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JP2019131593A - 最適化された皮下治療薬 - Google Patents

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JP2019131593A
JP2019131593A JP2019073048A JP2019073048A JP2019131593A JP 2019131593 A JP2019131593 A JP 2019131593A JP 2019073048 A JP2019073048 A JP 2019073048A JP 2019073048 A JP2019073048 A JP 2019073048A JP 2019131593 A JP2019131593 A JP 2019131593A
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therapeutic agent
dosage form
modified
patient
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JP2019073048A
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English (en)
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ヘンリー，ウィリアム
Henry William
ウォルフ−ギャラウェイ，リチャード
Wolf-Garraway Richard
チャールズ メイヨ，ジョン
Charles Mayo John
チャールズ メイヨ，ジョン
ジェイムス アール，マイケル
James Earl Michael
ジェイムス アール，マイケル
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Original Assignee
Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd
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Priority claimed from GBGB1213712.1A external-priority patent/GB201213712D0/en
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Abstract

【課題】持続時間の長い、血液凝固因子組成物などの治療薬の投与方法の提供。【解決手段】皮下投与のための投与製剤であって、生体適合性ポリマーにより治療薬の修飾を行い、親水性を増加させることにより、Ｃｍａｘ：Ｃａｖｅｒａｇｅ比が、静脈内送達されたときの薬剤のＣｍａｘ：Ｃａｖｅｒａｇｅ比よりも小さい製剤。治療薬が血液凝固因子であり、生体適合性ポリマーがポリエチレングリコールであることが好ましい。【選択図】なし

Description

本発明は、治療薬の皮下送達、およびこのような薬剤を皮下送達に適した状態にするた
めの修飾に関する。
多くの疎水性（親油性）分子が、感染症、疾患および障害の治療に用いられている。親
油性分子は、感染症、疾患などの部位への迅速な送達を確実にするために、一般に患者の
血流に直接投与される。しかしながら、このような分子の半減期および／またはバイオア
ベイラビリティはサブ最適化されている。静脈内投与の不利益としては、患者への比較的
大量の薬剤の送達に対する局所的および全体的な反応、ならびに静脈内投与の不便がある
。
本発明者らは、驚くべきことに、治療薬を修飾し、これによって薬剤の親水性および分
子次元を増加させると、このような薬剤が直接血管系に入れなくなることを見出した。し
かしながら、修飾された薬剤は、その水性のリンパ系を通って患者の循環系に入る能力の
ため、依然として生物学的に利用可能になる。前記修飾は、治療薬の結合組織への表面接
着を低減し、組織液におけるその溶解度を増加させるように選択される。本発明の修飾さ
れた治療薬は、皮下腔から直接血管系に入るには大きすぎるため、したがって、リンパ系
によって体内を輸送され、胸管（右リンパ本管および鎖骨下静脈）を通って循環系に入る
ため、特に皮下腔に送達されるときに有用である。驚くべきことに、これは患者の循環系
への薬剤の予測可能な定常的な注入をもたらす。したがって、本発明は、修飾された薬剤
の効果をその寿命、注入速度および消失速度、したがって効果の持続時間においてより予
測可能にするための、修飾された薬剤の皮下送達に関する。これは、患者に皮下送達され
ると、修飾された薬剤が血管壁を通って血流に入ることができず、リンパ系に入るように
間質液によって輸送されるように、薬剤をより親水性にし、その分子次元を調節すること
によって達成される。これは、リンパ系から血管系への制御された、予測可能な放出をも
たらす。後述するように、これによって送達部位の周囲の血管新生のレベルを考慮する必
要がなくなる。
本発明は、すべての血液因子、ホルモン、抗生物質、モノクローナル担体およびいくつ
かの小分子を含む、ペプチド、生体分子に適用されうる。分子の治療効果を妨げない、か
つ、親水性を増加させ、その分子次元（修飾された薬剤の分子量または物理的なサイズを
含みうる）を調節し、分子がはじめに胸管でリンパ系を介して鎖骨下静脈に入らずに、直
接血管系に入ることができないことを確保する、任意の適当な修飾が用いられうる。選択
された修飾は、薬剤の注入速度と消失速度とが最適な治療効果のために「バランスがとれ
ている」ように、薬剤の体内からの消失（排出、消化、免疫的攻撃または他の方法による
）を調整する随伴効果を有しうる。
適当な修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の例としては、薬剤の、ポリマー、適当には
、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ポリプロ
ピレングリコール（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体
、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオレフィンア
ルコール（ｐｏｌｙｏｌｅｆｉｎｉｃ ａｌｃｏｈｏｌ）、ポリヒドロキシアルキルメタ
クリレート、多糖、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリビニルアルコール、ポリホスホスフ
ァスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｓｐｈａｚｅｎｅ）、ポリ（Ｎ−アクリ
ロイルモルフォリン）、ポリアルキレンオキシドポリマー（ｐｏｌｙａｌｋｙｅｎｅ ｏ
ｘｉｄｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、ポリマレイン酸、ポリ（ＤＬ−アラニン）、カルボキシ
メチルセルロール、デキストラン、デンプンまたはデンプン誘導体、ヒアルロン酸、キチ
ン、ポリメタクリレート、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート（ｐ
ｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ ａｌｋａｎｏａｔｅｓ）、ポリアミノ酸およびこれらの組み合わ
せなどの生体適合性ポリマーとの共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）がある。生体適合性ポ
リマーは、直鎖または分岐鎖の構造を有していてもよい。
生体適合性ポリマーの他の例は、特に制限されないが、アルブミン、トランスフェリン
、モノクローナル抗体、抗体断片、例えば、単一ドメイン抗体、ＶＬ、ＶＨ、Ｆａｂ、Ｆ
（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ３、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、Ｆｃおよび
これらの組み合わせなどの免疫グロブリンからなる群から選択されるタンパク質である。
治療薬を修飾する他の方法は、融合タンパク質の使用；リポソーム、トランスファーソ
ーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅｓ）またはミセルなどの小胞送達ビヒクルへの組み込み
；デンドリマーへの取り込み／付着；薬剤のオリゴマー複合体の形成によるものでありう
る。選択された修飾は、薬剤の注入速度と消失速度とが最適な治療効果のために「バラン
スがとれている」ように、薬剤の体内からの消失（排出、消化、免疫的攻撃または他の方
法による）を調整する随伴効果を有しうる。
皮下腔に送達されると、このように位置した修飾された薬剤は、リンパ系を通して輸送
され鎖骨下静脈を通って血管系に注入されうる。その後、このような修飾はまた、薬剤製
品の体内からの消失速度に対する皮下腔から循環への注入速度の比が、修飾された薬剤の
治療効率および有効性を最適化するようにバランスがとられ、制御されるように、薬剤の
体内からの消失を制御する。
このように皮下送達のために修飾されうる治療薬の例としては、血液凝固因子がある。
血液凝固カスケードは、互いに活性化し、血液凝固の形成を促進し、健康な止血を維持す
るさまざまな働きをする、多くの異なるタンパク質を含む。いくつかの実施形態において
、本発明によって修飾される血液凝固因子は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩ
Ｉ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、
第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子およびプロテインＣからなる群から選択さ
れる。いくつかの実施形態において、血液凝固因子は、好ましくは、第ＶＩＩ因子、第Ｖ
ＩＩＩ因子または第ＩＸ因子である。
本発明の関する治療薬の例として、血液凝固第ＶＩＩ因子（本明細書中では、ＦＶＩＩ
とも称する）があり、これは１２個の天然のジスルフィド結合を有する、５３，０００ダ
ルトン（Ｄａ）の、グリコシル化されたビタミンＫ依存性の、１本鎖チモーゲンである(O
’Hara et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 84: 5158-5162 (1987))。このタンパク
質は、主に肝臓で生産される。ＦＶＩＩは、外因性の血液凝固カスケードに関与する（図
１）。このタンパク質は、４つの別のドメインで構成されている：Ｎ−末端γ−カルボキ
シグルタミン酸(Gla)ドメイン、２つの上皮成長因子様(EGF)ドメインおよびＣ−末端セリ
ンプロテアーゼドメイン。循環しているチモーゲンは、血管内皮下層に見つかっているコ
ファクター組織因子(cofactor tissue factor)（ＴＦ）の非存在下では非常にプロテアー
ゼ活性が低い。血管損傷を受けた後、ＦＶＩＩは高い親和性でＴＦに結合し、１５２番目
のアルギニン及び１５３番目のイソロイシンの間のペプチド結合の特異的な切断によって
活性のある、２本鎖の酵素ＦＶＩＩａに変換される。ＦＶＩＩａ軽鎖は、Ｎ−末端Ｇｌａ
及びＥＧＦ様ドメインから構成され、重鎖は、セリンプロテアーゼドメインから構成され
る。重鎖及び軽鎖は、１３５番目のシステイン及び２６２番目のシステインの間の１つの
ジスルフィド結合によって一緒に維持される。活性化されると、ＦＶＩＩａは、すばやく
、ＦＸからＦＸａへの及びＦＩＸからＦＩＸａへの変換を触媒する。次に、ＦＸａがＦＶ
ａと複合体を形成し、プロトロンビンを切断し、これにより、少量のトロンビンが生成す
る(Aitken, M. G. EMA, 16: 446-455 (2004))。このトロンビンの生成が血小板及び血小
板表面のコファクターＶ、ＶＩＩＩ及びＸＩを活性化する。活性化によって、トロンビン
バースト(thrombin burst)が形成され、これによりフィブリンの重合及び止血血栓の形成
が起こる。
ヒトの組換ＦＶＩＩａが開発され、Novo NordiskによってNovoSeven（登録商標）(epta
cog alfa [activated], ATC code B02BD08)として市販されている。NovoSeven（登録商標
）は、それぞれ、ＦＶＩＩＩまたはＩＸに対する阻害抗体を発現した血友病ＡまたはＢ患
者の出血症状の治療のために認可されている (Jurlander et al., Seminars in Thrombos
is and Hemostasis, 27: 373-383 (2001); Roberts et al., Blood, 15: 3858-3864 (200
4))。この治療は、１９９６年に開始されてから安全で有効であることが分かっている。
しかしながら、タンパク質のインビボでの半減期が比較的短い（２．３時間；Summary Ba
sis for Approval NovoSeven（登録商標）, FDA reference number 96-0597）ため、高投
与量の製品（９０μｇ／ｋｇ）を複数回輸注（multiple infusions）することが、止血す
るためには１回の出血症状の間長持間かけて必要である。製品の短い半減期及び所望の治
療効果を得るために必要とされる高投与量は、阻害剤で血友病患者を予防的に処置するた
めのNovoSeven（登録商標）の一般的な使用を妨げる。したがって、明らかに、半減期の
長く、薬物動態（ＰＫ）及び薬効（ＰＤ）が向上した、ＦＶＩＩａ分子を開発する必要が
ある。
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、重要な血液凝固因子であり、抗血友病因子（ＡＨＦ
）としても知られている。ヒトでは、第ＶＩＩＩ因子はＦ８遺伝子にコードされている。
この遺伝子が欠損すると、約５０００の男性のうち１人に発生する、劣性Ｘ染色体連鎖凝
固障害としてよく知られる血友病Ａになる。
前記Ｘ染色体に連鎖したＦ８遺伝子は、シグナルペプチドの開裂により２３３２アミノ
酸の成熟ＦＶＩＩＩ分子を与えた後の２６のエクソンから２３５１アミノ酸のポリペプチ
ドをコードする(Wang et al. Int. J. Pharmaceutics, 259: 1-15 (2003))。ＦＶＩＩＩ
は、ヒトにおける放出の原発部位がどこであるか不明な部分がかなりあるが、血管、糸球
体、および管状の内皮細胞、並びに肝類洞細胞により合成され、血流に放出されることが
見出されている。前記ＦＶＩＩＩ分子は、６つのタンパク質ドメイン；ＮＨ２−Ａ１−Ａ
２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２−ＣＯＯＨで構成されている。前記成熟分子は、Ｎ−結合およ
びＯ−結合のグリコシル化、スルホン化、およびジスルフィド結合形成を含む、多くの翻
訳後修飾を含む。ＦＶＩＩＩは、タンパク質のＡおよびＣドメインにおいて、合計２３の
システイン残基を含み、これらのうち１６は８のジスルフィド結合を形成する (McMullen
et al. Protein Science, 4:740-746(1995))。前記タンパク質の翻訳後修飾により、そ
の循環分子量は、グリコシル化のレベルおよび型により、最高３００ｋＤａでありうる。
前記循環種が重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）から構成されるヘ
テロダイマーとなるように、ＦＶＩＩＩはまた、タンパク質分解処理されている。ＦＶＩ
ＩＩが循環内に分泌されると、ＦＶＩＩＩは非共有な形態でヴォン・ヴィレブランド因子
（ｖＷＦ）と結合する。前記２つの分子の結合は、ＦＶＩＩＩの軽鎖のＡ３およびＣ２ド
メインで生じる(Lacroix-Desmazes et al. Blood, 112:240-249(2008))。ｖＷＦへの結合
は、ＦＶＩＩＩの安定性および循環半減期を増加させる。ｖＷＦへの結合は、ＦＶＩＩＩ
の循環半減期を増加させるが、ＦＶＩＩＩのもとの半減期は、１５〜１９時間である。
第ＶＩＩＩ因子は、内因系血液凝固経路に関わる重要な補因子である。その凝固カスケ
ードにおける役割は、活性化した血小板表面の正確な空間的配位におけるＦＸａｓｅ複合
体の成分を構成するための「核形成鋳型」としての機能である(Shen et al. Blood, 111:
1240-1247(2008))。ＦＶＩＩＩは、はじめにトロンビン（第ＩＩａ因子）またはＦＸａに
より活性化され、次いで、ＦＶＩＩＩａの形態でｖＷｆから解離する。ＦＶＩＩＩａは次
いで、活性化血小板と血管損傷した部位で結合し、Ａ２およびＡ３を介した相互作用を通
してＦＩＸａと結合する。血小板表面のＣａ２＋の存在下における前記ＦＩＸａのＦＶＩ
ＩＩへの結合により、約２０００００倍ＦＩＸａのタンパク質分解活性が向上する。この
複合体は、次いで、ＦＸをＦＸａに活性化する。次いで、第Ｘａ因子は、補因子である第
Ｖａ因子とともに、トロンビンをより活性化する。トロンビンは、次にフィブリノーゲン
をフィブリンに分解し、これは、その後（第ＸＩＩＩ因子を使用して）重合および架橋し
、フィブリン血液凝固が生じる。
もはやｖＷＦによって保護されてない活性化ＦＶＩＩＩは、前記工程においてタンパク
質分解が不活性化され（主に活性化タンパク質Ｃおよび第ＩＸａ因子によって）、血流か
ら速やかに除去される。
第ＩＸ因子（クリスマス因子としても知られる）は、凝固系のセリンプロテアーゼであ
り、このタンパク質の欠乏は血友病Ｂの原因となる。第ＩＸ因子は、不活性なチモーゲン
前駆体として生成され、これは続いてシグナルペプチドが除去処理され、その後、さらな
るグリコシル化およびそれに続く第ＸＩａ因子または第ＶＩＩａ因子による開裂が生じて
、ジスルフィド架橋によって結合された２本鎖の形態を生成する（Ｓｃｉｐｉｏ ｅｔ
ａｌ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９７８；６１（６）：１５２８−１５３８）。第
ＩＸａ因子として活性化されると、Ｃａ２＋、膜リン脂質、および第ＶＩＩＩ因子補因子
の存在下で、第Ｘ因子のアルギニン−イソロイシン結合を加水分解して第Ｘａ因子を形成
する。第ＩＸ因子は抗トロンビンによって阻害される。
血友病Ｂは、第ＩＸ因子遺伝子における突然変異の過多によって引き起こされるＸ染色
体連鎖出血性障害であり、有効な凝血促進剤（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）タンパク質の
欠乏をもたらす。クリスマス病としても知られる血友病Ｂは、内因性のカスケードの正常
な開始を妨げる、ＦＩＸが機能しない、または不足することによって引き起こされる。こ
の状態とともに、深刻な、潜在的に生命に関わる出血性イベントが進行しうるが、この状
態は適当な量のＦＩＸの適時投与によって治すことができる。循環しているチモーゲンが
治療域にあるかぎり、止血が維持されうる。
歴史的に、血友病Ｂは、血漿ＦＩＸまたはプロトロンビン複合体濃縮物の静脈内送達に
よって、より最近では、高度に精製された血漿由来および組み換えＦＩＸによって治療さ
れてきた。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）からの組み換えヒトＦＩＸの
出現は、クリスマス病の治療を、予防的治療が現在では特に小さい子供で可能であるとい
う点で転換させた。しかしながら、この点での制限因子は、短い半減期および潜在的な「
超効力」であり、これは予防的治療を約３日の間隔に制約していた。
血液凝固（ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔｔｉｎｇ）および他の障害を有する患者の治療を探求
する医師が直面する問題のひとつは、このような患者に投与される血液凝固因子組成物な
どの治療薬の長期間持続する治療用投与量を達成する方法である。他の問題は、特にこの
ような薬剤の予防的使用において、体内における治療薬の注入、分布および消失の予測可
能な、定常状態のレベルを維持し、したがって、薬剤およびその効果の両方のレベルにお
いて、のこぎり歯の「バースト」または「ピーク」を避けることである。
例えば、血液凝固の調節は、血液凝固の形成の失敗、および血栓症（ｔｈｒｏｍｂｏｓ
ｉｓ）、望ましくない血栓の形成、の両方を含む、多くの健康上の問題を引き起こす要素
を含むプロセスである。望ましくない血栓（凝固）を防止する薬剤は多くの状況で用いら
れ、多様な薬剤が利用できる。残念ながら、ほとんどの現在の治療法は望ましくない副作
用がある。経口投与されたワルファリンなどの抗凝血剤は、肝臓のビタミンＫの作用を阻
害することによって作用し、これによってビタミンＫ依存性タンパク質におけるグルタミ
ン酸残基の完全なカルボキシル化を防ぎ、循環系における活性タンパク質の濃度が低くな
り、凝固を形成する能力が低下する結果となる。ワルファリン療法は、薬剤のその標的と
の競合性によって複雑化される。食物中のビタミンＫの変動は、ワルファリンの過剰投与
または過少量投与という結果になりうる。凝固活性における変動は、この療法の望ましく
ない結果である。
低分子ヘパリンを含むヘパリンなどの注入された物質もまた、一般に用いられている抗
凝血剤である。再び、これらの化合物は過剰摂取しがちであり、注意深くモニターする必
要がある。
治療用ペプチドの有用性を制限する他の現象は、これらのペプチドのいくつかによって
示される相対的に短いインビボの半減期である。全体に、インビボの半減期が短いという
問題は、治療用糖ペプチドを高い頻度で、高い投与量で投与しなければならないというこ
とを意味し、これは最終的に、より高い局所副反応のリスク、および、糖タンパク質治療
の治療上有効なレベルをより長く維持するためのより効率的な方法が利用できた場合に必
要であろうコストよりも、高いヘルスケアコストに変換される。
リンパ系を通した治療薬の送達を確実にする能力は、薬剤の制御された注入を与える。
親水性の増加はまた、酵素、免疫系などの分解による損傷からの分子の遮蔽を助ける。さ
らに、水中での移動度の増加は、治療薬をより生物学的に利用可能にし、必要とされる投
与量をより少なくする。これは、結果的に、より少ない副作用、より効率的な治療、およ
び医師の治療におけるより少ない費やす時間につながる。
本発明者らは、驚くべきことに、本発明によって修飾され、皮下腔に送達されたとき、
治療薬のより一貫した「定常状態」のレベルが全身的に達成されうることを示した。この
「定常状態」の一貫性の増加は、代謝および／または免疫系低下（ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓ
ｔｅｍ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）の速度とバランスを保った、リンパ系を介した血管系
の中への導入（すなわち注入）の速度、および腎臓またはＧＩ管を介した消失速度の組み
合わせによる。
したがって、本発明による修飾された薬剤の皮下送達は、繰り返されるボーラス注射（
ｂｏｌｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）送達で一般にみられる「のこぎり歯」のピークおよび
谷を軽減させることができる。しかしながら、Ｃｍａｘが静脈内注射によって達成される
ものと同じになるように、より高い投与量が皮下送達によって投与されてもよく、この場
合、リンパ系を通って血管系への注入のより遅い速度によって、修飾された薬剤の治療効
果のより長い持続時間が達成されるであろう。したがって、本発明は、より頻度の低い投
与をもたらしうる。または、静脈内送達のかわりに、本発明によって皮下送達が採用され
ると、より低い投与量で同じ投与頻度が想定されうる。
つまり、一定の期間（４日など）にわたって、修飾された薬剤の皮下投与された投与量
のＣｍａｘ：Ｃａｖｅｒａｇｅの比は、同じ投与量が静脈内投与された場合よりも小さい
。これは、血流中の修飾された薬剤のレベルがより一貫していることから、明らかに利点
である。
当業者が理解するように、より小さいＣｍａｘは、より小さいＣｍａｘ：Ｃａｖｅｒａ
ｇｅ比またはＣｍａｘ：Ｃｍｉｎ比（すなわち、静脈内投与された薬剤の典型的な「のこ
ぎり歯」プロファイルと比較して、ピークおよび谷が平坦化されたグラフ）と同様に、患
者に有益でありうる。
例えば、第ＶＩＩａ因子は、この問題を明らかにし、修飾はその本発明の解決を示す。
第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子は、ヒトで約２〜４時間の循環半減期を有する。すな
わち、２〜４時間以内に、血清中のペプチド濃度は半分に減少する。第ＶＩＩａ因子が凝
血促進剤として特定の形態の血友病の治療に用いられる場合、標準プロトコルは、ＶＩＩ
ａを２時間ごとに、高い投与量（４５〜９０μｇ／ｋｇ体重）で注射するものである。Ｈ
ｅｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．７：７８−８３（１９
９３））を参照。したがって、これらのタンパク質の凝血促進剤または抗凝血剤（第ＶＩ
Ｉ因子の場合）としての使用は、前記タンパク質が高頻度の間隔で、高い投与量で投与さ
れることを必要とする。
従来、バイオ医薬品の生体適合性ポリマーへの共役を用いて、このような治療用製品の
物理化学的特性を改良するのに成功してきた。共役により改良されたタンパク質の特性と
しては、ＰＫ、ＰＤ及び免疫原性がある。化学的部分のタンパク質への結合は、その循環
半減期を有意に増加できる(Jevsevar et al., Biotechnol. J., 5: 113-128 (2010))。糸
球体濾過限界より下の分子量を有する分子種では、分子量の大きな部分の共役は、生成物
の腎クリアランスを妨げる。また、化学的部分の薬剤製品への付加は、立体障害により分
子のレセプターによる除去を妨げてしまう。
治療薬をより親水性にする、生体適合性ポリマーなどの分子の修飾の使用はまた、導入
された治療薬に対する免疫応答の低減または防止に役立ちうる。前記修飾は、薬剤の周囲
に「水の遮蔽」を与え、これは免疫系が他に応答しうる任意のエピトープを「隠し」うる
。修飾された治療薬の周囲の水分子の存在は、水溶液中でクラスレート構造を形成しうる
。
さらに、薬剤の皮下送達を可能にする修飾の使用によって、治療薬をリンパ系を通して
体内に段階的に導入することが可能になり、大投与量のボーラス注射または静脈内注入に
伴う反応、特定の抗生物質の静脈内投与に伴う「レッドマン症候群」など、を避けること
ができる。
したがって、皮下送達のためにこのような治療薬を修飾することによって、その結果、
それに続くリンパ系を通した血管系への注入によって、多くの利点が予想されうる。
したがって、本発明は、第１形態として、患者に治療薬を投与する方法であって、Ｃｍ
ａｘ：Ｃａｖｅｒａｇｅ比が静脈内送達されたときの薬剤のＣｍａｘ：Ｃａｖｅｒａｇｅ
比よりも小さくなるように患者に前記治療薬を皮下投与することを含み、薬剤が、前記治
療薬の本来の状態に対して親水性を増加させ、分子次元を調節するために修飾される、方
法を提供する。皮下投与は、静脈内投与と比較して、治療期間の間、薬剤が患者の血流中
により一定の濃度で存在するようにするものであり、Ｃｍａｘ：Ｃａｖｅｒａｇｅ比を低
減することを可能にする。
また、患者のリンパ系に治療薬を投与する方法であって、前記治療薬が注射部位で患者
の循環系に直接入らないように前記治療薬を皮下投与する段階を含み、修飾された薬剤が
投与部位から直接循環に入ることができないように、薬剤が、前記治療薬の本来の状態に
対して親水性を増加させ、分子次元を調節するために修飾される、方法が提供される。
さらに、患者に治療薬が皮下投与されたとき、前記治療薬が患者の局所循環系に直接入
ることを防ぐ方法であって、患者に修飾された薬剤を皮下投与する段階を含み、薬剤が、
前記治療薬の本来の状態に対して親水性を増加させ、分子次元を調節するために修飾され
る、方法が提供される。
前記修飾された薬剤の皮下投与は、静脈内ボーラス注射よりも、患者に投与する薬剤を
高い投与量にすることを可能にする；修飾された薬剤が静脈内投与された場合よりも早く
、患者に再投与することを可能にする；修飾された薬剤の静脈内投与よりも少ない、また
は同等の免疫原性応答が達成される；静脈内投与されたときの修飾された薬剤の治療効果
よりも少なくとも１２時間長い持続時間の治療効果を患者に与える；および、前記薬剤は
、静脈内に安全に送達されうる修飾された薬剤の濃度よりも高い濃度で送達可能である。
親水性は、少なくとも、未修飾の薬剤の分子次元に対する修飾された薬剤の分子次元の
比によって増加する。親水性は、水に対する親和性として定義される親水性親油性バラン
ス（ＨＬＢ）を意味し、本明細書中では表面接着の能力がより低く、水中により高く分散
することを示唆する。
本発明の方法は、被験者の皮下デポ製剤から治療薬を送達するスピードを調節すること
を提供し、前記治療薬を修飾して前記治療薬の親水性を変化させることを含み、ここで、
親水性のレベルがバイオアベイラビリティのレベルに比例する。
驚くべきことに、皮下腔からのデポー放出の最長の持続時間を達成するためには、より
少ない程度の修飾が必要とされることがわかった。理論によって拘束されることなく、こ
れは、より少ない程度の修飾によって治療薬の一部が皮下組織にさらされ、これによって
リンパを通した拡散の速度が遅くなる、ということで説明されうる。一方、より高い程度
の修飾は、治療薬を完全に被覆し、生成物を自由に、血液循環に速やかに入れるようにす
る。
また、バイオアベイラビリティは、モノ−修飾された種と比較して、より高次に修飾さ
れた、すなわち、ジ−またはトリ−修飾された種である、治療薬を支持することが示され
た。したがって、本発明者らは、修飾および水和レベルの程度が高いほど、高い程度の移
動度、したがって、バイオアベイラビリティが促進されることを確認した。
その結果、任意の治療薬に対して、皮下デポ製剤からの放出は、現在は、治療薬の修飾
のレベルを増加させるまたは減少させることによって調整されうる。
本発明によれば、皮下送達は、皮下注射、局所塗布、経皮パッチ、マイクロダーマルア
ブレーション、高圧乾燥粉末送達、または治療剤を皮下腔に導入するための任意の他の方
法によるものであってもよい。
本発明のさらなる形態は、第１のおよびさらなる形態に係る方法における使用のための
、治療薬および修飾を含む修飾された薬剤を提供し、ここで、前記修飾は、前記治療薬の
本来の状態に対して薬剤の親水性を増加させ、分子次元を調節する。薬剤の修飾は、治療
薬の本来の状態に対して、薬剤の親水性を少なくとも５０％、分子次元を少なくとも５０
％増加させうる。
幾つかの市販されているバイオ医薬製品に使用されている生体適合性ポリマーの例とし
ては、ポリエチレングリコール（本明細書中ではＰＥＧと称する）がある。ＰＥＧ分子を
他の分子に共有結合させるプロセスは、ＰＥＧ化(PEGylation)と称する。今日まで、９個
のＰＥＧ化製品がＦＤＡでマーケット認可がおり、４つがブロックバスター薬剤(blockbu
ster drug)：PegIntron（登録商標）(Schering-Plough)、Pegasys（登録商標）(Hoffman-
La Roche)、Neulasta（登録商標）(Amgen)及びMicera（登録商標）(Hoffman-La Roche)で
ある。多くの異なる化学物質が、タンパク質治療剤を活性化ＰＥＧ分子に共役するのに使
用されてきた。ランダムＰＥＧ化を用いて、タンパク質のアミノ基を介してタンパク質に
ＰＥＧ部分を共有結合するのに成功した。結合部位は、もっとも頻繁に（ただし、これに
限られない）、リジン残基の側鎖のε−アミノ基であった。このようなランダムな反応に
より、ＰＥＧ部分の結合数や結合部位が様々である共役体の非常に複雑な混合物が生産で
きる。ランダムな共役反応物の精製後であっても、位置異性体が存在してしまい、これに
より、非常に異なる物理化学的及び薬剤特性を示す。多くの部位特異的ＰＥＧ化技術が開
発され、現在、より良好に規定されたバイオ医薬品を生産するのに利用されている。部位
特異的ＰＥＧ化を行うのに使用されるアプローチとしては、Ｎ−末端、システイン、グリ
カン、ジスルフィド及びポリヒスチジン標的ＰＥＧ化(N-terminal, cysteine, glycan, d
isulphide and poly-histidine targeted PEGylation)がある。
ペプチド治療薬を誘導体化するためのＰＥＧの使用は、ペプチドの免疫原性を低下させ
ることが示されている。例えば、ＵＳ４１７９３３７には、ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）またはポリプロピレングリコールに結合した、酵素およびペプチドホルモンなどの
非免疫原性ポリペプチドが開示されている。免疫原性の低下に加えて、問題のポリペプチ
ドのＰＥＧ−共役体のサイズの増加のために、循環におけるクリアランス時間が長くなる
。
ＰＥＧおよびその誘導体のペプチドへの結合の主要な形態は、ペプチドアミノ酸残基を
介した非特異的な結合である（米国特許第４０８８５３８号、米国特許第４４９６６８９
号、米国特許第４４１４１４７号、米国特許第４０５５６３５、および国際公開第８７／
０００５６号を参照）。ＰＥＧをペプチドに結合させる他の形態は、糖ペプチド上のグリ
コシル残基の非特異的な酸化である（国際公開第９４／０５３３２号を参照）。
これらの非特異的な方法では、ポリエチレングリコールは、ポリペプチド骨格上の反応
性残基に、ランダムに、非特異的に付加される。もちろんＰＥＧ分子のランダム付加は、
最終生成物の均一性の欠如およびペプチドの生物活性または酵素活性が低下する可能性を
含む短所がある。したがって、治療用ペプチドの製造のために、特異的に標識された、容
易に特徴づけられる、実質的に均質な生成物が得られる誘導体化戦略が優れている。
組み換え血液凝固因子（ＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸなど）のような治療薬の
ＰＥＧ化における状況は、以下のようにまとめることができる。ＷＯ ９８／３２４６６
には、ＦＶＩＩがＰＥＧ化される可能性が示唆されているが、さらなる情報はない。ＵＳ
２００８／０２００６５１には、人工的に導入されたシステイン残基を介して共役したＰ
ＥＧ分子を有する野生型の、または活性の増加したＦＶＩＩポリペプチドがインビボでの
半減期が増加したことが示唆される。ＵＳ２００８／０２２１０３２には、インビボでの
半減期が有意に増加した分子を生じるＦＶＩＩａ−ポリシアル酸共役体の生産が記載され
る。ＵＳ２００９／０１７６９６７には、酵素がＰＥＧ等の生体適合性ポリマーが結合す
るＦＶＩＩポリペプチドのＣ末端に特定の官能基を導入するのに使用できることが示唆さ
れる。ＵＳ２００９／０２２７５０４には、血清中の半減期が改善した１以上のアスパラ
ギン−および／またはセリン−連結オリゴ糖鎖が少なくとも１つの重合性基で共有結合に
より修飾される(covalently modified)ＦＶＩＩａ（またはＦＶＩＩａ様分子）の調製が
記載される。ＵＳ２０１０／００２８９３９には、天然の糖タンパク質を、酵素であるガ
ラクトースオキシダーゼを用いて修飾して、グリカンの末端に反応性アルデヒド機能性を
生成させる方法が記載される。この反応性アルデヒドを、さらに用いて、重合性部分をタ
ンパク質に共役させて、薬理学的特性が向上した製品を製造できる。ＵＳ２０１０／００
５６４２８には、グリコシル基でのＰＥＧ等の重合性部分のオキシムによる糖タンパク質
の誘導化によって、ＦＶＩＩａで薬物動態特性の向上が達成できることが示唆される。Ｆ
ＶＩＩＩおよびＦＩＸに関して対応する報告が出版されている。それぞれ、ＵＳ２００８
／０２５５０２６およびＵＳ７６８３１５８を参照のこと。
タンパク質のＰＥＧ化の他のアプローチは、Polythericsによって開発され、ＰＥＧポ
リマーをタンパク質の１対のシステイン残基の還元ジスルフィド結合を介して有用なタン
パク質に結合したTheraPEG（商標）として知られている（ＷＯ ２００５／００７１９７
）。この技術を用いることにより、第ＦＩＸａ因子の混入のない第ＩＸ因子のＰＥＧ化形
態（ＷＯ ２００９／１３０６０２）、ＰＥＧ化第ＶＩＩ因子（ＷＯ ２０１１／１３５
３０８）およびＰＥＧ化第ＶＩＩＩ因子（ＷＯ ２０１１／１３５３０７）を調製した。
現在では、本発明者らによって、血液凝固因子のＰＥＧ化形態のような修飾された治療
薬の皮下投与は、特に「投与量調節された」とき、静脈内投与によって送達された等価形
態と比較して、半減期が改善され、血漿中で活性が持続する結果をもたらしうることが見
出された。皮下注射が与えられる特定の位置は、修飾された薬剤が血液系に現れる開始時
間を増加または減少させうる。いずれにしても、より低いＣｍａｘ：Ｃａｖｅｒａｇｅ比
が達成される；通常は持続放出製剤などに伴って、同様の薬物動態プロファイルがみられ
る。未修飾の治療薬を皮下投与することの不利益は、心臓血管系に直接入れることであり
、したがって得られたＣｍａｘおよび持続時間は皮下注射の部位の血管の状態に大きく依
存する。高度に血管新生された領域は、薬剤が皮下注射によってその領域に投与されたと
き、より血管新生されていない領域への注射と比較して、明らかにある量の薬剤をより速
く取り込むであろう。このような矛盾は、本発明の修飾された薬剤の皮下投与のための使
用によって解決されうる。
本発明による修飾された治療薬の提供は、リンパ系を通って心臓血管系に送達される分
子を与え、したがって注射部位の血管系に関係なく、リンパ系を通って循環へのより予測
可能な、一定の送達速度につながる。
血液凝固因子を含む治療薬の製剤についての当該分野での従来の推論は、皮下投与のた
めにこのような因子を製剤することから導かれうる利点を認識していない。特に、このよ
うな製剤は皮下投与されると、長期間の正常止血をもたらし、維持しうること、または、
定常的な注入効果が達成されることにより、薬剤のバイオアベイラビリティ（より低いＣ
ｍａｘ：Ｃａｖｅｒａｇｅ比）のより安定なレベルをもたらしうること、について、暗示
も示唆もない。リンパ系は血管壁がコラーゲンを含む水性流体を提供する。血管壁を通過
するには大きすぎる任意の分子は、血流に到達するためにリンパ廃液を頼る必要がある。
しかしながら、分子にある程度の疎水性が存在すると、リンパ系に入る前およびリンパ管
壁への両方で組織に付着しやすく、したがって体液中で固定されるであろう。一方、親水
性部分が与えられると、修飾された薬剤は、リンパの水相により速やかに分散され、系に
容易に流出し、胸管で血流に入るであろう。
任意の形態の治療薬は、小分子、高分子、ポリマーおよびポリペプチドであってよく、
ここで小分子は、催眠薬および鎮静剤、不整脈治療剤、酸化防止剤、抗喘息薬、避妊薬を
含むホルモン剤、交感神経様作用薬、利尿薬、脂質調節剤、抗アンドロゲン剤、駆虫剤、
抗凝血剤、腫瘍薬、抗腫瘍薬、血糖降下薬、精神賦活薬、精神安定剤、呼吸薬、抗痙攣薬
、筋弛緩剤、抗パーキンソン薬（ドーパミン拮抗薬）、サイトカイン、成長因子、抗癌剤
、抗血栓剤、抗高血圧剤、心血管治療薬、鎮痛剤、抗炎症剤、抗不安薬（不安緩解剤）、
食欲抑制薬、抗片頭痛薬、筋収縮剤、抗感染薬（抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、ワ
クチン）、抗関節炎薬、抗マラリア剤、制吐剤、抗てんかん薬、気管支拡張剤、栄養剤お
よび栄養補助剤、成長補助剤、抗腸炎剤、ワクチン、抗体、診断用薬および造影剤を含む
。
本発明での使用に適した薬剤の例としては、特に制限されないが、カルシトニン、エリ
トロポイエチン（ＥＰＯ）、セレデース（ｃｅｒｅｄａｓｅ）、セレザイム（ｃｅｒｅｚ
ｙｍｅ）、シクロスポリン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、トロンボポイエチン
（ＴＰＯ）、アルファ−１プロテイナーゼ阻害剤、エルカトニン（ｅｌｃａｔｏｎｉｎ）
、顆粒細胞マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、成長ホルモン、ヒト成長
ホルモン（ＨＧＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ヘパリン、低分子ヘパリ
ン（ＬＭＷＨ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、イン
ターロイキン−１受容体、インターロイキン−２、インターロイキン−１受容体拮抗薬、
インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、黄体形成ホルモ
ン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、第ＩＸ因子インスリン、プロインスリン、インスリン類似
体（例えば米国特許第５，９２２，６７５号に記載されるモノアシル化インスリン）、ア
ミリン、Ｃ−ペプチド、ソマトスタチン、オクトレオチドを含むソマトスタチン類似体、
バソプレッシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、イン
スリントロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｔｒｏｐｉｎ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（
Ｍ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、組織成長因子、ケラチノサイト成長因子（ＫＧ
Ｆ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、内皮成長因子、副甲状腺ホ
ルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン様ペプチドチモシンα１、ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、α−
１アンチトリプシン、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）化合物、ＶＬＡ−４阻害剤、ビス
ホスホネート、呼吸器合胞体ウイルス抗体、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）遺
伝子、デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、カルベニシリン、チカルシリン、アズ
ロシリン、メズロシリンおよびピペラシリンのような抗緑膿菌性ペニシリン；セフポドキ
シム、セフプロジル（ｃｅｆｐｒｏｚｉｌ）、セフチブテン（ｃｅｆｔｂｕｔｅｎ）、セ
フチゾキシム、セフトリアキソン（ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ）、セファロチン、セファピ
リン、セファレキシン、セフラドリン（ｃｅｐｈｒａｄｒｉｎｅ）、セフォキシチン、セ
ファマンドール、セファゾリン、セファロリジン、セファクロール、セファドロキシル、
セファログリシン、セフロキシム、セフォラニド（ｃｅｆｏｒａｎｉｄｅ）、セフォタキ
シム、セファトリジン、セファセトリル（ｃｅｐｈａｃｅｔｒｉｌｅ）、セフェピム、セ
フィキシム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォテタン、セフメタゾール、セフタジ
ジムなどのセファロスポリン、ロラカーベフ（ｌｏｒａｃａｒｂｅｆ）およびモキサラク
タム、アズトレオナムなどのモノバクタム；殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、
抗−ＣＭＶ抗体、１３−シス・レチノイン酸、マクロライド、例えば、エリスロマイシン
、オレアンドマイシン、トロレアンドマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシ
ン、ダベルシン（ｄａｖｅｒｃｉｎ）、アジスロマイシン、フルリスロマイシン（ｆｌｕ
ｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、ジリスロマイシン、ジョサマイシン、スピラマイシン（ｓｐ
ｉｒａｍｙｃｉｎ）、ミデカマイシン、ロイコマイシン、ミオカマイシン、ロキタマイシ
ン、及びアジスロマイシン、及びスウィノライドＡ（ｓｗｉｎｏｌｉｄｅ Ａ）；フルオ
ロキノロン、例えば、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、トロバ
フロキサシン、アラトロフロキサシン（ａｌａｔｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、モキシフロキ
シン、ノルフロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、ロメ
フロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン（ｔｅｍａｆｌｏｘａｃｉｎ）、
ペフロキサシン（ｐｅｆｌｏｘａｃｉｎ）、アミフロキサシン（ａｍｉｆｌｏｘａｃｉｎ
）、フレロキサシン、トスフロキサシン、プルリフロキサシン、イロキサシン（ｉｒｌｏ
ｘａｃｉｎ）、パズフロキサシン、クリナフロキサシン（ｃｌｉｎａｆｌｏｘａｃｉｎ）
、およびシタフロキサシン、アミノグリコシド、例えば、ゲンタマイシン、ネチルマイシ
ン、パラメシン、トブラマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、及びスト
レプトマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、ランポラニン（ｒａｍｐｏｌａｎｉ
ｎ）、ミデプラニン（ｍｉｄｅｐｌａｎｉｎ）、コリスチン、ダプトマイシン、グラミシ
ジン、コリスチメテート（ｃｏｌｉｓｔｉｍｅｔｈａｔｅ）、ポリミキシン類、例えば、
ポリミキシンＢ、カプレオマイシン、バシトラシン、ペネム系抗生物質；ペニシリン系抗
生物質、例えば、ペネシリナーゼ感受性薬剤、例えばペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ペニ
シリナーゼ−抵抗性薬剤、例えばメチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキ
サシリン、フロキサシリン（ｆｌｏｘａｃｉｌｌｉｎ）、ナフシリン；アンピシリン、ア
モキシシリン、及びヘタシリン、シリン、及びガルアンピシリン（ｇａｌａｍｐｉｃｉｌ
ｌｉｎ）などのグラム陰性微生物活性薬剤；並びにカルバペネム、例えばイミペネム、メ
ロペネム、ペンタミジン・イソチオウエート（ｉｓｅｔｈｉｏｕａｔｅ）、アルブテロー
ル硫酸塩、リドカイン、硫酸メタプロテレノール、ベクロメタゾン・ジプレピオネート（
ｄｉｐｒｅｐｉｏｎａｔｅ）、トリアムシノロンアセトアミド、ブデソニド・アセトニド
、フルチカゾン、イプラトロピウムブロミド、フルニソリド、クロモリンナトリウム、エ
ルゴタミン酒石酸塩、および適用可能であれば、上記の抗生物質、血液因子、ホルモン、
成長因子、他の治療用ペプチドもしくはタンパク質、またはモノクローナル抗体もしくは
小分子の、類似体、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、及び製薬上許容される塩の形
態が挙げられる。好ましくは、修飾される薬剤は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｉ
Ｘ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因
子、ヴォン・ヴィレブランド因子およびプロテインＣからなる群から選択されうる。いく
つかの実施形態において、血液凝固因子は、好ましくは第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子ま
たは第ＩＸ因子である。
本発明による薬剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−ホスファチジルコリ
ン（ＰＣ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレング
リコールとの共重合体、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリオキシエチル化ポリオー
ル、ポリオレフィンアルコール、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、多糖、ポリ（
α−ヒドロキシ酸）、ポリビニルアルコール、ポリホスホスファスファゼン（ｐｏｌｙｐ
ｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｓｐｈａｚｅｎｅ）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ
アルキレンオキシドポリマー、ポリマレイン酸、ポリ（ＤＬ−アラニン）、カルボキシメ
チルセルロース、デキストラン、デンプンまたはデンプン誘導体、ヒアルロン酸、キチン
、ポリメタクリレート、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリ
アミノ酸およびこれらの組み合わせなどの任意の生体適合性ポリマーによって修飾されう
る。生体適合性ポリマーは直鎖または分岐鎖の構造を有しうる。
さらなる実施形態において、生体適合性ポリマーは、特に制限されないが、アルブミン
、トランスフェリン、モノクローナル抗体、抗体断片、例えば、単一ドメイン抗体、ＶＬ
、ＶＨ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ３、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｓ
ｄＡｂ、Ｆｃ及びこれらの組み合わせ等の免疫グロブリンからなる群から選択されるタン
パク質である。
いくつかの実施形態において、皮下送達された修飾された治療薬の増加した親水性／溶
解性は、薬剤が静脈内送達された場合よりも送達媒体中に高い濃度で含まれることを可能
にする。このことによって、薬剤製品が注射によって投与された場合、使用される注射体
積をより小さくすることができ、皮下投与により適する。加えて、未修飾の薬剤が自己触
媒しうると予想されるより高い濃度で、前記修飾は薬剤の自己消化（未修飾の形態では望
ましくない、危険な副生成物をもたらしうる）を防ぐ。例えば、未修飾の血液因子ＩＸは
、高濃度で自己触媒して第ＩＸａ因子を生成するが、これは血栓形成の危険がある。
したがって、本発明の他の形態において、修飾された治療薬の皮下送達体積は、２ｍｌ
以下である。好ましくは、送達体積は、５μｌ、１０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、１００
μｌ、２５０μｌ、５００μｌ、７５０μｌ、または１ｍｌでありうる。他の実施形態に
おいて、薬剤の送達体積は、１．５ｍｌ、２ｍｌ、２．５ｍｌ、３．０ｍｌまたは３．５
ｍｌ以下でありうる。本発明は、患者の血流に直接送達されないため、静脈内注射よりも
、１回の皮下注射で送達される活性薬剤をより高い濃度に、より安全にできることに注意
することは重要である。高い濃度で静脈内投与される血液凝固因子は、患者に望ましくな
い、危険な血栓をもたらしうるため、このことは血液凝固因子を扱うときに特に重要であ
る。皮下送達によって、活性薬剤のリンパ系を通した血流への定常的な注入が可能になり
、そのため危険なレベルの活性薬剤が血液系に直接送達される影響を避けることができる
。したがって、血流への薬剤の送達濃度が患者のリンパ系によって調節されているため、
皮下投与の投与量において、より高い濃度で送達することができ、これによって静脈内送
達に従来用いられていたよりも使用される体積を少なくできる。
血管壁を通って血管系に直接入ることを防ぐために、親水性修飾によって修飾し、親水
性を増加させ分子次元を調節することができ、リンパ系を通って循環系に到達するために
、皮下投与によって患者に投与可能な薬剤が、本発明の範囲に含まれる。このような薬剤
を修飾する方法もまた本発明に含まれる。
本発明の投与形態は、少なくとも１日１回、少なくとも１日２回、およそ週１回、およ
そ週２回、およそ２週間に１回、またはおよそ月１回の投与のためのものでありうる。皮
下デポ製剤からの修飾された治療薬の放出速度を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）できるという
ことは、投与がより便利に制御されうることを意味する。
特定の治療用物質において、１日１回の投与量レジメは十分でありうるが、他のもので
は、より頻度の高い投与量レジメがより適当であるか、望ましい場合があり、このとき、
各投与量の皮下投与で送達される量は、標準的な静脈内投与量に対して低減されうる。そ
のため、例えば、本発明の投与形態は、１日１回、１日２回（必要に応じてそれよりも多
く）、投与されうる。
本発明によれば、血中の薬剤濃度の急激な上昇およびそれに続く下降（すなわち「のこ
ぎり歯」）を防ぐことができる。本発明は、患者の血液中にてより一定な、予測可能な薬
剤濃度を、未修飾の薬剤または同じ修飾された生成物が繰り返し静脈内に送達されたとき
に従来みられたものよりも、長期間にわたって提供する。
本発明のさらなる利点は、安全に静脈内投与される投与量よりも、皮下投与される薬剤
の投与量を高くすることができることである。これは、静脈内送達によるより高い投与量
での投与またはより高頻度での投与によって、通常、安全に達成されうるものよりも、よ
り長い持続時間の治療効果の提供をもたらす。例えば、血液因子の場合、生成物は胸管を
通って鎖骨下静脈に送達されるため、この方法は、一回限りで静脈に静脈内投与されうる
よりも、１回の投与量で、一回限りでより大量の生成物を皮下投与することを可能にする
。高投与量ボーラスの静脈への送達は、望ましくない血栓事象の原因となりうる。
本発明のさらなる利点は、薬剤の血中濃度が一定のレベルに維持される間隔で前記薬剤
の再投与を可能にし、これは持続性の、一定であり予測可能な治療効果が提供され、血中
における薬剤の濃度が治療上適切でないレベルに落ちるまで再投与を待つ必要がない。従
来の方法では、静脈内の再投与は、その即時のＣｍａｘおよび作用の開始とともに、治療
薬のレベルが、新たな注射からのＣｍａｘの追加が潜在的に血栓形成（ｔｈｒｏｍｂｏｇ
ｅｎｉｃ）レベルに到達しないレベルまで落ちたとみなされるまで遅らされる（すなわち
有害事象のリスクを減少させる）が、しかしながら、これは、患者が彼または彼女の血流
における薬剤のレベルの「不健康な」領域に達することを意味する。つまり、「健康なレ
ベル」または、治療上有効なレベルの薬剤が依然として血流中に存在する間は、薬剤の後
続の投与量は通常は患者に与えられない。しかしながら、本発明は、薬剤の血中濃度は依
然として治療上有効な領域にありながら、薬剤の再投与を行うことを可能にし、したがっ
て本発明は、血流中のタンパク質のより一定な治療上のレベルを提供し、すなわち、より
理想的に予防に適する。胸管を通した血流への薬剤の一定の送達によって、薬剤が血流中
で望ましくない高いレベルまで増加するという問題が回避される。
本発明の一形態によれば、皮下投与のための修飾された血液凝固因子の薬剤組成物の投
与形態であって、患者への皮下投与のために製剤されたとき、前記患者の全血凝固時間を
２０分以下に維持するのに十分な、１か月に１回以下の投与形態を提供する、投与形態が
提供される。また、１か月に１回１以下の皮下投与のための、ＰＥＧ化された血液凝固因
子の液体の投与形態であって、前記投与形態は、静脈内投与されるときの等価参照投与形
態と比べて少なくとも１０％であり、９０％以下であるＣｍａｘを有する、血液凝固障害
の治療における使用のための、投与形態が提供される。好ましくは、Ｃｍａｘは、２０〜
８０％、または３０〜７０％、または４０〜６０％である。好ましくは、血液凝固因子は
ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸでありうる。
「以下」は、投与形態が、所定の期間よりも高い頻度で投与されうることを意味するが
、そうしなくてもよい：このような投与形態の皮下投与の効果は、前記効果は前記期間の
持続時間でみられることを意味する。しかしながら、より低く、一定なＣｍａｘにより、
患者への副作用がなく、より高い頻度の投与が生じうる。
好ましくは、血液凝固因子の投与形態は、前記患者における全血凝固時間を１５分未満
、または好ましくは１２分未満に維持するのに十分でありうる。一実施形態において、血
液凝固因子の投与形態は、少なくとも週１回の投与形態、または少なくとも月１回、少な
くとも２週間に１回、少なくとも１／２週間に１回の投与形態である。
本発明に係る投与形態は、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因
子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、第Ｖ因子、ヴォン・ヴィレブ
ランド因子およびプロテインＣからなる群から選択される血液凝固因子を含みうる。好ま
しくは、血液凝固因子はＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸでありうる。
本発明の投与形態は、本明細書中に定義されるように、任意の生体適合性ポリマーによ
って修飾されうる。好ましくは、修飾はＰＥＧ化である。
前記投与形態は、静脈内投与される等価参照（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒｅｆｅｒｅｎ
ｃｅ）投与形態と比べて少なくとも１０％であり、９０％以下のＣｍａｘを有しうる。特
定の実施形態において、前記投与形態は、静脈内投与されるときの等価参照投与形態と比
べて１０〜２５％のＣｍａｘを有しうる。特定の実施形態において、前記投与形態は、静
脈内投与されるときの等価参照投与形態と比べて４０〜６０％のＣｍａｘを有しうる。特
定の実施形態において、前記投与形態は、静脈内投与されるときの等価参照投与形態と比
べて７５〜８０％のＣｍａｘを有しうる。特定の実施形態において、前記投与形態は、静
脈内投与されるときの等価参照投与形態と比べて７５〜７８．８％のＣｍａｘを有しうる
。一実施形態において、Ｃｍａｘは７５〜８０％であり、血液因子はＦＶＩＩでありうる
。他の実施形態において、Ｃｍａｘは１０〜２５％であり血液因子はＦＶＩＩＩでありう
る。さらに他の実施形態においてＣｍａｘは４０〜６０％であり血液因子はＦＩＸであり
うる。
また、投与量が１〜１０００ＩＵ／ｋｇ、または５〜５００ＩＵ／ｋｇ、または１００
〜２５０ＩＵ／ｋｇ、または２５〜５０ＩＵ／ｋｇである、本発明に係る投与製剤が提供
される。
本発明の投与形態は、投与形態の投与頻度を少なくすることができ、それでも患者の全
血凝固時間を２０分以下、または１５分以下、または１０分以下に維持するのに十分であ
る。一実施形態において、投与形態は全血凝固時間を１２分未満に維持するのに十分であ
る。投与形態は、２週間に１回以下、１週間に１回以下、１週間に２回以下、３日ごとに
１回以下、２日ごとに１回以下、１日１回以下、またはそれ以上もしくは以下の頻度の投
与形態を提供しうる。
本発明のひとつの利点は、薬剤が血液凝固因子である場合の製剤は、全血凝固時間を健
康な範囲に維持し続けるための間隔よりも高い頻度で患者に投与する必要はないが、制御
放出製剤のものと同様の「定常状態」の提供を助けるために、より高い頻度で投与されて
もよいことである、ということに注意することは重要である。「正常な」全血凝固時間は
、通常、当業者には１０〜１２分と考えられ、血友病ではないヒトでは１５分を下回れば
健康であると考えられる。全血凝固時間が２０分を超えると、健康ではない領域にあると
考えられる。１５〜２０分は、出血は制御されているが正常ではないことを意味すると考
えられる。
他の実施形態において、前記投与形態は、ボーラス静脈内注射の血漿半減期から予測さ
れるよりも少ない頻度で投与される。例えば、修飾された第ＩＸ因子のボーラス注射は週
１回必要でありうるが、本発明によって皮下送達される同じ薬剤は、１０日に１回以下し
か必要とされない。
本発明のさらなる形態によれば、静脈内投与される血液凝固因子と同じか、より少ない
頻度での皮下投与のための、２５〜５０ＩＵ／ｋｇの修飾された血液凝固因子の薬剤組成
物の投与形態が提供される。
したがって、本発明の製剤は、止血の正常値を７日まで維持することができる。ここで
正常値は、１５分未満、好ましくは約１２分以下の全血凝固時間（ＷＢＣＴ）として定義
される。
本発明の製剤は、静脈内投与されるときの等価参照（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒｅｆｅ
ｒｅｎｃｅ）投与形態と比べて少なくとも１０％であり、９０％以下であるＣｍａｘを有
する。本発明のいくつかの実施形態において、前記値は少なくとも７５％、７８％または
８０％であってよく、血液因子はＦＶＩＩでありうる。本発明のいくつかの実施形態にお
いて、前記値は少なくとも１５％、１８％または２０％であってよく、血液因子はＦＶＩ
ＩＩでありうる。本発明のいくつかの実施形態において、前記値は４０％、４５％または
５０％であってよく、血液因子はＦＩＸでありうる。
修飾された薬剤がＰＥＧ化血液因子である本発明の特定の実施形態の製剤は、１か月に
１回以下の皮下投与のために製剤される場合、２５〜５０ＩＵ／ｋｇの投与量を含む。い
くつかの実施形態において、投与量は、２５、３０、３５、４０、４５または５０ＩＵ／
ｋｇでありうる。投与量は、２５〜３０ＩＵ／ｋｇ、３５〜４０ＩＵ／ｋｇまたは４０〜
５０ＩＵ／ｋｇでありうる。
一実施形態において、１５０ＩＵ／ｋｇの投与量で投与形態が調製されたとき、前記製
剤は、必要とする患者に２週間ごとに１回投与するのに適する。好ましくは、前記製剤は
、２週間ごとに１回以下の投与のためのものでありうる。
本発明の一実施形態によれば、修飾された血液凝固因子の投与形態は、皮下投与のため
に製剤されると、少なくとも１／２週間は維持される正常止血を与えうる。
本発明による投与形態は、皮下投与されると、同じ治療上のエンドポイントを達成する
ために必要な修飾された血液凝固因子の量が少なくなり、したがって治療を必要とする患
者のためのより安全な製品を提供される。一実施形態において、静脈内投与される修飾さ
れた血液凝固因子の調節された投与量の半分で、特に、血液凝固因子が第ＶＩＩａ因子ま
たは第ＶＩＩＩ因子であるとき、患者において少なくとも１週間、正常止血を達成するの
に十分である。正常止血の適した値は、上述のように、全血凝固時間（ＷＢＣＴ）が約１
２分である。
本発明の製剤は、好ましくは、同じ治療効果を達成するために、同様に修飾された血液
凝固因子を含む静脈内投与のために製剤された参照製剤の、投与量調節された治療上有効
な量の半分未満を含みうる。例えば、血液凝固因子が第ＩＸ因子である実施形態において
。
したがって、本発明はまた、修飾された血液凝固因子の皮下投与のための投与形態を提
供し、ここで、前記投与形態は、有効な作用の同じ持続時間を達成するために静脈内投与
で必要とされる投与量調節された量の５０％を含む。
皮下投与に適した製剤は、好ましくは水性または実質的に水性の製剤として調製されう
る。前記製剤は、必要に応じて、このようなさらなる塩、保存料、および安定剤および／
または賦形剤またはアジュバントを含みうる。本発明の投与形態は、適当な水性媒体にす
ぐに製剤できる状態の無水の粉末として提供されてもよい。
このような投与形態を緩衝水性製剤（ｂｕｆｆｅｒｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ｆｏｒｍｕ
ｌａｔｉｏｎ）として製剤することが一般的に好ましい。適した緩衝溶液としては、特に
制限されないが、アミノ酸（例えばヒスチジン）、無機酸とアルカリ金属またはアルカリ
土類金属との塩（例えばナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、リチウム塩、また
はカルシウム塩、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなど）が挙げられる。浄化剤または
乳化剤（例えばＴｗｅｅｎ８０（登録商標）またはＴｗｅｅｎ（登録商標）の任意の他の
形態）などの他の成分が存在してもよく、安定剤（例えばベンズアミジンまたはベンズア
ミジン誘導体）、糖（例えばスクロース）などの賦形剤もまた存在しうる。ｐＨの適した
値は生理的ｐＨ、例えばｐＨ６．８〜７．４である。液体の投与形態は、このような投与
用ビヒクルにおいて使える状態に調製されうる。
「修飾された血液凝固因子」は、上記の１以上の修飾剤に結合した血液凝固因子である
。いくつかの実施形態において、修飾はＰＥＧである。ＰＥＧ分子は、直接的または間接
的に血液凝固因子に結合しうる。ＰＥＧ化血液凝固因子はまた、「ＰＥＧ分子に共役した
血液凝固因子」または「血液凝固因子−ＰＥＧ共役体」として定義されうる。
修飾された血液凝固因子は、好ましくは、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子
、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴ
ォン・ヴィレブランド因子およびプロテインＣの少なくとも１つを含む。いくつかの実施
形態において、血液凝固因子は、好ましくは第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ
因子である。
本明細書中で用いられる場合、「血液因子共役体」の用語は、ＰＥＧ部分、上記で定義
された他の共役部分などの修飾を含むように修飾された、血液凝固因子タンパク質を意味
する。
第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）および第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の用語はまた、特にこ
とわりのないかぎり、区別しないで用いられる。ＦＶＩＩＩは第ＶＩＩＩ因子の省略形と
して用いられ、ＦＩＸは第ＩＸ因子の省略形として用いられ、本明細書中に記載される血
液因子も同様である。
血液凝固因子は、任意の適当な源からであってよく、分子生物学的手法を用いた組み換
えＤＮＡ技術によって製造された組み換えタンパク質であってもよく、化学的に合成され
てもよく、または哺乳類の乳において遺伝子組み換えで製造されてもよく、または、前記
因子は天然の源から単離されてもよい（例えば血漿から精製される）。好ましくは、前記
因子は哺乳類の血液凝固因子、例えばヒト血液凝固因子である。血液凝固因子（ｂｌｏｏ
ｄ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）への言及は、血液凝固因子（ｂｌｏｏｄ ｃｏａ
ｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）を含む。
本明細書中に示されるように、本発明は、ポリエチレングリコールポリマー（「ＰＥＧ
化」）などの１以上の修飾剤との共役によって修飾された血液凝固因子の製剤に関する。
血液凝固因子の修飾は任意の便利な手段によるものであってよい。
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）は、現在、血液製品の製剤に広範に用いられている。Ｔｗｅｅ
ｎ（登録商標）８０は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）分子あたり約０．８キロダルトンのＰＥ
Ｇ当量の分子量を有するＰＥＧ化脂肪酸である。
上述のように、血液因子はすべて、とりわけ表面接着の特性により特徴づけられる。こ
れは、凝固カスケードの必要な特性であり、酵素および補因子が損傷部位においてカスケ
ードの他の関与物質に、血小板表面に、および組織に接着することを必要とする。実際に
、血液凝固（血栓）が損傷部位に残り、移動して危険な血栓症を引き起こさないことは特
に重要である。ＶＩＩａ、ＶＩＩＩおよびＩＸなどの血液因子は任意のガラスおよびプラ
スチック表面に過剰に接着するため、この性質は薬剤製品の製剤において課題を与える。
実際的な観点では、これはポリソルベート（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）の広範
な使用によって軽減される。
本発明の一実施形態において、ＦＶＩＩＩはこれに共役する２０ｋＤａの直鎖ポリエチ
レングリコール部分を有する。ＰＥＧの共役は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）のさらなる使用
が必要ない範囲まで、この因子の表面接着特性を軽減する。
凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）のプロセス中に活性化されると、ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ
は、依然として血小板の表面に接着し、全体の凝固プロセスにおいて小さな成分である。
この際、血液凝固（血栓）は、損傷部位で血小板上に正常に形成されるであろう。
モノ−ＰＥＧ化因子を有することによって、そして製剤においてさらなるＴｗｅｅｎ（
登録商標）の必要性をなくすことによって、ポリエチレングリコールの量の減少が達成さ
れうる。Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）ＦＳ（Ｂａｙｅｒ ＦＶＩＩＩ）を用いた計算は
、製剤に使用されるＦＶＩＩＩの１モルあたりのＰＥＧの総量を同定し、製剤にさらなる
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）を必要としない、単一の共役された２０ｋＤａの部分と比較する
ために行われた。したがって、ｄｏｓｅ−ｆｏｒ−ｄｏｓｅ基準では、本発明の一実施形
態はポリエチレングリコールの２５．８倍の減少を与え、これは、投与頻度の減少をも考
慮すると、ＰＥＧの投与において約８０倍の全体的な減少をもたらしうる。
本発明者らは、標的治療薬の水保持能力（ｗａｔｅｒ−ｃａｒｒｙｉｎｇ ｃａｐａｂ
ｉｌｉｔｙ）を増加させる（例えば生成物をモノ−ＰＥＧ化することに対して、ジ−ＰＥ
Ｇ化することによって）ことによって、皮下投与後の生成物の血流への通過が加速されう
ることを見出した。逆に、水保持能力を減少させることによって（例えば生成物をジ−Ｐ
ＥＧ化することに対して、モノ−ＰＥＧ化することによって）、皮下投与後の生成物の血
流への通過が遅くなり、貯蔵効果を与えうる。理論に拘束されることなく、より小さい水
保持能を有する（例えばモノ−ＰＥＧ化によって、またはより小さいＰＥＧ分子を用いて
）同じ生成物は、より大きい水保持能力を有するように修飾された（例えば、多−ＰＥＧ
化によって、またはより大きいＰＥＧ分子の結合によって）同じ生成物よりも、皮下腔を
通ってより長く分散されることに抵抗し、したがって高い貯蔵効果を与えるものと考えら
れる。
理論に拘束されることなく、生成物がより大きい水保持能力を有するように設計するこ
とによって（例えばジ−または多−ＰＥＧ化によって、ＰＥＧのサイズを増加させること
によって、または直鎖ＰＥＧ分子に対して分岐したものを用いることによって、ＰＥＧ被
覆を増加させることによって）、皮下腔内でより水分散性が高くなり、リンパ管を通って
血漿へ入る速度が速くなるものと考えられる；より小さい水保持特性を有するように設計
された生成物（例えばモノ−ＰＥＧ化によって、またはより小さいＰＥＧ分子の使用によ
って）の低減された親水性は、疎水性の治療薬のより多くを露出させたままにして、その
分散性を低下させ、水性リンパ系を通したその血漿への導入を遅くするものと考えられる
。
皮下投与のために、親水性と疎水性との間のバランスを選択的に調節することで分子の
分散特性を調節するこの能力は、皮下腔からリンパを通って血漿への生成物の制御放出に
わたって見事な制御の度合を与え、これは治療薬の特徴、患者の必要性および生理、これ
らの組み合わせ、または他の影響を与える因子にしたがって調節されうる。
いくつかの実施形態において、修飾がＰＥＧである場合、ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）は直鎖または分岐した構造を有してもよく、任意の便利な経路を介して治療薬に結
合しうる。治療薬がタンパク質、例えば、本明細書中に記載されるような血液凝固因子ま
たは治療用タンパク質である場合、ＰＥＧの共役は、天然タンパク質のセリンまたはトレ
オニン残基を介した、天然タンパク質に結合した糖残基上のヒドロキシル残基を介した、
または１以上のシステイン残基を介したものでありうる。ＰＥＧ部分は、天然または組み
換え型のタンパク質において生じるこのような残基を介して結合されてもよい。組み換え
発現によって作製されたタンパク質は、所望のアミノ酸残基をタンパク質配列に挿入する
ための、および／または特異的な（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）グリコシラーゼ酵素を用いてグリ
コシル化のパターンを制御するための、部位特異的なエンジニアリングを可能にする。Ｐ
ＥＧ化の他の経路としては、アミドまたはＮ−末端アミノ基ＰＥＧ化、カルボキシル基Ｐ
ＥＧ化がある。
ＰＥＧ部分はまた、１以上の還元されたシステインジスルフィド結合を介して血液凝固
因子、すなわち、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、
第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子
またはプロテインＣに共役しうる。遊離システイン残基は、タンパク質のシステインジス
ルフィド結合の還元によって生じる。例えば、前記共役は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因
子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第Ｘ
ＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインにおいてジスルフィド結合を
形成する２つのシステイン残基の硫黄残基に架橋するリンカー基によるものでありうる。
したがって、ジスルフィド結合は、天然のジスルフィド結合または組み換え技術によって
導入されたジスルフィド結合でありうる。
本発明の一実施形態において、ポリエチレングリコール鎖などの親水性部分は、通常は
血液凝固因子の本来の形態（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）におけるジスルフィド架橋を形成
する２つのシステイン残基の間の二価のリンカー部分を介して結合される。
ＰＥＧ分子は、任意の適当な分子量、例えば１ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１０〜５００ｋ
Ｄａ、適当には５〜３０ｋＤａまたは２０〜３０ｋＤａのものでありうる。いくつかの適
当な分子量としては、５、１０、２０または３０ｋＤａが挙げられる。適当には、ＰＥＧ
分子は５ｋＤａ〜４０ｋＤａでありうる。
第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第
ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテイ
ンＣとの共役体を形成するであろうポリエチレングリコールポリマーはいくつかの異なる
タイプがある。単一ポリエチレングリコール鎖を有する直鎖のＰＥＧポリマーがあり、分
岐鎖のまたは分岐した（ｍｕｌｔｉ−ａｒｍ）ＰＥＧポリマーがある。分岐鎖のポリエチ
レングリコールは、統一基（ｕｎｉｆｙｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）を介して一緒に結合する２
以上の別の直鎖のＰＥＧ鎖を含む。例えば、２個のＰＥＧポリマーがリジン残基によって
一緒に結合してもよい。一方の直鎖のＰＥＧ鎖がα−アミノ基に結合し、他方のＰＥＧ鎖
がε−アミノ基に結合する。リジンコアの残りのカルボキシル基は、タンパク質に共有結
合するために利用可能な状態で残っている。双方の直鎖及び分岐鎖のポリエチレングリコ
ールポリマーはある範囲の分子量で市販されている。
本発明の一実施形態において、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子
、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィ
レブランド因子またはプロテインＣ−共役体は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ
因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子
、ヴォン・ヴィレブランド因子およびプロテインＣに結合する１以上の直鎖ポリエチレン
グリコールポリマーを含む。いくつかの実施形態において、血液凝固因子は、第ＩＩＩ因
子、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子であり、ここで各ＰＥＧは約２ｋＤａ〜約１００ｋ
Ｄａの分子量を有する。本発明の他の形態において、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第
ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ
因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣ−共役体は、第ＶＩＩ因子、第Ｖ
ＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因
子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣに結合する１以上
の直鎖ポリエチレングリコールポリマーを含み、ここで各直鎖ＰＥＧは約１ｋＤａ〜約４
０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態において、各直鎖ＰＥＧは、約１０ｋＤａ〜
約３０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態において、各直鎖ＰＥＧは約２０ｋＤａ
の分子量を有する。特定の実施形態において、各直鎖ＰＥＧは約１０ｋＤａの分子量を有
する。特定の実施形態においては、各直鎖ＰＥＧは１０ｋＤａ未満の分子量を有する。特
定の実施形態において、血液因子共役体は、血液凝固因子に結合した２以上の直鎖ＰＥＧ
ポリマー、例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子
、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因
子またはプロテインＣに結合した、２、３、または８までの直鎖ＰＥＧポリマーを含む。
いくつかの実施形態において、血液因子共役体は、複数の直鎖ＰＥＧポリマーを含み、各
直鎖ＰＥＧは約５〜３０ｋＤａの分子量を有する。
本発明の血液因子共役体は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、
第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレ
ブランド因子またはプロテインＣに結合する１以上の分岐ＰＥＧポリマーを含んでもよく
、ここで各分岐ＰＥＧは約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する。本発明の他の形
態において、血液因子共役体は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子
、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィ
レブランド因子またはプロテインＣに結合する１以上の分岐ポリエチレングリコールポリ
マーを含み、ここで各分岐ＰＥＧは約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する。特定
の実施形態において、各分岐ＰＥＧは、約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有する。特
定の実施形態において、各分岐ＰＥＧは約１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、または約３０ｋＤａ
の分子量を有する。特定の実施形態において、各分岐ＰＥＧは約１０ｋＤａ未満の分子量
を有する。特定の実施形態において、血液因子共役体は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子
、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩ
ＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣに結合した２以上の分岐ＰＥ
Ｇポリマー、例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因
子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド
因子またはプロテインＣに結合した、２、３、または８までの分岐ＰＥＧポリマーを含む
。いくつかの実施形態において、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子
、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィ
レブランド因子またはプロテインＣ−ＰＥＧ共役体は、８までの分岐ＰＥＧポリマーを含
み、各分岐ＰＥＧは約５〜４０ｋＤａ、好ましくは１０〜３０ｋＤａの分子量を有する。
血液因子−ＰＥＧ共役体は、以下に制限されないが、イオン交換クロマトグラフィー及
びサイズ排除クロマトグラフィー等の当該分野において既知のクロマトグラフィー方法、
アフィニティクロマトグラフィー、沈殿および膜を用いた分離（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂａ
ｓｅｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）によって精製されてもよい。
好ましくは、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第
ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子ま
たはプロテインＣ−共役体のＰＥＧ部分は、２個のシステイン残基に結合してもよく、こ
れにより血液凝固因子にジスルフィド結合を形成する。ゆえに、リンカーを含むＰＥＧは
ジスルフィド結合を架橋する。このような共役方法の例は、ＷＯ２００５／００７１９７
、ＷＯ２００９／０４７５００及びＷＯ２０１０／０１０３２４に記載される。
上述のように、PEG化の他の経路としては、Stennicke et al (Thromb. Haemost. 2008,
100(5), 920-8)に記載される標準的なｇｌｙｃｏＰＥＧ化の手順、またはＵＳ５６４４
０２９に記載されるＮ−末端アミドＰＥＧ化がある。
本発明の一実施形態において、ＰＥＧ部分は、図２に示すスキームに従って第ＶＩＩ因
子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子
、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣに共役し
うる。図２中、基Ｒ１はＰＥＧ部分および血液因子分子上のジスルフィド結合の硫黄原子
を結ぶリンカー基の間に示される。
Ｒ１は、直接結合、アルキレン基（好ましくはＣ１−１０アルキレン基）、または置換
されてもよいアリール基もしくはヘテロアリール基でありうる置換基であり；この際、ア
リール基としては、フェニル基、ベンゾイル基およびナフチル基があり；適当なヘテロア
リール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、
オキサゾール、ピリダジン、ピリミジンおよびプリンがあり；ポリマーへの連結は、加水
分解により不安定になる結合（ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｌａｂｉｌｅ ｂｏｎｄ
）による、または安定な結合（ｎｏｎｌａｂｉｌｅ ｂｏｎｄ）によるものでありうる。
置換されてもよいアリール基またはヘテロアリール基に存在しうる特定の置換基として
は、例えば、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−Ｏ
Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲ
ＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ’ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ
＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ’ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２、
−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン、例えば、フッ素または塩素、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２及び１
３Ｃ＝ＣＨＲ（この際、ＲまたはＲ’はそれぞれ独立して、水素原子またはアルキル基（
好ましくはＣ１−６）またはアリール（好ましくはフェニル）基を表す）から選択される
１以上の同一または異なる置換基が挙げられる。電子求引性置換基の存在が特に好ましい
。一実施形態においては、Ｒ１の置換されてもよいアリール基またはヘテロアリール基と
しては、Ｒ１ユニットをＰＥＧ部分に連結するアミド（ＮＨＣＯ）基で置換されたアリー
ル基またはヘテロアリール基がある。
ゆえに、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ
因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子または
プロテインＣのシステイン残基間のもとのジスルフィド結合の２個の硫黄原子間のリンカ
ー基は、３−炭素架橋を有していてもよい。一実施形態において、第ＶＩＩ因子、第ＶＩ
ＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子
、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣのシステイン残基間
のもとのジスルフィド結合の２個の硫黄原子間のリンカー基は、（ＣＨ２）２ＣＨＣ（Ｏ
）−である。
本発明の一実施形態において、ＰＥＧ部分は上記したようにして共役してもよく、この
際、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、
第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテ
インＣがＰＥＧ部分に共役してなる組成物は下記構造を有する：
式中、Ｒ１は、上記で定義した通りであり、「Ｆａｃｔｏｒ」は血液凝固因子を表す。
上記と同様の定義のＲ１における置換されてもよいアリール基またはヘテロアリール基
がアミド（ＮＨＣＯ）基によって置換されたアリール基またはヘテロアリール基を含む実
施形態においては、Ｒ３が下記のように定義される共役タンパク質の構造は、下記の通り
でありうる：
Ｒ３は、直接結合、アルキレン基（好ましくはＣ１−１０アルキレン基）、または置換
されてもよいアリール基もしくはヘテロアリール基であってもよい置換基を表し；この際
、アリール基としては、フェニル基、ベンゾイル基及びナフチル基があり；適当なヘテロ
アリール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール
、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンがあり；ポリマーへの連結は、加水
分解により不安定になる結合（ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｌａｂｉｌｅ ｂｏｎｄ
）による、または安定な結合（ｎｏｎ−ｌａｂｉｌｅ ｂｏｎｄ）によるものであり、「
Ｆａｃｔｏｒ」は、血液凝固因子を表す。
置換されてもよいアリール基またはヘテロアリール基に存在しうる特定の置換基として
は、例えば、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−Ｏ
Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲ
ＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ’ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ
＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ’ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２、
−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン、例えば、フッ素または塩素、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２及び１
３Ｃ＝ＣＨＲ（この際、ＲまたはＲ’はそれぞれ独立して、水素原子またはアルキル（好
ましくはＣ１−６）基またはアリール（好ましくはフェニル）基を表す）から選択される
１以上の同一または異なる置換基が挙げられる。電子求引性置換基の存在が特に好ましい
。
いくつかの実施形態において、本発明の投与形態は、ポリエチレングリコール分子が直
鎖（好ましくは単分散）形態である、本明細書中で定義される血液凝固因子のＰＥＧ化形
態から構成されうる。ＰＥＧは、３つの炭素架橋部分を介して血液凝固因子に共役されて
もよい。例えば、ＰＥＧは１〜１００ｋＤａであり；いくつかの実施形態において、５〜
３０ｋＤａであり；いくつかの実施形態において、１０ｋＤａであり、他の実施形態にお
いて２０ｋＤａでありうる。
前記投与形態は、皮下投与のために、適当な水性ビヒクル中での製剤によって調製され
うる。ほとんどの実施形態において、適当な水溶液は、生理的ｐＨ（例えばｐＨ６．８）
に、１以上のアミノ酸および／または塩（例えばヒスチジンおよびＮａＣｌ）を含む組成
物を用いて、ノニオン系界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）および任意で
安定剤（例えばベンズアミジンまたはベンズアミジン誘導体、例えばＵＳ７６１２０６６
を参照）の存在下で緩衝される。
本発明によって用いられうるノニオン系界面活性剤／乳化剤としては、ポリオキシエチ
レンソルビタンオレイン酸モノエステル（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）
８０）、ポリソルベート６５、ポリソルベート６５、ポリソルベート６１、ポリソルベー
ト６０、ポリソルベート４０、ポリソルベート２１、ポリソルベート２０、ポリソルベー
ト８１、ポリソルベート８５およびポリソルベート１２０などのポリソルベート、ならび
にステアリン酸ポリオキシル８（ＰＥＧ４００モノステアレート）、ステアリン酸ポリオ
キシル２、ステアリン酸ポリオキシル４、ステアリン酸ポリオキシル６、ステアリン酸ポ
リオキシル１２、ステアリン酸ポリオキシル２０、ステアリン酸ポリオキシル３０、ステ
アリン酸ポリオキシル４０、ステアリン酸ポリオキシル５０、ステアリン酸ポリオキシル
１００、ステアリン酸ポリオキシル１５０、およびジステアリン酸ポリオキシル４、ジス
テアリン酸ポリオキシル８、ジステアリン酸ポリオキシル１２、ジステアリン酸ポリオキ
シル３２、ジステアリン酸ポリオキシル１５０などのステアリン酸ポリオキシエチレンが
ある。
組成物中の成分の適した濃度範囲は、例えば、５ｍＭ〜２５ｍＭのヒスチジン（好まし
くは１０ｍＭ〜１５ｍＭのヒスチジン）、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＮａＣｌ（好ましくは３
０ｍＭ〜４０ｍＭのＮａＣｌ）および０．００１〜０．０１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）
８０（好ましくは０．００５％〜０．００８％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）および任
意で０．５ｍＭ〜５ｍＭのベンズアミジン（好ましくは１ｍＭ〜２ｍＭのベンズアミジン
）でありうる。
本明細書中で使用される、「突然変異タンパク質(mutein)」ということばは、もとの血
液因子と比較して得られた産物の活性を顕著に変化させることなく、第ＶＩＩ因子、第Ｖ
ＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因
子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣの天然成分の１以
上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基に置換される、または欠失する、あるいは１以上
のアミノ酸残基が血液因子のもとの配列に付加する、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第
ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ
因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣの類似体を意味する。これらの突
然変異タンパク質は、既知の合成法によっておよび／または部位特異的突然変異誘発技術
によって、または上記に適切な他の既知の技術によって調製される。
本発明に係る突然変異タンパク質は、ストリンジェントな条件下で、本発明に係る、第
ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩ
Ｉａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣ
をコード化する、ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の、
核酸によってコード化されるタンパク質を包含する。「ストリンジェントな条件」という
用語は、ハイブリッド形成及び次の洗浄条件を意味し、当業者はこれを従来「ストリンジ
ェント」と称する（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．
，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ６３ ａｎｄ ６．４（１９８７，１９９２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ
（１９８９））。
特に制限されるものではないが、ストリンジェントな条件の例としては、研究対象のハ
イブリッドの計算上のＴｍより１２〜２０℃低い洗浄条件、例えば、５分間、２×ＳＳＣ
及び０．５％ＳＤＳ、１５分間、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ；３７℃で３０〜６０分
間、０．１倍ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳおよびその後６８℃で３０〜６０分間、０．１×
ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中での洗浄条件がある。当業者は、ストリンジェントな条件は
、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基等）またはオリゴヌクレオ
チドプローブ混合物の長さによっても異なることは理解している。プローブ混合物を使用
する場合には、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）を使用
することが好ましい。
任意のこのような突然変異タンパク質は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子
、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴ
ォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣと実質的に同様の活性、またはより高い活
性を有するように、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子
、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因
子またはプロテインＣの配列と十分重複したアミノ酸配列を有することが好ましい。
第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第
ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテイ
ンＣの特徴的な活性の一つとしては、血液凝固カスケードへの参加能があり、第ＶＩＩ因
子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子
、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣを検出す
るためのアッセイは本明細書に記載される。突然変異タンパク質がかなりの血液因子活性
を有する限り、これは血液因子と実質的に同様の活性を有すると考えられうる。ゆえに、
このような突然変異タンパク質を本明細書に記載されるアッセイにかけることを有する定
常的な実験によって、所定の突然変異タンパク質が少なくとも実質的に第ＶＩＩ因子、第
ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ
因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣと同じ活性を有
するかどうかを決定できる。
好ましい実施形態においては、任意のこのような突然変異タンパク質は、第ＶＩＩ因子
、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、
第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣのアミノ酸
配列と少なくとも４０％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ
）を有する。より好ましくは、これと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも
７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、９８％若
しくは９９％の同一性または相同性を有する。
同一性は、配列を比較することによって決定される、２以上のポリペプチド配列または
２以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。通常、同一性は、比較する配列の長
さにわたって、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の正確
なヌクレオチド−ヌクレオチドまたはアミノ酸−アミノ酸の対応（ｅｘａｃｔ ｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｏｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｏ ａｍ
ｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）を意味する。
正確な対応が存在しない配列では、「同一性（％）」が測定される。通常、比較される
２つの配列を、配列間に最大の相関性があるように並べる。これは、アライメントの度合
いを上げるために、１つまたは２つの配列中に「ギャップ」を挿入することを含んでもよ
い。同一性（％）は、比較されるそれぞれの配列の全長にわたって測定されてもよく（い
わゆる、グローバルアライメント）、これは同じまたは非常に同様の長さの配列に特に適
切である、またはより短い所定の長さにわたって測定されてもよく（いわゆる、ローカル
アライメント）、これは長さが異なる配列により適切である。
２以上の配列の同一性または相同性を比較する方法は当該分野において既知である。ゆ
えに、例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux, et al.
, Nucleic acids Research, 12: 387 (1984))で利用できるプログラム、例えば、プログ
ラムＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰを用いて、２つのポリヌクレオチド間の同一性（％）なら
びに２つのポリペプチド配列間の同一性（％）および相同性（％）を決定してもよい。Ｂ
ＥＳＴＦＩＴは、Smith and Waterman (Advances in Applied Mathematics, 2; 482-489
(1981))の「ローカルホモロジー（ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」アルゴリズムを使
用し、２つの配列間で類似する最も良好な単一の領域を見出す。配列間の同一性および／
または類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を決定する他のプログラムもまた当該分野におい
て既知であり、例えば、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム(Atschul et al., J. Molec.
Biol., 215: 403 (1990), www.ncbi.nlm.nih.govのNCBIのホームページでアクセス可能)
およびＦＡＳＴＡ(Pearson W R, Methods in Enzymology, 183: 63-98 (1990))がある。
本発明に従って使用できる第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第
Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブ
ランド因子またはプロテインＣの突然変異タンパク質としては、本明細書に提示される示
唆や助言に基づいて、過度の実験を必要とすることなく、当業者によって定常的に得られ
る置換ペプチドとして実質的に相当する配列の有限なセットがある。
本発明に係る突然変異タンパク質の好ましい変更は、「同類」置換（“ｃｏｎｓｅｒｖ
ａｔｉｖｅ”ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）として知られているものである。第ＶＩＩ因子
、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、
第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣの同類アミ
ノ酸置換は、グループのメンバー間の置換が分子の生物学的機能を保存するような十分に
同様の物理化学的特性を有するグループ内の同義的アミノ酸を含む。アミノ酸の挿入及び
欠失はまた、特に挿入または欠失が数個のアミノ酸だけ、例えば、３０個以下、好ましく
は１０個以下を含み、機能的な立体配置（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ）に重要なアミノ酸、例えば、システイン残基を除去または置換（ｄｉｓｐｌａｃｅ
）しない場合には、その機能を変えることなく上記配列中でなされてもよいことは明らか
である。このような欠失および／または挿入によって生産されたタンパク質及び突然変異
タンパク質は本発明の範囲に含まれる。
ゆえに、アミノ酸であるグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは、
しばしば他のアミノ酸（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）に置換されてもよい。これらの可
能性のある置換のうち、（比較的短い側鎖を有するので）グリシン及びアラニンを相互に
置換しあって使用すること、および（疎水性のより大きな脂肪族側鎖を有するため）バリ
ン、ロイシン及びイソロイシンを相互に置換しあって使用することが好ましい。しばしば
相互に置換しあうことができる他のアミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシン及び
トリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リジン、アルギニン及びヒスチジン（
塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩（酸性側鎖を有す
るアミノ酸）；アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）ならびにシ
ステイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）がある。このような置換は、
しばしば、「同類」または「半同類」アミノ酸置換と称する。本発明の融合タンパク質の
配列に対するアミノ酸変更は、適当な技術を用いることによって、例えば、部位特異的突
然変異誘発を用いることによって、なされうる。
本発明の範囲に含まれるアミノ酸置換または挿入が天然のまたは非天然のアミノ酸を用
いてできることは理解されるべきである。天然のまたは合成アミノ酸を使用するか否かに
かかわらず、Ｌ−アミノ酸のみが存在することが好ましい。
加えて、他のペプチドまたはタンパク質断片と融合した、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因
子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第Ｘ
ＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣを有する融合タンパク質は
また、融合タンパク質が第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ
因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブラン
ド因子またはプロテインＣの活性を保持する場合には使用されてもよい。本明細書におけ
る「融合タンパク質」ということばは、一般的な意味では、水素結合または塩架橋（ｓａ
ｌｔ ｂｒｉｄｇｅ）等の化学的な手段によって、またはタンパク質合成を介したペプチ
ド結合によってまたは双方によって、１以上のタンパク質が一緒に結合していることを意
味する。
本明細書中で使用される「機能的誘導体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖ
ｅ）」ということばは、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ
因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブラン
ド因子またはプロテインＣの誘導体、及びこれらの突然変異タンパク質を包含し、これら
は、当該分野において既知の手段によって、残基の側鎖として生じるまたはＮ−若しくは
Ｃ−末端基への付加である官能基から調製されてもよく、製薬上許容できる限り、即ち、
血液因子の活性と実質的に同等であるタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物に
毒性を付与しない限り、本発明に包含される。
これらの誘導体としては、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアとの
または第１級若しくは第２級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分
（例えば、アルカノイル基またはカルボキシルアロイル（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｒｏ
ｙｌ）基）を用いて形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体または例
えば、使用できるヒドロキシル残基のグリコシル化等の、アシル部分を用いて形成される
遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（例えば、セリルまたはトレオニル残基の誘導体
）がある。
本発明に係る「血液因子の活性断片」は、本明細書に定義されるような第ＶＩＩ因子、
第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第
Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣの断片または
突然変異タンパク質であってもよい。断片ということばは、分子のサブセット、即ち、所
望の生物学的活性を保持するより短いペプチドを意味する。断片は、血液因子分子のいず
れかの末端からアミノ酸を除去し、得られた断片について本明細書に記載される性質を試
験することによって容易に調製されうる。ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端のいず
れかから一度に１個のアミノ酸を除去するためのプロテアーゼは知られており、所望の生
物学的活性を保持する、断片を決定することは、定常的な実験のみを含む。
第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第
ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテイ
ンＣの活性画分、その突然変異タンパク質及び活性断片として、本発明は当該画分が第Ｖ
ＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩ
ａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣと
実質的に同等の活性を有する場合には、タンパク質分子のポリペプチド鎖の断片若しくは
前駆体単独、または前記タンパク質分子のポリペプチド鎖の断片若しくは前駆体がこれに
連結した分子若しくは残基、例えば、糖またはホスフェート残基と会合したもの、または
タンパク質分子の凝集体若しくは糖残基それ自体をさらに包含する。
本明細書における「塩」ということばは、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子
、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴ
ォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣ分子またはその類似体のカルボキシル基の
塩およびアミノ基の酸付加塩の双方を意味する。カルボキシル基の塩は、当該分野におい
て既知の手段によって形成され、無機塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウ
ム、鉄または亜鉛塩など、および例えば、トリエタノールアミン等のアミン、アルギニン
またはリジン、ピペリジン、プロカイン等により形成される塩等の有機塩基との塩が挙げ
られる。酸付加塩としては、例えば、鉱酸、例えば、塩酸または硫酸との塩、および有機
酸、例えば、酢酸またはシュウ酸との塩が挙げられる。いうまでもなく、このような塩は
、本明細書に記載される血液因子の生物学的活性を保持している必要がある。
患者に治療薬を投与する際の本明細書で使用される「濃度曲線下面積（ａｒｅａ ｕｎ
ｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）」または「ＡＵＣ」は、０から無限大の時間の関数として
の患者の体循環での薬剤の濃度を記載する濃度曲線下の全面積として定義される。本明細
書中で使用される、「クリアランス」または「腎クリアランス」ということばは、１分あ
たりに排出される一定量の薬剤を含む血漿の容積として定義される。
患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される、「半減期」または「ｔ
１／２」ということばは、患者の薬剤の血漿濃度が半分に減少するのに必要な時間として
定義される。複数のクリアランスメカニズム、再分配、及び当該分野において既知の他の
メカニズムによってペプチド薬剤と関連する２以上の半減期を有する場合がある。一般的
に、アルファ相半減期（ａｌｐｈａ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）及びベータ相半減期（ｂｅｔ
ａ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）は、アルファ相が再分配に関連し、ベータ相がクリアランスに
関連するように規定される。しかしながら、ほとんどで、血流に限定されるタンパク質薬
剤では、少なくとも２種のクリアランス半減期が存在しうる。アルファ相半減期及びベー
タ相半減期へのＰＥＧ化の正確な影響は、当該分野において既知であるように、大きさ及
び他のパラメーターによって変化するであろう。「半減期」のさらなる説明は、Pharmace
utical Biotechnology (1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publish
ers, Amsterdam, pp 101-120)に見出される。
患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される、「滞留時間（ｒｅｓｉ
ｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ）」ということばは、薬剤が投薬後に患者の体内にとどまる平均時
間として定義される。
患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される、「免疫原性」というこ
とばは、投薬後、または繰り返し投薬後の、そのペプチド薬剤の患者の免疫応答の誘発し
やすさとして定義される。
本明細書中、「分子次元（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）」の用語は、
薬剤の重量、サイズおよび／または形状を意味する。したがって、「修飾によって分子次
元を増加させる」は、薬剤の物理的なサイズが血管壁を通って血流に入るには大きすぎる
程度に、分子次元が大きくなることを意味する。しかしながら、分子次元は、例えば薬剤
が修飾の前に切断された場合、必ずしも分子量の増加を意味しない。分子次元は、修飾さ
れた薬剤が活性を保ち、リンパ系によって送達されることなく直接血管に入らなければ、
分子／重量、サイズおよび／またはコンフォメーションを含みうる。
本明細書中、「皮下送達」または「皮下投与」の用語は、治療薬が皮膚を通って皮下腔
に直接送達されるような任意の適当な手段による送達を意味する。
本明細書中、「投与量調節された」は、修飾された薬剤の皮下投与量の関連では、静脈
内Ｃｍａｘ／皮下Ｃｍａｘの割合を乗じた、修飾された薬剤の静脈内投与量を意味する。
本明細書中で説明されるように、本発明の方法は、静脈内投与された未修飾または修飾さ
れた薬剤と比較して、頻度の低い投与および／または高い投与量を患者に与えることを可
能にする。「投与量調節されていない」は、皮下投与量の関連では、修飾された薬剤の静
脈内の同じ投与量が、静脈内に送達される場合のように送達されることを意味する。
本明細書中で使用される「皮下腔」の用語は、皮膚の下の結合組織を意味する。これは
血管、血流および内臓を除く。
「本来の状態（ｎａｔｉｖｅ ｓｔａｔｅ）」は、修飾の前に薬剤が存在する状態を意
味し、この状態において、製薬上許容される形態で患者に通常静脈内投与される。
本発明の皮下投与形態は、製薬上許容される希釈剤、アジュバントまたは担体をさらに
含んでもよい。皮下投与に適した皮下投与形態としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤及び
前記製剤を対象となるレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含んでもよい水性
および／または非水性滅菌注射溶液；ならびに懸濁化剤及び増粘剤を含んでもよい水性お
よび非水性滅菌懸濁液が挙げられる。注射可能溶液に使用されうる賦形剤としては、例え
ば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油が挙げられる。本組成物は、１
回投与用（ｕｎｉｔ−ｄｏｓｅ）または複数回投与用（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ）容器、例
えば、密閉アンプル及びバイアル瓶に入れられてもよく、また、使用する直前に、滅菌液
、例えば、注射用水を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵されて
もよい。即席の注射溶液及び懸濁液を滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製してもよい。
一般に、皮下投与形態は、保存剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、塩（
本発明の活性物質はそれ自体が製薬上許容される塩の形態で提供されてもよい）、緩衝液
、または抗酸化剤を含みうる。本皮下投与形態はまた、本発明の物質に加えて治療上活性
のある薬剤を含んでもよい。本発明の皮下投与形態は、製薬上許容される希釈剤、アジュ
バントまたは担体と組み合わせて用いられうる。このような賦形剤としては、特に制限さ
れないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水など）、デキストロース
、リポソーム、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられる
。
本明細書中に記載される皮下投与形態の皮下投与は、患者の疾患の治療に有効な、任意
の有効な、便利な方法で行われうる。投与形態は液体の形態であっても固体の形態であっ
てもよい。液体の形態は、使える状態であってもよく、または、濃縮物として調製され、
その後、皮下投与の前に希釈されてもよい。固体の形態は、適切に、皮下投与のための適
当な投与用ビヒクルに再構成されてもよい。治療でまたは予防として、活性薬剤を、注射
可能な組成物として、例えば、滅菌水性分散液、好ましくは等張液として患者に投与して
もよい。
本発明のさらなる形態によれば、１か月に１回１以下の皮下投与のための、修飾された
血液凝固因子の液体の投与形態であって、前記投与形態は、Ｃｍａｘが、修飾された血液
因子の静脈内投与によって達成されるＣｍａｘの少なくとも１０％であり、９０％以下で
ある、血液凝固障害の治療における使用のための、投与形態が提供される。
本発明のこの形態はまた、本明細書中で定義される修飾された血液凝固因子の投与形態
を血液凝固疾患（ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）または外傷（ｔｒａ
ｕｍａ）を治療する必要のある患者に皮下投与することを有する、患者の血液凝固疾患ま
たは外傷の治療方法を含む。
したがって、本発明はまた、修飾された血液凝固因子の、患者における血液凝固障害の
治療のための、本明細書中に定義される投与形態を含む薬剤の作製における使用であって
、前記薬剤が皮下投与のためのものであり、Ｃｍａｘが、修飾された血液因子の静脈内投
与によって達成されるＣｍａｘの少なくとも１０％であり、９０％以下である、使用を提
供する。好ましくは、Ｃｍａｘは２０〜８０％、または３０〜７０％、または４０〜６０
％である。一実施形態において、Ｃｍａｘは７５〜８０％であり血液因子はＦＶＩＩであ
りうる。他の実施形態において、Ｃｍａｘは１０〜２５％であり血液因子はＦＶＩＩＩで
ありうる。さらに他の実施形態において、Ｃｍａｘは４０〜６０％であり血液因子はＦＩ
Ｘでありうる。
血液凝固疾患または血液凝固障害は、血液凝固因子の機能の損失（ｌｏｓｓ）または自
己抗体の生成によって特徴づけられうる。血液凝固疾患の例としては、血友病Ａおよび血
友病Ｂがある。
第ＶＩＩａ因子は、血友病ＡまたはＢにおける出血症状（ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｅｐｉｓ
ｏｄｅｓ）の治療、または、ＦＶＩＩＩもしくはＩＸのそれぞれに対する抑制抗体を発症
した患者の治療において用いられうる。第ＶＩＩＩ因子は血友病Ａの患者の出血症状の治
療に用いられ、第ＩＸ因子は血友病Ｂの患者の治療に用いられうる。
本明細書中で使用される、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」ということばは、ヒトまた
は非ヒト哺乳類に有益でありうるいずれのレジメをも包含する。「非ヒト哺乳類」の治療
は、ウマ及びコンパニオンアニマル（例えば、ネコやイヌ）ならびにヒツジ、ヤギ、ブタ
、ウシ及びウマ科の動物等の農場／農業動物（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｉｍａｌ
）などの、家畜哺乳類の治療にまで拡張される。治療は、現存の症状または疾患について
行われても、または予防（予防的治療）を目的としてもよい。治療は、遺伝病または後天
的な疾患に対してであってよい。治療は、急性または慢性の症状に対してであってよい。
本発明の皮下投与形態は、単独で、または、治療用化合物もしくは分子などの他の化合
物（例えば、抗炎症剤、鎮痛剤または抗生物質、または第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、
第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩ
Ｉ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子もしくはプロテインＣの活性を促進しうる、または
高めうる他の製薬上活性な薬剤、例えば別の血液凝固因子）と併用して用いられうる。こ
のような他の化合物との投与は、同時であっても、別々であっても、連続であってもよい
。これらの成分は、必要に応じて指示書を含むキットの形態で調製されてもよい。
血液凝固カスケードにおける活性のレベルは、任意の適当なアッセイ、例えば全血凝固
時間（ＷＢＣＴ）試験または活性化部分トロンボプラスチン時間（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ
Ｐａｒｔｉａｌ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ Ｔｉｍｅ）（ＡＰＴＴ）によって測定
されうる。
全血凝固時間（ＷＢＣＴ）試験は、外部環境、通常はガラス管またはディッシュで、全
血が凝固を形成するのにかかる時間を測定する。
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）試験は、血液凝固（ｂｌｏｏｄ ｃｌ
ｏｔｔｉｎｇ）経路の一部のパラメータを測定する。これは血友病で、および静脈内ヘパ
リン療法によって、異常に上昇する。ＡＰＴＴは、静脈から数ｍｌの血液を必要とする。
ＡＰＴＴ時間は、「内因性経路」として知られる凝固系の一部の指標である。ＡＰＴＴ値
は、実験室での試験において、特定の凝固プロセスが生じる時間（秒）である。この結果
は、常に、正常な血液の「対照」試料と比較される。試験試料が対照試料よりも長く時間
がかかった場合、内因性経路の凝固機能の低下を意味する。一般的な薬物療法では、通常
、４５〜７０秒のオーダーのＡＰＴＴの範囲を目標にするが、この値は正常に対する試験
の比（例えば正常の１．５倍）としても表されうる。ヘパリン治療をせずにＡＰＴＴが高
い場合は血友病による可能性があり、さらに試験する必要がある。
本発明はまた、本発明の皮下投与形態、および皮下投与用注射可能溶液を含む投与用ビ
ヒクルを含む部品のキットを提供し、前記キットは、好ましくはこれを使用するための指
示書を含む。
本発明の一実施形態において、修飾された血液凝固因子（好ましくは、第ＶＩＩ因子、
第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第
Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子またはプロテインＣ）の薬剤組成
物の皮下投与のための投与形態であって、患者への皮下投与のために製剤されたとき、前
記患者の全血凝固時間を１５分未満に維持するのに十分な、１か月に１回以下の投与形態
を与える、投与形態が提供される。前記投与形態は、好ましくは、静脈内投与されるとき
の等価参照（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）投与形態と比べて少なくとも
１０％であり、９０％以下であるＣｍａｘを有しうる。
したがって、本発明は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘ
ａ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブラ
ンド因子またはプロテインＣから選択される修飾された血液凝固因子を含む、皮下投与の
ための薬剤組成物の投与形態であって、患者への皮下投与のために製剤されたとき、前記
患者の全血凝固時間を１２分未満に維持するのに十分な、１か月に１回以下の投与形態を
与える、投与形態を提供する。
したがって、本発明の一実施形態において、１週間に１回以下の、皮下投与のための、
第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子からなる群から選択されるＰＥＧ化血
液凝固因子２５〜５０ＩＵ／ｋｇの薬剤組成物の投与形態が提供される。
本発明の液体の投与形態は、１か月に１回１以下の皮下投与のための、本明細書中に定
義される修飾された血液凝固因子を含み、血液凝固障害の治療における使用のための前記
投与形態は、少なくとも１０％であり、９０％以下であるＣｍａｘを有する。
このような組成物は、本発明に係る血液凝固因子の投与形態を血液凝固疾患（ｂｌｏｏ
ｄ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）または外傷（ｔｒａｕｍａ）を治療する必要の
ある患者に皮下投与することを有する、患者の血液凝固疾患または外傷の治療方法におい
て特に有用でありうる。
本発明の投与形態は、皮下投与されると、循環滴定濃度および凝固活性の両方において
、静脈内投与されたときの、それぞれの修飾された類似体の血液凝固因子のレベルと同等
のバイオアベイラビリティおよび有効性を有する。
本発明の他の実施形態において、本明細書中で定義された、直鎖単分散ポリエチレング
リコール分子が３つの炭素架橋を介してタンパク質の単一のジスルフィド結合に修飾され
た、血液凝固因子を含む、皮下投与のための投与形態が提供される。
本発明の液体の投与形態は、生理的に緩衝化された水溶液中で、ノニオン系界面活性剤
および任意で安定剤の存在下でＰＥＧ−共役血液凝固因子を製剤することによって調製さ
れうる。
本発明の第２のまたはそれに続く形態の好ましい特徴は、適宜変更して、本発明の第１
の形態と同様である。
本発明に係る修飾された薬剤の製品インパクトは、静脈内に送達された同様に修飾され
た薬剤よりも優れていることがわかった。製品インパクトは、例えば、ＷＢＣＴにおける
改善として定義されうる。これは、特定の時点でのＷＢＣＴで割った初期のＷＢＣＴとし
て定義される。この方法を用いると、皮下送達された修飾された血液凝固薬は、一貫して
、同じ時点で静脈内に送達された同じ製品よりも高い製品インパクトを示す。
本発明によれば、例えば生体適合性ポリマーの付加によって修飾された治療薬の皮下投
与から生じる免疫応答は低い。この効果は、薬剤製剤投与の分野の当業者によって本発明
以前に予測されたものと正反対である。例えば、血液因子製剤の分野では、未修飾の血液
因子の皮下投与は、免疫原性応答（ＦＶＩＩＩ阻害剤の生成）を刺激する、または存在す
るＦＶＩＩＩ阻害剤の集団によって免疫応答を引き起こすと予測されるということが一般
に受け入れられていた。
血液凝固因子に対する相対的な免疫応答は、ベセスダ単位で測定されうる。ベセスダ単
位（ＢＵ）は、血液凝固阻害剤の活性の指標である。Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｅｍｏｓ
ｔａｓｉｓによれば、１ベセスダ単位（Ｂｕ）は、３７℃で２時間培養した後、正常な血
漿中の第ＶＩＩＩ：Ｃ因子の１ユニットの５０％を中和する、血漿試料中の阻害剤の量と
して定義される（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｈａｒｏｌｄ Ｒｏｂｅｒｔ（２０００）．Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｉｎｆｏｒｍａ
Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，ｐ．５８３）。
本発明において、非常に驚くべき結果が見出された。免疫（阻害剤）応答の発生を低下
させるために、免疫応答のレベルが全身曝露のレベルに直接関連する皮下投与を採用する
ことが提案された。皮下送達を提供することによって、Ｃｍａｘが大幅に低下し、そうす
ることで免疫応答が低下した。
一例として、本発明は、ＰＥＧなどのポリマーに共役したとき、血液因子にみられる驚
くべき貯蔵効果について述べる。さらに、この結果は、ＰＥＧのサイズ（または量）から
タンパク質上に与えられる水和のレベルを操作することによって、皮下腔から血液因子が
利用できるようになる速度を設計することが可能であることを示す。
本願に示された結果から、１つのポリマー鎖によって修飾された治療薬では、このよう
な薬剤は、２つのポリマー鎖が付加した対応するジ−共役した形態よりも、血漿中に入る
速度が遅いことがわかる。
つまり、モノ−共役生成物は、ジ−共役生成物と比較して、タンパク質のより多くが露
出しているように思われる。この状況は、より高次の共役形態は、より水分散性が高くな
り、したがって、リンパ管を通って血漿へ入る速度が速くなることを意味する。
したがって、驚くべきことに、デポー放出の最長の持続時間を達成するためには、より
少ない程度の修飾が必要とされることがわかった。理論によって拘束されることなく、こ
れは、より少ない程度の修飾によって治療薬の一部が皮下組織にさらされ、これによって
リンパを通した拡散の速度が遅くなる、ということで説明されうる。一方、より高い程度
の修飾は、治療薬を完全に被覆し、生成物を遊離させ、血液循環に速やかに入れるように
する。
全体に、修飾とその後の皮下送達の組み合わせによって、皮下（ＳＱ）投与後のみかけ
の半減期において３５倍の増加が観察されるという、非常に驚くべき全体としての効果が
ある。
最後に、全体に、バイオアベイラビリティは、より高い次元の共役形態を支持し、修飾
レベルおよび水和レベルが高いほどより高い移動度のレベル、したがって、バイオアベイ
ラビリティが促進されることが確認されることがわかる。
各形態のすべての特徴は、適宜変更して、本発明のすべての他の形態に適用される。
本明細書において、下記図面を参照する。この際、
図１は、血液凝固カスケードを示す。略称：ＨＭＷＫ−高分子量キニノゲン（Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｋｉｎｉｎｏｇｅｎ）；ＰＫ−プレカリクレイン；ＰＬ−リン脂質。 図２は、共役試薬の一例としてＰＥＧ化試薬を使用するジスルフィドに特異的なバイオポリマー共役化学（ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に含まれる工程を示す（Ｓｈａｕｎａｋ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００６；２（６）：３１２−３１３から）。 図３は、ＰＥＧｈｒＦＩＸを被験体イヌ１に、ｈｒＦＩＸを被験体イヌ２に皮下（ＳＱ）投与した後の全血凝固時間（ＷＢＣＴ）を示す。 図４は、ＳＱ投与後の時間に対するＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）値を示す。 図５は、ＳＱ投与後の保持された血漿（Ｒｅｔａｉｎｅｄ Ｐｌａｓｍａ）のＡＰＴＴを示す。 図６は、ＳＱ投与後の、ベースラインに対するＡＰＴＴ相対値を示す。 図７は、２５ＩＵ／ｋｇのＳＱ投与後の被験体イヌ９のＷＢＣＴを示す。 図８は、２００μｇ／ｋｇのｒＦＶＩＩａの後のＦＶＩＩａのＰＫプロファイルおよびパラメータを示す。 図９は、８００μｇ／ｋｇのＴｈｅｒａＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａの後のＦＶＩＩａのＰＫプロファイルおよびパラメータを示す。 図１０は、１６００μｇ／ｋｇのＴｈｅｒａＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａの後のＦＶＩＩａのＰＫプロファイルおよびパラメータを示す。 図１１は、血漿中のＦＶＩＩＩ濃度を示す（すべてのイヌ）。 図１２は、血漿中のＦＶＩＩＩ濃度を示す（ＳＱ投与したイヌのみ）。 図１３ａは、皮下（ＳＱ）投与されたＰＥＧＦＶＩＩＩの、静脈内（ＩＶ）投与と比較した免疫データ（ベセスダ値）を示し、被験体の数は「ｎ」で与えられる。 図１３ｂは、皮下（ＳＱ）投与されたＰＥＧＦＶＩＩＩの、静脈内（ＩＶ）投与と比較した免疫データ（ベセスダ値）を示し、被験体の数は「ｎ」で与えられる。 図１３ｃは、皮下（ＳＱ）投与されたＰＥＧＦＶＩＩＩの、静脈内（ＩＶ）投与と比較した免疫データ（ベセスダ値）を示し、被験体の数は「ｎ」で与えられる。 図１３ｄは、皮下（ＳＱ）投与されたＰＥＧＦＶＩＩＩの、静脈内（ＩＶ）投与と比較した免疫データ（ベセスダ値）を示し、被験体の数は「ｎ」で与えられる。
ここで、本発明を下記実施例を参照しながらさらに説明するが、下記実施例は詳細に説
明するためのみに記載され、限定して解釈されてはならない。本発明の投与製剤の皮下投
与はＳＱ（ｓ．ｃ．）として表され、静脈内投与はＩＶ（ｉ．ｖ．）として表される。
実施例１：投与形態の調製および皮下投与
この研究は、皮下投与後のｈｒＦＩＸのバイオアベイラビリティおよび有効性の評価を
含む。循環滴定濃度および凝固活性の両方について、裸の（ＰＥＧ化されていない）ｈｒ
ＦＩＸをそのＰＥＧ化類似体と比較した。
１０ｋＤａのＰＥＧ化ｈｒＦＩＸを、１０ｋＤａの直鎖の単分散のポリエチレングリコ
ールを単一のジスルフィド結合に３つの炭素の架橋を介して共役させる、標準的な技術に
従って調製した。
投与のための試験物質は、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍＭのＮａＣｌおよび０．００
５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を用いてｐＨ６．８に緩衝化した適当な水溶液を作製
することによって調製した。１ｍＭのベンズアミジンを安定剤として添加した。
ｈｒＦＩＸの希釈の研究が、２５％の希釈でＰＥＧｒＦＩＸで同等の凝固時間を示した
ことに基づくと、この研究の割り付けられた効力（ａｌｌｏｃａｔｅｄ ｐｏｔｅｎｃｙ
）は、４Ｘタンパク質当量（ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）であった。対照物
質（ｃｏｎｔｒｏｌ ａｒｔｉｃｌｅ）は、凍結乾燥された粉末として供給され、再構成
のための同封の指示書に従って投与のために調製した。送達ビヒクルはＰＥＧについて上
述されたものと同一である。
この研究に付属するものとして、これはｒＦＩＸの皮下（ＳＱ）投与の可能性を探るこ
とに決定した。ＳＱ投与に適したｒＦＩＸのＰＥＧ化形態の見通しは、ＰＥＧがタンパク
質の遮蔽効果を与えたという上記の観察から浮上した。歴史的に、ＳＱ経路は、これが抗
体産生の発生率を悪化させ、血液中で意味のある量に変換しないであろうという懸念があ
ったため、ＦＩＸには利用不可能であると考えられていた。
研究のこの部分では、ＰＥＧｈｒＦＩＸ ５０ＩＵ／ｋｇをさらなる試験動物（イヌ１
）に皮下投与し、裸のｈｒＦＩＸの２頭の他の試験の被験体（すなわち、それぞれ、イヌ
６およびイヌ２）への２つのＳＱ投与と比較した。
この特定の表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）では、動物はそれぞれわずかに異な
るベースラインを有しており、そこで比較しやすくするために、投与前のＡＰＴＴレベル
を１に規格化した。イヌ１およびイヌ２は、２０１０年１月の前回のＰＥＧｒＦＩＸ試験
で試験の被験体であり、ここで静脈内投与後に記録された血漿滴定濃度（ｐｌａｓｍａ
ｔｉｔｒｅｓ）が比較に利用可能であった。
血液試料を正規の（一定間隔の）時間経過にわたって採取し、滴定濃度の崩壊（ｄｅｃ
ａｙ ｏｆ ｔｉｔｒｅ）および血液凝固における効果を観察した。表１は、２２時間で
、静脈内投与後の循環しているＦＩＸとして測定された滴定濃度（ｔｉｔｒｅｓ）のまと
めである。
表２は、皮下（ＳＱ）投与後２２時間で測定された循環ＦＩＸ滴定濃度の比較を示す。
ＳＱ経路による２５ＩＵ／ｋｇのＢｅｎｅｆｉｘ（登録商標）は、循環において検出不
可能であり、５０ＩＵ／ｋｇのＰＥＧｈｒＦＩＸは血漿中にかろうじて検出可能であった
ことがわかる。全く対照的に、ＰＥＧｈｒＦＩＸのＳＱ投与は、ＩＶ投与製品（９．９）
に近いレベル（７．８）であった。
凝固時間の補正におけるこれらの滴定濃度の影響を調べた。はじめに、全血凝固時間を
記録した。皮下投与後のＷＢＣＴを表３および図３に示す。加えて、Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ
（登録商標） ＪｕｎｉｏｒにおけるＡＰＴＴも記録し、皮下投与後の値を下記表４（全
血クエン酸化）および図４に示した。また、皮下投与後の保持された血漿試料のＡＰＴＴ
値を表５および図５に示す。
図６−データのこの収集は、裸のｒＦＩＸが皮下注射から（実際に）生物学的に利用可
能ではないことを明白に示す。これは、公表された文献および当該分野の一般的な知識か
ら完全に予測される。ＰＥＧｈｒＦＩＸの皮下注射の後、ｒＦＩＸのこのような高い循環
滴定濃度が検出されたら、なおさら驚くべきである。実際に、表１０から、皮下注射され
たＰＥＧｒＦＩＸの約８０％が止血の制御への関与に利用可能であることがわかる。
この対照は、測定された凝固時間、ｒＦＩＸについてのＷＢＣＴおよびＡＰＴＴの両方
は、かろうじて治ったが、一方、皮下注射からのＰＥＧｈｒＦＩＸは凝固時間をすぐに治
した点で、最も明確である。これらの測定による止血の持続時間は、１回の５０ＩＵ／ｋ
ｇの皮下注射から約１週間まで長くなった。
実施例２：イヌ９におけるｈｒＦＩＸの皮下投与（ＳＱ）
上記のＳＱ研究の成功を前提として、ＰＥＧｈｒＦＩＸのさらなる１回のＳＱ投与を行
い、同様に長期間にわたる止血制御を観察することに決定した。選択した試験の被験体は
、ＳＱ投与経路における抗体の中和の影響を調べるために、投薬を受けていない被験体イ
ヌ９であった。
イヌにおけるヒト血液因子の研究は、ヒトタンパク質に対するイヌの免疫系の応答によ
って混同されている。ヒトｒＦＩＸは異種タンパク質であり、したがって、イヌの研究に
おいて、抗体の中和は試験物質の投与後同じ点で求められる必要がある。実際、試験の被
験体がヒト血液因子に再導入されると、抗体の産生がより顕著であり、より速い。被験体
のイヌ１およびイヌ７は、皮下投与の後、結果として止血期間が短くなった。
試験被験体のイヌ９は、投薬を受けていない動物であり、少量の皮下投与量を与えられ
た。したがって、本発明のＰＥＧ化血液因子が提供しうる真の持続保護が明らかになった
。イヌ９は、これまでにヒト血液因子にさらされていないため、真の内在する（そして非
常に驚くべき）結果が観察された。
図７は、ＰＥＧ化されたＩＢ１００１をイヌ９に１ｍｌ（体積１ｍｌ）の投与量で、２
５ＩＵ／ｋｇで皮下（ＳＱ）投与した後のＷＢＣＴの結果を示す。以下の表６にも示す。
実施例３：比較例
ＦＩＸおよびＰＥＧ−ＦＩＸの静脈内投与と皮下投与との比較
結果から、皮下投与量のＣｍａｘが静脈内投与量の７８．８％であることがわかる。Ｉ
ＶおよびＳＱの百分率の値は、正常と比較すると低くみえるが、実際には実験的なアーテ
ィファクトである。それぞれの場合のＦＩＸは、試料が調製されると下降すると考えられ
る。静脈内投与量の９．９％の値は、実際には良好な結果を示していると考えられる。し
たがって、皮下投与量の７．８％との比較は、与えられた計算のＣｍａｘ値によって示さ
れるように、有益である。
結論：
２５および５０ＩＵ／ｋｇの両方の皮下注射によるｈｒＦＩＸの投与は、かろうじて検
出可能な循環滴定濃度となり、イヌの被験体における血友病を治さなかった。
上記と全く対照的に、５０ＩＵ／ｋｇのＰＥＧｈｒＦＩＸの皮下投与量では、バイオア
ベイラビリティが約８０％に上昇し、凝固時間が１週間の間、正常な範囲内になった。
実施例４：２０ｋＤａのＰＥＧを有する第ＶＩＩａ因子
この実施例は、皮下注射からの血液因子のＰＥＧＦＶＩＩａのバイオアベイラビリティ
に関する研究を報告する。２頭の血友病のイヌ（ＨＢ）を、時刻０で、ＰＥＧＦＶＩＩａ
の等価効力を有する量で、１頭は静脈内（ＩＶ）で、１頭は皮下（ＳＱ）で、治療した。
血液試料を採取し、ＦＶＩＩａタンパク質を測定する血漿を回収した。結果の表は、８９
．５％の皮下投与からのバイオアベイラビリティを示す。
ＰＥＧの存在は、リンパ管における移動度を促進する水溶解度を与える。このデータは
、ＩＶ注射に伴うボーラスのピークおよび谷ではなく、ＦＶＩＩａの定常的に制御された
注入を示す。
曲線下面積から、ＰＥＧ化ＦＶＩＩａについて８９．５％のバイオアベイラビリティ、
および、皮下送達されたときＦＶＩＩａのレベルがより定常的な状態であることが示され
た。
実施例５：ＰＥＧＦＶＩＩＩ薬剤製品
比較のために、Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）ＦＳ（市販の組み換えＦＶＩＩＩ）につ
いて述べる。ＰＥＧ化賦形剤であるＴｗｅｅｎ（登録商標）８０が大量に用いられている
。
ポリソルベートであるＴｗｅｅｎ（登録商標）８０は１３１０ｇ／ｍｏｌの分子量を有
し、そのうち８８０ｇがＰＥＧ化から誘導される（全モノマーユニットが２０であり、そ
れぞれが４４ｇ／ｍｏｌの（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）を有する）。
したがって、計算は：
モルＰＥＧ相当長さ（Ｍｏｌａｒ ＰＥＧ Ｌｅｎｇｔｈ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）：
参照：２５０ＩＵ バイアルのＰｒｏｄｕｃｔ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｅｘａｍｐｌｅ
ＦＶＩＩＩ分子量 ３．００×１０５ｇ／ｍｏｌ
ＩＵ／ｇ ４．００＋０６ＩＵ／ｇ
ＩＵ／バイアル ２．５０×１０２ＩＵ／バイアル
バイアル体積 ２．５０ｍｌ／バイアル
ポリソルベート濃度 ６．４０×１０−５ｇ／ｍｌ
ポリソルベート分子量 １．３１×１０３ｇ／ｍｏｌ
ポリソルベート１モルあたりのＰＥＧの分子量 ８８０ｇ／ｍｏｌ
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）／ＦＶＩＩＩの比 ５．８６×１０２
ＰＥＧ等価分子量（ＰＥＧ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ Ｍｏｌ Ｗｔ．） ５．１６×１
０５
したがって、Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）ＦＳにおいて、各ＦＶＩＩＩ分子は会合し
た５１６ｋＤａのＰＥＧの等価物を有する。比較すると、本発明によって調製されたＰＥ
ＧＦＶＩＩＩ投与製剤は、単一の２０ｋＤａのＰＥＧを有する。
結論：ｄｏｓｅ−ｆｏｒ−ｄｏｓｅ基準では、ポリエチレングリコールの２５．８倍の
減少があった；Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）の１週間に３回の基準の予防的使用に対し
て、本発明のＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ投与製剤は、１週間に１回投与されうることを考慮する
と、ＰＥＧの投与において約８０倍の全体的な減少の可能性がある；そして、投与期間に
わたって本発明のＦＶＩＩＩ投与製剤によって投与されるＰＥＧの量は、Ｋｏｇｅｎａｔ
ｅ（登録商標）によって投与されるものの１．２５％である。
実施例６：ＦＶＩＩａの皮下投与
この研究の目的は、ＴｈｅｒａＰＥＧｙ化および非ＴｈｅｒａＰＥＧ化組み換えヒトＦ
ＶＩＩａ（それぞれＴｈｅｒａＰＥＧｒＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ）の、血友病Ｂのイ
ヌに静脈内投与および皮下投与した後の、薬物動態を調べることである。
トランスジェニックＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）のＴｈｅｒａＰＥＧ化は、ＷＯ ２０
１１／１３５３０８に従って行った。ＴｈｅｒａＰＥＧｒＦＶＩＩａは、複数のバッチに
凍結乾燥物としてテストサイトに供給し、これを高純度水で再構成し、１ｍｇ／ｍｌのＴ
ｈｅｒａＰＥＧｒＦＶＩＩａをＦＶＩＩａの活性を維持する生理的に許容される緩衝液中
に得た。
実験動物は、早期の停止コドンおよび不安定なＦＩＸ転写産物をもたらす、Ｆ９遺伝子
における５−ｂｐ欠失およびＣ→Ｔトランジションによって引き起こされる先天性の重い
血友病Ｂを有するＬｈａｓａ Ａｐｓｏ−Ｂａｓｅｎｊｉ交配犬であった。投与前に、す
べてのイヌを、全血化学、フィブリノゲンの血清化学プロファイルイル、フィブリノゲン
由来ペプチド（ＦＤＰｓ）、トロンビン時間および尿分析を含む通常の健康状態を調べる
ために試験した。静脈内（ＩＶ）に与える薬剤は、橈側皮静脈へのボーラス注射として与
えた。皮下（ＳＱ）投与量は、１回の投与量として肩甲骨の間に与えた。
ＴｈｅｒａＰＥＧｒＦＶＩＩａのそれぞれのバッチを再構成し、次いで、表１１に記載
されるように、動物に投与するのに用いられる１回の投与溶液を製造するために合わせた
。
５ｍｌの血液試料を、以下の時点で、それぞれのイヌから採取する手順とした：
薬剤投与前（Ｐｒｅ−ｄｒｕｇ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）および投与後１０、
３０分、１、２、４、８、１２、１８、２４、３６、４８、７２、９６、１２０、１４４
、１６８、１９２、２１６および２４０時間。
４ｍｌの血液試料を氷上で０．１０９Ｍのトリ−クエン酸ナトリウム抗凝血剤（９：１
ｖ／ｖ）を含むチューブに移した。血漿を残ったクエン酸血の遠心分離によって調製し、
得られた血漿試料を−８０℃で一定量保存した。一定量の血漿について、ＥＬＩＳＡによ
ってＦＶＩＩａ濃度を分析した。
Ｓｔａｇｏ Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ ＶＩＩ：Ａｇ ＥＬＩＳＡアッセイは、血漿試
料中の第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子濃度の定量的な決定のための酵素結合免疫測定法の手順で
ある。このアッセイは、ウサギ抗ヒトＦＶＩＩ抗体であらかじめコートしたマイクロタイ
ターウェルから構成されるサンドイッチＥＬＩＳＡである。抗体がＦＶＩＩａに対してＰ
ＥＧ−ＦＶＩＩａとは異なる親和性を有するため、標準曲線は、試験血漿中に存在するＦ
ＶＩＩａに適切なタンパク質の希釈により準備した、すなわち、ｒＦＶＩＩａを投与した
イヌの血漿のアッセイにはｒＦＶＩＩａ（０．７８〜５０ｎｇ／ｍｌ）、または、ＰＥＧ
−ｒＦＶＩＩａを投与したイヌの血漿のアッセイにはＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ（０．７８〜
５０ｎｇ／ｍｌ）。
血漿試料を適当な濃度に希釈し、標準曲線に入るようにした。希釈した血漿試料および
標準を投入し、洗浄およびその後のウサギ抗ヒトＦＶＩＩ ＨＲＰ共役体およびＯＰＤ（
比色分析ＨＲＰ基質）での展開（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の前に室温で培養した。プレ
ートを４９２ｎｍで読み、試験試料の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を標準曲線から読みとった。
薬物動態
２００μｇ／ｋｇのＦＶＩＩａ、８００μｇ／ｋｇのＴｈｅｒａＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ
および１６００μｇ／ｋｇのＴｈｅｒａＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａのＩＶおよびＳＱプロファ
イルならびにＰＫパラメータを、図８、９および１０（表１２、表１３および表１４）に
示す。ＴｈｅｒａＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａの半減期は、１４〜２７時間であり、これは非Ｐ
ＥＧ化ｒＦＶＩＩａの２．３時間の半減期よりも明らかに長くなっていた。ＴｈｅｒａＰ
ＥＧ−ｒＦＶＩＩａの１６００μｇ／ｋｇのＩＶ投与量のＡＵＣは、８００μｇ／ｋｇの
ＩＶ投与量のものよりも１．８倍高かった。しかしながら、１６００μｇ／ｋｇのＳＱ投
与量では、８００μｇ／ｋｇの投与量のものよりも１．２倍しか高くなかった。これは、
８００μｇ／ｋｇおよび１６００μｇ／ｋｇの投与量で、それぞれ、６７％および４５％
のバイオアベイラビリティの計算に反映されており、非ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩａで観察され
た１１％のＳＱのバイオアベイラビリティと比べて有意な上昇を示した。
ＴｈｅｒａＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａの８００μｇ／ｋｇのＩＶ投与量のＡＵＣは、非ＰＥ
Ｇ化ｒＦＶＩＩａの２００μｇ／ｋｇのＩＶの後のＡＵＣの８４倍であり、ＴｈｅｒａＰ
ＥＧ−ｒＦＶＩＩａの８００μｇ／ｋｇのＳＱ投与量のＡＵＣは、非ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩ
ａの２００μｇ／ｋｇのＳＱの３００倍である。
実施例７：ＦＶＩＩＩの皮下投与
この研究の目的は、ＴｈｅｒａＰＥＧ化血漿由来ＦＶＩＩＩ（ＴｈｅｒａＰＥＧ−ｐｄ
ＦＶＩＩＩ）が血友病Ａのイヌに静脈内投与および皮下投与されたときの、薬物動態およ
び薬効を調べることである。ＴｈｅｒａＰＥＧ−ｐｄＦＶＩＩＩは、２０ｋＤａの直鎖Ｐ
ＥＧを用いてＷＯ ２０１１／１３５３０７に記載の方法で調製し、さらに精製して精製
ＴｈｅｒａＰＥＧ−ｐｄＦＶＩＩＩを得た。
実験動物は、先天性の重い血友病Ａを有し、以前に突発性出血の治療のためにイヌの血
漿を投与されているが、ヒトＦＶＩＩＩでの治療を受けていない、グレイハウンド交配犬
であった。投与前に、すべてのイヌを、全血化学、フィブリノゲンの血清化学プロファイ
ルイル、フィブリノゲン由来ペプチド（ＦＤＰｓ）、トロンビン時間および尿分析を含む
通常の健康状態を調べるために試験した。
表１５に、それぞれのイヌの体重、および投与されたＦＶＩＩＩ投与量を示す。それぞ
れのイヌに、高い（約０．１４ｍｇ／ｋｇ）または低い（０．０７ｍｇ／ｋｇ）投与量で
ＴｈｅｒａＰＥＧ−ｐｄＦＶＩＩＩを、または０．０３ｍｇ／ｋｇで非ＰＥＧ化ｐｄＦＶ
ＩＩＩを、１回の投与量で与えた。静脈内（ＩＶ）投与は、橈側皮静脈へのボーラス注射
として与えた。皮下（ＳＱ）投与は、１回の投与量として肩甲骨の間に与えた。
血液試料は、以下の時点で、それぞれのイヌから採取する手順とした。薬剤投与前およ
び投与後１０、３０分、１、２、４、８、１２、１８、２４、３６、４８、７２、９６、
１２０、１４４、１６８、１９２、２１６および２４０時間。全血（非クエン酸化）を全
血凝固アッセイおよび活性凝固時間アッセイに用いた。残った血液試料を氷上で０．１０
９Ｍのトリ−クエン酸ナトリウム抗凝血剤（９：１ ｖ／ｖ）を含むチューブに移した。
活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイをクエン酸血で行った。血漿をクエン酸血の
遠心分離によって調製し、得られた血漿試料をＦＶＩＩＩ抗原ＥＬＩＳＡのために、−８
０℃で一定量保存した。
全血凝固時間アッセイ（ＷＢＣＴ）
血液試料を２つのバキュチューブに分け（２×０．５ｍｌ）、完全に水平な位置で流れ
の遮断によって凝固が決定されるまで、チューブの周期的なおよび妥当な水平化を注意深
く観察した。次いで、凝固の質を、チューブを完全に逆の位置に保持することによって観
察した。ＷＢＣＴは、両方の試料で試料抽出から血液凝固が目視で観察されるまでの総時
間の平均として記録し、逆の位置における凝固の質も記録した。
活性凝固時間（ＡＣＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）
ＡＣＴおよびＡＰＴＴ試験は、Ｈａｅｍａｃｈｒｏｎ Ｊｒ 凝固分析器（Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ Ｃｏｒｐｓ．）を用いて、製造元の指示書に
従って行った。
血漿試料中のＦＶＩＩＩ抗原濃度は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ａ
ｎｃａｓｔｅｒ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）製のＶｉｓｕｌｉｚｅ ＦＶＩＩＩ
ａｎｔｉｇｅｎ ｋｉｔを用いて、製造元の指示書に従ってＥＬＩＳＡによって決定した
。
結果
全血凝固時間（ＷＢＣＴ）
止血（ＷＢＣＴ＜１２分）は、高投与量のＴｈｅｒａＰＥＧ−ｐｄＦＶＩＩＩ（ＨＡ１
−４）を受けたすべてのイヌで、８０〜１００時間維持された。ＩＶおよびＳＱ投与の間
でＷＢＣＴに差異はないように見えた。低投与量のＴｈｅｒａＰＥＧ−ｐｄＦＶＩＩＩ（
ＨＡ６）をＳＱで与えられたとき、止血は５６〜７５時間維持された。対照的に、ＳＱ投
与された非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩではＷＢＣＴが減少したが、１２分未満のＷＢＣＴが持続
しなかった。
活性凝固時間（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｌｏｔｔｉｎｇ Ｔｉｍｅ）（ＡＣＴ）
ＡＣＴは、高投与量のＴｈｅｒａＰＥＧ−ｐｄＦＶＩＩＩ（ＨＡ１−４）を受けたすべ
てのイヌで、投与後約８０時間、２００秒未満の正常な範囲に減少した。ＩＶおよびＳＱ
投与の間でＡＴＣプロファイルに差はなかった。
低投与量のＴｈｅｒａＰＥＧ−ｐｄＦＶＩＩＩ（ＨＡ６）をＳＱで与えると、２００秒
未満のＡＣＴが少なくとも３６時間維持された。対照的に、ＳＱで与えた非ＰＥＧ化ＦＶ
ＩＩＩではＡＣＴは減少したが、２００秒未満の持続ＡＣＴにはならなかった。
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）
ＡＰＴＴは、高投与量のＴｈｅｒａＰＥＧ−ｐｄＦＶＩＩＩ（ＨＡ１−４）を受けたす
べてのイヌで、投与後約６０時間、６０秒未満に減少した。ＩＶおよびＳＱ投与の間でＡ
ＰＴＴプロファイルに差はなかった。
低投与量のＴｈｅｒａＰＥＧ−ｐｄＦＶＩＩＩ（ＨＡ６）をＳＱで与えると、６０秒未
満のＡＰＰＴが４０時間維持された。対照的に、ＳＱで与えた非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩでは
ＡＰＴＴは減少したが、最も短いＡＰＴＴ時間は８０秒であった。この個体のＡＰＴＴが
投与後の持続時間の研究でベースライン値を下回ったままである理由は不明であるが、イ
ヌごとの変動によるものでありうる。
ＦＶＩＩＩの血漿濃度および薬物動態
すべてのイヌにおける時間に対するＦＶＩＩＩ血漿濃度を図１１に示す。ＳＱ投与され
たイヌのみのデータを図１２に示す。生データを表２３〜２８に示す。鍵となるＰＫパラ
メータを表１６に示す。
ＳＱ投与されたＴｈｅｒａＰＥＧ−ＦＶＩＩＩの半減期は、ＨＡ１および２について、
それぞれ、１８．３時間および１６．６時間であった。ＩＶ投与されると、半減期は、Ｈ
Ａ３および４について、それぞれ、１５．２時間および１３．９時間と、少し短くなった
。ＳＱ投与後のバイオアベイラビリティは３２％と計算された。非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ（
ＨＡ５）のＳＱ投与後のＦＶＩＩＩの濃度は、大部分は定量レベルより低く、したがって
ＰＫパラメータは計算できなかった。
結論
高投与量のＴｈｅｒａＰＥＧ−ＦＶＩＩＩの皮下投与は、ＷＢＣＴ、ＡＰＴＴおよびＡ
ＣＴによる測定と同様に、１回の投与量の後、８０〜１００時間の止血制御の結果となっ
た。これらのアッセイのＳＱのプロファイルは、ＩＶで与えられえたＴｈｅｒａＰＥＧ−
ＦＶＩＩＩの等価投与量のプロファイルと区別できなかった。これは、ＴｈｅｒａＰＥＧ
−ＦＶＩＩＩのＳＱ送達の実行可能性を明確に示す。
ＴｈｅｒａＰＥＧ−ｐｄＦＶＩＩＩの半減期は、１３．９〜１８．３時間であった。こ
れは、血友病Ａのイヌにおいて７〜１１時間と報告されている（Ｋａｒｐｆ ｅｔ ａｌ
．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １７，５（２０１１））市販の組み換えＦＶＩＩＩと比較
して、半減期の明らかな延長を示す。したがって、ＴｈｅｒａＰＥＧ−ＦＶＩＩＩは、生
物学的に利用可能なＳＱであるだけでなく、半減期が延長されることが示された。
ＴｈｅｒａＰＥＧ−ｐｄＦＶＩＩＩのＳＱ投与後のＦＶＩＩＩのＰＫプロファイルは、
ＩＶ投与と比較して、ＣｍａｘおよびＡＵＣが大幅に減少し、バイオアベイラビリティが
３２％と決定された。しかしながら、この投与量レベルでは、ＰＫ曲線の「遅い放出」の
性質によって、曝露が、ＩＶ投与後と同じ時間、ＳＱ投与後、正常レベルの５％を超えて
維持され、これは等価な機能的反応を説明している可能性がある。ＣｍａｘおよびＡＵＣ
の減少は、ＳＱ送達されたＴｈｅｒａＰＥＧ−ＦＶＩＩＩの作用の持続時間の増加と合わ
せて、この製品および投与オプションの可能性、さらなる安全性の特性を強調した。
非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの皮下投与は、血漿中に検出可能なＦＶＩＩＩが得られないとい
う結果になり、凝固時間は低下したが、止血の持続的な維持はできなかった。これは、非
ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは非常に低いＳＱバイオアベイラビリティを有するが、非常に少量の
ＦＶＩＩＩが止血に影響しうることを示す。非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩと対照的に、低投与量
のＴｈｅｒａＰＥＧ−ｐｄＦＶＩＩＩは、正常の９％までの血漿レベルとなり、止血が５
６〜７５時間維持された。したがって、ＴｈｅｒａＰＥＧのｐｄＦＶＩＩＩへの付加は、
ＳＱ投与したとき、より大きいバイオアベイラビリティおよび機能的反応をもたらした。
結論としては、この研究は、ＦＶＩＩＩのＴｈｅｒａＰＥＧ化は、皮下投与可能で、作用
の持続時間の長い、優れた生成物をもたらすことを明確に示した。
実施例８：イヌにおける皮下投与に対する免疫応答
本発明において、皮下投与から生じる免疫応答は低くなることが観察された。この効果
は、血液因子投与の分野の当業者によって本発明以前に予測されたものと正反対である。
皮下投与することによって、存在する非常に高いレベルの免疫応答（ＦＶＩＩＩ阻害剤の
頻度）が悪化するであろうということが一般に受け入れられていた。
本発明において、非常に驚くべき結果が見出された。免疫（阻害剤）応答の発生を低下
させるために、免疫応答のレベルが全身曝露のレベルに直接関連する皮下投与を採用する
ことが提案された。皮下投与を提供することによって、Ｃｍａｘが大幅に低下し、そうす
ることで免疫応答が低下した。
本発明の実施例において、ＰＥＧ化生成物を免疫環境、すなわちイヌの系のほとんどの
試験に露出していた。静脈内に与えられたとき、ベセスダ値（阻害剤量の単位）が最も高
く、最も早いことがわかる。対照的に、皮下送達では、Ｃｍａｘおよびより低く、より遅
いベセスダ反応からわかるように、全身曝露が非常に少ない。実際に、すべての中で最も
低い値は、ＳＱで与えられた裸のＦＶＩＩＩであり、これは全身曝露がほとんどなく、阻
害剤値がみられなかった。図１３／表２３に得られたデータを示す。
図１３のプロットは、この治療によって刺激されたときに、時間に対して、血漿中にど
の程度の阻害剤活性が見出されたかを示す。直接ＩＶ治療の場合、系によりゆっくりと到
達し、免疫系に対して刺激の少ないＳＱ治療と比較して、より高い阻害剤のレベルがより
速く発生する。
実施例９：ラットにおける皮下投与についての比較研究
この実施例は、ＰＥＧなどのポリマーに共役したとき、血液因子にみられる驚くべき貯
蔵効果について述べる。さらに、この結果は、ＰＥＧのサイズ（または量）からタンパク
質上に与えられる水和のレベルを操作することによって、皮下腔から血液因子が利用でき
るようになる速度を設計することが可能であることを示す。
３つの異なる形態のＰＥＧ化によるＰＥＧ化された第ＶＩＩａ因子の相対的な薬物動態
をラット被験体で研究し、皮下腔からの送達の観点でこれらの性能を比較した。
天然、組み換えの第ＶＩＩａ因子、および３つの異なるＰＥＧ化形態のＦＶＩＩａをラ
ット被験体に、皮下（ＳＱ）または静脈内（ＩＶ）投与した：
ａ）ＴｈｅｒａＰＥＧ化ＦＶＩＩａ：Ｐｏｌｙｔｈｅｒｉｃｓ社の「ＴｈｅｒａＰＥＧ
」技術（他に、およびＷＯ ２０１１／１３５３０８に記載される）を用いてＦＶＩＩａ
を２０ｋＤａのＰＥＧ分子にモノ−ＰＥＧ化した。
ｂ）ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＶＩＩａ：ジ−共役された２０ｋＤａのＰＥＧが主成分であ
り、いくつかの相当量のより高次のＰＥＧ生成物をも含む試験生成物を与える標準的なｇ
ｌｙｃｏＰＥＧ化技術によって、ＦＶＩＩａをＰＥＧに共役させた：
ｃ）ＨＡＴＵ−触媒ＰＥＧ化ＦＶＩＩａ：ＦＶＩＩａを２０ｋＤａのＰＥＧにモノＰＥ
Ｇ化した（ＵＳ５６４４０２９に記載されるものから導出される共役法を用いて）。
ＴｈｅｒａＰＥＧ−ＦＶＩＩａ
２０ｋＤａのＰＥＧを、５ｍＭのリン酸Ｎａ、ｐＨ８．０、１５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍ
ＭのＥＤＴＡに、１０ｍｇ／ｍＬで分散させた。その後、これを２０℃で３時間培養した
。バイアル瓶のＦＶＩＩａ（５．３ｍｇ）を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．
０、０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ中で、０．８ｍｇ／ｍＬに再構成した。こ
れを２０℃で１０分間培養した。その後、２４ｍＭのＴＣＥＰの１．５モル当量（ＭＥ）
および０．４ｍＭのＳｅＣＭの０．０２５ＭＥを添加し、２０℃で１時間培養した。その
後、２ＭＥの活性化されたＰＥＧを還元されたＦＶＩＩａに添加した。混合物を２０℃で
１時間、その後５℃で１７時間培養した。その後、ＰＥＧ化ＦＶＩＩａを精製するために
、調合緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２０
０カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを行った。
生成物の分析のために、再構成されたｒＦＶＩＩａ、活性化されたＰＥＧ、反応混合物
、および選択されたＳｕｐｅｒｄｅｘ画分（２５、３０、３５、３９、４５、５１、８０
）を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで処理した。ＰＥＧ化ＦＶＩＩａを含む画分を、凍結乾
燥に先立って、プールして、約３ｍＬに濃縮した。濃縮したＳＥＣのプールは、凍結乾燥
の前および後の両方で、凝固活性（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）および逆相Ｈ
ＰＬＣアッセイを、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験した。
ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＶＩＩａ
バイアル瓶のｒＦＶＩＩａ（５．３ｍｇ）を、２．５ｍＬのＭＯＰＳ緩衝食塩水中で再
構成した。その後、再構成したｒＦＶＩＩａを、ＰＤ１０脱塩カラム上でＭＯＰＳ緩衝食
塩水に緩衝液交換し、１ｍｇ／ｍＬまで希釈した。緩衝液交換したｒＦＶＩＩａを氷上に
置き、１００ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムを、最終濃度２．５ｍＭまで添加した。混合物
を最大３０分間、暗所で培養した。グリセロール（５０％）を、最終濃度３％まで添加し
た。次いで、Ｚｅｂａスピンカラムを用いて、混合物を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に
緩衝液交換した。アミノオキシＰＥＧの５０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を作製し、このＰ
ＥＧの１０ＭＥを脱塩されたＦＶＩＩａに添加した。反応混合物を、４℃で一晩さらに培
養する前に、１〜２時間室温で培養した。その後、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＶＩＩａを、上
記のようにＳＥＣクロマトグラフィーによって精製した。
生成物の分析のために、選択されたＳＥＣ画分（２３、２７、３２、３５、４０および
８０）を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理した。ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＦＶＩＩａを含む画分
は、凍結乾燥に先立って、プールして、約３ｍＬに濃縮した。濃縮したＳＥＣのプールは
、凍結乾燥の前および後の両方で、凝固活性および逆相ＨＰＬＣアッセイを、還元および
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験した。
ＨＡＴＵ ＰＥＧ−ＦＶＩＩａ
バイアル瓶のｒＦＶＩＩａ（５．３ｍｇ）を、２．５ｍＬのホウ酸塩緩衝液中で再構成
し、ＰＤ１０カラム上でホウ酸塩緩衝液に緩衝液交換し、０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した
。メトキシ−ＰＥＧのストック溶液をアセトニトリル中で１６ｍｇ／ｍＬに作製した。緩
衝液交換したｒＦＶＩＩａをＨＡＴＵの１．０ＭＥおよびＤＩＥＡの２．５ＭＥを用いて
室温で１０分間活性化した。活性化後、メトキシ−ＰＥＧの８ＭＥを活性化されたｒＦＶ
ＩＩａに２〜５分間かけて添加した。次いで、反応混合物を８０〜１００分間室温で培養
した。その後、ＨＡＴＵ ＰＥＧ化ＦＶＩＩａを、上記のようにＳＥＣクロマトグラフィ
ーによって精製した。
生成物の分析のために、選択されたＳＥＣ画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理した。
ＨＡＴＵ ＰＥＧ化ＦＶＩＩａを含む画分は、凍結乾燥に先立って、プールして、約３ｍ
Ｌに濃縮した。濃縮したＳＥＣのプールは、凍結乾燥の前および後の両方で、凝固活性お
よび逆相ＨＰＬＣアッセイを、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験した。
方法
０．５ｍｇ／ｋｇの投与量での製剤を、ＩＶまたはＳＱのいずれかで、健康なラットの
被験体に投与した。ＩＶ投与では、適当な体積の試験物質を尾静脈に注射した。ＳＱ投与
では、適当な体積の試験物質を首筋に注射した。対照試験物質（ネイティブｒＦＶＩＩａ
）の投与後、血液試料を以下の時間間隔で採取した：
試験物質の投与後、血液試料を以下の時間間隔で採取した：
それぞれの時点で、血液試料から血漿を調製し、ＦＶＩＩａ濃度をＳｔａｇｏ Ａｓｓ
ｅｒａｃｈｒｏｍ ＶＩＩ：Ａｇ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定した。このアッセイ
は、血漿試料中の第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子濃度の定量的な決定のための酵素結合免疫測定
法の手順である。このアッセイは、ウサギ抗ヒトＦＶＩＩ抗体であらかじめコートしたマ
イクロタイターウェルから構成されるサンドイッチＥＬＩＳＡである。抗体がＦＶＩＩａ
に対してＰＥＧ−ＦＶＩＩａとは異なる親和性を有するため、標準曲線は、試験血漿中に
存在するＦＶＩＩａに適切なタンパク質の希釈により準備した、すなわち、ｒＦＶＩＩａ
を投与したラットの血漿のアッセイにはｒＦＶＩＩａ（０．７８〜５０ｎｇ／ｍｌ）、ま
たは、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａを投与したイヌの血漿のアッセイにはＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ
（０．７８〜５０ｎｇ／ｍｌ）。
血漿試料を、標準曲線に入るように、適当な濃度に希釈した。希釈した血漿試料と標準
試料を設置し、室温で培養し、その後、洗浄し、続いてウサギ抗ヒトＦＶＩＩ ＨＲＰ共
役体およびＯＰＤ（比色分析ＨＲＰ基質）で成長させた。プレートを４９２ｎｍで読み、
試験試料の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を標準曲線から読みとった。この研究の結果を表２６（ａ
）と（ｂ）に示す。ここで、ＰＥＧ化ＦＶＩＩａ分子およびネイティブのＦＶＩＩａであ
る対照アームのそれぞれに投与経路が２つ；静脈内（ＩＶ）投与および皮下（ＳＱ）投与
；ある。
表２６（ａ）および（ｂ）に示されるように、ＰＥＧ化ＦＶＩＩａ分子およびネイティ
ブのＦＶＩＩａである対照アームのそれぞれに、静脈内（ＩＶ）投与および皮下（ＳＱ）
投与の２つの投与経路がある。
この実施例は、ＰＥＧなどのポリマーに共役したとき、血液因子にみられる驚くべき貯
蔵効果について述べる。さらに、この結果は、ＰＥＧのサイズ（または量）からタンパク
質上に与えられる水和のレベルを操作することによって、皮下腔から血液因子が利用でき
るようになる速度を設計することが可能であることを示す。
表２６（ａ）および（ｂ）に示された結果から、以下のことがわかる：
・全てのＰＥＧ化タンパク質は、裸のタンパク質と比べて血漿半減期が長かった。
モノ−ＰＥＧ化生成物、すなわちＴｈｅｒａＰＥＧおよびＨＡＴＵ ＰＥＧ化タンパク
質は、ジ−ＰＥＧ共役体（ＧｌｙｃｏＰＥＧ）よりも血漿に入る速度が遅く、したがって
、より顕著な貯蔵効果があることがわかった。これは、各生成物のＩＶおよびＳＱの半減
期の差を比較することから推定されうる。
・ＴｈｅｒａＰＥＧ−ＦＶＩＩａでは、ＩＶのｔ１／２は８．６８時間であり、ＳＱに
よって与えられた同じ生成物の２３．２時間と比較した。これは２．７倍の増加を示し、
このモノ−ＰＥＧ化生成物で非常に大きい貯蔵効果が示された。
・同様に、モノ−ＰＥＧ化ＨＡＴＵ ＰＥＧ−ＦＶＩＩａでは、ＳＱのｔ１／２はＩＶ
のｔ１／２に対して１．７倍（２４．３／１４．０７）の増加によって示される、高い貯
蔵効果を有する。
・対照的に、多ＰＥＧ化（ｈｅａｖｉｌｙ ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）生成物であるＧｌｙ
ｃｏＰＥＧ−ＦＶＩＩａでは、両方の製品の半減期は同等に（２２．３／１９．３４＝１
．１５倍）より近く、この生成物のＳＱ投与は、ＩＶ投与と比較して貯蔵効果が小さいこ
とが示唆される。
つまり、モノ−ＰＥＧ化生成物は、ＳＱ投与されたとき、ジ−ＰＥＧ化生成物よりも、
皮下腔を通ってより長く分散されることに抵抗し、したがって高い貯蔵効果を与えるもの
と考えられる。モノ−ＰＥＧ化生成物上のＰＥＧの量の減少は、タンパク質のより多くを
露出させたままにするであろう；ＧｌｙｃｏＰＥＧ生成物上のＰＥＧ被覆が大きいほど、
皮下腔内でより水分散性が高くなり、リンパ管を通って血漿へ入る速度が速くなるものと
考えられる。
したがって、驚くべきことに、デポー放出の最長の持続時間を達成するためには、より
少ない程度のＰＥＧ化が必要とされる。理論によって拘束されることなく、これは、より
少ない程度のＰＥＧ化によってタンパク質の一部が皮下組織にさらされ、これによってリ
ンパを通した拡散の速度が遅くなる、ということで説明されうる。一方、より高い程度の
ＰＥＧ化は、タンパク質を完全に被覆し、生成物を自由に、血液循環に速やかに入れるよ
うにする。
これは、標的分子の修飾（この場合はＰＥＧ化によって）が、放出特性を見事に修正し
、これによって長期にわたる血中の生成物の濃度およびそのバイオアベイラビリティを修
正するために調整されうるという教示を支持する。
ＰＥＧ化とその後の皮下投与の組み合わせによって、みかけの半減期において３５倍の
増加が観察される（裸のＦＶＩＩａの０．６６時間から皮下（ＳＱ）投与後の２３．２時
間に）という、非常に驚くべき全体としての効果がある。
最後に、全体に、バイオアベイラビリティは、より高いＰＥＧ化種、すなわちＧｌｙｃ
ｏＰＥＧを支持し、より高いＰＥＧおよび水和レベルは、より高い移動度の程度、したが
って、バイオアベイラビリティを促進することが確認されることがわかる。

Claims (53)

  1. 患者に治療薬を投与する方法であって、
    Ｃｍａｘ：Ｃａｖｅｒａｇｅ比が、静脈内送達されたときの薬剤のＣｍａｘ：Ｃａｖｅ
    ｒａｇｅ比よりも小さくなるように患者に前記治療薬を皮下投与することを含み、
    前記治療薬は、前記治療薬の本来の状態に対して親水性を増加させ、分子次元を調節す
    るために修飾される、方法。
  2. 患者のリンパ系に治療薬を投与する方法であって、
    前記治療薬が注射部位で患者の循環系に直接入らないように前記治療薬を皮下投与する
    段階を含み、
    前記治療薬は、前記治療薬の本来の状態に対して親水性を増加させ、分子次元を調節す
    るために修飾される、方法。
  3. 患者に治療薬が皮下投与されたとき、前記治療薬が患者の局所循環系に直接入ることを
    防ぐ方法であって、
    患者に修飾された薬剤を皮下投与する段階を含み、
    前記治療薬は、修飾された治療薬が投与部位から局所血管系に直接入れないように、前
    記治療薬の本来の状態に対して親水性を増加させ、分子次元を調節するために修飾される
    、方法。
  4. 被験者の皮下デポ製剤から治療薬を送達するスピードを調節する方法であって、前記治
    療薬を修飾して前記治療薬の親水性を変化させることを含み、親水性のレベルがバイオア
    ベイラビリティのレベルに比例する、方法。
  5. 前記修飾された治療薬の皮下投与は、１回の静脈内ボーラス注射によって安全に送達さ
    れうる投与量よりも、高い投与量で患者に修飾された前記治療薬を投与することを可能に
    する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記修飾された治療薬の皮下投与は、修飾された前記治療薬が静脈内投与された場合よ
    りも早く、患者に再投与することを可能にする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方
    法。
  7. 前記修飾された治療薬の皮下投与は、その修飾された、または本来の形態での前記薬剤
    の静脈内投与よりも少ない、または同等の免疫原性応答を与える、請求項１〜６のいずれ
    か１項に記載の方法。
  8. 前記治療薬の親水性が、前記治療薬の本来の状態に対して少なくとも５０％増加する、
    請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記治療薬は、抗生物質、血液凝固因子、ホルモン、他の治療用ペプチドもしくはタン
    パク質、小分子またはモノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の
    方法。
  10. 前記血液凝固因子は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、
    第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、第Ｖ因子、ヴォン・ヴィレブラン
    ド因子およびプロテインＣからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記修飾は、前記治療薬の生体適合性ポリマーへの共役である、請求項１〜１０のいず
    れか１項に記載の方法。
  12. 前記生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−ホスファチジ
    ルコリン（ＰＣ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピ
    レングリコールとの共重合体、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリオキシエチル化ポ
    リオール、ポリオレフィンアルコール（ｐｏｌｙｏｌｅｆｉｎｉｃ ａｌｃｏｈｏｌ）、
    ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、多糖、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリビニル
    アルコール、ポリホスホスファスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｓｐｈａｚ
    ｅｎｅ）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルフォリン）、ポリアルキレンオキシドポリマー、
    ポリマレイン酸、ポリ（ＤＬ−アラニン）、カルボキシメチルセルロール、デキストラン
    、デンプンまたはデンプン誘導体、ヒアルロン酸、キチン、ポリメタクリレート、ポリシ
    アル酸（ＰＳＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ ａｌｋａ
    ｎｏａｔｅｓ）、ポリアミノ酸およびこれらの組み合わせである、請求項１１に記載の方
    法。
  13. 前記生体適合性ポリマーは、ＰＥＧである、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記修飾は、ポリペプチドに融合して融合タンパク質を生成すること；リポソーム、ト
    ランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅｓ）またはミセルなどの小胞送達ビヒク
    ルへの組み込み；デンドリマーへの取り込みもしくは付着、または前記治療薬のオリゴマ
    ー複合体の形成である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記治療薬の皮下送達体積は２ｍｌ以下である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載
    の方法。
  16. 前記修飾された治療薬は、静脈内に安全に送達されうる修飾された前記治療薬の濃度よ
    りも高い濃度で送達可能である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記修飾された治療薬の皮下投与は、静脈内投与されたときの修飾された前記治療薬の
    治療効果（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｂｅｎｅｆｉｔ）よりも少なくとも１２時間長い持
    続時間の治療効果を患者に与える、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記皮下送達が、皮下注射、局所塗布、経皮パッチ、マイクロダーマルアブレーション
    （ｍｉｃｒｏｄｅｒｍａｌ ａｂｒａｓｉｏｎ）、または高圧乾燥粉末送達による、請求
    項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記皮下送達が、少なくとも１日１回、少なくとも１日２回、少なくとも週１回、少な
    くとも週２回、少なくとも２週間に１回、または少なくとも月１回である、請求項１〜１
    ８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 治療薬および修飾を含み、前記修飾が、前記治療薬の本来の状態に対して薬剤の親水性
    を増加させ、分子次元を調節する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法に使用す
    るための、修飾された薬剤。
  21. 前記修飾が、前記薬剤の親水性を、前記治療薬の本来の状態に対して少なくとも５０％
    増加させる、請求項１９に記載の使用のための修飾された薬剤。
  22. 前記修飾が、前記治療薬に融合した生体適合性ポリマーである、請求項２０または２１
    に記載の修飾された薬剤。
  23. 前記修飾された治療薬の皮下送達は、静脈内投与されたときの修飾された前記治療薬の
    治療効果よりも少なくとも１２時間長い持続時間の治療効果を患者に与える、請求項２０
    〜２２のいずれか１項に記載の修飾された薬剤。
  24. 修飾された治療薬の皮下送達は、静脈内投与されたときの修飾された前記治療薬の治療
    効果よりも少なくとも１２時間長い持続時間の治療効果を患者に与える、修飾された前記
    治療薬の薬剤組成物の投与形態。
  25. 皮下投与のための修飾された血液凝固因子の薬剤組成物の投与形態であって、患者への
    皮下投与のために製剤化されたとき、前記患者の全血凝固時間を２０分以下に維持するの
    に十分な、１か月に１回以下の投与形態を提供する、投与形態。
  26. １か月に１回以下の皮下投与のための、ＰＥＧ化血液凝固因子の液体の投与形態であっ
    て、
    前記投与形態は、静脈内投与されたときの等価参照（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒｅｆｅ
    ｒｅｎｃｅ）投与形態と比べて少なくとも１０％であり、９０％以下であるＣｍａｘを有
    する、血液凝固障害の治療における使用のための、投与形態。
  27. ２週間に１回以下、１週間に１回以下、１／２週間に１回以下、２日に１回以下、また
    は１日１回以下の投与量を提供する、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の投与形態
    。
  28. 前記患者における全血凝固時間を１５分未満に維持するのに十分である、請求項２４〜
    ２６のいずれか１項に記載の投与形態。
  29. 前記患者における全血凝固時間を１２分未満に維持するのに十分である、請求項２４〜
    ２６のいずれか１項に記載の投与形態。
  30. 前記血液凝固因子は、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、
    第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、第Ｖ因子、ヴォン・ヴィレブラン
    ド因子およびプロテインＣからなる群から選択される、請求項２４〜２９のいずれか１項
    に記載の投与形態。
  31. 前記修飾はＰＥＧ化である、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の投与形態。
  32. 静脈内投与されたときの等価参照投与形態と比べて少なくとも１０％であり、９０％以
    下であるＣｍａｘを有する、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の投与形態。
  33. 前記製剤は、静脈内投与されたときの等価参照投与形態と比べて１０〜２０％のＣｍａ
    ｘを有する、請求項３２に記載の投与形態。
  34. 前記薬剤が第ＶＩＩＩ因子である、請求項３３に記載の投与形態。
  35. 前記製剤は、静脈内投与されたときの等価参照投与形態と比べて４０〜６０％のＣｍａ
    ｘを有する、請求項３２に記載の投与形態。
  36. 前記薬剤が第ＩＸ因子である、請求項３５に記載の投与形態。
  37. 前記製剤は、静脈内投与されたときの等価参照投与形態と比べて７５〜８０％のＣｍａ
    ｘを有する、請求項３２に記載の投与形態。
  38. 前記製剤は、静脈内投与されたときの等価参照投与形態と比べて７５％のＣｍａｘを有
    する、請求項３２に記載の投与形態。
  39. 前記薬剤が第ＶＩＩ因子である、請求項３７または３８に記載の投与形態。
  40. 投与量が１〜１０００ＩＵ／ｋｇである、請求項２４〜３９のいずれか１項に記載の投
    与製剤。
  41. 投与量が５〜５００ＩＵ／ｋｇである、請求項２４〜３９のいずれか１項に記載の投与
    製剤。
  42. 投与量が１００〜２５０ＩＵ／ｋｇである、請求項２４〜３９のいずれか１項に記載の
    投与製剤。
  43. 投与量が５０〜２００ＩＵ／ｋｇである、請求項２４〜３９のいずれか１項に記載の投
    与製剤。
  44. 投与量が２５〜５０ＩＵ／ｋｇである、請求項２４〜３９のいずれか１項に記載の投与
    製剤。
  45. 前記投与形態が、少なくとも１日１回、少なくとも１日２回、およそ週１回、およそ週
    ２回、およそ２週間に１回、またはおよそ月１回の投与のためのものである、請求項２４
    〜３９のいずれか１項に記載の投与製剤。
  46. 投与形態が皮下投与のためのものであり、治療薬の親水性を変化させるために前記治療
    薬が修飾され、親水性のレベルがバイオアベイラビリティのレベルに比例する、前記治療
    薬の投与製剤。
  47. 請求項２４に記載の修飾された治療薬の投与形態を皮下投与することを含む、患者の疾
    患の治療方法。
  48. 請求項２４〜４６のいずれか１項に記載の血液凝固因子の投与形態を、それを必要とす
    る患者に皮下投与することを含む、患者の血液凝固疾患または外傷の治療方法。
  49. 前記投与形態が、少なくとも１日１回、少なくとも１日２回、少なくともおよそ週２回
    、少なくともおよそ週１回、少なくとも２週間に１回、または少なくともおよそ月１回投
    与される、請求項４７または４８に記載の治療方法。
  50. 前記投与形態が、少なくとも１日１回投与される、請求項４７または４８に記載の治療
    方法。
  51. 前記投与形態が１日２回投与され、患者が第１投与で第１投与形態を、第２投与で第２
    投与形態を受ける、請求項５０に記載の治療方法。
  52. 前記第２投与形態が、前記第１投与形態と別々に、同時に、または連続して投与される
    、請求項５１に記載の治療方法。
  53. 請求項２４〜４６のいずれか１項に記載の皮下投与形態および投与用ビヒクルを含む、
    部品のキット。
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