JP2020193198A

JP2020193198A - ダイダイの地上部の発酵抽出物

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Publication number: JP2020193198A
Application number: JP2020091161A
Authority: JP
Inventors: デイビッドレガンニュクス; Legangneux David; アリックストリビオ; Toribio Alix; フランソワルジューヌ; Lejeune Francois; エマニュエルボーイソー−カディオ; Emmanuelle Bouissou-Cadio; ガエルゲンドロニュー; Gaelle Gendronneau
Original assignee: Chanel Parfums Beaute SAS
Current assignee: Chanel Parfums Beaute SAS
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2020-12-03
Anticipated expiration: 2040-05-26
Also published as: KR102440849B1; EP3744339B1; CN112006951A; EP3744339A1; JP7174736B2; US11331264B2; KR20200136843A; US20200375883A1

Abstract

【課題】皮膚の老化および一般的な酸化ストレスの有害な影響に効果的に対抗することができる植物抽出物、それを得る方法、それを含有する化粧用または皮膚科用組成物の提供。【解決手段】キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部の抽出物をサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）種に属する酵母で発酵させるステップを含む方法によって入手可能な、キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部の発酵抽出物。【選択図】図２

Description

本発明は、ダイダイ（キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium））の地上部の発酵抽出物、それを得る方法、それを含有する化粧用または皮膚科用組成物、および様々な化粧品用途に関する。

皮膚は主に３種の層、すなわち、最表面から順に表皮、真皮、および下皮で構成されている。

表皮は、詳細には、ケラチノサイト（大部分）、メラノサイト（皮膚色素沈着に関与）、およびランゲルハンス細胞で構成されている。その機能は、外部環境から身体を保護し、その完全性を確保し、特に、微生物または化学物質の浸透を遅らせ、皮膚に含有される水分の蒸発を阻止することである。

このために、ケラチノサイトは、持続的な定方向の成熟過程を経るが、その間、表皮の基底層に位置するケラチノサイトは、その分化の最終段階で、タンパク質およびセラミドなどの脂質からなる角化膜の形態で完全に角質化した死細胞である角質細胞を形成する。この分化過程中、角質細胞間表皮脂質がさらに形成され、次いで、角質層において二重層（シート）の形態で組織化される。それらは、前述の角化膜と共に表皮のバリア機能に関与する。

皮膚は老化すると、薄くなり、ボリュームおよび弾力性を失い、そのバリア機能が損なわれる。

フリーラジカルの生成は、皮膚の老化を加速させる主な要因の１つである。この生成は主に、紫外線、汚染、および気候変動に晒された結果である。それは、酸化ストレスをまねき、タンパク質、脂肪酸などの身体のいくつかの構成要素だけでなく、細胞のＤＮＡの分解の原因にもなる。

これらのフリーラジカルは、抗酸化剤の作用によって中和することができる。皮膚の老化に対抗する既知の方法の１つは、そのような抗酸化剤を含有する化粧品組成物を皮膚に適用することである。

合成成分をできる限りほとんど含有しない天然物を求める消費者の意欲がますます高まっているため、かつ化学工業からの化合物に対する規制上の制約がますます厳しくなっていることを考慮して、現在、植物抽出物からの抗酸化剤が好まれている。

皮膚の老化および一般的な酸化ストレスの有害な影響に効果的に対抗することができる植物由来の新規な抗酸化分子が真に必要とされている。

今回、本出願人は、ダイダイ（キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium））の地上部の抽出物が著しい抗酸化能力を有することを実証した。この抽出物の特殊性は、それが発酵抽出物、すなわち、発酵ステップを含む抽出方法によって得られる抽出物であるということである。本出願で実証するように、そのような抽出物は、酸化ストレス応答経路、特に核因子エリスロイド−２−関連因子２（ＮＲＦ２）経路を活性化することによって細胞内のフリーラジカルの含有量を低減する。

したがって、第１の態様では、本発明は、キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部の発酵抽出物に関する。

そのような抽出物は、キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部の抽出物をサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）種の酵母で発酵させるステップを含む抽出方法によって入手可能である。

したがって、本発明はまた、キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部の抽出物をサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）種に属する酵母で発酵させるステップを含む方法によって入手可能な、キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部の発酵抽出物に関する。

本発明の別の一態様は、生理学的に許容される媒体中に前述のキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の少なくとも１種の発酵抽出物を含む化粧用および／または皮膚科用組成物に関する。

最後に、本発明はまた、皮膚の老化を防止／低減するための前述の抽出物の使用に関するが、酸化ストレスを阻止／低減するためおよび／または皮膚を解毒するための抗酸化活性剤としてのその使用にも関する。

第１の態様によれば、本発明は、発酵させたキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部の抽出物に関する。この抽出物は、キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の抽出物をサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）種に属する酵母で発酵させるステップを含む方法によって入手可能である。

「ダイダイ」または「ビガラディア（Bigaradia）」として一般に知られているキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）は、ミカン（Rutaceae）科の木本植物である。それは、高さ３〜１０メートルの、棘のある常緑樹で、香りのよい花および食用の果実を有する。本発明による抽出物は、キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部から得られる抽出物、すなわち、花、葉、果実、もしくは小枝から、またはそれらの混合物から得られる抽出物である。好ましい一実施形態では、その抽出物は、「オレンジブロッサム」とも呼ばれるキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の花からの抽出物である。

用語「発酵」抽出物は、ここでは、発酵ステップを経た抽出物を指すのに使用される。本発明の文脈において、この発酵ステップは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）種に属する酵母を用いて行われる。

サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）種の酵母は、周知であり、食品産業、特に製パンの分野において、または例えばブドウ酒研究の分野でのアルコール飲料の発酵のために特に使用される。本発明を実施するそのような酵母をどのように得るかは当業者には公知である。

特定の一実施形態では、前記酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の変種バヤヌス（bayanus）に属する。この実施形態によれば、酵母は、ＩＯＣＦｉｚｚ＋、ＩＯＣＤｉｖｉｎｅ、ＩＯＣ１８−２００７として市販されている酵母菌株またはそれらの混合物から選択することができる。これらの菌株はすべて、フランス・ブドウ・ワイン研究所（Institut Francais de la Vigne et du Vin [French Insitute in Vine and Wine]）によってリスト化されており、当業者は容易に入手可能である。

酵母菌株ＩＯＣＦｉｚｚ＋は、番号ＬＹＣＣ６０２２：ＬＡＣＬＡＩＲＥＣＧＣ６２およびＬＹＣＣ６０３９：ＬＡＣＬＡＩＲＥＳＰ６６５としてパスツール研究所に寄託された２種の酵母の混合物である。

ＩＯＣＤｉｖｉｎｅ菌株は、番号ＬＹＣＣ７０００としてパスツール研究所に寄託された菌株に対応し、菌株１８−２００７は、番号ＣＮＣＭＩ−５３２０としてパスツール研究所に寄託された菌株に対応する。

本発明の文脈において使用する酵母菌株は、乾燥形態でも、液体形態でも、または酵母クリーム形態でもよい。

特定の一実施形態では、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）菌株は乾燥形態である。

典型的には、発酵ステップは、発酵させる溶液に対して１〜５質量％、具体的には発酵させる溶液に対して２〜３質量％、より具体的には発酵させる溶液に対して２質量％のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）菌株を使用して行う。

特定の一実施形態では、発酵ステップは、発酵練り粉（leaven）を用いて行うことができる。この発酵練り粉は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）菌株で発酵させた濃縮キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）抽出物から調製する。発酵練り粉に使用する抽出物は、典型的には、乾物含量が５〜３０％になるまで濃縮する。

この実施形態によれば、発酵ステップは、この発酵練り粉をキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）抽出物に添加することによって行う。発酵練り粉を使用すると発酵が始まり、それにより、発酵ステップの速度が向上する。

典型的には、発酵練り粉は、水中において、乾物率５〜５０％、具体的には１５〜３０％に濃縮したキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）抽出物を、１０重量％のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）乾燥酵母を用いて、室温（あるいは３７℃）で約２時間発酵させることによって調製する。発酵ステップでは、１〜５重量％のこの発酵練り粉、優先的には２重量％の発酵練り粉をキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）抽出物に添加する。

本発明による発酵抽出物を得るために使用するキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）抽出物は、当業者に公知の任意の抽出方法によって得ることができる。

典型的には、植物抽出物を調製する方法は、
ａ）少なくとも１種のアルコール溶媒および／または水を用いて植物（この場合はキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部）を抽出するステップと；
ｂ）ａ）で得られた混合物を、例えばふるい分けによってろ過して、植物残渣を除去するステップと；
ｃ）任意選択で、ステップｂ）で得られた混合物を脱色するステップと；
ｄ）溶媒を除去し、抽出物を濃縮するステップと
を含む。

本発明によるキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の発酵抽出物を得るために、上記ステップａ）〜ｄ）の後にステップｅ）を通常追加するが、このステップｅ）は、ステップｄ）から得られた抽出物をサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）種に属する酵母で発酵させるステップを含む。

ステップａ）はさらに、植物、典型的にはその花および／または葉を破砕して、５ｃｍ未満、好ましくは２ｃｍ未満の粒子サイズを得ることを含んでよい。

抽出ステップは、アルコール溶媒および／または水からなる少なくとも１種の抽出溶媒で行う。典型的な植物と溶媒の比は、１対１０（重量／重量）である。

特定の一実施形態では、アルコール溶媒は９６度エタノールである。

抽出溶媒は、０〜１００体積％の水および０〜１００体積％のアルコール溶媒を含有してよい。特定の一実施形態では、抽出溶媒は１００％の水を含み、別の一実施形態では、抽出溶媒は１００％のエタノールを含む。抽出溶媒はまた、５０体積％の水および５０体積％のエタノールを含んでもよい。

特定の一実施形態では、水は脱イオン水でよい。本発明では、抽出溶媒は典型的には、脱イオン水である。

抽出ステップは、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、特に少なくとも３時間続き、１回または２回繰り返すことができる。

前述のように、抽出方法は、ステップｂ）からの混合物を脱色するステップを含んでよい。このステップの目的は、クロロフィルおよびキサントフィルなど、抽出物に存在する色素を除去することである。当業者は、これらの色素を除去するいくつかの方法に精通している。脱色は、例えば、混合物を活性炭と接触させることによって行うことができる。脱色後、混合物をろ過して、炭素残渣を除去する。

典型的には、ステップｄ）は、抽出物を、５〜３０％、好ましくは１５％〜３０％の範囲の乾物対水比に濃縮することを含む。

この濃縮ステップは、典型的には、抽出溶媒（アルコール溶媒および／または水）の蒸発によって行う。この抽出は、例えば、真空下で行うことができる。

ステップｄ）からのキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）抽出物、すなわち、濃縮キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）抽出物は、前述の発酵練り粉の調製に使用することができる。

前述の方法は、ステップｄ）とｅ）の間にステップｄ’）をさらに含むことができ、ステップｄ’）では、濃縮抽出物を含有する混合物を細かくろ過（典型的には２μｍ、さらには０．２μｍ）して、細かな粒子および残留細菌を除去する。

前記方法はさらに、発酵抽出物をろ過し、次いで、希釈して、１〜１５重量％の乾物、特に約１０重量％の乾物を含有する抽出物を得る、ステップｆ）を含むことができる。この抽出物は、透明で安定な水溶液の形態であり得る。

特定の一実施形態では、本発明によるキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の発酵抽出物を得る方法は、
ａ）２ｃｍ未満の細かさに粉砕したオレンジブロッサム粉末を、７５℃で脱イオン水で２回、最低２時間抽出するステップであって、植物／溶媒の比が１対１０（重量／重量）である、ステップと；
ｂ）混合物を４μｍまでろ過するステップと；
ｃ）得られた混合物を活性炭と１時間接触させることによって脱色し、次いで、１μｍまで精密ろ過して、炭素残渣を除去するステップと；
ｄ）抽出物を、乾物含量が１５％（重量／重量）近くに達するまで、水の一部を真空蒸発で除去することによって濃縮するステップと；
ｄ’）混合物を０．２μｍでろ過するステップと；
ｅ）混合物を２重量％の発酵練り粉と共に３７℃で２４〜４８時間発酵させるステップであって、前記発酵練り粉が、ステップｄ）の前で得られた抽出物の一部を水中において３０％乾物になるまで濃縮し、３７℃で２時間の第１の発酵で１０重量％の乾燥サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母を添加することによって得られるステップと；
ｆ）次いで、発酵抽出物を１μｍでろ過し、その後、希釈して、１〜１０重量％の乾物を含有する抽出物を得、保存性を向上させるためにこれに０．７％のフェノキシエタノールまたは２０％の１，３−プロパンジオール（１０％乾物／７０％水、重量／重量比）を添加するステップと
を含む。

本発明による発酵抽出物は、著しい抗酸化特性を有する。以下の実施例に示すように（特に実施例２および３を参照）、ケラチノサイトなどの皮膚細胞の酸化ストレスを著しく低減する。特に、これは、酸化ストレスに対する応答経路として既知の核因子エリスロイド−２−関連因子２（ＮＲＦ２）経路を活性化する。ＮＲＦ２は、抗酸化剤応答要素（ＡＲＥ）として既知の調節配列に結合することにより、抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現を可能にする転写因子である。したがって、この経路の活性化は、抗酸化剤の作用により組織のフリーラジカル含有量を低減する効果を有する。

上で説明したように、フリーラジカルの生成、およびこの生成が生じる酸化ストレスは、皮膚の老化を加速させる主要な要因の１つである。フリーラジカルの低減、それによる酸化ストレスの低減は、しわおよび小じわなどの皮膚老化の兆候、表皮および／もしくは真皮の組織損失によるハリおよび弾力性の喪失；表皮における微小循環の低下および細胞再生の減速による輝きの喪失、メラニン合成における機能不全に関連した色素沈着斑の出現、または角質層のバリア機能の低下および表皮再生の減速から生じる皮膚乾燥に対抗するものである。

したがって、別の一態様によれば、本発明は、皮膚の老化を防止／低減するためのキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部の発酵抽出物の使用に関する。

本発明はまた、抗酸化活性剤としての、および／または酸化ストレスを阻止／低減するための、および／または皮膚を解毒するための、キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部の発酵抽出物の使用に関する。

「抗酸化」活性剤は、抗フリーラジカル特性、すなわち、フリーラジカルを中和する能力、特に、これらのフリーラジカルと関係がある酸化反応を中和する能力を有する化合物である。この中和により、組織中のフリーラジカルの含有量が低減する。

「酸化ストレス」は、組織中の過剰な量のフリーラジカルと抗酸化剤との間の平衡異常である。したがって、抗酸化活性剤の供給によるフリーラジカルの中和は、この酸化ストレスの低減に役立つ。以下の実施例３は、酸化ストレス、詳細には、この酸化ストレスに対する抗酸化活性剤の効果を測定する方法を示す。

皮膚中のフリーラジカルおよび酸化ストレスの低減は、皮膚の「解毒」、すなわち、「解毒」効果の獲得に役立つ。用語「解毒」は、フリーラジカルの皮膚への有害な影響に対抗する効果を意味する。

本発明による抽出物は、有利なことに、化粧用または皮膚科用組成物に組み込むことができる。したがって、別の一態様によれば、本発明は、化粧品上または薬学的に許容されるビヒクル中に、本発明によるキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の一部のアルコール抽出物を含む化粧用または皮膚科用組成物に関する。

好ましくは、前記抽出物は、組成物の総重量に対して０．００１〜１０重量％の割合、特に組成物の総重量に対して０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％の割合で化粧用または皮膚科用組成物中に存在する。前記化粧用または皮膚科用組成物は、局所適用に特に適する場合がある。

有利には、前記化粧用または皮膚科用組成物は、粉末、エマルション、マイクロエマルション、ナノエマルション、懸濁液、溶液、ローション、クリーム、水性もしくは水アルコール性ゲル、フォーム、セラム、エアロゾルの溶液もしくは分散液、または脂質小胞の分散液の形態であってもよい。

エマルションの場合、それは油中水型エマルションでも水中油型エマルションでもよい。

本発明による化粧用または皮膚科用組成物はまた、様々な成分および投与形態に従って選択される溶媒を含んでもよい。

例としては、水（好ましくは脱塩水）、エタノールなどのアルコール、エトキシジグリコールまたはジエチレングリコールモノメチルエーテルなどのジエチレングリコールエーテルが挙げられる。

前記化粧用組成物はまた、本発明による抽出物に加えて、当分野で普通の少なくとも１種の添加物、例えば、皮膚軟化剤または湿潤剤、ゲル化剤および／または増粘剤、界面活性剤、油、活性剤、染料、防腐剤、抗酸化剤、活性剤、有機または無機粉末、日焼け止め剤、および香料から選択される１種の化合物を含んでよい。

特に、前記組成物は、次のものを含有してよい：

− 例えば、グリセリン、グリコール、水溶性シリコーン、例えば名称ＫＦ６０１１（信越化学工業株式会社）で販売されている水溶性シリコーンなど、および水溶性ホホバ、例えば名称ＲｅｓｐｌａｎｔａＪｏｊｏｂａ（ＲｅｓＰｈａｒｍａ）で販売されている水溶性ホホバなどから選択することができる１種または複数の皮膚軟化剤または湿潤剤。

前記皮膚軟化剤または湿潤剤は、組成物の総重量に対して０〜３０重量％、好ましくは２〜１０重量％の範囲の含有量で組成物中に存在することができる。

− 例えば、セルロース誘導体、植物由来のガム（グアー、ローカストビーン、アルギン酸塩、カラゲナン、ペクチン）、微生物由来のガム（キサンタン）、粘土（ラポナイト）、ＩＮＣＩ名「アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ｖｐコポリマー」および「アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／メタクリル酸ベヘネス−２５コポリマー」で識別される材料（Ｃｌａｒｉａｎｔから名称ＡｒｉｓｔｏｆｌｅｘＡＶＣおよびＨＭＢで販売されているものなど）から選択される、水相用の１種または複数のゲル化剤および／または増粘剤。

前記ゲル化剤および／または増粘剤は、組成物の総重量に対して０〜１０重量％の範囲の含有量で組成物中に存在することができる。

− 組成物の総重量に対して０〜８重量％、好ましくは０．５〜３重量％の範囲の含有量で存在する１種または複数の界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤。

− 好ましくは組成物の総重量に対して０〜約１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％の量の、油、揮発性または不揮発性の炭化水素またはシリコーン、直鎖状、環状、または分岐状の、例えば、イソドデカン、シクロペンタジメチルシロキサン、ジメチコン、イソノナン酸イソノニル、またはテトライソステアリン酸ペンタエリスリチルとして一般に既知の１種または複数の室温で液体の脂肪。

− 例えば、ビタミン、微量元素、アラントイン、植物タンパク質、植物抽出物、保湿剤、老化防止剤、抗酸化剤、光沢増強剤、およびそれらの混合物から選択される、生物活性を有する、天然または合成由来の１種または複数の活性剤。特に、活性剤は、バニラ・プラニフォリア（Vanilla planifolia）果実水、ナイアシンアミド、ヒアルロン酸およびその誘導体、酵母抽出物、ならびにそれらの混合物から選択される。

− 好ましくは組成物の総重量に対して０〜約２重量％の量の、例えば、ポンソー二ナトリウム塩、アリザリングリーン二ナトリウム塩、キノリンイエロー、アマランサス三ナトリウム塩、タルトラジン二ナトリウム塩、ローダミン一ナトリウム塩、フクシンまたはキサントフィル二ナトリウム塩などの、１種または複数の水溶性染料。

化粧品中で一般に使用される他の添加物、例えば、当技術分野で周知の防腐剤、抗酸化剤、または香料なども本発明による組成物中に存在してよい。

当業者は、これらすべての可能な添加物の中から、組成物がすべての特性を保持するように、組成物に添加されるものの性質と量の両方を選択することができる。

次に、本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。

本発明によるダイダイ抽出物によってケラチノサイトで調節される様々な生物学的経路を示す図である。本発明によるダイダイ抽出物で処理した後のケラチノサイトにおける酸化ストレスの低減を示す図である。

[実施例１]
本発明によるダイダイを抽出する方法：
１）乾燥させたオレンジブロッサムの花を２ｃｍ未満の細かさに破砕する；
２）次いで、オレンジブロッサム粉末を７５℃で脱イオン水で２回、最低２時間抽出し、植物／溶媒の比は１対１０（重量／重量）である；
３）混合物を１００ｐｍでふるいにかけて、植物残渣を除去し、次いで一晩静置し、再び４μｍまでろ過する；
４）得られた混合物を活性炭と１時間接触させることによって脱色して、クロロフィルおよびキサントフィルなどの色素を除去する；
５）脱色した混合物を、精密ろ過（１μｍまで）によって炭素残渣と分離する；
６）抽出物を、乾物含量が１５％（重量／重量）近くに達するまで、水の一部を真空蒸発で除去することによって濃縮する；
７）混合物を０．２μｍでろ過して、細かな粒子および残留細菌を除去する；
８）抽出物の発酵用発酵練り粉を調製するために、ステップ６）の前で得られた抽出物の一部を水中において３０％乾物になるまで濃縮し、次いで、１０重量％の乾燥酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の変種バヤヌス（bayanus）を添加する。混合物を室温で２時間撹拌する。この混合物が発酵練り粉を構成する。
９）２重量％の発酵練り粉をステップ６）からの混合物に添加する；
１０）撹拌しながら暗所において室温で２４〜４８時間発酵させた後、発酵抽出物を一晩静置して、生じた気泡を除去する；
１１）次いで、発酵抽出物を１μｍでろ過し、その後、希釈して、１０％の乾物を含有する抽出物を得、保存性を向上させるために０．７％のフェノキシエタノールまたは２０％の１，３−プロパンジオール（１０％乾物／７０％水、重量／重量比）を添加し、全体を０．２μｍでろ過する。

オレンジブロッサム抽出物の含有量を以下の表１に示す。

上で説明したように、本発明による方法は、オレンジブロッサム抽出物から単糖を完全に除去する。本発明による方法はまた、抽出物のポリフェノール含有量を増加させる。

[実施例２]
本発明によるダイダイ抽出物で処理された正常なヒトケラチノサイトにおける酸化ストレス応答経路の活性化

プロトコル：
３人の異なるドナー（１９〜３０歳）からの正常なヒト表皮ケラチノサイトを２４ウェルプレートに接種し、ＳＦＭ補足ケラチノサイト培地において３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間培養した。次いで、細胞を０．４％のダイダイ抽出物と一緒に２４時間インキュベートし、またはインキュベートしなかった（対照）。条件はｎ＝２で行った。インキュベーションの終わりに、培養上清を除去し、細胞単層をＰＢＳですすいだ。全ＲＮＡを、供給元の推奨に従ってＴｒｉｐｕｒｅ（登録商標）単離試薬を使用して抽出した。ＲＮＡの量および質をキャピラリー電気泳動（２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ）によって評価した。相補的ＤＮＡを合成し、トランスクリプトームをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐＨｕｍａｎＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＡｒｒａｙ２．０で生成した。発現が少なくとも２倍に調節されている遺伝子のバイオインフォマティクス分析を、ＩｎｇｅｎｕｉｔｙＰａｔｈｗａｙＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＩＰＡ（登録商標）、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。このソフトウェアは、ＩｎｇｅｎｕｉｔｙＫｎｏｗｌｅｄｇｅデータベース内の分子間相互作用、生物学的ネットワーク、および標準経路に関する情報を収集する。

結果：
ダイダイ抽出物によって調節された生物学的経路を図１に示す。ケラチノサイトにおいてダイダイ抽出物が活性化する主要な細胞機能は、３１の遺伝子が関与する酸化ストレスへの応答のＮＲＦ２経路である。この生物学的経路で過剰発現している遺伝子のリストを表１に示す。

[実施例３]
本発明によるダイダイ抽出物で処理された正常なヒトケラチノサイトにおける酸化ストレスの低減

プロトコル：
２７歳のドナーからの正常なヒト表皮ケラチノサイトを６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間培養した。次いで、細胞を０．４％のダイダイ抽出物と一緒に２４時間インキュベートし、またはインキュベートせずに（対照）、その後、細胞を５０μＭのメナジオン重亜硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）で処理することによって酸化ストレスを誘発させた。酸化ストレスを、ＭｉｔｏＳＯＸ赤色ミトコンドリア超酸化物インジケータ（Red Mitochondrial Superoxide Indicator）（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）蛍光プローブを使用して観察する。ストレスを誘発させた１．５時間後に培養物の写真を撮影し、蛍光シグナルの強度を定量した。

結果：
ダイダイ抽出物で処理した後、対照条件と比較して、シグナル強度の６３％低下が観察された（図２）。

[実施例４]
化粧用組成物
以下の組成物を当業者にとっては従来の方法で調製することができる。以下に示す量は、重量パーセンテージで表している。大文字の成分は、ＩＮＣＩの指示に従って識別している。

４Ａ−油／水エマルション

４ｂ−油／水クリームエマルション

これらの組成物は、毎日、朝および／または夜に皮膚に適用することができる。

Claims

発酵抽出物である、キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部の抽出物。
キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部の抽出物をサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）種に属する酵母で発酵させるステップを含む方法によって入手可能な、キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部の発酵抽出物。
前記サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）種の酵母が、前記サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の変種バヤヌス（bayanus）である、請求項２に記載の抽出物。
前記サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の変種バヤヌス（bayanus）の酵母が、ＩＯＣＦｉｚｚ＋菌株の酵母である、請求項３に記載の抽出物。
前記サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の変種バヤヌス（bayanus）の酵母が、ＩＯＣＤｉｖｉｎｅ菌株の酵母である、請求項３に記載の抽出物。
前記サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の変種バヤヌス（bayanus）の酵母が、ＩＯＣ１８−２００７菌株の酵母である、請求項３に記載の抽出物。
前記キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）抽出物が、花抽出物である、請求項１から６のいずれか一項に記載の抽出物。
キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部の発酵抽出物を得る方法であって、
ａ）少なくとも１種のアルコール溶媒および／または水を用いてキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の地上部を抽出するステップと、
ｂ）ａ）で得られた混合物をろ過して、植物残渣を除去するステップと、
ｃ）任意選択で、ステップｂ）から得られた混合物を脱色するステップと、
ｄ）抽出溶媒を除去し、得られた抽出物を濃縮するステップと、
ｅ）キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）から得られた抽出物をサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）種に属する酵母によって発酵させるステップと
を含む、方法。
前記発酵させるステップが、前記サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の菌株を用いた濃縮キトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）抽出物の発酵から調製された発酵練り粉によって行われる、請求項８に記載の方法。
請求項１から７のいずれか一項に記載のキトルス・アウランティウム（Citrus aurantium）の抽出物を含む、化粧用組成物。
皮膚の老化を防止／低減するための、請求項１から７のいずれか一項に記載の抽出物の美容的使用。
抗酸化活性剤としての、および／または酸化ストレスを阻止／低減するための、および／または皮膚を解毒するための、請求項１から７のいずれか一項に記載の抽出物の美容的使用。