JP2022526494A - 突然変異したアデノ随伴ウイルスキャプシドタンパク質、それを含むａａｖ粒子および肝臓指向性ａａｖベクター遺伝子療法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、第１の形態において、任意選択で前記オリゴペプチドの両方の部位の端部にリンカー配列を表すさらなるアミノ酸を有するオリゴペプチドで構成されるインサートを有する、任意選択で前記オリゴペプチドの両方の部位の端部にリンカー配列を表すさらなるアミノ酸を有するオリゴペプチドで構成されるインサートを有する、突然変異したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質またはそのフラグメントに関する。これらの突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質は、肝臓組織、肝細胞、肝臓細胞および肝臓細胞株または肝細胞癌（ＨＣＣ）を部分的により高い特異性で標的化することにおいてより効率的である。さらに、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質を含む突然変異したＡＡＶ粒子が提供される。加えて、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸は、対応する核酸ベクター、特定にはプラスミドと一緒に同定される。加えて、本発明に係る核酸ベクターまたは核酸分子を含有する宿主細胞。さらに、ＡＡＶ粒子の製造における、または遺伝子療法のための医薬品の製造における、本発明に係るＡＡＶ粒子または核酸または核酸ベクターの使用が記載される。さらに、肝細胞および／またはＨＣＣを標的化することにおける使用のための記載されたタンパク質、粒子分子、加えて核酸ベクターが記載される。特定には、肝細胞に関与する疾患を処置することにおける使用のための、またはＨＣＣを処置するための、特定には、遺伝子療法における使用のための、例えば肝細胞、肝臓組織またはＨＣＣへの目的の遺伝子の移入における使用のための前記成分が開示される。【選択図】図４
Description
本発明は、第１の形態において、オリゴペプチドの両方の部位にリンカー配列を表すさらなるアミノ酸を任意選択で有するオリゴペプチドで構成されるインサートを有する、突然変異したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質またはそのフラグメントに関する。これらの突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質は、肝臓組織、肝細胞、肝臓細胞および肝細胞株または肝細胞癌（ＨＣＣ）に、部分的にこれらの細胞型への改善された親和性で遺伝物質を移入させることにおいてより効率的である。さらに、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質を含む突然変異したＡＡＶ粒子（一様の、またはハイブリッドとして）が提供される。加えて、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸は、対応する核酸ベクター、特定にはプラスミドと一緒に同定される。加えて、本発明に係る核酸ベクターまたは核酸分子を含有する宿主細胞。さらに、遺伝子療法のための医薬品の製造における本発明に係るＡＡＶ粒子または核酸または核酸ベクターの使用。さらに、肝細胞および／またはＨＣＣを標的化することにおける使用のための、記載されたタンパク質、粒子分子、加えて核酸ベクターが記載される。特定には、肝細胞に関与する疾患を処置することにおける使用のための、またはＨＣＣを処置するための前記構成要素が開示され、特定には、遺伝子療法における使用のための、例えば肝細胞、肝臓組織またはＨＣＣへの目的の遺伝子の移入における使用のための前記構成要素が開示される。
肝臓は、複雑な代謝機能、免疫学的機能および止血機能を有する必須の臓器の一つである。肝臓は、広範な一遺伝子障害および慢性的な代謝状態による影響を受けるMarcellin、P.およびKutala, B. K.、Liver International、2018、38 (S1)、2～6を参照されたい。その結果として、肝臓は、Baruteau, J.、Journal of Inherited Metabolic Disease、2017、497～517で要約されているように、特定にはＡＡＶベクターを用いた遺伝子療法戦略の開発のための主要な標的になってきた。
近年の検討の通り、有望な結果は、例えば血友病に罹っている患者で得られている。Pierce, G. F.およびIorio, A.、Hamophilia、1018、24 (Suppl 6)、60～67を参照されたい。しかしながら、ヒト患者におけるＡＡＶベクターの低い効能を補うために、それでもなお高いベクター用量が必要である。効能は、重度の血友病表現型を軽度の形態に変換するのに必要な血液凝固因子の適度な生理学的レベルを得るのに十分であるが、他の肝疾患のためのより有効なＡＡＶベクターが緊急的に求められている。加えて、患者は、Fitzpatrickら、Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. Elsevier Ltd.、9(6月)、119～129によって記載されるように、第１のＡＡＶベクター投与のときに中和キャプシド抗体を確立する。これは、導入遺伝子発現レベルを改善するために同じまたは交差反応するＡＡＶキャプシドを用いたＡＡＶベクターの再投与を機能しなくする。それゆえに、現在の、さらには将来の遺伝子治療アプローチを改善するために、効率的な肝臓指向性遺伝子移入のための新規のキャプシド特性を有するＡＡＶベクターが最大の重要性を有する。
上述の疾患の他にも、肝臓は、がん、特定には肝細胞癌（ＨＣＣ）を発症させやすく、またはＨＣＣ以外の腫瘍に由来する転移のための「巣（home）」になりやすい。世界的に、ＨＣＣは、がん関連死の三番目に多い原因であることが報告されている。これは、ＨＣＣの進行期における予後不良を伴う重度のがん疾患である。これまで、治療効果がある可能性がある処置は、腫瘍切除のような外科手術、同所性肝移植、または経皮的高周波アブレーションに限定されている。Waghray, A.ら、WJH、2015、7(8)、1020～1029を参照されたい。患者の大半は、現在の治療選択肢が極めて不十分であるＨＣＣの進行期に診断される。それゆえに、ＡＡＶベクターベースのがん遺伝子療法を含む新規の治療アプローチへの強い必要性がある。ＡＡＶベクターは、自殺遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子または免疫療法のための導入遺伝子を腫瘍部位に送達するのに使用することができ、例えばDhungel, B.ら、2017、7544で論じられている通りである。がん遺伝子療法のための導入遺伝子の効率的で安全な送達を提供するために、ＨＣＣ標的組織に向けられ、効率的な治療的導入遺伝子発現が可能な新規のＡＡＶベクターの操作が必要である。
ＡＡＶベクターは、パルボウイルス科の非病原性の属やディペンドパルボウイルス属のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベースとする。ＡＡＶは、非エンベロープ二十面体タンパク質キャプシドにパッケージングされた約４．７ｋＢの一本鎖ＤＮＡゲノムで構成される。これは、小さい（直径２５ｎｍの）ウイルスであり、二十面体のキャプシドを形成する６０個の単量体からなる。これらの単量体は、１：１：１０の比率のウイルスキャプシドタンパク質（ＶＰ）ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３で構成される。４．５ｋＢの一本鎖コード化ＤＮＡゲノム（加えて逆方向末端反復（ＩＴＲ））は、非構造（Ｒｅｐタンパク質およびアセンブリ活性化タンパク質）および構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）をコードする２つの遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ）が結合している。ＡＡＶゲノムは、ＩＴＲを端部に有しており、これは、パッケージングおよび複製シグナルとして役立つ。ＡＡＶ感染の生物学的特徴は、主としてＡＡＶキャプシドと宿主細胞の相互作用に基づく。具体的には、キャプシドは、細胞移入や細胞内トラフィッキングに加えてビリオンのプロセシングを媒介する宿主細胞の細胞表面受容体と相互作用する。ＡＡＶは、いずれの疾患とも関連しておらず、むしろ腫瘍保護的であることに関して議論が起こっている。後代産生のためのヘルパーウイルス様のアデノウイルスの存在に依存性であることが独特である。さらに、ＡＡＶは、有糸分裂および有糸分裂後の組織を形質導入することができ、広範な組織親和性を示す。実際に、インビボにおける適用の場合、ＡＡＶベクター、特定にはＡＡＶ血清型２ベースのベクターの主要な欠点は、その広範な親和性である。ＡＡＶベクターは、多様な細胞型を形質導入することができるため、別個の標的臓器の形質導入効率は低く、治療標的細胞の形質導入レベルを達成するのに、より高いベクター用量の投与が必要である。
しかしながら、ＡＡＶ、特定にはＡＡＶ２は、遺伝子療法のためのベクターとしてだけでなく、ワクチン開発のためのプラットフォームとして、さらに、前臨床調査でのツールとしても大人気を博した。ＡＡＶベクターは、インビボにおける遺伝子療法にとって最適な遺伝子送達系とみなされる。ＡＡＶの有利な特徴としては、その非病原性、高い安定性、分裂細胞と非分裂細胞の両方を形質導入する能力、有糸分裂後のまたはゆっくり増殖する細胞における長期にわたる遺伝子発現、および低い免疫原性が挙げられる。加えて、ＡＡＶベクターは、本来のゲノム組み込み活性を欠如しており、したがって非組み込み型ベクターシステムと定義される。これは、挿入変異誘発のリスクを著しく低下させることから、レトロ／レンチウイルスベクターと比較して主要な利点である。さらに、ベクターは、その安定性のために、高いタイターおよび純度に生産することができる。
これまで、１３種の異なる天然ヒトおよび非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型および１００種を超える天然バリアントが単離されている。血清型のほとんどは、親和性および免疫系によって認識されるエピトープの点で異なっているいため、プロトタイプのＡＡＶベクターであるＡＡＶ血清型２の代替物としてベクター化されている。ベクター化のために、ウイルスゲノムは、導入遺伝子カセットで置き換えられる。血清型の用法は、ＩＴＲ２を端部に有するＡＡＶベクターゲノムを非ＡＡＶ２キャプシドにパッケージングすることを可能にするシュードパッケージング（ｐｓｅｕｄｏｐａｃｋａｇｉｎｇ）技術によって簡易化される。これは、キャプシドの点で異なるが同じベクターゲノムを送達するＡＡＶベクターの生産を可能にする。ＡＡＶベクターキャプシドおよびゲノムは、インビトロおよびインビボにおける効率的で指向性の遺伝子送達のために改変および最適化することができる。
シュードタイピング（シュードパッケージング）は、ＡＡＶベクターシステムの親和性を変更するための戦略の代表例である。しかしながらこれは、親和性を別個の細胞型にリダイレクトすることはできない。加えて、ＡＡＶベクター媒介細胞形質導入の効率を増加させるその効力は、限定的である。それゆえに、細胞を形質導入する第１の工程を含む宿主－ＡＡＶ相互作用を適合させるために、簡単に言えばキャプシド操作技術と称される代替戦略が開発されてきた。その結果として、非許容細胞型はＡＡＶ形質導入を受けやすくなり、許容細胞の場合の形質導入効率を改善することができる。加えて、ウイルスベクターのインビボにおける親和性を規定の細胞表面構造にリダイレクトすることが可能になる（Buning, H.ら、Current Opinion in Pharmacology、2015、24、94～104）。
細胞表面の標的化に焦点を当てた遺伝学的なキャプシド操作アプローチにおいて、ペプチドリガンドは、キャプシドの好適な位置に挿入される。この位置は、標的細胞の感染特性に影響を与えるためにキャプシド表面上に露出していることが必要である。これまでに、親和性改変のためのペプチド挿入は、主として以下の技術：Ｂｕｎｉｎｇらにおいて記載されたように、ＡＡＶ２の場合、ｉ）ＶＰ２のＮ末端への融合、またはｉｉ）可変領域（ＶＲ）－ＶＩＩＩの先端におけるペプチドの挿入：ＡＡＶ２の場合、アミノ酸５８７位における挿入、および位置５８８における挿入、またはＶＲ－ＩＶにおける挿入：アミノ酸４５３位における挿入によって実行される。上記；およびBuningおよびSvrivastava、Mol Ther Methods Clin Dev、2019、12、248～265を参照されたい。例えば、ＥＰ２１５８２１１Ｂ１は、そのようにして細胞標的化を媒介するリガンドを表す４～１３アミノ酸の長さを有する構造タンパク質の挿入を同定する。加えて、キャプシドタンパク質中に存在する特異的なアミノ酸を置換するためのアプローチが行われてきた。
治療的に興味深い多くの標的細胞または組織にとって、標的細胞の形質導入を媒介すると予想される好適なペプチドリガンドは不明であることから、ＡＡＶペプチドディスプレイライブラリーのハイスループットスクリーニングが記載されている。例えば、ライブラリーは、Muller, O. J.ら、Nature Biotechnology、2003、21 (9)、1040～1046およびPerabo, L.ら、Molecular Therapy、2003、8(1)、151～157で開示されている。Peraboらによって確立されたＡＡＶペプチドディスプレイライブラリーは、４個より多くのＥ６キャプシドバリアントで構成される。ライブラリーは、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸５８７位（ＶＰ１の番号付け）へのランダムな７－ｍｅｒのペプチドの挿入によって生成された。ランダムペプチドは、最適な提示を助けるためにリンカー配列を端部に有する。このライブラリーは、例えばＥＰ１４５６３８３Ｂ１に記載され、さらにはＥＰ２３６３４８７Ａ２にも記載されている。標的細胞でのこのライブラリーの選択は、新規の改善された形質導入特性を有するＡＡＶキャプシドバリアントを同定するのに使用されてきた。
ＵＳ２００２／０１９２８２３Ａ１では、ＡＡＶキャプシドバリアント、および前記ＡＡＶキャプシドバリアントを、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９をベースとするシャッフルされたＡＡＶキャプシドライブラリーから誘導する方法が記載されている。
さらなる戦略としては、標的細胞型の膜上で発現された細胞受容体との特異的な相互作用を媒介できるベクターの外面への外来分子の取り付けが挙げられる。キャプシド表面の表面または外部に存在するアミノ酸の化学修飾が論じられている。これらの改変としては、例えばストレプトアビジンを介してさらなる成分のカップリングを可能にするためのビオチンの結合が挙げられる。さらに、天然にはない部分の導入が開示されている。例えば、ＷＯ２０１２／１４９１６０Ａ２は、最終的にさらなる基の導入を可能にする天然にはないアミノ酸部分を導入することに基づく、ウイルスキャプシドタンパク質の改変のための戦略を記載している。
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上述したように、ＡＡＶベクターシステムの主な問題は、インビボにおける親和性に加えて、特異的な組織型の形質導入効率であり、したがって、高いベクター用量の使用を必要とすることである。
発明の要約
結果として、本発明の目的は、当業界で述べられている問題、すなわち広範な親和性および低い形質導入効率の問題を克服するＡＡＶベクターおよびキャプシドタンパク質を提供することである。
結果として、本発明の目的は、当業界で述べられている問題、すなわち広範な親和性および低い形質導入効率の問題を克服するＡＡＶベクターおよびキャプシドタンパク質を提供することである。
本発明は、第１の形態において、突然変異したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質またはそのフラグメントであって、インサートが、ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質、またはＡＡＶの他の血清型、すなわちＡＡＶ１、ＡＡＶ３ｂ～ＡＡＶ１１、およびウシＡＡＶのホモログキャプシドタンパク質に対応する配列番号２のアミノ酸番号１３９、１６１、２６１、３８１、４４７、４５３、４５９、５３４、５７０、５７３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９を有するアミノ酸の少なくとも１つの後に挿入されており、インサートは、少なくとも４個のアミノ酸および最大で３０個のアミノ酸のオリゴヌクレオチド、例えば、５～１２個のアミノ酸、特定には７個のアミノ酸からなるオリゴヌクレオチドを含み、前記インサートは、前記オリゴペプチドの両方の部位にリンカー配列を表すさらなるアミノ酸を任意選択で含有していてもよく、前記リンカー配列は、存在する場合、互いに独立して１～３個のアミノ酸のサイズを有し；突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質またはそのフラグメントまたはそのホモログは、肝臓組織、肝細胞、肝臓細胞および肝臓細胞株または肝細胞癌（ＨＣＣ）をより高い特異性で標的化することにおいてより効率的である、ＡＡＶキャプシドタンパク質またはそのフラグメントに関する。
第２の形態において、本発明は、本発明に係るＡＡＶキャプシドタンパク質またはそのフラグメントを含む突然変異したＡＡＶ粒子に関する。さらに、本発明は、本発明に係るＡＡＶウイルスキャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸に関する。加えて、核酸ベクター、特定には、本発明に係る核酸分子を含むプラスミド、加えて本発明に係る前記核酸ベクターまたは前記核酸を含有する宿主細胞が開示される。
さらに、ＡＡＶ粒子の製造または遺伝子療法のための医薬の製造における、本発明に係るＡＡＶ粒子または本発明に係る核酸分子または本発明に係る核酸ベクターの使用。さらに、突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質またはそのフラグメントもしくはホモログ、加えて、突然変異したＡＡＶ粒子または核酸分子もしくは核酸ベクターを含む本明細書に記載される構成要素は、肝細胞および／またはＨＣＣを標的化すること、および／または肝細胞および／またはＨＣＣにおけるＡＡＶベクターの形質導入効率を改善することにおける使用に好適である。さらに、これらの構成要素は、肝細胞またはＨＣＣへの目的の遺伝子の移入における使用、特定には、遺伝子療法における使用のための使用に好適である。
すなわち、本発明者らは、より高い特異性および／または効率で肝臓組織、肝細胞、肝臓細胞および肝臓細胞株、およびＨＣＣをそれぞれ形質導入することにおいてより効率的である、突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質またはそのフラグメントの新しいバリアントを同定した。
本発明者らは、肝臓組織、肝細胞、肝臓細胞および肝臓細胞株または肝細胞癌（ＨＣＣ）を標的化することにおいてより効率的であり、一部より特異的な、新しい突然変異ＡＡＶキャプシドタンパク質またはそのフラグメントを同定した。
ベクター粒子、加えてキャプシドタンパク質は、ＡＡＶのキャプシドタンパク質、またはＡＡＶの他の血清型、すなわちＡＡＶ１、ＡＡＶ３～ＡＡＶ１１、およびウシＡＡＶのホモログキャプシドタンパク質に対応する配列番号２のアミノ酸番号１３９、１６１、２６１、３８１、４４７、４５３、４５９、５３４、５７０、５７３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９を有するアミノ酸の少なくとも１つの後に、インサートが挿入されていることを特徴とし、インサートは、少なくとも４個のアミノ酸および最大で３０個のアミノ酸のオリゴペプチド、例えば、５～１２個のアミノ酸、特定には、７個のアミノ酸からなるオリゴペプチドを含む。インサートは、前記オリゴペプチドの両方の部位にリンカー配列を表すさらなるアミノ酸を任意選択で含有していてもよく、前記リンカー配列は、存在する場合、互いに独立して１～３個のアミノ酸のサイズを有する。
用語「そのフラグメント」は、本明細書で使用される場合、突然変異したアデノ随伴ウイルスキャプシドタンパク質由来のタンパク質またはポリペプチドを指す。典型的には、フラグメントのサイズは、その参照となる配列のサイズまたは長さの、少なくとも５０％、例えば少なくとも７０％、８０％、９０％、例えば９５％である。
用語「突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質」は、ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質ＶＰ１に対応する配列番号２の配列を参照して本明細書において同定された別個の位置に、アミノ酸で構成されるインサートを含有するキャプシドタンパク質を意味する。
用語「ホモログキャプシドタンパク質」は、ＡＡＶの他の血清型、すなわちＡＡＶ１（配列番号１）、ＡＡＶ３（配列番号３）、ＡＡＶ４（配列番号４）、ＡＡＶ５（配列番号５）、ＡＡＶ６（配列番号６）、ＡＡＶ７（配列番号７）、ＡＡＶ８（配列番号８）、ＡＡＶ９（配列番号９）、ＡＡＶ１０（配列番号１０）、ＡＡＶ１１（配列番号１１）およびウシＡＡＶ（配列番号１２）のホモログキャプシドタンパク質ＶＰ１を指す。すなわち、ホモログは、他のＡＡＶ血清型由来の血清型のキャプシドタンパク質である。概要は、Vance, M.A.ら、DOI：10.5772/61988に示される。血清型アライメントは、図７Ａ～Ｄに示される。すなわち、ＡＡＶ２の挿入部位に対応する他のＡＡＶ血清型における相同な挿入部位は、当業者によって容易に決定することができる。
用語「キャプシドの外面」は、キャプシドの外部を指し、したがって、相互作用パートナーとの相互作用を可能にするためのインサートが提示される。用語「キャプシドの外面」は、用語「キャプシドの外部」と同義的に使用される。
用語「リンカー」は、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質中に任意選択で存在するアミノ酸配列を指す。前記リンカーは、突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質のインサート中に存在するオリゴペプチドと、ＶＰ１タンパク質の野生型アミノ酸配列との間の連結要素である。
用語「粒子」または「ＡＡＶ粒子」、ＤＮＡ非含有またはＤＮＡ含有のいずれかのキャプシドを指す。用語「ベクター粒子」または「ベクター」は、ＤＮＡを含有するキャプシドを指す。用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスまたはその誘導体、例えば組換えＡＡＶベクター粒子などを指し、用語「ＡＡＶ野生型粒子」は、天然にＤＮＡ非含有またはＤＮＡ含有で存在するアデノ随伴ウイルスキャプシドを表す。用語「組換えＡＡＶ」または「組換えベクター粒子」は、ウイルスのゲノムが、ベクターゲノム、すなわち細胞に導入されることになる外来ＤＮＡで置き換えられているＡＡＶであり、これはまた、「ｒＡＡＶ」とも呼ばれる。用語「ＡＡＶ」またはそれぞれの組換えＡＡＶベクター粒子およびＡＡＶ野生型粒子当業界において公知の少なくとも１３種の異なる血清型を含む。ヒト血清型２のＡＡＶはまた、ＡＡＶ２またはＡＡＶ２粒子またはＡＡＶ２ベクター粒子とも言われる。
用語「標的化」は、ＡＡＶキャプシドの遺伝学的改変による、標的組織もしくは標的細胞への特異性の改善および／または標的組織もしくは標的細胞における形質導入効率の改善を指す。用語「標的化分子」は、標的細胞への本明細書に記載されるＡＡＶ粒子の標的化を可能にする分子を指す。
用語「標的細胞」または「標的組織」は、本明細書で使用される場合、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質またはそのフラグメント中に存在する標的化分子によって定義される標的を表す特異的な細胞型または組織を指す。すなわち、標的細胞または標的組織は、肝臓組織、肝細胞、肝臓細胞および肝臓細胞株、または肝細胞癌である。
本発明者らは、キャプシドタンパク質の別個の位置にインサートを挿入することが、キャプシドタンパク質を提供することを可能にし、その結果として、突然変異したアデノ随伴ウイルス粒子は、肝臓組織、肝細胞、肝臓細胞および肝臓細胞株または肝細胞癌を部分的により高い特異性で標的化することにおいてより効率的になることを認識した。
一実施態様において、突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントまたはそのホモログは、ＡＡＶ１、２、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１型およびウシＡＡＶ由来の突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質である。一実施態様において、突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質は、血清型ＡＡＶ２のＶＰ１由来である。
本発明のさらなる実施態様において、突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントまたはそのホモログは、インサートが、２６１、４５３、５３４、５７０、５７３、５８７および５８８のアミノ酸の少なくとも１つの後の位置にあるタンパク質である。好ましい実施態様において、インサートが導入される位置は、それぞれ４５３位と５８７位の後である。すなわち、挿入は、配列番号２の４５３位と４５４位との間、および／または配列番号２の５８７位と５８８位でなされる。一実施態様において、挿入は、配列番号２の５８７位と５８８位との間に存在する。
配列番号２の配列は、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質のコード配列に相当する。別の実施態様において、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメント、またはそのホモログは、点突然変異、内部または末端の欠失、第２の挿入および突然変異から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含む、突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメント、またはそのホモログである。
例えば、追加の突然変異は、当業界ですでに説明されている突然変異であってもよい。さらに、追加の突然変異は、開示されていないＥＰ１７１９３７４２．８に説明される突然変異であってもよい。
ヘパリンと結合するバリアントに関して予備クリーニングする工程の後の２つの異なる同所ＨＣＣマウスモデルにおいてインビボでライブラリーをスクリーニングすることによって、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質を得た。これは、この特徴が、ＡＡＶ２の一次結合細胞表面受容体であるヘパラン硫酸プロテオグリカンを発現する広範に様々な細胞型への非特異的な結合（ＨＳＰＧ）と相関するためである。Ｃ３Ｈマウスの肝臓にマウス肝癌細胞株（Ｈｅｐａ１２９）を移植することによって、ＨＣＣマウスモデルの１つを生成した（Schmitzら、J. Hepatol. 2004. 787～797）。さらなるマウスモデルは、それぞれＺｎＣｌ２およびアルブミン誘導性プロモーターによって制御されるＴＧＦ－ａおよびｃ－ｍｙｃを過剰発現するトランスジェニックマウスモデルを表す（Haupenthal J.ら、Neoplasia、2012、14(5)、410～419）。
本明細書で開示される予め決定された位置に挿入を有する突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質は、キャプシドがＡＡＶ粒子として組み立てられると、キャプシドの外面におけるキャプシドから導入されたインサートを提示することを特徴とする。すなわち、本発明者らは、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質に基づいて、インビボにおける肝細胞およびその悪性の対応物である肝細胞癌細胞への遺伝子移入の効率および選択性に関してＡＡＶベクターシステムを改善することを目的とする。すなわち、肝細胞およびＨＣＣの優れた形質導入効率は、転写のために、より高い細胞侵入率およびより効率的なベクターゲノムの接近しやすさにより達成された。本明細書に記載されるバリアントは、野生型ＡＡＶ２または他の公知の突然変異したキャプシド株と比較してより効率的に肝細胞およびＨＣＣを形質導入した。加えて、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質は、ここでも野生型ＡＡＶ２と比較してより効率的な細胞間プロセシングに関して論じられており、発現効率、すなわちベクターコピー当たりの転写物数に関して優れていることが見出されている。
すなわち、キャプシドがＡＡＶ粒子として組み立てられるときキャプシドの外面に存在する提示されたインサートは、トランスフェクションの効率を増加させることから、肝細胞およびＨＣＣそれぞれにおいて治療標的細胞の形質導入レベルを達成するのに必要な用量は、より低くなる。
本発明の一実施態様において、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントまたはそのホモログは、アミノ酸配列中のリンカー配列が、アミノ酸Ｇ、Ｓおよび／またはＡを含有するかまたはそれらからなるキャプシドタンパク質またはタンパク質フラグメントまたはそのホモログである。好ましい実施態様において、リンカーは、アミノ酸ＡまたはＳの少なくとも１つからなり、特定には、本明細書において同定された位置に挿入されたオリゴペプチドのアミノ酸配列の端部に、Ｎ末端にアミノ酸ＡＡＡおよびＣ末端にＡＡを有するか、またはＮ末端にＡＳＡおよびＣ末端にＡＡを有する。
一実施態様において、インサートは、いかなる停止コドンも含有しない。すなわち、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質は、インサートを含有し、それに続いて、インサートが導入されるアミノ酸の後野生型アミノ酸が存在することは明らかである。加えて、本発明に係る核酸分子は、コードされたペプチドの翻訳を停止する停止コドンをコードしない。
一実施態様において、リンカー、特定には上述のリンカーは、本明細書に記載される、少なくとも５個のアミノ酸および最大で１２個のアミノ酸のオリゴペプチド、例えば、７個のアミノ酸の端部にある。
一実施態様において、突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメント、またはそのホモログは、オリゴヌクレオチドが配列番号１３～２７５のいずれか１つによる配列を有する７個のアミノ酸のサイズを有するキャプシドタンパク質、そのタンパク質フラグメントまたはホモログである。別の実施態様において、突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメント、またはそのホモログは、配列番号２７６～５３８の配列を有するインサートを含有する。配列番号１３～２７５のいずれか１つによる配列は、いかなるリンカー基も含まないインサートを示すアミノ酸配列であり、一方で、配列番号２７６～５３８のいずれか１つのインサートは、配列番号１３～２７５に示されるペプチド配列の両方の部位にリンカー配列を含有する本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質におけるインサートとして存在することになる好適なインサートのアミノ酸配列を示す。
すなわち、本発明の実施態様は、７個のアミノ酸のオリゴヌクレオチドを有する配列番号２の５８７位と５８８位との間における挿入、および１～３個のアミノ酸の両側におけるリンカー配列を有するタンパク質である。好ましくは、この配列は、配列番号１３～２１および２７６～２８４のいずれか１つである。
本発明のさらなる形態において、本発明に係る突然変異したアデノ随伴ウイルスキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、またはそのホモログを含むベクター粒子とも称される突然変異したアデノ随伴ウイルス粒子が提供される。このＡＡＶ粒子は、肝臓組織、肝細胞、肝臓細胞および肝臓細胞株または肝細胞癌を部分的により高い特異性で標的化することにおいてより効率的である。すなわち、エクスビボまたはインビボにおける標的細胞または標的組織の形質導入の効率、加えて、送達ツールとしてのＡＡＶの適応性は、より高い特異性および／または効率で細胞を形質導入する突然変異したＡＡＶ粒子の能力を増加させることによって増加する。
例えば、この突然変異したＡＡＶ粒子は、遺伝子療法のための医薬品の製造におけるＡＡＶ粒子の製造において有用である。例えば、遺伝子療法のための医薬のケースにおいて、本発明に係るＡＡＶ粒子は、機能的な核酸フラグメントまたは目的の分子の核酸フラグメントを有する。前記目的の分子は、目的の分子をコードする核酸フラグメントを含む。より効率的であり、標的細胞または標的組織の標的化の部分的により高い特異性を有することで、肝臓組織、肝細胞、肝臓細胞および肝臓細胞株、またはＨＣＣを標的化することは、述べられた標的化された細胞および標的組織の悪性腫瘍を防止または処置するために、遺伝子療法に加えてワクチン接種戦略の効能を増加させることを可能にする。
特定には、本発明に係る突然変異したＡＡＶ粒子は、肝細胞および／またはＨＣＣを標的化することにおいて使用するのに好適である。
本発明に係る突然変異したＡＡＶ粒子は、肝細胞またはＨＣＣへの目的の遺伝子の移入において、特定には、遺伝子療法における使用のための上記移入において特に有用である。
本発明に係る突然変異したＡＡＶ粒子は、肝細胞またはＨＣＣへの目的の遺伝子の移入において、特定には、遺伝子療法における使用のための上記移入において特に有用である。
すなわち、本発明に係る突然変異したＡＡＶ粒子は、治療上有効な導入遺伝子の発現において有用である。例えば、酵素のような代謝因子は、遺伝的欠陥のような欠陥を克服するために発現される場合がある。例えばＨＣＣのケースでは、腫瘍抑制遺伝子、自殺遺伝子、炎症促進性因子などの発現が想定され得る。
さらに、突然変異したＡＡＶ粒子は、細胞に導入される導入遺伝子または抗原に対する免疫寛容を誘導するのに好適である。これは、特定には肝臓の標的細胞および標的組織において起こり得る。寛容は、自己免疫疾患を処置するのに役立つ。
さらなる形態において、本発明は、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、またはそのホモログをコードする核酸分子に関する。すなわち、本発明に係る核酸分子は、本明細書において定義されるＡＡＶキャプシドタンパク質もしくはそのフラグメント、例えば、配列番号１３～２７５のいずれか１つのオリゴペプチドを含有するＡＡＶキャプシドタンパク質もしくはそのフラグメントをコードする核酸分子、または配列番号２７６～５３８のいずれか１つによるインサートである。当然ながら、宿主細胞に応じて、コドン最適化を行うことができる。
さらなる形態は、核酸ベクター、特定には、本発明に係る核酸分子を含むプラスミドに関する。当業者は、好適なプラスミドおよびベクターについて熟知している。特定には、トランスフェクトしようとする宿主細胞に基づき、それに合うようにプラスミドまたはベクターが選択される。さらに核酸ベクターは、さらなる遺伝学的なＡＡＶヘルパーエレメント、例えばｒｅｐオープンリーディングフレームを含有していてもよい。
さらなる形態において、本発明に係る核酸ベクターまたは本発明に係る核酸分子を含有する宿主細胞が提供される。
宿主細胞は、組換えＡＡＶ粒子生産のために、例えばアデノウイルスヘルパー遺伝子Ｅ４、Ｅ２ＡおよびＶＡを含有するさらなるヘルパープラスミドまたは核酸分子を含有していてもよい。本発明の一実施態様において、宿主細胞は、本発明に係るＡＡＶ粒子の生産のためのプロデューサーである。
宿主細胞は、組換えＡＡＶ粒子生産のために、例えばアデノウイルスヘルパー遺伝子Ｅ４、Ｅ２ＡおよびＶＡを含有するさらなるヘルパープラスミドまたは核酸分子を含有していてもよい。本発明の一実施態様において、宿主細胞は、本発明に係るＡＡＶ粒子の生産のためのプロデューサーである。
さらなる形態において、本発明は、本発明に係る突然変異したＡＡＶ粒子、または本発明に係る核酸分子、または本発明に係る核酸ベクター、または好適な導入遺伝子ＤＮＡ成分を含む本明細書に記載される組成物に関する。前記導入遺伝子ＤＮＡ成分は、したがって、公知の導入遺伝子ＤＮＡ、または好適なペプチドもしくはタンパク質をコードするＤＮＡであり得る。別の実施態様において、本発明に係る突然変異したＡＡＶ粒子を含む組成物が提供され、例えば本組成物は、肝臓組織、肝細胞、肝臓細胞および肝臓細胞株または肝細胞癌の形質導入で使用するための医薬組成物である。さらに、本発明は、ＡＡＶ粒子の製造または遺伝子療法のための医薬の製造における、本発明に係るＡＡＶ粒子、本発明に係る核酸分子または本発明に係る核酸ベクターの使用に関する。
本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントもしくはホモログ、本発明に係る突然変異したＡＡＶ粒子、本発明に係る核酸分子、または本発明に係る核酸ベクターは、本明細書において実証された通り、肝細胞および／またはＨＣＣを標的化することにおいて特に有用である。
本発明の別の形態は、肝細胞に関与する疾患を処置することにおける使用のための、またはＨＣＣ：血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンウィルブランド病などの出血障害、アルファ１抗トリプシン欠損症、家族性高コレステロール血症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、クリグラー－ナジャー症候群、急性間欠性ポルフィリン症、グリコーゲン蓄積症１ａ型などの代謝障害、肝細胞癌、肝芽腫、胆管癌などの肝臓がん、多発性硬化症などの自己免疫障害、潜在性自己免疫性糖尿病、肝臓、腎臓、心臓、幹細胞などの同種移植に対する寛容の誘導、リポタンパク質リパーゼ欠損症、糖尿病およびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症などの代用の肝臓指向性遺伝子療法を処置するための、本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質もしくはそのフラグメントもしくはそのホモログ、本発明に係る突然変異したＡＡＶ粒子、本発明に係る核酸分子、または本発明に係る核酸ベクターに関する。
すなわち、突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントまたはそのホモログ、突然変異したＡＡＶ粒子、核酸分子または核酸ベクターを含む本明細書に記載される構成要素は、それを必要とする個体を処置する方法における使用に好適である。したがって、別の形態は、本発明に係る突然変異したＡＡＶ粒子、または本発明に係る突然変異したＡＡＶウイルスキャプシドタンパク質、そのフラグメント、もしくはそのホモログをコードする核酸分子、および／または本発明に係る核酸ベクターを、それを必要とする個体に投与する工程を含む、それを必要とする個体を処置する方法に関する。
さらに、投与は、公知の手段によって実行することができる。特定には、投与は、静脈内経路によって実行してもよいし、またはそれぞれ（肝）門脈、または肝内、もしくは腫瘍内への注射によって実行してもよい。
特定には、本発明に係る治療的処置方法は、肝細胞に関与する疾患の治療的処置またはＨＣＣの処置のための方法である。例としては、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンウィルブランド病などの出血障害、アルファ１抗トリプシン欠損症、家族性高コレステロール血症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、クリグラー－ナジャー症候群、急性間欠性ポルフィリン症、グリコーゲン蓄積症１ａ型などの代謝障害、肝細胞癌、肝芽腫、胆管癌などの肝臓がん、多発性硬化症などの自己免疫障害、潜在性自己免疫性糖尿病、肝臓、腎臓、心臓、幹細胞などの同種移植に対する寛容の誘導、リポタンパク質リパーゼ欠損症、糖尿病およびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症などの代用の肝臓指向性遺伝子療法が挙げられる。
本発明の一実施態様において、予防的または治療的処置の方法は、本発明に係るＡＡＶ粒子、または本発明に係る突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質もしくはそのフラグメントもしくはそのホモログの少なくとも１つを含むＡＡＶ粒子、本発明に係る核酸分子、および／または本発明に係る核酸ベクターを、例えば医薬組成物の形態で、投与する工程を含む遺伝子療法である。前記医薬組成物または医薬は、希釈剤、賦形剤または担体などの他の好適な成分を含有していてもよい。
さらに、特定には遺伝子療法、すなわち肝臓指向性ＡＡＶ遺伝子療法による、肝細胞またはＨＣＣへのエクスビボまたはインビボにおける目的の遺伝子の移入のための方法が開示される。
本発明を実施例によってさらに説明するが、これらに限定されない。
ＭＬＩＶキャプシドバリアントの特徴付け
ＡＡＶペプチドディスプレイライブラリー選択の前に、ライブラリーを、ヘパリンアフィニティーカラム精製によって、ＨＳＰＧ結合キャプシドバリアントから予備クリーニングした。ライブラリーにおいて、インサートは、配列番号２の５８７位と５８８位との間に配置される。２つの異なるマウスモデルにおけるインビボでのＡＡＶペプチドディスプレイライブラリー選択の後に肝臓組織中に蓄積したキャプシドバリアントを、それぞれＭＬＩＶ＊ライブラリー（Ｈｅｐａ１２９移植）およびＭＬＩＶライブラリー（ＴＧＦ－α／ｃ－ｍｙｃトランスジェニック）と名付けた。移植マウスモデルについて９２種の候補バリアントおよびトランスジェニックマウスモデルについて８４種の候補バリアントが同定された。２つのライブラリーのそれぞれの最も豊富なバリアントを、ＭＬＩＶ１（ＭＬＩＶ＊）（配列番号１３）およびＭＬＩＶ３（ＭＬＩＶ）（配列番号１４）と名付け、詳細に特徴付けた。インビボでの評価のために、ＭＬＩＶ１およびＭＬＩＶ３を、ルシフェラーゼ導入遺伝子カセットを発現する組換え（ｒ）ＡＡＶベクターとして生産した。導入遺伝子発現を、普遍的に発現されるプロモーターであるＣＭＶプロモーターによって制御した。詳細には、４．８Ｅ１１個のｒＡＡＶベクター粒子を、尾静脈注射を介して健康なマウスに適用した。対照として、さらに比較のために、マウスに、同じベクターゲノムを送達する天然血清型キャプシドと共にｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ８を与えた。注射の７、１４、および２８日後、マウスにＤ－ルシフェリン（動物１匹当たり１．５ｍｇ）を注射し、様々な体の領域におけるルシフェラーゼ活性を、発光シグナルを検出するカメラを使用したインビボの画像化によってモニターした。全てのマウスコホートにおいて、動物の上腹部、肝臓の領域において著しいルシフェラーゼ活性を検出した。新規のキャプシドバリアントｒＭＬＩＶ１およびｒＭＬＩＶ３は、ｒＡＡＶ２と比較して、マウス肝臓の形質導入効率において明らかな著しい改善（最大２６倍）を実証した（図１、Ａ、Ｂ）。新しいキャプシドバリアントのマウス肝臓の形質導入効率は、現在、肝臓指向性ヒト臨床遺伝子療法試験で使用されている対照ベクター（ｒＡＡＶ８）に類似している。ｒＭＬＩＶ１およびｒＭＬＩＶ３の生体内分布に関して、ベクターゲノムのｑＰＣＲ分析によって決定したところ、マウス肝臓への明らかな親和性が観察された。具体的には、肝臓中の検出されたベクターゲノムの量は、新規のキャプシドバリアントの場合、脾臓と比べて最大５１倍、肺と比べて最大１８倍、心臓と比べて３倍であった（図２）。特定には、ＡＡＶ２の主要なオフターゲット組織の１つであるマウス脾臓からの脱標的化が観察されたことは（マウスのオフターゲット組織において：ｒＡＡＶ２のゲノム含量＞ｒＭＬＩＶキャプシドバリアントのゲノム含量（脾臓において１８２倍；肺において最大２４倍、心臓において７倍））（図２）、インビボの遺伝子療法に関する本発明に係るバリアントの重要な新規の特徴である。
ＡＡＶペプチドディスプレイライブラリー選択の前に、ライブラリーを、ヘパリンアフィニティーカラム精製によって、ＨＳＰＧ結合キャプシドバリアントから予備クリーニングした。ライブラリーにおいて、インサートは、配列番号２の５８７位と５８８位との間に配置される。２つの異なるマウスモデルにおけるインビボでのＡＡＶペプチドディスプレイライブラリー選択の後に肝臓組織中に蓄積したキャプシドバリアントを、それぞれＭＬＩＶ＊ライブラリー（Ｈｅｐａ１２９移植）およびＭＬＩＶライブラリー（ＴＧＦ－α／ｃ－ｍｙｃトランスジェニック）と名付けた。移植マウスモデルについて９２種の候補バリアントおよびトランスジェニックマウスモデルについて８４種の候補バリアントが同定された。２つのライブラリーのそれぞれの最も豊富なバリアントを、ＭＬＩＶ１（ＭＬＩＶ＊）（配列番号１３）およびＭＬＩＶ３（ＭＬＩＶ）（配列番号１４）と名付け、詳細に特徴付けた。インビボでの評価のために、ＭＬＩＶ１およびＭＬＩＶ３を、ルシフェラーゼ導入遺伝子カセットを発現する組換え（ｒ）ＡＡＶベクターとして生産した。導入遺伝子発現を、普遍的に発現されるプロモーターであるＣＭＶプロモーターによって制御した。詳細には、４．８Ｅ１１個のｒＡＡＶベクター粒子を、尾静脈注射を介して健康なマウスに適用した。対照として、さらに比較のために、マウスに、同じベクターゲノムを送達する天然血清型キャプシドと共にｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ８を与えた。注射の７、１４、および２８日後、マウスにＤ－ルシフェリン（動物１匹当たり１．５ｍｇ）を注射し、様々な体の領域におけるルシフェラーゼ活性を、発光シグナルを検出するカメラを使用したインビボの画像化によってモニターした。全てのマウスコホートにおいて、動物の上腹部、肝臓の領域において著しいルシフェラーゼ活性を検出した。新規のキャプシドバリアントｒＭＬＩＶ１およびｒＭＬＩＶ３は、ｒＡＡＶ２と比較して、マウス肝臓の形質導入効率において明らかな著しい改善（最大２６倍）を実証した（図１、Ａ、Ｂ）。新しいキャプシドバリアントのマウス肝臓の形質導入効率は、現在、肝臓指向性ヒト臨床遺伝子療法試験で使用されている対照ベクター（ｒＡＡＶ８）に類似している。ｒＭＬＩＶ１およびｒＭＬＩＶ３の生体内分布に関して、ベクターゲノムのｑＰＣＲ分析によって決定したところ、マウス肝臓への明らかな親和性が観察された。具体的には、肝臓中の検出されたベクターゲノムの量は、新規のキャプシドバリアントの場合、脾臓と比べて最大５１倍、肺と比べて最大１８倍、心臓と比べて３倍であった（図２）。特定には、ＡＡＶ２の主要なオフターゲット組織の１つであるマウス脾臓からの脱標的化が観察されたことは（マウスのオフターゲット組織において：ｒＡＡＶ２のゲノム含量＞ｒＭＬＩＶキャプシドバリアントのゲノム含量（脾臓において１８２倍；肺において最大２４倍、心臓において７倍））（図２）、インビボの遺伝子療法に関する本発明に係るバリアントの重要な新規の特徴である。
非ヒト霊長類血清型ｒＡＡＶ８は、マウスの肝臓組織において高い形質導入効率を示すことが周知である。しかしながら、これは、ヒト肝臓の場合に達成された形質導入効率と相関しない。比較すると、ヒト血清型ｒＡＡＶ２ベクターは、ヒト肝細胞においてより効率的に吸収され、プロセシングされる。ヒト肝臓組織の場合において新たに開発されたキャプシドバリアントの効率を調査するために、初代ヒト肝細胞をｒＭＬＩＶ１およびｒＭＬＩＶ３（ならびに対照ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ８）で形質導入した。加えて、同じベクターを、初代マウス肝細胞（細胞に対して１Ｅ４のｒＡＡＶベクター粒子のＧＯＩ、７２時間）でアッセイした。ルシフェラーゼ発現の定量化のために、細胞溶解産物におけるルシフェラーゼ活性を、ルシフェリンの添加、それに続く発光シグナル検出（プロメガ（Promega）のルシフェラーゼアッセイキット）によって測定した。ここで、ｒＡＡＶ２ならびに新規のキャプシドバリアントｒＭＬＩＶ１およびｒＭＬＩＶ３は明らかに、ヒト臨床試験で使用されるｒＡＡＶ８より優れていた（Nathwani 2014 doi： 10.1056/NEJMoa 1407309；Pierce 2018、doi：10.1111/hae.13489）（図３、ＡおよびＢ）。
種全体にわたる強い肝臓親和性と高い肝臓の形質導入効率のために、ＭＬＩＶ１およびＭＬＩＶ３は、インビボの遺伝子療法のための有望な新しい開発を象徴する。さらに、初代ヒト肝細胞におけるｒＡＡＶ８と比較してより著しく高い効率は、エクスビボにおいて形質導入後に観察されたものであり、現在ヒト化マウスで確認されており、これは、これらの新規のベクターを肝臓指向性ヒト臨床遺伝子療法試験のためのツールとして進化させるための優れた基盤である。
ＨＣＣＭキャプシドバリアントの特徴付け
ＡＡＶペプチドディスプレイライブラリー選択の前に、ライブラリーを、ヘパリンアフィニティーカラム精製によって、ＨＳＰＧ結合キャプシドバリアントから予備クリーニングした。２つの異なるマウスモデルにおけるインビボのＡＡＶペプチドディスプレイライブラリー選択の後にＨＣＣ組織中に最も豊富に蓄積したキャプシドバリアントを、ＨＣＣＭ＊（Ｈｅｐａ１２９移植マウスモデルで選択された）およびＨＣＣＭ（ＴＧＦ－α／ｃ－ｍｙｃトランスジェニックマウスモデルで選択された）と名付けた。ＨＣＣＭ＊選択経路について、インビボにおける選択の前に、ＡＡＶペプチドディスプレイライブラリーをインビトロで標的細胞であるＨｅｐａ１２９において再選択した（pe-selected）。本発明者らは、移植マウスモデルにおいて１０３種の候補バリアント、およびトランスジェニックマウスモデルにおいて８９種の候補バリアントを同定した。これらのキャプシドバリアントを、肝臓（主要なオフターゲット）組織と比較したＨＣＣ（標的）における濃縮に関してさらにスコア付けした。最もよくスコア付けされたキャプシドバリアントを、全ての分析されたオフターゲット組織（肝臓、心臓、脾臓、骨格筋、腎臓、および膵臓）と比較したＨＣＣにおける濃縮に関してランク付けした。最もよくスコア付けされたキャプシドバリアントを、ＨＣＣＭ１（配列番号１５）、ＨＣＣＭ２（配列番号１６）、およびＨＣＣＭ３（配列番号１７）（ＨＣＣＭライブラリー）、ならびにＨＣＣＭ＊１（配列番号１８）、ＨＣＣＭ＊２（配列番号１９）、ＨＣＣＭ＊３（配列番号２０）、およびＨＣＣＭ＊４（配列番号２１）（ＨＣＣＭ＊ライブラリー）と名付けた。それらを、特徴付けのために、ルシフェラーゼレポーター導入遺伝子カセットを発現するｒＡＡＶベクターとして生産した。導入遺伝子の発現を、ＳＦＦＶプロモーターによって制御した。
ＡＡＶペプチドディスプレイライブラリー選択の前に、ライブラリーを、ヘパリンアフィニティーカラム精製によって、ＨＳＰＧ結合キャプシドバリアントから予備クリーニングした。２つの異なるマウスモデルにおけるインビボのＡＡＶペプチドディスプレイライブラリー選択の後にＨＣＣ組織中に最も豊富に蓄積したキャプシドバリアントを、ＨＣＣＭ＊（Ｈｅｐａ１２９移植マウスモデルで選択された）およびＨＣＣＭ（ＴＧＦ－α／ｃ－ｍｙｃトランスジェニックマウスモデルで選択された）と名付けた。ＨＣＣＭ＊選択経路について、インビボにおける選択の前に、ＡＡＶペプチドディスプレイライブラリーをインビトロで標的細胞であるＨｅｐａ１２９において再選択した（pe-selected）。本発明者らは、移植マウスモデルにおいて１０３種の候補バリアント、およびトランスジェニックマウスモデルにおいて８９種の候補バリアントを同定した。これらのキャプシドバリアントを、肝臓（主要なオフターゲット）組織と比較したＨＣＣ（標的）における濃縮に関してさらにスコア付けした。最もよくスコア付けされたキャプシドバリアントを、全ての分析されたオフターゲット組織（肝臓、心臓、脾臓、骨格筋、腎臓、および膵臓）と比較したＨＣＣにおける濃縮に関してランク付けした。最もよくスコア付けされたキャプシドバリアントを、ＨＣＣＭ１（配列番号１５）、ＨＣＣＭ２（配列番号１６）、およびＨＣＣＭ３（配列番号１７）（ＨＣＣＭライブラリー）、ならびにＨＣＣＭ＊１（配列番号１８）、ＨＣＣＭ＊２（配列番号１９）、ＨＣＣＭ＊３（配列番号２０）、およびＨＣＣＭ＊４（配列番号２１）（ＨＣＣＭ＊ライブラリー）と名付けた。それらを、特徴付けのために、ルシフェラーゼレポーター導入遺伝子カセットを発現するｒＡＡＶベクターとして生産した。導入遺伝子の発現を、ＳＦＦＶプロモーターによって制御した。
ＨＣＣＭ１、ＨＣＣＭ２、およびＨＣＣＭ３を、尾静脈注射を介してＴＧＦ－ａ／ｃ－ｍｙｃマウスに投与した（動物１匹当たり１．５Ｅ１１個のｒＡＡＶベクター粒子）。比較のために、親ＡＡＶ（同じベクターゲノムを送達する天然に存在する血清型を有するｒＡＡＶ２ベクター）を適用した。注射の３日後、マウスにＤ－ルシフェリン（動物１匹当たり１ｍｇ）を注射し、５分後に、体の異なる領域におけるルシフェラーゼ活性を、発光シグナル検出カメラ（３分の露出）を使用したインビボにおける画像化分析によって測定した。加えて、全ての動物から、ルシフェリンの繰り返しの投与の５分後に腫瘍を有する肝臓を単離し、発光シグナルをインサイチュで決定した（３分の露出）。もっぱら新規のｒＨＣＣＭキャプシドバリアントで処置したマウスコホートが、腫瘍において著しいルシフェラーゼ活性を実証し、それに対してｒＡＡＶ２コホートにおいて、発光シグナルは低いバックグラウンドレベル（１００ＲＬＵ）のままであった（図４、Ａ、Ｂ）。新規のキャプシドバリアントｒＨＣＣＭ１、ｒＨＣＣＭ２、およびｒＨＣＣＭ３は、対照と比較して、ＨＣＣ形質導入効率において明らかな改善を実証した。
ｒＡＡＶ２は、ヒト肝癌および肝細胞株を形質導入することにおいて極めて効率的である（細胞に対して１０００のＧＯＩのＡＡＶベクター粒子、２４時間）。ヒト組織の場合において新たに開発されたＨＣＣＭおよびＨＣＣＭ＊キャプシドバリアントの効率を推測するために、数種のヒト肝癌／肝細胞株を、新たに開発されたキャプシドバリアントｒＨＣＣＭ１、ｒＨＣＣＭ２、ｒＨＣＣＭ３、ｒＨＣＣＭ＊１、ｒＨＣＣＭ＊２、ｒＨＣＣＭ＊３、およびｒＨＣＣＭ＊４、加えて親対照（ｒＡＡＶ２）で形質導入した。ｒＡＡＶベクターは、ＣＭＶプロモーターによって制御されたウミシイタケルシフェラーゼを発現した。導入遺伝子発現レベルを、ルシフェラーゼアッセイ（プロメガのウミシイタケルシフェラーゼアッセイキット）によって定量化した。新規のキャプシドバリアントｒＨＣＣＭ１、ｒＨＣＣＭ２、ｒＨＣＣＭ３（図５、Ａ～Ｂ）、ｒＨＣＣＭ＊２、ｒＨＣＣＭ＊３、およびｒＨＣＣＭ＊４（図６）は、これらのヒト肝癌細胞株においてｒＡＡＶ２に匹敵するかまたはそれより優れた形質導入効率を実証した（図５、ＡおよびＢ）。
これまで、ＨＣＣの処置それ自体、したがってＨＣＣを標的化するＡＡＶベースの遺伝子療法も、低い効率によって制限されてきた。新規のＨＣＣＭキャプシドバリアントは、静脈注射後に、ＨＣＣ結節の明らかに改善された形質導入を示し、したがって、ＡＡＶベクターシステムを採用する新規の処置戦略のための有望な候補の一つである。
Claims (17)
- 突然変異したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質またはそのフラグメントであって、
インサートが、ＡＡＶ２型のキャプシドタンパク質、またはＡＡＶの他の血清型、すなわちＡＡＶ１、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびウシＡＡＶのホモログキャプシドタンパク質に対応する配列番号２のアミノ酸番号１３９、１６１、２６１、３８１、４４７、４５３、４５９、５３４、５７０、５７３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９を有する少なくとも１つアミノ酸の後に挿入されており、
前記インサートは、少なくとも４個のアミノ酸および最大で３０個のアミノ酸のオリゴペプチド、例えば５～１２個のアミノ酸、特定には７個のアミノ酸からなるオリゴペプチドを含み、
前記インサートは、任意選択で、前記オリゴペプチドの両方の部位にリンカー配列を表すさらなるアミノ酸を有していてもよく、前記リンカー配列は、存在する場合、互いに独立して１～３個のアミノ酸のサイズを有し；
突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質またはそのフラグメントまたはそのホモログは、肝臓組織、肝細胞、肝臓細胞および肝臓細胞株または肝細胞癌（ＨＣＣ）をより高い特異性で標的化することにおいてより効率的である、上記突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質またはそのフラグメント。 - 前記ＡＡＶが、１、２、３ｂ、５、６、７、８、９、１０、４、１１型、およびウシである、請求項１に記載の突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントまたはそのホモログ。
- 前記インサートが、配列番号２の、２６１、４５３、５３４、５７０、５７３、５８７および５８８、より好ましくは４５３および５８７、特に好ましくは、５８７のアミノ酸の少なくとも１つの後の位置にある、請求項１に記載の突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントまたはそのホモログ。
- 前記インサートが、配列番号２のアミノ酸５８７の後に挿入されており、７個のアミノ酸のオリゴヌクレオチドと、両側に１～３個のアミノ酸のリンカー配列とを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントまたはそのホモログ。
- 前記インサートが、配列番号１３～２１および２７６～２８４の配列である、請求項１～４のいずれか一項に記載の突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントまたはそのホモログ。
- 点突然変異、内部または末端の欠失、第２の挿入および置換から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の、突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントまたはそのホモログ。
- 前記リンカー配列が、アミノ酸Ｇ、Ｓおよび／またはＡを含有するかまたはそれからなるアミノ酸配列である場合、特定には、前記リンカーは、アミノ酸ＡまたはＳの少なくとも１つからなっており、特定には、少なくとも４個から最大で３０個のアミノ酸、例えば、少なくとも５個のアミノ酸から最大で１２個のアミノ酸、例えば、７個のアミノ酸のオリゴペプチドの端部に、Ｎ末端にＡＡＡアミノ酸およびＣ末端にＡＡを有するか、またはＮ末端にＡＳＡおよびＣ末端にＡＡを有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメント、またはそのホモログ。
- ７個のアミノ酸のサイズを有するオリゴペプチドが、配列番号１３～２７５のいずれか１つに記載の配列である、請求項１～７のいずれか一項に記載の突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメント、またはそのホモログ。
- 前記インサートが、配列番号２７６～５３８のいずれか１つである、請求項１～８のいずれか一項に記載の突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメント、またはそのホモログ。
- 突然変異したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、請求項１～９のいずれか一項に記載の突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントまたはそのホモログを含む、上記ＡＡＶ粒子。
- 請求項１～９のいずれか一項に記載の突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントまたはそのホモログをコードする核酸分子。
- 請求項１１に記載の核酸分子を含む核酸ベクター、特定にはプラスミド。
- 請求項１２に記載の核酸ベクターまたは請求項１１に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
- ＡＡＶ粒子の製造における、または遺伝子療法のための医薬の製造における、請求項１０に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１１に記載の核酸分子、または請求項１２に記載の核酸ベクターの使用。
- インビボまたはエクスビボで肝細胞および／またはＨＣＣを形質導入することにおける使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントもしくはホモログ、請求項６に記載の突然変異したＡＡＶ粒子、請求項４に記載の核酸分子、請求項１２に記載の核酸ベクター、または請求項１３に記載の核酸ベクター。
- 肝細胞に関連する疾患：血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンウィルブランド病などの出血障害、アルファ１抗トリプシン欠損症、家族性高コレステロール血症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、クリグラー－ナジャー症候群、急性間欠性ポルフィリン症、グリコーゲン蓄積症１ａ型などの代謝障害、肝細胞癌、肝芽腫、胆管癌などの肝臓がん、多発性硬化症などの自己免疫障害、潜在性自己免疫性糖尿病、肝臓、腎臓、心臓、幹細胞などの同種移植に対する寛容の誘導、リポタンパク質リパーゼ欠損症、糖尿病およびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症などの代用の肝臓指向性遺伝子療法を処置すること；またはＨＣＣを処置することにおける使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントまたはホモログ、請求項１０に記載の突然変異したＡＡＶ粒子、請求項１１に記載の核酸分子、または請求項１２に記載の核酸ベクター。
- 肝細胞またはＨＣＣへの目的の遺伝子の移入における使用のための、特定には、遺伝子療法における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の突然変異したＡＡＶキャプシドタンパク質、そのフラグメントまたはホモログ、請求項１０に記載の突然変異したＡＡＶ粒子、請求項１１に記載の核酸分子、請求項１２に記載の核酸ベクター、または請求項１３に記載の核酸ベクター。
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