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JP2021072871A - アデノ随伴ウイルス第ｖｉｉｉ因子ベクター - Google Patents

アデノ随伴ウイルス第ｖｉｉｉ因子ベクター Download PDF

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JP2021072871A
JP2021072871A JP2021024332A JP2021024332A JP2021072871A JP 2021072871 A JP2021072871 A JP 2021072871A JP 2021024332 A JP2021024332 A JP 2021024332A JP 2021024332 A JP2021024332 A JP 2021024332A JP 2021072871 A JP2021072871 A JP 2021072871A
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Abstract

【課題】血友病Ａを治療するための遺伝子治療法において有用な、機能的な第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする新規のＡＡＶベクターを提供する。【解決手段】本発明は、機能的に活性なＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶベクター（本明細書では「ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター」と称される）を提供する。機能的に活性なＦＶＩＩＩをコードするゲノムは、好ましくは７．０ｋｂ長以下、より好ましくは６．５ｋｂ長以下、さらにより好ましくは６．０ｋｂ長以下、さらにより好ましくは５．５ｋｂ長以下、さらにより好ましくは５．０ｋｂ長以下であり、増強されたプロモーター機能を有する。また、本発明は、本明細書に記載されるＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを作製する方法および関連するその治療的用途に関する。【選択図】なし

Description

本出願は、全体が参照によって本明細書に援用される、２０１３年９月１２日に出願さ
れた米国仮特許出願第６１／８７７，０４２号の優先権を主張する。
本発明は、高い発現活性を有するＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターおよび完全長または切断
型の機能的ＦＶＩＩＩを発現するＡＡＶ ＦＶＩＩＩ ベクターを含む、アデノ随伴ウイ
ルス（ＡＡＶ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ベクターに関する。また、本発明は、本明
細書に記載されるＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを作製する方法および関連するその治療的
用途に関する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染する、小
型の複製欠損の無エンベロープの動物ウイルスである。ＡＡＶのいくつかの特徴により、
このウイルスは遺伝子治療による治療用タンパク質の送達のための魅力的な媒介物となっ
ており、例えば、ＡＡＶが、ヒト疾患を引き起こすことが知られておらず、軽度の免疫応
答を誘導すること、並びにＡＡＶベクターが、宿主細胞ゲノム内への組込みなしに分裂細
胞および休止細胞の両方に感染可能であることが挙げられる。ＡＡＶを用いる遺伝子治療
ベクターは、いくつかの臨床試験で、例えば、血友病Ｂの治療のためのヒト第ＩＸ因子（
ＦＩＸ）の肝臓への送達への使用が成功している（Nathwani et al., New Engl. J. Me
d.365:2357-2365, 2011）。
しかしながらＡＡＶ遺伝子治療ベクターにはいくつかの欠点がある。具体的には、ＡＡ
Ｖベクターのクローニング能力が、前記ウイルスのＤＮＡパッケージング容量の影響によ
り、限定されている。野生型ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムは約４．７キロ塩基（ｋｂ）で
ある。実際には、約５．０ｋｂ以下のＡＡＶゲノムが、ＡＡＶウイルス粒子の中に、完全
にパッケージングされている（すなわち、完全長）と思われる。ＡＡＶベクター内の核酸
ゲノムは約１４５塩基のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を２つ有していなければならな
いという要件により、ＡＡＶベクターのＤＮＡパッケージング容量は、最大約４．４ｋｂ
のタンパク質コード配列がキャプシド形成され得る。
このサイズ制限により、巨大な治療用遺伝子、すなわち、約４．４ｋｂ長よりも長い遺
伝子は、一般に、ＡＡＶベクターでの使用に適していない。そのような治療用遺伝子の１
つは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子であり、この遺伝子は、Ｎ末端からＣ末端へ、
１９アミノ酸のシグナルペプチド、および３つの巨大ドメイン（すなわち、重鎖またはＡ
ドメイン、中央またはＢドメイン、および軽鎖またはＣドメイン）を含む、２３３２アミ
ノ酸のポリペプチドをコードする約７．０ｋｂのｍＲＮＡを有する。ＦＶＩＩＩにおける
ＡＡＶベクターのサイズ制限を克服するために使用された戦略の１つは、２つのＡＡＶベ
クター、重鎖またはＡドメインをコードする一方のＡＡＶベクター、および軽鎖またはＣ
ドメインをコードするもう一方のＡＡＶベクターを使用することであった（例えば、Cout
u et al.、米国特許第６，２２１３４９号、同第６，２００，５６０号および同第７，
３５１，５７７号を参照）。このサイズ制限を回避する別の戦略は、ＦＶＩＩＩの中央部
分またはＢドメインが欠失しており、ＳＱ配列として知られる１４アミノ酸リンカーで置
換されているＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶベクターを作製することであった（Ward et
al.,Blood, 117:798-807, 2011、およびMcIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 20
13）。
５．０ｋｂよりも長いＡＡＶゲノムを有するＡＡＶベクターが文献で報告されているが
、これらの場合の多くで、コードされた遺伝子の５’末端または３’末端が切断されてい
ると思われる（Hirsch etal., Molec. Ther. 18-6-8, 2010、およびGhosh et al., Bi
otech.Genet.Engin. Rev. 24:165-178, 2007参照）。しかし、ＡＡＶ感染細胞において
、５’末端切断および３’末端切断を有する核酸の間で、重複した相同組換えが生じる結
果、前記巨大タンパク質をコードする「完全な」核酸が作製され、それにより、機能的な
完全長遺伝子が再構築されることが示されている。
血友病Ａを治療するための遺伝子治療法において有用な、機能的な第ＶＩＩＩ因子タン
パク質をコードする新規のＡＡＶベクターが必要とされている。従って、本発明は、ＡＡ
Ｖウイルス粒子が治療用タンパク質をコードする核酸全体をキャプシド形成することによ
り（すなわち、完全にパッケージングされたＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター）、ゲノムのサ
イズ超過という上記の問題を回避するような、または、切断されていてもされていなくて
もよい機能的に活性な第ＶＩＩＩ因子タンパク質を少なくとも生成するような、機能的に
活性なＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶベクターに関する。さらに、カプシドを対象とした
免疫応答を回避するために、ＡＡＶベクターは、カプシド粒子当たりで、最高の標的タン
パク質形質導入／発現活性を有しているべきである。本発明はまた、高い発現活性を有す
る完全ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの作製に関する。最後に、本発明は、本明細書に記載
されるＡＡＶ第ＶＩＩＩ因子ベクターを作製するための方法、およびそれを使用するため
の関連方法に関する。
米国特許第６，２２１，３４９号明細書 米国特許第６，２００，５６０号明細書 米国特許第７，３５１，５７７号明細書
本発明は、機能的に活性なＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶベクター（本明細書では「Ａ
ＡＶ ＦＶＩＩＩベクター」と称される）を提供する。機能的に活性なＦＶＩＩＩをコー
ドするゲノムは、好ましくは７．０ｋｂ長以下、より好ましくは６．５ｋｂ長以下、さら
により好ましくは６．０ｋｂ長以下、さらにより好ましくは５．５ｋｂ長以下、さらによ
り好ましくは５．０ｋｂ長以下であり、増強されたプロモーター機能を有する。
本明細書で使用される場合、「機能的に活性なＦＶＩＩＩ」は、培養細胞において発現
される場合のインビトロにおいて、または細胞もしくは体組織において発現される場合の
インビボにおいて、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質の機能性を有するＦＶＩＩＩタンパク質
である。これには、例えば、血液凝固が起こることを可能にすること、および血友病Ａを
患う対象において血液が凝固するのにかかる時間を短縮することが含まれる。野生型ＦＶ
ＩＩＩは、凝固カスケードを介した血液凝固に関与しており、活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）
の補助因子として働いて、カルシウムイオンおよびリン脂質の存在下で、第Ｘ因子（ＦＸ
）を活性化ＦＸ（ＦＸａ）に変換する複合体を形成する。従って、機能的に活性なＦＶＩ
ＩＩはＦＩＸａと複合体を形成し得、この複合体はＦＸをＦＸａに変換し得る。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」とは、転写調節エレメント、すなわち
、一つまたは複数のプロモーターおよび／またはエンハンサーに機能的に連結したタンパ
ク質コード配列、並びにポリアデニル化配列、並びに、所望により、前記タンパク質コー
ド配列のエクソン間に挿入された一つまたは複数のイントロン、に隣接しているＡＡＶ５
’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列およびＡＡＶ３’ＩＴＲを有する、一本鎖または二本鎖
の核酸を指す。一本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルス粒子のゲノム内に存在し、本明
細書で開示される核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかであり得る核酸を
指す。このような一本鎖核酸のサイズは塩基単位で与えられる。二本鎖ＡＡＶベクターは
、ＡＡＶベクター核酸を発現または遺伝子導入するために使用される、プラスミド（例え
ば、ｐＵＣ１９）のＤＮＡ内、または二本鎖ウイルス（例えば、バキュロウイルス）のゲ
ノム内に存在する核酸を指す。このような二本鎖核酸のサイズは塩基対（ｂｐ）単位で与
えられる。
用語「逆方向末端反復（ＩＴＲ）」とは、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ複製の開
始点として、およびウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしてシスに機能する、Ａ
ＡＶゲノムの５’末端および３’末端に存在する、当該技術分野において認知されている
領域を指す。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と一緒になって、宿主細胞ゲ
ノムからの除去およびレスキュー、並びに宿主細胞ゲノムへの２つの隣接するＩＴＲ間に
挿入されたヌクレオチド配列の組込みを効率的に提供する。ある特定のＡＡＶ関連ＩＴＲ
の配列は、Yan etal., J. Virol. 79(1):364-379 (2005)（その全体が参照によって本
明細書に援用される）により開示されている。
「転写調節エレメント」は、遺伝子転写の調節に関与する遺伝子のヌクレオチド配列を
指し、例えば、転写因子が結合することで、ＲＮＡポリメラーゼの結合を助け、発現を促
進する、プロモーター、並びに応答エレメント、アクチベーターおよびエンハンサー配列
、並びに抑制タンパク質が結合することで、ＲＮＡポリメラーゼの結合を阻止し、発現を
妨げる、オペレーターまたはサイレンサー配列が含まれる。用語「肝臓特異的転写調節エ
レメント」は、肝組織特異的に遺伝子発現を調節する調節エレメントを指す。肝臓特異的
調節エレメントの例としては、限定はされないが、マウスサイレチン（thyretin）プロモ
ーター（ｍＴＴＲ）、内在性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター（Ｆ８）、ヒトα１アンチ
トリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）およびその活性断片、ヒトアルブミン最小プロモー
ター、並びにマウスアルブミンプロモーターが挙げられる。Ｅｎｈ１と共に、ＥＢＰ、Ｄ
ＢＰ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６等の、肝臓特異的転写因子結合部位に由
来するエンハンサーも考慮される。
一実施形態では、本発明のＡＡＶベクターは、１４アミノ酸ＳＱ配列によって置換され
たＢドメインを有する機能的に活性なＦＶＩＩＩをコードする、すなわち、ＦＶＩＩＩ
ＳＱをコードする核酸を含む。ＳＱ配列は、Ward et al., Blood, 117:798-807, 2011、
およびMcIntosh etal., Blood 121:3335-3344, 2013において開示されている。ＦＶＩ
ＩＩコード領域配列は、コドンを最適化した配列である（Nathwani et al.、２０１３年
１月２４日に公開された米国特許出願公開第２０１３／００２４９６０Ａ１号（その全体
が参照によって本明細書に援用される）、およびMcIntosh et al., Blood 121:3335-33
44, 2013を参照）。この配列は「ＵＣＬ ＳＱ ＦＶＩＩＩ」と本明細書では称される。
第１の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、図２Ａに模式的に示されるＰｒｏｔｏ１
を含み、配列番号１に記載される核酸配列を含む。
第２の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、図２Ｂに模式的に示されるＰｒｏｔｏ１
Ｓを含み、配列番号２に記載される核酸配列を含む。
第３の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、図２Ｃに模式的に示されるＰｒｏｔｏ２
Ｓを含み、配列番号３に記載される核酸配列を含む。
第４の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、図２Ｄに模式的に示されるＰｒｏｔｏ３
Ｓを含み、配列番号４に記載される核酸配列を含む。
別の実施形態では、本発明のＡＡＶベクターは、ＳＱ配列を含むＢドメイン全体、およ
び軽鎖またはＣドメインのすぐＮ末端側に位置するａ３ドメインを欠失しているＦＶＩＩ
Ｉをコードする核酸を含む。ＦＶＩＩＩコード領域配列はコドンを最適化した配列である
（Nathwani etal.、２０１３年１月２４日に公開された米国特許出願公開第２０１３／
００２４９６０Ａ１号（その全体が参照によって本明細書に援用される）、およびMcInto
sh et al.,Blood 121:3335-3344, 2013を参照）。
第１の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、図３Ａに模式的に示されるＰｒｏｔｏ４
を含み、配列番号５に記載される核酸配列を含む。
第２の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、図３Ｂに模式的に示されるＰｒｏｔｏ５
を含み、配列番号６に記載される核酸配列を含む。
第３の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、図３Ｃに模式的に示されるＰｒｏｔｏ６
を含み、配列番号７に記載される核酸配列を含む。
第４の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、図３Ｄに模式的に示されるＰｒｏｔｏ７
を含み、配列番号８に記載される核酸配列を含む。
別の実施形態では、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ５’逆方向末端反復（ＩＴ
Ｒ）、肝臓特異的転写調節領域、コドンを最適化した機能的に活性なＦＶＩＩＩコード領
域、所望により一つまたは複数のイントロン、ポリアデニル化配列、およびＡＡＶ２ ３
’ＩＴＲを含む核酸を含む。好ましい実施形態では、肝臓特異的転写調節領域は、短縮型
ＡｐｏＥエンハンサー配列、１８６塩基ヒトα抗トリプシン（ｈＡＡＴ）近位プロモータ
ー（５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の４２塩基を含む）、並びに（ｉ）３４塩基ヒトＡｐｏＥ
／Ｃ１エンハンサー、（ｉｉ）３２塩基ヒトＡＡＴプロモーター 遠位Ｘ領域および（ｉ
ｉｉ）ヒトＡＡＴ近位プロモーターの遠位エレメントの８０の追加塩基からなる群から選
択される一つまたは複数のエンハンサーを含み；コドンを最適化した機能的に活性なＦＶ
ＩＩＩコード領域はＦＶＩＩＩ ＳＱバリアントをコードする。別の好ましい実施形態で
は、肝臓特異的転写調節領域は、ａ１ミクログロブリン・エンハンサー配列および１８６
塩基ヒトα抗トリプシン（ＡＡＴ）近位プロモーターを含む。
第１の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号９に記載される核酸配列を含む
コンストラクト１００ＡＴＧを含む。
第２の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号１０に記載される核酸配列を含
むコンストラクト１００ＡＴＧ ｂＧＨポリＡを含む。
第３の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号１１に記載されるコンストラク
ト１００ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡ配列を含む。
第４の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号１２に記載される核酸配列を含
むコンストラクト１０３ＡＴＧを含む。
第５の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号１３に記載される核酸配列を含
むコンストラクト１０３ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡを含む。
第６の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号１４に記載される核酸配列を含
むコンストラクト１０５ＡＴＧ ｂＧＨポリＡを含む。
第７の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号１５に記載される核酸配列を含
むコンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩを含む。
第８の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号１６に記載される核酸配列を含
むコンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ｈＡＡＴを含む。
第９の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号１７に記載される核酸配列を含
むコンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩを含む。
第１０の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号１８に記載される核酸配列を
含むコンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ｈＡＡＴを含む。
第１１の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号１９に記載される核酸配列を
含むコンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩを含む。
第１２の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号２０に記載される核酸配列を
含むコンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ２×μ−グロブリ
ン・エンハンサーを含む。
第１３の態様では、本発明のＡＡＶベクター 配列番号２１に記載される核酸配列を含
むコンストラクト１００ＡＴＧ 短ポリＡ ２×μ−グロブリン・エンハンサー。
第１４の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号２２に記載される核酸配列を
含むコンストラクト第ＶＩＩＩ因子−ＢＭＮ００１を含む。
第１５の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号２３に記載されるコンストラ
クト第ＶＩＩＩ因子−ＢＭＮ００２配列を含む。
第１６の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号２４に記載される核酸配列を
含むコンストラクト９９を含む。
第１７の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号２５に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１００を含む。
第１８の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号２６に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１００逆配向を含む。
第１９の態様では、本発明ＡＡＶベクター 配列番号２７に記載される核酸配列を含む
コンストラクト１００ＡＴ。
第２０の態様では、本発明のＡＡＶベクター 配列番号２８に記載される核酸配列を含
むコンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ。
第２１の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号２９に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ ｂＧＨポリＡを含む。
第２２の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号３０に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ（逆）ｂＧＨポリＡを含む。
第２３の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号３１に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１００ ｂＧＨポリＡを含む。
第２４の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号３２に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１００〜４００を含む。
第２５の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号３３に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１０１を含む。
第２６の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号３４に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１０２配列を含む。
第２７の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号３５に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１０３を含む。
第２９の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号３６に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１０３逆配向を含む。
第３０の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号３７に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１０３ＡＴを含む。
第３１の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号３８に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１０３ＡＴ ２×ＭＧを含む。
第３２の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号３９に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１０３ＡＴ ２×ＭＧ ｂＧＨポリＡを含む。
第３３の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号４０に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１０３ ｂＧＨポリＡを含む。
第３４の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号４１に記載される核酸配列を
含む核酸を含むコンストラクト１０４を含む。
第３５の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号４２に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１０５を含む。
第３６の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号４３に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１０６を含む。
第３７の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号４４に記載される核酸配列を
含むコンストラクト１０６ＡＴを含む。
第３８の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号４５に記載される核酸配列を
含むコンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴを含む。
さらに他の実施形態では、本発明は、機能的な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードす
るベクターコンストラクトに関し、前記コンストラクトは、一つまたは複数の異なる配向
の、上記コンストラクトおよびそれらの組合せの個々の成分のうちの一つまたは複数を含
む。本発明は、逆配向の上記コンストラクトにも関する。
本発明の一本鎖ＡＡＶベクターは、約７．０ｋｂ長未満、または６．５ｋｂ長未満、ま
たは６．４ｋｂ長未満、または６．３ｋｂ長未満、または６．２ｋｂ長未満、または６．
０ｋｂ長未満、または５．８ｋｂ長未満、または５．６ｋｂ長未満、または５．５ｋｂ長
未満、または５．４ｋｂ長未満、または５．４ｋｂ長未満、または５．２ｋｂ長未満また
は５．０ｋｂ長未満である。本発明の一本鎖ＡＡＶベクターは、約５．０ｋｂ長〜約６．
５ｋｂ長、約４．８ｋｂ長〜約５．２ｋ長、または４．８ｋｂ長〜５．３ｋｂ長、または
約４．９ｋｂ長〜約５．５ｋｂ長、または約４．８ｋｂ長〜約６．０ｋｂ長、または約５
．０ｋｂ長〜６．２ｋｂ長または約５．１ｋｂ長〜約６．３ｋｂ長、または約５．２ｋｂ
長〜約６．４ｋｂ長、または約５．５ｋｂ長〜約６．５ｋｂ長の範囲である。
別の実施形態では、本発明は、本発明のＡＡＶベクターのいずれかを含む組換えアデノ
随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を作製する方法を提供する。前記方法は、本発明のＡＡＶベ
クターのいずれかを形質移入された細胞を培養する段階、および形質移入された細胞の上
清から組換えＡＡＶを回収する段階を含む。
本発明の細胞は、バキュロウイルスに感染しやすいあらゆる細胞型であり、例えば、Ｈ
ｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓｆ９、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、
Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ
１、ＢＭ−Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５およびＡｏ３８等の昆虫細胞が挙げられる。使
用される好ましい哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＳＰ２／０
、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ、ＨＴ１０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ−７、ＡＲ
ＰＥ−１９およびＭＲＣ−５細胞であり得、例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、
ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ、ＨＴ１０８０、Ａ５４９
、Ｃｏｓ−７、ＡＲＰＥ−１９およびＭＲＣ−５細胞等の哺乳類細胞が挙げられる。
また本発明は、本発明のＡＡＶベクターのいずれかまたは前述の本発明の方法によって
作製されるあらゆるウイルス粒子を含むウイルス粒子を提供する。
「ＡＡＶウイルス粒子（AAV virion）」または「ＡＡＶウイルス粒子（AAV viral p
article）」または「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタン
パク質およびキャプシド形成したポリヌクレオチドＡＡＶベクターから構成されるウイル
ス粒子を指す。前記粒子は、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達される
予定の導入遺伝子等の、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、通常
、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。従って、このよう
なベクターはＡＡＶベクター粒子内に含有されることから、ＡＡＶベクター粒子の作製に
は必然的にＡＡＶベクターの作製が含まれる。
また本発明は、本発明のＡＡＶベクターのいずれかを含む細胞、およびこれらの本発明
の細胞によって産生されるウイルス粒子を提供する。
別の実施形態では、本発明は、血友病Ａを患う患者を治療する方法を提供し、前記方法
は、前記患者に、有効量の本発明のＡＡＶベクターのいずれか、または本発明のウイルス
粒子もしくは本発明の方法によって作製されるウイルス粒子を投与することを含む。
更なる実施形態では、本発明は、血友病Ａの治療用の薬剤を調製するための、本発明の
ＡＡＶベクターのいずれかの用途を提供する。一つの態様では、前記薬剤は、血友病Ａを
治療するのに有効な量でヒトＦＶＩＩＩを発現する、ある量のＡＡＶベクターを含む。
別の実施形態では、本発明は、血友病Ａの治療のための、本発明のＡＡＶベクターのい
ずれかを含む組成物を提供する。一つの態様では、前記組成物は、血友病Ａを治療するの
に有効な量でヒトＦＶＩＩＩを発現する、ある量のＡＡＶベクターを含む。
別の実施形態では、本発明のＡＡＶベクターは、血友病Ａを患う患者を治療するのに有
用なＡＡＶウイルス粒子を作製するために使用される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ＡＡＶ２ ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、肝臓特異的な転写調節領域、コドンを最適
化した機能的に活性なＦＶＩＩＩコード領域、所望により一つまたは複数のイントロン、
ポリアデニル化配列、およびＡＡＶ２ ３’ＩＴＲを含む核酸を含む、アデノ随伴ウイル
ス（ＡＡＶ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ベクター。
（項目２）
核酸が以下から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目１に記載のＡＡＶ
ＦＶＩＩＩ ベクター、
ｉ． 配列番号１に記載されるＰｒｏｔｏ１配列、
ｉｉ． 配列番号２に記載されるＰｒｏｔｏ１Ｓ配列、
ｉｉｉ． 配列番号３に記載されるＰｒｏｔｏ２Ｓ配列、
ｉｖ． 配列番号４に記載されるＰｒｏｔｏ３Ｓ配列、
ｖ． 配列番号５に記載されるＰｒｏｔｏ４配列、
ｖｉ． 配列番号６に記載されるＰｒｏｔｏ５配列、
ｖｉｉ． 配列番号７に記載されるＰｒｏｔｏ６配列、
ｖｉｉｉ． 配列番号８に記載されるＰｒｏｔｏ７配列、
ｉｘ． 配列番号９に記載されるコンストラクト１００ＡＴＧ配列、
ｘ． 配列番号１０に記載されるコンストラクト１００ＡＴＧ ｂＧＨポリＡ配列、
ｘｉ． 配列番号１１に記載されるコンストラクト１００ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡ配列、
ｘｉｉ． 配列番号１２に記載されるコンストラクト１０３ＡＴＧ配列、
ｘｉｉｉ． 配列番号１３に記載されるコンストラクト１０３ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡ配列
、
ｘｉｖ． 配列番号１４に記載されるコンストラクト１０５ＡＴＧ ｂＧＨポリＡ配列、
ｘｖ． 配列番号１５に記載されるコンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ配列、
ｘｖｉ． 配列番号１６に記載されるコンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ｈ
ＡＡＴ配列、
ｘｖｉｉ． 配列番号１７に記載されるコンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴＧ
ＦＶＩＩＩ配列、
ｘｖｉｉｉ． 配列番号１８に記載されるコンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴ
Ｇ ＦＶＩＩＩ ｈＡＡＴ配列、
ｘｉｘ． 配列番号１９に記載されるコンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴ ＡＴＧ
ＦＶＩＩＩ配列、
ｘｘ． 配列番号２０に記載されるコンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴ ＡＴＧ
ＦＶＩＩＩ ２×μ−グロブリン・エンハンサー配列、
ｘｘｉ． 配列番号２１に記載されるコンストラクト１００ＡＴＧ 短ポリＡ ２×μ−
グロブリン・エンハンサー配列、
ｘｘｉｉ． 配列番号２２に記載されるコンストラクト第ＶＩＩＩ因子−ＢＭＮ００１配
列、
ｘｘｉｉｉ． 配列番号２３に記載されるコンストラクト第ＶＩＩＩ因子−ＢＭＮ００２
配列、
ｘｘｉｖ． 配列番号２４に記載されるコンストラクト９９配列、
ｘｘｖ． 配列番号２５に記載されるコンストラクト１００配列、
ｘｘｖｉ． 配列番号２６に記載されるコンストラクト１００逆配向配列、
ｘｘｖｉｉ． 配列番号２７に記載されるコンストラクト１００ＡＴ配列、
ｘｘｖｉｉｉ． 配列番号２８に記載されるコンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ配列、
ｘｘｉｘ． 配列番号２９に記載されるコンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ ポリＡ配
列、
ｘｘｘ． 配列番号３０に記載されるコンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ（逆）ｂＧＨ
ポリＡ配列、
ｘｘｘｉ． 配列番号３１に記載されるコンストラクト１００ ｂＧＨポリＡ配列、
ｘｘｘｉｉ． 配列番号３２に記載されるコンストラクト１００〜４００配列、
ｘｘｘｉｉｉ． 配列番号３３に記載されるコンストラクト１０１配列、
ｘｘｘｉｖ． 配列番号３４に記載されるコンストラクト１０２配列、
ｘｘｘｖ． 配列番号３５に記載されるコンストラクト１０３配列、
ｘｘｘｖｉ． 配列番号３６に記載されるコンストラクト１０３逆配向配列、
ｘｘｘｖｉｉ． 配列番号３７に記載されるコンストラクト１０３ＡＴ配列、
ｘｘｘｖｉｉｉ． 配列番号３８に記載されるコンストラクト１０３ＡＴ ２×ＭＧ配列
、
ｘｘｘｉｘ． 配列番号３９に記載されるコンストラクト１０３ＡＴ ２×ＭＧ ポリＡ
配列、
ｘｌ． 配列番号４０に記載されるコンストラクト１０３ｂＧＨポリＡ配列、
ｘｌｉ． 配列番号４１に記載されるコンストラクト１０４配列、
ｘｌｉｉ． 配列番号４２に記載されるコンストラクト１０５配列、
ｘｌｉｉｉ． 配列番号４３に記載されるコンストラクト１０６配列、
ｘｌｉｖ． 配列番号４４に記載されるコンストラクト１０６ＡＴ配列、および
ｘｌｖ． 配列番号４５に記載されるコンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴ配列。
（項目３）
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を作製する方法であって、
Ａ）項目１または２に記載のＡＡＶベクターを形質移入された細胞を培養し；
Ｂ）形質移入された細胞の上清から組換えＡＡＶ粒子を回収することを含む、
上記方法。
（項目４）
項目１または２に記載のウイルスベクターを含むウイルス粒子。
（項目５）
項目１または２に記載のウイルスベクターを含む細胞。
（項目６）
患者に有効量の項目１または２に記載のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを投与することを
含む、血友病Ａを患う患者を治療する方法。
（項目７）
血友病Ａの治療用薬剤を調製するための、項目１または２に記載のＡＡＶ ＦＶＩＩＩ
ベクターの用途。
（項目８）
血友病Ａの治療用の、項目１または２に記載のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを含む組成
物。
図１はＵＣＬ ＳＱベクターの模式図を示している。左から右に、ＵＣＬ ＳＱベクターは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、野生型ＡＡＶ２ウイルス配列、３４塩基ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサー、３２塩基ヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域、１８６塩基ヒトＡＡＴプロモーター（４２塩基の５’ＵＴＲ配列を含む）、コドンを最適化したヒトＦＶＩＩＩ ＳＱ配列（Nathwani et al.、２０１３年１月２４日に公開された米国特許出願公開第２０１３／００２４９６０Ａ１号（その全体が参照によって本ん明細書に援用される）、およびMcIntosh etal., Blood 121:3335-3344, 2013を参照）、４９塩基合成ポリアデニル化配列、野生型ＡＡＶ２ウイルス配列、およびＡＡＶ２ ３’ＩＴＲを含む。ＵＣＬ ＳＱベクターは５０８１塩基長である。 図２は、Ｐｒｏｔｏ１、Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、Ｐｒｏｔｏ２ＳおよびＰｒｏｔｏ３Ｓベクターの模式図および配列を示している。 Ｐｒｏｔｏ１ベクターの模式図。 ＵＣＬ ＳＱベクター（図１参照）から開始して、外来性野生型ＡＡＶ２ウイルス配列を除去し、ヒトＡＡＴ ５’ＵＴＲとヒトＦＶＩＩＩコード領域との間の、およびヒトＦＶＩＩＩ終止コドンと合成ポリアデニル化配列との間の、制限酵素認識部位に対応する配列を除去した。 Ｐｒｏｔｏ１Ｓ ベクターの模式図。Ｐｒｏｔｏ１ベクターから開始して、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲの３’末端における１０塩基および３’ＩＴＲの５’末端における１０塩基を除去した。 Ｐｒｏｔｏ２Ｓベクターの模式図。Ｐｒｏｔｏ１Ｓベクターから開始して、ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーおよびヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域を、ヒトＦＶＩＩＩ配列のエクソン１およびエクソン２の間に挿入された１００塩基 合成イントロン内に移動した。矢印で示されるように、ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーおよびヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域の配向は、Ｐｒｏｔｏ１Ｓでのそれらの配向と比較して反転している。 Ｐｒｏｔｏ３Ｓ ベクターの模式図。Ｐｒｏｔｏ２Ｓから開始して、ヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域を、逆配向のヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーの第２コピーで置換した。 図３は、Ｐｒｏｔｏ４、Ｐｒｏｔｏ５、Ｐｒｏｔｏ６およびＰｒｏｔｏ７ベクターの模式図を示している。 Ｐｒｏｔｏ４ベクターの模式図。Ｐｒｏｔｏ１ベクターから開始して、ＳＱ配列およびａ３ドメインを削除した。 Ｐｒｏｔｏ５ ベクターの模式図。Ｐｒｏｔｏ４ベクターから開始して、１２９塩基ＦＶＩＩＩイントロンを、ヒト第ＶＩＩＩ因子配列のエクソン１およびエクソン２の間に挿入した。 Ｐｒｏｔｏ６ベクターの模式図。Ｐｒｏｔｏ５ベクターから開始して、ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーの第２コピーを、ＦＶＩＩＩイントロン内に順配向で挿入した。 （Ｄ）Ｐｒｏｔｏ７ベクターの模式図。Ｐｒｏｔｏ５ベクターから開始して、ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーの第２コピーを、ＦＶＩＩＩイントロン内に逆配向で挿入した。 図４Ａ〜図４ＫＫは、改善されたプロモーター／エンハンサー配列を有するＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの模式図を示している。 コンストラクト１００ＡＴＧの模式図。 コンストラクト１００ＡＴＧ ｂＧＨポリＡの模式図。 コンストラクト１００ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡの模式図。 コンストラクト１０３ＡＴＧの模式図。 コンストラクト１０３ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡの模式図。 コンストラクト１０５ＡＴＧ ｂＧＨポリＡの模式図。 コンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩの模式図。 コンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ｈＡＡＴの模式図。 コンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩの模式図。 コンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ｈＡＡＴの模式図。 コンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩの模式図。 コンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ２×μグロブリン・エンハンサーの模式図。 コンストラクト１００ＡＴＧ 短ｂＧＨポリＡ ２×μグロブリン・エンハンサーの模式図。 コンストラクト第ＶＩＩＩ因子−ＢＭＮ００１の模式図。 コンストラクトＦＶＩＩＩ−ＢＭＮ００２の模式図。 コンストラクト９９の模式図。 コンストラクト１００の模式図。 コンストラクト１００逆配向の模式図。 コンストラクト１００ＡＴの模式図。 コンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧの模式図。 コンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ ｂＧＨポリＡの模式図。 コンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ（逆） ｂＧＨポリＡの模式図。 コンストラクト１００ ｂＧＨポリＡ。 コンストラクト１００〜４００の模式図。 コンストラクト１０１の模式図。 コンストラクト１０２の模式図。 コンストラクト１０３の模式図。 コンストラクト１０３逆配向の模式図。 コンストラクト１０３ＡＴの模式図。 コンストラクト１０３ＡＴ ２×ＭＧの模式図。 コンストラクト１０３ＡＴ ２×ＭＧ ｂＧＨポリＡの模式図。 １０３ｓｂＧＨポリＡの模式図。 コンストラクト１０４の模式図。 コンストラクト１０５の模式図。 コンストラクト１０６の模式図。 コンストラクト１０６ＡＴの模式図。 コンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴの模式図。 図５は、Ｒａｇ２マウスにおけるＰｒｏｔｏコンストラクトの評価の結果を示しており、Ｐｒｏｔｏ１が野生型と同様にＦＶＩＩＩを形質導入することを示している。 図６は、Ｐｒｏｔｏ１、Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、Ｐｒｏｔｏ２ＳおよびＰｒｏｔｏ３Ｓが、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質（図５）並びにＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ ＤＮＡ（図６）を発現することを示している。 同上。 図８は、プロモーターコンストラクトの改善がＦＶＩＩＩの発現を増加させることを示している。 同上。 同上。
大容量ＡＡＶベクターは５’末端でランダムに切断されており、５’ＡＡＶ ＩＴＲを
欠いている。ＡＡＶは一本鎖ＤＮＡウイルスであり、センス鎖またはアンチセンス鎖のい
ずれかをパッケージングしているため、大容量ＡＡＶベクター内のセンス鎖は５’ＡＡＶ
ＩＴＲを欠いており、標的タンパク質をコードする遺伝子の５’末端の一部を欠いてい
る可能性があり、大容量ＡＡＶベクター内のアンチセンス鎖は３’ＩＴＲを欠いており、
標的タンパク質をコードする遺伝子の３’末端の一部を欠いている可能性がある。標的細
胞内でのセンスおよびアンチセンス切断型ゲノムのアニーリングによって、大容量ＡＡＶ
ベクター感染細胞内で機能的な導入遺伝子が産生される。
本発明は、機能的に活性なＦＶＩＩＩ、すなわち、完全にパッケージングされたＡＡＶ
ＦＶＩＩＩベクターまたは高い発現活性を有するＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターをコード
するＡＡＶベクターを提供する。本発明のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターは、発現／粒子が
改善されており、ＡＡＶウイルス生産効率が改善され、精製が簡易化されている。一つま
たは複数のイントロンをＦＶＩＩＩタンパク質コード領域に導入することで、発現が増強
される。エンハンサーの数および位置付けを再設定することによっても発現が増強される
。
ＵＣＬ ＳＱベクター
ＵＣＬ ＳＱベクターは、Nathwani et al.、２０１３年１月２４日に公開された米国
特許出願公開第２０１３／００２４９６０Ａ１号（その全体が参照によって本明細書に援
用される）、およびMcIntosh etal., Blood 121:3335-3344, 2013に詳細に記載されて
いるが、このベクターは、大容量、すなわち５．０ｋｂ超の、ＡＡＶベクターである。図
１に示すように、ＵＣＬ ＳＱベクターは、左から右に、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）５
’ＩＴＲ、野生型ＡＡＶ２ウイルス配列、３４塩基ヒトアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ
）／Ｃ１エンハンサー、３２塩基ヒトα抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター遠位Ｘ領域
、１８６塩基ヒトＡＡＴプロモーター（４２塩基の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列を含む
）、Ｂドメインが１４アミノ酸のＳＱ配列で置換されているコドンを最適化したヒトＦＶ
ＩＩＩ配列、４９塩基合成ポリアデニル化配列、野生型ＡＡＶ２ウイルス配列、およびＡ
ＡＶ２ ３’ＩＴＲを含む。ＵＣＬ ＳＱベクターは５０８１塩基長である。
Nathwani etal.、２０１３年１月２４日に公開された米国特許出願公開第２０１３／
００２４９６０Ａ１号、およびMcIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013において
示されているように、ＵＣＬ ＳＱベクターは、機能的に活性なＦＶＩＩＩをインビトロ
およびインビボで発現する。
Ｐｒｏｔｏ１ベクター、Ｐｒｏｔｏ１Ｓベクター、Ｐｒｏｔｏ２ＳベクターおよびＰｒｏ
ｔｏ３Ｓベクター
大容量ＡＡＶベクターの問題を回避するため、および／またはＡＡＶベクターの発現を
増加させるために、本発明は、ＦＶＩＩＩ ＳＱバリアントをコードする、完全にパッケ
ージングされた、より小型の、すなわち５．０ｋｂ未満の、ＡＡＶベクターを提供する。
Ｐｒｏｔｏ１の配列の４９７０ｂｐヌクレオチド配列は配列番号１に記載される。
ＡＡＶベクターＰｒｏｔｏ１を作製するために、ＵＣＬ ＳＱベクターと比較して、機
能的に活性なＦＶＩＩＩの生産に不要と思われる配列を除去した。実施例１に示されるよ
うに、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲの３’側のＡＡＶ２ウイルス配列の５３塩基、ＡＡＶ２ ３
’ＩＴＲの５’側のＡＡＶ２ウイルス配列の４６塩基、およびコドンを最適化したＦＶＩ
ＩＩ ＳＱコード領域に隣接した１１塩基を含む、１１０塩基の外来性ＤＮＡを除去した
。得られるＰｒｏｔｏ１ベクターは４９７０塩基長である。設計した際、Ｐｒｏｔｏ１ベ
クターが機能的ＦＶＩＩＩポリペプチドをインビトロまたはインビボで発現可能であるか
どうかは不明であった。
ＡＡＶベクターＰｒｏｔｏ１Ｓを作製するために、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲの３’末端に
おける１０塩基、およびＡＡＶ３２ ３’ＩＴＲの５’末端における１０塩基を、Ｐｒｏ
ｔｏ１ベクターから除去した。得られるＰｒｏｔｏ１Ｓベクターは４９５０塩基長である
。Ｐｒｏｔｏ１Ｓの配列のヌクレオチド配列は配列番号２に記載される。
ＡＡＶベクターＰｒｏｔｏ２Ｓを作製するために、合成した１００塩基のイントロンを
、Ｐｒｏｔｏ１Ｓベクター内のコドンを最適化したＦＶＩＩＩ ＳＱ配列のエクソン１お
よびエクソン２の間に挿入した。３４塩基のＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーおよび３２塩基
のヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域をヒトＡＡＴプロモーターの上流から除去し、合成
イントロン内に逆配向（これらのエレメントがヒトＡＡＴプロモーターの上流に位置して
いる場合の配向と比較して）に挿入した。得られるＰｒｏｔｏ２Ｓベクターは４９８３塩
基長である。Ｐｒｏｔｏ２Ｓの配列のヌクレオチド配列は配列番号３に記載される。
ＡＡＶベクターＰｒｏｔｏ３Ｓを作製するために、ヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域
をＰｒｏｔｏ２Ｓベクターから除去し、逆配向の３４塩基ＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーの
第２コピーで置換した。得られるＰｒｏｔｏ３Ｓベクターは４９８４塩基長である。Ｐｒ
ｏｔｏ３Ｓの配列のヌクレオチド配列は配列番号４に記載される。
Ｐｒｏｔｏ４ベクター、ＰｒｏｔｏＳベクター、Ｐｒｏｔｏ６ベクターおよびＰｒｏｔｏ
７ベクター
ＡＡＶベクターのサイズを減少させるため、および／またはＡＡＶベクターの発現を増
加させるために、本発明は、完全にパッケージングされた、小型の、すなわち５．０ｋｂ
未満の、Ｂドメインおよびａ３ドメイン欠失ＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶベクターも提
供する。
ＡＡＶベクターＰｒｏｔｏ４を作製するために、１４アミノ酸ＳＱ配列およびＣドメイ
ンに隣接して位置するａ３ドメインを、Ｐｒｏｔｏ１ベクターから除去した。除去された
ＦＶＩＩＩ配列の合計量は、５５アミノ酸または１６５塩基である。得られるＰｒｏｔｏ
４ベクターは４８０５塩基長である。Ｐｒｏｔｏ４の配列のヌクレオチド配列は配列番号
５に記載される。
ＡＡＶベクターＰｒｏｔｏ５を作製するために、１２９塩基の切断型ＦＶＩＩＩイント
ロンを、Ｐｒｏｔｏ４ベクター内のコドンを最適化したＦＶＩＩＩ配列のエクソン１およ
びエクソン２の間に挿入した。得られるＰｒｏｔｏ５ベクターは４９３４塩基長である。
Ｐｒｏｔｏ５の配列のヌクレオチド配列は配列番号６に記載される。
ＡＡＶ Ｐｒｏｔｏ６ベクターを作製するために、３４塩基のＦＶＩＩＩイントロンを
、Ｐｒｏｔｏ５ベクター内の順配向の３４塩基 ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーの第２
コピーで置換した。得られるＰｒｏｔｏ６ベクターは４９３４塩基長である。Ｐｒｏｔｏ
６の配列のヌクレオチド配列は配列番号７に記載される。
ＡＡＶ Ｐｒｏｔｏ７ベクターを作製するため、３４塩基のＦＶＩＩＩイントロンを、
Ｐｒｏｔｏ５ベクター内の逆配向の３４塩基 ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーの第２コ
ピーで置換した。得られるＰｒｏｔｏ７ベクターは４９３４塩基長である。Ｐｒｏｔｏ７
の配列のヌクレオチド配列は配列番号８に記載される。
向上したプロモーター／エンハンサー配列を有する追加のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター
Ｂドメインおよびａ３ドメイン欠失ＦＶＩＩＩの発現を増加させるために、強力なプロ
モーターを有する大容量ＡＡＶベクターを作製し、これらのコンストラクトを、改変され
たエンハンサー配列および／またはプロモーター配列を伴って作製した。いくつかの実施
形態では、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターは、切断型の機能的ＦＶＩＩＩを発現する。これ
らのコンストラクトは、ＡｐｏＥ ＨＣＲもしくはその断片、μ−グロブリン・エンハン
サーもしくはその断片、ヒトα１アンチトリプシン・プロモーター（ｈＡＡＴ）もしくは
その断片、セルピンＡエンハンサーもしくはその断片、ＬＰ１プロモーターエンハンサー
もしくはその断片、またはマクログロブリン・エンハンサーもしくはその断片等の、一つ
または複数のプロモーター配列およびエンハンサー配列を含む。これらのコンストラクト
は、ｂＧＨポリＡ配列または合成ウサギβ−グロビンポリＡ配列等のポリアデニル化配列
を含む。いくつかの実施形態では、前記コンストラクトは、ｈＡＡＴイントロンまたはヒ
トβ−グロビンイントロン等のイントロンまたはイントロンの断片を含む。
コンストラクト１００ＡＴＧは５５１１塩基長である。このコンストラクトは配列番号
９に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０〜５０
２はＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基５０９〜７２６はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基
７２７〜９１０は改変ヒトβグロビン第２イントロンであり、塩基９２３〜５２９６はコ
ドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５３０５〜５３５２は合成ウサギβグロビンポ
リＡであり、塩基５３６７〜５５１１は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１００ＡＴＧ ｂＧＨ ポリＡは５６８８塩基長である。このコンスト
ラクトは配列番号１０に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり
、塩基１６０〜５０２はＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基５０９〜７２６はｈＡＡＴプロモ
ーターであり、塩基７２７〜９１０は改変ヒトβグロビン第２イントロンであり、塩基９
２３〜５２９６はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５３０５〜５５２９はｂＧ
ＨポリＡであり、塩基５５４４〜５６８８は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１００ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡは５６１３塩基長である。このコンストラ
クトは配列番号１１に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、
塩基１６０〜５０２はＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基５０９〜７２６はｈＡＡＴプロモー
ターであり、塩基７２７〜９１０は改変ヒトβグロビン第２イントロンであり、塩基９２
３〜５２９６はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５３０５〜５４５４は短ｂＧ
ＨポリＡであり、塩基５４６９〜５６１３は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１０３ＡＴＧは５３６２塩基長である。このコンストラクトは配列番号
１２に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９〜３
４４は４コピーの４４ｂｐ ＡｐｏＥ反復であり、塩基３６０〜５７７はｈＡＡＴプロモ
ーターであり、塩基５７８〜７６１は改変ヒトβグロビン第２イントロンであり、塩基７
７４〜５１４７はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５１５６〜５２０３は合成
ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５２１８〜５３６２は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである
。
コンストラクト１０３ＡＴＧ短ｂＧＨポリＡは５４６４塩基長である。このコンストラ
クトは配列番号１３に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、
塩基１６９〜３４４は４コピーの４４ｂｐ ＡｐｏＥ反復であり、塩基３６０〜５７７は
ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基５７８〜７６１は改変ヒトβグロビン第２イントロン
であり、塩基７７４〜５１４７はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５１５６〜
５３０５はｂＧＨ短ポリＡであり、塩基５３２０〜５４６４は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲであ
る。
コンストラクト１０５ＡＴＧ ｂＧＨポリＡは６３５４塩基長である。このコンストラ
クトは配列番号１４に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、
塩基１７３〜５１２は２コピー（２×）の１７０ｂｐミクログロブリン・エンハンサーで
あり、塩基５１９〜７３６はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７３７〜９２０は改変ヒ
トβグロビン第２イントロンであり、塩基９３３〜５３０６はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩ
ＩＩであり、塩基５３１５〜５５３９はｂＧＨポリＡであり、塩基５５４６〜６１９５は
２コピー（２×）の３２５ｂｐ ＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基６２１０〜６３５４は３
’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩは６３０８塩基長である。このコンスト
ラクトは配列番号１５に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり
、塩基１６０〜４４９は２コピー（２×）の１４５ｂｐマクログロブリン・エンハンサー
であり、塩基４５０〜１３４７は８９８ｂｐ ｈＡＡＴプロモーターであり、塩基１３４
８〜１５３１は改変ヒトβグロビン第２イントロンであり、塩基１５４４〜５９１７はコ
ドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５９２６〜６１４９はｂＧＨポリＡであり、塩
基６１６４〜６３０８は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクトＤＣ１７２ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ｈＡＡＴは５６３５塩基長である。こ
のコンストラクトは配列番号１６として記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２
ＩＴＲであり、塩基１６０〜４４９は２コピー（２×）の１４５ｂｐマクログロブリン
・エンハンサーであり、塩基４５７〜６７４はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基６７５
〜８５８は改変ヒトβグロビン第２イントロンであり、塩基８７１〜５２４４はコドン最
適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５２５３〜５４７６はｂＧＨポリＡであり、塩基５４
９０〜５６３５は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩは６９６２塩基長である
。このコンストラクトは配列番号１７に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２
ＩＴＲであり、塩基１６０〜８０７は２コピー（２×）の３２１ｂｐ ＡｐｏＥ ＨＣ
Ｒであり、塩基８１４〜１１０３は２コピー（２×）の１４５ｂｐマクログロブリン・エ
ンハンサーであり、塩基１１０４〜２００１は８９８ｂｐ ｈＡＡＴプロモーターであり
、塩基２００２〜２１８５は改変ヒトβグロビン第２イントロンであり、塩基２１９８〜
６５７１はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基６５８０〜６８０３はｂＧＨポリ
Ａであり、塩基６８１８〜６９６２は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクトＤＣ１７２ ２×ＨＣＲ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ｈＡＡＴは６２８９塩
基長である。このコンストラクトは配列番号１８に記載されており、塩基１〜１４５は５
’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０〜８０７は２コピー（２×）の３２１ｂｐ Ａｐ
ｏＥ ＨＣＲであり、塩基８１４〜１１０３は２コピー（２×）の１４５ｂｐマクログロ
ブリン・エンハンサーであり、塩基１１１１〜１３２８はｈＡＡＴプロモーターであり、
塩基１３２９〜１５１２は改変ヒトβグロビン第２イントロンであり、塩基１５２５〜５
８９８はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５９０７〜６１３０はｂＧＨポリＡ
であり、塩基６２４５〜６２８９は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩは５４３０塩基長であ
る。このコンストラクトは配列番号１９に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ
２ ＩＴＲであり、塩基１６８〜３０９は２コピー（２×）の７１ｂｐセルピンＡエンハ
ンサーであり、塩基３２６〜５４３はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基５４４〜７２７
は改変ヒトβグロビン第２イントロンであり、塩基７４０〜５１１３はコドン最適化ＳＱ
ＦＶＩＩＩであり、塩基５１２２〜５２７１は短ｂＧＨポリＡであり、塩基５２８６〜
５４３０は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴ ＡＴＧ ＦＶＩＩＩ ２×μ−グロブリン
・エンハンサーは５７７９塩基長である。このコンストラクトは配列番号２０に記載され
ており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６８〜３０９は２コピー
（２×）の７１ｂｐセルピンＡエンハンサーであり、塩基３２６〜５４３はｈＡＡＴプロ
モーターであり、塩基５４４〜７２７は改変ヒトβグロビン第２イントロンであり、塩基
７４０〜５１１３はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５１２２〜５２７１は短
ｂＧＨポリＡであり、塩基５２７９〜５６１８は２コピー（２×）の１７０ｂｐ μグロ
ブリン・エンハンサーであり、塩基５６３５〜５７７９は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１００ＡＴＧ 短ｂＧＨポリＡ ２×μグロブリン・エンハンサーは５
９６２塩基長である。このコンストラクトは配列番号２１に記載されており、塩基１〜１
４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０〜５０２はＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩
基５０９〜７２６はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７２７〜９１０は改変ヒトβグロ
ビン第２イントロンであり、塩基９２３〜５２９６はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであ
り、塩基５３０５〜５４５４は短ｂＧＨポリＡであり、塩基５４６２〜５８０１は２コピ
ー（２×）の１７０ｂｐミクログロブリン・エンハンサーであり、塩基５８１８〜５９６
２は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト第ＶＩＩＩ因子−ＢＭＮ００１は５９１９塩基長である。このコンスト
ラクトは配列番号２２に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり
、塩基１６０〜４８０はＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基４８７〜８８４は３９８ｂｐ ｈ
ＡＡＴプロモーターであり、塩基８８５〜１１４５は切断型ｈＡＡＴイントロンであり、
塩基１１５５〜５５２８はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５５３７〜５７６
０はｂＧＨポリＡであり、塩基５７７５〜５９１９は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクトＦＶＩＩＩ−ＢＭＮ００２は５３０６塩基長である。このコンストラク
トは配列番号２３に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩
基１７５〜７０５はＬＰ１プロモーター／エンハンサーであり、塩基７１８〜５０９１は
コドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５１００〜５１４７は合成ウサギβグロビン
ポリＡであり、塩基５１６２〜５３０６は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト９９は５４６１塩基長である。このコンストラクトは配列番号２４に記
載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９〜６２７はＡ
ｐｏＥ ＨＣＲ／ＭＡＲであり、塩基６３４〜８６６はｈＡＡＴプロモーターであり、塩
基８７３〜５２４６はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５２５５〜５３０２は
合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５３１７〜５４６１は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲで
ある。
コンストラクト１００は５３２７塩基長である。このコンストラクトは配列番号２５に
記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９〜４９３は
ＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基５０９〜７２６はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７３
９〜５１１２はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５１２１〜５１６８は合成ウ
サギβグロビンポリＡであり、塩基５１８３〜５３２７は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１００逆配向は５３０９塩基長である。このコンストラクトは配列番号
２６に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０〜４
８４は逆配向のＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基４９１〜７０８はｈＡＡＴプロモーターで
あり、塩基７２１〜５０９４はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５１０３〜５
１５０は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５１６５〜５３０９は３’ＡＡＶ２
ＩＴＲである。
コンストラクト１００ＡＴは５５３２塩基長である。このコンストラクトは配列番号２
７に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９〜４９
３はＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基５０９〜７２６はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基
７２７〜９３１はｈＡＡＴイントロンであり、塩基９４４〜５３１７はコドン最適化ＳＱ
ＦＶＩＩＩであり、塩基５３２６〜５３７３は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩
基５３８８〜５５３２は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧは５８７７塩基長である。このコンストラクトは
配列番号２８に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１
６９〜４９３はＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基５０８〜８４７は２コピー（２×）の１７
０ｂｐ μグロブリン・エンハンサーであり、塩基８５４〜１０７１はｈＡＡＴプロモー
ターであり、塩基１０７２〜１２７６はｈＡＡＴイントロンであり、塩基１２８９〜５６
６２はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５６７１〜５７１８は合成ウサギβグ
ロビンポリＡであり、塩基５７３３〜５８７７は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ ｂＧＨポリＡは６０５４塩基長である。このコ
ンストラクトは配列番号２９に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲ
であり、塩基１６９〜４９３はＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基５０８〜８４７は２コピー
（２×）の１７０ｂｐ μグロブリン・エンハンサーであり、塩基８５４〜１０７１はｈ
ＡＡＴプロモーターであり、塩基１０７２〜１２７６はｈＡＡＴイントロンであり、塩基
１２８９〜５６６２はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５６７１〜５８９５は
ｂＧＨポリＡであり、塩基５９１０〜６０５４は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１００ＡＴ ２×ＭＧ（逆） ｂＧＨポリＡは６０５４塩基長である。
このコンストラクトは配列番号３０に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２
ＩＴＲであり、塩基１６９〜４９３はＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基５０８〜８４７は２
コピー（２×）の逆配向１７０ｂｐ μグロブリン・エンハンサーであり、塩基８５４〜
１０７１はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基１０７２〜１２７６はｈＡＡＴイントロン
であり、塩基１２８９〜５６６２はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５６７１
〜５８９５はｂＧＨポリＡであり、塩基５９１０〜６０５４は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲであ
る。
コンストラクト１００ｂＧＨポリＡは５５０４塩基長である。このコンストラクトは配
列番号３１に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６
９〜４９３はＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基５０９〜７２６はｈＡＡＴプロモーターであ
り、塩基７３９〜５１１２はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基対５１２１〜５
３４５はｂＧＨポリＡであり、塩基５３６０〜５５０４は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１００〜４００は５５０７塩基長である。このコンストラクトは配列番
号３２に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９〜
４９３はＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基５１２〜９０６は３９８ｂｐ ｈＡＡＴプロモー
ターであり、塩基９１９〜５２９２はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５３０
１〜５３４８は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５３６３〜５５０７は３’ＡＡ
Ｖ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１０１は５３１１塩基長である。このコンストラクトは配列番号３３に
記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１７０〜４７７は
２コピー（２×）の１５４ｂｐ ＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基４９３〜７１０はｈＡＡ
Ｔプロモーターであり、塩基７２３〜５０９６はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、
塩基５１０５〜５１５２は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５１６７〜５３１１
は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１０２は５１５６塩基長である。このコンストラクトは配列番号３４に
記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９〜３２２は
１５４ｂｐ ＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基３３８〜５５５はｈＡＡＴプロモーターであ
り、塩基５６８〜４９４１はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基４９５０〜４９
９７は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５０１２〜５１５６は３’ＡＡＶ２ Ｉ
ＴＲである。
コンストラクト１０３は５１７８塩基長である。このコンストラクトは配列番号３５に
記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９〜３４４は
４コピー（４ｘ）の４４ｂｐ ＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基３６０〜５７７はｈＡＡＴ
プロモーターであり、塩基５９０〜４９６３はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩
基４９７２〜５０１９は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５０３４〜５１７８は
３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１０３逆配向は５１６０塩基長である。このコンストラクトは配列番号
３６に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６０〜３
３５は４コピー（４ｘ）の逆配向４４ｂｐ ＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基３４２〜５５
９はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基５７２〜４９４５はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩ
Ｉであり、塩基４９５４〜５００１は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５０１６
〜５１６０は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１０３ＡＴは５３８３塩基長である。このコンストラクトは配列番号３
７に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９〜３４
４は４コピー（４ｘ）の４４ｂｐ ＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基３６０〜５７７はｈＡ
ＡＴプロモーターであり、塩基５７８〜７８２はｈＡＡＴイントロンであり、塩基７９５
〜４３７４はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５１７７〜５２２４は合成ウサ
ギβグロビンポリＡであり、塩基５２３９〜５３８３は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１０３ＡＴ ２×ＭＧは５７２８塩基長である。このコンストラクトは
配列番号３８に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１
６９〜３４４は４コピー（４ｘ）の４４ｂｐ ＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基３５９〜６
９８は２コピー（２×）の１７０ｂｐ μグロブリン・エンハンサーであり、塩基７０５
〜９２２はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基９２３〜１１２７はｈＡＡＴイントロンで
あり、塩基１１４０〜５５１３はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５５２２〜
５５６９は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５５８４〜５７２８は３’ＡＡＶ２
ＩＴＲである。
コンストラクト１０３ＡＴ ２×ＭＧ ｂＧＨポリＡは５９０５塩基長である。このコ
ンストラクトは配列番号３９に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲ
であり、塩基１６９〜３４４は４コピー（４ｘ）の４４ｂｐ ＡｐｏＥ ＨＣＲであり、
塩基３５９〜６９８は２コピー（２×）の１７０ｂｐ μグロブリン・エンハンサーであ
り、塩基７０５〜９２２はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基９２３〜１１２７はｈＡＡ
Ｔイントロンであり、塩基１１４０〜５５１３はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、
塩基５５２２〜５７４６は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５７６１〜５９０５
は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１０３ ｂＧＨポリＡは５３５５塩基長である。このコンストラクトは
配列番号４０に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１
６９〜３４４は４コピー（４ｘ）の４４ｂｐ ＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基３６０〜５
７７はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基５９０〜４９６３はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩ
ＩＩであり、塩基４９７２〜５１９６は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５２１
１〜５３５５は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１０４は５６１８塩基長である。このコンストラクトは配列番号４１に
記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１６９〜７８４は
４コピー（４ｘ）の１５４ｂｐ ＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基８００〜１０１７はｈＡ
ＡＴプロモーターであり、塩基１０３０〜５４０３はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであ
り、塩基５４１２〜５４５９は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５４７４〜５６
１８は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１０５は５９９３塩基長である。このコンストラクトは配列番号４２に
記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１７３〜５１２は
２コピー（２×）の１７０ｂｐ μグロブリン・エンハンサーであり、塩基５１９〜７３
６はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７４９〜５１２２はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩ
Ｉであり、塩基５１３１〜５１７８は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５１８５
〜５８３４は２コピー（２×）のＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基５８４９〜５９９３は３
’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１０６は５３３７塩基長である。このコンストラクトは配列番号４３に
記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１７３〜５１２は
２コピー（２×）の１７０ｂｐ μグロブリン・エンハンサーであり、塩基５１９〜７３
６はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７４９〜５１２２はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩ
Ｉであり、塩基５１３１〜５１７８は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５１９３
〜５３３７は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
コンストラクト１０６ＡＴは５５４２塩基長である。このコンストラクトは配列番号４
４に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基１７３〜５１
２は２コピー（２×）の１７０ｂｐ μグロブリン・エンハンサーであり、塩基５１９〜
７３６はｈＡＡＴプロモーターであり、塩基７３７〜９４１はｈＡＡＴイントロンであり
、塩基９５４〜５３２７はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基５３３６〜５３８
３は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基５３９８〜５５４２は３’ＡＡＶ２ ＩＴ
Ｒである。
コンストラクト２×セルピンＡ ｈＡＡＴは５１２６塩基である。このコンストラクト
は配列番号４５に記載されており、塩基１〜１４５は５’ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、塩基
１６０〜３０１はＡｐｏＥ ＨＣＲであり、塩基３０８〜５２５はｈＡＡＴプロモーター
であり、塩基５３８〜４９１１はコドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩであり、塩基４９２０〜
４９６７は合成ウサギβグロビンポリＡであり、塩基４９８２〜５１２６は３’ＡＡＶ２
ＩＴＲである。
ＡＡＶベクター
本明細書で使用される場合、用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語で
ある。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染しているヘルパーウイルスによ
って与えられる、細胞内でのみ増殖する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、以下
の表１に示される通り、特徴付けられているＡＡＶの血清型は１３種存在する。ＡＡＶの
概説および総説は、例えば、Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp.
169-228、およびBerns,1990,Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)に見
出すことができる。しかし、種々の血清型は、遺伝子レベルにおいてでさえ、構造的に且
つ機能的に、極めて密接に関連していることがよく知られているため、これらの同一の原
理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることは十分に予想できる。（例えば、Blacklow
e,1988, pp.165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.
およびRose,Comprehensive Virology 3:1-61(1974)を参照）。例えば、全てのＡＡＶ
血清型は、一見、相同ｒｅｐ遺伝子によってもたらされるとてもよく似た複製特性を示し
、全て、ＡＡＶ６において発現されるもの等の３つの関連カプシドタンパク質を有してい
る。関連性の度合いは、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範なクロスハイブリダイゼー
ション；および「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に相当する終端における類似のセルフ
アニーリングセグメントの存在を明らかにする、ヘテロ二本鎖解析によってさらに示され
る。類似の感染性パターンは、それぞれの血清型における複製機能が同様の調節管理下に
あることも示す。
「ＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に
挟まれた一つまたは複数の目的のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクター
を指す。このようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物をコードおよび発
現するベクターを形質移入された宿主細胞内に存在する場合に、複製および感染性ウイル
ス粒子内へのパッケージングが可能である。
「ＡＡＶウイルス粒子（AAV virion）」または「ＡＡＶウイルス粒子（AAV viral p
article）」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパ
ク質およびキャプシド形成したポリヌクレオチドＡＡＶベクターから構成されるウイルス
粒子を指す。前記粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達される予定
の導入遺伝子等の、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、通常、「
ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。従って、このようなベ
クターはＡＡＶベクター粒子内に含有されることから、ＡＡＶベクター粒子の作製には必
然的にＡＡＶベクターの作製が含まれる。
ＡＡＶの「ｒｅｐ」遺伝子および「ｃａｐ」遺伝子は、それぞれ複製タンパク質および
キャプシド形成タンパク質をコードする遺伝子である。ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａ
ｐ遺伝子は、現在までに調べられた全てのＡＡＶ血清型において見出されており、本明細
書および引用した参考文献に記載されている。野生型ＡＡＶでは、ｒｅｐ遺伝子およびｃ
ａｐ遺伝子は通常、ウイルスゲノム内で互いに隣接して見出され（すなわち、これらは隣
接または重複する転写単位として共に「連結」している）、これらは通常、ＡＡＶ血清型
の間で保存されている。また、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、個々に、お
よび集合的に、「ＡＡＶパッケージング遺伝子」とも称される。本明細書におけるＡＡＶ
ｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐおよびａｄｅｎｏのヘルパー機能の存在下でＡＡＶベクターを
パッケージングすることが可能であり、標的細胞受容体と結合することが可能な、Ｃａｐ
タンパク質をコードしている。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、特定
のＡＡＶ血清型（例えば表１に示される血清型）に由来するアミノ酸配列を有するカプシ
ドタンパク質をコードしている。
Figure 2021072871
ＡＡＶの作製に使用されるＡＡＶ配列は、いかなるＡＡＶ血清型のゲノムに由来してい
てもよい。通常、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸レベルおよび核酸レベルで有意に相同的なゲ
ノム配列を有し、同様の一連の遺伝的機能を与え、本質的に物理的且つ機能的に等価なウ
イルス粒子を生成し、ほぼ同一の機構により複製および構築する。ＡＡＶ血清型のゲノム
配列およびゲノム類似性の考察については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号
Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋアクセ
ッション番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６；
Chlorini etal., J. Vir. 71: 6823-33(1997); Srivastava et al., J.Vir. 45:555-6
4 (1983);Chlorini et al., J. Vir. 73:1309-1319 (1999); Rutledge et al., J. Vi
r. 72:309-319(1998);およびWu et al., J. Vir. 74: 8635-47 (2000)を参照されたい
。
知られている全てのＡＡＶ血清型のゲノム構築は非常に似ている。ＡＡＶのゲノムは、
約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長未満の直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端
反復（ＩＴＲ）は、構造に関係しない複製（Ｒｅｐ）タンパク質および構造（ＶＰ）タン
パク質のユニークな翻訳領域クレオチド配列と隣接している。ＶＰタンパク質はカプシド
を形成する。末端の１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ字形ヘアピンを形成するエネルギ
ー的に安定な分子内二本鎖が形成され得るように構築されている。これらのヘアピン構造
は、ウイルスＤＮＡ複製の開始点として機能し、細胞性ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプラ
イマーとして働く。Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅ
ｐ５２、およびＲｅｐ４０をコードしている。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８はｐ５プロモ
ーターから転写され、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０はｐ１９プロモーターから転写される
。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードしている。
ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから転写される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列は、Ｓｆ９
細胞またはＨＥＫ細胞等の特定の細胞型における発現のための発現制御配列に機能的に連
結している。昆虫宿主細胞または哺乳類宿主細胞において外来遺伝子を発現するための、
当業者に公知の手法が、本発明を実施するために使用され得る。昆虫細胞においてのポリ
ペプチドの分子エンジニアリングおよび発現のための方法論は、例えば、Summers and
Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cul
ture Procedures,Texas Agricultural Experimental Station Bull.No. 7555, Col
lege Station,Tex.; Luckow. 1991. In Prokop et al., Cloning and Expression
of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors'Recombi
nant DNA Technology and Applications,97-152; King, L. A. 及び R. D.Possee,
1992, The baculovirus expression system,Chapman and Hall, UnitedKingdom; O
'Reilly, D. R.,L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vecto
rs: A Laboratory Manual,New York; W.H. Freeman 及び Richardson,C. D., 1995, B
aculovirus Expression Protocols,Methods in Molecular Biology,volume 39；
米国特許第４，７４５，０５１号；米国特許出願公開第２００３１４８５０６号；および
国際公開第０３／０７４７１４号、に記載されている。ＡＡＶカプシドタンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列の転写に特に適したプロモーターは、例えば、多角体（polyhedr
on）プロモーターである。しかし、昆虫細胞において活性な他のプロモーター、例えば、
ｐ１０、ｐ３５またはＩＥ−１プロモーターが当該技術分野において知られており、上記
の参考文献に記載されるさらなるプロモーターも考慮される。
異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は文書により十分に裏付けられており、
例えば、核酸、例えばベクター、例えば昆虫細胞適合ベクターをそのような細胞に導入す
る方法、およびそのような細胞を培養液中で維持する方法等である。例えば、METHODS I
N MOLECULAR BIOLOGY,ed. Richard, Humana Press, NJ (1995);O'Reilly et al., B
ACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS,A LABORATORY MANUAL, OxfordUniv. Press (1994)
; Samulski etal., J. Vir. 63:3822-8 (1989); Kajigaya et al.,Proc. Nat'l. Acad
. Sci. USA 88:4646-50 (1991); Ruffing et al., J. Vir.66:6922-30 (1992); Kirnb
auer et al.,Vir. 219:37-44 (1996); Zhao et al., Vir.272:382-93 (2000);およびS
amulski et al.、米国特許第６，２０４，０５９号を参照されたい。いくつかの実施形
態では、昆虫細胞におけるＡＡＶをコードする核酸構築体は、昆虫細胞適合ベクターであ
る。「昆虫細胞適合ベクター」または「ベクター」は、本明細書で使用される場合、昆虫
または昆虫細胞の増殖性形質転換またはトランスフェクションが可能である核酸分子を指
す。例示的な生物学的ベクターには、プラスミド、直鎖状核酸分子、および組換えウイル
スが含まれる。昆虫細胞適合性であればいかなるベクターも使用可能である。前記ベクタ
ーは昆虫細胞ゲノム内に組み込まれ得るが、前記ベクターの昆虫細胞内での存在は永続的
である必要はなく、一過性のエピソーム性ベクターも含まれる。前記ベクターは、あらゆ
る既知の手段によって、例えば、細胞の化学的処理、エレクトロポレーション、または感
染によって、導入され得る。いくつかの実施形態では、前記ベクターは、バキュロウイル
ス、ウイルスベクター、またはプラスミドである。より好ましい実施形態では、前記ベク
ターはバキュロウイルスであり、すなわち、コンストラクトがバキュロウイルスベクター
である。バキュロウイルスベクターおよびそれらの使用法は、昆虫細胞の分子工学に関す
る上記の引用文献に記載されている。
バキュロウイルスは、節足動物の、エンベロープを有するＤＮＡウイルスであり、その
うちの２つのメンバーは、細胞培養液中で組換えタンパク質を生産するための周知の発現
ベクターである。バキュロウイルスは、巨大なゲノム内容物の特定の細胞への送達を可能
にするように操作可能である、環状の二本鎖ゲノム（８０〜２００ｋｂｐ）を有している
。ベクターとして使用されるウイルスは、通常、オートグラファ・カリフォルニカ多カプ
シド核多核体病ウイルス（Autographa californica multicapsid nucleo polyhedrov
irus：ＡｃＭＮＰＶ）またはカイコ（Bombyxmori（Ｂｍ）ＮＰＶ）（Kato etal., 2010
）である。
バキュロウイルスは通常、組換えタンパク質の発現のための、昆虫細胞の感染に使用さ
れる。具体的には、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許第４，７４５，
０５１号；Friesen etal (1986)；欧州特許第１２７，８３９号；同第１５５，４７６
号；Vlak etal (1988);Miller et al (1988); Carbonell et al (1988); Maeda et
al(1985);Lebacq-Verheyden et al (1988); Smith et al (1985); Miyajima et al (
1987);およびMartin etal (1988)に記載されるように達成することができる。タンパク
質生産に使用することができる多数のバキュロウイルス株および変異体並びに対応する許
容的昆虫宿主細胞が、Luckow et al (1988), Miller et al (1986); Maeda et al (19
85)およびMcKenna(1989)に記載されている。
組換えＡＡＶの作製法
本開示は、昆虫細胞または哺乳類細胞において組換えＡＡＶを作製するための材料およ
び方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記ウイルスコンストラクトは、一つまた
は複数の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするための、プロ
モーターおよび前記プロモーターの下流の制限酵素認識部位をさらに含み、前記プロモー
ターおよび前記制限酵素認識部位は、５’ＡＡＶ ＩＴＲの下流および３’ＡＡＶ ＩＴ
Ｒの上流に位置する。いくつかの実施形態では、前記ウイルスコンストラクトは、制限酵
素認識部位の下流および３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流の転写後調節エレメントをさらに含む
。いくつかの実施形態では、前記ウイルスコンストラクトは、制限酵素認識部位に挿入さ
れ、プロモーターと機能的に連結されたポリヌクレオチドをさらに含み、前記ポリヌクレ
オチドは目的タンパク質のコード領域を含む。当業者に理解されるように、本出願で開示
されるＡＡＶベクターのいずれか１つが、組換えＡＡＶを作製するためのウイルスコンス
トラクトとして前記方法において使用可能である。
いくつかの実施形態では、前記ヘルパー機能は、アデノウイルスまたはバキュロウイル
スのヘルパー遺伝子を含む一つまたは複数のヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルス
によって与えられる。アデノウイルスまたはバキュロウイルスのヘルパー遺伝子の非限定
例としては、限定はされないが、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡが挙げられ、
これらは、ＡＡＶパッケージングにヘルパー機能を与え得る。
ＡＡＶのヘルパーウイルスは、当該技術分野において公知であり、例えば、アデノウイ
ルス科およびヘルペスウイルス科に由来するウイルスが含まれる。ＡＡＶのヘルパーウイ
ルスの例としては、限定はされないが、米国特許出願公開第２０１１０２０１０８８号（
この米国特許出願公開の開示は参照によって本明細書に援用される）に記載されるＳＡｄ
Ｖ−１３ヘルパーウイルスおよびＳＡｄＶ−１３様ヘルパーウイルス、ヘルパーベクター
ｐＨＥＬＰ（アプライド・ビロミクス社（Applied Viromics））が挙げられる。適切な
ヘルパー機能をＡＡＶに与え得るＡＡＶのいかなるヘルパーウイルスまたはヘルパープラ
スミドも本明細書で使用可能であることは、当業者に理解される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子はプラスミド内に存在する。前記プラ
スミドはＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をさらに含む。いかなるＡＡＶ血清型（例えば、限定はさ
れないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、
ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３およびそのあらゆるバリア
ント）に由来するｃａｐ遺伝子および／またはｒｅｐ遺伝子も、組換えＡＡＶを作製する
ために本明細書で使用することができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝
子は、血清型１、血清型２、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清
型９、血清型１０、血清型１１、血清型１２、血清型１３またはそのバリアントに由来す
るカプシドをコードする。
いくつかの実施形態では、昆虫細胞または哺乳類細胞が、ヘルパープラスミドまたはヘ
ルパーウイルス、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするウイルスコンストラクトおよびプラ
スミドを形質移入され得；同時形質移入後に前記組換えＡＡＶウイルスが種々の時点にお
いて収集され得る。例えば、組換えＡＡＶウイルスは、同時形質移入の約１２時間後、約
２４時間後、約３６時間後、約４８時間後、約７２時間後、約９６時間後、約１２０時間
後、またはこれらいずれか２つの時点の間の時間後に、収集され得る。
また組換えＡＡＶは、感染性組換えＡＡＶを作製するのに適切な、当該技術分野におい
て公知のいかなる常法を用いても作製することができる。いくつかの例では、組換えＡＡ
Ｖは、ＡＡＶ粒子生産に必要な成分のいくつかを安定に発現する昆虫細胞または哺乳類細
胞を用いることによって作製され得る。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃ
ａｐ遺伝子、並びにネオマイシン耐性遺伝子等の選択マーカーを含むプラスミド（または
複数のプラスミド）が、前記細胞のゲノム内に組み込まれ得る。前記昆虫細胞または哺乳
類細胞は次に、ヘルパーウイルス（例えば、ヘルパー機能を与えるアデノウイルスまたは
バキュロウイルス）、並びに５’ＡＡＶ ＩＴＲおよび３’ＡＡＶ ＩＴＲ（および、所
望であれば、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含むウイルスベクターに
同時感染され得る。この方法の利点は、細胞が選択可能であること、および組換えＡＡＶ
の大量生産に適していることである。別の非限定例として、プラスミドではなく、アデノ
ウイルスまたはバキュロウイルスが、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をパッケージング
細胞に導入するために使用され得る。さらに別の非限定例として、５’および３’ＡＡＶ
ＬＴＲ並びにｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子を含有するウイルスベクターの両方が産生細胞のＤ
ＮＡに安定に組み込まれ得、組換えＡＡＶを生産するためにヘルパー機能が野生型アデノ
ウイルスによって与えられ得る。
ＡＡＶ生産で使用される細胞型
本発明のＡＡＶベクターを含むウイルス粒子は、ＡＡＶまたは生物学的生成物（biolog
ic product）の生産を可能にし、培養液中で維持することができる、いかなる無脊椎動
物細胞型を用いてもレドキュー（redocued）することができる。例えば、使用される昆虫
細胞株は、ヨトウガ（Spodopterafrugiperda）由来の細胞、例えば、ＳＦ９、ＳＦ２１、
ＳＦ９００＋、ショウジョウバエ細胞株、蚊細胞株、例えば、ヒトスジシマカ（Aedesalb
opictus）由来細胞株、家蚕細胞株、例えばカイコガ（Bombyxmori）細胞株、イラクサギ
ンウワバ（Trichoplusia ni）細胞株、例えば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞または鱗翅目細
胞株、例えば、アスカラパ・オドラタ（Ascalaphaodorata）細胞株であり得る。好ましい
昆虫細胞は、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓｆ９、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣ
Ｒ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−１、Ｔｎ３
６８、ＨｚＡｍ１、ＢＭ−Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５およびＡｏ３８を含む、バキュ
ロウイルスに感染し易い昆虫種由来の細胞である。
バキュロウイルスは、節足動物の、エンベロープを有するＤＮＡウイルスであり、その
うちの２つのメンバーは細胞培養液中で組換えタンパク質を生産するための周知の発現ベ
クターである。バキュロウイルスは、特定の細胞への巨大なゲノム内容物の送達を可能に
するように操作することができる、環状二本鎖ゲノム（８０〜２００ｋｂｐ）を有する。
ベクターとして使用されるウイルスは、一般的には、オートグラファ・カリフォルニカ（
Autographa californica）多カプシド核多核体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）またはカイ
コ（Bombyx mori）（Ｂｍ ＮＰＶ）（Kato etal., 2010）である。
バキュロウイルスは、一般的に、組換えタンパク質の発現のための昆虫細胞の感染に使
用される。具体的には、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許第４，７４
５，０５１号；Friesen etal (1986)；欧州特許第１２７，８３９号；同第１５５，４
７６号；Vlak etal(1988);Miller et al (1988);Carbonell et al (1988);Maeda et
al(1985);Lebacq-Verheyden etal (1988);Smith et al (1985);Miyajima et al (19
87);およびMartin etal (1988)に記載されるように達成され得る。タンパク質生産に使
用することができる多数のバキュロウイルス株および変異体並びに対応する許容的昆虫宿
主細胞が、Luckow etal (1988), Miller et al (1986); Maeda et al (1985)およびM
cKenna (1989)に記載されている。
本発明の別の態様では、本発明の方法はまた、ＡＡＶの複製または生物学的産物の生産
を可能にし、培養液中で維持可能な、あらゆる哺乳類細胞型を用いて実行される。使用さ
れる好ましい哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、Ｐ
ＥＲ．Ｃ６、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ、ＨＴ１０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ−７、ＡＲＰＥ
−１９およびＭＲＣ−５細胞であり得る。
ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの試験
本発明の完全にパッケージングされたＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを試験するためのア
ッセイは、例えば、（１）ヒト肝臓由来の細胞株であるＨｅｐＧ２細胞におけるＡＡＶベ
クター核酸を含む二本鎖ＤＮＡプラスミドの一過性導入による、肝臓特異的なｍＲＮＡ発
現およびスプライシング、並びにＦＶＩＩＩタンパク質の産生および分泌のインビトロに
おけるチェック；（２）２９３細胞およびバキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＡＡＶ
ＦＶＩＩＩベクターを含むＡＡＶウイルス粒子の生産；（３）アルカリ性ゲル解析およ
び複製アッセイによるＡＡＶベクター核酸の評価；並びに（４）Ｒａｇ２マウスにおける
ＦＶＩＩＩ発現、ＦＶＩＩＩ活性、およびＦＶＩＩＩ比活性の評価を含む。これらのアッ
セイは、実施例に詳細に記載される。
本発明の完全にパッケージングされたＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターは、ＵＣＬ ＳＱベ
クターと少なくとも同一の発現および／または活性を示し、ＵＣＬ ＳＱベクターと比較
して１．５倍、２倍、３倍、４倍、または５倍またはそれより多い発現および／または活
性を示すことが好ましい。
本発明の完全にパッケージングされたＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターは、断片ゲノムの混
入がほとんどまたは全く無い高いベクター収率を有し、ＵＣＬ ＳＱベクターと比較して
１．５倍、２倍、３倍、４倍、または５倍より高いベクター収率を有することが好ましい
。
本発明の他の態様および利点は、以下の実例を考慮することにより理解される。
実施例１
Ｐｒｏｔｏ１、Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、Ｐｒｏｔｏ２ＳおよびＰｒｏｔｏ３Ｓベクターの作製
ＵＣＬ ＳＱベクターは、Nathwani et al.、２０１３年１月２４日に公開された米国
特許出願公開第２０１３／００２４９６０Ａ１号（その全体が参照によって本ん明細書に
援用される）、およびMcIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013に詳細に記載され
ており、大容量、すなわち、５．０ｋｂ超のＡＡＶベクターである。図１に示すように、
ＵＣＬ ＳＱベクターは、左から右に、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）５’ＩＴＲ、野生型
ＡＡＶ２ウイルス配列、３４塩基ヒトアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）／Ｃ１エンハン
サー、３２塩基ヒトα抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター遠位Ｘ領域、１８６塩基ヒト
ＡＡＴプロモーター（４２塩基の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列を含む）、Ｂドメインが
１４アミノ酸のＳＱ配列で置換されているコドンを最適化したヒトＦＶＩＩＩ配列、４９
塩基合成ポリアデニル化配列、野生型ＡＡＶ２ウイルス配列、およびＡＡＶ２ ３’ＩＴ
Ｒを含む。ＵＣＬ ＳＱベクターは５０８１塩基長である。
ＵＣＬ ＳＱベクターよりも小型のベクターを得るために、本発明者らがＦＶＩＩＩの
発現および／もしくは活性、またはＡＡＶウイルス粒子生産に不要と考えるＤＮＡ配列を
、ＵＣＬ ＳＱベクター配列から除去した。ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲの３’側のＡＡＶ２ウ
イルス配列の５３塩基、ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲの５’側のＡＡＶ２ウイルス配列の４６塩
基、およびコドンを最適化したＦＶＩＩＩ ＳＱコード領域に隣接した１１塩基を含む、
外来性ＤＮＡ配列を除去した。４９７０塩基長の得られるＰｒｏｔｏ１ベクターは図２Ａ
に模式図で示され、この配列は配列番号１に記載される。Ｐｒｏｔｏ１は、感染性ウイル
スを生産し、機能的な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。
ＡＡＶ２ ＩＴＲ内のヘアピンループに隣接する配列も、組換えＡＡＶベクターにおい
て不要であり得る（Srivastava etal.、米国特許第６，５２１，２２５号；Wang et a
l., J.Virol.70:1668-1677, 1996;およびWang et al., J. Virol. 71:3077-3082, 1997
参照）。Ｐｒｏｔｏ１ベクターのサイズをさらに減少させるため、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ
内のヘアピンループの３’側に隣接したＡＡＶ２配列の１０塩基を除去し、ＡＡＶ２ ３
’ＩＴＲ内のヘアピンループの５’側に隣接したＡＡＶ２配列の１０塩基を除去した。４
９５０塩基長の得られるＰｒｏｔｏ１Ｓベクターは、図２Ｂに模式図で示され、この配列
は配列番号２に記載される。
Ｐｒｏｔｏ１Ｓベクター内のＦＶＩＩＩ ＳＱバリアントの発現を増加させる試みにお
いて、１００塩基の合成イントロンを、コドンを最適化したＦＶＩＩＩ配列内のエクソン
１およびエクソン２の間に挿入した。イントロンの挿入は、例えばインターフェロン遺伝
子等のイントロンを含まない遺伝子における、ｍＲＮＡ発現のレベルを増加させ得ること
が知られている。
エンハンサーは、距離および配向に非依存的に働くと定義される。３４塩基ＡｐｏＥ／
Ｃ１エンハンサーは、Gray et al.、米国特許第８，０３０，０６５号（ＦＩＸ発現）お
よびNathwani etal.、米国特許出願公開第２０１３／００２４９６０号（ＦＶＩＩＩ発
現）（共に、それらの全体が参照によって本発明に援用される）における、その推定的な
エンハンサー活性によって例証されるように、ＦＶＩＩＩ発現に関して距離および配向非
依存的に働く。DiSimone etal., EMBO J. 6:2759-2766, 1987に記載される３２塩基
ヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域は、異種プロモーターの発現を増強する制御ドメイン
内に位置する。
Ｐｒｏｔｏ１Ｓベクター内のＦＶＩＩＩ ＳＱバリアントの発現をさらに増加させるた
めの別の試みにおいて、合成イントロン配列は、３４塩基 ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハン
サーおよび３２塩基 ヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域を組み入れ、ヒトＡＡＴプロモ
ーターの上流のその位置から移動された。これら２つの調節エレメントを、Ｐｒｏｔｏ１
Ｓにおけるそれらの配向に対し逆配向に挿入した。４９８３塩基長の得られるＰｒｏｔｏ
２Ｓベクターは、図２Ｃに模式図で示され、配列は配列番号３に記載される。
ヒトＡＡＴプロモーター遠位Ｘ領域は、イントロン内の転写開始点から下流で機能する
ことが以前に示されていなかったため、Ｐｒｏｔｏ２Ｓ ベクター内のこの調節エレメン
トを、イントロン内のエンハンサーの第１コピーと同じ配向の、３４塩基 ヒトＡｐｏＥ
／Ｃ１エンハンサーの第２コピーと置換した。４９８５塩基長の得られるＰｒｏｔｏ３Ｓ
ベクターは、図２Ｄに模式図で示され、この配列は配列番号４に記載される。
Ｐｒｏｔｏ１、Ｐｒｏｔｏ１Ｓ、Ｐｒｏｔｏ２ＳおよびＰｒｏｔｏ３Ｓベクター核酸を
、ｐＵＣ１９細菌発現プラスミド内にクローニングすることによって、二本鎖形態のＡＡ
Ｖ ＦＶＩＩＩベクターを作製した。
実施例２
Ｐｒｏｔｏ４、Ｐｒｏｔｏ５、Ｐｒｏｔｏ６およびＰｒｏｔｏ７ベクターの作製
Ｐｒｏｔｏ１ベクターのサイズをさらに減少させるため、および／またはＰｒｏｔｏ１
ベクターと比較したＦＶＩＩＩの発現を増加させるため、軽鎖またはＣドメインに隣接し
て位置するａ３ドメインを除去した。ａ３ドメインは、フォンウィルブランド因子（von
Willenbrand Factor）への結合に関与するが、インビボにおける機能的に活性なＦＶ
ＩＩＩには不要であり得る。
Ｐｒｏｔｏ１ベクターから開始して、１４アミノ酸のＳＱ配列および４１アミノ酸のａ
３ドメイン（野生型ＦＶＩＩＩのアミノ酸１６４９〜１６８９に対応）を除去した。４８
０５塩基長の得られるＰｒｏｔｏ４ベクターは、図３Ａに模式図で示され、この配列は配
列番号５に記載される。
Ｂドメインおよびａ３ドメイン欠失ＦＶＩＩＩの発現を増加させる試みにおいて、１２
９塩基の切断型ＦＶＩＩＩイントロンを、Ｐｒｏｔｏ４ベクター内のコドンを最適化した
ＦＶＩＩＩ配列内のエクソン１およびエクソン２の間に挿入した。４９３４塩基長の得ら
れるＰｒｏｔｏ５ベクターは、図３Ｂに模式図で示され、この配列は配列番号６に記載さ
れる。
Ｂドメインおよびａ３ドメイン欠失ＦＶＩＩＩの発現をさらに増加させる試みにおいて
、３４塩基 ヒトＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーの第２コピーを、Ｐｒｏｔｏ５ベクター内
に、順配向または逆配向に挿入した。４９３４塩基長であり、イントロンの順配向Ａｐｏ
Ｅ／Ｃ１エンハンサーを有する得られるＰｒｏｔｏ６ベクターは、図３Ｃに模式図で示さ
れ、この配列は配列番号７に記載される。
４９３４塩基長であり、イントロンの逆配向ＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサーを有する得ら
れるＰｒｏｔｏ７ベクターは、図３Ｄに模式図で示され、この配列は配列番号８に記載さ
れる。
Ｐｒｏｔｏ４、Ｐｒｏｔｏ５、Ｐｒｏｔｏ６およびＰｒｏｔｏ７ベクター核酸をｐＵＣ
１９細菌発現プラスミド内にクローニングすることによって、二本鎖形態のＡＡＶ ＦＶ
ＩＩＩベクターを作製した。
実施例３
ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの発現および活性を試験するためのアッセイ
本発明のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを試験するためのアッセイは、例えば、（１）ヒ
ト肝臓由来の細胞株であるＨｅｐＧ２細胞におけるＡＡＶベクター核酸を含む二本鎖ＤＮ
Ａプラスミドの一過性導入による、肝臓特異的なｍＲＮＡ発現およびスプライシング、並
びにＦＶＩＩＩタンパク質の産生および分泌のインビトロにおけるチェック；（２）２９
３細胞およびバキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを含む
ＡＡＶウイルス粒子の生産；（３）アルカリ性ゲル解析および複製アッセイによるＡＡＶ
ベクター核酸の評価；並びに（４）Ｒａｇ２マウスにおけるＦＶＩＩＩ発現、ＦＶＩＩＩ
活性、およびＦＶＩＩＩ比活性の評価を含む。
一過性導入アッセイ
予備的なインビトロアッセイが行われ、本発明のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターからのＦ
ＶＩＩＩの発現および活性が、ＵＣＬ ＳＱベクターからのＦＶＩＩＩの発現および活性
と比較される。本発明のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの二本鎖形態が、ヒト肝細胞株であ
るＨｅｐＧ２に一過性導入される。トランスフェクションの後、例えば、２４または４８
時間後、培養上清中のＦＶＩＩＩの抗原および活性が測定される。
このアッセイを用いた場合、Ｐｒｏｔｏ１、Ｐｒｏｔｏ１ＳおよびＰｒｏｔｏ２Ｓベク
ターを一過的導入されたＨｅｐＧ２細胞におけるＦＶＩＩＩ活性は、ＵＣＬ ＳＱベクタ
ーを用いて得られたＦＶＩＩＩ活性と同様であり、このことは、Ｐｒｏｔｏ１、Ｐｒｏｔ
ｏ１ＳおよびＰｒｏｔｏ２Ｓベクターが、機能的な第ＶＩＩＩ因子タンパク質を発現可能
であることを示している。
２９３細胞およびバキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＡＡＶウイルス粒子の産生
本発明のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターがＦＶＩＩＩをコードする核酸を確かにパッケー
ジングしていることを示すために、実施例１および２に記載されるように作製された二本
鎖形態のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターを、ＡＡＶウイルス粒子を産生可能な細胞内に導入
した。第一のＡＡＶウイルス産生系では、二本鎖形態のＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター核酸
を含むプラスミドを、ＡＡＶ ＣａｐおよびＲｅｐタンパク質を発現するプラスミド並び
にＡＡＶウイルス粒子産生に必要なアデノウイルスヘルパー機能を発現するプラスミドと
共に、２９３細胞に同時導入する。第二のＡＡＶウイルス産生系では、ＡＡＶ ＦＶＩＩ
Ｉベクター核酸を発現するバキュロウイルスコンストラクト、並びにＡＡＶ Ｃａｐおよ
びＲｅｐタンパク質を発現するバキュロウイルスコンストラクトを作製し、その後、昆虫
Ｓｆ９細胞に同時感染させる。一過性導入された２９３細胞またはバキュロウイルス感染
Ｓｆ９細胞内で産生される、得られるＡＡＶウイルス粒子を、当該技術分野において公知
の標準方法によって精製および解析する。
アルカリ性ゲルアッセイおよび複製アッセイによる評価
アルカリ性ゲル電気泳動アッセイを用いて、パッケージングされた核酸のサイズを決定
する。複製中心アッセイを用いて、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターが両方のパッケージング
法によってインタクトな形態でパッケージングされているかどうかを決定する。
プライマー伸長アッセイを用いて、完全な末端を有する、すなわち、ＡＡＶ２ ５’Ｉ
ＴＲ（センス鎖）または３’ＩＴＲ（アンチセンス鎖）内のヘアピンループの５’末端に
おいて終結している、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター核酸の量を定量化する。
あるいは、ＰＣＲアッセイを用いて、ＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクター核酸が完全な末端を
有しているかどうか、すなわち、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ（センス鎖）または３’ＩＴＲ（
アンチセンス鎖）内のヘアピンループの５‘末端において終結しているかどうかを決定す
る。
Ｒａｇ２マウスにおける評価
一過性導入された２９３細胞またはバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞パッケージ化ベク
ターにおいて産生されるＡＡＶウイルス粒子を、静脈内に与えられる２ｅ１１、２ｅ１２
、および２ｅ１３ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｋｇで、Ｒａｇ２マウスにおいて、ＦＶＩＩ
Ｉの発現および活性について試験する。ＦＶＩＩＩの発現および／または活性はＡＡＶウ
イルスまたはヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対する宿主免疫応答の存在によって複雑化され
ないため、Ｒａｇ２マウスを本アッセイで使用する。
ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いて、ＦＶＩＩＩ抗原を決定する。ＦＸａ活性化アッ
セイおよび／または凝固アッセイを用いて、ＦＶＩＩＩ活性を決定する。ＦＶＩＩＩ抗原
アッセイおよびＦＶＩＩＩ活性アッセイを用いて、ＦＶＩＩＩ比活性を決定する。
現在好ましいその実施形態を考慮することによって、本発明の実施における多数の変更
形態および変形形態の発生が当業者に予期される。従って、本発明の範囲に係るべき唯一
の限定は、添付の特許請求の範囲に現れるもののみである。
実施例４
改善されたプロモーター／エンハンサー配列を有するコンストラクトの作製
機能的ＦＶＩＩＩの発現を増加させる強力なプロモーターを有するさらなるＡＡＶベク
ターを作製するため、改変されたエンハンサー配列および／またはプロモーター配列を有
するコンストラクトを作製した。いくつかの実施形態では、前記コンストラクトは、短縮
型のＡｐｏＥエンハンサーまたはμグロブリン・エンハンサーを含んだ。これらのコンス
トラクトを標準的なＤＮＡクローニング技術を用いて作製し、その配列を配列ＩＳ番号９
〜４５に示す。
実施例５
ＡＡＶウイルス粒子の作製
組換えバクミドの作製
ＤＨ１０ Ｂａｃコンピテント細胞を氷上で解凍した。組換えシャトルプラスミド（例
えば、ｐＦＢ−ＧＦＰ）を添加し、コンピテント細胞と穏やかに混合し、氷上で３０分間
インキュベートした。次に、コンピテント細胞をおよそ４２℃の温度で３０秒間加熱し、
その後氷上で２分間冷却した。このコンピテント細胞を４２℃で３０秒間ヒートショック
し、氷上で２分間冷却した。ＳＯＣを細胞に添加し、撹拌しながら３７℃で４時間インキ
ュベートして、組換えを起こさせた。インキュベーション中、２枚のＬＢプレート（形質
転換のための種々の抗生物質（例えば、カナマイシン、ゲンタマイシンおよびテトラサイ
クリン）を追加で含有する 上にＸ−ｇａｌを、続いてＩＰＴＧを塗布した。
ある量のインキュベーション混合物が得られ、これを希釈した後、前記２枚のＬＢプレ
ート上に塗布し、３７℃でおよそ３０〜４８時間インキュベートした。いくつかの白色コ
ロニーを各プレートから選択し、ＬＢプレート中に与えられた同一の抗生物質の組合せを
含有するＬＢ培地中で一晩培養した。次に、バクミドＤＮＡおよびグリセロールストック
を調製し、−８０℃で保存した。
組換えバクミドＤＮＡの精製
ある量のバクミド・グリセロール・ストックを取り出し、実施例１に記載のＬＢプレー
ト中に与えられた同一の抗生物質の組合せを含有するＬＢ培地中でインキュベートする。
培養物を３７℃で一晩、振盪させながら増殖させる。次に、ある量の前記培養物を微量遠
心管内で最高速度でおよそ３０秒間スピンさせる。
ピペットを用いてペレットを再懸濁緩衝液中で再懸濁し、次に溶解緩衝液を加え、管を
数回反転させて緩衝液を混合し、次いで室温でおよそ５分間インキュベートした。例示的
な再懸濁緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＬ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよ
び１００μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡを含む。例示的な溶解緩衝液は、２００ｍＭ ＮａＯ
Ｈおよび１％ＳＤＳを含む。ある量の沈殿緩衝液（precipitate buffer）（例えば、３
．０Ｍ酢酸カリウムを含有する緩衝液（ｐＨ５．５））をゆっくりと加え、管を数回反転
させて緩衝液を混合し、次いで氷上でおよそ１０分間インキュベートした。管を最大速度
でおよそ１０分間遠心し、上清を、イソプロパノールを含有する管内に注いだ。管を数回
反転させて溶液を混合した。
次に、前記溶液を室温でおよそ１５分間、最大速度で遠心し、ピペットを用いて遠心分
離した直後に上清を取り除いた。
ある量の７０％エタノールを加えてペレットをリンスし、再度最大速度で１分間スピン
した。次にエタノールを除去し、溶液を再度スピンして微量のエタノールを取り除く。あ
る量のＴＥ／ＥＢ緩衝液を各管に加え、ペレットをピペットで注意深く溶解させる。すぐ
に使用しない場合はこの溶液を−２０℃で保存した。
組換えバキュロウイルスのＰ０ストックの作製
Ｓｆ９細胞を６ウェルプレート内におよそ１×１０６細胞／ウェル（または１０ｃｍプ
レート内に６×１０６細胞もしくは１５ｃｍディッシュ内に１．７×１０７細胞）で播種
し、トランスフェクションの前に少なくとも１時間細胞を付着させた。
トランスフェクション溶液ＡおよびＢを以下の通りに調製する。溶液Ａ：ある量のバク
ミドを、１５ｍＬ管内の抗生物質を含有しないある量の無血清培地中に希釈した。溶液Ｂ
：ある量のセルフェクチンを、１５ｍＬ管内の抗生物質を含有しないある量の無血清培地
中に希釈した。溶液Ｂを溶液Ａに加え、ピペットでおよそ３回、ピペットで穏やかに混合
し、室温で３０〜４５分間インキュベートした。次に、プレートからの培地を吸引し、あ
る量の抗生物質非含有無血清培地を加えて細胞を洗浄した。抗生物質を含有しないある量
のＳＦ９００ＩＩを、脂質−ＤＮＡ混合物を含有する各管に加えた。
細胞からの培地を吸引し、トランスフェクション溶液を細胞に加え、細胞を２８℃でお
よそ５時間インキュベートした。トランスフェクション溶液を除去し、ある量の無血清培
地および抗生物質を加え、２８℃でおよそ４日間インキュベートした。組換えバキュロウ
イルスを含有する培地を収集し、１０００ｒｐｍでおよそ５分間回転させて細胞片を除去
した。バキュロウイルスを４℃暗下で保存した。
バキュロウイルス（Ｐ１）の増幅
Ｓｆ９細胞をおよそ４×１０６細胞／ｍＬに増殖させ、振盪フラスコ内で新鮮な培地で
およそ２×１０６細胞／ｍＬに希釈した。ある量のＳｆ９細胞に、ある量のＰ０ストック
バキュロウイルスを感染させた。感染効率（ＭＯＩ）はおよそ０．１である。
Ｓｆ９細胞をおよそ３日間インキュベートし、バキュロウイルスを回収した。細胞を２
，０００ｒｐｍで５分間スピンして細胞をペレット状にし、上清を収集し、４℃暗下で保
存した。クロンテック社のＲａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔプロトコルに従ってバキュロ
ウイルスの力価を決定した。
Ｐ１組換えバキュロウイルスを用いたＡＡＶの生産
Ｓｆ９細胞を約１×１０７細胞／ｍＬに増殖させ、約５×１０６細胞／ｍＬに希釈した
。希釈したある量のＳｆ９細胞に、Ｂａｃ−ベクター（５Ｍｏｉ）およびＢａｃ−ヘルパ
ー（１５Ｍｏｉ）を３日間感染させた。３日目に細胞生存率を評価した（およそ５０％〜
７０％の死細胞が観察される）。
３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により細胞ペレットを回収した。培地を除去し、
細胞を溶解させた（または、すぐに使用しない場合は細胞ペレットを−２０℃で保存した
）。
溶解およびバンド形成（banding）のプロトコル
ある量のＳｆ９溶解緩衝液およびベンゾナーゼ（Benzonase）を核細胞ペレットに加え
、十分にボルテックスして細胞を再懸濁させる。再懸濁したＳｆ９細胞を氷上でおよそ１
０分間インキュベートして、可溶化液を冷却した。可溶化液をおよそ２０秒間超音波処理
して細胞を十分に溶解させ、次に３７℃でおよそ３０分間インキュベートした。
ある量の５Ｍ ＮａＣｌを添加し、混合物をボルテックスした後、３７℃でさらに３０
分間インキュベートした。ある量のＮａＣｌを添加して塩濃度を約５００ｍＭにし、ボル
テックスし、８，０００ｒｐｍ、１５℃で２０分間遠心して、清澄な可溶化液を作製した
。
清澄可溶化液を超遠心段階に進ませる。長い針を有する注射器を通じて、最初に清澄可
溶化液、次にある量の１．３２ｇ／ｃｃ、およびある量の１．５５ｇ／ｃｃ ＣｓＣｌ溶
液を添加することにより、ＣｓＣｌ勾配を調製した。ＣｓＣｌ溶液間の接触面に印を付け
た。ＰＢＳを遠心管の頂部まで加え、管を注意深く平衡させ、密封した。
管を５５，０００ｒｐｍ、１５℃でおよそ２０時間遠心した。各管の頂部に穴をあけ、
２つのＣｓＣｌ溶液の接触面マークの少し上に位置するＡＡＶバンドに印を付ける。
ＡＡＶ溶液を７０．１ Ｔｉローター用遠心管に移して第二のＣｓＣｌ遠心分離を行い
、管の頂部近くまである量のＣｓＣｌ溶液を加えた。管を平衡させ密封した。管を６５，
０００ｒｐｍでおよそ２０時間遠心し、ＡＡＶバンド（より低いバンド、より高いバンド
は空のカプシドである）を収集した。
実施例５
Ｒａｇ２マウスにおけるコンストラクトの評価
コドン最適化ＳＱ ＦＶＩＩＩコード遺伝子配列を含むＡＡＶゲノムを、ＵＣＬ ＳＱ
、Ｐｒｏｔｏ１、ＰｒｏｔｏＳ１、ＰｒｏｔｏＳ２およびＰｒｏｔｏＳ３コンストラクト
を用い、バキュロウイルスおよび２９３細胞を用いて作製した。パッケージングの限界は
、バキュロウイルスが４８００ｂｐ、２９３細胞が４９５０である。
図５に示すように、切断型または非切断型のゲノムを有するＰｒｏｔｏ１は、ＵＣＬ
ＳＱコンストラクトと同様に、ＦＶＩＩＩを形質導入する。４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ
Ｇｅｌ上で測定される、バキュロウイルスおよび２９３Ｔ細胞可溶化物から生じるＡＡ
Ｖ５．２。図６に示すように、各試料はＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質を発現し
た。図７に示すように、ＡＡＶ試料から得られたゲノムＤＮＡを０．８％アルカリ性アガ
ロースゲル上で泳動した。
これらのＡＡＶがバキュロウイルス系によって作られた場合、Ｐｒｏｔｏ１の形質導入
はＵＣＬ ＳＱコンストラクトと同様であった。イントロンを含有するＰｒｏｔｏ２Ｓお
よび３Ｓの包含は、Ｐｒｏｔｏ１よりも良好に形質導入しなかった。２９３細胞内で作ら
れたＡＡＶフランキング配列を含有するＵＣＬ ＳＱベクターは、バキュロウイルス内で
つくられたＡＡＶ配列を欠くＵＣＬ ＳＱよりも強力であった。結果として、作用強度を
増加させる試みにおいて、追加のエンハンサーをＰｒｏｔｏ１、例えばコンストラクト１
０１、１０２、１０２および１０４に付加した。
実施例６
改善されたプロモーター配列／エンハンサー配列を有するＡＡＶ ＦＶＩＩＩベクターの
発現および活性
コンストラクト９９〜コンストラクト１０６を含むＡＡＶベクターの発現および活性を
、水圧注入プロトコルを用いて試験した。水圧による送達は、インビボで肝臓プロモータ
ーをスクリーニングするための迅速な方法である。実施例５に記載の方法を用いてＡＡＶ
プラスミドＤＮＡを作製し、次にＴｒａｎｓＩＴ−ＱＲ Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｄ
ｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中で希釈した。プラスミドＤＮＡを、（マウス重量（
ｇ）／１０）＝０．１ｍＬ送達溶液）によって決定される体積で、５〜６週齢Ｃ５７Ｂｌ
／６マウス（１８〜２５ｇ）の尾静脈に注射した。注射時間は５秒間未満であった。各マ
ウスからの血漿を注射の４８時間後に採取し、発現されたＦＶＩＩＩ抗原の量を、ＥＬＩ
ＳＡアッセイを用いて測定した。
漸増量のＰｒｏｔｏ１プラスミド（２．５、５、１２．５および５０μｇ）をマウスの
尾静脈に注射した。注射されたマウスの血漿中のＦＶＩＩＩの量をＥＬＩＳＡ試験を用い
て測定し、組換えＦＶＩＩＩ（Ｘｙｎｔｈａ ＳＱ等価）を比較のための標準物質として
用いた。
発現を調べるため、コンストラクトｐ１００〜４００、コンストラクト１００（ｐ１０
０）、コンストラクトＦＶＩＩＩ−ＢＭＮ００１（ｐＦＶＩＩＩ−ＢＭＮ００１）、Ｐｒ
ｏｔｏ１、コンストラクト１００ＡＴ（ｐ１００−ＡＴ）、コンストラクト１００ ｂＧ
ＨポリＡ（ｐ１００−ｂＧＨＰＡ）、コンストラクト１０１（ｐ１０１）およびコンスト
ラクト１０４（ｐ１０４）の改善されたプロモーター／エンハンサー・エレメント。図８
に示すように、全てのコンストラクトが機能的なＦＶＩＩＩを種々の効率レベルで生産し
た。
図９および図１０は、種々のコンストラクトのプラスミド１μｇの注射についてのデー
タを示す。図８に示すように、コンストラクトＦＶＩＩＩ−ＢＭＮ００１、コンストラク
トＦＶＩＩＩ−ＢＭＮ００２、コンストラクト１０２（ｐ１０２）、コンストラクト１０
３（ｐ１０３）およびコンストラクト１０４（ｐ１０４）の注射は、１０匹中５匹のマウ
スにおいて少なくとも２０ｎｇのＦＶＩＩＩの発現をもたらした。図９に示すように、コ
ンストラクトＦＶＩＩＩ−ＢＭＮ００１、コンストラクト１０３（ｐ１０３）、コンスト
ラクト１０３−ＡＴ（ｐ１０３−ＡＴ；３９８ｂｐ ｈＡＡＴプロモーター）、コンスト
ラクト１００（ｐ１００）、コンストラクト１００ＡＴ（ｐ１００−ＡＴ；３９８ｂｐ
ｈＡＡＴプロモーター）の注射は、１０匹中５匹のマウスにおいて少なくとも１００ｎｇ
／ｍｌのＦＶＩＩＩの発現をもたらした。

Claims (1)

  1. 図面に記載の発明。
JP2021024332A 2013-09-12 2021-02-18 アデノ随伴ウイルス第ｖｉｉｉ因子ベクター Withdrawn JP2021072871A (ja)

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