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DE69922934T2 - Zusammensetzungen und Verfahren zur helfer-freien Herstellung von rekombinanten Adeno-assoziierten Viren - Google Patents

Zusammensetzungen und Verfahren zur helfer-freien Herstellung von rekombinanten Adeno-assoziierten Viren Download PDF

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DE69922934T2
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Bei dem Adeno-assoziierten Virus (AAV) handelt es sich um ein replikationsdefizientes Parvovirus, dessen Genom eine Länge von etwa 4,6 kb, einschließlich 145 Nukleotide langer invertierter terminaler Wiederholungen (inverted terminal repeats, ITRs) aufweist. Zwei offene Leseraster codieren eine Reihenfolge aus rep- und cap-Polypeptiden. Die rep-Polypeptide (rep78, rep68, rep62 und rep40) sind an der Replikation, Rettung und Integration des AAV-Genoms beteiligt. Die cap-Proteine (VP1, VP2 und VP3) bilden das Virioncapsid. Die offenen rep- und cap-Leseraster werden an den 5'- und 3'-Enden von 145 ßp langen invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs) flankiert, wobei deren erste 125 ßp in der Lage sind, Y- oder T-förmige Duplexstrukturen auszubilden. Für die Entwicklung von AAV-Vektoren ist bedeutsam, daß die gesamten rep- und cap-Domänen ausgeschnitten und durch ein therapeutisches oder Reporter-Transgen ersetzt werden können [B.J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses", Hrsg. P. Tijsser, CRC Press, S. 155-168 (1990)]. Es konnte gezeigt werden, daß die ITRs die zur Replikation, Rettung, Verpackung und Integration des AAV-Genoms benötigte Minimalsequenz darstellen.
  • Bei der Infektion einer menschlichen Zelle mit diesem nichtpathogenen menschlichen Virus integriert das virale Genom in das Chromosom 19, was zu einer latenten Infektion der Zelle führt. Eine Produktion von infektiösem Virus sowie die Replikation des Virus finden nicht statt, außer wenn die Zelle mit einem lytischen Helfervirus, wie z.B. Adenovirus (Ad) oder Herpesvirus, koinfiziert wird. Nach der Infektion mit einem Helfervirus wird das AAV-Provirus gerettet und amplifiziert, wobei sowohl das AAV als auch das Helfervirus produziert werden. Die infizierende Ausgangs-ssDNA wird in einer rep-abhängigen Art und Weise zu Duplex-DNAs der Replikationsform (RF) erweitert. Die geretteten AAV-Genome werden in vorgeformte Proteincapside (ikosahedrale Symmetrie mit einem Durchmesser von ungefähr 20 nm) verpackt und als infektiöse Virionen, in denen entweder +– oder -ssDNA-Genome verpackt sind, nach Zellyse freigesetzt.
  • AAV besitzt einzigartige Merkmale, die es als Vektor zur Zuführung von fremd-DNA (d.h. einem Transgen) an Zellen attraktiv machen, wobei die mögliche Verwendung des AAV bei der Behandlung von Krankheitszuständen von verschiedenen Gruppen untersucht wurde. Unter dem Begriff "Transgen", wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, versteht man die DNA, die einem Tier zugeführt werden soll, wobei es sich bei der DNA um nicht-AAV-DNA handelt. Aus verschiedenen Gründen gab es jedoch bislang nur langsame Fortschritte hinsichtlich einer Etablierung des AAV als Transduktionsvektor zur Zuführung von DNA in Form eines gewünschten Transgens.
  • Ein Hindernis bei der Verwendung des AAV zur Zuführung von DNA bestand im Fehlen hocheffizienter Schemata zur Verkapselung rekombinanter Genome und zur Produktion infektiöser Virionen. Siehe R. Kotin, Hum. Gene Ther., 5:793-801 (1994)]. Bei einem Verfahren, mit dem dieses Problem angegangen wird, wird ein rekombinantes AAV (rAAV) (das die zuzuführende DNA enthält, dem jedoch die rep- und cap-Gene fehlen) in Wirtszellen transfiziert, die anschließend mit Wildtyp (wt-)ARV (das die rep- und cap-Gene liefert) und Adenovirus (das zumindest die vier Adenovirusgene: E1, E2, E4 und VAI, deren Notwendigkeit für die rAAV-Produktion dargelegt worden ist, liefert) koinfiziert werden (siehe z.B. Carter, vorstehend zitiert]. Dieses Verfahren erfordert jedoch eine obligatorische Koinfektion und führt zu unannehmbar hohen wt-AAV-Niveaus, die von nichthomologer Rekombination sowie Verunreinigung des produzierten r-AAV mit wt-AAV herrühren. Die Verunreinigung mit anderen Viren oder Plasmiden erfordert eine Reinigung des rAAV. Eine Inkubation von Zellen mit rAAV bei Abwesenheit von verunreinigendem wt-AAV oder Helfer-Adenovirus ergibt nur eine geringe rekombinante Genexpression.
  • Bei einem allgemein anerkannten Mittel zur Herstellung transduzierender AAV-Virionen zur Gentherapie wird eine Kotransfektion mit zwei unterschiedlichen, komplementierenden Plasmiden durchgeführt. Eines dieser Plasmide enthält ein therapeutisches oder Reporter-Transgen, das von den zwei cis-wirkenden AAV-ITRs eingerahmt wird. Die zur Rettung und anschließenden Verpackung von rekombinantem Genom der Nachkommenschaft benötigten AAv-Komponenten werden in trans von einem zweiten Plasmid bereitgestellt, das die viralen offenen Leseraster für rep- und cap-Proteine codiert. In diesem System werden die Ad-Helferfunktionen von einem wt-Adenovirus oder einem replikationsdefekten Adenovirus bereitgestellt, wobei das fehlende E1-Gen von HEK-293-Zellen geliefert wird. Andere Varianten dieses Verfahrens sind beschrieben worden. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,658,785, das eine mit einem rAAV-Genom sowie mit AAV-rep- und cap-Genen stabil transfizierte Säugerwirtszelle sowie ein Verfahren zur Herstellung von rAAV mittels Infektion dieser Wirtszelle mit einem Helfervirus betrifft.
  • Das US-Patent Nr. 5,658,776 betrifft Verpackungssysteme sowie Verfahren zur Verpackung von AAV-Vektoren, bei denen der AAV-p5-Promotor durch einen heterologen Promotor ersetzt ist. Als Alternative betrifft das US-Patent Nr. 5,622,856 Konstrukte und Verfahren zur AAV-Vektorproduktion, wobei der homologe p5-Promotor auf eine 3' von den rep-Genen liegende Position verschoben wird, wobei die rep/cap-Gene und der repositionierte p5-Promotor gegebenenfalls mit FRT-Sequenzen flankiert werden.
  • Es besteht weiterhin im Fachgebiet ein Bedarf an zusätzlichen Zusammensetzungen und Verfahren, die die effiziente Produktion von AAV und rekombinanten AAV-Viren zur Verwendung als Vektoren für die somatische Gentherapie ohne die in den zuvor beschriebenen Verfahren vorliegenden Probleme der Ineffizienz, Verunreinigung und Reinigung gestatten.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung gestattet die effiziente Produktion von eine gewünschte Transgen-DNA enthaltendem rAAV. Sobald das rAAV selbst konstruiert ist, wird das rAAV durch diese Erfindung in wirksamer Weise unter Erhalt größerer Anzahlen amplifiziert. Insbesondere werden durch die vorliegende Erfindung sowohl Zusammensetzungen als auch Verfahren bereitgestellt, die die Produktion eines rAAV ermöglichen, ohne daß ein Helfer-Adenovirus benötigt wird, und ohne das Problem einer homologen Rekombination, durch die während der rAAV-Produktion verunreinigendes rekonstruiertes wt-AAV produziert wird.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß im Gegensatz zum angegebenen Stand der Technik die rAAV-Produktion das Vorhandensein von lediglich zwei Adenovirusgenen, E1 (d.h. E1a und E1b) und E2a, benötigt. Der Begriff "E1", wie er in der gesamten Beschreibung verwendet wird, bezieht sich sowohl auf E1a als auch E1b. Somit bezieht sich "E1-Genprodukt" sowohl auf das E1a- als auch auf das E1b-Genprodukt, und "E1-Gen" bzw. "E1-Gensequenz" bezieht sich sowohl auf das E1a- als auch auf das E1b-Gen bzw. die entsprechenden Gensequenzen. Der Begriff "E1a" bezieht sich spezifisch auf das E1a-Gen, die E1a-Gensequenzen oder das E1a-Genprodukt, und der Begriff "E1b" bezieht sich spezifisch auf das E1b-Gen, die E1b-Gensequenzen oder das E1b-Genprodukt. Indem für die Wirtszelle lediglich diejenigen Adenovirusgene, die zur Produktion des rAAV essentiell sind, bereitgestellt werden, wird das Problem des Standes der Technik der homologen Rekombination zwischen dem cis-Plasmid und dem Helfervirus, die zur Rückbildung des wt-Helfervirus führt, vollständig vermieden, und zwar aufgrund des Fehlens anderer Ad-Gene, die zum Stattfinden einer solchen Rekombination notwendig wären. Somit handelt es sich bei rAAV um das einzige von dem Verfahren der vorliegenden Erfindung produzierte Virus. Erfindungsgemäß wurde damit ein neues Verfahren und eine neue Wirtszelle zur Herstellung von rAAV bereitgestellt, ohne daß dabei irgendein zusätzliches Virus, d.h. Wildtyp oder replikationsdefizienter Adenovirus-Helfer, verwendet werden muß. Dieses Verfahren vereinfacht das Herstellungsverfahren für rAAV, indem die Notwendigkeit eines Reinigungsschritts beseitigt wird. Ein solcher Reinigungsschritt wird zur Zeit bei den rAAV-Herstellungsverfahren des Standes der Technik benötigt, um das rAAV entweder vom wtAAV-Helfervirus oder einem anderen Adenovirus, das in der Zelle gebildet wird, oder irgendeinem Virus, das zur Herstellung des rAAV mittels homologer Rekombination verwendet wird, zu trennen.
  • Die durch das vorliegende Verfahren hergestellten rAAV können therapeutische Transgene oder Marker-Transgene tragen und sind insbesondere zur Übertragung solcher Transgene auf eine Wirtszelle oder ein Wirtsgewebe geeignet. Diese rAAV sind als Forschungsreagenzien, als Werkzeuge für die rekombinante Herstellung eines Transgenprodukts in vitro und als therapeutische Reagenzien in Zusammenhang mit der Gentherapie geeignet.
  • In der vorliegenden Erfindung wird eine Säugerwirtszelle bereitgestellt, umfassend:
    • (1) ein von insertierten terminalen AAV-Wiederholungssequenzen (ITRs) flankiertes Transgen, das unter der Kontrolle von dessen Expression steuernden Regulationssequenzen steht;
    • (2) eine AAV-rep-Sequenz und eine AAV-cap-Sequenz unter der Kontrolle von deren Expression steuernden Regulationssequenzen; und
    • (3) die zur Expression eines E1a-Genprodukts, eines E1b-Genprodukts und eines E2a-Genprodukts benötigte kleinstmögliche Adenovirus-DNA.
  • Die Adenovirus-Genprodukte können in der Wirtszelle transient produziert werden, wobei beispielsweise die jeweiligen Gene in einem transfizierenden Plasmid zugeführt werden.
  • Als Alternative können sie in der Wirtszelle stabil exprimiert werden, wobei beispielsweise die jeweiligen Gene in der Wirtszelle als Episom vorliegen oder in die Chromosomen der Wirtszelle integriert werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die AAV-rep- und -cap-Sequenzen in der Wirtszelle transient exprimiert. In einer weiteren Ausführungsform wird wenigstens eines der adenoviralen E1- und E2a-Gene in der Wirtszelle transient exprimiert. Als Alternative werden in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die AAV-rep- und -cap-Sequenzen in der Wirtszelle stabil exprimiert. In einer weiteren Ausführungsform werden sowohl die AAV-rep- und -cap-Sequenzen als auch die adenoviralen DNA-Sequenzen in der Wirtszelle transient exprimiert. In einer weiteren Ausführungsform werden wenigstens ein und vorzugsweise mehrere der adenoviralen E1- und E2a-Gene in der Zelle stabil exprimiert. In noch einer weiteren Ausführungsform werden sowohl die AAV-rep- und -cap-Sequenzen als auch die adenovirale DNA in der Wirtszelle stabil exprimiert.
  • Jedes der adenoviralen Gene kann durch einen induzierbaren Promotor, einen konstitutiven Promotor oder seinen nativen adenoviralen Promotor reguliert werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung codiert die adenovirale DNA wenigstens eines der E1a-, E1b- und E2a-Adenovirus-Genprodukte unter der Regulationskontrolle eines induzierbaren Promotors. In einer weiteren Ausführungsform werden die die E1a- und E1b-Genprodukte umfassende E1-DNA sowie die E2a-DNA unter die Kontrolle unterschiedlicher induzierbarer Promotoren gestellt. In einer weiteren Ausführungsform wird wenigstens eines der adenoviralen E1a-, E1b- und E2a-Genprodukte unter die Kontrolle eines konstitutiven Promotors gestellt. In einer weiteren Ausführungsform wird wenigstens eines der adenoviralen E1a-, E1b- oder E2a-Genprodukte unter die Kontrolle seines nativen Promotors gestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die E1-DNA unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors und die E2a-DNA unter die Kontrolle ihres nativen adenoviralen Promotors gestellt.
  • Die E1a-, E1b- und E2a-Gene können koordiniert oder unabhängig voneinander reguliert werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hängt die Expression jedes der E1- und E2a-Genprodukte nicht vom Expressionsniveau der anderen adenoviralen Genprodukte ab. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform hängt die Expression wenigstens eines der E1- und E2a-Genprodukte von der Expression eines der adenoviralen Genprodukte ab und wird daher durch diese koordiniert reguliert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Expression des E2a-Genprodukts durch die Expression des E1-Genprodukts reguliert.
  • In einem weiteren Aspekt wird in der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus in Abwesenheit von verunreinigendem Helfervirus oder Wildtypvirus bereitgestellt. Bei dem Verfahren isoliert man ein rAAV aus den kultivierten Wirtszellen, wobei die kultivierten Zellen das das Transgen exprimierende rAAV, jedoch kein verunreinigendes Helfervirus oder Wildtyp-AAV enthalten. Dieses Verfahren kann ebenso die Kultivierung einer Wirtszelle umfassen, die ein von AAV-ITRs flankiertes Transgen, das unter der Kontrolle von dessen Expression steuernden Regulationssequenzen steht, eine AAV-rep-Gensequenz und eine AAV-cap-Gensequenz enthält, in Gegenwart der minimalen adenoviralen DNA, die benötigt wird, um die Expression eines E1a-Genprodukts, eines E1b-Genprodukts und eines E2a-Genprodukts zu gestatten. Dieses Verfahren vermeidet Reinigungsschritte, da weder ein Helfervirus verwendet wird noch genügend Adenovirussequenz in der Wirtszelle vorliegt, um eine homologe Rekombination zu einem verunreinigenden wt-Virus zu gestatten.
  • Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden weiter in der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon beschrieben.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Bei 1 handelt es sich um ein Balkendiagramm, bei dem infektiöse Einheiten (infectious units, IU) von rAAV, produziert in Gegenwart unterschiedlicher Kombinationen von durch die Plasmide prAAVLacZ (auch als prAAVCMVLacZ bezeichnet), pPGKE1, pMMTVE2a, pCMVORF6 und pAdVAI bereitgestellten Adenovirus-Helfergenen in B-50-Zellen, aufgetragen sind. Die verwendeten Plasmide sind durch "+"-Zeichen unterhalb der X-Achse gekennzeichnet und in Beispiel 1 ausführlich beschrieben.
  • Bei 2 handelt es sich um ein Balkendiagramm, bei dem IU von rAAV, produziert in Gegenwart unterschiedlicher Molverhältnisse der Plasmide pPGKE1 und pMMTVE2a in B-50-Zellen, aufgetragen sind. Die Molverhältnisse sind unterhalb der X-Achse angegeben. Siehe z.B. Beispiel 2.
  • Bei 3 handelt es sich um ein Balkendiagramm, bei dem IU von rAAV, produziert in Gegenwart von AAVrep/cap, Ad-E1-Genprodukt und Ad-E2a-Genprodukt in menschlichen A549-Lungenkarzinomzellen, aufgetragen sind. Die X-Achse zeigt die Molverhältnisse der in diesem Experiment verwendeten Plasmide pP5-Rep/Cap pPGKE1 : pMMTVE2a. pAdWt (eine Plasmid-DNA mit einem intakten Ad5-Genom) diente als Positivkontrolle.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • I. Erfindungsgemäße Verpackungszelle
  • In der folgenden Erfindung wird eine Säugerwirtszelle, umfassend ein von AAV-ITRs flankiertes Transgen, das unter der Kontrolle von dessen Expression steuernden Regulationssequenzen steht, eine AAV-rep-Sequenz und eine AAv-cap-Sequenz, die unter der Kontrolle von deren Expression steuernden Regulationssequenzen stehen, und die zur Expression eines E1a-Genprodukts, eines E1b-Genprodukts und eines E2a-Genprodukts benötigte kleinstmögliche Adenovirus-DNA, bereitgestellt.
  • A. Transgen
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung enthält die Wirtszelle ein gentechnisch hergestelltes Nukleinsäuremolekül, das ein gewünschtes Transgen, einen Promotor sowie weitere Regulationselemente, die die Expression des Transgens in einer Wirtszelle kontrollieren und steuern, flankiert von AAV-Sequenzen, umfaßt. Bei der Transgensequenz handelt es sich um eine zur AAV-Sequenz heterologe Nukleinsäuresequenz, die ein interessierendes Polypeptid oder Protein codiert. Die Zusammensetzung der Transgensequenz hängt von der vorgesehenen Verwendung des entstandenen rAAV ab. So umfaßt beispielsweise eine Art von Transgensequenz eine Reporter- oder Markersequenz, die bei Expression ein nachweisbares Signal produziert. Zu solchen Reporter- oder Markersequenzen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, DNA-Sequenzen, die β-Lactamase, β-Galactosidase (LacZ), alkalische Phosphatase, Thymidinkinase, Green Fluorescent Protein (GFP), Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), Luciferase, membrangebundene Proteine einschließlich z.B. CD2, CD4, CD8, das Influenza-Hämagglutininprotein und andere im Fachgebiet allgemein bekannte Proteine, für die gegen sie gerichtete Antikörper mit hoher Affinität existieren oder routinemäßig hergestellt werden können, sowie Fusionsproteine, die ein mit einer Antigen-Tag-Domäne aus u.a. Hämagglutinin oder Myc entsprechend fusioniertes membrangebundenes Protein umfassen, codieren.
  • Sind diese Sequenzen mit Regulationselementen, die ihre Expression vorantreiben, assoziiert, so liefern sie Signale, die mit herkömmlichen Mitteln, einschließlich enzymatischen, radiographischen, kolorimetrischen, Fluoreszenz- oder anderen spektrographischen Tests, dem fluoreszent aktivierten Zellsortierungstest sowie immunologischen Tests, einschließlich ELISA, RIA und Immunhistochemie, nachweisbar sind. Handelt es sich beispielsweise bei dem Transgen um das LacZ-Gen, so wird die Gegenwart von rAAV mit Tests auf beta-Galactosidaseaktivität nachgewiesen. In ähnlicher Weise kann, wenn es sich bei dem Transgen um Luciferase handelt, rAAV über Lichtproduktion in einem Luminometer gemessen werden.
  • Wünschenswerterweise handelt es sich bei dem Transgen jedoch um ein Nicht-Marker-Gen, das über das mit dem vorliegenden Verfahren hergestellte rAAV einer Zelle oder einem Tier zugeführt werden kann. Dabei kann das Transgen aus einer großen Vielfalt von in der Biologie und Medizin nützlichen Genprodukten, wie z.B. Proteinen, Antisense-Nukleinsäuren (z.B. RNAs) oder katalytischen RNAs, ausgewählt sein. Die Erfindung kann dazu verwendet werden, Genmängel, wobei normale Gene zwar exprimiert werden, jedoch auf geringeren Niveaus als üblich, zu korrigieren oder abzumildern, und kann ebenso dazu verwendet werden, um genetische Defekte, wobei ein funktionelles Genprodukt nicht exprimiert wird, zu korrigieren oder abzumildern. Eine bevorzugte Art von Transgensequenz ist ein therapeutisches Gen, das ein gewünschtes Genprodukt in einer Wirtszelle exprimiert. Diese therapeutischen Nukleinsäuresequenzen codieren typischerweise Produkte, die bei Expression in der Lage sind, einen vererbten oder nicht vererbten genetischen Defekt zu korrigieren oder zu komplementieren oder eine epigenetische Störung oder Krankheit zu behandeln. Das ausgewählte Transgen kann jedoch ein beliebiges Produkt, das man untersuchen möchte, codieren. Die Auswahl der Transgensequenz stellt keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung dar. Die Wahl einer Transgensequenz liegt im Bereich des fachmännischen Könnens im Sinne der Lehren der vorliegenden Anmeldung.
  • Die Erfindung umfaßt ebenso Verfahren zur Herstellung eines rAAV, das zur Korrektur oder Abmilderung eines durch ein Protein mit mehreren Untereinheiten verursachten Gendefekten verwendet werden kann. In bestimmten Situationen kann zur Codierung der Untereinheiten des Proteins jeweils ein unterschiedliches Transgen verwendet werden. Dies ist dann wünschenswert, wenn die die Proteinuntereinheit codierende DNA groß ist, beispielsweise bei einem Immunglobulin oder dem Thrombozytenwachstumsfaktorrezeptor (platelet-derived growth factor receptor). Damit die Zelle das Protein mit mehreren Untereinheiten produzieren kann, würde man eine Zelle mit rAAV, die jeweils die unterschiedlichen Untereinheiten enthalten, infizieren. Als Alternative können unterschiedliche Untereinheiten eines Proteins durch das gleiche Transgen codiert werden. In diesem Fall würde ein einziges Transgen die für jede der Untereinheiten codierende DNA enthalten, wobei die DNA für jede Untereinheit jeweils durch eine interne Ribosomeneintrittsstelle (internal ribosome entry site, IRES) getrennt ist. Dies ist wünschenswert, wenn die jeweils für die Untereinheit codierende DNA klein ist, so daß die gesamte, die Untereinheiten codierende DNA und die IRES weniger als fünf Kilobasen aufweisen.
  • Zu den geeigneten Genprodukten gehören Hormone sowie Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Insulin, Glucagon, Wachstumshormon (growth hormone, GH), Parathormon (PTH), Somatoliberin (growth hormone releasing factor, GRF), Follikel stimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH), menschliches Choriongonadotropin (hCG), VEGF (vascular endothelial growth factor), Angiopoetine, Angiostatin, GCSF (granulocyte colony stimulating factor), Erythropoetin (EPO), CTGF (connective tissue growth factors), bFGF (basic fibroblast growth factor), aFGF (acidic fibroblast growth factor), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), transformierender Wachstumsfaktor α (TGFα), Thrombozytenwachstumsfaktor (platelet-derived growth factor, PDGF), insulinähnliche Wachstumsfaktoren I und II (IGF-I und IGF-II), alle Mitglieder der Superfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ), umfassend TGFβ, Aktivine, Inhibine oder alle BMPs (bone morphogenic proteins), BMPs 1-15, alle Mitglieder der Wachstumsfaktorfamilie Heregulin/Neuregulin/ARIA/neu-Differenzierungsfaktor (NDF), Nervenwachstumsfaktor (NGF), BDNF (brain-derived neurotrophic factor), Neurotrophine NT-3 und NT-4/5, CNTF (ciliary neurotrophic factor), GDNF (glial cell line derived neurotrophic factor), Neurturin, Agrin, alle Mitglieder der Familie der Semaphorine/Collapsine, Netrin-1 und Netrin-2, HGF (hepatocyte growth factor), Ephrine, Noggin, "sonic hedgehog" und Tyrosinhydroxylase.
  • Zu weiteren geeigneten Genprodukten gehören Proteine, die das Immunsystem regulieren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Zytokine und Lymphokine, wie z.B. Thrombopoetin (TPO), Interleukine (IL), IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 und IL-17, MCP-1 (monocyte chemoattractant protein, LIF (leukemia inhibitory factor), GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor), Fas-Ligand, Tumornekrosefaktoren α und β (TNFα und TNFβ), Interferone (IFN) IFN-α, IFN-β und IFN-γ, Stammzellenfaktor, flk-2/flt3-Ligand. Vom Immunsystem produzierte Genprodukte sind ebenfalls von dieser Erfindung umfaßt. Zu diesen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, die Immunglobuline IgG, IgM, IgA, IgD und IgE, chimäre Immunglobuline, humanisierte Antikörper, Einzelkettenantikörper, T-Zellrezeptoren, chimäre T-Zellrezeptoren, Einzelketten-T-Zellrezeptoren, MHC-Moleküle Klasse I und Klasse II ebenso wie gentechnisch hergestellte MHC-Moleküle, einschließlich Einzelketten-MHC-Moleküle. Zu den verwendeten Genprodukten gehören ebenso Komplement-Regulationsproteine, wie z.B. Membrankofaktorprotein (MCP), DAF (decay accelerating factor) CR1, CR2 und CD59.
  • Zu den geeigneten Genprodukten gehören weiterhin auch alle Rezeptoren für die Hormone, Wachstumsfaktoren, Zytokine, Lymphokine, Regulationsproteine und Immunsystemproteine. Die Erfindung umfaßt Rezeptoren für die Cholesterinregulation, einschließlich des LDL-Rezeptors, HDL-Rezeptors, VLDL-Rezeptors und des "Scavenger"-Rezeptors. Die Erfindung umfaßt ebenfalls Genprodukte, wie z.B. die Steroidhormonrezeptor-Superfamilie, einschließlich Glucocorticoidrezeptoren und Östrogenrezeptoren, Vitamin-D-Rezeptoren und andere nukleäre Rezeptoren. Darüber hinaus gehören zu den geeigneten Genprodukten Transkriptionsfaktoren wie jun, fos, max, mad, SRF (serum response factor), AP-1, AP-2, myb, MRG1, CREM, Alx4, FREAC1, NF-κB, Mitglieder der Leucin-Zipper-Familie, C2H4-Zinkfingerproteine, einschließlich Zif268-, EGR1-, EGR2-, C6-Zinkfingerproteine, einschließlich der Glucocorticoid- und Östrogenrezeptoren, POU-Domäne-Proteine, z.B. Pit1, Homeodomäne-Proteine, einschließlich HOX-1, basische Helix-Loop-Helix-Proteine, einschließlich myc, MyoD und Myogenin, ETS-Box-haltige Proteine, TFE3-, E2F-, ATF1-, ATF2-, ATF3-, ATF4-, ZF5-, NFAT-, CREB-, HNF-4-, C/EBP-, SP1-, CCAAT-Box-Bindungsproteine, Interferon regulationsfaktor 1 (IRF-1), Wilms-Tumorprotein, ETS-Bindungsprotein, STAT-, GATA-Box-Bindungsproteine, z.B. GATA-3 sowie die "forkhead"-Familie der "winged helix"-Proteine.
  • Zu weiteren geeigneten Genprodukten gehören Carbamoylsynthetase I, Ornithin-transcarbamylase, Arginosuccinat-synthetase, Arginosuccinat-lyase, Arginase, Fumarylacetoacetat-hydrolase, Phenylalaninhydroxylase, alpha-1-Antitrypsin, Glucose-6-phosphatase, low-density-Lipoprotein-Rezeptor, Porphobilinogen-desaminase, Faktor VIII, Faktor IX, Cystathion-beta-synthase, verzweigtkettige-Ketosäuredecarboxylase, Albumin, Isovaleryl-CoA-dehydrogenase, Propionyl-CoA-carboxylase, Methylmalonyl-CoA-mutase, Glutaryl-CoA-dehydrogenase, Insulin, beta-Glucosidase, Pyruvatcarboxylase, hepatische Phosphorylase, Phosphorylase-kinase, Glycindecarboxylase (auch als P-Protein bezeichnet), H-Protein, T-Protein, Menkes-Syndrom-Protein, Tumorsuppressoren (z.B. p53), CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator) sowie das Produkt des Morbus-Wilson-Gens PWD.
  • Zu weiteren geeigneten Transgenen gehören nicht natürlich vorkommende Polypeptide, wie z.B. chimäre oder hybride Polypeptide oder Polypeptide mit einer nicht natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz, die Insertionen, Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen enthält. So könnten bespielsweise gentechnisch hergestellte Einzelketten-Immunglobuline bei bestimmten Patienten mit geschwächter Immunabwehr geeignet sein. Zu weiteren Arten nicht natürlich vorkommender Gensequenzen gehören Antisense-Moleküle und katalytische Nukleinsäuren, wie z.B. Ribozyme, die zur Reduzierung der Überexpression eines Gens verwendet werden könnten.
  • Die Konstruktion des Transgens zur Expression in Säugerzellen und -wirten sollte entsprechende Sequenzen beinhalten, die mit dem interessierenden Gen operativ verknüpft sind, um dessen Expression zu fördern. Zu den "operativ verknüpften" Sequenzen gehören sowohl Expressionskontrollsequenzen, die an das interessierende Gen angrenzen, als auch Expressionskontrollsequenzen, die zur Kontrolle des interessierenden Gens in trans oder in einem Abstand wirken. Zu den Expressionskontrollsequenzen gehören entsprechende Transkriptionsinitiations-, -terminations-, Promotor- und Enhancer-Sequenzen; wirksame RNA-Prozessierungssignale, wie z.B. Spleiß- und Polyadenylierungssignale; Sequenzen, die zytoplasmatische mRNA stabilisieren; Sequenzen, die die Translationseffizienz verbessern (d.h. Kozak-consensus-Sequenz); Sequenzen, die die Proteinstabilität verbessern; und, falls gewünscht, Sequenzen, die die Proteinsekretion verbessern. Im Fachgebiet sind eine große Anzahl von Expressionskontrollsequenzen – native, konstitutive, induzierbare und/oder gewebespezifische – bekannt und können zum Vorantreiben der Expression des Transgens je nach Art der gewünschten Expression eingesetzt werden. Bei eukaryontischen Zellen umfassen die Expressionskontrollsequenzen typischerweise einen Promotor, einen Enhancer, wie z.B. von einem Immunglobulingen, SV40, Cytomegalovirus usw. abgeleiteten Enhancer, sowie eine Polyadenylierungssequenz, die Spleiß-Donor- und -Akzeptorstellen enthalten kann. Die Polyadenylierungssequenz wird im allgemeinen hinter den Transgensequenzen und vor der 3'-AAV-ITR-Sequenz eingefügt. Ein für die vorliegende Erfindung geeignetes, Transgen-tragendes Molekül kann ebenso ein Intron enthalten, das wünschenswerterweise zwischen der Promotor/Enhancer-Sequenz und dem Transgen lokalisiert ist. Eine mögliche Intronsequenz leitet sich ebenfalls von SV-40 ab und wird als die SV-40-T-Intronsequenz bezeichnet. Als weiteres Vektorelement kann eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) verwendet werden. Eine IRES-Sequenz wird zur Produktion von mehr als einem Polypeptid von einem einzigen Gentranskript aus verwendet. Eine IRES-Sequenz würde zur Produktion von Proteinen verwendet werden, die mehr als eine Polypeptidkette enthalten. Die Auswahl dieser und weiterer üblicher Vektorelemente erfolgt in herkömmlicher Weise, und viele solche Sequenzen stehen zur Verfügung [siehe z.B. Sambrook et al. und die darin zitierten Literaturangaben, z.B. Seiten 3.18-3.26 und 16.17-16.27, sowie Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989].
  • In einer Ausführungsform ist eine konstitutive Expression auf hohem Niveau erwünscht. Zu derartigen Promotoren gehören beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, der retrovirale LTR-Promotor/Enhancer des Rous sarcoma virus (RSV), der immediate early promotor/enhancer des Cytomegalovirus (CMV) [siehe z.B. Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)], der SV40-Promotor, der Dihydrofolatreductase-Promotor, der zytoplasmatische β-Actin-Promotor sowie der Promotor der Phosphoglycerinkinase (PGK).
  • In einer weiteren Ausführungsform können induzierbare Promotoren erwünscht sein. Bei den induzierbaren Promotoren handelt es sich um solche, die von exogen zugeführten Verbindungen reguliert werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, der zinkinduzierbare Promotor des Schaf-Metallothionins (MT); der durch Dexamethason (Dex) induzierbare MMTV (mouse mammary tumor virus)-Promotor; das T7-Polymerase-Promotorsystem [WO 98/10088]; der Ecdyson-Promotor aus Insekten [No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)]; das Tetracyclinreprimierbare System [Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]; das Tetracyclininduzierbare System [Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995); siehe auch Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)]; das RU486-induzierbare System [Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) und Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)] sowie das Rapamycin-induzierbare System [Magari et al., J. Clin., Invest., 100:2865-2872 (1997)]. Weitere Arten von induzierbaren Promotoren, die in diesem Zusammenhang geeignet sein können, sind diejenigen, die durch einen spezifischen physiologischen Zustand reguliert werden, z.B. Temperatur, akute Phase, oder nur in replizierenden Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform steht das Transgen unter der Kontrolle des nativen AAV-Promotors P5.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird der native Promotor für das Transgen verwendet. Der native Promotor kann bevorzugt sein, wenn gewünscht wird, daß die Expression des Transgens die native Expression nachahmen soll. Der native Promotor kann dann verwendet werden, wenn die Expression des Transgens zeitlich oder entwicklungsmäßig oder in gewebespezifischer Weise oder als Reaktion auf spezifische Transkriptionsstimuli reguliert werden muß. In einer weiteren Ausführungsform können auch andere native Expressionskontrollelemente, wie z.B. Enhancerelemente, Polyadenylierungsstellen oder Kozak-consensus-Sequenzen, zur Nachahmung der nativen Expression verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform des Transgens umfaßt ein mit einem gewebespezifischen Promotor operativ verknüpftes Transgen. Ist beispielsweise die Expression im Skelettmuskel erwünscht, so sollte ein im Muskel aktiver Promotor verwendet werden. Zu diesen gehören die Promotoren von Genen, die Skelettmuskel-α-Actin, Myosin-leichte-Kette 2A, Dystrophin, Muskel-Creatinkinase codieren, ebenso wie synthetische Muskel-Promotoren, die höhere Aktivitäten als die natürlich vorkommenden Promotoren aufweisen [siehe Li et al., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)]. Gewebespezifische Promotoren sind beispielsweise bekannt für die Leber [Albumin, Miyatake et al., J. Virol., 71:5124-32 (1997); Core-Promotor des Hepatitis-B-Virus, Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996); alpha-Fetoprotein (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996), Knochen [Osteocalcin, Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997); Knochensialoprotein, Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)], Lymphozyten [CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); Immunglobulin, schwere Kette; T-Zellrezeptor, α-Kette], Neuronal [neuronenspezifische Enolase (NSE)-Promotor, Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993); Gen der leichten Kette des Neurofilaments, Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991); das neuronenspezifische vgf-Gen, Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)]; u.a.
  • Natürlich funktionieren nicht alle Vektoren und Expressionskontrollsequenzen gleichermaßen gut, um alle Transgene der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Doch kann der Fachmann eine Auswahl unter diesen Expressionskontrollsequenzen vornehmen, ohne dabei vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Geeignete Promotor/Enhancer-Sequenzen können vom Fachmann unter Verwendung der durch diese Anmeldung bereitgestellten Richtlinien ausgewählt werden. Bei einer solchen Auswahl handelt es sich um eine Routineangelegenheit und nicht um eine Beschränkung des Moleküls oder Konstrukts. So kann man beispielsweise eine oder mehrere Expressionskontrollsequenzen auswählen, die Sequenz mit einem interessierenden Transgen operativ verknüpfen und das die Expressionskontrollsequenz sowie das Transgen umfassende "Minigen" in einen AAV-Vektor einfügen. Nach Durchführung eines der in dieser Beschreibung gelehrten oder im Fachgebiet gelehrten Verfahrens zur Verpackung des rAAV kann man geeignete Zellen in vitro oder in vivo infizieren. Die Anzahl der Kopien des Transgens in der Zelle kann mittels Southern-blot oder quantitativer PCR überwacht werden; das Niveau der RNA-Expression kann mittels Northernblot oder quantitativer RT-PCR überwacht werden; und das Niveau der Proteinexpression kann mittels Westernblot, Immunhistochemie, ELISA, RIA oder Tests der biologischen Aktivität des Genprodukts des Transgens überwacht werden. Somit kann man leicht testen, ob eine bestimmte Expressionskontrollsequenz für ein spezifisches Transgen geeignet ist, und die zur Expression des gewünschten Transgens am besten geeignete Expressionskontrollsequenz wählen.
  • Bei den verwendeten AAV-Sequenzen handelt es sich vorzugsweise um die cis-wirkenden invertierten 5'- und 3'-terminalen Wiederholungssequenzen [siehe z.B. B.J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses", Hrsg. P. Tijsser, CRC Press, S. 155-168 (1990)]. Die ITR-Sequenzen weisen eine Länge von etwa 145 ßp auf. Vorzugsweise werden im Molekül weitgehend die gesamten, die ITRs codierenden Sequenzen verwendet, obwohl eine gewisse kleinere Modifikation dieser Sequenzen erlaubt ist. Der Fachmann ist dazu in der Lage, diese ITR-Sequenzen zu modifizieren [siehe z.B. Schriften wie z.B. Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Carter et al., vorstehend zitiert; und K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1996)]. Ein Beispiel eines solchen in der vorliegenden Erfindung verwendeten Moleküls ist ein das Transgen enthaltendes "cis-wirkendes" Plasmid, in dem die ausgewählte Transgensequenz und die assoziierten Regulationselemente von den 5'- und 3'-AAV-ITR-Sequenzen flankiert werden.
  • Die AAV-ITR-Sequenzen können von einem beliebigen bekannten AAV, einschließlich den zur Zeit identifizierten menschlichen AAV-Arten, gewonnen werden. In ähnlicher Weise können die in den Molekülen oder Konstrukten der vorliegenden Erfindung verwendeten ITRs auch von AAVs bereitgestellt werden, die bekanntermaßen andere Tiere infizieren. So können beispielsweise die ITRs von AAV Typ 1, AAV Typ 2, AAV Typ 3, AAV Typ 4, AAV Typ 5, AAV Typ 6, anderen AAV-Serotypen oder Densovirus bereitgestellt werden. Verschiedene AAV-Stämme sind von der American Type Culture Collection erhältlich oder können auf Anfrage von verschiedenen kommerziellen und institutionellen Quellen bezogen werden. In den folgenden beispielhaften Ausführungsformen wird aus Gründen der Zweckmäßigkeit ein AAV-2 verwendet. Jedoch liegt die Auswahl der Spezies und des Serotyps des AAV, das die Sequenzen bereitstellt, im Bereich des fachmännischen Könnens gemäß den Lehren der vorliegenden Anmeldung und stellt keine Beschränkung der folgenden Erfindung dar.
  • Das die das Transgen und die Regulationssequenzen (z.B. Promotoren, PolyA-Sequenzen usw.) flankierenden AAV-ITRs tragende Nukleinsäuremolekül kann in einer beliebigen Form vorliegen, in der diese Komponenten auf die Wirtszelle übertragen werden. Das die AAV-ITRs, das Transgen und die Regulationssequenzen umfassende Nukleinsäuremolekül kann sich innerhalb eines Vektors befinden. Ein "Vektor" umfaßt, ohne darauf beschränkt zu sein, alle genetischen Elemente, wie z.B. ein Plasmid, einen Phagen, ein Transposon, ein Cosmid, ein Chromosom, ein Virus, ein Virion usw., mit denen Gensequenzen auf eine Zelle übertragen werden können. Somit umfaßt der Begriff Klonierungs- und Expressionsvehikel ebenso wie virale Vektoren. Die Transformation sowie weitere Verfahren zur Einführung von Nukleinsäuren in eine Wirtszelle (z.B. Transfektion, Elektroporation, Zuführung mittels Liposomen, Membranfusionstechniken, DNA-beschichtete Hochgeschwindigkeitspellets, Virusinfektion und Protoplastenfusion) lassen sich mittels verschiedener Verfahren, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind, bewerkstelligen (siehe beispielsweise Ausubel et al. und Sambrook et al., supra). Säugerzellen werden mit einem Expressionsvektor, wie z.B. einem Plasmid, einem Cosmid, o.A. transformiert oder transfiziert, wobei der Expressionsvektor die interessierende DNA umfaßt. Die Einführung in Säugerzellen läßt sich mit verschiedenen Plasmiden, einschließlich pcDNA, pSV2, pBC12BI und p91023, ebenso wie lytischen Virusvektoren (z.B. Vakziniavirus), episomalen Virusvektoren (z.B. Rinder-Papillomavirus) und retroviralen Vektoren (z.B. Maus-Retroviren) erzielen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich das das Transgen umfassende rAAV-Transgen innerhalb eines Plasmidvektors. Die Plasmide der vorliegenden Erfindung können gentechnisch so hergestellt werden, daß sie sich zur Replikation und gegebenenfalls Integration in prokaryontischen Zellen und/oder Säugerzellen eignen. Shuttle-Vektoren umfassen Sequenzen, die die Replikation der Kassette sowohl in Eukaryonten als auch Prokaryonten gestatten, sowie Selektionsmarker sowohl für prokaryontische als auch eukaryontische Systeme. Siehe z.B. Sambrook und Ausubel, supra. Zu den selektierbaren Marker- oder Reportergenen gehören Sequenzen, die u.a. für Geneticin-, Hygromycin- oder Purimycinresistenz codieren. Ebenso enthalten sein können bestimmte selektionierbare Reporter oder Marker-Gene, die sich für das Wachstum des Vektors in Bakterienzellen verwenden lassen, wie z.B. Ampillicinresistenz. Zu weiteren Bestandteilen des Plasmids können ein Replikationsursprung und ein Amplifikat, wie z.B. das Amplifikatsystem, bei dem das nukleäre Antigen des Epstein-Barr-Virus eingesetzt wird, beispielsweise die Vektorkomponenten in pCEP4 (Invitrogen), gezählt werden. Siehe ebenso J. Horvath et al., Virology, 184:141-148 (1991). Dieses Amplifikatsystem oder ähnliche Amplifikatbestandteile gestatten eine episomale Replikation mit hoher Kopienzahl in den Zellen. Vorzugsweise wird dieses Nukleinsäuremolekül in die Zelle transfiziert, wo es transient oder vorzugsweise stabil als Episom existieren kann. Als Alternative kann das gesamte Molekül oder aber zumindest das Transgen und die Regulationssequenzen, stabil in ein Chromosom der Wirtszelle integriert werden.
  • Als Alternative können die Zellen mit einem viralen Expressionsvektor, der die interessierende DNA oder RNA umfaßt, infiziert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich das das Transgen umfassende rAAV-Konstrukt innerhalb eines Adenovirus/AW-Hybridvektors. Der Hybridvektor umfaßt ausgewählte Teile einer Adenovirussequenz, 5'- und 3'-AAV-ITR-Sequenzen, die ein ausgewähltes Transgen unter der Kontrolle eines ausgewählten Promotors flankieren, sowie weitere herkömmliche Vektorregulationsbestandteile. Siehe US-Patente Nr. 5,856,152 und 5,871,982. Die Adenovirussequenzen können von einem Wildtyp-Adenovirus oder einem mutanten Adenovirus stammen. Im Hybridvektorkonstrukt werden die AAV-Sequenzen von den ausgewählten adenoviralen Sequenzen flankiert. Die kleinstmöglichen eingesetzten Adenovirussequenzen sind die cis-wirkenden invertierten 5'- und 3'-terminalen Wiederholungssequenzen (ITR-Sequenzen) eines Adenovirus (die als Replikationsursprünge fungieren) sowie die nativen 5'-Verpackung/Enhancer-Domäne, die die zur Verpackung linearer Ad-Genome sowie Enhancer-Elemente für den E1-Promotor enthält. Die 5'- und 3'-AW-ITR-Sequenzen flankieren ihrerseits eine ausgewählte Transgensequenz und ihr assoziiertes Regulationselement. Die deletierten Genprodukte können im Hybridvirus-Produktionsverfahren von einer ausgewählten Verpackungszelle oder von dem Hybridvektor selbst geliefert werden. Zu den deletierten Genprodukten gehören E1, E2a, E4ORF6 und VAI RNA. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die ausgewählte Verpackungszelle E1 und E2a. Sobald das Hybridvirus oder trans-Infektionspartikel von einer Zelle aufgenommen worden ist, muß das von AAV ITR flankierte Transgen aus dem Ausgangsadenovirusgerüst freigesetzt werden, indem der infizierten Zelle ein AAV-rep-Gen, das vorzugsweise in der Verpackungswirtszelle vorliegt, zugeführt wird. Das rekombinante AAV-Genom wird verpackt, indem der infizierten Zelle ein AAV-cap-Gen, das vorzugsweise in der Verpackungswirtszelle vorliegt, zugeführt wird.
  • Die zur Konstruktion aller Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendeten gentechnischen Verfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäuremanipulation bekannt und umfassen die Gentechnik, Rekombinationstechnik und Synthesetechniken. Siehe z.B. Sambrook et al. und Ausubel et al., vorstehend zitiert; sowie die internationale Patentanmeldung Nr. WO95/13598.
  • In den nachfolgenden Beispielen handelt es sich bei einem beispielhaften transgenhaltigen Molekül um das in Beispiel 1 beschriebene, als prAAVCMVLacZ bezeichnete, cis-wirkende Plasmid.
  • B. AAV-rep- und -cap-Sequenzen
  • Die erfindungsgemäße Wirtszelle enthält auch eine AAV-rep-Sequenz sowie eine AAV-cap-Gensequenz, vorzugsweise unter der Regulationskontrolle einer Promotorsequenz. Die AAV-rep- und -cap-Sequenzen werden aus einer AAV-Quelle, wie sie vorstehend identifiziert wurde, gewonnen. Die AAV-rep- und -cap-Sequenzen können in die Wirtszelle auf eine beliebige, im Fachgebiet bekannte Weise, wie oben beschrieben, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Transfektion, Elektroporation, Zuführung mit Liposomen, Membranfusionstechniken, DNA-beschichtete Hochgeschwindigkeitspellets, Virusinfektion und Protoplastenfusion, eingeführt werden. In einer Ausführungsform können die rep- und cap-Sequenzen mit einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen in die Wirtszelle transfiziert werden und in der Zelle als Episom stabil existieren. In einer weiteren Ausführungsform werden die rep- und cap-Sequenzen stabil in das Genom der Zelle integriert. Eine stabile Wirtszellinie, die rep und cap enthält, ist B-50, beschrieben in PCT/US98/19463. In einer weiteren Ausführungsform werden die rep- und cap-Sequenzen in der Wirtszelle transient exprimiert. Ein geeignetes Nukleinsäuremolekül für eine solche Transfektion umfaßt bespielsweise, von 5' nach 3', einen Promotor, einen gegebenenfalls zwischen dem Promotor und der Startstelle der rep-Gensequenz liegenden Abstandhalter ("Spacer"), eine AAV-rep-Gensequenz sowie eine AAV-cap-Gensequenz.
  • Die rep- und cap-Sequenzen können zusammen mit ihren Expressionskontrollsequenzen entweder auf einem einzigen Vektor, oder jede Sequenz kann auf ihrem eigenen Vektor zugeführt werden. Vorzugsweise werden die rep- und cap-Sequenzen auf demselben Vektor zugeführt. Als Alternative können die rep- und cap-Sequenzen auf einem Vektor zugeführt werden, der weitere DNA-Sequenzen, die in die Wirtszellen eingeführt werden sollen, enthält. So kann der Vektor beispielsweise das das Transgen umfassende rAAV-Konstrukt enthalten. Der Vektor kann eines oder mehrere der Gene, die für die adenoviralen Proteine E1, E2a und E4ORF6 codieren, sowie das Gen für VAI RNA umfassen. Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Vektors enthält die rep- und cap-Gene sowie die E1- und E2-Gene. Der Vektor kann auch die rep- und cap-Sequenzen, das rAAV-Konstrukt sowie die adenoviralen Gene umfassen. Eine bevorzugte Ausführungsform des Vektors enthält die rep- und cap-Sequenzen, das rAAV-Konstrukt sowie die adenoviralen Gene E1 und E2a.
  • Bei dem in diesem Konstrukt verwendeten Promotor kann es sich vorzugsweise um einen beliebigen der konstitutiven, induzierbaren oder nativen Promotoren handeln, die dem Fachmann bekannt sind oder vorstehend erläutert wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine AAV-P5-Promotorsequenz eingesetzt. Obgleich er aus einer beliebigen der oben erwähnten AAV-Quellen gewonnen werden kann, ist der Parvovirus-P5-Promotor vorzugsweise zu dem AAV-Serotyp, der die rep- und cap-Gensequenzen bereitstellt, homolog. Als Alternative kann es sich bei dem Promotor um einen P5-Promotor aus einem anderen AAV-Typ als dem, der die rep- und cap-Sequenzen bereitstellt, handeln. AAVs, von denen bekannt ist, daß sie andere Menschen und andere Tiere infizieren, können ebenso den P5-Promotor bereitstellen. Durch die Auswahl des AAV zur Bereitstellung einer dieser Sequenzen wird die Erfindung nicht beschränkt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Promotor für rep um einen induzierbaren Promotor. Wie oben erläutert, gehören zu den induzierbaren Promotoren, ohne darauf beschränkt zu sein, der Metallothionin (MT) -Promotor; der mit Dexamethason (Dex) induzierbare Promotor des MMTV (mouse mammary tumor virus); das T7-Polymerase-Promotorsystem; der Ecdyson-Promotor aus Insekten; das Tetracyclinreprimierbare System; das Tetracyclin-induzierbare System; das RU486-induzierbare System; und das Rapamycin-induzierbare System. Ein bevorzugter Promotor für die rep-Expression ist der T7-Promotor. Der das durch den T7-Promotor regulierte rep-Gen und das cap-Gen umfassende Vektor wird in eine Zelle transfiziert oder transformiert, die die T7-Polymerase entweder konstitutiv oder induzierbar exprimiert. Siehe WO 98/10088, veröffentlicht am 12. März 1998.
  • Bei dem Spacer handelt es sich um ein optionales Element in der Konstruktion des Vektors. Bei dem Spacer handelt es sich um eine DNA-Sequenz, die zwischen dem Promotor und der ATG-Startstelle des rep-Gens liegt. Der Spacer kann eine beliebige gewünschte Konstruktion aufweisen, d.h. es kann sich dabei um eine Zufallssequenz von Nukleotiden handeln oder er kann als Alternative ein Genprodukt codieren, wie z.B. ein Markergen. Der Spacer kann Gene enthalten, die typischerweise Start/Stopp- und PolyA-Stellen beinhalten. Bei dem Spacer kann es sich um eine nicht codierende DNA-Sequenz aus einem Prokaryonten oder Eukaryonten, um eine repetitive nicht codierende Sequenz, um eine codierende Sequenz ohne Transkriptionskontrollen oder codierende Sequenzen mit Transkriptionskontrollen handeln. Zwei beispielhafte Quellen für Spacer- Sequenzen sind die λ-Phagen-Leitersequenzen oder Hefe-Leitersequenzen, die kommerziell erhältlich sind, z.B. u.a. von Gibco oder Invitrogen. Der Spacer kann eine beliebige Größe aufweisen, die ausreicht, um die Expression der rep78- und rep68-Genprodukte zu reduzieren, wobei die Expression der rep52-, rep40- und cap-Genprodukte auf einem normalen Niveau bleibt. Die Länge des Spacers kann daher in einem Bereich von etwa 10 ßp bis etwa 10,0 kßp, vorzugsweise in dem Bereich von etwa 100 ßp bis etwa 8,0 kßp, liegen. Um die Möglichkeit einer Rekombination zu verringern, beträgt die Länge des Spacers vorzugsweise weniger als 2 kßp; dadurch wird die Erfindung jedoch nicht beschränkt.
  • Die AAV-rep- und cap-Proteine bereitstellende beispielhafte Moleküle sind in den Beispielen beschrieben, z.B. pMT-Rep/Cap, pP5-Rep/Cap und pMMTV-Rep/Cap. Diese Plasmide enthalten jeweils ein selektives Neomycin-Marker-Gen und exprimieren die AAV-rep/cap-Gene entweder von deren nativen P5-Promotor (pP5-Rep/Cap), dem mit Zink induzierbaren Promotor des Schaf-Metallothionins (pMTRep/Cap) oder dem mit Dexamethason (Dex) induzierbaren Promotor des MMTV (mouse mammary tumor virus) (pMMTV-Rep/Cap) aus gesteuert. Obwohl diese Proteine für die Zelle mit verschiedenen Mitteln bereitgestellt werden können, umfassen beispielhafte erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung verschiedener Plasmide. Zur Konstruktion des Plasmids pMT-Rep/Cap wurde die ORF6-Sequenz durch BamHI-Verdauung aus einem pMTE4ORF6-Plasmid [G.P. Gao et al., J. Virol., 70:8934-8943 (1996)] entfernt und durch ein 4,1 kb großes rep/cap-Fragment, das durch PCR-Amplifikation unter Verwendung des pSub201-Plasmids [Samulski, R.J. et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)] als Matrize hergestellt wurde, ersetzt. Das Plasmid pMMTV-Rep/Cap wurde auf die gleiche Weise wie pMT-Rep/Cap hergestellt, mit der Ausnahme, daß ein pMMTVE4ORF6-Plasmid [Gao et al., vorstehend zitiert] als Vektorgrundgerüst verwendet wurde. Zur Konstruktion von P5-Rep/Cap wurden die MT- Promotorsequenz und die ORF6-Sequenz durch EcoRI/BamHI-Verdauung aus einem pMTE4ORF6-Plasmid [G.P. Gao et al., J. Virol., 70:8934-8943 (1996)] entfernt und durch ein 4,3 kb großes P5-Rep/Cap-Fragment, das aus einem pSub201-Plasmid [Samulski, R.J. et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)] durch XbaI-Verdauung isoliert wurde, ersetzt. Die Plasmidkonstruktion erfolgte mit herkömmlichen gentechnischen Verfahren, wie z.B, denen, die in Sambrook et al., vorstehend zitiert, beschrieben sind.
  • Verschiedene andere, die rep- und cap-Proteine bereitstellende Plasmidkonstrukte sind im Fachgebiet bekannt und können in der erfindungsgemäßen Wirtszelle eingesetzt werden. So kann beispielsweise in den rep/cap-Konstrukten der Spacer zwischen dem Promotor und den rep/cap-Genen, auf die in dem oben beschriebenen Konstrukt Bezug genommen wurde, weggelassen werden. Weitere Konstrukte aus dem Stand der Technik, wie z.B. das in dem US-Patent Nr. 5,622,856 beschriebene, bei dem der P5-Promotor 3' bei den rep/cap-Genen liegt, können ebenso in diesem Zusammenhang eingesetzt werden.
  • Das die rep- und cap-Proteine bereitstellende Molekül kann in einer beliebigen Form vorliegen, mit der diese Komponenten auf die Wirtszelle übertragen werden. Wie hier beispielhaft dargestellt, liegt dieses Molekül vorzugsweise in Form eines Plasmids vor, das andere nichtvirale Sequenzen, wie z.B. solche für Marker-Gene, enthalten kann. Dieses Molekül enthält nicht die AAV-ITRs und im allgemeinen nicht die AAV-Verpackungssequenzen. Um das Auftreten einer homologen Rekombination zu vermeiden, werden andere Virussequenzen, insbesondere solche des Adenovirus, in diesem Plasmid vermieden. Dieses Plasmid wird vorzugsweise so konstruiert, daß es stabil in eine Zelle transfiziert werden kann.
  • Obwohl das das rep und cap bereitstellende Molekül in der Wirtszelle transient (d.h. durch Transfektion) existieren kann, ist es bevorzugt, daß die rep/cap-Proteine und der ihre Expression kontrollierende Promotor stabil in der Wirtszelle exprimiert werden, z.B. als ein Episom oder durch Integration in das Chromosom der Wirtszelle.
  • Bei den zur Konstruktion von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eingesetzten Verfahren handelt es sich um herkömmliche gentechnische oder rekombinationstechnische Techniken, wie z.B. die in den obigen Literaturangaben beschriebenen. Zwar werden mit dieser Beschreibung veranschaulichende Beispiele verschiedener Konstrukte bereitgestellt, doch kann ein Fachmann unter Verwendung der hier bereitgestellten Informationen weitere geeignete Konstrukte auswählen und konstruieren, und zwar unter Verwendung einer Auswahl von Spacern, P5-Promotoren und weiteren Elementen, einschließlich wenigstens eines Translationsstart- und -stoppsignals sowie gegebenenfalls der Zugabe von Polyadenylierungsstellen.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die rep- und cap-Proteine stabil durch eine Wirtszelle, wie z.B. die B-50-Zelle, wie unten ausführlich beschrieben, bereitgestellt werden.
  • C. Adenovirus-Gene E1a, E1b und E2a
  • Die Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung enthält weiterhin die zur Expression eines E1a-Genprodukts, eines E1b-Genprodukts und eines E2a-Genprodukts ausreichende kleinstmögliche adenovirale DNA. Die Wirtszelle kann weitere adenovirale Gene, wie z.B. E4ORF6 und/oder VAI RNA, enthalten, doch sind diese Gene nicht erforderlich. In einer bevorzugten Ausführungsform werden von der Wirtszelle keine weiteren Adenovirus-Gene oder -Genfunktionen geliefert.
  • Die für die in der vorliegenden Erfindung geeigneten Adenovirus-Gene E1 und E2a codierenden DNA-Sequenzen können unter allen bekannten Adenovirusarten, einschließlich der zur Zeit im Menschen identifizierten 46 Arten, ausgewählt werden [siehe z.B. Horwitz, vorstehend zitiert, und American Type Culture Collection]. In ähnlicher Weise können Adenoviren, die bekanntermaßen andere Tiere infizieren, die Gensequenzen liefern. Die Auswahl der Adenovirusart für jede E1- und E2a-Gensequenz stellt keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung dar. Die Sequenzen für eine Reihe von Adenovirus-Serotypen, einschließlich der des Serotyps Ad5, sind bei GenBank erhältlich. Verschiedene Adenovirusstämme sind von der American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA erhältlich oder können auf Anfrage von verschiedenen kommerziellen und institutionellen Quellen bezogen werden. Einer oder mehrere der menschlichen Adenoviren Typen 1 bis 46 können eine der adenoviralen Sequenzen, einschließlich E1 und E2a, liefern. In der folgenden beispielhaften Ausführungsform handelt es sich bei den E1- und E2a-Gensequenzen um diejenigen aus dem Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5).
  • Unter "adenoviraler DNA, die das E1a-Genprodukt exprimiert" versteht man ein beliebiges Adenovirusgen, das für E1a oder einen beliebigen funktionellen E1a-Anteil codiert. In ähnlicher Weise sind alle Allele oder andere Modifikationen des E1a-Gens oder funktionellen Anteils davon umfaßt. Solche Modifikationen können absichtlich durch Anwendung herkömmlicher Gentechnik oder Mutagenesetechniken eingeführt werden, um die E1a-Funktion ebenso wie natürlich vorkommende allelische Varianten davon zu verbessern.
  • Unter "adenoviraler DNA, die das E1b-Genprodukt exprimiert" versteht man ein beliebiges Adenovirusgen, das für E1b oder einen beliebigen funktionellen E1b-Anteil codiert. In ähnlicher Weise sind alle Allele oder andere Modifikationen des E1b-Gens oder funktio nellen Anteils davon umfaßt. Solche Modifikationen können absichtlich durch Anwendung herkömmlicher Gentechnik oder Mutagenesetechniken eingeführt werden, um die E1b-Funktion ebenso wie natürlich vorkommende allelische Varianten davon zu verbessern.
  • Unter "adenoviraler DNA, die das E2a-Genprodukt exprimiert" versteht man ein beliebiges Adenovirusgen, das für E2a oder einen beliebigen funktionellen E2a-Anteil codiert. In ähnlicher Weise sind alle Allele oder andere Modifikationen des E2a-Gens oder funktionellen Anteils davon umfaßt. Solche Modifikationen können absichtlich durch Anwendung herkömmlicher Gentechnik oder Mutagenesetechniken eingeführt werden, um die E2a-Funktion ebenso wie natürlich vorkommende allelische Varianten davon zu verbessern. Solche Modifikationen und Verfahren zur Manipulierung von DNA zur Erzielung dieser Adenovirus-Genfunktionen sind dem Fachmann bekannt.
  • Die E1a-, E1b- und E2a-Genprodukte lassen sich ebenso wie alle anderen gewünschten adenoviralen Genprodukte mit allen Mitteln, die ihre Expression in einer Zelle gestatten, bereitstellen. Dabei können die Gene jeweils auf einen getrennten Vektor, oder ein oder mehrere Gene können auf dem gleichen Vektor vorliegen. Bei dem Vektor kann es sich um einen beliebigen im Fachgebiet bekannten oder vorstehend offenbarten Vektor handeln, einschließlich Plasmide, Cosmide und Viren. Die Einführung des das Genprodukt umfassenden Vektors in die Wirtszelle kann mit allen im Fachgebiet bekannten oder wie oben offenbarten Mitteln, einschließlich Transfektion, Infektion u.a., erreicht werden. Die adenoviralen Genprodukte, vor allem E1 und E2a, können in das Genom der Wirtszelle stabil integriert, als Episom stabil exprimiert oder transient exprimiert werden. Dabei können entweder alle Gene transient, auf einem Episom oder stabil integriert exprimiert werden, oder es können einige der Gene stabil exprimiert werden, während andere transient exprimiert werden. Weiterhin können die Promotoren für die adenoviralen Gene jeweils unabhängig aus einem konstitutiven Promotor, einem induzierbaren Promotor oder einem nativen adenoviralen Promotor ausgewählt werden. Die Promotoren können beispielsweise durch einen spezifischen physiologischen Zustand des Organismus oder der Zelle (d.h. durch den Differenzierungszustand oder in replizierenden oder ruhenden Zellen) oder durch exogen zugegebene Faktoren reguliert werden.
  • Die E1- und E2a-Promotoren können identisch oder verschieden sein. Zur Steuerung der Expression der Adenovirus-Gene in der Wirtszelle können gemäß der obigen Ausführungsformen verschiedene Promotoren verwendet werden, einschließlich konstitutiver, induzierbarer und nativer Promotoren. Dabei können alle Promotoren, die die Expression von E1a, E1b und E2a gestatten, eingesetzt werden, wobei die Proteine von den gleichen oder von verschiedenen Promotoren exprimiert werden können. Bei den Promotoren kann es sich jeweils um einen Promotor, der natürlicherweise mit dem 5'-flankierenden Bereich des Adenovirus-Gens assoziiert ist, oder um einen heterologen Promotor handeln.
  • In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform kann das E1-Genprodukt für die Zelle in Form einer Nukleinsäuresequenz, die sowohl E1a als auch E1b codiert, bereitgestellt werden. Bei der E1 umfassenden Nukleinsäure kann es sich, ohne darauf beschränkt zu sein, um ein Plasmid, ein Cosmid, einen Adenovirus/AAV-Hybridvektor, wie z.B. im US-Patent Nr. 5,856,152 beschrieben, ein Retrovirus oder eine andere Art von Virus handeln. Die Expression des E1a-Gens kann entweder durch einen induzierbaren oder einen konstitutiven Promotor gesteuert werden. Sobald die E1a-Expression durch seinen Promotor initiiert worden ist, aktiviert die E1a-Produktion den nativen E1b-Promotor, was zur Expression von E1b führt. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem das E1-Gen tragenden Molekül um ein Plasmid, das in einer transfizierten Wirtszelle transient existieren kann. Vorzugsweise existiert die Nukleinsäuresequenz oder das Plasmid stabil als Episom in der Wirtszelle oder ist in die Chromosomen der Wirtszelle integriert, so daß die E1a- und E1b-Genprodukte von der Wirtszelle stabil produziert werden.
  • In einer Ausführungsform wird das E1a-Gen (und anschließend das E1b-Gen) unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, des RSV-LTR-Promotor/Enhancer, des Immediate Early CMV-Promotor/Enhancer, des SV40-Promotors, des Dihydrofolatreductase-Promotors, des zytoplasmatischen β-Actin-Promotors und des Phosphoglycerinkinase (PGK) -Promotors, exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird zur Expression der E1-Genprodukte ein induzierbarer Promotor eingesetzt, um so die Menge und den Zeitpunkt der Produktion der E1a- und E1b-Genprodukte durch die Zelle, die nach übermäßiger Akkumulation toxisch für die Zelle sein können, zu kontrollieren [siehe z.B. William S.M. Wold, J. Cell. Biochem., 53:329-335 (1993); J. Nevins, Current Opinion in Genetics and Development, 4:130-134 (1994); E. Harrington et al., Current Opinion in Genetics and Development, 4:120-129 (1994); G. Evan et al., Current Opinion in Cell Biology, 7:825-834 (1995); J. Nevins, Science, 258:424 (1992)]. Zu den induzierbaren Promotoren gehören die im Fachgebiet bekannten sowie die oben erörterten Promotoren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, des mit Zink induzierbaren Promotors von Schaf-Metallothionin (MT); des mit Dexamethason (Dex) induzierbaren Promotors des MMTV (mouse mammary tumor virus); des T7-Promotors; des **Ecdyson-Promotors aus Insekten; des Tetracyclinreprimierbaren Systems; des Tetracyclin-induzierbaren Systems; des RU486-induzierbaren Systems; und des Rapamycin-induzierbaren Systems. Jede Art von induzierbarem Promotor, die streng reguliert ist und für eine E1-Expression auf hohem Niveau sorgt, kann verwendet werden. Als weitere Arten von induzierbaren Promotoren können in diesem Zusammenhang solche geeignet sein, die durch einen spezifischen physiologischen Zustand, z.B. Temperatur, akute Phase, einen besonderen Differenzierungszustand der Zelle, oder nur in replizierenden Zellen reguliert werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Adenovirus-DNA, die das E2a-Genprodukt exprimiert, für die Wirtszelle in Form einer Nukleinsäuresequenz bereitgestellt werden, die auch einen die Expression des E2a-Genprodukts steuernden Promotor sowie weitere optionale Regulationskomponenten beinhaltet, bereitgestellt werden [?]. Wie oben beschrieben, kann das Nukleinsäuremolekül für die Zelle in einer beliebigen Form bereitgestellt werden, einschließlich Transfektion oder Infektion, und kann in der Zelle transient oder vorzugsweise stabil als Episom oder integriert in die Chromosomen der Zelle existieren. Bei dem Promotor für E2a kann es sich um einen konstitutiven, induzierbaren oder nativen Promotor, wie oben erörtert, handeln.
  • Während es sich bei dem die Expression des E2a-Genprodukts kontrollierenden Promotor in bestimmten Ausführungsformen um einen konstitutiven Promotor handeln kann, ist in einer bevorzugten Ausführungsform der Promotor ein induzierbarer Promotor, um so die Menge und den Zeitpunkt der Erzeugung des E2a-Genprodukts (das bei übermäßiger Anhäufung für die Zelle toxisch ist [D. Brough et al., Virology, 190:624-634 (1992) und D. Klessig et al., Virus Res., 1:169-188 (1984)]) relativ zur Produktion der E1-Genprodukte zu kontrollieren. Siehe 2 und Beispiel 2. Eine bevorzugte Ausführungsform sieht vor, daß es sich bei dem die Produktion von E2a steuernden Promotor um einen von dem die Expression von E1a und E1b steuernden Promotor verschiedenen Promotor handelt und dadurch induzierbar ist, daß er einem anderen Induktionsmittel ausgesetzt wird, als dem, das für den induzierbaren E1-Promotor verwendet wird.
  • Reagiert jeder die Expression der E1- und E2a-Genprodukte kontrollierende induzierbare Promotor auf ein anderes Induktionsmittel, so können der Zeitpunkt und damit das Verhältnis der E1- und E2a-Genprodukte in der Wirtszelle durch Zuführung des entsprechenden Induktionsmittels kontrolliert werden. Eine solche Kontrolle des Verhältnisses von E1-Genprodukt zu E2a-Genprodukt in der Zelllinie kann die Produktionsgeschwindigkeit des in der Zelllinie produzierten rAAV verbessern. Siehe z.B. Beispiel 2 und 3.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Promotor für E2a um dessen nativen Promotor. Sobald die Expression von E1 durch dessen Promotor initiiert worden ist, aktiviert E1 den nativen E2a-Promotor, was zur Expression von E2a führt. Auf diese Weise können die adenoviralen Gensequenzen von lediglich einem einzigen Promotor, nämlich dem für E1a, kontrolliert werden. Sobald E1a exprimiert wird, aktiviert es die Expression von E1b und E2a. Darüber hinaus aktiviert E1 auch die Expression weiterer adenoviraler Gene, wie z.B. E4ORF6 und VAI RNA, über deren native Promotoren. Daher wird mit diesem System ein vereinfachtes Verfahren zur Produktion derjenigen adenoviralen Gene, die zur rAAV-Produktion in einem Zellsystem benötigt werden, bereitgestellt.
  • Die Auswahl der entsprechenden Promotoren für die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung kann von einem Fachmann im Sinne der vorliegenden Erfindung mit Bezugnahme auf Faktoren, wie z.B. der Art der Säugerzelle, ob das zu exprimierende Gen in der Zelle transient oder stabil als Episom oder integriert in der Zelle vorliegt, ebenso wie die Kulturbedingungen für die Zelle selbst, wenn sie zur Produktion von rekombinantem AAV verwendet wird, vorgenommen werden.
  • D. Wirtszellen
  • Die adenoviralen Genprodukte lassen sich in die Zellen mit allen anderen oben erörterten Verfahren, einschließlich Transfektion, Elektroporation, Zuführung von Liposomen, Membranfusionstechniken, DNA-beschichteten Hochgeschwindigkeitspellets, Virusinfektion und Protoblastenfusion, einführen.
  • Die Säugerwirtszelle kann ihrerseits aus einer beliebigen Säugerspezies ausgewählt sein, wie z.B. menschlichen Zellarten, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Zellen wie z.B. A549-, WEHI-, 3T3-, 10Tl/2-, BHK-, MDCK-, COS 1-, COS 7-, BSC 1-, BSC 40-, BMT 10-, VERO-, WI38-, HeLa-, 293-Zellen (die funktionelles adenovirales E1 exprimieren), Saos-, C2C12-, L-Zellen, HT1080-, HepG2-Zellen sowie primäre Fibroblasten, Hepatozyten und Myoblasten, die aus Säugern, einschließlich Mensch, Affe, Maus, Ratte, Kaninchen und Hamster, stammen. Die Auswahl der die Zellen bereitstellenden Säugerspezies stellt ebenso wie die Art der Säugerzelle, d.h. Fibroblast, Hepatozyt, Tumorzelle usw., keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung dar. Die Anforderungen an die verwendete Zelle bestehen darin, daß diese kein Adenovirus-Gen außer E1 und E2a tragen darf; daß sie kein anderes Virusgen enthalten darf, das zu einer homologen Rekombination eines kontaminierenden Virus während der Produktion von rAAV führen könnte; und daß sie zur Transfektion von DNA und Expression der transfizierten DNA fähig sein muß. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Zelle, in der rep und cap stabil transfiziert vorliegen, wie z.B. die B50-Zelllinie.
  • Wie oben erörtert, umfaßt die vorliegende Erfindung die folgenden veranschaulichenden Ausführungsformen:
    • (a) eine Zelle, die die AAv-rep- und -cap-Gene, die Adenovirus-Genprodukte E1 und E2a sowie das das Transgen umfassende Nukleinsäuremolekül exprimiert;
    • (b) eine Zelle, die die auf einem Episom vorliegenden oder in die Chromosomen der Zelle integrierten AAV-rep- und -cap-Gene stabil exprimiert und die die Adenovirus-Genprodukte E1 und E2a sowie das das Transgen umfassende Nukleinsäuremolekül transient exprimiert;
    • (c) eine Zelle, die wenigstens eines der AAv-rep- und -cap-Gene sowie die Adenovirus-Genprodukte E1 und E2a (oder funktionelle Fragmente davon) stabil exprimiert und die das das Transgen umfassende Nukleinsäuremolekül transient exprimiert;
    • (d) eine Zelle, die das AAv-rep-Gen, das AAV-cap-Gen, die Adenovirus-Gene E1a, E1b und E2a (oder funktionelle Fragmente davon) stabil als ein oder mehrere Episomen oder als integrierte DNA exprimiert und die das Transgen-enthaltende Nukleinsäuremolekül transient exprimiert; und
    • (e) eine Zelle, die die AAV-rep- und -cap-Gene, die Adenovirus-Genprodukte E1 und E2a sowie das das Transgen umfassende Nukleinsäuremolekül stabil exprimiert.
  • Eine beispielhafte Wirtszelle der vorliegenden Erfindung unter der obigen Option C ist die rep und cap stabil exprimierende B-50-Zelle, die mit der Andenovirus-E1- und -E2a-DNA sowie dem oben beschriebenen Transgen-enthaltenden Nukleinsäuremolekül transfiziert wird. Diese Wirtszelle ist ausführlich unter Beispiel 1 unten beschrieben, wobei B-50 mit prAAVCMVLacZ, pMMTVE2a und pPGKE1 transfiziert wurde. Weitere stabile, rep/cap exprimierende Zelllinien, wie z.B. die im US-Patent Nr. 5,658,785 beschriebenen, können ebenso in ähnlicher Weise eingesetzt werden.
  • Die Herstellung einer Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt mit Techniken, wie z.B. dem Zusammenfügen ausgewählter DNA-Sequenzen. Dieses Zusammenfügen läßt sich unter Nutzung herkömmlicher Techniken bewerkstelligen. Zu solchen Techniken gehören cDNA- und genomische Klonierung, die allgemein bekannt ist und in Sambrook et al. und Ausubel et al., vorstehend zitiert, beschrieben ist, die Verwendung überlappender Oligonukleotidsequenzen der Adenovirus- und AAV-Genome, in Kombination mit der Polymerasekettenreaktion, Syntheseverfahren sowie alle anderen geeigneten Verfahren, mit denen die gewünschte Nukleotidsequenz bereitgestellt wird.
  • Die Einführung der Moleküle (als Plasmide oder Viren) in die Wirtszelle kann ebenso unter Verwendung von Techniken, wie sie dem Fachmann bekannt sind und in der gesamten Beschreibung erörtert werden, bewerkstelligt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Standardtransfektionstechniken verwendet, z.B. CaPO4-Transfektion oder Elektroporation und/oder Infektion mit Adenovirus/AAV-Hybridvektoren in Zelllinien wie z.B. der menschlichen embryonalen Nierenzelllinie HEK 293 (eine menschliche Nierenzelllinie, die funktionelle Adenovirus-E1-Gene enthält und trans-wirkende E1-Proteine bereitstellt) sowie die B50-Zelllinien (eine HeLa-Zelllinie, die stabil integrierte rep- und cap-Gene enthält).
  • II. Erfindungsgemäßes Verfahren
  • Wie oben beschrieben, können die verschiedenen Ausführungsformen der Wirtszellen in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung, d.h. einem Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus in Abwesenheit von kontaminierendem Helfer-Virus oder Wildtyp-Virus, eingesetzt werden. Dieses Verfahren erfolgt dadurch, daß man die folgenden Schritte durchführt:
    • (a) Kultivierung einer Säugerwirtszelle, die ein von invertierten terminalen Wiederholungssequenzen des Adeno-assoziierten Virus flankiertes Transgen unter der Kontrolle von dessen Expression steuernden Regulationssequenzen, eine AAV-rep-Sequenz und eine AAV-cap-Sequenz unter der Kontrolle von deren Expression steuernden Regulationssequenzen sowie die zur Expression eines E1a-Genprodukts, eines E1b-Genprodukts und eines E2a-Genprodukts benötigte kleinstmögliche adenovirale DNA enthält, unter Verwendung einer der oben beschriebenen Ausführungsformen der Wirtszellen; und
    • (b) Isolierung eines rekombinanten AAV, das das Transgen exprimiert, aus der Zelle oder Zellkultur in Abwesenheit von kontaminierendem Helfervirus oder Wildtyp-AAV.
  • Zu den in diesem Verfahren eingesetzten herkömmlichen Techniken gehören die Klonierung der viralen rAAV-Genome sowie Verfahren zur Messung der Signalerzeugung, u.ä. Dabei wird kein Reinigungsschritt benötigt, um die "Message" oder das Signal nachzuweisen oder um das rAAV von anderen Viren zu trennen. Im allgemeinen werden bei der Produktion herkömmliche Reinigungstechniken, wie z.B. Chloridgradientenzentrifugation oder Säulenchromatographie, verwendet, um das rAAV aus den zellulären Proteinen im Lysat aufzukonzentrieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens werden die adenoviralen E1- und E2a-Genprodukte unter der Kontrolle von wenigstens einem induzierbaren Promotor exprimiert. Somit umfaßt das folgende Verfahren weiterhin den Schritt des Inkontaktbringens der kultivierten Wirtszellen mit wenigstens einem Induktionsmittel, das die Expression von wenigstens einem der benötigten Adenovirus-Genprodukte kontrolliert. Siehe z.B. Beispiel 1 und 4 unten. Enthält die Wirtszelle die Andenovirus-Genprodukte jeweils unter der Kontrolle eines unterschiedlichen induzierbaren Promotors, so umfaßt das Verfahren weiterhin die Schritte der Zugabe eines ersten Induktionsmittels für den ersten induzierbaren Promotor sowie eines zweiten Induktionsmittels für den zweiten induzierbaren Promotor zu der Wirtszellenkultur. Diese Ausführungsform des Verfahrens gestattet somit die zelluläre Expression der adenoviralen E1a und E1b-Genprodukte in einem gewünschten Verhältnis zur Expression des adenoviralen E2a-Genprodukts, wobei das Verhältnis für die rAAV-Produktion in der jeweiligen Wirtszelle unter geeigneten Kulturbedingungen für diese Zelle optimal ist. Siehe z.B. Beispiele 2 und 3 unten.
  • Die Bestimmung eines geeigneten Verhältnisses von E1-Genprodukten zu E2a-Genprodukten sowie der AAV-rep/cap-Produkte kann von einem Fachmann durchgeführt werden, wobei die Zellart, die Stärke der verwendeten konstitutiven und/oder induzierbaren Promotoren, die Mengen der (des) verwendeten Induktionsmittels) sowie die Reihenfolge bzw. der Zeitpunkt der Induktion bevorzugter Genprodukte berücksichtigt werden. Das optimale Verhältnis, das die höchste rAAV-Produktion gestattet, kann je nachdem, wie sich diese Faktoren unterscheiden, unterschiedlich sein. So stellte sich beispielsweise heraus, daß ein Verhältnis von 5,2:1 von E1-haltigem Plasmid zu E2a-haltigem Plasmid das optimale Verhältnis in Beispiel 2 unten darstellte. Siehe z.B. 2. So mußte ein gewisses Maß an Routineexperimenten durchgeführt werden, um das optimale Verhältnis in jedem einzelnen Fall zu beurteilen, wie in Beispielen 2 und 3 gezeigt wird. Wird beispielsweise das E1a-Gen von einem schwachen oder mittelstarken konstitutiven Promotor kontrolliert, so sollte das E2a-Gen von einem starken induzierbaren Promotor kontrolliert und das Induktionsmittel frühzeitig zu der Kultur gegeben werden, um ein geeignetes Verhältnis zu erzielen. Wird das E1a-Gen ebenso wie das E2a-Gen von einem induzierbaren Promotor kontrolliert, so können die beiden Induktionsmittel in unterschiedlichen Mengen und in unterschiedlicher Induktionsreihenfolge zugegeben werden, um das optimale Produktionssystem für rAAV bereitzustellen. Solche Optimierungsexperimente, die zur Bestimmung bevorzugter Mengen und Reihenfolgen eingesetzt werden, liegen jedoch deutlich im Bereich des fachmännischen Könnens und stellen im Licht der hier aufgeführten Offenbarungen lediglich Routineprozeduren dar.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das E1a-Genprodukt unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors exprimiert, wobei die E1b- und E2a-Gene ebenso wie alle weiteren vorhandenen adenoviralen Gene (z.B. E4ORF6 und/oder VAI RNA) unter der Kontrolle ihres nativen Promotors exprimiert werden. Wie oben erörtert, aktiviert das E1a-Genprodukt die nativen Promotoren von E1b, E2a und allen weiteren adenoviralen Genen. Dabei läßt sich ein beliebiger induzierbarer Promotor verwenden, solange damit niedrige E1a-Grundniveaus exprimiert werden, wenn die Zelle nicht induziert ist, und hohe E1a-Niveaus exprimiert werden, wenn die Zelle mit einem Induktionsmittel in Kontakt gebracht wird. Eine Anzahl induzierbarer Promotoren ist im Fachgebiet bekannt und wurde bereits zuvor in dieser Beschreibung erörtert. Zu den spezifischen induzierbaren Promotoren gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, der mit Zink induzierbare Promotor aus Schaf-Metallothionin (MT), der mit Dexamethason (Dex) induzierbare Promotor des MMTV (mouse mammary tumor virus); der Ecdyson-Promotor aus Insekten; das Tetracyclin-reprimierbare System; das Tetracyclininduzierbare System; das RU486-induzierbare System sowie das Rapamycin-induzierbare System.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen mehrere bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren. Diese Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollen keine Beschränkung des Umfangs der Erfindung darstellen.
  • BEISPIEL 1: AD-HELFERGENE UND rAAV-PRODUKTION IN B-50-ZELLEN
  • A. Plasmide
  • Die unten beschriebenen Plasmidkonstruktionen wurden mit herkömmlichen gentechnischen Verfahren, wie z.B. den in Sambrook et al., vorstehend zitiert, beschriebenen, durchgeführt.
  • (1) prAAVCMVLacZ (auch prAAVLacZ)
  • Bei dem Plasmid prAAVCMVLacZ [siehe internationale Patentanmeldung Nr. WO95/13598 für SEQ ID NO: 1; und Fisher K.J. et al., J. Virol., 70:520-532 (1996)] handelt es sich um eine rAAV-Kassette, in der die AAV-rep- und -cap-Gene durch ein β-Galactosidase von einem CMV-Promotor aus exprimierendes Minigen ersetzt sind. Die lineare Anordnung von prAAVCMVLacZ umfaßt:
    • (a) die 5'-AAV-ITR (Bp 1-173), erhalten durch PCR unter Verwendung von pAV2 [C.A. Laughlin et al., Gene, 23:65-73 (1983)] als Matrize [Nukleotide Nr. 365-538 der SEQ ID NO:1];
    • (b) einen Immediate Early Enhancer/Promotor des CMV [Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985); Nukleotide Nr. 563-1157 der SEQ ID NO:1],
    • (c) ein SV40-Intron als optionale Spacer-Sequenzen (Nukleotide Nr. 1178-1179 der SEQ ID NO:1],
    • (d) das Transgen, E.coli-beta-Galactosidase-cDNA (Nukleotide Nr. 1356-4827 der SEQ ID NO:1),
    • (e) ein optionales SV40-Polyadenylierungssignal (ein 237 großes BamHI-BclI-Restriktionsfragment, das die Spalt/Poly-A-Signale sowohl der frühen als auch der späten Transkriptionseinheiten enthält; Nukleotide Nr. 4839-5037 der SEQ ID NO:1) und
    • (f) 3'-AAV-ITR, erhalten aus pAV2 als ein SnaBI-BglII-Fragment (Nukleotide Nr. 5053-5221 der SEQ ID NO:1). Bei dem Rest des Plasmids handelt es sich einfach um das Plasmidgerüst aus einem pBR322-Derivat.
  • (2) pPGKE1
  • pPGKE1 ist ein auf pUC18 basierendes Plasmid, in dem eine heterologe Maus-PGK-Promotorsequenz inseriert ist, die die Expression des E1-Genbereichs (m.u. 1,42 bis 10,5) von Ad5 reguliert. Dieses Plasmid, das im Labor der Erfinder hergestellt wurde, enthält auch ein Neomycin-Resistenzgen als selektionierbaren Marker.
  • (3) pMMTVE2a
  • pMMTVE2a ist ein retrovirales Plasmid, in das der mit Dexamethason induzierbare Promotor des MMTV (murine mammary tumor virus) zur Regulationskontrolle des Ad5-E2a-Gens eingesetzt wurde. Das Plasmid wurde wie folgt konstruiert. Ein ClaI/KpnI-Fragment mit einer 1128 ßp großen MMTv-Promotor-Sequenz und einem 2372 ßp großen E2a-DBP-Gen wurde aus pMSGDBP-EN [D.E. Brough et al., Virol., 190:624-634 (1992)] isoliert. Dieses Fragment wurde in ein retrovirales Plasmid pLJ, ein auf pBR322 basierendes Plasmidgerüst mit den Maloney-Retrovirus-LTRs und einem Neomycin-Resistenzgen [zur Verfügung gestellt durch das Labor der Erfinder], nach einer Auffüllreaktion der SalI-Stelle kloniert.
  • (4) pCMVORF6
  • pCMVORF6 ist ein Plasmid, das eine Immediate Early Enhancer/Promotor-Sequenz des CMV enthält, die die Expression des E4 ORF6-Genbereichs von Ad5 reguliert. Es wurde hergestellt, indem pCMVβ [Clontech] mit NotI verdaut wurde, das βgal-Gen entfernt und das ORF6-Fragment, hergestellt mittels PCR [siehe z.B. F.J. Fisher et al., J. Virol., 520-532 (1996)] unter Auffüllen inseriert wurde.
  • (5) pAdVAI
  • pAdVAI ist ein kommerziell erhältliches Plasmid [Promega], das das Ad5-VAI-Gen unter der Kontrolle seines nativen Promotors enthält.
  • B. Experimentelle Vorschrift
  • Kurz gefaßt handelt es sich bei B-50 um eine Zelle, die die rep- und cap-Gene des AAV Typ 2 unter der Kontrolle des homoologen p5-Promotors stabil exprimiert. Diese Zellinie ist durch die Integration mehrerer Kopien (mindestens 5 Kopien) der P5-rep-cap-Genkassetten in einer konkatameren Form in das Wirtschromosom gekennzeichnet. Diese B-50-Zellinie wurde bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA, am 18. September 1997 unter der Zugangsnr. CRL-12401 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt.
  • B-50-Zellen wurden geteilt und mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro Platte in 60-mm-Platten ausgesät. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen mit einem Gemisch aus prAAVCMVLacZ-Plasmid-DNA und unterschiedlichen Kombinationen der folgenden Plasmid-DNA-Konstrukte: pPGKE1, pMMTVE2a, pCMVORF6 und pVAI (zur ausführlichen Beschreibung siehe X-Achse in 1) transfiziert, wobei DOTAP als Transfektionsreagenz verwendet wurde (Boehringer Mannheim). Als Induktionsmittel wurde Dexamethason zum Zeitpunkt der Transfektion in einer Endkonzentration von 10 μM in das Medium gegeben.
  • Sechsundneunzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen zusammen mit Transfektionsmedium mittels Schabern geerntet und jeweils dreimal in Ethanol-Trockeneis eingefroren und in einem 37°C warmen Wasserbad aufgetaut. Die Zellen wurden dann in einer Tischzentrifuge bei 3000 UpM und 4°C 15 Minuten zentrifugiert. Von jedem Lysat wurde jeweils ein Zehntel zur 24stündigen Infektion von 84-31 Zellen, einer E1/E4-Doppelkomplementationszellinie, die mit rAAV transduzierbar ist, verwendet. Die 84-31 Zellen wurden dann histochemisch mit X-Gal angefärbt. Die Anzahl an blauen Zellen in jeder Infektion wurde bestimmt und auf der Y-Achse der 1 jeweils als infektiöse Einheiten (Infectious Units, IU; 1 IU wurde als eine gezählte blaue Zelle definiert) rAAVLacZ, produziert pro Transfektion, aufgetragen.
  • C. AAV-Produktion
  • rAAV wurde auf einem Niveau von >1000 IU produziert, wenn das das Transgen tragende cis-Plasmid prAAVLacZ in Gegenwart des durch pPGKE1 gelieferten AdE1, des durch pMMTVE2a gelieferten E2a und des von der Zellinie gelieferten rep/cap transfiziert wurde.
  • Im Gegensatz dazu produzierten alle anderen Kombinationen von Adenovirus-Genen in diesen Kulturen entweder kein rAAV oder produzierten weniger als 300 IU. So wird beispielsweise in Spalte 1 der 1 ein rAAV beschrieben, das auf einem Niveau von <100 IU produziert wurde, wenn das das Transgen LacZ tragende cis-Plasmid prAAVLacZ in Gegenwart des durch pPGKE1 gelieferten AdE1 kultiviert wurde und die rep/cap-Proteine in der Zelle in Abwesenheit von AdE2a vorhanden waren. In Spalte 2 ist ein rAAV-Produktionsniveau von <250 IU gezeigt, wenn das das gleiche Transgen tragende cis-Plasmid prAAVLacZ in Gegenwart des von pMMTVE2a gelieferten AdE2a und des von der Zelle gelieferten rep/cap, jedoch ohne AdE1, transfiziert wurde. In Spalte 6 ist ein rAAV-Produktionsniveau von 200 IU gezeigt, wenn das das gleiche Transgen tragende Plasmid prAAVLacZ in Gegenwart von AdE1, AdE2a, Ad E4 ORF6 und des von der Zellinie gelieferten rep/cap kultiviert wurde. Spalte 7 zeigt, daß eine rAAV-Produktion von <200 erzielt wurde, wenn das das Transgen tragende cis-Plasmid prAAVLacZ in Gegenwart der Gene AdE1, AdE2a, Ad E4 ORF6 und AdVAI in der gleichen Zellinie kultiviert wurde. In Spalte 10 ist eine rAAV-Produktion von etwa 275 IU bei Vorhandensein des Transgens und der Gene AdE2a und AdVAI sowie bei Abwesenheit von AdE1 gezeigt. In Spalte 11 ist eine rAAV-Produktion von <100 bei Anwesenheit des Transgens, Ad E40RF6 und AdVAI gezeigt.
  • Keine rAAV-Produktion wurde erzielt, wenn das das Transgen tragende cis-Plasmid prAAVLacZ in Gegenwart:
    • (a) des Ad E4 ORF6-Gens und in Abwesenheit von AdE1 und AdE2a in der gleichen Zellinie (Spalte 3);
    • (b) des Ad VAI-Gens und in Abwesenheit von AdE1 und AdE2a in der gleichen Zellinie (Spalte 4);
    • (c) der Ad E2a- und Ad E4ORF6-Gene in der Zellinie in Abwesenheit von E1 (Spalte 8);
    • (d) der Ad E2a-, AdE4ORF6- und AdVAI-Gene in der Zellinie in Abwesenheit von E1 (Spalte 9);
    • (e) der Ad E1- und AdVAI-Gene in der Zellinie in Abwesenheit des E2a-Gens (Spalte 12); und
    • (f) der Ad E1- und AdE4 ORF6-Gene in der Zellinie in Abwesenheit des E2a-Gens (Spalte 13)
    kultiviert wurde.
  • Die Bereitstellung des Transgens in dem cis-wirkenden Plasmid, der AAV-rep- und -cap-Sequenzen durch die Zellinie und der AdE1- und AdE2a-Gene in einem transwirkenden Plasmid führte eindeutig zu einem dramatischen rAAV-Produktionsniveau.
  • BEISPIEL 2: MOLVERHÄLTNIS DES PLASMIDS MIT DEM E1-GEN ZU DEM PLASMID MIT DEM E2A-GEN UND rAAV-PRODUKTION IN B-50-ZELLEN.
  • Zur Optimierung der rAAV-Produktivität durch das helferfreie B-50/Transfektionssystem wurden B-50-Zellen mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro 60-mm-Platte 24 Stunden ausgesät und danach mit prAAVLacZ sowie einem Gemisch aus pPGKE1- und pMMTVE2a-Plasmid-DNAs in unterschiedlichen Molverhältnissen: 2,6:1, 0,9:1, 5,2:1 und 1,3:1, transfiziert. Sechsundneunzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellysate präpariert und das rAAVLacZ in jedem Lysat wie in Beispiel 1 beschrieben titriert.
  • Die Ergebnisse, die im Balkendiagramm der 2 dargestellt sind, zeigen, daß es bevorzugte Molverhältnisse der E1 enthaltenden Plasmide zu den E2a enthaltenden Plasmiden gibt, die eine verstärkte Produktion des rAAV gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gestatten. Unter diesen besonderen experimentellen Bedingungen wurde die größtmögliche rAAV-Produktion erzielt, wenn das Verhältnis in Gegenwart von Dexamethason, dem Induktionsmittel für den MMTV-Promotor, der die Expression von E2a kontrolliert, entweder 5,2:1 oder 0,9:1 betrug. Wie in 2 gezeigt, wurde in Abwesenheit des Induktionsmittels, d.h. keine E2a-Produktion, kein rAAV produziert. Interessanterweise wurde kein rAAV produziert, wenn das Verhältnis 1,3:1 betrug, obwohl bei dem Verhältnis von 2,6:1 eine gute Menge an rAAV produziert wurde. Man nimmt an, daß dieses Ergebnis an Unterschieden in der Effizienz der Transfektionen liegt.
  • BEISPIEL 3: HELFERFREIE rAAV-PRODUKTION IN A549-ZELLEN.
  • Zur Verifizierung der Entdeckung, daß lediglich die Ad E1- und -E2-Gene zur Bereitstellung der Helferfunktionen für die rAAV-Produktion notwendig sind, wurde das Verfahren der vorliegenden Erfindung an anderen Säugerzellinien, wie z.B. HEK293-Zellen, in denen ein E1-Gen unter einem konstitutiven Promotor integriert ist, und A549-Zellen (menschliche Lungenkarzinomzel len), die keine Adenovirus-Gene enthalten, ausprobiert.
  • Bei P5-Rep/Cap handelt es sich um ein in diesem Experiment verwendetes Plasmid, das die AAV-rep- und cap-Sequenzen unter der Kontrolle des nativen AAV-Promotors P5 trägt. Dieses Plasmid wurde wie folgt konstruiert: die MT-Promotor- und ORF6-Sequenzen wurden durch EcoRI/BamHI-Verdauung aus dem Plasmid pMTE4ORF6 [G.P. Gao et al., J. Virol., 70:8934-8943 (1996)] entfernt und durch ein 4,3 kB großes P5-Rep/Cap-Fragment, das durch XbaI-Verdauung aus dem Plasmid pSub201 [Samulski, R.J. et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)] isoliert wurde, ersetzt. Die Plasmidkonstruktion erfolgte mit herkömmlichen gentechnischen Verfahren, wie z.B. den in Sambrook et al., vorstehend zitiert, beschriebenen.
  • Von beiden Zellarten, HEK293 und A549, wurde jeweils eine Kultur mit prAAVCMVLacZ sowie einem Gemisch aus pP5-Rep/Cap (auch als pTrans bezeichnet), pPGKE1 und pMMTVE2a in unterschiedlichen Molverhältnissen kotransfiziert. Die Molverhältnisse von Rep/Cap zu E1-haltigem Plasmid zu E2a-haltigem Plasmid waren wie folgt: 3,2:2,6:1, 3,2:5,2:2; 3,2:7,8:1; 1,6:2,6:4; 1,6:10,4:1; 1,6:0:5 (d.h. kein E1); 1,6:13:0 (d.h. kein E2a); und 3,2:0:4 (d.h. kein E1). PadWt (eine Plasmid-DNA mit einem intakten Ad5-Genom) diente als positive Kontrolle. Wie oben beschrieben, wurde das Induktionsmittel Dexamethason dem Medium zum Zeitpunkt der Transfektion in einer Endkonzentration von 10 μM zugegeben. Sechsundneunzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellysate präpariert.
  • Das in jeder Transfektion produzierte rAAVLacZ wurde wie in Beispiel 1 beschrieben getitert. In diesem Experiment wurde durch die Kotransfektion der HEK293-Zellen mit pP5-Rep/Cap, prAAVCMVLacZ, pPGKE1 und pMMTVE2a bei keinem der Molverhältnisse ein rAAVLacZ erzeugt. Dies liegt vermutlich an einer Überexpression des E1-Genprodukts vor der Einführung des Induktionsmittels Dexamethason für das E2a-Plasmid.
  • Wie in 3 dargestellt, wurden mit diesem Verfahren unter Verwendung des Verhältnisses 3,2/5,2/2 ungefähr 2000 infektiöse Einheiten von rAAV in A549-Zellen produziert. Dabei ist anzumerken, daß mit einem Plasmid, das das gesamte Komplement an Ad-Helfergenen enthält, pAdWt, über 9000 infektiöse Einheiten rAAV produziert wurden.
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß die Adenovirusgene E1 und E2a eine ausreichende Helferfunktion liefern, um die rAAV-Produktion in mit AAV-rep/cap und dem das Transgen enthaltenden cis-Plasmid transfizierten A549-Zellen zu gestatten.
  • BEISPIEL 4: VERWENDUNG VON INDUZIERBAREM E1 UND EINEM AD/AAV-HYBRIDVEKTOR ZUR PRODUKTION VON rAAV IN B-50-ZELLEN
  • B-50-Zellen werden mit einem Plasmid, das das E1-Gen operativ verknüpft mit einem induzierbaren Promotor enthält, stabil transfiziert. Falls der induzierbare Promotor Rapamycin-induzierbar [Magari et al., J. Clin., Invest., 100:2865-2872 (1997)], Ecdysoninduzierbar [No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)]; RU486-induzierbar [Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) und Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)], Tet-induzierbar [Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)] oder Tetreprimierbar [Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Rossi et al., Nat. Genet., 20:389-393 (1998)] ist, so wird ein den entsprechenden Aktivator- und/oder Repressorfaktor (je nach System) codierender Vektor ebenfalls stabil in die B-50-Zellen transfiziert, wie in den Literaturangaben beschrieben. Die B-50-Zellen enthalten das Neomycin-Resistenzgen und sind gegenüber G-418 (Geneticin) resistent. Somit müssen die das induzierbare E1 und die Aktivator- und/oder Repressorfaktoren codierenden Plasmide einen anderen selektionierbaren Marker als Neomycin enthalten. Beispielhafte selektionierbare Marker sind Hygromycin- oder Puromycinresistenz. Stabile Transfektantenkolonien werden in Gegenwart von das entsprechende Antibiotikum (d.h. entweder Hygromycin oder Puromycin) enthaltenden Kulturmedien selektioniert und individuell expandiert. Individuelle Klone werden hinsichtlich der Kriterien, daß E1 weitgehend fehlt, wenn der Induktor nicht vorhanden ist, und daß hohe Niveaus an E1 vorhanden sind, wenn der Induktor vorhanden ist, beurteilt. Klone werden ebenso hinsichtlich der Fähigkeit des induzierten E1, die rep- und cap-Genexpression in den B-50-Zellen zu aktivieren, beurteilt.
  • B-50-Zellen werden in einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro 60-mm-Platte 24 Stunden ausgesät. Vierundzwanzig Stunden später wird das Aussaatmedium (DMEM/10% FBS, supplementiert mit Antibiotika) durch DMEM/2% FBS und das Induktionsmittel für den induzierbaren E1a-Promotor ersetzt. Die Zellen werden mit Ad.AV.CMVLacZ-Hybridklonen bei einer entsprechenden MOI infiziert. Das Ad.AV.CMVLacZ-Hybrid ist im US-Patent Nr. 5,856,152 beschrieben. Bei dem Ad/AV.CMVLacZ-Hybrid handelt es sich im wesentlichen um ein Adenovirus, das ein rekombinantes AAV-Genom (AV.CMVLacZ), das die E1a- und E1b-Ad5-Sequenzen ersetzt, enthält, wobei dieses rekombinante AAV-Genom eine lineare Anordnung:
    • (a) des 5'-AAV-2ITR (ßp 1-173);
    • (b) eines Immediate Early Enhancer/Promotor des CMV;
    • (c) eines SV40-Introns;
    • (d) der E.coli-Beta-Galactosidase-cDNA;
    • (e) eines SV40-Polyadenylierungssignals (ein 237 großes Bam HI-BclI-Restriktionsfragment, das die Spalt-/Poly-A-Signale sowohl von den frühen als auch den späten Transkriptionseinheiten enthält); und
    • (f) 3'-AAV-ITR, erhalten aus pAV2 als SnaBI-BglI- Fragment, aufweist.
  • In alternativen Ausführungsformen kann der CMV-Promotor (b) durch einen anderen induzierbaren, konstitutiven, gewebespezifischen oder nativen Promotor ersetzt werden; das SV40-Intron (c) und SV40-Polyadenylierungssignal (e) können durch andere Introns und Polyadenylierungssignale ersetzt oder deletiert werden; und die beta-Galactosidase-cDNA (d) kann durch ein beliebiges anderes Gen, einschließlich eines anderen Markergens oder eines therapeutischen Gens, ersetzt werden.
  • Vierundzwanzig Stunden bis sechsundneunzig Stunden nach der Infektion werden die Zellysate präpariert und das rAAVLacZ in jedem Lysat wie in Beispiel 1 beschrieben getitert.
  • In einer alternativen Ausführungsform wird das Induktionsmittel 24 Stunden nach der Infektion der Zellen mit dem Ad/AAV-Hybrid zugegeben.
  • In weiteren Ausführungsformen enthält das Ad/AAV-Hybrid zusätzlich zu den rAAV-Sequenzen lediglich das E2a-Gen und die adenoviralen Gene E4ORF6 und/oder VAI RNA. In dieser Ausführungsform ist das E2a-Gen, selbst wenn es im Ad/AAV-Hybrid enthalten ist, auch auf dem Vektor mit dem induzierbaren E1-Gen enthalten. Der Vektor mit dem induzierbaren E1-Gen kann ebenso eine oder mehrere E4ORF6- oder VAI-RNA enthalten.
  • BEISPIEL 5: VERWENDUNG VON INDUZIERBAREM E1 UND EINEM rAAV-VEKTOR ZUR AMPLIFIKATION VON rAAV IN B-50-ZELLEN
  • B-50-Zellen werden mit einem Vektor, der das E1-Gen operativ verknüpft mit einem induzierbaren Promotor enthält, transfiziert und hinsichtlich der Expression wie in Beispiel 4 erörtert beurteilt. Der Vektor mit dem induzierbaren E1 enthält vorzugsweise E2a und kann E4ORF6- und/oder VAI-RNA beinhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform steht das E2a sowie die gegebenenfalls vorhandene E4ORF6- und VAI-RNA unter der Kontrolle ihrer nativen Promotoren.
  • B-50-Zellen werden in einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro 60-mm-Platte 24 Stunden ausgesät. Vierundzwanzig Stunden später wird das Aussaatmedium (DMEM/10% FBS, supplementiert mit Antibiotika) durch DMEM/2% FBS sowie das Induktionsmittel für den induzierbaren E1a-Promotor ersetzt. Die Zellen werden mit rAAVLacZ, das frei von rcAAV ist, bei einer entsprechenden MOI infiziert. Das rAAVLacZ kann mit einem beliebigen, im Fachgebiet bekannten Verfahren, wie z.B. dem in Beispiel 4 beschriebenen, produziert werden.
  • Vierundzwanzig Stunden bis sechsundneunzig Stunden nach der Infektion werden die Zellysate präpariert, und das rAAVLacZ wird in jedem Lysat wie in Beispiel 1 beschrieben getitert.
  • BEISPIEL 6: VERWENDUNG VON B-50-ZELLEN ZUR ENTWICKLUNG VON HELFER-UNABHÄNGIGEN PRODUKTIONSZELLINIEN FÜR rAAV
  • B-50-Zellen werden mit einem Vektor, der das E1-Gen operativ verknüpft mit einem induzierbaren Promotor enthält, stabil transfiziert und hinsichtlich Expression wie in Beispiel 4 erörtert beurteilt. Der Vektor enthält ebenso zumindest das E2a-Gen und rAAV. Der Vektor mit E1, E2a und rAAV kann ebenso E4ORF6- und VAI-RNA enthalten. Bei den Promotoren für das E2a und den gegebenenfalls vorhandenen E4ORF6- und VAI-RNA-Genen handelt es sich vorzugsweise um deren native Promotoren.
  • B-50-Zellen werden in einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro 60-mm-Platte 24 Stunden ausgesät. Vierundzwanzig Stunden später wird das Aussaatmedium (DMEM/10% FBS, supplementiert mit Antibiotika) durch DMEM/2% FBS sowie das Induktionsmittel für den induzierbaren E1a-Promotor ersetzt. Durch den Induktor wird die E1-Expression eingeschaltet, die wiederum die Expression der anderen adenoviralen Gene, die rep- und cap-Expression sowie die anschließende rAAV-Produktion auslöst.
  • Vierundzwanzig Stunden bis sechsundneunzig Stunden nach der Induktion werden die Zellysate präpariert, und das Lysat wird hinsichtlich rAAV-Produktion mittels eines beliebigen im Fachgebiet bekannten Verfahrens getitert. Falls es sich bei dem rAAV um rAAVLacZ handelt, kann das Lysat wie in Beispiel 1 beschrieben getitert werden.
  • BEISPIEL 7: PRODUKTION EINER HELFER-UNABHÄNGIGEN ZELLLINIE FÜR DIE rAAV-PRODUKTION
  • Zellen einer Zellinie (z.B. A549, HeLa, 3T3, 10T1/2, HT1080 oder HepG2) werden mit einem Vektor, der das E1-Gen operativ verknüpft mit einem induzierbaren Promotor enthält, stabil transfiziert und wie in Beispiel 4 erörtert hinsichtlich Expression beurteilt. Der Vektor enthält ebenso zumindest das E2a-Gen, rAAV sowie das rep- und cap-Gen. Der Vektor kann auch E4ORF6- und VAI-RNA enthalten. Bei dem Promotor für das E2a sowie den gegebenenfalls vorhandenen E4ORF6- und VAI-RNA-Genen handelt es sich vorzugsweise um deren nativen Promotor. Bei dem Promotor für rep und cap handelt es sich vorzugsweise um den P5-Promotor. Der selektionierbare Marker für die Transfektion kann Neomycin- oder Hygromycinresistenz sein.
  • Die stabil transfizierten Zellen werden in einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro 60-mm-Platte 24 Stunden ausgesät. Vierundzwanzig Stunden später wird das Aussaatmedium (DMEM/10% FBS, supplementiert mit Antibiotika) durch DMEM/2% FBS sowie das Induktionsmittel für den induzierbaren E1a-Promotor ersetzt. Durch den Induktor wird die E1-Expression eingeschaltet, die wiederum die Expression der anderen adenoviralen Gene, die rep- und cap-Expression sowie die anschließende rAAV-Produktion auslöst.
  • Vierundzwanzig Stunden bis sechsundneunzig Stunden nach der Induktion werden die Zellysate präpariert, und das Lysat wird hinsichtlich rAAV-Produktion mittels eines beliebigen im Fachgebiet bekannten Verfahrens getitert. Falls es sich bei dem rAAV um rAAVLacZ handelt, kann das Lysat wie in Beispiel 1 beschrieben getitert werden.
  • BEISPIEL 8: VERWENDUNG DER B-50-ZELLINIE UND DES AD/AAV-HYBRIDVEKTORS ZUR PRODUKTION EINER HELFER-UNABHÄNGIGEN ZELLINIE
  • Es wird ein rekombinanter Ad/AAV-Hybridvektor unter Verwendung der im US-Patent Nr. 5,856,152 beschriebenen Verfahren konstruiert, mit der Ausnahme, daß das E3-Gen deletiert und das mit dem RSV- oder PGK-Promotor operativ verknüpfte bzw. unter dessen Kontrolle stehende E1-Gen in den E3-Bereich des Adenovirus-Genoms kloniert wird. Der Ad/AAV-Hybridvektor wird wie im US-Patent Nr. 5,856,152 beschrieben verpackt.
  • B-50-Zellen werden in einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro 60-mm-Platte 24 Stunden ausgesät. Vierundzwanzig Stunden später wird das Aussaatmedium (DMEM/10% FBS, supplementiert mit Antibiotika) durch DMEM/2% FBS ersetzt. Die Zellen werden mit einem rekombinanten Ad/AAV-Klon, der E1 und das rAAV-Minigen enthält, bei einer entsprechenden MOI infiziert. Durch diese Ein-Schritt-Infektion von B-50-Zellen werden alle für die rAAV-Produktion benötigten Helfergene bereitgestellt. Somit besteht kein Bedarf an anderen Helferviren, wie z.B. sub100r.
  • Vierundzwanzig Stunden bis sechsundneunzig Stunden nach der Induktion werden die Zellysate präpariert, und das Lysat wird hinsichtlich rAAV-Produktion mittels eines beliebigen im Fachgebiet bekannten Verfahrens getitert. Falls es sich bei dem rAAV um rAAVLacZ handelt, kann das Lysat wie in Beispiel 1 beschrieben getitert werden.
  • BEISPIEL 9: VERWENDUNG DER B-50-ZELLINIE UND DES AD/AAV-HYBRIDVEKTORS ZUR PRODUKTION EINER HELFER-UNABHÄNGIGEN ZELLINIE
  • Es wird ein rekombinanter Ad/AAV-Hybridvektor unter Verwendung der im US-Patent Nr. 5,856,152 beschriebenen Verfahren konstruiert, und zwar mit den folgenden Änderungen:
    • (a) das E3-Gen des Adenovirus wird deletiert und durch eine Nukleinsäuresequenz ersetzt, die die AAV-ITRs, das Transgen und die mit dem Transgen assoziierten Regulationssequenzen umfaßt;
    • (b) das E1-Gen des Adenovirus wird nicht deletiert; und
    • (c) ein induzierbarer Promotor, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, eines oben beschriebenen Promotors (d.h. des Metallothionin (MT) -Promotors, des mit Dexamethason (Dex) induzierbaren MMTV-Promotors, des T7-Polymerase-Promotorsystems, des Ecdyson-Promotors aus Insekten, des Tetracyclin-reprimierbaren Systems, des Tetracyclin-induzierbaren Systems, des RU486-induzierbaren Systems und des Rapamycininduzierbaren Systems) wird mit dem nativen E1a-Gen operativ verknüpft, wobei der native E1b-Promotor intakt bleibt, um die Expression des E1b-Gens zu regulieren. In einer alternativen Ausführungsform werden die nativen E1a- und E1b-Promotoren verwendet.
  • Der Ad/AAV-Hybridvektor wird wie im US-Patent Nr. 5,856,152 beschrieben verpackt.
  • B-50-Zellen werden in einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro 60-mm-Platte 24 Stunden ausgesät. Vierundzwanzig Stunden später wird das Aussaatmedium (DMEM/10% FBS, supplementiert mit Antibiotika) durch DMEM/2% FBS sowie das Induktionsmittel für den induzierbaren E1a-Promotor ersetzt. Durch den Induktor wird die E1a-Expression eingeschaltet, die wiederum die Expression von E1b, die rep- und cap-Expression sowie die anschließende rAAV-Produktion auslöst. Falls der native E1a-Promotor verwendet wird, wird das Induktionsmittel nicht benötigt. Die Zellen werden mit einem rekombinanten Ad/AAV-Klon, der das E1-Adenovirus-Gen und das rAAV-Minigen enthält, bei einer entsprechenden MOI infiziert. Durch diese Ein-Schritt-Infektion von B-50-Zellen werden alle für die rAAV-Produktion benötigten Helfergene bereitgestellt. Somit besteht kein Bedarf an anderen Helferviren, wie z.B. sub100r.
  • Vierundzwanzig Stunden bis sechsundneunzig Stunden nach Induktion und Infektion werden die Zellysate präpariert, und das Lysat wird hinsichtlich rAAV-Produktion mittels eines beliebigen im Fachgebiet bekannten Verfahrens getitert. Falls es sich bei dem rAAV um rAAVLacZ handelt, kann das Lysat wie in Beispiel 1 beschrieben getitert werden.
  • Die oben identifizierte Patentschrift umfaßt zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung, von denen man erwarten darf, daß sie für den Fachmann offensichtlich sind. Dabei wird angenommen, daß solche an den Verfahren der vorliegenden Erfindung vorgenommenen Modifikationen und Veränderungen vom Umfang der unten angefügten Ansprüche umfaßt sind.

Claims (20)

  1. Säugerwirtszelle, umfassend: (a) ein Transgen unter Kontrolle von dessen Expression steuernden Regulationssequenzen, das von invertierten terminalen AAV-Wiederholungssequenzen flankiert ist; (b) eine AAV-rep-Sequenz und eine AAV-cap-Sequenz unter Kontrolle von deren Expression steuernden Regulationssequenzen; sowie (c) Adenovirus-DNA, die aus der zur Expression eines Adenovirus-E1a-Genprodukts, eines Adenovirus-E1b-Genprodukts und eines Adenovirus-E2a-Genprodukts benötigten kleinstmöglichen Adenovirus-DNA besteht.
  2. Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die Transgenregulationssequenzen einen aus der Gruppe, bestehend aus einem nativen Promotor für das Transgen, einem induzierbaren Promotor, einem gewebsspezifischen Promotor und einem konstitutiven Promotor, ausgewählten Promotor umfassen.
  3. Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei es sich bei der das E1a-Genprodukt exprimierenden DNA um eine Nukleinsäuresequenz handelt, die eine das E1a-Genprodukt codierende Adenovirus-DNA sowie einen ersten, die Expression des E1a-Genprodukts steuernden Promotor umfaßt; es sich bei der das E1b-Genprodukt exprimierenden DNA um eine Nukleinsäuresequenz handelt, die eine das E1b-Genprodukt codierende Adenovirus-DNA sowie einen zweiten, die Expression des E1b-Genprodukts steuernden Promotor umfaßt; und es sich bei der das E2a-Genprodukt exprimierenden DNA um eine Nukleinsäuresequenz handelt, die eine das E2a-Genprodukt codierende Adenovirus-DNA sowie einen dritten, die Expression des E2a-Genprodukts steuernden Promotor umfaßt.
  4. Wirtszelle nach Anspruch 3, wobei der erste Promotor aus einer Gruppe, bestehend aus einem nativen Promotor für E1a, einem induzierbaren Promotor und einem konstitutiven Promotor, ausgewählt ist; wobei der zweite Promotor aus einer Gruppe, bestehend aus einem nativen Promotor für E1b, einem induzierbaren Promotor und einem konstitutiven Promotor, ausgewählt ist; und wobei der dritte Promotor aus einer Gruppe, bestehend aus einem nativen Promotor für E2a, einem induzierbaren Promotor und einem konstitutiven Promotor, ausgewählt ist.
  5. Wirtszelle nach Anspruch 3, wobei der erste Promotor und der dritte Promotor nicht identisch sind.
  6. Wirtszelle nach Anspruch 3, wobei der erste Promotor und der dritte Promotor identisch sind.
  7. Wirtszelle nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem ersten Promotor und dem dritten Promotor um induzierbare Promotoren handelt.
  8. Wirtszelle nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem ersten Promotor oder dem dritten Promotor um einen induzierbaren Promotor handelt.
  9. Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei das Transgen aus (a) stabil in die Chromosomen der Wirtszelle integriert wird, in der Wirtszelle als Episom vorliegt oder transient in der Wirtszelle exprimiert wird; die AAV-rep- und -cap-Gene aus (b) stabil in die Chromosomen der Wirtszelle integriert werden, in der Wirtszelle als Episom vorliegen oder transient in der Wirtszelle exprimiert werden; und die DNA aus (c) stabil in die Chromosomen der Wirtszelle integriert wird, in der Wirtszelle als Episom vorliegt oder transient in der Wirtszelle exprimiert wird.
  10. Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei das Transgen und das E2a-Genprodukt der Wirtszelle mit einem Adenovirus/AAV-Hybridvektor zugeführt werden.
  11. Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei das Transgen der Wirtszelle mit einem rAAV zugeführt wird.
  12. Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei das Transgen sowie die zur Expression des E1a-Genprodukts und des E1b-Genprodukts benötigte DNA der Wirtszelle auf demselben Vektor zugeführt werden.
  13. Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei das Transgen sowie die zur Expression des E1a-Genprodukts, des E1b-Genprodukts und des E2a-Genprodukts benötigte DNA der Wirtszelle mit einem Adenovirus/AAV-Hybridvektor zugeführt werden, wobei in dem Vektor Adenovirus-E1a- und -E1b-Gensequenzen funktionell deletiert und durch das Transgen ersetzt werden und eine Adenovirus-E3-Gensequenz funktionell deletiert und durch die zur Expression des E1a-Genprodukts und des E1b-Genprodukts benötigte DNA ersetzt wird.
  14. Verfahren zur Herstellung von rekombinantem adenoassoziiertem Virus (rAAV) in Abwesenheit von kontaminierendem Helfervirus oder Wildtyp-Virus, umfassend den Schritt der Kultivierung der Wirtszelle aus Anspruch 1.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, weiterhin umfassend den Schritt der Reinigung des rAAV aus der Wirtszelle oder der Wirtszellkultur.
  16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die DNA aus einer einen ersten Promotor codierenden ersten Nukleinsäuresequenz und einer das E1a-Genprodukt codierenden Adenovirus-DNA, einer einen zweiten Promotor codierenden zweiten Nukleinsäuresequenz und einer das E1b-Genprodukt codierenden Adenovirus-DNA sowie einer einen dritten Promotor codierenden dritten Nukleinsäuresequenz und einer das E2a-Produkt codierenden Adenovirus-DNA besteht.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der erste Promotor aus der Gruppe, bestehend aus einem induzierbaren Promotor, einem konstitutiven Promotor und einem nativen Promotor für E1a, ausgewählt ist, der zweite Promotor aus der Gruppe, bestehend aus einem induzierbaren Promotor, einem konstitutiven Promotor und einem nativen Promotor für E1b, ausgewählt ist und der dritte Promotor aus der Gruppe, bestehend aus einem induzierbaren Promotor, einem konstitutiven Promotor und einem nativen Promotor für E2a, ausgewählt ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei von dem ersten Promotor, zweiten Promotor und dritten Promotor wenigstens einer ein induzierbarer Promotor ist, wobei das Verfahren weiterhin den Schritt der Zugabe eines ersten Induktionsmittels zur Induktion des induzierbaren Promotors zur Wirtszellkultur umfaßt.
  19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich bei dem ersten und dem dritten Promotor um unterschiedliche, jeweils die Expression des jeweiligen Genprodukts steuernde induzierbare Promotoren handelt.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, weiterhin umfassend die Schritte der Zugabe eines ersten Induktionsmittels zur Induzierung des ersten induzierbaren Promotors und eines zweiten Induktionsmittels zur Induzierung des zweiten induzierbaren Promotors zur Wirtszellkultur, wodurch das Verhältnis der exprimierten Genprodukte variiert werden kann, um die Produktion von rAAV in den Wirtszellen zu optimieren.
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