAVクレードメンバー。
25.前記遺伝的距離が、表3に提供されるような、同じクレード内の約最小遺伝的距離から同じクレード内の約最大遺伝的距離までの範囲である、実施態様23のAAVクレードメンバー。
26.前記第二のVP1アミノ酸配列が配列番号1～96及び193:のいずれか1つのVP1アミノ酸配列を含む、実施態様23～25のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
27.近隣結合法によって決定したとき、第二のVP1アミノ酸配列と系統発生的に関連している第一のVP1アミノ酸配列:を含み、ここで、該第一のVP1アミノ酸配列が、該第二のVP1アミノ酸配列に対して、表3に提供されるような遺伝的距離を有する、アデノ随伴ウイルス(AAV)分岐のメンバー。
28.前記遺伝的距離が、表3に提供されるような、同じ分岐内の平均遺伝的距離である、実施態様27のAAV分岐メンバー。
29.前記遺伝的距離が、表3に提供されるような、同じ分岐内の約最小遺伝的距離から同じ分岐内の約最大遺伝的距離の範囲である、実施態様27のAAV分岐メンバー。
30.前記第二のVP1アミノ酸配列が配列番号1～96及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列を含む、実施態様27のAAV分岐メンバー。
31.インビトロアッセイによって決定されるAAV液性免疫を回避する能力をさらに含む、前述の実施態様のいずれかのAAVクレード又はAAV分岐メンバー。
32.前記インビトロアッセイがパーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、かつ該％形質導入が、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である、実施態様31のAAVクレード又はAAV分岐メンバー。
33.前記インビトロアッセイが中和抗体(Nab)力価を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NAb力価が、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している、実施態様31のAAVクレード又はAAV分岐メンバー。
34.前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NC50が、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している、実施態様31のAAVクレード又はAAV分岐メンバー。
35.(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質。
36.(a)前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するか、(b)前記VP2アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するか、又は(c)前記VP3アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有する、実施態様35のAAVカプシドタンパク質。
37.(a)前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するか、(b)前記VP2アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するか、又は(c)前記VP3アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有する、実施態様35のAAVカプシドタンパク質。
38.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列が、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列である、実施態様35のAAVカプシドタンパク質。
39.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列が可変領域アミノ酸配列を含み、かつ該可変領域アミノ酸配列が配列番号6～78及び193:のいずれか1つのVRI～VRIXである、実施態様35～38のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
40.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列がGBS領域アミノ酸配列を含み、かつ該GBS領域アミノ酸配列が配列番号6～78及び193:のいずれか1つのGBS領域である、実施態様35～39のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
41.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列がGHループアミノ酸配列を含み、かつ該GHループアミノ酸配列が配列番号6～78及び193:のいずれか1つから選択されるGHループである、実施態様35～40のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
42.インビトロアッセイによって決定されるAAV液性免疫を回避する能力をさらに含む、実施態様35～41のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
43.前記インビトロアッセイがパーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、かつ該％形質導入が所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である、実施態様35～42のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
44.前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NAb力価が、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している、実施態様35～42のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
45.前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NC50が、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している、実施態様35～42のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
46.(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列;並びに(b)宿主細胞における前記カプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列:を含むベクター。
47.前記VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3に対して少なくとも95％の同一性を有する、実施態様46のベクター。
48.前記VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3に対して少なくとも98％の同一性を有する、実施態様46のベクター。
49.(a)実施態様1～26又は31～34のいずれか1つのAAVクレードメンバーのVP1アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び(b)宿主細胞における前記カプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列:を含む、ベクター。
50.(a)実施態様27～34のいずれか1つのAAV分岐メンバーのVP1アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び(b)宿主細胞における前記カプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列:を含む、ベクター。
51.前記ベクターが宿主細胞における前記カプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子をさらに含む、実施態様46～50のいずれか1つのベクター。
52.実施態様35～45のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、インビトロ宿主細胞。
53.(a)カプシド(ここで、該カプシドは、実施態様1～26又は31～34のいずれか1つのAAVクレードメンバーのVP1アミノ酸配列を含む);及び(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノム:を含む、新規組換えAAVウイルス粒子。
54.(a)カプシド(ここで、該カプシドは、実施態様27～34のいずれか1つのAAV分岐メンバーのVP1アミノ酸配列を含む);及び(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノム:を含む、新規組換えAAVウイルス粒子。
55.(a)実施態様35～45のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質;及び(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノム:を含む、新規組換えAAVウイルス粒子。
56.前記rAAVベクターゲノムがAAV逆向き末端反復又はその断片を含む、実施態様53～55のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
57.前記AAV逆向き末端反復が表4から選択される5'AAV逆向き末端反復である、実施態様56の新規組換えAAVウイルス粒子。
58.前記AAV逆向き末端反復が表4から選択される3'AAV逆向き末端反復である、実施態様56の新規組換えAAVウイルス粒子。
59.前記rAAVベクターゲノムが5'AAV逆向き末端反復及び3'AAV逆向き末端反復を含む、実施態様53～55のいずれか1つの組換えAAVウイルス粒子。
60.前記5'AAV逆向き末端反復及び3'AAV逆向き末端反復が表4から選択される、実施態様59の組換えAAVウイルス粒子。
61.前記生体分子が、治療的タンパク質、酵素、ペプチド、RNA、CRISPR遺伝子編集系の構成要素、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)、AON媒介性エキソンスキッピング、ポイゾンエキソン、又はドミナントネガティブ突然変異体タンパク質から選択される、実施態様53～60のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
62.前記治療的タンパク質が、対象の筋肉、心臓、脳、血漿、腎臓、肝臓、又は癌細胞のうちの1つ又は複数で内在性に発現される、実施態様61の新規組換えAAVウイルス粒子。
63.治療的タンパク質が内在性に発現されたタンパク質の機能的バージョンである、実施態様62の新規組換えAAVウイルス粒子。
64.前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、筋肉細胞に対する増強された指向性を有する、実施態様53～63のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
65.前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、心臓細胞に対する増強された指向性を有する、実施態様53～63のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
66.前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、脳細胞に対する増強された指向性を有する、実施態様53～63のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
67.前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、形質細胞に対する増強された指向性を有する、実施態様53～63のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
68.前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、腎臓細胞に対する増強された指向性を有する、実施態様53～63のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
69.前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、肝臓細胞に対する増強された指向性を有する、実施態様53～63のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
70.前記新規組換えAAVウイルス粒子が、該新規rAAVが増強された指向性を有する細胞以外の対象の細胞を標的から外す、実施態様53～69のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
71.前記標的から外される細胞が筋肉細胞、心臓細胞、脳細胞、形質細胞、腎臓細胞、又は肝臓細胞のうちの1つ又は複数から選択される、実施態様70の新規組換えAAVウイルス粒子。
72.前記組換えAAVウイルス粒子がインビトロアッセイによって決定されるAAV液性免疫を回避する能力を有する、実施態様53～71のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
73.前記インビトロアッセイがパーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、かつ該％形質導入が、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である、実施態様72の新規組換えAAVウイルス粒子。
74.前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NAb力価が、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している、実施態様72の新規組換えAAVウイルス粒子。
75.前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NC50が、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している、実施態様72の新規組換えAAVウイルス粒子。
76.実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子:を含む、インビトロ細胞又は組織。
77.実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子:を含む、エクスビボ細胞又は組織。
78.(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1カプシドタンパク質を含む配列;又は(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1タンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列:を含むAAV VP1カプシドタンパク質をコードする組換え核酸分子:を含み、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。
79.(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP2カプシドタンパク質を含む配列;又は(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP2タンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列:を含むAAV VP2カプシドタンパク質をコードする組換え核酸分子:を含み、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。
80.(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP3カプシドタンパク質を含む配列;又は(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP3タンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列:を含むAAV VP3カプシドタンパク質をコードする組換え核酸分子:を含み、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。
81.配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質中で様々に変化するアミノ酸残基が表2から選択される、実施態様78～80のいずれか1つの培養宿主細胞。
82.(a)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長AAV VP1カプシドタンパク質のヌクレオチド;又は(b)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長VP1カプシドタンパク質のヌクレオチドに対して少なくとも95％同一のヌクレオチド配列:を含む組換え核酸分子を含有し、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。
83.(a)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長AAV VP2カプシドタンパク質のヌクレオチド;又は(b)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長VP2カプシドタンパク質のヌクレオチドに対して少なくとも95％同一のヌクレオチド配列:を含む組換え核酸分子を含有し、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。
84.(a)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長AAV VP3カプシドタンパク質のヌクレオチド;又は(b)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長VP3カプシドタンパク質のヌクレオチドに対して少なくとも95％同一のヌクレオチド配列:を含む組換え核酸分子を含有し、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。
85.配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列中で様々に変化するヌクレオチドが、表2の様々に変化するアミノ酸残基をコードするヌクレオチドから選択される、実施態様78～81のいずれか1つの培養宿主細胞。
86.(a)実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子;及び(b)生理学的に許容し得る担体:を含む、組成物。
87.生体分子をインビトロの細胞に送達する方法であって、該細胞を実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子で形質導入すること:を含む、前記方法。
88.生体分子をエクスビボの細胞に送達する方法であって、該細胞を実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子で形質導入すること:を含む、前記方法。
89.生体分子を対象の細胞に送達する方法であって、実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子を該対象の細胞に投与すること:を含む、前記方法。
90.前記細胞が、筋肉細胞、心臓細胞、脳細胞、形質細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、又は癌細胞のうちの1つ又は複数である、実施態様87～89のいずれか1つの方法。
91.疾患又は障害を治療する方法であって、実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子を対象に投与すること:を含む、前記方法。
92.前記対象がヒトである、実施態様89又は91の方法。
93.新規組換えAAVウイルス粒子を産生する方法であって、該新規rAAVウイルス粒子を生成させるための1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムを含む宿主細胞を培養すること:を含み、ここで、該1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムが実施態様35～45のいずれか1つのカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、前記方法。
94.新規組換えAAVウイルス粒子を産生する方法であって、該新規rAAVウイルス粒子を生成させるための1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムを含む宿主細胞を培養すること:を含み、ここで、該1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムが実施態様1～26又は31～34のいずれか1つのAAVクレードメンバーのVP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、前記方法。
95.新規rAAVウイルス粒子を産生する方法であって、該新規rAAVウイルス粒子を生成させるための1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムを含む宿主細胞を培養すること:を含み、ここで、該1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムが実施態様27～34のいずれか1つのAAV分岐メンバーのVP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、前記方法。
96.前記カプシドタンパク質又はVP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列が宿主細胞における該ヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結されている、実施態様93～95のいずれか1つの方法。
97.前記1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムがrAAVウイルス粒子を生成させるために前記宿主細胞によって使用されるヌクレオチド配列をさらに含み、かつ該ヌクレオチド配列が宿主細胞における該ヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結されている、実施態様93～96のいずれか1つの方法。
98.前記培養する工程の前に、前記宿主細胞が前記1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムでトランスフェクトされる、実施態様93～97のいずれか1つの方法。
99.前記新規rAAVウイルス粒子が前記宿主細胞から単離される、実施態様93～98のいずれか1つの方法。
表9: AAVカプシド配列－分岐6及び分岐7のAAVカプシド配列
1.(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバー。
2.(a)前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するか、(b)前記VP2アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するか、又は(c)前記VP3アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有する、実施態様1のAAVクレードメンバー。
3.前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有する、実施態様1のAAVクレードメンバー。
4.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列が可変領域配列を含み、ここで、該可変領域配列が配列番号6～78及び193のうちの少なくとも1つの可変領域から選択される、実施態様1、2、又は3のAAVクレードメンバー。
5.前記VP1アミノ酸配列がGBS領域配列を含み、ここで、該GBS領域配列が配列番号6～78及び193:のうちの少なくとも1つのGBS領域配列から選択される、実施態様1～4のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
6.前記VP1アミノ酸配列がGHループ配列を含み、ここで、該GHループ配列が配列番号6～78及び193:のうちの少なくとも1つのGHループから選択される、実施態様1～5のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
7.前記VP2アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列である、実施態様1～6のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
8.前記VP3アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列である、実施態様1～6のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
9.前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列である、実施態様1～6のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
10.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列が表2に掲載されているアミノ酸修飾のうちの1つ又は複数を含む、実施態様1～8のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
11.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列のアミノ酸修飾のうちの1つ又は複数が表2に掲載されているものに限定される、実施態様10のAAVクレードメンバー。
12. AAVクレードの代表的VP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するVP1アミノ酸配列:を含み、ここで、該代表的配列が、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14:のいずれか1つから選択される、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバー。
13.前記VP1アミノ酸配列が、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14:のいずれか1つに対して少なくとも95％の同一性を有する、実施態様12のAAVクレードメンバー。
14.前記VP1アミノ酸配列が、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14:のいずれか1つに対して少なくとも98％の同一性を有する、実施態様12のAAVクレードメンバー。
15.前記VP1アミノ酸配列が、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14:のいずれか1つに対して少なくともの99％同一性を有する、実施態様12のAAVクレードメンバー。
16.前記VP1アミノ酸配列が表2に掲載されているアミノ酸修飾のうちの1つ又は複数を含む、実施態様12～15のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
17.前記VP1アミノ酸配列修飾が表2に掲載されているものに限定される、実施態様16のAAVクレードメンバー。
18.可変領域アミノ酸配列を有するVP1アミノ酸配列:を含み、ここで、該可変領域アミノ酸配列が配列番号6～78及び193:のいずれか1つにおける可変領域アミノ酸配列に対する実質的な配列類似性又は同一性を有する、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバー。
19.前記可変領域アミノ酸配列が、VRI～VRIXのいずれか1つ、GBS領域、もしくはGHループ、又はこれらの組合せから選択される、実施態様18のAAVクレードメンバー。
20.前記VRI～VRIXの配列のいずれか1つが配列番号6～78及び193のいずれか1つのVRI～VRIXのいずれか1つに対して少なくとも90％の配列類似性又は同一性を有する、実施態様19のAAVクレードメンバー。
21.前記GBS領域配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのGBS領域に対して少なくとも90％の配列類似性又は同一性を有する、実施態様19のAAVクレードメンバー。
22.前記GHループ配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのGHループに対して少なくとも90％の配列類似性又は同一性を有する、実施態様19のAAVクレードメンバー。
23.近隣結合法によって決定したとき、第二のVP1アミノ酸配列と系統発生的に関連している第一のVP1アミノ酸配列:を含み、ここで、該第一のVP1アミノ酸配列が、該第二のVP1アミノ酸配列に対して、表3に提供されるような遺伝的距離を有する、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバー。
24.前記遺伝的距離が、表3に提供されるような同じAAVクレード内の平均遺伝的距離である、実施態様23のAAVクレードメンバー。
25.前記遺伝的距離が、表3に提供されるような、同じクレード内の約最小遺伝的距離から同じクレード内の約最大遺伝的距離までの範囲である、実施態様23のAAVクレードメンバー。
26.前記第二のVP1アミノ酸配列が配列番号1～96及び193:のいずれか1つのVP1アミノ酸配列を含む、実施態様23～25のいずれか1つのAAVクレードメンバー。
27.近隣結合法によって決定したとき、第二のVP1アミノ酸配列と系統発生的に関連している第一のVP1アミノ酸配列:を含み、ここで、該第一のVP1アミノ酸配列が、該第二のVP1アミノ酸配列に対して、表3に提供されるような遺伝的距離を有する、アデノ随伴ウイルス(AAV)分岐のメンバー。
28.前記遺伝的距離が、表3に提供されるような、同じ分岐内の平均遺伝的距離である、実施態様27のAAV分岐メンバー。
29.前記遺伝的距離が、表3に提供されるような、同じ分岐内の約最小遺伝的距離から同じ分岐内の約最大遺伝的距離の範囲である、実施態様27のAAV分岐メンバー。
30.前記第二のVP1アミノ酸配列が配列番号1～96及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列を含む、実施態様27のAAV分岐メンバー。
31.インビトロアッセイによって決定されるAAV液性免疫を回避する能力をさらに含む、前述の実施態様のいずれかのAAVクレード又はAAV分岐メンバー。
32.前記インビトロアッセイがパーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、かつ該％形質導入が、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である、実施態様31のAAVクレード又はAAV分岐メンバー。
33.前記インビトロアッセイが中和抗体(Nab)力価を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NAb力価が、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している、実施態様31のAAVクレード又はAAV分岐メンバー。
34.前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NC50が、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している、実施態様31のAAVクレード又はAAV分岐メンバー。
35.(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP3アミノ酸配列:を含む、AAVカプシドタンパク質。
36.(a)前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するか、(b)前記VP2アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するか、又は(c)前記VP3アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有する、実施態様35のAAVカプシドタンパク質。
37.(a)前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するか、(b)前記VP2アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するか、又は(c)前記VP3アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有する、実施態様35のAAVカプシドタンパク質。
38.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列が、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列である、実施態様35のAAVカプシドタンパク質。
39.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列が可変領域アミノ酸配列を含み、かつ該可変領域アミノ酸配列が配列番号6～78及び193:のいずれか1つのVRI～VRIXである、実施態様35～38のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
40.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列がGBS領域アミノ酸配列を含み、かつ該GBS領域アミノ酸配列が配列番号6～78及び193:のいずれか1つのGBS領域である、実施態様35～39のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
41.前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列がGHループアミノ酸配列を含み、かつ該GHループアミノ酸配列が配列番号6～78及び193:のいずれか1つから選択されるGHループである、実施態様35～40のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
42.インビトロアッセイによって決定されるAAV液性免疫を回避する能力をさらに含む、実施態様35～41のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
43.前記インビトロアッセイがパーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、かつ該％形質導入が所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である、実施態様35～42のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
44.前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NAb力価が、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している、実施態様35～42のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
45.前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NC50が、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している、実施態様35～42のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質。
46.(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列;並びに(b)宿主細胞における前記カプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列:を含むベクター。
47.前記VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3に対して少なくとも95％の同一性を有する、実施態様46のベクター。
48.前記VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3に対して少なくとも98％の同一性を有する、実施態様46のベクター。
49.(a)実施態様1～26又は31～34のいずれか1つのAAVクレードメンバーのVP1アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び(b)宿主細胞における前記カプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列:を含む、ベクター。
50.(a)実施態様27～34のいずれか1つのAAV分岐メンバーのVP1アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び(b)宿主細胞における前記カプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列:を含む、ベクター。
51.前記ベクターが宿主細胞における前記カプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子をさらに含む、実施態様46～50のいずれか1つのベクター。
52.実施態様35～45のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、インビトロ宿主細胞。
53.(a)カプシド(ここで、該カプシドは、実施態様1～26又は31～34のいずれか1つのAAVクレードメンバーのVP1アミノ酸配列を含む);及び(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノム:を含む、新規組換えAAVウイルス粒子。
54.(a)カプシド(ここで、該カプシドは、実施態様27～34のいずれか1つのAAV分岐メンバーのVP1アミノ酸配列を含む);及び(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノム:を含む、新規組換えAAVウイルス粒子。
55.(a)実施態様35～45のいずれか1つのAAVカプシドタンパク質;及び(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノム:を含む、新規組換えAAVウイルス粒子。
56.前記rAAVベクターゲノムがAAV逆向き末端反復又はその断片を含む、実施態様53～55のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
57.前記AAV逆向き末端反復が表4から選択される5'AAV逆向き末端反復である、実施態様56の新規組換えAAVウイルス粒子。
58.前記AAV逆向き末端反復が表4から選択される3'AAV逆向き末端反復である、実施態様56の新規組換えAAVウイルス粒子。
59.前記rAAVベクターゲノムが5'AAV逆向き末端反復及び3'AAV逆向き末端反復を含む、実施態様53～55のいずれか1つの組換えAAVウイルス粒子。
60.前記5'AAV逆向き末端反復及び3'AAV逆向き末端反復が表4から選択される、実施態様59の組換えAAVウイルス粒子。
61.前記生体分子が、治療的タンパク質、酵素、ペプチド、RNA、CRISPR遺伝子編集系の構成要素、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)、AON媒介性エキソンスキッピング、ポイゾンエキソン、又はドミナントネガティブ突然変異体タンパク質から選択される、実施態様53～60のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
62.前記治療的タンパク質が、対象の筋肉、心臓、脳、血漿、腎臓、肝臓、又は癌細胞のうちの1つ又は複数で内在性に発現される、実施態様61の新規組換えAAVウイルス粒子。
63.治療的タンパク質が内在性に発現されたタンパク質の機能的バージョンである、実施態様62の新規組換えAAVウイルス粒子。
64.前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、筋肉細胞に対する増強された指向性を有する、実施態様53～63のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
65.前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、心臓細胞に対する増強された指向性を有する、実施態様53～63のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
66.前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、脳細胞に対する増強された指向性を有する、実施態様53～63のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
67.前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、形質細胞に対する増強された指向性を有する、実施態様53～63のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
68.前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、腎臓細胞に対する増強された指向性を有する、実施態様53～63のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
69.前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、肝臓細胞に対する増強された指向性を有する、実施態様53～63のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
70.前記新規組換えAAVウイルス粒子が、該新規rAAVが増強された指向性を有する細胞以外の対象の細胞を標的から外す、実施態様53～69のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
71.前記標的から外される細胞が筋肉細胞、心臓細胞、脳細胞、形質細胞、腎臓細胞、又は肝臓細胞のうちの1つ又は複数から選択される、実施態様70の新規組換えAAVウイルス粒子。
72.前記組換えAAVウイルス粒子がインビトロアッセイによって決定されるAAV液性免疫を回避する能力を有する、実施態様53～71のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子。
73.前記インビトロアッセイがパーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、かつ該％形質導入が、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である、実施態様72の新規組換えAAVウイルス粒子。
74.前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NAb力価が、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している、実施態様72の新規組換えAAVウイルス粒子。
75.前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NC50が、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している、実施態様72の新規組換えAAVウイルス粒子。
76.実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子:を含む、インビトロ細胞又は組織。
77.実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子:を含む、エクスビボ細胞又は組織。
78.(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1カプシドタンパク質を含む配列;又は(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1タンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列:を含むAAV VP1カプシドタンパク質をコードする組換え核酸分子:を含み、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。
79.(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP2カプシドタンパク質を含む配列;又は(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP2タンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列:を含むAAV VP2カプシドタンパク質をコードする組換え核酸分子:を含み、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。
80.(a)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP3カプシドタンパク質を含む配列;又は(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP3タンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列:を含むAAV VP3カプシドタンパク質をコードする組換え核酸分子:を含み、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。
81.配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質中で様々に変化するアミノ酸残基が表2から選択される、実施態様78～80のいずれか1つの培養宿主細胞。
82.(a)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長AAV VP1カプシドタンパク質のヌクレオチド;又は(b)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長VP1カプシドタンパク質のヌクレオチドに対して少なくとも95％同一のヌクレオチド配列:を含む組換え核酸分子を含有し、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。
83.(a)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長AAV VP2カプシドタンパク質のヌクレオチド;又は(b)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長VP2カプシドタンパク質のヌクレオチドに対して少なくとも95％同一のヌクレオチド配列:を含む組換え核酸分子を含有し、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。
84.(a)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長AAV VP3カプシドタンパク質のヌクレオチド;又は(b)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長VP3カプシドタンパク質のヌクレオチドに対して少なくとも95％同一のヌクレオチド配列:を含む組換え核酸分子を含有し、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。
85.配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列中で様々に変化するヌクレオチドが、表2の様々に変化するアミノ酸残基をコードするヌクレオチドから選択される、実施態様78～81のいずれか1つの培養宿主細胞。
86.(a)実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子;及び(b)生理学的に許容し得る担体:を含む、組成物。
87.生体分子をインビトロの細胞に送達する方法であって、該細胞を実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子で形質導入すること:を含む、前記方法。
88.生体分子をエクスビボの細胞に送達する方法であって、該細胞を実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子で形質導入すること:を含む、前記方法。
89.生体分子を対象の細胞に送達する方法であって、実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子を該対象の細胞に投与すること:を含む、前記方法。
90.前記細胞が、筋肉細胞、心臓細胞、脳細胞、形質細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、又は癌細胞のうちの1つ又は複数である、実施態様87～89のいずれか1つの方法。
91.疾患又は障害を治療する方法であって、実施態様53～75のいずれか1つの新規組換えAAVウイルス粒子を対象に投与すること:を含む、前記方法。
92.前記対象がヒトである、実施態様89又は91の方法。
93.新規組換えAAVウイルス粒子を産生する方法であって、該新規rAAVウイルス粒子を生成させるための1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムを含む宿主細胞を培養すること:を含み、ここで、該1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムが実施態様35～45のいずれか1つのカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、前記方法。
94.新規組換えAAVウイルス粒子を産生する方法であって、該新規rAAVウイルス粒子を生成させるための1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムを含む宿主細胞を培養すること:を含み、ここで、該1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムが実施態様1～26又は31～34のいずれか1つのAAVクレードメンバーのVP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、前記方法。
95.新規rAAVウイルス粒子を産生する方法であって、該新規rAAVウイルス粒子を生成させるための1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムを含む宿主細胞を培養すること:を含み、ここで、該1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムが実施態様27～34のいずれか1つのAAV分岐メンバーのVP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、前記方法。
96.前記カプシドタンパク質又はVP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列が宿主細胞における該ヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結されている、実施態様93～95のいずれか1つの方法。
97.前記1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムがrAAVウイルス粒子を生成させるために前記宿主細胞によって使用されるヌクレオチド配列をさらに含み、かつ該ヌクレオチド配列が宿主細胞における該ヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結されている、実施態様93～96のいずれか1つの方法。
98.前記培養する工程の前に、前記宿主細胞が前記1以上のベクター又はrAAVベクターゲノムでトランスフェクトされる、実施態様93～97のいずれか1つの方法。
99.前記新規rAAVウイルス粒子が前記宿主細胞から単離される、実施態様93～98のいずれか1つの方法。
Claims (99)
- (a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP3アミノ酸配列
を含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバー。 - (a)前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するか、(b)前記VP2アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するか、又は(c)前記VP3アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有する、請求項1記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有する、請求項1記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列が可変領域配列を含み、ここで、該可変領域配列が配列番号6～78及び193のうちの少なくとも1つの可変領域から選択される、請求項1、2、又は3記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VP1アミノ酸配列がGBS領域配列を含み、ここで、該GBS領域配列が配列番号6～78及び193のうちの少なくとも1つのGBS領域配列から選択される、請求項1～4のいずれか一項記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VP1アミノ酸配列がGHループ配列を含み、ここで、該GHループ配列が配列番号6～78及び193のうちの少なくとも1つのGHループから選択される、請求項1～5のいずれか一項記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VP2アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列である、請求項1～6のいずれか一項記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VP3アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列である、請求項1～6のいずれか一項記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列である、請求項1～6のいずれか一項記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列が表2に掲載されているアミノ酸修飾のうちの1つ又は複数を含む、請求項1～8のいずれか一項記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列のアミノ酸修飾のうちの1つ又は複数が表2に掲載されているものに限定される、請求項10記載のAAVクレードメンバー。
- AAVクレードの代表的VP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するVP1アミノ酸配列
を含み、ここで、該代表的配列が、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14のいずれか1つから選択される、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバー。 - 前記VP1アミノ酸配列が、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14のいずれか1つに対して少なくとも95％の同一性を有する、請求項12記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VP1アミノ酸配列が、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14のいずれか1つに対して少なくとも98％の同一性を有する、請求項12記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VP1アミノ酸配列が、配列番号27、1、7、3、32、18、24、38、14、6、78、10、及び14のいずれか1つに対して少なくとも99％の同一性を有する、請求項12記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VP1アミノ酸配列が表2に掲載されているアミノ酸修飾のうちの1つ又は複数を含む、請求項12～15のいずれか一項記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VP1アミノ酸配列修飾が表2に掲載されているものに限定される、請求項16記載のAAVクレードメンバー。
- 可変領域アミノ酸配列を有するVP1アミノ酸配列
を含み、ここで、該可変領域アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つにおける可変領域アミノ酸配列に対する実質的な配列類似性又は同一性を有する、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバー。 - 前記可変領域アミノ酸配列が、VRI～VRIXのいずれか1つ、GBS領域、もしくはGHループ、又はこれらの組合せから選択される、請求項18記載のAAVクレードメンバー。
- 前記VRI～VRIXの配列のいずれか1つが配列番号6～78及び193のいずれか1つのVRI～VRIXのいずれか1つに対して少なくとも90％の配列類似性又は同一性を有する、請求項19記載のAAVクレードメンバー。
- 前記GBS領域配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのGBS領域に対して少なくとも90％の配列類似性又は同一性を有する、請求項19記載のAAVクレードメンバー。
- 前記GHループ配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのGHループに対して少なくとも90％の配列類似性又は同一性を有する、請求項19記載のAAVクレードメンバー。
- 近隣結合法によって決定したとき、第二のVP1アミノ酸配列と系統発生的に関連している第一のVP1アミノ酸配列
を含み、ここで、該第一のVP1アミノ酸配列が、該第二のVP1アミノ酸配列に対して、表3に提供されるような遺伝的距離を有する、アデノ随伴ウイルス(AAV)クレードのメンバー。 - 前記遺伝的距離が、表3に提供されるような同じAAVクレード内の平均遺伝的距離である、請求項23記載のAAVクレードメンバー。
- 前記遺伝的距離が、表3に提供されるような、同じクレード内の約最小遺伝的距離から同じクレード内の約最大遺伝的距離までの範囲である、請求項23記載のAAVクレードメンバー。
- 前記第二のVP1アミノ酸配列が配列番号1～96及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列を含む、請求項23～25のいずれか一項記載のAAVクレードメンバー。
- 近隣結合法によって決定したとき、第二のVP1アミノ酸配列と系統発生的に関連している第一のVP1アミノ酸配列
を含み、ここで、該VP1アミノ酸配列が、該第二のVP1アミノ酸配列に対して、表3に提供されるような遺伝的距離を有する、アデノ随伴ウイルス(AAV)分岐のメンバー。 - 前記遺伝的距離が、表3に提供されるような、同じ分岐内の平均遺伝的距離である、請求項27記載のAAV分岐メンバー。
- 前記遺伝的距離が、表3に提供されるような、同じ分岐内の約最小遺伝的距離から同じ分岐内の約最大遺伝的距離までの範囲である、請求項27記載のAAV分岐メンバー。
- 前記第二のVP1アミノ酸配列が配列番号1～96及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列を含む、請求項27記載のAAV分岐メンバー。
- インビトロアッセイによって決定されるAAV液性免疫を回避する能力をさらに含む、請求項1～30のいずれか一項記載のAAVクレード又はAAV分岐メンバー。
- 前記インビトロアッセイがパーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、かつ該％形質導入が、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である、請求項31記載のAAVクレード又はAAV分岐メンバー。
- 前記インビトロアッセイが中和抗体(Nab)力価を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NAb力価が、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している、請求項31記載のAAVクレード又はAAV分岐メンバー。
- 前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NC50が、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している、請求項31記載のAAVクレード又はAAV分岐メンバー。
- (a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1アミノ酸配列、(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2配列のVP2アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP2アミノ酸配列、又は(c)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVP3アミノ酸配列
を含む、AAVカプシドタンパク質 - (a)前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するか、(b)前記VP2アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するか、又は(c)前記VP3アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有する、請求項35記載のAAVカプシドタンパク質。
- (a)前記VP1アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するか、(b)前記VP2アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP2アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有するか、又は(c)前記VP3アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP3アミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を有する、請求項35記載のAAVカプシドタンパク質。
- 前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列が、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列である、請求項35記載のAAVカプシドタンパク質。
- 前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列が可変領域アミノ酸配列を含み、かつ該可変領域アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのVRI～VRIXである、請求項35～38のいずれか一項記載のAAVカプシドタンパク質。
- 前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列がGBS領域アミノ酸配列を含み、かつ該GBS領域アミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つのGBS領域である、請求項35～39のいずれか一項記載のAAVカプシドタンパク質。
- 前記VP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列がGHループアミノ酸配列を含み、かつ該GHループアミノ酸配列が配列番号6～78及び193のいずれか1つから選択されるGHループである、請求項35～40のいずれか一項記載のAAVカプシドタンパク質。
- インビトロアッセイによって決定されるAAV液性免疫を回避する能力をさらに含む、請求項35～41のいずれか一項記載のAAVカプシドタンパク質。
- 前記インビトロアッセイがパーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、かつ該％形質導入が、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である、請求項35～42のいずれか一項記載のAAVカプシドタンパク質。
- 前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NAb力価が、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している、請求項35～42のいずれか一項記載のAAVカプシドタンパク質。
- 前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NC50が、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している、請求項35～42のいずれか一項記載のAAVカプシドタンパク質。
- (a)配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3に対して少なくとも90％の同一性を有するVP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列;並びに
(b)宿主細胞における該カプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列
を含む、ベクター。 - 前記VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3に対して少なくとも95％の同一性を有する、請求項46記載のベクター。
- 前記VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号6～78及び193のいずれか1つのVP1、VP2、又はVP3に対して少なくとも98％の同一性を有する、請求項46記載のベクター。
- (a)請求項1～26又は31～34のいずれか一項記載のAAVクレードメンバーのVP1アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び
(b)宿主細胞における前記カプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列
を含む、ベクター。 - (a)請求項27～34のいずれか一項記載のAAV分岐メンバーのVP1アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び(b)宿主細胞における前記カプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列を含む、ベクター。
- 前記ベクターが、宿主細胞における前記カプシドタンパク質の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子をさらに含む、請求項46～50のいずれか一項記載のベクター。
- 請求項35～45のいずれか一項記載のVP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、インビトロ宿主細胞。
- (a)カプシド(ここで、該カプシドは、請求項1～26又は31～34のいずれか一項記載のAAVクレードメンバーのVP1アミノ酸配列を含む);及び
(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノム
を含む、新規組換えAAVウイルス粒子。 - (a)カプシド(ここで、該カプシドは、請求項27～34のいずれか一項記載のAAV分岐メンバーのVP1アミノ酸配列を含む);及び
(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノム
を含む、新規組換えAAVウイルス粒子。 - (a)請求項35～45のいずれか一項記載のAAVカプシドタンパク質;及び
(b)宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結された生体分子をコードするヌクレオチド配列を含むrAAVベクターゲノム
を含む、新規組換えAAVウイルス粒子。 - 前記rAAVベクターゲノムがAAV逆向き末端反復又はその断片を含む、請求項53～55のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記AAV逆向き末端反復が表4から選択される5'AAV逆向き末端反復である、請求項56記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記AAV逆向き末端反復が表4から選択される3'AAV逆向き末端反復である、請求項56記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記rAAVベクターゲノムが、5'AAV逆向き末端反復及び3'AAV逆向き末端反復を含む、請求項53～55のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記5'AAV逆向き末端反復及び3'AAV逆向き末端反復が表4から選択される、請求項59記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記生体分子が、治療的タンパク質、酵素、ペプチド、RNA、CRISPR遺伝子編集系の構成要素、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)、AON媒介性エキソンスキッピング、ポイゾンエキソン、又はドミナントネガティブ突然変異体タンパク質から選択される、請求項53～60のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記治療的タンパク質が、対象の筋肉、心臓、脳、血漿、腎臓、肝臓、又は癌細胞のうちの1つ又は複数で内在性に発現される、請求項61記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 治療的タンパク質が内在性に発現されたタンパク質の機能的バージョンである、請求項62記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、筋肉細胞に対する増強された指向性を有する、請求項53～63のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、心臓細胞に対する増強された指向性を有する、請求項53～63のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、脳細胞に対する増強された指向性を有する、請求項53～63のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、形質細胞に対する増強された指向性を有する、請求項53～63のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、腎臓細胞に対する増強された指向性を有する、請求項53～63のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記組換えAAVウイルス粒子が、参照AAVと比較して、肝臓細胞に対する増強された指向性を有する、請求項53～63のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記新規組換えAAVウイルス粒子が該新規rAAVが増強された指向性を有する細胞以外の対象の細胞を標的から外す、請求項53～69のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記標的から外される細胞が、筋肉細胞、心臓細胞、脳細胞、形質細胞、腎臓細胞、又は肝臓細胞のうちの1つ又は複数から選択される、請求項70記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記組換えAAVウイルス粒子がインビトロアッセイによって決定されるAAV液性免疫を回避する能力を有する、請求項53～71のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記インビトロアッセイがパーセント(％)形質導入を決定するIVIgアッセイであり、かつ該％形質導入は、所与のIVIg濃度の参照AAVと比較して、約2％～約500％大きい形質導入である、請求項72記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NAb力価が、参照AAVと比較して、約1倍～約4,000倍低下している、請求項72記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 前記インビトロアッセイがNC50を決定するIVIgアッセイであり、かつ該NC50が、参照AAVと比較して、約1倍～約600倍増加している、請求項72記載の新規組換えAAVウイルス粒子。
- 請求項53～75のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子を含む、インビトロ細胞又は組織。
- 請求項53～75のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子を含む、エクスビボ細胞又は組織。
- (a)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1カプシドタンパク質を含む配列;又は(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1タンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列:を含むAAV VP1カプシドタンパク質をコードする組換え核酸分子
を含み、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。 - (a)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP2カプシドタンパク質を含む配列;又は(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP2タンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列:を含むAAV VP2カプシドタンパク質をコードする組換え核酸分子
を含み、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。 - (a)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP3カプシドタンパク質を含む配列;又は(b)配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP3タンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列:を含むAAV VP3カプシドタンパク質をコードする組換え核酸分子
を含み、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。 - 配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質中で様々に変化するアミノ酸残基が表2から選択される、請求項78～80のいずれか一項記載の培養宿主細胞。
- (a)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長AAV VP1カプシドタンパク質のヌクレオチド;又は(b)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長VP1カプシドタンパク質のヌクレオチド配列に対して少なくとも95％同一のヌクレオチド配列
を含む組換え核酸分子を含有し、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。 - (a)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長AAV VP2カプシドタンパク質のヌクレオチド;又は(b)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長VP2カプシドタンパク質のヌクレオチド配列に対して少なくとも95％同一のヌクレオチド配列
を含む組換え核酸分子を含有し、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。 - (a)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長AAV VP3カプシドタンパク質のヌクレオチド;又は(b)配列番号102～174及び194のいずれか1つの全長VP3カプシドタンパク質のヌクレオチド配列に対して少なくとも95％同一のヌクレオチド配列
を含む組換え核酸分子を含有し、ここで、該組換え核酸分子が異種配列をさらに含む、培養宿主細胞。 - 配列番号6～78及び193のいずれか1つの全長VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質に対して少なくとも95％の同一性を有するAAV VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列中で様々に変化するヌクレオチドが表2の様々に変化するアミノ酸残基をコードするヌクレオチドから選択される、請求項78～81のいずれか一項記載の培養宿主細胞。
- (a)請求項53～75のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子;及び
(b)生理学的に許容し得る担体
を含む組成物。 - 生体分子をインビトロの細胞に送達する方法であって、
該細胞を請求項53～75のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子で形質導入すること
を含む、前記方法。 - 生体分子をエクスビボの細胞に送達する方法であって、
該細胞を請求項53～75のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子で形質導入すること
を含む、前記方法。 - 生体分子を対象の細胞に送達する方法であって、
請求項53～75のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子を該対象の細胞に投与すること
を含む、前記方法。 - 前記細胞が、筋肉細胞、心臓細胞、脳細胞、形質細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、又は癌細胞のうちの1つ又は複数である、請求項87～89のいずれか一項記載の方法。
- 疾患又は障害を治療する方法であって、
請求項53～75のいずれか一項記載の新規組換えAAVウイルス粒子を対象に投与すること
を含む、前記方法。 - 前記対象がヒトである、請求項89又は91記載の方法。
- 新規組換えAAVウイルス粒子を産生する方法であって、
該新規rAAVウイルス粒子を生成させるための1以上のベクターを含む宿主細胞を培養すること
を含み、ここで、該1以上のベクターが請求項35～45のいずれか一項記載のカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、前記方法。 - 新規組換えAAVウイルス粒子を産生する方法であって、
該新規rAAVウイルス粒子を生成させるための1以上のベクターを含む宿主細胞を培養すること
を含み、ここで、該1以上のベクターが請求項1～26又は31～34のいずれか一項記載のAAVクレードメンバーのVP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、前記方法。 - 新規rAAVウイルス粒子を産生する方法であって、該新規rAAVウイルス粒子を生成させるための1以上のベクターを含む宿主細胞を培養すること:を含み、ここで、該1以上のベクターが請求項27～34のいずれか一項記載のAAV分岐メンバーのVP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、前記方法。
- 前記カプシドタンパク質又はVP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列が宿主細胞における該ヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結されている、請求項93～95のいずれか一項記載の方法。
- 前記1以上のベクターがrAAVウイルス粒子を生成させるために前記宿主細胞によって使用されるヌクレオチド配列をさらに含み、かつ該ヌクレオチド配列が宿主細胞における該ヌクレオチド配列の発現を制御する異種調節配列に機能的に連結されている、請求項93～96のいずれか一項記載の方法。
- 前記培養する工程の前に、前記宿主細胞が前記1以上のベクターでトランスフェクトされる、請求項93～97のいずれか一項記載の方法。
- 前記新規rAAVウイルス粒子が前記宿主細胞から単離される、請求項93～98のいずれか一項記載の方法。
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