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CN109937046A - 脂质体抗癌组合物 - Google Patents

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CN109937046A
CN109937046A CN201780069799.1A CN201780069799A CN109937046A CN 109937046 A CN109937046 A CN 109937046A CN 201780069799 A CN201780069799 A CN 201780069799A CN 109937046 A CN109937046 A CN 109937046A
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liposome
doxorubicin
acid
pharmaceutical composition
alkalescent
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Alicias Co Ltd
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Abstract

本文提供了用于治疗癌症的方法和组合物。本文描述了脂质体包封的化学治疗剂以及制备和利用所述脂质体包封的化学治疗剂的方法，所述脂质体包封的化学治疗剂包围弱碱性抗癌化合物及其酸或盐，其中所述酸是草酸或酒石酸。

Description

脂质体抗癌组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月9日提交的62/385,763号美国临时申请的权益，所述临时申请的内容整体地且出于所有的目的并入本文。
背景技术
由于剂量限制性毒性和局部积聚不良而在肿瘤部位缺乏足够的药物浓度通常是体外有希望的抗癌剂在体内应用时失败的原因。多年来，已经开发了许多策略来改善肿瘤内药物递送，包括被动药物靶向、对肿瘤细胞的主动靶向和通过纳米载体进行的触发药物释放[2-12]。然而，在纳米载体中掺入药物可能会极大地改变它们的动力学和与细胞的相互作用特征。蒽环类抗生素多柔比星(doxorubicin)是各种恶性肿瘤的有效抗癌剂，但由于其心脏毒性副作用，其应用受到严重限制。将多柔比星包封到聚乙二醇化脂质体纳米载体中降低了典型的多柔比星相关副作用[4,5,7-8]。另外，循环时间延长[2]，并且由于增强的渗透性和保留效应，肿瘤特异性递送得到改善[3]。
含有抗癌化合物的脂质体的稳定性取决于血液中脂质体的稳定性和脂质体内药物的稳定性。脂质体内药物的稳定形式将归因于含有抗肿瘤药物的脂质体在血液中的延期和较低的毒性。已经证明多柔比星可以与若干种抗衡离子形成聚集体，所述抗衡离子诸如硫酸根[1,13-15]、磷酸根[13-14]和柠檬酸根[1,10,13-15]。多柔比星从含有不同多柔比星盐的脂质体中的泄漏行为证实多柔比星-盐聚集体决定了从脂质体中释放游离多柔比星的速率。
多柔比星是一种化学治疗药物。在脂质体多柔比星中，药物的分子被封闭(包封)在称为脂质体的脂肪包衣中。脂质体使多柔比星在体内保留更长时间[2]。这意味着将更多的化学治疗递送到癌细胞，而具有更少的对健康组织的副作用[4,5,7-8]。目前市场上已批准两种用于人用的多柔比星的脂质体制剂，即和(EU)，分别地(US)。这两种脂质体多柔比星药物目前以稍微不同的方式起作用，并且用于治疗不同类型的癌症。
纳米药物已被批准用于治疗AIDS相关的卡波西肉瘤、晚期卵巢癌和乳腺癌以及多发性骨髓瘤[4]。由聚乙二醇化磷脂和胆固醇组成，并且通过硫酸铵梯度加载。将多柔比星包封到聚乙二醇化脂质体纳米载体中降低了典型的多柔比星相关副作用[4-7]。尽管包封降低了心脏毒性并增加了循环时间[2]和肿瘤内递送[3]，但与游离制剂相比，治疗效果相当不大[6-9,11-12]。为了产生更长的循环时间和高稳定性，载体由磷脂和PEG包衣的稳健双层组成。随后，在进入肿瘤间质后，大部分药物仍保持包封，并且细胞内生物利用度(即药物在其细胞内靶位点的存在)受到限制[9]。因此，脂质体制剂向肿瘤递送更多的多柔比星，但不能有效释放活性多柔比星分子。这种具有非常缓慢的药物释放的永久状态可以解释与游离药物施用相比而不令人满意的肿瘤应答和重复施用的需要。事实上，的抗肿瘤功效受到在肿瘤部位处活性药物从脂质体中释放不良的阻碍[11]。大量已发表的报告证明，尽管观察到与游离多柔比星施用相比递送的肿瘤内多柔比星显著增加，但这种显著增加并不一定与细胞内生物利用度并且因此与治疗性多柔比星水平的增加相关[9,11-12]。在体外和体内研究游离多柔比星相对于脂质体多柔比星的动力学证明，在施用游离多柔比星后8h内，26％的药物易位至细胞核并且当达到特定浓度时杀死细胞。与游离多柔比星不同，只有0.4％的随脂质体制剂添加的多柔比星进入细胞核[12]。还已经证明，在溶酶体区室中对脂质体多柔比星的螯合导致向细胞核的递送有限。这种截留使得递送的多柔比星的生物可利用浓度显著降低，并且因此与游离多柔比星相比在杀死肿瘤细胞方面是无效的[12]。另外，这种药物与局部炎症组织反应(称为掌跖感觉丧失性红斑(PPE))相关[10]，这是加载聚乙二醇化多柔比星的脂质体的缺点。的主要副作用是口腔炎和皮肤毒性[7,10]。事实上，尽管聚乙二醇化降低了心脏毒性，但长循环时间常常导致称之为掌跖感觉丧失性红斑(PPE)的皮肤毒性，[7,10,38-39]，这是加载聚乙二醇化多柔比星的脂质体的缺点并且尚待克服。
包括卵磷脂酰胆碱/胆固醇，并通过柠檬酸盐梯度加载多柔比星。尽管多柔比星-柠檬酸盐聚集体的形成导致在pH 4.5-5.5下相对较高的药物释放速率(在酸性溶酶体环境中的理想结果)[1,13-15]，但这也导致多柔比星在生理pH和37℃下从脂质体中的额外泄漏[14]。这种释放曲线将导致脂质体在血液中循环时多柔比星从脂质体中损失，并且降低掺入的Dox的有效浓度[14]。长期来看(取决于施用方案)，这可能导致配制的多柔比星的较高毒性和较低功效以及作为脂质体悬浮液的较短产品保质期。为了克服稳定性问题，将以三个小瓶系统供应，所述三个小瓶系统要求调制药房遵循多步骤方案用于在施用至患者之前制备加载多柔比星的脂质体。实际上，所述程序涉及加热和剧烈摇动，并且包括多个步骤，所述多个步骤包括在不同介质中单独重构脂质体材料和多柔比星、调节空脂质体的pH、将材料加热至55-60℃、将多柔比星加载到脂质体中以及在使用前将材料冷却至RT。这是非常不方便在床边制备的制剂。
因此，现有疗法有改进的余地。尽管作为脂质体悬浮液具有优异的稳定性，并且因此是呈有吸引力的一个小瓶呈递形式，但的抗肿瘤功效受到其在肿瘤部位从脂质体中释放活性药物减少或受限的阻碍。与相比，在酸性pH下(肿瘤部位)显示出明显更高的多柔比星释放，但在生理pH下表现出多柔比星从脂质体中的泄漏，导致药物的安全性和功效降低。产品还要求药房遵循麻烦的多步骤方案用于在施用至患者之前制备加载多柔比星的脂质体。
因此，需要开发相对于已知的市售产品(例如，和)具有改进的药物释放曲线并且具有简单、有效和有吸引力的制剂制备系统的新型脂质体纳米载体。在此提供了针对本领域中的这些和其他需要的解决方法。
发明内容
本公开在此尤其提供了抗癌组合物及其生产方法。在某些方面，组合物为包含脂质体的药物组合物。脂质体包围弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。在若干实施方案中，酸是草酸或酒石酸。在若干实施方案中，弱碱性抗癌化合物是多柔比星、伊立替康、米托蒽醌或其组合。
在若干实施方案中，脂质体包含泊洛沙姆。在若干实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
在若干实施方案中，脂质体包含多种脂质化合物。多种脂质与弱碱性抗癌剂的重量比可以为至少20/1。在若干实施方案中，脂质体包含多种脂质化合物，并且多种脂质与弱碱性抗癌剂的重量比为约20/1至约100/1。在若干实施方案中，脂质体包含多种脂质化合物，并且多种脂质与弱碱性抗癌剂的重量比为20/1至约50/1。
在若干实施方案中，弱碱性抗癌化合物基本上仅在酸性pH下从脂质体中释放。在若干实施方案中，在标准测定条件下、在pH 5.0至6.7下至少10-100％的弱碱性抗癌化合物从脂质体中释放。在一实施方案中，在标准测定条件下、在pH 7.4下少于5％的弱碱性抗癌化合物从脂质体中释放。在若干实施方案中，标准测定条件包括在pH 5.0或更高(例如，pH5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 6.7、pH 7.0或pH 7.4或前述pH的任何中间值)的PBS缓冲液或人血清或人血液中进行20X和/或50X稀释，并且在37℃下温育2、4或8小时。在若干实施方案中，标准测定条件包括在PBS缓冲液中进行20X和/或50X稀释。在若干实施方案中，标准测定条件包括在具有约pH 5.0的PBS缓冲液中温育。在若干实施方案中，标准测定条件包括在具有约pH 5.5的PBS缓冲液中温育。在若干实施方案中，标准测定条件包括在具有约pH6.0的PBS缓冲液中温育。在若干实施方案中，标准测定条件包括在具有约pH 6.5的PBS缓冲液中温育。在若干实施方案中，标准测定条件包括在具有约pH 6.7的PBS缓冲液中温育。在若干实施方案中，标准测定条件包括在具有约pH 7.0的PBS缓冲液中温育。在若干实施方案中，标准测定条件包括在具有约pH 7.4的PBS缓冲液中温育。在若干实施方案中，标准测定条件包括在人血清或人血液中温育。在若干实施方案中，标准测定条件包括在37℃下温育约2小时。在若干实施方案中，标准测定条件包括在37℃下温育约4小时。在若干实施方案中，标准测定条件包括在37℃下温育约6小时。
在若干实施方案中，脂质体基本上是球形的。在若干实施方案中，药物组合物包含多个脂质体，所述多个脂质体具有由通过动态光散射测量的强度平均颗粒直径(Z-平均值)确定的约60-80nm的平均最长尺寸。在若干实施方案中，药物组合物包含多个脂质体，所述多个脂质体具有由通过动态光散射测量的基于数量的颗粒直径确定的约10-30nm的平均最长尺寸。在若干实施方案中，药物组合物包括多个脂质体，所述多个脂质体具有通过低温透射电子显微镜确定的10-30nm的平均最长尺寸。
在若干实施方案中，脂质体包含约500-1000μg/mL的弱碱性抗癌化合物及任选其酸或盐。在若干实施方案中，脂质体包含约700-850μg/mL的弱碱性抗癌化合物及其酸或盐(如果可适用)。在若干实施方案中，脂质体包含形成聚集体的多种弱碱性抗癌化合物。聚集体可以为非结晶的。非结晶聚集体可以为部分或完全紊乱型的(无序的)。在若干实施方案中，脂质体包含多种弱碱性抗癌化合物，并且当在标准储存条件下在2-8℃下储存40天后，保留多种弱碱性抗癌化合物的多于90％。
在若干实施方案中，脂质体不包含胆固醇或泊洛沙姆188。在若干实施方案中，脂质体不包含除草酸、酒石酸或其盐之外的酸性有机化合物。在若干实施方案中，脂质体不包含除弱碱性抗癌化合物之外的活性剂。在若干实施方案中，脂质体不包含除弱碱性抗癌化合物之外的药物。在若干实施方案中，脂质体不包含除弱碱性抗癌化合物之外的药学活性化合物。在若干实施方案中，脂质体不包含除弱碱性抗癌化合物之外的任何抗癌化合物(例如，脂质体包含仅具有一种化学结构的弱碱性抗癌化合物，包括其盐)。
在若干实施方案中，通过将弱碱性抗癌化合物加载到未加载的脂质体中然后在室温下温育来形成脂质体。在一些实施方案中，将未加载的脂质体储存约30天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约60天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约90天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约120天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约150天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约180。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约210天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约240天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约270天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约300天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约330天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约360天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约390天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约420天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约450天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约480天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约510天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体储存约540天。在若干实施方案中，将未加载的脂质体在标准储存条件下在2-8℃下储存。在若干实施方案中，在上述任何条件下储存的未加载的脂质体在加载弱碱性抗癌化合物时保留多于90％的弱碱性抗癌化合物。在若干实施方案中，在标准测定条件下、在pH 5.0下至少40-80％的弱碱性抗癌化合物从脂质体中释放。在若干实施方案中，在pH 6.0下至少20-60％的弱碱性抗癌化合物从脂质体中释放。在若干实施方案中，在标准测定条件下、在pH 6.7下至少7-30％的弱碱性抗癌化合物从脂质体中释放。在一些实施方案中，在标准测定条件下、在pH 7.4下少于5％的弱碱性抗癌化合物从脂质体中释放。
在另外的方面，本文提供的公开内容包括用于制备包围(即包含或包封)弱碱性抗癌化合物、弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的脂质体的方法。在若干实施方案中，酸是草酸或酒石酸。所述方法包括：将其弱碱性抗癌化合物的溶液与包含含有包封的酸或盐的脂质体的悬浮液混合；并且将其弱碱性抗癌化合物的溶液与包含含有包封的酸或盐的脂质体的悬浮液一起温育。在若干实施方案中，用于与含有包封的酸或盐的脂质体的悬浮液混合的其弱碱性抗癌化合物的约85-100％保留在脂质体内。在若干实施方案中，用于与含有包封的酸或盐的脂质体的悬浮液混合的其弱碱性抗癌化合物的约90-100％保留在脂质体内。在若干实施方案中，温育步骤在室温下发生。在温育步骤中为约10-30分钟。在若干实施方案中，温育步骤为约5-25分钟。
在另外的方面，本文提供的公开内容包括试剂盒，所述试剂盒包括第一小瓶和第二小瓶，所述第一小瓶包含其弱碱性抗癌化合物，所述第二小瓶包含含有包封的酸或盐的脂质体的悬浮液。在若干实施方案中，第一小瓶的其弱碱性抗癌化合物是其冻干的弱碱性抗癌化合物。在若干实施方案中，第二小瓶的含有包封的酸或盐的脂质体的悬浮液是水性脂质体悬浮液。
在另外的方面，本文提供的公开内容包括使用上述试剂盒的方法，所述方法包括将第一小瓶的内容物与第二小瓶的内容物混合。在若干实施方案中，混合是在室温下。
在一实施方案中，本文提供的公开内容包括用于制备包围弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的脂质体的方法。在若干实施方案中，酸为柠檬酸。所述方法包括将弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的溶液与包含含有包封的其酸或盐的脂质体的悬浮液混合；并且将弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的溶液与包含含有包封的其酸或盐的脂质体的悬浮液一起温育。
在一实施方案中，本文提供的公开内容包括药物组合物，所述药物组合物包含脂质体，所述脂质体包围弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。在若干实施方案中，酸为柠檬酸。在若干实施方案中，脂质体包含多种脂质化合物，并且多种脂质与弱碱性抗癌剂的重量比为至少20/1。
在另外的方面，本文的公开内容提供了治疗受试者的癌症的方法。所述方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的药物组合物。药物组合物含有包围弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的脂质体。在若干实施方案中，酸是草酸或酒石酸。弱碱性抗癌化合物对所述癌症具有抗癌活性。
除非明确地或清楚地从实施方案或方面的上下文中排除，否则本文所述的每个方面和实施方案能够一起使用。
附图说明
图1是示出(A)体循环、(B)肿瘤和局部环境以及(C和D)细胞内环境中的pH梯度的示意图。(E)示出在pH 8.0-5.0范围内的希望的释放曲线。
图2是用于体内研究的实验设计的示意图。
图3是示出在37℃下温育8小时后释放到溶出介质中的脂质体内多柔比星的百分比的条形图。在70℃下进行多柔比星到脂质体中的加载。每对上的左侧条-在pH 5下的释放；每对上的右侧条-在pH 7.4下的释放。曲线上的每个点表示2-6个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。
图4是通过(NH4)2HPO4梯度加载多柔比星的EPC/Chol脂质体的(C-TEM)显微图[13]。
图5是加载到通过柠檬酸盐缓冲的脂质体中的多柔比星的(C-TEM)图像[15]。
图6A和图6B示出了在柠檬酸盐[15]中制备的脂质体(图6A)和在(NH4)2SO4[15,25]中制备的脂质体(图6B)的低温透射电子显微镜(cTEM)图像。
图7A、7B和7C示出了含有多柔比星-草酸盐的脂质体(批号647-2-157)的低温透射电子显微镜表征。图7A具有27K的放大倍数并且图7B和7C具有50K的放大倍数。
图8是示出脂质比药物(或等同地称之为脂质/药物或脂质:药物)比例对8小时处释放到溶出介质中的脂质体内多柔比星百分比的影响的图示。在70℃下进行多柔比星到含有草酸盐的脂质体中的加载。释放实验在37℃下进行。在pH 5.0下的释放-顶部线。在pH7.4下的释放-底部线。曲线上的每个点表示两至三个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。
图9是示出安慰剂、游离多柔比星、和含有多柔比星-草酸盐的脂质体对小鼠死亡率的影响的图示。将小鼠分成4组(每个Rx组中8只小鼠；安慰剂组中6只小鼠)。通过静脉内(iv)注射将所有测试物品连续三天施用至小鼠。使每个Rx治疗组每次注射接受3mg/kg多柔比星。第1组(安慰剂)接受无药物脂质制剂。第2组接受多柔比星草酸盐脂质体(批号647-2-13)。第3组接受第4组接受游离多柔比星。治疗也在图示中指示出。在图示中，将B淋巴瘤细胞施用日定义为第0天
图10是示出脂质/药物比例对8小时处释放到溶出介质中的脂质体内多柔比星百分比的影响的图示。在70℃下进行多柔比星到含有酒石酸盐的脂质体中的加载。释放实验在37℃下进行。在pH 5.0下的释放-顶部线。在pH 7.4下的释放-底部线。曲线上的每个点表示两至三个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。
图11是示出脂质/药物比例对8小时处释放到溶出介质中的脂质体内多柔比星百分比的影响的图示。在室温下进行多柔比星到含有草酸盐的脂质体中的加载。释放实验在37℃下进行。在pH 5.0下的释放-顶部线。在pH 7.4下的释放-底部线。曲线上的每个点表示两至三个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。
图12是示出脂质/药物比例对8小时处释放到溶出介质中的脂质体内多柔比星百分比的影响的图示。在室温下进行多柔比星到含有酒石酸盐的脂质体中的加载。释放实验在37℃下进行。在pH 5.0下的释放-顶部线。在pH 7.4下的释放-底部线。曲线上的每个点表示两至三个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。
图13是示出不同的加载温度对在37℃下测定的释放到溶出介质中的脂质体内多柔比星百分比的影响的图示。在70℃下进行多柔比星到含有草酸盐的脂质体中的加载：a)在pH 5.0下的释放(顶部实线)；b)在pH 7.4下的释放(底部实线)；曲线上的每个点表示四个独立实验中获得的数据的平均值±STD。在室温下进行多柔比星到含有草酸盐的脂质体中的加载：c)在pH 5.0下的释放(顶部虚线)；在pH 7.4下的释放(底部虚线)；曲线上的每个点表示两个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。
图14是示出不同的加载温度对在37℃下测定的释放到溶出介质中的脂质体内多柔比星百分比的影响的图示。在70℃下进行多柔比星到含有酒石酸盐的脂质体中的加载：a)在pH 5.0下的释放(顶部实线)；b)在pH 7.4下的释放(底部实线)；曲线上的每个点表示两个独立实验中获得的数据的平均值±STD。在室温下进行多柔比星到含有酒石酸盐的脂质体中的加载。c)在pH 5.0下的释放(顶部虚线)；在pH 7.4下的释放(底部虚线)；曲线上的每个点表示两个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。
图15是示出在37℃下温育8小时后释放到溶出介质中的脂质体内多柔比星的百分比的图示。在室温下进行多柔比星到脂质体中的加载。每对的左侧条-在pH 5下释放；每对的右侧条-在pH 7.4下释放。曲线上的每个点表示2-3个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。
图16是示出各种抗衡离子对从脂质体中的pH依赖性多柔比星释放的影响的图示。与和“Myocet”比较。将脂质体材料在溶出介质中进行20X稀释并且在pH 7.4、6.7、6.0和5.0下在37℃下进行释放实验，持续8小时。曲线上的每个点表示2-3个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。制剂组合物、脂质比药物(即，脂质/药物)比例和磷脂比游离胆固醇(即，磷脂/游离胆固醇或PL/FC)比例示出在表28e-28g中。
图17是示出各种抗衡离子对从脂质体中的pH依赖性多柔比星释放的影响的图示。与和“Myocet”比较。将脂质体材料在溶出介质中进行50X稀释并且在pH 7.4、6.7、6.0和5.0下在37℃下进行释放实验，持续8小时。曲线上的每个点表示2-3个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。制剂组合物、脂质/药物比例和磷脂/游离胆固醇(PL/FC)比例示出在表28e-28g中。
图18是示出脂质/药物比例和磷脂/游离胆固醇(PL/FC)比例对从脂质体中的pH依赖性多柔比星释放的影响的图示。与和“Myocet”比较。将脂质体材料在溶出介质中进行20X稀释并且在pH 7.4、6.7、6.0和5.0下在37℃下进行释放实验，持续8小时。曲线上的每个点表示2-3个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。制剂组合物、脂质/药物比例和磷脂/游离胆固醇(PL/FC)比例示出在表28e-28g中。
图19是示出脂质/药物比例和磷脂/游离胆固醇(PL/FC)比例对从脂质体中的pH依赖性多柔比星释放的影响的图示。与和“Myocet”比较。将脂质体材料在溶出介质中进行20X稀释并且在pH 7.4、6.7、6.0和5.0下在37℃下进行释放实验，持续8小时。曲线上的每个点表示2-3个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。制剂组合物、脂质/药物比例和磷脂/游离胆固醇(PL/FC)比例示出在表28e-28g中。
图20是示出脂质/药物比例对脂质体的血清稳定性的影响的图示。与和“Myocet”比较。将脂质体材料在人血清中进行50X稀释并且在37℃下针对2、4和8小时监测脂质体的稳定性。曲线上的每个点表示2-3个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。制剂组合物、脂质/药物比例和磷脂/游离胆固醇(PL/FC)比例示出在表28e和28h中。
图21是示出磷脂/游离胆固醇(PL/FC)比例对脂质体的血清稳定性的影响的图示。与和“Myocet”比较。将脂质体材料在人血清中进行50X稀释并且在37℃下针对2、4和8小时监测脂质体的稳定性。曲线上的每个点表示2-3个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。制剂组合物、脂质/药物比例和磷脂/游离胆固醇(PL/FC)比例示出在表28e和28h中。
图22是示出在37℃下温育2小时后释放到溶出介质(pH 5)中的脂质体内伊立替康的百分比的图示。曲线上的每个点表示2-6个独立实验中获得的数据的平均值±STD。对于每个实验，所有测量以一式六份进行。
图23A和图23B是在pH 7.4和pH 5.0下的米托蒽醌的图像。图23A示出时间0处的溶液。图23B示出时间24小时处的溶液。在2-8℃下进行米托蒽醌到脂质体中的加载。
具体实施方式
本公开描述了用于产生稳定抗癌化合物及其酸或盐和适于药物递送的富含脂质的亚微米颗粒(具有脂质体的纳米颗粒)的组合物和方法。本公开的组合物和方法可以类似地应用于脂质体中的其他药物盐。多柔比星盐的组合物和根据本文公开的方法制备的脂质体的结构产生理想的生物和物理化学性能(pH依赖性药物释放曲线)。
在利用抗癌化合物多柔比星的本公开的实施方案中，与已知的脂质体包封的多柔比星疗法相比，本公开的治疗用途在其更理想的释放曲线方面得到改善，所述释放曲线包括：在生理pH～7.4下(在循环中时)从脂质体中释放多柔比星的速率低，并且在更酸性的pH5.0-6.7下(例如在暴露于局部肿瘤环境或暴露于在癌细胞内化加载多柔比星的脂质体后的内体/溶酶体环境之后)释放速率显著更高。
有许多已发表的报告表明了正常组织与肿瘤部位之间pH梯度的存在和重要性，以及从脂质体中的pH依赖性药物释放的影响，释放不仅用于递送，还用于使得癌细胞可利用游离药物(通过高效释放)[1,10,13-15,25,40-42]。许多实体瘤与周围正常组织之间的一个主要差异是营养和代谢环境。肿瘤的功能性脉管系统通常不足以满足扩大的肿瘤细胞群的营养需求，导致氧气和许多其他营养素的缺乏。在厌氧条件下产生乳酸和在能量不足的环境中水解ATP促成在许多肿瘤类型中发现的酸性微环境[35]。人和啮齿动物正常组织中的pH范围为7.00至8.06，而在恶性组织中测定出更广范围的pH值，在人类和啮齿动物肿瘤中均为约pH 5.8至pH 7.6[1,41-42]
因此，来自脂质体的多柔比星的理想释放曲线如下：在酸性pH 5.0-6.7下(即在暴露于局部肿瘤环境或暴露于在癌细胞内化脂质体后的内体/溶酶体环境之后)最大释放速率，同时抑制在生理pH～7.4(在循环中)下从脂质体中释放。
定义
如本文所用，“脂质体”主要是由脂质双层构成的球形纳米颗粒。在若干实施方案中，脂质体可以包封治疗剂用于递送。脂质体的脂质含量可以变化，从而改变脂质体大小、稳定性、溶解度、曲率等。脂质的实例包括但不限于：胆固醇、磷脂酰胆碱(PC)产物/衍生物(各种碳链长度的脂肪酸，饱和、多不饱和及混合的酸性PC)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸酯(DMPA)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸酯(DPPA)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(DMPG)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(DPPG)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(DOPG)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DMPS)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DPPS)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPC)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-mPEG-2000)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇-胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-5000](DSPE-mPEG-5000)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-2000)；1,2-硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；L-α-磷脂酰胆碱，氢化的(氢化大豆PC)和2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(溶血PC)。
如本文所用，术语“包围”、“包封”或“保留”意指包括在例如脂质体内。在本文的权利要求的上下文中，这也可以称为“包含”。例如，脂质体可以包围治疗剂，诸如抗癌化合物，或其酸或盐。在若干实施方案中，当被包围时，治疗剂可以随时间从脂质体中消散或扩散出。
如本文所用，术语“弱碱性抗癌化合物”包括具有弱碱性pKa的可用于治疗癌症或赘生性疾病的任何治疗剂。在若干实施方案中，弱碱性pH通过约pH 7.0-10.0的pKa指示。在若干实施方案中，弱碱性pH通过约pH 7.0至9.0的pKa指示。在若干实施方案中，弱碱性pH通过约pH 7.5至9.0的pKa指示。在若干实施方案中，弱碱性pH通过约pH 8.0至9.0的pKa指示。在若干实施方案中，抗癌剂具有多于一个的pKa，其中任何一个可以落入如上所述的弱碱范围内。
术语“多柔比星”根据其平常和普通的含义使用。多柔比星是一种最初从波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)获得的抗癌化合物。多柔比星也可称为阿霉素(Adriamycin)、Doxil、Rubex、Adriablastin和doxorubicine。在若干实施方案中，多柔比星是弱碱性抗癌化合物。多柔比星的结构如本文所示。
术语“伊立替康”根据其平常和普通的含义使用。伊立替康是可用于已经转移(扩散至身体其他部位)的结肠直肠癌(包括已复发(重现)或用其他化学疗法未见好转的转移性癌症)的抗癌化合物，并且可用于治疗在基于吉西他滨的疗法后而疾病进展之后的胰腺的转移性腺癌的患者。伊立替康也可称为Camptosar；97682-44-5；(+)-伊立替康；Irinotecanum；和Irinotecanum。在若干实施方案中，伊立替康是弱碱性抗癌化合物。伊立替康的结构如本文所示。
术语“米托蒽醌”根据其平常和普通的含义使用。米托蒽醌是可用于急性髓性白血病(AML)和前列腺癌的抗癌化合物。它也可以用作激素难治性(对激素治疗没有应答)的晚期疾病的姑息治疗。米托蒽醌也可称为65271-80-9；Mitoxanthrone；Mitozantrone；DHAQ；和Mitoxantron。在若干实施方案中，米托蒽醌是弱碱性抗癌化合物。米托蒽醌的结构如本文所示。
如本文所用，术语“其酸或盐”是指所述化合物的任何药学上可接受的酸或盐。适合与抗癌化合物一起使用的示例性酸或盐包括但不限于，1-羟基-2-萘甲酸、2,2-二氯乙酸、2-羟基乙磺酸、2-氧代戊二酸、4-乙酰氨基苯甲酸、4-氨基水杨酸、乙酸、己二酸、抗坏血酸(L)、天冬氨酸(L)、苯磺酸、苯甲酸、樟脑酸(+)、樟脑-10-磺酸(+)、羊蜡酸(癸酸)、羊油酸(己酸)、羊脂酸(辛酸)、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸(D)、葡萄糖酸(D)、葡糖醛酸(D)、谷氨酸、戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、异丁酸、乳酸(DL)、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸(-L)、丙二酸、扁桃酸(DL)、甲磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、烟酸、硝酸、油酸、草酸、棕榈酸、扑酸、磷酸、丙酸、焦谷氨酸(-L)、水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸(+L)、硫氰酸、甲苯磺酸(p)和十一碳烯酸
如本文所用，术语“紊乱型”或“非结晶”是指化合物的无序多晶型状态。这种紊乱型状态可能类似于无定形状态。在紊乱型非结晶聚集体中，分子不形成有序的晶格。在若干实施方案中，紊乱型聚集体还可包括任何非结晶结构，和胶体。在若干实施方案中，一些紊乱型和非结晶聚集体可含有一些纤维状结构。
如本文所用，术语“基本上释放”表明大部分内容物例如从脂质体中释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约5％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约10％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约20％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约30％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约40％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约50％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约60％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约70％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约80％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约90％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约95％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约97％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约98％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本上释放意指多于约99％或更多包围的内容物得以释放。在若干实施方案中，基本释放是pH驱动的，例如，抗癌剂基本上仅在酸性pH下释放。
如本文所用，术语“标准测定条件(a standard assay condition/standardassay conditions)”是指受控的一组测定条件，包括时间、温度、pH等的标准量度。在若干实施方案中，标准测定条件包括在PBS中进行20X和/或50X稀释。在若干实施方案中，标准测定条件包括在血清或血液中进行20X和/或50X稀释。在若干实施方案中，本文所述的用于释放测定的标准测定条件是在约25℃下。在若干实施方案中，本文所述的用于释放测定的标准测定条件是在约37℃下。在若干实施方案中，本文所述的用于释放测定的标准测定条件包括温育约2、4、8小时或前述的任何中间时间段或超过约8小时。在若干实施方案中，本文所述的用于释放测定的标准测定条件包括温育约2小时。在若干实施方案中，本文所述的用于释放测定的标准测定条件包括温育约4小时。在若干实施方案中，本文所述的用于释放测定的标准测定条件包括温育约8小时。在若干实施方案中，本文所述的用于释放测定的标准测定条件包括温育超过8小时。在若干实施方案中，本文所述的用于释放测定的标准测定条件包括在约pH 7.4下温育。在若干实施方案中，本文所述的用于释放测定的标准测定条件包括在约pH 6.7下温育。在若干实施方案中，本文所述的用于释放测定的标准测定条件包括在约pH 6.0下温育。在若干实施方案中，本文所述的用于释放测定的标准测定条件包括在约pH 5.0下温育。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的PBS中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的PBS中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的PBS中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的PBS中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的血清或血液中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH7.4的血清或血液中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的血清或血液中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的血清或血液中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的血清或血液中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH6.7的血清或血液中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的血清或血液中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的血清或血液中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的血清或血液中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH6.0的血清或血液中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的血清或血液中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的血清或血液中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的血清或血液中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH5.0的血清或血液中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的血清或血液中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的血清或血液中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的血清或血液中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH7.4的血清或血液中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的血清或血液中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的血清或血液中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的血清或血液中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH6.7的血清或血液中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的血清或血液中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的血清或血液中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的血清或血液中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH6.0的血清或血液中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的血清或血液中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的血清或血液中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的血清或血液中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH5.0的血清或血液中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的血清或血液中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在25℃下或在约25℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的血清或血液中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的血清或血液中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH7.4的血清或血液中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的血清或血液中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的血清或血液中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的血清或血液中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH6.7的血清或血液中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的血清或血液中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的血清或血液中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的血清或血液中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH6.0的血清或血液中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的血清或血液中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的血清或血液中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的血清或血液中的20X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH5.0的血清或血液中的20X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的血清或血液中的20X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的血清或血液中的20X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的血清或血液中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH7.4的血清或血液中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的血清或血液中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 7.4的血清或血液中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的血清或血液中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH6.7的血清或血液中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的血清或血液中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.7的血清或血液中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的血清或血液中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH6.0的血清或血液中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的血清或血液中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 6.0的血清或血液中的50X稀释液中温育超过8小时。
因此，在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的血清或血液中的50X稀释液中温育约2小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH5.0的血清或血液中的50X稀释液中温育约4小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的血清或血液中的50X稀释液中温育约8小时。在一些实施方案中，用于释放测定的标准测定条件是在37℃下或在约37℃下，并且包括在于具有约pH 5.0的血清或血液中的50X稀释液中温育超过8小时。
如本文所用，术语“标准储存条件(a standard storage condition/standardstorage conditions)”是指为了适当储存化合物(例如药物化合物)而控制的条件。在若干实施方案中，可以控制某些标准量度，诸如时间、温度、湿度等。在若干实施方案中，标准储存条件包括在2-8℃、环境相对湿度下储存。在若干实施方案中，环境相对湿度包括约10％至约90％相对湿度之间的任何范围。在若干实施方案中，环境相对湿度包括约10％的相对湿度。在若干实施方案中，环境相对湿度包括约20％的相对湿度。在若干实施方案中，环境相对湿度包括约30％的相对湿度。在若干实施方案中，环境相对湿度包括约40％的相对湿度。在若干实施方案中，环境相对湿度包括约50％的相对湿度。在若干实施方案中，环境相对湿度包括约60％的相对湿度。在若干实施方案中，环境相对湿度包括约70％的相对湿度。在若干实施方案中，环境相对湿度包括约80％的相对湿度。在若干实施方案中，环境相对湿度包括约90％的相对湿度。
如本文所用，“基本上球形”意指朝向球形形状的平均趋势，例如，通过任何轴的直径大致相等。在若干实施方案中，直径在长度上没有不同。在若干实施方案中，直径与任何其他轴处的直径在长度上相差不超过约20％或更小。在若干实施方案中，在基本上球形的形状内直径与任何其他轴处的直径在长度上相差不超过约20％或更小。在若干实施方案中，在基本上球形的形状内直径与任何其他轴处的直径在长度上相差不超过约15％或更小。在若干实施方案中，在基本上球形的形状内直径与任何其他轴处的直径在长度上相差不超过约10％或更小。在若干实施方案中，在基本上球形的形状内直径与任何其他轴处的直径在长度上相差不超过约9％或更小。在若干实施方案中，在基本上球形的形状内直径与任何其他轴处的直径在长度上相差不超过约8％或更小。在若干实施方案中，在基本上球形的形状内直径与任何其他轴处的直径在长度上相差不超过约7％或更小。在若干实施方案中，在基本上球形的形状内直径与任何其他轴处的直径在长度上相差不超过约6％或更小。在若干实施方案中，在基本上球形的形状内直径与任何其他轴处的直径在长度上相差不超过约5％或更小。在若干实施方案中，在基本上球形的形状内直径与任何其他轴处的直径在长度上相差不超过约4％或更小。在若干实施方案中，在基本上球形的形状内直径与任何其他轴处的直径在长度上相差不超过约3％或更小。在若干实施方案中，在基本上球形的形状内直径与任何其他轴处的直径在长度上相差不超过约3％或更小。在若干实施方案中，在基本上球形的形状内直径与任何其他轴处的直径在长度上相差不超过约1％或更小。
如本文所用，术语“平均最长尺寸”是指基本上球形物体的最长尺寸的平均值。在一些实施方案中，平均最长尺寸可以通过强度平均颗粒直径(Z-平均值)测量。在一些实施方案中，强度平均颗粒直径(Z-平均值)由ISO 13321(国际标准化组织1996)中定义的累积量分析计算。在一些实施方案中，平均最长尺寸可以通过基于数量的颗粒直径测量。在一些实施方案中，根据材料的强度分布和光学特性计算根据数量的颗粒大小分布。颗粒大小与对分布的贡献之间存在一次幂关系。
如本文所用，术语“室温”或“RT”是指在标准室内温度下进行的测定的温度。在若干实施方案中，室温是指在没有任何额外加热或冷却的情况下的测定实施。在若干实施方案中，室温为约22-25℃的受控温度。在若干实施方案中，室温为25℃。
如本文所用，“脂质体溶液”、“脂质体的水溶液”、“脂质体悬浮液”或“脂质体的水性悬浮液”是指脂质体的液体溶液或悬浮液。脂质体可以悬浮在多种溶剂、缓冲液或溶液中。在若干实施方案中，脂质体悬浮在水相中。在若干实施方案中，脂质体悬浮在具有pH7.0-6.7的生理缓冲液中。
如本文所用，术语“泊洛沙姆”是非离子共聚物。泊洛沙姆包括聚氧丙烯的中心疏水链和聚氧乙烯的两个侧翼链。在若干实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。泊洛沙姆188的另外名称为F68、P188、P188和聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)。P188的CAS编号为9003-11-6。P188具有以下结构，其中X为80，Z为80并且Y为27：
如本文所用，术语“胆固醇”或“胆固醇化合物”是指甾醇或修饰的类固醇。非限制性实例包括：胆固醇、羟基胆固醇、胆甾烷(cholestan/cholestane)、酮胆甾烷醇、菜油甾醇、胆固醇环氧化物、胆固醇-peg、羊毛甾醇、酯化胆固醇。术语“游离胆固醇”是指未酯化的胆固醇，具有以下通式C27H46O和结构：
如本文所用，术语“磷脂(phospholipid/phospholipids)”也称为磷脂(phosphatide/phosphatides)，是指含磷和/或脂肪酸的物质的种类成员。通常，磷脂由一个磷酸酯基团、两个醇和一个或两个脂肪酸组成。在分子的一端是磷酸酯基团和一个醇；该端是极性的，即具有电荷，并且被水吸引(亲水性)。另一端由脂肪酸组成，是中性的；它是疏水性且水不溶性的，但是脂溶性的。磷脂的一些非限制性和示例性实例包括但不限于，磷脂酸(磷脂酸酯)、磷脂酰胆碱(pc)产物/衍生物(各种碳链长度的脂肪酸，饱和、多不饱和及混合的酸性PC)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸酯(DMPA)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸酯(DPPA)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(DMPG)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(DPPG)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(DOPG)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DMPS)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DPPS)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPC)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-mPEG-2000)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇-胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-5000](DSPE-mPEG-5000)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-2000)；1,2-硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；L-α-磷脂酰胆碱，氢化的(氢化大豆PC)和2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(溶血PC)；磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇磷酸(PIP)、磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)、鞘磷脂及其任何衍生物。
如本文所用，术语“冻干(lyophilize/lyophilizing/lyophilized/lyophilization)”也称为冷冻干燥或冷干，是指可以用于保存材料或化合物的脱水方法。冻干可以涉及冷冻材料或化合物，并且然后降低周围压力以使在冷冻的材料或化合物中的冻结水或液体组分成为气相。
“治疗(treatment/“treating/treat)”定义为用药剂对疾病、病症或病状作用以减少或改善疾病、病症或病状和/或其症状的有害的或任何其他不良影响。“治疗”病状或有需要的受试者是指(1)采取步骤以获得有益或所需的结果，包括临床结果，诸如症状的减少；(2)抑制疾病，例如，阻止或减少疾病或其临床症状的发展；(3)缓解疾病，例如引起疾病或其临床症状消退；或(4)延迟疾病。例如，有益或所需的临床结果包括但不限于癌细胞的减少和/或消除以及癌细胞转移的预防和/或减少。
如本文所用，“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将组合物物理引入至受试者。用于本文所述组合物的施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指非肠内和局部施用的、通常是通过注射的施用方式，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。可替代地，本文所述的组合物可以通过非肠胃外途径施用，所述非肠胃外途径诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如以鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部方式。施用还可进行例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内进行。
“抗癌剂”或“抗癌化合物”是具有抗癌活性的治疗剂，其可用于治疗或预防癌症。抗癌剂可以是大分子或小分子。抗癌剂的实例包括抗体、小分子和大分子或其组合。“抗癌活性”的实例包括但不限于减少癌细胞数量、减小癌症大小、杀伤癌细胞、减少和/或抑制转移以及减少癌细胞生长和/或增殖。
术语“受试者”或“有需要的受试者”是指罹患疾病或病状或具有将来患有疾病或病状的可能性的活生物体。术语“患者”是指已经患有疾病或病状的活生物体，例如，已被诊断患有疾病或病状或具有与疾病或病状相关的一种或多种症状的患者。非限制性实例包括人、其他哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、牛、鹿，以及其他非哺乳动物。在一些实施方案中，患者为人。
根据本文提供的方法，可以向受试者施用有效量的本文提供的一种或多种药剂、组合物或复合物(所述药剂、组合物或复合物全部在本文中可互换使用)(例如，包含脂质体的药物组合物，所述脂质体包围抗癌化合物及其酸或盐)。术语“有效量”和“有效剂量”可互换使用。术语“有效量”定义为产生所希望效果(例如，治疗疾病诸如癌症)所需的任何量。用于施用药剂的有效量和时间表可由本领域技术人员凭经验确定。用于施用的剂量范围是足够大以产生所希望效果的那些。剂量不应太大，以致于导致大量的不良副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量可以随着年龄、病状、性别、疾病类型、疾病或病症的程度、施用途径或者方案中是否包括其他药物而变化，并且可由本领域技术人员确定。在任何禁忌症的情况下，可由个体医师调整剂量。剂量可变化，并且可以每天一次或多次剂量施用进行施用，持续一天或几天。对给定类别药物产品的适当剂量的指导可见于文献中。例如，对于给定参数，有效量可以显示出至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％的增加或减少。功效还可以表达为“倍数”增加或减少。例如，治疗有效量可以具有相对于对照至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍，或更多的作用。精确的剂量和配方可以取决于治疗目的，并且可以由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第20版,Gennaro编辑(2003)和Pickar,Dosage Calculations(1999))。
如本文所用，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌肿瘤、癌和肉瘤。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性、ER阳性、ER阴性、化学疗法耐受性、赫赛汀耐受性、HER2阳性、多柔比星耐受性、他莫昔芬耐受性、导管癌、小叶癌，原发性、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、黑素瘤、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头部、颈部或食道)、结肠直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。另外的实例包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食道癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或成神经管细胞瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌变前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺赘生物、甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer)、甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma)、黑素瘤、结肠直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌、佩吉特乳头病、叶状肿瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。
脂质体组合物
在若干实施方案中，本公开的组合物在制造的药物产品中是化学和物理稳定的，以允许商业上足够的保质期。
在若干实施方案中，颗粒大小减小可导致药物溶解度的显著增加。与相同组成的较大颗粒中的材料相比，纳米颗粒中的材料具有更高的离开颗粒并进入周围溶液的倾向。这种现象可以增加药物穿过生物膜运输的可用性，但是它也可以产生纳米颗粒本身的物理不稳定性。纳米颗粒的物理稳定性可以通过以下方式来改善：以合适的水平使用适当的表面活性剂和赋形剂以降低界面能、控制颗粒的表面电荷以保持分散，以及制造窄大小分布的颗粒。
在若干实施方案中，本公开的组合物的有利特性可归因于颗粒的大小、形状、组成和电荷。在若干实施方案中，颗粒可以是基本上球形的，以平滑地移动通过毛细管。在若干实施方案中，大小分布范围为约10至160nm。在若干实施方案中，大小分布范围为约20至150nm。在若干实施方案中，大小分布范围为约30至140nm。在若干实施方案中，大小分布范围为约40至130nm。在若干实施方案中，大小分布范围为约50至120nm。在若干实施方案中，大小分布范围为约60至110nm。在若干实施方案中，大小分布范围为约70至100nm。在若干实施方案中，大小分布范围为约10nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约20nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约30nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约40nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约50nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约60nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约70nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约80nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约90nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约100nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约110nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约120nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约130nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约140nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约150nm的平均值。在若干实施方案中，大小分布范围为约160nm的平均值。所述组合物可以包含胆固醇、其他脂质和表面活性剂，添加或不添加用于限定颗粒结构的聚合物。
颗粒大小可以通过多种技术确定。示例技术包括动态光散射(DLS)和低温透射电子显微镜。DLS可以通过测量强度来评估颗粒大小，例如，强度平均颗粒直径(Z-平均值)由ISO 13321(国际标准化组织1996)中定义的累积量分析计算。在若干实施方案中，当通过DLS根据强度测量时，脂质体的平均最长尺寸在约40-100nm、50-90nm或60-80nm的范围内。
DLS还可用于通过数量测量来评估颗粒大小，例如，颗粒大小与对分布的贡献之间存在一次幂关系。根据材料的强度分布和光学特性计算根据数量的颗粒大小分布。在若干实施方案中，当通过DLS根据数量测量时，脂质体颗粒的平均最长尺寸在约1-50nm、5-40nm或10-30nm的范围内
低温透射电子显微镜也可以用于评估脂质体大小。在若干实施方案中，如通过低温透射电子显微镜测量的脂质体的平均最长尺寸在约1-50nm、5-40nm或10-30nm的范围内。
在若干实施方案中，本公开的脂质体是单层的。可以包含在脂质体双层内的脂质的实例包括但不限于：胆固醇、磷脂酰胆碱(PC)产物/衍生物(各种碳链长度的脂肪酸，饱和、多不饱和及混合的酸性PC)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸酯(DMPA)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸酯(DPPA)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(DMPG)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(DPPG)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(DOPG)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DMPS)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DPPS)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPC)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-mPEG-2000)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇-胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-5000](DSPE-mPEG-5000)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-2000)；1,2-硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；L-α-磷脂酰胆碱，氢化的(氢化大豆PC)和2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(溶血PC)。
盐和抗衡离子
本公开包括包封在脂质体中的抗癌化合物及其盐的组合物。决定盐聚集体的性能和物理状态的抗衡离子的物理化学特性包括pKa、化合价、大小、立体化学、偶极矩、极化率。本公开提供了最佳的脂质比药物比例以及适当的抗衡离子以充分利用抗衡离子的pKa特性和抗癌化合物聚集体的物理状态来实现靶向释放特性(例如最高可能的ΔpH 6.7至5.0释放差异)。
表1提供了包括适用的pKa的示例性盐。表2提供了示例性弱碱性抗癌化合物，特别是与草酸根或酒石酸根形成盐或聚集体的那些。
表1.药物盐和抗衡离子。
表2.与草酸根或酒石酸根形成盐/聚集体并展示出所希望的pH区别性药物释放曲线的弱碱化学治疗剂的实例。
在若干实施方案中，本公开的组合物包含多柔比星盐。在若干实施方案中，多柔比星盐存在于脂质体中。在若干实施方案中，多柔比星盐可以在包封多柔比星后在脂质体内形成。在若干实施方案中，本文提供的组合物表现出所希望的物理性能和最佳的pH依赖性药物释放曲线，其在肿瘤组织中可以是非常有效的，同时表现出低的脱靶毒性。在若干实施方案中，不受任何特定理论的束缚，在生理pH下，当在血液中循环时，多柔比星主要由脂质体保留，而在细胞内溶酶体区室和肿瘤部位的由于脉管系统不良而倾向于保留脂质体的局部细胞外空间中发生的较低pH(～5.0-6.7)下实现显著更高的药物释放。
在若干实施方案中，多柔比星盐的组成通过选择阴离子和对应的酸的物理-化学特性，以及用于产生掺入具有所希望物理化学特性的多柔比星盐聚集体的脂质体的加工步骤来确定。
在若干实施方案中，在含有适当抗衡离子、包封抗癌化合物的脂质体内的最佳脂质比药物比例起利用抗衡离子的pKa特性和多柔比星聚集体的物理状态实现靶向释放特性(例如最高可能的ΔpH 6.7/6.7/6.0/5.0释放差异-ΔpH 6.7/5.0)的作用。在若干实施方案中，以适当的脂质/药物比例将多柔比星用合适的抗衡离子稳定化在脂质体内，以最大化安全性和功效。
当提及两部分之间的比例，即A与B之间的比例时，可以将其称为A/B、A:B或A比B。例如，如果对于每个部分A和B引用的值分别是1和10，则可以表明A/B比例(或A与B之比或比例A:B)为1:10、1/10或1比10。
例如，硫酸的pKa1是-3(多柔比星-硫酸盐-)，而柠檬酸的pKa1是+3.13(多柔比星-柠檬酸盐-)(表1)。硫酸根可以与多柔比星形成强盐，其可能导致脂质体中的多柔比星在pH 6.7至5.0范围内释放较低。相比之下，多柔比星-柠檬酸盐是较弱的盐，其可能导致多柔比星在pH 6.7至5.0范围内从脂质体中释放较高。
因此，本文提供了这样的实施方案，其中通过选择pKa(例如pKa1)值高于-3(硫酸)且低于+3.13(柠檬酸)的适当抗衡离子来实现多柔比星从脂质体中的最佳释放。因此，在若干实施方案中，本文采用的酸具有高于-3且小于3的pKa(例如，pKa1)。在若干实施方案中，本文采用的酸具有高于-2.9且小于2.9的pKa(例如，pKa1)。在若干实施方案中，本文采用的酸具有高于-2.8且小于2.8的pKa(例如，pKa1)。在若干实施方案中，本文采用的酸具有高于-2.5且小于2.5的pKa(例如，pKa1)。
测试了具有不同pKa值的多种抗衡离子(表1)促进多柔比星加载到脂质体中并提供从脂质体中的pH依赖性多柔比星释放的能力。在pH 6.7至pH 5.0(ΔpH 6.7/5.0)下提供多柔比星释放之间最高差异的抗衡离子具有优选的释放曲线。
在若干实施方案中，将实施例释放曲线测定脂质体样品在25℃下或预热至37℃(模拟体内温度)在PBS pH 6.7缓冲液中进行20X稀释(即100μL样品+1.9mL稀释剂)或50X稀释(即50μL样品+2.45mL稀释剂)，并且分别在25℃或37℃下温育2、4和8小时。在若干实施方案中，将实施例释放曲线测定脂质体样品在25℃下或预热至37℃(模拟体内温度)在PBS pH6.7缓冲液中进行20X稀释(即100μL样品+1.9mL稀释剂)或50X稀释(即50μL样品+2.45mL稀释剂)，并且分别在25℃或37℃下温育2、4和8小时。在若干实施方案中，将实施例释放曲线测定脂质体样品在25℃下或预热至37℃(模拟体内温度)在PBS pH 6.0缓冲液中进行20X稀释(即100μL样品+1.9mL稀释剂)或50X稀释(即50μL样品+2.45mL稀释剂)，并且分别在25℃或37℃下温育2、4和8小时。在若干实施方案中，将实施例释放曲线测定脂质体样品在25℃下或预热至37℃(模拟体内温度)在PBS pH5.0缓冲液中进行20X稀释(即100μL样品+1.9mL稀释剂)或50X稀释(即50μL样品+2.45mL稀释剂)，并且分别在25℃或37℃下温育2、4和8小时。
在若干实施方案中，对于T0时间点测定，将脂质体制剂在～25℃下在PBS pH 6.7中进行稀释。在若干实施方案中，对于T0时间点测定，将脂质体制剂在～25℃下在PBS pH6.7中进行稀释。在若干实施方案中，对于T0时间点测定，将脂质体制剂在～25℃下在PBSpH 6.0中进行稀释。在若干实施方案中，对于T0时间点测定，将脂质体制剂在～25℃下在PBS pH 5.0中进行稀释。板读数器温度可以设定为25℃，并且将激发和发射波长分别设定为478nm和594nm。在每个时间点测量完整脂质体(Fi)的荧光和用Triton X-100破裂的脂质体的总荧光(Ft)。将药物释放的百分比定量为[(Fi_n–Fi_t)/Ft_avrg)]*100％，其中Fi_n–在2、4或8小时测量的Fi，Fi_t0–在T0测量的Fi，以及Ft_avrg–对于所有时间点测定的Ft值的平均值。
在若干实施方案中，并且不受理论束缚，可以针对有利的特性选择各种抗癌化合物盐的结晶状态。例如，低温透射电子显微镜(cTEM)揭示在含有柠檬酸盐和硫酸盐的脂质体中多柔比星沉淀物为纤维束聚集体[1,13-14]。平面芳族蒽环霉素环被认为纵向堆叠以形成线性纤维。这些纤维以六边形排列对齐形成束，每束大约12-60根纤维[25]。在硫酸盐存在下的多柔比星聚集体通常具有刚性线性纤维束(纤维间距为大约27A°)，而在柠檬酸盐存在下的多柔比星-柠檬酸盐聚集体主要呈线性或弯曲的(纤维间距为大约30–35A°)[15,25]。在若干实施方案中，小于柠檬酸根阴离子的硫酸根阴离子可以允许更紧密的堆积排列，导致纤维束的柔韧性降低。在若干实施方案中，与多柔比星-磷酸盐[13-14]和柠檬酸盐(例如柠檬酸盐聚集体)[1,13-15]相比，多柔比星-硫酸盐(例如多柔比星-硫酸盐聚集体)导致在生理和酸性pH下药物释放更慢。
在若干实施方案中，本公开的组合物被设计为利用通过采用适当的抗衡离子(草酸根和酒石酸根)、优化的脂质/药物比例和优化的抗癌化合物(例如多柔比星)加载条件、药物释放的强pH依赖性和将化学治疗剂优先靶向至肿瘤部位而产生的肿瘤生物学。在若干实施方案中，采用螯合剂来补充抗衡离子和/或抗氧化剂。
在若干实施方案中，使用草酸根或酒石酸根作为抗衡离子、在优化范围内的脂质/药物比例和适当的加载条件将允许实现靶向性(pH依赖性)药物释放，并且因此改善具有各种分子靶标的多种弱碱化学治疗剂(DNA嵌入/损伤剂、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂等；表3)的安全性和功效。
表3.预期与草酸根或酒石酸根形成盐/聚集体的弱碱化学治疗剂的其他实例。
在若干实施方案中，根据血液-肿瘤部位-溶酶体pH梯度靶向脂质体药物释放与其非pH或较低pH区别性脂质体和/或游离形式相比，改善了弱碱化学治疗剂安全性和功效。
脂质比药物(即，脂质/药物)和磷脂比游离胆固醇(即，PL/FC)比例
在若干实施方案中，通过适当的抗衡离子选择实现本申请的颗粒中的最佳药物负荷。此外，可以选择亲脂性非活性组分和表面活性剂。此外，可以选择适当的药物与脂质比例。在若干实施方案中，进行选择以便在循环中时的中性pH下减少释放并且在靶位点处的更酸性pH下增加细胞外/细胞内释放。
在若干实施方案中，脂质比药物(脂质/药物)和PL/FC比例与所希望的物理化学和生物学性能有关。
在若干实施方案中，通过选择制剂组分和脂质/药物和PL/FC比例，以及用于产生颗粒的加工步骤来确定颗粒的结构。决定颗粒性能的结构和定量要素包括脂质/药物和PL/FC比例、抗衡离子、颗粒大小(和群体中的大小分布)、颗粒形状、颗粒电荷和颗粒中单独组分的分布，尤其是在颗粒表面的那些。
在若干实施方案中，本申请的结构化的富含脂质的纳米颗粒/脂质体被设计为在肠胃外施用的药物产品中携带有用的药物负荷。关于该递送系统的感兴趣的药物包括那些在生理pH下具有低溶解度并且在更酸性(局部肿瘤细胞外和内体/溶酶体环境)pH下具有显著更高溶解度的药物/盐复合物。包括在本申请中的脂质体可以具有独特的物理-化学性能。在若干实施方案中，高脂质/药物比例和≤4.0但≥1.0PL/FC比例可以导致稳定的脂质层，其通过浓度梯度并且在血清或血液中限制脂质体内容物的释放，但允许响应于外部pH的变化的区别性药物释放，并且因此可以利用特定抗衡离子和相应酸的pKa。
在若干实施方案中，多柔比星可以是聚乙二醇化的脂质体多柔比星，诸如在中使用那种。在若干实施方案中，多柔比星被两亲性嵌段共聚物而不是聚乙二醇取代。
在若干实施方案中，本文的脂质体制剂中使用的脂质是聚乙二醇化脂质。在若干实施方案中，使用泊洛沙姆脂质(例如P188脂质)而不是聚乙二醇化脂质。泊洛沙姆是非离子聚(环氧乙烷)(PEO)-聚(环氧丙烷)(PPO)共聚物。它们可以作为表面活性剂用于药物制剂中。它们的表面活性剂特性可用于去污、分散、稳定、发泡和乳化。泊洛沙姆广泛用于临床应用中[16]。在若干实施方案中，用p188包被(例如插层)的脂质体通过如下的方式形成：将脂质和P188溶解在DCM中，蒸发DCM-形成脂质膜，以及水合脂质膜。该示例性方法导致p188疏水性烃链插层(插入)在脂质烃链之间并且导致更亲水性部分在水相中，以及在脂质体的改性脂质表面中的暴露，所述改性脂质表面阻止脂质体的调理作用和巨噬细胞系统的识别。
在若干实施方案中，本文使用的具有用泊洛沙姆(例如，p188)包被的脂质体的组合物用于治疗需要活性物质(例如弱碱性抗癌化合物)穿过血脑屏障的疾病。在若干实施方案中，本文使用的具有用泊洛沙姆(例如，p188)包被的脂质体的组合物用于治疗需要活性物质(例如弱碱性抗癌化合物)的疾病，在不需要载脂蛋白E干扰的情况下使用。
在若干实施方案中，使用较低的脂质/药物比例导致表面张力增加和脂质层完整性受损，所述受损的脂质层完整性在稀释后可导致脂质体内容物由于浓度梯度而在中性pH下到溶出介质中的泄漏增加，并且可抵消pH驱动的释放药物。在若干实施方案中，使用较高的脂质比药物比例来降低表面张力并且实现获得较高的完整性脂质层，所述脂质层能够防止脂质体内物质“脱靶”泄漏到溶出介质中，并且仅响应于pH转变而释放药物。
在若干实施方案中，脂质体包含多种脂质，并且可以考虑多种脂质比药物(例如弱碱性抗癌剂和/或其酸或盐)的比例。在若干实施方案中，脂质比药物(脂质比药物)比例表示在加载药物的脂质体的最终悬浮液中总脂质比药物(例如多柔比星游离碱)的重量比重量(w比w)比例，并且具有约0.5比1(重量比重量)、约1比1、约5比1、约10比1、约20比1、约30比1、约40比1、约50比1、约60比1、约70比1、约80比1、约90比1、约100比1或前述的任何中间数或高于约100比1的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物(脂质比药物)比例表示在加载药物的脂质体的最终悬浮液中总脂质比药物的摩尔比摩尔(mol比mol)比例，并且具有0.5比1(mol比mol)、约1比1、约5比1、约10比1、约20比1、约30比1、约40比1、约50比1、约60比1、约70比1、约80比1、约90比1、约100比1或前述的任何中间数或高于约100比1的平均值。
在若干实施方案中，脂质比药物(即，脂质/药物)比例(mol比mol或重量比重量)具有在约0.5比1至1比1、约0.5比1至5比1、约0.5比1至10比1、约0.5比1至20比1、约0.5比1至30比1、约0.5比1至40比1、约0.5比1至50比1、约0.5比1至60比1、约0.5比1至70比1、约0.5比1至80比1、约0.5比1至90比1或约0.5比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质与药物比例(mol比mol或重量比重量)具有在约1比1至5比1、约1比1至10比1、约1比1至20比1、约1比1至30比1、约1比1至40比1、约1比1至50比1、约1比1至60比1、约1比1至70比1、约1比1至80比1、约1比1至90比1或约1比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质与药物比例(mol比mol或重量比重量)具有在约5比1至10比1、约5比1至20比1、约5比1至30比1、约5比1至40比1、约5比1至50比1、约5比1至60比1、约5比1至70比1、约5比1至80比1、约5比1至90比1或约5比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质与药物比例(mol比mol或重量比重量)具有在约10比1至20比1、约10比1至30比1、约10比1至40比1、约10比1至50比1、约10比1至60比1、约10比1至70比1、约10比1至80比1、约10比1至90比1或约10比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质与药物比例(mol比mol或重量比重量)具有在约20比1至30比1、约20比1至40比1、约20比1至50比1、约20比1至60比1、约20比1至70比1、约20比1至80比1、约20比1至90比1或约20比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质与药物比例(mol比mol或重量比重量)具有在约30比1至40比1、约30比1至50比1、约30比1至60比1、约30比1至70比1、约30比1至80比1、约30比1至90比1或约30比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质与药物比例(mol比mol或重量比重量)具有在约40比1至50比1、约40比1至60比1、约40比1至70比1、约40比1至80比1、约40比1至90比1或约40比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质与药物比例(mol比mol或重量比重量)具有在约50比1至60比1、约50比1至70比1、约50比1至80比1、约50比1至90比1或约50比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质与药物比例(mol比mol或重量比重量)具有在约60比1至70比1、约60比1至80比1、约60比1至90比1或约60比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质与药物比例(mol比mol或重量比重量)具有在约70比1至80比1、约70比1至90比1或约70比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质与药物比例(mol比mol或重量比重量)具有在约80比1至90比1或约80比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质与药物比例(mol比mol或重量比重量)具有在约90比1至100比1的范围内的平均值。
在若干实施方案中，药物mol％(例如药物的摩尔数相对于包括磷脂、胆固醇、泊洛沙姆、抗癌药物、盐等的所有制剂成分的总摩尔数)具有约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约30％或前述的任何中间数或高于约30％的平均值。
在若干实施方案中，药物mol％具有约0.5-1％、约0.5-2％、约0.5-3％、约0.5-4％、约0.5-5％、约0.5-6％、约0.5-7％、约0.5-8％、约0.5-9％、约0.5-10％、约0.5-15％、约0.5-20％或约0.5-30％的范围。在一些实施方案中，药物mol％具有约1-2％、约1-3％、约1-4％、约1-5％、约1-6％、约1-7％、约1-8％、约1-9％、约1-10％、约1-15％、约1-20％或约1-30％的范围。在一些实施方案中，药物mol％具有约2-3％、约2-4％、约2-5％、约2-6％、约2-7％、约2-8％、约2-9％、约2-10％、约2-15％、约2-20％或约2-30％的范围。在一些实施方案中，药物mol％具有约3-4％、约3-5％、约3-6％、约3-7％、约3-8％、约3-9％、约3-10％、约3-15％、约3-20％或约3-30％的范围。在一些实施方案中，药物mol％具有约4-5％、约4-6％、约4-7％、约4-8％、约4-9％、约4-10％、约4-15％、约4-20％或约4-30％的范围。在一些实施方案中，药物mol％具有约5-6％、约5-7％、约5-8％、约5-9％、约5-10％、约5-15％、约5-20％或约5-30％的范围。在一些实施方案中，药物mol％具有约6-7％、约6-8％、约6-9％、约6-10％、约6-15％、约6-20％或约6-30％的范围。在一些实施方案中，药物mol％具有约7-8％、约7-9％、约7-10％、约7-15％、约7-20％或约7-30％的范围。在一些实施方案中，药物mol％具有约8-9％、约8-10％、约8-15％、约8-20％或约8-30％的范围。在一些实施方案中，药物mol％具有约9-10％、约9-15％、约9-20％或约9-30％的范围。在一些实施方案中，药物mol％具约10-15％、约10-20％或约10-30％的范围。在一些实施方案中，药物mol％具约15-20％或约15-30％的范围。在一些实施方案中，药物mol％具约20-30％的范围。
在若干实施方案中，脂质体包含多种游离胆固醇(FC)。在若干实施方案中，未加载的脂质体和/或加载到脂质体中的药物具有多种磷脂(PL)。因此，在某些实施方案中，加载有药物的脂质体具有游离胆固醇(FC)和磷脂(PL)。在若干实施方案中，PL与FC之比(即，“PL比FC”或“PL/FC”比例)表示在加载药物的脂质体的最终悬浮液中磷脂比游离胆固醇的重量比重量(w比w)比例，并且具有0.5比1(w比w)、约1比1、约2比1、约3比1、约4比1、约5比1、约10比1、约20比1、约30比1、约40比1、约50比1、约60比1、约70比1、约80比1、约90比1、约100比1或前述的任何中间数或高于约100比1的平均值。在若干实施方案中，PL与FC之比(即，“PL比FC”比例)表示在加载药物的脂质体的最终悬浮液中磷脂比游离胆固醇的摩尔比摩尔(mol比mol)比例，并且具有约0.5比1(mol比mol)、约1比1、约2比1、约3比1、约4比1或约5比1、约10比1、约20比1、约30比1、约40比1、约50比1、约60比1、约70比1、约80比1、约90比1、约100比1或前述的任何中间数或高于约100比1的平均值。
在若干实施方案中，“PL比FC(即，PL/FC)”比例(mol比mol或w比w)具有在以下范围内的平均值：约0.5比1、约0.55比1、约0.6比1、约0.65比1、约0.7比1、约0.75比1、约0.8比1、约0.85比1、约0.9比1、约0.95比1、约1比1、约1.05比1、约1.1比1、约1.15比1、约1.2比1、约1.25比1、约1.3比1、约1.35比1、约1.4比1、约1.45比1、约1.5比1、约1.55比1、约1.6比1、约1.65比1、约1.7比1、约1.75比1、约1.8比1、约1.85比1、约1.9比1、约2比1、约2.05比1、约2.1比1、约2.15比1、约2.2比1、约2.25比1、约2.3比1、约2.35比1、约2.4比1、约2.45比1、约2.5比1、约2.55比1、约2.6比1、约2.65比1、约2.7比1、约2.75比1、约2.8比1、约2.85比1、约2.9比1、约3比1、约3.05比1、约3.1比1、约3.15比1、约3.2比1、约3.25比1、约3.3比1、约3.35比1、约3.4比1、约3.45比1、约3.5比1、约3.55比1、约3.6比1、约3.65比1、约3.7比1、约3.75比1、约3.8比1、约3.85比1、约3.9比1、约4比1、约4.05比1、约4.1比1、约4.15比1、约4.2比1、约4.25比1、约4.3比1、约4.35比1、约4.4比1、约4.45比1、约4.5比1、约4.55比1、约4.6比1、约4.65比1、约4.7比1、约4.75比1、约4.8比1、约4.85比1、约4.9比1、约5比1或前述的任何中间数。
在若干实施方案中，“PL比FC(即，PL/FC)”比例(mol比mol或w比w)具有在约0.86比1、约1.22比1、约1.29比1、约1.62比1、约1.72比1、约3.68比1或前述的任何中间数。在若干实施方案中，“PL比FC”比例(mol比mol或w比w)具有在约0.86比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，“PL比FC”比例(mol比mol或w比w)具有在约1.22比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，“PL比FC”比例(mol比mol或w比w)具有在约1.29比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，“PL比FC”比例(mol比mol或w比w)具有在约1.62比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，“PL比FC”比例(mol比mol或w比w)具有在约1.72比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，“PL比FC”比例(mol比mol或w比w)具有在约3.68比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，“PL比FC”比例(mol比mol或w比w)具有在约0.86比1至1.22比1、约0.86比1至1.29比1、约0.86比1至1.62比1、约0.86比1至1.72比1或约0.86比1至3.68比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，“PL比FC”比例(mol比mol或w比w)具有在约1.22比1至1.29比1、约1.22比1至1.62比1、约1.22比1至1.72比1或约1.22比1至3.68比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，“PL比FC”比例(mol比mol或w比w)具有在约1.29比1至1.62比1、约1.29比1至1.72比1或约1.29比1至3.68比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，“PL比FC”比例(mol比mol或w比w)具有在约1.62比1至1.72比1或约1.62比1至3.68比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，“PL比FC”比例(mol比mol或w比w)具有在约1.72至1至3.68比1的范围内的平均值。
在若干实施方案中，“PL比FC(即PL/FC)”比例(mol比mol或w比w)具有在约0.5比1至1比1、约0.5比1至2比1、约0.5比1至3比1、约0.5比1至4比1、约0.5比1至5比1、约0.5比1至10比1、约0.5比1至20比1、约0.5比1至30比1、约0.5比1至40比1、约0.5比1至50比1、约0.5比1至60比1、约0.5比1至70比1、约0.5比1至80比1、约0.5比1至90比1或约0.5比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约1比1至2比1、约1比1至3比1、约1比1至4比1、约1比1至5比1、约1比1至10比1、约1比1至20比1、约1比1至30比1、约1比1至40比1、约1比1至50比1、约1比1至60比1、约1比1至70比1、约1比1至80比1、约1比1至90比1或约1比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约2比1至3比1、约2比1至4比1、约2比1至5比1、约2比1至10比1、约2比1至20比1、约2比1至30比1、约2比1至40比1、约2比1至50比1、约2比1至60比1、约2比1至70比1、约2比1至80比1、约2比1至90比1或约1比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约3比1至4比1、约3比1至5比1、约3比1至10比1、约3比1至20比1、约3比1至30比1、约3比1至40比1、约3比1至50比1、约3比1至60比1、约3比1至70比1、约3比1至80比1、约3比1至90比1或约3比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约4比1至5比1、约4比1至10比1、约4比1至20比1、约4比1至30比1、约4比1至40比1、约4比1至50比1、约4比1至60比1、约4比1至70比1、约4比1至80比1、约4比1至90比1或约4比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约5比1至10比1、约5比1至20比1、约5比1至30比1、约5比1至40比1、约5比1至50比1、约5比1至60比1、约5比1至70比1、约5比1至80比1、约5比1至90比1或约5比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约10比1至20比1、约10比1至30比1、约10比1至40比1、约10比1至50比1、约10比1至60比1、约10比1至70比1、约10比1至80比1、约10比1至90比1或约10比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约20比1至30比1、约20比1至40比1、约20比1至50比1、约20比1至60比1、约20比1至70比1、约20比1至80比1、约20比1至90比1或约20比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约30比1至40比1、约30比1至50比1、约30比1至60比1、约30比1至70比1、约30比1至80比1、约30比1至90比1或约30比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约40比1至50比1、约40比1至60比1、约40比1至70比1、约40比1至80比1、约40比1至90比1或约40比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约50比1至60比1、约50比1至70比1、约50比1至80比1、约50比1至90比1或约50比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约60比1至70比1、约60比1至80比1、约60比1至90比1或约60比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约70比1至80比1、约70比1至90比1或约70比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约80比1至90比1或约80比1至100比1的范围内的平均值。在若干实施方案中，脂质比药物比例(mol比mol或w比w)具有在约90比1至100比1的范围内的平均值。
在若干实施方案中，磷脂mol％(例如磷脂的摩尔数相对于包括磷脂、胆固醇、泊洛沙姆、抗癌药物、盐等的所有制剂成分的总摩尔数)具有约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或前述的任何中间数或高于约90％的平均值。
在若干实施方案中，游离胆固醇(FC)mol％(例如FC的摩尔数相对于包括磷脂、胆固醇、泊洛沙姆、抗癌药物、盐等的所有制剂成分的总摩尔数)具有约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或前述的任何中间数或高于约60％的平均值。
在若干实施方案中，较低的PL/FC比例(w/w或mol/mol)导致脂质双层刚性增加，进而对pH依赖性药物释放产生负面影响。在若干实施方案中，较高的PL/FC比例(w/w或mol/mol)损害了血清或血液中脂质体的稳定性。因此，在一些实施方案中，PL/FC的最佳范围被确定在1/1至4/1的范围内。
关于含有伊立替康的脂质体获得的数据与对于多柔比星获得的结果非常一致，并且支持草酸根和酒石酸根抗衡离子的效应以及优选的脂质/药物比例。
将抗癌化合物加载在脂质体内的方法
在若干实施方案中，加载条件的影响可以改变脂质体内包含的药物体积、释放动力学、脂质体大小等。在若干实施方案中，在冷(例如在没有加热步骤的情况下，或在室温)条件下加载脂质体产生有利的释放动力学。
在若干实施方案中，抗癌化合物及其含有包封的抗衡离子的成对脂质体可以储存在单独的容器(例如小瓶)中，以在使用前在医疗环境中混合。在若干实施方案中，本公开的弱碱性抗癌化合物是冻干的并且易于在无菌注射用水中重构。在若干实施方案中，可以将冻干和重构的抗癌化合物与脂质体悬浮液混合。在若干实施方案中，该混合在室温下发生。本公开的组合物在混合时允许短的温育时间。在若干实施方案中，温育时间为约0-60分钟。在若干实施方案中，温育时间为约0-45分钟。在若干实施方案中，温育时间为约0-30分钟。在若干实施方案中，温育时间为约0-25分钟。在若干实施方案中，温育时间为约0-20分钟。在若干实施方案中，温育时间为约0-15分钟。在若干实施方案中，温育时间为约0-10分钟。在若干实施方案中，温育时间为约10-30分钟。在若干实施方案中，温育时间为约5-25分钟。在若干实施方案中，脂质体悬浮在pH～6.7的水性缓冲液中
在乳糖和/或甘露醇存在下冻干多柔比星水溶液产生冻干物质，其在室温下易于在无菌注射水中重构，最终浓度为6mg/mL。将本公开的冻干和重构的多柔比星与含有草酸盐和酒石酸盐的脂质体混合导致对多柔比星的高效且快速的包封。
实施例
在若干实施方案中，本公开的脂质体组合物具有独特的生物学性能。在施用时，这些颗粒可能不被认为是外来的，例如，它们没有用在网状内皮系统的组织中触发清除过程的蛋白质标记。在若干实施方案中，脂质体组合物包被有抑制调理作用和吞噬作用的组分。此外，脂质体组合物可以允许在某些条件下优化的药物释放，例如pH依赖性释放。
在若干实施方案中，考虑到全身性和肿瘤生物学，可以通过选择适当的抗衡离子、脂质组成和微调脂质/药物比例来优化pH依赖性药物释放曲线(图1)。例如，在参数优化期间可以考虑以下原则：
在体循环中时-限制中性pH(血液的pH为6.7)下的药物释放(图1A)。
在肿瘤部位积累-在更酸性的局部细胞外空间推动药物释放(图1B)。与血液相比，肿瘤可能具有酸性局部环境(～pH 6.5-7.2)[1,40-42]。此外，肿瘤的不良脉管系统可能导致药物的脂质体载体的优选积聚。因此，脂质体的积累和更酸性的局部环境两者都可能推进在肿瘤部位的细胞外空间中的局部药物释放。
在被癌细胞内化时-在内体环境的更酸性pH(例如，6-6.5)下脂质体驻留期间药物的最大释放(图1C)，从而需要较少的药物截留在溶酶体中(图1D)[50-51]。脂质体药物载体在肿瘤部位处的局部累积/截留也可导致癌细胞对脂质体的内化增强。在内化并进入酸性内体环境(～pH 6.0-6.5)时，脂质体可以容易地释放药物，并且因此显著改善其细胞质生物利用度。
因此，所希望的药物释放曲线(图1E)将有助于在6.9至6.0的pH范围(至少在一些实施方案中代表局部肿瘤和内体环境)内释放大多数包封的药物。
实施例1：材料和方法：多柔比星
多柔比星的HPLC定量
所有HPLC均使用Agilent 1260 Infinity系统进行，所述系统配备有G13110B泵、G1329B自动进样器、G1316A柱室和G1315D二极管阵列检测器。OpenLab CDS(EZChrom版)软件控制所有模块并且用于色谱的分析和报告。对于所有分析使用Phenomenex Luna C18柱(5μ，150×4.6mm；部件号00G-4252-E0)。
乙酸钠是来自Macco Organiques Inc.(Valleyfield,P.Q.,Canada)的cGMP等级并且盐酸(用于调节pH)是来自EMD Millipore(Billerica,MA)的ACS等级。使用的所有水均是纯化的。
多柔比星(DOX)的色谱分析在Agilent 1260 Infinity系统上使用C18柱(参见上文)进行，柱温为40℃并且样品温度在环境条件(～25℃)下。将所有流动相试剂在使用前用0.45μm滤膜过滤。HPLC级乙腈来自EMD Millipore。使用含有0.05M乙酸钠(pH 4.0)和乙腈(72:28，v/v)的等度流动相。将流动相流速设定为1.0mL/min，运行时间为15分钟。将二极管阵列检测器在487nm下操作，带宽为4nm。注射量设定为10μL。
在0.9％盐水，或甲醇或水溶液(1mg/mL)中制备多柔比星的标准储备溶液。通过将储备溶液在无水甲醇中稀释以括入用于分析的目标浓度来制备校准标准品。对于该研究，将多柔比星溶液用无水甲醇或IPA分别稀释至终浓度50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL。在分析之前，将脂质体悬浮液的样品也用无水甲醇或IPA稀释8倍或10倍。
荧光测定术
所有分析均使用Molecular Devices SpectraMax Gemini EM荧光板读数器进行。SoftMax Pro软件控制设备并且用于对值的分析和报告。
在0.9％盐水溶液(6mg/mL)中制备盐酸多柔比星的标准储备溶液。通过将储备溶液在pH 6.7和5.0的磷酸盐缓冲盐水中稀释以括入用于分析的目标浓度来制备校准标准品。将板读数器温度设定为25℃，并且将激发和发射波长分别设定为478nm和594nm。线性响应范围确定为0.5-4μg/mL盐酸多柔比星。为了保持中线性响应范围内，相应地稀释盐酸多柔比星校准标准品和样品。
为了测定脂质体制剂中多柔比星的总含量(Ft)，在定量前，通过添加Triton X-100至终浓度1％、通过倒置混合，并且温育来使脂质体破裂。
为了测定游离多柔比星，将脂质体制剂加载到分子量截断值为100,000D的超滤单元(Pierce浓缩器，ThermoScientific,Rockford,IL)中。在2500rpm离心1至2小时后，将滤液使用SpectraMax Gemini EM荧光板读数器分析并且进行定量。
为了测定脂质体内多柔比星含量的荧光，在没有用Triton X-100进行预处理的情况下对脂质体制剂进行荧光分析。
对来自脂质体制剂的多柔比星释放的定量
采用荧光去猝灭技术并将其相对于100％荧光(用Triton X-100破裂的脂质体)进行转发的Lee等人[20]的方法已用于测定多柔比星的释放。该方法基于以下事实：多柔比星的荧光在包封到脂质体中时被猝灭，并且在多柔比星从脂质体中释放时明显增加。因此，在样品在溶出介质中温育期间，完整脂质体的荧光增加(Fi)表示多柔比星释放到介质中。不同时间点与T0之间处的Fi值的差异相对于Ft(破裂脂质体的100％荧光)进行转发，并且表示释放药物的百分比。
研究在以下时间点在25℃和37℃(模拟体内条件)下进行：T0、T2小时、T4小时和T8小时。将单个样品在多达4种单独的稀释剂/溶出介质；PBS pH 6.7，和/或PBS/pH 6.7，和/或PBS pH6.0，和/或PBS pH 5.0中稀释20倍(例如100μL样品+1.9mL稀释剂)，或50X(例如50μL样品+2.45mL稀释剂)。对于T0时间点测定，在～25℃下将脂质体制剂在pH 6.7和/或pH6.7和/或pH 6.0和/或pH 5.0的PBS缓冲液中稀释。立即测量完整脂质体(Fi)的荧光和用Triton X-100破裂的脂质体的总荧光(Ft)。将板读数器温度设定为25℃，并且将激发和发射波长分别设定为478nm和594nm。
将其他脂质体样品在预热至37℃(以模拟体内温度)的pH 6.7、6.7、6.0和pH 5.0的PBS缓冲液中进行20X或50X稀释，并且在37℃下温育2、4和8小时。
将其他脂质体样品在预热至37℃(以模拟体内温度)的人血清或人血液中进行20X或50X稀释，并且在37℃下温育2、4和8小时。在每个时间点测量完整脂质体(Fi)的荧光和用Triton X-100破裂的脂质体的总荧光(Ft)。将药物释放的百分比定量为[(Fi_n–Fi_t0)/Ft_avrg)]*100％，其中Fi_n–在2、4或8小时测量的Fi，Fi_t0–在T0测量的Fi，以及Ft_avrg–对于所有时间点测定的Ft值的平均值。值得一提的是，在不同时间点和pH下观察到的Ft值没有显著变化。
颗粒大小测定
所有分析均使用具有4mW He-Ne激光器的Malvern Zetasizer Nano ZS进行，所述激光器在波长633nm和检测角为173°下操作。Zetasizer软件控制设备并且用于对值的分析和报告。
根据强度的颗粒大小分布。强度平均颗粒直径(Z-平均值)由ISO13321(国际标准化组织1996)中定义的累积量分析计算。
根据数量的颗粒大小分布。在该分布中，颗粒大小与对分布的贡献之间存在一次幂关系。根据数量的颗粒大小分布根据材料的强度分布和光学特性计算。当从强度平均值进行至数量平均值时，典型的高质量DLS结果通常会看到直径减小[35]。
通常，基于强度的Z-平均值和强度值大于由透射电子显微镜(TEM)获得的直径，这是因为a)光散射强度与颗粒直径之间的六次幂关系，较大的颗粒支配信号，和b)DLS测量流体动力学直径(即颗粒加上与颗粒表面相关的配体、离子或分子的直径)，因此对于该仪器的颗粒与TEM相比看起来更大
使用30μL脂质体制剂在1.5mL磷酸盐缓冲盐水(pH 6.7)中制备样品，并且将所述样品在分析前平衡至25℃。对于每个样品，一式三份地进行大小测量。
对含有多柔比星的脂质体的低温透射电子显微镜分析。
使用EMS100x辉光放电单元对铜400目+碳膜”网格(EMS)进行辉光放电。将三微升在所提供缓冲液中稀释15x的样品施加在辉光放电网格上，并且随后使用VitrobotTM MarkII(FEI)在液体乙烷中快速冷冻，且然后储存在液氮中。使用FEI CM200场发射枪透射电子显微镜在200kV的加速电压下对网格成像。仔细观察网格，并且使用TVIPS F224 2kx2k检测器以15kx、27.5kx、38kx、50kx和66kx的放大倍数采集代表性图像。
pH测量。
所有分析均使用具有Mettler Toledo InLab pH微电极的Mettler ToledoSevenCompact pH计进行。
粗悬浮液制备。
通过以表6中所指出的比例将PC、DMPC、FC和P188溶解在10mL的DCM中来制备粗悬浮液。将混合物在氮气流下干燥直至形成粘性膜。将膜在真空烘箱中进一步干燥过夜。第二天，将干燥的脂质膜用预热至65℃的300mM下列铵盐溶液水合：草酸铵或硫酸铵或吡啶甲酸铵或磷酸铵或柠檬酸铵或乙酸铵或甲酸铵，并且立即用手持式均质器均化2-3min。测定粗悬浮液的颗粒大小并且其始终在800-1200nm的范围内。将马来酸、半胱氨酸、NAC、抗坏血酸、丙二酸、酒石酸、富马酸或琥珀酸首先用氢氧化铵滴定至pH 4.8-5.0，并且然后用作水合介质。
Mf处理。
除非另有说明，否则MF处理体积始终为100ml。MF处理压力始终为10KPSI。在受控(≤65℃)温度下以循环模式(将材料返回到进料储器中)进行粗悬浮液的微流化。处理时间在10-16min范围内。目标颗粒大小(Z-平均值)为60-70nm。
切向流过滤
从微流化器收获半透明纳米悬浮液，并用15-20X体积的PBS pH 6.7进行切向流过滤(TFF)。TFF的目的是用PBS替换外部缓冲液，包括草酸铵、硫酸铵、磷酸铵、酒石酸铵或柠檬酸铵，或用氢氧化铵滴定至pH 4.8-5.0的马来酸、半胱氨酸、NAC、抗坏血酸、丙二酸、酒石酸、富马酸或琥珀酸，并且主要从外部缓冲液和脂质体内空间中除去铵。通过使用铵特异性电极测量外部缓冲液中的铵。当外部缓冲液中的铵浓度≤3mM时停止TFF。
多柔比星的远程加载
将盐酸多柔比星溶解在盐水中至终浓度为6mg/mL。将多柔比星的盐水溶液添加至PBS pH 6.7中的脂质体纳米悬浮液中至终浓度1mg/mL。将混合物加热至70℃。在70℃下温育30min后，使混合物冷却至环境温度(～25℃)，并且用含有6％蔗糖的PBS pH 6.7进行另一个TFF 5X循环。
如下进行多柔比星到脂质体中的冷加载：在室温下将多柔比星的盐水溶液添加至脂质体纳米悬浮液至终浓度1mg/mL，轻轻倒置(2-3次)并且在室温下温育10min。在室温下温育10min后，将混合物：a)用含有6％蔗糖的PBS pH 6.7进行另一个TFF 5X循环，和/或b)置于2-8℃冷藏室中16小时，并且然后无菌过滤或用含有6％蔗糖的PBS pH 6.7进行另一个TFF 5X循环。
冷加载后，将脂质体纳米悬浮液通过0.22μm过滤器无菌过滤到无菌Nalgene烧瓶中。测定颗粒大小、pH、多柔比星的HPLC含量、Fi、Ft、游离多柔比星和多柔比星释放曲线。将无菌纳米悬浮液无菌分配到2mL预先灭菌的小瓶中，塞住并密封。将小瓶储存在2-8℃下。
体外基于细胞的细胞毒性测定。
Daudi细胞(ATCC，CCL-213)。将细胞以每孔100K细胞的密度铺板在96孔板中。将盐酸多柔比星、或多柔比星草酸盐脂质体在生长培养基(RPMI-1640，10％FBS)中适当稀释并添加至细胞。在37℃下温育1小时后，将板离心，通过抽吸除去上清液，向每个孔中添加100μL新鲜培养基，并且将细胞培养48小时。
Hela细胞(HeLa(ATCC CCL-2)。将细胞以每孔25K细胞的密度铺板在96孔板中。将盐酸多柔比星、或多柔比星草酸盐脂质体在生长培养基(DMEM，5％FBS，1％抗生素，1％HEPES)中适当稀释并添加至细胞。在37℃下温育1小时后，将板离心，通过抽吸除去上清液，向每个孔中添加100μL新鲜培养基，并且将细胞培养48小时。
在评估细胞活力的第3天，在1:250稀释的生长培养基(RPMI-1640，10％FBS)中制备Alamar Blue溶液，并且直接添加至细胞培养基。在37℃下温育6小时后，在板读数器上读取所产生的荧光。将未接受任何药物处理的细胞的荧光定义为最大活力。将无细胞培养基的荧光定义为完全细胞死亡。通过使用用于曲线拟合和IC50值测定的Prism非线性回归软件(GraphPad Software)进行数据分析。
体内研究
将人B淋巴瘤细胞系Ramos(RA 1)(ATCC CRL-1596)在含有20mM HEPES、10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的RPMI-1640培养基中培养。将细胞密度维持在3×105-1.5×106范围内，并且活力在90-95％范围内。在施用到动物中之前的同一天将细胞计数，以12000rpm离心，用无菌PBS洗涤，再次以1200rpm离心，重悬浮于无菌PBS中至最终细胞计数35×10-/mL。通过单次推注注射将细胞悬浮液静脉内施用至动物中，每只小鼠递送5×106个细胞。
将四周龄免疫缺陷型SCID Beige(品系-CB17.Cg-PrkdcscidLystbg-J/Crl)小鼠维持饲料饮食。在8周龄时，将小鼠细分为3组。在第1天，将5×106个B淋巴瘤细胞静脉内注射到每只小鼠中(图2)。在第2天，使一组接受安慰剂(不含多柔比星的脂质体)，并且使另外两组分别接受用(批号FAZSR00)或多柔比星草酸盐脂质体的治疗。在第2天和第3天，重复所有治疗(图2)。每天监测动物并且每周称重两次。
注射前，将脂质体或多柔比星草酸盐脂质体用PBS适当稀释至终浓度0.5mg/mL。通过单次推注注射将治疗制品以120μL静脉内施用，以递送60μg多柔比星/小鼠或～3mg/kg剂量。
使用的材料示出在表4中。
表4.材料列表
*-药物主档案持有者。
使用的设备示出在表5中。
表5.设备列表
使用的缩略语的概述：HPLC–高压液相色谱法；MFD–制造日期；DCM–二氯甲烷；PC–磷脂酰胆碱；FC–游离胆固醇；P188–泊洛沙姆188；DMPC-1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱；MF–微流化器；W/V–重量体积比；mfg–制造；ND–未测定；Fi–加载有荧光药物的完整脂质体的荧光；Ft–来源于破裂脂质体的总荧光；TFF-切向流过滤；W/W–重量比重量比例；脂质比药物比例–(PC+DMPC+FC)/多柔比星或伊立替康或米托蒽醌的W/W比例。
实施例2：在70℃下的多柔比星加载：在固定的50:1(即50比1或50/1)脂质/药物 (即，脂质比药物)比例下比较不同的抗衡离子。
使用的水合介质：
a)300mM下列铵盐的溶液：草酸铵或硫酸铵或吡啶甲酸铵或磷酸铵或柠檬酸铵或乙酸铵或甲酸铵。
b)将草酸、马来酸、半胱氨酸、丙二酸、酒石酸、富马酸、琥珀酸、抗坏血酸或N-乙酰L半胱氨酸(NAC)首先用氢氧化铵滴定至pH 4.8-5.0，并且然后用作水合介质。
在70℃下用1mg/mL盐酸多柔比星(例如每毫升0.936mg多柔比星游离碱)进行远程加载。盐酸盐。制剂组成示出在表6中。所有制剂均以50:1的脂质/药物比例制备(表6)。脂质/药物比例表示在加载多柔比星的脂质体的最终悬浮液中总脂质与多柔比星游离碱的重量/重量(w/w)比例。
未显示吡啶甲酸盐、马来酸盐、半胱氨酸盐、丙二酸盐、富马酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、抗坏血酸或NAC的数据，因为未观察到多柔比星加载，并且在2-8℃下过夜储存后脂质体材料沉淀。
表6.制剂组成。
制备粗悬浮液并且进行MF处理。在MF处理9-12min后，颗粒大小(Z-平均值)达到～60-75nm。收集样品并且无菌过滤到Nalgene烧瓶中。测定过滤的纳米悬浮液的颗粒大小(表7)。
表7.对MF处理和所得乳液参数的概述。
对脂质体进行TFF，然后用多柔比星进行远程加载，并且用PBS蔗糖进行另一个TFF循环。用于远程加载的盐酸多柔比星浓度：1.0mg/mL(多柔比星游离碱浓度：0.936mg/mL)。
加载多柔比星的脂质体的颗粒大小呈现于表8中。
表8.加载多柔比星的脂质体的颗粒大小。
对脂质体悬浮液中多柔比星的测定。将随后的多柔比星加载的脂质体悬浮液进行5X TFF以主要除去游离(未包封的)多柔比星。为了确定T0(在MFD的一周内)的总多柔比星浓度，用甲醇或IPA稀释TFF洗涤的脂质体并且进行HPLC分析。多柔比星含量、回收百分率(脂质体悬浮液中的多柔比星含量相对于用于远程加载的多柔比星游离碱浓度)和包封效率(％)呈现于表9中。包封效率(％)表示多柔比星回收率(％)与游离多柔比星(％)之间的差异。
表9.总多柔比星含量和包封效率。
在制造一周内测定游离(未包封的)多柔比星的量(表10)。
表10.游离多柔比星含量。
批号 抗衡离子 总量的％
647-2-106 硫酸根 0.02
647-2-121 A 草酸根 0.13
647-2-145 B 草酸根 0.01
647-2-144 B 磷酸根 0.46
647-2-151 B 酒石酸根 0.03
647-2-105 B 柠檬酸根 0.90
在2-8℃下储存期间游离(未包封的)多柔比星含量的变化呈现于表11中。
表11.在2-8℃下储存期间游离多柔比星含量的变化。
在25℃(表12)和37℃(表13)下进行脂质体多柔比星释放研究。对于每个样品，在2、4和8小时时间点测定多柔比星释放。
表12.在25℃下测定的多柔比星释放速率。
表13.在37℃下测定的多柔比星释放速率。
还在2-8℃条件下储存样品期间监测多柔比星释放速率(在37℃下)(表14)。
表14.在37℃下的多柔比星释放速率。在2-8℃下储存的影响。
颗粒大小。从表7中可以看出，不同脂质体制剂的微流化导致相似的颗粒大小。多柔比星加载导致所有制剂的颗粒大小略微增加(表8)。
多柔比星包封的效率在79％至100％之间变化。当使用硫酸根作为抗衡离子时，观察到最高的包封100％(表9)。
游离多柔比星反映了(制造(T0)后一周内，以及在2-8℃下储存脂质体材料期间测定的未包封药物的浓度。从表10中可以看出，T0处的游离多柔比星含量在从0.02-0.9％的范围内。在2-8℃下储存至少一个月内未观察到游离多柔比星的浓度显著变化(表11)。
脂质体多柔比星释放速率。在25℃和37℃下进行药物释放研究。
在25℃下，所有制剂(例如用硫酸盐、草酸盐、磷酸盐、酒石酸盐和柠檬酸盐的制剂)展示出非常低且相似的释放速率(表12)，ΔpH6.7/5.0释放差异接近于零。
在37℃下，当使用草酸根或酒石酸根作为抗衡离子时，pH 6.7和pH 5.0的多柔比星释放之间的差异(ΔpH 6.7/5.0释放差异)与其他使用的抗衡离子相比明显更高(表13和图3)。
值得一提的是，无论是草酸铵盐还是草酸(用NH4OH滴定至pH 4.8-5.0)用于制备水合介质，空载或多柔比星加载的脂质体的颗粒大小(表7-8)、多柔比星包封效率(表9)和释放曲线(表13-14)基本相同。
在T0(MFD后一周内)观察到的37℃释放速率和ΔpH 6.7/5.0差异的程度在2-8℃下储存至少～两个月期间是维持的(表14)。
在25℃下关于所有测试抗衡离子观察到的多柔比星释放速率都很差(表12)并且与硫酸盐、磷酸盐和柠檬酸盐相比，在草酸盐或酒石酸盐情况下观察到的37℃下多柔比星释放显著增加(表13)，表明了在37℃下的多柔比星-草酸盐-或-酒石酸盐聚集体的可促进其溶解，并且因此促进多柔比星释放的物理状态的独特性。观察到的对于特定抗衡离子在25℃和37℃下测定的ΔpH 6.7/5.0释放差异的差异也可能表明，在一些实施方案中与硫酸盐或磷酸盐相比，多柔比星-草酸盐或-酒石酸盐脂质体内聚集体的物理状态的温度依赖性转变更急剧。
在若干实施方案中，当响应于pH梯度和抗衡离子包封在脂质体中时，多柔比星形成聚集体，所述观察结果已经由若干个研究组[1,13,15,23-25]证实。抗衡离子(例如，草酸根、硫酸根、磷酸根、酒石酸根和柠檬酸根)的物理化学特性(诸如大小、pKa值、立体化学、偶极矩、极化率等)可以相互作用以产生不同的沉淀结构，并且因此控制多柔比星从脂质体中的释放。
Andreas Fritze等人[13]使用低温透射电子显微镜(C-TEM)可视化在300mM(NH4)2HPO4溶液中制备的加载多柔比星的脂质体。如图4中所示，包埋和沉淀的多柔比星形成呈现为线性结构的束并且诱导脂质体形状的变化，从而产生特征性“咖啡豆”结构。已证明，在1小时和25℃下从含有多柔比星磷酸盐束的脂质体中释放到pH 6.7缓冲液中的多柔比星<2-3％[13]。
Xingong Li等人[15]检查了溶液中和通过跨膜pH梯度加载的EPC/胆固醇脂质体内部的多柔比星(DOX)物理状态。使用低温电子显微镜(cryo-EM)，他们注意到在含有柠檬酸盐的脂质体中的加载至200-300mM内部浓度的多柔比星形成线性、弯曲和圆形纤维束，而囊泡膜没有显著的相互作用/扰动[15](图5)。还证明，从含有多柔比星柠檬酸盐束的脂质体中到pH 7.6缓冲液中的多柔比星释放相对较缓慢(在1小时～4％)。
在硫酸盐存在下的多柔比星聚集体通常具有刚性线性纤维束(纤维间距为大约27A°)，而在柠檬酸盐存在下的多柔比星-柠檬酸盐聚集体主要呈线性或弯曲的(纤维间距为大约30-35A°)[1,15,23-25](图6)。这些结果表明，小于柠檬酸根阴离子的硫酸根阴离子可以允许更紧密的填充排列，导致纤维束的柔韧性降低，并且因此导致来自脂质体的药物释放的速率较低。
含多柔比星-草酸盐的脂质体的Cryo-TEM分析(批号647-2-157)。将含有多柔比星-草酸盐的脂质体(批号647-2-157)通过低温透射电子显微镜(cryo-TEM)表征。Cryo-TEM分析揭示了球形形态的轮廓分明的致密脂质体颗粒(图7A、7B和7C)，其具有轮廓分明的双层膜(5-6nm厚度，图7C)和符合高药物比脂质比例(50:1)的脂质体的精细内部密度。还值得一提的是，通过超滤法测定的游离(未包封的)多柔比星为～0.3％(表21)。
虽然颗粒看起来密集地堆积在载体上，但样品的网格扩散也是相对均匀的，并且没有观察到颗粒聚簇，也没有观察到聚集。在更高的放大倍数下，可以清楚地区分膜双层(图7B和7C)。绝大多数(97％)颗粒是单层的。
在若干实施方案中，多柔比星-草酸盐聚集体看起来具有非结晶性质(图7A-7C)，并且当使用硫酸根或磷酸根用作抗衡离子时未观察到形成的紧密堆积的束(图4-6)。该发现表明了与多柔比星-硫酸盐和-磷酸盐聚集体相比，脂质体内多柔比星-草酸盐聚集体的独特物理状态，并且与观察到的药物释放曲线的差异非常一致(图3，表13-14)。
总体获得的数据证明，当使用硫酸根、草酸根、磷酸根、酒石酸根和柠檬酸根作为抗衡离子时，多柔比星高效加载并且形成稳定的脂质体制剂。虽然所有制剂在25℃下类似地释放多柔比星，但当在37℃测定多柔比星释放速率时，草酸盐和酒石酸盐显示出所希望的ΔpH 6.7/5.0释放差异。该数据表明，与多柔比星-硫酸盐或-磷酸盐聚集体相比，多柔比星-草酸盐或-酒石酸盐聚集体的温度依赖性物理状态转变可能范围更大。
在若干实施方案中，不受理论束缚，虽然抗衡离子的pKa值决定了对外部pH变化的响应，但pKa可能不仅对于分子水平上的脂质体多柔比星释放(当在溶液中时)是重要的，而且与抗衡离子的其他物理化学特性(例如大小、立体化学、偶极矩，极化率等)组合时在控制脂质体内多柔比星包装、形成的聚集体的物理状态并且因此控制它们的溶出速率方面也是重要的。
因此，证明了抗衡离子对最佳pH依赖性药物释放的影响，并且进行的研究强烈表明，至少在一些实施方案中，最佳抗衡离子是草酸根和酒石酸根。
在一些另选的实施方案中，柠檬酸根可以用作抗衡离子。
实施例3：对含有多柔比星-草酸盐的脂质体的进一步表征。可变的脂质/药物比 例。
水合介质：300mM草酸铵。
以不同的脂质/药物比例(5:1–100:1)和各种浓度的P188(表15)制备脂质体。用于远程加载的最终盐酸多柔比星浓度为0.5或1.0mg/mL，在70℃下进行远程加载。
表15.制剂组成。
制备粗悬浮液并且将其在10KPSI处理压力下进行MF处理。在MF处理9-15min后，颗粒大小(Z-平均值)达到～60-65nm。收集样品并且无菌过滤到Nalgene烧瓶中。测定过滤的纳米悬浮液的颗粒大小(表16)。
表16.对MF处理和所得乳液参数的概述。
对脂质体进行TFF，然后用多柔比星进行远程加载，并且用PBS蔗糖进行另一个TFF循环。用于远程加载的盐酸多柔比星浓度：0.5或1.0mg/mL。
加载多柔比星的脂质体的颗粒大小呈现于表17中。
表17.加载多柔比星的脂质体的颗粒大小。
颗粒大小稳定性数据呈现于表18中。
表18.加载多柔比星的脂质体的颗粒大小。在2-8℃下的稳定性。
对脂质体悬浮液中多柔比星的测定。将随后的多柔比星加载的脂质体悬浮液进行5X TFF以主要除去游离(未包封的)多柔比星。为了确定T0(在MFD的一周内)的总多柔比星浓度，用甲醇或IPA稀释TFF洗涤的脂质体并且进行HPLC分析。多柔比星含量、回收百分率(脂质体悬浮液中的多柔比星含量相对于用于远程加载的多柔比星游离碱浓度)和包封效率(％)呈现于表19中。包封效率(％)表示多柔比星回收率(％)与游离多柔比星(％)之间的差异。
表19.总多柔比星含量和包封效率。
在2-8℃下储存期间评估脂质体多柔比星的稳定性。相对于在T0测定的初始多柔比星含量，储存期间的回收百分比示出在表20中。
表20.包封的多柔比星的稳定性。储存条件：2-8℃。
批号 脂质/药物 T0后的天数 含量，μg/m 回收率，％
647-1-175 50 41 861 102
647-1-174 100 42 452 103
647-2-13 100 118 461 100
647-2-48 50 84 812 91
647-2-121A 50 45 799 95
在制造一周内测定游离多柔比星的量(表21)。
表21.游离多柔比星含量。
在2-8℃下储存期间游离多柔比星含量的变化呈现于表22中。
表22.在2-8℃下储存期间游离多柔比星含量的变化。
在制造后一周内在37℃下进行脂质体多柔比星释放研究(表23)。对于每个样品，在2、4和8小时时间点测定多柔比星释放。
表23.在T0测定的多柔比星释放速率(在制造后一周内)。
ND*-未进行
还在2-8℃条件下进一步储存样品期间监测脂质体多柔比星释放速率(在37℃下)(表23a)。
表23a.在2-8℃下储存期间多柔比星释放速率的变化。
ND*-未进行
颗粒大小。从表15和16中可以看出，所有特定脂质体制剂的微流化导致相似的颗粒大小。多柔比星加载仅导致具有50:1至100:1的脂质/药物比例的制剂的颗粒大小略微增加(表17)，而对于具有脂质/药物比例20:1和5:1的制剂，观察到明显增加(表17)。具有50:1至100:1的脂质/药物比例的加载多柔比星的脂质体的颗粒大小在至少四个月内保持稳定(表18)，而具有脂质/药物比例20:1和5:1的脂质体的颗粒大小不稳定并且显示出显著的增加。
多柔比星包封的效率。以50:1至100:1的脂质/药物比例将多柔比星包封到脂质体中的效率在90％至98％之间变化(表19)，并且在2-8℃储存期间未观察到脂质体多柔比星含量显著变化(表20)。相比之下，对于具有脂质/药物比例20:1和5:1的脂质体，观察到明显更低的包封效率(31％-52％)(表19)。
游离(未包封的)多柔比星。游离多柔比星反映了在加载步骤期间未被包封到脂质体中或在储存期间从脂质体中泄漏的药物的浓度。从表21中可以看出，具有脂质/药物比例50:1和100:1的制剂中的游离多柔比星含量在0.2-0.41％的范围内。在2-8℃下储存多达～4个月未观察到游离多柔比星的浓度显著变化(表22)。
在具有20:1和5:1脂质/药物比例的制剂中测定的游离多柔比星含量明显更高(表21)，并且在2-8℃下储存7天后明显增加(表22)。这些数据表明多柔比星由低于50:1脂质/药物比例制备并且在2-8℃和pH 6.7下储存的脂质体中明显泄漏。
脂质体多柔比星释放速率。从表23中可以看出，对于具有脂质/药物比例50:1和100:1的制剂，与pH 6.7下的多柔比星放速率相比，pH 5下的多柔比星释放速率明显更高(表23和图3)。在T0(MFD一周内)观察到的ΔpH 6.7/5.0释放差异在2-8℃下储存多达114天期间是维持的(表23a)。
相比之下，具有较低脂质/药物比例(20:1和5:1)的制剂展示出差的ΔpH 6.7/5.0释放差异(表23和图8)并且在pH 6.7下多柔比星的明显泄漏(表22-23a)。
在若干实施方案中，不受理论束缚，较低的脂质/药物比例可导致表面张力增加和脂质层完整性受损，所述受损的脂质层完整性在稀释后可导致由于浓度梯度而脂质体内容物到溶出介质中的非pH依赖性泄漏增加，并且可能抵消pH驱动的药物释放。相比之下，较高的脂质比药物比例导致形成具有较低表面张力和较高完整性的脂质层的脂质体，所述脂质层能够防止脂质体内物质“脱靶”泄漏到溶出介质中，并且仅响应于pH转变而释放药物。
因此，证明了脂质/药物比例对pH依赖性药物释放和脂质体稳定性能的影响。进行的研究表明，在一些实施方案中，最佳脂质/药物比例在20:1至50:1的范围内。在一些其他实施方案中，可以使用的其他比例包括20:1至100:1。
还值得一提的是，与在没有P188情况下制备的脂质体制剂(批号647-2-159B)相比，向脂质体制剂中添加P188对颗粒大小(表15-17)、多柔比星包封效率(表19和21)和多柔比星释放曲线(表23)没有任何显著影响。然而，P188被选择用于脂质体制剂中，因为它可能对加载药物的脂质体的生物学性能产生有利影响[10-11,16-19]。
实施例4：体外基于细胞的细胞毒性测定。
接下来将通常用于评价治疗B细胞淋巴瘤的药物[21,22]的人类淋巴瘤Daudi B细胞系用于测试加载多柔比星-草酸盐的脂质体相对于游离多柔比星和的B细胞的细胞毒性。从表24中可以看出，三种不同批次的加载多柔比星-草酸盐的脂质体展示出与游离多柔比星相似的细胞的细胞毒性，并且相对于(批号L01DB01)效力高～50-70倍，所述差异预示着体内功效增加。
也将来源于宫颈癌的人细胞系Hela细胞用于评价药物的细胞毒性。从表24中可以看出，加载多柔比星-草酸盐的脂质体展示出比游离多柔比星低2-3倍的细胞毒性，但效力相对于高4-6倍(表24)。
表24.对于多柔比星和脂质体多柔比星制剂获得的CC50(μM)值。
获得的细胞毒性数据证明，相比于含有多柔比星-草酸盐的脂质体效力明显增加，这与相比于含有多柔比星-硫酸盐的脂质体，含有多柔比星-草酸盐的脂质体的ΔpH 6.7/5.0释放差异明显较高非常一致。
实施例5：体内研究
在Beige(品系-CB17.Cg-PrkdcscidLystbg-J/Crl)小鼠的标准淋巴瘤模型中评价加载多柔比星-草酸盐的脂质体(批号647-2-13)相对于(批号FAZSR00)的功效。如图2中的时间线所示，在第0天静脉内注射B淋巴瘤细胞(5×106个)并且使其散布24小时，然后在第1、2和3天向小鼠给予无药物脂质制剂(安慰剂)或含有多柔比星-草酸盐的脂质体(3mg多柔比星/kg)，或(3mg多柔比星/kg)。
用安慰剂(不含多柔比星的脂质体)治疗的动物在21天内达到中值存活时间(MST)，而加载多柔比星-草酸盐的脂质体使MTS增加至33天(图5)。相比之下，脂质体的MST为15天(图5)。与安慰剂(图5)治疗的小鼠相比，在情况下观察到的MST较短表明潜在的毒性，而在含有多柔比星-草酸盐的脂质体的情况下未观察到这种毒性。一组未治疗的小鼠(未注射任何物质)显示出与安慰剂相同的存活率(图中未显示)。在第11天，在多柔比星-草酸盐治疗的动物中观察到大约8％的最大组平均体重减轻，并且在第17天完全恢复，而在治疗的小鼠中，在第14天观察到～30％的体重减轻，导致4至8只动物死亡。在用游离多柔比星治疗的一组小鼠中也观察到高毒性(在第13天死亡率为50％)，但是存活者展示出最长的MST，验证了模型。对含有多柔比星-草酸盐的脂质体观察到的较低毒性可能部分是由于它们更快的清除。与相比，根据本公开的测试脂质体的较低毒性和较高功效是高度所希望的和令人鼓舞的结果。因此，在相同的实验方案下，用含有多柔比星-草酸盐的脂质体的治疗未显示出与安慰剂对照相比明显的毒性和存活率的显著改善，而用相同剂量和方案的的治疗显示出显著的毒性并且没有导致与安慰剂相比任何显著改善的MST。多柔比星-草酸盐脂质体的较佳性能与优化的ΔpH释放差异一致，并且与(多柔比星-硫酸盐)脂质体相比，总体上导致改善的安全性和功效。
因此，在相同的实验方案下，用含有多柔比星-草酸盐的脂质体的治疗未显示出与安慰剂对照相比明显的毒性和存活率的显著改善，而用相同剂量和方案的的治疗显示出显著的毒性并且没有导致与安慰剂相比任何显著改善的MST(图9)。含有多柔比星-草酸盐的脂质体的较佳性能与优化的ΔpH 6.7/5.0释放差异一致，并且与(多柔比星-硫酸盐)脂质体相比，总体上导致改善的安全性和功效。
实施例6：对含有多柔比星-酒石酸盐的脂质体的进一步表征：可变的脂质比药物 比例。
对含有多柔比星-酒石酸盐的脂质体的制备和进一步表征。以不同的脂质/药物比例(5:1，其等同地称为5比1或5/1-100:1，其等同地称为100比1或100/1)制备脂质体(表25)。用于远程加载的盐酸多柔比星浓度为0.5或1.0mg/mL(即每mL 0.468和0.936mg多柔比星游离碱)。用盐酸多柔比星在70℃下进行远程加载。将酒石酸首先用氢氧化铵滴定至pH4.8-5.0，并且然后用作水合介质。
表25.制剂组成。
制备粗悬浮液并且将其在10KPSI处理压力下进行MF处理。在MF处理9-15min后，颗粒大小(Z-平均值)达到～60-65nm。收集样品并且无菌过滤到Nalgene烧瓶中。测定过滤的纳米悬浮液的颗粒大小(表25a)。
表25a.对MF处理和所得乳液参数的概述。
对脂质体进行TFF，然后用多柔比星进行远程加载，并且用PBS蔗糖进行另一个TFF循环。用于远程加载的盐酸多柔比星浓度：0.5或1.0mg/mL。
加载多柔比星的脂质体的颗粒大小呈现于表25b中。
表25b.加载多柔比星的脂质体的颗粒大小。
对脂质体悬浮液中多柔比星的测定。将随后的多柔比星加载的脂质体悬浮液进行5X TFF以主要除去游离(未包封的)多柔比星。为了确定T0(在MFD的一周内)的总多柔比星浓度，用甲醇或IPA稀释TFF洗涤的脂质体并且进行HPLC分析。多柔比星含量、回收百分率(脂质体悬浮液中的多柔比星含量相对于用于远程加载的多柔比星游离碱浓度)和包封效率(％)呈现于表25c中。包封效率(％)表示多柔比星回收率(％)与游离多柔比星(％)之间的差异。
表25c.总多柔比星含量和包封效率。
在制造一周内测定游离(未包封的)多柔比星的量(表25d)。
表25d.游离多柔比星含量。
批号 脂质/药物 总量的％
647-2-186 B 100 0.01
647-2-151 B 50 0.03
647-2-178 B 20 0.01
647-2-178 D 5 3.20
在制造后一周内在37℃下进行脂质体多柔比星释放研究(表25e)。对于每个样品，在2、4和8小时时间点测定多柔比星释放。
表25e.在T0(制造后一周内)测定的多柔比星释放速率。
颗粒大小。从表25和25a中可以看出，所有特定脂质体制剂的微流化导致相似的颗粒大小。多柔比星加载仅导致颗粒大小略微增加(表25b)。
多柔比星包封的效率。以5:1至100:1的脂质/药物比例将多柔比星包封到脂质体中的效率在76％至96％之间变化(表25c)。相比之下，对于具有脂质/药物比例5:1的脂质体，观察到明显更低的包封效率(41％)(表25c)。
游离(未包封的)多柔比星。游离多柔比星反映了在加载步骤期间未被包封到脂质体中或在储存期间从脂质体中泄漏的未包封药物的浓度。从表25d中可以看出，具有脂质/药物比例20:1至100:1的制剂中的游离多柔比星含量在0.01-0.03％的范围内，而在5:1脂质/药物比例下观察到增加的游离多柔比星水平(3.2％)。这些数据与对于含有草酸盐的脂质体获得的结果一致(表21)，并且表明在中性pH下多柔比星明显从以低于20:1脂质/药物比例制得的脂质体中泄漏。
脂质体多柔比星释放速率。虽然对于所有制剂，pH 5下的多柔比星释放速率高于pH 6.7下的多柔比星释放速率(表25e)，但对于脂质/药物比例低于50:1的制剂，观察到在中性pH下的额外泄漏。然而，值得一提的是，与含有草酸盐的脂质体相比，含有酒石酸盐的脂质体在pH 6.7下的多柔比星泄漏明显更少(表21、23，图8、10)。
因此，证明了脂质/药物比例对抗衡离子草酸盐和酒石酸盐两者的影响。进行的研究表明，在一些实施方案中，最佳脂质/药物比例在20:1至50:1的范围内。在一些其他实施方案中，可以使用的其他比例包括20:1至100:1。
实施例7：多柔比星到含有草酸盐和酒石酸盐的脂质体中的冷加载：可变的脂质/ 药物比例。
如下进行多柔比星到脂质体中的冷加载：在室温下将盐酸多柔比星的盐水溶液添加至脂质体纳米悬浮液至终浓度0.5或1mg/mL(即每mL 0.468和0.936mg多柔比星游离碱)，轻轻倒置(2-3次)并且在室温下温育10-20min。在室温下温育10-20min后，将混合物：a)用含有6％蔗糖的PBS pH 6.7进行另一个TFF 5X循环，和/或b)置于2-8℃冷藏室中16小时，并且然后用含有6％蔗糖的PBS pH 6.7进行另一个TFF 5X循环。在RT下，或在RT然后2-8℃过夜温育加载的脂质体的多柔比星释放曲线之间未观察到显著差异，未示出关于RT然后2-8℃过夜温育的数据。
制剂组成示出在表26中。
表26.制剂组成。
制备粗悬浮液并且将其在10KPSI处理压力下进行MF处理。在MF处理9-15min后，颗粒大小(Z-平均值)达到～60-66nm。收集样品并且无菌过滤到Nalgene烧瓶中。测定过滤的纳米悬浮液的颗粒大小(表26a)。
表26a.对MF处理和所得乳液参数的概述。
对脂质体进行TFF，然后用多柔比星进行远程加载，并且用PBS蔗糖进行另一个TFF循环。加载多柔比星的脂质体的颗粒大小呈现于表26b中。
表26b.加载多柔比星的脂质体的颗粒大小。
对脂质体悬浮液中多柔比星的测定。将随后的多柔比星加载的脂质体悬浮液进行5X TFF以主要除去游离(未包封的)多柔比星。为了确定T0(在MFD的一周内)处总多柔比星浓度，用甲醇或IPA稀释TFF洗涤的脂质体并且进行HPLC分析。多柔比星含量、回收百分率(脂质体悬浮液中的多柔比星含量相对于用于远程加载的多柔比星游离碱浓度)和包封效率(％)呈现于表26c中。包封效率(％)表示多柔比星回收率(％)与游离多柔比星(％)之间的差异。
表26c.总多柔比星含量和包封效率。
在制造一周内测定游离多柔比星的量(表26d)。
表26d.游离多柔比星含量。
批号 抗衡离子 脂质/药物 总量的％
647-2-181 A 草酸根 100 0.07
647-2-163 B 草酸根 50 0.08
647-2-185 A 草酸根 20 0.01
647-2-185 C 草酸根 5 4.96
647-2-186 A 酒石酸根 100 0.01
647-2-170 B 酒石酸根 50 0.04
647-2-178 A 酒石酸根 20 0.01
647-2-178 C 酒石酸根 5 2.51
在制造后一周内在37℃下进行脂质体多柔比星释放研究(表26e)。对于每个样品，在2、4和8小时时间点测定多柔比星释放。
表26e.在37℃下测定的多柔比星释放速率。
颗粒大小。从表26和26a中可以看出，所有特定脂质体制剂的微流化导致相似的颗粒大小。多柔比星加载仅导致一些制剂的颗粒大小略微增加。
多柔比星包封的效率。以20:1至100:1的脂质/药物比例将多柔比星包封到含有草酸盐的脂质体中的效率在91％至97％之间变化(表26c)。相比之下，对于具有脂质/药物比例5:1的脂质体，观察到明显更低的包封效率(22％)(表26c)。
当将酒石酸根用作抗衡离子时，以20:1至100:1的脂质/药物比例将多柔比星包封到脂质体中的效率在83％至91％之间变化(表26c)，而对于具有脂质/药物比例5:1的脂质体观察到更低的包封效率(67％)(表26c)。
游离(未包封的)多柔比星。游离多柔比星反映了在加载步骤期间未被包封到脂质体中或在储存期间从脂质体中泄漏的药物的浓度。从表26d中可以看出，具有脂质/药物比例20:1和100:1的含有草酸盐的脂质体中的游离多柔比星含量在0.01-0.08％的范围内。具有5:1脂质/药物比例的制剂中测定的游离多柔比星含量为4.96％(表26d)。
当将酒石酸根用作抗衡离子时，具有20:1至100:1的脂质/药物比例的脂质体的游离多柔比星含量在0.01％至0.04％之间变化(表26d)，而对于具有脂质/药物比例5:1的脂质体观察到更低的包封效率和更高的游离多柔比星含量(2.51％)(表26d)。
脂质体多柔比星释放速率。
脂质/药物比例的影响。从表26e中可以看出，对于两种抗衡离子，对于具有脂质/药物比例50:1和100:1的制剂，与pH 6.7下的多柔比星释放相比，pH 5下的多柔比星释放显著更高(表26e和图11-12)。此外，pH 6.7下的多柔比星泄漏被完全抑制(表26e，图11-12)。
在pH 5下，来自冷加载的含有草酸盐的脂质体的多柔比星释放在2小时时间点实现～100％，并且是在70℃下加载的脂质体的多柔比星释放的两倍(图13)。
在pH 5下，来自冷加载的含有酒石酸盐的脂质体的多柔比星释放在4小时时间点实现～90-100％，并且是在70℃下加载的脂质体的多柔比星释放的三倍(图14)。
令人惊讶的是，当使用草酸根和/或酒石酸根作为抗衡离子时，冷加载(例如在室温下混合)通过以下方式而与在70℃下加载的脂质体相比进一步改善(最大化)ΔpH 6.7/5.0释放差异：在pH 5下显著增加药物释放，而在pH 6.7下抑制其释放(表26e和图13和图14)。在酸性pH下，来自冷加载的含有草酸盐的脂质体的多柔比星释放在2小时时间点实现～100％，并且是在70℃下加载的脂质体的多柔比星释放的两倍(图13)。来自冷加载的含有酒石酸盐的脂质体的多柔比星释放在4小时实现～90％(图14)，并且是在70℃下加载的脂质体的多柔比星释放的三倍。
有趣的是，含有多柔比星-柠檬酸盐的脂质体在pH 5下展示出低释放速率，但由于pH 6.7下的极低释放，ΔpH 6.7/5.0释放差异是可接受的(表13和图3)。
相比之下，具有低于5:1的脂质/药物比例的制剂展示出差的ΔpH 6.7/5.0释放差异，这是由于在pH 5.0下的较低释放和在pH 6.7下的多柔比星泄漏(表26e和图11-12)。然而，值得一提的是，与草酸盐脂质体相比，低于50:1脂质/药物比例的含有酒石酸盐的脂质体在中性pH下展示出更强的多柔比星泄漏抑制(表26e和图11-12)。
因此，在一些实施方案中，两种抗衡离子草酸根和酒石酸根的脂质比药物比例可能发挥作用。进行的研究表明，在一些实施方案中，最佳脂质比药物比例在一些实施方案中可以在20:1至50:1的范围内。在一些其他实施方案中，在一些其他实施方案中，可以使用的其他比例包括10:1至100:1。
还已经证明，在一些实施方案中，多柔比星的冷加载使用作为抗衡离子的草酸根和酒石酸根和50:1和100:1脂质/药物比例实现的ΔpH 6.7/5.0释放差异最大化。在一些其他实施方案中，可用于在草酸盐和酒石酸盐中的远程多柔比星加载的其他温度包括2-8℃至70℃。
实施例8.1：冻干且重构的多柔比星到含有草酸盐和/或酒石酸盐的脂质体中的冷 加载。
冻干。将盐酸多柔比星在含有6％蔗糖或4％甘露醇或1％乳糖或3％乳糖的无菌注射用水中溶解至6mg/mL的终浓度，无菌过滤，无菌填充于2mL小瓶中(1mL填充体积)，并且在VirTis Genesis SQ25EL冷冻干燥器中冻干。将含有多柔比星溶液的小瓶转移至预冷冻至-40℃的冷冻干燥器中并使其冷冻过夜(16)小时。16小时后，打开真空并且以温度斜升速率1℃/4min将温度增加至-32℃。在32℃下冻干24小时后，以温度斜升速率1℃/20min将温度进一步增加至20℃。将小瓶在真空下塞住。
远程加载：将冻干物质在无菌注射用水中重构至最终浓度6mg/mL，并且在室温下将0.4mL重构的物质(～2.24mg多柔比星游离碱)添加到2mL脂质体纳米悬浮液中至终浓度0.936mg/mL多柔比星游离碱，轻轻倒置(2-3次)并在室温下温育10min。
制剂组成示出在表27中。
表27.制剂组成。
制备粗悬浮液并且将其在10KPSI处理压力下进行MF处理。在MF处理9-15min后，颗粒大小(Z-平均值)达到～60-70nm。收集样品并且无菌过滤到Nalgene烧瓶中。测定过滤的纳米悬浮液的颗粒大小(表27a)。
表27a.对MF处理和所得乳液参数的概述。
对脂质体进行TFF，然后用多柔比星在RT下进行远程加载，持续10min。加载多柔比星的脂质体的颗粒大小呈现于表27b中。
表27b.加载多柔比星的脂质体的颗粒大小。
在制造一周内测定游离(未包封的)多柔比星的量(表27c)。
表27c.游离多柔比星含量。
对脂质体悬浮液中多柔比星的测定。在多柔比星加载步骤之后，未进行第二TFF。为了确定T0(在MFD的一周内)的总多柔比星浓度，用甲醇或IPA稀释多柔比星加载的脂质体并且进行HPLC分析。多柔比星含量、回收百分率(脂质体悬浮液中的多柔比星含量相对于用于远程加载的多柔比星游离碱浓度)和包封效率(％)呈现于表27d中。包封效率(％)表示多柔比星回收率(％)与游离多柔比星(％)之间的差异。
表27d.总多柔比星含量和包封效率。
在制造后一周内在37℃下进行脂质体多柔比星释放研究(表27e)。对于每个样品，在2、4和8小时时间点测定多柔比星释放。
表27e.在37℃下测定的多柔比星释放速率。
冻干的多柔比星产品。含有甘露醇或乳糖的冻干多柔比星水溶液产生易于(即，即时)重构的多柔比星产品。相比之下，在6％蔗糖存在下的冻干产生不易于重构的物质。因此，不考虑将含有6％蔗糖的冻干多柔比星产物用于进一步开发，并且不将其用于加载实验。
颗粒大小。从表27和27a中可以看出，脂质体制剂的微流化导致相似的颗粒大小。多柔比星加载不影响脂质体的颗粒大小，所述颗粒大小与抗衡离子和低温保护剂无关(表27b)。
游离(未包封的)多柔比星。游离多柔比星反映了在加载步骤期间未被包封到脂质体中或在储存期间从脂质体中泄漏的药物的浓度。从表27c中可以看出，含有草酸盐的脂质体中的游离多柔比星含量为～0.24％。当使用酒石酸根作为抗衡离子时，脂质体悬浮液中的游离多柔比星含量在0.14％至0.18％的范围内(表27d)。
多柔比星包封的效率。多柔比星包封的效率为97至100％(考虑游离多柔比星的水平)，而与抗衡离子和低温保护剂无关(表27d)。
脂质体多柔比星释放速率。将冻干且重构的多柔比星冷(室温)加载到含有草酸盐和/或酒石酸盐的脂质体中导致多柔比星的快速(在10min内)包封。脂质体多柔比星产品展示出优异的ΔpH 6.7/5.0释放差异，在pH 5下具有高多柔比星释放，而在pH 6.7下的多柔比星释放被完全抑制(表27e)。
因此，证明了成功冻干多柔比星导致在RT下易于在注射用水中重构的冻干产物、我们的新型脂质体在RT下快速包封重构的多柔比星产物的独特能力，并且提供了优异的ΔpH 6.7/5.0释放差异。
总之，脂质体多柔比星产物的稳定性取决于脂质体的稳定性和脂质体内药物产品的稳定性。冻干的且易于在RT下重构的多柔比星，和含有草酸盐或酒石酸盐的脂质体在RT下快速加载多柔比星的能力解决了这些潜在的稳定性问题，同时还提供了优异的释放曲线。该发现导致特定的产品呈现形式，其由两个小瓶组成：具有冻干多柔比星的小瓶和具有脂质体载体悬浮液的小瓶。在室温下混合(通过简单的倒置)两个小瓶的重构内容物将在几分钟内产生最终的即用型产品。
产品稳定性。当在2-8℃环境RH下储存至少6个月时，不含多柔比星、含有草酸盐或酒石酸盐的脂质体((媒介物)和冻干多柔比星的两种悬浮液都是稳定的。六个月的时间点表示对8.1章节中描述的制剂进行的最后稳定性测试。载体加载有冻干且重构的多柔比星并且稳定性测试包括：冻干且重构的多柔比星物质的HPLC测定(98±2，％)、多柔比星包封到脂质体中的效率(98±2，％)、游离(未包封)多柔比星的测定(0.1-1％)、颗粒大小(Z平均值＝63-68nm)、pH(7.2-6.7)，并且ΔpH 6.7/5.0多柔比星释放差异接近100％。此外，在2-8℃环境RH下储存的较老批次(647-1-190)的含有草酸盐的脂质体((媒介物)显示出至少18个月的可接受的稳定性，在上述参数中未观察到显著的变化。还考虑了冻干脂质体媒介物的开发。
实施例8.2：在固定的50:1脂质/药物比例下不同抗衡离子的比较：冷加载。
使用的水合介质：
a)300mM下列铵盐的溶液：草酸铵或硫酸铵或磷酸铵或柠檬酸铵。
b)将酒石酸、抗坏血酸或N-乙酰L半胱氨酸(NAC)首先用氢氧化铵滴定至pH 4.8-5.0，并且然后用作水合介质。
制剂组成示出在表27中。所有制剂均以50:1固定的脂质/药物比例制备(表28)
未显示NAC的数据，因为未观察到多柔比星加载，并且在2-8℃下过夜储存后脂质体材料沉淀。
表28.制剂组成。
制备粗悬浮液并且进行MF处理。在MF处理9-12min后，颗粒大小(Z-平均值)达到～60-75nm。收集样品并且无菌过滤到Nalgene烧瓶中。然后对脂质体进行TFF，然后用多柔比星进行远程加载，并且用PBS蔗糖进行另一个TFF循环。微流化脂质体材料的颗粒大小类似于本文所示的颗粒大小。
用于远程加载的盐酸多柔比星浓度：1.0mg/mL(多柔比星游离碱浓度：0.936mg/mL)。
如下进行多柔比星到脂质体中的冷加载：在室温下将盐酸多柔比星的盐水溶液(6mg/mL)添加至脂质体纳米悬浮液至终浓度1mg/mL(即每mL 0.936mg多柔比星游离碱)，轻轻倒置(2-3次)并且在室温下温育10-20min。在室温下温育10-20min后，将混合物：a)用含有6％蔗糖的PBS pH 6.7进行另一个TFF 5X循环，和/或b)置于2-8℃冷藏室中16小时，并且然后用含有6％蔗糖的PBS pH 6.7进行另一个TFF 5X循环。在RT下，或在RT然后2-8℃过夜温育加载的脂质体的多柔比星释放曲线之间未观察到显著差异。未示出关于RT然后2-8℃过夜温育的数据。
加载多柔比星的脂质体的颗粒大小呈现于表28a中。
表28a.加载多柔比星的脂质体的颗粒大小。
对脂质体悬浮液中多柔比星的测定。将随后的多柔比星加载的脂质体悬浮液进行5X TFF以主要除去游离(未包封的)多柔比星。为了确定T0(在MFD的一周内)的总多柔比星浓度，用甲醇或IPA稀释TFF洗涤的脂质体并且进行HPLC分析。多柔比星含量、回收百分率(脂质体悬浮液中的多柔比星含量相对于用于远程加载的多柔比星游离碱浓度)和包封效率(％)呈现于表28b中。包封效率(％)表示多柔比星回收率(％)与游离多柔比星(％)之间的差异。
表28b.总多柔比星含量和包封效率。
在制造一周内测定游离多柔比星的量(表28c)。
表28c.游离多柔比星含量。
批号 抗衡离子 总量的％
647-2-169 B 硫酸根 0.01
647-2-163 B 草酸根 0.08
647-2-169 C 磷酸根 0.01
647-2-170 B 酒石酸根 0.04
647-2-169 D 柠檬酸根 0.01
647-2-164 B 抗坏血酸根 1.85
在37℃下进行脂质体多柔比星释放研究(表28d)。对于每个样品，在2、4和8小时时间点测定多柔比星释放。
表28d.在37℃下测定的多柔比星释放速率。
颗粒大小。不同脂质体制剂的微流化导致接近类似于本文所示的颗粒大小的相似颗粒大小。与在70℃下加载多柔比星的脂质体相比，冷多柔比星加载导致颗粒大小增加略微较少(含有抗坏血酸盐的脂质体除外)(表28a和表8)。
多柔比星包封的效率。大多数配方的多柔比星包封效率在86％至97％之间变化，除了含有磷酸盐的脂质体显示出78％的多柔比星回收率(表27b)。当使用草酸根作为抗衡离子时观察到最高效的包封，而在磷酸根的情况下效率最低(表28b)。
游离(未包封的)多柔比星。游离多柔比星反映了在T0(制造后一周内)测定的未包封药物的浓度。从表27c中可以看出，对于所有制剂的游离多柔比星含量在从0.01-0.08％的范围内。含有多柔比星-抗坏血酸盐的脂质体展示出明显更高的游离多柔比星泄漏(表28c)。
脂质体多柔比星释放速率。在37℃下进行药物释放研究。
在70℃下与多柔比星加载的脂质体相比(表13，图3)，多柔比星的冷加载导致柠檬酸盐的ΔpH 6.7/5.0释放差异的一些改善(表28d，图15)、草酸盐的ΔpH 6.7/5.0释放差异显著改善，和酒石酸盐的主要改善(表28d，图15)。
含有多柔比星-硫酸盐和-磷酸盐的脂质体保留了差的ΔpH 6.7/5.0释放差异(表28d，图15)，这是由于在两种pH下的低释放。虽然含有多柔比星-抗坏血酸盐的脂质体在pH5下展示出高的多柔比星释放，但由于多柔比星在pH 6.7下的高释放/泄漏，ΔpH 6.7/5.0释放差异非常差(表28d，图15)，这使得多柔比星包封的目的失败，并且将损害产品稳定性和体内性能。
因此，当使用草酸根或酒石酸根作为抗衡离子时，与其他使用的抗衡离子相比，在pH 5和pH 6.7下的多柔比星释放之间的差异明显更高，而与加载条件无关(表13，图3和表28d，图15)。然而，值得一提的是，相对于在70℃下加载的相同脂质体制剂，冷加载进一步改善了含有多柔比星-草酸盐和-酒石酸盐的脂质体的ΔpH 6.7/5.0释放差异。观察到的差异表明了在37℃下多柔比星-草酸盐或-酒石酸盐聚集体的物理状态的独特性，所述独特性可以促进它们响应于温度和pH而溶出。
实施例8.3：多柔比星到含有草酸盐或酒石酸盐或柠檬酸盐的脂质体中的冷加载。
该实施例提供(i)关于在pH 6.7、6.7、6.0和5.0下pH依赖性多柔比星释放的进一步表征和(ii)脂质/药物和磷脂/游离胆固醇(PL/FC)比例对pH依赖性多柔比星释放的影响。用Myocet样制剂(“Myocet”，多柔比星-柠檬酸盐)和(多柔比星-硫酸盐)进行比较。
制备含有草酸盐、酒石酸盐和柠檬酸盐的脂质体((媒介物)，并且如8.1方法和章节中所述用盐酸多柔比星加载至终浓度为1mg/mL。通过调节磷脂和/或游离胆固醇的相对量(表28e)和/或通过在加载多柔比星之前相应稀释脂质体来实现各种脂质/药物和磷脂/游离胆固醇(PL/FC)比例。在表28e-28h中，“脂质/药物”表示在加载多柔比星的脂质体的最终悬浮液中总脂质与多柔比星游离碱的重量/重量(w/w)比例。“PL/FC”表示加载多柔比星的脂质体的最终悬浮液中磷脂(PL)与游离胆固醇(FC)的mol/mol比。
将商业和Myocet样(“Myocet”)脂质体用作比较物。通过在65℃下将含有6.9g PC和2.84g FC(55/45摩尔比)的脂质膜用100mL 0.3M柠檬酸pH 4.0水合来制备Myocet样(“Myocet”)脂质体。如8.1方法和章节中所述进行微流化和TFF。将所得的脂质体无菌过滤。取出1.9mL等分试样，并且使其根据Myocet包装插页中描述的方案，在70℃下在总共25mL加载介质中加载50mg多柔比星。详细的制剂组成列于表28e中。
表28e.制剂组成。
PL-磷脂，FC-游离胆固醇。
多柔比星释放测试在溶出介质中以20X(表28f)和50X(表28g)稀释度进行。
表28f.在37℃下在pH 6.7、6.7、6.0和5.0溶出介质中温育8小时后测定的多柔比星释放速率。溶出介质中的稀释度＝20X。
表28g.在37℃下在pH 6.7、6.7、6.0和5.0溶出介质中温育8小时后测定的多柔比星释放速率。溶出介质中的稀释度＝50X。
抗衡粒子的影响。从表28f、28g和图16-17中可以看出，当与用相同(50/1)脂质/药物比例制备的含有多柔比星-酒石酸盐和多柔比星-柠檬酸盐的脂质体相比时，含有多柔比星-草酸盐的脂质体在20X和50X稀释度下展示出最高的ΔpH(6.7/6.7/6.0/5.0)多柔比星释放差异。值得一提的是，来自含有多柔比星-草酸盐的脂质体的pH依赖性多柔比星释放(表28f、28g，图16和17)和多柔比星-酒石酸脂质体的略微较小程度的pH依赖性多柔比星释放与体内发生的生理pH梯度一致(图1)，这指示了我们的脂质体递送系统的pH靶向能力。在20X和50X稀释度下，对于“Myocet”，观察到明显更低的ΔpH(6.7/6.7/6.0/5.0)多柔比星释放差异(表28f、28g，图16-17)。的ΔpH(6.7/6.7/6.0/5.0)多柔比星释放差异接近于零(表28f、28g，图16-17)。
脂质/药物比例的影响。当将多柔比星-草酸盐脂质体(50/1脂质/药物比例)的ΔpH释放差异与以23/1和/或16/1脂质/药物比例制得的多柔比星-草酸盐脂质体的ΔpH释放差异相比时，可以清楚地看到ΔpH(6.7/6.7/6.0/5.0)多柔比星释放差异对脂质/药物比例的依赖性(表28f和图18；在溶出介质中20X稀释脂质体)。在溶出介质中50X稀释的脂质体材料时观察到相似的依赖性，但程度较小(表28g和图19)。值得一提的是，以低(23/1和16/1)脂质/药物比例制得的脂质体显示出对稀释因子(即，20X或50X)的显著依赖性，而具有更高(50/1)脂质/药物比例的脂质体在两种条件下展示出基本上类似的药物释放(表28f、28g和图16-19)。在50X稀释度下观察到从以低(23/1和16/1)脂质比药物比例制备的脂质体中的一些多柔比星泄漏(表28g和图19)。
从在20X和50稀释度下以50/1和3.5/1脂质/药物比例制备的多柔比星-柠檬酸盐脂质体的比较中可以看出ΔpH(6.7/6.7/6.0/5.0)多柔比星释放差异对脂质/药物比例的显著依赖性(表28f、28g和图16-17)。
因此，获得的数据证明，在一些实施方案中，较高的脂质/药物比例实现较高的ΔpH 6.7/6.7、6.7/6.0和6.7/5.0多柔比星释放差异。在一些实施方案中，在较低的脂质/药物比例下，可以迫使多柔比星-草酸盐或-酒石酸盐或可能的柠檬酸盐聚集体形成更密集的原纤维状结构，其将对聚集体的溶出产生负面影响。这些数据还表明，在一些实施方案中，较高的脂质/药物比例适应/支持多柔比星聚集体的pH敏感性、可能紊乱的物理状态。对于较低的脂质/药物比制剂观察到的多柔比星在中性pH下的泄漏可能是由于较低的脂质含量，从而导致表面张力增加并且至少在一些实施方案中导致加载多柔比星的脂质体的脂质双层的完整性受损。
PL/FC(磷脂/游离胆固醇)比例的影响。游离胆固醇含量可以影响单层脂质体脂质双层刚性，所述刚性可能潜在地转化为脂质体的血清/血液稳定性[52,53]，并且还可以为进一步开发冻干产品奠定基础。为了测试增加的FC含量是否会对ΔpH(6.7/6.7/6.0/5.0)多柔比星释放差异产生负面影响，进行FC含量，并且因此PL/FC比例对ΔpH释放差异的影响的实验。从表28f和图18(在溶出介质中20X稀释)中可以看出，多柔比星-草酸盐脂质体中FC含量的增加和PL/FC比例从3.68至0.86的相应降低导致6.7pH下的药物释放显著降低，而在pH6.0和5.0下的释放没有受显著影响。
当使用具有3.68至1.29PL/FC比例的脂质体以50X稀释度(表28g和图19)进行释放实验时，未观察到FC对ΔpH(6.7/6.7/6.0/5.0)多柔比星释放差异的显著影响。值得一提的是，PL/FC比例<1.0导致在20X和50X稀释度下的多柔比星释放显著变化(表28f和28g)。
因此，总体数据证明，在一些实施方案中，当以50X稀释度进行释放实验时，多柔比星-草酸盐脂质体的ΔpH(6.7/6.7/6.0/5.0)多柔比星释放差异可以高度耐受PL/FC摩尔比从3.68中至1.29的降低。在20X稀释下，PL/FC摩尔比从3.68至1.29的降低主要影响ΔpH(6.7/6.7)释放差异，而在pH 6.0和5.0下未观察到多柔比星释放速率的显著变化。相比之下，多柔比星-柠檬酸盐脂质体的PL/FC摩尔比从3.68至1.22的降低导致在整个pH范围内的ΔpH释放差异降低(表28f、28g和图16-17)。
实施例8.4：多柔比星到含有草酸盐或酒石酸盐或柠檬酸盐的脂质体中的冷加载。
该实施例提供(i)关于含有多柔比星-草酸盐、多柔比星-酒石酸盐和(ii)多柔比星-柠檬酸盐的脂质体在人血清中的稳定性的进一步表征。证明了脂质/药物和磷脂/游离胆固醇(PL/FC)比例的影响。
制备含有草酸盐、酒石酸盐和柠檬酸盐的脂质体((媒介物)，并且如8.1方法和章节中所述用盐酸多柔比星加载至终浓度为1mg/mL。通过操纵磷脂和/或游离胆固醇的相对量(表28e)和/或通过在加载多柔比星之前适当稀释脂质体来实现各种脂质/药物和磷脂/游离胆固醇(PL/FC)比例。
将商业和Myocet样(“Myocet”)脂质体用作比较物。通过在65℃下将含有6.9g PC和2.84g FC(55/45摩尔比)的脂质膜用100mL 0.3M柠檬酸pH 4.0水合来制备Myocet样(“Myocet”)脂质体。如8.1方法和章节中所述进行微流化和TFF。将所得的脂质体无菌过滤。取出1.9mL等分试样，并且使其根据Myocet包装插页中描述的方案，在70℃下在总共25mL加载介质中加载50mg多柔比星。详细的制剂组成列于表28e中。
通过将50uL加载多柔比星的脂质体添加至2.45mL(50x稀释度)人血清中，以脂质体材料在人血清中的50x稀释液(模拟60mg/m2或110mg/70kg人剂量的多柔比星的施用)进行血清稳定性研究。立即分析T0样品并且将其他样品在37℃下温育2、4和8小时。在每个时间点测量完整脂质体(Fi)的荧光和用Triton X-100破裂的脂质体的总荧光(Ft)。数据呈现在表28h中。
表28h.在37℃和50X稀释度下将加载多柔比星的脂质体在人血清中温育2、4和8小时后测定的多柔比星释放。
抗衡粒子的影响。对于在相同(50/1)脂质/药物比例下制得的多柔比星-草酸盐、-酒石酸盐和-柠檬酸盐脂质体，观察到人血清中的类似稳定性(表28h)。该数据表明抗衡离子不能决定测试制品在人血清中的稳定性。值得一提的是，通过使用聚乙二醇化脂质实现了血清中脂质体的显著稳定性[2-5,7-8]。
脂质/药物比例的影响。在表28h和图20中可以看出，多柔比星-草酸盐脂质体的血清稳定性随着脂质/药物比例的降低而降低。与用23/1和16/1脂质/药物比例制得的多柔比星-草酸盐脂质体相比，以≥50/1脂质/药物比例制得的多柔比星-草酸盐脂质体的稳定性显著更高。在比较以50/1和3.5/1脂质/药物比例制得的多柔比星-柠檬酸盐脂质体时观察到相同的趋势(表28h和图20)。这些数据清楚地证明，脂质/药物比例可能有助于脂质体的血清稳定性。脂质/药物比例对脂质体血清稳定性的影响以及其对ΔpH(6.7/6.7/6.0/5.0)多柔比星释放差异的影响展示了在一些实施方案中使用较高的脂质/药物比例以获得脂质体传递系统的最佳性能的优势。
PL/FC(磷脂/游离胆固醇)比例的影响。随着FC含量的增加和随后PL/FC比例的降低，观察到多柔比星-草酸盐脂质体的血清稳定性的进一步增加(表28h和图21)。PL/FC比例0.86展示出对人血清中脂质体的最高保护，但是观察到0.86PL/FC比例对ΔpH(6.7/6.7/6.0/5.0)多柔比星释放差异的显著负面影响(表28f和28g)。获得的数据表明，多柔比星-草酸盐脂质体的最佳PL/FC比例将在3.68与1之间(表28f-28h，和图20-21)。值得一提的是，具有接近最佳PL/FC比例(1.29)但低于50/1的脂质/药物比例(即，23/1和16/1)的多柔比星-草酸盐脂质体展示出较低的血清稳定性(表28h和图20)。这些数据证明了脂质/药物和PL/FC比例对脂质体血清稳定性的贡献。对于多柔比星-柠檬酸盐脂质体，观察到脂质/药物和PL/FC比例之间的类似关系((表28h和图20)。还值得一提的是，与人血清相比，人血液和小鼠血清对脂质体显示出较小的有害作用(未示出数据)。
获得的数据清楚地证明了脂质/药物比例和PL/FC比例对脂质体血清稳定性和ΔpH(6.7/6.7/6.0/5.0)多柔比星释放差异的影响，这强调了较高的脂质/药物比例和低于3.68但高于1.0的PL/FC比例在一些实施方案中的有益效果。
总之，获得的数据证明，与“Myocet”和相比，多柔比星-草酸盐脂质体表现出明显更高的ΔpH(6.7/6.7/6.0/5.0)多柔比星释放差异(表28e-28g和图16-17)。多柔比星-草酸盐脂质体的血清稳定性明显高于“Myocet”的血清稳定性，但低于但是降低PL/FC比例同时保持脂质/药物比例≥50/1进一步改善了多柔比星-草酸盐脂质体的血清稳定性并且使其与有些相当于(表28e、28h和图21)。已知脂质体的若干种物理和化学特性，诸如大小、脂质组成、电荷和表面涂层，决定了它们与影响囊泡清除药代动力学的血浆蛋白的相互作用[53]。因此，如果根据本公开的脂质体递送系统的体内药代动力学(即血浆浓度-时间曲线下面积、消除半衰期等)反映血清性能(即，在Myocet与之间)，则那将是非常理想的结果。
实施例9：多柔比星到固定(50:1)脂质/药物比例脂质体中的冷加载：向草酸铵和/ 或酒石酸铵水合介质中添加抗坏血酸(AA)或N-乙酰半胱氨酸(NAC)、抗坏血酸棕榈酸酯 (ascorbil palmitate)(AP)、泛醌(CoQ10)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
使用的水合介质：草酸铵的300mM溶液；将酒石酸首先用氢氧化铵滴定至ph 4.8-5.0，并且然后用作水合介质。
如方法章节中所述制备脂质体，不同的是将NAC或AA或AP或CoQ10或EDTA添加至300mM草酸铵水合介质至最终浓度100mM(NAC)或36和100mM(AA)、2mM或20mM(AP)、1mM(CoQ10)、2mM或20mM(EDTA)。
如下进行多柔比星到脂质体中的冷加载：在室温下将盐酸多柔比星的盐水溶液(6mg/mL)添加至脂质体纳米悬浮液至终浓度1mg/mL(即每mL 0.936mg多柔比星游离碱)，轻轻倒置(2-3次)并且在室温下温育10-20min。在室温下温育10-20min后，将混合物：a)用含有6％蔗糖的PBS pH 6.7进行另一个TFF 5X循环，和/或b)置于2-8℃冷藏室中16小时，并且然后用含有6％蔗糖的PBS pH 6.7进行另一个TFF 5X循环。在RT下，或在RT然后2-8℃过夜温育加载的脂质体的多柔比星释放曲线之间未观察到显著差异。未示出关于RT然后2-8℃过夜温育的数据。
制剂组成示出于表29中。
表29.制剂组成。
制备粗悬浮液并且将其在10KPSI处理压力下进行MF处理。在MF处理9-15min后，颗粒大小(Z-平均值)达到～60-75nm。收集样品并且无菌过滤到Nalgene烧瓶中。测定过滤的纳米悬浮液的颗粒大小(表29a)。
表29a.对MF处理和所得乳液参数的概述。
对脂质体进行TFF，然后用多柔比星进行远程加载，并且用PBS蔗糖进行另一个TFF循环。
加载多柔比星的脂质体的颗粒大小呈现于表29b中。
表29b.加载多柔比星的脂质体的颗粒大小。
在制造一周内测定游离(未包封的)多柔比星的量(表29c)。
表29c.游离多柔比星含量。
批号 总量的％
647-2-163 B 0.08
647-2-170 B 0.04
647-2-153 C 0.07
647-2-161 B 0.03
647-2-165 B 0.01
647-2-172 B 0.08
647-2-173 B 0.09
647-2-175 B 0.16
647-2-190 B 0.1
647-2-192 B 0.07
647-2-193 B 0.02
647-2-194 B 0.01
对脂质体悬浮液中多柔比星的测定。将随后的多柔比星加载的脂质体悬浮液进行5X TFF以主要除去游离(未包封的)多柔比星。为了确定T0(在MFD的一周内)的总多柔比星浓度，用甲醇或IPA稀释TFF洗涤的脂质体并且进行HPLC分析。多柔比星含量、回收百分率(脂质体悬浮液中的多柔比星含量相对于用于远程加载的多柔比星游离碱浓度)和包封效率(％)呈现于表29d中。包封效率(％)表示多柔比星回收率(％)与游离多柔比星(％)之间的差异。
表29d.总多柔比星含量和包封效率。
在制造后一周内在37℃下进行脂质体多柔比星释放研究(表29e)。对于每个样品，在2、4和8小时时间点测定多柔比星释放。
表29e.在37℃下测定的多柔比星释放速率。
在存在或不存在抗坏血酸或NAC的情况下多柔比星包封的效率在80-97％的范围内(表29d)。与仅用草酸盐或酒石酸盐形成的脂质体相比，向草酸铵水合介质中添加抗坏血酸或NAC对脂质体±多柔比星的颗粒大小(表289和29b)、游离(未包封或泄漏的)多柔比星(表29c)以及更重要地多柔比星释放曲线(表29e)没有显著影响(表29a-e)。
添加2mM或20mM EDTA、2mM或20mM AP或1mM CoQ10对空载或加载多柔比星脂质体的颗粒大小(表29a和29b)、游离多柔比星(29c)和包封效率没有任何显著影响(表29d)。
用2mM AP(AP/草酸盐-1:150)或1mM CoQ10(CoQ10/草酸盐-1:300)补充草酸盐不影响多柔比星释放曲线(表29e)。虽然在添加20mM AP(AP/草酸盐-1:15)后观察到多柔比星释放的一些降低，但ΔpH 6.7/5.0释放差异足够高(表29e)。
用2mM EDTA(比例为1:150的草酸盐/EDTA)补充草酸盐不影响多柔比星释放曲线(表28e)。虽然当将2mM EDTA添加至300mM酒石酸盐(酒石酸盐/EDTA-1:150)水合介质时观察到多柔比星释放显著降低(表29e)，但ΔpH 6.7/5.0释放差异足够高。相比之下，当将20mM的EDTA添加至300mM草酸盐或酒石酸盐水合介质时观察到非常低的多柔比星释放(表29e)。
这些发现使得能够使用抗坏血酸和/或NAC和/或抗坏血酸棕榈酸酯和/或CoQ10和/或EDTA与草酸盐或酒石酸盐(在一些实施方案中优选的抗衡离子)或柠檬酸盐组合来减轻加工过程中的氧化应激并且可以使产品更稳定，具有更长的保质期。此外，抗坏血酸可以发挥心脏保护作用，以预防或减轻多柔比星诱导的心脏毒性[28-29和33]。在若干实施方案中，这可以由不受限制的、药物诱导的心脏活性氧代谢产生[28-29]。研究表明，用多柔比星治疗后的电子转移在心脏中显著增强，并且导致线粒体和肌浆网中超氧阴离子和过氧化氢形成的显著增加，这是多柔比星对心脏损伤的两个主要位点[28,30-31]。维生素C(抗坏血酸)是一种抗氧化维生素，其已显示出拮抗产生的活性氧物质的抗肿瘤药物的作用[29,32-33]。还已经证明用药理剂量的NAC治疗实验动物选择性地挽救心脏免于多柔比星的毒性[28,29,34]。诸如EDTA的螯合剂可通过螯合过渡金属离子减少活性氧物质(ROS)的产生，从而减少对心肌细胞膜的损伤和多柔比星相关心肌病的风险[36,37]。除了EDTA外，还可以通过抑制金属催化的脂质氧化来增加脂质体制剂的稳定性。
因此，用抗坏血酸(AA/草酸盐-1:8或1:3)和/或NAC(NAC/草酸盐-1:3)和/或AP(AP/草酸盐-1:150或1:15)和/或CoQ10(CoQ10/草酸盐-1:300)和/或EDTA(EDTA/草酸盐1:150)补充草酸盐或酒石酸盐(在一些实施方案中优选的抗衡离子)或柠檬酸盐对ΔpH 6.7/5.0多柔比星释放差异没有相当大的负面影响。因此，优化的ΔpH 6.7/5.0释放差异和抗氧化剂/螯合剂的这种强有力组合可能对癌症患者有效并且有利于减轻游离多柔比星的心脏毒性作用。可以使用的抗坏血酸或NAC与草酸盐或酒石酸盐或柠檬酸盐的其他比例包括1:10至1:1。可以使用的AP与草酸盐或酒石酸盐或柠檬酸盐的其他比例包括1:300至1:10。可以使用的CoQ10与草酸盐或酒石酸盐或柠檬酸盐的其他比例包括1:300至1:10。可以使用的EDTA与草酸盐或酒石酸盐或柠檬酸盐的其他比例包括1:300至1:5。
螯合剂(例如抗坏血酸(AA)或N-乙酰半胱氨酸(NAC)、抗坏血酸棕榈酸酯(AP)、泛醌(CoQ10)或乙二胺四乙酸(EDTA))与抗衡离子(例如草酸根、酒石酸根或柠檬酸根)的比例，即螯合剂/反离子比例可以为约1:1至约1:10,000。
因此，在若干实施方案中，AA/草酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。在若干实施方案中，NAC/草酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。在若干实施方案中，AP/草酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。在若干实施方案中，CoQ10/草酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。在若干实施方案中，EDTA/草酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。
在若干实施方案中，AA/酒石酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。在若干实施方案中，NAC/酒石酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。在若干实施方案中，AP/酒石酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。在若干实施方案中，CoQ10/酒石酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。在若干实施方案中，EDTA/酒石酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。
在若干实施方案中，AA/柠檬酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。在若干实施方案中，NAC/柠檬酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。在若干实施方案中，AP/柠檬酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。在若干实施方案中，CoQ10/柠檬酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。在若干实施方案中，EDTA/柠檬酸盐的比例可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约1:20、约1:50、约1:100、约1:200、约1:300、约1:500、约1:1000、约1:2000、约1:5000、约1:10,000或更多。
可以有利和/或与草酸盐和/或酒石酸盐组合使用的其他抗衡离子和/或抗氧化剂和/或螯合剂包括柠檬酸盐和/或植酸盐和/或谷胱甘肽和/或维生素e和/或右雷佐生和/或去铁胺。
总体而言，获得的数据证明了以下的效应：
a)适当的抗衡离子诸如草酸根和酒石酸根，其决定脂质体内多柔比星聚集体的物理状态和最佳的ΔpH 6.7/5.0和ΔpH 6.7/6.7/6.0/5.0释放差异；
b)用于对pH变化选择性响应的脂质/药物比例(在一些实施方案中优选范围为20:-50:1)；
c)多柔比星加载温度(用于最大化ΔpH 6.7/5.0和ΔpH 6.7/6.7/6.0/5.0释放差异的冷加载的优点)；
用于实现最佳pH依赖性药物释放曲线和加载多柔比星的脂质体的稳定性能。
此外，用其他抗衡离子和/或抗氧化剂和/或螯合剂补充优选的抗衡离子可能有利于最终产品稳定性及其生物学性能。
实施例10：伊立替康
方法：
荧光测定术
所有分析均使用Molecular Devices SpectraMax Gemini EM荧光板读数器进行。SoftMax Pro软件控制设备并且用于对值的分析和报告。
在无菌注射用水中的6％蔗糖溶液中制备盐酸伊立替康的标准储备溶液(例如，在含有6％蔗糖的1mL水中6.0mg盐酸伊立替康粉末)。通过将储备溶液在pH 6.7和5.0的磷酸盐缓冲盐水中稀释以括入用于分析的目标浓度来制备校准标准品。将板读数器温度设定为25℃，并且将激发和发射波长分别设定为370nm和470nm。线性响应范围确定为0.5-4μg/mL盐酸伊立替康。为了保持在线性响应范围内，相应地稀释盐酸伊立替康校准标准品和样品。
为了测定脂质体制剂中总伊立替康的荧光(Ft)，在定量前，通过添加Triton X-100至终浓度1％、通过倒置混合，并且温育5-10min来使脂质体破裂。
为了测定脂质体内伊立替康的荧光(Fi)，在不用Triton X-100进行预处理的情况下对脂质体制剂进行荧光分析。
对来自脂质体制剂的伊立替康释放的定量
采用荧光去猝灭技术并将其相对于荧光(用Triton X-100破裂的脂质体)进行转发的方法已用于测定伊立替康的释放。该方法基于以下事实：伊立替康的荧光在包封到脂质体中时被猝灭，并且在伊立替康从脂质体中释放时明显增加。因此，在样品在溶出介质中温育期间，完整脂质体的荧光(Fi)增加表示伊立替康释放到介质中。不同时间点与T0的Fi值之间的差异相对于Ft(破裂脂质体的荧光)进行转发，并且表示释放药物的百分比。
对于以下时间点进行研究：T0、T2小时、T4小时和T8小时。将单个样品在2种单独的稀释剂/溶出介质；PBS pH 6.7和PBS pH 5中稀释20倍(例如100μL样品+1.9mL稀释剂)以模拟到小鼠中的静脉内注射。对于T0时间点测定，在～25℃下将脂质体制剂在pH 6.7和pH 5的PBS缓冲液中稀释。立即(在10min内)测量完整脂质体的荧光(Fi)和用Triton X-100破裂的脂质体的总荧光(Ft)。将板读数器温度设定为25℃，并且将激发和发射波长分别设定为370nm和470nm。
将其他脂质体样品在预热至37℃(以模拟体内温度)的pH 6.7和pH 5的PBS缓冲液中进行20X稀释，并且在37℃下温育2、4和8小时。在每个时间点测量完整脂质体的荧光(Fi)和用Triton X-100破裂的脂质体的总荧光(Ft)。将药物释放的百分比定量为[(Fi_n–Fi_t0)/Ft_avrg)]*100％，其中Fi_n–在2、4或8小时测量的Fi，Fi_t0–在T0处测量的Fi，以及Ft_avrg–相对于T0时间点测定的Ft值的平均值。
值得一提的是，在于pH 6.7下脂质体温育8小时内总荧光(Ft)显著增加。该观察结果与报道的伊立替康在中性介质中转化为羧酸盐形式一致[26-27]。
颗粒大小测定
所有分析均使用具有4mW He-Ne激光器的Malvern Zetasizer Nano ZS进行，所述激光器在波长633nm和检测角为173°下操作。Zetasizer软件控制设备并且用于对值的分析和报告。
强度平均颗粒直径(Z-平均值)由ISO 13321(国际标准化组织1996)中定义的累积量分析计算。
使用30μL脂质体制剂在1.5mL磷酸盐缓冲盐水(pH 6.7)中制备样品，并且将所述样品在分析前平衡至25℃。对于每个样品，一式三份地进行大小测量。
pH测量
所有分析均使用具有Mettler Toledo InLab pH微电极的Mettler ToledoSevenCompact pH计进行。
脂质体的制备：粗悬浮液制备。
通过以表29中所指出的比例将PC、DMPC、FC和P188溶解在10mL的DCM中来制备粗悬浮液。将混合物在氮气流下干燥直至形成粘性膜。将膜在真空烘箱中进一步干燥过夜。第二天，将干燥的脂质膜用预热至65℃的300mM草酸铵或硫酸铵或磷酸铵或柠檬酸铵缓冲液水合，并且立即用手持式均质器均化2-3min。将酒石酸首先用NH4OH滴定至pH 4.8-5.0，并且然后用作水合介质。测定粗悬浮液的颗粒大小并且其始终在800-1200nm的范围内。
MF处理
除非另有说明，否则MF处理体积始终为100ml。MF处理压力始终为10KPSI。在受控(≤65℃)温度下以循环模式(将材料返回到进料储器中)进行粗悬浮液的微流化。处理时间在9-12min范围内。目标颗粒大小为60-70nm(Z-平均值)。
切向流过滤
从微流化器收获半透明纳米悬浮液，并用15-20X体积的PBS pH6.7进行切向流过滤(TFF)。TFF的目的是由PBS替换外部缓冲液草酸铵或硫酸铵或磷酸铵、柠檬酸铵或酒石酸铵，并且主要从脂质体内空间中除去铵。通过使用铵特异性电极测量外部缓冲液中的铵。当外部缓冲液中的铵浓度≤3mM时停止TFF。
伊立替康的远程加载
将盐酸伊立替康溶解在含有6％蔗糖的无菌注射用水中至终浓度为6mg/mL。在室温下将盐酸伊立替康溶液添加至脂质体纳米悬浮液至终浓度1mg/mL(例如，每mL 0.94mg伊立替康游离碱)，并且在室温下温育10-30min，进行或不进行在2-8℃的过夜温育，并且然后用含有6％蔗糖的PBS pH 6.7进行另一个TFF 5X循环。该TFF循环的目的是洗掉游离(未包封的)伊立替康。在RT下，或在RT然后2-8℃过夜温育加载的脂质体的伊立替康释放曲线之间未观察到显著差异。未示出关于RT然后2-8℃过夜温育的数据。
然后将脂质体纳米悬浮液通过0.22um过滤器无菌过滤到无菌Nalgene烧瓶中。测定颗粒大小、pH、Fi、Ft和伊立替康释放曲线。将无菌纳米悬浮液无菌分配到2mL预先灭菌的小瓶中，塞住并密封。将小瓶储存在2-8℃下。
实施例11：伊立替康到固定(50:1)脂质/药物比例脂质体中的冷加载。
在该实施例中使用了展示出促进多柔比星加载到50:1脂质/药物比例脂质体中的抗衡离子。
使用的水合介质：300mM硫酸铵、草酸铵、磷酸铵、柠檬酸铵。
将酒石酸首先用氢氧化铵滴定至pH 5，并且然后用作水合介质。
用1mg/mL(即，每mL 0.94mg伊立替康游离碱)盐酸伊立替康进行冷的远程加载。制剂组成示出在表30中。所有制剂均以50:1固定的脂质/药物比例制备(表30)。
表30.制剂组成。
制备粗悬浮液并且将其在10KPSI处理压力下进行MF处理。在MF处理9-12min后，颗粒大小((Z-平均值)达到～60-65nm。收集样品并且无菌过滤到Nalgene烧瓶中。测定过滤的纳米悬浮液的颗粒大小(表31)。
表31.对MF处理和所得乳液参数的概述。
对脂质体进行TFF，然后用伊立替康进行远程加载，并且用含有6％蔗糖的PBS对加载伊立替康的脂质体进行另一个TFF循环。用于远程加载的盐酸多伊立替康浓度：1.0mg/mL(伊立替康游离碱浓度：0.94mg/mL)。
加载伊立替康的脂质体的颗粒大小呈现于表32中。
表32.加载伊立替康的脂质体的颗粒大小。
将随后的伊立替康加载的脂质体悬浮液进行5X TFF以主要除去游离(未包封的)伊立替康。为了测定T0(在MFD的一周内)的脂质体伊立替康浓度，在通过荧光分析定量前，通过添加Triton X-100至终浓度1％、通过倒置混合，并且温育5-10min来使TFF洗涤的脂质体破裂。伊立替康含量和回收百分率(脂质体悬浮液中的伊立替康含量相对于用于远程加载的伊立替康游离碱浓度)呈现于表33中。
表33.脂质体伊立替康含量。
在制造后一周内在37℃下进行脂质体伊立替康释放研究(表34)。对于每个样品，在2、4和8小时时间点测定伊立替康释放。
表34.在T0测定的伊立替康释放速率(在MFD后一周内)。
颗粒大小。从表31中可以看出，不同脂质体制剂的微流化导致相似的颗粒大小。对于制备的制剂中的任一种，伊立替康加载未导致颗粒大小的任何显著增加(表31-32)。
脂质体伊立替康含量。当使用硫酸盐作为抗衡离子时，观察到100％回收率(表33)。有趣的是，对于含有多柔比星的脂质体观察到类似的趋势(表9)。用PBS(pH 6.7)进行5x TFF后，脂质体伊立替康的～100％回收率强烈表明包封的伊立替康没有泄漏。
脂质体伊立替康释放速率。药物释放研究在MFD后一周内进行。由于伊立替康在中性pH下高度不稳定并且在中性介质中迅速转化为羧酸盐[26-27]，因此释放实验仅在pH 5下进行。从表34中可以看出，当使用草酸根或酒石酸根作为抗衡离子时，在pH 5下的伊立替康释放速率达到～100％并且在2-4小时时间点达到稳定水平。当使用柠檬酸根作为抗衡离子时，在酸性pH下的释放更温和并且在4-8小时处达到70％。具有硫酸盐和磷酸盐的制剂在pH 5下显示出非常低的释放(表34和图22)。总之，关于脂质体伊立替康含量及其在pH 5下的释放获得的数据表明当使用草酸根、酒石酸根或柠檬酸根作为抗衡离子实现到高ΔpH6.7/5.0释放差异。
有趣的是，来自含有硫酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐的脂质体的多柔比星或伊立替康的释放显示出对相应抗衡离子的pKa1值的依赖性(图15和16)。然而，来自含有草酸盐或酒石酸盐(在一些实施方案中优选的抗衡离子)的脂质体的多柔比星或伊立替康的释放与测试的抗衡离子的pKa1值不一致(图15和16)。这些数据强烈表明多柔比星-草酸盐和/或-酒石酸盐以及伊立替康-草酸盐和/或-酒石酸盐脂质体内聚集体的独特物理状态对多柔比星或伊立替康释放曲线的贡献，并且与含有多柔比星-草酸盐的脂质体的c_TEM分析一致。
总之，关于伊立替康脂质体获得的数据与对于多柔比星获得的结果非常一致，并且支持草酸根和酒石酸根抗衡离子在优选的脂质/药物比例下的效应。因此，在一些实施方案中，草酸根或酒石酸根抗衡离子可用于递送伊立替康。数据还表明在一些实施方案中使用柠檬酸根作为伊立替康的抗衡离子。
实施例12：米托蒽醌
方法。
来自脂质体制剂的米托蒽醌释放
在37℃下对于以下时间点进行研究：T0和T24小时。将单个样品在2种单独的稀释剂/溶出介质；PBS pH 6.7和PBS pH 5中稀释20倍(例如100μL样品+1.9mL稀释剂)以模拟到小鼠中的静脉内注射。对于T0时间点，在～25℃下将脂质体制剂在pH 6.7和pH 5的PBS缓冲液中稀释。
将其他脂质体样品在预热至37℃(以模拟体内温度)的pH 6.7和pH 5的PBS缓冲液中进行20X稀释，并且在37℃下温育0和T24小时。通过视觉观察评估在每个时间点米托蒽醌从脂质体中的释放：米托蒽醌的PBS/盐水溶液具有强烈的蓝色，并且在包封到脂质体中时变为紫色。米托蒽醌从脂质体中释放导致颜色从紫色变为蓝色。
颗粒大小测定
所有分析均使用具有4mW He-Ne激光器的Malvern Zetasizer Nano ZS进行，所述激光器在波长633nm和检测角为173°下操作。Zetasizer软件控制设备并且用于对值的分析和报告。
强度平均颗粒直径(Z-平均值)由ISO 13321(国际标准化组织1996)中定义的累积量分析计算。
使用30μL脂质体制剂在1.5mL磷酸盐缓冲盐水(pH 6.7)中制备样品，并且将所述样品在分析前平衡至25℃。对于每个样品，一式三份地进行大小测量。
pH测量
所有分析均使用具有Mettler Toledo InLab pH微电极的Mettler ToledoSevenCompact pH计进行。
粗悬浮液制备。
通过以表34中所指出的比例将PC、DMPC、FC和P188溶解在10mL的DCM中来制备粗悬浮液。将混合物在氮气流下干燥直至形成粘性膜。将膜在真空烘箱中进一步干燥过夜。第二天，将干燥的脂质膜用预热至65℃的300mM草酸铵缓冲液水合，并且立即用手持式均质器均化2-3min。测定粗悬浮液的颗粒大小并且其始终在800-1200nm的范围内。
MF处理
除非另有说明，否则MF处理体积始终为100ml。MF处理压力始终为10KPSI。在受控(≤65℃)温度下以循环模式(将材料返回到进料储器中)进行粗悬浮液的微流化。处理时间在9-12min范围内。目标颗粒大小为60-70nm(Z-平均值)。
切向流过滤
从微流化器收获半透明纳米悬浮液，并用15-20X体积的PBS pH6.7进行切向流过滤(TFF)。TFF的目的是由PBS替换外部缓冲液草酸铵并且主要从脂质体内和外部空间中去除铵。通过使用铵特异性电极测量外部缓冲液中的铵。当外部缓冲液中的铵浓度≤3mM时停止TFF。
米托蒽醌的远程加载
将盐酸米托蒽醌溶解在盐水中至终浓度为6mg/mL。将盐酸米托蒽醌的盐水溶液添加至在PBS pH 6.7中的脂质体纳米悬浮液至终浓度1mg/mL，在室温下温育30分钟，并且置于2-8℃下。在2-8℃下温育16小时后，使混合物用含有6％蔗糖的PBS pH 6.7进行另一个TFF 5X循环。该TFF循环的目的是去除游离(未包封的)米托蒽醌。
然后将脂质体纳米悬浮液通过0.22um过滤器无菌过滤到无菌Nalgene烧瓶中。测定颗粒大小和pH。将无菌纳米悬浮液无菌分配到2mL预先灭菌的小瓶中，塞住并密封。将小瓶储存在2-8℃下。
实施例13：米托蒽醌到固定(50:1)脂质/药物比例脂质体中的冷加载。
草酸盐展示出促进多柔比星和伊立替康加载到50:1脂质/药物比例脂质体中的能力。因此，在该实施例中使用草酸盐(表35)。
表35.制剂组成。
制备粗悬浮液并且将其在10KPSI处理压力下进行MF处理。在MF处理9-12min后，颗粒大小((Z-平均值)达到～60-70nm。收集样品并且无菌过滤到Nalgene烧瓶中。测定过滤的纳米悬浮液的颗粒大小(表36)。
表36.对MF处理和所得乳液参数的概述。
对脂质体进行TFF，然后用米托蒽醌进行远程加载，并且用PBS蔗糖进行另一个TFF循环。用于远程加载的盐酸米托蒽醌浓度：1.0mg/mL
加载米托蒽醌的脂质体的颗粒大小呈现于表37中。
表37.颗粒大小。加载米托蒽醌的脂质体。
在制造后一周内进行脂质体米托蒽醌释放研究。通过视觉观察评估在每个时间点(0和24小时)处米托蒽醌从脂质体中的释放。值得一提的是，与多柔比星和伊立替康相比，米托蒽醌从脂质体中的释放明显更慢。
由于米托蒽醌释放研究持续24小时，因此在T0和T24测定温育样品的颗粒大小，以证明脂质体的完整性没有受损。从表37中可以看出，在37℃下温育20倍稀释样品24小时后观察到的颗粒大小或聚集没有显著变化。
表38.释放研究期间的颗粒大小测量。
讨论
颗粒大小。从表36和37中可以看出，米托蒽醌的微流化和加载导致与多柔比星(表16和17)和伊立替康(表31和32)相当的相似颗粒大小。
脂质体米托蒽醌释放。药物释放研究在MFD后一周内进行。值得一提的是，米托蒽醌的PBS/盐水溶液具有强烈的蓝色，并且在包封到脂质体中时变为紫色。从图23A中可以看出，在T0处米托蒽醌的颜色在pH 6.7和5下均保持紫色，这指示包封的米托蒽醌。当使用草酸根作为抗衡离子时，样品的颜色在pH 5.0下24小时后变为蓝色，而在pH 6.7下保持紫色(图23B)。这些数据表明米托蒽醌在pH 5.0下从脂质体中释放，并且在pH 6.7下不存在释放。
因此，总体获得的数据证明了草酸根和酒石酸根抗衡离子、脂质/药物比例和药物加载条件对于至少在一些实施方案中导致最佳ΔpH 6.7/5.0释放差异的脂质体内多柔比星聚集体的优先物理状态的影响。所有这些因素可有助于将弱碱化学治疗剂高效地pH靶向递送至肿瘤部位。
实验发现的概述
在若干实施方案中，鉴定了可以与弱碱形成脂质体内药物盐聚集体的适当抗衡离子草酸根和酒石酸根(例如在一些实施方案中优选的抗衡离子)、适当的脂质/药物比例(例如在一些实施方案中优选范围20:1至65:1)和PL/FC比例(例如在一些实施方案中优选范围1/1至4/1)以最大化中性与酸性pH之间的药物释放差异并增加血清/血液中的脂质体稳定性，以便将弱碱化学治疗剂(针对各种分子靶标)最佳pH靶向递送至肿瘤部位。含有草酸盐或酒石酸盐的脂质体与其他测试的抗衡离子的体外特征之间的明显差异强烈表明了脂质体内多柔比星-草酸盐或-酒石酸盐聚集体的物理状态的独特性，其明显促进它们响应于温度和pH的溶出。
15种测试抗衡离子中仅5种(硫酸根、草酸根、磷酸根、酒石酸根和柠檬酸根)促进多柔比星的远程加载和稳定的含有多柔比星-盐的脂质体的形成。其他10种测试的抗衡离子未导致多柔比星加载到脂质体中并且在2-8℃过夜储存期间引起脂质体材料沉淀。
在若干实施方案中，令人惊讶地发现在37℃(体温)下，仅草酸盐和酒石酸盐产生具有所希望pH依赖性药物释放曲线(ΔpH 6.7/5.0或ΔpH 6.7/6.7/6.0/5.0释放差异)的含有多柔比星的脂质体。因此，在一些实施方案中，选择草酸根和酒石酸根作为优选的抗衡离子。
在两种癌细胞系(Daudi和Hela细胞)的情况下观察到含有多柔比星-草酸盐的脂质体与(多柔比星-硫酸盐)相比细胞毒性增加
在小鼠B淋巴瘤模型中观察到与(多柔比星-硫酸盐)相比，含有多柔比星-草酸盐的脂质体的安全性和功效得到改善；
在一些实施方案中，令人惊讶地发现含有草酸盐和酒石酸盐的脂质体可以在室温下有效且快速地包封多柔比星。还令人惊讶地发现，在一些实施方案中，与在70℃下加载的含有草酸盐和/或酒石酸盐的脂质体相比，多柔比星到含有草酸盐和酒石酸盐的脂质体中的室温(RT)加载进一步改善(最大化)ΔpH 6.7/5.0释放差异。可用于在含有草酸盐的脂质体中远程多柔比星加载的其他温度包括2-8℃至70℃，进行或不进行在2-8℃下的过夜温育。
在一些实施方案中，柠檬酸根是在冷加载多柔比星后显示出ΔpH 6.7/5.0释放差异的显著改善的另一种抗衡离子。相比之下，当使用硫酸根和/或磷酸根作为抗衡离子时，室温加载未导致多柔比星释放曲线的改善。可用于在含有酒石酸盐和草酸盐的脂质体中远程多柔比星加载的其他温度包括2-8℃至70℃，进行或不进行在2-8℃下的过夜温育。
在若干实施方案中，在乳糖和/或甘露醇存在下成功冻干多柔比星产生冻干物质，其在室温下易于在无菌注射水中重构，最终浓度至多为6mg/mL。在若干实施方案中，冻干且重构的多柔比星材料与含有新型草酸根和酒石酸根(在一些实施方案中优选的抗衡离子)的脂质体的混合导致多柔比星在室温下高效且快速地包封。在一些实施方案中，所得产物展示出优异的ΔpH 6.7/5.0或ΔpH 6.7/6.7/6.0/5.0释放差异。在若干实施方案中，该发现导致特定的产品呈现形式，其具有两个小瓶或由两个小瓶组成：具有冻干多柔比星的小瓶和具有脂质体媒介物悬浮液的小瓶。在室温下混合(通过简单的倒置)两个小瓶的重构内容物将在几分钟内产生最终的即用型产品-一种非常方便在床边制备的制剂。还考虑了冻干脂质体媒介物的开发。
在若干实施方案中，对于优选的抗衡离子草酸根和酒石酸根，证明了脂质/药物比例对于实现最大ΔpH 6.7/5.0或ΔpH 6.7/6.7/6.0/5.0释放差异和最佳血清/血液稳定性的影响。在若干实施方案中，还令人惊讶地发现当脂质比药物比例高于20(优选范围为20:1-65:1)时，脂质体表现出高ΔpH 6.7/5.0或ΔpH 6.7/6.7/6.0/5.0释放差异和增加的血清/血液稳定性。在若干实施方案中，当脂质/药物比例≤20时，多柔比星加载较差并且多柔比星从脂质体中的泄漏是明显的。可以使用的其他比例包括20:1至100:1。进行的研究表明，在一些实施方案中，用于实现最大pH释放差异的最佳脂质/药物比例在20:1至65:1的范围内。可以使用的其他比例包括10:1至100:1。在若干实施方案中，对于优选的抗衡离子草酸根，证明了特定范围的PL/FC比例(例如1/1至4/1)对最佳血清/血液稳定性和ΔpH 6.7/6.7/6.0/5.0释放差异的影响。
对于3种结构不同的弱碱癌症治疗剂，即多柔比星、伊立替康和米托蒽醌，证明了特定抗衡离子和优化的脂质/药物比例对实现pH区别性药物释放曲线的适用性。可以使用的其他比例包括20:1至100:1。
低温透射电子显微镜(cryo-TEM)导致以下重要发现：多柔比星-草酸盐聚集体看起来具有非结晶性质，并且当使用硫酸根、磷酸根或柠檬酸根作为抗衡离子时未观察到形成紧密堆积的束。该发现表明了与多柔比星-硫酸盐、磷酸盐和柠檬酸盐聚集体相比脂质体内多柔比星-草酸盐聚集体的独特物理状态，并且与观察到的药物释放曲线的差异非常一致。
在若干实施方案中，对于所有测试的抗衡离子，在25℃下观察到差的ΔpH 6.7/5.0释放差异，而在37℃下在草酸盐或酒石酸盐的情况下观察到ΔpH 6.7/5.0释放差异的显著增加，但是在硫酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐的情况下未观察到。观察到的在25℃和37℃下测定的ΔpH 6.7/5.0释放差异的差异也可能表明，至少在一些实施方案中与硫酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐相比多柔比星-草酸盐或-酒石酸盐脂质体内聚集体的物理状态的温度依赖性转变更急剧。
在若干实施方案中，与在没有P188情况下制备的脂质体制剂相比，向脂质体制剂中添加P188对颗粒大小、多柔比星包封效率和多柔比星释放曲线没有任何显著影响。然而，将P188用于脂质体制剂中，因为它在一些实施方案中可能对加载药物的脂质体的生物学性能产生有利影响[10-11,16-19]。
在若干实施方案中，与仅含有草酸盐或酒石酸盐的脂质体相比，用抗坏血酸(例如AA/草酸盐-1:8或1:3)和/或NAC(例如NAC/草酸盐-1:3)和/或抗坏血酸棕榈酸酯(例如AP/草酸盐-1:150或1:15)和/或CoQ10(例如CoQ10/草酸盐-1:300)和/或EDTA(例如EDTA/草酸盐1:150)补充优选的抗衡离子草酸根和/或酒石酸根未显示出对多柔比星释放曲线的相当大的负面影响。在若干实施方案中，该发现使得能够使用抗坏血酸和/或NAC和/或抗坏血酸棕榈酸酯和/或CoQ10和/或EDTA与草酸盐或酒石酸盐的组合。在若干实施方案中，柠檬酸盐可以任何比例与任何上面列出的螯合剂一起使用。在若干实施方案中，添加抗氧化剂和/或螯合剂可减轻脂质体加工过程中的氧化应激，并且因此可有利于最终产品的稳定性。此外，在若干实施方案中，优化的ΔpH 6.7/5.0释放差异和抗氧化剂和/或螯合剂的组合对于最终产品生物学性能可能是有利的。已经显示，抗坏血酸、NAC和EDTA发挥心脏保护作用，从而减轻多柔比星诱导的心脏毒性[28-29,33,36-37]。在若干实施方案中，可以使用的PA与草酸盐或酒石酸盐的其他比例包括1:300至1:10。可以使用的CoQ10与草酸盐或酒石酸盐的其他比例包括1:300至1:10。可以使用的EDTA与草酸盐或酒石酸盐的其他比例包括1:300至1:5。可以有利和/或与草酸盐和/或酒石酸盐组合使用的其他抗衡离子和/或抗氧化剂和/或螯合剂包括柠檬酸盐和/或植酸盐和/或谷胱甘肽和/或维生素e和/或右雷佐生和/或去铁胺。
在若干实施方案中，令人惊讶地发现结构不同的化学治疗剂伊立替康和米托蒽醌(表2)当在50:1脂质/药物比例(可以使用的其他比例包括20:1至100:1)下使用草酸根和/或酒石酸根作为抗衡离子时展示出与多柔比星类似的pH区别性释放曲线。值得一提的是，多柔比星、伊立替康和米托蒽醌是弱碱(表2)。因此，在若干实施方案中，化学治疗剂的碱性、适当的抗衡离子、最佳脂质/药物比例和加载条件可有助于pH区别性药物释放和弱碱化学治疗剂(表3)向肿瘤的高效递送。
在若干实施方案中，来自含有硫酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐的脂质体的多柔比星或伊立替康的释放显示出对相应抗衡离子的pKa1值的依赖性。然而，来自含有草酸盐或酒石酸盐(在一些实施方案中优选的抗衡离子)的脂质体的多柔比星或伊立替康的释放与测试的抗衡离子的pKa1值不一致。这些数据可以表明多柔比星-草酸盐和-酒石酸盐脂质体内聚集体的独特物理状态对多柔比星释放曲线的贡献，并且与含有多柔比星-草酸盐的脂质体的c_TEM分析一致。
实施方案
实施方案1
一种药物组合物，其包含脂质体，所述脂质体包围弱碱性抗癌化合物及其酸或盐，其中所述酸为草酸或酒石酸。
实施方案2
如实施方案1所述的药物组合物，其中所述弱碱性抗癌化合物是多柔比星、伊立替康、米托蒽醌或其组合。
实施方案3
如实施方案1或2所述的药物组合物，其中所述脂质体包含泊洛沙姆。
实施方案4
如实施方案3所述的药物组合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
实施方案5
如实施方案1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种脂质化合物，并且所述多种脂质与所述弱碱性抗癌剂的重量比为至少20/1。
实施方案6
如实施方案1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种脂质化合物，并且所述多种脂质与所述弱碱性抗癌剂的重量比为约20/1至约100/1。
实施方案7
如实施方案1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种脂质化合物，并且所述多种脂质与所述弱碱性抗癌剂的重量比为20/1至约50/1。
实施方案8
如实施方案1-7中任一项所述的药物组合物，其中所述弱碱性抗癌化合物基本上仅在酸性pH下从所述脂质体中释放。
实施方案9
如实施方案8所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 5下至少40％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放，并且在标准测定条件下、在pH 6.7下少于5％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案10
如实施方案8所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 5下至少80％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放，并且在标准测定条件下、在pH 6.7下少于5％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案11
如实施方案9所述的药物组合物，其中所述标准测定条件包括在pH 6.7或pH 5的PBS缓冲液中进行20X稀释，以及在25℃或37℃下温育2、4或8小时。
实施方案12
如实施方案1-11中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质体基本上是球形的。
实施方案13
如实施方案1-12中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含多个脂质体，所述多个脂质体具有由通过动态光散射测量的强度平均颗粒直径(Z-平均值)确定的约60-80nm的平均最长尺寸。
实施方案14
如实施方案1-12中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含多个脂质体，所述多个脂质体具有由通过动态光散射测量的基于数量的颗粒直径确定的约10-30nm的平均最长尺寸。
实施方案15
如实施方案1-12中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含多个脂质体，所述多个脂质体具有通过低温透射电子显微镜确定的10-30nm的平均最长尺寸。
实施方案16
如实施方案1-14中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质体包含约500-1000μg/mL的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。
实施方案17
如实施方案1-14中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质体包含约700-850μg/mL的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。
实施方案18
如实施方案1-17所述的药物组合物，其中所述脂质体包含形成紊乱型非结晶聚集体的多种所述弱碱性抗癌化合物。
实施方案19
如实施方案1-18中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种所述弱碱性抗癌化合物，并且当在标准储存条件下在2-8℃下储存40天后，保留所述多种弱碱性抗癌化合物的多于90％。
实施方案20
如实施方案1-2或4-19所述的药物组合物，其中所述脂质体不包含胆固醇或泊洛沙姆188。
实施方案21
如实施方案1所述的药物组合物，其中所述脂质体不包含除草酸、酒石酸或其盐之外的酸性有机化合物。
实施方案22
如实施方案1-21中任一项所述的药物组合物，其中所述加载药物的脂质体通过如下的方式形成：将所述弱碱性抗癌化合物加载到含有包封的酸或其盐的未加载的脂质体中，然后在室温下温育。
实施方案23
一种用于制备包围弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的脂质体的方法，其中所述酸为草酸或酒石酸，所述方法包括
将所述弱碱性抗癌化合物的溶液与包含所述含有包封的酸或其盐的脂质体的悬浮液混合；并且
将所述弱碱性抗癌化合物的溶液与包含所述含有包封的酸或其盐的脂质体的悬浮液一起温育。
实施方案24
如实施方案23所述的方法，其中用于与包含所述含有包封的酸或其盐的脂质体的悬浮液混合的所述弱碱性抗癌化合物的约85-100％保留在所述脂质体内。
实施方案25
如实施方案23所述的方法，其中用于与包含所述含有包封的酸或其盐的脂质体的悬浮液混合的所述弱碱性抗癌化合物的约95-100％保留在所述脂质体内。
实施方案26
如实施方案23-26中任一项所述的方法，其中所述温育步骤在室温下发生。
实施方案27
如实施方案25所述的方法，其中所述温育步骤为约10-30分钟。
实施方案28
如实施方案25所述的方法，其中所述温育步骤为约5-25分钟。
实施方案29
一种试剂盒，所述试剂盒包括第一小瓶和第二小瓶，所述第一小瓶包含弱碱性抗癌化合物，所述第二小瓶具有包含含有包封的酸或其盐的脂质体的悬浮液。
实施方案30
如实施方案29所述的试剂盒，其中所述第一小瓶的所述弱碱性抗癌化合物是冻干的弱碱性抗癌物。
实施方案31
如实施方案29所述的试剂盒，其中所述第二小瓶的所述脂质体悬浮液是含有包封的酸或其盐的脂质体的水性悬浮液。
实施方案32
一种使用如实施方案28-31中任一项所述的试剂盒的方法，所述方法包括将所述第一小瓶的内容物与所述第二小瓶的内容物混合。
实施方案33
如实施方案32所述的方法，其中所述混合是在室温下。
实施方案34
如实施方案23-25中任一项所述的方法，其中所述温育步骤在室温下发生，然后在2-8℃下温育。
实施方案35
如实施方案34所述的方法，其中在RT下的温育步骤为约10-30分钟。
实施方案36
如实施方案34中任一项所述的方法，其中在2-8℃下的温育步骤为约60-960分钟。
实施方案37
如实施方案23-35中任一项所述的方法，其中所述温育步骤在70℃下发生。
实施方案38
如实施方案37所述的方法，其中所述温育步骤为约10-30分钟。
实施方案39
一种用于制备包围弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的脂质体的方法，其中所述酸为柠檬酸，所述方法包括
将所述弱碱性抗癌化合物的溶液与包含所述含有包封的酸或其盐的脂质体的悬浮液混合；并且
将所述弱碱性抗癌化合物的溶液与包含所述含有包封的酸或其盐的脂质体的悬浮液一起温育。
实施方案40
一种药物组合物，其包含脂质体，所述脂质体包围弱碱性抗癌化合物及其酸或盐，其中所述酸为柠檬酸并且其中所述脂质体包含多种脂质化合物，并且所述多种脂质与所述弱碱性抗癌剂的重量比为至少20/1。
实施方案41
一种药物组合物，其包含脂质体，所述脂质体包围弱碱性抗癌化合物及其酸或盐，其中所述酸为草酸或酒石酸。
实施方案42
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述弱碱性抗癌化合物是多柔比星、伊立替康、米托蒽醌或其组合。
实施方案43
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体包含泊洛沙姆。
实施方案44
如实施方案43所述的药物组合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
实施方案45
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种脂质，并且所述脂质与所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的重量比为至少10/1。
实施方案46
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种脂质，并且所述脂质与所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的重量比为约10/1至约100/1。
实施方案47
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种脂质，并且所述脂质与所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的重量比为20/1至约50/1。
实施方案48
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种游离胆固醇。
实施方案49
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种磷脂。
实施方案50
如实施方案48所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含磷脂，并且所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比为至少0.5/1。
实施方案51
如实施方案48所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含磷脂，并且所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比为至少0.5/1至约4/1。
实施方案52
如实施方案48所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含磷脂，并且所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比在约0.86/1至约3.68/1的范围内。
实施方案53
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述弱碱性抗癌化合物基本上在pH<6.7下从所述脂质体中释放。
实施方案54
如实施方案41所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 5下至少40％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案55
如实施方案41所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下少于5％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案56
如实施方案41所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 5下至少80％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案57
如实施方案41所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在约pH 6.0下至少10％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案58
如实施方案41所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.0下至少50％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案59
如实施方案41所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下至少7％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案60
如实施方案41所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下至少30％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案61
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种弱碱性抗癌化合物，并且当在标准测定条件下测试时，在血清或血液中长达约8小时温育保留所述多种弱碱性抗癌化合物的多于35-50％。
实施方案62
如实施方案54-61中任一项所述的药物组合物，其中所述标准测定条件包括将所述脂质体在PBS缓冲液中进行20X或50X稀释。
实施方案63
如实施方案54-61中任一项所述的药物组合物，其中所述标准测定条件包括在pH6.7、pH 6.7、pH 6.0或pH 5.0下温育。
实施方案64
如实施方案54-61中任一项所述的药物组合物，其中所述标准测定条件包括在约25℃或约37℃下温育。
实施方案65
如实施方案14-21中任一项所述的药物组合物，其中所述标准测定条件包括温育约2、约4或约8小时。
实施方案66
如实施方案54-61中任一项所述的药物组合物，其中所述标准测定条件包括将所述脂质体在血清或血液中进行50X稀释，并且在生理pH(pH 6.7)下、在37℃下温育2、4或8小时。
实施方案67
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体基本上是球形的。
实施方案68
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含多个脂质体，所述多个脂质体具有由通过动态光散射测量的强度平均颗粒直径(Z-平均值)确定的约60-80nm的平均最长尺寸。
实施方案69
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含多个脂质体，所述多个脂质体具有由通过动态光散射测量的基于数量的颗粒直径确定的约10-30nm的平均最长尺寸。
实施方案70
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含多个脂质体，所述多个脂质体具有通过低温透射电子显微镜确定的10-30nm的平均最长尺寸。
实施方案71
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体包含约500-1000μg/mL的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。
实施方案72
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体包含约700-850μg/mL的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。
实施方案73
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体包含形成紊乱型非结晶聚集体的多种所述弱碱性抗癌化合物。
实施方案74
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种所述弱碱性抗癌化合物，并且当在标准储存条件下在2-8℃下储存40天后，保留所述多种弱碱性抗癌化合物的多于90％。
实施方案75
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体不包含胆固醇或泊洛沙姆188。
实施方案76
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体不包含除草酸、酒石酸或其盐之外的酸性有机化合物。
实施方案77
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述脂质体不包含所述弱碱性抗癌化合物及其除草酸、酒石酸或其盐之外的酸或盐。
实施方案78
如实施方案41所述的药物组合物，其中所述包围所述碱性抗癌化合物及其酸或盐的脂质体通过如下的方式形成：将所述弱碱性抗癌化合物加载到含有包封的酸或其盐的未加载的脂质体中，然后在室温下温育。
实施方案79
如实施方案38所述的药物组合物，其中在标准储存条件下在2-8℃下储存180和/或540天后的所述未加载的脂质体在加载时保留多于90％的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。
实施方案80
如实施方案39所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 5.0下约40-80％的所述加载的弱碱性抗癌化合物及其酸或盐从所述脂质体中释放。
实施方案81
如实施方案39所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.0下约20-60％的所述加载的弱碱性抗癌化合物及其酸或盐从所述脂质体中释放。
实施方案82
如实施方案39所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下约7-30％的所述加载的弱碱性抗癌化合物及其酸或盐从所述脂质体中释放。
实施方案83
如实施方案39所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下少于5％的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐从所述脂质体中释放。
实施方案84
如权利要求41所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含选自由以下组成的组的化合物：抗坏血酸(AA)或N-乙酰半胱氨酸(NAC)、抗坏血酸棕榈酸酯(AP)、泛醌(CoQ10)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
实施方案85
一种用于制备包围弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的脂质体的方法，其中所述酸为草酸或酒石酸，所述方法包括
将包含弱碱性抗癌化合物的溶液与包含多个脂质体的悬浮液混合，其中所述脂质体中的每一个包含草酸或酒石酸或其盐。
实施方案86
如实施方案85所述的方法，其中进一步包括将所述溶液和所述悬浮液温育。
实施方案87
如实施方案85所述的方法，其中在所述混合之后约85-100％的所述弱碱性抗癌化合物并入在所述多个脂质体内。
实施方案88
如实施方案85所述的方法，其中在所述混合之后约95-100％的所述弱碱性抗癌化合物并入在所述多个脂质体内。
实施方案89
如实施方案86所述的方法，其中所述温育步骤在室温(RT)下发生。
实施方案90
如实施方案89所述的方法，其中所述温育步骤为约10-30分钟。
实施方案91
如实施方案89所述的方法，其中所述温育步骤为约5-25分钟。
实施方案92
如实施方案85所述的方法，其中所述温育步骤在室温(RT)下发生，然后在2-8℃下温育。
实施方案93
如实施方案92所述的方法，其中在RT下的温育步骤为约10-30分钟。
实施方案94
如实施方案92所述的方法，其中在2-8℃下的温育步骤为约60-960分钟。
实施方案95
如实施方案86所述的方法，其中所述温育步骤在70℃下发生。
实施方案96
如实施方案95所述的方法，其中所述温育步骤为约10-30分钟。
实施方案97
一种试剂盒，所述试剂盒包括第一容器和第二容器，所述第一容器包含弱碱性抗癌化合物，所述第二容器包含悬浮液，所述悬浮液包含多个脂质体，其中所述多个脂质体中的每一个包含所述弱碱性抗癌化合物的酸或盐，其中所述酸为草酸或酒石酸。
实施方案98
如实施方案97所述的试剂盒，其中所述弱碱性抗癌化合物是冻干的弱碱性抗癌化合物。
实施方案99
如实施方案97所述的试剂盒，其中所述悬浮液是水性悬浮液。
实施方案100
一种使用如实施方案97所述的试剂盒的方法，所述方法包括将所述第一容器的内容物与所述第二容器的内容物混合。
实施方案101
如实施方案100所述的方法，其中所述混合是在室温下。
实施方案102
一种用于制备包含弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的脂质体的方法，其中所述酸为柠檬酸，所述方法包括
将包含所述弱碱性抗癌化合物的溶液与包含多个脂质体的悬浮液混合，其中所述多个脂质体中的每一个包含酸或其盐。
实施方案103
如实施方案102所述的方法，所述方法进一步包括将所述溶液与所述悬浮液一起温育。
实施方案104
如实施方案102所述的方法，其中所述温育步骤在室温(RT)下发生。
实施方案105
如实施方案104所述的方法，其中所述温育步骤为约10-30分钟。
实施方案106
如实施方案104所述的方法，其中所述温育步骤为约5-25分钟。
实施方案107
如实施方案103所述的方法，其中所述温育步骤在室温(RT)下发生，然后在2-8℃下温育。
实施方案108
如实施方案107所述的方法，其中在RT下的温育步骤为约10-30分钟。
实施方案109
如实施方案107所述的方法，其中在2-8℃下的温育步骤为约60-960分钟。
实施方案110
如实施方案103所述的方法，其中所述温育步骤在70℃下发生。
实施方案111
如实施方案110所述的方法，其中所述温育步骤为约10-30分钟。
实施方案112
一种药物组合物，其包含脂质体，所述脂质体包含弱碱性抗癌化合物及其酸或盐，其中所述酸为柠檬酸。
实施方案113
如实施方案112所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种脂质，并且所述多种脂质与所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的重量比为至少10比1。
实施方案114
如实施方案112所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种游离胆固醇。
实施方案115
如实施方案114所述的药物组合物，其中所述脂质体包含磷脂，其中所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比为至少1比1。
实施方案116
如实施方案112所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含选自由以下组成的组的化合物：抗坏血酸(AA)或N-乙酰半胱氨酸(NAC)、抗坏血酸棕榈酸酯(AP)、泛醌(CoQ10)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
实施方案117
一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
向需要治疗的受试者施用有效量的如实施方案40所述的药物组合物。
实施方案118
如实施方案117所述的方法，其中所述弱碱性抗癌化合物是多柔比星、伊立替康、米托蒽醌或其组合。
实施方案119
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体包含泊洛沙姆。
实施方案120
如实施方案117所述的方法，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
实施方案121
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体包含脂质，并且所述脂质与所述弱碱性抗癌化合物的重量比为至少10比1。
实施方案122
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体包含脂质，并且所述脂质与所述弱碱性抗癌化合物的重量比为约10比1至约100比1。
实施方案123
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体包含多种脂质，并且所述脂质与所述弱碱性抗癌化合物的重量比为约20比1至约50比1。
实施方案124
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体包含多种游离胆固醇。
实施方案125
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体包含多种磷脂。
实施方案126
如实施方案125所述的方法，其中所述脂质体包含磷脂，并且所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比为至少0.5比1。
实施方案127
如实施方案125所述的方法，其中所述脂质体包含磷脂，并且所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比为至少0.5比1至约4比1。
实施方案128
如实施方案125所述的方法，其中所述脂质体包含磷脂，并且所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比在约0.86比1至约3.68比1的范围内。
实施方案129
如实施方案117所述的方法，其中所述弱碱性抗癌化合物基本上在pH<6.7下从所述脂质体中释放。
实施方案130
如实施方案117所述的方法，其中在标准测定条件下、在pH 5下至少40％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案131
如实施方案117所述的方法，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下少于5％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案132
如实施方案117所述的方法，其中在标准测定条件下、在pH 5下至少80％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案132
如实施方案117所述的方法，其中在标准测定条件下、在约pH 6.0下至少10％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案134
如实施方案117所述的方法，其中在标准测定条件下、在pH 6.0下至少50％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案135
如实施方案117所述的方法，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下至少7％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案136
如实施方案117所述的方法，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下至少30％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
实施方案137
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体包含多种弱碱性抗癌化合物，并且当在标准测定条件下测试时，在血清或血液中长达约8小时温育保留所述多种弱碱性抗癌化合物的多于35-50％。
实施方案138
如实施方案130-137中任一项所述的方法，其中所述标准测定条件包括将所述脂质体在PBS缓冲液中进行20X或50X稀释。
实施方案139
如实施方案130-137中任一项所述的方法，其中所述标准测定条件包括在pH 6.7、pH 6.7、pH 6.0或pH 5.0下温育。
实施方案140
如实施方案130-137中任一项所述的方法，其中所述标准测定条件包括在约25℃或约37℃下温育。
实施方案141
如实施方案130-137中任一项所述的方法，其中所述标准测定条件包括温育约2、约4或约8小时。
实施方案142
如实施方案130-137中任一项所述的方法，其中所述标准测定条件包括将所述脂质体在血清或血液中进行50X稀释，并且在生理pH(pH 6.7)下、在37℃下温育2、4或8小时。
实施方案143
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体基本上是球形的。
实施方案144
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体包含约500-1000μg/mL的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。
实施方案145
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体包含约700-850μg/mL的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。
实施方案146
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体包含形成紊乱型非结晶聚集体的多种所述弱碱性抗癌化合物。
实施方案147
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体不包含胆固醇或泊洛沙姆188。
实施方案148
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体不包含除草酸、酒石酸或其盐之外的酸性有机化合物。
实施方案149
如实施方案117所述的方法，其中所述脂质体不包含所述弱碱性抗癌化合物及其除草酸、酒石酸或其盐之外的酸或盐。
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Claims (109)

1.一种药物组合物，其包含脂质体，所述脂质体包围弱碱性抗癌化合物及其酸或盐，其中所述酸为草酸或酒石酸。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述弱碱性抗癌化合物是多柔比星、伊立替康、米托蒽醌或其组合。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体包含泊洛沙姆。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种脂质并且所述脂质与所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的重量比为至少10比1。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种脂质并且所述脂质与所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的重量比为约10比1至约100比1。
7.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种脂质并且所述脂质与所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的重量比为20比1至约50比1。
8.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种游离胆固醇。
9.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种磷脂。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含磷脂并且所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比为至少0.5比1。
11.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含磷脂并且所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比为至少0.5比1至约4比1。
12.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含磷脂并且所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比在约0.86比1至约3.68比1的范围内。
13.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述弱碱性抗癌化合物基本上在pH<6.7下从所述脂质体中释放。
14.如权利要求1所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 5下至少40％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
15.如权利要求1所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下少于5％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
16.如权利要求1所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 5下至少80％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
17.如权利要求1所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在约pH 6.0下至少10％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
18.如权利要求1所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.0下至少50％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
19.如权利要求1所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下至少7％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
20.如权利要求1所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下至少30％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
21.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种弱碱性抗癌化合物，并且当在标准测定条件下测试时，在血清或血液中长达约8小时温育保留所述多种弱碱性抗癌化合物的多于35-50％。
22.如权利要求14-21中任一项所述的药物组合物，其中所述标准测定条件包括将所述脂质体在PBS缓冲液中进行20X或50X稀释。
23.如权利要求14-21中任一项所述的药物组合物，其中所述标准测定条件包括在pH6.7、pH 6.7、pH 6.0或pH 5.0下温育。
24.如权利要求14-21中任一项所述的药物组合物，其中所述标准测定条件包括在约25℃或约37℃下温育。
25.如权利要求14-21中任一项所述的药物组合物，其中所述标准测定条件包括温育约2、约4或约8小时。
26.如权利要求14-21中任一项所述的药物组合物，其中所述标准测定条件包括将所述脂质体在血清或血液中进行50X稀释并且在生理pH(pH 6.7)下、在37℃下温育2、4或8小时。
27.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体基本上是球形的。
28.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含多个脂质体，所述多个脂质体具有由通过动态光散射测量的强度平均颗粒直径(Z-平均值)确定的约60-80nm的平均最长尺寸。
29.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含多个脂质体，所述多个脂质体具有由通过动态光散射测量的基于数量的颗粒直径确定的约10-30nm的平均最长尺寸。
30.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含多个脂质体，所述多个脂质体具有通过低温透射电子显微镜确定的10-30nm的平均最长尺寸。
31.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体包含约500-1000μg/mL的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。
32.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体包含约700-850μg/mL的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。
33.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体包含形成紊乱型非结晶聚集体的多种所述弱碱性抗癌化合物。
34.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种所述弱碱性抗癌化合物，并且当在标准储存条件下在2-8℃下储存40天后，保留所述多种弱碱性抗癌化合物的多于90％。
35.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体不包含胆固醇或泊洛沙姆188。
36.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体不包含除草酸、酒石酸或其盐之外的酸性有机化合物。
37.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质体不包含所述弱碱性抗癌化合物及其除草酸、酒石酸或其盐之外的酸或盐。
38.如权利要求1所述的药物组合物，其中包围所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的所述脂质体通过如下的方式形成：将所述弱碱性抗癌化合物加载到含有包封的酸或其盐的未加载的脂质体中，然后在室温下温育。
39.如权利要求38所述的药物组合物，其中所述未加载的脂质体在标准储存条件下在2-8℃下储存180和/或540天后在加载时保留多于90％的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。
40.如权利要求39所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 5.0下约40-80％的所述加载的弱碱性抗癌化合物及其酸或盐从所述脂质体中释放。
41.如权利要求39所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.0下约20-60％的所述加载的弱碱性抗癌化合物及其酸或盐从所述脂质体中释放。
42.如权利要求39所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下约7-30％的所述加载的弱碱性抗癌化合物及其酸或盐从所述脂质体中释放。
43.如权利要求39所述的药物组合物，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下少于5％的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐从所述脂质体中释放。
44.如权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含选自由以下组成的组的化合物：抗坏血酸(AA)或N-乙酰半胱氨酸(NAC)、抗坏血酸棕榈酸酯(AP)、泛醌(CoQ10)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
45.一种用于制备包围弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的脂质体的方法，其中所述酸为草酸或酒石酸，所述方法包括
将包含弱碱性抗癌化合物的溶液与包含多个脂质体的悬浮液混合，其中所述脂质体中的每一个包含草酸或酒石酸或其盐。
46.如权利要求45所述的方法，其中进一步包括温育所述溶液和所述悬浮液。
47.如权利要求45所述的方法，其中在所述混合之后约85-100％的所述弱碱性抗癌化合物并入在所述多个脂质体内。
48.如权利要求45所述的方法，其中在所述混合之后约95-100％的所述弱碱性抗癌化合物掺入在所述多个脂质体内。
49.如权利要求46所述的方法，其中所述温育步骤在室温(RT)下发生。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述温育步骤为约10-30分钟。
51.如权利要求49所述的方法，其中所述温育步骤为约5-25分钟。
52.如权利要求46所述的方法，其中所述温育步骤在室温(RT)下发生，然后在2-8℃下温育。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述在RT下的温育步骤为约10-30分钟。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述在2-8℃下的温育步骤为约60-960分钟。
55.如权利要求46所述的方法，其中所述温育步骤在70℃下发生。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述温育步骤为约10-30分钟。
57.一种试剂盒，所述试剂盒包括第一容器和第二容器，所述第一容器包含弱碱性抗癌化合物，所述第二容器包含悬浮液，所述悬浮液包含多个脂质体，其中所述多个脂质体中的每一个包含所述弱碱性抗癌化合物的酸或盐，其中所述酸为草酸或酒石酸。
58.如权利要求57所述的试剂盒，其中所述弱碱性抗癌化合物是冻干的弱碱性抗癌化合物。
59.如权利要求57所述的试剂盒，其中所述悬浮液是水性悬浮液。
60.一种使用如权利要求57所述的试剂盒的方法，所述方法包括将所述第一容器的内容物与所述第二容器的内容物混合。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述混合在室温下进行。
62.一种用于制备包含弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的脂质体的方法，其中所述酸为柠檬酸，所述方法包括
将包含所述弱碱性抗癌化合物的溶液与包含多个脂质体的悬浮液混合，其中所述多个脂质体中的每一个包含酸或其盐。
63.如权利要求62所述的方法，所述方法进一步包括将所述溶液与所述悬浮液一起温育。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述温育步骤在室温(RT)下发生。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述温育步骤为约10-30分钟。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述温育步骤为约5-25分钟。
67.如权利要求63所述的方法，其中所述温育步骤在室温(RT)下发生，然后在2-8℃下温育。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述在RT下的温育步骤为约10-30分钟。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述在2-8℃下的温育步骤为约60-960分钟。
70.如权利要求63所述的方法，其中所述温育步骤在70℃下发生。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述温育步骤为约10-30分钟。
72.一种药物组合物，其包含脂质体，所述脂质体包含弱碱性抗癌化合物及其酸或盐，其中所述酸为柠檬酸。
73.如权利要求72所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种脂质，并且所述多种脂质与所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐的重量比为至少10比1。
74.如权利要求72所述的药物组合物，其中所述脂质体包含多种游离胆固醇。
75.如权利要求74所述的药物组合物，其中所述脂质体包含磷脂，其中所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比为至少1比1。
76.如权利要求72所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含选自由以下组成的组的化合物：抗坏血酸(AA)或N-乙酰半胱氨酸(NAC)、抗坏血酸棕榈酸酯(AP)、泛醌(CoQ10)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
77.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
向需要所述治疗的所述受试者施用有效量的如权利要求1所述的药物组合物。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述弱碱性抗癌化合物是多柔比星、伊立替康、米托蒽醌或其组合。
79.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体包含泊洛沙姆。
80.如权利要求77所述的方法，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
81.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体包含脂质，并且所述脂质与所述弱碱性抗癌化合物的重量比为至少10比1。
82.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体包含脂质，并且所述脂质与所述弱碱性抗癌化合物的重量比为约10比1至约100比1。
83.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体包含多种脂质，并且所述脂质与所述弱碱性抗癌化合物的重量比为约20比1至约50比1。
84.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体包含多种游离胆固醇。
85.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体包含多种磷脂。
86.如权利要求84所述的方法，其中所述脂质体包含磷脂，并且所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比为至少0.5比1。
87.如权利要求84所述的方法，其中所述脂质体包含磷脂，并且所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比为至少0.5比1至约4比1。
88.如权利要求84所述的方法，其中所述脂质体包含磷脂，并且所述磷脂与所述游离胆固醇的摩尔比在约0.86比1至约3.68比1的范围内。
89.如权利要求77所述的方法，其中所述弱碱性抗癌化合物基本上在pH<6.7下从所述脂质体中释放。
90.如权利要求77所述的方法，其中在标准测定条件下、在pH 5下至少40％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
91.如权利要求77所述的方法，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下少于5％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
92.如权利要求77所述的方法，其中在标准测定条件下、在pH 5下至少80％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
93.如权利要求77所述的方法，其中在标准测定条件下、在约pH 6.0下至少10％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
94.如权利要求77所述的方法，其中在标准测定条件下、在pH 6.0下至少50％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
95.如权利要求77所述的方法，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下至少7％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
96.如权利要求77所述的方法，其中在标准测定条件下、在pH 6.7下至少30％的所述弱碱性抗癌化合物从所述脂质体中释放。
97.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体包含多种弱碱性抗癌化合物，并且当在标准测定条件下测试时，在血清或血液中长达约8小时温育保留所述多种弱碱性抗癌化合物的多于35-50％。
98.如权利要求90-97中任一项所述的方法，其中所述标准测定条件包括将所述脂质体在PBS缓冲液中进行20X或50X稀释。
99.如权利要求90-97中任一项所述的方法，其中所述标准测定条件包括在pH 6.7、pH6.7、pH 6.0或pH 5.0下温育。
100.如权利要求90-97中任一项所述的方法，其中所述标准测定条件包括在约25℃或约37℃下温育。
101.如权利要求90-97中任一项所述的方法，其中所述标准测定条件包括温育约2、约4或约8小时。
102.如权利要求90-97中任一项所述的方法，其中所述标准测定条件包括将所述脂质体在血清或血液中进行50X稀释并且在生理pH (pH 6.7)下、在37℃下温育2、4或8小时。
103.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体基本上是球形的。
104.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体包含约500-1000μg/mL的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。
105.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体包含约700-850μg/mL的所述弱碱性抗癌化合物及其酸或盐。
106.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体包含形成紊乱型非结晶聚集体的多种所述弱碱性抗癌化合物。
107.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体不包含胆固醇或泊洛沙姆188。
108.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体不包含除草酸、酒石酸或其盐之外的酸性有机化合物。
109.如权利要求77所述的方法，其中所述脂质体不包含所述弱碱性抗癌化合物及其除草酸、酒石酸或其盐之外的酸或盐。
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