JP2024541000A

JP2024541000A - アデノ随伴ウイルスカプシドタンパク質の突然変異体

Info

Publication number: JP2024541000A
Application number: JP2024524454A
Authority: JP
Inventors: ジェ－ヒョン・ジャン; ユ・ジン・キム
Original assignee: グルジーン・セラピューティクス・インコーポレイテッド
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2022-11-18
Publication date: 2024-11-06

Abstract

本発明は、アデノ随伴ウイルス血清型１（ＡＡＶ１）カプシドタンパク質の突然変異体であって、前記突然変異体は、野生型のＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較して４３０位のセリンがシステインに置換され、６４７位のイソロイシンがバリンに置換されたＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体、前記ＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体をコードする核酸、前記ＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体をコードする核酸を含む組換えＡＡＶ１ベクター、前記ベクターを含む薬剤学的組成物を提供する。特に、ＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体をコードする核酸を含む組換えウイルスベクターは、気管支を通じてエアロゾル状態で伝達する際、肺血管標的細胞における導入遺伝子の発現が向上されて肺動脈高血圧症の予防または治療に有用である。

Description

本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質の突然変異体に関し、特にＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体を含む組換えウイルスベクターは、気管支を通じてエアロゾル状態に伝達する際、肺血管標的細胞における導入遺伝子の発現に有用である。

遺伝子治療を効果的に行うためには、治療遺伝子を所望の標的細胞に伝達し、高い発現効率が得られるようにする遺伝子伝達技術の開発が最優先される。

このような遺伝子伝達技術のうち、ＡＡＶは、非病原性ウイルスとして浸透された感染細胞に副作用がなく、対象細胞の遺伝子情報に突然変異を起こす確率が低いため、他の遺伝子治療技術に対して安全性に優れている。

ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ）は、分裂または分裂しない細胞の両方に感染させることができるｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐｅｄの一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは、ヘルパーウイルスが存在する場合にのみ複製が可能であり、ヒトにとっては非病原性である。このような特徴により様々な細胞に遺伝子を導入する有用な方法であり、遺伝子治療のための有用なベクターとして使用されている。

ＡＡＶは、様々な血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）が存在し、血清型によってｈｏｓｔやウイルスの特徴が異なることが知られている。血清型２（ＡＡＶ２）は、古くから広く研究されてきた血清型で、様々な細胞を感染させることができる。血清型１（ＡＡＶ１）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）は、より組織感染特異性を持つ血清型で、ＡＡＶ１は、筋肉、肝臓、気道、中枢神経系などに、ＡＡＶ５は、中枢神経系、肝臓、網膜などに、ＡＡＶ６は、心臓、筋肉、肝臓などに対する遺伝子導入効率が高いことが知られている。特定組織への遺伝子伝達特性が血清型によって異なるが、依然として他組織への伝達が容易であるため、組織特異性を向上させて安全性と効率性を改善させることができる新しいＡＡＶベクターの開発が必須的であるといえる。

一方、肺動脈高血圧症は、特別な理由もなく肺細動脈が狭くなる疾患で、肺動脈の圧力が上昇して右心室の機能が低下する疾患である。息切れ、めまいなど日常でよく経験するものが主な症状であるため、そのまま見過ごされたり、他の疾患と考えられやすい。このような理由で患者が診断を受けるまで時間がかかる場合が多い。

実際、疾病管理本部の調査によると、肺動脈高血圧症の正確な診断にかかる時間は平均１．５年であった。また、正確な診断のためには、高コストに加えて体内にワイヤを入れる心臓カテーテル検査が必要であった。

血液が心臓から肺に円滑に伝達されず、呼吸困難、心不全、ひどい場合は死亡に至ることもある。医学技術の持続的な発展にもかかわらず、肺動脈高血圧症の５年生存率は、半分程度に過ぎない。予後が非常に悪いので、適切な早期診断と治療が重要である。

ＡＡＶカプシドタンパク質を変形させることによって遺伝子導入効率を向上させる試みが行われているが、肺血管を標的部位とするアデノ随伴ウイルスに対する研究は、まだ報告されていない。

国際公開番号第２０１７－２０１１２１号（２０１７．１１．２３．）日本特許公開２０２１－００１０３７２号（２０２１．０２．０４．）

そこで、本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意努力した結果、肺動脈高血圧症の根本的な遺伝的原因を解決する遺伝子治療剤を伝達する潜在力のある肺血管を標的とする新しいアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型１のカプシドを基本骨格とするタンパク質変異体を開発することにより、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、組換えＡＡＶによる標的細胞への遺伝子導入効率の向上及び／又は遺伝情報発現効率の向上のためにＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体を提供することである。

また、本発明の他の目的は、前記ＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体をコードする核酸を提供することである。

また、本発明の他の目的は、前記ＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体をコードする核酸を含む組換えＡＡＶ１ベクターを提供することである。

また、本発明のさらに他の目的は、前記組換えＡＡＶ１ベクターを含む薬剤学的組成物を提供することである。

また、本発明のさらに他の目的は、治療的有効量の前記薬剤学的組成物を対象体に投与する段階を含む、肺高血圧症の予防または治療方法を提供することである。

本発明は、肺血管を特異的に標的化して高効率遺伝子伝達能を有する組換えＡＡＶ１カプシド変異体に関し、ＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体をコードする核酸を含む組換えウイルスベクターは、気管支を通じてエアロゾル状態で伝達する際、肺血管標的細胞における導入遺伝子の発現に有用であり、肺血管疾患の予防または治療が可能である。

図１は、組換えＡＡＶ１ベクター（＃２-３変異体）の３Ｄ構造を示したものである。図２ａは、＃２-３変異体の開裂地図を示したものである。図２ｂは、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド開裂地図を示したものである。図２ｃは、ｐＣＭＶＧＦＰプラスミド開裂地図を示したものである。図２ｄは、ｐＣＭＶＬａｃＺプラスミド開裂地図を示したものである。図３は、本発明による配列番号５で表される組換えＡＡＶ１ベクター（＃２-３変異体）の全塩基配列を示したものである。図４は、野生型ＡＡＶ１ベクターの全塩基配列を示したものである。図５は、野生型ＡＡＶ１と本発明の組換えＡＡＶ１ベクター（＃２-３変異体）のパッケージング効率（ｐａｃｋａｇｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を定量的ＰＣＲ分析を通じてゲノミック力価を比較したものである。図６は、ヒト肺動脈平滑筋細胞（ＨＰＡＳＭＣ）の形質導入効率の向上を全培養細胞のうちＧＦＰを発現する細胞の割合で分析したものである。図７は、組換えＡＡＶ１ベクター（＃２－３変異体）の肺組織内の血管特異性を確認するため、８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスから摘出された肺の全体にマウントβ－ガラクトシダーゼを染色してＬａｃＺ発現を確認した肺組織内の効率的な局所伝達結果を示したものである。図８は、組換えＡＡＶ１ベクター（＃２-３変異体）の肺血管平滑筋細胞標的化を定量化したものである。図９は、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）上で組換えＡＡＶ１ベクター（＃２-３変異体）のブラウン運動（Ｂｒｏｗｎｉａｎｍｏｔｉｏｎ）を確認したものである。図１０は、組換えＡＡＶ１ベクター（＃２-３変異体）をｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎした後、血管ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌへのターゲティング及び分布を確認したものである。図１１は、組換えＡＡＶ１ベクター（＃２－３変異体）の直径１００μｍ以上のサイズの血管内のＬａｃＺ発現をｘ－ｇａｌ染色を通じて確認したものである［Ｖ：Ｖｅｓｓｅｌ血管、Ｂ：Ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｅ気管支］。

以下、本発明をより詳細に説明すると、次の通りである。

本発明は、アデノ随伴ウイルス血清型１（ＡＡＶ１）カプシドタンパク質の突然変異体に関する。

本発明で使用される用語の「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」とは、遺伝子治療法において使用するすべてのアデノ随伴ウイルスをそれらの誘導体、ウイルス亜型、自然発生及び組換え形態を含んで指す。ＡＡＶの様々な血清型は、多数の互いに異なる細胞タイプを形質導入するための組換え遺伝子伝達ウイルスとして使用してもよい。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列だけでなく、天然末端反復体（ｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ：ＴＲ）の配列、Ｒｅｐタンパク質及びカプシドサブユニットは、当業界で公知である。このような配列は、文献またはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）などのパブリックデータベースで見つけることができる。例えば、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＮＣ＿００２０７７（ＡＡＶ－１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ－１）を参照してもよい。

本発明で使用される用語の「血清型」とは、血清学的またはＤＮＡ配列分析法によって同定され、その抗原特性によって区別できるＡＡＶの細分された一部分を意味する。

本発明で使用される用語の「カプシド」とは、ウイルスのゲノムに存在するｃａｐ遺伝子にコードされるタンパク質で、ウイルスの外殻を構成するタンパク質を意味する。野生型ＡＡＶゲノムまたはｃａｐ遺伝子は、３種類のカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）をコードする。本明細書では、そのすべてがカプシドタンパク質に含まれる。野生型ＡＡＶ１カプシドタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む。

一具現例において、本発明は、アデノ随伴ウイルス血清型１（ＡＡＶ１）カプシドタンパク質の突然変異体であって、前記突然変異体は、野生型のＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較して４３０位のセリンがシステインに置換され、６４７位のイソロイシンがバリンに置換されたＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体を含む。

一具現例において、本発明によるＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体は、配列番号３で表されるアミノ酸配列（ＶＰ１）を含むか、またはそれからなる。ＶＰ２は、配列番号３のＴ１３８から最後までのアミノ酸配列に対応し、ＶＰ３は、配列番号３のＭ２０３から最後までのアミノ酸配列に対応する。

本願の実施例では、本発明によるＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体を＃２－３と命名した。

本発明で使用される用語の「野生型」とは、種の中で、野生の集団に最も多くみられる型を意味する。突然変異型について、野生型は、基本と考えられる表現型またはその個体を指す。野生型は別名として「正常型」とも呼ばれる。また、本明細書において「突然変異体」とは、突然変異を起こした遺伝子が形質的な変化として現れるタンパク質、ウイルス、細胞、個体などを意味する。また、本明細書において「突然変異体」とは、突然変異を起こした遺伝子そのものを指すこともある。

一具現例において、本発明は、前記ＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体をコードする核酸を含む。本発明の核酸は、前記ＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体をコードする。本発明の核酸は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質をコードする核酸（ｃａｐ遺伝子）の塩基配列において少なくとも１つの塩基が他の塩基に置換されることにより、作製される。本発明の核酸は、ＤＮＡの形態で存在してもよいが、場合によってはＲＮＡの形態であってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとのキメラであってもよい。また、本発明の核酸には相補的な核酸（例えば、ｃＤＮＡ）も含まれる。本発明の核酸は、シングル－ストランドであってもよく、ダブル－ストランドであってもよいが、好ましくは、ダブル－ストランドである。

本発明は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体をコードする核酸として特に限定されないが、一具現例において配列番号４で表される塩基配列を有する核酸が挙げられる。

本発明の核酸は、適切な制御配列と作動可能に連結してもよい。制御配列には、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流の調節ドメイン、内部リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙｓｉｔｅｓ：ＩＲＥＳ）、エンハンサーなどが含まれる。プロモーター配列には、誘導性プロモーター配列、構成的プロモーター配列が含まれる。制御配列は、カプシドタンパク質の由来となるＡＡＶに固有のものであってもよく、外来性のものであってもよく、天然配列であってもよく、合成配列であってもよい。本発明の核酸を含むＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体を発現可能な組換えＤＮＡも本発明に含まれる。

前記組換えＤＮＡは、試験管内、生体外及び生体内の細胞に本発明の核酸を伝達し、当該細胞にＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体を発現する能力を与えるのに有用である。そして、本発明の核酸が伝達された細胞は、組換えＡＡＶ粒子を製造するのにも有用である。当該組換えＤＮＡは、特に真核細胞、好ましくは、動物細胞、より好ましくは、哺乳類細胞に本発明の核酸を伝達または導入するために使用してもよい。

本発明では、ベクターとして使用されているＤＮＡに本発明の核酸を保有させて組換えＤＮＡを作製してもよい。例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーマルＤＮＡ、ウイルスゲノムなどを使用してもよい。

例えば、プラスミドに本発明のＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体をコードする核酸（ｃａｐ遺伝子）を保有させることにより、パッケージングプラスミドを作製してもよい。パッケージングプラスミドは、さらにレプリカーゼ（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする核酸（ｒｅｐ遺伝子）などの任意の核酸配列を含んでもよい。好ましくは、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２由来のＲｅｐを追加してもよい。

公知のパッケージングプラスミドに搭載されたｃａｐ遺伝子の核酸配列において、ＰＬＡ２ドメインコード領域における少なくとも１つの塩基を他の塩基に置換することによっても、本発明の核酸を含む組換えＤＮＡを作製しうる。前記パッケージングプラスミドとして特に限定されないが、ｃａｐ遺伝子を搭載したパッケージングプラスミド、好適にはｃａｐ遺伝子とｒｅｐ遺伝子を搭載したパッケージングプラスミドが挙げられる。一例として、本発明では、本発明のＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体をコードする核酸（ｃａｐ遺伝子）とｒｅｐ遺伝子を搭載したパッケージングプラスミドである配列番号５で表される組換えＡＡＶ１ベクター、ｐ＃２－３を作製した。

核酸に塩基の置換を導入する方法は、公知の方法により行うことができ、特に限定されないが、市販の試薬、例えば、ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＢａｓａｌＫｉｔ（ＴＡＫＡＲＡＢＩＯＩＮＣ．）を使用し、キットに付属の説明書に従ってＰＣＲを行うことによって達成しうる。

したがって、本発明は、遺伝子治療の適用のための新規のＡＡＶ１＃２－３変異体であって、ＡＡＶ１カプシドタンパク質変異体をコードする核酸を含む組換えＡＡＶ１ベクターを含む。

本発明の組換えＡＡＶベクターは、標的細胞への遺伝子導入に有用である。本発明の組換えＡＡＶベクターによって導入された遺伝子は、前記標的細胞において強く発現される。

本明細書で使用される用語の「ＡＡＶベクター」とは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の成分を含むか、またはこれらの成分から由来し、脳、心臓、肺、骨格筋、肝臓、腎臓、脾臓または膵臓などの任意の多くの組織タイプのヒト細胞を含む哺乳類細胞を試験管内または生体内にかかわらず、感染させるのに適した任意のベクターを指す。用語の「ＡＡＶベクター」とは、関心のあるタンパク質をコードする少なくとも核酸分子を含むＡＡＶ型ウイルス粒子（またはビリオン）を指すために使用されてもよい。

本明細書で使用される用語の「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（野生型ＡＡＶのすべてのカプシドタンパク質による）及びカプシド内に移入された（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅｄ）ポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳類細胞に伝達される移植遺伝子）を含む場合、これは典型的に「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ｒＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ｒＡＡＶ粒子の生成は必然的にｒＡＡＶの生成を含むが、このようなベクターがｒＡＡＶ粒子内に含まれるためである。

「パッケージング」とは、ＡＡＶ粒子の組立体及びカプシド内の移入を引き起こす一連の細胞内事件を指す。

ＡＡＶ「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製及びカプシド内の移入タンパク質を暗号化するポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐは、本明細書においてＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と呼ばれる。

ＡＡＶに対する「ヘルパーウイルス」とは、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳類細胞によって複製され、パッケージングされるようにするウイルスを指す。アデノウイルス、ルペスウイルス、及びワクシニアなどのフォックスウイルスを含む、ＡＡＶに対する様々な、このようなヘルパーウイルスは、当業界で公知である。サブグループＣのタイプ５のアデノウイルスが最もよく使用されるが、アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを含む。ヒト、非ヒト哺乳類及び鳥類由来の数多くのアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｅｓ：ＨＳＶ）及びエプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒｖｉｒｕｓｅｓ：ＥＢＶ）だけでなく、サイトメカロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ：ＣＭＶ）及び仮性狂犬病ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓｅｓ：ＰＲＶ）を含むが、これらはやはりＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。

「ヘルパーウイル機能（ら）」とは、ＡＡＶ複製及びパッケージング（本明細書に記載された複製及びパッケージングのための他の要求事項とともに）を許容するヘルパーウイルスゲノムにおいて暗号化された機能（ら）を指す。本明細書に記載されたように、「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供するか、または例えばトランスでプロデューサー細胞に必須機能（ら）を暗号化するポリヌクレオチド配列を提供することによって含まれる、様々な方法で提供されてもよい。例えば、少なくとも１つのアデノウイルスタンパク質を暗号化するヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは他の発現ベクターは、ｒＡＡＶベクターとともにプロデューサー細胞に形質感染される。

一具現例において、本発明によるＡＡＶ１ベクターは、野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶ１ベクターと比較すると、標的組織に対して向上された形質導入プロファイルを有する。すなわち、本発明によるＡＡＶ１ベクターは、明確な組織標的化能力（例えば、組織向性（ｔｉｓｓｕｅｔｒｏｐｉｓｍ））を有する。

本明細書において、用語の「向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）」とは、特定タイプの細胞または組織を感染または形質導入させるためのＡＡＶウイルス粒子に存在するＡＡＶカプシドタンパク質の特異性を意味する。

特定タイプの細胞または組織に対するＡＡＶカプシドの向性は、本明細書の実施例に開示されたような当業界でよく知られている標準分析法を使用し、ＡＡＶ１カプシドタンパク質を含んで特定タイプの細胞または組織を感染させるか、または形質導入するＡＡＶベクター粒子の能力を測定することにより、決定されてもよい。

すなわち、「向性」とは、少なくとも１つの特定の細胞タイプを感染させるＡＡＶベクターまたはビリオンの能力を意味するが、ベクターが少なくとも１つの特定の細胞タイプに細胞を形質導入するように機能するかどうかを含むこともできるところ、すなわち、向性は、特定の細胞または組織タイプ（ら）へのＡＡＶベクターまたはビリオンの優先的な導入及び／又は特定の細胞または組織タイプへの進入を容易にする細胞表面との優先的な相互作用の後、場合によって、及び好ましくは、細胞内においてＡＡＶベクターまたはビリオンによって運搬される配列の発現（例えば、転写及び場合によっては翻訳）、例えば、組換えウイルスの場合、異種ヌクレオチド配列（ら）の発現を意味する。

本明細書で使用する用語の「形質導入」とは、少なくとも１つの特定の細胞タイプを感染させるＡＡＶベクターまたはビリオンの能力を意味するところ、すなわち、形質導入は、ＡＡＶベクターまたはビリオンを細胞内に導入し、ＡＡＶベクターまたはビリオン内に含まれた遺伝物質を細胞に伝達してベクターゲノムから発現を得ることを意味する。すべての場合ではないが、一部の場合には形質導入と向性は相関関係がある。

本願に記載のＡＡＶは、少なくとも１つのカプシドタンパク質において新しい、または増強された組織向性の特性を付与するアミノ酸変形を含む。本願発明によるＡＡＶ１変形は、肺血管（例えば、肺動脈）を標的とする。

本明細書で使用される用語の「肺組織または肺血管の向性」とは、肺組織または肺血管に対する向性を意味する。

一具現例において、ペプチド－変形したハイブリッドＡＡＶカプシドタンパク質の肺血管の向性は、ペプチドを有していない野生型ＡＡＶカプシドタンパク質の肺血管の向性に比べて少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上またはそれ以上に増加する。

また、本発明は、前記組換えＡＡＶ１ベクターを含む薬剤学的組成物を含む。前記組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。

前記「薬学的に許容可能な担体」は、組成物の有効成分と組み合わせると、成分が意図しない免疫反応などの支障をきたす生理学的反応を引き起こすことなく、生物学的活性を有することを可能にする任意の物質を含む。薬学的に許容可能な担体としては、水、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）、オイル／水エマルジョンなどのエマルジョン、及び湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇａｇｅｎｔ）を含む。このような担体を含む組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｕｒｒｅｎｔＥｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，ＥａｓｔｏｎＰａ．１８０４２，ＵＳＡ；Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ”，２０ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓａｎｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌｅｔａｌ．，７ｔｈｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；ａｎｄＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅｅｔａｌ．，３ｒｄｅｄ．Ａｍｅｒ．ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｓｓｏｃに記載されているように、周知の従来の方法によって剤形化される。

一具現例において、本発明による薬剤学的組成物は、肺動脈高血圧症の予防または治療のための薬剤学的組成物であってもよい。

本明細書で使用される用語の「治療」とは、疾患関連症候群、合併症、症状又は生化学的徴候の進行、発達、重症度又は再発を反転、緩和、改善、阻害又は遅延又は予防しようとする目的で対象に行われた任意類型の介入又は過程、又は対象に活性剤を投与することを指す。治療は、疾患のある対象体又は疾患のない対象体（例えば、予防用）に対して行われてもよい。

また、一具現例において、本発明は、治療有効量の前記薬剤学的組成物を対象体に投与する段階を含む肺動脈高血圧症の予防または治療方法を含む。

本明細書で使用する「投与」とは、当業者に公知の様々な方法と伝達系のうち任意のものを用いて対象に治療剤又は治療剤を含む組成物を物理的に導入することを指す。好ましい投与経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄、硝子体内、又は例えば注射又は注入による他の非経口投与経路を含む。本明細書で使用する用語の「非経口投与」とは、一般に注射による腸内及び局所投与以外の投与方式を意味し、これに制限されないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病変内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、硝子体内、関節内、皮膜下、蜘蛛膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入だけでなく、生体内電気穿孔を含む。

本明細書で使用する用語の「治療有効量」とは、対象の疾患又は障害を「治療」したり、疾患又は障害（例えば、肺動脈高血圧症）の危険、潜在性、可能性又は発生を減少させるのに効果的な薬物単独又は他の治療剤と組み合わせた薬物の量を指す。「治療有効量」は、疾患又は障害（例えば、本明細書に開示の肺動脈高血圧症）を有するか、有する危険のある対象体に一部の改善又は実益を提供する薬物又は治療剤の量を含む。これによって、「治療有効量」は、疾患又は障害の危険、潜在性、可能性又は発生を減少させたり、又は一部緩和、軽減を提供し／又は少なくとも１つの指標（例えば、肺動脈高血圧症）を減少させ／又は疾患又は障害の少なくとも１つの臨床症状を減少させる量である。

本明細書で使用する用語の「対象体」とは、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。用語の「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両棲類、爬虫類などのような非哺乳類を含む。

以下、本発明による実施例を通じて本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が下記の実施例によって制限されるものではない。

［実施例］

実施例１：ＡＡＶライブラリーを用いた肺血管ｔｒｏｐｉｃＡＡＶ１カプシドタンパク質変異体の選別

１）ＡＡＶ１カプシドタンパク質変異体の選別
野生型ＡＡＶ変異体（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）のｃａｐ遺伝子にｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲを用いたランダムポイント突然変異誘発及び各血清型の３－ｆｏｌｄｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎにｒａｎｄｏｍ７ｍｅｒ／９ｍｅｒを挿入してプラスミドプールを作製した。ＡＡＶプラスミドライブラリー７－７０ｎｇ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ２５μｇ，ｐＨｅｌｐｅｒ２５μｇをカルシウム－ホスフェート複合体（ｃａｌｃｉｕｍ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｃｏｍｐｌｅｘ）を形成し、ＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションしてＡＡＶパッケージングを行い、各変異体のｃａｐ遺伝子情報を搭載したＡＡＶライブラリープールを作製した。

８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスをイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で呼吸麻酔した後、気道部位の皮膚を１ｃｍほど切開した。ＰｅｎＷｕｍｉｃｒｏ－ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒ（ＢｉｏＪａｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）（１．２５" ｌｅｎｇｔｈｏｆｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｐｏｒｔｉｏｎ，７００μｍｏｆｏｕｔｅｒｄｉａｍｅｔｅｒ，４３０μｍｏｆｉｎｎｅｒｄｉａｍｅｔｅｒ）にＰＢＳのうち１×１０^１１ｖｇ／１００μｌのＡＡＶライブラリープールをロードして気道にニードルが通過する様子を確認し、気管内注射（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を行った。

１週間後、０．９％の生理食塩水を心臓を通じて流して灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を行い、肺を摘出した。均質化（Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）後、ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて肺全体からＤＮＡを抽出し、ＡＡＶｃａｐ遺伝子特異的フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ）５’－ＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧ－３’（配列番号７）、リバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ）５’－ＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡ－３’（配列番号８）を用いて、肺全体に向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を示すＡＡＶ変異体のｃａｐ遺伝子を増幅した。これを肺向性（ｔｒｏｐｉｃ）ＡＡＶライブラリープールで作製し、前記と同様に気管内注射（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を行った（１×１０^１１ｖｇ／１００μｌ）。１週間後に灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）及び肺摘出を行い、３０秒間ｃｈｏｐｐｉｎｇして小片にした後、コラゲナーゼＩＩを用いてｓｉｎｇｌｅ細胞解離（ｃｅｌｌｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を行った。このとき、ＤＮａｓｅＩを添加してｄｅａｄｃｅｌｌから放出されたｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＤＮＡによる細胞クラスタリング（ｃｅｌｌｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を防止し、ｃｅｌｌｌｏｓｓを最小化しようとした。これを３７℃で４～６時間インキュベーションした後、ピペッティングを通じて単一細胞の形態のｔｏｔａｌｌｕｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを得て、ｒｅｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌｌｙｓｉｓを常温で光を遮断した状態で行った後、７０μｍのｐｏｒｅを持つｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒでろ過してＦＡＣＳバッファーに細胞を移した。その後、血管向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を示すＡＡＶ変異体を選別するために、１０μｇのＡＰＣ（Ａｎｔｉ－ａｌｐｈａｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ）を添加した後、４℃でインキュベーションを行った。その後、ＡＰＣｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓをｓｏｒｔｉｎｇして血管関連細胞を選別し、ｃｅｌｌｌｙｓｉｓ及びＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ後、プライマー（５’－ＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧ－３’：配列番号９）及び（５’－ＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡ－３’：配列番号１０）を用いて細胞内に移入されたＡＡＶ変異体のｃａｐ遺伝子を増幅した。増幅されたｃａｐｇｅｎｅ遺伝子は、両末端にＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩ配列を含み、これをｐＳｕｂ２プラスミドにＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ及びｌｉｇａｔｉｏｎを通じてサブクローニングしてＤＨ１０βに電気穿孔後、プラスミドを精製して（ＱｉａｇｅｎＰｌａｓｍｉｄＭａｘｉＫｉｔ）血管向性プラスミドプール（ｐｏｏｌ）の形態で保管した（ｐＳｕｂ２は、ｐＳｕｂ２０１（ＡＴＣＣ）に基づいてＵＣＢｅｒｋｅｌｅｙ，ＤａｖｉｄＳｃｈａｆｆｅｒＬａで作製したプラスミドで、ＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩを用いてｃａｐｇｅｎｅをｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇできるように作製される、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ１．ＮａｒｅｎｄｒａＭａｈｅｓｈｒｉｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６；２．ＪａｍｅｓＴＫｏｅｒｂｅｒ，ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００６）。計３ｒｏｕｎｄのｉｎｖｉｖｏ選別を経て選別された多様な変異体のうち、肺動脈高血圧症の予防及び治療用ＡＡＶ遺伝子伝達体として＃２－３変異体が最終選定され、これはＡＡＶ１ベースのｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎＳ４３０Ｃ、Ｉ６４７Ｖを保有していることが確認された（図１）。

２）組換えＡＡＶ１ベクター（ＡＡＶ１＃２－３変異体）の作製
（１）パッケージングプラスミド突然変異体の作製
血管向性プラスミドプールにおいてＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ制限酵素を通じて多数の血管向性ｃａｐ遺伝子をｃａｐ遺伝子の挿入のために、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩが導入されているｐＸＸ２（ＵＣＢｅｒｋｅｌｅｙ，ＤａｖｉｄＳｃｈａｆｆｅｒＬａｂ）にｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇしてｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅを搭載するための多数の血管特異的プラスミド突然変異体の作製を完了した。

（２）ＡＡＶ２９３細胞へのプラスミド導入
ＡＡＶ１＃２－３変異体の作製
突然変異体プラスミド１７μｇ、ＩＴＲｆｌａｎｋｅｄｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ（ｐＣＭＶ－ＧＦＰまたはｐＣＭＶ－ＬａｃＺまたはｐＣＭＶ－ＦＧＦ１２－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）１７μｇ、ｐＨｅｌｐｅｒ１７μｇをｃａｌｃｉｕｍ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｃｏｍｐｌｅｘを形成し、ＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションし、約４８時間後、細胞ペレットのみを集めて凍結－解凍（ｆｒｅｅｚｉｎｇ－ｔｈａｗｉｎｇ）を通じて細胞内のＡＡＶを抽出した。その後、遠心分離を通じて細胞破壊物（ｃｅｌｌｄｅｂｒｉｓ）を除去し、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）１０Ｕ／ｍＬを３７℃で３０分間インキュベーションしてウイルス産生細胞から出た核酸を除去した。

作製された＃２－３変異体の開裂地図は図２に示し、全塩基配列は図３と同じである。

野生型ＡＡＶ１の作製
ＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子とＡＡＶ１のｃａｐ遺伝子を含むパッケージングプラスミド１７μｇ、ＩＴＲｆｌａｎｋｅｄｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ（ｐＣＭＶ－ＧＦＰまたはｐＣＭＶ－ＬａｃＺまたはｐＣＭＶ－ＦＧＦ１２－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）１７μｇ、ｐＨｅｌｐｅｒ１７μｇをｃａｌｃｉｕｍ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｃｏｍｐｌｅｘを形成し、ＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションし、約４８時間後、細胞ペレットのみを集めて凍結－解凍（ｆｒｅｅｚｉｎｇ－ｔｈａｗｉｎｇ）を通じて細胞内のＡＡＶを抽出した。その後、遠心分離を通じて細胞破壊物（ｃｅｌｌｄｅｂｒｉｓ）を除去し、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）１０Ｕ／ｍＬを３７℃で３０分間インキュベーションしてウイルス産生細胞から出た核酸を除去した。

３）ＡＡＶ１＃２－３変異体の精製
ＡＡＶ溶液をイオディキサノールの勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用いて超遠心分離を行った。イオディキサノール溶液を１５％、２５％、４０％、５４％で作製し、順番に超遠心分離チューブにロードし、その上にＡＡＶ溶液をロードした。チューブシーリング（Ｔｕｂｅｓｅａｌｉｎｇ）後、ＯｐｔｉｍａＸＥ－９０Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（ＢＥＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲ）及びＶｔｉ６５．２ｒｏｔｏｒを用いて超遠心分離を行った（４２，０００ＲＰＭ、１８℃、２時間）。５４％と４０％のイオディキサノールの中間に位置するＡＡＶ層を抽出し、それをＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒ（ＭＷＣＯ１００，０００）を用いて０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファーでバッファー交換（ｂｕｆｆｅｒｅｘｃｈａｎｇｅ）を行った。

４）ＡＡＶ１＃２－３変異体力価の測定
ＣＭＶ－ＦＧＦ１２－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを搭載している野生型ＡＡＶ１（ｗｔＡＡＶ１）とＡＡＶ１＃２－３変異体の力価は、ＤｎａｓｅＩ（５Ｕ）に抵抗性を有するウイルスをプロテイナーゼＫ処理してウイルスゲノムを抽出した後、ＣＭＶに対する定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）プライマー（５’－ＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧ－３’：配列番号１１及び５’－ＧＧＣＧＧＡＧＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＡＴＴＴＴＧＧ－３’：配列番号１２）を用いてそれぞれのｓｔａｎｄａｒｄとともにｑＰＣＲを行って定量した。

野生型ＡＡＶ１と組換えＡＡＶ１ベクター（＃２－３変異体）のパッケージング効率（ｐａｃｋａｇｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）をｇｅｎｏｍｉｃｔｉｔｅｒ比較して図５に示した。これは、＃２－３変異体が野生型ＡＡＶ１に比べてパッケージング効率が向上したもので、進化論的に優れた個体を維持できる可能性を意味する。

実施例２：組換えＡＡＶ１変異体の感染の確認

１）インビトロ実験
レポーター遺伝子として遺伝子伝達効率及び位置分析のためにＣＭＶ－ＧＦＰを搭載した野生型ＡＡＶ１と＃２－３変異体をそれぞれパッケージングし、ＨＰＡＳＭＣ（Ｈｕｍａｎｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ；２×１０^４ｃｅｌｌｓ／２０μＬ）に感染させた。

それぞれのウイルスは、ＣＭＶ－ＦＧＦ１２－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを搭載し、ＧＦＰを搭載した場合はＨＰＡＳＭＣ感染（ＭＯＩ１０，０００）４８時間後にフローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を通じて全培養細胞のうちＧＦＰ発現細胞の割合（％）を分析して感染能を確認し、その結果を図６に示した。

図６は、ヒト肺動脈平滑筋細胞（ＨＰＡＳＭＣ）の形質導入効率の向上を全培養細胞のうちＧＦＰを発現する細胞の割合で分析したもので、＃２－３変異体の野生型ＡＡＶ１に対して血管細胞への優れた遺伝子伝達効能及びヒトプライマリー細胞（ヒト肺動脈平滑筋細胞）への向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）も優れていることを示す。

２）インビボ実験
ＣＭＶ－ＬａｃＺを搭載したＡＡＶ１野生型と＃２－３変異体をそれぞれパッケージングし、８週齢のＣ５７ＢＬ／６ｍａｌｅマウスの気管内にエアロゾル形態で注入（５×１０^１１ｖｇ／１００μｌ）した。

組換えＡＡＶ１ベクター（＃２－３ｖａｒｉａｎｔ）の肺組織内の特異性を確認するために、８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスに注入１週間後に摘出された肺に全体をマウントβ－ガラクトシダーゼで染色してＬａｃＺ発現を確認した結果を図３に示し、これにより肺組織に効率的に局所伝達されたことを確認した。

また、組換えＡＡＶ１ベクター（＃２－３ｖａｒｉａｎｔ）の肺組織内血管特異性を確認するために、８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを注入１週間後に肺を摘出してｘ－ｇａｌ染色を通じて肺血管でのＬａｃＺ発現の有無を確認し、その結果を図７に示した。これにより肺血管に効率的に伝達されたことを確認した。

実施例３：組換えＡＡＶ１変異体の肺血管平滑筋細胞ターゲティング効率の確認

肺組織内の血管平滑筋細胞ターゲティング効率を評価するために、ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｌｅｖｅｌにおいて複数の細胞に移入されたｖｉｒａｌｇｅｎｏｍｅをｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎしようとした。ＬａｃＺを搭載した＃２－３変異体とｗｔＡＡＶ１をパッケージングし、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスにｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（５×１０^１１ｖｇ／１００μｌ）を行った。注射後の３日目または７日目に肺を摘出し、ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを行った後、それぞれのｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇのためのα－ｓｍａにｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎされた抗体（α－ｓｍａ－Ａｌｅｘａ４８８，ａｂｃａｍ，ａｂ１８４６７５）を４℃で一晩のインキュベーションを行った。

Ｉｎｉｔｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｄｏｓｅに対して各細胞内に移入されたｖｉｒａｌｇｅｎｏｍｅ比を計算し、ｗｔＡＡＶ１値でｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行い、＃２－３変異体のｗｔＡＡＶ１に対して増減倍数（ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ）を確認した。（＊ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０１）

図８に示すように、α－ｓｍａにコンジュゲーションされた抗体を用いて平滑筋細胞をｓｏｒｔｉｎｇしたサンプル内のｖｉｒａｌｇｅｎｏｍｅ比は、ｗｔＡＡＶ１に対して＃２－３変異体がＤａｙ３では３．７±０．９倍増加、Ｄａｙ７では２．７±０．５倍増加する傾向を示した。

実施例４：組換えＡＡＶ１変異体の運動性の確認

＃２－３変異体とｗｔＡＡＶ１をエアロゾルｆｏｒｍでｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ後、気道壁とｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ、血管壁など様々な障壁を通過して血管ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌに到達する。これを可能にした原因の一つとして、＃２－３のｔｒｏｐｉｓｍだけでなくＡＡＶ１のｍｏｂｉｌｉｔｙも優れていることを証明するために、液相（ＰＢＳ相）でのブラウン運動（Ｂｒｏｗｎｉａｎｍｏｔｉｏｎ）を確認した。

１）１ｘＰＢＳ、静的（ｓｔａｔｉｃ）状態
１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）を条件としてｗｔＡＡＶ１または＃２－３変異体を１．０Ｅ＋０９ｖｇ／ｍｌの濃度で分散してｓｔａｔｉｃ状態での軌道を観察した結果、ｗｔＡＡＶ１に対して＃２－３は、ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ形態の動きを示すことを確認した。

ＭＳＤ（平均二乗変位、Ｍｅａｎｓｑｕａｒｅｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）をｍｓｄ（τ）＝＜Δｒ（τ）２＞＝＜［ｒ（ｔ＋τ）－ｒ（ｔ）］^２＞式（ｒ（ｔ）は、時間ｔにおけるｖｅｃｔｏｒ位置、τは、２つの位置（各ベクター別に得られた軌跡での差）間のｌａｇｔｉｍｅ）を用いて測定し、Ｌｏｇ_１０（ＭＳＤ_１ｓ）／ｐｉｘｅｌ^２でまとめて比較した結果、ＡＡＶ１（２．２１±０．４９）に対して＃２－３（３．１２±０．１７）は、統計的に有意な増加を示した（＊ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０１）。すなわち、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４の条件で＃２－３変異体が動いた距離がｗｔＡＡＶ１よりも増加したことを示した（図９）。

ブラウン運動とは、液体や気体の中で粒子が不規則に動く運動を意味し、ｄｉｆｆｕｓｉｏｎは、比較的方向性を持って動く粒子の運動を表す。Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎは、ブラウン運動のｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ表現と見なすことができ、ブラウン運動の平均的な動きを計算してｄｉｆｆｕｓｉｏｎ形態を予測しうる。

すなわち、不規則に動き、所定の位置にとどまる軌跡を示すＡＡＶ１に対して＃２－３変異体の軌跡は、比較的線形の動きを示し、ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ形態の動きを示した。

実施例５：組換えＡＡＶ１変異体の肺血管の向性の確認

１）組換えＡＡＶ１変異体の肺組織内分布の確認
ｗｔＡＡＶ１または＃２－３変異体にＡｌｅｘａ５９４をタグ付けし、８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスにｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎを行い（３×１０^１１ｖｇ／１００μｌ）、注入４８時間後に麻酔及び心臓に通じたｐｅｒｆｕｓｉｏｎを行って肺を摘出した。４％ＰＦＡ固定後にｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇし、α-ｓｍａ-抗体（Ａｌｅｘａ４８８）を用いて細動脈（ａｒｔｅｒｉｏｌｅ）内のＡＡＶ分布のｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎを確認した。

Ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ２４ｈ後のＡＡＶｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎを観察した結果、＃２－３変異体は、Ａｌｅｘａ５９４ＡＡＶカプシドにｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎした蛍光物質）でタグ付けされたＡＡＶベクターが細気管支（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｅ）から細動脈に移動する現象が観察された。

Ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ後、４８ｈｔｉｍｅｐｏｉｎｔでは、ほとんどの＃２－３ベクターが細気管支から細動脈に移動し、血管壁にＡＡＶベクターがｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎされていることが確認され、これは血管内平滑筋細胞マーカーであるα－ｓｍａ抗体ともｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎされることを確認することにより、＃２－３ベクターの肺血管の向性（ｂｌｏｏｄｖｅｓｓｅｌｔｒｏｐｉｓｍ）を確認した。これに対して、ｗｔＡＡＶ１は４８ｈｔｉｍｅｐｏｉｎｔで、血管周辺部の空気袋（ａｉｒｓａｃ）部分には多量のＡＡＶベクターが存在していることが確認されたが、α－ｓｍａ抗体とはｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎされる現象を示さなかった（図１０）。

すなわち、ウイルスに蛍光をかけて肺組織内での動きを確認した結果、ｗｔＡＡＶ１は気管支の周りに留まっていたり、血管に到達できなかったのに対し、＃２－３変異体は気管支を通過して血管側に急速に移動する様子が非常に円滑に起こり、血管細胞で集中的に＃２－３ベクターの遺伝子が発見された。

２）ＬａｃＺ発現現象による肺血管の向性の確認
ＬａｃＺを搭載したｗｔＡＡＶ１または＃２－３変異体を８週齢のＣ５７ＢＬ／６オスマウスにｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎを行い（３×１０^１１ｖｇ／１００μｌ）、２週間後に麻酔及び心臓によるｐｅｒｆｕｓｉｏｎを行い、ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇしてＸ－ｇａｌ染色を行った。ｗｔＡＡＶ１に対して＃２－３変異体は、血管部分におけるＬａｃＺ発現現象を観察した。

図１１に示すように、＃２－３ベクターは、ｗｔＡＡＶ１に対して向上された移動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）を有し、肺組織内で気道と細胞外基質を通過して血管部分に物理的に到達する割合を向上させるとともに、血管に集まる血管ｔｒｏｐｉｓｍを示した。したがって、本発明の組換えＡＡＶ１である＃２－３ベクターは、肺血管ターゲット疾患の治療及び予防用ＡＡＶベクターとして使用できるものと期待される。

Claims

アデノ随伴ウイルス血清型１（ＡＡＶ１）カプシドタンパク質の突然変異体であって、前記突然変異体は、野生型のＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較して４３０位のセリンがシステインに置換され、６４７位のイソロイシンがバリンに置換されたＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体。
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体。
請求項１に記載のＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体をコードする核酸。
配列番号４で表される塩基配列を有する、請求項３に記載の核酸。
請求項３に記載のＡＡＶ１カプシドタンパク質の突然変異体をコードする核酸を含む、組換えＡＡＶ１ベクター。
前記ＡＡＶ１ベクターは、ＡＡＶ１野生型ウイルスベクターと比較すると、標的組織に対して向上された形質導入プロファイルを有する、請求項５に記載の組換えＡＡＶベクター。
前記標的組織は、肺血管である、請求項６に記載の組換えＡＡＶ１ベクター。
前記肺血管は、肺動脈である、請求項７に記載の組換えＡＡＶ１ベクター。
配列番号７で表される、請求項５に記載の組換えＡＡＶ１ベクター。
請求項５に記載の組換えＡＡＶ１ベクターを含む、薬剤学的組成物。
前記組成物は薬剤学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１０に記載の薬剤学的組成物。
肺動脈高血圧症の予防または治療のための請求項１０に記載の薬剤学的組成物。
前記組成物が静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病変内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、硝子体内、関節内、皮膜下、蜘蛛膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射により投与される、請求項１０に記載の薬剤学的組成物。
治療的有効量の請求項５に記載の組換えＡＡＶ１ベクターを含む薬剤学的組成物を対象体に投与する段階を含む、肺動脈高血圧症の予防または治療方法。
前記組成物が静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病変内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、硝子体内、関節内、皮膜下、蜘蛛膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射により投与される、請求項１４に記載の肺動脈高血圧症の予防または治療方法。