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JP2024540061A - ノロウイルスワクチン及び使用法 - Google Patents

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JP2024540061A JP2024525251A JP2024525251A JP2024540061A JP 2024540061 A JP2024540061 A JP 2024540061A JP 2024525251 A JP2024525251 A JP 2024525251A JP 2024525251 A JP2024525251 A JP 2024525251A JP 2024540061 A JP2024540061 A JP 2024540061A
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アトチナ－ヴァッサーマン，エレナ
ワイズマン，ドリュー
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ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア
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Abstract

ノロウイルス感染に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための、ノロウイルスＶＰ１抗原をコードするｍＲＮＡ分子を含むノロウイルスワクチン、及びその使用法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月２７日に出願された米国仮出願番号６３／２７２，４３９号の優先権を主張し、これはその全体が参照により本明細書に援用される。
発明の背景
ヒトノロウイルス（ＨｕＮｏＶ）は、世界中の急性ウイルス性胃腸炎の最多の原因であり、小児において推定して年間２億件の症例及び約２０万人の死亡を引き起こしている。ノロウイルスは１０の遺伝子グループに分類され、その中の５つがヒトに感染し、ヒト感染の９０％超が、遺伝子グループＩ又はＩＩのいずれかの株によって引き起こされ、遺伝子グループＩＩの遺伝子型４が、ヒトノロウイルス感染の大半及び数年毎の周期的なパンデミック疾患の波を引き起こしている。
ノロウイルスは、カリシウイルス科のエンベロープを有さない一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。そのゲノムは約７．５kbから７．７kbのサイズであり、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み；ＯＲＦ２は、ウイルスの抗原性を決定し、キャプシドの基底に位置するシェルドメインからなる、主要キャプシドタンパク質（ＶＰ１）をコードする。
ノロウイルス（ＮｏＶ）は、完全な主要キャプシドタンパク質ＶＰ１の配列に基づいて、１０の遺伝子グループ（ＧＩからＧＸ）に分類される。しかしながら、ＧＩ、ＧＩＩ、及びＧＩＶのみがヒトに感染する。
世界的にＧＩＩ．４が、過去２０年間にわたり大半の諸国において、全てのノロウイルスの大発生の約７０～８０％を占める、最も優勢な遺伝子型である。
ノロウイルス疾患を処置するための承認されたワクチン又は具体的な治療薬は全くない。したがって、当技術分野において、改善されたノロウイルスのワクチンが必要である。本発明はこの必要性に取り組む。
発明の概要
１つの実施態様では、本発明は、少なくとも１つのノロウイルス抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を含む、ノロウイルス（ＮｏＶ）に対する免疫応答を誘導するための組成物に関する。１つの実施態様では、ノロウイルス抗原は、ｐ４８、ヌクレオシド－トリホスファターゼ（ＮＴＰアーゼ）、ｐ２２、ＶＰｇ、プロテアーゼ、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、ＶＰ１、ＶＰ２、それらの断片、又はそれらの任意の組合せである。
１つの実施態様では、ノロウイルス抗原は、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶＩＩＩ、又はＧＩＸ遺伝子グループに由来する。
１つの実施態様では、前記組成物は、少なくとも２つのノロウイルスＶＰ１抗原をコードするｍＲＮＡ分子の組合せを含む。１つの実施態様では、該組成物は、ＧＩ ＶＰ１抗原及びＧＩＩ ＶＰ１抗原をコードするｍＲＮＡ分子の組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＧＩ．１抗原、ＧＩ．３ＶＰ１抗原、ＧＩ．５ＶＰ１抗原、ＧＩＩ．３ＶＰ１抗原及びＧＩＩ．４ＶＰ１抗原の少なくとも２つをコードするｍＲＮＡ分子の組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩ．１抗原をコードするｍＲＮＡ分子と、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩＩ．４抗原をコードするｍＲＮＡ分子との組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩ.１抗原、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩＩ.４抗原、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩ.３抗原及びＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩＩ.３抗原の各々をコードするｍＲＮＡ分子の組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を含む。
１つの実施態様では、前記組成物はアジュバントを更に含む。
１つの実施態様では、ｍＲＮＡ分子は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入されている。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードする２つ以上のｍＲＮＡ分子を封入している、２つ以上のＬＮＰの組合せを含む。
１つの実施態様では、ｍＲＮＡ分子は、少なくとも１つのシュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、又は５－メチル－ウリジン修飾ヌクレオシドを含むヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ分子である。
１つの実施態様では、本発明は、少なくとも１つのノロウイルス抗原又はその断片をコードするｍＲＮＡ分子を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象においてノロウイルス（ＮｏＶ）の少なくとも１つの株に対する免疫応答を誘導する方法に関する。１つの実施態様では、ノロウイルス抗原は、ｐ４８、ヌクレオシド－トリホスファターゼ（ＮＴＰアーゼ）、ｐ２２、ＶＰｇ、プロテアーゼ、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、ＶＰ１、ＶＰ２、それらの断片、又はそれらの任意の組合せである。１つの実施態様では、ノロウイルス抗原は、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶＩＩＩ、又はＧＩＶ遺伝子グループに由来する。
１つの実施態様では、前記方法は、少なくとも２つのＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードするｍＲＮＡ分子の組合せを投与することを含む。１つの実施態様では、該組成物は、ＧＰ ＶＰ１抗原及びＧＩＩ ＶＰ１抗原をコードするｍＲＮＡ分子の組合せを含む。
１つの実施態様では、前記方法は、ＧＩ．１抗原、ＧＩ．３ ＶＰ１抗原、ＧＩ．５ ＶＰ１抗原、ＧＩＩ．３ ＶＰ１抗原及びＧＩＩ．４ ＶＰ１抗原の少なくとも２つをコードするｍＲＮＡ分子の組合せを投与することを含む。
１つの実施態様では、前記方法は、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩ．１抗原をコードするｍＲＮＡ分子と、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩＩ．４抗原をコードするｍＲＮＡ分子との組合せを投与することを含む。
１つの実施態様では、前記方法は、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩ．１抗原、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩＩ．４抗原、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩ．３抗原、及びＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩＩ．３抗原の各々をコードするｍＲＮＡ分子の組合せを投与することを含む。
１つの実施態様では、前記方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を投与することを含む。
１つの実施態様では、前記方法は、アジュバントを投与することを更に含む。
１つの実施態様では、前記方法は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を投与することを含む。
１つの実施態様では、前記方法は、ＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードする２つ以上のｍＲＮＡ分子を封入している２つ以上のＬＮＰの組合せを投与することを含む。
１つの実施態様では、前記方法は、少なくとも１つのシュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、又は５－メチル－ウリジン修飾ヌクレオシドを含む、少なくとも１つのヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ分子を投与することを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、皮内、皮下、吸入、鼻腔内、又は筋肉内送達経路によって投与される。
１つの実施態様では、前記方法は、前記組成物の単回投与を含む。１つの実施態様では、該方法は、該組成物の複数回投与を含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、ノロウイルス感染に関連した疾患又は障害を治療又は予防する。１つの実施態様では、ノロウイルス感染に関連した疾患又は障害は、胃腸炎、食中毒、嘔吐又は下痢である。
以下の本発明の実施態様の詳細な説明は、添付図面と併せて読めば、より良く理解される。本発明は、図面に示される実施態様のまさにその配置及び手段に限定されないことが理解されるべきである。
図１は、ＧＩ．１/Norwalk1968、ＧＩＩ．４/CapeTown2012、ＧＩ．３/Sweden2008、ＧＩ．３/Argentina2016、ＧＩ．３/Nashville2019、ＧＩＩ．３/Canada2019、ＧＩＩ．２/UK2015、ＧＩＩ．３/USA2011及びＧＩＩ．３/Japan2009ウイルスのキャプシドタンパク質ＶＰ１配列をコードするヌクレオシド修飾ｍＲＮＡが、正しいタンパク質を発現していることを実証している、例示的な実験データを示す。還元条件が使用された。１ウェルあたり１０μgをのせた；ＧＩ．１－抗ノロウイルス抗体（ＶＰ１ ＧＩ．１キャプシドタンパク質）、ウサギポリクローナルＲｂ Ｇ１；ＧＩＩ．４－抗ノロウイルス抗体（ＶＰ１ ＧＩＩ．４キャプシドタンパク質）、ウサギポリクローナルＲｂ４２８、ＧＩ．３－抗ノロウイルス抗体（ＶＰ１ ＧＩ．３キャプシドタンパク質）、ウサギポリクローナルＲｂ４０２、ＧＩＩ．３－抗ノロウイルス抗体（ＶＰ１ ＧＩＩ．３キャプシドタンパク質）、ウサギポリクローナルＲｂ３９７、ＧＡＰＤＨ（１４Ｃ１０）－ウサギモノクローナル抗体、（セルシグナリング社、２１１８Ｓ番）；一晩４℃でインキュベート、１：２，５００の希釈率；２回目のＧＡＲ－西洋ワサビペルオキシダーゼ、１時間室温、希釈率１：１０，０００；腸クロマフィン様細胞陽性。 図２は、二価ｍＲＮＡワクチン（ＧＩ．１及びＧＩＩ．４）を用いた例示的な免疫化スキームを示す。 図３は、１８０日目まで高いレベルで持続している遮断性抗体の力価を実証している、例示的な実験データを示す。 図４は、ワクチンが、良好であるが遺伝子型特異的な遮断抗体応答を誘導することを実証している、例示的な実験データを示す。 図５は、Ｔ細胞刺激アッセイのための例示的な免疫化スキームを示す。 図６は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）（ＧＩ．１、ＧＩ．３、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４）を用いたＴ細胞刺激アッセイの結果を示す。 図７は、ヒトノロウイルス二価ｍＲＮＡワクチン用量応答を実証している、例示的な実験データを示す。 図８は、低用量のｍＲＮＡワクチンが、強力なＴｈ１応答を誘導することを実証している、例示的な実験データを示す。 図９は、四価ノロウイルスｍＲＮＡワクチンについての例示的な免疫化スキームを示す。 図１０は、ヒトノロウイルス四価ワクチン用量応答を実証している、例示的な実験データを示す。 図１１は、生ヒトノロウイルスを用いた幹細胞由来ヒト３次元エンテロイドの感染を実証している、例示的な実験データを示す。 図１２は、生ヒトノロウイルスを用いた幹細胞由来ヒト３次元エンテロイドの感染を実証している、例示的な画像を示す。 図１３は、皮内（i.d.）注射による、１回のワクチン／１匹のマウスあたり１０μgでワクチン接種されたｍＲＮＡ－ＬＮＰのワクチン接種されたマウスに由来する血清による、ＧＩＩ．４感染に対するヒト腸管エンテロイドの防御を実証している、例示的な実験データを示す。 図１４は、筋肉内（i.m.）注射による、１回のワクチン／１匹のマウスあたり０．２５μgでワクチン接種されたｍＲＮＡ－ＬＮＰのワクチン接種されたマウスに由来する血清による、ＧＩＩ．４感染に対するヒト腸管エンテロイドの防御を実証している、例示的な実験データを示す。
詳細な説明
本発明は、対象においてノロウイルス（ＮｏＶ）に対する免疫応答を誘導するための組成物及び方法に関する。いくつかの実施態様では、本発明は、１つ以上のノロウイルス遺伝子グループに由来する少なくとも１つのノロウイルス主要キャプシドタンパク質（ＶＰ１）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子を含む、少なくとも１つの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む組成物を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶ、ＧＶＩ、ＧＶＩＩ、ＧＶＩＩＩ、ＧＩＸ、又はＧＸ遺伝子グループに由来する少なくとも１つのＶＰ１をコードする少なくとも１つのヌクレオシド修飾ＲＮＡ分子を含む、少なくとも１つの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、組成物を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は、少なくとも２つのノロウイルス主要キャプシドタンパク質（ＶＰ１）をコードするヌクレオシド修飾ＲＮＡ分子を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の組合せを含む、組成物を提供する。いくつかの実施態様では、該組成物は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２０個を超えるノロウイルスＶＰ１抗原をコードするｍＲＮＡ分子を含む。
１つの実施態様では、少なくとも２つのＶＰ１は、同じノロウイルス遺伝子グループに由来する。１つの実施態様では、少なくとも２つのＶＰ１は、２つ以上の異なるノロウイルス遺伝子グループに由来する。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＧＩＩに由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む、少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩに由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰとの組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＧＩＩに由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩに由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩＶに由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰとの組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＧＩＩ．４に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩ．１に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰとの組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＧＩＩ．４に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩ．１に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩ．３に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩＩ．３に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰとの組合せを含む。
本発明はまた、ノロウイルス感染を処置する方法、又は、本発明の組成物を使用して嘔吐及び下痢などのノロウイルス感染に関連した疾患若しくは障害を治療若しくは予防する方法にも関する。
定義
特記しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書において使用する以下の用語の各々は、この章におけるその用語に関連した意味を有する。
「１つの（a）」及び「１つの（an）」という語句は本明細書において、１つ又は１つを超える（すなわち少なくとも１つの）文法上の対象物を指すために使用される。例えば、「１つの要素」は、１つの要素又は１つを超える要素を意味する。
本明細書において使用される「約」は、量、期間などの測定可能な数値に言及する場合には、具体的な数値から±２０％、±１０％、±５％、±１％、又は±０．１％の変動を包含することを意味する。なぜなら、このような変動は、開示された方法を実施するのに適切であるからである。
本明細書において使用する「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然源又は組換えられた入手源に由来するインタクトな免疫グロブリンであり得、かつインタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は典型的には、免疫グロブリン分子の四量体である。本発明の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２、並びに一本鎖抗体及びヒト化抗体を含む、多種多様な形態で存在し得る（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。
「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部を指し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ抗体、及び抗体断片から形成された多重特異的抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において使用する「抗体重鎖」は、その天然に存在するコンフォメーションで全ての抗体分子に存在する、２種類のポリペプチド鎖の大きい方を指す。
本明細書において使用する「抗体軽鎖」は、その天然に存在するコンフォメーションで全ての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖の小さい方を指す。κ軽鎖及びλ軽鎖は、抗体軽鎖の２つの主なアイソタイプを指す。
本明細書において使用する「合成抗体」という用語によって、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される、抗体を意味する。該用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって作製された抗体を意味すると捉えられるべきであり、そのＤＮＡ分子は、抗体タンパク質又は抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここでのＤＮＡ配列又はアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能でありかつ周知である、合成ＤＮＡ配列技術又はアミノ酸配列技術を使用して得られた。該用語はまた、抗体をコードするＲＮＡ分子の合成によって作製された抗体を意味すると捉えられるべきである。ＲＮＡ分子は、抗体タンパク質、又は抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここでのＲＮＡは、ＤＮＡ（合成又はクローニングされたもの）を転写するか、ＲＮＡを合成するか、又は当技術分野において利用可能かつ周知である他の技術によって得られた。
抗体に関して本明細書において使用する「特異的に結合する」という用語によって、試料中の特定の抗原を認識するが、他の分子は実質的には認識しないか又は結合しない、抗体を意味する。例えば、ある種に由来する抗原に特異的に結合する抗体はまた、１つ以上の他の種に由来する抗原に結合する可能性がある。しかし、このような交差種反応性はそれ自体では、特異的であるとする抗体の分類を変化させない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体はまた、抗原の異なる対立遺伝子形にも結合し得る。しかしながら、このような交差反応性はそれ自体では、特異的であるとする抗体の分類を変化させない。場合によっては、「特異的な結合」又は「特異的に結合している」という用語は、抗体、タンパク質、又はペプチドと第二の化学種の相互作用に関連して、相互作用が、化学種上の特定の構造（例えば抗原決定基すなわちエピトープ）の存在に依存することを意味するために使用され得る；例えば、抗体は、タンパク質に全体的にではなく、特定のタンパク質構造を認識しそして結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」と抗体とを含有している反応液中において、エピトープＡ（すなわち遊離の標識されていないＡ）を含有している分子の存在は、抗体に結合する標識されたＡの量を減少させる。
本明細書において使用する「免疫原」という用語は、個体において適応免疫応答を誘導することのできる物体を示すことを意図し、ここでの前記の適応免疫応答は、病原性物質（これは免疫原と免疫学的特色を共有する）に有意に関与する免疫応答を誘導することができる。「免疫原」は、免疫応答を発生させるために、体内に導入された任意の物質を指す。その物質は、タンパク質などの物理的分子であっても、又は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、若しくはウイルスなどの、ベクターによってコードされるものであってもよい。
本明細書において使用する「抗原」すなわち「Ａｇ」という用語は、適応免疫応答を惹起する分子として定義される。この免疫応答は、抗体の産生、又は特異的な免疫学的に適格な細胞の活性化のいずれか、又はその両方を含み得る。当業者は、実質的に全てのタンパク質又はペプチドを含む、任意の巨大分子が、抗原としての役目を果たすことができることを理解する。更に、抗原は、組換え又はゲノムＤＮＡ又はＲＮＡに由来していてもよい。それ故、当業者は、適応免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分ヌクレオチド配列を含む、任意のＤＮＡ又はＲＮＡは、その用語が本明細書において使用される場合には「抗原」をコードすることを理解している。更に、当業者は、抗原は、単に、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってコードされる必要はないことを理解している。本発明は、１つを超える遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むがこれらに限定されず、これらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を惹起するために様々な組合せで並べられていることが容易に理解される。更に、当業者は、抗原が、「遺伝子」によって全くコードされる必要がないことを理解している。抗原が合成的に作製されても、又は生物学的試料に由来してもよいことは容易に明らかである。このような生物学的試料は、組織試料、腫瘍試料、細胞、又は生物学的液体を含み得るが、これらに限定されない。
「免疫応答」は、該用語が本明細書において使用される場合、例えば非限定的な例では、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び／又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）における、エフェクター機能の活性化及び／又は誘導に関与するプロセスを意味する。したがって、免疫応答は、当業者によって理解されているであろうように、任意の検出可能な抗原特異的活性化及び／又はヘルパーＴ細胞若しくは細胞障害性Ｔ細胞の活性若しくは応答の誘導、抗体の産生、抗原提示細胞の活性又は浸潤、マクロファージの活性又は浸潤、好中球の活性又は浸潤などを含むがこれらに限定されない。
本明細書において使用する「免疫原性組成物」は、抗原（例えばペプチド又はポリペプチド）、抗原をコードする核酸、抗原若しくは細胞性成分を発現若しくは提示している細胞、抗原若しくは細胞性成分を発現若しくは提示しているウイルス、又はその組合せを含み得る。特定の実施態様では、該組成物は、本明細書に記載の任意のペプチド抗原の全部若しくは一部、又はその免疫学的に機能的な等価体を含むか又はコードする。他の実施態様では、該組成物は、追加の免疫刺激性物質又はこのような物質をコードする核酸を含む混合物中にある。免疫刺激性物質は、追加の抗原、免疫モジュレーター、抗原提示細胞、脂質ナノ粒子、又はアジュバントを含むがこれらに限定されない。他の実施態様では、追加の物質（群）の１つ以上が、抗原又は免疫刺激性物質に任意の組合せで共有結合している。
本明細書において使用する「ワクチン」という用語は、対象への接種時に免疫応答を誘導する組成物を指す。いくつかの実施態様では、誘導された免疫応答は防御免疫を提供する。
「コードする」は、規定のヌクレオチド配列（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は規定のアミノ酸配列のいずれかとそれから結果として生じる生物学的特性を有している、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のための鋳型としての役目を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド内の特定のヌクレオチド配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合には、タンパク質をコードする。コード鎖（そのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ配列に対して同一であり、通常、配列表に提供されている）と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖のどちらも、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードすると言及され得る。
「ベクター」は、単離された核酸を含み、かつ、単離された核酸を細胞内部に送達するために使用され得る物質の組成物である。鎖状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物の会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むがこれらに限定されない、数多くのベクターが当技術分野において公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律複製プラスミド又はウイルスを含む。該用語はまた、細胞内への核酸の導入を促進する、非プラスミド性及び非ウイルス性化合物、例えばポリリジン化合物、リポソームなどを含むと捉えられるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるがこれらに限定されない。
「発現ベクター」は、発現される予定のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、発現制御配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用配列を含み；発現のための他の配列は、宿主細胞によって又はインビトロでの発現系において供給され得る。発現ベクターは、当技術分野において公知である全てのもの、例えば、組換えポリヌクレオチドを取り込む、コスミド、プラスミド（例えば裸であるか又はリポソームに含有されている）ＲＮＡ、及びウイルス（例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含む。
「相同な」は、２つのポリペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性又は配列同一性を指す。２つの比較される配列の両方における位置が、同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占有される場合、例えば、２つの各ＤＮＡ分子内の位置がアデニンによって占有される場合、該分子はその位置において相同である。２つの配列間の相同率は、２つの配列によって共有される一致しているか又は相同である位置の数を、比較される位置の数で割り、１００を乗じた関数である。例えば、２つの配列内の１０中６個の位置が、一致しているか又は相同である場合、２つの配列は６０％相同である。例えば、ＤＮＡ配列のＡＴＴＧＣＣ及びＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同率を共有する。一般的には、２つの配列を最大の相同率が得られるように並べて、比較が行なわれる。
本明細書において使用するヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列が、元来のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％の同一性の程度を有する場合に、本明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれかに対して「実質的に相同」である。
本明細書において使用するアミノ酸配列は、そのアミノ酸配列が、元来のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％の同一性の程度を有する場合に、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれかに対して「実質的に相同」である。２つのアミノ酸配列間の同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)）を使用することによって決定され得る。
核酸に関して本明細書において使用する「変異体」という用語は、（ｉ）参照されたヌクレオチド配列の一部又は断片；（ｉｉ）参照されたヌクレオチド配列又はその一部の相補体；（ｉｉｉ）参照された核酸に対して実質的に同一である核酸又はその相補体；又は（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で参照された核酸にハイブリダイズする核酸、その相補体、又はそれに対して実質的に同一な配列を指す。変異体は、完全な遺伝子配列の完全長又はその断片にわたり実質的に同一である、核酸配列であり得る。核酸配列は、遺伝子配列の完全長又はその断片にわたり８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であり得る。
ペプチド又はポリペプチドに関して使用される「変異体」という用語は、アミノ酸の挿入、欠失又は保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持している、ペプチド又はポリペプチドを指す。変異体はまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているアミノ酸配列を有する、参照されたタンパク質に対して実質的に同一である、アミノ酸配列を有するタンパク質も指し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似の特性（例えば疎水性、荷電領域の程度及び分布）を有する異なるアミノ酸を用いてアミノ酸を置換することは当技術分野において、典型的にはマイナー変化を含むと認識されている。これらのマイナー変化は、一部には、当技術分野において理解されているような（Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132）、アミノ酸の疎水性指数を考慮することによって同定され得る。アミノ酸の疎水性指数は、その疎水性及び荷電の考察に基づく。当技術分野において、類似の疎水性指数を有するアミノ酸を置換することができ、かつ依然としてタンパク質の機能を保持していることが知られている。１つの態様では、±２の疎水性指数を有するアミノ酸が置換されている。アミノ酸の親水性はまた、生物学的機能を保持しているタンパク質をもたらすであろう、置換を明らかにするために使用され得る。ペプチドの状況におけるアミノ酸の親水性の考察は、該ペプチドの最大の局所的で平均的な親水性の計算を可能とし、これは、抗原性及び免疫原性と良く相関していると報告されている有用な尺度である。米国特許第４，５５４，１０１号明細書は、参照により本明細書に完全に援用される。類似した親水性数値を有しているアミノ酸の置換は、当技術分野において理解されているように、例えば免疫原性などの、生物学的活性を保持しているペプチドをもたらし得る。置換は、互いに±２以内の親水性数値を有しているアミノ酸を用いて行なわれ得る。アミノ酸の疎水性指数及び親水性数値のどちらも、アミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能と適合したアミノ酸の置換は、疎水性、親水性、荷電、サイズ及び他の特性によって判明するように、アミノ酸、特にそうしたアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存すると理解される。変異体は、アミノ酸配列の完全長又はその断片にわたり実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列の完全長又はその断片にわたり８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり得る。
本明細書において使用する「断片」又は「機能的断片」という用語は、対象に投与されると、増加した免疫応答を与える、抗原又は抗原をコードする核酸配列の断片を指す。断片は、一般的には１０以上のアミノ酸長又は核酸長である。「断片」は、対象において免疫応答を惹起することのできる、抗原のポリペプチド断片を意味し得る。抗原の断片は、Ｎ末端及び／又はＣ末端から少なくとも１つのアミノ酸が欠失している以外は、完全長に対して１００％同一であり得、各々の場合において、シグナルペプチド及び／又は１位のメチオニンを含むか又は含まない。断片は、付加されたあらゆる異種シグナルペプチドを除いた、特定の完全長抗原の長さの、２０％又はそれ以上、２５％又はそれ以上、３０％又はそれ以上、３５％又はそれ以上、４０％又はそれ以上、４５％又はそれ以上、５０％又はそれ以上、５５％又はそれ以上、６０％又はそれ以上、６５％又はそれ以上、７０％又はそれ以上、７５％又はそれ以上、８０％又はそれ以上、８５％又はそれ以上、９０％又はそれ以上、９１％又はそれ以上、９２％又はそれ以上、９３％又はそれ以上、９４％又はそれ以上、９５％又はそれ以上、９６％又はそれ以上、９７％又はそれ以上、９８％又はそれ以上、９９％又はそれ以上の比率を含み得る。該断片は、該抗原に対して９５％若しくはそれ以上、９６％若しくはそれ以上、９７％若しくはそれ以上、９８％若しくはそれ以上、又は９９％若しくはそれ以上同一である、ポリペプチドの断片を含み得、そして、同一性を計算する場合に含まれないＮ末端メチオニン又は異種シグナルペプチドを更に含む。
抗原をコードする核酸配列の断片は、５’末端及び／又は３’末端から少なくとも１つのヌクレオチドを欠失している以外は、完全長に対して１００％同一であり得、それぞれの場合において、シグナルペプチド及び／又は１位のメチオニンをコードする配列を含むか又は含まない。断片は、付加されたあらゆる異種シグナルペプチドを除いて、特定の完全長のコード配列の長さの２０％又はそれ以上、２５％又はそれ以上、３０％又はそれ以上、３５％又はそれ以上、４０％又はそれ以上、４５％又はそれ以上、５０％又はそれ以上、５５％又はそれ以上、６０％又はそれ以上、６５％又はそれ以上、７０％又はそれ以上、７５％又はそれ以上、８０％又はそれ以上、８５％又はそれ以上、９０％又はそれ以上、９１％又はそれ以上、９２％又はそれ以上、９３％又はそれ以上、９４％又はそれ以上、９５％又はそれ以上、９６％又はそれ以上、９７％又はそれ以上、９８％又はそれ以上、９９％又はそれ以上の比率を含み得る。該断片は、該抗原に対して９５％又はそれ以上、９６％又はそれ以上、９７％又はそれ以上、９８％又はそれ以上、９９％又はそれ以上同一であるポリペプチドをコードする断片を含み得、場合により更に、同一性を計算する場合には含まれない、Ｎ末端メチオニン又は異種シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。
「単離された」は、天然の状態から変化した又は取り出されたことを意味する。例えば、生存している対象に天然に存在している核酸又はペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から部分的に若しくは完全に分離された同核酸若しくは同ペプチドは、「単離」されている。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に純粋な形態で存在し得るか、又は、例えば宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。
本発明の脈絡において、一般的に存在しているヌクレオシドについての以下の略称（Ｎ－グリコシド結合を介してリボース又はデオキシリボース糖に結合した核酸塩基）が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシチジンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
特記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いのdegenerateバージョンであり、かつ同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びＲＮＡはイントロンを含んでいてもよい。タンパク質をコードするヌクレオチド配列又はＲＮＡという語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、いくつかの形態においては、イントロン（群）を含み得る範囲で、イントロンを含んでいてもよい。更に、ヌクレオチド配列は、細胞内で翻訳機械によって翻訳されることのできる、修飾ヌクレオシドを含有していてもよい。例示的な修飾ヌクレオシドは、本明細書の何処かに記載されている。例えば、ｍＲＮＡにおいては、ウリジンのいくつか又は全てが、シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、５－メチル－ウリジン又は別の修飾ヌクレオシド、例えば本明細書の何処かで記載されているものなどで置換されている。いくつかの実施態様では、ヌクレオチド配列は、いくつかの又は全てのシチジンが、メチル化シチジン、又は別の修飾ヌクレオシド、例えば本明細書の何処かで記載されたもので置換されている、配列を含み得る。
「作動可能に連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列の間の機能的な結合を指し、その結果として、後者が発現される。例えば、第一の核酸配列が、第二の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合に、第一の核酸配列は、第二の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターが、コード配列の転写又は発現に影響を及ぼしている場合に、該プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。一般的には、作動可能に連結されたＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列は連続し、必要であれば、同じリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域は接続されている。
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド鎖として定義される。更に、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書において使用する核酸及びポリヌクレオチドは、互換可能である。当業者は、核酸が、モノマー「ヌクレオチド」へと加水分解され得る、ポリヌクレオチドであるという一般的な知識を有する。モノマーヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書において使用するポリヌクレオチドは、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術及びＰＣＲ（商標）などを使用した、組換えライブラリー又は細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含むがこれらに限定されない、当技術分野において利用可能な任意の手段によって、及び合成手段によって得られる、全ての核酸配列を含むがこれらに限定されない。
場合によっては、本発明のポリヌクレオチド又は核酸は「ヌクレオシド修飾核酸」であり、これは少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む核酸を指す。「修飾ヌクレオシド」は、修飾を有するヌクレオシドを指す。例えば、１００個以上の異なるヌクレオシド修飾がＲＮＡにおいて同定されている（Rozenski, et al., 1999, The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197）。
本明細書において使用する「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、同義語として使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基を含む化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質の配列又はペプチドの配列を含み得る、アミノ酸の最大数に対しては制限は全く置かれない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合によって接続された、２つ以上のアミノ酸を含む、任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書において使用する該用語は、例えば、当技術分野においてペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと一般的に称される短い鎖、並びに、当技術分野においてタンパク質（その中には多くの種類がある）と一般的に称されるより長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。該ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はその組合せを含む。
本明細書において使用する「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的な転写を開始するのに必要とされる細胞の合成機械、又は導入された合成機械によって認識されるＤＮＡ配列と定義される。非制限的な例として、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターは、インビトロでの転写によってｍＲＮＡを生成するのに使用される。
本明細書において使用する「アジュバント」という用語は、抗原特異的な適応免疫応答を増強するための任意の分子として定義される。
いくつかの実施態様では、「シュードウリジン」は、ｍ１ａｃｐ３Ψ（１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン）を指す。別の実施態様では、該用語は、ｍ１Ψ（１－メチルシュードウリジン）を指す。別の実施態様では、該用語は、Ψｍ（２’－Ｏ－メチルシュードウリジン）を指す。別の実施態様では、該用語は、ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）を指す。別の実施態様では、該用語は、ｍ３Ψ（３－メチルシュードウリジン）を指す。別の実施態様では、該用語は、更に修飾されていないシュードウリジン部分を指す。別の実施態様では、該用語は、上記のシュードウリジンのいずれかの一リン酸、二リン酸、又は三リン酸を指す。別の実施態様では、該用語は、当技術分野において公知である任意の他のシュードウリジンを指す。各々の可能性は、本発明の別々の実施態様を示す。
「脂質ナノ粒子」という用語は、１つ以上の脂質を含む、ナノメートルの次元（例えば１～１，０００nm）で少なくとも１つの寸法を有している粒子を指す。
「脂質」という用語は、脂肪酸の誘導体（例えばエステル）である有機化合物群を指し、一般的には水中には不溶性であるが、多くの有機溶媒中には可溶性であることによって特徴付けられる。脂質は通常、少なくとも３つのクラスに分類される：（１）脂肪及び油並びにワックスを含む、「単純な脂質」；（２）リン脂質と糖脂質を含む「複合脂質」；及び（３）「誘導された脂質」、例えばステロイド。
本明細書において使用する「陽イオン性脂質」という用語は、陽イオンであるか、又は、脂質のイオン化可能な基のｐＫ未満に下降すると陽イオンとなる（プロトン化される）が、より高いｐＨ値では進行的により中性となる、脂質を指す。ｐＫ未満のｐＨ値では、その後、脂質は、負に荷電した核酸と会合することができる。いくつかの実施態様では、陽イオン性脂質は双性イオン性脂質を含み、これはｐＨ低下時に陽性荷電と推定される。
「中性脂質」という用語は、生理的ｐＨにおいて非荷電形又は中性双性イオン形のいずれかで存在する、多くの脂質種のいずれか１つを指す。代表的な中性脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが挙げられる。
「陰イオン性脂質」という用語は、生理的ｐＨにおいて負に荷電している任意の脂質を指す。
「ポリマーにコンジュゲートした脂質」という用語は、脂質部分とポリマー部分の両方を含む、分子を指す。ポリマーにコンジュゲートした脂質の一例はＰＥＧ化脂質である。
「ＰＥＧ化脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む、分子を指す。ＰＥＧ化脂質は当技術分野において公知であり、これには１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ｓ－ＤＭＧ）などが含まれる。
「リポソーム」は、封入された脂質二重層又は凝集物の生成によって形成された、多種多様な単層及び多重層脂質小胞を包含している一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部水性媒体とを有する小胞構造を有するとして特徴付けられ得る。多重層リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁されると、自発的に形成される。脂質成分は、封入構造の形成前に自己再編成を受け、脂質二重層の間に水と溶けた溶質とを包摂する（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造と推定され得るか、又は単に、脂質分子の不均一な凝集物として存在し得る。リポフェクタミン－核酸複合体も考えられる。
「対象」、「患者」、「個体」などの用語は本明細書において同義語として使用され、インビトロであれ又はインサイチュであれ、本明細書に記載の方法を受け入れられる任意の動物又はその細胞を指す。いくつかの非制限的な実施態様では、患者、対象、又は個体は、哺乳動物、鳥類、家禽、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、フェレット、霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、コウモリ、又はヒトである。
「疾患」は、対象は恒常性を維持することができず、該疾患が寛解しなければ、対象の健康は悪化し続ける、対象の健康状態である。
これとは対照的に、対象の「障害」は、対象は恒常性を維持することはできるが、対象の健康状態は、障害がない場合よりも良くない健康状態である。処置せず放置すれば、障害は、対象の健康状態の更なる低下を必ずしも引き起こすわけではない。
本明細書において使用する「モジュレートする」という用語によって、処置若しくは化合物の非存在下における対象の応答レベルと比較して、及び／又は、他の点では同一であるが未処置の対象の応答レベルと比較して、対象の応答レベルの検出可能な増加若しくは減少を媒介することを意味する。該用語は、天然のシグナル又は応答を攪乱及び／又はそれに影響を及ぼし、これにより、ヒトなどの対象において有益な治療応答を媒介することを包含する。
疾患を「処置する」ことは、該用語が本明細書において使用されている場合、対象によって経験される疾患又は障害の少なくとも１つの兆候又は症状の頻度又は重症度を低減させることを意味する。
本明細書において使用する「有効量」は、治療的な又は予防的な利益をもたらす量を意味する。
本明細書において使用する「治療」という用語は、処置及び／又は予防を意味する。治療効果は、疾患又は障害の少なくとも１つの兆候又は症状の抑制、減少、緩解、予防、又は根治によって得られる。
「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医によって探索される、組織、系、又は対象の生物学的応答又は医学的応答を惹起するであろう、対象化合物の量を指す。「治療有効量」という用語は、投与されると、処置される障害又は疾患の兆候又は症状の１つ以上の発症を予防するか、あるいはある程度まで軽減するのに十分である、化合物の量を含む。治療有効量は、化合物、疾患及びその重症度、並びに処置される予定の対象の年齢、体重などに応じて変更される。
本明細書において使用する「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」という用語は、外来性核酸が、宿主細胞に移行又は導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外来性核酸を用いてトランスフェクトされたか、形質転換されたか、又は形質導入された細胞である。該細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
本明細書において使用する「転写制御下」又は「作動可能に連結された」という語句は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチドの発現を制御するために、ポリヌクレオチドに対して正しい位置及び方向にあることを意味する。
本明細書において使用する「追加の成分」は、以下の１つ以上を含むがこれらに限定されない：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒剤及び崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味剤；芳香剤；着色剤；保存剤；生分解性組成物、例えばゼラチン；水性ビヒクル及び溶媒；油性ビヒクル及び溶媒；懸濁化剤；分散剤又は湿潤剤；乳化剤、軟化剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；並びに薬学的に許容可能なポリマー性物質又は疎水性物質。本発明の医薬組成物に含まれ得る他の「追加の成分」は当技術分野において公知であり、例えば、レミントンの製薬科学（1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co.、ペンシルバニア州イーストン）に記載され、これは参照により本明細書に援用される。
範囲：本開示全体を通して、本発明の様々な態様を、範囲の形式で提示することができる。範囲の形式の記載は、単に簡便性及び簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限と捉えられるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な下位範囲並びにその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えられるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの下位範囲、並びに、その範囲内の個々の数字、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を具体的に開示していると考えられるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
記載
本発明は、対象において１つ以上のノロウイルス株に対する免疫応答を誘導するための組成物及び方法に関する。いくつかの実施態様では、本発明は、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶ、ＧＶＩ、ＧＶＩＩ、ＧＶＩＩＩ、ＧＩＸ又はＧＸの遺伝子グループに由来する少なくとも１つのＶＰ１をコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、組成物を提供する。いくつかの実施態様では、ｍＲＮＡ分子は、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ分子である。
いくつかの実施態様では、本発明は、少なくとも２つのノロウイルス主要キャプシドタンパク質（ＶＰ１）をコードするｍＲＮＡ分子（例えばヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ分子）の組合せを含む、組成物を提供する。いくつかの実施態様では、該組成物は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２０個を超えるノロウイルスＶＰ１抗原をコードするｍＲＮＡ分子（例えばヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ分子）を含む。
１つの実施態様では、少なくとも２つのＶＰ１は、同じノロウイルス遺伝子グループ内の異なる株に由来する。１つの実施態様では、少なくとも２つのＶＰ１は、２つ以上の異なるノロウイルス遺伝子グループに由来する。
１つの実施態様では、前記組成物は、少なくとも１つのＧＩＩ株に由来するＶＰ１をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子と、少なくとも１つのＧＩ株に由来するＶＰ１をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子との組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＧＩＩに由来するＶＰ１をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子と、ＧＩに由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩＶに由来するＶＰ１をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子との組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＧＩＩ．４に由来するＶＰ１をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子と、ＧＩ．１に由来するＶＰ１をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子との組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＧＩＩ．４に由来するＶＰ１をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子と、ＧＩ．１に由来するＶＰ１をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子と、ＧＩ．３に由来するＶＰ１をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子と、ＧＩＩ．３に由来するＶＰ１をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子との組合せを含む。
いくつかの実施態様では、前記組成物は更に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２０個を超える追加のウイルス抗原をコードするｍＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施態様では、１つ以上の追加のウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、例えばヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、及びＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、天然痘ウイルス（大痘瘡及び小痘瘡）、ワクシニアウイルス、ライノウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－１）、ヘアリーセル白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－ＩＩ）、カルフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス（出血熱）、狂犬病ウイルス、エボラ熱ウイルス、マールブルクウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、１型単純ヘルペス（口腔ヘルペス）、２型単純ヘルペス（性器ヘルペス）、帯状疱疹（水痘帯状疱疹、別名鶏痘）、サイトメガロウイルス（（ＣＭＶ）、例えばヒトＣＭＶ、エプシュタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、フラビウイルス、手足口病ウイルス、ラッサウイルス、アレナウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、インフルエンザウイルス、重度の急性呼吸器症候群－コロナウイルス２を含むがこれらに限定されないコロナウイルス、癌を引き起こすウイルス、又はそれらの任意の組合せに由来し得る。１つの実施態様では、１つ以上の追加のウイルス抗原は、ノロウイルス抗原である。例示的な追加のノロウイルス抗原としては、ｐ４８、ヌクレオシド－トリホスファターゼ（ＮＴＰアーゼ）、ｐ２２、ＶＰｇ、プロテアーゼ、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、ＶＰ１、ＶＰ２、それらの断片、又はそれらの任意の組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施態様では、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ分子（例えばヌクレオチド修飾ｍＲＮＡ分子）は、１つ以上のＬＮＰに封入されている。いくつかの実施態様では、該組成物は、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶ、ＧＶＩ、ＧＶＩＩ、ＧＶＩＩＩ、ＧＩＸ、又はＧＸ遺伝子グループに由来する少なくとも１つのＶＰ１抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ分子を含む、少なくとも１つのＬＮＰを含む。いくつかの実施態様では、該組成物は、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶ、ＧＶＩ、ＧＶＩＩ、ＧＶＩＩＩ、ＧＩＸ又はＧＸ遺伝子グループに由来する少なくとも２つのＶＰ１抗原の組合せをコードする、ヌクレオシド修飾ＲＮＡ分子を含む、ＬＮＰの組合せを含む。
いくつかの実施態様では、前記組成物は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２０個を超えるノロウイルスＶＰ１抗原をコードするｍＲＮＡ分子を含む、ＬＮＰの組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、少なくとも１つのＧＩＩ株に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、少なくとも１つのＧＩ株に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰとの組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＧＩＩに由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩに由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩＶに由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰとの組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＧＩＩ．４に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩ．１に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰとの組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は、ＧＩＩ．４に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩ．１に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩ．３に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰと、ＧＩＩ．３に由来するＶＰ１をコードするｍＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのＬＮＰとの組合せを含む。
ワクチン
１つの実施態様では、本発明は、対象においてノロウイルス（ＮｏＶ）に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物を提供する。例えば、１つの実施態様では、免疫原性組成物はワクチンである。ワクチンとして組成物が有用であるために、該組成物は、細胞、組織、又は対象においてノロウイルス抗原に対する免疫応答を誘導しなければならない。いくつかの実施態様では、該組成物は、細胞、組織、又は対象において複数のノロウイルス株に対する幅広い免疫応答を誘導する。場合によっては、ワクチンは、対象において防御的免疫応答を誘導する。
本発明のワクチンは、核酸及び／又は細胞性成分のその組成において変化してもよい。１つの実施態様では、該ワクチンは、ＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードする核酸分子を含む。１つの実施態様では、該ワクチンは、２つ以上のノロウイルス遺伝子グループに由来するノロウイルスＶＰ１抗原をコードする核酸分子の組合せを含む。１つの実施態様では、該ワクチンは、１つ以上のノロウイルスＧＩＩ株及び１つ以上のノロウイルスＧＩ株に由来するノロウイルスＶＰ１抗原をコードする核酸分子の組合せを含む。
非制限的な例では、ＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードする１つ以上の核酸分子はまた、アジュバントと共に製剤化されてもよい。別の非制限的な例では、該ワクチンは、１つ以上のアジュバントを含み得る。本発明のワクチン、及びその様々な成分は、本明細書に開示された任意の方法によって、又は当業者には公知であろうように、本開示に照らして調製及び／又は投与され得る。
様々な実施態様では、ＮｏＶ ＶＰ１抗原の発現による免疫の誘導は、インビボ又はインビトロで、１つ以上のＮｏＶ ＶＰ１抗原に対する宿主の免疫系の全部又は任意の一部の応答を観察することによって検出され得る。
例えば、細胞障害性Ｔリンパ球の誘導を検出するための方法は周知である。体内に進入する外来物質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の作用によって、Ｔ細胞及びＢ細胞に提示される。ＡＰＣによって提示された抗原に対して抗原特異的に応答するいくつかのＴ細胞は、抗原による刺激に因り、細胞障害性Ｔ細胞（細胞障害性Ｔリンパ球すなわちＣＴＬとも呼ばれる）へと分化する。これらの抗原により刺激された細胞は、その後、増殖する。このプロセスは本明細書において、Ｔ細胞の「活性化」と呼ばれる。それ故、ポリペプチド又はペプチドのエピトープ又はその組合せによるＣＴＬの誘導は、抗原提示細胞によって、Ｔ細胞にポリペプチド又はペプチドのエピトープ又はその組合せを提示し、ＣＴＬの誘導を検出することによって評価され得る。更に、抗原提示細胞は、Ｂ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、マクロファージ、好酸球及びナチュラルキラー細胞を活性化する作用を有する。
樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞として使用したＣＴＬの作用の誘導を評価するための方法は、当技術分野において周知である。樹状細胞は、抗原提示細胞の中でも頑強なＣＴＬ誘導作用を有する代表的な抗原提示細胞である。本発明の方法では、ポリペプチド又はペプチドのエピトープ又はその組合せは、樹状細胞によってまず発現され、その後、この樹状細胞は、Ｔ細胞と接触する。樹状細胞との接触後に目的の細胞に対して細胞障害性作用を有するＴ細胞の検出は、ポリペプチド又はペプチドのエピトープ又はその組合せが、細胞障害性Ｔ細胞を誘導する活性を有することを示す。更に、誘導された免疫応答はまた、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどの、抗インターフェロンγ抗体を使用した可視化によって、固定されたペプチド又はペプチドの組合せを有する抗原提示細胞の存在において、ＣＴＬによって産生及び放出されたインターフェロンγを測定することによって調べられ得る。
樹状細胞とは別に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はまた、抗原提示細胞としても使用され得る。ＣＴＬの誘導は、顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子及びインターロイキン－４の存在下で、ＰＢＭＣを培養することによって増強されると報告されている。同様に、ＣＴＬは、キーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及びインターロイキン－７の存在下で、ＰＢＭＣを培養することによって誘導されることが示された。
これらの方法によってＣＴＬ誘導活性を有することが確認された抗原は、樹状細胞活性化作用及びそれに続くＣＴＬ誘導活性を有する抗原である。更に、抗原提示細胞による抗原の提示に因り獲得された細胞障害性を有するＣＴＬもまた、抗原に関連した障害に対するワクチンとして使用され得る。
ノロウイルス抗原の発現による免疫の誘導は、ノロウイルス抗原に対する抗体の産生の誘導を観察することによって更に確認され得る。例えば、抗原に対する抗体が、抗原をコードする組成物で免疫化された実験用対象において誘導される場合、そして抗原に関連した病態がそうした抗体によって抑制される場合、該組成物は免疫を誘導すると決定される。
対象において誘導された抗体応答の特異性は、送達された抗原の多くの領域への結合、並びに、感染を予防するか又は疾患の重症度を低減する、中和可能な抗体の誘導を含み得る。
ノロウイルス抗原の発現による免疫の誘導は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、又はその組合せなどのＴ細胞の誘導を観察することによって更に確認され得る。例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞はまた、標的細胞を溶解することもできるが、ＣＴＬ及び抗体の生成を含む、他の種類の免疫応答の誘導の補助を主に供給し得る。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の補助の種類は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）又は濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）として特徴付けられ得る。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の各サブタイプは、特定の種類の免疫応答に補助を供給する。１つの実施態様では、該組成物は、濾胞性ヘルパーＴ細胞を選択的に誘導し、これは、強力な抗体応答を駆動する。
本発明の治療用化合物又は組成物は、予防的に（すなわち、疾患又は障害を予防するために）又は治療的に（すなわち、疾患又は障害を治療するために）、疾患又は障害を患っているか又は発症するリスクがある（又は発症し易い）対象に投与され得る。このような対象は、標準的な臨床法を使用して同定され得る。本発明の脈絡において、予防投与は、疾患の明白な臨床症状の顕現する前に行なわれ、よって疾患又は障害は予防されるか又は代替的にはその進行が遅延する。医学の分野の脈絡では、「予防する」という用語は、疾患から死亡率又は罹患率の負荷を低減させる、任意の活性を包含する。予防は、一次、二次、及び三次予防レベルで行なわれ得る。一次予防は、疾患の発症を回避するが、二次及び三次レベルの予防は、疾患の進行及び症状の出現を予防すること、並びに、機能を回復させそして疾患関連合併症を低減させることによって、すでに確立された疾患の負の影響を低減させることを目指した、活動を包含する。
抗原
本発明は、対象において免疫応答を誘導する組成物を提供する。１つの実施態様では、該組成物は、少なくとも１つのノロウイルス（ＮｏＶ）抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を含む。本発明の組成物に含まれ得るノロウイルス抗原としては、ｐ４８、ヌクレオシド－トリホスファターゼ（ＮＴＰアーゼ）、ｐ２２、ＶＰｇ、プロテアーゼ、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、ＶＰ１、ＶＰ２、それらの断片、又はそれらの任意の組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
１つの実施態様では、前記抗原は、ＶＰ１抗原である。１つの実施態様では、ＶＰ１抗原は、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶ、ＧＶＩ、ＧＶＩＩ、ＧＶＩＩＩ、ＧＩＸ又はＧＸ遺伝子グループに由来する。１つの実施態様では、ＶＰ１抗原は、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶＩＩＩ又はＧＩＸ遺伝子グループに由来する。１つの実施態様では、ＶＰ１抗原は、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４、ＧＩ．１、ＧＩ．３、ＧＩ．５又はそれらの任意の組合せに由来する。
いくつかの実施態様では、前記ワクチンは更に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２０個を超える追加のウイルス抗原をコードする１つ以上の追加の核酸分子を含む。いくつかの実施態様では、１つ以上の追加のウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、例えばヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、及びＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、天然痘ウイルス（大痘瘡及び小痘瘡）、ワクシニアウイルス、ライノウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－１）、ヘアリーセル白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－ＩＩ）、カルフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス（出血熱）、狂犬病ウイルス、エボラ熱ウイルス、マールブルクウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、１型単純ヘルペス（口腔ヘルペス）、２型単純ヘルペス（性器ヘルペス）、帯状疱疹（水痘帯状疱疹、別名鶏痘）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えばヒトＣＭＶ、エプシュタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、フラビウイルス、手足口病ウイルス、ラッサウイルス、アレナウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、インフルエンザウイルス、重症の急性呼吸器症候群－コロナウイルス２を含むがこれらに限定されないコロナウイルス、癌を引き起こすウイルス、又はそれらの任意の組合せに由来し得る。１つの実施態様では、１つ以上の追加のウイルス抗原は、ノロウイルス抗原である。
例えば、いくつかの実施態様では、前記組成物は、ＮｏＶ ＧＩ、ＧＩＩ、及びＧＩＶ遺伝子グループに由来する、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２０個を超えるＮｏＶ ＶＰ１抗原の組合せをコードする、ヌクレオシド修飾ＲＮＡ、又はその断片若しくは変異体を含む。
いくつかの実施態様では、ＮｏＶ ＶＰ１抗原は、完全長ＶＰ１抗原、又はその断片若しくは変異体を含む。
１つの実施態様では、ＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードするｍＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０をコードする。
１つの実施態様では、ＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードする核酸分子は、タグ又はシグナルペプチド（ＳＰ）をコードする配列を含む。使用され得る他のシグナルペプチドとしては、ＩＬ－２、ｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）、マウス及びヒトＩｇＧ、及び最適化された合成シグナル配列が挙げられるがこれらに限定されない。場合によっては、核酸配列は、ペプチド結合によって抗原に連結された、リンカー配列又はタグ配列をコードする、追加の配列を含む。
いくつかの実施態様では、ＮｏＶ ＶＰ１抗原は、本明細書に記載のＮｏＶ ＶＰ１抗原のアミノ酸配列に対して実質的に相同であるアミノ酸配列を含み、元来のアミノ酸配列の免疫原性機能を保持している。例えば、いくつかの実施態様では、ＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％の同一性の程度を有する。
アジュバント
１つの実施態様では、前記組成物はアジュバントを含む。１つの実施態様では、該組成物は、アジュバントをコードする核酸分子を含む。１つの実施態様では、アジュバントをコードする核酸分子は、インビトロ転写ＲＮＡである。１つの実施態様では、アジュバントをコードする核酸分子は、ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。１つの実施態様では、アジュバントをコードする核酸分子は、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡである。
例示的なアジュバントとしては、α－インターフェロン、γ－インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＮＦβ、ＧＭ－ＳＣＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、主要組織適合複合体、ＣＤ８０、ＣＤ８６が挙げられるがこれらに限定されない。有用なアジュバントであり得る他の遺伝子としては、単球走化性因子（ＭＣＰ）－１、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）－１α、ＭＩＰ－１ｐ、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－Ｉ、リンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ）－１、最晩期抗原（ＶＬＡ）－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－Ｉ、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、突然変異型のＩＬ－１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ－７、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－Ｉ、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ―ｊｕｎ、Ｓｐ－Ｉ、Ａｐ－Ｉ、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅ１、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦκβ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、抗ＣＴＬＡ４－ｓｃ抗体、抗ＬＡＧ３－Ｉｇ抗体、抗ＴＩＭ３－Ｉｇ抗体、及びその機能的断片コードするものが挙げられる。
いくつかの実施態様では、前記組成物はＬＮＰを含み、ここではＬＮＰはアジュバントとして作用する。
核酸
１つの実施態様では、本発明は、少なくとも１つのノロウイルス抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子（例えばヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ分子）を含む。本発明のｍＲＮＡ分子によってコードされ得るノロウイルス抗原としては、ｐ４８、ヌクレオシド－トリホスファターゼ（ＮＴＰアーゼ）、ｐ２２、ＶＰｇ、プロテアーゼ、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、ＶＰ１、ＶＰ２、それらの断片、又はそれらの任意の組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
１つの実施態様では、ｍＲＮＡ分子はＶＰ１抗原をコードする。１つの実施態様では、ＶＰ１抗原は、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶ、ＧＶＩ、ＧＶＩＩ、ＧＶＩＩＩ、ＧＩＸ又はＧＸ遺伝子グループに由来する。１つの実施態様では、ＶＰ１は、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶＩＩＩ又はＧＩＸ遺伝子グループに由来する。１つの実施態様では、ＶＰ１抗原は、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４、ＧＩ．１、ＧＩ．３又はＧＩ．５、又はそれらの任意の組合せに由来する。
核酸分子は、インビトロでの転写、化学合成などを含むがこれらに限定されない、当技術分野における任意の方法を使用して作製され得る。
本明細書に記載のような、少なくとも１つのノロウイルス抗原をコードするヌクレオチド配列は代替的には、結果として得られたポリヌクレオチドが本発明に記載のポリペプチドをコードするという条件で、元来のヌクレオチド配列に対して、例えば、１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入、及び／又は欠失などの、配列の変異を含み得る。それ故、本発明の範囲は、本明細書に列挙されたヌクレオチド配列に対して実質的に相同又は実質的に同一であり、そして、本発明のノロウイルス抗原をコードするヌクレオチド配列を含む。
抗原をコードするヌクレオチド配列に対して実質的に相同であるヌクレオチド配列は典型的には、例えば保存的置換又は非保存的置換を導入することによって、ヌクレオチド配列に含まれる情報に基づいて、抗原のプロデューサー生物から単離され得る。可能な修飾の他の例としては、配列内への１つ以上のヌクレオチドの挿入、配列のいずれかの末端への１つ以上のヌクレオチドの付加、又は配列のいずれかの末端若しくは配列内での１つ以上のヌクレオチドの欠失が挙げられる。２つのポリヌクレオチド間の同一性の程度は、コンピューターアルゴリズム及び当業者には広く公知である方法を使用して決定される。
更に、本発明の範囲は、本明細書に列挙されたアミノ酸配列に対して実質的に相同であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、そして元来のアミノ酸配列の免疫原性機能を保持している。
１つの実施態様では、本発明は、ＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードするヌクレオチド配列を含む、構築物に関する。１つの実施態様では、本発明は、複数のノロウイルス抗原をコードする、複数のヌクレオチド配列を含む。例えば、いくつかの実施態様では、本発明は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上のＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードする、複数のヌクレオチド配列を含む。１つの実施態様では、本発明は、アジュバントをコードするヌクレオチド配列を含む構築物に関する。１つの実施態様では、本発明は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上のＮｏＶ ＶＰ１抗原とアジュバントをコードする、複数のヌクレオチド配列の組合せを含む。
１つの実施態様では、前記組成物は複数の構築物を含み、各構築物は、ＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードする。１つの実施態様では、複数のＮｏＶ ＶＰ１抗原は、ノロウイルス遺伝子グループＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶＩＩＩ又はＧＩＸ又はそれらの任意の組合せに由来する。１つの実施態様では、該組成物は、ＮｏＶ ＧＩＩ．４ ＶＰ１抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第一の構築物；及び、ＮｏＶ ＧＩ．１ ＶＰ１抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第二の構築物を含む。１つの実施態様では、該組成物は、ＮｏＶ ＧＩＩ．４ ＶＰ１抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第一の構築物；ＮｏＶ ＧＩ．１ ＶＰ１抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第二の構築物、ＮｏＶ ＧＩＩ．３ ＶＰ１抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第三の構築物、及びＮｏＶ ＧＩ．３ ＶＰ１抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第四の構築物を含む。１つの実施態様では、ＮｏＶ ＧＩ．１抗原をコードするｍＲＮＡ分子は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする。１つの実施態様では、ＮｏＶ ＧＩＩ．４抗原をコードするｍＲＮＡ分子は、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列をコードする。１つの実施態様では、ＮｏＶ ＧＩ．３抗原をコードするｍＲＮＡ分子は、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列をコードする。１つの実施態様では、ＮｏＶ ＧＩＩ．３抗原をコードするｍＲＮＡ分子は、配列番号７又は配列番号８のアミノ酸配列をコードする。１つの実施態様では、ＮｏＶ ＧＩ抗原をコードするｍＲＮＡ分子は、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列をコードする。
別の特定の実施態様では、前記構築物は、翻訳制御配列に作動可能に結合している。該構築物は、本発明のヌクレオチド配列の発現のための作動可能に結合した調節配列を取り込み得、これにより、発現カセットを形成し得る。
ベクター
本発明のノロウイルス抗原（群）をコードする核酸配列（群）は、当技術分野において公知である組換え法を使用して、例えば、標準的な技術を使用して、該遺伝子を発現している細胞に由来するライブラリーをスクリーニングすることによって、それを含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、又はそれを含有している細胞及び組織から直接単離することによって得ることができる。あるいは、目的の遺伝子は合成で作製されてもよい。
核酸分子は、多くの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、ＰＣＲで作製された鎖状ＤＮＡ配列、及びコスミドを含むがこれらに限定されない、ベクターにクローニングすることができる。特に関心の高いベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、シークエンスベクター、及びインビトロでの転写用に最適化されたベクターが挙げられる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ、及び脂質に基づいた系、例えば水中油滴型エマルション、ミセル、混合ミセル、炭水化物、ペプチド、陽イオン性ポリマー、及びリポソームが挙げられる。インビトロ及びインビボでの送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば人口膜小胞）である。
非ウイルス送達系が使用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用が、宿主細胞へ核酸の導入（インビトロ、エクスビボ、又はインビボ）のために考えられる。別の態様では、核酸を、脂質と会合させてもよい。脂質と会合させた核酸は、リポソーム内部の水性部分に封入され得るか、リポソームの脂質二重層内に散在させ得るか、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と会合する連結分子を介してリポソームに付着させ得るか、リポソーム内に包摂させ得るか、リポソームと複合体を形成させか、液体を含有している溶液中に分散させ得るか、脂質と混合させ得るか、脂質と配合させ得るか、液体中に懸濁液として含有させ得るか、ミセルと共に含有させるか若しくはミセルと複合体を形成させ得るか、又は別の方法で脂質と会合させ得る。脂質、脂質／ＲＮＡ、又は脂質／発現ベクターに会合させた組成物は、溶液中において任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらは二重層構造で、ミセルとして、又は「崩壊した」構造で存在し得る。それらはまた単に、溶液中に散在し得、おそらくサイズ又は形状の均一ではない凝集物を形成している。脂質は脂肪物質であり、これは天然脂質であっても、又は合成脂質であってもよい。例えば、脂質は、細胞質内に天然に存在する脂肪液滴、並びに、長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含有しているクラスの化合物、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドを含む。
使用に適した脂質は、業者から得ることができる。例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、シグマ社、ミズーリ州セントルイスから得ることができ；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、K & K Laboratories（ニューヨーク州プレインビュー）から得ることができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はCalbiochem-Behring社から得ることができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Avanti Polar Lipids社（アラバマ州バーミンガム）から得ることができる。脂質のクロロホルム又はクロロホルム／メタノール中ストック溶液は、約－２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発されるので使用される。
外来性核酸を宿主細胞に導入するために又は別の方法で細胞を本発明の組成物に曝すために使用される方法に関係なく、宿主細胞内のｍＲＮＡ配列の存在を確認するために、多種多様なアッセイが実施され得る。このようなアッセイとしては、例えば、ノザンブロット及び逆転写ＰＣＲなどの当業者には周知である「分子生物学的な」アッセイ；例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）によって特定のペプチドの有無を検出するなどの「生化学的な」アッセイ、又は本発明の範囲内に該当する物質を同定するための本明細書に記載のアッセイが挙げられる。
インビトロで転写されるＲＮＡ
１つの実施態様では、本発明の組成物は、本発明のノロウイルス抗原をコードするインビトロで転写（ＩＶＴ）されるＲＮＡ分子の組合せを含む。１つの実施態様では、インビトロで転写されるＲＮＡは、一過性トランスフェクションの形態として細胞内に導入されてもよい。ＲＮＡは、合成で作製されたプラスミドＤＮＡ鋳型を使用して、インビトロでの転写によって生成される。任意の入手源に由来する目的のＤＮＡは、ＰＣＲによって、適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型に直接変換され得る。ＤＮＡ源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、又は任意の他の適切なＤＮＡ源であり得る。１つの実施態様では、インビトロでの転写のための所望の鋳型は、適応免疫応答を誘導することのできるノロウイルス抗原である。１つの実施態様では、インビトロでの転写のために望ましい鋳型は、適応免疫応答を増強することのできるアジュバントである。
１つの実施態様では、ＰＣＲのために使用される予定のＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含有している。ＤＮＡは、生物のゲノムに由来する天然ＤＮＡ配列に由来していてもよい。１つの実施態様では、ＤＮＡは、目的の完全長の遺伝子又は遺伝子の一部である。該遺伝子は、５’及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のいくらか又は全部を含み得る。該遺伝子は、エキソン及びイントロンを含み得る。１つの実施態様では、ＰＣＲのために使用される予定のＤＮＡは、ヒト遺伝子である。別の実施態様では、ＰＣＲのために使用される予定のＤＮＡは、５’及び／又は３’非翻訳領域を含む、ヒト遺伝子である。別の実施態様では、ＰＣＲのために使用される予定のＤＮＡは、細菌、ウイルス、寄生虫及び真菌を含む、病原性生物又は共生生物に由来する遺伝子である。別の実施態様では、ＰＣＲのために使用される予定のＤＮＡは、５’及び３’非翻訳領域を含む、細菌、ウイルス、寄生虫及び真菌を含む、病原性生物又は共生生物に由来する。ＤＮＡは、代替的には、通常は天然生物内に発現されていない人工ＤＮＡ配列であってもよい。例示的な人工ＤＮＡ配列は、遺伝子の一部が互いにライゲートして、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを一緒に形成しているものである。互いにライゲートしているＤＮＡの一部は、１つの生物に由来していても、又は１つを超える生物に由来していてもよい。
ＰＣＲのためのＤＮＡ源として使用され得る遺伝子としては、生物内で適応免疫応答を誘導又は増強するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。場合によっては、該遺伝子は、短期間の処置に有用である。場合によっては、該遺伝子は、発現された遺伝子の用量に関して、安全性の懸念が少ない。
様々な実施態様では、プラスミドは、トランスフェクションのために使用される、ｍＲＮＡのインビトロでの転写のための鋳型を作成するために使用される。
安定性及び／又は翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用され得る。いくつかの実施態様では、ＲＮＡは、５’及び３’非翻訳領域を有する。１つの実施態様では、５’非翻訳領域は、ゼロから３０００ヌクレオチド長の間である。コード領域に付加される予定の５’及び３’非翻訳領域配列の長さは、非翻訳領域の異なる領域にアニーリングするＰＣＲ用プライマーを設計する方法を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって変化させ得る。このアプローチを使用して、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要とされる５'及び３’非翻訳領域の長さを改変することができる。
５'及び３’非翻訳領域は、目的の遺伝子についての天然に存在している内因性の５'及び３’非翻訳領域であってもよい。あるいは、目的の遺伝子に対して内因性ではない非翻訳領域配列は、非翻訳領域配列を正方向プライマー及び逆方向プライマーに取り込むことによって、又は任意の他の鋳型の修飾によって付加されてもよい。目的の遺伝子に対して内因性ではない非翻訳領域配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率を修飾するのに有用であり得る。例えば、３’非翻訳領域配列内のＡＵリッチ配列は、ｍＲＮＡの安定性を減少させ得ることが知られている。それ故、３’非翻訳領域は、当技術分野において周知である非翻訳領域配列の特性に基づいて、転写されたＲＮＡの安定性を高めるように選択または設計され得る。
１つの実施態様では、５'非翻訳領域は、内因性遺伝子のコザック配列を含有していてもよい。あるいは、目的の遺伝子に対して内因性ではない５'非翻訳領域が、上記のようなＰＣＲによって付加される場合、共通コザック配列は、５’非翻訳領域配列を付加することによって再設計されてもよい。コザック配列は、いくつかのＲＮＡ転写物の翻訳効率を高め得るが、効率的な翻訳を可能とするために全てのＲＮＡに必要とされるわけではないようである。多くのｍＲＮＡにおけるコザック配列の必要性は、当技術分野において公知である。他の実施態様では、５'非翻訳領域は、そのＲＮＡゲノムが細胞内において安定である、ＲＮＡウイルスに由来していてもよい。他の実施態様では、エキソヌクレアーゼによるｍＲＮＡの分解を妨害するために、様々なヌクレオチド類似体が３’又は５’非翻訳領域において使用され得る。
ＤＮＡ鋳型からＲＮＡの合成を可能とするために、転写プロモーターを、転写される予定の配列の上流のＤＮＡ鋳型に付着させるべきである。ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターとして機能する配列が、正方向プライマーの５'末端に付加されると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写される予定のオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に取り込まれることになる。１つの実施態様では、該プロモーターは、本明細書の何処かで記載されているような、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、Ｔ３及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６プロモーターのための共通ヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である。
１つの実施態様では、リボソームの結合、翻訳の開始、及び細胞内でのｍＲＮＡの安定性を決定するｍＲＮＡは、５’末端上のキャップ及び３’ポリ（Ａ）テイルの両方を有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えばプラスミドＤＮＡ上で、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞内での発現に適していない長鎖状の産物を産生する。３’非翻訳領域末端で鎖状化されたプラスミドＤＮＡの転写により、通常のサイズのｍＲＮＡがもたらされ、これは転写後にポリアデニル化されると真核細胞でのトランスフェクションに効果的である。
鎖状ＤＮＡ鋳型上で、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最後の塩基を超えて転写物の３’末端を伸長することができる（Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)）。
ＤＮＡ鋳型にポリＡ／Ｔ伸長配列を組み込む従来の方法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに組み込まれたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミドの不安定性を引き起こし得、これは、プラスミドの増幅のための組換え能力のない細菌細胞を使用することを通して回復され得る。
ＲＮＡのポリ（Ａ）テイルは、大腸菌（エシェリヒア・コリ）のポリＡポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）又は酵母ポリＡポリメラーゼなどの、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの使用を伴うインビトロでの転写後に更に伸長されてもよい。１つの実施態様では、１００ヌクレオチドから３００～４００ヌクレオチドへとポリ（Ａ）テイルの長さを伸長することにより、ＲＮＡの翻訳効率は約２倍増加する。更に、３'末端への様々な化学基の付着も、ｍＲＮＡの安定性を高め得る。このような付着は、修飾された／人工のヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物を含有し得る。例えば、ＡＴＰ類似体が、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して、ポリ（Ａ）テイルに取り込まれてもよい。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性を更に高めることができる。
５'キャップもまた、ｍＲＮＡ分子に安定性を与える。１つの実施態様では、ＲＮＡは、５’ｃａｐ１構造を含めるための方法によって産生される。このようなｃａｐ１構造は、ワクシニアキャッピング酵素及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素（CellScrip社、ウィスコンシン州マディソン）を使用して生成され得る。あるいは、５'キャップは、当技術分野において公知でありかつ本明細書に記載の技術を使用して提供される（Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)）。
ＲＮＡは、多くの異なる方法のいずれか、例えば、電気穿孔法（Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems社、ドイツ、ケルン)）、ＥＣＭ ８３０（ＢＴＸ社）（Harvard Instruments社、マサチューセッツ州ボストン）、又はGene Pulser II（バイオラッド社、コロラド州デンバー）、マルチポレーター（Eppendort社、ドイツ、ハンブルク）、リポフェクションを使用した陽イオン性リポソームにより媒介されるトランスフェクション、ポリマーへの封入、ペプチドにより媒介されるトランスフェクション、又は微粒子銃による粒子送達システム、例えば「遺伝子銃」（例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照）を含むがこれらに限定されない、商業的に利用できる方法を使用して、標的細胞に導入することができる。いくつかの実施態様では、本発明のＲＮＡは、場合によっては、高い効率、低い毒性、トランスフェクションをもたらす、TransIT（登録商標）－ｍＲＮＡトランスフェクションキット（Mirus社、ウィスコンシン州マディソン）の使用を含む方法を用いて細胞内に導入される。
ヌクレオシド修飾ＲＮＡ
１つの実施態様では、本発明の組成物は、本明細書に記載のようなノロウイルス抗原をコードするヌクレオチド修飾核酸を含む。１つの実施態様では、本発明の組成物は、本明細書に記載のような複数のノロウイルス抗原をコードする、複数のヌクレオシド修飾核酸分子を含む。１つの実施態様では、本発明の組成物は、本明細書に記載のようなアジュバントをコードする、ヌクレオシド修飾核酸を含む。１つの実施態様では、本発明の組成物は、１つ以上のノロウイルス抗原及び１つ以上のアジュバントをコードするヌクレオシド修飾核酸を含む。
例えば、１つの実施態様では、前記組成物は、ヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む。１つの実施態様では、該組成物は、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡを含む。ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡは、例えば、高まった安定性、低い又は存在しない自然免疫原性、及び増強された翻訳を含む、未修飾ｍＲＮＡを上回る特定の利点を有する。本発明において有用であるヌクレオシド修飾ｍＲＮＡは、米国特許第８，２７８，０３６号明細書、同第８，６９１，９６６号明細書及び同第８，８３５，１０８号明細書に更に記載され、その各々のその全体が本明細書に参照により援用される。
いくつかの実施態様では、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡは、病理生理学的な経路を全く活性化せず、送達後に非常に効率的かつほぼ即座に翻訳し、そしてインビボで数日間から数週間続く持続的なタンパク質の産生のための鋳型としての役割を果たす（Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840; Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953）。生理学的な効果を奏功するのに必要とされるｍＲＮＡの量は少なく、これにより、ヒトへの治療に適用可能となる。例えば、本明細書に記載のように、ノロウイルス抗原をコードするヌクレオシド修飾ｍＲＮＡは、抗原特異的な抗体産生を誘導する能力を実証した。例えば、場合によっては、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡによってコードされる抗原は、未修飾ｍＲＮＡによってコードされる抗原と比較して、抗原特異的な抗体産生のより大きな産生を誘導する。
場合によっては、コーディングｍＲＮＡを送達することによってタンパク質を発現させることは、タンパク質、プラスミドＤＮＡ、又はウイルスベクターを使用する方法を上回る多くの利点を有する。ｍＲＮＡのトランスフェクション中、所望のタンパク質のコード配列は、細胞に送達される唯一の物質であり、よってプラスミド骨格、ウイルス遺伝子、及びウイルスタンパク質に関連した全ての副作用が回避される。より重要なことには、ＤＮＡに基づいたベクター及びウイルスに基づいたベクターとは異なり、ｍＲＮＡは、ゲノムに取り込まれるリスクを有さず、タンパク質の産生は、ｍＲＮＡの送達直後に始まる。例えば、高いレベルの循環中タンパク質は、コーディングｍＲＮＡのインビボでの注射から１５から３０分間以内に測定される。いくつかの実施態様では、タンパク質よりもｍＲＮＡを使用することにも、多くの利点を有する。循環中又は組織中のタンパク質の半減期は、短いことが多く、よって、タンパク質による処置は、頻回投薬を必要とするであろうが、ｍＲＮＡは、数日間から数週間持続する連続的なタンパク質の産生のための鋳型を提供する。タンパク質の精製は問題があり、それらは、有害な作用を引き起こす凝集物及び他の不純物を含有している可能性がある（Kromminga and Schellekens, 2005, Ann NY Acad Sci 1050:257-265）。
いくつかの実施態様では、ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、天然修飾ヌクレオシドシュードウリジンを含む。いくつかの実施態様では、シュードウリジンの包含は、ｍＲＮＡをより安定的なものとし、非免疫原性とし、高度に翻訳可能とする（Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840; Anderson et al., 2010, Nucleic Acids Res 38:5884-5892; Anderson et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:9329-9338; Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:e142; Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953; Kariko et al., 2005, Immunity 23:165-175）。
ＲＮＡ内にシュードウリジンを含む、修飾ヌクレオシドの存在が、それらの自然免疫原性を抑制することが実証されている（Kariko et al., 2005, Immunity 23:165-175）。更に、シュードウリジンを含有しているタンパク質をコードしインビトロで転写されるＲＮＡは、修飾ヌクレオシドを全く含有していないか又は他の修飾ヌクレオシドを含有しているＲＮＡよりも効率的に翻訳され得る（Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840）。続いて、シュードウリジンの存在は、ＲＮＡの安定性を向上させ（Anderson et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:9329-9338）、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼの活性化及び翻訳の阻害の両方を軽減することが示される（Anderson et al., 2010, Nucleic Acids Res 38:5884-5892）。
シュードウリジンについて記載されているような類似した効果もまた、１－メチル－１－シュードウリジンを含有しているＲＮＡについて観察されている。
いくつかの実施態様では、ヌクレオシド修飾核酸分子は、精製されたヌクレオシド修飾核酸分子である。例えば、いくつかの実施態様では、該組成物は、二本鎖混入物を除去するために精製される。場合によっては、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製手順を使用することにより、優れた翻訳能を有し、かつ自然免疫原性を全く有さない、シュードウリジン含有ＲＮＡが得られる（Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:e142）。マウス及びマカクへの、エリスロポエチンをコードする、ＨＰＬＣで精製されたシュードウリジン含有ＲＮＡの投与により、血清中エリスポエチンレベルは有意に上昇し（Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953）、したがって、シュードウリジン含有ｍＲＮＡが、インビボでのタンパク質療法に適していることが確認される。いくつかの実施態様では、ヌクレオシド修飾核酸分子は、ＨＰＬＣ以外の方法を使用して精製される。場合によっては、ヌクレオシド修飾核酸分子は、ＨＰＬＣ及び高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を含むがこれらに限定されない、クロマトグラフィー法を使用して精製される。例示的なＦＰＬＣに基づいた精製手順が、Weissman et al., 2013, Methods Mol Biol, 969: 43-54に記載されている。例示的な精製手順は、米国特許出願公開第２０１６／００３２３１６号明細書にも記載され、これはその全体が参照によりここに援用される。
本発明は、シュードウリジン又は修飾ヌクレオシドを含む、ＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド、及びポリリボヌクレオチド分子を包含する。いくつかの実施態様では、該組成物は、抗原をコードする単離された核酸を含み、ここでの核酸は、シュードウリジン又は修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施態様では、該組成物は、抗原、アジュバント又はその組合せをコードする単離された核酸を含むベクターを含み、ここでの核酸は、シュードウリジン又は修飾ヌクレオシドを含む。
１つの実施態様では、本発明のヌクレオシド修飾ＲＮＡは、本明細書の何処かで記載されているようなインビトロ転写ＲＮＡである。例えば、いくつかの実施態様では、ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼによって合成される。別の実施態様では、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡは、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼによって合成される。別の実施態様では、ヌクレオシドの修飾されたＲＮＡは、Ｔ３ファージによって合成される。別の実施態様では、ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼによって合成される。
１つの実施態様では、修飾ヌクレオシドは、ｍ１ａｃｐ３Ψ（１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジンである。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、ｍ１Ψ（１－メチルシュードウリジン）である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、Ψｍ（２’－Ｏ－メチルシュードウリジン）である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、ｍ３Ψ（３－メチルシュードウリジン）である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、更に修飾されていないシュードウリジン部分である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、上記のいずれかのシュードウリジンの一リン酸、二リン酸、又は三リン酸である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、当技術分野において公知である、任意の他のシュードウリジン様ヌクレオシドである。
別の実施態様では、本発明のヌクレオシド修飾ＲＮＡ内において修飾されているヌクレオシドは、ウリジン（Ｕ）である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、シチジン（Ｃ）である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、アデノシン（Ａ）である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、グアノシン（Ｇ）である。
別の実施態様では、本発明の修飾ヌクレオシドは、ｍ５Ｃ（５－メチルシチジン）である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、ｍ５Ｕ（５－メチルウリジン）である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、ｍ６Ａ（Ｎ６－メチルアデノシン）である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、ｓ２Ｕ（２－チオウリジン）である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、Ψ（シュードウリジン）である。別の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、Ｕｍ（２’－Ｏ－メチルウリジン）である。
他の実施態様では、修飾ヌクレオシドは、ｍ１Ａ（１－メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）；Ａｍ（２’－Ｏ－メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２－メチルチオ―Ｎ６－メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６－イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１－メチルイノシン）；ｍ１Ｉｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）；Ｃｍ（２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２－チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４－アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５－ホルミルシチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リジン）；ｍ１Ｇ（１－メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’－Ｏ－メチルグアノシン）；ｍ２ ２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）；ｍ２ ２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸））；ｙＷ（ウイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシウイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシウイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（修飾の少ないヒドロキシウイブトシン）；ｉｍＧ（ウイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルウイオシン）；Ｑ（キューオシン）；ｏＱ（エポキシキューオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル－キューオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル－キューオシン）；ｐｒｅＱ０（７－シアノ－７－デアザグアノシン）；ｐｒｅＱ１（７－アミノメチル－７－デアザグアノシン）；Ｇ＋（アーケオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５－メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン）；ｍｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－２－チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン）；ｍ６ ２Ａ（Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン）；Ｉｍ（２’－Ｏ－メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４－メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン）；ｍ６ ２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ－２’－トリメチルアデノシン）；ｍ２，７Ｇ（Ｎ２，７－ジメチルグアノシン）；ｍ２，２，７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）；ｍ５Ｕ（５－メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）；ｍ１Ａｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン）；τｍ５Ｕ（５－タウリノメチルウリジン）；τｍ５ｓ２Ｕ（５－タウリノメチル－２－チオウリジン））；ｉｍＧ－１４（４－デメチルウイオシン）；ｉｍＧ２（イソウイオシン）；又はａｃ６Ａ（Ｎ６－アセチルアデノシン）である。
別の実施態様では、本発明のヌクレオシド修飾ＲＮＡは、上記の２つ以上の修飾の組合せを含む。別の実施態様では、ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、上記の３つ以上の修飾の組合せを含む。別の実施態様では、ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、上記の３つを超える修飾の組合せを含む。
様々な実施態様では、本発明のヌクレオシド修飾ＲＮＡ内の残基の０．１％～１００％が、（例えば、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、５－メチル－ウリジン、又は別の修飾ヌクレオシド塩基のいずれかの存在によって）修飾されている。１つの実施態様では、修飾残基の割合は０．１％である。別の実施態様では、修飾残基の割合は０．２％である。別の実施態様では、割合は０．３％である。別の実施態様では、割合は０．４％である。別の実施態様では、割合は０．５％である。別の実施態様では、割合は０．６％である。別の実施態様では、割合は０．７％である。別の実施態様では、割合は０．８％である。別の実施態様では、割合は０．９％である。別の実施態様では、割合は１％である。別の実施態様では、割合は１．５％である。別の実施態様では、割合は２％である。別の実施態様では、割合は２．５％である。別の実施態様では、割合は３％である。別の実施態様では、割合は４％である。別の実施態様では、割合は５％である。別の実施態様では、割合は６％である。別の実施態様では、割合は７％である。別の実施態様では、割合は８％である。別の実施態様では、割合は９％である。別の実施態様では、割合は１０％である。別の実施態様では、割合は１２％である。別の実施態様では、割合は１４％である。別の実施態様では、割合は１６％である。別の実施態様では、割合は１８％である。別の実施態様では、割合は２０％である。別の実施態様では、割合は２５％である。別の実施態様では、割合は３０％である。別の実施態様では、割合は３５％である。別の実施態様では、割合は４０％である。別の実施態様では、割合は４５％である。別の実施態様では、割合は５０％である。別の実施態様では、割合は５５％である。別の実施態様では、割合は６０％である。別の実施態様では、割合は６５％である。別の実施態様では、割合は７０％である。別の実施態様では、割合は７５％である。別の実施態様では、割合は８０％である。別の実施態様では、割合は８５％である。別の実施態様では、割合は９０％である。別の実施態様では、割合は９１％である。別の実施態様では、割合は９２％である。別の実施態様では、割合は９３％である。別の実施態様では、割合は９４％である。別の実施態様では、割合は９５％である。別の実施態様では、割合は９６％である。別の実施態様では、割合は９７％である。別の実施態様では、割合は９８％である。別の実施態様では、割合は９９％である。別の実施態様では、割合は１００％である。
別の実施態様では、割合は５％未満である。別の実施態様では、割合は３％未満である。別の実施態様では、割合は１％未満である。別の実施態様では、割合は２％未満である。別の実施態様では、割合は４％未満である。別の実施態様では、割合は６％未満である。別の実施態様では、割合は８％未満である。別の実施態様では、割合は１０％未満である。別の実施態様では、割合は１２％未満である。別の実施態様では、割合は１５％未満である。別の実施態様では、割合は２０％未満である。別の実施態様では、割合は３０％未満である。別の実施態様では、割合は４０％未満である。別の実施態様では、割合は５０％未満である。別の実施態様では、割合は６０％未満である。別の実施態様では、割合は７０％未満である。
別の実施態様では、所与のヌクレオシドの残基（すなわち、ウリジン、シチジン、グアノシン、又はアデノシン）の０．１％が修飾されている。別の実施態様では、修飾された残基の割合は０．２％である。別の実施態様では、割合は０．３％である。別の実施態様では、割合は０．４％である。別の実施態様では、割合は０．５％である。別の実施態様では、割合は０．６％である。別の実施態様では、割合は０．７％である。別の実施態様では、割合は０．８％である。別の実施態様では、割合は０．９％である。別の実施態様では、割合は１％である。別の実施態様では、割合は１．５％である。別の実施態様では、割合は２％である。別の実施態様では、割合は２．５％である。別の実施態様では、割合は３％である。別の実施態様では、割合は４％である。別の実施態様では、割合は５％である。別の実施態様では、割合は６％である。別の実施態様では、割合は７％である。別の実施態様では、割合は８％である。別の実施態様では、割合は９％である。別の実施態様では、割合は１０％である。別の実施態様では、割合は１２％である。別の実施態様では、割合は１４％である。別の実施態様では、割合は１６％である。別の実施態様では、割合は１８％である。別の実施態様では、割合は２０％である。別の実施態様では、割合は２５％である。別の実施態様では、割合は３０％である。別の実施態様では、割合は３５％である。別の実施態様では、割合は４０％である。別の実施態様では、割合は４５％である。別の実施態様では、割合は５０％である。別の実施態様では、割合は５５％である。別の実施態様では、割合は６０％である。別の実施態様では、割合は６５％である。別の実施態様では、割合は７０％である。別の実施態様では、割合は７５％である。別の実施態様では、割合は８０％である。別の実施態様では、割合は８５％である。別の実施態様では、割合は９０％である。別の実施態様では、割合は９１％である。別の実施態様では、割合は９２％である。別の実施態様では、割合は９３％である。別の実施態様では、割合は９４％である。別の実施態様では、割合は９５％である。別の実施態様では、割合は９６％である。別の実施態様では、割合は９７％である。別の実施態様では、割合は９８％である。別の実施態様では、割合は９９％である。別の実施態様では、割合は１００％である。別の実施態様では、修飾されている所与のヌクレオチドの割合は８％未満である。別の実施態様では、割合は１０％未満である。別の実施態様では、割合は５％未満である。別の実施態様では、割合は３％未満である。別の実施態様では、割合は１％未満である。別の実施態様では、割合は２％未満である。別の実施態様では、割合は４％未満である。別の実施態様では、割合は６％未満である。別の実施態様では、割合は１２％未満である。別の実施態様では、割合は１５％未満である。別の実施態様では、割合は２０％未満である。別の実施態様では、割合は３０％未満である。別の実施態様では、割合は４０％未満である。別の実施態様では、割合は５０％未満である。別の実施態様では、割合は６０％未満である。別の実施態様では、割合は７０％未満である。
いくつかの実施態様では、前記組成物は、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製された調製物を含む。例えば、いくつかの実施態様では、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製された調製物は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を実質的に含まない。いくつかの実施態様では、精製された調製物は、他の全ての核酸分子（ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）に比べて、少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．９％の一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。
別の実施態様では、本発明のヌクレオシド修飾ＲＮＡは、同じ配列を有する未修飾ＲＮＡ分子よりも効率的に細胞内で翻訳される。別の実施態様では、ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、標的細胞によって翻訳される増強された能力を示す。別の実施態様では、翻訳は、その未修飾対応物と比較して２倍増強される。別の実施態様では、翻訳は、３倍増強される。別の実施態様では、翻訳は４倍増強される。別の実施態様では、翻訳は５倍増強される。別の実施態様では、翻訳は６倍増強される。別の実施態様では、翻訳は７倍増強される。別の実施態様では、翻訳は８倍増強される。別の実施態様では、翻訳は９倍増強される。別の実施態様では、翻訳は１０倍増強される。別の実施態様では、翻訳は１５倍増強される。別の実施態様では、翻訳は２０倍増強される。別の実施態様では、翻訳は５０倍増強される。別の実施態様では、翻訳は１００倍増強される。別の実施態様では、翻訳は２００倍増強される。別の実施態様では、翻訳は５００倍増強される。別の実施態様では、翻訳は１０００倍増強される。別の実施態様では、翻訳は２０００倍増強される。別の実施態様では、倍率は１０～１０００倍である。別の実施態様では、倍率は１０～１００倍である。別の実施態様では、倍率は１０～２００倍である。別の実施態様では、倍率は１０～３００倍である。別の実施態様では、倍率は１０～５００倍である。別の実施態様では、倍率は２０～１０００倍である。別の実施態様では、倍率は３０～１０００倍である。別の実施態様では、倍率は５０～１０００倍である。別の実施態様では、倍率は１００～１０００倍である。別の実施態様では、倍率は２００～１０００倍である。別の実施態様では、翻訳は、任意の他の有意な量又は量の範囲だけ増強される。
別の実施態様では、本発明のヌクレオシドの修飾された抗原をコードするＲＮＡは、同じ配列を有する未修飾のインビトロで合成されたＲＮＡ分子と比較して、有意により頑強な適応免疫応答を誘導する。別の実施態様では、修飾ＲＮＡ分子は、その未修飾対応物より２倍高い、適応免疫応答を誘導する。別の実施態様では、適応免疫応答は、３倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、４倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、５倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、６倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、７倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、８倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、９倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、１０倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、１５倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、２０倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、５０倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、１００倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、２００倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、５００倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、１０００倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、２０００倍増加する。別の実施態様では、適応免疫応答は、別の倍率差だけ増加する。
別の実施態様では、「より頑強な適応免疫応答を誘導する」は、適応免疫応答の検出可能な増加を指す。別の実施態様では、該用語は、適応免疫応答の増加倍数を指す（例えば、上記に列挙されている増加倍数は１）。別の実施態様では、該用語は、ヌクレオシド修飾ＲＮＡを、同じように効果的な適応免疫応答を依然として誘導しつつ、未修飾ＲＮＡ分子よりも少ない用量又はより低い頻度で投与することができるような増加を指す。別の実施態様では、増加は、ヌクレオシド修飾ＲＮＡを、１回量を使用して投与して、効果的な適応免疫応答を誘導することができるようなものである。
別の実施態様では、本発明のヌクレオシド修飾ＲＮＡは、同じ配列を有する未修飾のインビトロで合成されたＲＮＡ分子よりも、有意により低い自然免疫原性を示す。別の実施態様では、修飾ＲＮＡ分子は、その未修飾の対応物より２倍低い、自然免疫応答を示す。別の実施態様では、自然免疫原性は３倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は４倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は５倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は６倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は７倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は８倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は９倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は１０倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は１５倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は２０倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は５０倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は１００倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は２００倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は５００倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は１０００倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は２０００倍減少する。別の実施態様では、自然免疫原性は別の倍率差だけ減少する。
別の実施態様では、「有意により低い自然免疫原性を示す」は、自然免疫原性の検出可能な減少を指す。別の実施態様では、該用語は、自然免疫原性の減少倍数を指す（例えば、上記に列挙されている減少倍数は１）。別の実施態様では、該用語は、ヌクレオシド修飾ＲＮＡの有効量を、検出可能な自然免疫応答をトリガーすることなく投与することができるような減少を指す。別の実施態様では、該用語は、ヌクレオシド修飾ＲＮＡを、修飾ＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生を検出可能なほどに減少させるに十分な自然免疫応答を惹起することなく繰り返し投与することができるような減少を指す。別の実施態様では、減少は、ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、修飾ＲＮＡによってコードされるタンパク質の検出可能な産生を排除するのに十分な自然免疫応答を惹起することなく、繰り返し投与することができるようなものである。
脂質ナノ粒子
１つの実施態様では、ヌクレオシド修飾ＲＮＡの送達は、本明細書の何処かで記載された例示的なＲＮＡトランスフェクション法を含む、任意の適切な送達法を含む。いくつかの実施態様では、対象へのヌクレオシド修飾ＲＮＡの送達は、接触工程前に、ヌクレオシド修飾ＲＮＡを、トランスフェクション試薬と混合する工程を含む。別の実施態様では、本発明の方法は更に、ヌクレオシド修飾ＲＮＡを、トランスフェクション試薬と一緒に投与することを含む。別の実施態様では、トランスフェクション試薬は、陽イオン性脂質試薬である。別の実施態様では、トランスフェクション試薬は、陽イオン性ポリマー試薬である。
別の実施態様では、トランスフェクション試薬は、脂質を基剤としたトランスフェクション試薬である。別の実施態様では、トランスフェクション試薬は、タンパク質を基剤としたトランスフェクション試薬である。別の実施態様では、トランスフェクション試薬は、炭水化物を基剤としたトランスフェクション試薬である。別の実施態様では、トランスフェクション試薬は、陽イオン性脂質を基剤としたトランスフェクション試薬である。別の実施態様では、トランスフェクション試薬は、陽イオン性ポリマーを基剤としたトランスフェクション試薬である。別の実施態様では、トランスフェクション試薬は、ポリエチレンイミンを基剤としたトランスフェクション試薬である。別の実施態様では、トランスフェクション試薬は、リン酸カルシウムである。別の実施態様では、トランスフェクション試薬は、リポフェクチン（登録商標）、リポフェクタミン（登録商標）、又はＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）である。別の実施態様では、トランスフェクション試薬は、当技術分野において公知である任意の他のトランスフェクション試薬である。
別の実施態様では、トランスフェクション試薬はリポソームを形成している。別の実施態様では、リポソームは、細胞内安定性を高め、取り込み効率を高め、生物学的活性を向上させる。別の実施態様では、リポソームは、細胞膜を構成する脂質などと同じような様式で並んだ脂質から構成される中空で球状の小胞である。それらは、別の実施態様では、水溶性化合物を包摂するための内部水性空間を有し、直径のサイズは０．０５から数ミクロンの範囲である。別の実施態様では、リポソームは、生物学的に活性な形態で細胞にＲＮＡを送達することができる。
１つの実施態様では、前記組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び本明細書に記載の１つ以上の核酸分子を含む。例えば、１つの実施態様では、該組成物は、ＬＮＰと、１つ以上の抗原、アジュバント又はその組合せをコードする１つ以上のヌクレオシド修飾ＲＮＡ分子とを含む。
いくつかの実施態様では、脂質ナノ粒子は、ナノメートルの次元（例えば１～１，０００nm）の少なくとも１つの寸法を有している粒子である。いくつかの実施態様では、脂質ナノ粒子は、１つ以上の脂質を含む。例えば、いくつかの実施態様では、脂質は、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の脂質を含む。
いくつかの実施態様では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載のようなヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む製剤中に含まれる。いくつかの実施態様では、このような脂質ナノ粒子は、陽イオン性脂質（例えば式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の脂質）と、中性脂質、荷電した脂質、ステロイド、及びポリマーにコンジュゲートした脂質（例えばＰＥＧ化脂質、例えばＰＥＧ化した構造（ＩＶ）の脂質）から選択された１つ以上の賦形剤とを含む。いくつかの実施態様では、ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、脂質ナノ粒子の脂質部分に、又は脂質ナノ粒子の液体部分のいくらか若しくは全てによって包まれる水性空間に封入され、これにより、それは酵素的分解又は宿主生物若しくは細胞の機序によって誘導される他の望ましくない作用、例えば有害な免疫応答から防御される。
様々な実施態様では、脂質ナノ粒子は、約３０nm～約１５０nm、約４０nm～約１５０nm、約５０nm～約１５０nm、約６０nm～約１３０nm、約７０nm～約１１０nm、約７０nm～約１００nm、約８０nm～約１００nm、約９０nm～約１００nm、約７０nm～９０nm、約８０nm～約９０nm、約７０nm～約８０nm、又は約３０nm、３５nm、４０nm、４５nm、５０nm、５５nm、６０nm、６５nm、７０nm、７５nm、８０nm、８５nm、９０nm、９５nm、１００nm、１０５nm、１１０nm、１１５nm、１２０nm、１２５nm、１３０nm、１３５nm、１４０nm、１４５nm、又は１５０nmの平均直径を有し、実質的に無毒性である。いくつかの実施態様では、ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に存在する場合、ヌクレアーゼによる分解に対して、水溶液中において抵抗性である。
ＬＮＰは、１つ以上の核酸分子が付着している粒子を形成することができるか、又は１つ以上の核酸分子が封入されている、任意の脂質を含み得る。
１つの実施態様では、ＬＮＰは、１つ以上の陽イオン性脂質、及び１つ以上の安定化脂質を含む。安定化させる脂質は、中性脂質及びＰＥＧ化脂質を含む。
１つの実施態様では、ＬＮＰは、陽イオン性脂質を含む。いくつかの実施態様では、陽イオン性脂質は、生理的ｐＨなどの選択したｐＨにおいて正味の正の電荷を有する多くの脂質種のいずれかを含む。このような脂質としては、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、及びＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロピ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が挙げられるがこれらに限定されない。更に、本発明において使用することのできる、陽イオン性脂質の多くの市販の調製物が入手可能である。これらは、例えば、リポフェクチン（登録商標）（ＤＯＴＭＡ及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、市販されている陽イオン性リポソーム、ギブコ／ＢＲＬ社製、ＮＹ州グランドアイランド）；リポフェクタミン（登録商標）（Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）及び（ＤＯＰＥ）を含む、市販されている陽イオン性リポソーム、ギブコ／ＢＲＬ社製）；トランスフェクタム（登録商標）（エタノール中にジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含む市販されている陽イオン性脂質、プロメガ社製、ウィスコンシン州マディソン）を含む。以下の脂質は陽イオン性であり、生理的ｐＨ未満において正の電荷を有する；ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。
１つの実施態様では、陽イオン性脂質は、アミノ脂質である。本発明において有用である適切なアミノ脂質は、国際公開公報第２０１２／０１６１８４号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載のものを含む。代表的なアミノ脂質としては、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、及び２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］―ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。
適切なアミノ脂質は、以下の式：
Figure 2024540061000002
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、同じ又は異なるのいずれかで、独立して、場合により置換されたＣ１０～Ｃ２４アルキル、場合により置換されたＣ１０～Ｃ２４アルケニル、場合により置換されたＣ１０～Ｃ２４アルキニル、又は場合により置換されたＣ１０～Ｃ２４アシルであり；
Ｒ３及びＲ４は、同じ又は異なるのいずれかで、独立して、場合により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、場合により置換されたＣ２～Ｃ６アルケニル、又は場合により置換されたＣ２～Ｃ６アルキニルであるか、あるいは、Ｒ３及びＲ４は接続して、４～６個の炭素原子及び窒素と酸素から選択された１又は２個のヘテロ原子を有する、場合により置換されたヘテロ環を形成し；
Ｒ５は、存在しないか又は存在するのいずれかであり、存在する場合、水素又はＣ１～Ｃ６アルキルであり；
ｍ、ｎ及びｐは、同じ又は異なるのいずれかであり、独立して０又は１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎ及びｐは同時に０ではなく；
ｑは０、１、２、３、又は４であり；そして
Ｙ及びＺは、同じ又は異なるのいずれかであり、独立してＯ、Ｓ、又はＮＨである）
を有するものを含む。１つの実施態様では、Ｒ１及びＲ２は各々リノレイルであり、アミノ脂質はジリノレイルアミノ脂質である。１つの実施態様では、アミノ脂質は、ジリノレイルアミノ脂質である。１つの実施態様では、アミノ脂質は、ジリノレイルアミノ脂質である。
代表的な有用なジリノレイルアミノ脂質は、以下の式：
Figure 2024540061000003
（式中、ｎは０、１、２、３又は４である）
を有する。
１つの実施態様では、陽イオン性脂質は、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡである。１つの実施態様では、陽イオン性脂質は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（上記のＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ここでのｎは２である）である。
１つの実施態様では、ＬＮＰの陽イオン性脂質成分は、以下の式（Ｉ）：
Figure 2024540061000004
（式中、
Ｌ１及びＬ２は各々独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、又は炭素－炭素二重結合であり；
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、各場所において、独立して、（ａ）Ｈ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、又は（ｂ）Ｒ１ａは、Ｈ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂはそれが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成し；
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、各場所において、独立して（ａ）Ｈ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、又は（ｂ）Ｒ２ａはＨ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂはそれが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成し；
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、各場所において、独立して（ａ）Ｈ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、又は（ｂ）Ｒ３ａはＨ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂはそれが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ３ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成し；
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各場所において、独立して（ａ）Ｈ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、又は（ｂ）Ｒ４ａはＨ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂはそれが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成し；
Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、メチル又はシクロアルキルであり；
Ｒ７は、各場所において、独立してＨ又はＣ１～Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ８及びＲ９は、各々独立して、Ｃ１～Ｃ１２アルキルであるか；あるいは、Ｒ８及びＲ９は、それが付着している窒素原子と一緒に、１つの窒素原子を含む５、６、又は７員環ヘテロ環を形成し；
ａ及びｄは各々独立して、０～２４の整数であり；
ｂ及びｃは各々独立して、１～２４の整数であり；そして
ｅは１又は２である）
で示される構造、又はその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグ若しくは立体異性体を有する。
式（Ｉ）のいくつかの実施態様では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ若しくはＲ４ａの少なくとも１つはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、又はＬ１若しくはＬ２の少なくとも１つは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－もしくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。他の実施態様では、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、ａが６である場合にはイソプロピルではなく、ａが８である場合にはｎ－ブチルではない。
式（Ｉ）のまた更なる実施態様では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ若しくはＲ４ａの少なくとも１つはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、又はＬ１若しくはＬ２の少なくとも１つは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－もしくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり；そして
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、ａが６である場合にはイソプロピルではなく、ａが８である場合にはｎ－ブチルではない。
式（Ｉ）の他の実施態様では、Ｒ８及びＲ９は各々独立して、置換されていないＣ１～Ｃ１２アルキルであるか；又は、Ｒ８及びＲ９はそれらが付着している窒素原子と一緒に、１つの窒素原子を含む５、６若しくは７員環ヘテロ環を形成している。
式（Ｉ）のいくつかの実施態様では、Ｌ１若しくはＬ２のいずれか一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－又は炭素－炭素二重結合であり得る。Ｌ１及びＬ２は各々、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり得るか、又は各々、炭素－炭素二重結合であり得る。
式（Ｉ）のいくつかの実施態様では、Ｌ１又はＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。他の実施態様では、Ｌ１及びＬ２のどちらも－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。
式（Ｉ）のいくつかの実施態様では、Ｌ１又はＬ２の一方は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。他の実施態様では、Ｌ１及びＬ２のどちらも－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
式（Ｉ）のいくつかの他の実施態様では、Ｌ１又はＬ２の一方は、炭素－炭素二重結合である。他の実施態様では、Ｌ１及びＬ２のどちらも炭素－炭素二重結合である。
式（Ｉ）のまた他の実施態様では、Ｌ１又はＬ２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、Ｌ１又はＬ２の他方は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。更なる実施態様では、Ｌ１又はＬ２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、Ｌ１又はＬ２の他方は炭素－炭素二重結合である。また更なる実施態様では、Ｌ１又はＬ２の一方は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１又はＬ２の他方は炭素－炭素二重結合である。
本明細書全体を通して使用されるような「炭素－炭素」二重結合は、以下の構造：
Figure 2024540061000005
（式中、
Ｒａ及びＲｂは、各場所において、独立して、Ｈ又は置換基である）
の１つを指すことが理解される。例えば、いくつかの実施態様では、Ｒａ及びＲｂは、各場所において、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、又はシクロアルキルであり、例えばＨ又はＣ１～Ｃ１２アルキルである。
他の実施態様では、式（Ｉ）の脂質化合物は、以下の構造（Ｉａ）：
Figure 2024540061000006
を有する。
他の実施態様では、式（Ｉ）の脂質化合物は、以下の構造（Ｉｂ）：
Figure 2024540061000007
を有する。
更に他の実施態様では、式（Ｉ）の脂質化合物は、以下の構造（Ｉｃ）：
Figure 2024540061000008
を有する。
式（Ｉ）の脂質化合物のいくつかの実施態様では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは各々独立して、
２～１２の整数、又は４～１２の整数である。他の実施態様では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは各々独立して、８～１２又は５～９の整数である。いくつかの実施態様では、ａは０である。いくつかの実施態様では、ａは１である。他の実施態様では、ａは２である。更なる実施態様では、ａは３である。更に他の実施態様では、ａは４である。いくつかの実施態様では、ａは５である。他の実施態様では、ａは６である。更なる実施態様では、ａは７である。更に他の実施態様では、ａは８である。いくつかの実施態様では、ａは９である。他の実施態様では、ａは１０である。更なる実施態様では、ａは１１である。更に他の実施態様では、ａは１２である。いくつかの実施態様では、ａは１３である。他の実施態様では、ａは１４である。更なる実施態様では、ａは１５である。更に他の実施態様では、ａは１６である。
式（Ｉ）のいくつかの他の実施態様では、ｂは１である。他の実施態様では、ｂは２である。更なる実施態様では、ｂは３である。更に他の実施態様では、ｂは４である。いくつかの実施態様では、ｂは５である。他の実施態様では、ｂは６である。更なる実施態様では、ｂは７である。更に他の実施態様では、ｂは８である。いくつかの実施態様では、ｂは９である。他の実施態様では、ｂは１０である。更なる実施態様では、ｂは１１である。更に他の実施態様では、ｂは１２である。いくつかの実施態様では、ｂは１３である。他の実施態様では、ｂは１４である。更なる実施態様では、ｂは１５である。更に他の実施態様では、ｂは１６である。
式（Ｉ）のいくつかの更なる実施態様では、ｃは１である。他の実施態様では、ｃは２である。更なる実施態様では、ｃは３である。更に他の実施態様では、ｃは４である。いくつかの実施態様では、ｃは５である。他の実施態様では、ｃは６である。更なる実施態様では、ｃは７である。更に他の実施態様では、ｃは８である。いくつかの実施態様では、ｃは９である。他の実施態様では、ｃは１０である。更なる実施態様では、ｃは１１である。更に他の実施態様では、ｃは１２である。いくつかの実施態様では、ｃは１３である。他の実施態様では、ｃは１４である。更なる実施態様では、ｃは１５である。更に他の実施態様では、ｃは１６である。
式（Ｉ）のいくつかの他の実施態様では、ｄは０である。いくつかの実施態様では、ｄは１である。他の実施態様では、ｄは２である。更なる実施態様では、ｄは３である。更に他の実施態様では、ｄは４である。いくつかの実施態様では、ｄは５である。他の実施態様では、ｄは６である。更なる実施態様では、ｄは７である。更に他の実施態様では、ｄは８である。いくつかの実施態様では、ｄは９である。他の実施態様では、ｄは１０である。更なる実施態様では、ｄは１１である。更に他の実施態様では、ｄは１２である。いくつかの実施態様では、ｄは１３である。他の実施態様では、ｄは１４である。更なる実施態様では、ｄは１５である。更に他の実施態様では、ｄは１６である。
式（Ｉ）のいくつかの他の様々な実施態様では、ａ及びｄは同じである。いくつかの他の実施態様では、ｂ及びｃは同じである。いくつかの他の具体的な実施態様では、ａ及びｄは同じであり、ｂ及びｃは同じである。
式（Ｉ）におけるａとｂの合計、及びｃとｄの合計は、所望の特性を有している式（Ｉ）の脂質が得られるように変更してもよい係数である。１つの実施態様では、ａ及びｂは、それらの合計が、１４～２４の範囲の整数となるように選択される。他の実施態様では、ｃ及びｄは、それらの合計が１４～２４の範囲の整数となるように選択される。更なる実施態様では、ａとｂの合計及びｃとｄの合計は同じである。例えば、いくつかの実施態様では、ａとｂの合計及びｃとｄの合計はどちらも同じ整数であり、これらは１４～２４の範囲内であり得る。また更なる実施態様では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、ａとｂの合計及びｃとｄの合計が１２以上となるように選択される。
式（Ｉ）のいくつかの実施態様では、ｅは１である。他の実施態様では、ｅは２である。
式（Ｉ）のＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａにおける置換基は、特に限定されない。いくつかの実施態様では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａは、各場所においてＨである。いくつかの他の実施態様では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａの少なくとも１つは、Ｃ１～Ｃ１２アルキルである。いくつかの他の実施態様では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａの少なくとも１つは、Ｃ１～Ｃ８アルキルである。いくつかの他の実施態様では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａの少なくとも１つは、Ｃ１～Ｃ６アルキルである。前記の実施態様のいくつかにおいて、Ｃ１～Ｃ８アルキルはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシル、又はｎ－オクチルである。
式（Ｉ）のいくつかの実施態様では、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各場所においてＣ１～Ｃ１２アルキルである。
式（Ｉ）の更なる実施態様では、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂの少なくとも１つはＨであるか、又はＲ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂは各場所においてＨである。
式（Ｉ）のいくつかの実施態様では、Ｒ１ｂは、それが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成している。前記の他の実施態様では、Ｒ４ｂは、それが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成している。
式（Ｉ）のＲ５及びＲ６における置換基は、前記の実施態様において特に限定されない。いくつかの実施態様では、Ｒ５又はＲ６の一方又は両方がメチルである。いくつかの他の実施態様では、Ｒ５又はＲ６の一方又は両方がシクロアルキル、例えばシクロヘキシルである。これらの実施態様では、シクロアルキルは、置換されていても、又は置換されていなくてもよい。いくつかの他の実施態様では、シクロアルキルは、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、例えばｔｅｒｔ－ブチルで置換されている。
Ｒ７における置換基は、式（Ｉ）の前記の実施態様において特に限定されない。いくつかの実施態様では、少なくとも１つのＲ７はＨである。いくつかの実施態様では、Ｒ７はは各場所においてＨである。いくつかの他の実施態様では、Ｒ７はＣ１～Ｃ１２アルキルである。
式（Ｉ）のいくつかの他の前記の実施態様において、Ｒ８又はＲ９の一方はメチルである。他の実施態様では、Ｒ８及びＲ９のどちらもメチルである。
式（Ｉ）のいくつかの異なる実施態様では、Ｒ８及びＲ９は、それらが付着している窒素原子と一緒に、５、６又は７員環ヘテロ環を形成している。前記のいくつかの実施態様では、Ｒ８及びＲ９は、それらが付着している窒素原子と一緒に、５員環ヘテロ環、例えばピロリジニル環を形成している。
様々な異なる実施態様では、式（Ｉ）の脂質は、以下の表１に示される構造の１つを有する。
Figure 2024540061000009
Figure 2024540061000010

Figure 2024540061000011

Figure 2024540061000012

Figure 2024540061000013

Figure 2024540061000014

Figure 2024540061000015
いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、式（Ｉ）で示される脂質、ヌクレオシド修飾ＲＮＡ、並びに中性脂質、ステロイド、及びＰＥＧ化脂質から選択された１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施態様では、式（Ｉ）で示される脂質は化合物Ｉ－５である。いくつかの実施態様では、式（Ｉ）の脂質は化合物Ｉ－６である。
いくつかの他の実施態様では、ＬＮＰの陽イオン性脂質成分は、式（ＩＩ）
Figure 2024540061000016
（式中、
Ｌ１及びＬ２は、各々独立的に、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ―、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、又は直接結合であり；
Ｇ１は、Ｃ１～Ｃ２アルキレン、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、又は直接結合であり；
Ｇ２は、－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ又は直接結合であり；
Ｇ３は、Ｃ１～Ｃ６アルキレンであり；
Ｒａは、Ｈ又はＣ１～Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、各場所において、独立して、（ａ）Ｈ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか；又は（ｂ）Ｒ１ａはＨ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂは、それが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ１ｂ及びそれらが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成し；
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、各場所において、独立して、（ａ）Ｈ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか；又は（ｂ）Ｒ２ａは、Ｈ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂは、それが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ２ｂ及びそれらが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成し；
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、各場所において、独立して、（ａ）Ｈ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか；又は（ｂ）Ｒ３ａは、Ｈ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂは、それが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ３ｂ及びそれらが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成し；
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各場所において、独立して、（ａ）Ｈ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか；又は（ｂ）Ｒ４ａは、Ｈ若しくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂは、それが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成し；
Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、Ｈ又はメチルであり；
Ｒ７は、Ｃ４～Ｃ２０アルキルであり；
Ｒ８及びＲ９は、各々独立して、Ｃ１～Ｃ１２アルキルであるか；又は、Ｒ８及びＲ９は、それらが付着している窒素原子と一緒に、５、６又は７員環ヘテロ環を形成し；
ａ、ｂ、ｃ及びｄは、各々独立して、１～２４の整数であり；そして
ｘは０、１又は２である）
で示される構造、又はその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグ若しくは立体異性体を有する。
式（ＩＩ）のいくつかの実施態様では、Ｌ１及びＬ２は、各々独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、又は直接結合である。他の実施態様では、Ｇ１及びＧ２は、各々独立して、－（Ｃ＝Ｏ）－又は直接結合である。いくつかの異なる実施態様では、Ｌ１及びＬ２は、各々独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、又は直接結合であり；Ｇ１及びＧ２は、各々独立して、－（Ｃ＝Ｏ）－又は直接結合である。
式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施態様では、Ｌ１及びＬ２は、各々独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲａＳ（Ｏ）ｘＮＲａ－、－ＮＲａＳ（Ｏ）ｘ－、又は－Ｓ（Ｏ）ｘＮＲａ－である。
式（ＩＩ）の前記の他の実施態様では、脂質化合物は、以下の構造（ＩＩＡ）又は（ＩＩＢ）：
Figure 2024540061000017
の１つを有する。
式（ＩＩ）のいくつかの実施態様では、脂質化合物は、構造（ＩＩＡ）を有する。他の実施態様では、脂質化合物は構造（ＩＩＢ）を有する。
式（ＩＩ）の前記のいずれかの実施態様では、Ｌ１又はＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施態様では、Ｌ１及びＬ２の各々は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。
式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施態様では、Ｌ１又はＬ２の一方は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。例えば、いくつかの実施態様では、Ｌ１及びＬ２の各々は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
式（ＩＩ）の異なる実施態様では、Ｌ１又はＬ２の一方は、直接結合である。本明細書において使用する「直接結合」は、基（例えばＬ１又はＬ２）が存在しないことを意味する。例えば、いくつかの実施態様では、Ｌ１及びＬ２の各々は直接結合である。
式（ＩＩ）の他の異なる実施態様では、Ｒ１ａ及びＲ１ｂの少なくとも１つの存在について、Ｒ１ａはＨ又はＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂは、それが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成している。
式（ＩＩ）の更に他の異なる実施態様では、Ｒ４ａ及びＲ４ｂの少なくとも１つの存在について、Ｒ４ａは、Ｈ又はＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂは、それが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ４ｂ及びそれらが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成している。
式（ＩＩ）の更なる実施態様では、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの少なくとも１つの存在について、Ｒ２ａは、Ｈ又はＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂは、それが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成している。
式（ＩＩ）の他の異なる実施態様では、Ｒ３ａ及びＲ３ｂの少なくとも１つの存在について、Ｒ３ａは、Ｈ又はＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂは、それが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ３ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成している。
式（ＩＩ）の様々な他の実施態様では、脂質化合物は、以下の構造（ＩＩＣ）又は（ＩＩＤ）：
Figure 2024540061000018
（式中、
ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、各々独立して、１～１２の整数である）
の１つを有する。
式（ＩＩ）のいくつかの実施態様では、脂質化合物は、構造（ＩＩＣ）を有する。他の実施態様では、脂質化合物は、構造（ＩＩＤ）を有する。
構造（ＩＩＣ）又は（ＩＩＤ）の様々な実施態様では、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは各々独立して、４～１０の整数である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施態様では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは各々独立して、２～１２の整数又は４～１２の整数である。他の実施態様では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは各々独立して、８～１２又は５～９の整数である。いくつかの実施態様では、ａは０である。いくつかの実施態様では、ａは１である。他の実施態様では、ａは２である。更なる実施態様では、ａは３である。更に他の実施態様では、ａは４である。いくつかの実施態様では、ａは５である。他の実施態様では、ａは６である。更なる実施態様では、ａは７である。更に他の実施態様では、ａは８である。いくつかの実施態様では、ａは９である。他の実施態様では、ａは１０である。更なる実施態様では、ａは１１である。更に他の実施態様では、ａは１２である。いくつかの実施態様では、ａは１３である。他の実施態様では、ａは１４である。更なる実施態様では、ａは１５である。更に他の実施態様では、ａは１６である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施態様では、ｂは１である。他の実施態様では、ｂは２である。更なる実施態様では、ｂは３である。更に他の実施態様では、ｂは４である。いくつかの実施態様では、ｂは５である。他の実施態様では、ｂは６である。更なる実施態様では、ｂは７である。更に他の実施態様では、ｂは８である。いくつかの実施態様では、ｂは９である。他の実施態様では、ｂは１０である。更なる実施態様では、ｂは１１である。更に他の実施態様では、ｂは１２である。いくつかの実施態様では、ｂは１３である。他の実施態様では、ｂは１４である。更なる実施態様では、ｂは１５である。更に他の実施態様では、ｂは１６である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施態様では、ｃは１である。他の実施態様では、ｃは２である。更なる実施態様では、ｃは３である。更に他の実施態様では、ｃは４である。いくつかの実施態様では、ｃは５である。他の実施態様では、ｃは６である。更なる実施態様では、ｃは７である。更に他の実施態様では、ｃは８である。いくつかの実施態様では、ｃは９である。他の実施態様では、ｃは１０である。更なる実施態様では、ｃは１１である。更に他の実施態様では、ｃは１２である。いくつかの実施態様では、ｃは１３である。他の実施態様では、ｃは１４である。更なる実施態様では、ｃは１５である。更に他の実施態様では、ｃは１６である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施態様では、ｄは０である。いくつかの実施態様では、ｄは１である。他の実施態様では、ｄは２である。更なる実施態様では、ｄは３である。更に他の実施態様では、ｄは４である。いくつかの実施態様では、ｄは５である。他の実施態様では、ｄは６である。更なる実施態様では、ｄは７である。更に他の実施態様では、ｄは８である。いくつかの実施態様では、ｄは９である。他の実施態様では、ｄは１０である。更なる実施態様では、ｄは１１である。更なる他の実施態様では、ｄは１２である。いくつかの実施態様では、ｄは１３である。他の実施態様では、ｄは１４である。更なる実施態様では、ｄは１５である。更に他の実施態様では、ｄは１６である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施態様では、ｅは１である。他の実施態様では、ｅは２である。更なる実施態様では、ｅは３である。更に他の実施態様では、ｅは４である。いくつかの実施態様では、ｅは５である。他の実施態様では、ｅは６である。更なる実施態様では、ｅは７である。更に他の実施態様では、ｅは８である。いくつかの実施態様では、ｅは９である。他の実施態様では、ｅは１０である。更なる実施態様では、ｅは１１である。更に他の実施態様では、ｅは１２である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施態様では、ｆは１である。他の実施態様では、ｆは２である。更なる実施態様では、ｆは３である。更に他の実施態様では、ｆは４である。いくつかの実施態様では、ｆは５である。他の実施態様では、ｆは６である。更なる実施態様では、ｆは７である。更に他の実施態様では、ｆは８である。いくつかの実施態様では、ｆは９である。他の実施態様では、ｆは１０である。更なる実施態様では、ｆは１１である。更に他の実施態様では、ｆは１２である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施態様では、ｇは１である。他の実施態様では、ｇは２である。更なる実施態様では、ｇは３である。更に他の実施態様では、ｇは４である。いくつかの実施態様では、ｇは５である。他の実施態様では、ｇは６である。更なる実施態様では、ｇは７である。更に他の実施態様では、ｇは８である。いくつかの実施態様では、ｇは９である。他の実施態様では、ｇは１０である。更なる実施態様では、ｇは１１である。更に他の実施態様では、ｇは１２である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施態様では、ｈは１である。他の実施態様では、ｅは２である。更なる実施態様では、ｈは３である。更に他の実施態様では、ｈは４である。いくつかの実施態様では、ｅは５である。他の実施態様では、ｈは６である。更なる実施態様では、ｈは７である。更に他の実施態様では、ｈは８である。いくつかの実施態様では、ｈは９である。他の実施態様では、ｈは１０である。更なる実施態様では、ｈは１１である。更に他の実施態様では、ｈは１２である。
式（ＩＩ）のいくつかの他の様々な実施態様では、ａ及びｄは同じである。いくつかの他の実施態様では、ｂ及びｃは同じである。いくつかの他の具体的な実施態様では、ａ及びｄは同じであり、ｂ及びｃは同じである。
式（ＩＩ）のａとｂの合計、及びｃとｄの合計は、所望の特性を有している脂質が得られるように変更してもよい係数である。１つの実施態様では、ａ及びｂは、それらの合計が、１４～２４の範囲の整数となるように選択される。他の実施態様では、ｃ及びｄは、それらの合計が、１４～２４の範囲の整数となるように選択される。更なる実施態様では、ａとｂの合計、及びｃとｄの合計は同じである。例えば、いくつかの実施態様では、ａとｂの合計、及びｃとｄの合計はどちらも、同じ整数であり、これは１４～２４の範囲であり得る。また更なる実施態様では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、ａとｂの合計、及びｃとｄの合計が１２以上になるように選択される。
式（ＩＩ）のＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａにおける置換基は、特に限定されない。いくつかの実施態様では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａの少なくとも１つは、Ｈである。いくつかの実施態様では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａは各場所においてＨである。いくつかの実施態様では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａの少なくとも１つは、Ｃ１～Ｃ１２アルキルである。いくつかの他の実施態様では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａの少なくとも１つは、Ｃ１～Ｃ８アルキルである。いくつかの他の実施態様では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａの少なくとも１つは、Ｃ１～Ｃ６アルキルである。前記の実施態様のいくつかにおいて、Ｃ１～Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシル、又はｎ－オクチルである。
式（ＩＩ）のいくつかの実施態様では、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各場所においてＣ１～Ｃ１２アルキルである。
式（ＩＩ）の更なる実施態様では、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂの少なくとも１つはＨであるか、又はＲ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂは各場所においてＨである。
式（ＩＩ）のいくつかの実施態様では、Ｒ１ｂは、それが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成している。前記の他の実施態様では、Ｒ４ｂは、それが結合している炭素原子と一緒に、隣接しているＲ４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒に、炭素－炭素二重結合を形成している。
式（ＩＩ）のＲ５及びＲ６における置換基は、前記の実施態様において特に限定されない。いくつかの実施態様では、Ｒ５又はＲ６の一方はメチルである。他の実施態様では、Ｒ５又はＲ６の一方はメチルである。
式（ＩＩ）のＲ７における置換基は、前記の実施態様において特に限定されない。いくつかの実施態様では、Ｒ７は、Ｃ６～Ｃ１６アルキルである。いくつかの他の実施態様では、Ｒ７は、Ｃ６～Ｃ９アルキルである。これらの中のいくつかの実施態様では、Ｒ７は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲｂ、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－ＯＲｂ、－Ｓ（Ｏ）ｘＲｂ、－Ｓ－ＳＲｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｂ、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、－ＮＲａＲｂ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲｂ、－ＮＲａＳ（Ｏ）ｘＲａＲｂ、－ＮＲａＳ（Ｏ）ｘＲｂ、又は－Ｓ（Ｏ）ｘＲａＲｂを用いて置換され、ここでのＲａは、Ｈ又はＣ１～Ｃ１２アルキルであり；Ｒｂは、Ｃ１～Ｃ１５アルキルであり；ｘは０、１又は２である。例えば、いくつかの実施態様では、Ｒ７は、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｂ又は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｂを用いて置換されている。
式（ＩＩ）の様々な前記の実施態様では、Ｒｂは、分枝Ｃ１～Ｃ１５アルキルである。例えば、いくつかの実施態様では、Ｒｂは、以下の構造：
Figure 2024540061000019
の１つを有する。
式（ＩＩ）のいくつかの他の前記の実施態様では、Ｒ８又はＲ９の一方はメチルである。他の実施態様では、Ｒ８及びＲ９のどちらもメチルである。
式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施態様では、Ｒ８及びＲ９は、それらが付着している窒素原子と一緒に、５、６又は７員環ヘテロ環を形成している。前記のいくつかの実施態様では、Ｒ８及びＲ９は、それらが付着している窒素原子と一緒に、５員環ヘテロ環、例えばピロリジニル環を形成している。前記のいくつかの異なる実施態様では、Ｒ８及びＲ９は、それらが付着している窒素原子と一緒に、６員環ヘテロ環、例えばピペラジニル環を形成している。
式（ＩＩ）の前記の脂質の更に他の実施態様では、Ｇ３は、Ｃ２～Ｃ４アルキレン、例えばＣ３アルキレンである。
様々な異なる実施態様では、脂質化合物は以下の表２に示される構造の１つを有する。
Figure 2024540061000020
Figure 2024540061000021

Figure 2024540061000022

Figure 2024540061000023

Figure 2024540061000024

Figure 2024540061000025

Figure 2024540061000026
いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、式（ＩＩ）の脂質、ヌクレオシド修飾ＲＮＡ、並びに中性脂質、ステロイド及びＰＥＧ化脂質から選択された１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施態様では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－９である。いくつかの実施態様では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－１０である。いくつかの実施態様では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－１１である。いくつかの実施態様では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－１２である。いくつかの実施態様では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－３２である。
いくつかの他の実施態様では、ＬＮＰの陽イオン性脂質成分は、以下の式（ＩＩＩ）：
（ＩＩＩ）
（式中、
Ｌ１又はＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、又は－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、そしてＬ１又はＬ２の他方は、－Ｏ（＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、又は－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－又は直接結合であり；
Ｇ１及びＧ２は、各々独立して、置換されていないＣ１～Ｃ１２アルキレン、又はＣ１～Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３は、Ｃ１～Ｃ２４アルキレン、Ｃ１～Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルケニレンであり；
Ｒａは、Ｈ又はＣ１～Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、Ｃ６～Ｃ２４アルキル又はＣ６～Ｃ２４アルケニルであり；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４、又は－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり；
Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ５は、Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり；そして
ｘは、０、１又は２である）
で示される構造、又はその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグ、若しくは立体異性体を有する。
式（ＩＩＩ）の前記のいくつかの実施態様では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＡ）又は（ＩＩＩＢ）：
Figure 2024540061000027
（式中、
Ａは、３～８員環シクロアルキル環又はシクロアルキレン環であり；
Ｒ６は、各場所において、独立して、Ｈ、ＯＨ、又はＣ１～Ｃ２４アルキルであり；
ｎは、１～１５の範囲の整数である）
の１つを有する。
式（ＩＩＩ）の前記のいくつかの実施態様では、脂質は構造（ＩＩＩＡ）を有し、他の実施態様では、脂質は構造（ＩＩＩＢ）を有する。
式（ＩＩＩ）の他の実施態様では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＣ）又は（ＩＩＩＤ）：
Figure 2024540061000028
（式中、
ｙ及びｚは各々独立して、１～１２の範囲の整数である）
の１つを有する。
式（ＩＩＩ）の前記のいずれかの実施態様では、Ｌ１又はＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施態様では、Ｌ１及びＬ２の各々は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。前記のいずれかのいくつかの異なる実施態様では、Ｌ１及びＬ２は、各々独立して、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－又は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施態様では、Ｌ１及びＬ２の各々は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
式（ＩＩＩ）のいくつかの異なる実施態様では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＥ）又は（ＩＩＩＦ）：
Figure 2024540061000029
の１つを有する。
式（ＩＩＩ）の前記のいくつかの実施態様では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＧ）、（ＩＩＩＨ）、（ＩＩＩＩ）、又は（ＩＩＩＪ）：
Figure 2024540061000030
の１つを有する。
式（ＩＩＩ）の前記のいくつかの実施態様では、ｎは２～１２、例えば２～８又は２～４の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施態様では、ｎは３、４、５又は６である。いくつかの実施態様では、ｎは３である。いくつかの実施態様では、ｎは４である。いくつかの実施態様では、ｎは５である。いくつかの実施態様では、ｎは６である。
式（ＩＩＩ）の前記のいくつかの他の実施態様では、ｙ及びｚは各々独立して、２～１０の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施態様では、ｙ及びｚは、各々独立して、４～９又は４～６の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）の前記のいくつかの実施態様では、Ｒ６はＨである。他の前記の実施態様では、Ｒ６はＣ１～Ｃ２４アルキルである。他の実施態様では、Ｒ６はＯＨである。
式（ＩＩＩ）のいくつかの実施態様では、Ｇ３は、置換されていない。他の実施態様では、Ｇ３は置換されている。様々な異なる実施態様では、Ｇ３は、鎖状Ｃ１～Ｃ２４アルキレン又は鎖状Ｃ１～Ｃ２４アルケニレンである。
式（ＩＩＩ）のいくつかの他の前記の実施態様では、Ｒ１若しくはＲ２又はその両方が、Ｃ６～Ｃ２４アルケニルである。例えば、いくつかの実施態様では、Ｒ１及びＲ２は各々独立して、以下の構造：
Figure 2024540061000031
（式中、
Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、各場所において、独立して、Ｈ又はＣ１～Ｃ１２アルキルであり；
ａは、２～１２の整数であり、
Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びａは各々、Ｒ１及びＲ２が各々独立して、６～２０個の炭素原子を含むように選択される）
を有する。例えば、いくつかの実施態様では、ａは、５～９又は８～１２の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）のいくつかの前記の実施態様では、Ｒ７ａの少なくとも１つの存在はＨである。例えば、いくつかの実施態様では、Ｒ７ａは、各存在においてＨである。前記の他の異なる実施態様では、Ｒ７ｂの少なくとも１つの存在は、Ｃ１～Ｃ８アルキルである。例えば、いくつかの実施態様では、Ｃ１～Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシル、又はｎ－オクチルである。
式（ＩＩＩ）の異なる実施態様では、Ｒ１若しくはＲ２又はその両方が、以下の構造：
Figure 2024540061000032
の１つを有する。
式（ＩＩＩ）のいくつかの前記の実施態様では、Ｒ３は、ＯＨ、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４、又は－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ４である。いくつかの実施態様では、Ｒ４は、メチル又はエチルである。
様々な異なる実施態様では、式（ＩＩＩ）の陽イオン性脂質は、以下の表３に示される構造の１つを有する。
Figure 2024540061000033
Figure 2024540061000034

Figure 2024540061000035

Figure 2024540061000036

Figure 2024540061000037
いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、式（ＩＩＩ）の脂質、ヌクレオシド修飾ＲＮＡ、並びに中性脂質、ステロイド、及びＰＥＧ化脂質から選択された１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施態様では、式（ＩＩＩ）の脂質は化合物ＩＩＩ－３である。いくつかの実施態様では、式（ＩＩＩ）の脂質は化合物ＩＩＩ－７である。
いくつかの実施態様では、陽イオン性脂質は、ＬＮＰ中に、約３０～約９５モル％の量で存在する。１つの実施態様では、陽イオン性脂質は、ＬＮＰ中に、約３０～約７０モル％の量で存在する。１つの実施態様では、陽イオン性脂質は、ＬＮＰ中に、約４０～約６０モル％の量で存在する。１つの実施態様では、陽イオン性脂質は、ＬＮＰ中に、約５０モル％の量で存在する。１つの実施態様では、ＬＮＰは、陽イオン性脂質のみを含む。
いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、それらの形成中に粒子の形成を安定化させる、１つ以上の追加の脂質を含む。
適切な安定化脂質としては、中性脂質及び陰イオン性脂質が挙げられる。
例示的な陰イオン性脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質に接続された他の陰イオン性修飾基が挙げられるがこれらに限定されない。
例示的な中性脂質としては、例えば、ジエステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアリオイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、及び１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（トランスＤＯＰＥ）が挙げられる。１つの実施態様では、中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。
いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭから選択された中性脂質を含む。様々な実施態様では、陽イオン性脂質（例えば、式（Ｉ）の脂質）と中性脂質のモル比は、約２：１から８：１の範囲である。
様々な実施態様では、ＬＮＰは更に、ステロイド又はステロイド類似体を含む。「ステロイド」は、以下の炭素骨格：
Figure 2024540061000038
を含む化合物である。
いくつかの実施態様では、ステロイド又はステロイド類似体は、コレステロールである。これらの中のいくつかの実施態様では、陽イオン性脂質（例えば式（Ｉ）の脂質）とコレステロールのモル比は、約２：１から１：１の範囲である。
いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、糖脂質（例えばモノシアロガングリオシドＧＭ１）を含む。いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、ステロール、例えばコレステロールを含む。
いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、ポリマーにコンジュゲートした脂質を含む。
いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、ポリエチレングリコール－脂質（ＰＥＧ化脂質）である、追加の安定化させる脂質を含む。適切なポリエチレングリコール－脂質としては、ＰＥＧで修飾されたホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧで修飾されたホスファチジン酸、ＰＥＧで修飾されたセラミド（例えばＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧで修飾されたジアルキルアミン、ＰＥＧで修飾されたジアシルグリセロール、ＰＥＧで修飾されたジアルキルグリセロールが挙げられる。代表的なポリエチレングリコール－脂質としては、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、及びＰＥＧ－ｓ－ＤＭＧが挙げられる。１つの実施態様では、ポリエチレングリコール－脂質は、Ｎ－［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）である。１つの実施態様では、ポリエチレングリコール－脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧである。他の実施態様では、ＬＮＰは、ＰＥＧ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、例えば１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコ－ル）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧスクシネートジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、例えば４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）、又はＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメート、例えばω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバメート又は２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル－Ｎ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバメートを含む。様々な実施態様では、陽イオン性脂質とＰＥＧ化脂質のモル比は、約１００：１から約２５：１の範囲である。
いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、以下の構造（ＩＶ）：
Figure 2024540061000039
（式中、
Ｒ１０及びＲ１１は、各々独立して、１０～３０個の炭素原子を含有している、直鎖又は分枝鎖の、飽和又は不飽和のアルキル鎖であり、ここでのアルキル鎖は場合により、１つ以上のエステル結合によって分断され；そしてｚは、３０～６０の範囲の平均値を有する）
を有するＰＥＧ化脂質、又はその薬学的に許容される塩、互変異性体若しくは立体異性体を含む。
ＰＥＧ化脂質（ＩＶ）の前記のいくつかの実施態様では、Ｒ１０及びＲ１１は、ｚが４２である場合、どちらもｎ－オクタデシルであるわけではない。いくつかの他の実施態様では、Ｒ１０及びＲ１１は、各々独立して、１０～１８個の炭素原子を含有している、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施態様では、Ｒ１０及びＲ１１は、各々独立して、１２～１６個の炭素原子を含有している、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施態様では、Ｒ１０及びＲ１１は、各々独立して、１２個の炭素原子を含有している、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施態様では、Ｒ１０及びＲ１１は、各々独立して、１４個の炭素原子を含有している、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のアルキル鎖である。他の実施態様では、Ｒ１０及びＲ１１は、各々独立して、１６個の炭素原子を含有している、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のアルキル鎖である。また更なる実施態様では、Ｒ１０及びＲ１１は、各々独立して、１８個の炭素原子を含有している、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のアルキル鎖である。また他の実施態様では、Ｒ１０は、１２個の炭素原子を含有している、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のアルキル鎖であり、Ｒ１１は、１４個の炭素原子を含有している、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和のアルキル鎖である。
様々な実施態様では、ｚは、（ＩＩ）のＰＥＧ部分が、約４００～約６０００ｇ/モルの平均分子量を有するように選択される範囲におよぶ。いくつかの実施態様では、ｚの平均値は約４５である。
他の実施態様では、ＰＥＧ化脂質は、以下の構造：
Figure 2024540061000040
（式中、
ｎはＰＥＧ化脂質の平均分子量が約２５００g/モルであるように選択された整数である）
の１つを有する。
いくつかの実施態様では、追加の脂質は、ＬＮＰ中に、約１から約１０モル％の量で存在する。１つの実施態様では、追加の脂質は、ＬＮＰ中に、約１から約５モル％の量で存在する。１つの実施態様では、追加の脂質は、ＬＮＰ中に、約１モル％又は約１．５モル％で存在する。
いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、式（Ｉ）の脂質、ヌクレオシド修飾ＲＮＡ、中性脂質、ステロイド、及びＰＥＧ化脂質を含む。いくつかの実施態様では、式（Ｉ）の脂質は化合物Ｉ－６である。異なる実施態様では、中性脂質はＤＳＰＣである。他の実施態様では、ステロイドはコレステロールである。更に異なる実施態様では、ＰＥＧ化脂質は、化合物ＩＶａである。
いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、１つ以上の標的化部分を含み、これは細胞又は細胞集団にＬＮＰを標的化させることができる。例えば、１つの実施態様では、標的化部分はリガンドであり、これは、ＬＮＰを、細胞表面上に見られる受容体へと指向させる。
いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、１つ以上の内部移行ドメインを含む。例えば、１つの実施態様では、ＬＮＰは、細胞に結合して、ＬＮＰの内部移行を誘導する、１つ以上のドメインを含む。例えば、１つの実施態様では、１つ以上の内部移行ドメインは、細胞表面上に見られる受容体に結合して、ＬＮＰの受容体により媒介される取り込みを誘導する。いくつかの実施態様では、ＬＮＰは、インビボで生体分子に結合することができ、ここでＬＮＰに結合した生体分子は、その後、細胞表面受容体によって認識されることにより、内部移行を誘導することができる。例えば、１つの実施態様では、ＬＮＰは、全身のアポリポタンパク質Ｅに結合し、これにより、ＬＮＰ及び会合したカーゴの取り込みが行なわれる。
他の例示的なＬＮＰ及びそれらの製造は、当技術分野において、例えば米国特許出願公開第２０１２０２７６２０９号明細書、Semple et al., 2010, Nat Biotechnol., 28(2):172-176; Akinc et al., 2010, Mol Ther., 18(7): 1357-1364; Basha et al., 2011, Mol Ther, 19(12): 2186-2200; Leung et al., 2012, J Phys Chem C Nanomater Interfaces, 116(34): 18440-18450; Lee et al., 2012, Int J Cancer., 131(5): E781-90; Belliveau et al., 2012, Mol Ther nucleic Acids, 1: e37; Jayaraman et al., 2012, Angew Chem Int Ed Engl., 51(34): 8529-8533; Mui et al., 2013, Mol Ther Nucleic Acids. 2, e139; Maier et al., 2013, Mol Ther., 21(8): 1570-1578; and Tam et al., 2013, Nanomedicine, 9(5): 665-74（それぞれ、その全体が参照により援用される）に記載されている、
以下の反応スキームは、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の脂質の作製法を示す。
Figure 2024540061000041
式（Ｉ）の脂質（例えば化合物Ａ－５）の実施態様は、一般的な反応スキームＩ（「方法Ａ」）に従って調製され得、ここでのＲは、飽和若しくは不飽和Ｃ１～Ｃ２４アルキル又は飽和若しくは不飽和シクロアルキルであり、ｍは０又は１であり、ｎは１～２４の整数である。一般的な反応スキーム１に言及すると、構造Ａ－１の化合物は、業者から購入しても、又は当業者によく知られた方法に従って調製されてもよい。Ａ－１、Ａ－２及びＤＭＡＰの混合物を、ＤＣＣで処理することにより、ブロミドＡ－３が得られる。ブロミドＡ－３と、塩基（例えばＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）とＮ，Ｎ－ジメチルジアミンＡ－４の混合物を、十分な温度及び時間で加熱することにより、任意の必要な後処理工程又は精製工程後にＡ－５が生成する。
Figure 2024540061000042
式（Ｉ）の化合物（例えば化合物Ｂ－５）の他の実施態様は、一般的な反応スキーム２（「方法Ｂ」）に従って調製され得、ここでのＲは、飽和若しくは不飽和Ｃ１～Ｃ２４アルキル又は飽和若しくは不飽和シクロアルキルであり、ｍは０又は１であり、ｎは１～２４の整数である。一般的な反応スキーム２に示されているように、構造Ｂ－１の化合物は、業者から購入しても、又は当業者によく知られた方法に従って調製されてもよい。Ｂ－１（１等量）の溶液を、酸クロリドＢ－２（１等量）及び塩基（例えばトリエチルアミン）で処理する。粗生成物を、酸化剤（例えばクロロクロム酸ピリジニウム）を用いて処理し、中間生成物Ｂ－３を回収する。その後、粗Ｂ－３、酸（例えば酢酸）、及びＮ，Ｎ－ジメチルアミノアミンＢ－４の溶液を、還元剤（例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム）を用いて処理することにより、任意の必要な後処理及び／又は精製後にＢ－５が得られる。
出発物質Ａ－１及びＢ－１は、飽和メチレン炭素のみしか含んでいないと上記に示されているが、炭素－炭素二重結合を含む出発物質も、炭素－炭素二重結合を含む化合物の調製のために使用され得ることが注記されるべきである。
Figure 2024540061000043
式（Ｉ）の脂質（例えばＣ－７又はＣ９の化合物）の様々な実施態様は、一般的な反応スキーム３（「方法Ｃ」）に従って調製され得、ここでのＲは、飽和若しくは不飽和Ｃ１～Ｃ２４アルキル又は飽和若しくは不飽和シクロアルキルであり、ｍは０又は１であり、ｎは１～２４の整数である。一般的な反応スキーム３に言及すると、構造Ｃ－１の化合物は、業者から購入しても、又は当業者によく知られた方法に従って調製されてもよい。
Figure 2024540061000044
式（ＩＩ）の化合物（例えばＤ－５及びＤ－７の化合物）の実施態様は、一般的な反応スキーム４（「方法Ｄ」）に従って調製され得、ここでのＲ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１、Ｌ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、本明細書において定義されている通りであり、Ｒ７’は、Ｒ７又はＣ３～Ｃ１９シクロアルキルを示す。一般的な反応スキーム１に言及すると、Ｄ－１及びＤ－２の構造の化合物は、業者から購入しても、又は当業者によく知られた方法に従って調製されてもよい。Ｄ－１及びＤ－２の溶液を、還元剤（例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム）を用いて処理することにより、任意の必要な後処理の後にＤ－３が得られる。Ｄ－３と塩基（例えばトリメチルアミン、ＤＭＡＰ）の溶液を、塩化アシルＤ－４（又はカルボン酸及びＤＣＣ）を用いて処理することにより、任意の必要な後処理及び／又は精製後にＤ－５が得られる。Ｄ－５を、Ｄ－６のＬｉＡｌＨ４を用いて還元することにより、任意の必要な後処理及び／又は精製後にＤ－７が得られる。
Figure 2024540061000045
式（ＩＩ）の脂質（例えばＥ－５の化合物）の実施態様は、一般的な反応スキーム５（「方法Ｅ」）に従って調製され得、ここでのＲ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１、Ｌ２、Ｇ３、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、本明細書において定義されている通りである。一般的な反応スキーム２に言及すると、Ｅ－１及びＥ－２の構造の化合物は業者から購入しても、又は当業者によく知られた方法に従って調製されてもよい。Ｅ－１（過剰）とＥ－２と塩基（例えば炭酸カリウム）の混合物を加熱することにより、任意の必要な後処理後にＥ－３が得られる。Ｅ－３と塩基（例えばトリメチルアミン、ＤＭＡＰ）の溶液を、Ｅ－４の酸クロリド（又はカルボン酸及びＤＣＣ）を用いて処理することにより、任意の必要な後処理及び／又は精製後にＥ－５が得られる。
Figure 2024540061000046
一般的な反応スキーム６は、式（ＩＩＩ）の脂質の調製のための例示的な方法（方法Ｆ）を使用して提供する。一般反応スキーム６におけるＧ１、Ｇ３、Ｒ１及びＲ３は、式（ＩＩＩ）について本明細書において定義されている通りであり、Ｇ１’は、Ｇ１より１炭素だけ短い相同体を指す。Ｆ－１の構造の化合物は購入されるか、又は当技術分野において公知の方法に従って調製される。適切な縮合条件下（例えばＤＣＣ）でＦ－１をＦ－２のジオールと反応させることにより、Ｆ３のエステル／アルコールが得られ、これをその後、Ｆ－４のアルデヒドへと酸化（例えばＰＣＣ）することができる。還元アミン化条件下でのＦ－４とアミンＦ－５との反応により、式（ＩＩＩ）の脂質が得られる。
式（ＩＩＩ）の脂質の調製のための様々な代替的な戦略が、当業者には利用可能であることが留意されるべきである。例えば、他の式（ＩＩＩ）の脂質（ここでのＬ１及びＬ２は、エステル以外である）は、適切な出発物質を使用して、類似した方法に従って調製され得る。更に、一般反応スキーム６は、式（ＩＩＩ）（ここでのＧ１及びＧ２は同じである）の脂質の調製を示すが；しかしながら、これは、本発明の必要とされる態様ではなく、上記の反応スキームへの修飾が可能であり、これにより、Ｇ１及びＧ２が異なる化合物が得られる。
本明細書に記載のプロセスにおいて、中間体化合物の官能基は、適切な保護基によって保護される必要があり得ることが当業者によって理解される。このような官能基としては、ヒドロキシ、アミノ、メルカプト、及びカルボン酸が挙げられる。ヒドロキシに適した保護基としては、トリアルキルシリル又はジアリールアルキルシリル（例えば、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリル又はトリメチルシリル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルなどが挙げられる。アミノ、アミジノ、及びグアニジノに適した保護基としては、ｔ－ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが挙げられる。メルカプトに適した保護基としては、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ’’（ここでのＲ’’はアルキル、アリール又はアリールアルキルである）、ｐ－メトキシベンジル、トリチルなどが挙げられる。カルボン酸に適した保護基としては、アルキル、アリール、又はアリールアルキルエステルが挙げられる。保護基は、当業者には公知であり、本明細書に記載されているような、標準的な技術に従って付加又は除去され得る。保護基の使用は、Green, T.W. and P.G.M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 3rd Ed., Wileyに詳述されている。当業者は、保護基は、Ｗａｎｇ樹脂、Ｒｉｎｋ樹脂、又は２－クロロトリチル－クロライド樹脂などのポリマー樹脂であってもよいことを理解している。
医薬組成物
本明細書に記載されている医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において公知であるか又は以後開発された任意の方法によって調製され得る。一般的には、このような調製法は、活性成分を担体又は１つ以上の他の補助成分と合わせる工程、その後、必要であれば又は所望であれば、生成物を所望の単回投与量単位又は複数回投与量単位へと成形又は包装する工程を含む。
本明細書において提供される医薬組成物の説明は、基本的には、ヒトへの倫理的投与に適した医薬組成物に向けられるが、当業者によって、このような組成物は、一般的には全種類の被検体への投与に適していることが理解される。該組成物を、様々な被検体への投与に適したものとするための、ヒトへの投与に適した医薬組成物の修飾は、良く理解され、通常の技能を有する獣医薬理学者は、たとえ行なうとしても、単に通常の実験を行なうだけで、このような修飾を設計及び実施することができる。本発明の医薬組成物の投与が考えられる被検体としては、ヒト及び他の霊長類、哺乳動物、例えば商業的に妥当な哺乳動物、例えばヒト以外の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、及びイヌが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の方法において有用である医薬組成物は、眼内、口腔内、直腸、膣内、非経口、局所、肺内、鼻腔内、頬側、静脈内、脳室内、皮内、筋肉内、又は別の投与経路に適した製剤で調製、包装、又は販売され得る。他の考えられる製剤としては、射出されたナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有しているリシールされた赤血球、及び免疫原性に基づいた製剤が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、原末で、１回単位用量として、又は複数の１回単位用量として、調製されても、包装されても、又は販売されてもよい。本明細書において使用する「単位用量」は、所定の量の活性成分を含む、個別の量の医薬組成物である。活性成分の量は一般的には、被検体に投与されるであろう活性成分の用量、又は、このような用量の都合の良い割合、例えばこのような用量の半分若しくは３分の１に等価である。
本発明の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、及び任意の追加の成分の相対量は、処置される被検体の正体、体格、及び条件に応じて、そして更に、該組成物が投与される予定の経路に応じて変更される。例えば、該組成物は、０．１％～１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
活性成分に加えて、本発明の医薬組成物は更に、１つ以上の追加の薬学的に活性な物質を含み得る。
本発明の医薬組成物の徐放性製剤又は持続放出製剤は、従来の技術を使用して作製され得る。
本明細書において使用する医薬組成物の「非経口投与」は、被検体の組織を物理的に割くことによって特徴付けられる任意の投与経路、及び、組織内の割れ目を通した医薬組成物の投与を含む。したがって、非経口投与は、該組成物の注射による、手術による切開を通した該組成物の適用による、組織を貫通する手術以外の創傷を通した該組成物の適用による、医薬組成物の投与などを含むがこれらに限定されない。特に、非経口投与は、眼内、硝子体内、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、胸骨内注射、腫瘍内、静脈内、脳室内、及び腎透析注入技術を含むと考えられるが、これらに限定されない。
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、滅菌水又は滅菌等張食塩水などの、薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与に又は連続投与に適した剤形で調製、包装、又は販売され得る。注射用製剤は、アンプルなどにおいて単位用量剤形で、又は保存剤を含有しているマルチドーズ容器で調製、包装、又は販売され得る。非経口投与用製剤としては、懸濁剤、液剤、油性若しくは水性ビヒクル中の乳剤、ペースト剤、及び埋め込み可能な持続放出型製剤又は生分解性製剤が挙げられるがこれらに限定されない。このような製剤は更に、懸濁化剤、安定化剤、又は分散剤を含むがこれらに限定されない、１つ以上の追加の成分を含み得る。非経口投与用の製剤の１つの実施態様では、活性成分は、復元された組成物の非経口投与前に、適切なビヒクル（例えば無菌で発熱物質非含有の水）で復元するために、乾燥（すなわち粉末又は顆粒）剤形で提供される。
医薬組成物は、無菌注射用水性又は油性の懸濁剤又は液剤の剤形で、調製、包装又は販売され得る。この懸濁剤又は液剤は、公知の技術に従って製剤化され得、活性成分に加えて、本明細書に記載の追加の成分、例えば分散剤、湿潤剤、又は懸濁化剤を含み得る。このような無菌の注射製剤は、無毒性の非経口で許容可能な希釈剤又は溶剤、例えば水又は１，３－ブタンジオールなどを使用して調製され得る。他の許容可能な希釈剤及び溶剤としては、リンガー液、等張性塩化ナトリウム溶液、及び不揮発性油、例えば合成モノグリセリド又はジグリセリドが挙げられるがこれらに限定されない。有用である他の非経口投与できる製剤としては、微結晶形で、リポソーム調製物で、又は生分解性ポリマー系の一成分として活性成分を含む製剤が挙げられる。持続放出又は埋め込みのための組成物は、薬学的に許容されるポリマー性又は疎水性物質、例えばエマルション、イオン交換樹脂、やや難溶性のポリマー、またはやや難溶性の塩を含み得る。
本発明の医薬組成物は、頬側口腔を介した肺内投与に適した製剤で調製、包装又は販売され得る。このような製剤は、活性成分を含み、かつ約０．５～約７nmの範囲内の直径を有する、乾燥粒子を含み得る。いくつかの実施態様では、該製剤は、活性成分を含み、かつ約１～約６nmの範囲の直径を有する、乾燥粒子を含み得る。このような組成物は簡便には、噴射剤の気流を方向付けて粉末を分散することのできる乾燥粉末レザバーを含む装置を使用した、又は自動噴射性溶媒／粉末施薬容器、例えば密閉容器中の低沸点の噴射剤に溶解若しくは懸濁させた活性成分を含む装置を使用した、投与用の乾燥粉末剤形である。いくつかの実施態様では、このような粉末は粒子を含み、ここでの粒子の少なくとも９８重量％は、０．５nmより大きな直径を有し、粒子の数の少なくとも９５％が、７nmより小さな直径を有する。いくつかの実施態様では、少なくとも９５重量％の粒子が、１nmよりも大きな直径を有し、粒子の数の少なくとも９０％が、６nmよりも小さな直径を有する。いくつかの実施態様では、乾燥粉末組成物は、固体微粉末希釈剤、例えば糖を含み、これは簡便には単位用量剤形で提供される。
低沸点の噴射剤は一般的には、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般的には、噴射剤は、該組成物の５０～９９．９％（ｗ／ｗ）を成し得、活性成分は、該組成物の０．１～２０％（ｗ／ｗ）を成し得る。噴射剤は更に、液体の非イオン性の若しくは固体の陰イオン性の界面活性剤、又は固体の希釈剤（場合によっては、活性成分を含む粒子と同じ次元の粒径を有する）などの、追加の成分を含み得る。
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、滅菌水又は滅菌等張食塩水などの、薬学的に許容される担体と配合された活性成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与に又は連続投与に適した剤形で調製、包装、又は販売され得る。注射用製剤は、アンプルなどにおいて単位用量剤形で、又は保存剤を含有しているマルチドーズ容器で調製、包装、又は販売され得る。非経口投与用製剤としては、懸濁剤、液剤、油性若しくは水性ビヒクル中の乳剤、ペースト剤、及び埋め込み可能な持続放出型又は生分解性製剤が挙げられるがこれらに限定されない。このような製剤は更に、懸濁化剤、安定化剤、又は分散剤を含むがこれらに限定されない、１つ以上の追加の成分を含み得る。非経口投与用の製剤の１つの実施態様では、活性成分は、復元された組成物の非経口投与前に、適切なビヒクル（例えば無菌で発熱物質非含有の水）で復元するために、乾燥（すなわち粉末又は顆粒）剤形で提供される。
医薬組成物は、無菌注射用水性又は油性の懸濁剤又は液剤の剤形で、調製、包装又は販売され得る。この懸濁剤又は液剤は、公知の技術に従って製剤化され得、活性成分に加えて、本明細書に記載の追加の成分、例えば分散剤、湿潤剤、又は懸濁化剤を含み得る。このような無菌の注射製剤は、無毒性の非経口で許容可能な希釈剤又は溶剤、例えば水又は１，３－ブタンジオールなどを使用して調製され得る。他の許容可能な希釈剤及び溶剤としては、リンガー液、等張性塩化ナトリウム溶液、及び不揮発性油、例えば合成モノグリセリド又はジグリセリドが挙げられるがこれらに限定されない。有用である他の非経口投与できる製剤としては、微結晶形で、リポソーム調製物で、又は生分解性ポリマー系の一成分として活性成分を含む製剤が挙げられる。持続放出又は埋め込みのための組成物は、薬学的に許容されるポリマー性又は疎水性物質、例えばエマルション、イオン交換樹脂、やや難溶性のポリマー、またはやや難溶性の塩を含み得る。
治療法又は予防法
本発明は、ノロウイルスＶＰ１抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子（例えばヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ分子）、又はノロウイルスＶＰ１抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子（例えばヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ分子）を含む組成物（例えばＬＮＰ）の有効量を投与することを含む、対象においてノロウイルスに対して適応免疫応答を誘導する方法を提供する。
１つの実施態様では、前記方法は、対象において、複数のノロウイルス株、ノロウイルス感染、又はノロウイルスに関連した疾患若しくは障害（胃腸炎、食中毒、嘔吐及び下痢を含むがこれらに限定されない）に対して免疫を提供する。したがって、本発明は、ノロウイルスに関連した感染、疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供する。
１つの実施態様では、前記組成物は、ノロウイルスに関連した感染、疾患又は障害を有する対象に投与される。１つの実施態様では、該組成物は、ノロウイルスに関連した感染、疾患又は障害を発症するリスクのある対象に投与される。例えば、該組成物は、ノロウイルスに接触するリスクのある対象に投与されてもよい。１つの実施態様では、該組成物は、ノロウイルスが流行している地理的地域に住んでいるか、旅行したか、又は旅行することが予想される対象に投与される。ワクチン投与に関心の高い集団としては、小児（例えば、５歳以下）、軍人、クルーズ船のスタッフ及び乗客、長期介護施設のスタッフ及び居住者（高齢者介護施設、児童保護施設、学校）、食品取扱業者、並びに旅行中の対象が挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施態様では、該組成物は、ノロウイルスが流行している地理的地域に住んでいるか、旅行したか、又は旅行することが予想される他人と接触しているか又は接触すると予想される対象に投与される。１つの実施態様では、該組成物は、職業又は他の接触を通して、ノロウイルスに曝されることが分かっている対象に投与される。
１つの実施態様では、前記方法は、１つ以上のノロウイルス抗原をコードする１つ以上のヌクレオシド修飾核酸分子を含む組成物を投与することを含む。１つの実施態様では、該方法は、１つ以上のノロウイルス抗原をコードする第一のヌクレオシド修飾核酸分子と、１つ以上のノロウイルス抗原をコードする第二のヌクレオシド修飾核酸分子とを含む組成物を投与することを含む。１つの実施態様では、該方法は、本明細書に記載の複数のノロウイルス抗原をコードする１つ以上のヌクレオシド修飾核酸分子を含む組成物を投与することを含む。
１つの実施態様では、前記方法は、１つ以上の組成物を投与することを含み、各組成物は、１つ以上のノロウイルス抗原をコードする、１つ以上のヌクレオシド修飾核酸分子を含む。１つの実施態様では、該方法は、１つ以上のノロウイルス抗原をコードする１つ以上のヌクレオシド修飾核酸分子を含む第一の組成物を投与すること、並びに、１つ以上のノロウイルス抗原をコードする１つ以上のヌクレオシド修飾核酸分子を含む第二の組成物を投与することを含む。１つの実施態様では、該方法は、複数の組成物を投与することを含み、各組成物は、本明細書に記載の１つ以上のノロウイルス抗原をコードする１つ以上のヌクレオシド修飾核酸分子を含む。いくつかの実施態様では、該方法は、複数の組成物の時間差投与を含む。
いくつかの実施態様では、前記方法は、複数のノロウイルス抗原、アジュバント、又はその組合せをコードする、複数のヌクレオチド修飾核酸分子を対象に投与することを含む。
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、投与後少なくとも数日間、本明細書に記載のノロウイルス抗原又はアジュバントの持続的発現を可能とする。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、投与後少なくとも２週間、本明細書に記載のノロウイルス抗原又はアジュバントの持続的発現を可能とする。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、投与後少なくとも１か月間、本明細書に記載のノロウイルス抗原又はアジュバントの持続的発現を可能とする。しかしながら、該方法は、いくつかの実施態様では、一過性発現も与える。なぜなら、いくつかの実施態様では、核酸は、被検体のゲノムに組み込まれないからである。
いくつかの実施態様では、前記方法は、本明細書に記載のノロウイルス抗原又はアジュバントの安定な発現をもたらす、ヌクレオシド修飾ＲＮＡを投与することを含む。いくつかの実施態様では、ヌクレオシド修飾ＲＮＡの投与により、効果的な適応免疫応答が誘導されるが、自然免疫応答は殆ど又は全く起こらない。
いくつかの実施態様では、前記方法はノロウイルスに対する持続的な防御を与える。例えば、いくつかの実施態様では、該方法は、２週間以上、ノロウイルスに対する持続的な防御を与える。いくつかの実施態様では、該方法は、１か月以上、ノロウイルスに対する持続的な防御を与える。いくつかの実施態様では、該方法は、２か月間以上、ノロウイルスに対する持続的な防御を与える。いくつかの実施態様では、該方法は、３か月間以上、ノロウイルスに対する持続的な防御を与える。いくつかの実施態様では、該方法は、４か月間以上、ノロウイルスに対する持続的な防御を与える。いくつかの実施態様では、該方法は、５か月間以上、ノロウイルスに対する持続的な防御を与える。いくつかの実施態様では、該方法は、６か月間以上、ノロウイルスに対する持続的な防御を与える。いくつかの実施態様では、該方法は、１年間以上、ノロウイルスに対する持続的な防御を与える。
１つの実施態様では、前記組成物の１回の免疫化は、１か月間以上、２か月間以上、３か月間以上、４か月間以上、５か月間以上、６か月間以上、又は１年間以上、ノロウイルスに対する持続的な防御を誘導する。
処置法における本発明の組成物の投与は、当技術分野において公知である方法を使用して、多くの異なる方法で成し遂げられ得る。１つの実施態様では、本発明の方法は、例えば経腸投与又は非経口投与を含む、対象の全身投与を含む。いくつかの実施態様では、該方法は、該組成物の皮内送達を含む。別の実施態様では、該方法は、該組成物の静脈内送達を含む。いくつかの実施態様では、該方法は、該組成物の筋肉内送達を含む。１つの実施態様では、該方法は、該組成物の皮下投与を含む。１つの実施態様では、該方法は、該組成物の吸入を含む。１つの実施態様では、該方法は、該組成物の鼻腔内送達を含む。
本発明の組成物は、単独で又は別の物質と併用してのいずれかで対象に投与され得ることが理解される。
したがって、本発明の治療法及び予防法は、本発明の方法を実施するための、本明細書に記載のノロウイルス抗原、アジュバント、又はその組合せをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子（例えばヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ分子）を含む、医薬組成物の使用を包含する。本発明を実施するのに有用な医薬組成物は、１ng/kg/日から１００mg/kg/日の用量が送達されるように投与され得る。１つの実施態様では、本発明は、哺乳動物において１０nMから１０μMの本発明の化合物の濃度をもたらす、用量の投与を想定する。
典型的には、本発明の方法においてヒトなどの哺乳動物に投与され得る用量は、０．０１μg/kgから約５０mg/kg（哺乳動物の体重）の量の範囲であるが、投与される正確な用量は、哺乳動物の種類及び処置される疾患状態の種類、哺乳動物の年齢、並びに投与経路を含むがこれらに限定されない、任意の数の要因に応じて変更される。いくつかの実施態様では、該化合物の用量は、約０．１μg/kgから約１０mg/kg（哺乳動物の体重）まで変化する。いくつかの実施態様では、用量は、約１μg/kgから約１mg/kg（哺乳動物の体重）まで変化する。
前記組成物は、１日数回という高い頻度で哺乳動物に投与されても、あるいは、より低い頻度で、例えば１日１回、週１回、２週間毎に１回、月１回、又は更に低い頻度で、例えば数か月間に１回、数年間に１回、又は更に低い頻度で、例えば１０～２０年間毎に１回、１５～３０年間毎に１回、又は更に低い頻度で、例えば５０～１００年毎に１回、投与されてもよい。用量の頻度は、当業者には容易に明らかであるし、そして処置される疾患の種類及び重症度、哺乳動物の種類及び年齢などを含むがこれらに限定されない、任意の数の要因に依存する。
いくつかの実施態様では、本発明の免疫原性組成物若しくはワクチンの投与は、単回投与によって実施されても、又は複数回の投与によってブーストされてもよい。
実験的実施例
本発明は、以下の実験的実施例への参照によって、更に詳述されている。これらの実施例は、単に説明のために提供され、特記されない限り限定するものではない。したがって、本発明は、いずれにしても、以下の実施例に限定されていると捉えられるべきではなく、むしろ、本明細書に提供された教示の結果として明らかになった任意及び全ての改変を包含すると解されるべきである。
更に説明することなく、当業者は、先行する説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明を作製及び利用し、特許請求された方法を実践することができると考えられる。それ故、以下のデータの裏付けられた実施例は、いずれにしても、残りの開示部分を限定するものと捉えられるべきではない。
実施例１：ノロウイルス用のヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチン
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と複合体を形成したヌクレオシド修飾ｍＲＮＡのワクチンプラットフォームを使用して、ノロウイルス用のワクチンを開発した。ノロウイルスワクチンは、複数の遺伝子グループ（ＧＩ．１、ＧＩ．３、ＧＩＩ．３及びＧＩＩ．４）に由来するノロウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１をコードする。ＬＮＰへの封入は、インビボでのヌクレオシド修飾ｍＲＮＡの効率的な送達及び発現を可能とし、そしてウリジンの代わりの１－メチルシュードウリジンヌクレオシド修飾は、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）のその誘導を通した、ｍＲＮＡプラットフォームによって誘導される抗体応答の効力に重要である。ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンは、高いＨＢＧＡ（組織血液型抗原）遮断抗体力価を実証し、ノロウイルス感染からヒトエンテロイドを防御し、強力なＣＤ４陽性応答及びＣＤ８陽性応答を低い用量（０．２５μg）においてさえ誘導した。これらのデータは、ノロウイルスＶＰ１配列に基づいた修飾ヌクレオシドｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンが、インビボにおいて免疫原性であり、そしてインビトロでウイルス感染を遮断する中和抗体を生じるという実証概念を提供する。ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンは、低い用量において極めて効果的であり、高度に拡大縮小可能な製造を受け入れられる非複製ベクターであり；それ故、それは、ノロウイルスに対して人々を免疫化するための世界規模の公衆衛生キャンペーンに使用されるのに理想的に適している。
ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ－ＬＮＰノロウイルスワクチンは、高力価の遮断抗体、ノロウイルス感染からのヒトエンテロイドの良好な防御を実証し、強力なＣＤ４陽性Ｔ細胞応答及びＣＤ８陽性Ｔ細胞応答を惹起した。これらのデータは、ノロウイルスＶＰ１配列に基づいた修飾ヌクレオシドｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンが、インビボで免疫原性であり、そしてインビトロでウイルス感染を遮断する中和抗体を生じるという概念実証を提供する。
ｍＲＮＡ分子が正しいタンパク質を発現したことを確認するために、２９３Ｔ細胞に、ｍＲＮＡによりコードされるＮｏｒｗａｌｋ１９６８、ＣａｐｅＴｏｗｎ２０１２、Ｓｗｅｄｅｎ２００８、Ａｒｇｅｎｔｉｎａ２０１６、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ２０１６、Ｃａｎａｄａ２０１９、ＵＫ２０１５、ＵＳＡ２０１１又はＪａｐａｎ２００９をトランスフェクトした。２４時間後に細胞を収集し、ＧＩ．１、ＧＩＩ．４、ＧＩ．３又はＧＩＩ．３キャプシドの発現についてウェスタンブロットによって分析した（図１）。
Ｂａｌｂ／ｃマウス（６～８週令）に、１０μgの空ＬＮＰ又はｍＲＮＡ二価ワクチンを用いて皮内注射によって０日目及び２８日目に２回免疫化した：Norwalk/2011/GI.1は、遺伝子グループＩ株を代表し、CapeTown/2012/GII.4は遺伝子グループＩＩ株を代表する。要するに、遺伝子グループＩ株及びＩＩ株は、ヒトノロウイルス感染の９０％超を占める。図２は、免疫化スキームを詳述する。
ｍＲＮＡ二価ワクチン後のヒトノロウイルス遮断抗体応答
Norwalk1968/GI.1及びSydney2012/GII.4ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に対する血清を、サロゲート中和アッセイにおいて、ＶＬＰと結合リガンドの相互作用を遮断する能力についてスクリーニングした（図３）。ＶＬＰ－リガンド結合を少なくとも５０％遮断しなかった血清には、０．５×ＬＬＤの力価（ＩＤ５０＝２５）が割り当てられ、マーカーは検出限界未満に置かれた（点線）。
ｍＲＮＡ二価ワクチン後のヒトノロウイルス遮断抗体応答
図４は、追加のＶＬＰに対する遮断抗体応答は、ワクチン応答が、遺伝子型特異的であり、試験された遺伝子グループ間（ＧＩ．３、ＧＩ．５、ＧＩＩ．３）には交差反応性が全くないことを実証したことを実証する。ＧＩＩ．４遺伝子型の中で、ＧＩＩ．４／２００９及びＧＩＩ．４／２００２についての遮断抗体力価は、ＧＩＩ．４／２０１２の力価と比べてそれぞれ約２０％及び約５％であり、世界的に優勢なＧＩＩ．４パンデミック遺伝子型内で知られている抗原連続変異と一致している。
Ｔ細胞刺激アッセイ
Ｂａｌｂ／ｃマウス（６～８週令）に、マウス１匹あたり１０μgのｍＲＮＡ二価ワクチン（ＧＩＩ．４／ＣａｐｅＴｏｗｎ２０１２、ＧＩ．１／Ｎｏｗａｌｋ２０１２）を用いて、又は対照としてのｍＲＮＡ－Ｌｕｃを用いて筋肉内注射によって０日目に免疫化した。ｎ＝５／群（図５）。Ｔ細胞刺激アッセイは、ＶＬＰ（ＧＩ．１、ＧＩ．３、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４）を用いて実施された（図６）。
ヒトノロウイルス二価ｍＲＮＡワクチンの用量応答
最適な量の二価ｍＲＮＡワクチンを決定するために、４つの用量（マウス１匹あたり、０．２５、０．５、１又は３μgの各ワクチン）又は対照としてのｍＲＮＡ－Ｌｕｃ（１２μg/マウス）を、２８日間隔で２回マウスに筋肉内（i.m.）注射によって投与した（図７）。血清を、免疫化後０日目、２８日目、５６日目、１５０日目に回収し、そしてサロゲート中和アッセイにおいて評価した。指定された時点において、ｎ＝１０匹／群。遮断抗体の力価は、０．２５μg/マウスという少ない用量でさえ高いレベルである。
低用量のｍＲＮＡワクチンは、強力なＴｈ１応答を誘導する
Ｔｈ１応答を評価するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（６～８週令）を、マウス１匹あたり０．２５μgのｍＲＮＡワクチン（ＧＩＩ．４）を用いて又は対照としてのｍＲＮＡ－Ｌｕｃを用いて筋肉内注射によって、０日目及び２８日目に２回免疫化した（図８）。ブーストから２週間後、脾臓単一細胞懸濁液を、ＧＩＩ．４ペプチドプール（１５アミノ酸長、１１アミノ酸だけ重複している）を用いて、３７℃で５％ＣＯ２で５時間刺激し、フローサイトメトリーによってＴ細胞の活性化について分析した。各群あたりｎ＝１０匹。ＧＩＩ．４ｍＲＮＡ－ＬＮＰを用いてワクチン接種され、かつＧＩＩ．４ペプチドプールを用いて刺激されたマウスから単離された脾臓細胞は、ｍＲＮＡワクチンが、強力なＣＤ４陽性Ｔ細胞応答及びＣＤ８Ｔ細胞応答を惹起したことを実証した。
四価ノロウイルスｍＲＮＡワクチン
ＧＩ．３及びＧＩＩ．３遺伝子型を含む、四価ノロウイルスｍＲＮＡワクチンを開発した。なぜならこれらは、小児ノロウイルス急性胃腸炎のノロウイルス大発生において、最も優勢なＧＩ及びＧＩＩ遺伝子型であるからである。ＧＩ．３／Argentina2016及びＧＩＩ．３/ Canada2019のキャプシドタンパク質ＶＰ１配列が、ＧｅｎＢａｎｋで同定され、プラスミドが設計され、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡが産生された。ＧＩ．１、ＧＩＩ．４、ＧＩ．３及びＧＩＩ．３をコードするｍＲＮＡを、ＬＮＰへの封入前に、エンドトキシンのレベル及びインターフェロンαの活性化について確認した。
Ｂａｌｂ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウス（６～８週令）を、マウス１匹あたり０．１２５、０．２５、０．５、１μgのｍＲＮＡ四価ワクチン（ＧＩＩ．４/CapeTown2012、ＧＩ．１/Nowalk2012、ＧＩ．３/Argentina2016、ＧＩＩ．３/Canada2019）を用いて、又は対照としての空ＬＮＰ（１群あたりｎ＝５）を用いて、筋肉内注射によって０日目及び２８日目に２回免疫化した（図９）。
最適な量の四価ｍＲＮＡワクチンを決定するために、４つの用量（マウス１匹あたり、０．１２５、０．２５、０．５、又は１μgの各ワクチン）又は対照としての空ＬＮＰ（４μg/マウス）を、２８日間隔で２回マウスに筋肉内注射によって投与した（図１０）。空ＬＮＰは、検出限界未満であった（示されていない）。
ヒト腸管エンテロイド
ヒトノロウイルスのための有効な介入の展開に対する大きな障壁は、頑強で再現性あるインビトロ培養系の欠如である。近年の研究者は、ヒト腸管エンテロイド（ＨＩＥ）を開発し、ここでの３次元インビトロ培養液は、ヒト消化管生検材料又は手術標本から単離された腺窩において増殖中の幹細胞に由来する。ＨＩＥ培養液は、腸管上皮の多細胞の複雑性及び組織構成を有する。ＨＩＥは、生理学的に活性であり、正常な消化管の全ての上皮細胞型を含有し、セグメント特異的特性を保持している。
図１１及び図１２は、ＧＩＩ．４に感染させた患者糞便試料に由来する生ヒトノロウイルスを用いた、幹細胞由来ヒト３次元エンテロイドの感染の作用を実証する。ＨＩＥを使用して、ヒトノロウイルス感染をアッセイすることができる。なぜなら、ヒトノロウイルスに感染させたエンテロイドは、ＶＰ１キャプシドタンパク質の存在、及びタイトジャンクションの完全性のマーカーであるＺ０１染色の欠失を示すからである（図１２）。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週令）に、マウス１匹あたり０．２５μgのｍＲＮＡワクチン（ＧＩＩ．４）を用いて又は対照としてのｍＲＮＡ－Ｌｕｃを用いて、筋肉内注射によって０日目及び２８日目に２回免疫化した。ブーストから４週間後、血清を回収し、示された希釈率で希釈し、ヒトノロウイルス陽性糞便試料と共にプレインキュベートし、そして、生検材料に由来するヒト小腸オルガノイドにおけるヒトノロウイルス感染の中和能について分析した。図１３及び図１４は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰのワクチン接種されたマウスに由来する血清によって、ＧＩＩ．４感染に対して、ヒト腸管エンテロイドが防御されることを実証する。
これらのデータは、初回刺激から３０日後の遮断抗体力価が、ヒトノロウイルスに感染した患者に由来する遮断抗体力価より高いか（ＧＩ．１）又は同等（ＧＩＩ．４）であり、遮断抗体は、少なくとも２４０日目まで高い力価で持続可能であり、低用量ｍＲＮＡワクチン（０．２５μg）が、強力なＣＤ４陽性Ｔ細胞応答及びＣＤ８陽性Ｔ細胞応答を惹起し、そして、ワクチン接種されたマウスに由来する血清がヒトノロウイルスを中和し、ＧＩＩ．４感染からヒト腸管エンテロイドを防御したことを実証する。それ故、データは、ノロウイルスＶＰ１配列に基づいた修飾ヌクレオシドｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンが、インビボで免疫原性であり、インビトロでウイルス感染を遮断する中和抗体を生じることを支持する。
実施例２：配列
配列番号１
キャプシドタンパク質ＶＰ１［ヒトノロウイルス／ＧＩ．１／８ＦＩＩａ／１９６８／米国］
ＡＦＪ３８５１６．１
Figure 2024540061000047
配列番号２
［ヒトノロウイルス／ＧＩ．１／ＣＨＡ９Ａ００４＿２０１１０４１９／２０１１／米国］
ＡＧＭ３３２２３．１
Figure 2024540061000048
配列番号３
ＶＰ１［ヒトノロウイルス／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵ］
ＡＦＶ０８７９５．１
Figure 2024540061000049
配列番号４
［ノロウイルスＧＩＩ／ヒト／ＺＡＦ／２０１２／ＧＩＩ．Ｐ４＿ＧＩＩ．４／ＣａｐｅＴｏｗｎ／９７７２］
ＡＬＸ８７３５７．１
Figure 2024540061000050
配列番号５
キャプシドタンパク質［ノロウイルスＧＩ．３］（中国２０１５）
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＲＩ７１１４７．１
Figure 2024540061000051
配列番号６
ＶＰ１［ノロウイルスＧＩ．３］（ヒト／米国／ＧＩ．Ｐｄ－ＧＩ．３／Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ－００４７）
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＺＪ１７７６６．１
Figure 2024540061000052
配列番号７
ＶＰ１［ノロウイルスＧＩＩ．３］英国２０１５
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＷＲ１７５４９．１
Figure 2024540061000053
配列番号８
主要キャプシドタンパク質ＶＰ１［ノロウイルスＧＩＩ］（ヒト／ＧＩＩ．Ｐ１６－ＧＩＩ．３／ＲＵＳ／Ｎｏｖｏｓｉｂｉｒｓｋ／ＮＳ１７－Ａ９９６／２０１７）
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＶＯ６２５７２．１
Figure 2024540061000054
配列番号９
ＶＰ１［ノロウイルスＧＩ］（Ａｒｇｅｎｔｉｎａ２０１６）
ＧｅｎＢａｎｋ：ＱＰＪ５８８３７．１
Figure 2024540061000055
配列番号１０
ＶＰ１［ノロウイルスＧＩＩ］（カナダ２０１９）
ＧｅｎＢａｎｋ：ＱＳＤ５８３８５．１
Figure 2024540061000056
本明細書に引用された個々の及び全ての特許、特許出願、及び刊行物の開示は、本明細書によりその全体が参照により本明細書に援用される。本発明は、具体的な実施態様を参照にして開示されているが、本発明の他の実施態様及び改変物も、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのこのような実施態様及び均等な改変物を包含すると解釈されることを意図する。

Claims (27)

  1. 対象においてノロウイルス（ＮｏＶ）に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、少なくとも１つのＮｏＶ抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を含む、組成物。
  2. ＮｏＶ抗原が、ｐ４８、ヌクレオシド－トリホスファターゼ（ＮＴＰアーゼ）、ｐ２２、ＶＰｇ、プロテアーゼ、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、ＶＰ１、ＶＰ２、それらの断片及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
  3. ＮｏＶ抗原が、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶＩＩＩ、及びＧＩＸからなる遺伝子グループから選択される、請求項１記載の組成物。
  4. 少なくとも２つのＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードするｍＲＮＡ分子の組合せを含む、請求項１記載の組成物であって、該ＶＰ１抗原は、ＧＩ及びＧＩＩからなるＮｏＶ遺伝子グループから選択される、組成物。
  5. 少なくとも２つのＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードするｍＲＮＡ分子の組合せを含む、請求項４記載の組成物であって、該ＶＰ１抗原は、ＧＩ．１、ＧＩ．３、ＧＩ．５、ＧＩＩ．３及びＧＩＩ．４からなる群より選択される、組成物。
  6. ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩ．１抗原をコードするｍＲＮＡ分子と、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩＩ．４抗原をコードするｍＲＮＡ分子との組合せを含む、請求項４記載の組成物。
  7. ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩ．１抗原、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩＩ.４抗原、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩ.３抗原、及びＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩＩ.３抗原の各々をコードするｍＲＮＡ分子の組合せを含む、請求項４記載の組成物。
  8. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を含む、請求項１記載の組成物。
  9. アジュバントを更に含む、請求項１記載の組成物。
  10. ｍＲＮＡ分子が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入されている、請求項１記載の組成物。
  11. ｍＲＮＡ分子が、シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、及び５－メチル－ウリジンからなる群より選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含むヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ分子である、請求項１記載の組成物。
  12. 少なくとも１つのＮｏＶ抗原又はその断片をコードするｍＲＮＡ分子を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象においてノロウイルス（ＮｏＶ）の少なくとも１つの株に対する免疫応答を誘導する方法。
  13. ＮｏＶ抗原が、ｐ４８、ヌクレオシド－トリホスファターゼ（ＮＴＰアーゼ）、ｐ２２、ＶＰｇ、プロテアーゼ、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、ＶＰ１、ＶＰ２、それらの断片、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１２記載の方法。
  14. ＮｏＶ抗原が、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶＩＩＩ、及びＧＩＸからなる遺伝子グループから選択される、請求項１２記載の方法。
  15. 少なくとも２つのＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードするｍＲＮＡ分子の組合せを含む、請求項１２記載の方法であって、該ＶＰ１抗原は、ＧＩ及びＧＩＩからなるＮｏＶ遺伝子グループから選択される、方法。
  16. 少なくとも２つのＮｏＶ ＶＰ１抗原をコードするｍＲＮＡ分子の組合せを含む、請求項１５記載の方法であって、該ＶＰ１抗原は、ＧＩ.１、ＧＩ.３、ＧＩ.５、ＧＩＩ.３及びＧＩＩ.４からなる群より選択される、方法。
  17. ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩ．１抗原をコードするｍＲＮＡ分子と、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩＩ.４抗原をコードするｍＲＮＡ分子との組合せを含む、請求項１５記載の方法。
  18. ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩ.１抗原、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩＩ.４抗原、ＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩ.３抗原及びＮｏＶ ＶＰ１ ＧＩＩ.３抗原の各々をコードするｍＲＮＡ分子の組合せを含む、請求項１５記載の方法。
  19. 前記組成物が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を含む、請求項１２記載の方法。
  20. 前記組成物がアジュバントを更に含む、請求項１２記載の方法。
  21. ｍＲＮＡ分子が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入されている、請求項１２記載の方法。
  22. ｍＲＮＡ分子が、シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、及び５－メチル－ウリジンからなる群より選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含むヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ分子である、請求項１２記載の方法。
  23. 前記組成物が、皮内、皮下、吸入、鼻腔内、及び筋肉内からなる群より選択される送達経路によって投与される、請求項１２記載の方法。
  24. 前記組成物の単回投与を含む、請求項１２記載の方法。
  25. 前記組成物の複数回投与を含む、請求項１２記載の方法。
  26. 前記組成物が、ＮｏＶ感染に関連した疾患又は障害を治療又は予防する、請求項１２記載の方法。
  27. ＮｏＶ感染に関連した疾患又は障害が、胃腸炎、食中毒、嘔吐及び下痢からなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
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