CN104073482A - 聚乙二醇化的组织激肽释放酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
聚乙二醇化的组织激肽释放酶及其制备方法和应用，涉及聚乙二醇修饰的蛋白类药物，所述组织激肽释放酶具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的序列，所述组织激肽释放酶可以是天然或重组的，其中聚乙二醇为分子量为20-40kDa的聚乙二醇，其中所述聚乙二醇在组织激肽释放酶的N端伯氨基上偶联。本发明提供的聚乙二醇化的KLK1，在具有半衰期明显延长、免疫原性显著降低、结构稳定均一的等优点的基础上，更大程度的提高了其生物活性，尤其在治疗脑卒中及糖尿病肾病方面更加显著。
Description
技术领域
本发明涉及聚乙二醇修饰的蛋白类药物，特别是聚乙二醇修饰的组织激肽释放酶及其制备方法和其在药物制备中的应用。
背景技术
激肽释放酶，又称激肽原酶（kininogenase）或血管舒缓素（kallidinogenase），它是属于丝氨酸蛋白酶的一种，存在于各种组织和生物液体中，催化大分子前体物（激肽原，Kininogen）释放生物活性肽（激肽，Kinin）。激肽释放酶的生理效应包括使毛细血管和动脉血管舒张以及通透性增加，使冠状动脉、脑、视网膜处的血流供应增加，适用于高血压冠状血管以及动脉血管硬化等症，对心绞痛、血管痉挛、血栓性闭塞性脉管炎、冻疮以及创伤等症也有治疗作用。同时，激肽释放酶也可以作为活化因子，使纤溶酶原激活成纤溶酶，将不溶性的纤维蛋白水解成可溶性的小肽，从而对脑梗塞、动脉粥样硬化等起到治疗作用，并用于治疗血栓、预防血栓再形成（G.M.Yousef,E.P.Diamandis Clin Biochem,2003(36):443-452）。体外研究显示，激肽释放酶对离体动脉具有舒张作用，并可抑制血小板聚集、增强血细胞变形能力和氧解离能力。动物试验显示，激肽释放酶静脉注射可增加麻醉犬椎间、颈总和股动脉血流量，增加麻醉犬后肢、家兔肌肉血流量。因此，激肽原酶在人类微循环障碍（如糖尿病肾病或糖尿病眼底病变等）及轻-中度急性血栓性脑梗死等疾病的治疗中具有较高的应用价值。
国内市场上现有的激肽释放酶药物分为两类：一类是从猪胰脏中提取的组织激肽释放酶，它来源广泛，但是免疫原性较高，不适于静脉给药；另一类是从新鲜人尿中提取精制的人尿激肽原酶，虽然其不存在免疫原性问题，但是原料限制较大，产量较低。此外，二者均存在半衰期短，需反复重复给药的问题。为克服此类药用蛋白和多肽普遍存在的生物稳定性差、体内半衰期短和具免疫原性等缺点，通常采用基因工程改造和化学修饰等手段对其进行修饰改造，提高药用蛋白和多肽的体内生物稳定性，延长半衰期，降低或消除免疫原性。但针对每种蛋白的结构特殊性，对各类方法的适用及其产生的实际效果却有很大的差距。
聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一种常用的蛋白质修饰剂，可有效延长蛋白质类生物药物的半衰期并降低免疫原性。PEG修饰类型分为随机修饰和定点修饰。随机修饰是在蛋白质赖氨酸的ε氨基上进行的修饰反应，该类型PEG修饰剂反应迅速，修饰率高，但是修饰产物比较复杂，单修饰产物的位点不均一，修饰产物活性各不相同，难以保证批次间的稳定性。定点修饰主要包括N末端修饰和半胱氨酸残基修饰，两种修饰手段均可保证样品的一致性，但是对蛋白质的结构和性质要求较高。并且，在大多数情况下，与未修饰的原蛋白相比，聚乙二醇化的蛋白药物的活性会降低，一般修饰后的蛋白活性仅有原蛋白的30%-40%,甚至更低。例如Schering-Plough公司的PEG-Intron,是用分子量为5000的PEG修饰干扰素，修饰后其活性只有原蛋白的8%。并且，随着PEG分子量的增大，修饰后的蛋白质活性降低更明显。例如用分子量为20KDa、30KDa、40KDa的PEG修饰促红细胞生成素（EPO）后，活性随着PEG分子量的增大而显著减小(Yin-jue Wang,journal of controlled release,2010(145):306-313)。由此可见，蛋白的结构以及所用PEG的分子量以及修饰的位点等对聚乙二醇化的蛋白质的生物活性有很大的影响。对于特定药物的修饰，聚乙二醇修饰剂是影响修饰产物理化性质、体内外生物活性、药代动力学、药效学以及修饰产物临床表现最重要的因素。
激肽原酶的PEG化修饰目前国外没有相关的报道研究，而国内只有中国药科大学的吴梧桐老师做过初步研究（聚乙二醇（PEG5000）对胰激肽释放酶化学修饰的初步研究，药物生物技术，2006（13）：409-412）。采用分子量为5000的以琥珀酰亚胺碳酸酯为活性基团的PEG对激肽原酶进行氨基随机修饰，所得产物均一性较差，并且稳定性不高，极易发生水解，半衰期及免疫原性均未得到明显改善。因此为了开发出长效的、低免疫原性的，并且具有较高生物活性的聚乙二醇化的激肽原酶需要选择更加合适的修饰方法和PEG原料。
发明内容
解决的技术问题：本发明旨在提供一种具有高的生物活性、长半衰期、低免疫原性的聚乙二醇化的组织激肽释放酶(KLK1)，及其在制备治疗轻-中度急性血栓性脑梗死疾病的药物中的应用。更进一步的说：
本发明的第一目的是提供一种聚乙二醇化的KLK1；
本发明的第二目的是提供一种上述的聚乙二醇化的KLK1的制备方法；
本发明的第三目的是提供一种上述所述的聚乙二醇化的KLK1在制备治疗轻、中度急性血栓性脑梗死疾病或糖尿病肾病的药物中的新用途。
本发明的第四目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物含有上述所述的聚乙二醇化的KLK1和药学上可接受的辅料。
本发明的第五目的是提供一种聚乙二醇化的KLK1或其药物组合物的配制为药学上可接受的盐及其复合物。
技术方案：聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其中聚乙二醇为分子量为20-40kDa的聚乙二醇，其中所述聚乙二醇在组织激肽释放酶的N端伯氨基上偶联。
所述聚乙二醇通过丙醛基团与组织激肽释放酶的N端伯氨基偶联。
所述聚乙二醇分子为直链型或分支型。
所述聚乙二醇分子为分支型PEG衍生物，其中活化基团为丙醛、丁醛、乙醛或戊醛。
所述聚乙二醇化的组织激肽释放酶的结构通式如下所示：
其中R为H或C1-C4的烷基；n为10到1150的整数值，p为1-3的整数；AA为N端的L-氨基酸残基，m为0-5的整数。
所述烷基为甲基，n为57-455之间的整数值，p为2，m为0，所述KLK1具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的序列。
所述n为227-455之间的整数。
聚乙二醇化的组织激肽释放酶的制备方法，包括如下步骤：步骤1，用10-50mM pH4-6的乙酸钠缓冲液配制0.1-30mg/mL的组织激肽释放酶溶液；步骤2，按摩尔比组织激肽释放酶:PEG:还原剂=1:2-25:20-1000在4℃-37℃的条件下反应0.1-24h；步骤3，反应结束后以色谱法纯化处理，最终得到单修饰的聚乙二醇化的组织激肽释放酶。
所述还原剂优选为氰基硼氢化钠。
所述聚乙二醇化的组织激肽释放酶在制备治疗脑卒中药物中的应用。
所述聚乙二醇化的组织激肽释放酶在制备治疗糖尿病引起的肾病中药物中的应用。
一种治疗脑卒中或糖尿病引起的肾病药物，有效成分为上述聚乙二醇化的组织激肽释放酶及其药学上可接受的盐及其复合物。
药学上可接受的盐在其被施用的量和浓度存在时是非毒性的。制备此类盐可通过改变化合物的物理特征而不妨碍其发挥生理学效果来促进药物应用。在物理特性方面有用的改变包括降低熔点以促进经粘膜施用，以及增加溶解性以促进施用更高浓度的药物。
上述所述的药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如含有硫酸盐、盐酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐等。上述所述的药学上可接受的盐可来自酸，包括盐酸、马来酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸等。
药学上可接受的载体和/或赋形剂也可被掺入根据本发明的药物组合物中促进特定激肽释放酶的施用。适于实施本发明的载体包括碳酸钙，磷酸钙，各种糖类（乳糖、葡萄糖、蔗糖），或各种淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇，以及生理学上相容的溶剂（包括用于注射的无菌水溶液，盐溶液和右旋糖）。
有益效果：本发明提供的聚乙二醇化的KLK1，在具有半衰期明显延长、免疫原性显著降低、结构稳定均一的等优点的基础上，更大程度的提高了其生物活性。
附图说明
图1为不同PEG-KLK1偶联物的HPLC-SEC纯度分析图。
通过高效凝胶过滤分析结果可以看出制备的偶联物中没有明显杂质，纯度均大于98%，符合中国药典标准。
图2为不同PEG-KLK1偶联物的体外生物活性图。
通过体外活性检测结果可知，偶联物1到偶联物4分别保留了原蛋白活性的81%、83%、90%、86%，由此可见，各PEG修饰产物中偶联物3的生物活性最高，偶联物1的活性最低。
图3为不同PEG-KLK1偶联物的热稳定性图。
由图可知，未修饰的激肽释放酶在65℃放置10min后活性基本丧失，而偶联物1和偶联物3在高温下的热稳定性均有提高，其中偶联物3在65℃放置20min后仍具有一定活力，说明激肽释放酶经PEG修饰后热稳定性提高，且偶联物3的热稳定性显著高于偶联物1。
图4a为不同给药组的实验动物神经缺陷症状的评分状况图。根据实验结果可知，阳性对照1组（尤瑞克林）、偶联物2组、偶联物3组相对于模型组均具有显著性差异，且偶联物2组和偶联物3组的实验动物给药后神经缺陷症状评分明显高于阳性对照1组。
图4b为不同给药组的实验动物脑梗死面积的结果图。根据实验结果可知，阳性对照1组（尤瑞克林）、偶联物2组、偶联物3组相对于模型组均具有显著性差异，且偶联物2组和偶联物3组的实验动物给药后脑梗死面积低于阳性对照1组。由此可见，偶联物4组、阳性对照2（tPA）及激肽释放酶均未有明显改善模型动物脑梗死状态；偶联物1可轻微改善实验动物脑梗死状态；偶联物2、偶联物3比阳性对照1（尤瑞克林）、阳性对照组2（tPA）及激肽释放酶具有更好的治疗急性血栓性脑梗死疾病的作用。
图4a、图4b：不同PEG-KLK1偶联物治疗脑卒中的药效比较。
图5a是给药前后实验动物尿量的变化图，根据结果可知，与模型组相比，原蛋白组及偶联物3组给药后24h尿量有显著降低；
图5b是给药前后实验动物24h尿蛋白的变化图，根据结果可知，与模型组相比，原蛋白组及偶联物3组给药后24h尿蛋白有显著降低，且偶联物3组降低更为明显；
图5c是给药前后实验动物24h尿肌酐的变化图，根据结果可知，与模型组相比，原蛋白组及偶联物3组给药后24h尿肌酐有显著降低，且偶联物3组降低更为明显；
图5d是给药前后实验动物24h尿素氮的变化图，根据结果可知，与模型组相比，原蛋白组及偶联物3组给药后24h尿素氮有显著降低，且偶联物3组降低更为明显。由此可见，激肽释放酶原蛋白及PEG修饰后的激肽释放酶偶联物均可有效改善实验动物糖尿病肾病引起的肾脏损伤。并且，根据PEG修饰后的激肽释放酶偶联物给药间隔为激肽释放酶原蛋白一倍可知，经PEG修饰后，激肽释放酶的体内半衰期明显延长，且药效得到了显著的改善。
图5a～图5d展示了PEG-KLK1偶联物对糖尿病肾病的治疗作用。
图6为不同PEG-KLK1偶联物的免疫原性图。
实验结果显示，不同PEG-KLK1偶联物在注射到小鼠体内后，偶联物2组、偶联物3组与相比，实验动物体内产生的抗体滴度远远低于阳性对照1组（尤瑞克林）、未经PEG修饰的激肽释放酶组实验动物的抗体滴度。说明经PEG修饰后的偶联物2和偶联物3的免疫原性远远低于阳性对照1（尤瑞克林）及未经PEG修饰的激肽释放酶，且偶联物3的对小鼠相对免疫原性略低于偶联物2。
图7为不同PEG-KLK1偶联物大鼠静脉给药后的血药浓度变化图。
通过同位素标记示踪法对不同PEG-KLK1偶联物的药代动力学进行检测。实验结果显示，与阳性对照1（尤瑞克林）及激肽释放酶相比，偶联物3的血药浓度降低较为缓慢，半衰期明显增长，且AUC显著提高，血浆清除速度明显下降。
图8a为不同PEG-KLK1偶联物和原蛋白的远紫外圆二色谱图比较图。
图8b为不同PEG-KLK1偶联物和原蛋白的近紫外圆二色谱图比较图。
图8a、图8b：不同PEG-KLK1偶联物和原蛋白的圆二色谱图比较。通过圆二色谱图可以看出，KLK1用PEG修饰以后，其近紫外和远紫外的圆二色谱图基本没有改变，说明修饰后KLK1的二级结构和三级结构没有发生改变。
图9为偶联物3和原蛋白的酶解肽图比较图。
由偶联物3和原蛋白的酶解肽图可以看出，偶联物3的PEG是修饰在蛋白的N端的。
图10为重组hK1蛋白在毕赤酵母X-33工程菌中的表达鉴定图。
其中，泳道1为相对分子质量较大的重组hK1蛋白，泳道2为相对分子质量较小的重组hK1蛋白；泳道3为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker。两种分子量不同重组hK1蛋白除糖基化修饰不同外，其理化性质及生物学活性没有差异。
图11为酵母表达的重组人激肽释放酶的PEG修饰产物的蛋白电泳分析图。
其中，泳道1为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker，泳道2为经Y-PALD-30K修饰后的重组hK1蛋白。通过蛋白电泳结果可以看出制备的偶联物中没有明显杂质，分子量和原蛋白比有显著提高，纯度也较高。
图12为CHO-S细胞株稳定表达重组hK1蛋白的上清培养液免疫印迹图。
其中，泳道1为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker，泳道2为CHO-S宿主细胞制备重组hK1蛋白第13天的上清培养液。
图13为CHO细胞表达的重组人激肽释放酶的PEG修饰产物的HPLC分析图。
用HPLC来对制备出的PEG修饰产物进行纯度分析。通过HPLC的结果可以看出制备的偶联物纯度较高，达到98%以上。
具体实施方式
定义：
本发明使用以下缩写：
PEG（polyethylene glycol）：聚乙二醇；
Y-PALD-20K：分子量为20KDa的包含两个直链甲氧基聚乙二醇的分支型PEG丙醛,结构呈Y型；
Y-PALD-30K：分子量为30KDa的包含两个直链甲氧基聚乙二醇的分支型PEG丙醛,结构呈Y型；
Y-PALD-40K：分子量为40KDa的包含两个直链甲氧基聚乙二醇的分支型PEG丙醛,结构呈Y型；
KLK1：猪胰脏中提取的组织激肽释放酶，人尿中提取的激肽释放酶。
hK1：重组人激肽释放酶。
mPEG-SC5000：分子量为5000的直链单甲氧基PEG，活化基团为琥珀酰亚胺碳酸酯。
本申请中所用术语“偶联物”，是指聚乙二醇修饰KLK1的单修饰产物；
几种聚乙二醇修饰KLK1的单修饰产物可在本申请中称为“SC-PEG5000-KLK1，Y-PALD-20K-KLK1，Y-PALD-30K-KLK1，Y-PALD-40K-KLK1”统称为PEG-KLK1或偶联物。
“聚乙二醇”指环氧乙烷缩聚物和水的混合物，有分支型和直链型。“聚乙二醇”或“PEG”加上数字后缀表示其平均分子量。例如，PEG-20000指分子量为20000左右的聚乙二醇；也可把“PEG”省略，如Y-PALD-20K，表示分子量为20000左右的Y型PEG丙醛，结构式如下所示。
R为H或C1-C4烷基，优选为甲基；n为10到1000整数值，本发明优选为57-455之间的整数值，更优选为227-455之间的整数，p为1-3的整数，本发明优选为2。聚乙二醇有利的具有下列范围内的分子量：大约20000Da至大约40000Da。更具体地，聚乙二醇具有选自下列的分子量：20000Da，30000Da，40000Da。在特定的实施方式中，聚乙二醇的分子量为30000Da。
在本发明中，KLK1可从任何来源衍生、克隆或产生，包括来自动物或通过基因重组技术或它们的组合。例如，KLK1可从动物组织或尿液中提取，包括但不限于猪胰脏，人尿。在本发明的偶联物的特定实施方式中，KLK1与包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列的蛋白具有至少约60%的序列一致性。
在特定的实施方式中，所述蛋白为来源于猪胰脏的组织型KLK1，其具有SEQ ID NO:1所示的序列。在另一个实施方式中，KLK1来自重组的人源KLK1，其具有SEQ ID NO:2所示的序列。
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的蛋白的片段也被包含在本发明的偶联物中所使用的蛋白的定义中。所述的“SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的蛋白的片段”是指多肽的序列可包括比SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2更少的氨基酸，但仍包括足够的氨基酸来赋予催化大分子前体物（激肽原）释放生物活性肽的活性。
本领域熟知的是，可通过置换、插入、缺失和/或添加一个或多个氨基酸来修饰多肽但同时保留其酶活性。例如，在给定的位置通过化学上等同的氨基酸来置换一个氨基酸而不影响蛋白的功能特性是常见的。因此，可预期如下改变将产生功能上等同的产物：产生以一个带负电的残基取代另一个的改变或产生一个带正电的残基取代另一个的改变。
用来使PEG共价结合KLK1的连接基团可以是任何生物相容的连接基团。“生物相容”表示化合物或基团是非毒性且可在体外或体内使用而不引起损伤、呕吐、疾病或死亡。PEG可结合连接基团，例如通过酯键、硫醇键或酰胺键。
本发明中，最优选的生物相容连接基团的共同特征是它们通过丙醛基团与KLK1的N末端氨基偶联。另外，KLK1可通过氨基、巯基、羟基或羧基直接与PEG偶联。在一个最优实施方案中，PEG通过酰胺键，偶联KLK1上N末端的氨基。
本发明的制备聚乙二醇化的KLK1的方法，所述方法包括使用一定量的PEG与一定量的KLK1在缓溶液中反应足量时间至使PEG与KLK1共价结合。在特定的实施方式中，所述KLK1来自胰脏，更特别的来自猪胰脏，并且更特别的，所述KLK1包含SEQ ID NO：1的序列。在一个实施方式中，所述PEG为Y-PALD型。
在一个特定的实施方式中，缓冲液的pH值在大约4.0至大约9.0的范围内。最优选的pH值范围是大约5.0至6.0，例如，pH值约为5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9或6.0。
此外，激肽释放酶的聚乙二醇化在下列蛋白浓度下进行：大约0.5-30mg/mL，更特别优选的大约2mg/mL-20mg/mL，最特别优选地大约3mg/mL-15mg/mL。在特定的实施方式中，在这些蛋白浓度下聚乙二醇化的激肽释放酶来自猪的胰脏，并且更特别的，所述激肽释放酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO:2的序列。
在升高的蛋白浓度下，聚乙二醇化反应快速进行，在少于3h之内。此外，所应用的PEG与激肽释放酶的摩尔过量至多为25：1。例如，摩尔过量为少于25:1，20:1，19:1，18:1，17:1，16:1，15:1，14:1，13:1，12:1，11:1，10:1，9:1，8:1，7.5:1，7:1，6.5:1，6:1，5.5:1。
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。
实施例1：KLK1的PEG偶联物的制备及分析
制备例一，本发明聚乙二醇化KLK1通过如下方法制备、纯化、鉴定：
1.PEG偶联物样品制备
用50mM pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解将激肽释放酶（来源于常州千红生化制药股份有限公司）以配制成为8mg/mL的溶液，分别用Y-PALD20K,Y-PALD30K,Y-PALD40K(购自北京键凯科技有限公司)，按激肽释放酶:PEG:氰基硼氢化钠为1:10:100的摩尔比进行反应，在4℃下反应12h后，加入1M甘氨酸终止反应。制备得到3种单修饰产物Y-PALD-20K-KLK1(偶联物2)，Y-PALD-30K-KLK1(偶联物3)，Y-PALD-40K-KLK1(偶联物4)。
另外以50mM pH8.5的Tris-HCl缓冲液溶解激肽释放酶，配制成为8mg/mL的激肽释放酶溶液，用mPEG-SC5000(购自北京键凯科技有限公司)，按激肽释放酶:PEG为1:8的摩尔比进行反应，在4℃下反应0.5h。制备得到单修饰产物SC-PEG5000-KLK1(偶联物1)，制备此修饰产物是为了与本发明的修饰产物进行比较。偶联物1、偶联物2、偶联物3和偶联物4的收率分别为40%，55%，58%，61%。
2.PEG偶联物样品纯化
2.1色谱法去除未反应PEG
色谱法条件：Q离子交换柱（购自GE公司，HiTrap Q HP5mL），A液：20mM的Tris-HCl（pH8.0），B液：含1M NaCl的20mM的Tris-HCl（pH8.0），流速2.5mL/min，检测波长为280nm。
上样：上述修饰反应产物用0.5M的NaOH溶液调节至pH8.0，结合至Q离子交换柱。
平衡：A液冲洗5个柱体积。
收集：50%(v/v)的B液洗脱，并收集洗脱峰样品。
2.2色谱法纯化单修饰PEG偶联物
色谱法条件：Hiload16/60Superdex200pg（购自GE公司）半制备型凝胶过滤柱，洗脱液为PBS，流速1.5mL/min，检测波长为280nm。
3.PEG偶联物样品检测
色谱法条件：HPLC（Waters，e2695HPLC），Superdex20010/300GL（购自GE公司），流动相为含0.1M Na2SO4的PBS（pH7.4），流速为0.4mL/min，检测波长为280nm，进样量50μL，检测时间为60min。
分析结果见图1所示。如图可以看出，制备的4种单修饰产物SC-PEG5000-KLK1(偶联物1)，Y-PALD-20K-KLK1(偶联物2)，Y-PALD-30K-KLK1(偶联物3)，Y-PALD-40K-KLK1(偶联物4)的纯度均高于98%，并且随着所使用的PEG的分子量的逐渐增加，偶联物1到偶联物4的分子量也逐渐增加。
制备例二至四除了pH值、反应温度、反应时间、蛋白浓度、摩尔比不同之外，其他方法与制备例一相同，具体参数与得率如下表所示：
| 制备例二 | 制备例三 | 制备例四 | |
| pH值 | 5.0 | 5.5 | 6.0 |
| 修饰剂 | Y-PALD-30K | Y-PALD-30K | Y-PALD-30K |
| 摩尔比（蛋白:PEG:还原剂） | 1:5:100 | 1:15:15000 | 1:25:2500 |
| 反应温度 | 4℃ | 25℃ | 37℃ |
| 反应时间（小时） | 24 | 10 | 0.5 |
| 蛋白浓度（mg/mL） | 15 | 10 | 0.5 |
| 收率(%) | 61 | 59 | 63 |
制备例二、三、四所制备的单修饰产物的活性及纯度与制备例一中的所得的单修饰产物偶联物3的活性及纯度无显著差别。下述实施例中所用的PEG-KLK1偶联物均采用制备例一中所得的偶联物。
实施例2：PEG-KLK1偶联物的体外活性检测
激肽释放酶可以降解N-苯甲酰-L精氨酸乙酯盐酸盐（BAEE购自sigma公司），根据酶促反应前后吸光度增量的变化可用于测定激肽原酶的活性，具体测定方法参照2010版《中华人民共和国药典》第二部850-851页所述方法进行。检测的样品分别是制备例一的SC-PEG5000-KLK1(偶联物1)，Y-PALD-20K-KLK1(偶联物2)，Y-PALD-30K-KLK1(偶联物3)，Y-PALD-40K-KLK1(偶联物4)以及未修饰的原蛋白。它们的相对活性比较结果如图2所示。
由图2的结果可以看出，原蛋白在用PEG修饰后活性均有一定的降低。与未修饰的原蛋白相比，偶联物1到偶联物4分别保留了原蛋白活性的81%、83%、90%、86%，各PEG修饰产物中偶联物3的生物活性最高，偶联物1的活性最低。由此可见，本发明的PEG修饰KLK1在更大程度上保留了原蛋白的体外生物活性。其中偶联物1和文献报道的活性一致。
其次，根据PEG修饰的一般规律，所使用的PEG分子量越大，对活性的影响越大。然而，本发明中并未显示该规律，本发明所采用的PEG修饰剂分子量均远大于5000Da，但修饰后的激肽释放酶生物活性却仍然大于前者，并且当PEG分子量为30KDa的偶联物3的生物活性最高。
实施例3：PEG-KLK1偶联物的热稳定性
为了验证PEG修饰后可提高激肽释放酶的稳定性，本实施例分别检测了偶联物1、偶联物3及原蛋白在65℃水浴放置一段时间后的活性。具体方法如下：把PBS缓冲液溶解的蛋白浓度为1mg/mL的偶联物1，偶联物3和未修饰的激肽释放酶置于65℃水浴中，分别于0min、2.5min、5min、7.5min、10min、20min、25min、30min取样并放入4℃冰箱备用。取样结束后采用实施例2中的方法（即2005版《中华人民共和国药典》第三部的附录ⅨF所述方法）检测其生物活性。检测结果如下图3所示。
由图可以看出，与原蛋白相比，经PEG修饰后的激肽释放酶热稳定性均有提高，但是偶联物1的热稳定性提高不明显，而偶联物3的热稳定性比原蛋白有了显著的提高。
实施例4：不同PEG-KLK1偶联物治疗脑卒中的药效比较
采用SD大鼠（购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司）颈内动脉线栓法制备大脑中动脉阻塞（Middle cerebral artery,MCAO）脑缺血再灌注模型，分别设置阳性药对照组1（尤瑞克林，广东天普生化医药股份有限公司），阳性药对照组2（tPA，上海勃林格殷格翰药业有限公司）、模型对照组（PBS）、假手术组、激肽释放酶组（来源于常州千红生化制药股份有限公司）、偶联物1组、偶联物2组、偶联物3组、偶联物4组。于脑缺血再灌注后按照3μg/kg（按蛋白质量进行计算）立即尾静脉注射给药1次，再灌注后24h观察神经缺陷症状，测定脑梗死面积。
其中模型组给大鼠尾静脉注射等体积的PBS。假手术组仅分离血管，不插入栓塞线，给大鼠尾静脉注射等体积的PBS。
采用改良Bederson5分制法进行神经缺陷症状评价。单盲法评价脑外伤后大鼠的神经缺陷症状，即由试验设计者将动物按组标记，由不明分组情况的实验者对神经缺陷症状进行评分。
脑梗死面积的计算采用如下的方法进行。SD大鼠大脑用TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑，SIGMA）染色后用图像分析软件对照片进行统计，按如下公式计算脑梗死面积的百分比。
实验结果如图4及表1、表2所示。
表1PEG-KLK1偶联物和激肽释放酶以及阳性对照药药效研究神经缺陷症状比较
表2PEG-KLK1偶联物和激肽释放酶以及阳性对照药药效研究脑梗死面积比较
试验结果表明，在神经缺陷症状评分及脑梗死面积计算实验中，偶联物4组、阳性对照2（tPA）及激肽释放酶均未有明显改善模型动物脑梗死状态，而阳性对照1组（尤瑞克林）、偶联物1组、偶联物2组、偶联物3组相对于模型组均具有显著性差异，且偶联物2组和偶联物3组对急性血栓性脑梗死的治疗作用高于阳性对照1组。综上所述，与未经PEG修饰的原蛋白及两种阳性药物相比，偶联物2及偶联物3对采用MACO法制备的脑缺血再灌注模型SD大鼠的脑缺血损伤有明显的保护作用，且药效优于市售产品。偶联物1仅有部分改善模型动物的脑梗状态，而偶联物4基本没有缩小实验动物的脑梗死面积，并且神经缺陷症状没有改善，说明二者并未达到治疗脑梗疾病的作用，无法改善脑梗病人的最终生理状态，由此可见采用PEG修饰改善蛋白多肽类的药理药效或药代性质具有较高的个体差异性。
实施例5：PEG-KLK1偶联物和原蛋白治疗糖尿病引起的肾病的药效比较
糖尿病肾病动物模型采用db/db小鼠（购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，SPF级，8周龄，雄性，合格证编号为2007000552656），分别设置模型组，激肽释放酶（购于常州千红生化制药股份有限公司）原蛋白组和偶联物3组。给药剂量为2ug/kg（按蛋白质量计算），尾静脉给药，其中模型组和原蛋白组每周给药一次，偶联物3组每2周给药一次，连续给药2个月后检测尿量、尿蛋白、尿素氮和尿肌酐。（尿蛋白检测试剂盒、尿肌酐检测试剂盒、尿素氮检测试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司）
检测结果见图5，由实验结果可以看出，与模型组相比，原蛋白组和偶联物3组的实验动物在尿量、尿蛋白、尿肌酐和尿素氮的数值都有显著下降，说明激肽释放酶对于治疗由糖尿病引起的肾病具有明显的治疗效果。另外偶联物3组和原蛋白组比较，尿蛋白、尿肌酐尿素氮均有更明显的减少。根据实验设置可知，偶联物3组是每两周给药一次，原蛋白组是一周给药一次，综合分析，偶联物3组的药效明显优于原蛋白组，说明激肽释放酶经PEG修饰后体内半衰期明显延长，使得药效也有了较为显著的改善。
实施例6：PEG-KLK1偶联物的免疫原性
本实施例测定了不同PEG-KLK1偶联物的对小鼠的相对免疫原性，并和原蛋白进行了比较。试验分偶联物2组、偶联物3组、尤瑞克林组及原蛋白组，以每周两次的频率，连续4w的方法给小鼠尾静脉注射1mg/kg（按蛋白质量计算）的上述蛋白。在给药结束1周后从眼眶取血。通过间接ELISA测定血清中抗激肽释放酶抗体的水平。结果如图6中所示。
从结果可以得出，偶联物2和偶联物3对小鼠的抗体滴度均远远低于猪胰脏激肽释放酶和人尿来源的尤瑞克林，说明PEG修饰后能够明显降低蛋白的免疫原性，且偶联物3的对小鼠相对免疫原性略低于偶联物2。
实施例7：PEG-KLK1偶联物的药代动力学研究
本实施例采用125I同位素标记示踪法对PEG修饰前后的激肽释放酶的体内血药浓度进行了研究。其中，为了减少大鼠甲状腺对标记药物的吸收，实验前约8h腹腔注射1%KI（国药集团）溶液1mL饱和大鼠的甲状腺。将大鼠随机分为偶联物3组、激肽释放酶组、尤瑞克林组三组，每组8只，雌雄各半（购自浙江省实验动物中心）。
具体操作方法如下：
1.放射性碘取代蛋白质分子中氨基酸残基苯环上的羟基，得到具有放射性示踪作用的125I上述蛋白。
2.用苦味酸在其身上按照编号规则进行编号，称重。用大鼠固定器固定后，由尾静脉注射给药（1.5U/kg）。给药后立即放开大鼠，自由活动，自由饮水和喂食。
3.分别于给药后1min，3min、10min、20min、40min、60min、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h从眼眶取血约0.2mL，并加入EDTA抗凝。
4.5000rpm/3min离心分离大鼠血浆，用伽马计数器（安可中佳，GC-911）测定血浆放射性活度，测量时间为1min。
5.放射性活度测量完毕后回收血浆，HPLC（岛津LC-20AT）分离未降解的蛋白原性药物。药时曲线如图6所示，各参数的计算见表3所示。
表3PEG-KLK1偶联物3和激肽释放酶、尤瑞克林药药代动力学参数比较
| Sample | T1/2β(h) | AUC(μg/L*h) | CL(L/h/kg) | V(L/kg) |
| 激肽释放酶 | 18.81 | 18.59 | 0.13 | 3.53 |
| 阳性对照1（尤瑞克林） | 17.49 | 11.68 | 0.21 | 5.16 |
| 偶联物3 | 20.03 | 113.62 | 0.02 | 0.64 |
实验结果表明，上述药物的药动学模型属于二房室模型。偶联物3的药代参数与原蛋白、尤瑞克林的参数相比，半衰期明显延长，并且药时曲线下面积（AUC）有了显著提高。其次，偶联物3的在血液中的清除速率也显著低于原蛋白和阳性对照，且三组中偶联物3的表观分布容积最小，说明偶联物3比其他两种未修饰蛋白更加集中在血浆中。由此可见，未修饰的激肽释放酶以及人尿来源的尤瑞克林相比，激肽释放酶经PEG修饰所得的偶联物3的半衰期显著提高，血液中代谢速度明显降低，有效的延长了激肽释放酶的药效时间。
实施例8：PEG-KLK1偶联物和原蛋白的圆二色谱图分析
用圆二色光谱仪可以表征修饰蛋白以及未修饰蛋白的二级结构及三级结构。蛋白浓度范围是0.1～0.2mg/mL。样品加入1mm光径的圆二色比色杯，检测其远紫外区（190nm-250nm）和近紫外区（253nm-480nm）的圆二色光谱，扫描带宽为1nm，扫描速度为500nm/min。每次检测以相应缓冲液为背景，测三次取平均值。由图8a可以看出，偶联物2和偶联物3的远紫外区圆二色谱图和原蛋白相比，偶联物的光谱几乎没有发生峰的位移，这说明PEG修饰没有影响KLK1的二级结构。由图8b可以看出，偶联物2和偶联物3的近紫外区圆二色谱图和原蛋白相比，偶联物的光谱几乎没有发生峰的位移，这说明PEG修饰没有影响KLK1的三级结构。总体看来，通过不同修饰剂制备的偶联物，KLK1的高级结构基本没有发生改变。由于偶联物经过PEG修饰后，其结构未变化，因此其活性和原蛋白比较，损失较少。实施例2的数据也验证了这一点。并且这个结果也符合PEG修饰的一般规律，大多数蛋白药物在被PEG修饰后，其高级结构都没有发生改变。
实施例9：偶联物3的PEG修饰位点的鉴定
为了确定偶联物3的PEG修饰位点，我们对偶联物三进行了胰蛋白酶的酶解实验，并和原蛋白的酶解图谱做比较。通过比较原蛋白和修饰产物肽段的差异，可以确定PEG的修饰位点。具体实验步骤如下，取浓度为0.5mg/mL样品100μL加入0.9μL浓度为1mg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃反应5h。反应结束后加入10%（v/v）的TFA对反应进行终止。酶解产物使用C18反相色谱柱（购自Waters公司）进行分析，流动相分别为：A液H2O+0.1%wtTFA，B液乙腈+0.1%（v/v）TFA，上样量为80μL，流速为0.5mL/min，运行时间为120min。梯度洗脱条件：0-100min5%-60%（v/v）B。肽图的比较结果如图9所示，由图可以看出，和原蛋白的图谱相比，偶联物3的N末端肽段已经消失，但在68min出现了PEG修饰的N末端的峰，说明PEG确实是偶联到了KLK1的N末端氨基酸上，与预期结果一致。
实施例10：酵母表达的重组人激肽释放酶（hK1）的制备
（一）基因设计
根据GenBank登录号AAA59455的序列对该基因进行密码子优化后得到本发明的重组hK1基因，如SEQ ID No：3所示。
（二）重组hK1基因的表达质粒构建
1.将优化后的重组hK1全基因合成的片段，构建到pUC57质粒（购自南京金斯瑞生物科技有限公司）中，得到一种长期保存质粒，将该质粒记为pUC57-opt-hK1质粒。
2.以pUC57-opt-hK1质粒为模板，上、下游引物分别引入Xho I和Not I酶切位点，进行PCR扩增，所用引物序列如下：
上游引物：
P1:GCCGCTCGAGAAGAGAGAAGCAGAGGCTATCGTC
下游引物：
P2:AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAACTATTTTCAGCGAT
反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Q5超保真DNA聚合酶（M0491S，购自New England Biolabs公司），2U/μL，。反应条件为98℃10s、55℃30s、72℃30s，25个循环后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小（760bp）一致。将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化。纯化后，用Xho I和Not I双酶切，用T4连接酶连接到pPICZαA（V19520，购自Invitrogen）中，转化到DH5α感受态细胞中，在含有Zeocin的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到重组hK1一种形式的表达质粒，记为pPICZα-opt-hK1。
（三）重组hK1蛋白酵母工程菌株的构建
按照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书的方法将X-33菌株（C18000，购自Invitrogen）制备成电感受态细胞。将得到的含有pPICZα-opt-hK1质粒，用Sac I限制性内切酶酶切线性化，乙醇沉淀后将线性化载体，电转化进入到X-33感受态酵母细胞，涂布到含有Zeocin的YPD固体培养基，30℃培养直到克隆长出。
（四）重组hK1蛋白的表达
挑取hK1的X-33阳性单克隆菌株于5mL BMGY培养基中，于50mL无菌离心管中30℃,220rpm培养，至OD600=1.0-2.0时，取1mL保存菌种，并将剩余菌液重悬后转移到BMMY中小量诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓度为1%wt。一周后，离心收集菌液上清。
（五）重组hK1蛋白的表达及纯化
1.发酵液的除杂预处理
将重组hK1发酵液，12000rpm，15min低温离心收集上清，加入高浓度(NH)2SO4溶液，使其在上清中终浓度为1.0M，0.45μm滤膜过滤。
2.HisTrap Phenyl HP疏水层析
运用全自动智能蛋白纯化系统（AKTA avant150，购自GE healcare）UNICORN6.1操作软件中DOE方法优化对预处理获得的重组hK1发酵液HisTrap Phenyl HP纯化工艺，最终确定为平衡缓冲液为20mM磷酸钠，1.0M(NH)2SO4，10%甘油，pH6.0，洗脱缓冲液为20mM磷酸盐，10%甘油，pH6.0。按照0.2M逐步递减(NH)2SO4浓度等度洗脱的方法，收集各个洗脱峰，分离后的样品用SDS-PAGE鉴定。结果如图10，由糖基化修饰导致的分子量大小不一致的两条重组hK1蛋白得到完全分离。
实施例11：酵母表达的重组人激肽释放酶的PEG修饰产物的蛋白电泳分析和活性测定
用Y-PALD-30K修饰剂对实施例10重组表达的较低分子量的人激肽释放酶（hKLK1）进行修饰，修饰后按照实施例1中所述方法制备单修饰产物(Y-PALD-30K-hKLK1)。单修饰产物和原蛋白的电泳结果如图11所示。由图11可以看出，纯化后得到的单修饰产物的条带显示为单一的条带，并且相比较于原蛋白，分子量显著提高，达到了130KDa左右。因为PEG能够结合大量水分子，因此电泳时其表观分子量会显著大于其实际分子量。按照实施例2的实验方法对其修饰前后的人激肽释放酶（hKLK1）的活性进行了测定，活性测定结果表明修饰后的hKLK1，保留了修饰前原蛋白85%的活性，由此可见，Y-PALD-30K-hKLK1的药效和药代实验结果和原蛋白相比，也将有有显著改善。
实施例12：CHO细胞表达的重组人激肽释放酶的制备
（一）基因设计
以GenBank登录号AAA59455序列对该基因进行密码子优化后得到本发明的重组hK1基因，如SEQ ID No：4所示。
（二）重组hK1基因的表达质粒构建
将优化后的重组hK1全基因合成的片段，构建到pUC57质粒（由南京金斯瑞生物科技有限公司提供）中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-opt-hK1质粒。
以pUC57-opt-hK1质粒为模板，上游引物P3引入AvrII和下游引物P4引入BstZ171酶切位点，进行PCR扩增，所用引物序列如下：
上游引物P3:CATGCCTAGGGCCACCATGTCCGCTCTGCT
下游引物P4:GGGCGTATACTCAACTGTTTTCAGCAATGGT
反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶为Q5High-Fidelity DNA Polymerase，2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃10秒、55℃20秒、72℃30秒，25个循环后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小（780bp，如图7所示）一致。将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化。纯化后，用AvrII(R0104S，购于New England Biolabs)和BstZ171（R0136S，购于New EnglandBiolabs），用T4连接酶连接到pCHO1.0质粒（A1369601，购于Invitrogen）中，转化到Top10感受态细胞（CB104，购于北京天根生化）中，在含有卡那霉素（0408-100G，购于Amresco）的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到重组hK1一种形式的表达质粒，记为pCHO1.0-opt-hK1
（三）CHO阳性克隆制备
分别在24孔板中加入适量的CHO-S（A1369601，购于Invitrogen）细胞，再依次加入含不同浓度嘌呤霉素的CD FortiCHO（A1148301，购于Invitrogen）培养基。2周后，MTT方法确定嘌呤霉素工作浓度在5-10ug/mL之间，本申请中嘌呤霉素工作浓度起始为10μg/mL。
将测序正确的pCHO1.0-opt-hK1质粒通过NruI（R0192S，购于Invitrogen）线性化，电转染到CHO-S细胞中后，分别加入嘌呤霉素和MTX进行筛选，一周后计算细胞活率，当细胞活率大于30%以上转移到摇床中，并通过不断增加嘌呤霉素和MTX浓度来加压筛选直到通过表达量评价。通过有限稀释法筛选单克隆细胞株，蛋白免疫印迹鉴定高表达细胞株。
（四）重组hK1在哺乳动物细胞CHO中的表达
将含有表达重组hK1的单克隆细胞株CHO-S接种于CD FortCD培养基中，37℃，8%CO2，130rpm摇床中培养。当细胞密度达到要求后，每隔一天流加2g/L的葡萄糖并取样，检测细胞的活率和密度，直到细胞的活率低于70%时，收集含有重组人激肽释放酶的培养基。每天流加葡萄糖，收集上清培养液免疫印迹图鉴定，结果见图12。实验结果显示，CHO-S可高效表达重组hK1蛋白，并且，由于糖修饰化的不同，重组hK1蛋白分子量分布也略为宽泛。
实施例13：CHO细胞表达的重组人激肽释放酶的PEG修饰产物的HPLC分析和活性测定
用Y-PALD-30K修饰剂对实施例12制备的重组CHO细胞表达的人激肽释放酶进行修饰，修饰后按照实施例1中所述方法制备单修饰产物(Y-PALD-30K-rhKLK1)。单修饰产物的HPLC分析结果如图13所示。由图13可以看出，纯化后得到的单修饰产物的纯度较高，达到了98%以上。且峰的位置和原蛋白相比，明显左移。说明经过PEG修饰后，其分子量有了显著提高。按照实施例2的实验方法对其修饰前后的人激肽释放酶的活性进行测定，活性测定结果表明修饰后的rhKLK1，保留了修饰前原蛋白88%的活性，这也和实施例2以及实施例11中的结果类似，由此可见，Y-PALD-30K-rhKLK1的药效和药代实验结果和原蛋白相比，也将有有显著改善。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司
常州京森生物医药研究所有限公司
<120> 聚乙二醇化的组织激肽释放酶及其制备方法和应用
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 239
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 1
Ile Ile Gly Gly Arg Glu Cys Glu Lys Asp Ser His Pro Trp Gln Val
1 5 10 15
Ala Ile Tyr His Tyr Ser Ser Phe Gln Cys Gly Gly Val Leu Val Asp
20 25 30
Pro Lys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys Asn Asp Asn Tyr Gln
35 40 45
Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Asn Glu Val Thr Ala Gln
50 55 60
Phe Phe Gly Val Thr Ala Asp Phe Pro His Pro Gly Phe Asn Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Lys Asn His Thr Lys Ala Asp Gly Lys Asp Tyr Ser His Asp
85 90 95
Leu Met Leu Leu Arg Leu Gln Ser Pro Ala Lys Ile Thr Asp Ala Val
100 105 110
Lys Val Leu Glu Leu Pro Thr Gln Glu Pro Glu Leu Gly Ser Thr Cys
115 120 125
Gln Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Gly Pro Asp Asp Phe Glu
130 135 140
Phe Pro Asp Glu Ile Gln Cys Val Glu Leu Thr Leu Leu Gln Asn Thr
145 150 155 160
Phe Cys Ala Asp Ala His Pro Asp Lys Val Thr Glu Ser Met Leu Cys
165 170 175
Ala Gly Tyr Leu Pro Gly Gly Lys Asp Thr Cys Met Gly Asp Ser Gly
180 185 190
Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Met Trp Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly
195 200 205
His Thr Pro Cys Gly Ser Ala Asn Lys Pro Ser Ile Tyr Thr Lys Leu
210 215 220
Ile Phe Tyr Leu Asp Trp Ile Asn Asp Thr Ile Thr Glu Asn Pro
225 230 235
<210> 2
<211> 238
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Gln His Ser Gln Pro Trp Gln Ala
1 5 10 15
Ala Leu Tyr His Phe Ser Thr Phe Gln Cys Gly Gly Ile Leu Val His
20 25 30
Arg Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Ser Asp Asn Tyr Gln
35 40 45
Leu Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Asp Asp Glu Asn Thr Ala Gln
50 55 60
Phe Val His Val Ser Glu Ser Phe Pro His Pro Gly Phe Asn Met Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Asn His Thr Arg Gln Ala Asp Glu Asp Tyr Ser His Asp
85 90 95
Leu Met Leu Leu Arg Leu Thr Glu Pro Ala Asp Thr Ile Thr Asp Ala
100 105 110
Val Lys Val Val Glu Leu Pro Thr Gln Glu Pro Glu Val Gly Ser Thr
115 120 125
Cys Leu Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Asn Phe Ser Phe
130 135 140
Pro Asp Asp Leu Gln Cys Val Asp Leu Lys Ile Leu Pro Asn Asp Glu
145 150 155 160
Cys Lys Lys Ala His Val Gln Lys Val Thr Asp Phe Met Leu Cys Val
165 170 175
Gly His Leu Glu Gly Gly Lys Asp Thr Cys Val Gly Asp Ser Gly Gly
180 185 190
Pro Leu Met Cys Asp Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr
195 200 205
Val Pro Cys Gly Thr Pro Asn Lys Pro Ser Val Ala Val Arg Val Leu
210 215 220
Ser Tyr Val Lys Trp Ile Glu Asp Thr Ile Ala Glu Asn Ser
225 230 235
<210> 3
<211> 717
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atcgtcggtg gatgggaatg tgagcaacat tctcagccat ggcaagcagc tttgtaccac 60
ttttccacct tccagtgtgg tggaattttg gttcatagac aatgggtcct tactgccgca 120
cactgcatct ctgataacta tcagttgtgg cttggtagac ataacttgtt tgatgacgaa 180
aatactgccc aattcgttca tgtctcagag agttttccac accctggttt caacatgtct 240
ttgcttgaaa atcatactag acaggctgat gaggactact cccacgattt gatgttgctt 300
agacttacag aaccagccga taccattact gacgcagtta aggttgtcga gttgccaaca 360
caagaacctg aggttggttc aacctgtttg gcttctggtt ggggttctat tgaaccagag 420
aactttagtt tccctgatga cttgcagtgt gttgatttga agatccttcc taatgacgaa 480
tgcaagaaag ctcatgttca aaaagtcaca gatttcatgt tgtgtgttgg tcaccttgaa 540
ggtggaaagg atacctgtgt tggagactct ggtggaccat tgatgtgcga cggtgttctt 600
caaggagtca cttcatgggg ttatgttcct tgcggaacac caaacaagcc tagtgtcgca 660
gttagagtcc ttagttatgt caagtggatc gaagatacaa tcgctgaaaa tagttag 717
<210> 4
<211> 717
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
atcgtcgggg gttgggagtg tgaacagcat agtcagccct ggcaggccgc tctgtaccac 60
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cattgtatta gcgataacta tcagctgtgg ctgggccggc ataacctgtt cgacgatgag 180
aataccgccc agtttgtgca cgtctcagaa tccttccccc atcctggctt caacatgagt 240
ctgctggaga atcacaccag gcaggctgac gaagattact cacatgacct gatgctgctg 300
cgactgacag agccagcaga cactatcacc gatgctgtga aggtggtcga gctgcccaca 360
caggaacctg aagtgggctc tacttgcctg gcaagcggat ggggttctat cgagcctgaa 420
aacttcagtt ttccagacga tctgcagtgc gtggacctga agattctgcc taatgatgag 480
tgtaagaaag ctcacgtcca gaaagtgact gattttatgc tgtgcgtggg gcatctggag 540
ggaggcaagg acacctgcgt cggcgactcc ggaggacctc tgatgtgtga cggggtgctg 600
cagggtgtca ctagctgggg ctacgtgcca tgtggaaccc caaataagcc ctccgtggcc 660
gtcagagtgc tgagctatgt gaaatggatc gaggacacca ttgctgaaaa cagttga 717
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gccgctcgag aagagagaag cagaggctat cgtc 34
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaggaaaaaa gcggccgcct aactattttc agcgat 36
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
catgcctagg gccaccatgt ccgctctgct 30
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gggcgtatac tcaactgttt tcagcaatgg t 31
Claims (10)
1.聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于，其中聚乙二醇为分子量为20-40kDa的聚乙二醇，其中所述聚乙二醇在组织激肽释放酶的N端伯氨基上偶联。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于所述聚乙二醇通过丙醛基团与组织激肽释放酶的N端伯氨基偶联。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于所述聚乙二醇分子为直链型或分支型。
4.根据权利要求3所述的聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于所述聚乙二醇为分支型聚乙二醇衍生物，其中活化基团为丙醛、丁醛、乙醛或戊醛。
5.根据权利要求1所述的聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于所述聚乙二醇化的组织激肽释放酶的结构通式如下所示：
其中R为H或C1-C4的烷基；n为10到1150的整数值，p为1-3的整数；AA为N端的L-氨基酸残基，m为0-5的整数。
6.根据权利要求5所述的聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于所述烷基为甲基，n为57-455之间的整数值，p为2，m为0，所述KLK1具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的序列。
7.根据权利要求6所述的聚乙二醇化的组织激肽释放酶，其特征在于所述n为227-455之间的整数。
8.聚乙二醇化的组织激肽释放酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1，用10-50mMpH4-6的乙酸钠缓冲液配制0.1-30mg/mL的组织激肽释放酶溶液；步骤2，按摩尔比组织激肽释放酶:PEG:还原剂=1:(2-25):(20-1000)在4℃-37℃的条件下反应0.1-24h；步骤3，反应结束后以色谱法纯化处理，最终得到单修饰的聚乙二醇化的组织激肽释放酶；其中，所述还原剂优选为氰基硼氢化钠。
9.权利要求1～7任一所述聚乙二醇化的组织激肽释放酶在制备治疗脑卒中或糖尿病肾病药物中的应用。
10.一种治疗脑卒中或糖尿病肾病的药物，其特征在于有效成分为权利要求1～7任一项所述聚乙二醇化的组织激肽释放酶及其药学上可接受的盐及其复合物。
Priority Applications (4)
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