KR20230081958A

KR20230081958A - 아데노 관련 바이러스 캡시드 단백질의 돌연변이체

Info

Publication number: KR20230081958A
Application number: KR1020220120442A
Authority: KR
Inventors: 장재형; 김유진
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2022-09-23
Publication date: 2023-06-08

Abstract

본 발명은 아데노 관련 바이러스 혈청형 1(AAV1) 캡시드 단백질의 돌연변이체로서, 상기 돌연변이체는 야생형의 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 비교해서 430번 위치의 세린이 시스테인으로 치환되고, 647번 위치의 이소류신이 발린으로 치환된 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체, 상기 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 핵산, 상기 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV1 벡터, 상기 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특히, AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터는 기관지를 통해 에어로졸 상태로 전달 시 폐 혈관 표적 세포에서의 도입 유전자 발현이 향상되어 폐동맥 고혈압 예방 또는 치료에 유용하다.

Description

아데노 관련 바이러스 캡시드 단백질의 돌연변이체{MUTANT OF ADENO-ASSOCIATED VIRUS CAPSID PROTEIN}

본 발명은 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질의 돌연변이체에 관한 것으로, 특히 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 포함하는 재조합 바이러스 벡터는 기관지를 통해 에어로졸 상태로 전달 시 폐 혈관 표적 세포에서의 도입 유전자의 발현에 유용하다.

유전자 치료를 효과적으로 하기 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적세포로 전달하여 높은 발현 효율을 얻을 수 있도록 하는 유전자 전달 기술 개발이 가장 우선시 된다.

이러한 유전자 전달 기술 중 AAV는 비병원성 바이러스로서 침투된 감염 세포에 부작용이 없으며 대상 세포 유전자 정보에 돌연변이를 일으키는 확률이 희박하므로 다른 유전자 치료기술 대비 안전성이 탁월하다.

AAV(Adeno-Associated Virus)는 분열하거나 분열하지 않는 세포 모두에 감염시킬 수 있는 non-enveloped의 단일 가닥 DNA 바이러스이다. AAV는 헬퍼 바이러스가 존재 시에만 복제가 가능하며 인간에게는 비병원성이다. 이런 특징으로 다양한 세포에 유전자를 도입하는 유용한 방법이며 유전자 치료를 위한 유용한 벡터로 사용되고 있다.

AAV는 다양한 혈청형(serotype)이 존재하고 혈청형에 따라 host나 바이러스의 특징이 다른 것으로 알려져 있다. 혈청형 2 (AAV2)는 오래전부터 널리 연구되어 온 혈청형으로 다양한 세포를 감염시킬 수 있다. 혈청형 1 (AAV1), 혈청형 5 (AAV5),혈청형 6 (AAV6)은 보다 조직 감염특이성을 가진 혈청형으로, AAV1은 근육, 간, 기도, 중추신경계 등에, AAV5 는 중추신경계, 간, 망막 등에, AAV6는 심장, 근육, 간 등에 대한 유전자 도입효율이 높다고 알려져 있다. 특정 조직으로의 유전자 전달 특성이 혈청형에 따라 달라지기는 하지만 여전히 타 조직으로의 전달이 용이하기 때문에 조직 특이성을 향상시켜 안전성과 효율성을 개선시킬 수 있는 새로운 AAV 벡터의 개발이 필수적이라고 할 수 있다.

한편, 폐동맥 고혈압은 특별한 이유 없이 폐세동맥이 좁아지는 질환으로 폐동맥 압력이 상승해 우심실 기능이 저하되는 질병이다. 숨 가쁨, 어지러움 등 일상에서 흔한 것들이 주요 증상이라 그냥 넘어가거나 다른 질환이라 여기기 쉽다. 이런 이유로 환자가 확진받기까지 시간이 지체되는 경우가 많다.

실제 질병관리본부 조사에 따르면 폐동맥고혈압을 정확히 진단받는데 걸리는 시간은 평균 1.5년이었다. 또한 정확한 진단을 위해선 고비용에다가 몸속에 와이어를 집어넣는 심도자 검사가 필요하였다.

혈액이 심장에서 폐로 원활하게 전달되지 않아 호흡곤란, 심부전, 심한 경우 사망에 이를 수 있다. 의학기술의 꾸준한 발전에도 폐동맥 고혈압의 5년 생존율은 절반 정도에 불과하다. 예후가 매우 나쁘기 때문에 적절한 조기 진단과 치료가 중요하다.

AAV 캡시드 단백질을 변형시킴으로써 유전자 도입 효율을 향상시키는 시도가 이루어지고 있긴 하나, 폐 혈관을 표적 부위로 하는 아데노 관련 바이러스에 대한 연구는 아직까지 보고된 바 없다.

국제 공개번호 제2017-201121호 (2017.11.23.) 일본 특허 공개 제2021-0010372호 (2021.02.04.)

이에, 본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 노력한 결과, 폐동맥 고혈압의 근본적인 유전적 원인을 해결하는 유전자 치료제를 전달할 잠재력이 있는 폐 혈관을 표적으로 하는 새로운 아데노 관련 바이러스(AAV) 혈청형 1의 캡시드를 기본 골격으로 하는 단백질 변이체를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 재조합 AAV에 의한 표적 세포로의 유전자 도입 효율의 향상 및/또는 유전정보 발현 효율의 향상을 위해서 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV1 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 AAV1 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 치료적 유효량의 상기 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 폐 고혈압 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 아데노 관련 바이러스 혈청형 1(AAV1) 캡시드 단백질의 돌연변이체에 관한 것이다.

본 발명에 사용된 용어 "아데노 관련 바이러스" 또는 "AAV"는 유전자 치료법에서 사용하는 모든 아데노 관련 바이러스를 이들의 유도체, 바이러스 아형 및 자연 발생 및 재조합 형태를 포함하여 지칭한다. AAV의 다양한 혈청형은 다수의 서로 다른 세포 유형을 형질 도입하기 위한 재조합 유전자 전달 바이러스로서 사용될 수 있다. AAV의 다양한 혈청형의 게놈 서열뿐만 아니라 천연 말단 반복체(terminal repeat: TR)의 서열, Rep 단백질 및 캡시드 서브유닛은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 서열은 문헌에서 또는 진뱅크(GenBank)와 같은 공용 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 진뱅크(GenBank) 등록번호 NC_002077(AAV-1), AF063497(AAV-1)를 참조할 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "혈청형"은 혈청학적 또는 DNA 서열분석 방법에 의해 동정될 수 있고 그의 항원 특성에 의해 구별될 수 있는 AAV의 세분된 한 부분을 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 "캡시드"는 바이러스의 게놈에 존재하는 cap 유전자에 코딩되는 단백질로, 바이러스의 외각을 구성하는 단백질을 의미한다. 야생형 AAV 게놈 또는 cap 유전자는 3종류의 캡시드 단백질(VP1, VP2 및 VP3)을 코딩한다. 본 명세서에서는 의 모두가 캡시드 단백질에 포함된다. 야생형 AAV1 캡시드 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명은 아데노 관련 바이러스 혈청형 1(AAV1) 캡시드 단백질의 돌연변이체로서, 상기 돌연변이체는 야생형의 AAV1 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 비교해서 430번 위치의 세린이 시스테인으로 치환되고, 647번 위치의 이소류신이 발린으로 치환된 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열(VP1)을 포함하거나 이로 이루어진다. VP2는 서열번호 3의 T138에서 끝까지의 아미노산 서열에 상응하며, VP3은 서열번호 3의 M203에서 끝까지의 아미노산 서열에 상응한다.

본원 실시예에서는 본 발명에 따른 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 #2-3으로 명명하였다.

본 발명에 사용된 용어"야생형"은 종 가운데서, 야생의 집단에 가장 많이 볼 수 있는 형을 의미한다. 돌연변이형에 대해서, 야생형은 기본으로 생각되는 표현형 또는 그 개체를 가리킨다. 야생형은 별명으로서 '정상형'이라고도 불린다. 한편, 본 명세서에 있어서 "돌연변이체"란 돌연변이를 일으킨 유전자가 형질적인 변화로서 나타나 있는 단백질, 바이러스, 세포, 개체 등을 의미한다. 또, 본 명세서에 있어서 「돌연변이체」란 돌연변이를 일으킨 유전자 자체를 가리키는 경우도 있다.

일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 포함한다. 본 발명의 핵산은 상기 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩한다. 본 발명의 핵산은 AAV1 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산(cap 유전자)의 염기서열에 있어서 적어도 1개의 염기가 다른 염기로 치환되는 것에 의해 제작된다. 본 발명의 핵산은 DNA의 형태로 존재할 수 있지만, 경우에 따라서는 RNA의 형태나, DNA와 RNA와의 키메라일 수도 있다. 또, 본 발명의 핵산에는 상보적인 핵산(예, cDNA)도 포함된다. 본 발명의 핵산은 싱글-스트랜드일 수도 있고, 더블-스트랜드일 수도 있지만, 바람직하게는 더블-스트랜드이다.

본 발명은 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 핵산으로서 특별하게 한정되지 않지만, 일 구현예로 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 가지는 핵산이 예시된다.

본 발명의 핵산은 적절한 제어서열과 작동 가능하게 연결할 수도 있다. 제어서열에는 프로모터 서열, 폴리아데닐화 시그널, 전사 종결 서열, 상류의 조절 도메인, 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry sites:IRES), 인핸서 등이 포함된다. 프로모터 서열에는 유도성 프로모터 서열, 구성적 프로모터 서열이 포함된다. 제어서열은 캡시드 단백질의 유래가 되는 AAV에 고유한 것일 수도 있고 외래성의 것일 수도 있고, 천연서열일 수도 있고, 합성 서열일 수도 있다. 본 발명의 핵산을 포함하는 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 발현 가능한 재조합 DNA도 본 발명에 포함된다.

상기 재조합 DNA는 시험관 내, 생체 외 및 생체 내의 세포에 본 발명의 핵산을 전달하고, 당해 세포에 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 발현하는 능력을 부여하는데 유용하다. 그리고 본 발명의 핵산이 전달된 세포는 재조합 AAV 입자를 제조하는데도 유용하다. 당해 재조합 DNA는 특히 진핵세포, 바람직하게는 동물세포, 더 바람직하게는 포유류 세포에 본 발명의 핵산을 전달 또는 도입하는데 사용할 수 있다.

본 발명에서는 벡터로서 사용되고 있는 DNA에 본 발명의 핵산을 보유시켜서 재조합 DNA를 제작할 수 있다. 예를 들면, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 에피소말 DNA, 바이러스 게놈 등을 사용할 수 있다.

예를 들면, 플라스미드에 본 발명의 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 핵산(cap 유전자)을 보유시키는 것에 의해, 패키징 플라스미드를 제작할 수 있다. 패키징 플라스미드는 추가로 레플리카제(Rep) 단백질을 코딩하는 핵산(rep 유전자) 등, 임의의 핵산서열을 포함할 수 있다. 바람직하게 rep 유전자는 AAV2 유래 Rep를 추가할 수 있다.

공지의 패키징 플라스미드에 탑재된 cap 유전자의 핵산서열에 있어서, PLA2 도메인 코딩 영역에서의 적어도 1개의 염기를 다른 염기로 치환하는 것에 의해서도, 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 DNA를 제작할 수 있다. 상기 패키징 플라스미드로서 특별하게 한정은 되지 않지만, cap 유전자를 탑재한 패키징 플라스미드, 적합하게는 cap 유전자와 rep 유전자를 탑재한 패키징 플라스미드가 예시된다. 일 례로, 본 발명에서는 본 발명의 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 핵산(cap 유전자)과 rep 유전자를 탑재한 패키징 플라스미드인 서열번호 5로 표시되는 재조합 AAV1 벡터, p #2-3를 제작하였다.

핵산에 염기의 치환을 도입하는 방법은 공지의 방법에 의해 실시할 수 있고, 특별하게 한정은 없지만, 시판하고 있는 시약, 예를 들면 Mutagenesis Basal Kit(TAKARA BIO INC.)을 사용하여, 키트에 부속의 설명서에 따라서 PCR을 실시하는 것에 의해 달성할 수 있다.

따라서, 본 발명은 유전자 치료 적용을 위한 신규의 AAV1 #2-3 변이체로서, 상기 AAV1 캡시드 단백질 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV1 벡터를 포함한다.

본 발명의 재조합 AAV 벡터는 표적 세포로의 유전자 도입에 유용하다. 본 발명의 재조합 AAV 벡터에 의해 도입된 유전자는 상기 표적 세포에서 강하게 발현된다.

본 명세서에 사용되고 있는 용어 "AAV 벡터"는 아데노-연관 바이러스(AAV)의 성분을 포함하거나 이들 성분으로부터 유래하고 뇌, 심장, 폐, 골격근, 간, 신장, 비장 또는 췌장과 같은 임의의 많은 조직 유형의 인간 세포를 포함한 포유류 세포를 시험관내 또는 생체 내 관계없이 감염시키기 적합한 임의의 벡터를 지칭한다. 용어 "AAV 벡터"는 관심 단백질을 코딩하는 적어도 핵산 분자를 포함하는 AAV형 바이러스 입자(또는 비리온)를 지칭하기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "rAAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질(야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질에 의함) 및 캡시드 내 이입된(encapsidated) 폴리뉴클레오타이드 rAAV 벡터로 구성되는 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오타이드(즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 포유류 세포에 전달되는 이식유전자)를 포함한다면, 이는 전형적으로 "rAAV 벡터 입자" 또는 간단하게 "rAAV 벡터"로서 지칭된다. 따라서, rAAV 입자의 생성은 필연적으로 rAAV의 생성을 포함하는데, 이러한 벡터가 rAAV 입자 내에 함유되기 때문이다.

"패키징"은 AAV 입자의 조립체 및 캡시드 내 이입을 야기하는 일련의 세포내 사건을 지칭한다.

AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 아데노-관련 바이러스의 복제 및 캡시드 내 이입 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. AAV rep 및 cap은 본 명세서에서 AAV "패키징 유전자"로서 지칭된다.

AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는 AAV(예를 들어, 야생형 AAV)가 포유류 세포에 의해 복제되고, 패키징되게 하는 바이러스를 지칭한다. 아데노바이러스, 르페스바이러스, 및 백시니아와 같은 폭스바이러스를 포함하는, AAV에 대한 다양한 이러한 헬퍼 바이러스는 당업계에 공지되어 있다. 서브그룹 C의 아데노바이러스 5형이 가장 흔히 사용되지만, 아데노바이러스는 다수의 상이한 서브그룹을 포함한다. 인간, 비인간 포유류 및 조류 유래의 수많은 아데노바이러스는 공지되어 있고, ATCC와 같은 기탁기관으로부터 입수 가능하다. 헤르페스과의 바이러스는, 예를 들어 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex viruses: HSV) 및 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr viruses: EBV)뿐만 아니라 사이토메칼로바이러스(cytomegaloviruses: CMV) 및 가성광견병 바이러스(pseudorabies viruses: PRV)를 포함하는데; 이들은 또한 ATCC와 같은 기탁기관으로부터 입수 가능하다.

"헬퍼 바이러스 기능(들)"은 AAV 복제 및 패키징(본 명세서에 기재된 복제 및 패키징을 위한 다른 요구사항과 함께)을 허용하는 헬퍼 바이러스 게놈에서 암호화된 기능(들)을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, "헬퍼 바이러스 기능"은 헬퍼 바이러스를 제공하거나 또는, 예를 들어 트랜스로 생산자 세포에 필수 기능(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공함으로써 포함되는, 다양한 방법으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 또는 다른 발현 벡터는 rAAV 벡터와 함께 생산자 세포로 형질감염된다.

일 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 AAV1 벡터는 야생형 캡시드 단백질을 포함하는 AAV1 벡터와 비교할 때, 표적 조직에 대해서 향상된 형질도입 프로파일을 갖는다. 즉, 본 발명에 따른 AAV1 벡터는 명확한 조직 표적화 능력(예를 들어, 조직 향성(tissue tropism))을 갖고 있다.

본 명세서에서, 용어 "향성 (tropism)"은 특정 유형의 세포 또는 조직을 감염 또는 형질도입시키기 위한 AAV 바이러스 입자에 존재하는 AAV 캡시드 단백질의 특이성을 의미한다.

특정 유형의 세포 또는 조직에 대한 AAV 캡시드의 향성은 본 명세서의 실시예에 개시된 것과 같은 당업계에 잘 알려진 표준 분석법을 사용하여, AAV1 캡시드 단백질을 포함하여 특정 유형의 세포 또는 조직을 감염시키거나 형질도입하는 AAV 벡터 입자의 능력을 측정함으로써 결정될 수 있다.

즉, "향성"은 하나 이상의 특정 세포 유형을 감염시키는 AAV 벡터 또는 비리온의 능력을 의미하지만, 벡터가 하나 이상의 특정 세포 유형에 세포를 형질 도입하도록 기능하는지를 포함할 수도 있는 바; 즉 향성은 특정 세포 또는 조직 유형(들)으로 AAV 벡터 또는 비리온의 우선적인 도입 및/또는 특정 세포 또는 조직 유형으로 진입을 용이하게 하는 세포 표면과의 우선적인 상호작용 후, 경우에 따라 그리고 바람직하게는 세포에서 AAV 벡터 또는 비리온에 의해 운반되는 서열의 발현(예를 들어, 전사 및 경우에 따라 번역), 예를 들어 재조합 바이러스의 경우에는 이종 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 의미한다.

본 명세서에서 사용하는 용어 "형질 도입"은 하나 이상의 특정 세포 유형을 감염시키는 AAV 벡터 또는 비리온의 능력을 의미하는 바; 즉 형질 도입은 AAV 벡터 또는 비리온을 세포 내 도입하고 AAV 벡터 또는 비리온 내 함유된 유전 물질을 세포로 전달하여 벡터 게놈으로부터 발현을 얻는 것을 의미한다. 모든 경우는 아니지만 일부의 경우에는 형질 도입과 향성은 상관관계가 있을 수 있다.

본원에 기재되는 AAV는 1 이상의 캡시드 단백질에 있어서 새로운 또는 증강된 조직 향성 특성을 부여하는 아미노산 변형을 포함한다. 본원발명에 따른 AAV1 변형은 폐 혈관(예를 들면, 폐 동맥)을 표적으로 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "폐 조직 또는 폐 혈관 향성"은 폐 조직 또는 폐 혈관에 대한 향성을 의미한다.

일부 구현예에서, 펩티드-변형된 하이브리드 AAV 캡시드 단백질의 폐 혈관 향성은, 펩티드를 갖지 않는 야생형 AAV 캡시드 단백질의 폐혈관 향성에 비해 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상 추가로 증가된다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 AAV1 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

상기 "약학적으로 허용가능한 담체"는 조성물의 유효 성분과 조합될 때, 성분들이 의도되지 않은 면역 반응과 같은, 지장을 주는 생리학적 반응들을 야기하는 것 없이 생물학적 활성을 보유하는 것을 가능하게 하는, 임의의 물질을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체들은 물, 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼들, 및 습윤제들(wetting agent)을 포함한다. 이러한 담체들을 포함하는 조성물들은 Remington's Pharmaceutical Sciences, current Ed., Mack Publishing Co., Easton Pa. 18042, USA; A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc 에 쓰인 것들과 같이 잘 알려진 종래의 방법들에 의하여 제형화된다.

일 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 폐동맥 고혈압 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 치료"는 질환 관련 증후군, 합병증, 증상 또는 생화학적 징후의 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 반전, 완화, 개선, 저해 또는 지연 또는 예방하고자 하는 목적으로 대상에 대해 수행된 임의 유형의 개입 또는 과정 또는 대상에게 활성제를 투여하는 것을 말한다. 치료는 질환이 있는 대상체 또는 질환이 없는 대상체(예를 들어 예방용)에 대해 이루어질 수 있다.

또한, 일 구현예에 있어서, 본 발명은 치료유효량의 상기 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 폐동맥 고혈압 예방 또는 치료방법을 포함한다.

본 명세서에서 사용하는 "투여"는 당업자에게 공지된 다양한 방법과 전달계 중 임의의 것을 사용하여 대상에 치료제 또는 치료제를 포함하는 조성물을 물리적으로 도입하는 것을 말한다. 바람직한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척추, 유리체내, 또는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 문구 "비경구 투여"는 일반적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 이에 제한되지는 않지만 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강 내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 표피하, 유리체내, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입뿐 아니라 생체내 전기천공을 포함한다.

본 명세서에서 사용하는 용어 "치료 유효량"은 대상의 질환 또는 장애를 "치료"하거나 질환 또는 장애(예를 들어, 폐동맥 고혈압)의 위험, 잠재성, 가능성 또는 발생을 감소시키는 데 효과적인 약물 단독 또는 또 다른 치료제와 조합한 약물의 양을 지칭한다. "치료 유효량"은 질환 또는 장애(예를 들어 본 명세서에 개시된 폐동맥 고혈압)를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체에 일부 개선 또는 실익을 제공하는 약물 또는 치료제의 양을 포함한다. 이에 따라 "치료 유효양"은 질환 또는 장애의 위험, 잠재성, 가능성 또는 발생을 감소시키거나 또는 일부 완화, 경감을 제공하고/또는 적어도 하나의 지표(예를 들어 폐동맥 고혈압)를 감소시키고/또는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 임상 증상을 감소시키는 양이다.

본 명세서에서 사용하는 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 비-포유류를 포함한다.

본 발명은 폐 혈관을 특이적으로 표적화하여 고효율 유전자 전달능을 가진 재조합 AAV1 캡시드 변이체에 관한 것으로, AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터는 기관지를 통해 에어로졸 상태로 전달 시 폐 혈관 표적 세포에서의 도입 유전자의 발현에 유용하여 폐혈관 질환 예방 또는 치료가 가능하다.

도 1은 재조합 AAV1 벡터(#2-3 변이체)의 3D 구조를 나타낸 것이다.
도 2a는 #2-3 변이체의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2b는 pHelper 플라스미드 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2c는 pCMV GFP 플라스미드 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2d는 pCMV LacZ 플라스미드 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 서열번호 5로 표시되는 재조합 AAV1 벡터(#2-3 변이체)의 전체 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4은 야생형 AAV1 벡터의 전체 염기서열을 나타낸 것이다.
도 5은 야생형 AAV1과 본 발명의 재조합 AAV1 벡터(#2-3 변이체)의 패키징 효율(packaging efficiency)을 정량적 PCR 분석으로 게노믹 역가를 비교한 것이다.
도 6는 인간 폐동맥 평활근 세포(HPASMC) 형질도입 효율 향상을 전체 배양세포 중 GFP를 발현하는 세포의 비율로 분석한 것이다.
도 7은 재조합 AAV1 벡터(#2-3 변이체)의 폐 조직 내 혈관 특이성을 확인하기 위하여, 8주령 C57BL/6 수컷 마우스로부터 적출된 폐에 전체 마운트 β-갈락토시다아제 염색하여 LacZ 발현을 확인한 폐 조직 내 효율적 국소 전달 결과를 나타낸 것이다.
도 8는 재조합 AAV1 벡터(#2-3 변이체)의 폐 혈관 평활근 세포 표적화를 정량화한 것이다.
도 9은 1xPBS (pH 7.4) 상에서 재조합 AAV1 벡터(#2-3 변이체)의 브라운 운동(Brownian motion)을 확인한 것이다.
도 10은 재조합 AAV1 벡터(#2-3 변이체)를 intratracheal injection 한 후 혈관 smooth muscle cell로의 타겟팅 및 분포를 확인한 것이다.
도 11는 재조합 AAV1 벡터(#2-3 변이체)의 직경 100 μm 이상 크기의 혈관 내 LacZ 발현을 x-gal 염색을 통하여 확인한 것이다[V: Vessel 혈관, B: Bronchiole 기관지].

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: AAV 라이브러리를 이용한 폐 혈관 tropic AAV1 캡시드 단백질 변이체 선별

1) AAV1 캡시드 단백질 변이체 선별

야생형 AAV 변이체 (AAV1, AAV2, AAV4, AAV6, AAV8, AAV9)의 cap 유전자에 error-prone PCR을 이용한 랜덤 포인트 돌연변이 유도 및 각 혈청형의 3-fold protrusion에 random 7mer/9mer를 삽입하여 플라스미드 풀을 제작하였다. AAV 플라스미드 라이브러리 7-70ng, pBluescript 25μg, pHelper 25μg를 칼슘-포스페이트 복합체(calcium-phosphate complex)를 이뤄 AAV293 세포에 트랜스펙션하여 AAV 패키징을 진행하였고, 각 변이체의 cap 유전자 정보를 탑재한 AAV 라이브러리 풀을 제작하였다.

8주령의 C57BL/6 수컷 마우스를 이소플루란(isoflurane)으로 호흡 마취한 후 기도 부위의 피부를 1cm 가량 절개하였다. PenWu micro-aerosolizer (BioJane, Shanghai, China) (1.25" length of intratracheal portion, 700μm of outer diameter, 430μm of inner diameter)에 PBS 중 1x10¹¹vg/100 μl의 AAV 라이브러리 풀을 로딩하여 기도로 니들이 통과하는 모습을 확인하며 기관 내 주사(intratracheal injection)를 진행하였다.

일주일 후 0.9% 생리식염수를 심장을 통해 흘려주어 관류(perfusion)를 진행하였고 폐를 적출하였다. 균질화(Homogenization) 후 DNA 미니 킷 (Qiagen)을 이용해 폐 전체에서 DNA를 추출하였고, AAV cap 유전자 특이적 정방향 프라이머(forward primer) 5´-GCGGAAGCTTCGATCAACTACG-3´(서열번호 7), 역방향 프라이머(reverse primer) 5´-CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGA-3´ (서열번호 8)를 이용하여 폐 전체에 향성(tropism)을 보이는 AAV 변이체들의 cap 유전자를 증폭하였다. 이를 폐 향성(tropic) AAV 라이브러리 풀로 제작하여 위와 동일한 방식으로 기관 내 주사(intratracheal injection)을 진행하였다(1x10¹¹vg/100μl). 일주일 후 관류(perfusion) 및 폐 적출을 진행하였고, 30초간 chopping하여 작은 조각으로 만든 후 콜라게나아제 II를 이용하여 single 세포 해리(cell dissociation)를 진행하였다. 이때 DNase I을 첨가하여 dead cell로부터 방출된 chromosomal DNA에 의한 세포 클러스터링(cell clustering)을 방지하여 cell loss를 최소화하고자 하였다. 이를 37 ℃에서 4-6 시간 동안 인큐베이션 후 피펫팅을 통해 단일 세포 형태의 total lung population을 얻었고, red blood cell lysis를 상온에서 빛을 차단한 상태로 진행한 뒤 70μm의 pore를 가진 cell strainer에 걸러 FACS 버퍼로 세포를 옮겼다. 이후 혈관 향성(tropism)을 보이는 AAV 변이체를 선별하기 위해 10μg의 APC(Anti-alpha smooth muscle actin antibody)를 첨가 후 4 ℃에서 인큐베이션을 진행하였다. 이후, APC positive cells를 sorting하여 혈관 관련 세포를 선별하였고, cell lysis 및 DNA extraction 후, 프라이머(5'-GCGGAAGCTTCGATCAACTACG-3': 서열번호 9) 및 (5'-CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGA-3': 서열번호 10)를 이용해 세포 내로 이입된 AAV 변이체의 cap 유전자를 증폭하였다. 증폭된 cap gene 유전자는 양 말단에 HindIII와 NotI 서열을 포함하여 이를 pSub2 플라스미드에 HindIII/NotI restriction 및 ligation을 통해 서브클로닝하여 DH10β에 전기천공 후 플라스미드를 정제하여(Qiagen Plasmid Maxi Kit) 혈관 향성 플라스미드 풀(pool) 형태로 보관하였다. (pSub2는 pSub201(ATCC)를 기반으로 UC Berkeley, David Schaffer Lab에서 제작한 플라스미드로 HindIII와 NotI을 이용해 cap gene을 subcloning할 수 있도록 제작됨, Reference 1. Narendra Maheshri et al., Nature Biotechnology, 2006; 2. James T Koerber, Nature Protocols, 2006) 총 3 round의 in vivo 선별에 거쳐 선별된 다양한 변이체 중 폐동맥 고혈압 예방 및 치료용 AAV 유전자 전달체로서 #2-3 변이체가 최종 선정되었고, 이는 AAV1 기반 point mutation S430C, I647V를 보유하고 있는 것으로 확인되었다 (도 1).

2) 재조합 AAV1 벡터(AAV1 #2-3 변이체)의 제작

① 패키징 플라스미드 돌연변이체의 제작

혈관 향성 플라스미드 풀에서 HindIII/NotI 제한효소를 통해 다수의 혈관 향성 cap 유전자를 cap 유전자 삽입을 위해 HindIII 및 NotI이 도입되어 있는 pXX2(UC Berkeley, David Schaffer Lab)에 subcloning하여 reporter gene 탑재를 위한 다수의 혈관 특이적 플라스미드 돌연변이체의 제작을 완료하였다.

② AAV293 세포로의 플라스미드 도입

AAV1 #2-3 변이체의 제작

돌연변이체 플라스미드 17 μg, ITR flanked reporter gene (pCMV-GFP 또는 pCMV-LacZ 또는 pCMV-FGF12-IRES-GFP) 17 μg, pHelper 17μg을 calcium-phosphate complex를 이뤄 AAV293 세포에 트랜스펙션하였고, 약 48시간 후 세포 펠렛만을 모아 동결-해동(freezing-thawing)을 통해 세포 내부의 AAV를 추출하였다. 이후 원심분리를 통해 세포 파괴물(cell debris)을 제거하고 벤조나아제(benzonase) 10 U/mL를 37 ℃에서 30분간 인큐베이션하여 바이러스 생산 세포로부터 나온 핵산을 제거하였다.

제작된 #2-3 변이체의 개열지도는 도 2에 나타내었으며, 전제 염기서열은 도 3과 같다.

야생형 AAV1의 제작

AAV2의 rep 유전자와 AAV1의 cap 유전자를 포함하는 패키징 플라스미드 17 μg, ITR flanked reporter gene (pCMV-GFP 또는 pCMV-LacZ 또는 pCMV-FGF12-IRES-GFP) 17 μg, pHelper 17μg을 calcium-phosphate complex를 이뤄 AAV293 세포에 트랜스펙션하였고, 약 48시간 후 세포 펠렛만을 모아 동결-해동(freezing-thawing)을 통해 세포 내부의 AAV를 추출하였다. 이후 원심분리를 통해 세포 파괴물(cell debris)을 제거하고 벤조나아제(benzonase) 10 U/mL를 37 ℃에서 30분간 인큐베이션하여 바이러스 생산 세포로부터 나온 핵산을 제거하였다.

3) AAV1 #2-3 변이체 정제

AAV 용액을 이오딕사놀 기울기(gradient)를 이용해 초원심분리를 진행하였다. 이오딕사 용액을 15%, 25%, 40%, 54%로 제작하여 차례로 초원심분리 튜브에 로딩하였고, 그 위로 AAV 용액을 로딩하였다. 튜브 실링(Tube sealing) 후 Optima XE-90 Ultracentrifuge (BECKMAN COULTER) 및 Vti65.2 rotor를 이용해 초원심분리를 진행(42,000 RPM, 18 ℃, 2시간)하였다. 54%와 40% 이오딕사놀 중간에 위치한 AAV 층을 추출하였고, 이를 Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter (MWCO 100,000)를 이용해 0.01% 트윈 20을 함유한 PBS 버퍼로 버퍼 교환(buffer exchange)을 진행하였다.

4) AAV1 #2-3 변이체 역가 측정

CMV-FGF12-IRES-GFP를 탑재하고 있는 야생형 AAV1(wtAAV1)과 AAV1 #2-3 변이체의 역가는 Dnase I(5U)에 저항성을 지닌 바이러스를 프로테이나제 K 처리하여 바이러스 게놈을 추출한 후, CMV에 대한 정량적 PCR (qPCR) 프라이머(5'-ATGGTGATGCGGTTTTGGCAG-3': 서열번호 11 및 5'-GGCGGAGTTGTTACGACATTTTGG-3': 서열번호 12)를 이용하여 각각의 standard와 함께 qPCR를 진행하여 정량하였다.

야생형 AAV1과 재조합 AAV1 벡터(#2-3 변이체)의 패키징 효율(packaging efficiency)을 genomic titer 비교하여 도 5에 나타내었다. 이는 #2-3 변이체가 야생형 AAV1에 비해 패키징 효율이 향상된 것으로 진화론적으로 우수하게 개체가 유지될 수 있는 가능성을 의미한다.

실시예 2: 재조합 AAV1 변이체 감염 확인

1) 인 비트로 실험

리포터 유전자로서 유전자 전달 효율 및 위치 분석을 위해 CMV-GFP를 탑재한 야생형 AAV1과 #2-3 변이체를 각각 패키징하여 HPASMC(Human pulmonary arterial smooth muscle cell; 2x10⁴ cells/20 μL)에 감염시켰다.

각각의 바이러스는 CMV-FGF12-IRES-GFP를 탑재하였으며, GFP를 탑재한 경우에는 HPASMC 감염 (MOI 10,000) 48시간 이후에 유세포 분석기(flow cytometry)를 통해 전체 배양 세포 중 GFP 발현 세포의 비율(%)을 분석하여 감염능을 확인하였으며, 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6은 인간 폐동맥 평활근 세포(HPASMC) 형질도입 효율 향상을 전체 배양세포 중 GFP를 발현하는 세포의 비율로 분석한 것으로, #2-3 변이체의 야생형 AAV1 대비 혈관 세포로의 우수한 유전자 전달 효능 및 인간 프라이머리 세포(인간 폐동맥 평활근 세포)로의 향성(tropism)도 우수함을 나타낸다.

2) 인 비보 실험

CMV-LacZ를 탑재한 AAV1 야생형과 #2-3 변이체를 각각 패키징하여 8주령의 C57BL/6 male 마우스에 기관 내 에어로졸 형태로 주입 (5x10¹¹vg/100μl)하였다.

재조합 AAV1 벡터(#2-3 variant)의 폐 조직 특이성을 확인하기 위하여, 8주령 C57BL/6 수컷 마우스를 주입 1주일 후 적출된 폐에 전체 마운트 β-갈락토시다아제 염색하여 LacZ 발현을 확인한 결과를 도 3에 나타내었으며, 이로서 폐 조직에 효율적으로 국소 전달되었음을 확인하였다.

또한, 재조합 AAV1 벡터(#2-3 variant)의 폐 조직 내 혈관 특이성을 확인하기 위하여, 8주령 C57BL/6 수컷 마우스를 주입 1주일 후 폐 적출하여 x-gal 염색을 통해서 폐 혈관에서의 LacZ 발현 여부를 확인하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다. 이로서 폐 혈관에 효율적으로 전달되었음을 확인하였다.

실시예 3: 재조합 AAV1 변이체의 폐혈관 평활근 세포 타겟팅 효율 확인

폐 조직 내 혈관 평활근 세포 타겟팅 효율을 평가하고자 single cell level에서 여러 세포 내로 이입된 viral genome을 quantification하고자 하였다. LacZ를 탑재한 #2-3 변이체와 wtAAV1을 패키징하여 8주령의 C57BL/6 마우스에 intratracheal injection(5x10¹¹vg/100μl)을 하였다. 주사 후 3 일째 또는 7일째 폐를 적출하여 single cell dissociation을 진행한 후 각각의 cell sorting을 위한 α-sma에 conjugation된 항체(α-sma-Alexa488, abcam, ab184675)를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

Initial injection dose 대비 각 세포 내로 이입된 viral genome 비율을 계산하였고, wtAAV1 값으로 normalization을 하여 #2-3 변이체의 wtAAV1 대비 증감 배수(fold change)를 확인하였다. (*p-value<0.01)

도 8에 나타낸 바와 같이, α-sma에 컨쥬게이션된 항체를 이용해 평활근 세포를 sorting한 샘플 내 viral genome 비율은 wtAAV1 대비 #2-3 변이체가 Day3에서는 3.7±0.9배 증가, Day7에서는 2.7±0.5배 증가하는 경향성을 보였다

실시예 4: 재조합 AAV1 변이체의 운동성 확인

#2-3 변이체와 wtAAV1을 에어로졸 form으로 intratracheal injection 후 기도 벽과 extracellular matrix, 혈관 벽 등 다양한 장벽을 통과해서 혈관 smooth muscle cell에 도달하게 된다. 이를 가능하게 했던 원인 중 하나로 #2-3의 tropism 뿐만 아니라 AAV1의 mobility도 우수했다는 점을 증명하기 위해 액상(PBS 상)에서의 브라운 운동(Brownian motion)을 확인하였다.

1) 1xPBS, 정적(static) 상태

1xPBS(pH 7.4) 조건에 wtAAV1 또는 #2-3 변이체를 1.0E+09 vg/ml 농도로 분산하여 static 상태에서의 궤도를 관찰한 결과 wtAAV1 대비 #2-3은 diffusion 형태의 움직임을 보이는 것을 확인하였다.

MSD (평균 제곱 변위, Mean squared displacement)를 msd(τ) = <Δr(τ)²> = <[r(t+τ) -　r(t)]²> 식(r(t)는 시간 t에서의 vector 위치, τ는 두 위치(각 벡터별로 얻은 궤적에서의 차이) 간 lag time)을 이용해 측정하여 Log₁₀(MSD_1s)/pixel²으로 정리해 비교한 결과 AAV1(2.21±0.49) 대비 #2-3(3.12±0.17)은 통계적으로 유의미한 증가를 보였다 (*p-value<0.01). 즉, 1xPBS, pH 7.4 조건에서 #2-3 변이체가 움직인 거리가 wtAAV1 보다 증가했음을 보여주었다 (도 9).

브라운 운동은 액체나 기체 속에서 입자들이 불규칙하게 움직이는 운동을 의미하고, diffusion 은 비교적 방향성을 가지고 움직이는 입자의 운동을 나타낸다. Diffusion은 브라운 운동의 macroscopic 표현으로 간주될 수 있어 브라운 운동의 평균적인 움직임을 계산하여 diffusion 양상을 예측할 수 있다.

즉, 불규칙하게 움직이며 제자리에 머무는 궤적을 보이는 AAV1 대비 #2-3 변이체의 궤적은 비교적 선형의 움직임을 보여 diffusion 형태의 움직임을 보였다.

실시예 5: 재조합 AAV1 변이체의 폐 혈관 향성 확인

1) 재조합 AAV1 변이체의 폐 조직 내 분포 확인

wtAAV1 또는 #2-3 변이체에 Alexa594를 태깅하여 8주령의 C57BL/6 수컷 마우스에 intratracheal injection을 하였고(3x10¹¹vg/100μl), 주입 48시간 이후 마취 및 심장을 통한 perfusion을 진행하여 폐를 적출하였다. 4% PFA 고정 후 sectioning하여 α-sma-항체(Alexa488)를 이용해 세동맥(arteriole) 내 AAV 분포의 colocalization을 확인하였다.

Intratracheal injection 24h 후의 AAV distribution을 관찰한 결과 #2-3 변이체는 Alexa594AAV 캡시드에 conjugation한 형광 물질)로 태깅된 AAV 벡터가 세기관지(bronchiole)로부터 세동맥으로 이동해가는 현상이 관찰되었다.

Intratracheal injection 후 48h time point에서는 대부분의 #2-3 벡터가 세기관지로부터 세동맥으로 이동하여 혈관벽에 AAV 벡터가 localization되어 있는 점이 확인되었고, 이는 혈관 내 평활근세포 마커인 α-sma 항체와도 colocalization되는 점을 확인함으로써 #2-3 벡터의 폐 혈관 향성(blood vessel tropism)을 확인하였다. 이에 반해 wtAAV1은 48h time point에서 혈관 주변부의 공기주머니(air sac) 부분에는 다량의 AAV 벡터가 존재하고 있는 점이 확인되었지만 α-sma 항체와는 colocalization되는 현상을 보이지 않았다 (도 10).

즉, 바이러스에 형광을 달아 폐 조직 내에서의 움직임을 확인한 결과, wtAAV1은 기관지 주변에 머물러 있거나 혈관에 도달하지 못한 반면에, #2-3 변이체는 기관지를 통과하여 혈관 쪽으로 빠르게 이동하는 모습이 매우 원활하게 일어났고 혈관세포에서 집중적으로 #2-3 벡터의 유전자가 발견되었다.

2) LacZ 발현 현상으로 폐혈관 향성 확인

LacZ를 탑재한 wtAAV1 또는 #2-3 변이체를 8주령의 C57BL/6 수컷 마우스에 intratracheal injection을 하였고(3x10¹¹vg/100μl), 2주 후 마취 및 심장을 통한 perfusion 진행 후 sectioning하여 X-gal 염색을 진행하였다. wtAAV1 대비 #2-3 변이체는 혈관 부분에서의 LacZ 발현 현상을 관찰하였다.

도 11에 나타낸 바와 같이, #2-3 벡터는 wtAAV1 대비 향상된 이동성(mobility)을 가져 폐 조직 내에서 기도와 세포외기질을 통과하여 혈관 부분에 물리적으로 도달하는 비율을 향상시킴과 동시에 혈관에 모이는 혈관 tropism을 보였다. 따라서, 본 발명의 재조합 AAV1인 #2-3 벡터는 폐 혈관 타겟 질환의 치료 및 예방용 AAV 벡터로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

아데노 관련 바이러스 혈청형 1(AAV1) 캡시드 단백질의 돌연변이체로서,
상기 돌연변이체는 야생형의 AAV1 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 비교해서 430번 위치의 세린이 시스테인으로 치환되고, 647번 위치의 이소류신이 발린으로 치환된 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체.
제 1 항에 있어서,
서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체.
제 1 항의 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 핵산.
제 3 항에 있어서,
서열번호 4로 표시되는 염기서열을 가지는 핵산.
제 3 항의 AAV1 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV1 벡터.
제 5 항에 있어서,
상기 AAV1 벡터는 AAV1 야생형 바이러스 벡터와 비교할 때, 표적 조직에 대해 향상된 형질도입 프로파일을 갖는, 재조합 AAV 벡터.
제 6 항에 있어서,
상기 표적 조직은 폐 혈관인 재조합 AAV1 벡터.
제 7 항에 있어서,
상기 폐 혈관은 폐 동맥인 재조합 AAV1 벡터.
제 5 항에 있어서,
서열번호 7로 표시되는 재조합 AAV1 벡터.
제 5 항에 따른 재조합 AAV1 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
제 10 항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
제 10 항에 있어서,
폐 동맥 고혈압 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물.
제 10 항에 있어서,
상기 조성물이 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강 내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 표피하, 유리체내, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사로 투여되는 약제학적 조성물.
치료적 유효량의 제 5 항에 따른 재조합 AAV1 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 폐동맥 고혈압 예방 또는 치료 방법.
제 14 항에 있어서,
상기 조성물이 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강 내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 표피하, 유리체내, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사로 투여되는 폐동맥 고혈압 예방 또는 치료 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 대상체는 인간을 제외한 포유동물인, 폐동맥 고혈압 예방 또는 치료 방법.