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JP2022172133A - リポソーム抗がん組成物 - Google Patents

リポソーム抗がん組成物 Download PDF

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JP2022172133A JP2022127726A JP2022127726A JP2022172133A JP 2022172133 A JP2022172133 A JP 2022172133A JP 2022127726 A JP2022127726 A JP 2022127726A JP 2022127726 A JP2022127726 A JP 2022127726A JP 2022172133 A JP2022172133 A JP 2022172133A
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Abstract

【課題】がんの治療のための方法及び組成物を提供する。【解決手段】弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含するリポソーム封入化学療法剤であって、その酸がシュウ酸または酒石酸である、リポソーム封入化学療法剤ならびにそれを調製及び利用するための方法を提供する。【選択図】図３

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／３８５，７６３号の利益を主張し、その内容はその全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
用量制限毒性及び不十分な局所蓄積の結果としての腫瘍部位での適切な薬物濃度の欠如はしばしば、インビトロで有望な抗がん剤がインビボで適用された場合に失敗する理由である。長年にわたって、受動的薬物標的化、腫瘍細胞への能動的標的化及びナノ担体による薬物放出の誘発を含む、腫瘍内薬物送達を改善するための多くの戦略が開発されてきた［２～１２］。しかしながら、ナノ担体に薬物を組み込むことは、それらの動態及び細胞との相互作用特性を大きく変化させる場合がある。アントラサイクリン系抗生物質のドキソルビシンは、様々な悪性腫瘍のための効果的な抗がん剤であるが、その適用はその心毒性の副作用のために厳しく制限されている。ペグ化リポソームナノ担体へのドキソルビシンの封入は、典型的なドキソルビシンに関連する副作用を低下させる［４、５、７～８］。また、循環時間は延長され［２］、腫瘍特異的送達は透過性及び保持効果の向上のため改善される［３］。
抗がん化合物を含有するリポソームの安定性は、血液中のリポソームの安定性及びリポソーム内部の薬物の安定性の両方に依存する。リポソーム内部の薬物の安定な形態は、血液中の抗腫瘍薬を含有するリポソームの長期化及びより低い毒性に起因するであろう。ドキソルビシンは、硫酸塩［１、１３～１５］、リン酸塩［１３～１４］、及びクエン酸塩［１、１０、１３～１５］などのいくつかの対イオンと凝集体を形成し得ることが示されてきた。異なるドキソルビシン塩を含有するリポソームからのドキソルビシンの漏出挙動は、ドキソルビシン－塩凝集体がリポソームからの遊離ドキソルビシン放出の速度を決定することを確認する。
ドキソルビシンは化学療法薬である。リポソームドキソルビシンでは、薬物の分子は、リポソームとして知られている脂肪コーティング内に包含（封入）されている。そのリポソームは、ドキソルビシンが体内により長く留まることを可能にする［２］。これは、健康な組織に対するより少ない副作用を有しつつ、化学療法剤のより多くががん細胞に送達されることを意味する［４、５、７～８］。ヒトでの使用に承認されたドキソルビシンの２つのリポソーム製剤が現在市場に出ており、それはＭｙｏｃｅｔ（登録商標）及びＣａｅｌｙｘ（登録商標）（ＥＵ）それぞれＤｏｘｉｌ（登録商標）（米国）である。これらの２つのリポソームドキソルビシン薬は現在、わずかに異なる方法で作用し、異なる種類のがんを治療するために使用される。
ナノ薬のＤｏｘｉｌ（登録商標）は、エイズ関連カポジ肉腫、進行性卵巣及び乳がんならびに多発性骨髄腫の治療のために承認されている［４］。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）は、ペグ化リン脂質及びコレステロールから構成され、硫酸アンモニウム勾配により装填される。ドキソルビシンをペグ化リポソームナノ担体に封入すると、典型的なドキソルビシンに関連する副作用が減少する［４～７］。封入は、心毒性を低下させ、循環時間［２］及び腫瘍内送達［３］を増加させるが、治療有効性は、遊離製剤と比較してむしろ軽度である［６～９、１１～１２］。より長い循環時間及び高い安定性を作り出すために、担体は、リン脂質及びＰＥＧコーティングの頑丈な二重層から構成されている。その後、腫瘍間質に入った後、薬物のほとんどは封入されたままであり、細胞内生物学的利用能（すなわち、その細胞内標的部位における薬物の存在）は制限される［９］。それ故、リポソームＤｏｘｉｌ（登録商標）製剤は、より多くのドキソルビシンを腫瘍に送達するが、活性ドキソルビシン分子を効果的に放出しない。非常に遅い薬物放出を伴うこの永続的状態は、遊離薬物投与と比較した不満足な腫瘍反応及び反復投与の必要性を説明することができる。実際、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）の抗腫瘍有効性は、腫瘍部位でのリポソームからの活性薬物の不十分な放出によって妨げられる［１１］。遊離ドキソルビシン投与と比較してＤｏｘｉｌ（登録商標）によって送達される腫瘍内ドキソルビシンの有意な増加が観察されるが、この有意な増加は必ずしも細胞内生物学的利用能及びひいては治療ドキソルビシンレベルの増加と相関するわけではないことを多数の公開された報告が示している［９、１１～１２］。インビトロ及びインビボでの遊離ドキソルビシン対リポソームドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））の動態の調査は、遊離ドキソルビシン投与後８時間以内に、薬物の２６％が核に移行し、特定の濃度に達すると細胞を死滅させることを示した。遊離ドキソルビシンとは異なり、リポソーム製剤として添加されるドキソルビシンの０．４％しか核に進入しなかった［１２］。リソソーム区画におけるリポソームドキソルビシンの隔離が核への送達の制限をもたらすことも示されてきた。この閉じ込めは、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）で送達されたドキソルビシンの生物学的利用可能濃度を大幅に低いものとし、そのため、腫瘍細胞の殺傷において遊離ドキソルビシンと比較して効果的ではない［１２］。また、この薬物は、ペグ化ドキソルビシン装填リポソームの欠点である手掌足底発赤知覚異常（ＰＰＥ）［１０］と呼ばれる局所的炎症性組織反応に関連している。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）の主な副作用は口内炎及び皮膚毒性であった［７、１０］。実際、心毒性はペグ化によって減少するが、長い循環時間はしばしば手掌足底発赤知覚異常（ＰＰＥ）と称される皮膚毒性をもたらし［７、１０、３８～３９］、これはペグ化ドキソルビシン装填リポソームの欠点であり、克服されないままである。
Ｍｙｏｃｅｔ（登録商標）は、卵ホスファチジルコリン／コレステロールを含み、クエン酸塩勾配によりドキソルビシンが装填される。ドキソルビシン－クエン酸塩凝集体の形成は、ｐＨ４．５～５．５で比較的高い薬物放出速度（酸性リソソーム環境で望ましい結果）をもたらすが［１、１３～１５］、これはまた、生理学的ｐＨ及び３７℃でリポソームからのドキソルビシンの余分な漏出をもたらす［１４］。そのような放出プロファイルは、リポソームが血液中を循環している間にリポソームからのドキソルビシンの喪失、及び組み込まれたＤｏｘの有効濃度の減少につながる［１４］。長期的には（投与レジメンに応じて）これは、製剤化されたドキソルビシンのより高い毒性及びより低い有効性ならびにリポソーム懸濁液としてのより短い製品保管期間をもたらし得る。安定性の問題を克服するために、Ｍｙｏｃｅｔ（登録商標）は、患者への投与前にドキソルビシン装填リポソームの調製のための多段階プロトコルに従うことを調剤薬局に要求する３つのバイアルのシステムとして供給される。実際に、その手順は加熱及び激しい振盪を含み、異なる媒体中でのリポソーム材料及びドキソルビシンの別々の再構成、空のリポソームのｐＨの調整、５５～６０℃への材料の加熱、リポソームへのドキソルビシンの装填、及び使用前の室温への材料の冷却を含む複数の段階からなる。これはベッドサイドで調製するには非常に不便な製剤である。
それ故、既存の療法は改善の余地がある。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）はリポソーム懸濁液として優れた安定性を有し、そのため魅力的な１つのバイアル提示形式であるが、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）の抗腫瘍有効性は腫瘍部位でのリポソームからの活性薬物のその減少したまたは制限された放出によって妨げられる。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）と比較して、Ｍｙｏｃｅｔ（登録商標）は、酸性ｐＨ（腫瘍部位）でドキソルビシンの著しく高い放出を示すが、薬物の安全性及び有効性の低下をもたらす生理学的ｐＨでのリポソームからのドキソルビシンの漏出を示す。Ｍｙｏｃｅｔ（登録商標）製品はまた、患者への投与の前にドキソルビシン装填リポソームの調製のための困難な多段階プロトコルに従うことを薬局に要求する。
それ故、既知の市販製品（例えば、Ｍｙｏｃｅｔ（登録商標）及びＤｏｘｉｌ（登録商標））に対して改善された薬物放出プロファイルを有し、かつ単純で効率的で魅力的な製剤調製システムを有する新規リポソームナノ担体の開発の必要性が存在する。本明細書では、当該技術分野におけるこれらの及び他の必要性に対する解決策が提供される。
本明細書の開示は、とりわけ、抗がん組成物及びそれらの生成のための方法を提供する。所定の態様では、組成物は、リポソームを含む医薬組成物である。リポソームは、弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含する。実施形態では、酸は、シュウ酸または酒石酸である。実施形態では、弱塩基性抗がん化合物は、ドキソルビシン、イリノテカン、ミトキサントロンまたはそれらの組み合わせである。
実施形態では、リポソームはポロキサマーを含む。実施形態では、ポロキサマーはポロキサマー１８８である。
実施形態では、リポソームは複数の脂質化合物を含む。複数の脂質の弱塩基性抗がん剤に対する重量比は、少なくとも２０／１であり得る。実施形態では、リポソームは、複数の脂質化合物を含み、複数の脂質の弱塩基性抗がん剤に対する重量比は、約２０／１～約１００／１である。実施形態では、リポソームは、複数の脂質化合物を含み、複数の脂質の弱塩基性抗がん剤に対する重量比は、２０／１～約５０／１である。
実施形態では、弱塩基性抗がん化合物は、酸性ｐＨでのみリポソームから実質的に放出される。実施形態では、弱塩基性抗がん化合物の少なくとも１０～１００％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５．０～６．７でリポソームから放出される。実施形態では、弱塩基性抗がん化合物の５％未満が、標準アッセイ条件下でｐＨ７．４でリポソームから放出される。実施形態では、標準アッセイ条件は、ｐＨ５．０以上、例えば、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ６．７、ｐＨ７．０、もしくはｐＨ７．４または前述のｐＨの任意の介在数のＰＢＳ緩衝液またはヒト血清、もしくはヒト血液での２０倍及び／または５０倍の希釈及び３７℃での２、４、または８時間のインキュベートを含む。実施形態では、標準アッセイ条件は、ＰＢＳ緩衝液での２０倍及び／または５０倍の希釈を含む。実施形態では、標準アッセイ条件は、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳ緩衝液でのインキュベートを含む。実施形態では、標準アッセイ条件は、約ｐＨ５．５を有するＰＢＳ緩衝液でのインキュベートを含む。実施形態では、標準アッセイ条件は、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳ緩衝液でのインキュベートを含む。実施形態では、標準アッセイ条件は、約ｐＨ６．５を有するＰＢＳ緩衝液でのインキュベートを含む。実施形態では、標準アッセイ条件は、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳ緩衝液でのインキュベートを含む。実施形態では、標準アッセイ条件は、約ｐＨ７．０を有するＰＢＳ緩衝液でのインキュベートを含む。実施形態では、標準アッセイ条件は、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳ緩衝液でのインキュベートを含む。実施形態では、標準アッセイ条件は、ヒト血清またはヒト血液でのインキュベートを含む。実施形態では、標準アッセイ条件は、３７℃で約２時間のインキュベートを含む。実施形態では、標準アッセイ条件は、３７℃で約４時間のインキュベートを含む。実施形態では、標準アッセイ条件は、３７℃で約６時間のインキュベートを含む。
実施形態では、リポソームは実質的に球状である。実施形態では、医薬組成物は、動的光散乱によって測定される強度平均粒径（Ｚ平均）によって決定される約６０～８０ｎｍの平均最長寸法を有する複数のリポソームを含む。実施形態では、医薬組成物は、動的光散乱によって測定される数基準粒径によって決定される約１０～３０ｎｍの平均最長寸法を有する複数のリポソームを含む。実施形態では、医薬組成物は、低温透過型電子顕微鏡法によって決定される１０～３０ｎｍの平均最長寸法を有する複数のリポソームを含む。
実施形態では、リポソームは、約５００～１０００μｇ／ｍＬの弱塩基性抗がん化合物及び任意に酸またはその塩を含む。実施形態では、リポソームは、約７００～８５０μｇ／ｍＬの弱塩基性抗がん化合物及び、適用可能な場合には、酸またはその塩を含む。実施形態では、リポソームは、凝集体を形成する複数の弱塩基性抗がん化合物を含む。凝集体は非結晶性であり得る。非結晶性凝集体は、部分的にまたは完全に無秩序（非規則的）であり得る。実施形態では、リポソームは、複数の弱塩基性抗がん化合物を含み、標準保存条件下で２～８℃で保存した場合、４０日後に複数の弱塩基性抗がん化合物の９０％超を保持する。
実施形態では、リポソームは、コレステロールもポロキサマー１８８も含まない。実施形態では、リポソームは、シュウ酸、酒石酸、またはそれらの塩以外の酸性有機化合物を含まない。実施形態では、リポソームは、弱塩基性抗がん化合物以外の活性剤を含まない。実施形態では、リポソームは、弱塩基性抗がん化合物以外の薬物を含まない。実施形態では、リポソームは、弱塩基性抗がん化合物以外の医薬活性化合物を含まない。実施形態では、リポソームは、弱塩基性抗がん化合物以外のいかなる抗がん化合物も含まない（例えば、リポソームは、弱塩基性抗がん化合物の塩を含む１つのみの化学構造の弱塩基性抗がん化合物を含む）。
実施形態では、リポソームは、弱塩基性抗がん化合物を非装填リポソームに装填し、続いて室温でインキュベートすることによって形成される。いくつかの実施形態では、非装填リポソームは約３０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約６０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約９０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約１２０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約１５０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約１８０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約２１０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約２４０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約２７０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約３００日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約３３０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約３６０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約３９０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約４２０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約４５０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約４８０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約５１０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは約５４０日間保存される。実施形態では、非装填リポソームは標準保存条件下で２～８℃で保存される。実施形態では、上記の任意の条件で保存された非装填リポソームは、弱塩基性抗がん化合物の装填時の弱塩基性抗がん化合物の９０％超を保持する。実施形態では、弱塩基性抗がん化合物の少なくとも４０～８０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５．０でリポソームから放出される。実施形態では、弱塩基性抗がん化合物の少なくとも２０～６０％がｐＨ６．０でリポソームから放出される。実施形態では、弱塩基性抗がん化合物の少なくとも７～３０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７でリポソームから放出される。いくつかの実施形態では、弱塩基性抗がん化合物の５％未満が、標準アッセイ条件下でｐＨ７．４でリポソームから放出される。
更なる態様では、本明細書で提供される開示は、弱塩基性抗がん化合物、弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含する（すなわち、含むまたは封入する）リポソームを調製するための方法を含む。実施形態では、酸は、シュウ酸または酒石酸である。その方法は、その弱塩基性抗がん化合物の溶液を、封入された酸または塩を含有するリポソームを含む懸濁液と混合すること；及びその弱塩基性抗がん化合物の溶液を、封入された酸または塩を含有するリポソームを含む懸濁液とインキュベートすることを含む。実施形態では、封入された酸または塩を含有するリポソームの懸濁液と混合するのに使用されるその弱塩基性抗がん化合物の約８５～１００％がリポソーム内に保持される。実施形態では、封入された酸または塩を含有するリポソームの懸濁液と混合するのに使用されるその弱塩基性抗がん化合物の約９０～１００％がリポソーム内に保持される。実施形態では、インキュベート工程は室温で行われる。インキュベート工程は約１０～３０分である。実施形態では、インキュベート工程は約５～２５分である。
更なる態様では、本明細書で提供される開示は、その弱塩基性抗がん化合物を含む第１のバイアル、及び封入された酸または塩を含有するリポソームの懸濁液を含む第２のバイアルを含むキットを含む。実施形態では、第１のバイアルのその弱塩基性抗がん化合物は、その凍結乾燥された弱塩基性抗がん化合物である。実施形態では、第２のバイアルの封入された酸または塩を含有するリポソームの懸濁液は、水性リポソーム懸濁液である。
更なる態様では、本明細書で提供される開示は、上述のキットを使用する方法であって、その方法が第１のバイアルの内容物を第２のバイアルの内容物と混合することを含む、方法を含む。実施形態では、混合は室温で行われる。
実施形態では、本明細書で提供される開示は、弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含するリポソームを調製するための方法を含む。実施形態では、酸はクエン酸である。その方法は、弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩の溶液を、封入された酸またはその塩を含有するリポソームを含む懸濁液と混合すること；及び弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩の溶液を、封入された酸またはその塩を含有するリポソームを含む懸濁液とインキュベートすることを含む。
実施形態では、本明細書で提供される開示は、リポソームを含む医薬組成物であって、そのリポソームが、弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含する、医薬組成物を含む。実施形態では、酸はクエン酸である。実施形態では、リポソームは、複数の脂質化合物を含み、複数の脂質の弱塩基性抗がん剤に対する重量比が少なくとも２０／１である。
更なる態様では、本明細書の開示は、対象においてがんを治療する方法を提供する。その方法は、有効量の医薬組成物を治療を必要とする対象に投与することを含む。医薬組成物は、弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含するリポソームを含有する。実施形態では、酸は、シュウ酸または酒石酸である。弱塩基性抗がん化合物は、がんに対して抗がん活性を有する。
本明細書に記載の態様及び実施形態の各々は、実施形態または態様の文脈から明示的または明確に除外されない限り、一緒に使用することができる。
（Ａ）組織的循環、（Ｂ）腫瘍及び局所環境ならびに（Ｃ及びＤ）細胞内環境におけるｐＨ勾配を示す概略図である。（Ｅ）はｐＨ８．０～５．０の範囲にわたる望ましい放出プロファイルを示す。 （Ａ）組織的循環、（Ｂ）腫瘍及び局所環境ならびに（Ｃ及びＤ）細胞内環境におけるｐＨ勾配を示す概略図である。（Ｅ）はｐＨ８．０～５．０の範囲にわたる望ましい放出プロファイルを示す。 インビボ試験のための実験設計の概略図である。 ３７℃での８時間のインキュベート後の溶解媒体へのリポソーム内ドキソルビシンの放出の割合を示す棒グラフである。リポソームへのドキソルビシン装填は７０℃で実施した。各対の左側の棒－ｐＨ５での放出；各対の右側の棒－ｐＨ７．４での放出。曲線上の各点は、２～６回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。 （ＮＨ４）２ＨＰＯ４勾配を介してドキソルビシンが装填されたＥＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームの（Ｃ－ＴＥＭ）顕微鏡写真である［１３］。 クエン酸塩によって緩衝化されたリポソームに装填されたドキソルビシンの（Ｃ－ＴＥＭ）画像である［１５］。 図６Ａ及び図６Ｂは、（図６Ａ）クエン酸塩中で調製されたリポソーム［１５］、及び（図６Ｂ）（ＮＨ４）２ＳＯ４中で調製されたリポソーム［１５、２５］の低温透過型電子顕微鏡法（ｃＴＥＭ）画像を示している。 図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃは、ドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソーム（ロット＃６４７－２－１５７）の低温透過型電子顕微鏡法の特性化を示している。図７Ａは２７Ｋの倍率を有し、図７Ｂ及び７Ｃは５０Ｋの倍率を有する。 ８時間での溶解媒体へのリポソーム内ドキソルビシンの放出の割合に対する脂質対薬物（または脂質／薬物または脂質：薬物と同等に称される）比の影響を示すグラフである。シュウ酸塩含有リポソームへのドキソルビシン装填は７０℃で実施した。放出実験は３７℃で行った。ｐＨ５．０での放出－上の線。ｐＨ７．４での放出－下の線。曲線上の各点は、２～３回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。 プラセボ、遊離ドキソルビシン、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）、及びドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームのマウス死亡率に対する影響を示すグラフである。マウスを４つの群に分けた（各Ｒｘ群に８匹のマウス；プラセボ群に６匹のマウス）。全ての試験品を静脈内（ｉｖ）注射により３日間連続してマウスに投与した。各Ｒｘ処置群には１回の注射当たり３ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンが投与された。群＃１（プラセボ）には薬物非含有脂質製剤が投与された。群２にはドキソルビシンシュウ酸塩リポソーム（ロット＃６４７－２－１３）が投与された。群３にはＤｏｘｉｌ（登録商標）が投与された。群４には遊離ドキソルビシンが投与された。その治療はまたグラフに示されている。グラフにおいてＢリンパ腫細胞投与日は０日目として定義される。 ８時間での溶解媒体へのリポソーム内ドキソルビシンの放出の割合に対する脂質／薬物比の影響を示すグラフである。酒石酸塩含有リポソームへのドキソルビシン装填は７０℃で実施した。放出実験は３７℃で行った。ｐＨ５．０での放出－上の線。ｐＨ７．４での放出－下の線。曲線上の各点は、２～３回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。 ８時間での溶解媒体へのリポソーム内ドキソルビシンの放出の割合に対する脂質／薬物比の影響を示すグラフである。シュウ酸塩含有リポソームへのドキソルビシン装填は室温で実施した。放出実験は３７℃で行った。ｐＨ５．０での放出－上の線。ｐＨ７．４での放出－下の線。曲線上の各点は、２～３回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。 ８時間での溶解媒体へのリポソーム内ドキソルビシンの放出の割合に対する脂質／薬物比の影響を示すグラフである。酒石酸塩含有リポソームへのドキソルビシン装填は室温で実施した。放出実験は３７℃で行った。ｐＨ５．０での放出－上の線。ｐＨ７．４での放出－下の線。曲線上の各点は、２～３回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。 ３７℃で測定された溶解媒体へのリポソーム内ドキソルビシンの放出の割合に対する異なる装填温度の影響を示すグラフである。シュウ酸塩含有リポソームへのドキソルビシン装填は７０℃で実施した：ａ）ｐＨ５．０での放出（上の実線）；ｂ）ｐＨ７．４での放出（下の実線）；曲線上の各点は、４回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。シュウ酸塩含有リポソームへのドキソルビシン装填は室温で実施した：ｃ）ｐＨ５．０での放出（上の点線）；ｐＨ７．４での放出（下の点線）；曲線上の各点は、２回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。 ３７℃で測定された溶解媒体へのリポソーム内ドキソルビシンの放出の割合に対する異なる装填温度の影響を示すグラフである。酒石酸塩含有リポソームへのドキソルビシン装填は７０℃で実施した：ａ）ｐＨ５．０での放出（上の実線）；ｂ）ｐＨ７．４での放出（下の実線）；曲線上の各点は、２回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。酒石酸塩含有リポソームへのドキソルビシン装填は室温で実施した。ｃ）ｐＨ５．０での放出（上の点線）；ｐＨ７．４での放出（下の点線）；曲線上の各点は、２回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。 ３７℃での８時間のインキュベート後の溶解媒体へのリポソーム内ドキソルビシンの放出の割合を示すグラフである。リポソームへのドキソルビシン装填は室温で実施した。各対の左側の棒－ｐＨ５での放出；各対の右側の棒－ｐＨ７．４での放出。曲線上の各点は、２～３回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。 リポソームからのｐＨ依存性ドキソルビシン放出に対する様々な対イオンの影響を示すグラフである。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）及び「Ｍｙｏｃｅｔ」との比較。リポソーム材料を溶解媒体で２０倍に希釈し、放出実験をｐＨ７．４、６．７、６．０、及び５．０で３７℃で８時間行った。曲線上の各点は、２～３回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。製剤組成、脂質対薬物（すなわち、脂質／薬物）及びリン脂質対遊離コレステロール（すなわち、リン脂質／遊離コレステロールまたはＰＬ／ＦＣ）比が表２８ｅ～２８ｇに示されている。 リポソームからのｐＨ依存性ドキソルビシン放出に対する様々な対イオンの影響を示すグラフである。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）及び「Ｍｙｏｃｅｔ」との比較。リポソーム材料を溶解媒体で５０倍に希釈し、放出実験をｐＨ７．４、６．７、６．０、及び５．０で３７℃で８時間行った。曲線上の各点は、２～３回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。製剤組成、脂質／薬物及びリン脂質／遊離コレステロール（ＰＬ／ＦＣ）比が表２８ｅ～２８ｇに示されている。 リポソームからのｐＨ依存性ドキソルビシン放出に対する脂質／薬物及びリン脂質／遊離コレステロール（ＰＬ／ＦＣ）比の影響を示すグラフである。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）及び「Ｍｙｏｃｅｔ」との比較。リポソーム材料を溶解媒体で２０倍に希釈し、放出実験をｐＨ７．４、６．７、６．０、及び５．０で３７℃で８時間行った。曲線上の各点は、２～３回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。製剤組成、脂質／薬物及びリン脂質／遊離コレステロール（ＰＬ／ＦＣ）比が表２８ｅ～２８ｇに示されている。 リポソームからのｐＨ依存性ドキソルビシン放出に対する脂質／薬物及びリン脂質／遊離コレステロール（ＰＬ／ＦＣ）比の影響を示すグラフである。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）及び「Ｍｙｏｃｅｔ」との比較。リポソーム材料を溶解媒体で２０倍に希釈し、放出実験をｐＨ７．４、６．７、６．０、及び５．０で３７℃で８時間行った。曲線上の各点は、２～３回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。製剤組成、脂質／薬物及びリン脂質／遊離コレステロール（ＰＬ／ＦＣ）比が表２８ｅ～２８ｇに示されている。 リポソームの血清安定性に対する脂質／薬物比の影響を示すグラフである。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）及び「Ｍｙｏｃｅｔ」との比較。リポソーム材料をヒト血清中で５０倍に希釈し、リポソームの安定性を３７℃で２、４、及び８時間モニターした。曲線上の各点は、２～３回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。製剤組成、脂質／薬物及びリン脂質／遊離コレステロール（ＰＬ／ＦＣ）比が表２８ｅ及び２８ｈに示されている。 リポソームの血清安定性に対するリン脂質／遊離コレステロール（ＰＬ／ＦＣ）比の影響を示すグラフである。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）及び「Ｍｙｏｃｅｔ」との比較。リポソーム材料をヒト血清中で５０倍に希釈し、リポソームの安定性を３７℃で２、４、及び８時間モニターした。曲線上の各点は、２～３回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。製剤組成、脂質／薬物及びリン脂質／遊離コレステロール（ＰＬ／ＦＣ）比が表２８ｅ及び２８ｈに示されている。 ３７℃での２時間のインキュベート後の溶解媒体（ｐＨ５）へのリポソーム内のイリノテカン放出の割合を示すグラフである。曲線上の各点は、２～６回の独立した実験で得られたデータの平均±ＳＴＤを表す。各実験について全ての測定を六重に実施した。 図２３Ａ及び図２３Ｂは、ｐＨ７．４及びｐＨ５．０におけるミトキサントロン溶液の画像である。図２３Ａは時間０における溶液を示している。図２３Ｂは時間２４時間における溶液を示している。リポソームへのミトキサントロン装填は２～８℃で実施した。
本開示は、薬物送達に好適な安定な抗がん化合物及び酸またはその塩ならびに脂質に富むサブミクロン粒子（リポソームを有するナノ粒子）を作製するために使用される組成物及びプロセスを記載する。本開示の組成物及び方法は、リポソーム中の他の薬物塩に同様に適用され得る。本明細書に開示される方法に従って調製されたドキソルビシン塩の組成物及びリポソームの構造は、望ましい生物学的及び物理化学的性能（ｐＨ依存性薬物放出プロファイル）をもたらす。
抗がん化合物のドキソルビシンを利用する本開示の実施形態では、本開示の治療的有用性は、生理学的ｐＨ約７．４でのリポソームからの低速度のドキソルビシン放出（循環中の間）、及びより酸性のｐＨ５．０～６．７での有意に高い放出速度（例えば、がん細胞によるドキソルビシン装填リポソームの内在化時の局所腫瘍環境またはエンドソーム／リソソーム環境への曝露後）を含むそれらのより望ましい放出プロファイルにおいて既知のリポソームに封入されたドキソルビシンの療法と比較して改善されている。
通常の組織と主要部位とのｐＨ勾配の存在及び重要性、ならびに単に送達のためではなく、利用可能な遊離薬物を作製するためのリポソームからの（効率的な放出を介する）がん細胞へのｐＨ依存性薬物放出の効果を示す数多くの公開された報告がある［１、１０、１３～１５、２５、４０～４２］。多くの固形腫瘍と取り囲む通常の組織との間の１つの主要な相違は、栄養及び代謝環境である。腫瘍の機能的血管系はしばしば、腫瘍細胞の拡大する集団の栄養的必要性を供給するには不十分であり、これは酸素及び多くの他の栄養素の欠乏につながる。嫌気性条件下での乳酸の生成及びエネルギー欠乏環境でのＡＴＰの加水分解は、多くの腫瘍タイプで見られる酸性微環境に貢献する［３５］。ヒト及び齧歯類の通常の組織におけるｐＨは７．００～８．０６の範囲である一方で、より広い範囲のｐＨ値が悪性腫瘍において、ヒト及び齧歯類の両方の腫瘍では約ｐＨ５．８～ｐＨ７．６と決定された［１、４１～４２］。
それ故、リポソームからのドキソルビシンの望ましい放出プロファイルは次のものであろう：生理学的ｐＨ約７．４（循環中の間）でリポソームからの放出を抑制しつつ、酸性ｐＨ５．０～６．７（すなわち、がん細胞によるリポソームの内在化時の局所腫瘍環境またはエンドソーム／リソソーム環境への曝露後）で最大化された放出速度。
定義
本明細書で使用される場合、「リポソーム」は、脂質二重層から構成される主に球状のナノ粒子である。実施形態では、リポソームは送達のために治療薬を封入することができる。リポソームの脂質含有量は、リポソームのサイズ、安定性、溶解度、曲率などを変えることで変動し得る。脂質の例には、コレステロール、ホスファチジルコリン（ＰＣ）生成物／誘導体（様々な炭素鎖長の脂肪酸、飽和、多不飽和及び混酸のＰＣ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ＤＭＰＡ）；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ＤＰＰＡ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ＤＯＰＡ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＭＰＧ）；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＰＰＧ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＭＰＳ）；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＰＰＳ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ－２０００）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノール－アミン－Ｎ－［フォレート（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ－５０００）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００）；１，２－ステアロイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｌ－α－ホスファチジルコリン、水素化（Ｈｙｄｒｏ Ｓｏｙ ＰＣ）；及び２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｌｙｓｏ ＰＣ）が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「包含すること」、「封入すること」または「保持すること」という用語は、例えば、リポソーム内に含むことを意味する。これはまた、本明細書の請求項の文脈において「含む」と称され得る。例えば、リポソームは、抗がん化合物、または酸もしくはその塩などの治療剤を包含し得る。実施形態では、包含された場合、治療剤は経時的にリポソームから散逸し得るか、またはリポソームから拡散し得る。
本明細書で使用される「弱塩基性抗がん化合物」という用語は、弱塩基性ｐＫａを有するがんまたは新生物性疾患の治療に有用な任意の治療剤を含む。実施形態では、弱塩基性ｐＨは、約ｐＨ７．０～１０．０のｐＫａによって示される。実施形態では、弱塩基性ｐＨは、約ｐＨ７．０～９．０のｐＫａによって示される。実施形態では、弱塩基性ｐＨは、約ｐＨ７．５～９．０のｐＫａによって示される。実施形態では、弱塩基性ｐＨは、約ｐＨ８．０～９．０のｐＫａによって示される。実施形態では、抗がん剤は、複数のｐＫａを有し、そのうちのいずれか１つは、上述した弱塩基性の範囲内に入り得る。
「ドキソルビシン」という用語は、その明白な通常の意味に従って使用される。ドキソルビシンは、元々Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓから得られる抗がん化合物である。ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）はまた、アドリアマイシン、ドキシル、ルベックス、アドリアブラスチン、及びドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｅ）とも称され得る。実施形態では、ドキソルビシンは弱塩基性抗がん化合物である。ドキソルビシンの構造は本明細書に示されている。
「イリノテカン」という用語は、その明白な通常の意味に従って使用される。イリノテカンは、再発した（復活した）または他の化学療法では良好にならなかった転移性がんを含む転移した（身体の他の部分に広がった）大腸がん及びゲムシタビンに基づく療法の後の疾患進行後の膵臓の転移性腺がんを有する患者の治療に使用され得る抗がん化合物である。イリノテカンはまた、カンプトサー（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）；９７６８２－４４－５；（＋）－イリノテカン；イリノテカナム；及びイリノテカナムとも称され得る。実施形態では、イリノテカンは弱塩基性抗がん化合物である。イリノテカンの構造は本明細書に示されている。
「ミトキサントロン」という用語は、その明白な通常の意味に従って使用される。ミトキサントロンは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び前立腺がんに使用され得る抗がん化合物である。それはまた、ホルモン抵抗性である（ホルモン治療に反応しない）進行した疾患における緩和治療として使用され得る。ミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）は、６５２７１－８０－９；ミトキサンスロン；ミトザントロン；ＤＨＡＱ；及びミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎ）とも称され得る。実施形態では、ミトキサントロンは弱塩基性抗がん化合物である。ミトキサントロンの構造は本明細書に示されている。
本明細書で使用される場合、「酸またはその塩」という用語は、記述された化合物の任意の医薬的に許容可能な酸または塩を指す。抗がん化合物と共に使用するのに好適な酸または塩の例には、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、２，２－ジクロロ酢酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、２－オキソグルタル酸、４－アセトアミド安息香酸、４－アミノサリチル酸、酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｌ）、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ショウノウ酸（＋）、ショウノウ－１０－スルホン酸（＋）、カプリン酸（デカン酸）、カプロン酸（ヘキサン酸）、カプリル酸（オクタン酸）、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸（Ｄ）、グルコン酸（Ｄ）、グルクロン酸（Ｄ）、グルタミン酸、グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩酸、イソ酪酸、乳酸（ＤＬ）、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸（－Ｌ）マロン酸、マンデル酸（ＤＬ）、メタンエスルホン酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸（－Ｌ）、サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸（＋Ｌ）、チオシアン酸、トルエンスルホン酸（ｐ）、及びウンデシレン酸が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「無秩序」または「非結晶性」という用語は、化合物の非規則的な多形状態をいう。この無秩序な状態は、非晶質状態に似ている場合がある。無秩序な非結晶性凝集体では、分子は規則的な結晶格子を形成しない。実施形態では、無秩序な凝集体はまた、任意の非結晶性構造、及びコロイドを含み得る。実施形態では、いくつかの無秩序で非結晶性の凝集体は、いくつかの繊維性構造を含有し得る。
本明細書で使用される場合、「実質的に放出される」という用語は、内容物の大部分が、例えば、リポソームから放出されることを示す。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約５％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約１０％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約２０％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約３０％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約４０％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約５０％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約６０％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約７０％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約８０％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約９０％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約９５％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約９７％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約９８％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的に放出されるとは、包含された内容物の約９９％超またはそれ以上が放出されることを意味する。実施形態では、実質的な放出はｐＨ駆動であり、例えば、抗がん剤は酸性ｐＨでのみ実質的に放出される。
本明細書で使用される場合、「標準アッセイ条件（複数可）」という用語は、時間、温度、ｐＨなどの標準的な尺度を含む、制御された一連のアッセイ条件を指す。実施形態では、標準アッセイ条件は、ＰＢＳでの２０倍及び／または５０倍希釈を含む。実施形態では、標準アッセイ条件は、血清または血液での２０倍及び／または５０倍希釈を含む。実施形態では、本明細書に記載の放出アッセイのための標準アッセイ条件は約２５℃である。実施形態では、本明細書に記載の放出アッセイのための標準アッセイ条件は約３７℃である。実施形態では、本明細書に記載の放出アッセイのための標準アッセイ条件は、約２、４、８時間または前述の任意の介在期間または約８時間超のインキュベートを含む。実施形態では、本明細書に記載の放出アッセイのための標準アッセイ条件は、約２時間のインキュベートを含む。実施形態では、本明細書に記載の放出アッセイのための標準アッセイ条件は、約４時間のインキュベートを含む。実施形態では、本明細書に記載の放出アッセイのための標準アッセイ条件は、約８時間のインキュベートを含む。実施形態では、本明細書に記載の放出アッセイのための標準アッセイ条件は、８時間超のインキュベートを含む。実施形態では、本明細書に記載の放出アッセイのための標準アッセイ条件は、約ｐＨ７．４でのインキュベートを含む。実施形態では、本明細書に記載の放出アッセイのための標準アッセイ条件は、約ｐＨ６．７でのインキュベートを含む。実施形態では、本明細書に記載の放出アッセイのための標準アッセイ条件は、約ｐＨ６．０でのインキュベートを含む。実施形態では、本明細書に記載の放出アッセイのための標準アッセイ条件は、約ｐＨ５．０でのインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有するＰＢＳでの５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有するＰＢＳでの５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有するＰＢＳでの５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、２５℃または約２５℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での２０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での２０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での２０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での２０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ７．４を有する血清または血液での５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．７を有する血清または血液での５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ６．０を有する血清または血液での５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
そのため、いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での５０倍希釈での約２時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での５０倍希釈での約４時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での５０倍希釈での約８時間のインキュベートを含む。いくつかの実施形態では、放出アッセイのための標準アッセイ条件は、３７℃または約３７℃であり、約ｐＨ５．０を有する血清または血液での５０倍希釈での８時間超のインキュベートを含む。
本明細書で使用される場合、「標準保存条件（複数可）」という用語は、化合物、例えば、医薬化合物の適切な保存のために制御された条件を指す。実施形態では、時間、温度、湿度などの所定の標準的な尺度が制御され得る。実施形態では、標準保存条件は、２～８℃、周囲相対湿度下での保存を含む。実施形態では、周囲相対湿度は、約１０％～約９０％の相対湿度の任意の範囲を含む。実施形態では、周囲相対湿度は、約１０％の相対湿度を含む。実施形態では、周囲相対湿度は、約２０％の相対湿度を含む。実施形態では、周囲相対湿度は、約３０％の相対湿度を含む。実施形態では、周囲相対湿度は、約４０％の相対湿度を含む。実施形態では、周囲相対湿度は、約５０％の相対湿度を含む。実施形態では、周囲相対湿度は、約６０％の相対湿度を含む。実施形態では、周囲相対湿度は、約７０％の相対湿度を含む。実施形態では、周囲相対湿度は、約８０％の相対湿度を含む。実施形態では、周囲相対湿度は、約９０％の相対湿度を含む。
本明細書で使用される場合、「実質的に球状」は、球状形状への平均的傾向を意味し、例えば、任意の軸を通る直径はおおよそ同等である。実施形態では、長さが異なる直径はない。実施形態では、任意の他の軸の直径から長さが約２０％以下を超えて異なる直径はない。実施形態では、実質的に球状の形状の範囲内で任意の他の軸の直径から長さが約２０％以下を超えて異なる直径はない。実施形態では、実質的に球状の形状の範囲内で任意の他の軸の直径から長さが約１５％以下を超えて異なる直径はない。実施形態では、実質的に球状の形状の範囲内で任意の他の軸の直径から長さが約１０％以下を超えて異なる直径はない。実施形態では、実質的に球状の形状の範囲内で任意の他の軸の直径から長さが約９％以下を超えて異なる直径はない。実施形態では、実質的に球状の形状の範囲内で任意の他の軸の直径から長さが約８％以下を超えて異なる直径はない。実施形態では、実質的に球状の形状の範囲内で任意の他の軸の直径から長さが約７％以下を超えて異なる直径はない。実施形態では、実質的に球状の形状の範囲内で任意の他の軸の直径から長さが約６％以下を超えて異なる直径はない。実施形態では、実質的に球状の形状の範囲内で任意の他の軸の直径から長さが約５％以下を超えて異なる直径はない。実施形態では、実質的に球状の形状の範囲内で任意の他の軸の直径から長さが約４％以下を超えて異なる直径はない。実施形態では、実質的に球状の形状の範囲内で任意の他の軸の直径から長さが約３％以下を超えて異なる直径はない。実施形態では、実質的に球状の形状の範囲内で任意の他の軸の直径から長さが約３％以下を超えて異なる直径はない。実施形態では、実質的に球状の形状の範囲内で任意の他の軸の直径から長さが約１％以下を超えて異なる直径はない。
本明細書で使用される場合、「平均最長寸法」という用語は、実質的に球状の物体の最長寸法の平均を指す。いくつかの実施形態では、平均最長寸法は、強度平均粒径（Ｚ平均）によって測定され得る。いくつかの実施形態では、強度平均粒径（Ｚ平均）は、ＩＳＯ１３３２１（国際標準化機構１９９６）で定義されているようにキュムラント分析から計算される。いくつかの実施形態では、平均最長寸法は、数基準粒径によって測定され得る。いくつかの実施形態では、数による粒子サイズ分布は、材料の強度分布及び光学特性から算出される。粒子サイズと分布への寄与との間には一乗関係がある。
本明細書で使用される場合、「室温」または「ＲＴ」という用語は、標準的な室内温度で行われるアッセイの温度を指す。実施形態では、室温は、いかなる追加の加熱または冷却を伴わないアッセイの実施を指す。実施形態では、室温は約２２～２５℃の制御された温度である。実施形態では、室温は２５℃である。
本明細書で使用される場合、「リポソーム溶液」、「リポソームの水溶液」、「リポソーム懸濁液」または「リポソームの水性懸濁液」は、リポソームの液体溶液または懸濁液を指す。リポソームは様々な溶媒、緩衝液または溶液に懸濁され得る。実施形態では、リポソームは水相に懸濁される。実施形態では、リポソームはｐＨ７．０～６．７を有する生理的緩衝液に懸濁される。
本明細書で使用される場合、「ポロキサマー」という用語は、非イオン性コポリマーである。ポロキサマーは、ポリオキシプロピレンの中央疎水性鎖及びポリオキシエチレンの２つの側部鎖を含む。実施形態では、ポロキサマーはポロキサマー１８８である。ポロキサマー１８８の更なる名称は、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８、Ｐ１８８、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８、及びポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）である。Ｐ１８８のＣＡＳ番号は９００３－１１－６である。Ｐ１８８は以下の構造（式中、Ｘは８０であり、Ｚは８０であり、Ｙは２７である）を有する：
Figure 2022172133000002
本明細書で使用される場合、「コレステロール」または「コレステロール化合物」という用語は、ステロールまたは変性ステロイドを指す。非限定的な例には、コレステロール、ヒドロキシコレステロール、コレスタン（ｃｈｏｌｅｓｔａｎ）、コレスタン（ｃｈｏｌｅｓｔａｎｅ）、ケトコレスタノール、カンペステロール、コレステロールエポキシド、コレステロール－ペグ、ラノステロール、エステル化コレステロールが含まれる。「遊離コレステロール」という用語は、以下の一般式Ｃ２７Ｈ４６Ｏ及び構造を有する非エステル化コレステロールを指す：
Figure 2022172133000003
本明細書で使用される場合、ホスファチド（複数可）とも呼ばれる「リン脂質（複数可）」という用語は、リン及び／または脂肪酸含有物質の種類のメンバーを指す。一般に、リン脂質は、リン酸基、２つのアルコール、及び１つまたは２つの脂肪酸から構成されている。分子の一方の端部には、リン酸基及び１つのアルコールがあり；この端部は極性であり、すなわち、電荷を有し、水に引き付けられる（親水性）。脂肪酸からなる他方の端部は中性であり；それは疎水性かつ水不溶性であるが脂溶性である。リン脂質のいくつかの非限定的かつ例示的な例には、ホスファチジン酸（ホスファチデート）、ホスファチジルコリン（ｐｃ）生成物／誘導体（様々な炭素鎖長の脂肪酸、飽和、多不飽和及び混酸のＰＣ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ＤＭＰＡ）；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ＤＰＰＡ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ＤＯＰＡ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＭＰＧ）；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＰＰＧ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＭＰＳ）；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＰＰＳ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ－２０００）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノール－アミン－Ｎ－［フォレート（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ－５０００）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００）；１，２－ステアロイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｌ－α－ホスファチジルコリン、水素化（Ｈｙｄｒｏ Ｓｏｙ ＰＣ）；及び２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｌｙｓｏ ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）ホスファチジルイノシトールホスフェート（ＰＩＰ）ホスファチジルイノシトールビスホスフェート（ＰＩＰ２）、ホスホスフィンゴ脂質ならびにそれらの任意の誘導体が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「凍結乾燥する」、「凍結乾燥すること」、「凍結乾燥された」または「凍結乾燥」という用語は、冷凍乾燥または低温乾燥としても知られており、材料または化合物を保存するために使用され得る脱水プロセスを指す。凍結乾燥は、材料または化合物を凍結すること、及び次いで周囲の圧力を低下させて、凍結材料または化合物中の凍結水または液体成分を気相にすることを含み得る。
「治療」、「治療すること」、及び「治療する」は、疾患、障害、もしくは状態及び／またはその症状の有害なまたは任意の他の望ましくない影響を減少または改善するための薬剤を用いて疾患、障害、または状態に作用することと定義される。状態を「治療すること」もしくは状態の「治療」またはそれを必要とする対象を「治療すること」または対象の「治療」は、（１）症状の減少などの臨床的結果を含む有益なまたは所望の結果を得るための工程をとること；（２）疾患を阻害すること、例えば、疾患またはその臨床的症状の進行を阻止または減少させること；（３）疾患を軽減すること、例えば、疾患またはその臨床的症状の退行を引き起こすこと；または（４）疾患を遅延させることを指す。例えば、有益なまたは所望の臨床的結果には、がん細胞の減少及び／または排除ならびにがん細胞の転移の予防及び／または減少が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「投与すること」は、当業者に知られている様々な方法及び送達システムのいずれかを使用する対象への組成物の物理的導入を指す。本明細書に記載の組成物の投与経路には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば注射または注入によるものが含まれる。本明細書で使用される「非経口投与」という語句は、通常は注射による、腸内及び局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨下注射及び注入、ならびにインビボエレクトロポレーションを含む。代替的に、本明細書に記載の組成物は、局所、表皮、または粘膜の投与経路などの非経口ではない経路を介して、例えば、鼻腔内に、経口で、経膣で、直腸内に、舌下にまたは局所的に投与され得る。投与はまた、例えば、１回、複数回、及び／または１つ以上の長期間にわたって実施され得る。
「抗がん剤」または「抗がん化合物」は、がんの治療または予防に使用され得る抗がん活性を有する治療剤である。抗がん剤は大きなまたは小さな分子であり得る。例示的な抗がん剤には、抗体、小分子、及び大分子またはそれらの組み合わせが含まれる。「抗がん活性」の例には、がん細胞数の減少、がんサイズの減少、がん細胞の死滅、転移の減少及び／または阻害ならびにがん細胞の成長及び／または増殖の減少が含まれるがこれらに限定されない。
「対象」または「それを必要とする対象」という用語は、疾患もしくは状態に罹患しているか、または将来的に疾患もしくは状態を有する可能性を有する生命体を指す。「患者」という用語は、既に疾患もしくは状態を有する生命体、例えば、疾患もしくは状態と診断された、または疾患もしくは状態に関連する１つ以上の症状を有する患者を指す。非限定的な例には、ヒト、他の哺乳動物、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカ、及び他の非哺乳動物が含まれる。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。
本明細書で提供される方法によれば、対象には、有効量の本明細書で提供される薬剤、組成物または複合体（これらの全てが本明細書で互換的に使用される）（例えば、抗がん化合物及び酸またはその塩を包含するリポソームを含む医薬組成物）の１つ以上が投与され得る。「有効量」及び「有効投薬量」という用語は互換的に使用される。「有効量」という用語は、所望の効果（例えば、がんなどの疾患の治療）を生じさせるのに必要な任意の量として定義される。薬剤を投与するための有効量及びスケジュールは、当業者によって経験的に決定され得る。投与のための投薬量範囲は、所望の効果を生じさせるのに十分に多いものである。投薬量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などのような実質的な有害な副作用を引き起こすほど多くすべきではない。一般に、投薬量は、年齢、状態、性別、疾患の種類、疾患もしくは障害の程度、投与の経路、または他の薬物がレジメンに含まれるかどうかによって変動し得、当業者によって決定され得る。禁忌がある場合には、投薬量は個々の医師によって調節され得る。投薬量は変動し得、１日または数日間、毎日１回以上の用量投与で投与され得る。所与の種類の医薬品についての適切な投薬量についての手引きは文献で見ることができる。例えば、所与のパラメータについて、有効量は少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、または少なくとも１００％の増加または減少を示し得る。有効性はまた、「～倍」の増加または減少として表され得る。例えば、治療有効量は、対照に対して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、またはそれ以上の効果を有し得る。正確な用量及び製剤は、治療の目的に依存し得、既知の技術を使用して当業者によって確かめることができる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄｉｔｏｒ（２００３），及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、白血病、リンパ腫、黒色腫、神経内分泌腫瘍、がん腫及び肉腫を含む、哺乳動物で見られる全ての種類のがん、新生物または悪性腫瘍を指す。本明細書で提供される化合物、医薬組成物、または方法で治療され得る例示的ながんには、リンパ腫、肉腫、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、子宮頸がん、結腸がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、骨髄腫、甲状腺がん、白血病、前立腺がん、乳がん（例えば、トリプルネガティブ、ＥＲポジティブ、ＥＲネガティブ、化学療法耐性、ハーセプチン耐性、ＨＥＲ２ポジティブ、ドキソルビシン耐性、タモキシフェン耐性、腺管がん、小葉がん、原発性、転移性）、卵巣がん、膵臓がん、肝がん（例えば、肝細胞がん）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、扁平上皮肺がん、腺がん、大細胞肺がん、小細胞肺がん、カルチノイド、肉腫）、多形性膠芽腫、神経膠腫、黒色腫、前立腺がん、去勢耐性前立腺がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膠芽腫、卵巣がん、肺がん、扁平上皮がん（例えば、頭部、頸部、または食道）、大腸がん、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、または多発性骨髄腫が含まれる。追加的な例には、甲状腺、内分泌系、脳、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、食道、肝臓、腎臓、肺、非小細胞肺、黒色腫、中皮腫、卵巣、肉腫、胃、子宮のがんまたは髄芽腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、神経膠腫、多形性膠芽腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱がん、前がん性皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽腫、食道がん、尿生殖路がん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、膵内分泌腺または膵外分泌腺の新生物、甲状腺髄様がん、甲状腺髄様がん腫、黒色腫、大腸がん、乳頭様甲状腺がん、肝細胞がん、乳頭のパージェット病、葉状腫瘍、小葉がん、腺管がん、膵星細胞のがん、肝星細胞のがん、または前立腺がんが含まれる。
リポソーム組成物
実施形態では、本開示の組成物は、製造された薬物製品において化学的及び物理的に安定であることで商業的に適切な保管期間を可能にする。
実施形態では、粒子サイズの減少は薬物溶解度の有意な増加をもたらし得る。ナノ粒子中の材料は、同じ組成のより大きな粒子中のものよりも、粒子を離れて周囲の溶液に入る傾向がはるかに高い。この現象は、生体膜を横切って輸送するための薬物の利用可能性を増加させ得るが、それはまた、ナノ粒子自体の物理的不安定性を生み出す可能性がある。ナノ粒子の物理的安定性は、界面エネルギーを減少させるために正しいレベルで適切な表面活性剤及び賦形剤を使用し、分散を維持するために粒子の表面電荷を制御し、狭いサイズ分布で粒子を製造することによって改善され得る。
実施形態では、本開示の組成物の有利な配置は、粒子のサイズ、形状、組成及び電荷に起因し得る。実施形態では、粒子は、毛細血管を通って滑らかに移動するために実質的に球状であり得る。実施形態では、サイズ分布範囲は、約１０～１６０ｎｍである。実施形態では、サイズ分布範囲は、約２０～１５０ｎｍである。実施形態では、サイズ分布範囲は、約３０～１４０ｎｍである。実施形態では、サイズ分布範囲は、約４０～１３０ｎｍである。実施形態では、サイズ分布範囲は、約５０～１２０ｎｍである。実施形態では、サイズ分布範囲は、約６０～１１０ｎｍである。実施形態では、サイズ分布範囲は、約７０～１００ｎｍである。実施形態では、サイズ分布範囲は、約１０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約２０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約３０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約４０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約５０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約６０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約７０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約８０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約９０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約１００ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約１１０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約１２０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約１３０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約１４０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約１５０ｎｍの平均である。実施形態では、サイズ分布範囲は、約１６０ｎｍの平均である。組成物は、コレステロール、他の脂質及び表面活性剤を、粒子構造を画定するために使用されるポリマーを添加してまたは添加せずに含み得る。
粒子サイズは複数の技術によって決定され得る。例示的な技術には、動的光散乱（ＤＬＳ）及び低温透過型電子顕微鏡法が含まれる。ＤＬＳは、強度の測定によって粒子サイズを評価するために使用することができ、例えば、強度平均粒径（Ｚ平均）は、ＩＳＯ１３３２１（国際標準化機構１９９６）で定義されているようにキュムラント分析から計算される。実施形態では、強度でＤＬＳによって測定した場合のリポソームの平均最長寸法は、約４０～１００ｎｍ、５０～９０ｎｍ、または６０～８０ｎｍの範囲内である。
ＤＬＳはまた、数による測定によって粒子サイズを評価するために使用することができ、例えば、粒子サイズと分布への寄与との間に一乗関係がある。数による粒子サイズ分布は、材料の強度分布及び光学特性から算出される。実施形態では、数でＤＬＳによって測定した場合のリポソーム粒子の平均最長寸法は、約１～５０ｎｍ、５～４０ｎｍ、または１０～３０ｎｍの範囲内である。
低温透過型電子顕微鏡法もまたリポソームサイズを評価するために使用され得る。実施形態では、低温透過型電子顕微鏡法によって測定したときのリポソームの平均最長寸法は、約１～５０ｎｍ、５～４０ｎｍ、または１０～３０ｎｍの範囲内である。
実施形態では、本開示のリポソームは単層である。リポソームの二重層内に含まれ得る例示的な脂質には、コレステロール、ホスファチジルコリン（ＰＣ）生成物／誘導体（様々な炭素鎖長の脂肪酸、飽和、多不飽和及び混酸のＰＣ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ＤＭＰＡ）；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ＤＰＰＡ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ＤＯＰＡ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＭＰＧ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＰＰＧ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＭＰＳ）；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＰＰＳ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ－２０００）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノール－アミン－Ｎ－［フォレート（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ－５０００）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００）；１，２－ステアロイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｌ－α－ホスファチジルコリン、水素化（Ｈｙｄｒｏ Ｓｏｙ ＰＣ）；及び２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｌｙｓｏ ＰＣ）が含まれるがこれらに限定されない。
塩及び対イオン
本開示は、リポソームに封入された抗がん化合物及びその塩の組成物を含む。塩凝集体の性能及び物理的状態を決定する対イオンの物理化学的特性には、ｐＫａ、価数、サイズ、立体化学、双極子モーメント、分極率が含まれる。本開示は、対イオンのｐＫａ特性及び抗がん化合物凝集体の物理的状態の両方を十分に利用して標的放出特性（例えば、可能性のある最も高いΔｐＨ６．７対５．０放出差）を達成するために、適切な対イオン（複数可）と共に最適な脂質対薬物比（複数可）を提供する。
表１は、適用可能なｐＫａを含む例示的な塩を提供する。表２は、例示的な弱塩基性抗がん化合物、特にシュウ酸塩または酒石酸塩と塩または凝集体を形成するものを提供する。
Figure 2022172133000004
Figure 2022172133000005
Figure 2022172133000006
Figure 2022172133000007
Figure 2022172133000008
実施形態では、本開示の組成物はドキソルビシン塩を含む。実施形態では、ドキソルビシン塩はリポソーム中に存在する。実施形態では、ドキソルビシン塩は、ドキソルビシンの封入時にリポソーム内に形成され得る。実施形態では、本明細書で提供される組成物は、低いオフターゲット毒性を示しつつ、腫瘍組織において極めて有効であり得る望ましい物理的性能及び最適なｐＨ依存性薬物放出プロファイルを示す。実施形態では、いかなる特定の理論によっても縛られることなく、生理学的ｐＨでは、血液中を循環しながら、ドキソルビシンはほとんどリポソームによって保持される一方で、不十分な血管系のためにリポソームを保持する傾向がある腫瘍部位の細胞内リソソーム区画及び局所細胞外空間で生じるより低いｐＨ（約５．０～６．７）では著しく高い薬物放出が達成される。
実施形態では、ドキソルビシン塩の組成は、アニオン及び対応する酸の物理化学的特性、ならびに望ましい物理化学的特性を有するリポソームに組み込まれたドキソルビシン塩凝集体を作製するために使用される処理工程の選択によって決定される。
実施形態では、抗がん化合物を封入した適切な対イオン（複数可）を含有するリポソーム内の最適な脂質対薬物比（複数可）は、対イオンのｐＫａ特性及びドキソルビシン凝集体の物理的状態の両方を利用して機能して、標的放出特性（例えば、可能性のある最も高いΔｐＨ６．７／６．７／６．０／５．０放出差－ΔｐＨ６．７／５．０）を達成する。実施形態では、ドキソルビシンは、安全性及び有効性を最大化するために、適切な脂質／薬物比でリポソームの内部で好適な対イオンで安定化される。
２つの部分の間の比、すなわち、ＡとＢの間の比が言及される場合、それはＡ／Ｂ、Ａ：ＢまたはＡ対Ｂと称され得る。例えば、各部分Ａ及びＢに参照される値がそれぞれ１及び１０である場合、Ａ／Ｂ比（またはＡ対Ｂの比または比Ａ：Ｂ）が１：１０、１／１０または１対１０であることが示され得る。
例えば、硫酸のｐＫａ１は－３（ドキソルビシン－硫酸塩－Ｄｏｘｉｌ（登録商標））である一方で、クエン酸のｐＫａ１は＋３．１３（ドキソルビシン－クエン酸塩－Ｍｙｏｃｅｔ（登録商標））である（表１）。ドキソルビシンとの強塩からのスルファテカンは、ｐＨ６．７～５．０の範囲でＤｏｘｉｌ（登録商標）リポソームにおいてより低いドキソルビシン放出をもたらし得る。対照的に、ドキソルビシン－クエン酸塩は、ｐＨ６．７～５．０の範囲でＭｙｏｃｅｔ（登録商標）リポソームからより高いドキソルビシン放出をもたらし得るより弱い塩である。
それ故、リポソームからのドキソルビシンの最適放出が、－３（硫酸）より高く＋３．１３（クエン酸）未満のｐＫａ（例えば、ｐＫａ１）値を有する適切な対イオンの選択により達成される実施形態が本明細書で提供される。それ故、実施形態では、本明細書で用いられる酸は、－３より高く３未満のｐＫａ（例えば、ｐＫａ１）を有する。実施形態では、本明細書で用いられる酸は、－２．９より高く２．９未満のｐＫａ（例えば、ｐＫａ１）を有する。実施形態では、本明細書で用いられる酸は、－２．８より高く２．８未満のｐＫａ（例えば、ｐＫａ１）を有する。実施形態では、本明細書で用いられる酸は、－２．５より高く２．５未満のｐＫａ（例えば、ｐＫａ１）を有する。
リポソームへのドキソルビシン装填を促進し、かつリポソームからのｐＨ依存性ドキソルビシン放出を提供するそれらの能力について、異なるｐＫａ値で様々な対イオンを試験した（表１）。ｐＨ６．７～ｐＨ５．０でのドキソルビシン放出の間の最も大きな差（ΔｐＨ６．７／５．０）を提供する対イオン（複数可）は好ましい放出プロファイルを有する。
実施形態では、例示的な放出プロファイルアッセイのリポソーム試料を、２５℃でまたは３７℃に事前に温められた（インビボ温度をシミュレートするため）ＰＢＳのｐＨ６．７の緩衝液で２０倍（すなわち、１００μＬの試料＋１．９ｍＬの希釈剤）または５０倍（すなわち、５０μＬの試料＋２．４５ｍＬの希釈剤）に希釈し、それぞれ２５℃または３７℃で２、４、及び８時間インキュベートする。実施形態では、例示的な放出プロファイルアッセイのリポソーム試料を、２５℃でまたは３７℃に事前に温められた（インビボ温度をシミュレートするため）ＰＢＳのｐＨ６．７の緩衝液で２０倍（すなわち、１００μＬの試料＋１．９ｍＬの希釈剤）または５０倍（すなわち、５０μＬの試料＋２．４５ｍＬの希釈剤）に希釈し、それぞれ２５℃または３７℃で２、４、及び８時間インキュベートする。実施形態では、例示的な放出プロファイルアッセイのリポソーム試料を、２５℃でまたは３７℃に事前に温められた（インビボ温度をシミュレートするため）ＰＢＳのｐＨ６．０の緩衝液で２０倍（すなわち、１００μＬの試料＋１．９ｍＬの希釈剤）または５０倍（すなわち、５０μＬの試料＋２．４５ｍＬの希釈剤）に希釈し、それぞれ２５℃または３７℃で２、４、及び８時間インキュベートする。実施形態では、例示的な放出プロファイルアッセイのリポソーム試料を、２５℃でまたは３７℃に事前に温められた（インビボ温度をシミュレートするため）ＰＢＳのｐＨ５．０の緩衝液で２０倍（すなわち、１００μＬの試料＋１．９ｍＬの希釈剤）または５０倍（すなわち、５０μＬの試料＋２．４５ｍＬの希釈剤）に希釈し、それぞれ２５℃または３７℃で２、４、及び８時間インキュベートする。
実施形態では、Ｔ０時点の測定のために、リポソーム製剤を約２５℃でｐＨ６．７のＰＢＳに希釈した。実施形態では、Ｔ０時点の測定のために、リポソーム製剤を約２５℃でｐＨ ｐＨ６．７のＰＢＳに希釈した。実施形態では、Ｔ０時点の測定のために、リポソーム製剤を約２５℃でｐＨ６．０のＰＢＳに希釈した。実施形態では、Ｔ０時点の測定のために、リポソーム製剤を約２５℃でｐＨ５．０のＰＢＳに希釈した。プレートリーダーの温度を２５℃に設定し得、励起及び発光波長をそれぞれ４７８ｎｍ及び５９４ｎｍに設定した。各時点において、無傷リポソームの蛍光（Ｆｉ）及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で破裂したリポソームの全蛍光（Ｆｔ）を測定した。薬物放出の割合は、［（Ｆｉ＿ｎ－Ｆｉ＿ｔ）／Ｆｔ＿平均）］＊１００％（式中、Ｆｉ＿ｎ－２、４、または８時間で測定されたＦｉ、Ｆｉ＿ｔ０－Ｔ０で測定されたＦｉ、及びＦｔ＿平均－全時点について決定されたＦｔ値の平均）として定量化した。
実施形態では、理論に縛られることなく、様々な抗がん化合物塩の結晶状態は好ましい特性のために選択され得る。例えば、低温透過型電子顕微鏡法（ｃＴＥＭ）は、クエン酸塩含有及び硫酸塩含有の両方のリポソーム中の繊維束凝集体としてのドキソルビシン沈殿物を明らかにしている［１、１３～１４］。平面芳香族アントラサイクリン環は、長手方向に積層して線状繊維を形成すると考えられる。これらの繊維は、六角形の配列で整列して、１束当たりおよそ１２～６０本の繊維を有する束を形成する［２５］。硫酸塩の存在下でのドキソルビシン凝集体は、典型的には、大抵が線状または曲がっているように見えるクエン酸塩の存在下でのドキソルビシン－クエン酸塩凝集体（繊維間の間隔はおよそ３０～３５Ａ°である）と比較して剛性の線状繊維束（繊維間の間隔はおよそ２７Ａ°である）を有する［１５、２５］。実施形態では、クエン酸アニオンより小さな硫酸アニオンは、より詰まった充填配置を可能にし、繊維束の柔軟性の低下をもたらす。実施形態では、ドキソルビシン－硫酸塩（例えば、ドキソルビシン－硫酸塩凝集体）は、ドキソルビシン－リン酸塩［１３～１４］、及びクエン酸塩（例えば、クエン酸塩凝集体）［１、１３～１５］と比較して、生理学的及び酸性ｐＨでより遅い薬物放出をもたらす。
実施形態では、本開示の組成物は、適切な対イオン（シュウ酸塩及び酒石酸塩）、最適化された脂質／薬物比及び最適化された抗がん化合物（例えば、ドキソルビシン）装填条件、薬物放出の強いｐＨ依存性及び腫瘍部位への化学療法剤（複数可）の優先的標的化を用いることによって腫瘍生物学を利用するように設計される。実施形態では、対イオン（複数可）及び／または抗酸化剤を補完するためにキレート剤が用いられる。
実施形態では、対イオンとしてのシュウ酸塩または酒石酸塩、最適化された範囲内の脂質／薬物比、及び適切な装填条件を使用すると、標的化（ｐＨ依存性）薬物放出が可能になり、そのため様々な分子標的を有する多数の弱塩基化学療法剤（ＤＮＡインターカレート／損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤など；表３）の安全性及び有効性が改善される。
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実施形態では、血液－腫瘍部位－リソソームｐＨ勾配に従ってリポソーム薬物放出を標的化することは、それらの非ｐＨまたはより低いｐＨ区別的リポソーム及び／または遊離形態と比較して、弱塩基化学療法剤の安全性及び有効性を改善する。
脂質対薬物（すなわち、脂質／薬物）及びリン脂質対遊離コレステロール（すなわち、ＰＬ／ＦＣ）比
実施形態では、本出願の粒子中の最適な薬物装填は、適切な対イオンの選択で達成される。また、脂溶性不活性成分及び表面活性剤が選択され得る。また、適切な薬物対脂質比が選択され得る。実施形態では、循環中に中性ｐＨでの放出を減少させるため及び標的部位でのより酸性のｐＨで細胞外／細胞内放出を増加させるために選択が行われる。
実施形態では、脂質対薬物（脂質／薬物）及びＰＬ／ＦＣ比は、望ましい物理化学的及び生物学的性能に関連する。
実施形態では、粒子の構造は、製剤成分ならびに脂質／薬物及びＰＬ／ＦＣ比の、及び粒子を作製するために使用される処理工程の選択によって決定される。粒子性能を決定する構造的及び定量的要素には、脂質／薬物及びＰＬ／ＦＣ比、対イオン、粒子サイズ（及び集団内のサイズ分布）、粒子形状、粒子電荷ならびに粒子内の個々の成分の分布、特に粒子表面におけるものが含まれる。
実施形態では、本出願の構造化された脂質に富むナノ粒子／リポソームは、非経口投与される薬物製品において有用な薬物装填を保持するように設計される。この送達システムに関して関心のある薬物は、生理学的ｐＨで低い溶解度及びより酸性の（局所腫瘍細胞外及びエンドソーム／リソソーム環境）ｐＨで有意に高い溶解度を有するそれらの薬物／塩複合体を含む。本出願に含まれるリポソームは、独特の物理化学的性能を有し得る。実施形態では、高い脂質／薬物及び≦４．０であるが≧１．０のＰＬ／ＦＣ比は、濃度勾配を介して及び血清または血液中でリポソーム内容物の放出を制限する安定な脂質層をもたらし得るが、外部のｐＨの変化に応じて区別的薬物放出を可能にし、そのため対応する酸（複数可）の特定の対イオン及びｐＫａ（複数可）を利用する。
実施形態では、ドキソルビシンは、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）で使用されるものなどのペグ化リポソームドキソルビシンであり得る。実施形態では、ドキソルビシンは、ポリエチレングリコールではなく、両親媒性ブロックコポリマーで置換される。
実施形態では、本明細書のリポソーム製剤に使用される脂質は、ペグ化脂質である。実施形態では、ペグ化脂質ではなく、ポロキサマー脂質が使用される（例えば、Ｐ１８８脂質）。ポロキサマーは、非イオン性ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）－ポリ（プロピレンオキシド）（ＰＰＯ）コポリマーである。それらは、医薬製剤において界面活性剤として使用され得る。それらの界面活性剤の特性は、洗浄力、分散性、安定化、発泡、及び乳化に有用である。ポロキサマーは臨床用途で広く使用されている［１６］。実施形態では、ｐ１８８でコーティングされた（例えば、インターカレートされた）リポソームは、脂質及びＰ１８８をＤＣＭに溶解し、ＤＣＭを蒸発させて脂質膜を形成し、脂質膜を水和することによって形成される。この例のプロセスは、脂質炭化水素鎖）の間のｐ１８８疎水性炭化水素鎖のインターカレート（挿入）及び水相中でのより親水性の部分の露出、ならびにそれらのオプソニン化及びマクロファージ系による認識を防止するリポソームの脂質表面の変性をもたらす。
実施形態では、ポロキサマー（例えば、ｐ１８８）でコーティングされたリポソームを有する本明細書で使用される組成物は、血液脳関門を横断するための活性剤（例えば、弱塩基性抗がん化合物）を必要とする疾患を治療するために使用される。実施形態では、ポロキサマー（例えば、ｐ１８８）でコーティングされたリポソームを有する本明細書で使用される組成物は、アポリポタンパク質Ｅの干渉が望まれない場合に活性剤（例えば、弱塩基性抗がん化合物）が使用されることを必要とする疾患を治療するために使用される。
実施形態では、使用されるより低い脂質／薬物比は、希釈時に濃度勾配のために中性ｐＨで溶解媒体へのリポソーム内容物の漏出の増加をもたらす場合があり、かつ薬物のｐＨ駆動放出を相殺する場合がある表面張力の増加及び脂質層の完全性の損失につながる。実施形態では、より高い脂質対薬物比は、表面張力を低下させるために使用され、溶解媒体へのリポソーム内材料の「オフターゲットの」漏出を防止することができ、かつｐＨ遷移のみ応じて薬物を放出するより高い完全性の脂質層（複数可）を達成する。
実施形態では、リポソームは複数の脂質を含み、複数の脂質の薬物（例えば、弱塩基性抗がん剤及び／または酸もしくはその塩）に対する比が考慮され得る。実施形態では、脂質の薬物に対する（脂質対薬物）比は、薬物が装填されたリポソームの最終懸濁液中の総脂質の薬物（例えば、ドキソルビシン遊離塩基）に対する重量対重量（ｗ対ｗ）比を表し、約０．５対１（重量対重量）、約１対１、約５対１、約１０対１、約２０対１、約３０対１、約４０対１、約５０対１、約６０対１、約７０対１、約８０対１、約９０対１、約１００対１または前述の任意の介在数または約１００対１超の平均を有する。実施形態では、脂質の薬物に対する（脂質対薬物）比は、薬物が装填されたリポソームの最終懸濁液中の総脂質の薬物に対するモル対モル（ｍｏｌ対ｍｏｌ）比を表し、０．５対１（ｍｏｌ対ｍｏｌ）、約１対１、約５対１、約１０対１、約２０対１、約３０対１、約４０対１、約５０対１、約６０対１、約７０対１、約８０対１、約９０対１または約１００対１または前述の任意の介在数または約１００対１超の平均を有する。
実施形態では、脂質対薬物（すなわち、脂質／薬物）比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたは重量対重量）は、約０．５対１～１対１、約０．５対１～５対１、約０．５対１～１０対１、約０．５対１～２０対１、約０．５対１～３０対１、約０．５対１～４０対１、約０．５対１～５０対１、約０．５対１～６０対１、約０．５対１～７０対１、約０．５対１～８０対１、約０．５対１～９０対１または約０．５対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたは重量対重量）は、約１対１～５対１、約１対１～１０対１、約１対１～２０対１、約１対１～３０対１、約１対１～４０対１、約１対１～５０対１、約１対１～６０対１、約１対１～７０対１、約１対１～８０対１、約１対１～９０対１または約１対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたは重量対重量）は、約５対１～１０対１、約５対１～２０対１、約５対１～３０対１、約５対１～４０対１、約５対１～５０対１、約５対１～６０対１、約５対１～７０対１、約５対１～８０対１、約５対１～９０対１または約５対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたは重量対重量）は、約１０対１～２０対１、約１０対１～３０対１、約１０対１～４０対１、約１０対１～５０対１、約１０対１～６０対１、約１０対１～７０対１、約１０対１～８０対１、約１０対１～９０対１または約１０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたは重量対重量）は、約２０対１～３０対１、約２０対１～４０対１、約２０対１～５０対１、約２０対１～６０対１、約２０対１～７０対１、約２０対１～８０対１、約２０対１～９０対１または約２０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたは重量対重量）は、約３０対１～４０対１、約３０対１～５０対１、約３０対１～６０対１、約３０対１～７０対１、約３０対１～８０対１、約３０対１～９０対１または約３０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたは重量対重量）は、約４０対１～５０対１、約４０対１～６０対１、約４０対１～７０対１、約４０対１～８０対１、約４０対１～９０対１または約４０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたは重量対重量）は、約５０対１～６０対１、約５０対１～７０対１、約５０対１～８０対１、約５０対１～９０対１または約５０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたは重量対重量）は、約６０対１～７０対１、約６０対１～８０対１、約６０対１～９０対１または約６０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたは重量対重量）は、約７０対１～８０対１、約７０対１～９０対１または約７０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたは重量対重量）は、約８０対１～９０対１または約８０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたは重量対重量）は、約９０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。
実施形態では、薬物のｍｏｌ％（例えば、リン脂質、コレステロール、ポロキサマー、抗がん薬、塩などを含む全ての製剤構成の総モル数に対する薬物のモル数）は、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％または前述の任意の介在数または約３０％超の平均を有する。
実施形態では、薬物のｍｏｌ％は、約０．５～１％、約０．５～２％、約０．５～３％、約０．５～４％、約０．５～５％、約０．５～６％、約０．５～７％、約０．５～８％、約０．５～９％、約０．５～１０％、約０．５～１５％、約０．５～２０％または約０．５～３０％の範囲を有する。いくつかの実施形態では、薬物のｍｏｌ％は、約１～２％、約１～３％、約１～４％、約１～５％、約１～６％、約１～７％、約１～８％、約１～９％、約１～１０％、約１～１５％、約１～２０％または約１～３０％の範囲を有する。いくつかの実施形態では、薬物のｍｏｌ％は、約２～３％、約２～４％、約２～５％、約２～６％、約２～７％、約２～８％、約２～９％、約２～１０％、約２～１５％、約２～２０％または約２～３０％の範囲を有する。いくつかの実施形態では、薬物のｍｏｌ％は、約３～４％、約３～５％、約３～６％、約３～７％、約３～８％、約３～９％、約３～１０％、約３～１５％、約３～２０％または約３～３０％の範囲を有する。いくつかの実施形態では、薬物のｍｏｌ％は、約４～５％、約４～６％、約４～７％、約４～８％、約４～９％、約４～１０％、約４～１５％、約４～２０％または約４～３０％の範囲を有する。いくつかの実施形態では、薬物のｍｏｌ％は、約５～６％、約５～７％、約５～８％、約５～９％、約５～１０％、約５～１５％、約５～２０％または約５～３０％の範囲を有する。いくつかの実施形態では、薬物のｍｏｌ％は、約６～７％、約６～８％、約６～９％、約６～１０％、約６～１５％、約６～２０％または約６～３０％の範囲を有する。いくつかの実施形態では、薬物のｍｏｌ％は、約７～８％、約７～９％、約７～１０％、約７～１５％、約７～２０％または約７～３０％の範囲を有する。いくつかの実施形態では、薬物のｍｏｌ％は、約８～９％、約８～１０％、約８～１５％、約８～２０％または約８～３０％の範囲を有する。いくつかの実施形態では、薬物のｍｏｌ％は、約９～１０％、約９～１５％、約９～２０％または約９～３０％の範囲を有する。いくつかの実施形態では、薬物のｍｏｌ％は、約１０～１５％、約１０～２０％または約１０～３０％の範囲を有する。いくつかの実施形態では、薬物のｍｏｌ％は、約１５～２０％または約１５～３０％の範囲を有する。いくつかの実施形態では、薬物のｍｏｌ％は、約２０～３０％の範囲を有する。
実施形態では、リポソームは複数の遊離コレステロール（ＦＣ）を含む。実施形態では、非装填リポソーム及び／またはリポソームに装填された薬物は、複数のリン脂質（ＰＬ）を有する。そのため、所定の実施形態では、薬物が装填されたリポソームは、遊離コレステロール（ＦＣ）及びリン脂質（ＰＬ）を有する。実施形態では、ＰＬのＦＣに対する比（すなわち、「ＰＬ対ＦＣ」または「ＰＬ／ＦＣ」比）は、薬物が装填されたリポソームの最終懸濁液中のリン脂質の遊離コレステロールに対する重量対重量（ｗ対ｗ）比を表し、０．５対１（ｗ対ｗ）、約１対１、約２対１、約３対１、約４対１、約５対１、約１０対１、約２０対１、約３０対１、約４０対１、約５０対１、約６０対１、約７０対１、約８０対１、約９０対１、約１００対１または前述の任意の介在数または約１００対１超の平均を有する。実施形態では、ＰＬのＦＣに対する比（すなわち、「ＰＬ対ＦＣ」比）は、薬物が装填されたリポソームの最終懸濁液中のリン脂質の遊離コレステロールに対するモル対モル（ｍｏｌ対ｍｏｌ）比を表し、約０．５対１（ｍｏｌ対ｍｏｌ）、約１対１、約２対１、約３対１、約４対１、または約５対１、約１０対１、約２０対１、約３０対１、約４０対１、約５０対１、約６０対１、約７０対１、約８０対１、約９０対１、約１００対１または前述の任意の介在数または約１００対１超の平均を有する。
実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ（すなわちＰＬ／ＦＣ）」比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約０．５対１、約０．５５対１、約０．６対１、約０．６５対１、約０．７対１、約０．７５対１、約０．８対１、約０．８５対１、約０．９対１、約０．９５対１、約１対１、約１．０５対１、約１．１対１、約１．１５対１、約１．２対１、約１．２５対１、約１．３対１、約１．３５対１、約１．４対１、約１．４５対１、約１．５対１、約１．５５対１、約１．６対１、約１．６５対１、約１．７対１、約１．７５対１、約１．８対１、約１．８５対１、約１．９対１、約２対１、約２．０５対１、約２．１対１、約２．１５対１、約２．２対１、約２．２５対１、約２．３対１、約２．３５対１、約２．４対１、約２．４５対１、約２．５対１、約２．５５対１、約２．６対１、約２．６５対１、約２．７対１、約２．７５対１、約２．８対１、約２．８５対１、約２．９対１、約３対１、約３．０５対１、約３．１対１、約３．１５対１、約３．２対１、約３．２５対１、約３．３対１、約３．３５対１、約３．４対１、約３．４５対１、約３．５対１、約３．５５対１、約３．６対１、約３．６５対１、約３．７対１、約３．７５対１、約３．８対１、約３．８５対１、約３．９対１、約４対１、約４．０５対１、約４．１対１、約４．１５対１、約４．２対１、約４．２５対１、約４．３対１、約４．３５対１、約４．４対１、約４．４５対１、約４．５対１、約４．５５対１、約４．６対１、約４．６５対１、約４．７対１、約４．７５対１、約４．８対１、約４．８５対１、約４．９対１、約５対１または前述の任意の介在数の範囲内の平均を有する。
実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ（すなわち、ＰＬ／ＦＣ）」比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約０．８６対１、約１．２２対１、約１．２９対１、約１．６２対１、約１．７２対１、約３．６８対１または前述の任意の介在数の範囲内の平均を有する。実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ」比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約０．８６対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ」比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約１．２２対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ」比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約１．２９対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ」比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約１．６２対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ」比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約１．７２対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ」比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約３．６８対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ」比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約０．８６対１～１．２２対１、約０．８６対１～１．２９対１、約０．８６対１～１．６２対１、約０．８６対１～１．７２対１または約０．８６対１～３．６８対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ」比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約１．２２対１～１．２９対１、約１．２２対１～１．６２対１、約１．２２対１～１．７２対１または約１．２２対１～３．６８対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ」比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約１．２９対１～１．６２対１、約１．２９対１～１．７２対１または約１．２９対１～３．６８対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ」比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約１．６２対１～１．７２対１または約１．６２対１～３．６８対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ」比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約１．７２対１～３．６８対１の範囲内の平均を有する。
実施形態では、「ＰＬ対ＦＣ（すなわち、ＰＬ／ＦＣ）比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約０．５対１～１対１、約０．５対１～２対１、約０．５対１～３対１、約０．５対１～４対１、約０．５対１～５対１、約０．５対１～１０対１、約０．５対１～２０対１、約０．５対１～３０対１、約０．５対１～４０対１、約０．５対１～５０対１、約０．５対１～６０対１、約０．５対１～７０対１、約０．５対１～８０対１、約０．５対１～９０対１または約０．５対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約１対１～２対１、約１対１～３対１、約１対１～４対１、約１対１～５対１、約１対１～１０対１、約１対１～２０対１、約１対１～３０対１、約１対１～４０対１、約１対１～５０対１、約１対１～６０対１、約１対１～７０対１、約１対１～８０対１、約１対１～９０対１または約１対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約２対１～３対１、約２対１～４対１、約２対１～５対１、約２対１～１０対１、約２対１～２０対１、約２対１～３０対１、約２対１～４０対１、約２対１～５０対１、約２対１～６０対１、約２対１～７０対１、約２対１～８０対１、約２対１～９０対１または約１対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約３対１～４対１、約３対１～５対１、約３対１～１０対１、約３対１～２０対１、約３対１～３０対１、約３対１～４０対１、約３対１～５０対１、約３対１～６０対１、約３対１～７０対１、約３対１～８０対１、約３対１～９０対１または約３対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約４対１～５対１、約４対１～１０対１、約４対１～２０対１、約４対１～３０対１、約４対１～４０対１、約４対１～５０対１、約４対１～６０対１、約４対１～７０対１、約４対１～８０対１、約４対１～９０対１または約４対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約５対１～１０対１、約５対１～２０対１、約５対１～３０対１、約５対１～４０対１、約５対１～５０対１、約５対１～６０対１、約５対１～７０対１、約５対１～８０対１、約５対１～９０対１または約５対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約１０対１～２０対１、約１０対１～３０対１、約１０対１～４０対１、約１０対１～５０対１、約１０対１～６０対１、約１０対１～７０対１、約１０対１～８０対１、約１０対１～９０対１または約１０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約２０対１～３０対１、約２０対１～４０対１、約２０対１～５０対１、約２０対１～６０対１、約２０対１～７０対１、約２０対１～８０対１、約２０対１～９０対１または約２０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約３０対１～４０対１、約３０対１～５０対１、約３０対１～６０対１、約３０対１～７０対１、約３０対１～８０対１、約３０対１～９０対１または約３０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約４０対１～５０対１、約４０対１～６０対１、約４０対１～７０対１、約４０対１～８０対１、約４０対１～９０対１または約４０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約５０対１～６０対１、約５０対１～７０対１、約５０対１～８０対１、約５０対１～９０対１または約５０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約６０対１～７０対１、約６０対１～８０対１、約６０対１～９０対１または約６０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約７０対１～８０対１、約７０対１～９０対１または約７０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約８０対１～９０対１または約８０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。実施形態では、脂質対薬物比（ｍｏｌ対ｍｏｌまたはｗ対ｗ）は、約９０対１～１００対１の範囲内の平均を有する。
実施形態では、リン脂質のｍｏｌ％（例えば、リン脂質、コレステロール、ポロキサマー、抗がん薬、塩などを含む全ての製剤構成の総モル数に対するリン脂質のモル数）は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または前述の任意の介在数または約９０％超の平均を有する。
実施形態では、遊離コレステロール（ＦＣ）のｍｏｌ％（例えば、リン脂質、コレステロール、ポロキサマー、抗がん薬、塩などを含む全ての製剤構成の総モル数に対するＦＣのモル数）は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または前述の任意の介在数または約６０％超の平均を有する。
実施形態では、より低いＰＬ／ＦＣ比（ｗ／ｗまたはｍｏｌ／ｍｏｌ）は、脂質二重層の剛性の増加をもたらし、それはひいてはｐＨ依存性薬物放出にマイナスの影響を及ぼす。実施形態では、より高いＰＬ／ＦＣ比（ｗ／ｗまたはｍｏｌ／ｍｏｌ）は、血清または血液中のリポソームの安定性を損なう。それ故、いくつかの実施形態では、ＰＬ／ＦＣの最適範囲は、１／１～４／１の範囲内にあると決定される。
イリノテカン含有リポソームについて得られたデータは、ドキソルビシンについて得られた結果とよく一致しており、シュウ酸塩及び酒石酸塩対イオン及び好ましい脂質／薬物比の効果を裏付けている。
リポソーム内に抗がん化合物を装填する方法
実施形態では、装填条件の影響は、リポソーム内に含有される薬物の体積、放出動態、リポソームサイズなどを変化させ得る。実施形態では、低温条件下で（例えば、加熱工程を伴わずに、または室温で）リポソームを装填すると、好ましい放出動態が生じる。
実施形態では、抗がん化合物、及び封入された対イオンを含有するその対を形成したリポソームは、使用前に医療現場で混合するために別々の容器（例えば、バイアル）に保存され得る。実施形態では、本開示の弱塩基性抗がん化合物は、凍結乾燥され、注射用滅菌水中で容易に再構成可能である。実施形態では、凍結乾燥され、再構成された抗がん化合物はリポソーム懸濁液と混合され得る。実施形態では、この混合は室温で行われる。本開示の組成物は、混合時に短いインキュベート時間を可能にする。実施形態では、インキュベート時間は約０～６０分である。実施形態では、インキュベート時間は約０～４５分である。実施形態では、インキュベート時間は約０～３０分である。実施形態では、インキュベート時間は約０～２５分である。実施形態では、インキュベート時間は約０～２０分である。実施形態では、インキュベート時間は約０～１５分である。実施形態では、インキュベート時間は約０～１０分である。実施形態では、インキュベート時間は約１０～３０分である。実施形態では、インキュベート時間は約５～２５分である。実施形態では、リポソームはｐＨ約６．７の水性緩衝液に懸濁される。
ラクトース及び／またはマンニトールの存在下でのドキソルビシンの水溶液の凍結乾燥は、室温での注射用滅菌水において最終濃度６ｍｇ／ｍＬに容易に再構成可能な凍結乾燥された材料をもたらした。本開示の凍結乾燥され、再構成されたドキソルビシンとシュウ酸塩含有及び酒石酸塩含有リポソームとの混合は、ドキソルビシンの効率的かつ迅速な封入をもたらす。
実施形態では、本開示のリポソーム組成物は独特の生物学的性能を有する。投与時に、これらの粒子は異物として認識されない場合があり、例えば、それらは、網状内皮系の組織におけるクリアランスプロセスを引き起こすタンパク質で標識されていない。実施形態では、リポソーム組成物は、オプソニン作用及び食作用を阻害する成分でコーティングされている。更に、リポソーム組成物は、所定の条件下で最適化された薬物放出、例えば、ｐＨ依存性放出を可能にし得る。
実施形態では、ｐＨ依存性薬物放出プロファイルは、全身及び腫瘍の生物学（図１）を考慮した適切な対イオン、脂質組成、及び脂質／薬物比の微調整の選択により最適化され得る。例えば、以下の原理がパラメータ最適化中に考慮され得る。
全身循環中－中性ｐＨで薬物放出を制限する（血液のｐＨは６．７である）（図１Ａ）。
腫瘍部位で蓄積すると、より酸性の局所細胞外空間で薬物放出を推進する（図１Ｂ）。腫瘍は、血液と比較して酸性の局所的環境（ｐＨ約６．５～７．２）を有し得る［１、４０～４２］。その上、腫瘍の不十分な血管系は、薬物のリポソーム担体の好ましい蓄積をもたらし得る。それ故、リポソームの蓄積及びより酸性の局所的環境の両方が、腫瘍部位の細胞外空間における局所的薬物放出を推進し得る。
がん性細胞による内在化時－エンドソーム環境のより酸性のｐＨ（例えば、６～６．５）でリポソーム滞在中に薬物を最大放出し（図１Ｃ）、それによってリソソーム中に捕捉されるより少ない薬物を必要とする（図１Ｄ）［５０～５１］。腫瘍部位におけるリポソーム薬物担体の局所的蓄積／捕捉はまた、がん性細胞によるリポソームの内在化の増強をもたらし得る。内在化及び酸性エンドソーム環境（約ｐＨ６．０～６．５）への移行時に、リポソームは、薬物を容易に放出し得、そのため、その細胞質生物学的利用能を有意に改善し得る。
それ故、望ましい薬物放出プロファイル（図１Ｅ）は、少なくともいくつかの実施形態において局所的な腫瘍及びエンドソーム環境を表す６．９～６．０のｐＨ範囲で、封入された薬物の大部分の放出を促進するであろう。
実施例１：材料及び方法：ドキソルビシン
ドキソルビシンのＨＰＬＣ定量化
全てのＨＰＬＣは、Ｇ１３１１０Ｂポンプ、Ｇ１３２９Ｂオートサンプラー、Ｇ１３１６Ａカラム区画、及びＧ１３１５Ｄダイオードアレイ検出器を備えるＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステムを使用して実施した。ＯｐｅｎＬａｂ ＣＤＳ（ＥＺＣｈｒｏｍ版）ソフトウェアは全てのモジュールを制御し、クロマトグラフィーの分析及び報告に使用された。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム（５μ、１５０×４．６ｍｍ；パート＃００Ｇ－４２５２－Ｅ０）を全ての分析に使用した。
酢酸ナトリウムは、Ｍａｃｃｏ Ｏｒｇａｎｉｑｕｅｓ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｌｅｙｆｉｅｌｄ，Ｐ．Ｑ．，Ｃａｎａｄａ）製のｃＧＭＰグレードであり、塩酸（ｐＨを調節するために使用された）は、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）製のＡＣＳグレードであった。使用された全ての水は精製された。
ドキソルビシン（ＤＯＸ）のクロマトグラフィー分析は、４０℃のカラム温度及び周囲条件（約２５℃）での試料温度を有するＣ１８カラム（上記参照）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステムで実施した。全ての移動相試薬は使用前に０．４５μｍフィルター膜で濾過した。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリルはＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製であった。０．０５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）及びアセトニトリルを含有するアイソクラティック移動相（７２：２８、ｖ／ｖ）を使用した。移動相の流速は１５分の稼働時間で１．０ｍＬ／分に設定した。ダイオードアレイ検出器は４８７ｎｍで４ｎｍの帯域幅で操作した。注射体積は１０μＬに設定した。
ドキソルビシンの標準的なストック溶液は、０．９％の生理食塩水、またはメタノール、または水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）中で調製した。較正標準は、分析のための標的濃度を括るために、ストック溶液を無水メタノールに希釈することによって調製した。この試験のため、ドキソルビシン溶液を無水メタノールまたはＩＰＡでそれぞれ最終濃度５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び２００μｇ／ｍＬに希釈した。リポソーム懸濁液の試料も分析前に無水メタノールまたはＩＰＡで８倍または１０倍に希釈した。
蛍光分析
全ての分析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭの蛍光プレートリーダーを使用して実施した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアがデバイスを制御し、値の分析及び報告に使用された。
ドキソルビシン塩酸塩の標準ストック溶液を０．９％の生理食塩水で調製した（６ｍｇ／ｍＬ）。較正標準は、分析のための標的濃度を括るために、ストック溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．７及び５．０）に希釈することによって調製した。プレートリーダーの温度を２５℃に設定し、励起及び発光波長をそれぞれ４７８ｎｍ及び５９４ｎｍに設定した。線形応答範囲は、０．５～４μｇ／ｍＬのドキソルビシン塩酸塩であると決定された。線形応答範囲内に留まるために、ドキソルビシン塩酸塩較正標準及び試料をそれに応じて希釈した。
リポソーム製剤中のドキソルビシンの総含有量（Ｆｔ）を決定するために、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を最終濃度１％まで添加することによってリポソームを破裂させ、反転によって混合し、定量化の前にインキュベートした。
遊離ドキソルビシンを測定するために、リポソーム製剤を１００，０００Ｄの分子量カットオフを有する限外濾過ユニット（Ｐｉｅｒｃｅコンセントレータ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に装填した。２５００ｒｐｍで１～２時間遠心分離した後、濾液をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅプレートリーダーを使用して分析し、定量化した。
ドキソルビシンのリポソーム内含有量の蛍光を決定するために、リポソーム製剤をＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で前処理することなく蛍光分析に供した。
リポソーム製剤からのドキソルビシン放出の定量化
蛍光消光技術を用い、それを１００％蛍光（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で破裂したリポソーム）に中継するＬｅｅら［２０］の方法は、ドキソルビシン放出の測定に使用されてきた。このアプローチは、ドキソルビシンの蛍光がリポソームへの封入の際に消光し、リポソームからのドキソルビシン放出の際に著しく増加するという事実に基づく。そのため、溶解媒体中での試料のインキュベート中の無傷リポソームの蛍光（Ｆｉ）の増加は、媒体へのドキソルビシンの放出を表す。異なる時点とＴ０との間のＦｉ値の差は、Ｆｔ（破裂したリポソームの１００％蛍光）に中継され、放出された薬物の割合を表す。
次の時点：Ｔ０、Ｔ２時間、Ｔ４時間、及びＴ８時間で２５℃及び３７℃（インビボ条件を模倣するため）で試験を行った。個々の試料を最大４つの別々の希釈剤／溶解媒体；ＰＢＳ ｐＨ６．７、及び／またはＰＢＳ／ｐＨ６．７、及び／またはＰＢＳ ｐＨ６．０、及び／またはＰＢＳ ｐＨ５．０で２０倍（例えば、１００μＬの試料＋１．９ｍＬの希釈剤）、または５０倍（例えば、５０μＬの試料＋２．４５ｍＬの希釈剤）に希釈した。Ｔ０時点の測定のために、リポソーム製剤を、約２５℃でＰＢＳのｐＨ６．７、及び／またはｐＨ６．７、及び／またはｐＨ６．０、及び／またはｐＨ５．０の緩衝液に希釈した。無傷リポソームの蛍光（Ｆｉ）及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で破裂したリポソームの全蛍光（Ｆｔ）を直ちに測定した。プレートリーダーの温度を２５℃に設定し、励起及び発光波長をそれぞれ４７８ｎｍ及び５９４ｎｍに設定した。
他のリポソーム試料を、（インビボ温度をシミュレートするために）３７℃に事前に温められたＰＢＳのｐＨ６．７、６．７、６．０、及びｐＨ５．０の緩衝液で２０倍または５０倍に希釈し、３７℃で２、４、及び８時間インキュベートした。
他のリポソーム試料を、（インビボ温度をシミュレートするために）３７℃に事前に温められたヒト血清またはヒト血液で２０倍または５０倍に希釈し、３７℃で２、４、及び８時間インキュベートした。各時点において、無傷リポソームの蛍光（Ｆｉ）及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で破裂したリポソームの全蛍光（Ｆｔ）を測定した。薬物放出の割合は、［Ｆｉ＿ｎ－Ｆｉ＿ｔ０／Ｆｔ＿平均）］＊１００％（式中、Ｆｉ＿ｎ－２、４、または８時間で測定されたＦｉ、Ｆｉ＿ｔ０－Ｔ０で測定されたＦｉ、及びＦｔ＿平均－全時点について決定されたＦｔ値の平均）として定量化した。異なる時点及びｐＨで観察されたＦｔ値の有意な変化はなかったことは言及する価値がある。
粒子サイズの測定
全ての分析は、６３３ｎｍの波長及び１７３°の検出角度で作動する４ｍＷのＨｅ－Ｎｅレーザーを有するＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して実施した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアがデバイスを制御し、値の分析及び報告に使用された。
強度による粒子サイズ分布．強度平均粒径（Ｚ平均）は、ＩＳＯ１３３２１（国際標準化機構１９９６）で定義されているようにキュムラント分析から計算した。
数による粒子サイズ分布。この分布では、粒子サイズと分布への寄与との間に一乗関係がある。数による粒子サイズ分布は、材料の強度分布及び光学特性から算出される。典型的な高品質のＤＬＳの結果では、通常、強度平均値から数平均値にすると直径が減少することが見られる［３５］。
一般に、強度基準Ｚ平均及び強度値は、ａ）光散乱強度と粒径との間の六乗関係（より大きな粒子がシグナルを支配する）、及びｂ）ＤＬＳが流体力学直径（すなわち、粒子に、粒子の表面と関連するリガンド、イオンまたは分子を加えた直径）を測定することで、粒子がＴＥＭと比較して機器に対してより大きく見えるという理由により、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）から得られる直径よりも大きい。
１．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．７）中の３０μＬのリポソーム製剤を使用して試料を調製し、分析前に２５℃に平衡化した。サイズ測定は各試料について三重に行った。
ドキソルビシン含有リポソームの低温透過型電子顕微鏡法分析。
銅４００メッシュ＋炭素膜」グリッド（ＥＭＳ）をＥＭＳ１００ｘグロー放電ユニットを使用してグロー放電した。提供された緩衝液で１５倍希釈した３マイクロリットルの試料をグロー放電グリッドに適用し、続いてＶｉｔｒｏｂｏｔ（商標）Ｍａｒｋ ＩＩ（ＦＥＩ）を使用して液体エタン中で急冷凍し、次いで液体窒素中で保存した。２００ｋＶの加速電圧でＦＥＩ ＣＭ２００電界放射銃透過型電子顕微鏡を使用してグリッドを画像化した。グリッドを慎重に観察し、ＴＶＩＰＳ Ｆ２２４ ２ｋｘ２ｋ検出器を使用して１５ｋｘ、２７．５ｋｘ、３８ｋｘ、５０ｋｘ及び６６ｋｘの倍率で代表的な画像を取得した。
ｐＨ測定．
全ての分析は、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＩｎＬａｂ ｐＨ微小電極を有するＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＳｅｖｅｎＣｏｍｐａｃｔ ｐＨメーターを使用して実施した。
粗懸濁液の調製
粗懸濁液は、ＰＣ、ＤＭＰＣ、ＦＣ、及びＰ１８８を表６に示される比で１０ｍＬのＤＣＭに溶解することによって調製した。粘稠な膜が形成されるまで、混合物を窒素流下で乾燥させた。膜を真空オーブン内で一晩更に乾燥させた。翌日、乾燥した脂質膜を、次のアンモニウム塩：６５℃に事前に温めたアンモニウム－シュウ酸塩、またはアンモニウム－硫酸塩、またはアンモニウム－ピコリン酸塩、またはアンモニウム－リン酸塩、またはアンモニウム－クエン酸塩、またはアンモニウム－酢酸塩、またはアンモニウム－ギ酸塩の３００ｍＭ溶液で水和し、直ちにハンドヘルドホモジナイザーで２～３分間ホモジナイズした。粗懸濁液の粒子サイズを測定したところ、常に８００～１２００ｎｍの範囲内であった。マレイン酸、システイン、ＮＡＣ、アスコルビン酸、マロン酸、酒石酸、フマル酸、またはコハク酸をまず水酸化アンモニウムでｐＨ４．８～５．０に滴定し、次いで水和媒体として使用した。
Ｍｆ処理．
特に異なって特定されない限り、ＭＦ処理体積は常に１００ｍｌであった。ＭＦ処理圧力は常に１０ＫＰＳＩであった。制御された（≦６５℃）温度でのリサイクルモード（材料の供給容器への戻し）で粗懸濁液の微小流動化を実施した。処理時間は１０～１６分の範囲内であった。標的粒子サイズ（Ｚ平均）は６０～７０ｎｍであった。
接線流濾過
半透明のナノ懸濁液を微小流動化機から採取し、１５～２０倍の体積のｐＨ６．７のＰＢＳで接線流濾過（ＴＦＦ）に供した。ＴＦＦの目的は、水酸化アンモニウムでｐＨ４．８～５．０に滴定されたアンモニウム－シュウ酸塩、またはアンモニウム－硫酸塩、またはアンモニウム－リン酸塩、またはアンモニウム－酒石酸塩、またはアンモニウム－クエン酸塩、またはマレイン酸、システイン、ＮＡＣ、アスコルビン酸、マロン酸、酒石酸、フマル酸、またはコハク酸を包含する外部緩衝液をＰＢＳに置き換えること、ならびに外部緩衝液及びリポソーム内空間からアンモニウムを大部分除去することであった。外部緩衝液中のアンモニウムはアンモニウム特異電極を使用することによって測定した。外部緩衝液中のアンモニウム濃度が≦３ｍＭであった場合にＴＦＦを停止した。
ドキソルビシンの遠隔装填
ドキソルビシン塩酸塩を生理食塩水に溶解して最終濃度６ｍｇ／ｍＬとした。ドキソルビシンの生理食塩水溶液をｐＨ６．７のＰＢＳ中のリポソームナノ懸濁液に添加して最終濃度１ｍｇ／ｍＬとした。混合物を７０℃に加熱した。７０℃で３０分のインキュベートの後、混合物を周囲温度（約２５℃）に冷却し、６％のスクロースを含有するｐＨ６．７のＰＢＳで別のＴＦＦの５回のサイクルに供した。
リポソームへのドキソルビシンの低温装填は次のように実施した：ドキソルビシンの生理食塩水溶液を室温でリポソームナノ懸濁液に添加して最終濃度１ｍｇ／ｍＬとし、穏やかに反転させ（２～３回）、室温で１０分間インキュベートした。室温での１０分のインキュベートの後、混合物をａ）６％のスクロースを含有するｐＨ６．７のＰＢＳで別のＴＦＦの５回のサイクルに供し、及び／またはｂ）２～８℃の冷凍庫内に１６時間配置し、次いで滅菌濾過したかまたは６％のスクロースを含有するｐＨ６．７のＰＢＳで別のＴＦＦの５回のサイクルに供した。
低温装填の後、リポソームナノ懸濁液を０．２２μｍのフィルターを介して滅菌Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ内に滅菌濾過した。粒子サイズ、ｐＨ、ドキソルビシンのＨＰＬＣ含有量、Ｆｉ、Ｆｔ、遊離ドキソルビシン、及びドキソルビシン放出プロファイルを決定した。滅菌ナノ懸濁液を２ｍＬの事前に滅菌したバイアルに無菌的に分注し、栓をし、密封した。バイアルを２～８℃で保存した。
インビトロ細胞ベースの細胞毒性アッセイ。
Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－２１３）。細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり密度１００Ｋの細胞で播種した。ドキソルビシン塩酸塩、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）、またはドキソルビシンシュウ酸塩リポソームを増殖培地（ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ＦＢＳ）で適切に希釈し、細胞に添加した。３７℃で１時間のインキュベートの後、プレートを遠心分離し、上清を吸引により除去し、１００μＬの新鮮な培地を各ウェルに添加し、細胞を４８時間培養した。
Ｈｅｌａ細胞（ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）。細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり密度２５Ｋの細胞で播種した。ドキソルビシン塩酸塩、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）、またはドキソルビシンシュウ酸塩リポソームを増殖培地（ＤＭＥＭ、５％ＦＢＳ、１％抗生物質、１％ＨＥＰＥＳ）で適切に希釈し、細胞に添加した。３７℃で１時間のインキュベートの後、プレートを遠心分離し、上清を吸引により除去し、１００μＬの新鮮な培地を各ウェルに添加し、細胞を４８時間培養した。
３日目に細胞生存性を評価するために、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ溶液を増殖培地（ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ＦＢＳ）中で１：２５０の希釈で調製し、細胞培地に直接添加した。３７℃で６時間のインキュベートの後、得られた蛍光をプレートリーダーで読み取った。いかなる薬物治療も受けていない細胞の蛍光を最大生存率と定義した。無細胞培地の蛍光を完全細胞死と定義した。データ分析は、曲線適合及びＩＣ５０値の決定のためにＰｒｉｓｍ非線形回帰ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用することによって実施した。
インビボ試験
ヒトＢリンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓ（ＲＡ１）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５９６）を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ－グルタミン、及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。細胞密度を３×１０５～１．５×１０６の範囲内で、生存率を９０～９５％の範囲内で維持した。同じ日に動物への投与前に、細胞を計数し、１２０００ｒｐｍで遠心分離し、滅菌ＰＢＳで洗浄し、１２００ｒｐｍで再度遠心分離し、無菌ＰＢＳ中で再懸濁して最終的な細胞数を１ｍＬ当たり３５×１０－とした。細胞の懸濁液を単回ボーラス注射により動物に静脈内投与してマウス１匹当たり５×１０６の細胞を送達した。
４週齢の免疫不全ＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅ（株－ＣＢ１７．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＬｙｓｔｂｇ－Ｊ／Ｃｒｌ）マウスを固形飼料で飼育した。８週齢でマウスを３つの群に細分した。１日目に、５×１０６のＢリンパ腫細胞を各マウスに静脈内注射した（図２）。２日目に、１つの群にはプラセボ（ドキソルビシン非含有リポソーム）が投与され、別の２つはそれぞれＤｏｘｉｌ（登録商標）（ロット＃ＦＡＺＳＲ００）またはドキソルビシンシュウ酸塩リポソームでの処置を受けた。２日目及び３日目に、全ての処置を繰り返した（図２）。動物を毎日モニターし、週に２回計量した。
注射前に、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）リポソーム、またはドキソルビシンシュウ酸塩リポソームをＰＢＳで適切に希釈して最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとした。治療品を単回ボーラス注射により１２０μＬで静脈内投与してマウス一匹当たり６０μｇのドキソルビシンまたは約３ｍｇ／ｋｇの用量を送達した。
使用された材料は表４に示されている。
Figure 2022172133000017
使用された機器は表５に示されている。
Figure 2022172133000018
使用された略語の要約：ＨＰＬＣ－高圧液体クロマトグラフィー；ＭＦＤ－製造年月日；ＤＣＭ－ジクロロメタン；ＰＣ－ホスファチジルコリン；ＦＣ－遊離コレステロール；Ｐ１８８－ポロキサマー１８８；ＤＭＰＣ－１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン；ＭＦ－微小流動化機；Ｗ／Ｖ－重量対体積；ｍｆｇ－製造；ＮＤ－未測定；Ｆｉ－蛍光薬物を装填した無傷リポソームの蛍光；Ｆｔ－破裂したリポソームに由来する薬物の全蛍光；ＴＦＦ－接線流濾過；Ｗ／Ｗ－重量対重量比；液体対薬物比－（ＰＣ＋ＤＭＰＣ＋ＦＣ）／ドキソルビシン、またはイリノテカン、またはミトキサントロンのＷ／Ｗ比。
実施例２：７０℃でのドキソルビシン装填：一定の５０：１（すなわち、５０対１または５０／１）の脂質／薬物（すなわち、脂質対薬物）比での異なる対イオンの比較。
使用した水和媒体：
ａ）次のアンモニウム塩の３００ｍＭ溶液：アンモニウム－シュウ酸塩、またはアンモニウム－硫酸塩、またはアンモニウム－ピコリン酸塩、またはアンモニウム－リン酸塩、またはアンモニウム－クエン酸塩、またはアンモニウム－酢酸塩、またはアンモニウム－ギ酸塩。
ｂ）まずシュウ酸、マレイン酸、システイン、マロン酸、酒石酸、フマル酸、コハク酸、アスコルビン酸、またはＮ－アセチルＬシステイン（ＮＡＣ）を水酸化アンモニウムでｐＨ４．８～５．０に滴定し、次いで水和媒体として使用した。
遠隔装填は、１ｍｇ／ｍＬのドキソルビシン塩酸塩（例えば、１ｍＬ当たり０．９３６ｍｇのドキソルビシン遊離塩基）を用いて７０℃で行った。塩酸塩。製剤組成が表６に示されている。全ての製剤は５０：１の脂質／薬物比で調製した（表６）。脂質／薬物比は、ドキソルビシン装填リポソームの最終懸濁液中の総脂質のドキソルビシン遊離塩基に対する重量／重量（ｗ／ｗ）比を表す。
ピコリン酸塩、マレイン酸塩、システイン酸塩、マロン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、アスコルビン酸、またはＮＡＣについてのデータは、２～８℃で一晩保存した後にドキソルビシン装填が観察されず、リポソーム材料が沈殿したので示されていない。
Figure 2022172133000019
粗懸濁液を調製し、ＭＦ処理した。９～１２分のＭＦ処理の後、粒子サイズ（Ｚ平均）は約６０～７５ｎｍに達した。試料を収集し、Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ内に滅菌濾過した。濾過したナノ懸濁液の粒子サイズを測定した（表７）。
Figure 2022172133000020
リポソームをＴＦＦに供し、続いてドキソルビシンの遠隔装填、及びＰＢＳスクロースでの別のＴＦＦサイクルに供した。遠隔装填に使用されたドキソルビシン塩酸塩の濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ（ドキソルビシン遊離塩基濃度：０．９３６ｍｇ／ｍＬ）。
ドキソルビシン装填リポソームの粒子サイズが表８に示されている。
Figure 2022172133000021
リポソーム懸濁液中のドキソルビシンの測定。続いてドキソルビシン装填リポソーム懸濁液を５回のＴＦＦに供して遊離（封入されていない）ドキソルビシンを大部分除去した。Ｔ０（ＭＦＤから１週間以内）での総ドキソルビシン濃度を測定するために、ＴＦＦ洗浄リポソームをメタノールまたはＩＰＡで希釈し、ＨＰＬＣ分析に供した。ドキソルビシン含有量、回収率（遠隔装填に使用されたドキソルビシン遊離塩基濃度に対するリポソーム懸濁液中のドキソルビシン含有量）、及び封入効率（％）が表９に示されている。封入効率（％）は、ドキソルビシン回収率（％）と遊離ドキソルビシン（％）との間の差を表す。
Figure 2022172133000022
遊離（封入されていない）ドキソルビシンの量を製造から１週間以内に測定した（表１０）。
Figure 2022172133000023
２～８℃で保存中の遊離（封入されていない）ドキソルビシン含有量の変化が表１１に示されている。
Figure 2022172133000024
リポソームドキソルビシン放出試験を２５℃（表１２）及び３７℃（表１３）で行った。各試料についてドキソルビシン放出を２、４及び８時間の時点で測定した。
Figure 2022172133000025
Figure 2022172133000026
（３７℃での）ドキソルビシン放出速度をまた、２～８℃の条件で試料の保存中にモニターした（表１４）。
Figure 2022172133000027
粒子サイズ。表７から、異なるリポソーム製剤の微小流動化が同様の粒子サイズをもたらしたことが分かる。ドキソルビシン装填は、全ての製剤の粒子サイズのわずかな増加をもたらした（表８）。
ドキソルビシン封入の効率は７９％から１００％まで変動した。対イオンとして硫酸塩を使用した場合、最も高い封入率１００％が観察された（表９）。
遊離ドキソルビシンは、（製造後１週間以内（Ｔ０）、及び２～８℃でのリポソーム材料の保存中に測定された封入されていない薬物の濃度を反映する。表１０から、Ｔ０における遊離ドキソルビシン含有量は０．０２～０．９％の範囲内であったことが分かる。２～８℃で少なくとも１ヶ月の保存にわたって観察された遊離ドキソルビシンの濃度における有意な変化はなかった（表１１）。
リポソームドキソルビシン放出速度。薬物放出試験を２５℃及び３７℃で行った。
２５℃では、全ての製剤（例えば、硫酸塩、シュウ酸塩、リン酸塩、酒石酸塩、及びクエン酸塩を有する）は、ゼロに近いΔｐＨ６．７／５．０放出差で非常に低くかつ同様の放出速度を示した（表１２）。
３７℃において、シュウ酸塩または酒石酸塩を対イオンとして使用した場合、ｐＨ６．７及びｐＨ５．０でのドキソルビシン放出の差（ΔｐＨ６．７／５．０放出差）は、使用した他の対イオンと比較して著しく高かった（表１３及び図３）。
アンモニウム－シュウ酸塩またはシュウ酸（ＮＨ４ＯＨでｐＨ４．８～５．０に滴定した）のどちらが水和媒体を調製するために使用されたかにかかわらず、空のまたはドキソルビシン装填リポソームの粒子サイズ（表７～８）、ドキソルビシン封入の効率（表９）、及び放出プロファイル（表１３～１４）は本質的に同じであったことは言及する価値がある。
Ｔ０（ＭＦＤ後１週間以内）で観察された３７℃の放出速度及びΔｐＨ６．７／５．０差の程度は、２～８℃で少なくとも約２ヶ月間の保存中に持続した（表１４）。
２５℃で全ての試験された対イオンについて観察された不十分なドキソルビシン放出速度（表１２）及び硫酸塩、リン酸塩、及びクエン酸塩と比較してシュウ酸塩または酒石酸塩で観察された３７℃でのドキソルビシン放出の劇的な増加（表１３）は、それらの溶解、及びひいてはドキソルビシン放出を促進し得る３７℃でのドキソルビシン－シュウ酸塩または酒石酸塩の凝集体の物理的状態（複数可）の独自性を示唆している。２５℃及び３７℃で特定の対イオンについて測定されたΔｐＨ６．７／５．０放出差の観察された差は、いくつかの実施形態では硫酸塩またはリン酸塩と比較してドキソルビシン－シュウ酸塩または－酒石酸塩のリポソーム内凝集体の物理的状態のより深い温度依存性遷移も示している可能性がある。
実施形態では、ドキソルビシンは、ｐＨ勾配及び対イオンに応じてリポソーム内に封入されると凝集体を形成し、これはいくつかの研究グループによって確認されている見解である［１、１３、１５、２３～２５］。対イオン（例えば、シュウ酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酒石酸塩、及びクエン酸塩）の物理化学的特性、例えば、サイズ、ｐＫａ値、立体化学、双極子モーメント、分極率などは、相互作用して異なる沈殿構造を生成し、そのため、リポソームからのドキソルビシンの放出を制御し得る。
Ａｎｄｒｅａｓ Ｆｒｉｔｚｅら［１３］は、３００ｍＭの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４溶液中で調製したドキソルビシン装填リポソームを可視化するために、クライト低温透過型電子顕微鏡法（Ｃ－ＴＥＭ）を使用した。図４に示されるように、捕捉され、沈殿したドキソルビシン形態の束は線状構造として現れ、リポソーム形状の変化を誘導し、特徴的な「コーヒー豆」構造をもたらす。ドキソルビシンリン酸塩の束を含有するリポソームからｐＨ６．７の緩衝液へのドキソルビシンの放出は、１時間及び２５℃で＜２～３％であったことが示された［１３］。
Ｘｉｎｇｏｎｇ Ｌｉら［１５］は、溶液中及び膜貫通ｐＨ勾配を介して装填されたＥＰＣ／コレステロールリポソーム内のドキソルビシン（ＤＯＸ）の物理的状態を調査した。低温電子顕微鏡法（低温－ＥＭ）を使用して、彼らは、クエン酸塩含有リポソーム内に２００～３００ｍＭの内部濃度まで装填されたドキソルビシンが、小胞膜の有意な相互作用／摂動のない線状の、曲がった、及び円状の繊維の束を形成したことに気づいた［１５］（図５）。ドキソルビシンクエン酸塩繊維を含有するリポソームからのｐＨ７．６緩衝液へのドキソルビシン放出は比較的遅かった（１時間で約４％）ことも示された。
硫酸塩の存在下でのドキソルビシン凝集体は、典型的には、大抵が線状または曲がっているように見えるクエン酸塩の存在下でのドキソルビシン－クエン酸塩凝集体（繊維間の間隔はおよそ３０～３５Ａ°である）と比較して剛性の線状繊維束（繊維間の間隔はおよそ２７Ａ°である）を有する［１、１５、２３～２５］（図６）。これらの結果は、クエン酸アニオンよりも小さな硫酸アニオンがより詰まった充填配置を可能にし得、繊維束の柔軟性の減少及びひいてはリポソームからの薬物放出のより低い速度をもたらすことを示唆している。
ドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソーム（ロット＃６４７－２－１５７）の低温ＴＥＭ分析。ドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソーム（ロット＃６４７－２－１５７）を低温透過型電子顕微鏡法（低温ＴＥＭ）によって特性化した。低温ＴＥＭ分析は、良好に画定された二重層膜（５～６ｎｍ厚、図７Ｃ）及び微小な内部密度のリポソーム（高い（５０：１）薬物対脂質比と合致する）を有する球状形態の良好に画定された高密度のリポソーム粒子（図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃ）を明らかにした。限外濾過法によって測定された遊離（封入されていない）ドキソルビシンが約０．３％であったことも言及する価値がある（表２１）。
粒子が支持体上に密集して充填されているように見えても、試料の格子上の広がりは比較的均一であり、粒子のクラスタ化も凝集も観察されなかった。より高い倍率では、膜二重層は明確に区別され得る（図７Ｂ及び７Ｃ）。粒子の大部分（９７％）は単層であった。
実施形態では、ドキソルビシン－シュウ酸塩凝集体は、非結晶性の性質を有するようであり（図７Ａ～７Ｃ）、対イオンとして硫酸塩またはリン酸塩を使用した場合に観察された緊密に充填された束を形成しなかった（図４～６）。この知見は、ドキソルビシン－硫酸塩及びリン酸塩凝集体と比較したリポソーム内ドキソルビシン－シュウ酸塩凝集体の独特の物理的状態を意味し、薬物放出プロファイルにおいて観察された差とよく一致している（図３、表１３～１４）。
全体の得られたデータは、硫酸塩、シュウ酸塩、リン酸塩、酒石酸塩、及びクエン酸塩を対イオンとして使用した場合のドキソルビシンの効率的な装填及び安定なリポソーム製剤の形成を示している。全ての製剤が２５℃で同様にドキソルビシンを放出したが、ドキソルビシン放出速度を３７℃で測定した場合、シュウ酸塩及び酒石酸塩は望ましいΔｐＨ６．７／５．０放出差を示した。このデータは、ドキソルビシン－シュウ酸塩または－酒石酸塩凝集体の温度依存性の物理的状態転移が、ドキソルビシン－硫酸塩または－リン酸塩凝集体と比較してより広範囲であり得ることを示している。
実施形態では、理論に縛られることなく、対イオンのｐＫａ値は外部ｐＨの変化に対する反応を決定するが、ｐＫａが分子レベルでのリポソームドキソルビシン放出にとって重要であり得るだけでなく（溶液中の場合）、対イオンの他の物理化学的特性（例えば、サイズ、立体化学、双極子モーメント、分極率など）と組み合わせられ、また、リポソーム内ドキソルビシンの充填、形成された凝集体の物理的状態、及びひいてはそれらの溶解速度を制御する上で重要である。
それ故、最適なｐＨ依存性薬物放出に対しての対イオンの効果が示され、実施された試験は、少なくともいくつかの実施形態では最適な対イオンがシュウ酸塩及び酒石酸塩であることを強く示唆している。
いくつかの代替的な実施形態では、クエン酸塩が対イオンとして使用され得る。
実施例３：ドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームの更なる特性化。可変脂質／薬物比。
水和媒体：３００ｍＭのアンモニウム－シュウ酸塩。
リポソームを、異なる脂質／薬物比（５：１～１００：１）及び様々な濃度のＰ１８８で調製した（表１５）。遠隔装填に使用された最終ドキソルビシン塩酸塩濃度は０．５または１．０ｍｇ／ｍＬであった。遠隔装填は７０℃で実施した。
Figure 2022172133000028
粗懸濁液を調製し、１０ＫＰＳＩの処理圧力でＭＦ処理した。９～１５分のＭＦ処理の後、粒子サイズ（Ｚ平均）は約６０～６５ｎｍに達した。試料を収集し、Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ内に滅菌濾過した。濾過したナノ懸濁液の粒子サイズを測定した（表１６）。
Figure 2022172133000029
リポソームをＴＦＦに供し、続いてドキソルビシンの遠隔装填、及びＰＢＳスクロースでの別のＴＦＦサイクルに供した。遠隔装填に使用されたドキソルビシン塩酸塩の濃度：０．５または１．０ｍｇ／ｍＬ。
ドキソルビシン装填リポソームの粒子サイズが表１７に示されている。
Figure 2022172133000030
粒子サイズ安定性データが表１８に示されている。
Figure 2022172133000031
リポソーム懸濁液中のドキソルビシンの測定。続いてドキソルビシン装填リポソーム懸濁液を５回のＴＦＦに供して遊離（封入されていない）ドキソルビシンを大部分除去した。Ｔ０（ＭＦＤから１週間以内）での総ドキソルビシン濃度を測定するために、ＴＦＦ洗浄リポソームをメタノールまたはＩＰＡで希釈し、ＨＰＬＣ分析に供した。ドキソルビシン含有量、回収率（遠隔装填に使用されたドキソルビシン遊離塩基濃度に対するリポソーム懸濁液中のドキソルビシン含有量）、及び封入効率（％）が表１９に示されている。封入効率（％）は、ドキソルビシン回収率（％）と遊離ドキソルビシン（％）との間の差を表す。
Figure 2022172133000032
リポソームドキソルビシンの安定性は、２～８℃での保存中に評価した。Ｔ０で測定された初期ドキソルビシン含有量に対する保存中の回収率が表２０に示されている。
Figure 2022172133000033
遊離ドキソルビシンの量を製造から１週間以内に測定した（表２１）。
Figure 2022172133000034
２～８℃で保存中の遊離ドキソルビシン含有量の変化が表２２に示されている。
Figure 2022172133000035
製造後１週間以内に、リポソームドキソルビシン放出試験を３７℃で行った（表２３）。各試料についてドキソルビシン放出を２、４及び８時間の時点で測定した。
Figure 2022172133000036
（３７℃での）リポソームドキソルビシン放出速度をまた、２～８℃の条件で試料の更なる保存中にモニターした（表２３ａ）。
Figure 2022172133000037
粒子サイズ。表１５及び１６から、全ての特定のリポソーム製剤の微小流動化が同様の粒子サイズをもたらしたことが分かる。ドキソルビシン装填は、５０：１～１００：１の脂質／薬物比を有する製剤の粒子サイズのわずかな増加しかもたらさず（表１７）、その一方で脂質／薬物比２０：１及び５：１を有する製剤については顕著な増加が観察された（表１７）。５０：１～１００：１の脂質／薬物比を有するドキソルビシン装填リポソームの粒径は少なくとも４ヶ月間安定のままであり（表１８）、その一方で脂質／薬物比２０：１及び５：１を有するリポソームの粒径は不安定であり、有意な増加を示した。
ドキソルビシン封入の効率。５０：１～１００：１の脂質／薬物比を有するリポソームへのドキソルビシン封入の効率は９０から９８％まで変動し（表１９）、２～８℃での保存中にリポソームドキソルビシン含有量の有意な変化は観察されなかった（表２０）。対照的に、脂質／薬物比２０：１及び５：１を有するリポソームについては著しく低い封入効率（３１％～５２％）が観察された（表１９）。
遊離（封入されていない）ドキソルビシン。遊離ドキソルビシンは、装填工程中にリポソーム内に封入されなかったか、または保存中にリポソームから漏出した薬物の濃度を反映する。表２１から、脂質／薬物比５０：１及び１００：１を有する製剤中の遊離ドキソルビシン含有量は０．２～０．４１％の範囲内であったことが分かる。２～８℃で最大約４か月の保存で観察された遊離ドキソルビシンの濃度における有意な変化はなかった（表２２）。
２０：１及び５：１の脂質／薬物比を有する製剤で測定された遊離ドキソルビシン含有量は著しく高く（表２１）、２～８℃で７日間の保存後に著しく増加した（表２２）。これらのデータは、５０：１未満の脂質／薬物比で作製され、２～８℃及びｐＨ６．７で保存されたリポソームからのドキソルビシンの明らかな漏出を示している。
リポソームドキソルビシン放出速度。表２３から、脂質／薬物比５０：１及び１００：１を有する製剤についてｐＨ５でのドキソルビシン放出速度はｐＨ６．７でのものと比較して著しく高かったことが分かる（表２３及び図３）。Ｔ０（ＭＦＤから１週間以内）で観察されたΔｐＨ６．７／５．０放出差は、２～８℃で最大１１４日間の保存中に持続した（表２３ａ）。
対照的に、より低い脂質／薬物比（２０：１及び５：１）を有する製剤は、不十分なΔｐＨ６．７／５．０放出差（表２３及び図８）及びｐＨ６．７でのドキソルビシンの顕著な漏出を示した（表２２～２３ａ）。
実施形態では、理論に縛られることなく、より低い脂質／薬物比は、表面張力の増加及び脂質層の完全性の損失につながり得、それは希釈の際に濃度勾配に起因する溶解媒体へのリポソーム内容物の非ｐＨ依存性漏出の増加をもたらす可能性があり、ｐＨで推進される薬物の放出を相殺する可能性がある。対照的に、より高い脂質対薬物比は、溶解媒体へのリポソーム内材料の「オフターゲットの」漏出を防止することができ、かつｐＨ遷移のみに応じて薬物を放出するより低い表面張力及びより高い完全性の脂質層（複数可）を有するリポソームの形成をもたらし得る。
それ故、ｐＨ依存性薬物放出及びリポソームの安定な性能の両方に対する脂質／薬物比の効果が示された。実施された試験は、最適な脂質／薬物比がいくつかの実施形態では２０：１～５０：１の範囲内にあることを示唆している。使用され得る他の比は、いくつかの他の実施形態では２０：１～１００：１を含む。
リポソーム製剤へのＰ１８８の添加が、Ｐ１８８を用いずに調製されたリポソーム製剤（ロット＃６４７－２－１５９Ｂ）と比較して、粒子サイズ（表１５～１７）、ドキソルビシン封入の効率（表１９及び２１）、及びドキソルビシン放出プロファイル（表２３）に対していかなる有意な影響も及ぼさなかったことも言及する価値がある。しかしながら、Ｐ１８８は、薬物装填リポソームの生物学的性能に対するその可能性のある有利な影響のためにリポソーム製剤における使用のために選ばれた［１０～１１、１６～１９］。
実施例４：インビトロ細胞ベースの細胞毒性アッセイ．
次に、Ｂ細胞リンパ腫の治療用薬物の評価に一般的に使用されるヒトリンパ腫Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞株［２１、２２］を使用して、ドキソルビシン－シュウ酸塩装填リポソーム対遊離ドキソルビシン、及びＤｏｘｉｌ（登録商標）のＢ細胞毒性を試験した。表２４から、３つの異なるロットのドキソルビシン－シュウ酸塩装填リポソームが遊離ドキソルビシンと同様の細胞毒性を示し、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）（ロット＃Ｌ０１ＤＢ０１）に対して約５０～７０倍強力（インビボでの有効性の上昇を予測する差）であったこと分かる。
子宮頸がんに由来するヒト細胞株であるＨｅｌａ細胞も薬物の細胞毒性を評価するために使用した。表２４から、ドキソルビシン－シュウ酸塩装填リポソームが遊離ドキソルビシンよりも２～３倍低い細胞毒性を示したが、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）に対して４～６倍強力であったことが分かる（表２４）。
Figure 2022172133000038
得られた細胞毒性データは、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）と比較してドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームの効能の著しい上昇を示したが、これはドキソルビシン－硫酸塩含有リポソームと比較してドキソルビシン－シュウ酸塩の顕著に高いΔｐＨ６．７／５．０放出差とよく一致する。
実施例５：インビボ試験
Ｄｏｘｉｌ（登録商標）（ロット＃ＦＡＺＳＲ００）に対するドキソルビシン－シュウ酸塩装填リポソーム（ロット＃６４７－２－１３）の有効性を、Ｂｅｉｇｅ（株－ＣＢ１７．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＬｙｓｔｂｇ－Ｊ／Ｃｒｌ）マウスにおいて標準リンパ腫モデルで評価した。図２におけるタイムラインによって示されるように、Ｂリンパ腫細胞（５×１０６）を０日目に静脈内注射し、２４時間広がらせ、続いて１、２、及び３日目に薬物非含有脂質製剤（プラセボ）、またはドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソーム（３ｍｇのドキソルビシン／ｋｇ）、またはＤｏｘｉｌ（登録商標）（３ｍｇのドキソルビシン／ｋｇ）をマウスに投与した。
プラセボ（ドキソルビシン非含有リポソーム）で処置した動物は２１日で生存期間中央値（ＭＳＴ）に達した一方で、ドキソルビシン－シュウ酸塩装填リポソームはＭＴＳを３３日まで増加させた（図５）。対照的に、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）リポソームは１５日のＭＳＴを示した（図５）。プラセボ（図５）で処置したマウスと比較してＤｏｘｉｌ（登録商標）で観察されたより短いＭＳＴは、潜在的なＤｏｘｉｌ（登録商標）の毒性を示す一方で、そのような毒性はドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームでは観察されなかった。未処置マウス（いかなる物質も注射されていない）の群はプラセボと同じ生存率を示した（グラフには示されていない）。ドキソルビシン－シュウ酸塩で処置した動物では１１日目でおよそ８％の最大群平均体重損失が観察され、１７日目に完全に回復した一方で、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）で処置したマウスでは１４日目に約３０％の体重損失が観察され、４～８匹の動物の死亡をもたらした。高い毒性はまた、遊離ドキソルビシンで処置したマウスの群でも観察されたが（１３日目で５０％の死亡率）、生存したものは、そのモデルを認証する最長のＭＳＴを示した。ドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームについて観察されたより低い毒性は、それらのより速いクリアランスのために部分的であり得る。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）と比較した本開示による試験されたリポソームのより低い毒性及びより高い有効性は、非常に望ましくかつ有望な結果である。それ故、同じ実験プロトコル下では、ドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームでの治療は、プラセボ対照と比較して、明らかな毒性がないこと及び生存率の有意な改善を示した一方で、同じ用量及びレジメンでのＤｏｘｉｌ（登録商標）での治療は、著しい毒性を示し、プラセボと比較してＭＳＴの有意な改善をもたらさなかった。ドキソルビシン－シュウ酸塩リポソームのより良好な性能は、最適化されたΔｐＨ放出差に合致し、全体として、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）（ドキソルビシン－硫酸塩）リポソームと比較して改善した安全性及び有効性をもたらした。
それ故、同じ実験プロトコル下では、ドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームでの治療は、プラセボ対照と比較して、明らかな毒性がないこと及び生存率の有意な改善を示した一方で、同じ用量及びレジメンでのＤｏｘｉｌ（登録商標）での治療は、著しい毒性を示し、プラセボと比較してＭＳＴの有意な改善をもたらさなかった（図９）。ドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームのより良好な性能は、最適化されたΔｐＨ６．７／５．０放出差に合致し、全体として、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）（ドキソルビシン－硫酸塩）リポソームと比較して改善した安全性及び有効性をもたらした。
実施例６：ドキソルビシン－酒石酸塩含有リポソームの更なる特性化：可変脂質対薬物比。
ドキソルビシン－酒石酸塩含有リポソームの調製及び更なる特性化。リポソームは、異なる脂質／薬物比（５：１（５対１または５／１と同等に称される）～１００：１（１００対１または１００／１と同等に称される）で調製した（表２５）。遠隔装填に使用されたドキソルビシン塩酸塩濃度は、０．５または１．０ｍｇ／ｍＬ（すなわち、１ｍＬ当たり０．４６８及び０．９３６ｍｇのドキソルビシン遊離塩基）であった。遠隔装填はドキソルビシン塩酸塩を用いて７０℃で実施した。まず酒石酸を水酸化アンモニウムでｐＨ４．８～５．０に滴定し、次いで水和媒体として使用した。
Figure 2022172133000039
粗懸濁液を調製し、１０ＫＰＳＩの処理圧力でＭＦ処理した。９～１５分のＭＦ処理の後、粒子サイズ（Ｚ平均）は約６０～６５ｎｍに達した。試料を収集し、Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ内に滅菌濾過した。濾過したナノ懸濁液の粒子サイズを測定した（表２５ａ）。
Figure 2022172133000040
リポソームをＴＦＦに供し、続いてドキソルビシンの遠隔装填及びＰＢＳスクロースでの別のＴＦＦサイクルに供した。遠隔装填に使用されたドキソルビシン塩酸塩の濃度：０．５または１．０ｍｇ／ｍＬ。
ドキソルビシン装填リポソームの粒子サイズが表２５ｂに示されている。
Figure 2022172133000041
リポソーム懸濁液中のドキソルビシンの測定。続いてドキソルビシン装填リポソーム懸濁液を５回のＴＦＦに供して遊離（封入されていない）ドキソルビシンを大部分除去した。Ｔ０（ＭＦＤから１週間以内）での総ドキソルビシン濃度を測定するために、ＴＦＦ洗浄リポソームをメタノールまたはＩＰＡで希釈し、ＨＰＬＣ分析に供した。ドキソルビシン含有量、回収率（遠隔装填に使用されたドキソルビシン遊離塩基濃度に対するリポソーム懸濁液中のドキソルビシン含有量）、及び封入効率（％）が表２５ｃに示されている。封入効率（％）は、ドキソルビシン回収率（％）と遊離ドキソルビシン（％）との間の差を表す。
Figure 2022172133000042
遊離（封入されていない）ドキソルビシンの量を製造から１週間以内に測定した（表２５ｄ）。
Figure 2022172133000043
製造後１週間以内に、リポソームドキソルビシン放出試験を３７℃で行った（表２５ｅ）。各試料についてドキソルビシン放出を２、４及び８時間の時点で測定した。
Figure 2022172133000044
粒子サイズ。表２５及び２５ａから、全ての特定のリポソーム製剤の微小流動化が同様の粒子サイズをもたらしたことが分かる。ドキソルビシン装填は、粒子サイズのわずかな増加しかもたらさなかった（表２５ｂ）。
ドキソルビシン封入の効率。５：１～１００：１の脂質／薬物比を有するリポソームへのドキソルビシン封入の効率は、７６から９６％まで変動した（表２５ｃ）。対照的に、脂質／薬物比５：１を有するリポソームについては著しく低い封入効率（４１％）が観察された（表２５ｃ）。
遊離（封入されていない）ドキソルビシン。遊離ドキソルビシンは、装填工程中にリポソーム内に封入されなかったか、または保存中にリポソームから漏出した封入されていない薬物の濃度を反映する。表２５ｄから、脂質／薬物比２０：１～１００：１を有する製剤中の遊離ドキソルビシン含有量は０．０１～０．０３％の範囲内であった一方で、５：１の脂質／薬物比では遊離ドキソルビシンの増加したレベル（３．２％）が観察されたことが分かる。これらのデータは、シュウ酸塩含有リポソームについて得られた結果と一致しており（表２１）、２０：１の脂質／薬物比よりも低い比で作製されたリポソームからの中性ｐＨでのドキソルビシンの明らかな漏出を示している。
リポソームドキソルビシン放出速度。ｐＨ５でのドキソルビシン放出速度は、全ての製剤についてｐＨ６．７でのものと比較してより高かったが（表２５ｅ）、５０：１未満の脂質／薬物比を有する製剤については中性ｐＨでの余分な漏出が観察された。しかしながら、ｐＨ６．７でのドキソルビシンの漏出は、シュウ酸塩含有リポソームのものと比較して酒石酸塩含有リポソームの方が著しく少なかったことは言及する価値がある（表２１、２３、図８、１０）。
それ故、対イオンのシュウ酸塩及び酒石酸塩の両方に対する脂質／薬物比の効果が示された。実施された試験は、最適な脂質／薬物比がいくつかの実施形態では２０：１～５０：１の範囲内にあることを示唆している。使用され得る他の比は、いくつかの他の実施形態では２０：１～１００：１を含む。
実施例７：シュウ酸塩含有及び酒石酸塩含有リポソームへのドキソルビシンの低温装填：可変脂質／薬物比。
リポソームへのドキソルビシンの低温装填は次のように実施した：ドキソルビシン塩酸塩の生理食塩水溶液を室温でリポソームナノ懸濁液に添加して最終濃度０．５または１ｍｇ／ｍＬ（すなわち、１ｍＬ当たり０．４６８及び０．９３６ｍｇのドキソルビシン遊離塩基）とし、穏やかに反転させ（２～３回）、室温で１０～２０分間インキュベートした。室温での１０～２０分のインキュベートの後、混合物をａ）６％のスクロースを含有するｐＨ６．７のＰＢＳで別のＴＦＦの５回のサイクルに供し、及び／またはｂ）２～８℃の冷凍庫内に１６時間配置し、次いで６％のスクロースを含有するｐＨ６．７のＰＢＳで別のＴＦＦの５回のサイクルに供した。室温で、または室温に続いて２～８℃で一晩のインキュベートで装填されたリポソームのドキソルビシン放出プロファイル間で観察された顕著な差はなかった。室温に続いて２～８℃で一晩のインキュベートのデータは示されていない。
製剤組成が表２６に示されている。
Figure 2022172133000045
粗懸濁液を調製し、１０ＫＰＳＩの処理圧力でＭＦ処理した。９～１５分のＭＦ処理の後、粒子サイズ（Ｚ平均）は約６０～６６ｎｍに達した。試料を収集し、Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ内に滅菌濾過した。濾過したナノ懸濁液の粒子サイズを測定した（表２６ａ）。
Figure 2022172133000046
リポソームをＴＦＦに供し、続いてドキソルビシンの遠隔装填、及びＰＢＳスクロースでの別のＴＦＦサイクルに供した。ドキソルビシン装填リポソームの粒子サイズが表２６ｂに示されている。
Figure 2022172133000047
リポソーム懸濁液中のドキソルビシンの測定。続いてドキソルビシン装填リポソーム懸濁液を５回のＴＦＦに供して遊離（封入されていない）ドキソルビシンを大部分除去した。Ｔ０（ＭＦＤから１週間以内）での総ドキソルビシン濃度を測定するために、ＴＦＦ洗浄リポソームをメタノールまたはＩＰＡで希釈し、ＨＰＬＣ分析に供した。ドキソルビシン含有量、回収率（遠隔装填に使用されたドキソルビシン遊離塩基濃度に対するリポソーム懸濁液中のドキソルビシン含有量）、及び封入効率（％）が表２６ｃに示されている。封入効率（％）は、ドキソルビシン回収率（％）と遊離ドキソルビシン（％）との間の差を表す。
Figure 2022172133000048
遊離ドキソルビシンの量を製造から１週間以内に測定した（表２６ｄ）。
Figure 2022172133000049
製造後１週間以内に、リポソームドキソルビシン放出試験を３７℃で行った（表２６ｅ）。各試料についてドキソルビシン放出を２、４及び８時間の時点で測定した。
Figure 2022172133000050
粒子サイズ。表２６及び２６ａから、全ての特定のリポソーム製剤の微小流動化が同様の粒子サイズをもたらしたことが分かる。ドキソルビシン装填は、いくつかの製剤の粒子サイズのわずかな増加しかもたらさなかった。
ドキソルビシン封入の効率。２０：１～１００：１の脂質／薬物比を有するシュウ酸塩含有リポソームへのドキソルビシン封入の効率は、９１から９７％まで変動した（表２６ｃ）。対照的に、脂質／薬物比５：１を有するリポソームについては著しく低い封入効率（２２％）が観察された（表２６ｃ）。
酒石酸塩を対イオンとして使用した場合、２０：１～１００：１の脂質／薬物比を有するリポソームへのドキソルビシン封入の効率は、８３から９１％まで変動し（表２６ｃ）、一方で脂質／薬物比５：１を有するリポソームについてはより低い封入効率（６７％）が観察された（表２６ｃ）。
遊離（封入されていない）ドキソルビシン。遊離ドキソルビシンは、装填工程中にリポソーム内に封入されなかったか、または保存中にリポソームから漏出した薬物の濃度を反映する。表２６ｄから、脂質／薬物比２０：１及び１００：１を有するシュウ酸塩含有リポソーム中の遊離ドキソルビシン含有量は０．０１～０．０８％の範囲内であったことが分かる。５：１の脂質／薬物比を有する製剤において測定された遊離ドキソルビシン含有量は４．９６％であった（表２６ｄ）。
酒石酸塩を対イオンとして使用した場合、２０：１～１００：１の脂質／薬物比を有するリポソームの遊離ドキソルビシン含有量は０．０１から０．０４％まで変動し（表２６ｄ）、一方で脂質／薬物比５：１を有するリポソームについてはより低い封入効率及びより高い遊離ドキソルビシン含有量（２．５１％）が観察された（表２６ｄ）。
リポソームドキソルビシン放出速度。
脂質／薬物比の影響。表２６ｅから、両方の対イオンについて、脂質／薬物比５０：１及び１００：１を有する製剤についてｐＨ５でのドキソルビシン放出はｐＨ６．７でのものと比較して劇的に高かったことが分かる（表２６ｅ、図１１～１２）。その上、ｐＨ６．７でのドキソルビシン漏出は十分に抑制された（表２６ｅ、図１１～１２）。
ｐＨ５では、低温装填されたシュウ酸塩含有リポソームからのドキソルビシン放出は２時間の時点で約１００％を達成し、７０℃で装填されたリポソームのものの２倍であった（図１３）。
ｐＨ５では、低温装填された酒石酸塩含有リポソームからのドキソルビシン放出は４時間の時点で約９０～１００％を達成し、７０℃で装填されたリポソームのものの３倍であった（図１４）。
驚くべきことに、シュウ酸塩及び／または酒石酸塩を対イオンとして使用した場合、低温装填（例えば、室温での混合）は、ｐＨ５で薬物放出を著しく増加させることによって７０℃で装填されたリポソームと比較してΔｐＨ６．７／５．０放出差を更に改善し（最大化し）、一方でｐＨ６．７でのその放出を抑制した（表２６ｅならびに図１３及び図１４）。酸性ｐＨでは、低温装填されたシュウ酸塩含有リポソームからのドキソルビシン放出は２時間の時点で約１００％を達成し、７０℃で装填されたリポソームのものの２倍であった（図１３）。低温装填された酒石酸塩含有リポソームからのドキソルビシン放出は４時間で約９０％を達成し（図１４）、７０℃で装填されたリポソームのものの３倍であった。
興味深いことに、ドキソルビシン－クエン酸塩含有リポソームはｐＨ５で低い放出速度を示したが、ΔｐＨ６．７／５．０放出差はｐＨ６．７での極端に低い放出のため許容可能であった（表１３及び図３）。
対照的に、５：１未満の脂質／薬物比を有する製剤は、ｐＨ５．０でのより低い放出及びｐＨ６．７でのドキソルビシンの漏出のために不十分なΔｐＨ６．７／５．０放出差を示した（表２６ｅ及び図１１～１２）。しかしながら、５０：１より低い脂質／薬物比での酒石酸塩含有リポソームが、シュウ酸塩リポソームと比較して中性ｐＨでドキソルビシン漏出のより強い抑制を示したことは言及する価値がある（表２６ｅ及び図１１～１２）。
それ故、いくつかの実施形態では、対イオンのシュウ酸塩及び酒石酸塩の両方についての脂質対薬物比が役割を果たし得る。実施された試験は、いくつかの実施形態では、最適な脂質／薬物比が少なくともいくつかの実施形態では２０：１～５０：１の範囲内にあり得ることを示唆している。使用され得る他の比は、いくつかの他の実施形態ではいくつかの他の実施形態では１０：１～１００：１を含む。
いくつかの実施形態では、ドキソルビシンの低温装填が、対イオンとしてのシュウ酸塩及び酒石酸塩ならびに５０：１及び１００：１の脂質／薬物比を用いて達成されたΔｐＨ６．７／５．０放出差を最大化したことも示された。シュウ酸塩及び酒石酸塩における遠隔ドキソルビシン装填のために使用され得る他の温度は、いくつかの他の実施形態では２～８℃から７０℃を含む。
実施例８．１：シュウ酸塩及び／または酒石酸塩含有リポソームへの凍結乾燥され、再構成されたドキソルビシンの低温装填。
凍結乾燥。ドキソルビシン－塩酸塩を６％のスクロース、または４％のマンニトール、または１％のラクトース、または３％のラクトースを含有する注射用滅菌水に６ｍｇ／ｍＬの最終濃度となるように溶解し、滅菌濾過し、２ｍＬのバイアル内に無菌的に充填し（１ｍＬの充填体積）、ＶｉｒＴｉｓ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＳＱ２５ＥＬ凍結乾燥機で凍結乾燥させた。ドキソルビシン溶液を含有するバイアルを、－４０℃に事前に凍結した凍結乾燥機に移し、一晩（１６）時間凍結させた。１６時間後、真空をオンにし、１℃／４分の温度上昇速度で温度を－３２℃に上昇させた。３２℃で２４時間の凍結乾燥後、温度上昇速度１℃／２０分で温度を２０℃に更に上昇させた。バイアルに真空下で栓をした。
遠隔装填：凍結乾燥した材料を注射用滅菌水中で再構成して最終濃度６ｍｇ／ｍＬとし、０．４ｍＬの再構成した材料（約２．２４ｍｇのドキソルビシン遊離塩基）を２ｍＬのリポソームナノ懸濁液に室温で添加して最終濃度０．９３６ｍｇ／ｍＬのドキソルビシン遊離塩基とし、穏やかに反転させ（２～３回）、室温で１０分間インキュベートした。
製剤組成が表２７に示されている。
Figure 2022172133000051
粗懸濁液を調製し、１０ＫＰＳＩの処理圧力でＭＦ処理した。９～１５分のＭＦ処理の後、粒子サイズ（Ｚ平均）は約６０～７０ｎｍに達した。試料を収集し、Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ内に滅菌濾過した。濾過したナノ懸濁液の粒子サイズを測定した（表２７ａ）。
Figure 2022172133000052
リポソームをＴＦＦに供し、続いてドキソルビシンを室温で１０分間遠隔装填した。ドキソルビシン装填リポソームの粒子サイズが表２７ｂに示されている。
Figure 2022172133000053
遊離（封入されていない）ドキソルビシンの量を製造から１週間以内に測定した（表２７ｃ）。
Figure 2022172133000054
リポソーム懸濁液中のドキソルビシンの測定。ドキソルビシン装填工程に続いて２回目のＴＦＦは実施しなかった。Ｔ０（ＭＦＤから１週間以内）での総ドキソルビシン濃度を測定するために、ドキソルビシン装填リポソームをメタノールまたはＩＰＡで希釈し、ＨＰＬＣ分析に供した。ドキソルビシン含有量、回収率（遠隔装填に使用されたドキソルビシン遊離塩基濃度に対するリポソーム懸濁液中のドキソルビシン含有量）、及び封入効率（％）が表２７ｄに示されている。封入効率（％）は、ドキソルビシン回収率（％）と遊離ドキソルビシン（％）との間の差を表す。
Figure 2022172133000055
製造後１週間以内に、リポソームドキソルビシン放出試験を３７℃で行った（表２７ｅ）。各試料についてドキソルビシン放出を２、４及び８時間の時点で測定した。
Figure 2022172133000056
凍結乾燥されたドキソルビシン生成物。マンニトールまたはラクトースを含有する凍結乾燥されたドキソルビシン水溶液は、容易に（すなわち、即座に）再構成可能なドキソルビシン生成物をもたらした。対照的に、６％のスクロースの存在下での凍結乾燥は容易には再構成できない材料をもたらした。そのため、６％のスクロースを含有する凍結乾燥されたドキソルビシン生成物は、更なる開発には考慮されず、装填実験には使用されなかった。
粒子サイズ。表２７及び２７ａから、リポソーム製剤の微小流動化が同様の粒子サイズをもたらしたことが分かる。ドキソルビシン装填は、対イオン及び抗凍結剤とは無関係にリポソームの粒子サイズに影響を及ぼさなかった（表２７ｂ）。
遊離（封入されていない）ドキソルビシン。遊離ドキソルビシンは、装填工程中にリポソーム内に封入されなかったか、または保存中にリポソームから漏出した薬物の濃度を反映する。表２７ｃから、シュウ酸塩含有リポソーム中の遊離ドキソルビシン含有量は約０．２４％であったことが分かる。酒石酸塩を対イオンとして使用した場合、リポソーム懸濁液中の遊離ドキソルビシン含有量は０．１４～０．１８％の範囲内であった（表２７ｄ）。
ドキソルビシン封入の効率。ドキソルビシン封入の効率は、対イオン及び抗凍結剤とは無関係に（遊離ドキソルビシンのレベルを考慮して）９７～１００％であった（表２７ｄ）。
リポソームドキソルビシン放出速度。凍結乾燥され再構成されたドキソルビシンのシュウ酸塩及び／または酒石酸塩含有リポソームへの低温（室温）装填は、ドキソルビシンの急速な（１０分以内の）封入をもたらした。リポソームドキソルビシン生成物は、ｐＨ５でのドキソルビシンの高い放出で格別のΔｐＨ６．７／５．０放出差を示した一方で、ｐＨ６．７でのドキソルビシン放出は十分に抑制された（表２７ｅ）。
それ故、注射凍結乾燥製品用の水の中で室温で容易に再構成可能であり、再構成されたドキソルビシン生成物を室温で迅速に封入する我々の新規リポソームの独特の能力をもたらし、格別のΔｐＨ６．７／５．０放出差を提供するというドキソルビシンの成功した凍結乾燥が示された。
全体として、リポソームドキソルビシン生成物の安定性は、リポソームの安定性及びリポソーム内部の薬物製品の安定性の両方に依存する。凍結乾燥され、室温で容易に再構成可能なドキソルビシン、及び室温でドキソルビシンを迅速に装填するシュウ酸塩または酒石酸塩含有リポソームの能力は、優れた放出プロファイルも提供しつつ、これらの潜在的な安定性の問題に対処する。この知見は、２つのバイアル：凍結乾燥されたドキソルビシンを有するバイアル及びリポソームビヒクル懸濁液を有するバイアルからなる特定の製品提示形式につながる。室温で２つのバイアルの再構成された内容物を（単純な反転により）混合することは、数分以内に最終的なすぐに使用可能な製品をもたらす。
製品安定性。ドキソルビシン非含有シュウ酸塩または酒石酸塩含有リポソーム（ビヒクル）及び凍結乾燥したドキソルビシンの両方の懸濁液は、２～８℃及び周囲相対湿度で少なくとも６ヶ月間保存した場合に安定であった。６ヶ月の時点は、節８．１に記載された製剤について実施された最後の安定性試験を表す。凍結乾燥され、再構成されたドキソルビシンをビヒクルに装填し、安定性試験は以下を含んでいた：凍結乾燥され、再構成されたドキソルビシン材料のＨＰＬＣアッセイ（９８±２％）、リポソームへのドキソルビシン封入の効率（９８±２％）、遊離（封入されていない）ドキソルビシンの測定（０．１～１％）、粒子サイズ（Ｚａｖｒｇ＝６３～６８ｎｍ）、ｐＨ（７．２～６．７）、及びΔｐＨ６．７／５．０ドキソルビシン放出差は１００％に近かった。その上、２～８℃及び周囲相対湿度で保存されたより古いバッチ（６４７－１－１９０）のシュウ酸塩含有リポソーム（ビヒクル）は、少なくとも１８ヶ月間許容可能な安定性を示し、上述したパラメータに顕著な変化は観察されなかった。凍結乾燥されたリポソームビヒクルの開発も考慮されている。
実施例８．２：一定の５０：１の脂質／薬物比での異なる対イオンの比較：低温装填。
使用した水和媒体：
ａ）次のアンモニウム塩の３００ｍＭ溶液：アンモニウム－シュウ酸塩、またはアンモニウム－硫酸塩、またはアンモニウム－リン酸塩、またはアンモニウム－クエン酸塩。
ｂ）まず酒石酸、アスコルビン酸、またはＮ－アセチルＬシステイン（ＮＡＣ）を水酸化アンモニウムでｐＨ４．８～５．０に滴定し、次いで水和媒体として使用した。
製剤組成が表２７に示されている。全ての製剤は５０：１の一定の脂質／薬物比で調製した（表２８）。
ＮＡＣについてのデータは、２～８℃で一晩保存した後にドキソルビシン装填が観察されず、リポソーム材料が沈殿したので示されていない。
Figure 2022172133000057
粗懸濁液を調製し、ＭＦ処理した。９～１２分のＭＦ処理の後、粒子サイズ（Ｚ平均）は約６０～７５ｎｍに達した。試料を収集し、Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ内に滅菌濾過した。次いでリポソームをＴＦＦに供し、続いてドキソルビシンの遠隔装填、及びＰＢＳスクロースでの別のＴＦＦサイクルに供した。微小流動化されたリポソーム材料の粒子サイズは、本明細書に示されるものと同様であった。
遠隔装填に使用されたドキソルビシン塩酸塩の濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ（ドキソルビシン遊離塩基濃度：０．９３６ｍｇ／ｍＬ）。
リポソームへのドキソルビシンの低温装填は次のように実施した：ドキソルビシン塩酸塩の生理食塩水溶液（６ｍｇ／ｍＬ）を室温でリポソームナノ懸濁液に添加して最終濃度１ｍｇ／ｍＬ（すなわち、１ｍＬ当たり０．９３６ｍｇのドキソルビシン遊離塩基）とし、穏やかに反転させ（２～３回）、室温で１０～２０分間インキュベートした。室温での１０～２０分のインキュベートの後、混合物をａ）６％のスクロースを含有するｐＨ６．７のＰＢＳで別のＴＦＦの５回のサイクルに供し、及び／またはｂ）２～８℃の冷凍庫内に１６時間配置し、次いで６％のスクロースを含有するｐＨ６．７のＰＢＳで別のＴＦＦの５回のサイクルに供した。室温で、または室温に続いて２～８℃で一晩のインキュベートで装填されたリポソームのドキソルビシン放出プロファイル間で観察された顕著な差はなかった。室温に続いて２～８℃で一晩インキュベートした場合のデータは示されていない。
ドキソルビシン装填リポソームの粒子サイズが表２８ａに示されている。
Figure 2022172133000058
リポソーム懸濁液中のドキソルビシンの測定。続いてドキソルビシン装填リポソーム懸濁液を５回のＴＦＦに供して遊離（封入されていない）ドキソルビシンを大部分除去した。Ｔ０（ＭＦＤから１週間以内）での総ドキソルビシン濃度を測定するために、ＴＦＦ洗浄リポソームをメタノールまたはＩＰＡで希釈し、ＨＰＬＣ分析に供した。ドキソルビシン含有量、回収率（遠隔装填に使用されたドキソルビシン遊離塩基濃度に対するリポソーム懸濁液中のドキソルビシン含有量）、及び封入効率（％）が表２８ｂに示されている。封入効率（％）は、ドキソルビシン回収率（％）と遊離ドキソルビシン（％）との間の差を表す。
Figure 2022172133000059
遊離ドキソルビシンの量を製造から１週間以内に測定した（表２８ｃ）。
Figure 2022172133000060
リポソームドキソルビシン放出試験を３７℃で行った（表２８ｄ）。各試料についてドキソルビシン放出を２、４及び８時間の時点で測定した。
Figure 2022172133000061
粒子サイズ。異なるリポソーム製剤の微小流動化は、本明細書に示されるものに非常に似ている同様の粒子サイズをもたらした。低温ドキソルビシン装填は、７０℃でドキソルビシンを装填したリポソームと比較して、粒子サイズのわずかに少ない増加をもたらした（アスコルビン酸塩含有リポソームを除く）。（表２８ａ及び表８）。
ドキソルビシン封入の効率。７８％のドキソルビシン回収率を示したリン酸塩含有リポソームを除き、処方の大部分についてのドキソルビシン封入の効率は８６から９７％まで変動した（表２７ｂ）。最も効率的な封入は、シュウ酸塩を対イオンとして使用した場合に観察され、リン酸塩では最も効率的ではなかった（表２８ｂ）。
遊離（封入されていない）ドキソルビシン．遊離ドキソルビシンは、Ｔ０で（製造後１週間以内に）測定された封入されていない薬物の濃度を反映する。表２７ｃから、全ての製剤（アスコルビン酸塩以外）についての遊離ドキソルビシン含有量は０．０１～０．０８％の範囲内であったことが分かる。ドキソルビシン－アスコルビン酸塩含有リポソームは、遊離ドキソルビシンの著しく高い漏出を示した（表２８ｃ）。
リポソームドキソルビシン放出速度。薬物放出試験を３７℃で行った。
ドキソルビシンの低温装填は、７０℃でドキソルビシンを装填したリポソーム（表１３、図３）と比較して、クエン酸塩についてはΔｐＨ６．７／５．０放出差のいくらかの改善（表２８ｄ、図１５）、シュウ酸塩についてはΔｐＨ６．７／５．０放出差の顕著な改善、及び酒石酸塩については大幅な改善（表２８ｄ、図１５）をもたらした。
ドキソルビシン－硫酸塩及び－リン酸塩含有リポソームは、両方のｐＨでの放出が少ないため、不十分なΔｐＨ６．７／５．０放出差を保持した（表２８ｄ、図１５）。ドキソルビシン－アスコルビン酸塩含有リポソームはｐＨ５で高いドキソルビシン放出を示したが、ΔｐＨ６．７／５．０放出差はｐＨ６．７でのドキソルビシンの高い放出／漏出のために非常に不十分であり（表２８ｄ、図１５）、これはドキソルビシン封入の目的を害し、製品安定性及びインビボ性能を損なう。
それ故、シュウ酸塩または酒石酸塩を対イオンとして使用した場合、ｐＨ５とｐＨ６．７との間のドキソルビシン放出の差は、装填条件にかかわらず、他の使用された対イオンと比較して著しく高かった（表１３、図３及び表２８ｄ、図１５）。しかしながら、低温装填は、７０℃で装填された同じリポソーム製剤と比較して、ドキソルビシン－シュウ酸塩含有及び酒石酸塩含有リポソームについてのΔｐＨ６．７／５．０放出差を更に改善したことは言及する価値がある。観察された差は、温度及びｐＨに応じてそれらの溶解を促進し得る３７℃でのドキソルビシン－シュウ酸塩または酒石酸塩凝集体の物理的状態（複数可）の独自性を示唆している。
実施例８．３：シュウ酸塩または酒石酸塩、またはクエン酸塩含有リポソームへのドキソルビシンの低温装填。
この実施例は、（ｉ）ｐＨ６．７、６．７、６．０、及び５．０でのｐＨ依存性ドキソルビシン放出に関する更なる特性化及び（ｉｉ）ｐＨ依存性ドキソルビシン放出に対する脂質／薬物及びリン脂質／遊離コレステロール（ＰＬ／ＦＣ）比の影響を提供する。Ｍｙｏｃｅｔ様製剤（「Ｍｙｏｃｅｔ」、ドキソルビシン－クエン酸塩）及びＤｏｘｉｌ（登録商標）（ドキソルビシン－硫酸塩）との比較を行った。
シュウ酸塩含有、酒石酸塩含有、及びクエン酸塩含有リポソーム（ビヒクル）を調製し、方法及び節８．１に記載されているようにドキソルビシン塩酸塩を装填して１ｍｇ／ｍＬの最終濃度とした。様々な脂質／薬物及びリン脂質／遊離コレステロール（ＰＬ／ＦＣ）比を、リン脂質及び／または遊離コレステロールの相対量を調節することによって（表２８ｅ）及び／またはドキソルビシンを装填する前にリポソームをそれぞれ希釈することにより達成した。表２８ｅ～２８ｈにおいて、「脂質／薬物」は、ドキソルビシン装填リポソームの最終懸濁液中の総脂質のドキソルビシン遊離塩基に対する重量／重量（ｗ／ｗ）比を表す。「ＰＬ／ＦＣ」は、ドキソルビシン装填リポソームの最終懸濁液中のリン脂質（ＰＬ）の遊離コレステロール（ＦＣ）に対するｍｏｌ／ｍｏｌ比を表す。
市販のＤｏｘｉｌ（登録商標）及びＭｙｏｃｅｔ様（「Ｍｙｏｃｅｔ」）リポソームを比較として使用した。Ｍｙｏｃｅｔ様（「Ｍｙｏｃｅｔ」）リポソームは、６．９ｇのＰＣ及び２．８４ｇのＦＣ（５５／４５のモル比）を含有する脂質膜を１００ｍＬの０．３Ｍクエン酸（ｐＨ４．０）で６５℃で水和することによって調製した。微小流動化及びＴＦＦは、方法及び節８．１に記載されているように実施した。得られたリポソームを滅菌濾過した。１．９ｍＬのアリコートを採取し、Ｍｙｏｃｅｔの添付文書に記載されたプロトコルに従って７０℃で合計２５ｍＬの装填媒体中で５０ｍｇのドキソルビシンを装填した。詳細な製剤組成は表２８ｅに示されている。
Figure 2022172133000062
ドキソルビシン放出試験は、溶解媒体での２０倍（表２８ｆ）及び５０倍（表２８ｇ）希釈で行った。
Figure 2022172133000063
Figure 2022172133000064
対イオンの影響。表２８ｆ、２８ｇ、及び図１６～１７から、ドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームは、同じ（５０／１）脂質／薬物比で作製されたドキソルビシン－酒石酸塩含有及びドキソルビシン－クエン酸塩含有リポソームと比較した場合、２０倍及び５０倍希釈の両方で最も高いΔｐＨ（６．７／６．７／６．０／５．０）ドキソルビシン放出差を示したことが分かる。ドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームからのｐＨ依存性ドキソルビシン放出（表２８ｆ、２８ｇ、図１６、及び１７）及びドキソルビシン－酒石酸塩リポソームのわずかに少ない程度は、インビボで生じる生理的なｐＨ勾配（図１）に合致しており、我々のリポソーム伝達システムのｐＨ標的化能力を示していることは言及する価値がある。著しく低いΔｐＨ（６．７／６．７／６．０／５．０）ドキソルビシン放出差が「Ｍｙｏｃｅｔ」について２０倍及び５０倍希釈の両方で観察された（表２８ｆ、２８ｇ、図１６～１７）。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）のΔｐＨ（６．７／６．７／６．０／５．０）ドキソルビシン放出差はゼロに近かった（表２８ｆ、２８ｇ、図１６～１７）。
脂質／薬物比の影響。脂質／薬物比に対するΔｐＨ（６．７／６．７／６．０／５．０）ドキソルビシン放出差の依存性は、ドキソルビシン－シュウ酸塩リポソーム（５０／１の脂質／薬物比）のΔｐＨ放出差を２３／１及び／または１６／１の脂質／薬物比で作製されたドキソルビシン－シュウ酸塩リポソームのものと比較した場合、明確に見ることができる（表２８ｆ及び図１８；溶解媒体でのリポソームの２０倍希釈）。より少ない程度ではあるが、同様の依存性が、リポソーム材料の溶解媒体での５０倍希釈で観察された（表２８ｇ及び図１９）。低い（２３／１及び１６／１）脂質／薬物比で作製されたリポソームは希釈倍率（すなわち、２０倍または５０倍）に対して著しい依存性を示した一方で、より高い（５０／１）脂質／薬物比を有するリポソームは、両方の条件で本質的に同様の薬物放出を示したことは言及する価値がある（表２８ｆ、２８ｇ、及び図１６～１９）。低い（２３／１及び１６／１）脂質対薬物比で調製されたリポソームからのドキソルビシンのいくらかの漏出が５０倍希釈で観察された（表２８ｇ及び図１９）。
脂質／薬物比に対するΔｐＨ（６．７／６．７／６．０／５．０）ドキソルビシン放出差の著しい依存性は、２０倍及び５０倍希釈の両方において５０／１及び３．５／１の脂質／薬物比で作製されたドキソルビシン－クエン酸塩リポソームの比較から見ることができる（表２８ｆ、２８ｇ、及び図１６～１７）。
それ故、得られたデータは、いくつかの実施形態では、より高い脂質／薬物比がより高いΔｐＨ６．７／６．７、６．７／６．０、及び６．７／５．０ドキソルビシン放出差を達成することを示している。いくつかの実施形態では、より低い脂質／薬物比において、ドキソルビシン－シュウ酸塩、または酒石酸塩、または場合によりクエン酸塩の凝集体は、凝集体の溶解にマイナスの影響を与えるであろうより密集した繊維様構造を形成せざるを得なくなり得る。これらのデータはまた、いくつかの実施形態では、より高い脂質／薬物比がｐＨ感受性の、場合により無秩序な、ドキソルビシン凝集体の物理的状態に適応／支持することを示している。より低い脂質／薬物比の製剤で観察された中性ｐＨでのドキソルビシンの漏出は、少なくともいくつかの実施形態ではドキソルビシン装填リポソームの脂質二重層の表面張力の上昇及び完全性の損失につながるより低い脂質含有量に起因する可能性がある。
ＰＬ／ＦＣ（リン脂質／遊離コレステロール）比の影響。遊離コレステロール含有量は、リポソームの血清／血液安定性において潜在的に変換し得る単層リポソームの脂質二重層の剛性に影響を及ぼし得［５２、５３］、また、凍結乾燥された製品の更なる開発への道を切り開く可能性がある。増加したＦＣ含有量が、ΔｐＨ（６．７／６．７／６．０／５．０）ドキソルビシン放出差にマイナスに影響するかどうかを試験するために、ΔｐＨ放出差に対するＦＣ含有量、及びひいてはＰＬ／ＦＣ比の影響に関する実験を行った。表２８ｆ及び図１８（溶解媒体での２０倍希釈）において、ドキソルビシン－シュウ酸塩リポソームにおけるＦＣ含有量の増加及び３．６８から０．８６へのＰＬ／ＦＣ比のそれぞれの減少は、ｐＨ６．７での薬物放出の顕著な減少をもたらしたが、ｐＨ６．０及び５．０での放出は有意な影響を受けなかったことが分かる。
３．６８～１．２９のＰＬ／ＦＣ比を有するリポソームを使用して５０倍希釈（表２８ｇ及び図１９）で放出実験を実施した場合、ΔｐＨ（６．７／６．７／６．０／５．０）ドキソルビシン放出差に対するＦＣの顕著な影響は観察されなかった。ＰＬ／ＦＣ比＜１．０が２０倍及び５０倍希釈の両方でドキソルビシン放出の顕著な変化をもたらしたことは言及する価値がある（表２８ｆ及び２８ｇ）。
それ故、全体のデータは、いくつかの実施形態では、ドキソルビシン－シュウ酸塩リポソームのΔｐＨ（６．７／６．７／６．０／５．０）ドキソルビシン放出差が、放出実験が５０倍希釈で実施された場合、３．６８から１．２９へのＰＬ／ＦＣモル比の減少を高度に許容し得ることを示す。２０倍希釈では、３．６８から１．２９へのＰＬ／ＦＣモル比の減少は主にΔｐＨ（６．７／６．７）放出差に影響を及ぼしたが、ｐＨ６．０及び５．０ではドキソルビシン放出速度の有意な変化は観察されなかった。対照的に、３．６８から１．２２までのドキソルビシン－クエン酸塩リポソームのＰＬ／ＦＣモル比の減少は、全ｐＨ範囲にわたってΔｐＨ放出差の減少をもたらした（表２８ｆ、２８ｇ、及び図１６～１７）。
実施例８．４：シュウ酸塩または酒石酸塩、またはクエン酸塩含有リポソームへのドキソルビシンの低温装填。
この実施例は、（ｉ）ドキソルビシン－シュウ酸塩、ドキソルビシン－酒石酸塩の安定性に関する更なる特性化及び（ｉｉ）ヒト血清中のドキソルビシン－クエン酸塩含有リポソームを提供する。脂質／薬物及びリン脂質／遊離コレステロール（ＰＬ／ＦＣ）比の影響が示される。
方法及び節８．１に記載されているようにシュウ酸塩含有、酒石酸塩含有、及びクエン酸塩含有リポソーム（ビヒクル）を調製し、ドキソルビシン塩酸塩を１ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで装填した。様々な脂質／薬物及びリン脂質／遊離コレステロール（ＰＬ／ＦＣ）比は、リン脂質及び／または遊離コレステロールの相対量を操作することによって（表２８ｅ）、及び／またはドキソルビシンを装填する前にリポソームを適切に希釈することにより達成された。
市販のＤｏｘｉｌ（登録商標）及びＭｙｏｃｅｔ様（「Ｍｙｏｃｅｔ」）リポソームを比較として使用した。Ｍｙｏｃｅｔ様（「Ｍｙｏｃｅｔ」）リポソームは、６．９ｇのＰＣ及び２．８４ｇのＦＣ（５５／４５のモル比）を含有する脂質膜を１００ｍＬの０．３Ｍクエン酸（ｐＨ４．０）で６５℃で水和することによって調製した。微小流動化及びＴＦＦは、方法及び節８．１に記載されているように実施した。得られたリポソームを滅菌濾過した。１．９ｍＬのアリコートを採取し、Ｍｙｏｃｅｔの添付文書に記載されたプロトコルに従って７０℃で合計２５ｍＬの装填媒体中で５０ｍｇのドキソルビシンを装填した。詳細な製剤組成は表２８ｅに示されている。
血清安定性試験は、２．４５ｍＬ（５０倍希釈）のヒト血清に５０μＬのドキソルビシン装填リポソームを添加することによって、ヒト血清中のリポソーム材料の５０倍希釈（６０ｍｇ／ｍ２または１１０ｍｇ／７０ｋｇのヒト用量のドキソルビシンの投与をシミュレートする）で行った。Ｔ０試料を直ちに分析し、他の試料を３７℃で２、４、及び８時間インキュベートした。各時点において、無傷リポソームの蛍光（Ｆｉ）及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で破裂したリポソームの全蛍光（Ｆｔ）を測定した。データが表２８ｈに示されている。
Figure 2022172133000065
対イオンの影響。同じ（５０／１）脂質／薬物比で作製されたドキソルビシン－シュウ酸塩、－酒石酸塩、及び－クエン酸塩リポソームについて、ヒト血清中で同様の安定性が観察された（表２８ｈ）。このデータは、対イオンがヒト血清中の試験品の安定性を決定しないことを示している。血清中のＤｏｘｉｌ（登録商標）リポソームの顕著な安定性は、ペグ化された脂質の使用により達成されることは言及する価値がある［２～５、７～８］。
脂質／薬物比の影響。表２８ｈ及び図２０から、ドキソルビシン－シュウ酸塩リポソームの血清安定性は、脂質／薬物比の低下と共に低下することが分かる。≧５０／１の脂質／薬物比で作製されたドキソルビシン－シュウ酸塩リポソームの安定性は、２３／１及び１６／１の脂質／薬物比で作製されたドキソルビシン－シュウ酸塩リポソームと比較して著しく高い。同じ傾向は、５０／１及び３．５／１の脂質／薬物比で作製されたドキソルビシン－クエン酸塩リポソームの比較の際に観察された（表２８ｈ及び図２０）。これらのデータは、脂質／薬物比がリポソームの血清安定性に寄与し得ることを明確に示している。リポソームの血清安定性に対する脂質／薬物比の影響及びΔｐＨ（６．７／６．７／６．０／５．０）ドキソルビシン放出差に対するその影響は、いくつかの実施形態ではリポソーム送達システムの最適性能のためにより高い脂質／薬物比を使用する利点を示している。
ＰＬ／ＦＣ（リン脂質／遊離コレステロール）比の影響。ドキソルビシン－シュウ酸塩リポソームの血清安定性の更なる上昇は、ＦＣ含有量の増加及びその後のＰＬ／ＦＣ比の低下に伴って観察された（表２８ｈ及び図２１）。ＰＬ／ＦＣ比０．８６は、ヒト血清中のリポソームの最も高い保護を示したが、ΔｐＨ（６．７／６．７／６．０／５．０）ドキソルビシン放出差に対する０．８６のＰＬ／ＦＣ比の顕著なマイナスの影響が観察された（表２８ｆ及び２８ｇ）。得られたデータは、ドキソルビシン－シュウ酸塩リポソームについての最適ＰＬ／ＦＣ比が３．６８と１の間にあるであろうことを示唆している（表２８ｆ～２８ｈ、及び図２０～２１）。しかしながら、最適に近いＰＬ／ＦＣ比（１．２９）であるが５０／１未満の脂質／薬物比（すなわち、２３／１及び１６／１）のドキソルビシン－シュウ酸塩リポソームは、より低い血清安定性を示したことは言及する価値がある（表２８ｈ及び図２０）。これらのデータは、リポソーム血清安定性に対する脂質／薬物及びＰＬ／ＦＣ比の両方の寄与を示している。脂質／薬物とＰＬ／ＦＣ比との間の同様の関係は、ドキソルビシン－クエン酸塩リポソームについて観察された（（表２８ｈ、及び図２０）。マウス血清と同様にヒト血液も、ヒト血清と比較してリポソームに対してより少ない悪影響を示したことは言及する価値がある（データは示されていない）。
得られたデータは、いくつかの実施形態では、リポソームの血清安定性及びΔｐＨ（６．７／６．７／６．０／５．０）ドキソルビシン放出差の両方に対する脂質／薬物比及びＰＬ／ＦＣ比の影響を明確に示し、より高い脂質／薬物比及び３．６８未満であるが１．０より高いＰＬ／ＦＣ比の有益な影響を強調している。
全体として、得られたデータは、ドキソルビシン－シュウ酸塩リポソームが、「Ｍｙｏｃｅｔ」及びＤｏｘｉｌ（登録商標）と比較して著しく高いΔｐＨ（６．７／６．７／６．０／５．０）ドキソルビシン放出差を示すことを示している（表２８ｅ～２８ｇ及び図１６～１７）。ドキソルビシン－シュウ酸塩リポソームの血清安定性は、「Ｍｙｏｃｅｔ」のものよりも著しく高かった一方でＤｏｘｉｌ（登録商標）よりも低かったが、脂質／薬物比≧５０／１を維持しながらＰＬ／ＦＣ比を低下させることは、ドキソルビシン－シュウ酸塩リポソームの血清安定性を更に改善し、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）に幾分匹敵するものとする（表２８ｅ、２８ｈ、及び図２１）。リポソームのいくつかの物理的及び化学的特性、例えば、サイズ、脂質組成、電荷、及び表面コーティングは、小胞のクリアランス薬物動態に影響を及ぼす血漿タンパク質とのそれらの相互作用を決定することが知られている［５３］。そのため、本明細書の開示によるリポソーム送達システムのインビボ薬物動態（すなわち、血漿濃度－時間曲線下の面積、排出半減期など）が血清性能を反映している場合（すなわち、ＭｙｏｃｅｔｏとＤｏｘｉｌ（登録商標）との間で）、それは非常に望ましい結果であろう。
実施例９：一定の（５０：１）脂質／薬物比のリポソームへのドキソルビシンの低温装填：アスコルビン酸（ＡＡ）、またはＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、アスコルビルパルミテート（ＡＰ）、ユビキノン（ＣｏＯ１０）、またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のアンモニウム－シュウ酸塩及び／または酒石酸塩水和媒体への添加。
使用した水和媒体：アンモニウム－シュウ酸塩の３００ｍＭの溶液；まず酒石酸を水酸化アンモニウムでｐＨ４．８～５．０に滴定し、次いで水和媒体として使用した。
ＮＡＣ、またはＡＡ、またはＡＰ、またはＣｏＱ１０、またはＥＤＴＡを３００ｍＭのアンモニウム－シュウ酸塩水和媒体に添加して最終濃度１００ｍＭ（ＮＡＣ）、または３６及び１００ｍＭ（ＡＡ）、２ｍＭまたは２０ｍＭ（ＡＰ）、１ｍＭ（ＣｏＱ１０）、２ｍＭまたは２０ｍＭ（ＥＤＴＡ）としたこと以外は方法の節に記載されているようにリポソームを調製した。
リポソームへのドキソルビシンの低温装填は次のように実施した：ドキソルビシン塩酸塩の生理食塩水溶液（６ｍｇ／ｍＬ）を室温でリポソームナノ懸濁液に添加して最終濃度１ｍｇ／ｍＬ（すなわち、１ｍＬ当たり０．９３６ｍｇのドキソルビシン遊離塩基）とし、穏やかに反転させ（２～３回）、室温で１０～２０分間インキュベートした。室温での１０～２０分のインキュベートの後、混合物をａ）６％のスクロースを含有するｐＨ６．７のＰＢＳで別のＴＦＦの５回のサイクルに供し、及び／またはｂ）２～８℃の冷凍庫内に１６時間配置し、次いで６％のスクロースを含有するｐＨ６．７のＰＢＳで別のＴＦＦの５回のサイクルに供した。室温で、または室温に続いて２～８℃で一晩のインキュベートで装填されたリポソームのドキソルビシン放出プロファイル間で観察された顕著な差はなかった。室温に続いて２～８℃で一晩インキュベートした場合のデータは示されていない。
製剤組成が表２９に示されている。
Figure 2022172133000066
粗懸濁液を調製し、１０ＫＰＳＩの処理圧力でＭＦ処理した。９～１５分のＭＦ処理の後、粒子サイズ（Ｚ平均）は約６０～７５ｎｍに達した。試料を収集し、Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ内に滅菌濾過した。濾過したナノ懸濁液の粒子サイズを測定した（表２９ａ）。
Figure 2022172133000067
リポソームをＴＦＦに供し、続いてドキソルビシンの遠隔装填及びＰＢＳスクロースでの別のＴＦＦサイクルに供した。
ドキソルビシン装填リポソームの粒子サイズが表２９ｂに示されている。
Figure 2022172133000068
遊離（封入されていない）ドキソルビシンの量を製造から１週間以内に測定した（表２９ｃ）。
Figure 2022172133000069
リポソーム懸濁液中のドキソルビシンの測定。続いてドキソルビシン装填リポソーム懸濁液を５回のＴＦＦに供して遊離（封入されていない）ドキソルビシンを大部分除去した。Ｔ０（ＭＦＤから１週間以内）での総ドキソルビシン濃度を測定するために、ＴＦＦ洗浄リポソームをメタノールまたはＩＰＡで希釈し、ＨＰＬＣ分析に供した。ドキソルビシン含有量、回収率（遠隔装填に使用されたドキソルビシン遊離塩基濃度に対するリポソーム懸濁液中のドキソルビシン含有量）、及び封入効率（％）が表２９ｄに示されている。封入効率（％）は、ドキソルビシン回収率（％）と遊離ドキソルビシン（％）との間の差を表す。
Figure 2022172133000070
製造後１週間以内に、リポソームドキソルビシン放出試験を３７℃で行った（表２９ｅ）。各試料についてドキソルビシン放出を２、４及び８時間の時点で測定した。
Figure 2022172133000071
アスコルビン酸またはＮＡＣの存在下または非存在下でのドキソルビシン封入の効率は８０～９７％の範囲内であった（表２９ｄ）。アンモニウム－シュウ酸塩水和媒体へのアスコルビン酸またはＮＡＣの添加は、シュウ酸塩または酒石酸塩単独で形成されたリポソームと比較してリポソーム±ドキソルビシンの粒子サイズ（表２８９及び２９ｂ）、遊離（封入されていないまたは漏出した）ドキソルビシン（表２９ｃ）、及びより重要なことにはドキソルビシン放出プロファイル（表２９ｅ）に有意な影響を及ぼさなかった（表２９ａ～ｅ）。
２ｍＭまたは２０ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭまたは２０ｍＭのＡＰ、または１ｍＭのＣｏＱ１０の添加は、空のまたはドキソルビシン装填リポソームの粒子サイズ（表２９ａ及び２９ｂ）、遊離ドキソルビシン（２９ｃ）、及び封入効率（表２９ｄ）に対していかなる有意な影響も及ぼさなかった。
２ｍＭのＡＰ（ＡＰ／シュウ酸塩－１：１５０）または１ｍＭのＣｏＱ１０（ＣｏＱ１０／シュウ酸塩－１：３００）でのシュウ酸塩の補完は、ドキソルビシン放出プロファイルに影響を及ぼさなかった（表２９ｅ）。２０ｍＭのＡＰ（ＡＰ／シュウ酸塩－１：１５）を添加するとドキソルビシン放出のいくらかの減少が観察されたが、ΔｐＨ６．７／５．０放出差は十分に高かった（表２９ｅ）。
２ｍＭのＥＤＴＡ（１：１５０の比でのシュウ酸塩／ＥＤＴＡ）でのシュウ酸塩の補完は、ドキソルビシン放出プロファイルに影響を及ぼさなかった（表２８ｅ）。２ｍＭのＥＤＴＡを３００ｍＭの酒石酸塩（酒石酸塩／ＥＤＴＡ－１：１５０）水和媒体に添加した場合、ドキソルビシン放出の顕著な減少が観察されたが（表２９ｅ）、ΔｐＨ６．７／５．０放出差は十分に高かった。対照的に、２０ｍＭのＥＤＴＡを３００ｍＭのシュウ酸塩または酒石酸塩のいずれかの水和媒体に添加した場合、非常に低いドキソルビシンの放出が観察された（表２９ｅ）。
これらの知見は、処理中の酸化ストレスを軽減するために、アスコルビン酸、及び／またはＮＡＣ、及び／またはアスコルビルパルミテート、及び／またはＣｏＱ１０、及び／またはＥＤＴＡをシュウ酸塩または酒石酸塩（いくつかの実施形態で好ましい対イオン）またはクエン酸塩と組み合わせて使用することを可能し、より長い保管期間を有するより安定な製品をもたらし得る。その上、アスコルビン酸は、ドキソルビシンで誘発される心臓毒性を予防または軽減するための心臓保護効果を発揮することができる［２８～２９、及び３３］。実施形態では、これは、非拘束型の薬物で誘発される心臓反応性酸素代謝に由来し得る［２８～２９］。調査は、ドキソルビシンでの治療後の電子移動が心臓において著しく向上し、ドキソルビシンからの心臓損傷の２つの主要な部位であるミトコンドリア及び筋小胞体におけるスーパーオキシドアニオン及び過酸化水素の形成の実質的な増加につながることを示してきた［２８、３０～３１］。ビタミンＣ（アスコルビン酸）は、反応性酸素種を生成する抗腫瘍薬の効果に拮抗することが示されている抗酸化性ビタミンである［２９、３２～３３］。また、ＮＡＣの薬理学的投薬量での実験動物の治療は、ドキソルビシンの毒性から心臓を選択的に救うことが示されている［２８、２９、３４］。ＥＤＴＡなどのキレート剤は、遷移金属イオンをキレート化することによって反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成を低減し得、そのため心筋細胞膜に対する損傷及びドキソルビシン関連心筋症のリスクを減少させ得る［３６、３７］。その上、ＥＤＴＡは、金属で触媒される脂質酸化を阻害することによってリポソーム製剤の安定性を上昇させ得る。
それ故、シュウ酸塩または酒石酸塩（いくつかの実施形態で好ましい対イオン）またはクエン酸塩のアスコルビン酸（ＡＡ／シュウ酸塩－１：８または１：３）、及び／またはＮＡＣ（ＮＡＣ／シュウ酸塩－１：３）、及び／またはＡＰ（ＡＰ／シュウ酸塩－１：１５０または１：１５）、及び／またはＣｏＱ１０（ＣｏＱ１０／シュウ酸塩－１：３００）、及び／またはＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ／シュウ酸塩１：１５０）での補完は、ΔｐＨ６．７／５．０ドキソルビシン放出差に対して大幅なマイナスの影響を及ぼさなかった。そのため、最適化されたΔｐＨ６．７／５．０放出差及び抗酸化剤（複数可）／キレート剤のこの強力な組み合わせは、がん患者にとって有効であり得、遊離ドキソルビシンの心毒性作用の軽減に有利であり得る。使用され得るシュウ酸塩または酒石酸塩またはクエン酸塩に対するアスコルビン酸またはＮＡＣの他の比は１：１０～１：１を含む。使用され得るシュウ酸塩または酒石酸塩またはクエン酸塩に対するＡＰの他の比は１：３００～１：１０を含む。使用され得るシュウ酸塩または酒石酸塩またはクエン酸塩に対するＣｏＱ１０の他の比は１：３００～１：１０を含む。使用され得るシュウ酸塩または酒石酸塩またはクエン酸塩に対するＥＤＴＡの他の比は１：３００～１：５を含む。
キレート剤（例えば、アスコルビン酸（ＡＡ）、またはＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、アスコルビルパルミテート（ＡＰ）、ユビキノン（ＣｏＱ１０）、またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））の対イオン（例えば、シュウ酸塩、酒石酸塩またはクエン酸塩）に対する比、すなわち、キレート剤／対イオン比は、約１：１～約１：１０，０００であり得る。
それ故、実施形態では、ＡＡ／シュウ酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。実施形態では、ＮＡＣ／シュウ酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。実施形態では、ＡＰ／シュウ酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。実施形態では、ＣｏＱ１０／シュウ酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。実施形態では、ＥＤＴＡ／シュウ酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。
実施形態では、ＡＡ／酒石酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。実施形態では、ＮＡＣ／酒石酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。実施形態では、ＡＰ／酒石酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。実施形態では、ＣｏＱ１０／酒石酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。実施形態では、ＥＤＴＡ／酒石酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。
実施形態では、ＡＡ／クエン酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。実施形態では、ＮＡＣ／クエン酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。実施形態では、ＡＰ／クエン酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。実施形態では、ＣｏＱ１０／クエン酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。実施形態では、ＥＤＴＡ／クエン酸塩の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：８、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：５００、約１：１０００、約１：２０００、約１：５０００、約１：１０，０００またはそれ以上であり得る。
有利であり得るか、及び／またはシュウ酸塩及び／または酒石酸塩と組み合わせて使用され得る他の対イオン及び／または抗酸化剤、及び／またはキレート剤には、クエン酸塩、及び／またはフィチン酸塩、及び／またはグルタチオン、及び／またはビタミンｅ、及び／またはデクスラゾキサン、及び／またはデフェロキサミンが含まれる。
全体として、得られたデータは、ドキソルビシン装填リポソームの最適なｐＨ依存性薬物放出プロファイル及び安定性能のために、
ａ）リポソーム内ドキソルビシン凝集体の物理的状態ならびに最適なΔｐＨ６．７／５．０及びΔｐＨ６．７／６．７／６．０／５．０放出差を決定するシュウ酸塩及び酒石酸塩などの適切な対イオン；
ｂ）ｐＨ変化に対する選択的反応のための脂質／薬物比（いくつかの実施形態では好ましい範囲は２０：～５０：１である）；
ｃ）ドキソルビシン装填温度（ΔｐＨ６．７／５．０及びΔｐＨ６．７／６．７／６．０／５．０放出差を最大にするための低温装填の利点）；
の影響を示した。
その上、好ましい対イオン（複数可）の他の対イオン、及び／または抗酸化剤、及び／またはキレート剤での補完は、最終生成物の安定性及びその生物学的性能にとって有益であり得る。
実施例１０：イリノテカン
方法：
蛍光分析
全ての分析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭの蛍光プレートリーダーを使用して実施した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアがデバイスを制御し、値の分析及び報告に使用された。
イリノテカン塩酸塩の標準ストック溶液を注射用滅菌水中の６％スクロース溶液中で調製した（例えば、６％のスクロースを含有する１ｍＬの水中に６．０ｍｇのイリノテカン塩酸塩粉末）。較正標準は、分析のための標的濃度を括るために、ストック溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．７及び５．０）に希釈することによって調製した。プレートリーダーの温度を２５℃に設定し、励起及び発光波長をそれぞれ３７０ｎｍ及び４７０ｎｍに設定した。線形応答範囲は、０．５～４μｇ／ｍＬのイリノテカン塩酸塩であると決定された。線形応答範囲内に留まるために、イリノテカン塩酸塩較正標準及び試料をそれに応じて希釈した。
リポソーム製剤中の総イリノテカンの蛍光（Ｆｔ）を決定するために、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を最終濃度１％まで添加することによってリポソームを破裂させ、反転によって混合し、定量化の前に５～１０分間インキュベートした。
リポソーム内イリノテカンの蛍光（Ｆｉ）を決定するために、リポソーム製剤をＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で前処理することなく蛍光分析に供した。
リポソーム製剤からのイリノテカン放出の定量化
蛍光消光技術を用い、それを蛍光（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で破裂したリポソーム）に中継する方法は、イリノテカン放出の測定に使用されてきた。このアプローチは、イリノテカンの蛍光がリポソームへの封入の際に消光し、リポソームからのイリノテカン放出の際に著しく増加するという事実に基づく。そのため、溶解媒体中での試料のインキュベート中の無傷リポソームの蛍光（Ｆｉ）の増加は、媒体へのイリノテカンの放出を表す。異なる時点とＴ０との間のＦｉ値の差は、Ｆｔ（破裂したリポソームの蛍光）に中継され、放出された薬物の割合を表す。
試験は次の時点で行った：Ｔ０、Ｔ２時間、Ｔ４時間、及びＴ８時間。個々の試料を２つの別々の希釈剤／溶解媒体；ｐＨ６．７のＰＢＳ及びｐＨ５のＰＢＳで２０倍（例えば、１００μＬの試料＋１．９ｍＬの希釈剤）に希釈して、マウスへの静脈内注射をシミュレートした。Ｔ０時点の測定のために、リポソーム製剤を約２５℃でＰＢＳのｐＨ６．７及びｐＨ５の緩衝液に希釈した。無傷リポソームの蛍光（Ｆｉ）及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で破裂したリポソームの全蛍光（Ｆｔ）を直ちに（１０分以内に）測定した。プレートリーダーの温度を２５℃に設定し、励起及び発光波長をそれぞれ３７０ｎｍ及び４７０ｎｍに設定した。
他のリポソーム試料を、（インビボ温度をシミュレートするために）３７℃に事前に温められたＰＢＳのｐＨ６．７及びｐＨ５の緩衝液で２０倍に希釈し、３７℃で２、４、及び８時間インキュベートした。各時点において、無傷リポソームの蛍光（Ｆｉ）及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で破裂したリポソームの全蛍光（Ｆｔ）を測定した。薬物放出の割合は、［（Ｆｉ＿ｎ－Ｆｉ＿ｔ０）／Ｆｔ＿平均）］＊１００％（式中、Ｆｉ＿ｎ－２、４、または８時間で測定されたＦｉ、Ｆｉ＿ｔ０－Ｔ０で測定されたＦｉ、及びＦｔ＿平均－Ｔ０時点について決定されたＦｔ値の平均）として定量化した。
全蛍光（Ｆｔ）がｐＨ６．７でのリポソームの８時間のインキュベートにわたって有意に増加したことは言及する価値がある。この見解は、報告された中性媒体中でのイリノテカンのカルボキシレート形態への変換と一致していた［２６～２７］。
粒子サイズの測定
全ての分析は、６３３ｎｍの波長及び１７３°の検出角度で作動する４ｍＷのＨｅ－Ｎｅレーザーを有するＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して実施した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアがデバイスを制御し、値の分析及び報告に使用された。
強度平均粒径（Ｚ平均）は、ＩＳＯ１３３２１（国際標準化機構１９９６）で定義されているようにキュムラント分析から計算した。
１．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．７）中の３０μＬのリポソーム製剤を使用して試料を調製し、分析前に２５℃に平衡化した。サイズ測定は各試料について三重に行った。
ｐＨ測定
全ての分析は、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＩｎＬａｂ ｐＨ微小電極を有するＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＳｅｖｅｎＣｏｍｐａｃｔ ｐＨメーターを使用して実施した。
リポソームの調製：粗懸濁液の調製
粗懸濁液は、ＰＣ、ＤＭＰＣ、ＦＣ、及びＰ１８８を表２９に示される比で１０ｍＬのＤＣＭに溶解することによって調製した。粘稠な膜が形成されるまで、混合物を窒素流下で乾燥させた。膜を真空オーブン内で一晩更に乾燥させた。翌日、乾燥した脂質膜を、６５℃に事前に温めた３００ｍＭのアンモニウム－シュウ酸塩、またはアンモニウム－硫酸塩、またはアンモニウム－リン酸塩、またはアンモニウム－クエン酸塩緩衝液で水和し、直ちにハンドヘルドホモジナイザーで２～３分間ホモジナイズした。まず酒石酸をＮＨ４ＯＨでｐＨ４．８～５．０に滴定し、次いで水和媒体として使用した。粗懸濁液の粒子サイズを測定したところ、常に８００～１２００ｎｍの範囲内であった。
ＭＦ処理
異なって特定されない限り、ＭＦ処理体積は常に１００ｍｌであった。ＭＦ処理圧力は常に１０ＫＰＳＩであった。制御された（≦６５℃）温度でのリサイクルモード（材料の供給容器への戻し）で粗懸濁液の微小流動化を実施した。処理時間は９～１２分の範囲内であった。標的粒子サイズは６０～７０ｎｍであった（Ｚ平均）。
接線流濾過
半透明のナノ懸濁液を微小流動化機から採取し、１５～２０倍の体積のｐＨ６．７のＰＢＳで接線流濾過（ＴＦＦ）に供した。ＴＦＦの目的は、アンモニウム－シュウ酸塩、またはアンモニウム－硫酸塩、またはアンモニウム－リン酸塩、アンモニウム－クエン酸塩またはアンモニウム－酒石酸塩の外部緩衝液をＰＢＳに置き換えること、及びリポソーム内空間からアンモニウムを大部分除去することであった。外部緩衝液中のアンモニウムはアンモニウム特異電極を使用することによって測定した。外部緩衝液中のアンモニウム濃度が≦３ｍＭであった場合にＴＦＦを停止した。
イリノテカンの遠隔装填
イリノテカン塩酸塩を６％のスクロースを含有する注射用滅菌水に溶解して最終濃度６ｍｇ／ｍＬとした。イリノテカン塩酸塩の溶液を室温でリポソームナノ懸濁液に添加して最終濃度１ｍｇ／ｍＬ（例えば、１ｍＬ当たり０．９４ｍｇのイリノテカン遊離塩基）とし、２～８℃での一晩のインキュベートをしてまたはせずに１０～３０分間室温でインキュベートし、次いで６％のスクロースを含有するｐＨ６．７のＰＢＳで別のＴＦＦの５回のサイクルに供した。このＴＦＦサイクルの目的は、遊離（封入されていない）イリノテカンを洗い流すことであった。室温で、または室温に続いて２～８℃で一晩のインキュベートで装填されたリポソームのイリノテカン放出プロファイル間で観察された顕著な差はなかった。室温に続いて２～８℃で一晩インキュベートした場合のデータは示されていない。
次いでリポソームナノ懸濁液を０．２２uｍのフィルターを介して滅菌Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ内に滅菌濾過した。粒子サイズ、ｐＨ、Ｆｉ、Ｆｔ、及びイリノテカン放出プロファイルを決定した。滅菌ナノ懸濁液を２ｍＬの事前に滅菌したバイアルに無菌的に分注し、栓をし、密封した。バイアルを２～８℃で保存した。
実施例１１：一定の（５０：１）脂質／薬物比のリポソームへのイリノテカンの低温装填。
この実施例では、５０：１の脂質／薬物比のリポソームへのドキソルビシンの装填を促進する能力を示した対イオンを使用した。
使用した水和媒体：３００ｍＭのアンモニウム－硫酸塩、アンモニウム－シュウ酸塩、アンモニウム－リン酸塩、アンモニウム－クエン酸塩。
まず酒石酸を水酸化アンモニウムでｐＨ５に滴定し、次いで水和媒体として使用した。
低温遠隔装填は、１ｍｇ／ｍＬ（すなわち、１ｍＬ当たり０．９４ｍｇのイリノテカン遊離塩基）のイリノテカン塩酸塩で行った。製剤組成が表３０に示されている。全ての製剤は５０：１の一定の脂質／薬物比で調製した（表３０）。
Figure 2022172133000072
粗懸濁液を調製し、１０ＫＰＳＩの処理圧力でＭＦ処理した。９～１２分のＭＦ処理の後、粒子サイズ（Ｚ平均）は約６０～６５ｎｍに達した。試料を収集し、Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ内に滅菌濾過した。濾過したナノ懸濁液の粒子サイズを測定した（表３１）。
Figure 2022172133000073
リポソームをＴＦＦに供し、続いてイリノテカンの遠隔装填、及び６％のスクロースを含有するＰＢＳでのイリノテカン装填リポソームの更なるＴＦＦサイクルに供した。遠隔装填に使用されたイリノテカン塩酸塩の濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ（イリノテカン遊離塩基濃度：０．９４ｍｇ／ｍＬ）。
イリノテカン装填リポソームの粒子サイズが表３２に示されている。
Figure 2022172133000074
続いてイリノテカン装填リポソーム懸濁液を５回のＴＦＦに供して遊離（封入されていない）イリノテカンを大部分除去した。Ｔ０（ＭＦＤから１週間以内）でのリポソームイリノテカン濃度を測定するために、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を最終濃度１％まで添加することによってＴＦＦ洗浄リポソームを破裂させ、反転によって混合し、蛍光分析による定量化の前に５～１０分間インキュベートした。イリノテカン含有量及び回収率（遠隔装填に使用されたイリノテカン遊離塩基濃度に対するリポソーム懸濁液中のイリノテカン含有量）が表３３に示されている。
Figure 2022172133000075
製造後１週間以内に、リポソームイリノテカン放出試験を３７℃で行った（表３４）。各試料についてイリノテカン放出を２、４及び８時間の時点で測定した。
Figure 2022172133000076
粒子サイズ。表３１から、異なるリポソーム製剤の微小流動化が同様の粒子サイズをもたらしたことが分かる。イリノテカン装填は、調製された製剤のいずれについても粒子サイズの有意な増加をもたらさなかった（表３１～３２）。
リポソームイリノテカン含有量。対イオンとして硫酸塩を使用した場合、１００％の回収率が観察された（表３３）。興味深いことに、ドキソルビシン含有リポソームについて同様の傾向が観察された（表９）。ＰＢＳ（ｐＨ６．７）での５回のＴＦＦ後のリポソームイリノテカンの約１００％の回収率は、封入されたイリノテカンの漏出がないことを強く示唆している。
リポソームイリノテカン放出速度。薬物放出試験はＭＦＤ後１週間以内に行った。イリノテカンは中性ｐＨで非常に不安定であり、中性媒体中でカルボキシレート形態に迅速に転化するので［２６～２７］、放出実験はｐＨ５でのみ行った。表３４から、シュウ酸塩または酒石酸塩を対イオンとして使用した場合、ｐＨ５でのイリノテカン放出速度は約１００％に達し、２～４時間の時点でプラトーになったことが分かる。クエン酸塩を対イオンとして使用した場合、酸性ｐＨでの放出はより緩やかであり、４～８時間で７０％に達した。硫酸塩及びリン酸塩を有する製剤は、ｐＨ５で非常に低い放出を示した（表３４及び図２２）。全体として、リポソームイリノテカン含有量及びｐＨ５でのその放出について得られたデータは、シュウ酸塩、または酒石酸塩、またはクエン酸塩を対イオンとして使用した場合に達成された高いΔｐＨ６．７／５．０放出差を示している。
興味深いことに、硫酸塩、リン酸塩、またはクエン酸塩含有リポソームからのドキソルビシンまたはイリノテカンのいずれかのその放出は、対応する対イオンのｐＫａ１値に対する依存性を示した（図１５及び１６）。しかしながら、シュウ酸塩または酒石酸塩（いくつかの実施形態で好ましい対イオン）含有リポソームからのドキソルビシンまたはイリノテカンのいずれの放出も、試験された対イオンのｐＫａ１値と合致しなかった（図１５及び１６）。これらのデータは、ドキソルビシン－シュウ酸塩及び／または酒石酸塩ならびにイリノテカン－シュウ酸塩及び／または酒石酸塩のリポソーム内凝集体の独特の物理的状態のドキソルビシンまたはイリノテカン放出プロファイルに対する寄与を強く示唆しており、ドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームのｃ＿ＴＥＭ分析と一致している。
全体として、イリノテカンリポソームについて得られたデータは、ドキソルビシンについて得られた結果とよく一致しており、好ましい脂質／薬物比でのシュウ酸塩及び酒石酸塩対イオンの効果を裏付けている。それ故、いくつかの実施形態では、シュウ酸塩または酒石酸塩対イオンをイリノテカンの送達に使用することができる。そのデータはまた、いくつかの実施形態ではイリノテカンのための対イオンとしてのクエン酸塩の使用を示唆している。
実施例１２：ミトキサントロン
方法。
リポソーム製剤からのミトキサントロン放出
試験は次の時点で３７℃で行った：Ｔ０及びＴ２４時間。個々の試料を２つの別々の希釈剤／溶解媒体；ｐＨ６．７のＰＢＳ及びｐＨ５のＰＢＳで２０倍（例えば、１００μＬの試料＋１．９ｍＬの希釈剤）に希釈して、マウスへの静脈内注射をシミュレートした。Ｔ０時点のため、リポソーム製剤を約２５℃でＰＢＳのｐＨ６．７及びｐＨ５の緩衝液に希釈した。
他のリポソーム試料を、（インビボ温度をシミュレートするために）３７℃に事前に温められたＰＢＳのｐＨ６．７及びｐＨ５の緩衝液で２０倍に希釈し、３７℃で０及びＴ２４時間インキュベートした。各時点で、リポソームからのミトキサントロンの放出を目視観察によって評価した：ミトキサントロンのＰＢＳ／生理食塩水溶液は強い青色を有し、それはリポソームへの封入時に紫色に変わる。リポソームからのミトキサントロンの放出は、紫色から青色への色の変化をもたらす。
粒子サイズの測定
全ての分析は、６３３ｎｍの波長及び１７３°の検出角度で作動する４ｍＷのＨｅ－Ｎｅレーザーを有するＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して実施した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアがデバイスを制御し、値の分析及び報告に使用された。
強度平均粒径（Ｚ平均）は、ＩＳＯ１３３２１（国際標準化機構１９９６）で定義されているようにキュムラント分析から計算した。
１．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．７）中の３０μＬのリポソーム製剤を使用して試料を調製し、分析前に２５℃に平衡化した。サイズ測定は各試料について三重に行った。
ｐＨ測定
全ての分析は、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＩｎＬａｂ ｐＨ微小電極を有するＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＳｅｖｅｎＣｏｍｐａｃｔ ｐＨメーターを使用して実施した。
粗懸濁液の調製
粗懸濁液は、ＰＣ、ＤＭＰＣ、ＦＣ、及びＰ１８８を表３４に示される比で１０ｍＬのＤＣＭに溶解することによって調製した。粘稠な膜が形成されるまで、混合物を窒素流下で乾燥させた。膜を真空オーブン内で一晩更に乾燥させた。翌日、乾燥した脂質膜を、６５℃に事前に温めた３００ｍＭのアンモニウム－シュウ酸塩緩衝液で水和し、直ちにハンドヘルドホモジナイザーで２～３分間ホモジナイズした。粗懸濁液の粒子サイズを測定したところ、常に８００～１２００ｎｍの範囲内であった。
ＭＦ処理
異なって特定されない限り、ＭＦ処理体積は常に１００ｍｌであった。ＭＦ処理圧力は常に１０ＫＰＳＩであった。制御された（≦６５℃）温度でのリサイクルモード（材料の供給容器への戻し）で粗懸濁液の微小流動化を実施した。処理時間は９～１２分の範囲内であった。標的粒子サイズは６０～７０ｎｍであった（Ｚ平均）。
接線流濾過
半透明のナノ懸濁液を微小流動化機から採取し、１５～２０倍の体積のｐＨ６．７のＰＢＳで接線流濾過（ＴＦＦ）に供した。ＴＦＦの目的は、アンモニウム－シュウ酸塩の外部緩衝液をＰＢＳに置き換えること及びリポソーム内及び外部空間からアンモニウムを主に除去することであった。外部緩衝液中のアンモニウムはアンモニウム特異電極を使用することによって測定した。外部緩衝液中のアンモニウム濃度が≦３ｍＭであった場合にＴＦＦを停止した。
ミトキサントロンの遠隔装填
ミトキサントロン塩酸塩を生理食塩水に溶解して最終濃度６ｍｇ／ｍＬとした。ミトキサントロン塩酸塩の生理食塩水溶液をｐＨ６．７のＰＢＳ中のリポソームナノ懸濁液に添加して最終濃度１ｍｇ／ｍＬとし、室温で３０分間インキュベートし、２～８℃で放置した。２～８℃で１６時間のインキュベートの後、混合物を６％のスクロースを含有するｐＨ６．７のＰＢＳで別のＴＦＦの５回のサイクルに供した。このＴＦＦサイクルの目的は、遊離（封入されていない）ミトキサントロンを除去することであった。
次いでリポソームナノ懸濁液を０．２２μｍのフィルターを介して滅菌Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ内に滅菌濾過した。粒子サイズ及びｐＨを測定した。滅菌ナノ懸濁液を２ｍＬの事前に滅菌したバイアルに無菌的に分注し、栓をし、密封した。バイアルを２～８℃で保存した。
実施例１３：一定の（５０：１）脂質／薬物比のリポソームへのミトキサントロンの低温装填。
シュウ酸塩は、５０：１の脂質／薬物比のリポソームへのドキソルビシン及びイリノテカンの装填を促進する能力を示した。そのため、この実施例ではシュウ酸塩を使用した（表３５）。
Figure 2022172133000077
粗懸濁液を調製し、１０ＫＰＳＩの処理圧力でＭＦ処理した。９～１２分のＭＦ処理の後、粒子サイズ（Ｚ平均）は約６０～７０ｎｍに達した。試料を収集し、Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ内に滅菌濾過した。濾過したナノ懸濁液の粒子サイズを測定した（表３６）。
Figure 2022172133000078
リポソームをＴＦＦに供し、続いてミトキサントロンの遠隔装填及びＰＢＳスクロースでの別のＴＦＦサイクルに供した。遠隔装填に使用されたミトキサントロン塩酸塩の濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ
ミトキサントロン装填リポソームの粒子サイズが表３７に示されている。
Figure 2022172133000079
製造後１週間以内にリポソームミトキサントロン放出試験を行った。各時点（０及び２４時間）で、リポソームからのミトキサントロンの放出を目視観察によって評価した。リポソームからのミトキサントロン放出がドキソルビシン及びイリノテカンと比較して著しく遅かったことは言及する価値がある。
ミトキサントロン放出試験は２４時間継続したので、リポソームの完全性が損なわれなかったことを証明するためにインキュベートした試料の粒子サイズをＴ０及びＴ２４で測定した。表３７から、２０倍に希釈した試料を３７℃で２４時間インキュベートした後に観察された粒子サイズまたは凝集の劇的な変化はなかったことが分かる。
Figure 2022172133000080
論述
粒子サイズ。表３６及び３７から、ミトキサントロンの微小流動化及び装填は、ドキソルビシン（表１６及び１７）及びイリノテカン（表３１及び３２）に匹敵する同様の粒子サイズをもたらしたことが分かる。
リポソームミトキサントロン放出。薬物放出試験は、ＭＦＤ後１週間以内に行われた。ミトキサントロンのＰＢＳ／生理食塩水溶液が強い青色を有し、それがリポソームへの封入時に紫色に変化することは言及する価値がある。図２３Ａから、Ｔ０ではミトキサントロンの色は、ｐＨ６．７及び５の両方において、封入されたミトキサントロンを示す紫色のままであることが分かる。シュウ酸塩を対イオンとして使用した場合、試料の色はｐＨ５．０で２４時間後に青色に変化した一方で、それはｐＨ６．７で紫色のままであった（図２３Ｂ）。これらのデータは、ｐＨ５．０でのリポソームからのミトキサントロンの放出及びｐＨ６．７での放出の非存在を示している。
それ故、全体の得られたデータは、少なくともいくつかの実施形態で最適なΔｐＨ６．７／５．０放出差をもたらすリポソーム内ドキソルビシン凝集体の優先的物理的状態についてのシュウ酸塩及び酒石酸塩対イオン、脂質／薬物比、及び薬物装填条件の影響を示している。全てのこれらの要因は、腫瘍部位への弱塩基化学療法剤の効率的なｐＨ標的化送達に寄与し得る。
実験の知見の要約
実施形態では、弱塩基とリポソーム内医薬塩凝集体を形成し得る適切な対イオンのシュウ酸塩及び酒石酸塩（例えば、いくつかの実施形態で好ましい対イオン）、適切な脂質／薬物比（例えば、いくつかの実施形態で好ましい範囲２０：１～６５：１）、及びＰＬ／ＦＣ比（例えば、いくつかの実施形態で好ましい範囲１／１～４／１）を特定して、中性と酸性のｐＨとの間の薬物放出差を最大化し、腫瘍部位への弱塩基化学療法剤（様々な分子標的用）の最適なｐＨ標的化送達のための血清／血液中のリポソーム安定性を増加させる。シュウ酸塩または酒石酸塩含有リポソームと、他の試験された対イオンとの間のインビトロ特性の著しい差は、温度及びｐＨに応じてそれらの溶解を明らかに促進するリポソーム内ドキソルビシン－シュウ酸塩または酒石酸塩の凝集体の物理的状態（複数可）の独自性を強く示唆している。
１５種の試験された対イオンから５種のみ（硫酸塩、シュウ酸塩、リン酸塩、酒石酸塩、及びクエン酸塩）が、ドキソルビシンの遠隔装填及び安定なドキソルビシン－塩含有リポソームの形成を促進した。他の１０種の試験された対イオンは、リポソームへのドキソルビシンの装填をもたらさず、２～８℃で一晩の保存中にリポソーム材料の沈殿を引き起こした。
実施形態では、シュウ酸塩及び酒石酸塩のみが、３７℃（体温）において望ましいｐＨ依存性薬物放出プロファイル（ΔｐＨ６．７／５．０またはΔｐＨ６．７／６．７／６．０／５．０放出差）を有するドキソルビシン含有リポソームをもたらしたことは驚くべき知見であった。そのため、いくつかの実施形態ではシュウ酸塩及び酒石酸塩が好ましい対イオンとして選択された。
Ｄｏｘｉｌ（登録商標）（ドキソルビシン－硫酸塩）と比較したドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームの細胞毒性の増加が２種のがん性細胞株（Ｄａｕｄｉ及びＨｅｌａ細胞）で観察された。
Ｄｏｘｉｌ（登録商標）（ドキソルビシン－硫酸塩）と比較したドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームの安全性及び有効性の改善がマウスＢリンパ腫モデルにおいて観察された。
いくつかの実施形態では、シュウ酸塩及び酒石酸塩含有リポソームが室温でドキソルビシンを効率的かつ迅速に封入することができることは驚くべき知見であった。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩及び酒石酸塩含有リポソームへのドキソルビシンの室温（ＲＴ）装填が、７０℃で装填されたシュウ酸塩及び／または酒石酸塩含有リポソームと比較してΔｐＨ６．７／５．０放出差を更に改善した（最大化した）ことも驚くべき知見であった。シュウ酸塩含有リポソームにおける遠隔ドキソルビシン装填に使用され得る他の温度には、２～８℃で一晩のインキュベートをしてまたはせずに、２～８℃から７０℃が含まれる。
いくつかの実施形態では、クエン酸塩は、ドキソルビシンの低温装填の際にΔｐＨ６．７／５．０放出差の顕著な改善を示した別の対イオンであった。対照的に、室温装填は、硫酸塩及び／またはリン酸塩を対イオンとして使用した場合、ドキソルビシン放出プロファイルの改善をもたらさなかった。酒石酸塩及びクエン酸塩含有リポソームにおける遠隔ドキソルビシン装填に使用され得る他の温度には、２～８℃で一晩のインキュベートをしてまたはせずに、２～８℃から７０℃が含まれる。
実施形態では、ラクトース及び／またはマンニトールの存在下でのドキソルビシンの成功した凍結乾燥は、最大６ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで室温で注射用水中で容易に再構成可能であった凍結乾燥材料をもたらした。実施形態では、凍結乾燥され、再構成されたドキソルビシン材料と、新規なシュウ酸塩及び酒石酸塩（いくつかの実施形態で好ましい対イオン）含有リポソームとの混合は、室温でドキソルビシンの効率的かつ迅速な封入をもたらした。得られた生成物は、いくつかの実施形態では格別のΔｐＨ６．７／５．０またはΔｐＨ６．７／６．７／６．０／５．０放出差を示した。実施形態では、この知見は、２つのバイアル：凍結乾燥されたドキソルビシンを有するバイアル及びリポソームビヒクル懸濁液を有するバイアルを有するかそれらからなる特定の製品提示形式につながる。室温で２つのバイアルの再構成された内容物を（単純な反転により）混合することは、数分以内に最終的なすぐに使用可能な製品（ベッドサイドで調製するための非常に便利な製剤）をもたらす。凍結乾燥されたリポソームビヒクルの開発も考慮されている。
実施形態では、最大のΔｐＨ６．７／５．０またはΔｐＨ６．７／６．７／６．０／５．０放出差及び最適な血清／血液安定性を達成するための脂質／薬物比の効果は、好ましい対イオンのシュウ酸塩及び酒石酸塩の両方について示された。実施形態では、脂質対薬物比が２０を超えた場合（好ましい範囲は２０：１～６５：１である）、リポソームが、高いΔｐＨ６．７／５．０またはΔｐＨ６．７／６．７／６．０／５．０放出差及び増加した血清／血液安定性を示したことも驚くべき知見であった。実施形態では、脂質／薬物比が≦２０であった場合、ドキソルビシン装填は不十分であり、リポソームからのドキソルビシンの漏出は明らかであった。使用され得る他の比は２０：１～１００：１を含む。実施された試験は、いくつかの実施形態では、最大ｐＨ放出差を達成するための最適な脂質／薬物比が２０：１～６５：１の範囲内にあることを示唆している。使用され得る他の比は１０：１～１００：１を含む。実施形態では、最適な血清／血液安定性及びΔｐＨ６．７／６．７／６．０／５．０放出差についての特定範囲のＰＬ／ＦＣ比（例えば、１／１～４／１）の効果が好ましい対イオンのシュウ酸塩について示された。
ｐＨ区別的薬物放出プロファイルを達成するための特定の対イオン及び最適化された脂質／薬物比の適用性可能性は、構造的に異なる３つの弱塩基がん治療剤：ドキソルビシン、イリノテカン、及びミトキサントロンについて示された。使用され得る他の比は２０：１～１００：１を含む。
低温透過型電子顕微鏡法（低温ＴＥＭ）は、ドキソルビシン－シュウ酸塩凝集体が非結晶性の性質を有するようであり、硫酸塩、リン酸塩、またはクエン酸塩が対イオンとして使用された場合に観察された緊密に充填された束を形成しなかったという重要な知見を導いた。この知見は、ドキソルビシン－硫酸塩、リン酸塩及びクエン酸塩凝集体と比較したリポソーム内ドキソルビシン－シュウ酸塩凝集体の独特の物理的状態を意味し、薬物放出プロファイルにおいて観察された差とよく一致している。
実施形態では、全ての試験された対イオンについて２５℃では不十分なΔｐＨ６．７／５．０放出差が観察された一方で、３７℃ではΔｐＨ６．７／５．０放出差の劇的な増加がシュウ酸塩または酒石酸塩で観察されたが、硫酸塩、リン酸塩、またはクエン酸塩では観察されなかった。２５℃及び３７℃で測定されたΔｐＨ６．７／５．０放出差における観察された差はまた、少なくともいくつかの実施形態では、ドキソルビシン－シュウ酸塩または酒石酸塩のリポソーム内凝集体の物理的状態が、硫酸塩、リン酸塩、またはクエン酸塩と比較してより深い温度依存性遷移を示している可能性がある。
実施形態では、リポソーム製剤へのＰ１８８の添加は、Ｐ１８８を用いずに調製されたリポソーム製剤と比較して、粒子サイズ、ドキソルビシン封入の効率、及びドキソルビシン放出プロファイルに対していかなる有意な影響も及ぼさなかった。しかしながら、いくつかの実施形態では、Ｐ１８８は、薬物装填リポソームの生物学的性能に対するその可能性のある有利な影響のためにリポソーム製剤に使用された［１０～１１、１６～１９］。
実施形態では、好ましい対イオンのシュウ酸塩及び／または酒石酸塩をアスコルビン酸（例えば、ＡＡ／シュウ酸塩－１：８または１：３）、及び／またはＮＡＣ（例えば、ＮＡＣ／シュウ酸塩－１：３）、及び／またはアスコルビルパルミテート（例えば、ＡＰ／シュウ酸塩－１：１５０または１：１５）、及び／またはＣｏＱ１０（例えば、ＣｏＱ１０／シュウ酸塩－１：３００）、及び／またはＥＤＴＡ（例えば、ＥＤＴＡ／シュウ酸塩１：１５０）で補完すると、シュウ酸塩または酒石酸塩を単独で含有するリポソームと比較してドキソルビシン放出プロファイルに対して大幅なマイナスの影響を示さなかった。実施形態では、この知見は、アスコルビン酸及び／またはＮＡＣ、及び／またはアスコルビルパルミテート及び／またはＣｏＱ１０、及び／またはＥＤＴＡをシュウ酸塩または酒石酸塩と組み合わせて使用することを可能にする。実施形態では、クエン酸塩は、任意の比で上記で列挙した任意のキレート剤と共に使用され得る。実施形態では、抗酸化剤及び／またはキレート剤の添加は、リポソーム処理中の酸化ストレスを軽減することができ、そのため、最終製品の安定性にとって有益であり得る。その上、実施形態では、最適化されたΔｐＨ６．７／５．０放出差と抗酸化剤（複数可）及び／またはキレート剤との組み合わせは、最終生成物の生物学的性能にとって有利であり得る。アスコルビン酸、ＮＡＣ、及びＥＤＴＡは、ドキソルビシンで誘発される心臓毒性を軽減する心臓保護効果を発揮することが示されている［２８～２９、３３、３６～３７］。実施形態では、使用され得るシュウ酸塩または酒石酸塩に対するＰＡの他の比は１：３００～１：１０を含む。使用され得るシュウ酸塩または酒石酸塩に対するＣｏＱ１０の他の比は１：３００～１：１０を含む。使用され得るシュウ酸塩または酒石酸塩に対するＥＤＴＡの他の比は１：３００～１：５を含む。有利であり得るか、及び／またはシュウ酸塩及び／または酒石酸塩と組み合わせて使用され得る他の対イオン及び／または抗酸化剤、及び／またはキレート剤には、クエン酸塩、及び／またはフィチン酸塩、及び／またはグルタチオン、及び／またはビタミンｅ、及び／またはデクスラゾキサン、及び／またはデフェロキサミンが含まれる。
実施形態では、構造的に異なる化学療法剤のイリノテカン及びミトキサントロン（表２）が、対イオンとしてシュウ酸塩及び／または酒石酸塩が５０：１の脂質／薬物比（使用され得る他の比は２０：１～１００：１を含む）で使用された場合にドキソルビシンのｐＨ区別的放出プロファイルと同様のものを示したことは驚くべき知見であった。ドキソルビシン、イリノテカン、及びミトキサントロンが弱塩基であることは言及する価値がある（表２）。それ故、実施形態では、化学療法剤の塩基性度、適切な対イオン、最適な脂質／薬物比、及び負荷条件は、ｐＨ区別的薬物放出及び腫瘍への弱塩基化学療法剤（表３）の効率的な送達に寄与し得る。
実施形態では、硫酸塩、リン酸塩、またはクエン酸塩含有リポソームからのドキソルビシンまたはイリノテカンのいずれかの放出は、対応する対イオンのｐＫａ１値に対する依存性を示した。しかしながら、シュウ酸塩または酒石酸塩（いくつかの実施形態で好ましい対イオン）含有リポソームからのドキソルビシンまたはイリノテカンのいずれの放出も、試験された対イオンのｐＫａ１値と合致しなかった。これらのデータは、ドキソルビシン－シュウ酸塩及び－酒石酸塩リポソーム内凝集体の独特の物理的状態のドキソルビシン放出プロファイルに対する寄与を示唆している可能性があり、ドキソルビシン－シュウ酸塩含有リポソームのｃ＿ＴＥＭ分析と一致している。
実施形態
実施形態１
リポソームを含む医薬組成物であって、前記リポソームが、弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含し、前記酸が、シュウ酸または酒石酸である、前記医薬組成物。
実施形態２
前記弱塩基性抗がん化合物が、ドキソルビシン、イリノテカン、ミトキサントロンまたはそれらの組み合わせである、実施形態１に記載の医薬組成物。
実施形態３
前記リポソームが、ポロキサマーを含む、実施形態１または２に記載の医薬組成物。
実施形態４
前記ポロキサマーが、ポロキサマー１８８である、実施形態３に記載の医薬組成物。
実施形態５
前記リポソームが複数の脂質化合物を含み、前記複数の脂質の前記弱塩基性抗がん剤に対する重量比が少なくとも２０／１である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態６
前記リポソームが複数の脂質化合物を含み、前記複数の脂質の前記弱塩基性抗がん剤に対する重量比が約２０／１～約１００／１である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態７
前記リポソームが複数の脂質化合物を含み、前記複数の脂質の前記弱塩基性抗がん剤に対する重量比が２０／１～約５０／１である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態８
前記弱塩基性抗がん化合物が、酸性ｐＨでのみ前記リポソームから実質的に放出される、実施形態１～７のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態９
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも４０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５で前記リポソームから放出され、前記弱塩基性抗がん化合物の５％未満が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、実施形態８に記載の医薬組成物。
実施形態１０
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも８０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５で前記リポソームから放出され、前記弱塩基性抗がん化合物の５％未満が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、実施形態８に記載の医薬組成物。
実施形態１１
前記標準アッセイ条件が、ｐＨ６．７またはｐＨ５のＰＢＳ緩衝液での２０倍希釈及び２５℃または３７℃で２、４、または８時間のインキュベートを含む、実施形態９の医薬組成物。
実施形態１２
前記リポソームが、実質的に球状である、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態１３
前記医薬組成物が、動的光散乱によって測定される強度平均粒径（Ｚ平均）によって決定される約６０～８０ｎｍの平均最長寸法を有する複数の前記リポソームを含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態１４
前記医薬組成物が、動的光散乱によって測定される数基準粒径によって決定される約１０～３０ｎｍの平均最長寸法を有する複数の前記リポソームを含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態１５
前記医薬組成物が、低温透過型電子顕微鏡法によって決定される１０～３０ｎｍの平均最長寸法を有する複数の前記リポソームを含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態１６
前記リポソームが、約５００～１０００μｇ／ｍＬの前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含む、実施形態１～１４のいずれかに記載の医薬組成物。
実施形態１７
前記リポソームが、約７００～８５０μｇ／ｍＬの前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含む、実施形態１～１４のいずれかに記載の医薬組成物。
実施形態１８
前記リポソームが、無秩序な非結晶性凝集体を形成する複数の前記弱塩基性抗がん化合物を含む、実施形態１～１７に記載の医薬組成物。
実施形態１９
前記リポソームが、複数の前記弱塩基性抗がん化合物を含み、標準保存条件下で２～８℃で保存した場合、４０日後に前記複数の弱塩基性抗がん化合物の９０％超を保持する、実施形態１～１８のいずれかに記載の医薬組成物。
実施形態２０
前記リポソームが、コレステロールもポロキサマー１８８も含まない、実施形態１～２または４～１９に記載の医薬組成物。
実施形態２１
前記リポソームが、シュウ酸、酒石酸、またはそれらの塩以外の酸性有機化合物を含まない、実施形態１に記載の医薬組成物。
実施形態２２
前記薬物装填リポソームが、前記弱塩基性抗がん化合物を、封入された酸またはその塩を含有する非装填リポソームに装填し、続いて室温でインキュベートすることによって形成される、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態２３
弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含するリポソームを調製するための方法であって、前記酸が、シュウ酸または酒石酸であり、前記方法が、
前記弱塩基性抗がん化合物の溶液を、封入された酸またはその塩を含有する前記リポソームを含む懸濁液と混合すること；及び
前記弱塩基性抗がん化合物の前記溶液を、封入された酸またはその塩を含有する前記リポソームを含む前記懸濁液とインキュベートすること、
を含む、前記方法。
実施形態２４
封入された酸またはその塩を含有する前記リポソームを含む懸濁液と混合するのに使用される前記弱塩基性抗がん化合物の約８５～１００％が、前記リポソーム内に保持される、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２５
封入された酸またはその塩を含有する前記リポソームを含む懸濁液と混合するのに使用される前記弱塩基性抗がん化合物の約９５～１００％が、前記リポソーム内に保持される、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２６
前記インキュベートする工程が、室温で行われる、実施形態２３～２６のいずれかに記載の方法。
実施形態２７
前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２８
前記インキュベートする工程が、約５～２５分である、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２９
弱塩基性抗がん化合物を含む第１のバイアル、及び封入された酸またはその塩を含有するリポソームを含む懸濁液を有する第２のバイアルを含むキット。
実施形態３０
前記第１のバイアルの前記弱塩基性抗がん化合物が、凍結乾燥された弱塩基性抗がんである、実施形態２９に記載のキット。
実施形態３１
前記第２のバイアルの前記リポソーム懸濁液が、封入された酸またはその塩を含有するリポソームの水性懸濁液である、実施形態２９に記載のキット。
実施形態３２
実施形態２８～３１のいずれか１つに記載のキットを使用する方法であって、前記第１のバイアルの内容物を前記第２のバイアルの内容物と混合することを含む、前記方法。
実施形態３３
前記混合が、室温で行われる、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３４
前記インキュベートする工程が、室温で行われ、続いて２～８℃でインキュベートする、実施形態２３～２５のいずれかに記載の方法。
実施形態３５
室温での前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、実施形態３４に記載の方法。
実施形態３６
２～８℃での前記インキュベートする工程が、約６０～９６０分である、実施形態３４のいずれかに記載の方法。
実施形態３７
前記インキュベートする工程が、７０℃で行われる、実施形態２３～３５のいずれかに記載の方法。
実施形態３８
前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９
弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含するリポソームを調製するための方法であって、前記酸が、クエン酸であり、前記方法が、
前記弱塩基性抗がん化合物の溶液を、封入された酸またはその塩を含有する前記リポソームを含む懸濁液と混合すること；及び
前記弱塩基性抗がん化合物の前記溶液を、封入された酸またはその塩を含有する前記リポソームを含む前記懸濁液とインキュベートすること、
を含む、前記方法。
実施形態４０
リポソームを含む医薬組成物であって、前記リポソームが、弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含し、前記酸が、クエン酸であり、前記リポソームが、複数の脂質化合物を含み、前記複数の脂質の前記弱塩基性抗がん剤に対する重量比が、少なくとも２０／１である、前記医薬組成物。
実施形態４１
リポソームを含む医薬組成物であって、前記リポソームが、弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含し、前記酸が、シュウ酸または酒石酸である、前記医薬組成物。
実施形態４２
前記弱塩基性抗がん化合物が、ドキソルビシン、イリノテカン、ミトキサントロンまたはそれらの組み合わせである、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態４３
前記リポソームが、ポロキサマーを含む、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態４４
前記ポロキサマーが、ポロキサマー１８８である、実施形態４３に記載の医薬組成物。
実施形態４５
前記リポソームが、複数の脂質を含み、前記脂質の前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩に対する重量比が、少なくとも１０／１である、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態４６
前記リポソームが、複数の脂質を含み、前記脂質の前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩に対する重量比が、約１０／１～約１００／１である、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態４７
前記リポソームが、複数の脂質を含み、前記脂質の前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩に対する重量比が、２０／１～約５０／１である、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態４８
前記リポソームが、複数の遊離コレステロールを含む、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態４９
前記リポソームが、複数のリン脂質を含む、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態５０
前記医薬組成物が、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、少なくとも０．５／１である、実施形態４８に記載の医薬組成物。
実施形態５１
前記医薬組成物が、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、少なくとも０．５／１～約４／１である、実施形態４８に記載の医薬組成物。
実施形態５２
前記医薬組成物が、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、約０．８６／１～約３．６８／１の範囲内である、実施形態４８に記載の医薬組成物。
実施形態５３
前記弱塩基性抗がん化合物が、ｐＨ＜６．７で前記リポソームから実質的に放出される、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態５４
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも４０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５で前記リポソームから放出される、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態５５
前記弱塩基性抗がん化合物の５％未満が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態５６
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも８０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５で前記リポソームから放出される、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態５７
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも１０％が、標準アッセイ条件下で約ｐＨ６．０で前記リポソームから放出される、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態５８
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも５０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．０で前記リポソームから放出される、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態５９
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも７％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態６０
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも３０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態６１
前記リポソームが、複数の弱塩基性抗がん化合物を含み、標準アッセイ条件下で試験した場合、血清または血液中で最大約８時間のインキュベートで前記複数の弱塩基性抗がん化合物の３５～５０％超を保持する、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態６２
前記標準アッセイ条件が、ＰＢＳ緩衝液での前記リポソームの２０倍または５０倍希釈を含む、実施形態５４～６１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態６３
前記標準アッセイ条件が、ｐＨ６．７、ｐＨ６．７、ｐＨ６．０またはｐＨ５．０でのインキュベートを含む、実施形態５４～６１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態６４
前記標準アッセイ条件が、約２５℃または約３７℃でのインキュベートを含む、実施形態５４～６１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態６５
前記標準アッセイ条件が、約２、約４または約８時間のインキュベートを含む、実施形態１４～２１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態６６
前記標準アッセイ条件が、血清または血液での前記リポソームの５０倍希釈及び生理学的ｐＨ（ｐＨ６．７）で２、４、または８時間の３７℃でのインキュベートを含む、実施形態５４～６１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態６７
前記リポソームが、実質的に球状である、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態６８
前記医薬組成物が、動的光散乱によって測定される強度平均粒径（Ｚ平均）によって決定される約６０～８０ｎｍの平均最長寸法を有する複数の前記リポソームを含む、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態６９
前記医薬組成物が、動的光散乱によって測定される数基準粒径によって決定される約１０～３０ｎｍの平均最長寸法を有する複数の前記リポソームを含む、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態７０
前記医薬組成物が、低温透過型電子顕微鏡法によって決定される１０～３０ｎｍの平均最長寸法を有する複数の前記リポソームを含む、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態７１
前記リポソームが、約５００～１０００μｇ／ｍＬの前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含む、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態７２
前記リポソームが、約７００～８５０μｇ／ｍＬの前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含む、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態７３
前記リポソームが、無秩序な非結晶性凝集体を形成する複数の前記弱塩基性抗がん化合物を含む、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態７４
前記リポソームが、複数の前記弱塩基性抗がん化合物を含み、標準保存条件下で２～８℃で保存した場合、４０日後に前記複数の弱塩基性抗がん化合物の９０％超を保持する、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態７５
前記リポソームが、コレステロールもポロキサマー１８８も含まない、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態７６
前記リポソームが、シュウ酸、酒石酸、またはそれらの塩以外の酸性有機化合物を含まない、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態７７
前記リポソームが、前記弱塩基性抗がん化合物及びシュウ酸、酒石酸またはそれらの塩以外の酸またはその塩を含まない、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態７８
前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含する前記リポソームが、前記弱塩基性抗がん化合物を、封入された酸またはその塩を含有する非装填リポソームに装填し、続いて室温でインキュベートすることによって形成される、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態７９
標準保存条件下で２～８℃で１８０及び／または５４０日保存した後の非装填リポソームが、装填時の前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩の９０％超を保持する、実施形態３８に記載の医薬組成物。
実施形態８０
前記負荷された弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩の約４０～８０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５．０で前記リポソームから放出される、実施形態３９に記載の医薬組成物。
実施形態８１
前記負荷された弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩の約２０～６０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．０で前記リポソームから放出される、実施形態３９に記載の医薬組成物。
実施形態８２
前記負荷された弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩の約７～３０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、実施形態３９に記載の医薬組成物。
実施形態８３
前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩の５％未満が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、実施形態３９に記載の医薬組成物。
実施形態８４
アスコルビン酸（ＡＡ）、またはＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、アスコルビルパルミテート（ＡＰ）、ユビキノン（ＣｏＱ１０）、及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）からなる群から選択される化合物を更に含む、実施形態４１に記載の医薬組成物。
実施形態８５
弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含するリポソームを調製するための方法であって、前記酸が、シュウ酸または酒石酸であり、前記方法が、
弱塩基性抗がん化合物を含む溶液を複数のリポソームを含む懸濁液と混合することであって、前記リポソームの各々が、シュウ酸もしくは酒石酸またはそれらの塩を含む、前記混合すること、
を含む、前記方法。
実施形態８６
前記溶液及び前記懸濁液をインキュベートすることを更に含む、実施形態８５に記載の方法。
実施形態８７
前記弱塩基性抗がん化合物の約８５～１００％が、前記混合後に前記複数のリポソーム内に組み込まれる、実施形態８５に記載の方法。
実施形態８８
前記弱塩基性抗がん化合物の約９５～１００％が、前記混合後に前記複数のリポソーム内に組み込まれる、実施形態８５に記載の方法。
実施形態８９
前記インキュベートする工程が、室温（ＲＴ）で行われる、実施形態８６に記載の方法。
実施形態９０
前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、実施形態８９に記載の方法。
実施形態９１
前記インキュベートする工程が、約５～２５分である、実施形態８９に記載の方法。
実施形態９２
前記インキュベートする工程が、室温（ＲＴ）で行われ、それに２～８℃でのインキュベートが続く、実施形態８５に記載の方法。
実施形態９３
室温での前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、実施形態９２に記載の方法。
実施形態９４
２～８℃での前記インキュベートする工程が、約６０～９６０分である、実施形態９２に記載の方法。
実施形態９５
前記インキュベートする工程が、７０℃で行われる、実施形態８６に記載の方法。
実施形態９６
前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、実施形態９５に記載の方法。
実施形態９７
弱塩基性抗がん化合物を含む第１の容器、及び懸濁液を含む第２の容器を含むキットであって、前記懸濁液が、複数のリポソームを含み、前記複数のリポソームの各々が、前記弱塩基性抗がん化合物の酸または塩を含み、前記酸が、シュウ酸または酒石酸である、前記キット。
実施形態９８
前記弱塩基性抗がん化合物が、凍結乾燥された弱塩基性抗がん化合物である、実施形態９７に記載のキット。
実施形態９９
前記懸濁液が、水性懸濁液である、実施形態９７に記載のキット。
実施形態１００
実施形態９７に記載のキットを使用する方法であって、前記第１の容器の内容物を前記第２の容器の内容物と混合することを含む、前記方法。
実施形態１０１
前記混合が、室温で行われる、実施形態１００に記載の方法。
実施形態１０２
弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含むリポソームを調製するための方法であって、前記酸が、クエン酸であり、前記方法が、
前記弱塩基性抗がん化合物を含む溶液を複数のリポソームを含む懸濁液と混合することであって、前記複数のリポソームの各々が、酸またはその塩を含む、前記混合すること、
を含む、前記方法。
実施形態１０３
前記溶液を前記懸濁液とインキュベートすることを更に含む、実施形態１０２に記載の方法。
実施形態１０４
前記インキュベートする工程が、室温（ＲＴ）で行われる、実施形態１０２に記載の方法。
実施形態１０５
前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、実施形態１０４に記載の方法。
実施形態１０６
前記インキュベートする工程が、約５～２５分である、実施形態１０４に記載の方法。
実施形態１０７
前記インキュベートする工程が、室温（ＲＴ）で行われ、続いて２～８℃でインキュベートする、実施形態１０３に記載の方法。
実施形態１０８
室温での前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、実施形態１０７に記載の方法。
実施形態１０９
２～８℃での前記インキュベートする工程が、約６０～９６０分である、実施形態１０７に記載の方法。
実施形態１１０
前記インキュベートする工程が、７０℃で行われる、実施形態１０３に記載の方法。
実施形態１１１
前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、実施形態１１０に記載の方法。
実施形態１１２
リポソームを含む医薬組成物であって、前記リポソームが、弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含み、前記酸が、クエン酸ある、前記医薬組成物。
実施形態１１３
前記リポソームが、複数の脂質を含み、前記複数の脂質の前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩に対する重量比が、少なくとも１０対１である、実施形態１１２に記載の医薬組成物。
実施形態１１４
前記リポソームが、複数の遊離コレステロールを含む、実施形態１１２に記載の医薬組成物。
実施形態１１５
前記リポソームが、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、少なくとも１対１である、実施形態１１４に記載の医薬組成物。
実施形態１１６
アスコルビン酸（ＡＡ）、またはＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、アスコルビルパルミテート（ＡＰ）、ユビキノン（ＣｏＱ１０）、及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）からなる群から選択される化合物を更に含む、実施形態１１２に記載の医薬組成物。
実施形態１１７
対象においてがんを治療する方法であって、前記方法が、
有効量の実施形態４０に記載の医薬組成物を前記治療を必要とする前記対象に投与すること、
を含む、前記方法。
実施形態１１８
前記弱塩基性抗がん化合物が、ドキソルビシン、イリノテカン、ミトキサントロンまたはそれらの組み合わせである、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１１９
前記リポソームが、ポロキサマーを含む、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１２０
前記ポロキサマーが、ポロキサマー１８８である、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１２１
前記リポソームが、脂質を含み、前記脂質の前記弱塩基性抗がん化合物に対する重量比が、少なくとも１０対１である、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１２２
前記リポソームが、脂質を含み、前記脂質の前記弱塩基性抗がん化合物に対する重量比が、約１０対１～約１００対１である、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１２３
前記リポソームが、複数の脂質を含み、前記脂質の前記弱塩基性抗がん化合物に対する重量比が、約２０対１～約５０対１である、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１２４
前記リポソームが、複数の遊離コレステロールを含む、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１２５
前記リポソームが、複数のリン脂質を含む、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１２６
前記リポソームが、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、少なくとも０．５対１である、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２７
前記リポソームが、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、少なくとも０．５対１～約４対１である、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２８
前記リポソームが、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、約０．８６対１～約３．６８対１の範囲内である、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２９
前記弱塩基性抗がん化合物が、ｐＨ＜６．７で前記リポソームから実質的に放出される、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１３０
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも４０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５で前記リポソームから放出される、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１３１
前記弱塩基性抗がん化合物の５％未満が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１３２
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも８０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５で前記リポソームから放出される、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１３２
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも１０％が、標準アッセイ条件下で約ｐＨ６．０で前記リポソームから放出される、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１３４
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも５０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．０で前記リポソームから放出される、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１３５
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも７％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１３６
前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも３０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１３７
前記リポソームが、複数の弱塩基性抗がん化合物を含み、標準アッセイ条件下で試験した場合、血清または血液中で最大約８時間のインキュベートで前記複数の弱塩基性抗がん化合物の３５～５０％超を保持する、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１３８
前記標準アッセイ条件が、ＰＢＳ緩衝液での前記リポソームの２０倍または５０倍希釈を含む、実施形態１３０～１３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３９
前記標準アッセイ条件が、ｐＨ６．７、ｐＨ６．７、ｐＨ６．０またはｐＨ５．０でのインキュベートを含む、実施形態１３０～１３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４０
前記標準アッセイ条件が、約２５℃または約３７℃でのインキュベートを含む、実施形態１３０～１３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４１
前記標準アッセイ条件が、約２、約４または約８時間のインキュベートを含む、実施形態１３０～１３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４２
前記標準アッセイ条件が、血清または血液での前記リポソームの５０倍希釈及び生理学的ｐＨ（ｐＨ６．７）で２、４、または８時間の３７℃でのインキュベートを含む、実施形態１３０～１３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４３
前記リポソームが、実質的に球状である、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１４４
前記リポソームが、約５００～１０００μｇ／ｍＬの前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含む、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１４５
前記リポソームが、約７００～８５０μｇ／ｍＬの前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含む、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１４６
前記リポソームが、無秩序な非結晶性凝集体を形成する複数の前記弱塩基性抗がん化合物を含む、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１４７
前記リポソームが、コレステロールもポロキサマー１８８も含まない、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１４８
前記リポソームが、シュウ酸、酒石酸、またはそれらの塩以外の酸性有機化合物を含まない、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１４９
前記リポソームが、シュウ酸、酒石酸またはそれらの塩以外の前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含まない、実施形態１１７に記載の方法。
参考文献
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８．Ｊｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｙ．Ｂｌａｙ，Ｑ．ｖａｎ Ｈｏｅｓｅｌ，Ａ．ｌｅ Ｃｅｓｎｅ，Ａ．Ｔ．ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｒｏｍ，Ｍ．Ｊ．Ｃｌｅｍｏｎｓ，Ｃ．Ｋａｍｂｙ，Ｃ．Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｅ．Ｄｏｎａｔｏ ｄｉ Ｐａｏｌａ，Ｊ．Ｖｅｒｗｅｉｊ，Ｓ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（ＤＯＸＩＬ／ＣＡＥＬＹＸ）ｖｅｒｓｕｓ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｒｃｏｍａ：ａ ｓｔｕｄｙ ｂｙ ｔｈｅ ＥＯＲＴＣ Ｓｏｆｔ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｂｏｎｅ Ｓａｒｃｏｍａ Ｇｒｏｕｐ．２００１．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３７，８７０－８７７．
９．Ｋ．Ｍ．Ｌａｇｉｎｈａ，Ｓ．Ｖｅｒｗｏｅｒｔ，Ｇ．Ｊ．Ｃｈａｒｒｏｉｓ，Ｔ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｗｈｏｌｅ ｔｕｍｏｒ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｕｃｌｅｉ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｕｍｏｒｓ．２００５．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１，６９４４－６９４９．
１０．Ｒｏｂｅｒｔｏ Ａｎｇｉｏｌｉ，Ｍｉｃｈｅｌａ Ａｎｇｅｌｕｃｃｉ，Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｐｌｏｔｔｉ，Ｃｏｒｒａｄｏ Ｔｅｒｒａｎｏｖａ，Ｒｏｂｅｒｔｏ Ｍｏｎｔｅｒａ，Ｐａｔｒｉｚｉｏ Ｄａｍｉａｎｉ，Ｅｓｔｅｒ Ｖａｌｅｎｔｉｎａ Ｃａｆａ，Ｐｉｅｒｌｕｉｇｉ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ Ｐａｎｉｃｉ ａｎｄ Ａｎｇｉｏｌｏ Ｇａｄｄｕｃｃｉ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ Ｃｉｔｒａｔｅ（Ｌｅｄｃ）ａｓ ａｎ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｐｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ．２０１３．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｉｓｓｕｅ １，１－５．
１１．Ｙｉ Ｚｈａｏ，Ｄａｒｉａ Ｙ．Ａｌａｋｈｏｖａ，Ｊｏｎｇ Ｏｈ Ｋｉｍ，Ｔａｔｉａｎａ Ｋ．Ｂｒｏｎｉｃｈ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｖ．Ｋａｂａｎｏｖ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｗａｙ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ Ｄｏｘｉｌ（登録商標）ｔｈｅｒａｐｙ：Ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｉｔｅ ｂｙ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ．２０１３．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １６８， ６１－６９
１２．Ａｎｎ Ｌ．Ｂ．Ｓｅｙｎｈａｅｖｅ，Ｂｉｌｙａｎａ Ｍ．Ｄｉｃｈｅｖａ，Ｓａｓｋｅ Ｈｏｖｉｎｇ，Ｇｅｒｂｅｎ Ａ．Ｋｏｎｉｎｇ，Ｔｉｍｏ Ｌ．Ｍ．ｔｅｎ Ｈａｇｅｎ．Ｉｎｔａｃｔ Ｄｏｘｉｌ ｉｓ ｔａｋｅｎ ｕｐ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｙｓｏｓｏｍｅ：Ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ．２０１３．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １７２，３３０－３４０
１３．Ａｎｄｒｅａｓ Ｆｒｉｔｚｅ，Ｆｅｌｉｃｉｔａｓ Ｈｅｎｓ，Ａｎｄｒｅａ Ｋｉｍｐｆ ｌｅｒ，Ｒｏｌｆ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｒｅｇｉｎｅ Ｐｅｓｃｈｋａ－Ｓｕｓｓ．Ｒｅｍｏｔｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｉｎｔｏ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ａ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ．２００６．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１７５８，１６３３－１６４０
１４．Ｌｅｉ Ｚｈａｎｇ，Ｈｏｎｇ Ｐａｎ，Ｍｉｎ Ｌｉｕ，Ｗｅｉｙｕｅ Ｌｕ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｓａｌｔｓ ｉｎｓｉｄｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｐｅｒ．ｅｄｕ．ｃｎ）
１５．Ｌｉ，Ｘｉｎｇｏｎｇ，Ｈｉｒｓｈ，Ｄｏｎａｌｄ Ｊ．，Ｃａｂｒａｌ－Ｌｉｌｌｙ，Ｄｏｎｎａ．，Ｚｉｒｋｅｌ，Ａｃｈｉｍ．，Ｇｒｕｎｅｒ，Ｓｏｌ Ｍ．，Ｊａｎｏｆｆ，Ａｎｄｒｅｗ Ｓ．，Ｐｅｒｋｉｎｓ Ｗａｌｔｅｒ Ｒ．Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｔｅ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｓｉｄｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｌｏａｄｅｄ ｖｉａ ａ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ．１９９８．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４１５，２３－４０
１６．Ｈｉｔｅｓｈ Ｒ．Ｐａｔｅｌ，Ｒａｋｅｓｈ Ｐ．Ｐａｔｅｌ，Ｍ．Ｍ．Ｐａｔｅｌ．“Ｐｏｌｏｘａｍｅｒｓ：Ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｂｅｈａｖｉｏｒｓ”．２００９．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＰｈａｒｍＴｅｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．２，ｐｐ２９９－３０３．
１７．Ｇｕｏｈｕｉ Ｗｕ，Ｊａｒｏｓｌａｗ Ｍａｊｅｗｓｋｉ，Ｃａｎａｙ Ｅｇｅ，Ｋｒｉｓｔｉａｎ Ｋｊａｅｒ，Ｍａｒｋｕｓ Ｊａｎ Ｗｅｙｇａｎｄ，ａｎｄ Ｋａ Ｙｅｅ Ｃ．Ｌｅｅ．“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｌｉｐｉｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ａｎｄ Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８：Ａｎ Ｘ－Ｒａｙ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ”．２００５．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌｕｍｅ ８９，３１５９－３１７３．
１８．Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｎ－ｌｉ，Ｌｉｕ Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ，Ｌｉｕ Ｘｉａｏ－ｘｕ，Ｃｈｅｎ Ｚｈｉ－ｑｉａｎｇ．“Ｓｔｅａｌｔｈ ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ ＩＩＡ－ｌｏａｄｅｄ ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８ ｃｏａｔｉｎｇ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ｒａｔｓ”．２００９．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍ Ｓｉｎ，４４：１４２１－１４２８．
１９．Ｐａｒａｇ Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｂ．Ｈａｌｌ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｂ．ＭｃＬｅｌａｎｄ，Ｍａｒｉｎａ Ａ．Ｄｏｂｒｏｖｏｌｓｋａｉａ，Ｓｃｏｔｔ Ｅ．ＭｃＮｅｉｌ．“Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｉｔ ｒｅｌａｔｅｓ ｔｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ”．２００９．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６１，４２８－４３７．
２０．Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｓ．，Ｔｕｒｋ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ Ｌｏｗ，Ｐ．Ｓ．“Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ａｎｄ ｉｎｔｒａｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｂｕｆｆｅｒ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｏｎ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”．１９９８．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ１８（２）：６９－７８．
２１．Ｇｈｅｔｉｅ ＭＡ，Ｔｕｃｋｅｒ Ｋ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ Ｊ，Ｕｈｒ ＪＷ，Ｖｉｔｅｔｔａ ＥＳ．Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｄａｕｄｉ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｕｓｉｎｇ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｃｏｃｋｔａｉｌ．１９９４．Ｂｌｏｏｄ．８４（３）：７０２－７０７．
２２．Ｎｅｗｔｏｎ ＤＬ，Ｈａｎｓｅｎ ＨＪ，Ｍｉｋｕｌｓｋｉ ＳＭ，Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ＤＭ，Ｒｙｂａｋ ＳＭ．Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ２２－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ．２００１．Ｂｌｏｏｄ．；９７（２）：５２８－５３５．
２３．Ｌａｓｉｃ，Ｄ．Ｄ．Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｉｎ ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．１９９６．Ｎａｔｕｒｅ ３８０，５６１－５６２．
２４．Ｌａｓｉｃ，Ｄ．Ｄ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｋ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｔｕａｒｔ，Ｍ．Ｃ．，Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ，Ｙ．，ａｎｄ ＭｃＩｎｔｏｓｈ，Ｔ．Ｊ．．Ｇｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｉｎｔｅｒｉｏｒ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．１９９２．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３１２，２５５－２５８．
２５．Ｓｈｅｅｌａ Ａ．Ａｂｒａｈａｍ，Ｄａｗｎ Ｎ．Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｄ．Ｍａｙｅｒ，Ｐｉｅｔｅｒ Ｒ．Ｃｕｌｌｉｓ，Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｍａｄｄｅｎ，ａｎｄ Ｍａｒｃｅｌ Ｂ．Ｂａｌｌｙ．Ｔｈｅ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ．２００５．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３９１：７１－９７．
２６．Ｈｏｎｇｙａｎ Ｗｅｉ，Ｊｕａｎ Ｓｏｎｇ，Ｈａｏ Ｌｉ，Ｙａｎｇ Ｌｉ，Ｓｈａｎｓｈａｎ Ｚｈｕ，Ｘｉａｏｄａｎ Ｚｈｏｕ，Ｘｉｗｅｎ Ｚｈａｎｇ，Ｌｉ Ｙａｎｇ．Ａｃｔｉｖｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．２０１３．Ａｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８，３０３－３１１．
２７．Ｄａｒｙｌ Ｃ．Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｏ．Ｎｏｂｌｅ，Ｚｅｘｉｏｎｇ Ｇｕｏ，Ｋｅｅｌｕｎｇ Ｈｏｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗ．Ｐａｒｋ，ａｎｄ Ｄｍｉｔｒｉ Ｂ．Ｋｉｒｐｏｔｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｎａｎｏｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｎｔｒａｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｙ．２００６．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，６６：（６），３２７１－７．
２８．Ｊａｍｅｓ Ｈ．Ｄｏｒｏｓｈｏｗ，Ｇｅｒｓｈｏｎ Ｙ．Ｌｏｃｋｅｒ，Ｉｎａ Ｉｆｒｉｍ，Ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｅ．Ｍｙｅｒｓ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ Ｃａｒｄｉａｃ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ ｂｙ Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ．１９８１．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌｕｍｅ ６８，１０５３－１０６４．
２９．Ｓａｋｔｈｉｂａｌａｎ Ｍ，Ｓａｗａｄｋａｒ ＭＳ，Ａｓｍａｔｈｕｌｌａ Ｓ，Ｉｖａｎ ＥＡ，Ｍｕｔｈｕ Ｇ．Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃａｒｄｉｏ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＮＡｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ，Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ，ａｎｄ Ｅｎａｌａｐｒｉｌ ｇｉｖｅｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｒｄｉｏ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ．２０１３．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ．３６（３６）：１９０２－１９０８
３０．Ｍｙｅｒｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｗ．Ｐ．ＭｃＧｕｉｒｅ，Ｒ．Ｈ．Ｌｉｓｓ，Ｉ．Ｉｆｒｉｍ，Ｋ．Ｇｒｏｔｚｉｎｇｅｒ，ａｎｄ Ｒ．Ｃ．Ｙｏｕｎｇ．Ａｄｒｉａｉｎｙｃｉｎ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．１９７７．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈ．Ｄ．Ｃ．）．１９７：１６５－１６７．
３１．Ｄｏｒｏｓｈｏｗ，Ｊ．Ｈ．，ａｎｄ Ｊ．Ｒｅｅｖｅｓ．Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｏｘｙｇｅｎ ｒａｄｉｃａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ．１９８０．Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２６６．
３２．Ｈｅａｎｅｙ ＭＬ，Ｇａｒｄｎｅｒ ＪＲ，Ｋａｒａｓａｖｖａｓ Ｎ，Ｇｏｌｄｅ ＤＷ，Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ ＤＡ，Ｓｍｉｔｈ ＥＡ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ＯＡ．Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ．２００８．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８（１９）：８０３１－８０３．
３３．Ｖｉｓｗａｎａｔｈａ Ｓｗａｍｙ ＡＨ，Ｗａｎｇｉｋａｒ Ｕ，Ｋｏｔｉ ＢＣ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｙｏｃａｒ－ｄｉａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｒａｔｓ．２０１１．Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４３：５０７－５１１．
３４．Ｖｉｌｌａｎｉ Ｆ，Ｇａｌｉｍｂｅｒｔｉ Ｍ，Ｍｏｎｔｉ Ｅ，Ｐｉｃｃｉｎｉｎｉ Ｆ，Ｌａｎｚａ Ｅ，Ｒｏｚｚａ Ａ，Ｆａｖａｌｌｉ Ｌ，Ｐｏｇｇｉ Ｐ，Ｚｕｎｉｎｏ Ｆ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ａｎｄ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃａｒｄｉａｃ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ．１９９０．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１１（１－３）：１４５－５１．
３５．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｘ’ｓ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．２０１５．Ｖ．１．４．
３６．Ｓｏｎｇ Ｙ，Ｈｕａｎｇ Ｚ，Ｓｏｎｇ Ｙ，Ｔｉａｎ Ｑ，Ｌｉｕ Ｘ，Ｓｈｅ Ｚ，Ｊｉａｏ Ｊ，Ｌｕ Ｅ，Ｄｅｎｇ Ｙ．Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＤＴＡ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ：ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｌｏａｄｅｄ ｖｉａ ＮＨ４ＥＤＴＡ ｇｒａｄｉｅｎｔ．２０１４．Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．９：３６１１－２１．
３７．Ｃｒａｎｔｏｎ ＥＭ，Ｆｒａｃｋｅｌｔｏｎ ＪＰ．Ｆｒｅｅ ｏｘｙｇｅｎ ｒａｄｉｃａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＥＤＴＡ ｃｈｅｌａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ．１９８８．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１１（４）：２７７－３１０
３８．Ｈｏｎｇ ＲＬ，Ｔｓｅｎｇ ＹＬ．Ｐｈａｓｅ Ｉ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ｓｔａｂｌｅ，ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｇｌｙｃｏｌａｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ：ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．２００１．Ｃａｎｃｅｒ；９１：１８２６－１８３３．
３９．Ｃｈａｏ ＴＣ，Ｗａｎｇ ＷＳ，Ｙｅｎ ＣＣ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｄｏｓｅ－ｅｓｃａｌａｔｉｎｇ ｐｉｌｏｔ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ，ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（Ｌｉｐｏ－Ｄｏｘ） ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．２００３．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ；２１：８３７－８４７．
４０．Ｉａｎ Ｆ．Ｔａｎｎｏｃｋ ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌａ Ｒｏｔｉｎ．Ａｃｉｄ ｐＨ ｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ．１９８９．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４９，４１７３－４３８４．
４１．３６．Ｗｉｋｅ－Ｈｏｏｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．，Ｈａｖｅｍａｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｊ．Ｓ．Ｔｈｅ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ ｐＨ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ．１９８４．Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌ．，２：３４３－３６６．
４２．Ｙｕａｎ Ｆ，Ｌｅｕｎｉｇ Ｍ，Ｈｕａｎｇ ＳＫ，Ｂｅｒｋ ＤＡ，Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ Ｄ，Ｊａｉｎ ＲＫ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ（Ｓｔｅａｌｔｈ） ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ．１９９４．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４：３３５２－３３５６．
４３．Ｖｉｔｏｌｓ Ｓ：Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ－ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．１９９１．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ３，４８８－４９５．
４４．Ｍｕｌｌｅｒ ＣＰ，Ｔｒｉｌｌｉｎｇ Ｂ，Ｓｔｅｉｎｋｅ Ｂ：Ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓｅｒｕｍ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．１９９２．Ｃａｎｃｅｒ ６９，１０４２－１０４６．
４５．Ｐａｒａｇ Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｂ．Ｈａｌｌ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｂ．ＭｃＬｅｌａｎｄ，Ｍａｒｉｎａ Ａ．Ｄｏｂｒｏｖｏｌｓｋａｉａ，Ｓｃｏｔｔ Ｅ．ＭｃＮｅｉｌ．“Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｉｔ ｒｅｌａｔｅｓ ｔｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ”．２００９．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６１，４２８－４３７．
４６．Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ ＴＬ ａｎｄ Ｍａｈｌｅｙ ＲＷ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｏｆ ａｐｏ－Ｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．１９７８．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４４０－１４４７．
４７．Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ ＴＬ Ｐｉｔａｓ ＲＥ ａｎｄ Ｍａｈｌｅｙ ＲＷ（１９７９） Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ－ｒｉｃｈ（Ｅ）ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｔｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．１９７９．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５４：４１８６－４１９０．
４８．ＡＪ Ｖｅｒｓｌｕｉｓ，ＰＣＮ Ｒｅｎｓｅｎ，ＥＴ Ｒｕｍｐ，ＴＪＣ Ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ ａｎｄ ＭＫ Ｂｉｊｓｔｅｒｂｏｓｃｈ．Ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｔｏ Ｂ１６ ｔｕｍｏｕｒｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．１９９８．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ７８（１２）：１６０７－１６１４．
４９．Ｚｅｎｓｉ Ａ，Ｂｅｇｌｅｙ Ｄ，Ｐｏｎｔｉｋｉｓ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ａｌｂｕｍｉｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｐｏ Ｅ ｅｎｔｅｒ ｔｈｅ ＣＮＳ ｂｙ ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ａｒｅ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｎｅｕｒｏｎｅｓ．２００９．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ；１３７（１）：７８－８６．
５０．Ｐｉｌｌａｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｅ．Ｅｌｌｉｏｔｔ，ａｎｄ Ｃ．Ｄｅｎｎｉｓｏｎ．２００２．Ｅｎｄｏｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６３：４１７－４２９．
５１．Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｍｉｎｄｅｌｌ．Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．２０１２．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．７４：６９－８６．
５２．Ｇｕｏ ＬＳ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＲＬ，Ｇｏｅｒｋｅ Ｊ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＪＮ，Ｈａｖｅｌ ＲＪ． Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｗｉｔｈ ｓｅｒｕｍ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．１９８０．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．２１（８）：９９３－１００３．
５３．Ｓｅａｎ Ｃ．Ｓｅｍｐｌｅ，Ａｒｃａｄｉｏ Ｃｈｏｎｎ，Ｐｉｅｔｅｒ Ｒ．Ｃｕｌｌｉｓ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｃａｒｒｉｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｉｎ ｖｉｖｏ．１９９８．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｖｏｌ．３２：３－１７．

Claims (109)

  1. リポソームを含む医薬組成物であって、前記リポソームが、弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含し、前記酸が、シュウ酸または酒石酸である、前記医薬組成物。
  2. 前記弱塩基性抗がん化合物が、ドキソルビシン、イリノテカン、ミトキサントロンまたはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記リポソームが、ポロキサマーを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 前記ポロキサマーが、ポロキサマー１８８である、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 前記リポソームが、複数の脂質を含み、前記脂質の前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩に対する重量比が、少なくとも１０対１である、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 前記リポソームが、複数の脂質を含み、前記脂質の前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩に対する重量比が、約１０対１～約１００対１である、請求項１に記載の医薬組成物。
  7. 前記リポソームが、複数の脂質を含み、前記脂質の前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩に対する重量比が、２０対１～約５０対１である、請求項１に記載の医薬組成物。
  8. 前記リポソームが、複数の遊離コレステロールを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  9. 前記リポソームが、複数のリン脂質を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  10. 前記医薬組成物が、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、少なくとも０．５対１である、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 前記医薬組成物が、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、少なくとも０．５対１～約４対１である、請求項９に記載の医薬組成物。
  12. 前記医薬組成物が、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、約０．８６対１～約３．６８対１の範囲内である、請求項９に記載の医薬組成物。
  13. 前記弱塩基性抗がん化合物が、ｐＨ＜６．７で前記リポソームから実質的に放出される、請求項１に記載の医薬組成物。
  14. 前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも４０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５で前記リポソームから放出される、請求項１に記載の医薬組成物。
  15. 前記弱塩基性抗がん化合物の５％未満が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、請求項１に記載の医薬組成物。
  16. 前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも８０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５で前記リポソームから放出される、請求項１に記載の医薬組成物。
  17. 前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも１０％が、標準アッセイ条件下で約ｐＨ６．０で前記リポソームから放出される、請求項１に記載の医薬組成物。
  18. 前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも５０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．０で前記リポソームから放出される、請求項１に記載の医薬組成物。
  19. 前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも７％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、請求項１に記載の医薬組成物。
  20. 前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも３０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、請求項１に記載の医薬組成物。
  21. 前記リポソームが、複数の弱塩基性抗がん化合物を含み、標準アッセイ条件下で試験した場合、血清または血液中で最大約８時間のインキュベートで前記複数の弱塩基性抗がん化合物の３５～５０％超を保持する、請求項１に記載の医薬組成物。
  22. 前記標準アッセイ条件が、ＰＢＳ緩衝液での前記リポソームの２０倍または５０倍希釈を含む、請求項１４～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  23. 前記標準アッセイ条件が、ｐＨ６．７、ｐＨ６．７、ｐＨ６．０またはｐＨ５．０でのインキュベートを含む、請求項１４～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  24. 前記標準アッセイ条件が、約２５℃または約３７℃でのインキュベートを含む、請求項１４～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  25. 前記標準アッセイ条件が、約２、約４または約８時間のインキュベートを含む、請求項１４～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  26. 前記標準アッセイ条件が、血清または血液での前記リポソームの５０倍希釈及び生理学的ｐＨ（ｐＨ６．７）で２、４、または８時間の３７℃でのインキュベートを含む、請求項１４～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  27. 前記リポソームが、実質的に球状である、請求項１に記載の医薬組成物。
  28. 前記医薬組成物が、動的光散乱によって測定される強度平均粒径（Ｚ平均）によって決定される約６０～８０ｎｍの平均最長寸法を有する複数の前記リポソームを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  29. 前記医薬組成物が、動的光散乱によって測定される数基準粒径によって決定される約１０～３０ｎｍの平均最長寸法を有する複数の前記リポソームを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  30. 前記医薬組成物が、低温透過型電子顕微鏡法によって決定される１０～３０ｎｍの平均最長寸法を有する複数の前記リポソームを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  31. 前記リポソームが、約５００～１０００μｇ／ｍＬの前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  32. 前記リポソームが、約７００～８５０μｇ／ｍＬの前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  33. 前記リポソームが、無秩序な非結晶性凝集体を形成する複数の前記弱塩基性抗がん化合物を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  34. 前記リポソームが、複数の前記弱塩基性抗がん化合物を含み、標準保存条件下で２～８℃で保存した場合、４０日後に前記複数の弱塩基性抗がん化合物の９０％超を保持する、請求項１に記載の医薬組成物。
  35. 前記リポソームが、コレステロールもポロキサマー１８８も含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
  36. 前記リポソームが、シュウ酸、酒石酸、またはそれらの塩以外の酸性有機化合物を含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
  37. 前記リポソームが、前記弱塩基性抗がん化合物及びシュウ酸、酒石酸またはそれらの塩以外の酸またはその塩を含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
  38. 前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含する前記リポソームが、前記弱塩基性抗がん化合物を、封入された酸またはその塩を含有する非装填リポソームに装填し、続いて室温でインキュベートすることによって形成される、請求項１に記載の医薬組成物。
  39. 標準保存条件下で２～８℃で１８０及び／または５４０日保存した後の前記非装填リポソームが、装填時の前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩の９０％超を保持する、請求項３８に記載の医薬組成物。
  40. 前記装填された弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩の約４０～８０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５．０で前記リポソームから放出される、請求項３９に記載の医薬組成物。
  41. 前記装填された弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩の約２０～６０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．０で前記リポソームから放出される、請求項３９に記載の医薬組成物。
  42. 前記装填された弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩の約７～３０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、請求項３９に記載の医薬組成物。
  43. 前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩の５％未満が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、請求項３９に記載の医薬組成物。
  44. アスコルビン酸（ＡＡ）、またはＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、アスコルビルパルミテート（ＡＰ）、ユビキノン（ＣｏＱ１０）、及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）からなる群から選択される化合物を更に含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  45. 弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を包含するリポソームを調製するための方法であって、前記酸が、シュウ酸または酒石酸であり、前記方法が、
    弱塩基性抗がん化合物を含む溶液を複数のリポソームを含む懸濁液と混合することであって、前記リポソームの各々が、シュウ酸もしくは酒石酸またはそれらの塩を含む、前記混合すること、
    を含む、前記方法。
  46. 前記溶液及び前記懸濁液をインキュベートすることを更に含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記弱塩基性抗がん化合物の約８５～１００％が、前記混合後に前記複数のリポソーム内に組み込まれる、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記弱塩基性抗がん化合物の約９５～１００％が、前記混合後に前記複数のリポソーム内に組み込まれる、請求項４５に記載の方法。
  49. 前記インキュベートする工程が、室温（ＲＴ）で行われる、請求項４６に記載の方法。
  50. 前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記インキュベートする工程が、約５～２５分である、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記インキュベートする工程が、室温（ＲＴ）で行われ、続いて２～８℃でインキュベートする、請求項４６に記載の方法。
  53. 室温での前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、請求項５２に記載の方法。
  54. ２～８℃での前記インキュベートする工程が、約６０～９６０分である、請求項５２に記載の方法。
  55. 前記インキュベートする工程が、７０℃で行われる、請求項４６に記載の方法。
  56. 前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、請求項５５に記載の方法。
  57. 弱塩基性抗がん化合物を含む第１の容器、及び懸濁液を含む第２の容器を含むキットであって、前記懸濁液が、複数のリポソームを含み、前記複数のリポソームの各々が、前記弱塩基性抗がん化合物の酸または塩を含み、前記酸が、シュウ酸または酒石酸である、前記キット。
  58. 前記弱塩基性抗がん化合物が、凍結乾燥された弱塩基性抗がん化合物である、請求項５７に記載のキット。
  59. 前記懸濁液が、水性懸濁液である、請求項５７に記載のキット。
  60. 請求項５７に記載のキットを使用する方法であって、前記第１の容器の内容物を前記第２の容器の内容物と混合することを含む、前記方法。
  61. 前記混合が、室温で行われる、請求項６０に記載の方法。
  62. 弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含むリポソームを調製するための方法であって、前記酸が、クエン酸であり、前記方法が、
    前記弱塩基性抗がん化合物を含む溶液を複数のリポソームを含む懸濁液と混合することであって、前記複数のリポソームの各々が、酸またはその塩を含む、前記混合すること、
    を含む、前記方法。
  63. 前記溶液を前記懸濁液とインキュベートすることを更に含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記インキュベートする工程が、室温（ＲＴ）で行われる、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記インキュベートする工程が、約５～２５分である、請求項６４に記載の方法。
  67. 前記インキュベートする工程が、室温（ＲＴ）で行われ、続いて２～８℃でインキュベートする、請求項６３に記載の方法。
  68. 室温での前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、請求項６７に記載の方法。
  69. ２～８℃での前記インキュベートする工程が、約６０～９６０分である、請求項６７に記載の方法。
  70. 前記インキュベートする工程が、７０℃で行われる、請求項６３に記載の方法。
  71. 前記インキュベートする工程が、約１０～３０分である、請求項７０に記載の方法。
  72. リポソームを含む医薬組成物であって、前記リポソームが、弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含み、前記酸が、クエン酸ある、前記医薬組成物。
  73. 前記リポソームが、複数の脂質を含み、前記複数の脂質の前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩に対する重量比が、少なくとも１０対１である、請求項７２に記載の医薬組成物。
  74. 前記リポソームが、複数の遊離コレステロールを含む、請求項７２に記載の医薬組成物。
  75. 前記リポソームが、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、少なくとも１対１である、請求項７４に記載の医薬組成物。
  76. アスコルビン酸（ＡＡ）、またはＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、アスコルビルパルミテート（ＡＰ）、ユビキノン（ＣｏＱ１０）、及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）からなる群から選択される化合物を更に含む、請求項７２に記載の医薬組成物。
  77. 対象においてがんを治療する方法であって、前記方法が、
    有効量の請求項１に記載の医薬組成物を前記治療を必要とする前記対象に投与すること、
    を含む、前記方法。
  78. 前記弱塩基性抗がん化合物が、ドキソルビシン、イリノテカン、ミトキサントロンまたはそれらの組み合わせである、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記リポソームが、ポロキサマーを含む、請求項７７に記載の方法。
  80. 前記ポロキサマーが、ポロキサマー１８８である、請求項７７に記載の方法。
  81. 前記リポソームが、脂質を含み、前記脂質の前記弱塩基性抗がん化合物に対する重量比が、少なくとも１０対１である、請求項７７に記載の方法。
  82. 前記リポソームが、脂質を含み、前記脂質の前記弱塩基性抗がん化合物に対する重量比が、約１０対１～約１００対１である、請求項７７に記載の方法。
  83. 前記リポソームが、複数の脂質を含み、前記脂質の前記弱塩基性抗がん化合物に対する重量比が、約２０対１～約５０対１である、請求項７７に記載の方法。
  84. 前記リポソームが、複数の遊離コレステロールを含む、請求項７７に記載の方法。
  85. 前記リポソームが、複数のリン脂質を含む、請求項７７に記載の方法。
  86. 前記リポソームが、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、少なくとも０．５対１である、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記リポソームが、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、少なくとも０．５対１～約４対１である、請求項８４に記載の方法。
  88. 前記リポソームが、リン脂質を含み、前記リン脂質の前記遊離コレステロールに対するモル比が、約０．８６対１～約３．６８対１の範囲内である、請求項８４に記載の方法。
  89. 前記弱塩基性抗がん化合物が、ｐＨ＜６．７で前記リポソームから実質的に放出される、請求項７７に記載の方法。
  90. 前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも４０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５で前記リポソームから放出される、請求項７７に記載の方法。
  91. 前記弱塩基性抗がん化合物の５％未満が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、請求項７７に記載の方法。
  92. 前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも８０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ５で前記リポソームから放出される、請求項７７に記載の方法。
  93. 前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも１０％が、標準アッセイ条件下で約ｐＨ６．０で前記リポソームから放出される、請求項７７に記載の方法。
  94. 前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも５０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．０で前記リポソームから放出される、請求項７７に記載の方法。
  95. 前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも７％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、請求項７７に記載の方法。
  96. 前記弱塩基性抗がん化合物の少なくとも３０％が、標準アッセイ条件下でｐＨ６．７で前記リポソームから放出される、請求項７７に記載の方法。
  97. 前記リポソームが、複数の弱塩基性抗がん化合物を含み、標準アッセイ条件下で試験した場合、血清または血液中で最大約８時間のインキュベートで前記複数の弱塩基性抗がん化合物の３５～５０％超を保持する、請求項７７に記載の方法。
  98. 前記標準アッセイ条件が、ＰＢＳ緩衝液での前記リポソームの２０倍または５０倍希釈を含む、請求項９０～９７のいずれか１項に記載の方法。
  99. 前記標準アッセイ条件が、ｐＨ６．７、ｐＨ６．７、ｐＨ６．０またはｐＨ５．０でのインキュベートを含む、請求項９０～９７のいずれか１項に記載の方法。
  100. 前記標準アッセイ条件が、約２５℃または約３７℃でのインキュベートを含む、請求項９０～９７のいずれか１項に記載の方法。
  101. 前記標準アッセイ条件が、約２、約４または約８時間のインキュベートを含む、請求項９０～９７のいずれか１項に記載の方法。
  102. 前記標準アッセイ条件が、血清または血液での前記リポソームの５０倍希釈及び生理学的ｐＨ（ｐＨ６．７）で２、４、または８時間の３７℃でのインキュベートを含む、請求項９０～９７のいずれか１項に記載の方法。
  103. 前記リポソームが、実質的に球状である、請求項７７に記載の方法。
  104. 前記リポソームが、約５００～１０００μｇ／ｍＬの前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含む、請求項７７に記載の方法。
  105. 前記リポソームが、約７００～８５０μｇ／ｍＬの前記弱塩基性抗がん化合物及び酸またはその塩を含む、請求項７７に記載の方法。
  106. 前記リポソームが、無秩序な非結晶性凝集体を形成する複数の前記弱塩基性抗がん化合物を含む、請求項７７に記載の方法。
  107. 前記リポソームが、コレステロールもポロキサマー１８８も含まない、請求項７７に記載の方法。
  108. 前記リポソームが、シュウ酸、酒石酸、またはそれらの塩以外の酸性有機化合物を含まない、請求項７７に記載の方法。
  109. 前記リポソームが、前記弱塩基性抗がん化合物及びシュウ酸、酒石酸またはそれらの塩以外の酸またはその塩を含まない、請求項７７に記載の方法。
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