CN118450902A

CN118450902A - 诺如病毒疫苗及使用方法

Info

Publication number: CN118450902A
Application number: CN202280086321.0A
Authority: CN
Inventors: 埃琳娜·阿托希纳-瓦谢尔曼; 德鲁·韦斯曼
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2022-10-27
Publication date: 2024-08-06
Also published as: IL312261A; KR20240111822A; EP4422681A1; JP2024540061A; CA3235832A1; AU2022379626A1; WO2023076977A1; MX2024005194A

Abstract

提供了包含编码诺如病毒VP1抗原的mRNA分子的诺如病毒疫苗及其用于治疗或预防与诺如病毒感染有关的疾病或病症的方法。

Description

诺如病毒疫苗及使用方法

相关申请

本发明申请主张2021年10月27日提交的美国临时专利申请No.63/272,439的优先权，该专利申请以其全部内容通过参考并入本文。

背景技术

人诺如病毒(HuNoV)是世界范围内急性胃肠炎最常见的病毒病因，估计每年在幼儿中造成2亿例病例和～20万例死亡。诺如病毒被分为10个基因群，其中5个感染人，>90％的人感染由基因群I或II的菌株引起，其中基因群II、基因型4引起了大部分HuNoV感染和每隔几年的周期性疾病大流行。

诺如病毒是杯状病毒科(family Caliciviridae)中的无包膜单链正义RNA病毒。其基因组大小约为7.5kb至7.7kb，并且含有3个开放阅读框(ORF)；ORF2编码决定病毒抗原性的主要衣壳蛋白(VP1)，并且由位于衣壳基部的壳结构域组成。

诺如病毒(NoV)根据完整的主要衣壳蛋白VP1序列分为10个基因群(GI至GX)。然而，只有GI、GII和GIV感染人。

在全球范围内，GII.4是最主要的基因型，在过去20年中占大多数国家所有NoV爆发的～70-80％。

尚无批准的疫苗或特定的疗法来治疗诺如病毒疾病。因此，本领域需要改善的诺如病毒疫苗。本发明解决了这种需要。

发明内容

在一个实施方式中，本发明涉及用于诱导针对诺如病毒(NoV)的免疫应答的组合物，其包含编码至少一种NoV抗原的至少一种mRNA分子。在一个实施方式中，NoV抗原是p48、核苷三磷酸酶(NTP酶)、p22、VPg、蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)、VP1、VP2、其片段或它们的任何组合。

在一个实施方式中，NoV抗原来自GI、GII、GIV、GVIII或GIX基因群。

在一个实施方式中，组合物包含编码至少两种NoV VP1抗原的mRNA分子的组合。在一个实施方式中，组合物包含编码GI VP1抗原和GII VP1抗原的mRNA分子的组合。

在一个实施方式中，组合物包含编码GI.1抗原、GI.3 VP1抗原、GI.5 VP1抗原、GII.3 VP1抗原和GII.4 VP1抗原中的至少两种的mRNA分子的组合。

在一个实施方式中，组合物包含编码NoV VP1 GI.1抗原的mRNA分子和编码NoVVP1 GII.4抗原的mRNA分子的组合。

在一个实施方式中，组合物包含编码NoV VP1 GI.1抗原、NoV VP1GII.4抗原、NoVVP1 GI.3抗原和NoV VP1 GII.3抗原中的每一种的mRNA分子的组合。

在一个实施方式中，组合物包含编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQID NO:10的氨基酸序列的至少一种mRNA分子。

在一个实施方式中，组合物还包含佐剂。

在一个实施方式中，mRNA分子被封装在脂质纳米颗粒(LNP)内。

在一个实施方式中，组合物包含两种或更多种LNP的组合，LNP封装两种或更多种编码NoV VP1抗原的mRNA分子。

在一个实施方式中，mRNA分子是核苷修饰的mRNA分子，其包含至少一种假尿苷、1-甲基假尿苷或5-甲基尿苷修饰的核苷。

在一个实施方式中，本发明涉及在受试者中诱导针对诺如病毒(NoV)的至少一个毒株的免疫应答的方法，其包括向受试者施用有效量的组合物，组合物包含编码至少一种NoV抗原或其片段的mRNA分子。在一个实施方式中，NoV抗原是p48、核苷三磷酸酶(NTP酶)、p22、VPg、蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)、VP1、VP2、其片段或它们的任何组合。在一个实施方式中，NoV抗原来自GI、GII、GIV、GVIII或GIX基因群。

在一个实施方式中，方法包括施用编码至少两种NoV VP1抗原的mRNA分子的组合。在一个实施方式中，组合物包含编码GI VP1抗原和GII VP1抗原的mRNA分子的组合。

在一个实施方式中，方法包括施用编码GI.1抗原、GI.3 VP1抗原、GI.5 VP1抗原、GII.3 VP1抗原和GII.4 VP1抗原中的至少两种的mRNA分子的组合。

在一个实施方式中，方法包括施用编码NoV VP1 GI.1抗原的mRNA分子和编码NoVVP1 GII.4抗原的mRNA分子的组合。

在一个实施方式中，方法包括施用编码NoV VP1 GI.1抗原、NoV VP1GII.4抗原、NoV VP1 GI.3抗原和NoV VP1 GII.3抗原中的每一种的mRNA分子的组合。

在一个实施方式中，方法包括施用编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQID NO:10的氨基酸序列的至少一种mRNA分子。

在一个实施方式中，方法还包括施用佐剂。

在一个实施方式中，方法包括施用至少一种封装在脂质纳米颗粒(LNP)内的mRNA分子。

在一个实施方式中，方法包括施用两种或更多种LNP的组合，LNP封装两种或更多种编码NoV VP1抗原的mRNA分子。

在一个实施方式中，方法包括施用至少一种核苷修饰的mRNA分子，其包含至少一种假尿苷、1-甲基假尿苷或5-甲基尿苷修饰的核苷。

在一个实施方式中，通过皮内、皮下、吸入、鼻内或肌内递送途径施用组合物。

在一个实施方式中，方法包括组合物的单次施用。在一个实施方式中，方法包括组合物的多次施用。

在一个实施方式中，组合物治疗或预防与NoV感染有关的疾病或病症。在一个实施方式中，与NoV感染有关的疾病或病症是胃肠炎、食物中毒、呕吐或腹泻。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的实施方式的以下详细说明。应理解本发明不局限于附图中所示的实施方式的确切方案和工具。

图1显示了示例性实验数据，其证实编码GI.1/Norwalk1968、GII.4/CapeTown2012、GI.3/Sweden2008、GI.3/Argentina2016、GI.3/Nashville2019、GII.3/Canada2019、GII.2/UK2015、GII.3/USA2011和GII.3/Japan2009病毒的衣壳蛋白VP1序列的核苷修饰的mRNA表达正确的蛋白。使用还原条件。每个孔的加载量-10μg；GI.1-抗诺如病毒(VP1GI.1衣壳蛋白)，兔多克隆Rb G1；GII.4-抗诺如病毒(VP1 GII.4衣壳蛋白)，兔多克隆Rb 428；GI.3-抗诺如病毒(VP1 GI.3衣壳蛋白)，兔多克隆Rb 402；GII.3-抗诺如病毒(VP1GII.3衣壳蛋白)，兔多克隆Rb 397；GAPDH(14C10)-兔mAb(Cell Signaling，#2118S)；o/n+4℃孵育，稀释度1:2,500；第二GAR-HRP，1h RT，稀释度1:10,000；ECL+。

图2显示了使用二价mRNA疫苗(GI.1和GII.4)的示例性免疫方案。

图3显示了示例性实验数据，其证实阻断抗体滴度以高水平持续至长达第180天。

图4显示了示例性实验数据，其证实疫苗诱导了良好但基因型特异的阻断抗体应答。

图5显示了用于T细胞刺激测定的示例性免疫方案。

图6显示了用VLP(GI.1、GI.3、GII.3、GII.4)进行的T细胞刺激测定的结果。

图7显示了示例性实验数据，其证实了人诺如病毒二价mRNA疫苗的剂量应答。

图8显示了示例性实验数据，其证实了低剂量mRNA疫苗诱导强Th1应答。

图9显示了四价诺如病毒mRNA疫苗的示例性免疫方案。

图10显示了示例性实验数据，其证实了人诺如病毒四价疫苗的剂量应答。

图11显示了示例性实验数据，其证实了用活HNoV对干细胞来源的人3D类肠道(enteroids)的感染。

图12显示了证实活HNoV对干细胞来源的人3D类肠道的感染的示例性图像。

图13显示了示例性实验数据，其证实了通过来自通过皮内(i.d.)注射，以10μg每疫苗/小鼠接种的mRNA-LNP接种小鼠的血清对人类肠道抵抗GII.4感染的保护。

图14显示了示例性实验数据，其证实了通过来自通过肌内(i.m.)注射，以0.25μg每疫苗/小鼠接种的mRNA-LNP接种小鼠的血清对人类肠道抵抗GII.4感染的保护。

具体实施方式

本发明涉及用于在受试者中诱导针对诺如病毒(NoV)的免疫应答的组合物和方法。在一些实施方式中，本发明提供了包含至少一种脂质纳米颗粒(LNP)的组合物，脂质纳米颗粒包含至少一种核苷修饰的RNA分子，RNA分子编码来自一种或多种诺如病毒基因群的至少一种诺如病毒主要衣壳蛋白(VP1)。在一些实施方式中，本发明提供了包含至少一种脂质纳米颗粒(LNP)的组合物，脂质纳米颗粒包含至少一种核苷修饰的RNA分子，RNA分子编码来自GI、GII、GIII、GIV、GV、GVI、GVII、GVIII、GIX或GX基因群的至少一种VP1。在一些实施方式中，本发明提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)的组合的组合物，脂质纳米颗粒包含编码至少两种NoV主要衣壳蛋白(VP1)的核苷修饰的RNA分子。在一些实施方式中，组合物包含编码至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或大于20个NoV VP1抗原的mRNA分子。

在一个实施方式中，至少两个VP1来自相同的NoV基因群。在一个实施方式中，至少两个VP1来自两个或更多个不同的NoV基因群。

在一个实施方式中，组合物包含至少一种包含编码来自GII的VP1的mRNA分子的LNP和至少一种包含编码来自GI的VP1的mRNA分子的LNP的组合。

在一个实施方式中，组合物包含至少一种包含编码来自GII的VP1的mRNA分子的LNP、至少一种包含编码来自GI的VP1的mRNA分子的LNP和至少一种包含编码来自GIV的VP1的mRNA分子的LNP的组合。

在一个实施方式中，组合物包含至少一种包含编码来自GII.4的VP1的mRNA分子的LNP和至少一种包含编码来自GI.1的VP1的mRNA分子的LNP的组合。

在一个实施方式中，组合物包含至少一种包含编码来自GII.4的VP1的mRNA分子的LNP、至少一种包含编码来自GI.1的VP1的mRNA分子的LNP、至少一种包含编码来自GI.3的VP1的mRNA分子的LNP和至少一种包含编码来自GII.3的VP1的mRNA分子的LNP的组合。

本发明还涉及使用本发明的组合物治疗诺如病毒感染或治疗或预防与诺如病毒感染有关的疾病或病症，如呕吐和腹泻的方法。

定义

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。

如本文所使用的，以下术语中的每一个具有在该部分中与之有关的含义。

冠词“一个”在本文中用于表示一个或大于一个(即至少一个)所述冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”表示一个元素或大于一个元素。

当表示可测值，如量、时距等时，如本文所使用的“约”意味着涵盖了所指定值的±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％的变化，照此这些变化对于实施所公开的方法是适合的。

如本文所使用的术语“抗体”是指特异性结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体可以是来源于天然来源或来源于重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，其包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。

术语“抗体片段”是指全抗体的一部分并且是指全抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多重特异性抗体。

如本文所使用的“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的多肽链。

如本文所使用的“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的多肽链。κ和λ轻链表示两种主要的抗体轻链同种型。

如本文所使用的术语“合成抗体”表示使用DNA重组技术产生的抗体。还应将该术语视为表示已通过编码所述抗体的DNA分子的合成产生并且所述DNA分子表达指明所述抗体的抗体蛋白质或氨基酸序列的抗体，其中已使用在本领域中可用的并且熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得了所述DNA或氨基酸序列。该术语还应被理解为表示通过编码所述抗体的RNA分子的合成产生的抗体。RNA分子表达抗体蛋白质，或者表示所述抗体的氨基酸序列，其中已通过在本领域中可用且熟知的转录DNA(合成或克隆)、合成RNA或其他技术获得RNA。

对于抗体来说，如本文所使用的术语“特异性结合”表示识别特异性抗原，但是基本不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合至来自一个物种的抗原的抗体还可以结合至来自一个或多个其他物种的抗原。但是，这种物种间的反应性本身不改变抗体作为特异性的分类。在另一个实例中，特异性结合至抗原的抗体还可以结合至所述抗原不同的等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体作为特异性的分类。在一些情况下，术语“特异性结合”可以与抗体、蛋白或肽与第二化学物质的相互作用结合用于表示所述相互作用取决于所述化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，通常，抗体识别并结合至特异性蛋白结构，而不是蛋白。如果抗体对表位“A”特异，则在含有标记的“A”和所述抗体的反应中，含有表位A的分子(或者游离的未标记的A)的存在将降低结合至所述抗体的标记的A的量。

如本文所使用的，术语“免疫原”旨在表示能够在个体中诱导适应性免疫反应的物质，其中所述适应性免疫反应能够诱导免疫应答，所述免疫应答显著接合病原体，所述病原体与免疫原共有免疫学特性。“免疫原”是指引入身体以产生免疫应答的任何物质。所述物质可以是物理分子，如蛋白，或者可以通过载体，如DNA、mRNA编码，或者是病毒。

如本文所使用的，将术语“抗原”或“Ag”定义为引起适应性免疫反应的分子。这种免疫应答可以包括抗体产生，或者特异性免疫-感受态细胞的激活，或者两者。技术人员将理解任何大分子，包括几乎所有蛋白或肽可以用作抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA或RNA。技术人员将理解任何DNA或RNA包含编码引起适应性免疫反应的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列，并因此编码如在本文中使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅通过基因的全长核苷酸序列编码。显而易见地，本发明包括但不限于不止一个基因的部分核苷酸序列的使用，并且这些核苷酸序列以不同组合布置以引起所期望的免疫应答。此外，技术人员将理解完全不需要通过“基因”编码抗原。显而易见地，可以合成产生抗原，或者抗原可以来源于生物样品。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。

作为本文中所使用的术语的“免疫应答”表示涉及通过非限制性实例，在T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和/或抗原递呈细胞(APC)中的效应因子功能的激活和/或诱导的过程。因此，如技术人员将理解的，免疫应答包括但不限于辅助性T细胞或细胞毒性T细胞活性或反应、抗体产生、抗原递呈细胞活性或浸润、巨噬细胞活性或浸润、嗜中性白细胞活性或浸润等的任何可检测的抗原特异性激活和/或诱导。

如本文所使用的，“免疫原性组合物”可以包含抗原(例如，肽或多肽)、编码抗原的核酸、表达或递呈抗原或细胞组分的细胞、表达或递呈抗原或细胞组分的病毒或它们的组合。在具体的实施方式中，组合物包含或编码本文所描述的任何肽抗原的全部或部分，或其免疫功能等价物。在其他实施方式中，组合物是包含其他免疫刺激性试剂或者编码该试剂的核酸的混合物。免疫刺激性试剂包括但不限于其他抗原、免疫调节剂、抗原递呈细胞、脂质纳米颗粒或佐剂。在其他实施方式中，一种或多种其他试剂以任何组合共价键合至抗原或免疫刺激性试剂。

如本文所使用的，术语“疫苗”是指一旦接种到受试者，引起免疫应答的组合物。在一些实施方式中，所诱导的免疫应答提供保护性免疫。

“编码”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列，如基因、cDNA或mRNA用作生物过程中用于具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或者具有从中所获得的限定的氨基酸序列和生物学性质的其他聚合物和大分子的合成的模板的固有性质。因此，如果对应于所述基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生了蛋白，则所述基因编码所述蛋白。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链以及用作基因或cDNA转录的模板的非编码链两者可以称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。

“载体”是包含分离的核酸并且可以用于向细胞内部递送分离的核酸的物质组合物。多种载体在本领域中是已知的，其包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物有关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应被视为包括有利于核酸向细胞递送的非质粒和非病毒化合物，如，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、反转录病毒载体等。

“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作性地连接至要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含对于表达来说足够的顺式作用元件；其他用于表达的元件可以通过宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域中已知的所有那些载体，如粘粒、质粒(例如，裸质粒或包含在脂质体中的质粒)、RNA和病毒(例如，慢病毒、反转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)，载体引入了重组多核苷酸。

“同源的”是指两条多肽之间或者两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两条所比较的序列的两者中的位置被相同碱基或氨基酸单体亚基占据，例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在该位置是同源的。两条序列之间的同源性百分比是两条序列共有的匹配或同源位置数目除以所比较的位置数目再×100。例如，如果两条序列的10个位置中有6个匹配或同源，则所述两条序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50％的同源性。一般地，当两条序列比对时进行比较以提供最大同源性。

如本文所使用的，当其核苷酸序列相对于原始核苷酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的同一性程度时，则所述核苷酸序列与本文所描述的任何核苷酸序列“基本同源”。

如本文所使用的，当其氨基酸序列相对于原始氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的同一性程度时，则所述氨基酸序列与本文所描述的任何氨基酸序列“基本同源”。可以通过使用BLASTN算法(BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894，Altschul,S等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))确定两条氨基酸序列之间的同一性。

如本文所使用的，相对于核酸，术语“变体”是指(i)参考核苷酸序列的部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列基本同一的核酸；或者(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与之基本同一的序列杂交的核酸。变体可以是相对于完整基因序列的全长或其片段基本同一的核酸序列。核酸序列可以相对于基因序列全长或其片段是80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的。

如相对于肽或多肽所使用的术语“变体”是指通过氨基酸的插入、缺失或保守替换在氨基酸序列方面不同，但是保留了至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可以是指氨基酸序列与具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白基本相同的蛋白。在本领域中，将氨基酸的保守替换，即用具有类似性质(例如，亲水性、荷电区域分布程度)的不同氨基酸替换氨基酸理解为通常涉及微小改变。如本领域中所理解的，可以部分通过考虑氨基酸的亲水指数来识别这些微小改变。Kyte等人,1982,J.Mol.Biol.157:105-132)。氨基酸的亲水指数取决于其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知可以替换具有类似亲水指数的氨基酸并且其仍保留蛋白功能。在一个方面，替换具有±2的亲水指数的氨基酸。氨基酸的亲水性还可以用于揭示将导致保留生物学功能的蛋白的替换。在肽的背景下，氨基酸的亲水性的考虑允许计算所述肽的最大局部平均亲水性，它是已报道与抗原性和免疫原性良好相关的有用的量度。美国专利号4,554,101，其作为参考完全并入本文。如本领域中所理解的，具有类似亲水性值的氨基酸的替换可以导致产生保留生物活性，例如，免疫原性的肽。可以用彼此的亲水性值在±2以内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者受该氨基酸的具体侧链的影响。与该观察一致，将与生物学功能相容的氨基酸替换理解为取决于氨基酸的相对相似性，并且具体地，那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、尺寸和其他性质所显示的。变体可以是相对于氨基酸序列的全长或其片段基本同一的氨基酸序列。氨基酸序列可以相对于氨基酸序列全长或其片段是80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的。

如本文所使用的，术语“片段”或“功能性片段”表示当向受试者施用时，提供提高的免疫应答的抗原片段或者编码抗原的核酸序列。片段长度通常为10个或更多个氨基酸或核酸。“片段”可以表示能够在受试者中引起免疫应答的抗原的多肽片段。在位置1具有或不具有信号肽和/或蛋氨酸的每种情况下，除了从N和/或C末端缺少至少一个氨基酸外，抗原的片段可以与全长100％同一。除了所添加的任何异源信号肽，片段可以包含特定全长抗原长度的20％或以上、25％或以上、30％或以上、35％或以上、40％或以上、45％或以上、50％或以上、55％或以上、60％或以上、65％或以上、70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上的百分比。所述片段可以包含与所述抗原95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上或者99％或以上同一的多肽的片段，并且另外包含当计算同一性时，不包括的N末端蛋氨酸或异源信号肽。

在位置1具有或不具有编码信号肽和/或蛋氨酸的序列的每种情况下，除了从5'和/或3'末端缺少至少一个核苷酸外，编码抗原的核酸序列片段可以与全长100％同一。除了所添加的任何异源信号肽，片段可以包含特定全长编码序列长度的20％或以上、25％或以上、30％或以上、35％或以上、40％或以上、45％或以上、50％或以上、55％或以上、60％或以上、65％或以上、70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上的百分比。所述片段可以包含编码与所述抗原95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上或者99％或以上同一的多肽的片段，并且另外可选地包含当计算同一性百分比时，不包括的编码N末端蛋氨酸或异源信号肽的序列。

“分离的”表示相对于天然状态改变或从天然状态中除去。例如，天然存在于活体受试者中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态中共存的材料部分或完全分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以处于基本纯化的形式，或者可以存在于非天然环境中，如，例如，宿主细胞。

在本发明的背景中，使用了常见核酸(通过N-糖苷键结合至核糖或脱氧核糖的核碱基)的下列缩写。“A”是指腺嘌呤核苷，“C”是指胞嘧啶核苷，“G”是指鸟嘌呤核苷，“T”是指胸腺嘧啶核苷，并且“U”是指尿嘧啶核苷。

除非另作说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。短语编码蛋白或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，从而在一些形式中，编码所述蛋白的核苷酸序列可以含有内含子。另外，所述核苷酸序列可以含有能够通过细胞中的翻译机器翻译的修饰的核苷。在本文其他处描述了示例性修饰的核苷。例如，其中尿苷中的一些或全部已被假尿苷、1-甲基假尿苷、5-甲基-尿苷或另一种修饰的核苷，如本文其他处所述的那些代替的mRNA。在一些实施方式中，所述核苷酸序列可以含有其中一些或全部胞嘧啶核苷被甲基化胞嘧啶核苷或者另一种修饰的核苷，如本文其他处所述的那些替换的序列。

术语“可操作性地连接的”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能性连接，其导致后者表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作性地连接。例如，如果所述启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作性地连接至编码序列。一般地，在相同阅读框中，可操作性地连接的DNA或RNA序列是邻接的，并且必要时，连接两个蛋白编码区。

如本文所使用的术语“多核苷酸”的定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有以下常识：核酸是多核苷酸，其可以水解为单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解为核苷。如本文所使用的多核苷酸包括但不限于通过本领域中可用的任何方式获得的所有核酸序列，所述方式无限制地包括重组方式，即使用常规克隆技术和PCR^TM等从重组文库或细胞基因组中对核酸序列的克隆，和通过合成方式。

在一些情况下，本发明所述的多核苷酸或核酸是“核苷修饰的核酸”，其是指包含至少一个修饰的核苷的核酸。“修饰的核苷”是指具有修饰的核苷。例如，已在RNA中识别了超过100种不同的核苷修饰(Rozenski等人,1999,The RNA Modification Database:1999update.Nucl Acids Res 27:196-197)。

如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”是可互换使用的，并且表示由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且不限制蛋白或肽序列可以包含的最大氨基酸数目。多肽包括包含通过肽键彼此连接在一起的两个或更多个氨基酸的任何的肽或蛋白。如本文所使用的，该术语是指短链和长链两者，所述短链在本领域中通常也被称为肽、寡肽和寡聚物，并且长链在本领域中通常被称为蛋白，其存在多种类型。“多肽”包括，例如，生物学活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同型二聚体、杂二聚物、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类拟物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或它们的组合。

将如本文所使用的术语“启动子”定义为被细胞的合成机器，或引入的合成机器识别的DNA序列，它是起始多核苷酸序列的特异性转录所需的。通过一个非限制性实例，通过噬菌体RNA聚合酶识别启动子并且将其用于通过体外转录产生mRNA。

将如本文所使用的术语“佐剂”定义为增强抗原特异性适应性免疫反应的任何分子。

在一些实施方式中，“假尿苷”是指m¹acp³Ψ(1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷)。在另一个实施方式中，该术语是指m¹Ψ(1-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，该术语是指Ψm(2'-O-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，该术语是指m⁵D(5-甲基二氢尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，该术语是指m³Ψ(3-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，该术语是指未进一步修饰的假尿苷部分。在另一个实施方式中，该术语是指任何以上假尿苷的单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。在另一个实施方式中，该术语是指本领域中已知的任何其他假尿苷。每种可能性代表了本发明的单独的实施方式。

术语“脂质纳米颗粒”是指具有至少纳米级(例如，1-1,000nm)一维尺度的颗粒，其包括一个或多个脂质。

术语“脂质”是指作为脂肪酸的衍生物(例如，酯)并且特征通常为不溶于水但可溶于多种有机溶剂的一组有机化合物。脂质通常被分成至少3类：(1)“单纯脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括磷脂和糖脂；和(3)“衍生脂质”，如类固醇。

如本文所使用的，术语“阳离子脂质”是指当pH降低至脂质的可电离基团的pK以下时为阳离子或变为阳离子(质子化)，但在更高的pH值下逐渐更中性的脂质。在低于pK的pH值，脂质则能够与带负电荷的核酸结合。在一些实施方式中，阳离子脂质包括pH降低时带正电荷的两性离子脂质。

术语“中性脂质”是指在生理学pH，以不带电或中性两性离子形式存在的一些脂质物质中的任一种。代表性的中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。

术语“阴离子脂质”是指在生理学pH带负电荷的任何脂质。

术语“聚合物缀合的脂质”是指包含脂质部分和聚合物部分两者的分子。聚合物缀合的脂质的实例是PEG化的脂质。

术语“PEG化的脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分两者的分子。PEG化的脂质在本领域中是已知的并且包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-s-DMG)等。

“脂质体”是涵盖多种通过封闭的脂质双分子层或聚集物的产生所形成的单层和多层脂质媒介物的一般术语。可以将脂质体表征为具有磷脂双分子层膜和内部水媒介的胞囊状结构。多层脂质体具有通过水媒介分隔的多个脂质层。当将磷脂在过量水溶液中混悬时，它们自发形成。脂质组分在封闭结构形成前经历自重排，并且在脂质双分子层之间包埋水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，还涵盖了在溶液中具有不同于正常胞囊状结构的结构的组合物。例如，脂质可以采取胶束结构或者仅作为脂质分子的非均一聚集物存在。还考虑了脂质体-核酸复合物。

术语“受试者”、“患者”、“个体”等在本文中是可互换使用的并且表示无论体外还是原位，对本文所述的方法起反应的任何动物或其细胞。在一些非限制性实施方式中，所述患者、受试者或个体是哺乳动物、鸟、禽类、牛、猪、马、绵羊、雪貂、灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、蝙蝠或人。

“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不可以维持体内平衡，并且其中如果疾病未得到改善，则受试者的健康继续变差。

相反，受试者中的“病症”是其中受试者能够维持体内平衡，但是其中受试者的健康状态不如不存在所述病症的情况下的状态良好的健康状态。如果保持不治疗，病症不必需导致受试者的健康状态进一步降低。

如本文所使用的，术语“调节”表示与不存在治疗或化合物的受试者中的反应水平相比和/或与相同但未治疗的受试者中的反应水平相比，调节受试者中的反应水平的可检测的升高或降低。该术语涵盖了干扰和/或影响受试者，如人中的天然信号或反应，借此调节有益治疗反应。

作为本文中所使用的术语，“治疗”疾病表示降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重程度。

如本文所使用的，“有效量”是指提供治疗或预防益处的量。

如本文所使用的术语“治疗的”表示治疗和/或预防。通过抑制、减少、缓解、预防或消除疾病或病症的至少一种病征或症状获得治疗效果。

术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或其他临床医师所探寻的组织、系统或受试者的生物或医学反应的受试化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时，足以预防正在治疗的疾病或病症的一种或多种病征和/或症状的发展或者在某种程度上减轻所述一种或多种病征和/或症状的化合物的量。治疗有效量将基于化合物、疾病及其严重程度、要治疗的受试者的年龄、体重等而改变。

如本文所使用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指通过其将外源核酸转移或引入宿主细胞的方法。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是其中用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其子代。

如本文所使用的短语“受转录控制”或者“可操作性连接的”表示启动子相对于多核苷酸处于正确位置和取向以控制通过RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。

如本文所使用的，“其他成分”包括但不限于以下中的一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒剂和崩解剂；粘结剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理学可降解的组成，如明胶；水性媒介物和溶剂；油性媒介物和溶剂；助悬剂；分散剂或润湿剂；乳化剂，镇痛剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填料；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药学上可接受的聚合物或疏水性材料。可以包括在本发明的药物组合物中的其他“另外的成分”在本领域中是已知的并且描述于(例如)Remington's PharmaceuticalSciences(1985,Genaro主编,Mack Publishing Co.,Easton,PA)，以上文献作为参考并入本文。

范围：在整个发明公开中，本发明的多个方面可以以范围格式存在。应理解以范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应将其视为对本发明范围的刻板限制。因此，对范围的描述应认为具有具体公开的所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，对范围，如1至6的描述应认为具有具体公开的子范围，如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等，以及该范围内的各个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。这是适用的，而无需考虑范围的宽度。

描述

本发明涉及用于在受试者中诱导针对诺如病毒的一种或多种株的免疫应答的组合物和方法。在一些实施方式中，本发明提供了包含至少一种RNA分子的组合物，RNA分子编码来自GI、GII、GIII、GIV、GV、GVI、GVII、GVIII、GIX或GX基因群的至少一种VP1。在一些实施方式中，mRNA分子是核苷修饰的mRNA分子。

在一些实施方式中，本发明提供了包含编码至少两种NoV主要衣壳蛋白(VP1)的mRNA分子(例如，核苷修饰的mRNA分子)的组合的组合物。在一些实施方式中，组合物包含编码至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或大于20个NoV VP1抗原的mRNA分子(例如，核苷修饰的mRNA分子)。

在一个实施方式中，至少两个VP1来自相同NoV基因群内的不同的株。在一个实施方式中，至少两个VP1来自两个或更多个不同的NoV基因群。

在一个实施方式中，组合物包含编码来自至少一种GII株的VP1的至少一种mRNA分子和编码来自至少一种GI株的VP1的至少一种mRNA分子的组合。

在一个实施方式中，组合物包含至少一种编码来自GII的VP1的mRNA分子、至少一种包含编码来自GI的VP1的mRNA分子的LNP和至少一种编码来自GIV的VP1的mRNA分子的组合。

在一个实施方式中，组合物包含至少一种编码来自GII.4的VP1的mRNA分子和至少一种编码来自GI.1的VP1的mRNA分子的组合。

在一个实施方式中，组合物包含至少一种编码来自GII.4的VP1的mRNA分子、至少一种编码来自GI.1的VP1的mRNA分子、至少一种编码来自GI.3的VP1的mRNA分子和至少一种编码来自GII.3的VP1的mRNA分子的组合。

在一些实施方式中，组合物还包含编码至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或大于20个其他病毒抗原的mRNA分子。在一些实施方式中，一种或多种其他病毒抗原可以来自人类免疫缺陷性病毒(HIV)、基孔肯亚病毒(CHIKV)、登革热病毒、乳头状瘤病毒，例如，人乳头状瘤病毒(HPV)、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒，例如，甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)、天花病毒(重型天花和轻型天花)、牛痘病毒、鼻病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、黄热病毒、诺沃克病毒、甲型肝炎病毒、人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、毛细胞白血病病毒(HTLV-II)、加利福尼亚脑炎病毒、汉坦病毒(出血热)、狂犬病病毒、埃博拉热病毒、马伯格氏病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯性疱疹1(口腔疱疹)、单纯性疱疹2(生殖器疱疹)、带状疱疹(水痘-带状疱疹，也叫做水痘)、巨细胞病毒(CMV)，例如，人CMV、埃-巴二氏病毒(EBV)、黄病毒、口蹄疫病毒、拉沙病毒、沙粒病毒、Merkel细胞多形瘤病毒(MCV)、流感病毒、冠状病毒，包括但不限于严重急性呼吸综合征-冠状病毒2、导致癌症的病毒或它们的任何组合。在一个实施方式中，一种或多种其他病毒抗原是NoV抗原。示例性的其他NoV抗原包括但不限于p48、核苷三磷酸酶(NTP酶)、p22、VPg、蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)、VP1、VP2、其片段或它们的任何组合。

在一些实施方式中，核苷修饰的mRNA分子(例如，核苷修饰的mRNA分子)被封装在一个或多个LNP中。在一些实施方式中，组合物包含至少一种LNP，LNP包含至少一种核苷修饰的RNA分子，所述核苷修饰的RNA分子编码至少一种来自GI、GII、GIII、GIV、GV、GVI、GVII、GVIII、GIX或GX基因群的VP1抗原。在一些实施方式中，组合物包含LNP的组合，LNP包含核苷修饰的RNA分子，RNA分子编码来自GI、GII、GIII、GIV、GV、GVI、GVII、GVIII、GIX或GX基因群的至少两种VP1抗原的组合。

在一些实施方式中，组合物包含LNP的组合，LNP包含编码至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或大于20个NoV VP1抗原的mRNA分子。

在一个实施方式中，组合物包含至少一种包含编码来自至少一种GII株的VP1的mRNA分子的LNP和至少一种包含编码来自至少一种GI株的VP1的mRNA分子的LNP的组合。

疫苗

在一个实施方式中，本发明提供了用于在受试者中诱导针对诺如病毒(NoV)的免疫应答的免疫原性组合物。例如，在一个实施方式中，所述免疫原性组合物是疫苗。对于用作疫苗的组合物，组合物必须在细胞、组织或受试者中诱导针对诺如病毒抗原的免疫应答。在一些实施方式中，组合物在细胞、组织或受试者中诱导针对多种NoV株的广泛免疫应答。在一些情况下，疫苗在受试者中诱导保护性免疫应答。

本发明的疫苗可以在其核酸组成和/或细胞组分中不同。在一个实施方式中，疫苗包含编码NoV VP1抗原的核酸分子。在一个实施方式中，疫苗包含编码来自两个或更多个NoV基因群的NoV VP1抗原的核酸分子的组合。在一个实施方式中，疫苗包含编码来自NoVGII的一种或多种株和NoV GI的一种或多种株的NoV VP1抗原的核酸分子的组合。

在一个非限制性实例中，编码NoV VP1抗原的一个或多个核酸分子也可以与佐剂一起配制。在另一个非限制性实例中，疫苗可以包含一种或多种佐剂。可以通过本文所公开的任何方法，或者如根据本发明公开，本领域的技术人员将已知的，制备和/或施用本发明的疫苗及其多种组分。

在多个实施方式中，可以通过体内或体外观察宿主中免疫系统的全部或任何部分对一种或多种NoV VP1抗原的应答来检测通过表达NoV VP1抗原对免疫性的诱导。

例如，用于检测细胞毒T淋巴细胞诱导的方法是熟知的。进入活体的外源物质在抗原递呈细胞(APC)的作用下递呈至T细胞和B细胞。由于抗原刺激，以抗原特异性方式对APC递呈的抗原应答的一些T细胞分化为细胞毒性T细胞(也称为细胞毒T淋巴细胞或CTL)。然后，这些抗原-刺激的细胞增殖。该过程在本文中被称为T细胞的“激活”。因此，可以通过：通过APC将多肽或肽的表位或它们的组合递呈给T细胞并检测CTL的诱导，评价通过多肽或肽的表位或它们的组合的CTL诱导。此外，APC具有激活B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞和NK细胞的作用。

评价使用树突状细胞(DC)作为APC对CTL的诱导动作的方法在本领域中是熟知的。DC是APC中具有稳健CTL诱导动作的代表性APC。在本发明所述的方法中，起初通过DC表达多肽或肽的表位或它们的组合，然后将该DC与T细胞接触。在与DC接触后，对所关心的细胞具有细胞毒性作用的T细胞的检测显示多肽或肽的表位或它们的组合具有诱导细胞毒性T细胞的活性。此外，还可以通过使用抗IFN-γ显象，如ELISPOT测定，通过测量CTL在存在携带固定化的肽或肽的组合的抗原递呈细胞的情况下所产生和释放的IFN-γ检验诱导的免疫应答。

除DC外，周围血单核细胞(PBMC)也可以用作APC。据报道通过在存在GM-CSF和IL-4的情况下培养PBMC增强CTL的诱导。类似地，已显示在存在钥孔血蓝素(KLH)和IL-7的情况下通过培养PBMC诱导了CTL。

通过这些方法确认具有CTL诱导性活性的抗原是具有DC激活作用和后续CTL诱导性活性的抗原。此外，由于通过APC的抗原递呈获得细胞毒性的CTL也可以用作针对抗原相关病症的疫苗。

通过观察对NoV抗原的抗体产生的诱导，可以进一步确认由NoV抗原的表达对免疫性的诱导。例如，当在用编码抗原的组合物免疫的实验室受试者中诱导抗抗原的抗体时，并且当通过那些抗体抑制抗原相关病理学时，确定组合物诱导免疫性。

在受试者中诱导的抗体应答的特异性可以包括与所递送的抗原的多个区域的结合，以及预防感染或降低疾病严重性的能够中和的抗体的诱导。

通过观察T细胞，如CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合的诱导，可以进一步确认通过NoV抗原的表达对免疫性的诱导。例如，CD4+T细胞还可以裂解靶细胞，但是主要在诱导其他类型免疫应答中提供帮助，包括CTL和抗体产生。可以将CD4+辅助性T细胞类型鉴定为Th1、Th2、Th9、Th17、T调控细胞(Treg)或滤泡辅助性T细胞(Tfh)。每种CD4+T细胞亚型为某些免疫应答类型提供帮助。在一个实施方式中，组合物选择性诱导滤泡辅助性T细胞，其驱动有效的抗体应答。

可以向患有疾病或病症或处于患疾病或病症风险(或者对疾病或病症敏感)的受试者预防性(即预防疾病或病症)或治疗性(即治疗疾病或病症)施用本发明所述的治疗性化合物或组合物。可以使用标准临床方法鉴定这些受试者。在本发明的背景中，预防性施用发生在疾病明显临床症状表现前，从而预防了疾病或病症或作为另外一种选择延缓其发展。在医学领域背景中，术语“预防”涵盖了任何降低疾病的死亡率或发病率负担的活动。预防可以发生在第一、第二和第三级预防水平。尽管第一级预防避免了疾病发生，但是第二和第三级预防水平涵盖了针对预防疾病发展和症状出现，以及通过恢复功能和减少疾病相关并发症减少已建立的疾病的不利影响的活动。

抗原

本发明提供了在受试者中引起免疫应答的组合物。在一个实施方式中，组合物包含至少一种编码至少一种诺如病毒(NoV)抗原的mRNA分子。可以包括在本发明的组合物中的诺如病毒抗原包括但不限于p48、核苷三磷酸酶(NTP酶)、p22、VPg、蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)、VP1、VP2、其片段或它们的任何组合。

在一个实施方式中，抗原是VP1抗原。在一个实施方式中，VP1抗原来自GI、GII、GIII、GIV、GV、GVI、GVII、GVIII、GIX或GX基因群。在一个实施方式中，VP1抗原来自GI、GII、GIV、GVIII或GIX基因群。在一个实施方式中，VP1抗原来自GII.3、GII.4、GI.1、GI.3、GI.5或它们的任何组合。

在一些实施方式中，疫苗还包含一种或多种编码至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或大于20个其他病毒抗原的其他核酸分子。在一些实施方式中，一种或多种其他病毒抗原可以来自人类免疫缺陷性病毒(HIV)、基孔肯亚病毒(CHIKV)、登革热病毒、乳头状瘤病毒，例如，人乳头状瘤病毒(HPV)、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒，例如，甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)、天花病毒(重型天花和轻型天花)、牛痘病毒、鼻病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、黄热病毒、诺沃克病毒、甲型肝炎病毒、人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、毛细胞白血病病毒(HTLV-II)、加利福尼亚脑炎病毒、汉坦病毒(出血热)、狂犬病病毒、埃博拉热病毒、马伯格氏病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯性疱疹1(口腔疱疹)、单纯性疱疹2(生殖器疱疹)、带状疱疹(水痘-带状疱疹，也叫做水痘)、巨细胞病毒(CMV)，例如人CMV、埃-巴二氏病毒(EBV)、黄病毒、口蹄疫病毒、拉沙病毒、沙粒病毒、Merkel细胞多形瘤病毒(MCV)、流感病毒、冠状病毒，包括但不限于严重急性呼吸综合征-冠状病毒2、导致癌症的病毒或它们的任何组合。在一个实施方式中，一种或多种其他病毒抗原是NoV抗原。

例如，在一些实施方式中，组合物包含核苷修饰的RNA，RNA编码来自NoV GI、GII和GIV基因群的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或大于20个NoV VP1抗原或其片段或变体的组合。

在一些实施方式中，NoV VP1抗原包括全长VP1抗原，或其片段或变体。

在一个实施方式中，编码NoV VP1抗原的mRNA分子编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9或SEQ ID NO:10。

在一个实施方式中，编码NoV VP1抗原的核酸分子包含编码标签或信号肽(SP)的序列。可以使用的其他信号肽包括但不限于来源于IL-2、tPA、小鼠和人IgG的信号序列以及合成优化的信号序列。在一些情况下，所述核酸序列包含编码通过肽键与抗原连接的接头或标签序列的其他序列。

在一些实施方式中，NoV VP1抗原包含与本文所描述的NoV VP1抗原的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列，并且保留了原始氨基酸序列的免疫原性功能。例如，在一些实施方式中，编码NoV VP1抗原的核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的同一性程度。

佐剂

在一个实施方式中，组合物包含佐剂。在一个实施方式中，组合物包含编码佐剂的核酸分子。在一个实施方式中，佐剂-编码核酸分子是IVT RNA。在一个实施方式中，佐剂-编码核酸分子是核苷修饰的RNA。在一个实施方式中，佐剂-编码核酸分子是核苷修饰的mRNA。

示例性佐剂包括但不限于α-干扰素、γ-干扰素、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞-吸引趋化因子(CTACK)、上皮细胞胸腺-表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮细胞趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86。可以作为有用的佐剂的其他基因包括编码下列的那些：MCP-I、MIP-Ia、MIP-Ip、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-I、VLA-I、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-I、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-I、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬氨酸酶ICE、Fos、c-jun、Sp-I、Ap-I、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活的NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素响应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP 1、TAP2、抗CTLA4-sc、抗LAG3-Ig、抗TIM3-Ig及其功能性片段。

在一些实施方式中，组合物包含LNP，其中LNP用作佐剂。

核酸

在一个实施方式中，本发明包括编码至少一种NoV抗原的至少一种mRNA分子(例如，核苷修饰的mRNA分子)。可以由本发明的mRNA分子编码的诺如病毒抗原包括但不限于p48、核苷三磷酸酶(NTP酶)、p22、VPg、蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)、VP1、VP2、其片段或它们的任何组合。

在一个实施方式中，mRNA分子编码VP1抗原。在一个实施方式中，VP1抗原来自GI、GII、GIII、GIV、GV、GVI、GVII、GVIII、GIX或GX基因群。在一个实施方式中，VP1抗原来自GI、GII、GIV、GVIII或GIX基因群。在一个实施方式中，VP1抗原来自GII.3、GII.4、GI.1、GI.3或GI.5或它们的任何组合。

可以使用本领域中的任何方法制备所述核酸分子，其包括但不限于体外转录、化学合成等。

编码至少一种如本文所描述的NoV抗原的核苷酸序列可以作为另外一种选择包含相对于原始核苷酸序列的序列变化，例如，一个或多个核苷酸的替换、插入和/或缺失，但条件是所产生的多核苷酸编码根据本发明的多肽。因此，本发明的范围包括与本文所列举的核苷酸序列基本同源或基本相同并编码本发明的NoV抗原的核苷酸序列。

例如，通过引入保守或非保守替换，基于所述核苷酸序列中所含的信息，与编码抗原的核苷酸序列基本同源的核苷酸序列通常可以分离自抗原的产生生物。可能的修饰的其他实例包括一个或多个核苷酸在所述序列中的插入、一个或多个核苷酸在任何序列末端的添加或者一个或多个核苷酸在任何序列末端或内部的缺失。使用本领域技术人员普遍已知的计算机算法和方法确定两条多核苷酸之间的同一性程度。

此外，本发明的范围包括编码与本文所列举的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列并且保留了原始氨基酸序列的免疫原性功能的核苷酸序列。

在一个实施方式中，本发明涉及包含编码NoV VP1抗原的核苷酸序列的构建体。在一个实施方式中，本发明包含编码多个NoV抗原的多个核苷酸序列。例如，在一些实施方式中，本发明包含编码1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个或者4个或更多个NoV VP1抗原的多个核苷酸序列。在一个实施方式中，本发明涉及包含编码佐剂的核苷酸序列的构建体。在一个实施方式中，本发明包括编码1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、或4个或更多个NoV VP1抗原的多个核苷酸序列和佐剂的组合。

在一个实施方式中，组合物包含多个构建体，每个构建体编码NoV VP1抗原。在一个实施方式中，所述多个NoV VP1抗原来自NoV基因群GI、GII、GIV、GVIII或GIX或它们的任何组合。在一个实施方式中，组合物包含第一构建体，其包含编码NoV GII.4 VP1抗原的核苷酸序列；和第二构建体，其包含编码NoV GI.1 VP1抗原的核苷酸序列。在一个实施方式中，组合物包含：包含编码NoV GII.4 VP1抗原的核苷酸序列的第一构建体；包含编码NoVGI.1 VP1抗原的核苷酸序列的第二构建体，包含编码NoV GII.3 VP1抗原的核苷酸序列的第三构建体，和包含编码NoV GI.3 VP1抗原的核苷酸序列的第四构建体。在一个实施方式中，编码NoV GI.1抗原的mRNA分子编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一个实施方式中，编码NoV GII.4抗原的mRNA分子编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一个实施方式中，编码NoV GI.3抗原的mRNA分子编码SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一个实施方式中，编码NoV GII.3抗原的mRNA分子编码SEQ ID NO:7或SEQID NO:8的氨基酸序列。在一个实施方式中，编码NoV GI抗原的mRNA分子编码SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

在另一个具体的实施方式中，所述构建体可操作性地结合至翻译控制元件。所述构建体可以引入可操作性结合的调控序列以用于表达本发明的核苷酸序列，因此形成表达盒。

载体

可以使用本领域中已知的重组方法获得编码本发明所述的NoV抗原的核酸序列，如，例如，使用标准技术，通过从表达所述基因的细胞筛选文库，通过从已知包括它们的载体获得基因或者通过直接从含有它们的细胞和组织分离来获得。作为另外一种选择，可以合成产生所关心的基因。

可以将所述核酸分子克隆到一些载体类型中。例如，可以将所述核酸克隆至载体中，载体包括但不限于质粒、噬粒、噬菌体衍生物、动物病毒、PCR-产生的线性DNA序列和粘粒。特别关心的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体、测序载体和对于体外转录优化的载体。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散体系，如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和脂质基系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束、碳水化合物、肽、阳离子聚合物和脂质体。用作体外和体内递送媒介的示例性胶体体系是脂质体(例如，人工膜囊)。

在其中使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。脂质制剂的使用旨在用于将所述核酸(体外、离体或体内)引入宿主细胞。在另一个方面，所述核酸可以与脂质结合。可以将与脂质结合的核酸封装在脂质体的水性内部、分散在脂质体的脂质双分子层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者结合的连接分子连接至脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质合并、作为混悬液包含在脂质中、包含或与胶束复合或另外与脂质结合。脂质、脂质/RNA或脂质/表达载体相关组合物不局限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双分子层结构、作为胶束或通过“塌缩”结构存在。它们还可以简单地散布在溶液中，可能地形成尺寸或形状不均一的聚集体。脂质是可以天然存在的脂肪物质或者合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃和它们的衍生物的化合物种类，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。

适合使用的脂质可以得自商品化来源。例如，二豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以得自Sigma,St.Louis,MO；联十六烷基磷酸酯(“DCP”)可以得自K&K Laboratories(Plainview,NY)；胆固醇(“Chol”)可以得自Calbiochem-Behring；二豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)及其他脂质可以得自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储液可以储存在约-20℃。由于比甲醇更易于蒸发，因此使用氯仿。

不考虑用于将外源核酸引入到宿主细胞中或另外将细胞暴露于本发明的组合物的方法，为了确认所述宿主细胞中mRNA序列的存在，可以实施多种测定。这些测定包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如RNA印迹和RT-PCR；“生物化学”测定，如，例如，通过免疫原性方式(ELISA和免疫印迹)或者通过本文所描述的测定检测特定的肽的存在或不存在，以鉴别试剂是否在本发明的范围内。

体外转录的RNA

在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码本发明的NoV抗原的体外转录(IVT)RNA分子的组合。在一个实施方式中，可以将IVT RNA作为瞬时转染形式引入细胞。使用合成产生的质粒DNA模板，通过体外转录产生RNA。可以使用适当引物和RNA聚合酶，通过PCR将来自任何来源的所关心的DNA直接转化为用于体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是(例如)基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或者任何其他适合的DNA来源。在一个实施方式中，对于体外转录所期望的模板是能够诱导适应性免疫反应的NoV抗原。在一个实施方式中，对于体外转录所期望的模板是能够增强适应性免疫反应的佐剂。

在一个实施方式中，用于PCR的DNA含有开放阅读框。DNA可以来自来源于生物基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施方式中，DNA是所关心的全长基因或基因的一部分。所述基因可以包括5'和/或3'未翻译区(UTR)的一些或全部。所述基因可以包括外显子和内含子。在一个实施方式中，用于PCR的DNA是人基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA是来自致病或共生生物，包括细菌、病毒、寄生虫和真菌的基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA来自致病或共生生物，包括细菌、病毒、寄生虫和真菌，DNA包括5'和3'UTR。作为另外一种选择，DNA可以是在天然存在的生物中不正常表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因的一部分的序列。连接在一起的DNA部分可以来自单一生物或来自不止一种生物。

可以用作用于PCR的DNA来源的基因包括编码诱导或增强生物中适应性免疫反应的多肽的基因。在一些情况下，所述基因对于短期治疗有用。在一些情况下，所述基因对于所表达的基因剂量具有有限的安全性问题。

在多个实施方式中，将质粒用于产生用于mRNA的体外转录的模板，其对于转染有用。

还可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。在一些实施方式中，RNA具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，5'UTR的长度在0至3000个核苷酸之间。可以通过不同方法改变要添加至编码区的5'和3'UTR序列长度，方法包括但不限于设计用于与UTR的不同区域退火的PCR引物。使用该方法，本领域的技术人员可以在转录的RNA转染后，改变实现最优翻译效率所需的5'和3'UTR长度。

5'和3'UTR可以是所关心的基因的天然存在的、内源的5'和3'UTR。作为另外一种选择，可以通过将UTR序列引入正向和反向引物或通过对模板的任何其他修饰，添加对所关心的基因非内源的UTR序列。对所关心的基因非内源的UTR序列的使用对于改变RNA的稳定性和/或翻译效率可以是有用的。例如，已知3'UTR序列中AU-富集元件可以降低mRNA的稳定性。因此，基于在本领域中熟知的UTR的性质，可以选择或设计3'UTR以提高转录的RNA的稳定性。

在一个实施方式中，5'UTR可以含有内源基因的Kozak序列。作为另外一种选择，当如以上所描述的，通过PCR添加对所关心的基因非内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录本的翻译效率，但是似乎不是所有RNA能够有效翻译所需的。多种mRNA对Kozak序列的要求在本领域中是已知的。在其他实施方式中，5'UTR可以来源于其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其他实施方式中，多种核苷酸类似物可以用于3'或5'UTR中以阻碍mRNA的核酸外切酶降解。

为了使得能够从DNA模板合成RNA，应将转录启动子连接至要转录的序列上游的DNA模板。当将起到RNA聚合酶启动子作用的序列加入至正向引物5'末端时，RNA聚合酶启动子被引入要转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个实施方式中，所述启动子是T7 RNA聚合酶启动子，如在本文其他地方所描述的。其他有用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列在本领域中是已知的。

在一个实施方式中，mRNA在5'端和3'多聚(A)尾具有帽，其决定了核糖体结合、翻译起始以及mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板上，例如，质粒DNA、RNA聚合酶产生长多联体产物，其不适合于在真核细胞中表达。在3'UTR末端线性化的质粒DNA的转录导致产生了正常尺寸的mRNA，当在转录后多聚腺苷酸化时，它在真核转染中有效。

在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录本的3'端延伸至模板最后一个碱基之外(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nachevaand Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003))。

多聚A/T段向DNA模板整合的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的多聚A/T序列可以引起质粒不稳定性，这可以通过对于质粒增殖的重组非感受态细菌细胞的使用进行改善。

可以在体外转录后，通过使用多聚(A)聚合酶，如大肠杆菌(E.coli)多聚A聚合酶(E-PAP)或酵母多聚A聚合酶进一步延伸RNA的多聚(A)尾。在一个实施方式中，将多聚(A)尾的长度从100个核苷酸提高至300至400个核苷酸之间导致RNA翻译效率提高约2倍。另外，不同化学基团与3'端的连接可以提高mRNA稳定性。这种连接可以含有修饰/人工核苷酸、适体及其他化合物。例如，可以使用多聚(A)聚合酶将ATP类似物引入多聚(A)尾。ATP类似物可以进一步提高RNA的稳定性。

5'帽还对mRNA分子提供了稳定性。在一个实施方式中，通过方法产生RNA以包括5'帽1结构。可以使用牛痘封端酶和2'-O-甲基转移酶(CellScript,Madison,WI)产生这种帽1结构。作为另外一种选择，使用本领域中已知的和本文所描述的技术提供5'帽(Cougot等人,Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。

可以使用任何一些不同的方法将RNA引入靶细胞，方法例如可商购的方法，其包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或者Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂质转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物封装、肽介导的转染或生物弹(biolistic)颗粒递送系统，如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa等人.Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001))。在一些实施方式中，通过包括-mRNA转染试剂盒(Mirus,Madison WI)的使用的方法将本发明的RNA引入细胞，方法在一些情况下提供了高效、低毒的转染。

核苷修饰的RNA

在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码如本文所描述的NoV抗原的核苷修饰的核酸。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码如本文所描述的多个NoV抗原的多个核苷修饰的核酸分子。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码如本文所描述的佐剂的核苷修饰的核酸。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码一种或多种NoV抗原的核苷修饰的核酸和一种或多种佐剂。

例如，在一个实施方式中，组合物包含核苷修饰的RNA。在一个实施方式中，组合物包含核苷修饰的mRNA。核苷修饰的mRNA相比于未修饰的mRNA具有特别的优势，包括，例如，提高的稳定性、低或不存在的先天免疫原性和增强的翻译。在本发明中有用的核苷修饰的mRNA进一步描述于美国专利号8,278,036、8,691,966和8,835,108，以上每篇专利以其全部内容作为参考并入本文。

在一些实施方式中，核苷修饰的mRNA不激活任何病理生理途径，转化非常有效并且几乎在递送后立即转化，并且用作持续几天至几周的体内连续蛋白质生产的模板(Karikó等人,2008,Mol Ther 16:1833-1840；Karikó等人,2012,Mol Ther 20:948-953)。发挥生理作用所需的mRNA的量较小，这使其适用于人疗法。例如，如本文所描述的，编码NoV抗原的核苷修饰的mRNA已显示出诱导抗原特异性抗体产生的能力。例如，在一些情况下，与通过非修饰的mRNA编码的抗原相比，通过核苷修饰的mRNA所编码的抗原引起更大的抗原特异性抗体生产。

在一些情况下，与使用蛋白、质粒DNA或病毒载体的方法相比，通过递送编码mRNA表达蛋白具有多种益处。在mRNA转染期间，所期望的蛋白的编码序列是递送至细胞的唯一物质，因此避免了与质粒主链、病毒基因和病毒蛋白质有关的所有副作用。更重要地，不同于DNA-和病毒-基载体，mRNA不具有引入基因组的风险并且在mRNA递送后立即开始蛋白质生产。例如，已在体内注射编码mRNA 15至30分钟内测量到高水平的循环蛋白。在一些实施方式中，使用mRNA而不是蛋白也具有多种优势。蛋白在循环或在组织中的半衰期通常较短，因此蛋白处理将需要频繁的剂量施用，同时mRNA提供了几天至几周的连续蛋白质生产的模板。蛋白纯化是成问题的并且它们可以含有引起副作用的聚集物及其他杂质(Krommingaand Schellekens,2005,Ann NY Acad Sci 1050:257-265)。

在一些实施方式中，核苷修饰的RNA包含天然存在的修饰的-核苷假尿苷。在一些实施方式中，假尿苷的包含使得mRNA更稳定、非免疫原性且高度可翻译(Karikó等人,2008,Mol Ther 16:1833-1840；Anderson等人,2010,Nucleic Acids Res 38:5884-5892；Anderson等人,2011,Nucleic Acids Research 39:9329-9338；Karikó等人,2011,NucleicAcids Research39:e142；Karikó等人,2012,Mol Ther 20:948-953；Karikó等人,2005,Immunity 23:165-175)。

已证实修饰的核苷，包括假尿苷在RNA中的存在抑制它们先天免疫原性(Karikó等人,2005,Immunity 23:165-175)。此外，可以比不含或含有其他修饰的核苷的RNA更有效地转化蛋白编码性、体外转录的含有假尿苷的RNA(Karikó等人,2008,Mol Ther 16:1833-1840)。随后，已表明假尿苷的存在改善了RNA的稳定性(Anderson等人,2011,NucleicAcids Research 39:9329-9338)并且降低了PKR的激活和翻译的抑制两者(Anderson等人,2010,Nucleic Acids Res 38:5884-5892)。

对于含有1-甲基-假尿苷的RNA也观察到了如对于假尿苷所述的类似作用。

在一些实施方式中，核苷修饰的核酸分子是纯化的核苷修饰的核酸分子。例如，在一些实施方式中，纯化组合物以除去双链污染物。在一些情况下，将制备型高效液相色谱(HPLC)纯化程序用于获得具有优良翻译潜力且无先天免疫原性的含有假尿苷的RNA(Karikó等人,2011,Nucleic Acids Research 39:e142)。将编码促红细胞生成素的HPLC纯化的含假尿苷的RNA施用于小鼠和猕猴导致血清EPO水平显著升高(karikó等人,2012,Mol Ther20:948-953)，因此确认含假尿苷的mRNA适合于体内蛋白疗法。在一些实施方式中，使用非HPLC方法纯化核苷修饰的核酸分子。在一些情况下，使用色谱方法纯化核苷修饰的核酸分子，方法包括但不限于HPLC和快速蛋白液相色谱(FPLC)。示例性的基于FPLC的纯化程序描述于Weissman等人,2013,Methods Mol Biol,969:43-54。在美国专利申请公开号US2016/0032316中也描述了示例性纯化程序，该专利申请公开以其全部内容作为参考并入本文。

本发明涵盖了包含假尿苷或修饰的核苷的RNA、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸分子。在一些实施方式中，组合物包含编码抗原的分离的核酸，其中所述核酸包含假尿苷或修饰的核苷。在一些实施方式中，组合物包含载体，载体包含编码抗原的分离的核酸、佐剂或其组合，其中所述核酸包含假尿苷或修饰的核苷。

在一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA是IVT RNA，如在本文其他地方所描述的。例如，在一些实施方式中，通过T7噬菌体RNA聚合酶合成了核苷修饰的RNA。在另一个实施方式中，通过SP6噬菌体mRNA聚合酶合成了核苷修饰的mRNA。在另一个实施方式中，通过T3噬菌体mRNA聚合酶合成了核苷修饰的RNA。

在一个实施方式中，修饰的核苷是m¹acp³Ψ(1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m¹ψ(1-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是ψm(2'-O-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m⁵D(5-甲基二氢尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m³Ψ(3-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是未进一步修饰的假尿苷部分。在另一个实施方式中，修饰的核苷是任何以上假尿苷的单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。在另一个实施方式中，修饰的核苷是本领域中已知的任何其他假尿苷样核苷。

在另一个实施方式中，在本发明的核苷修饰的RNA中修饰的核苷是尿嘧啶核苷(U)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是胞苷(C)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是腺苷酸(A)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是鸟苷(G)。

在另一个实施方式中，本发明所述的修饰的核苷是m⁵C(5-甲基胞苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m⁵U(5-甲基尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m⁶A(N⁶-甲基腺苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是s²U(2-硫尿核苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是Ψ(假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是Um(2'-O-甲基尿嘧啶核苷)。

在其他实施方式中，修饰的核苷是m¹A(1-甲基腺苷)；m²A(2-甲基腺苷)；Am(2’-O-甲基腺苷)；ms²m⁶A(2-甲基硫代-N⁶-甲基腺苷)；i⁶A(N⁶-异戊烯基腺苷)；ms²i6A(2-甲基硫代-N⁶异戊烯基腺苷)；io⁶A(N⁶-(顺羟基异戊烯基)腺苷)；ms²io⁶A(2-甲基硫代-N⁶-(顺羟基异戊烯基)腺苷)；g⁶A(N⁶-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷)；t⁶A(N⁶-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；ms²t⁶A(2-甲基硫代-N⁶-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；m⁶t⁶A(N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；hn⁶A(N⁶-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷)；ms²hn⁶A(2-甲基硫代-N⁶-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷)；Ar(p)(2’-O-核糖基腺苷(磷酸酯))；I(肌苷)；m¹I(1-甲基肌苷)；m¹Im(1,2’-O-二甲基肌苷)；m³C(3-甲基胞苷)；Cm(2’-O-甲基胞苷)；s²C(2-硫代胞苷)；ac⁴C(N⁴-乙酰基胞苷)；f⁵C(5-甲酰基胞苷)；m⁵Cm(5,2’-O-二甲基胞苷)；ac⁴Cm(N⁴-乙酰基-2’-O-甲基胞苷)；k²C(赖胞苷)；m¹G(1-甲基鸟苷)；m²G(N²-甲基鸟苷)；m⁷G(7-甲基鸟苷)；Gm(2’-O-甲基鸟苷)；m² ₂G(N²,N²-二甲基鸟苷)；m²Gm(N²,2’-O-二甲基鸟苷)；m² ₂Gm(N²,N²,2’-O-三甲基鸟苷)；Gr(p)(2’-O-核糖基鸟苷(磷酸酯))；yW(怀丁苷)；o₂yW(过氧怀丁苷)；OHyW(羟基怀丁苷)；OHyW*(修饰不完全的羟基怀丁苷)；imG(怀俄苷)；mimG(甲基怀俄苷)；Q(辫苷)；oQ(环氧基辫苷)；galQ(半乳糖基-辫苷)；manQ(甘露糖基-辫苷)；preQ₀(7-氰基-7-去氮鸟苷)；preQ₁(7-氨基甲基-7-去氮鸟苷)；G⁺(古嘌苷)；D(二氢尿苷)；m⁵Um(5,2’-O-二甲基尿苷)；s⁴U(4-硫代尿苷)；m⁵s²U(5-甲基-2-硫代尿苷)；s²Um(2-硫代-2’-O-甲基尿苷)；acp³U(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷)；ho⁵U(5-羟基尿苷)；mo⁵U(5-甲氧基尿苷)；cmo⁵U(尿苷5-羟乙酸)；mcmo⁵U(尿苷5-羟乙酸甲酯)；chm⁵U(5-(羧基羟基甲基)尿苷)；mchm⁵U(5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯)；mcm⁵U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm⁵Um(5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基尿苷)；mcm⁵s²U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷)；nm⁵s²U(5-氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm⁵U(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm⁵s²U(5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm⁵se²U(5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷)；ncm⁵U(5-氨基甲酰基甲基尿苷)；ncm⁵Um(5-氨基甲酰基甲基-2’-O-甲基尿苷)；cmnm⁵U(5-羧基甲基氨基甲基尿苷)；cmnm⁵Um(5-羧基甲基氨基甲基-2’-O-甲基尿苷)；cmnm⁵s²U(5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；m⁶ ₂A(N⁶,N⁶-二甲基腺苷)；Im(2’-O-甲基肌苷)；m⁴C(N⁴-甲基胞苷)；m⁴Cm(N⁴,2’-O-二甲基胞苷)；hm⁵C(5-羟基甲基胞苷)；m³U(3-甲基尿苷)；cm⁵U(5-羧基甲基尿苷)；m⁶Am(N⁶,2’-O-二甲基腺苷)；m⁶ ₂Am(N⁶,N⁶,O-2’-三甲基腺苷)；m^2,7G(N²,7-二甲基鸟苷)；m^2,2,7G(N²,N²,7-三甲基鸟苷)；m³Um(3,2’-O-二甲基尿苷)；m⁵D(5-甲基二氢尿苷)；f⁵Cm(5-甲酰基-2’-O-甲基胞苷)；m¹Gm(1,2’-O-二甲基鸟苷)；m¹Am(1,2’-O-二甲基腺苷)；τm⁵U(5-牛磺酸甲基尿苷)；τm⁵s²U(5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷)；imG-14(4-去甲基怀俄苷)；imG2(异怀俄苷)；或者ac⁶A(N⁶-乙酰基腺苷)。

在另一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA包含2个或以上上述修饰的组合。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA包含3个或以上上述修饰的组合。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA包含大于3个上述修饰的组合。

在多个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA中0.1％至100％的残基是修饰的(例如，通过假尿苷、1-甲基-假尿苷、5-甲基-尿苷或者另一种修饰的核苷碱基的存在)。在一个实施方式中，修饰残基的份数为0.1％。在另一个实施方式中，修饰残基的份数为0.2％。在另一个实施方式中，份数为0.3％。在另一个实施方式中，份数为0.4％。在另一个实施方式中，份数为0.5％。在另一个实施方式中，份数为0.6％。在另一个实施方式中，份数为0.7％。在另一个实施方式中，份数为0.8％。在另一个实施方式中，份数为0.9％。在另一个实施方式中，份数为1％。在另一个实施方式中，份数为1.5％。在另一个实施方式中，份数为2％。在另一个实施方式中，份数为2.5％。在另一个实施方式中，份数为3％。在另一个实施方式中，份数为4％。在另一个实施方式中，份数为5％。在另一个实施方式中，份数为6％。在另一个实施方式中，份数为7％。在另一个实施方式中，份数为8％。在另一个实施方式中，份数为9％。在另一个实施方式中，份数为10％。在另一个实施方式中，份数为12％。在另一个实施方式中，份数为14％。在另一个实施方式中，份数为16％。在另一个实施方式中，份数为18％。在另一个实施方式中，份数为20％。在另一个实施方式中，份数为25％。在另一个实施方式中，份数为30％。在另一个实施方式中，份数为35％。在另一个实施方式中，份数为40％。在另一个实施方式中，份数为45％。在另一个实施方式中，份数为50％。在另一个实施方式中，份数为55％。在另一个实施方式中，份数为60％。在另一个实施方式中，份数为65％。在另一个实施方式中，份数为70％。在另一个实施方式中，份数为75％。在另一个实施方式中，份数为80％。在另一个实施方式中，份数为85％。在另一个实施方式中，份数为90％。在另一个实施方式中，份数为91％。在另一个实施方式中，份数为92％。在另一个实施方式中，份数为93％。在另一个实施方式中，份数为94％。在另一个实施方式中，份数为95％。在另一个实施方式中，份数为96％。在另一个实施方式中，份数为97％。在另一个实施方式中，份数为98％。在另一个实施方式中，份数为99％。在另一个实施方式中，份数为100％.

在另一个实施方式中，份数为小于5％。在另一个实施方式中，份数为小于3％。在另一个实施方式中，份数为小于1％。在另一个实施方式中，份数为小于2％。在另一个实施方式中，份数为小于4％。在另一个实施方式中，份数为小于6％。在另一个实施方式中，份数为小于8％。在另一个实施方式中，份数为小于10％。在另一个实施方式中，份数为小于12％。在另一个实施方式中，份数为小于15％。在另一个实施方式中，份数为小于20％。在另一个实施方式中，份数为小于30％。在另一个实施方式中，份数为小于40％。在另一个实施方式中，份数为小于50％。在另一个实施方式中，份数为小于60％。在另一个实施方式中，份数为小于70％。

在另一个实施方式中，给定核苷(即尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷或腺嘌呤核苷)的0.1％的残基是修饰的。在另一个实施方式中，修饰残基的份数为0.2％。在另一个实施方式中，份数为0.3％。在另一个实施方式中，份数为0.4％。在另一个实施方式中，份数为0.5％。在另一个实施方式中，份数为0.6％。在另一个实施方式中，份数为0.7％。在另一个实施方式中，份数为0.8％。在另一个实施方式中，份数为0.9％。在另一个实施方式中，份数为1％。在另一个实施方式中，份数为1.5％。在另一个实施方式中，份数为2％。在另一个实施方式中，份数为2.5％。在另一个实施方式中，份数为3％。在另一个实施方式中，份数为4％。在另一个实施方式中，份数为5％。在另一个实施方式中，份数为6％。在另一个实施方式中，份数为7％。在另一个实施方式中，份数为8％。在另一个实施方式中，份数为9％。在另一个实施方式中，份数为10％。在另一个实施方式中，份数为12％。在另一个实施方式中，份数为14％。在另一个实施方式中，份数为16％。在另一个实施方式中，份数为18％。在另一个实施方式中，份数为20％。在另一个实施方式中，份数为25％。在另一个实施方式中，份数为30％。在另一个实施方式中，份数为35％。在另一个实施方式中，份数为40％。在另一个实施方式中，份数为45％。在另一个实施方式中，份数为50％。在另一个实施方式中，份数为55％。在另一个实施方式中，份数为60％。在另一个实施方式中，份数为65％。在另一个实施方式中，份数为70％。在另一个实施方式中，份数为75％。在另一个实施方式中，份数为80％。在另一个实施方式中，份数为85％。在另一个实施方式中，份数为90％。在另一个实施方式中，份数为91％。在另一个实施方式中，份数为92％。在另一个实施方式中，份数为93％。在另一个实施方式中，份数为94％。在另一个实施方式中，份数为95％。在另一个实施方式中，份数为96％。在另一个实施方式中，份数为97％。在另一个实施方式中，份数为98％。在另一个实施方式中，份数为99％。在另一个实施方式中，份数为100％。在另一个实施方式中，修饰的给定核苷酸的份数为小于8％。在另一个实施方式中，份数为小于10％。在另一个实施方式中，份数为小于5％。在另一个实施方式中，份数为小于3％。在另一个实施方式中，份数为小于1％。在另一个实施方式中，份数为小于2％。在另一个实施方式中，份数为小于4％。在另一个实施方式中，份数为小于6％。在另一个实施方式中，份数为小于12％。在另一个实施方式中，份数为小于15％。在另一个实施方式中，份数为小于20％。在另一个实施方式中，份数为小于30％。在另一个实施方式中，份数为小于40％。在另一个实施方式中，份数为小于50％。在另一个实施方式中，份数为小于60％。在另一个实施方式中，份数为小于70％。

在一些实施方式中，组合物包含单链核苷修饰的RNA的纯化制剂。例如，在一些实施方式中，单链核苷修饰的RNA的纯化制剂基本不含双链RNA(dsRNA)。在一些实施方式中，相对于所有其他核酸分子(DNA、dsRNA等)，纯化制剂是至少90％，或者至少91％，或者至少92％，或者至少93％，或者至少94％，或者至少95％，或者至少96％，或者至少97％，或者至少98％，或者至少99％，或者至少99.5％，或者至少99.9％的单链核苷修饰的RNA。

在另一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA在细胞中的翻译比具有相同序列的未修饰的RNA分子更有效。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA显示出增强的被靶细胞翻译的能力。在另一个实施方式中，相对于其未修饰的对应物，翻译增强2倍。在另一个实施方式中，翻译增强3倍。在另一个实施方式中，翻译增强4倍。在另一个实施方式中，翻译增强5倍。在另一个实施方式中，翻译增强6倍。在另一个实施方式中，翻译增强7倍。在另一个实施方式中，翻译增强8倍。在另一个实施方式中，翻译增强9倍。在另一个实施方式中，翻译增强10倍。在另一个实施方式中，翻译增强15倍。在另一个实施方式中，翻译增强20倍。在另一个实施方式中，翻译增强50倍。在另一个实施方式中，翻译增强100倍。在另一个实施方式中，翻译增强200倍。在另一个实施方式中，翻译增强500倍。在另一个实施方式中，翻译增强1000倍。在另一个实施方式中，翻译增强2000倍。在另一个实施方式中，倍数是10至1000倍。在另一个实施方式中，倍数是10至100倍。在另一个实施方式中，倍数是10至200倍。在另一个实施方式中，倍数是10至300倍。在另一个实施方式中，倍数是10至500倍。在另一个实施方式中，倍数是20至1000倍。在另一个实施方式中，倍数是30至1000倍。在另一个实施方式中，倍数是50至1000倍。在另一个实施方式中，倍数是100至1000倍。在另一个实施方式中，倍数是200至1000倍。在另一个实施方式中，翻译增强任何其他显著的量或量的范围。

在另一个实施方式中，与相同序列未修饰的体外合成的RNA分子相比，本发明的核苷修饰的抗原-编码RNA诱导显著更稳健的适应性免疫反应。在另一个实施方式中，修饰的RNA分子诱导比其未修饰的对应物大2倍的适应性免疫反应。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强3倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强4倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强5倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强6倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强7倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强8倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强9倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强10倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强15倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强20倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强50倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强100倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强200倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强500倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强1000倍。在另一个实施方式中，适应性免疫反应增强2000倍。在另一个实施方式中，所述适应性免疫反应增强另一种倍数差异。

在另一个实施方式中，“诱导显著更稳健的适应性免疫反应”是指适应性免疫反应可检测的增强。在另一个实施方式中，该术语是指适应性免疫反应的成倍增强(例如，以上列举的增强倍数之一)。在另一个实施方式中，该术语是指使得可以以比未修饰的RNA分子更低的剂量或频率施用核苷修饰的RNA，同时仍诱导类似有效的适应性免疫反应的增强。在另一个实施方式中，所述增强使得可以使用单一剂量施用核苷修饰的RNA以诱导有效的适应性免疫反应。

在另一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA显示出比具有相同序列的未修饰的体外合成的RNA分子显著较低的先天免疫原性。在另一个实施方式中，修饰的RNA分子显示出比其未修饰的对应物小2倍的先天性免疫应答。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了3倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了4倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了5倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了6倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了7倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了8倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了9倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了10倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了15倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了20倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了50倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了100倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了200倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了500倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了1000倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了2000倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低另一倍数差异。

在另一个实施方式中，“显示出显著较低的先天免疫原性”是指先天免疫原性的可检测降低。在另一个实施方式中，该术语是指先天免疫原性的成倍降低(例如，以上列举的降低倍数之一)。在另一个实施方式中，该术语是指使得可以施用有效量的核苷修饰的RNA但不会引发可检测的先天性免疫应答的降低。在另一个实施方式中，该术语是指使得可以反复施用核苷修饰的RNA，但不会引起足以可检测地降低修饰的RNA所编码的蛋白的产生的先天性免疫应答的降低。在另一个实施方式中，所述降低使得可以反复施用核苷修饰的RNA，但不会引起足以消除修饰的RNA所编码的蛋白的可检测的产生的先天性免疫应答的降低。

脂质纳米颗粒

在一个实施方式中，核苷修饰的RNA的递送包括任何适合的递送方法，包括本文其他处所述的示例性RNA转染方法。在一些实施方式中，核苷修饰的RNA向受试者的递送包括在接触步骤前，将核苷修饰的RNA与转染试剂混合。在另一个实施方式中，本发明的方法还包括与转染试剂一起施用核苷修饰的RNA。在另一个实施方式中，转染试剂是阳离子脂质试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是阳离子聚合物试剂。

在另一个实施方式中，转染试剂是基于脂质的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于蛋白的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于碳水化合物的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于阳离子脂质的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于阳离子聚合物的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是聚乙烯亚胺基转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是磷酸钙。在另一个实施方式中，转染试剂是或在另一个实施方式中，转染试剂是本领域中已知的任何其他转染试剂。

在另一个实施方式中，转染试剂形成脂质体。在另一个实施方式中，脂质体提高胞内稳定性，提高吸收效率并改善生物活性。在另一个实施方式中，脂质体是由以与组成细胞膜的那些脂质类似的方式排列的脂质所组成的中空球形囊泡。在另一个实施方式中，它们具有用于包埋水溶性化合物并直径尺寸在0.05至几微米范围内的内部水性空间。在另一个实施方式中，脂质体可以将RNA以生物学活性形式递送至细胞。

在一个实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)和本文所描述的一种或多种核酸分子。例如，在一个实施方式中，组合物包含LNP和编码一种或多种抗原、佐剂或它们的组合的一种或多种核苷修饰的RNA分子。

在一些实施方式中，脂质纳米颗粒是具有约纳米(例如，1-1,000nm)的至少一维尺度的颗粒。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包含一种或多种脂质。例如，在一些实施方式中，脂质包含化学式(I)、(II)或(III)所示的脂质。

在一些实施方式中，在包含如本文所描述的核苷修饰的RNA的制剂中包含脂质纳米颗粒。在一些实施方式中，这些脂质纳米颗粒包含阳离子脂质(例如，化学式(I)、(II)或(III)所示的脂质)和选自下列的一种或多种赋形剂：中性脂质、荷电脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质(例如，PEG化脂质，如具有结构(IV)的PEG化脂质)。在一些实施方式中，核苷修饰的RNA封装在脂质纳米颗粒的脂质部分或者通过脂质纳米颗粒的一些或全部脂质部分包围的水性空间中，借此保护它避免被酶促降解或者避免通过宿主生物或细胞机制诱导的其他不期望的影响，如不利的免疫应答。

在多个实施方式中，脂质纳米颗粒的平均直径为约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm，或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm，并且是基本无毒的。在一些实施方式中，当存在于脂质纳米颗粒中时，核苷修饰的RNA在水溶液中耐受核酸酶的降解。

LNP可以包含能够形成一个或多个核酸分子与之附接或者其中封装了一个或多个核酸分子的颗粒的任何脂质。

在一个实施方式中，LNP包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和PEG化脂质。

在一个实施方式中，LNP包含阳离子脂质。在一些实施方式中，阳离子脂质包含在选择性pH，如生理学pH携带净正电荷的任何一些脂质物质。这类脂质包括但不限于N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)；N-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化氨(DOTMA)；N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化氨(DOTAP)；3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺)乙基)-N,N-二甲基三氟醋酸铵(DOSPA)、双十八烷基氨基甘氨酰羧基精胺(DOGS)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、N,N-二甲基-2,3-二油酰基氧基丙胺(DODMA)和N-(1,2-二肉豆蔻基氧代丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。另外，可以在本发明中使用的一些阳离子脂质的商品化制剂是可获得的。这些包括，例如，(可商购的阳离子脂质体，其包含DOTMA和1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，来自GIBCO/BRL，Grand Island,N.Y.)；(可商购的阳离子脂质体，其包含N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰胺)乙基)-N,N-二甲基三氟醋酸铵(DOSPA)和(DOPE)，来自GIBCO/BRL)；和(可商购的阳离子脂质，其包含处于乙醇中的双十八烷基氨基甘氨酰羧基精胺(DOGS)，来自Promega Corp.,Madison,Wis.)。以下脂质是阳离子的并且在低于生理学pH下具有正电荷：DODAP、DODMA、DMDMA、1,2-二亚油醇基氧代-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻烯基氧代-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)。

在一个实施方式中，阳离子脂质是氨基脂质。在本发明中有用的适合的氨基脂质包括WO 2012/016184中所述的那些，该专利以其全部内容作为参考并入本文。代表性的氨基脂质包括但不限于1,2-二亚麻醇氧代-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚麻醇氧代-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚麻酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚麻醇硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚麻醇氧代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油醇基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚麻酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油醇基氧基-3-(N-甲基哌嗪并)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚麻醇氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油醇基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚麻醇氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)和2,2-二亚油醇基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)。

适合的氨基脂质包括具有化学式的那些：

其中R₁和R₂是相同或不同的并且独立地为可选地取代的C₁₀-C₂₄烷基、可选地取代的C₁₀-C₂₄烯基、可选地取代的C₁₀-C₂₄炔基或者可选地取代的C₁₀-C₂₄酰基；

R₃和R₄是相同或不同的并且独立地为可选地取代的C₁-C₆烷基、可选地取代的C₂-C₆烯基或可选地取代的C₂-C₆炔基，或者R₃和R₄可以连接以形成具有4至6个碳原子和选自氮和氧的1或2个杂原子的可选地取代的杂环；

R₅是不存在或存在的，并且当存在时，是氢或C₁-C₆烷基；

m、n和p是相同或不同的，并且独立地为0或1，但条件是m、n和p不同时为0；

q是0、1、2、3或4；和

Y和Z是相同或不同的并且独立地为O、S或NH。

在一个实施方式中，R₁和R₂分别为亚油烯基，并且氨基脂质是二亚油醇基氨基脂质。在一个实施方式中，氨基脂质是二亚油醇基氨基脂质。

代表性的有用的二亚油醇基氨基脂质具有以下化学式：

其中n是0、1、2、3或4。

在一个实施方式中，阳离子脂质是DLin-K-DMA。在一个实施方式中，阳离子脂质是DLin-KC2-DMA(以上的DLin-K-DMA，其中n是2)。

在一个实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有化学式(I)所示的结构：

或其药学上可接受的盐、互变异构体、前体药物或立体异构体，其中：

L¹和L²分别独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或碳-碳双键；

R^1a和R^1b在每次出现时独立地为(a)H或C₁-C₁₂烷基，或者(b)R^1a为H或C₁-C₁₂烷基，并且R^1b与它所结合的碳原子一起和相邻的R^1b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；

R^2a和R^2b在每次出现时独立地为(a)H或C₁-C₁₂烷基，或(b)R^2a为H或C₁-C₁₂烷基，并且R^2b与它所结合的碳原子一起和相邻的R^2b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；

R^3a和R^3b在每次出现时独立地为(a)H或C₁-C₁₂烷基，或(b)R^3a为H或C₁-C₁₂烷基，并且R^3b与它所结合的碳原子一起和相邻的R^3b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；

R^4a和R^4b在每次出现时独立地为(a)H或C₁-C₁₂烷基，或(b)R^4a为H或C₁-C₁₂烷基，并且R^4b与它所结合的碳原子一起和相邻的R^4b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；

R⁵和R⁶分别独立地为甲基或环烷基；

R⁷在每次出现时独立地为H或C₁-C₁₂烷基；

R⁸和R⁹分别独立地为C₁-C₁₂烷基；或者R⁸和R⁹，与它们所连接的氮原子一起，形成包含一个氮原子的5、6或7-元杂环；

a和d分别独立地为0至24的整数；

b和c分别独立地为1至24的整数；和

e是1或2。

在化学式(I)的一些实施方式中，R^1a、R^2a、R^3a或R^4a中的至少一个是C₁-C₁₂烷基或者L¹或L²中的至少一个是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-。在其他实施方式中，当a为6时，R^1a和R^1b不是异丙基，或者当a为8时，为正丁基。

在化学式(I)的其他实施方式中，R^1a、R^2a、R^3a或R^4a中的至少一个是C₁-C₁₂烷基或者L¹或L²中的至少一个是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；且

当a为6时，R^1a和R^1b不是异丙基，或者当a为8时，为正丁基。

在化学式(I)的其他实施方式中，R⁸和R⁹分别独立地为未取代的C₁-C₁₂烷基；或者R⁸和R⁹，与它们所连接的氮原子一起，形成包含一个氮原子的5、6或7-元杂环；

在化学式(I)的一些实施方式中，L¹或L²中的任一个可以是-O(C＝O)-或碳-碳双键。L¹和L²分别可以是-O(C＝O)-或者分别可以是碳-碳双键。

在化学式(I)的一些实施方式中，L¹或L²之一是-O(C＝O)-。在其他实施方式中，L¹和L²两者为-O(C＝O)-。

在化学式(I)的一些实施方式中，L¹或L²之一是-(C＝O)O-。在其他实施方式中，L¹和L²两者为-(C＝O)O-。

在化学式(I)的一些其他实施方式中，L¹或L²之一是碳-碳双键。在其他实施方式中，L¹和L²两者为碳-碳双键。

在化学式(I)的其他实施方式中，L¹或L²之一是-O(C＝O)-并且L¹或L²中的另一个是-(C＝O)O-。在更多实施方式中，L¹或L²之一是-O(C＝O)-并且L¹或L²中的另一个是碳-碳双键。在更多实施方式中，L¹或L²之一是-(C＝O)O-并且L¹或L²中的另一个是碳-碳双键。

应理解如在整个说明书中所使用的，“碳-碳”双键是指以下结构之一：

其中R^a和R^b在每次出现时独立地为H或取代基。例如，在一些实施方式中，R^a和R^b在每次出现时独立地为H、C₁-C₁₂烷基或环烷基，例如，H或C₁-C₁₂烷基。

在其他实施方式中，化学式(I)所示的脂质化合物具有以下结构(Ia)：

在其他实施方式中，化学式(I)所示的脂质化合物具有以下结构(Ib)：

在其他实施方式中，化学式(I)所示的脂质化合物具有以下结构(Ic)：

在化学式(I)所示的脂质化合物的一些实施方式中，a、b、c和d分别独立地为2至12的整数或者4至12的整数。在其他实施方式中，a、b、c和d分别独立地为8至12或5至9的整数。在一些实施方式中，a为0。在一些实施方式中，a为1。在其他实施方式中，a为2。在更多实施方式中，a为3。在又一其他实施方式中，a为4。在一些实施方式中，a为5。在其他实施方式中，a为6。在更多实施方式中，a为7。在又一其他实施方式中，a为8。在一些实施方式中，a为9。在其他实施方式中，a为10。在更多实施方式中，a为11。在又一其他实施方式中，a为12。在一些实施方式中，a为13。在其他实施方式中，a为14。在更多实施方式中，a为15。在又一其他实施方式中，a为16。

在化学式(I)的一些其他实施方式中，b为1。在其他实施方式中，b为2。在更多实施方式中，b为3。在又一其他实施方式中，b为4。在一些实施方式中，b为5。在其他实施方式中，b为6。在更多实施方式中，b为7。在又一其他实施方式中，b为8。在一些实施方式中，b为9。在其他实施方式中，b为10。在更多实施方式中，b为11。在又一其他实施方式中，b为12。在一些实施方式中，b为13。在其他实施方式中，b为14。在更多实施方式中，b为15。在又一其他实施方式中，b为16。

在化学式(I)的一些更多实施方式中，c为1。在其他实施方式中，c为2。在更多实施方式中，c为3。在又一其他实施方式中，c为4。在一些实施方式中，c为5。在其他实施方式中，c为6。在更多实施方式中，c为7。在又一其他实施方式中，c为8。在一些实施方式中，c为9。在其他实施方式中，c为10。在更多实施方式中，c为11。在又一其他实施方式中，c为12。在一些实施方式中，c为13。在其他实施方式中，c为14。在更多实施方式中，c为15。在又一其他实施方式中，c为16。

在化学式(I)的一些其他实施方式中，d为0。在一些实施方式中，d为1。在其他实施方式中，d为2。在更多实施方式中，d为3。在又一其他实施方式中，d为4。在一些实施方式中，d为5。在其他实施方式中，d为6。在更多实施方式中，d为7。在又一其他实施方式中，d为8。在一些实施方式中，d为9。在其他实施方式中，d为10。在更多实施方式中，d为11。在又一其他实施方式中，d为12。在一些实施方式中，d为13。在其他实施方式中，d为14。在更多实施方式中，d为15。在又一其他实施方式中，d为16。

在化学式(I)的一些其他多个实施方式中，a和d相同。在一些其他实施方式中，b和c相同。在一些其他具体实施方式中，a和d相同且b和c相同。

化学式(I)中a和b之和以及c和d之和是可以改变以获得具有所期望的性质的化学式(I)所示的脂质的因素。在一个实施方式中，选择a和b，从而它们的和为14至24的整数。在其他实施方式中，选择c和d，从而它们的和为14至24的整数。在其他实施方式中，a和b之和与c和d之和相同。例如，在一些实施方式中，a和b之和以及c和d之和均为相同整数，其可以在14至24的范围内。在更多实施方式中，选择a、b、c和d，从而a和b之和以及c和d之和为12或以上。

在化学式(I)的一些实施方式中，e为1。在其他实施方式中，e为2。

未具体限制在化学式(I)的R^1a、R^2a、R^3a和R^4a处的取代基。在一些实施方式中，R^1a、R^2a、R^3a和R^4a在每次出现时为H。在一些其他实施方式中，R^1a、R^2a、R^3a和R^4a中的至少一个是C₁-C₁₂烷基。在一些其他实施方式中，R^1a、R^2a、R^3a和R^4a中的至少一个是C₁-C₈烷基。在一些其他实施方式中，R^1a、R^2a、R^3a和R^4a中的至少一个是C₁-C₆烷基。在以上实施方式中的一些中，C₁-C₈烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。

在化学式(I)的一些实施方式中，R^1a、R^1b、R^4a和R^4b在每次出现时是C₁-C₁₂烷基。

在化学式(I)的其他实施方式中，R^1b、R^2b、R^3b和R^4b中的至少一个是H，或者R^1b、R^2b、R^3b和R^4b在每次出现时为H。

在化学式(I)的一些实施方式中，R^1b与它所结合的碳原子一起与相邻R^1b和它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。在上述其他实施方式中，R^4b与它所结合的碳原子一起与相邻R^4b和它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。

在上述实施方式中未具体限制在化学式(I)的R⁵和R⁶处的取代基。在一些实施方式中，R⁵或R⁶之一或两者是甲基。在一些其他实施方式中，R⁵或R⁶之一或两者是环烷基，例如环己基。在这些实施方式中，所述环烷基可以被取代或未被取代。在一些其他实施方式中，所述环烷基被C₁-C₁₂烷基，例如叔丁基取代。

在化学式(I)的上述实施方式中未具体限制R⁷处的取代基。在一些实施方式中，至少一种R⁷是H。在一些其他实施方式中，R⁷在每次出现时为H。在一些其他实施方式中，R⁷是C₁-C₁₂烷基。

在化学式(I)的上述实施方式的一些其他实施方式中，R⁸或R⁹之一是甲基。在其他实施方式中，R⁸和R⁹两者是甲基。

在化学式(I)的一些不同实施方式中，R⁸和R⁹与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7-元杂环。在上述的一些实施方式中，R⁸和R⁹与它们所连接的氮原子一起形成5元杂环，例如吡咯烷基环。

在多种不同实施方式中，化学式(I)所示的脂质具有下表1所示的结构之一。

表1：化学式(I)所示的代表性脂质。

在一些实施方式中，LNP包含化学式(I)所示的脂质、核苷修饰的RNA和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，化学式(I)所示的脂质是化合物I-5。在一些实施方式中，化学式(I)所示的脂质是化合物I-6。

在一些其他实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有化学式(II)所示的结构：

L¹和L²分别独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、

-S(O)_x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、-NR^aC(＝O)NR^a、

-OC(＝O)NR^a-、-NR^aC(＝O)O-或直接的键；

G¹是C₁-C₂亚烷基、-(C＝O)-、-O(C＝O)-、-SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-或直接的键；

G²是-C(＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-、-C(＝O)NR^a或直接的键；

G³是C₁-C₆亚烷基；

R^a是H或C₁-C₁₂烷基；

R^1a和R^1b在每次出现时独立地为：(a)H或C₁-C₁₂烷基；或者(b)R^1a为H或C₁-C₁₂烷基，并且R^1b与它所结合的碳原子一起和相邻R^1b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；

R^2a和R^2b在每次出现时独立地为：(a)H或C₁-C₁₂烷基；或者(b)R^2a为H或C₁-C₁₂烷基，并且R^2b与它所结合的碳原子一起和相邻R^2b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；

R^3a和R^3b在每次出现时独立地为：(a)H或C₁-C₁₂烷基；或者(b)R^3a为H或C₁-C₁₂烷基，并且R^3b与它所结合的碳原子一起和相邻R^3b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；

R^4a和R^4b在每次出现时独立地为：(a)H或C₁-C₁₂烷基；或者(b)R^4a为H或C₁-C₁₂烷基，并且R^4b与它所结合的碳原子一起和相邻R^4b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；

R⁵和R⁶分别独立地为H或甲基；

R⁷是C₄-C₂₀烷基；

R⁸和R⁹分别独立地为C₁-C₁₂烷基；或者R⁸和R⁹，与它们所连接的氮原子一起，形成5、6或7-元杂环；

a、b、c和d分别独立地为1至24的整数；和

x为0、1或2。

在化学式(II)的一些实施方式中，L¹和L²分别独立地为

-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或直接的键。在其他实施方式中，G¹和G²分别独立地为-(C＝O)-或直接的键。在一些不同的实施方式中，L¹和L²分别独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或直接的键；并且G¹和G²分别独立地为-(C＝O)-或直接的键。

在化学式(II)的一些不同的实施方式中，L¹和L²分别独立地为-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NR^a-、-NR^aC(＝O)-、

-C(＝O)NR^a-、-NR^aC(＝O)NR^a、-OC(＝O)NR^a-、-NR^aC(＝O)O-、-NR^aS(O)_xNR^a-、

-NR^aS(O)_x-或-S(O)_xNR^a-。

在化学式(II)的上述实施方式的其他实施方式中，脂质化合物具有(IIA)或(IIB)所示的下列结构之一：

在化学式(II)的一些实施方式中，脂质化合物具有结构(IIA)。在其他实施方式中，脂质化合物具有结构(IIB)。

在化学式(II)的任何上述实施方式中，L¹或L²之一是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方式中，L¹和L²中的每一个为-(C＝O)O-。

在化学式(II)的一些不同的实施方式中，L¹或L²之一是-(C＝O)O-。例如，在一些实施方式中，L¹和L²中的每一个为-(C＝O)O-。

在化学式(II)的不同实施方式中，L¹或L²之一是直接的键。如本文所使用的，“直接的键”表示基团(例如，L¹或L²)不存在。例如，在一些实施方式中，L¹和L²中的每一个是直接的键。

在化学式(II)的其他不同实施方式中，对于R^1a和R^1b的至少一次出现，R^1a为H或C₁-C₁₂烷基，并且R^1b与它所结合的碳原子一起和相邻的R^1b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。

在化学式(II)的其他不同实施方式中，对于R^4a和R^4b的至少一次出现，R^4a为H或C₁-C₁₂烷基，并且R^4b与它所结合的碳原子一起和相邻的R^4b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。

在化学式(II)的其他实施方式中，对于R^2a和R^2b的至少一次出现，R^2a为H或C₁-C₁₂烷基，并且R^2b与它所结合的碳原子一起和相邻的R^2b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。

在化学式(II)的其他不同实施方式中，对于R^3a和R^3b的至少一次出现，R^3a为H或C₁-C₁₂烷基，并且R^3b与它所结合的碳原子一起和相邻的R^3b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。

在化学式(II)的多种其他实施方式中，脂质化合物具有(IIC)或(IID)所示的下列结构之一：

其中e、f、g和h分别独立地为1至12的整数。

在化学式(II)的一些实施方式中，脂质化合物具有结构(IIC)。在其他实施方式中，脂质化合物具有结构(IID)。

在结构(IIC)或(IID)的多个实施方式中，e、f、g和h分别独立地为4至10的整数。

在化学式(II)的一些实施方式中，a、b、c和d分别独立地为2至12的整数或者4至12的整数。在其他实施方式中，a、b、c和d分别独立地为8至12或5至9的整数。在一些实施方式中，a为0。在一些实施方式中，a为1。在其他实施方式中，a为2。在更多实施方式中，a为3。在又一其他实施方式中，a为4。在一些实施方式中，a为5。在其他实施方式中，a为6。在更多实施方式中，a为7。在又一其他实施方式中，a为8。在一些实施方式中，a为9。在其他实施方式中，a为10。在更多实施方式中，a为11。在又一其他实施方式中，a为12。在一些实施方式中，a为13。在其他实施方式中，a为14。在更多实施方式中，a为15。在又一其他实施方式中，a为16。

在化学式(II)的一些实施方式中，b为1。在其他实施方式中，b为2。在更多实施方式中，b为3。在又一其他实施方式中，b为4。在一些实施方式中，b为5。在其他实施方式中，b为6。在更多实施方式中，b为7。在又一其他实施方式中，b为8。在一些实施方式中，b为9。在其他实施方式中，b为10。在更多实施方式中，b为11。在又一其他实施方式中，b为12。在一些实施方式中，b为13。在其他实施方式中，b为14。在更多实施方式中，b为15。在又一其他实施方式中，b为16。

在化学式(II)的一些实施方式中，c为1。在其他实施方式中，c为2。在更多实施方式中，c为3。在又一其他实施方式中，c为4。在一些实施方式中，c为5。在其他实施方式中，c为6。在更多实施方式中，c为7。在又一其他实施方式中，c为8。在一些实施方式中，c为9。在其他实施方式中，c为10。在更多实施方式中，c为11。在又一其他实施方式中，c为12。在一些实施方式中，c为13。在其他实施方式中，c为14。在更多实施方式中，c为15。在又一其他实施方式中，c为16。

在化学式(II)的一些实施方式中，d为0。在一些实施方式中，d为1。在其他实施方式中，d为2。在更多实施方式中，d为3。在又一其他实施方式中，d为4。在一些实施方式中，d为5。在其他实施方式中，d为6。在更多实施方式中，d为7。在又一其他实施方式中，d为8。在一些实施方式中，d为9。在其他实施方式中，d为10。在更多实施方式中，d为11。在又一其他实施方式中，d为12。在一些实施方式中，d为13。在其他实施方式中，d为14。在更多实施方式中，d为15。在又一其他实施方式中，d为16。

在化学式(II)的一些实施方式中，e为1。在其他实施方式中，e为2。在更多实施方式中，e为3。在又一其他实施方式中，e为4。在一些实施方式中，e为5。在其他实施方式中，e为6。在更多实施方式中，e为7。在又一其他实施方式中，e为8。在一些实施方式中，e为9。在其他实施方式中，e为10。在更多实施方式中，e为11。在又一其他实施方式中，e为12。

在化学式(II)的一些实施方式中，f为1。在其他实施方式中，f为2。在更多实施方式中，f为3。在又一其他实施方式中，f为4。在一些实施方式中，f为5。在其他实施方式中，f为6。在更多实施方式中，f为7。在又一其他实施方式中，f为8。在一些实施方式中，f为9。在其他实施方式中，f为10。在更多实施方式中，f为11。在又一其他实施方式中，f为12。

在化学式(II)的一些实施方式中，g为1。在其他实施方式中，g为2。在更多实施方式中，g为3。在又一其他实施方式中，g为4。在一些实施方式中，g为5。在其他实施方式中，g为6。在更多实施方式中，g为7。在又一其他实施方式中，g为8。在一些实施方式中，g为9。在其他实施方式中，g为10。在更多实施方式中，g为11。在又一其他实施方式中，g为12。

在化学式(II)的一些实施方式中，h为1。在其他实施方式中，e为2。在更多实施方式中，h为3。在又一其他实施方式中，h为4。在一些实施方式中，e为5。在其他实施方式中，h为6。在更多实施方式中，h为7。在又一其他实施方式中，h为8。在一些实施方式中，h为9。在其他实施方式中，h为10。在更多实施方式中，h为11。在又一其他实施方式中，h为12。

在化学式(II)的一些其他多个实施方式中，a和d相同。在一些其他实施方式中，b和c相同。在一些其他具体实施方式中，a和d相同且b和c相同。

化学式(II)中a和b之和以及c和d之和是可以改变以获得具有所期望的性质的脂质的因素。在一个实施方式中，选择a和b，从而它们的和为14至24的整数。在其他实施方式中，选择c和d，从而它们的和为14至24的整数。在其他实施方式中，a和b之和与c和d之和相同。例如，在一些实施方式中，a和b之和以及c和d之和均为相同整数，其可以在14至24的范围内。在更多实施方式中，选择a、b、c和d，从而a和b之和以及c和d之和为12或以上。

未具体限制化学式(II)的R^1a、R^2a、R^3a和R^4a处的取代基。在一些实施方式中，R^1a、R^2a、R^3a和R^4a中的至少一个为H。在一些实施方式中，R^1a、R^2a、R^3a和R^4a在每次出现时为H。在一些其他实施方式中，R^1a、R^2a、R^3a和R^4a中的至少一个是C₁-C₁₂烷基。在一些其他实施方式中，R^1a、R^2a、R^3a和R^4a中的至少一个是C₁-C₈烷基。在一些其他实施方式中，R^1a、R^2a、R^3a和R^4a中的至少一个是C₁-C₆烷基。在以上实施方式中的一些中，C₁-C₈烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。

在化学式(II)的一些实施方式中，R^1a、R^1b、R^4a和R^4b在每次出现时是C₁-C₁₂烷基。

在化学式(II)的其他实施方式中，R^1b、R^2b、R^3b和R^4b中的至少一个是H，或者R^1b、R^2b、R^3b和R^4b在每次出现时为H。

在化学式(II)的一些实施方式中，R^1b与它所结合的碳原子一起与相邻R^1b和它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。在上述其他实施方式中，R^4b与它所结合的碳原子一起与相邻R^4b和它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。

在上述实施方式中未具体限制在化学式(II)的R⁵和R⁶处的取代基。在一些实施方式中，R⁵或R⁶之一是甲基。在其他实施方式中，R⁵或R⁶中的每一个是甲基。

在上述实施方式中未具体限制在化学式(II)的R⁷处的取代基。在一些实施方式中，R⁷是C₆-C₁₆烷基。在一些其他实施方式中，R⁷是C₆-C₉烷基。在这些实施方式的一些中，R⁷被下列取代基取代：-(C＝O)OR^b、-O(C＝O)R^b、-C(＝O)R^b、-OR^b、-S(O)_xR^b、-S-SR^b、-C(＝O)SR^b、

-SC(＝O)R^b、-NR^aR^b、-NR^aC(＝O)R^b、-C(＝O)NR^aR^b、-NR^aC(＝O)NR^aR^b、

-OC(＝O)NR^aR^b、-NR^aC(＝O)OR^b、-NR^aS(O)_xNR^aR^b、-NR^aS(O)_xR^b或-S(O)_xNR^aR^b，其中：R^a是H或C₁-C₁₂烷基；R^b是C₁-C₁₅烷基；且x为0、1或2。例如，在一些实施方式中，R⁷被-(C＝O)OR^b或-O(C＝O)R^b取代。

在化学式(II)的上述实施方式的多种实施方式中，R^b是支链C₁-C₁₅烷基。例如，在一些实施方式中，R^b具有以下结构之一：

在化学式(II)的上述实施方式的一些其他实施方式中，R⁸或R⁹之一是甲基。在其他实施方式中，R⁸和R⁹两者是甲基。

在化学式(II)的一些不同实施方式中，R⁸和R⁹与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7-元杂环。在上述的一些实施方式中，R⁸和R⁹与它们所连接的氮原子一起形成5元杂环，例如吡咯烷基环。在上述的一些不同的实施方式中，R⁸和R⁹与它们所连接的氮原子一起形成6元杂环，例如哌嗪基环。

在化学式(II)所示的上述脂质的其他实施方式中，G³是C₂-C₄亚烷基，例如C₃亚烷基。

在多种不同实施方式中，脂质化合物具有下表2所示的结构之一。

表2：化学式(II)所示的代表性脂质。

在一些实施方式中，LNP包含化学式(II)所示的脂质、核苷修饰的RNA和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，化学式(II)所示的脂质是化合物II-9。在一些实施方式中，化学式(II)所示的脂质是化合物II-10。在一些实施方式中，化学式(II)所示的脂质是化合物II-11。在一些实施方式中，化学式(II)所示的脂质是化合物II-12。在一些实施方式中，化学式(II)所示的脂质是化合物II-32。

在一些其他实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有化学式(III)所示的结构：

L¹或L²之一是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x-、-S-S-、

-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)NR^a-或

-NR^aC(＝O)O-，并且L¹或L²中的另一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x-、

-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)NR^a-或-NR^aC(＝O)O-或直接的键；

G¹和G²分别独立地为未取代的C₁-C₁₂亚烷基或者C₁-C₁₂亚烯基；

G³是C₁-C₂₄亚烷基、C₁-C₂₄亚烯基、C₃-C₈环亚烷基、C₃-C₈亚环烯基；

R^a是H或C₁-C₁₂烷基；

R¹和R²分别独立地为C₆-C₂₄烷基或C₆-C₂₄烯基；

R³是H、OR⁵、CN、-C(＝O)OR⁴、-OC(＝O)R⁴或-NR⁵C(＝O)R⁴；

R⁴是C₁-C₁₂烷基；

R⁵是H或C₁-C₆烷基；且

x为0、1或2。

在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，脂质具有以下结构(IIIA)或(IIIB)之一：

其中：

A是3至8-元环烷基或环亚烷基环；

R⁶在每次出现时独立地为H、OH或C₁-C₂₄烷基；

n为1至15的整数。

在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，脂质具有结构(IIIA)，并且在其他实施方式中，脂质具有结构(IIIB)。

在化学式(III)的其他实施方式中，脂质具有以下结构(IIIC)或(IIID)之一：

其中y和z分别独立地为1至12的整数。

在化学式(III)的任何上述实施方式中，L¹或L²之一是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方式中，L¹和L²中的每一个是-O(C＝O)-。在任何上述的一些不同的实施方式中，L¹和L²分别独立地为-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方式中，L¹和L²中的每一个为-(C＝O)O-。

在化学式(III)的一些不同的实施方式中，脂质具有以下结构(IIIE)或(IIIF)之一：

在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，脂质具有以下结构(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或者(IIIJ)之一：

在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，n是2至12，例如，2至8或2至4的整数。例如，在一些实施方式中，n是3、4、5或6。在一些实施方式中，n是3。在一些实施方式中，n是4。在一些实施方式中，n是5。在一些实施方式中，n是6。

在化学式(III)的上述实施方式中的一些其他实施方式中，y和z分别独立地为2至10的整数。例如，在一些实施方式中，y和z分别独立地为4至9或4至6的整数。

在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，R⁶是H。在上述实施方式中的其他实施方式中，R⁶是C₁-C₂₄烷基。在其他实施方式中，R⁶是OH。

在化学式(III)的一些实施方式中，G³是未取代的。在其他实施方式中，G³是取代的。在多种不同实施方式中，G³是直链C₁-C₂₄亚烷基或者直链C₁-C₂₄亚烯基。

在化学式(III)的一些其他以上实施方式中，R¹或R²或两者为C₆-C₂₄烯基。例如，在一些实施方式中，R¹和R²分别独立地具有以下结构：

其中：

R^7a和R^7b在每次出现时独立地为H或C₁-C₁₂烷基；且

a是2至12的整数，

其中分别选择R^7a、R^7b和a，从而R¹和R²分别独立地包含6至20个碳原子。例如，在一些实施方式中，a是5至9或8至12的整数。

在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，R^7a的至少一次出现为H。例如，在一些实施方式中，R^7a在每次出现时为H。在上述实施方式的其他不同的实施方式中，R^7b的至少一次出现是C₁-C₈烷基。例如，在一些实施方式中，C₁-C₈烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。

在化学式(III)的不同的实施方式中，R¹或R²或两者具有以下结构之一：

在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，R³是OH、CN、-C(＝O)OR⁴、-OC(＝O)R⁴或-NHC(＝O)R⁴。在一些实施方式中，R⁴是甲基或乙基。

在多种不同实施方式中，化学式(III)所示的阳离子脂质具有下表3所示的结构之一。

表3：化学式(III)所表示的代表性化合物。

在一些实施方式中，LNP包含化学式(III)所示的脂质、核苷修饰的RNA和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，化学式(III)所示的脂质是化合物III-3。在一些实施方式中，化学式(III)所示的脂质是化合物III-7。

在一些实施方式中，阳离子脂质以约30至约95摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约30至约70摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约40至约60摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约50摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，LNP仅包含阳离子脂质。

在一些实施方式中，LNP包含一种或多种其他脂质，其在它们形成期间稳定颗粒形成。

适合的稳定脂质包括中性脂质和阴离子脂质。

示例性阴离子脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)和结合至中性脂质的其他阴离子修饰基团。

示例性中性脂质包括，例如，二硬脂酰磷脂酰胆喊(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二反油酸氧基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE(transDOPE))。在一个实施方式中，所述中性脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。

在一些实施方式中，LNP包含选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质。在多个实施方式中，阳离子脂质(例如，化学式(I)所示的脂质)与中性脂质的摩尔比在约2:1至约8:1的范围内。

在多个实施方式中，LNP还包含类固醇或类固醇类似物。“类固醇”是包含以下碳骨架的化合物：

在一些实施方式中，所述类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在这些实施方式的一些中，阳离子脂质(例如，化学式(I)所示的脂质)与胆固醇的摩尔比在约2:1至1:1的范围内。

在一些实施方式中，LNP包含糖脂(例如，单唾液酸神经节苷脂GM₁)。在一些实施方式中，LNP包含甾醇类，如胆固醇。

在一些实施方式中，LNP包含聚合物缀合的脂质。

在一些实施方式中，LNP包含其他稳定-脂质，它是聚乙二醇-脂质(PEG化脂质)。适合的聚乙二醇-脂质包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的甘油二酯、PEG修饰的二烷基甘油。代表性的聚乙二醇-脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA和PEG-s-DMG。在一个实施方式中，所述聚乙二醇-脂质是N-[(甲氧基聚(乙二醇)₂₀₀₀)氨甲酰基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一个实施方式中，所述聚乙二醇-脂质是PEG-c-DOMG。在其他实施方式中，LNP包含PEG化的甘油二酯(PEG-DAG)，如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸甘油二酯(PEG-S-DAG)，如4-O-(2',3'-二(十四酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、PEG化的神经酰胺(PEG-cer)或者PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四酰氧基)丙基)氨基甲酸酯或者2,3-二(十四酰氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。在多个实施方式中，阳离子脂质与所述PEG化的脂质的摩尔比在约100:1至约25:1的范围内。

在一些实施方式中，LNP包含具有以下结构(IV)的PEG化脂质：

或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：

R¹⁰和R¹¹分别独立地为直链或支链、饱和或不饱和的烷基链，其含有10至30个碳原子，其中所述烷基链可选地被一个或多个酯键中断；和z具有30至60的平均值。

在PEG化的脂质(IV)的以上实施方式的一些实施方式中，当z为42时，R¹⁰和R¹¹不均为n-十八基。在一些其他实施方式中，R¹⁰和R¹¹分别独立地为含有10至18个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方式中，R¹⁰和R¹¹分别独立地为含有12至16个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方式中，R¹⁰和R¹¹分别独立地为含有12个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方式中，R¹⁰和R¹¹分别独立地为含有14个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在其他实施方式中，R¹⁰和R¹¹分别独立地为含有16个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在其他实施方式中，R¹⁰和R¹¹分别独立地为含有18个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在其他实施方式中，R¹⁰是含有12个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链，并且R¹¹是含有14个碳原子的直链或支链，饱和或不饱和的烷基链。

在多个实施方式中，z覆盖选择以使得(II)的PEG部分具有约400至约6000g/mol的平均分子量的范围。在一些实施方式中，平均值z为约45。

在其他实施方式中，所述PEG化的脂质具有以下结构之一：

其中n是选择以使得PEG化的脂质的平均分子量为约2500g/mol的整数。

在一些实施方式中，所述其他脂质以约1至约10摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，其他脂质以约1至约5摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，其他脂质以约1摩尔百分比或者约1.5摩尔百分比存在于LNP中。

在一些实施方式中，LNP包含化学式(I)所示的脂质、核苷修饰的RNA、中性脂质、类固醇和PEG化脂质。在一些实施方式中，化学式(I)所示的脂质是化合物I-6。在不同的实施方式中，所述中性脂质是DSPC。在其他实施方式中，所述类固醇是胆固醇。在其他不同的实施方式中，所述PEG化脂质是化合物IVa。

在一些实施方式中，LNP包含一个或多个靶向部分，其能够将LNP靶向细胞或细胞群体。例如，在一个实施方式中，靶向部分是配体，其将LNP导向存在于细胞表面上的受体。

在一些实施方式中，LNP包含一个或多个内化结构域。例如，在一个实施方式中，LNP包含一个或多个结构域，其结合至细胞以诱导LNP的内化。例如，在一个实施方式中，一个或多个内化结构域结合至存在于细胞表面上的受体以诱导受体-介导的LNP的吸收。在一些实施方式中，LNP能够体内结合生物分子，其中LNP-结合的生物分子然后可以被细胞-表面受体识别以诱导内化。例如，在一个实施方式中，LNP结合全身性ApoE，其导致LNP和结合的货物的吸收。

本领域描述了其他示例性LNP和它们的生产，例如，在美国专利申请公开号US20120276209；Semple等人,2010,Nat Biotechnol.,28(2):172-176；Akinc等人,2010,Mol Ther.,18(7):1357-1364；Basha等人,2011,Mol Ther,19(12):2186-2200；Leung等人,2012,J Phys Chem C Nanomater Interfaces,116(34):18440-18450；Lee等人,2012,IntJ Cancer.,131(5):E781-90；Belliveau等人,2012,Mol Ther nucleic Acids,1:e37；Jayaraman等人,2012,Angew Chem Int Ed Engl.,51(34):8529-8533；Mui等人,2013,MolTher Nucleic Acids.2,e139；Maier等人,2013,Mol Ther.,21(8):1570-1578；和Tam等人,2013,Nanomedicine,9(5):665-74，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入。

以下反应流程显示了制备化学式(I)、(II)或(III)所示的脂质的方法。

一般反应流程1

可以根据一般反应流程1(“方法A”)制备化学式(I)所示的脂质的实施方式(例如，化合物A-5)，其中R是饱和或不饱和的C₁-C₂₄烷基或者饱和或不饱和的环烷基，m为0或1并且n是1至24的整数。参考一般反应流程1，具有结构A-1的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。将A-1、A-2和DMAP的混合物用DCC处理以提供溴化物A-3。在任何必需的清理和/或纯化步骤之后，在足以产生A-5的温度和时间下加热溴化物A-3、碱(例如，N,N-二异丙基乙胺)和N,N-二甲基二胺A-4的混合物。

一般反应流程2

可以根据一般反应流程2(“方法B”)制备化学式(I)所示的化合物的其他实施方式(例如，化合物B-5)，其中R是饱和或不饱和的C₁-C₂₄烷基或者饱和或不饱和的环烷基，m为0或1并且n是1至24的整数。如一般反应流程2所示，具有结构B-1的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。用酸性氯化物B-2(1当量)和碱(例如，三乙胺)处理B-1(1当量)的溶液。用氧化剂(例如，氯铬酸吡啶)处理粗产物，并回收中间产物B-3。在任何必需的清理和/或纯化之后，用还原剂(例如，三乙酰氧基氢硼化钠)处理粗B-3、酸(例如，乙酸)和N,N-二甲基氨基胺B-4的溶液以获得B-5。

应注意尽管以上将起始材料A-1和B-1显示在仅包括饱和亚甲基碳，但是包括碳-碳双键的起始材料也可以用于包括碳-碳双键的化合物的制备。

一般反应流程3：

可以根据一般反应流程3(“方法C”)制备化学式(I)所示的脂质的不同实施方式(例如，化合物C-7或C9)，其中R是饱和或不饱和的C₁-C₂₄烷基或者饱和或不饱和的环烷基，m为0或1并且n是1至24的整数。参考一般反应流程3，具有结构C-1的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。

一般反应流程4

可以根据一般反应流程4(“方法D”)制备化学式(II)所示的化合物的实施方式(例如，化合物D-5和D-7)，其中R^1a、R^1b、R^2a、R^2b、R^3a、R^3b、R^4a、R^4b、R⁵、R⁶、R⁸、R⁹、L¹、L²、G¹、G²、G³、a、b、c和d是如本文所定义的并且R⁷'表示R⁷或C₃-C₁₉烷基。参考一般反应流程1，具有结构D-1和D-2的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。在任何必需的清理后，用还原剂(例如，三乙酰氧基氢硼化钠)处理D-1和D-2的溶液以获得D-3。在任何必需的清理和/或纯化之后，用酰基氯D-4(或羧酸和DCC)处理D-3和碱(例如，三甲胺、DMAP)的溶液以获得D-5。可以在任何必需的清理和/或纯化之后，用LiAlH4 D-6还原D-5以提供D-7。

一般反应流程5

可以根据一般反应流程5(“方法E”)制备化学式(II)所示的脂质的实施方式(例如，脂质E-5)，其中R^1a、R^1b、R^2a、R^2b、R^3a、R^3b、R^4a、R^4b、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、L¹、L²、G³、a、b、c和d是如本文所定义的。参考一般反应流程2，具有结构E-1和E-2的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。在任何必需的清理后，加热E-1(过量)、E-2和碱(例如，碳酸钾)的混合物以获得E-3。在任何必需的清理和/或纯化之后，用酰基氯E-4(或羧酸和DCC)处理E-3和碱(例如，三甲胺、DMAP)的溶液以获得E-5。

一般反应流程6

一般反应流程6提供了制备化学式(III)所示的脂质的示例性方法(方法F)。一般反应流程6中的G¹、G³、R¹和R³是如本文对于化学式(III)所定义的，并且G1'是指G1短1个碳的同系物。具有结构F-1的化合物是购买的或者根据本领域中已知的方法制备的。F-1与二醇F-2在适当缩合条件(例如，DCC)下的反应获得了酯/醇F-3，其然后可以氧化(例如，PCC)为醛F-4。F-4与胺F-5在还原胺化条件下的反应获得了化学式(III)所示的脂质。

应注意用于制备化学式(III)所示的脂质的多种替代策略对于本领域那些技术人员是可用的。例如，可以使用适当起始材料，根据类似方法制备其中L¹和L²是除酯以外的化学式(III)所示的其他脂质。此外，一般反应流程6显示了化学式(III)所示的脂质的制备，其中G¹和G²是相同的；然而，这不是本发明所要求的方面并且对以上反应流程的改变对于获得其中G¹和G²不同的化合物是可能的。

本领域技术人员将理解在本文所描述的方法中，中间体化合物的官能性基团可能需要适当保护基的保护。这些官能性基团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。羟基的适当保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔-丁基二甲基甲硅烷基、叔-丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。适合于氨基、脒基和胍基的保护基包括叔-丁氧羰基、苄氧羰基等。适合于巯基的保护基包括-C(O)-R”(其中R”是烷基、芳基或芳基烷基)、p-甲氧基苄基、三苯甲基等。适合于羧酸的保护基包括烷基、芳基或芳基烷基酯。可以根据标准技术添加或除去保护基，这是本领域技术人员已知的并且是如本文所描述的。保护基的使用详细描述于Green,T.W.and P.G.M.Wutz,Protective Groups inOrganic Synthesis(1999),第3版,Wiley。如本领域中技术人员将理解的，所述保护基还可以是聚合物树脂，如Wang树脂、Rink树脂或2-氯代三苯甲基-氯树脂。

药物组合物

可以通过任何药学领域中已知的或此后发展的方法制备本文所述的药物组合物的制剂。一般地，这些制备方法包括使活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分结合的步骤，然后，如有必要或者如果希望，将所述产物成形或包装成所期望的单剂量或多剂量单元。

尽管对本文所提供的药物组合物的描述主要涉及适合于向人伦理学施用的药物组合物，但是技术人员将理解这些组合物通常适合于向各种各样的受试者施用。对适合于向人施用的药物组合物进行改变以使组合物适合于向多种受试者施用是很好理解的，并且常规兽医药理学家可以仅通过常规实验(即使有的话)来设计和实施这些改变。考虑了施用本发明所述的药物组合物的受试者，其包括但不限于人及其他灵长类、哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，如非人灵长类、牛、猪、马、绵羊、猫和狗。

可以以适合于眼、口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺部、鼻内、口腔、静脉内、脑室内、皮内、肌内或者另一种施用途径的制剂制备、包装或出售在本发明所述的方法中有用的药物组合物。其他所考虑的制剂包括投射纳米颗粒(projected nanoparticle)、脂质体制剂、包含活性成分的重新封装的红细胞和基于免疫原性的制剂。

可以作为整体，作为单一单位剂量或者作为多个单一单位剂量制备、包装或出售本发明的药物组合物。如本文所使用的，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的单个的量。所述活性成分的量通常等于将向受试者施用的活性成分的剂量或者该剂量的便捷的部分(convenient fraction)，如，例如，该剂量的一半或三分之一。

在本发明的药物组合物中，所述活性成分、所述药学上可接受的载体和任何其他成分的相对量将基于所治疗的受试者的身份、体型和状况并且还基于施用组合物的途径而改变。举例来说，组合物可以包括0.1％至100％(w/w)之间的活性成分。

除所述活性成分之外，本发明的药物组合物还可以包括一种或多种其他药物活性剂。

可以使用常规技术制备本发明的药物组合物的控释或缓释制剂。

如本文所使用的，药物组合物的“肠胃外施用”包括任何施用途径，其特征在于物理打破受试者组织并通过所述组织中的破口施用所述药物组合物。因此，肠胃外施用包括但不限于通过组合物的注射，通过手术切口的组合物应用，通过穿透组织的非手术伤口的组合物应用等的药物组合物的施用。具体地，考虑了肠胃外施用，其包括但不限于眼内、玻璃体内、皮下、腹膜内、肌内、皮内、胸骨内注射、肿瘤内、静脉内、脑室内和肾透析输注技术。

适合于肠胃外施用的药物组合物制剂包括与药学上可接受的载体，如无菌水或无菌等渗盐水组合的活性成分。可以以适合于丸剂施用或者适合于连续施用的形式制备、包装或出售这些制剂。可以以单位剂量形式，如在安瓿瓶中或在含有防腐剂的多剂量容器中制备、包装或出售注射制剂。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于处于油性或水性媒介物中的混悬液、溶液、乳液、糊剂和可植入缓释或生物可降解制剂。这些制剂还可以包括一种或多种其他成分，其包括但不限于混悬剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方式中，以在肠胃外施用所复原的组合物之前，用适合的媒介物(例如，无菌无热原的水)复原的干燥(即粉末或颗粒)形式提供所述活性成分。

以无菌可注射的水性或油性混悬液或溶液的形式制备、包装或出售所述药物组合物。可以根据已知技术配制这种混悬液或溶液，并且除所述活性成分之外，其可以包括本文所描述的其他成分，如分散剂、润湿剂或助悬剂。可以使用无毒肠胃外可用的稀释剂或溶剂，如，例如，水或1,3-丁二醇制备这些无菌注射制剂。其他可用的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油剂，如合成的单或二-甘油酯。其他有用的可胃肠外施用的制剂包括包含处于微晶形式，处于脂质体制剂中或者作为可生物降解的聚合物系统的组分的活性成分的那些。用于缓释或植入的组合物可以包括药学上可接受的聚合物或疏水性材料，如乳液、离子交换树脂、微溶性聚合物或微溶性盐。

可以以适合于通过颊间隙肺部施用的制剂制备、包装或出售本发明的药物组合物。这种制剂可以包括干燥颗粒，所述颗粒包括活性成分并且具有约0.5至约7纳米的范围内的直径。在一些实施方式中，所述制剂可以包含无水颗粒，其包含活性成分并且具有约1至约6纳米的范围内的直径。这些组合物方便地处于用于使用装置或者使用自抛射溶剂/粉末分配容器施用的干粉形式，所述装置包括干粉储罐，可以将抛射剂流导向所述干粉储罐以分散所述粉末，并且所述自抛射溶剂/粉末分配容器如包括溶解或混悬在密封容器中的低沸点抛射剂中的活性成分的装置。在一些实施方式中，这些粉末包括颗粒，其中按重量计至少98％的所述颗粒的直径大于0.5纳米并且按数量计至少95％的所述颗粒的直径小于7纳米。在一些实施方式中，按重量计至少95％的所述颗粒的直径大于1纳米并且按数量计至少90％的所述颗粒的直径小于6纳米。在一些实施方式中，干粉组合物包括固体细粉稀释剂，如糖，并且所述干粉组合物方便地以单位剂量形式提供。

低沸点抛射剂通常包括在大气压力下具有小于65°F的沸点的液体抛射剂。通常，所述抛射剂可以占组合物的50至99.9％(w/w)，并且所述活性成分可以占组合物的0.1至20％(w/w)。所述抛射剂还可以包括其他成分，如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或者固体稀释剂(在一些情况下，具有与包含所述活性成分的颗粒同数量级的颗粒尺寸)。

治疗或预防方法

本发明提供了在受试者中诱导针对诺如病毒的适应性免疫应答的方法，其包括施用有效量的至少一种编码NoV VP1抗原的mRNA分子(例如，核苷修饰的mRNA分子)或包含至少一种编码NoV VP1抗原的mRNA分子(例如，核苷修饰的mRNA分子)的组合物(例如，LNP)。

在一个实施方式中，方法在受试者中提供了对多种诺如病毒株、诺如病毒感染或与诺如病毒有关的疾病或病症的免疫性，所述与诺如病毒有关的疾病或病症包括但不限于肠胃炎、食物中毒、呕吐和腹泻。因此，本发明提供了治疗或预防与诺如病毒有关的感染、疾病或病症的方法。

在一个实施方式中，向患有与诺如病毒有关的感染、疾病或病症的受试者施用组合物。在一个实施方式中，向处于发生与诺如病毒有关的感染、疾病或病症的风险的受试者施用组合物。例如，可以向处于接触诺如病毒风险的受试者施用组合物。在一个实施方式中，向生活在、旅行至或预期将旅行至其中诺如病毒流行的地理区域的受试者施用组合物。对于疫苗施用来说所关心的人群包括但不限于幼儿(例如，5岁以下)、军事人员、游轮工作人员和乘客、长期护理机构工作人员和居民(老人护理、儿童保育、学校)、食品处理人员和旅行对象。在一个实施方式中，向接触或预期接触生活在、旅行至或预期将旅行至其中诺如病毒流行的地理区域的其他人的受试者施用组合物。在一个实施方式中，向已知通过他们的职业或其他接触暴露于诺如病毒的受试者施用组合物。

在一个实施方式中，方法包括施用包含编码一个或多个NoV抗原的一个或多个核苷修饰的核酸分子的组合物。在一个实施方式中，方法包括施用包含编码一个或多个NoV抗原的第一核苷修饰的核酸分子和编码一个或多个NoV抗原的第二核苷修饰的核酸分子的组合物。在一个实施方式中，方法包括施用包含编码本文所描述的多个NoV抗原的一个或多个核苷修饰的核酸分子的组合物。

在一个实施方式中，方法包括施用一种或多种组合物，每种组合物包含编码一个或多个NoV抗原的一个或多个核苷修饰的核酸分子。在一个实施方式中，方法包括施用包含编码一个或多个NoV抗原的一个或多个核苷修饰的核酸分子的第一组合物和施用包含编码一个或多个NoV抗原的一个或多个核苷修饰的核酸分子的第二组合物。在一个实施方式中，方法包括施用多种组合物，每种组合物包含编码本文所描述的一种或多种NoV抗原的一种或多种核苷修饰的核酸分子。在一些实施方式中，方法包括多种组合物的交错施用。

在一些实施方式中，方法包括向受试者施用编码多种NoV抗原的多种核苷修饰的核酸分子、佐剂或其组合。

在一些实施方式中，本发明所述的方法允许本文所描述的NoV抗原或佐剂在施用后持续表达至少几天。在一些实施方式中，本发明所述的方法允许本文所描述的NoV抗原或佐剂在施用后持续表达至少2周。在一些实施方式中，本发明所述的方法允许本文所描述的NoV抗原或佐剂在施用后持续表达至少1个月。然而，在一些实施方式中，方法还提供了瞬时表达，如在一些实施方式中，所述核酸未整合到受试基因组中。

在一些实施方式中，方法包括施用核苷修饰的RNA，其提供了本文所描述的NoV抗原或佐剂的稳定表达。在一些实施方式中，核苷修饰的RNA的施用导致很少与无先天性免疫应答，同时诱导有效适应性免疫反应。

在一些实施方式中，方法提供了针对NoV的持续保护。例如，在一些实施方式中，方法提供了超过2周的针对NoV的持续保护。在一些实施方式中，方法提供了1个月或以上的针对NoV的持续保护。在一些实施方式中，方法提供了2个月或以上的针对NoV的持续保护。在一些实施方式中，方法提供了3个月或以上的针对NoV的持续保护。在一些实施方式中，方法提供了4个月或以上的针对NoV的持续保护。在一些实施方式中，方法提供了5个月或以上的针对NoV的持续保护。在一些实施方式中，方法提供了6个月或以上的针对NoV的持续保护。在一些实施方式中，方法提供了1年或以上的针对NoV的持续保护。

在一个实施方式中，组合物的单次免疫诱导针对NoV的持续保护达1个月或更长时间、2个月或更长时间、3个月或更长时间、4个月或更长时间、5个月或更长时间、6个月或更长时间或者1年或更长时间。

可以使用本领域中已知的方法以一些不同方式实现本发明的组合物在治疗方法中的施用。在一个实施方式中，本发明所述的方法包括受试者的全身施用，包括，例如，肠内或肠胃外施用。在一些实施方式中，方法包括组合物的皮内递送。在另一个实施方式中，方法包括组合物的静脉内递送。在一些实施方式中，方法包括组合物的肌内递送。在一个实施方式中，方法包括组合物的皮下递送。在一个实施方式中，方法包括组合物的吸入。在一个实施方式中，方法包括组合物的鼻内递送。

将理解可以单独或与另一种试剂结合向受试者施用本发明的组合物。

因此，本发明所述的治疗和预防方法涵盖了本文所描述的包含至少一种编码NoV抗原的mRNA分子(例如，核苷修饰的mRNA分子)、佐剂或其组合的药物组合物用于实施本发明所述的方法的用途。可以施用用于实践本发明的药物组合物以递送1ng/kg/天至100mg/kg/天的剂量。在一个实施方式中，本发明设想施用一种剂量，其在哺乳动物中产生10nM至10μM的本发明所述化合物的浓度。

通常，可以在本发明所述的方法中施用于哺乳动物，如人的剂量在0.01μg至约50mg每公斤哺乳动物体重的量的范围内，尽管要施用的准确剂量将基于多种因素改变，所述因素包括但不限于哺乳动物类型和要治疗的疾病状况的类型、哺乳动物年龄和施用途径。在一些实施方式中，所述化合物的剂量将在每千克哺乳动物体重约0.1μg至约10mg之间改变。在一些实施方式中，所述剂量将在每千克哺乳动物体重约1μg至约1mg之间改变。

可以将组合物以每天几次的频率施用于哺乳动物，或者可以不太频繁施用组合物，如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或甚至更不频繁，如每几个月、几年一次，或甚至更不频繁，如每10-20年、15-30年，或甚至更不频繁，如每50-100年。所述剂量的频率对于技术人员来说将是显而易见的并且将取决于多种因素，如(但不限于)要治疗的疾病的类型和严重程度，哺乳动物的类型和年龄等。

在一些实施方式中，可以通过单次施用实施本发明的免疫原性组合物或疫苗的施用或通过多次施用加强它们的施用。

实验实施例

通过参考以下实验实施例进一步详细描述了本发明。除非另作说明，否则仅出于说明的目的提供了这些实施例，并且它们不意欲限制。因此，本发明决不应视为受限于以下实施例，而是应视为涵盖由于本文所提供的教导内容而变得显而易见的任何和所有改变。

在不进行进一步描述的情况下，据信本领域的技术人员可以使用以上描述和以下说明性实施例制备和使用本发明和实践所主张的方法。因此，不应以任何方式将以下工作实施例视为对本发明公开的其余部分的限制。

实施例1：诺如病毒的核苷修饰的mRNA-LNP疫苗

将与脂质纳米颗粒(LNP)复合的核苷修饰的mRNA的疫苗平台用于开发诺如病毒疫苗。诺如病毒疫苗编码来自多个基因群(GI.1、GI.3、GII.3和GII.4)的诺如病毒衣壳蛋白VP1。LNP封装允许核苷修饰的mRNA体内有效递送和表达，并且代替尿苷的1-甲基假尿苷核苷修饰对于mRNA平台通过其对Tfh细胞的诱导所诱导的抗体应答的效力是关键的。即使在低剂量(0.25μg)下，核苷修饰的mRNA-LNP疫苗也证实了高HBGA阻断抗体滴度，保护人类肠道抵抗诺如病毒感染，并引发强CD4+和CD8+应答。这些数据提供了基于诺如病毒VP1序列的修饰的核苷mRNA-LNP疫苗在体内具有免疫原性并在体外产生阻断病毒感染的中和抗体的概念验证。mRNA-LNP疫苗在低剂量下非常有效，并且是一种可高度规模化生产的非复制型载体，因此，它非常适合用于全球公共卫生运动以使人对诺如病毒免疫。

核苷修饰的mRNA-LNP诺如病毒疫苗表现出高阻断抗体滴度，对人类肠道抵抗诺如病毒感染的良好保护作用，并引发了强CD4+和CD8+T细胞应答。这些数据提供了基于诺如病毒VP1序列的修饰的核苷mRNA-LNP疫苗在体内具有免疫原性并在体外产生阻断病毒感染的中和抗体的概念验证。

为了确认mRNA分子表达正确的蛋白质，用编码Norwalk1968、Capetown2012、Sweden2008、Argentina2016、Nashville2016、Canada2019、UK2015、USA2011或Japan2009的mRNA转染293T细胞。24小时后，收获细胞并通过蛋白印迹分析GI.1、GII.4、GI.3或GII.3衣壳的表达(图1)。

在第0天和第28天通过i.d.注射10μg空LNP或mRNA二价疫苗使Balb/c小鼠(6-8周龄)免疫两次：Norwalk/2011/GI.1代表基因群I株，而CapeTown/2012/GII.4代表基因群II株。基因群I和II株共占人类诺如病毒感染的>90％。图2详细说明了免疫方案。

mRNA二价疫苗后的HuNoV阻断抗体应答

对于在替代中和测定中阻断VLP与结合配体的相互作用的能力，针对Norwalk1968/GI.1和Sydney2012/GII.4病毒样颗粒(VLP)筛选血清(图3)。未阻断至少50％VLP-配体结合的血清的滴度为0.5×LLD(ID50＝25)，并将记号置于检测限(短划线)以下。

mRNA二价疫苗后的HuNoV阻断抗体应答

图4表明对其他VLP的阻断Ab应答表明疫苗应答是基因型特异性的，在所测试的基因群内或之间没有交叉反应性(GI.3，GI.5，GII.3)。在GII.4基因型内，GII.4/2009和GII.4/2002的阻断Ab滴度分别约为GII.4/2012滴度的～20％和～5％，与全球主要GII.4大流行基因型内已知的抗原性漂移一致。

T细胞刺激测定

在第0天通过肌肉注射10μg/小鼠的mRNA二价疫苗(GII.4/CapeTown2012、GI.1/Nowalk2012)或以mRNA-Luc作为对照使Balb/c小鼠(6-8周龄)免疫。n＝5只/组(图5)。用VLP(GI.1，GI.3，GII.3，GII.4)进行T细胞刺激测定(图6)。

人诺如病毒二价mRNA疫苗剂量反应

为了确定二价mRNA疫苗的最佳量，通过以28天间隔向小鼠肌内(i.m.)注射两次施用四个剂量(每只小鼠0.25、0.5、1或3μg每种疫苗)或作为对照的mRNA-Luc(12μg/小鼠)(图7)。在免疫后第0天、第28天、第56天、第150天收集血清，并在替代中和测定中进行评价。在指定的时间点，n＝10只/组。即使是0.25μg/小鼠的小剂量，阻断抗体的滴度也处于高水平。

低剂量mRNA疫苗诱导强Th1应答

为了评价Th1应答，在第0天和第28天通过肌内注射0.25μg/小鼠的mRNA疫苗(GII.4)或作为对照的mRNA-Luc使Balb/c小鼠(6-8周龄)免疫两次(图8)。在加强免疫后两周，用GII.4肽混合池(15个AA长，11个AA重叠)在37℃，5％ CO₂条件下刺激脾脏单细胞悬液5小时，并通过流式细胞术分析T细胞的激活。每个组，n＝10只。从接种GII.4mRNA-LNP并用GII.4肽混合池刺激的小鼠中分离的脾细胞表明mRNA疫苗引发了强CD4+和CD8 T细胞应答。

四价诺如病毒mRNA疫苗

开发了一种四价诺如病毒mRNA疫苗，其包括GI.3和GII.3基因型，因为这些基因型是儿科NoV急性胃肠炎中NoV暴发中最流行的GI和GII基因型。在GenBank上鉴别了GI.3/Argentina2016和GII.3/Canada2019的衣壳蛋白VP1序列，设计了质粒，并产生了核苷修饰的mRNA。在LNP封装前，检查编码GI.1、GII.4、GI.3和GII.3的mRNA的内毒素水平和IFN-α的激活。

在第0天和第28天通过肌内注射0.125、0.25、0.5、1μg/小鼠的mRNA四价疫苗(GII.4/CapeTown2012、GI.1/Nowalk2012、GI.3/Argentina2016、GII.3/Canada2019)或用空LNP作为对照(每组n＝5只)使Balb/c和C57BL/6小鼠(6-8周龄)免疫两次(图9)。

为了确定四价mRNA疫苗的最佳量，以28天间隔，通过i.m.注射向小鼠施用四个剂量(0.125、0.25、0.5或1μg每种疫苗/小鼠)或作为对照的空LNP(4μg/小鼠)两次(图10)。空LNP低于检测水平(未显示)。

人类肠道

开发针对人诺如病毒的有效干预措施的主要障碍是缺乏稳健且可重复的体外培养系统。最近，研究人员开发了人类肠道(HIE)，其中三维体外培养物来源于从人胃肠道活组织检查或手术样本中分离的隐窝中的增殖的干细胞。HIE培养物具有肠上皮的多细胞复杂性和组织结构。HIE具有生理活性，包含正常GI道的所有上皮细胞类型，并保留了节段特异性性质。

图11和图12证实了干细胞来源的人3D类肠道被来自感染了GII.4的患者粪便样品的活HNoV的感染效果。HIE可以用于测定HNoV感染，因为感染了HNoV的类肠道显示VP1衣壳蛋白的存在和ZO1染色(紧密连接完整性的标志物)的缺失(图12)。

在第0天和第28天通过i.m.注射0.25μg/小鼠的mRNA疫苗(GII.4)或作为对照的mRNA-Luc使C57BL/6小鼠(6-8周龄)免疫两次。加强免疫后4周，收集血清，用指定的稀释液稀释，与HNoV阳性粪便样品预孵育，并分析其在活组织检查来源的人小肠类器官中中和HuNoV感染的能力。图13和图14证实来自mRNA-LNP接种疫苗的小鼠的血清对人类肠道具有抗GII.4感染的保护作用。

这些数据表明初免后30天的阻断抗体滴度较高(GI.1)或与来自感染HNoV的患者的阻断抗体滴度相当(GII.4)，阻断抗体在高滴度下至少持续到第240天，低剂量mRNA疫苗(0.25μg)引发了强CD4+和CD8+T细胞应答，并且来自接种疫苗的小鼠的血清中和了HNoV并保护人类肠道抵抗GII.4感染。因此，这些数据支持基于诺如病毒VP1序列的修饰的核苷mRNA-LNP疫苗在体内具有免疫原性并在体外产生阻断病毒感染的中和抗体。

实施例2：序列

SEQ ID NO:1

衣壳蛋白VP1[诺如病毒Hu/GI.1/8FIIa/1968/USA]

AFJ38516.1

MMMASKDATSSVDGASGAGQLVPEVNASDPLAMDPVAGSSTAVATAGQVNPIDPWIINNFVQAPQGEFTISPNNTPGDVLFDLSLGPHLNPFLLHLSQMYNGWVGNMRVRIMLAGNAFTAGKIIVSCIPPGFGSHNLTIAQATLFPHVIADVRTLDPIEVPLEDVRNVLFHNNDRNQQTMRLVCMLYTPLRTGGGTGDSFVVAGRVMTCPSPDFNFLFLVPPTVEQKTRPFTLPNLPLSSLSNSRAPLPISSMGISPDNVQSVQFQNGRCTLDGRLVGTTPVSLSHVAKIRGTSNGTVINLTELDGTPFHPFEGPAPIGFPDLGGCDWHINMTQFGHSSQTQYDVDTTPDTFVPHLGSIQANGIGSGNYVGVLSWISPPSHPSGSQVDLWKIPNYGSSITEATHLAPSVYPPGFGEVLVFFMSKMPGPGAYNLPCLLPQEYISHLASEQAPTVGEAALLHYVDPDTGRNLGEFKAYPDGFLTCVPNGASSGPQQLPINGVFVFVSWVSRFYQLKPVGTASSARGRLGLRR

SEQ ID NO:2

[诺如病毒Hu/GI.1/CHA9A004_20110419/2011/USA]

AGM33223.1

MMMASKDATSSVDGASGAGQLVPEVNASDPLAMDPVAGSSTAVATAGQVNPIDPWIINNFVQAPQGEFTISPNNTPGDVLFDLSLGPHLNPFLLHLSQMYNGWVGNMRVRIMLAGNAFTAGKIIVSCIPPGFGSHNLTIAQATLFPHVIADVRTLDPIEVPLEDVRNVLFHNNDRNQQTMRLVCMLYTPLRTGGGTGDSFVVAGRVMTCPSPDFNFLFLVPPTVEQKTRPFTLPNLPLSSLSNSRAPLPISSMGISPDNVQSVQFQNGRCTLDGRLVGTTPVSLSHVAKIRGTSNGTVINLTELDGTPFHPFEGPAPIGFPDLGGCDWHINMTQFGHSSQTQYDVDTTPDTFVPHLGSIQANGIGSGNYVGVLSWISPPSRPSGSQVDLWKIPNYGSSITEATHLAPSVYPPGFGEVLVFFMSKMPGPGAYNLPCLLPQEYISHLASEQAPTVGEAALLHYVDPDTGRNLGEFKAYPDGFLTCVPNGASSGPQQLPINGVFVFVSWVSRFYQLKPVGTASSARGRLGLRR

SEQ ID NO:3

VP1[诺如病毒Hu/GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU]

AFV08795.1

MKMASSDANPSDGSAANLVPEVNNEVMALEPVVGAAIAAPVAGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPRNAPGEILWSAPLGPDLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKVIFAAVPPNFPTEGLSPSQVTMFPHIVVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYHYNQSNDPTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPDFDFIFLVPPTVESRTKPFSVPVLTVEEMTNSRFPIPLEKLFTGPSSAFVVQPQNGRCTTDGVLLGTTQLSPVNICTFRGDVTHITGSRNYTMNLASQNWNDYDPTEEIPAPLGTPDFVGKIQGVLTQTTRTDGSTRGHKATVYTGSADFAPKLGRVQFETDTDRDFEANQNTKFTPVGVIQDGGTTHRNEPQQWVLPSYSGRNTHNVHLAPAVAPTFPGEQLLFFRSTMPGCSGYPNMDLDCLLPQEWVQYFYQEAAPAQSDVALLRFVNPDTGRVLFECKLHKSGYVTVAHTGQHDLVIPPNGYFRFDSWVNQFYTLAPMGNGTGRRRAV

SEQ ID NO:4

[诺如病毒GII/Hu/ZAF/2012/GII.P4_GII.4/CapeTown/9772]

ALX87357.1

MKMASSDANPSDGSAANLVPEVNNEVMALEPVVGAAIAAPVAGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPRNAPGEILWSAPLGPDLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKVIFAAVPPNFPTEGLSPSQVTMFPHIVVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYHYNQSNDPTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPDFDFIFLVPPTVESRTKPFSVPVLTVEEMTNSRFPIPLEKLFTGPSSAFVVQPQNGRCTTDGVLLGTTQLSPVNICTFRGDVTHITGSRNYTMNLASQNWNNYDPTEEIPAPLGTPDFVGEIQGVLTQTTRTDGSTRGHKATVYTGSADFAPKLGRIQFETDTDHDFEANQNTKFTPVGVIQDGSTTHRNEPQQWVLPSYSGRNTHNVHLAPAVAPTFPGEQLLFFRSTMPGCSGYPNMDLDCLLPQEWVQYFYQEAAPSQSDVALLRFVNPDTGRVLFECKLHKSGYVTVAHTGQHDLVIPPNGYFRFDSWVNQFYTLAPMGNGTGRRRVV

SEQ ID NO:5

衣壳蛋白[诺如病毒GI.3](China 2015)

GenBank：ARI71147.1

MMMASKDAPTNMDGTSGAGQLVPEANTAEPISMEPVAGAATAAATAGQVNMIDPWIMNNYVQAPQGEFTISPNNTPGDILFDLQLGPHLNPFLSHLAQMYNGWVGNMKVKVLLAGNAFTAGKIIISCIPPGFAAQNISIAQATMFPHVIADVRVLEPIEVPLEDVRNVLFHNNDNTPTMRLVCMLYTPLRASGSSSGTDPFVIAGRVLTCPSPDFSFLFLVPPNVEQKTKPFSVPNLPLNTLSNSRVPSLIKSMMVSRDHGQMVQFQNGRVTLDGQLQGTTPTSASQLCKIRGSVFHANGGNGYNLTELDGSPYHAFESPAPIGFPDLGECDWHMEASPTTQFNTGDVIKQINVKQESAFAPHLGTIQADGLSDVSVNTNMIAKLGWVSPVSDGHKRDVDPWVIPRYGSTLTEAAQLAPPIYPPGFGEAIVFFMSDFPIAHGTNGLSVPCTIPQEFVTHFVNEQAPTRGEAALLHYLDPDTHRNLGEFKLYPDGFMTCVPNSSGTGPQTLPINGVFVFVSWVSRFYQLKPVGTAGPARRLGIRRS

SEQ ID NO:6

VP1[诺如病毒GI.3](Hu/USA/2016/GI.Pd-GI.3/Nashville-0047)

GenBank：AZJ17766.1

MMMASKDAPTNMDGTSGAGQLVPEANTAEPISMEPVAGAATAAATAGQVNMIDPWIMNNYVQAPQGEFTISPNNTPGDILFDLQLGPHLNPFLSHLAQMYNGWVGNMKVKVLLAGNAFTAGKIIISCIPPGFVSQNISIAQATMFPHVIADVRVLEPIEVPLEDVRNVLFHNNDNTPTMRLVCMLYTPLRASGSSSGTDPFVIAGRVLTCPSPDFSFLFLVPPNVEQKTKPFSVPDLPLNVLSNSRVPSLIKFMMVSQDHGQMVQFQNGRVTLDGQLQGTTPTSASQLCKMRGTVYHASGGQGLNLTEIDGTPYHAFESPAPIGFPDIGDSDWHINASPATAFGSGESVKRLDMEQGSSFAPHLGTVHYTNASYEANADLICSLEWLSPPSGGTPNKVNPWAIPRYGSTLTEAAQLAPPIYPPGFGEAIVFFMSDFPIANGQDGLRVPCTIPQEFVTHFVNEQAPTRGEAALLHYVDPDTHRNLGEFKLYPEGFMTCVPNSSGSGPQTLPINGVFTFVSWVSRFYQLKPVGTTGPVRRLGIRRS

SEQ ID NO:7

VP1[诺如病毒GII.3]UK 2015

GenBank：AWR17549.1MKMASNDAAPSNDGAAGLVPEINNEAMALEPVAGAAIAAPLTGQQNIIDPWIMNNFVQAPGGEFTVSPRNSPGEILLNLELGPGINPYLAHLARMYNGYAGGFEVQVVLAGNAFTAGKIIFAAIPPNFPIDNLSAAQITMCPHVIVDVRQLEPVNLPMPDVRNNFFHYNQGSDSRLRLIAMLYTPLRANNSGDDVFTVSCRVLTRPSPDFSFNFLVPPTVESKTKPFSLPILTISEMSNSRFPVPIDSLHTSPTENIVVQCQNGRVTLDGELMGTTQLLPSQICAFRGVLTRSTSRASDQADTATPRLFNYYWHIQLDNLDGTPYDPAEDIPGPLGTPDFRGKVFGVASQRNPDATTRAHEAKIDTTSGRFTPKLGSLEISTESSDFDQNQPTRFTPVGVGVDHEADFQQWTLPDYAGQFTHNMNLAPAVAPNFPGEQLLFFRSHLPSSGGRSNGILDCLVPQEWVQHFYQESAPSQSQVALIRYVNPDTGRVLFEAKLHKLGFMTIAKNGDSPITVPPNGYFRFESWVNPFYTLAPMGTGNGRRRIQ

SEQ ID NO:8

主要衣壳蛋白VP1[诺如病毒GII](Hu/GII.P16-GII.3/RUS/Novosibirsk/NS17-A996/2017)

GenBank：AVO62572.1

MKMASNDATPSNDGAAGLVPEINNEAMALDPVAGAAIAAPLTGQQNIIDPWIMNNFVQAPGGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPEINPYLAHLARMYNGYAGGFEVQVVLAGNAFTAGKIIFAAIPPNFPTDNLSAAQITMCPHVIVDVRQLEPVNLPMPDVRNNFFHYNQGSDSKLRLVAMLYTPLRANNSGDDVFTVSCRVLTRPSPEFSFNFLVPPTVESKTKPFTLPILTISEMSNSRFPVPIDSLHTSPTENIVVQCQNGRVTLDGELMGTTQLLPSQICAFRGVLTRSTSRASDQADTATPRLFNYYWHIQLDNLNGTPYDPAEDIPGPLGTPDFRGKVFGVASQRNPDSTTRAHEAKVDTTAGRFTPKLGSLEISTESDDFDQNQPTRFTPVGIGVDHESDFQQWSLPDYSGQFTHNMNLAPAVAPNFPGEQLLFFRSQLPSSGGRSNGILDCLVPQEWVQHFYQESAPAQTQVALVRYVNPDTGRVLFEAKLHKLGFMTIAKNGDSPITVPPNGYFRFESWVNPFYTLAPMGTGNGRRRVQ

SEQ ID NO:9

VP1[诺如病毒GI](Argentina 2016)

GenBank：QPJ58837.1

MMMASKDAPTNMDGTSGAGQLVPEANTAEPISMEPVAGAATAAATAGQVNMIDPWIMNNYVQAPQGEFTISPNNTPGDILFDLQLGPHLNPFLSHLAQMYNGWVGNMKVKVLLAGNAFTAGKIIISCIPPGFAAQNISIAQATMFPHVIADVRVLEPIEVPLEDVRNVLFHNNDNTPTMRLVCMLYTPLRASGSSSGTDPFVIAGRVLTCPSPDFSFLFLVPPNVEQKTKPFSVPNLPLNTLSNSRVPSLIKSMMVSRDHGQMVQFQNGRVTLDGQLQGTTPTSASQLCKIRGSVFHANGGNGYNLTELDGSPYHAFESPAPIGFPDLGECDWHMEASPTTQFNIGDVIKQINVKQESAFAPHLGTVQVDGLSDVSVNTNMIAKLGWVSPVSDRHKRDVDPWVIPRYGSTLTEAAQLAPPIYPPGFGEAIVFFMSDFPIAHGTNGLSVPCTIPQEFVTHFVNEQAPTRGEAALLHYLDPDTNRNLGEFKLYPDGFMTCVPNSSGTGPQTLPINGVFVFVSWVSRFYQLKPVGTAGPARRLGIRRS

SEQ ID NO:10

VP1[诺如病毒GII](Canada 2019)

GenBank：QSD58385.1

MKMASNDATPSNDGAAGLVPEINNEAMALEPVAGAAIAAPLTGQQNIIDPWIMNNFVQAPGGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPEINPYLAHLARMYNGYAGGFEVQVVLAGNAFTAGKIIFAAIPPNFPIDNLSAAQITMCPHVIVDVRQLEPVNLPMPDVRNNFFHYNQGSDSRLRLVAMLYTPLRANNSGDDVFTVSCRVLTRPSPDFSFNFLVPPTVESKTKPFTLPILTISEMSNSRFPVPIDSLHTSPTENIVVQCQNGRVTLDGELMGTTQLLPSQICAFRGVLTRSTSRASDQADTATPRLFNYYWHIQLDNLNGTPYDPAEDIPGPLGTPDFRGKVFGVASQRNPDSTTRAHEAKVDTTAGRFTPKLGSLEISTESGDFDQNQPTRFTPVGIGVDHEADFQQWSLPDYSGQFTHNMNLAPAVAPNFPGEQLLFFRSQLPSSGGRSNGILDCLVPQEWVQHFYQESAPAQTQVALVRYVNPDTGRVLFEAKLHKLGFMTVAKNGDSPITVPPNGYFRFESWVNPFYTLAPMGTGNGRRRVQ。

本文所引用的每篇专利、专利申请和专利公开的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。尽管已参考具体实施方式公开了本发明，但是显然在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域其他技术人员可以设计本发明的其他实施方式和变化。所附权利要求旨在视为包括所有这些实施方式和等价变化。

Claims

1.用于在受试者中诱导针对诺如病毒(NoV)的免疫应答的组合物，所述组合物包含编码至少一种NoV抗原的至少一种mRNA分子。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述NoV抗原选自p48、核苷三磷酸酶(NTP酶)、p22、VPg、蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)、VP1、VP2、其片段及它们的任何组合。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述NoV抗原选自由GI、GII、GIV、GVIII和GIX组成的基因群。

4.根据权利要求1所述的组合物，其包含编码至少两种NoV VP1抗原的mRNA分子的组合，其中所述VP1抗原选自由GI和GII组成的NoV基因群。

5.根据权利要求4所述的组合物，其包含编码至少两种NoV VP1抗原的mRNA分子的组合，其中所述VP1抗原选自GI.1、GI.3、GI.5、GII.3和GII.4。

6.根据权利要求4所述的组合物，其包含编码NoV VP1 GI.1抗原的mRNA分子和编码NoVVP1 GII.4抗原的mRNA分子的组合。

7.根据权利要求4所述的组合物，其包含编码NoV VP1 GI.1抗原、NoV VP1 GII.4抗原、NoV VP1 GI.3抗原和NoV VP1 GII.3抗原中的每一种的mRNA分子的组合。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含编码选自下列的氨基酸序列的至少一种mRNA分子：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含佐剂。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述mRNA分子被封装在脂质纳米颗粒(LNP)内。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述mRNA分子是核苷修饰的mRNA分子，其包含至少一种选自假尿苷、1-甲基假尿苷和5-甲基尿苷的修饰的核苷。

12.在受试者中诱导针对诺如病毒(NoV)的至少一个毒株的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含编码至少一种NoV抗原或其片段的mRNA分子。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述NoV抗原选自p48、核苷三磷酸酶(NTP酶)、p22、VPg、蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)、VP1、VP2、其片段及它们的任何组合。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述NoV抗原选自由GI、GII、GIV、GVIII和GIX组成的基因群。

15.根据权利要求12所述的方法，其包含编码至少两种NoV VP1抗原的mRNA分子的组合，其中所述VP1抗原选自由GI和GII组成的NoV基因群。

16.根据权利要求15所述的方法，其包含编码至少两种NoV VP1抗原的mRNA分子的组合，其中所述VP1抗原选自GI.1、GI.3、GI.5、GII.3和GII.4。

17.根据权利要求15所述的方法，其包含编码NoV VP1 GI.1抗原的mRNA分子和编码NoVVP1 GII.4抗原的mRNA分子的组合。

18.根据权利要求15所述的方法，其包含编码NoV VP1 GI.1抗原、NoVVP1 GII.4抗原、NoV VP1 GI.3抗原和NoV VP1 GII.3抗原中的每一种的mRNA分子的组合。

19.根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物包含编码选自下列的氨基酸序列的至少一种mRNA分子：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

20.根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物还包含佐剂。

21.根据权利要求12所述的方法，其中所述mRNA分子被封装在脂质纳米颗粒(LNP)内。

22.根据权利要求12所述的方法，其中所述mRNA分子是核苷修饰的mRNA分子，其包含至少一种选自假尿苷、1-甲基假尿苷和5-甲基尿苷的修饰的核苷。

23.根据权利要求12所述的方法，其中通过选自皮内、皮下、吸入、鼻内和肌内的递送途径施用所述组合物。

24.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法包括所述组合物的单次施用。

25.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法包括所述组合物的多次施用。

26.根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物治疗或预防与NoV感染有关的疾病或病症。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述与NoV感染有关的疾病或病症选自肠胃炎、食物中毒、呕吐和腹泻。