JP2018522825A - リポソームナノ構造並びにそれを製造及び使用する方法 - Google Patents

Abstract

本明細書では、ａ）リゾリン脂質及び光増感剤を含むコンジュゲート；ｂ）第１のリン脂質及び歪んだシクロオクチン部分を含む第１の誘導体化リン脂質；ｃ）第２のリン脂質及びポリエチレングリコールポリマーを含む第２の誘導体化リン脂質；及びｄ）カチオン性脂質又はアニオン性脂質を含むリポソームが提供される。本明細書ではまた、ａ）リゾリン脂質及び光増感剤を含むコンジュゲート；ｂ）第１のリン脂質及び標的部分を含む第１の誘導体化リン脂質；ｃ）第２のリン脂質及びポリエチレングリコールポリマーを含む第２の誘導体化リン脂質；及びｄ）カチオン性脂質又はアニオン性脂質を含むリポソームも提供される。本明細書で提供されるリポソームは、例えば、癌の処置又は癌腫瘍の画像化に使用され得る。

Description

優先権の主張
本出願は、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、２０１５年５月２６日出願の米国仮特許出願第６２／１６６，３５３号明細書の利益を請求する。

本開示は、コンジュゲート光増感剤を含むリポソームに関する。

ナノスケール薬物送達システム（例えば、リポソーム）は、栄養物及び薬物の選択的な分子標的への放出を可能にする。リポソームは、リン脂質含有外層（例えば、ホスファチジルコリン及び／又は卵ホスファチジルエタノールアミンを含有する）及び水性コアから構成される場合が多い。リポソームのタイプの例としては、多層小胞（いくつかのラメラ相脂質二重層を含む）、小さい単層小胞（１つの脂質二重層を含む）、大きい単層小胞、及び蝸牛小胞が挙げられる（例えば、国際公開第０９０３２７１６号パンフレットを参照されたい）。疎水性領域及び親水性領域の両方の存在により、リポソームは、例えば、薬物、ＤＮＡ、及び／又は他の生理活性分子を含む疎水性及び／又は親水性分子を充填することができる。リポソームの表面に、特定の標的に結合するようにリガンドを付加することができ、従って、リポソーム内に充填された分子の標的への選択的送達が可能となる。リポソームは、例えば、細胞膜の二重層との融合（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３８（３）：２０７−２３２，１９９３を参照されたい）を含む様々な手段又はマクロファージ食作用によって分子を放出する。

本明細書では、ａ）リゾリン脂質及び光増感剤を含むコンジュゲート；ｂ）第１のリン脂質及び歪んだ（ｓｔｒａｉｎｅｄ）シクロオクチン部分を含む第１の誘導体化リン脂質；ｃ）第２のリン脂質及びポリエチレングリコールポリマーを含む第２の誘導体化リン脂質；及びｄ）カチオン性脂質又はアニオン性脂質を含むリポソームが提供される。本明細書ではまた、ａ）リゾリン脂質及び光増感剤を含むコンジュゲート；ｂ）第１のリン脂質及び標的部分を含む第１の誘導体化リン脂質；ｃ）第２のリン脂質及びポリエチレングリコールポリマーを含む第２の誘導体化リン脂質；及びｄ）カチオン性脂質又はアニオン性脂質を含むリポソームも提供される。本明細書で提供されるリポソームは、例えば、癌の処置又は癌腫瘍の画像化に使用され得る。

本明細書では、患者の癌を処置する方法が更に提供され、この方法は、治療有効量の、本明細書で提供されるリポソームを患者に投与するステップ；及びこの患者に放射線を照射してこのリポソームを破壊するステップを含む。

本明細書で提供されるリポソームは、患者の癌を画像化するためにも使用され得る。一部の実施形態では、この方法は、治療有効量の、本明細書で提供されるリポソームを患者に投与するステップ；この患者に放射線を照射してこのリポソームを破壊するステップ；及び患者を画像化するステップを含む。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細が添付の図面及び以下の説明で示される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

（１）脂質二重層内に埋め込まれたＢＰＤを含むリポソーム、（２）１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤにコンジュゲートしたＢＰＤを含むリポソーム、及び（３）２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤにコンジュゲートしたＢＰＤを含むリポソームについての、ＯＶＣＡＲ−５細胞内のリポソーム調合物中のＢＰＤの濃度に対するＢＰＤ蛍光強度の中央値を示す。 ５％、４％、３％、２％、１％、及び０．５％のリン脂質１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ_２０００）の取り込みによって立体的に安定化された、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤを含むリポソームのＺ平均直径及び多分散性指数を示す。 それぞれＤＯＴＡＰを含む、ＤＯＰＧを含む、又は追加の電荷を含まないＡＤＩＢＯ修飾、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ含有リポソームについてのζ電位、Ｚ平均直径、及び多分散性指数（ＰＤＩ）を示す。 それぞれＤＯＴＡＰを含む、ＤＯＰＧを含む、又は追加の電荷を含まないＡＤＩＢＯ修飾、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ含有リポソームについてのζ電位、Ｚ平均直径、及び多分散性指数（ＰＤＩ）を示す。 それぞれＤＯＴＡＰを含む、ＤＯＰＧを含む、又は追加の電荷を含まないＡＤＩＢＯ修飾、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ含有リポソームについてのζ電位、Ｚ平均直径、及び多分散性指数（ＰＤＩ）を示す。 ＯＶＣＡＲ−５細胞、Ａ４３１細胞、及びＴ４７Ｄ細胞での非標的ＤＯＴＡＰ含有及びＤＯＰＧ含有リポソームの細胞最新情報の定量化（ｐモル１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ／μｇ細胞タンパク質）を示す。 （１）Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ（一番上のプロット）を含むリポソーム、（２）Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ及びアジド（真中のプロット）を含むリポソーム、及び（３）Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＰＢＤ（一番下のプロット）を含まないリポソームの６９０ｎｍの光でのフルエンス（光線量）に対する倍率放出（ｆｏｌｄ ｒｅｌｅａｓｅ）を示す。 銅フリーのクリック化学によってセツキシマブ−プロテインＺに結合したリポソーム表面の概略図である。プロテインＺは、任意のＩｇＧ分子（例えば、セツキシマブ）のＦｃ領域に部位特異的に結合して、非天然ベンゾイルフェニルアラニンアミノ酸によって光架橋している。ペプチド結合プロテインＺの末端アジドは、最適な表面モル比のＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ、歪んだシクロオクチン誘導体化リン脂質にクリックコンジュゲートしている。 銅フリーのクリック化学によってセツキシマブ−プロテインＺに結合したリポソーム表面の概略図である。プロテインＺは、任意のＩｇＧ分子（例えば、セツキシマブ）のＦｃ領域に部位特異的に結合して、非天然ベンゾイルフェニルアラニンアミノ酸によって光架橋している。ペプチド結合プロテインＺの末端アジドは、最適な表面モル比のＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ、歪んだシクロオクチン誘導体化リン脂質にクリックコンジュゲートしている。 銅フリーのクリック化学によってアジド−セツキシマブＺに結合したリポソーム表面の概略図である。標的タンパク質（例えば、セツキシマブ）に確率的に付着したＰＥＧ４分子の末端アジドは、最適なモル比のＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ、歪んだシクロオクチン誘導体化リン脂質にクリックコンジュゲートしている。 銅フリーのクリック化学によってアジド−セツキシマブＺに結合したリポソーム表面の概略図である。標的タンパク質（例えば、セツキシマブ）に確率的に付着したＰＥＧ４分子の末端アジドは、最適なモル比のＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ、歪んだシクロオクチン誘導体化リン脂質にクリックコンジュゲートしている。 それぞれ部位特異的アジドコンジュゲートの紫外−可視スペクトル及び構造概略図を示す。アジド部分のセツキシマブへの確率的導入は、ＰＥＧ４−アジドのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを用いて達成した。単一フルオロフォア（部位特異的セツキシマブでは５−ＦＡＭ、確率的セツキシマブではＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８）を各抗体コンジュゲートに導入した。プロテインＺのセツキシマブに対する比率は、１．１３±０．１７である。 それぞれ部位特異的アジドコンジュゲートの紫外−可視スペクトル及び構造概略図を示す。アジド部分のセツキシマブへの確率的導入は、ＰＥＧ４−アジドのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを用いて達成した。単一フルオロフォア（部位特異的セツキシマブでは５−ＦＡＭ、確率的セツキシマブではＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８）を各抗体コンジュゲートに導入した。プロテインＺのセツキシマブに対する比率は、１．１３±０．１７である。 それぞれＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８を取り込んだ確率的アジドコンジュゲートの紫外−可視スペクトル及びその構造概略図を示す。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８のセツキシマブに対する比率は、１．００±０．０４である。 それぞれＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８を取り込んだ確率的アジドコンジュゲートの紫外−可視スペクトル及びその構造概略図を示す。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８のセツキシマブに対する比率は、１．００±０．０４である。 部位特異的（図９Ａ）及び確率的（図９Ｂ）コンジュゲーションのリポソームサイズ（各図面の一番上のプロット）及び多分散性指数（各図面の下側のプロット）の比較を示す。 部位特異的（図９Ａ）及び確率的（図９Ｂ）コンジュゲーションのリポソームサイズ（各図面の一番上のプロット）及び多分散性指数（各図面の下側のプロット）の比較を示す。 ８０ｋＶの加速電圧及び４６，０００倍の拡大で画像化された、セツキシマブ−プロテインＺに部位特異的にクリックコンジュゲートしたリポソームの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。 部位特異的（左の一番上のプロット）及び確率的（左の下側のプロット）コンジュゲーションについてのζ電位とコンジュゲーション効率との比較を示す。 部位特異的（一番上のプロット）及び確率的（下側のプロット）コンジュゲーションについての１リポソーム当たりのコンジュゲートしたセツキシマブの数とコンジュゲーション効率との比較を示す。 Ａ４３１細胞（高ＥＧＦＲ；一番上のプロット）、Ｔ４７Ｄ細胞（低ＥＧＦＲ；真中のプロット）、及びＣＨＯ−ＷＴ細胞（ＥＧＦＲなし；下側のプロット）における結合選択性の比較を示す。 Ａ４３１細胞（高ＥＧＦＲ；一番上のプロット）、Ｔ４７Ｄ細胞（低ＥＧＦＲ；真中のプロット）、及びＣＨＯ−ＷＴ細胞（ＥＧＦＲなし；下側のプロット）におけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含むリポソーム−セツキシマブコンジュゲートの結合選択性の比較を示す。 標的リポソーム及び非特異的リポソーム、並びにＥＧＦＲが遮断されたときの標的リポソーム及び非特異的リポソームのフローサイトメトリーのデータを示す。 セツキシマブに部位特異的及び確率的にコンジュゲートした１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤリポソームを用いた選択的光線力学療法後の細胞生存率を示す。 トラスツズマブ（抗ＨＥＲ−２抗体、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））及びトランスフェリン（トランスフェリン受容体の天然リガンド）の確率的アジド修飾が、ＡＤＩＢＯ修飾、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ含有リポソームにクリックしたときに結合の細胞選択性を示すことを実証している。 １６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤが膜に閉じ込められていないＡＤＩＢＯ修飾リポソームに、水溶性光増感剤クロリンｅ６モノエチレンジアミンモノアミド（ＣＭＡ）が充填され、セツキシマブに確率的にコンジュゲートしたときに細胞選択性を提供することを示す。 リポソームの概略図を示す。 漸進的時間間隔での、ＯＶＣＡＲ−５細胞における非標的及び確率的標的リポソームの共焦点蛍光顕微鏡画像を示し、標的リポソームの細胞内への内部移行を示唆している。 ０．２％ ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＮＨ_２をＡＤＩＢＯ修飾リポソーム内に取り込み、近赤外線色素のアミン反応性ＮＨＳ−エステルとコンジュゲートさせて、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングに使用できる安定したクリック反応性リポソームのパネルを形成したことを示す。 様々な色素を含むリポソームのサイズ及び多分散性指数を示す。 それぞれの紫外−可視スペクトルを示す。 １リポソーム当たりのセツキシマブ−プロテインＺ（Ｃｅｔ−Ｐｚ）密度の関数としてリサミンローダミンＢの強度の中央値を示し、蛍光標識リポソームが、Ｔ４７Ｄ細胞（低ＥＧＦＲ；下側のプロット）と比較して、Ａ４３１細胞（高ＥＧＦＲ；上側のプロット）に選択的に結合することを実証している。 時間に対するＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤ（上側のプロット）及びＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ（下側のプロット）の平均補正蛍光を示し、ｓｈａｍヒトＩｇＧ１対照にクリックコンジュゲートした同時注射ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識リポソームと比較した、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）にクリックコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ標識リポソームの皮下Ｕ２５１腫瘍に対する選択的結合性を実証している。 標的リポソーム（各対の右のバー）が非標的リポソーム（バーの各対の左のバー）よりもＡ４３１腫瘍に対して選択的であったことを示す。 １６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤの蛍光を使用して生体内分布を定量的に画像化し、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤリポソーム対照を含む非コンジュゲートＤＩＢＯと比較した、０．２５ｍｇ／ｋｇのＢＰＤ当量の投与から２４時間後の、皮下Ａ４３１（高ＥＧＦＲ）腫瘍を有するマウスでの確率的にクリックコンジュゲートしたリポソームの腫瘍選択性を確認できることを示す。 図示されているＰＥＧ鎖を有する１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ光増感剤を含むリポソームの構造概略図を示す。 二重層内又はコア封入ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子内に作用物質を含む標的リポソームの概念図である。 フローサイトメトリーのデータを提供し、このデータは、１リポソーム当たりｖ０、１０、５０、又は１００のセツキシマブ−プロテインＺコンジュゲート（Ｃｅｔ−Ｐｚ）と反応したリポソームからの光増感剤（ＢＰＤ）の強度の中央値を示す。 リポソーム膜から生じた光増感剤（ＢＰＤ）の強度の中央値を示すフローサイトメトリーのデータを提供する。 プロテインＺに付着した蛍光標識ペプチドから生じた５−ＦＡＭの蛍光強度の中央値を示す。 図３０Ａ（高ＥＧＦＲ）に示されているＡ４３１細胞及び図３０Ｂ（低ＥＧＦＲ）に示されているＴ４７Ｄ細胞におけるＢＰＤの蛍光強度の中央値と、セツキシマブに結合した５−ＦＡＭプロテインＺとの間の相関性を示す。高い相関係数は、リポソームにクリックコンジュゲーションしたセツキシマブの完全性を示唆する。 図３０Ａ（高ＥＧＦＲ）に示されているＡ４３１細胞及び図３０Ｂ（低ＥＧＦＲ）に示されているＴ４７Ｄ細胞におけるＢＰＤの蛍光強度の中央値と、セツキシマブに結合した５−ＦＡＭプロテインＺとの間の相関性を示す。高い相関係数は、リポソームにクリックコンジュゲーションしたセツキシマブの完全性を示唆する。 フローサイトメトリーのデータを示し、ＢＰＤの強度の中央値は、５０，０００の個々に測定された細胞の平均である。細胞を、１リポソーム当たり５０のセツキシマブにクリックコンジュゲートしたリポソーム（図３１Ａ）及び非コンジュゲートリポソーム（図３１Ｂ）と共に３０分間、９０分間、又は１８０分間インキュベートした。リポソームの選択性（図３１Ｃ）は、標的リポソームと共にインキュベートされた細胞のＢＰＤの強度の中央値を、非特異的リポソームと共にインキュベートされた細胞のＢＰＤの強度の中央値で除した値を表している。 フローサイトメトリーのデータを示し、ＢＰＤの強度の中央値は、５０，０００の個々に測定された細胞の平均である。細胞を、１リポソーム当たり５０のセツキシマブにクリックコンジュゲートしたリポソーム（図３１Ａ）及び非コンジュゲートリポソーム（図３１Ｂ）と共に３０分間、９０分間、又は１８０分間インキュベートした。リポソームの選択性（図３１Ｃ）は、標的リポソームと共にインキュベートされた細胞のＢＰＤの強度の中央値を、非特異的リポソームと共にインキュベートされた細胞のＢＰＤの強度の中央値で除した値を表している。 フローサイトメトリーのデータを示し、ＢＰＤの強度の中央値は、５０，０００の個々に測定された細胞の平均である。細胞を、１リポソーム当たり５０のセツキシマブにクリックコンジュゲートしたリポソーム（図３１Ａ）及び非コンジュゲートリポソーム（図３１Ｂ）と共に３０分間、９０分間、又は１８０分間インキュベートした。リポソームの選択性（図３１Ｃ）は、標的リポソームと共にインキュベートされた細胞のＢＰＤの強度の中央値を、非特異的リポソームと共にインキュベートされた細胞のＢＰＤの強度の中央値で除した値を表している。 ２０Ｊ／ｃｍ^２の６９０ｎｍのレーザー光でのＰＤＴ処置後のＡ４３１細胞及びＯＶＣＡＲ−５細胞（高ＥＧＦＲ）、並びにＴ４７Ｄ細胞（低ＥＧＦＲ）のＭＴＴアッセイの結果を示す。確率的標的リポソームをこれらの細胞と共に２４時間インキュベートした。 １リポソーム当たりのセツキシマブ−プロテインＺ密度の関数として５−ＦＡＭの蛍光強度の中央値を示し、Ｔ４７Ｄ細胞（下側のプロット）と比較してＡ４３１細胞（上側のプロット）での高い選択性も実証している。最適な密度は、１リポソーム当たりの約１００のＣｅｔ−Ｐｚで生じる。 ５００ｎＭ及び１００ｎＭの濃度のリサミンローダミンＢ（それぞれ一番上のプロット及びその下のプロット）でのＡ４３１細胞、並びに５００ｎＭ及び１００ｎＭの濃度のリサミンローダミンＢ（下側２つのプロット）でのＴ４７Ｄ細胞の最適なセツキシマブ−プロテインＺ密度を示す。 ５００ｎＭ リサミンローダミンＢ当量での、ＧＯＡ＿１１１−ＣｅｔＰｚ（１リポソーム当たり１０のＣｅｔＰｚ）リサミンローダミンＢの強度の中央値を用いた様々な癌細胞株の倍率選択性を示す。１００μＬのリポソーム試料を５０，０００の細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートした。 前述の手順に従って処理されたリポソームの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。 ｎＭ当量のローダミンに対する倍率選択性を示し、セツキシマブにクリックコンジュゲートし、且つ脂質固定ローダミン色素及び疎水性によって閉じ込められた遊離ＢＰＤの両方を含むリポソームが、抗体コンジュゲーションのないリポソームと比較して異なるレベルの選択性を示すことを示している。 ローダミン標識リポソーム（赤色）と共に３０分間インキュベートしたＭＧＧ６細胞ニューロスフェア（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３２４で染色された核、青色）の共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。図３８は、３０分で、セツキシマブ−抗ＥＧＦＲにクリックコンジュゲートした標的リポソームが、非標的リポソーム（図３８Ｂ）と比較して優先的結合（図３８Ａ）を示すことを示す。 ローダミン標識リポソーム（赤色）と共に３０分間インキュベートしたＭＧＧ６細胞ニューロスフェア（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３２４で染色された核、青色）の共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。図３８は、３０分で、セツキシマブ−抗ＥＧＦＲにクリックコンジュゲートした標的リポソームが、非標的リポソーム（図３８Ｂ）と比較して優先的結合（図３８Ａ）を示すことを示す。 脂質固定フルオロフォアリサミンローダミンＢ−ＤＰＰＥを取り込んでいる調合物の一例を提供する。 ３つの試料（５０％（ｖ／ｖ）ＧＯＡ＿１１１＋５×ＡＤＩＢＯ １（一番上のプロット）、５０％（ｖ／ｖ）ＧＯＡ＿１１１＋５×ＡＤＩＢＯ ２（真中のプロット）、及び５０％（ｖ／ｖ）ＧＯＡ＿１１１＋５×ＡＤＩＢＯ ３（一番下のプロット））のサイズ及び多分散性指数を示す。 各試料のサイズ及び多分散性指数を示す。

本明細書では、安定した銅フリークリック化学リポソームが提供される。このリポソームは、光線力学療法剤として作用し得る脂質固定光増感剤分子、フルオロフォア、及び／又はリポソームカーゴの時空的に制御された光誘発性放出のためのメディエーターを安定して取り込むように化学的に最適化されている。リポソームカーゴは、光増感剤と相乗作用し得る、遊離した又はナノ粒子が結合した二次生物学的又は化学的治療薬を含み得る。本明細書で提供されるリポソームは、結合の安定性及び選択性並びに光毒性について化学的に調整される。例えば、このリポソームは、光増感剤及び任意選択のカーゴを選択的に標的にする標的部分、例えば、抗体を含み得る。このリポソームは、近赤外線イメージング剤の安定したモジュール式非干渉コンジュゲーション（ｍｏｄｕｌａｒ ａｎｄ ｎｏｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を更に調整して、標的リポソームの並行した深部組織の追跡と画像化とを可能にすることができる。

例えば、図２７は、本明細書で提供される標的リポソームの概念図である。一部の実施形態では、このリポソームは、二重層内又はコア封入ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子内に作用物質を含む。これらの作用物質は、光増感剤、イメージング剤、薬物、又はキナーゼ阻害剤を含み得る。親水性の光増感剤、イメージング剤、薬物、又はキナーゼ阻害剤は、水性コア内に封入することができる。リポソームの表面は、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯのリポソーム組成物を用いる銅フリーのクリック化学によって標的部分、例えば、抗体にコンジュゲートされる。

本明細書では、ａ）リゾリン脂質及び光増感剤を含むコンジュゲート；ｂ）第１のリン脂質及び歪んだシクロオクチン部分を含む第１の誘導体化リン脂質；ｃ）第２のリン脂質及びポリエチレングリコールポリマーを含む第２の誘導体化リン脂質；及びｄ）カチオン性脂質又はアニオン性脂質を含むリポソームが提供される。

本明細書ではまた、ａ）リゾリン脂質及び光増感剤を含むコンジュゲート；ｂ）第１のリン脂質及び標的部分を含む第１の誘導体化リン脂質；ｃ）第２のリン脂質及びポリエチレングリコールポリマーを含む第２の誘導体化リン脂質；及びｄ）カチオン性脂質又はアニオン性脂質を含むリポソームも提供される。

本明細書で使用される光増感剤は、小分子光線力学療法剤、フルオロフォア、並びに／又は時空的に制御された光トリガーによるリポソームの破壊及び／若しくはリポソームカーゴの放出のためのメディエーターを指す。一部の実施形態では、光増感剤は疎水性である。一部の実施形態では、光増感剤は親水性である。一部の実施形態では、光増感剤は、ポルフィリン光増感剤である。例えば、光増感剤は、ベンゾポルフィリン部分を含む。一部の実施形態では、光増感剤は、ベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）である。

一部の実施形態では、光増感剤は、ポルフィリン、クロリン、バテリオクロリン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、テキサフリン、アントラキノン、アントラサイクリン、ペリレンキノン、キサンテン、シアニン、アクリジン、フェノキサジン、フェノチアジン、トリアリールメタン、カルコゲナピリリウム色素、及びフタレイン色素を含む光増感剤のクラスから選択される。一部の実施形態では、光増感剤は、ベルテポルフィン（３−［（２３Ｓ，２４Ｒ）−１４−エテニル−５−（３−メトキシ−３−オキソプロピル）−２２，２３−ビス（メトキシカルボニル）−４，１０，１５，２４−テトラメチル−２５，２６，２７，２８−テトラアザヘキサシクロ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］オクタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１−ドデカエン−９−イル］プロパン酸）；プロトポルフィリンＩＸ；テモポルフィン（３，３’，３’’，３’’’−（２，３−ジヒドロポルフィリン−５，１０，１５，２０−テトライル）テトラフェノール）；モトキサフィンルテチウム；９−アセトキシ−２，７，１２，１７−テトラキス−（β−メトキシエチル）−ポルフィセン（ＡＴＭＰｎ）；クロリンｅ６；クロリンモノエチレンジアミンモノアミド；プロトポルフィリンＩＸ；亜鉛フタロシアニン；シリコンフタロシアニンＰｃ４；及びナフタロシアニンから選択される。

一部の実施形態では、光増感剤は、リゾリン脂質にコンジュゲートされる。例えば、Ｊ．Ｌｏｖｅｌｌ、Ｃ．Ｊｉｎ、Ｅ．Ｈｕｙｎｈ、Ｈ．Ｊｉｎ、Ｃ．Ｋｉｍ、Ｊ．Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ、Ｗ．Ｃｈａｎ、Ｗ．Ｃａｏ、Ｌ．Ｗａｎｇ、及びＧ．Ｚｈｅｎｇを参照されたい。、マルチモジュール式バイオフォトニック造影剤として使用されるポルフィリン二重層によって形成されるポルフィソームナノ小胞である、２０１１ Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１０，３２４−３３２。一部の実施形態では、光増感剤は水性封入される。一部の実施形態では、光増感剤は、（例えば、ポリエチレングリコールポリマーへのコンジュゲーションによって）本明細書に記載の第２の誘導体化リン脂質にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、光増感剤は、リン脂質のリン酸頭基との反応によって本明細書に記載のリン脂質にコンジュゲートされる（Ｋ．Ａ．Ｒｉｓｋｅ，Ｔ．Ｐ．Ｓｕｄｂｒａｃｋ，Ｎ．Ｌ．Ａｒｃｈｉｌｈａ，Ａ．Ｆ．Ｕｃｈｏａ，Ａ．Ｐ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｃ．Ｍ．Ｍａｒｑｕｅｓ，Ｍ．Ｓ．Ｂａｐｔｉｓｔａ，Ｒ．Ｉｔｒｉ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９７（２００９）１３６２-１３７０を参照されたい）。一部の実施形態では、光増感剤は、リン脂質のアシル鎖にコンジュゲートされる（Ｔ．Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｍ．Ｍｏｒｉｔａｋｅ，Ａ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｅ．Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８（２００２）５４６９-５４８０を参照されたい）。一部の実施形態では、光増感剤は、リポソームの別の成分、例えば、コレステロールにコンジュゲートされる。

本明細書で使用されるリゾリン脂質は、一方又は両方のアシル誘導体が加水分解によって除去されたリン脂質の任意の誘導体である。一部の実施形態では、リゾリン脂質は、脂肪酸鎖に１４〜２２の炭素を含む。例えば、リゾリン脂質は、脂肪酸鎖に１６〜２０の炭素を含み得る。一部の実施形態では、リゾリン脂質は、不飽和脂肪酸鎖を含む。一部の実施形態では、リゾリン脂質は、１６：０リゾリン脂質、２０：０リゾリン脂質、及びこれらの組み合わせから選択される。

リゾリン脂質及び光増感剤を含むコンジュゲートは、リポソーム中に約０．０１モルパーセント〜約１モルパーセントで存在し得る。例えば、リポソーム中に約０．０５モルパーセント〜約０．５モルパーセント；リポソーム中に約０．０８モルパーセント〜約０．１２モルパーセントである。一部の実施形態では、リゾリン脂質及び光増感剤を含むコンジュゲートは、リポソーム中に約０．１モルパーセント〜約０．２モルパーセントで存在する。例えば、リゾリン脂質及び光増感剤を含むコンジュゲートは、リポソーム中に約０．１モルパーセントで存在し得る。

一部の実施形態では、コンジュゲート（例えば、１６：０リゾリン脂質（ＬｙｓｏＰＣ）及び／又は２０：０ ＬｙｓｏＰＣのＢＰＤコンジュゲート、並びに１６：０ ＬｙｓｏＰＣ−ＢＰＤ及び２０：０ ＬｙｓｏＰＣ−ＢＰＤを含む成形安定リポソーム）を、標的リガンドのクリックコンジュゲーションのために十分に最適化された表面を有するリン脂質二重層に安定に埋め込むことができる。全てのコンジュゲートが他と同程度に適切であるわけではない。例えば、ＢＰＤのカルボン酸塩のコレステロールのヒドロキシルへのコンジュゲーションは、いずれかの分子が示す全ての極性を除去し、安定した高次構造が両親媒性脂質二重層内に存在することができず、封入はほぼ０％である。同様に、疎水性ＢＰＤのＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−アミンの親水性末端へのアミドコンジュゲーションは、ＢＰＤを膜中に固定するが、内部リポソーム表面のＢＰＤ部分の周辺疎水性スタッキングにより安定していないリポソームが生じる。本明細書に示されるように、安定リポソームは、光増感剤のリゾリン脂質へのコンジュゲーション（例えば、１６：０ ＬｙｓｏＰＣ−ＢＰＤ及び２０：０ ＬｙｓｏＰＣ−ＢＰＤ）で形成することができる。本明細書で提供されるリポソームは、脂質二重層での疎水性ＢＰＤ封入で観察されるような、光増感剤の周囲細胞への非特異的な漏れを遮断する。

リゾリン脂質と化学的に反応性の官能基、例えば、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ_２、及び−ＳＨを含む疎水性光増感剤とのコンジュゲーションは、リゾリン脂質への標準的なコンジュゲーション法、例えば、本明細書で提供される方法（例えば、リゾリン脂質及びリゾリン脂質−リンカー誘導体（例えば、リゾリン脂質−ＰＥＧ誘導体）を用いて達成することができる。化学的に反応性の官能基、例えば、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ_２、及び−ＳＨを含む親水性光増感剤のコンジュゲーションは、リン脂質、例えば、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＨ、ＤＯＰＧのリン酸頭基の誘導体、又はコレステロールの極性−ＯＨ基へのコンジュゲーションによって達成することができる。

本明細書に記載の第１のリン脂質は、ホスファチジルコリン；ホスファチジン酸；ホスファチジルエタノールアミメ；ホスファチジルグリセロール；及びホスファチジルセリンからなる群から選択することができる。本明細書で提供されるリポソームの第１のリン脂質の非限定の例としては、水素化大豆ホスホチジルコリン（ＨＳＰＣ）；１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＤＰＣ）；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＥＰＡ）；１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）；１，２−ジエライドイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＥＰＧ）；１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＯＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＬＰＡ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＬＰＳ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＭＰＡ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＭＰＳ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＯＰＡ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＯＰＳ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＰＰＡ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＰＰＳ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＳＰＡ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＳＰＳ）；１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ ３−ホスホコリン（ＭＰＰＣ）；１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＳＰＣ）；１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＭＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）；１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ）；１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＰＣ）；及び１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＯＰＣ）；１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＰＰＣ）、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、第１のリン脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。

一部の実施形態では、第１の誘導体化リン脂質は、リンカーを更に含む。例えば、このリンカーは、ポリエチレングリコールであり得、このポリエチレングリコールは、二価であり、且つ第１のリン脂質と歪んだシクロオクチン部分との間のリンカー、又は第１のリン脂質と標的部分との間のリンカーである。一部の実施形態では、このリンカーは、第１のリン脂質と、歪んだシクロオクチン部分及び標的部分の銅フリーのクリック化学反応産物との間のリンカーとして作用し得る。

一部の実施形態では、ポリエチレングリコールは、約３５０ｇ／モル〜約３０，０００ｇ／モルの分子量を有する。例えば、ポリエチレングリコールは、３５０ｇ／モル、５５０ｇ／モル、７５０ｇ／モル、１０００ｇ／モル、２０００ｇ／モル、３０００ｇ／モル、５０００ｇ／モル、１０，０００ｇ／モル、２０，０００ｇ／モル、又は３０，０００ｇ／モルからなる群から選択される分子量を有し得る。一部の実施形態では、ポリエチレングリコールは、２０００ｇ／モルの分子量を有する。

一部の実施形態では、第１の誘導体化リン脂質はＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００を含む。

歪んだシクロオクチンの非限定の例としては、アザ−ジベンゾシクロオクチン（ＡＤＩＢＯ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、（ＯＣＴ）、アリールレスオクチン（ａｒｙｌ−ｌｅｓｓ ｏｃｔｙｎｅ）（ＡＬＯ）、モノフッ素化シクロオクチン（ＭＯＦＯ）、ジフッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）、又はジメトキシアザシクロオクチン（ＤＩＭＡＣ）部分が挙げられる。第１のリン脂質又はリンカーとの反応前に、歪んだシクロオクチンは、ジベンゾシクロオクチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＡＤＩＢＯ−ＮＨＳ）、ジベンゾシクロオクチン−Ｃ６−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−ＰＥＧ（４、５、１３又はｎ）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−Ｓ−Ｓ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−マレイミド、ジベンゾシクロオクチン−ＰＥＧ（４、５、１３又はｎ）−マレイミド、及び（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチルＮ−スクシンイミジルカーボネートからなる群から選択することができる。

本明細書で使用される標的部分は、葉酸、ＲＧＤペプチド、天然タンパク質リガンド（例えば、ＴＮＦ、ＥＧＦ、トランスフェリン）、アフィボディ、抗体、抗体断片、エンジニアリングされた抗体ベースのタンパク質、癌関連受容体、葉酸受容体、トランスフェリング受容体（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＨＥＲ−２受容体、ａｖｂ５イネグリン（ｉｎｅｇｒｉｎ）、及びソマトスタチン受容体の１つ以上を含み得る。一部の実施形態では、標的部分は抗体である。

一部の実施形態では、標的部分は、第１の誘導体化リン脂質にコンジュゲートする前にアジド部分を含む。一部の実施形態では、標的部分は、第１のリン脂質にコンジュゲートする前に、本明細書で提供される歪んだシクロオクチンを含む。一部の実施形態では、標的部分は、銅フリーのクリック化学を用いて第１のリン脂質にコンジュゲートされる。例えば、標的部分上のアジド又は歪んだシクロオクチンは、それぞれ銅フリーのクリック化学によって第１のリン脂質上の歪んだシクロオクチン又はアジドと反応し得る。一部の実施形態では、第１の誘導体化リン脂質は、第１のリン脂質と、歪んだシクロオクチン及びアジドを含む標的部分の反応産物とを含む。

歪んだシクロオクチンで事前に修飾されたリポソーム表面への標的部分の銅フリーのクリックコンジュゲーションのために、標的部分がアジド部分で修飾される。例えば、アジド部分のセツキシマブへの部位特異的導入は、遺伝子操作プロテインＺ分子を用いて達成することができ、このプロテインＺ分子は、ＩｇＧ分子のＦｃタンパク質のみに結合する（例えば、Ｈｕｉ，Ｊ．Ｚ．、Ａｌ Ｚａｋｉ，Ａ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｚ．、Ｐｏｐｉｋ，Ｖ．、Ｚｈａｎｇ，Ｈ．、Ｐｒａｋ，Ｅ．Ｔ．Ｌ、及びＴｓｏｕｒｋａｓ，Ａ．、Ｆａｃｉｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ ＩｇＧ ｏｎｔｏ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（２０１４）１０（１６）：３３５４−６３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｍｌｌ．２０１３０３６２９を参照されたい）。アジド部分のセツキシマブへの確率的導入は、ＰＥＧ４−アジドのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを用いて達成することができる。単一フルオロフォア（部位特異的セツキシマブでは５−ＦＡＭ、確率的セツキシマブではＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８）を各抗体コンジュゲート中に導入することができる。一部の実施形態では、歪んだシクロオクチン脂質に対して事前にクリックされたミセル化アジド標的リガンドも、任意の治療／画像化カーゴを有する事前形成リポソーム中に後挿入することができる。標的リガンドは、アジド修飾リポソーム（例えば、第１のリン脂質及びアジド部分を含む第１の誘導体化リン脂質）へのクリックコンジュゲーションのために歪んだシクロオクチンで修飾することもできる。

本明細書で提供される標的部分は、本明細書で提供されるリポソームの選択性を高める。例えば、選択的な結合及び光毒性を、そのそれぞれの標的過剰発現細胞株を用いてあらゆるクリックコンジュゲート標的部分について達成することができる。リポソームプラットフォームへの銅フリーのクリックコンジュゲーションの潜在的な候補であるアジド修飾リガンドとしては、葉酸、ＲＧＤペプチド、天然タンパク質リガンド（例えば、ＴＮＦ、ＥＧＦ、トランスフェリン）、アフィボディ、又は抗体断片の任意の変異体が挙げられる。選択的結合性及び光毒性はまた、水性光増感剤（例えば、クロリンｅ６、メチレンブルー、硫酸アルミニウムフタロシアニン、ローズベンガル）を封入する任意の標的シクロオクチン修飾リポソームについても達成することができる。一部の実施形態では、任意の疎水性光増感剤を閉じ込めている水溶性ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子を、選択的なＰＤＴベース様式のために標的ＤＩＢＯ修飾リポソーム内に封入することもできる。選択的な結合及び光毒性は、閉じ込められた疎水性脂質固定光増感剤、例えば、プロトポルフィリンＩＸを更に含む、本明細書で提供されるリポソームについても達成することができる。

一部の実施形態では、第１の誘導体化リン脂質は、最大約０．５モルパーセントの量でリポソーム中に存在する。例えば、第１の誘導体化リン脂質は、約０．０５モルパーセント〜約０．５モルパーセント（例えば、約０．１モルパーセント、約０．２モルパーセント、約０．２５モルパーセント、約０．３モルパーセント、及び約０．４モルパーセント）の量で存在し得る。

本明細書に記載の第２のリン脂質は、ホスファチジルコリン；ホスファチジン酸；ホスファチジルエタノールアミメ；ホスファチジルグリセロール；及びホスファチジルセリンからなる群から選択することができる。第２のリン脂質の非限定の例としては、水素化大豆ホスホチジルコリン（ＨＳＰＣ）；１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＤＰＣ）；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＥＰＡ）；１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）；１，２−ジエライドイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＥＰＧ）；１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＯＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＬＰＡ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＬＰＳ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＭＰＡ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＭＰＳ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＯＰＡ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＯＰＳ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＰＰＡ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＰＰＳ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＳＰＡ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＳＰＳ）；１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ ３−ホスホコリン（ＭＰＰＣ）；１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＳＰＣ）；１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＭＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）；１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ）；１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＰＣ）；及び１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＯＰＣ）；１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＰＰＣ）、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、第２のリン脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。

一部の実施形態では、第２の誘導体化リン脂質中に存在するポリエチレングリコールポリマーは、約３５０ｇ／モル〜約３０，０００ｇ／モルの分子量を有し得る。例えば、ポリエチレングリコールポリマーは、３５０ｇ／モル、５５０ｇ／モル、７５０ｇ／モル、１０００ｇ／モル、２０００ｇ／モル、３０００ｇ／モル、５０００ｇ／モル、１０，０００ｇ／モル、２０，０００ｇ／モル、及び３０，０００ｇ／モルからなる群から選択される分子量を有し得る。一部の実施形態では、ポリエチレングリコールポリマーは、２０００ｇ／モルの分子量を有する。一部の実施形態では、ポリエチレングリコールポリマーは、アルコキシル、カルボキシル、アミン、ビオチン、マレイミド、スクシニル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、シラン、ピリジルジチオール、又はシアノ部分で終端されている。一部の実施形態では、第２の誘導体化リン脂質は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ_２０００、又はこれらの組み合わせである。

一部の実施形態では、第２の誘導体化リン脂質は、リポソーム中に約０．５モルパーセント〜約５モルパーセントの量で存在する。一部の実施形態では、コンジュゲートの第２の誘導体化リン脂質に対するモル比は、約１：１０である。一部の実施形態では、第２の誘導体化リン脂質は、リポソーム中にコンジュゲートの量よりも約１０倍多い量で存在する。

いかなる理論にも拘束されるものではないが、第２の誘導体化リン脂質は、リポソームに安定性を付与し得る。

一部の実施形態では、このリポソームは、アニオン性脂質を含む。例えば、このリポソームは、アニオン性リン脂質を含み得る。アニオン性リン脂質の非限定の例としては、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）；ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＭＰＧ）；ホスファチジルセリン（ＰＳ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）；及びリン酸ジセチル（ＤＣＰ）が挙げられる。アニオン性脂質（例えば、アニオン性リン脂質）は、リポソーム中に最大約１０モルパーセント（例えば、約０．１モルパーセント〜約１０モルパーセント）の量で存在し得る。例えば、アニオン性脂質は、リポソーム中に約５モルパーセント〜約１０モルパーセントの量で存在する。一部の実施形態では、アニオン性脂質は、リポソーム中に約７モルパーセント〜約９モルパーセントの量で存在する。

一部の実施形態では、このリポソームは、カチオン性脂質を含む。例えば、このリポソームは、カチオン性リン脂質を含み得る。カチオン性リン脂質の非限定の例としては、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）が挙げられる。カチオン性脂質（例えば、カチオン性リン脂質）は、リポソーム中に最大約１０モルパーセント（例えば、約０．１モルパーセント〜約１０モルパーセント）の量で存在し得る。例えば、アニオン性脂質は、リポソーム中に約５モルパーセント〜約１０モルパーセントの量で存在する。一部の実施形態では、アニオン性脂質は、リポソーム中に約７モルパーセント〜約９モルパーセントの量で存在する。

いかなる理論にも拘束されるものではないが、カチオン性脂質又はアニオン性脂質は、リポソームの静電的安定性を提供すると考えられる。例えば、静電的安定性の不足により、リポソームの沈殿が起こり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質又はアニオン性脂質の存在は、カチオン性脂質又はアニオン性脂質が不足しているリポソームと比較して、本明細書で提供されるリポソームの細胞取り込みの増加に寄与し得る。

一部の実施形態では、本明細書で提供されるリポソームは、１つ以上の化学療法化合物；１つ以上のポリマーナノ粒子；１つ以上のタンパク質ベースのナノ粒子；１つ以上のデンドリマー構造；１つ以上の無機ナノ粒子；１つ以上のイメージング剤；１つ以上のキナーゼ阻害剤；１つ以上の生物製剤；及びこれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるカーゴを更に含み得る。

一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、受容体チロシンキナーゼ阻害剤である。このカーゴは、生物製剤（Ｓ．Ｔａｎｇｕｔｏｏｒｉ、Ｂ．Ｑ．Ｓｐｒｉｎｇ、Ｚ．Ｍａｉ、Ａ．Ｐａｌａｎｉｓａｍｉ、Ｌ．Ｍｅｎｓａｈ、及びＴ．Ｈａｓａｎ、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｎａｎｏ．２０１５．０８．００７）；化学療法剤（Ｈ．Ｃ．Ｈｕａｎｇ、Ｓ．Ｍａｌｌｉｄｉ、Ｊ．Ｌｉｕ、Ｃ．Ｔ．Ｃｈｉａｎｇ、Ｚ．Ｍａｉ、Ｒ．Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ、Ｎ．Ｅｂｒａｈｉｍ−Ｚａｄｅｈ、Ｉ．Ｒｉｚｖｉ、及びＴ．Ｈａｓａｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１６，７６，１０６６−１０７７）；又は小分子受容体チロシンキナーゼ阻害剤（Ｂ．Ｑ．Ｓｐｒｉｎｇ、Ｒ．Ｂ．Ｓｅａｒｓ、Ｌ．Ｋ．Ｚｈｅｎｇ、Ｚ．Ｍａｉ、Ｒ．Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｍ．Ｅ．Ｓｈｅｒｗｏｏｒｄ、Ｄ．Ａ．Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ、Ｂ．Ｗ．Ｐｏｇｕｅ、Ｓ．Ｐ．Ｐｅｒｅｉｒａ、Ｅ．Ｖｉｌｌａ、及びＴ．Ｈａｓａｎ、Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１６，ｉｎ ｐｒｅｓｓ）であり得る。一部の実施形態では、１つ以上の化学療法化合物の１つ以上が光増感剤との相乗作用を示す。

一部の実施形態では、このカーゴ（例えば、疎水性化学療法剤又は小分子阻害剤）は、リポソーム二重層内に閉じ込めることができる。

本明細書で提供されるリポソームはまた、１つ以上のリン脂質、スフィンゴ脂質、生物活性脂質、天然脂質、コレステロール、ステロール、又はこれらの組み合わせも含み得る。

本明細書に記載のリン脂質は、ホスファチジルコリン；ホスファチジン酸；ホスファチジルエタノールアミメ；ホスファチジルグリセロール；及びホスファチジルセリンからなる群から選択することができる。リン脂質の非限定の例としては、水素化大豆ホスホチジルコリン（ＨＳＰＣ）；１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＤＰＣ）；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＥＰＡ）；１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）；１，２−ジエライドイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＥＰＧ）；１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＯＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＬＰＡ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＬＰＳ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＭＰＡ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＭＰＳ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＯＰＡ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＯＰＳ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＰＰＡ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＰＰＳ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＳＰＡ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＳＰＳ）；１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ ３−ホスホコリン（ＭＰＰＣ）；１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＳＰＣ）；１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＭＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）；１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ）；１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＰＣ）；及び１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＯＰＣ）；１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＰＰＣ）、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、１つ以上のリン脂質の少なくとも１つは、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）である。

一部の実施形態では、１つ以上のリン脂質は、リポソーム中に約４０モルパーセント〜８０モルパーセントで存在する。例えば、１つ以上のリン脂質は、リポソーム中に約５０モルパーセント〜７０モルパーセント；リポソーム中に約５５モルパーセント〜６５モルパーセント；リポソーム中に約１５モルパーセント〜約４５モルパーセント；又はリポソーム中に約２０モルパーセント〜約３０モルパーセントで存在する。

一部の実施形態では、このコレステロールは、リポソームの約１０モルパーセント〜約５０モルパーセントの量で存在する。例えば、リポソームの約２０モルパーセント〜約４０モルパーセント；約２５モルパーセント〜約３５モルパーセント；及びリポソームの約２７モルパーセント〜約２９モルパーセントである。

一部の実施形態では、本明細書で提供されるリポソームは、約５０モルパーセント〜約６５モルパーセントの１つ以上のリン脂質；約５モルパーセント〜約１０モルパーセントのアニオン性脂質又はカチオン性脂質；約２０モルパーセント〜約３５モルパーセントのコレステロール；約２モルパーセント〜約８モルパーセントの第２の誘導体化リン脂質；及び約０．０５モルパーセント〜約０．２５モルパーセントのコンジュゲートを含む。例えば、本明細書で提供されるリポソームは、約５５モルパーセント〜約６０モルパーセントの１つ以上のリン脂質；約７モルパーセント〜約９モルパーセントのアニオン性脂質又はカチオン性脂質；約２５モルパーセント〜約３０モルパーセントのコレステロール；約４モルパーセント〜約６モルパーセントの第２の誘導体化リン脂質；及び約０．０８モルパーセント〜約０．１２モルパーセントのコンジュゲートを含む。

一部の実施形態では、このリポソームは、フルオロフォア、造影剤（例えば、ＭＲＩ、ＰＥＴ、又はＳＰＥＣＴ造影剤）、又はこれらの組み合わせを更に含む。

本明細書に記載される「フルオロフォア」は、光励起時に光を再発光し得るあらゆる小分子であり得る（例えば、可視スペクトル内の光）。例えば、フルオロフォアは、ローダミン、フルオレセイン、ホウ素−ジピロロメタン、クマリン、ピレン、シアニン、オキサジン、アクリジン、オーラミンＯ、及びこれらの誘導体を含み得る。場合により、誘導体は、スルホン化誘導体、例えば、スルホン化ピレン、スルホン化クマリン、スルホン化ローダミン、及びスルホン化シアニン（例えば、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）色素）を含む。

一部の実施形態では、化学的に反応性の官能基、例えば、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ_２、−ＳＨを含む任意の疎水性フルオロフォアの脂質固定は、リゾリン脂質及びリゾリン脂質誘導体（例えば、ポリエチレングリコールポリマーに結合したリゾリン脂質）へのコンジュゲーションによって達成することができる。これらのリポソームは、任意の標的部分にクリックコンジュゲートすることができ、且つそれらの標的に選択的に結合する。化学的に反応性の官能基、例えば、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ_２、及び−ＳＨを含む任意の親水性フルオロフォアの脂質固定は、リン脂質、例えば、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＨ、ＤＯＰＧのリン酸頭基の誘導体、又はコレステロールの極性−ＯＨ基へのコンジュゲーションによって達成することができる。これらのリポソームは、任意の標的部分にクリックコンジュゲートすることができ、且つそれらの標的に選択的に結合する。

本明細書で提供されるリポソームは、当業者に公知の方法を用いて調製することができる。例えば、リポソームは、懸濁形態で調製してもよく、又は本明細書で提供されるリポソーム成分を含む凍結乾燥粉末を水性溶液で戻して形成してもよい。一部の実施形態では、本明細書で提供されるリポソームは、２００ｎｍ未満の平均粒径分布を有する。例えば、本明細書で提供されるリポソームは、約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍの平均粒径分布を有し得る。

本明細書では、本明細書で提供されるリポソーム及び薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物も提供される。

本明細書で提供されるリポソームは、単独で、又は従来の医薬担体若しくは賦形剤などと組み合わせて投与することができる。薬学的に許容され得る賦形剤としては、限定されるものではないが、医薬剤形に使用される界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、ポロキサマー又は他の類似のポリマー送達マトリックス、緩衝物質、例えば、リン酸塩、トリス、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸、水、塩、又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムの部分グリセリド混合物が挙げられる。シクロデキストリン、例えば、α−、β−、及びγ−シクロデキストリン、又は化学的に修飾された誘導体、例えば、２−及び３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含むヒドロキシアルキルシクロデキストリン、又は他の可溶化誘導体も使用することができる。０．００５％〜１００％の範囲で本明細書に記載のリポソームを含み、残部が非毒性担体から構成される剤形又は組成物を調製することができる。企図される組成物は、本明細書で提供されるリポソームを０．００１％〜１００％、一実施形態では０．１％〜９５％、別の実施形態では７５％〜８５％、更なる実施形態では２０％〜８０％含み得る。このような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか又は明らかであり；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ．２０１２）を参照されたい。

薬学的に投与可能な液体組成物を、例えば、本明細書で提供される化合物及び任意選択による医薬アジュバントを担体（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、又はエタノールなど）に溶解させ、分散させるなどして溶液、コロイド、リポソーム、エマルション、複合体、コアセルベート、又は懸濁液を形成して調製することができる。必要に応じて、医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤、乳化剤、共溶媒、可溶化剤、及びｐＨ緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、酢酸トリエタノールアミン、及びオレイン酸トリエタノールアミンなど）も含み得る。

注射物質を、溶液、コロイド、リポソーム、複合体、コアセルベート若しくは懸濁液、エマルションとして従来の形態で、又は注射前に液体で戻すのに適した固体形態で調製することができる。このような非経口組成物に含められる本明細書で提供されるリポソームのパーセンテージは、リポソームの特定の性質及び患者の要求に大きく依存する。

濃度及び用量の値は、特定のリポソーム及び緩和するべき状態の重症度によって異なり得ることに留意されたい。いすれの特定の患者に対しても、特定の投与計画を、個人の要求、及び組成物の投与を管理又は監督する人の専門的な判断に従って長期にわたって調整するべきであることを更に理解されたい。

本明細書では、患者の癌を処置する方法が更に提供され、この方法は、治療有効量の、本明細書で提供されるリポソームを患者に投与するステップ；及び患者に放射線を照射してリポソームを破壊するステップを含む。

本明細書で提供されるリポソームはまた、患者の癌を画像化するためにも使用され得る。一部の実施形態では、この方法は、治療有効量の、本明細書で提供されるリポソームを患者に投与するステップ；患者に放射線を照射してリポソームを破壊するステップ；及び患者を画像化するステップを含む。

非限定の癌としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：
１）ＥＲ＋乳癌、ＥＲ−乳癌、ｈｅｒ２−乳癌、ｈｅｒ２＋乳癌、間質腫瘍、例えば、線維腺腫、葉状腫瘍、及び肉腫、並びに上皮腫瘍、例えば、大管乳頭腫を含む乳癌；ｉｎ ｓｉｔｕ腺管癌（パジェット病を含む）及びｉｎ ｓｉｔｕ小葉癌を含むｉｎ ｓｉｔｕ（非侵襲性）腺癌、並びに限定されるものではないが、侵襲性腺管癌、侵襲性小葉癌、髄様癌、膠様（粘液性）癌、管状癌、及び侵襲性乳頭癌を含む侵襲性（浸潤性）癌腫を含む乳房の癌腫；並びにその他の悪性新生物。乳癌の更なる例としては、管腔Ａ、管腔Ｂ、基底Ａ、基底Ｂ、及び三重陰性乳癌を挙げることができ、この三重陰性乳癌は、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）、プロゲステロン受容体陰性、及びｈｅｒ２陰性（ｈｅｒ２−）である。一部の実施形態では、乳癌は、高リスクのＯｎｃｏｔｙｐｅスコアを有し得る。
２）例えば、肉腫、例えば、血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、及び脂肪肉腫；粘液腫；横紋筋腫；線維腫；脂肪腫、及び奇形腫を含む噴門癌。
３）例えば、気管支原性癌、例えば、扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、及び腺癌；肺胞及び気管支肺癌；気管支腺腫；肉腫；リンパ腫；軟骨腫性過誤腫；及び中皮腫を含む肺癌。
４）例えば、食道の癌、例えば、扁平上皮細胞癌、腺癌、平滑筋肉腫、及びリンパ腫；胃の癌、例えば、癌腫、リンパ腫、及び平滑筋肉腫；膵臓の癌、例えば、腺管癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、及び血管腫；小腸の癌、例えば、腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、及び線維腫；大腸の癌、例えば、腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、及び平滑筋腫を含む消化管癌。
５）例えば、腎臓の癌、例えば、腺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽細胞腫）、リンパ腫、及び白血病；膀胱及び尿道の癌、例えば、扁平上皮細胞癌、移行上皮癌、及び腺癌；前立腺の癌、例えば、腺癌及び肉腫；精巣の癌、例えば、セミノーマ、奇形腫、胚性癌腫、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、及び脂肪腫を含む尿生殖路癌。
６）例えば、肝細胞腫、例えば、肝細胞癌；胆管癌；肝芽腫；血管肉腫；肝細胞腺腫；及び血管腫を含む肝癌。
７）例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨大細胞腫瘍脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨外腫）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨線維腫、類骨骨種、及び巨細胞腫を含む骨肉腫。
８）例えば、頭蓋骨の癌、例えば、骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、及び変形性骨炎；髄膜の癌、例えば、髄膜腫、髄膜肉腫、及び神経膠腫症；脳の癌、例えば、星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、上衣腫、胚芽腫（松果体腫）、多形神経膠芽腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽腫、及び先天性腫瘍；及び脊髄の癌、例えば、神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、及び肉腫を含む神経系の癌。
９）例えば、子宮の癌、例えば、子宮内膜の癌；子宮頸部の癌、例えば、子宮頸癌及び前腫瘍性子宮頸部異形成；卵巣の癌、例えば、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類癌腫、顆粒膜莢壁細胞腫瘍、セルトリライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、及び悪性奇形腫を含む卵巣癌；外陰部の癌、例えば、扁平上皮細胞癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、及び黒色腫；膣の癌、例えば、明細胞癌、扁平上皮細胞癌、ブドウ状肉腫、及び胎児性横紋筋肉腫；及び卵管の癌、例えば、癌腫を含む婦人科癌。
１０）例えば、血液の癌、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）、及びヴァルデンスレームマクログロブリン血症を含む血液癌。
１１）例えば、悪性黒色腫及び転移性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、異型性母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、及び強皮症を含む皮膚癌及び皮膚疾患。
１２）例えば、神経芽細胞腫を含む副腎癌。

癌は、転移性であっても転移性でなくてもよい固形腫瘍であり得る。癌は、白血病でのように、びまん性組織としても起こり得る。従って、本明細書に示される用語「腫瘍細胞」は、上で特定された障害のいずれか１つに罹患した細胞を含む。

本明細書に記載される化合物又は組成物を用いた癌を処置する方法は、例えば、化学療法、放射線、又は外科手術（例えば、卵巣摘出術）による癌を処置する既存の方法と組み合わせることができる。一部の実施形態では、化合物又は組成物を、別の抗癌剤又は処置の前、その間、又はその後に投与することができる。

治療効果は、疾患の１つ以上の症状をある程度緩和する。

本明細書で使用される「処置する」、「処置」、又は「処置すること」は、治療目的のために本明細書で提供される化合物又は医薬組成物を投与することを指す。用語「治療処置」は、既に疾患に罹患している患者に処置を施し、これにより、治療的に有効な効果をもたらす、例えば、存在する症状を緩和する、症状の根本的な代謝の原因を緩和する、障害の更なる発症を延期若しくは防止する、及び／又は将来発症する若しくは発症が見込まれる症状の重症度を軽減することを指す。

本明細書で提供されるリポソームは、光酸化に対して不安定である。一部の実施形態では、本明細書で提供されるリポソームは、リポソームペイロード（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｐａｙｌｏａｄ）の光誘発性放出に使用することができる。例えば、Ｂ．Ｑ．Ｓｐｒｉｎｇ、Ｒ．Ｂ．Ｓｅａｒｓ、Ｌ．Ｋ．Ｚｈｅｎｇ、Ｚ．Ｍａｉ、Ｒ．Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｍ．Ｅ．Ｓｈｅｒｗｏｏｒｄ、Ｄ．Ａ．Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ、Ｂ．Ｗ．Ｐｏｇｕｅ、Ｓ．Ｐ．Ｐｅｒｅｉｒａ、Ｅ．Ｖｉｌｌａ、及びＴ．Ｈａｓａｎ、Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１６，ｉｎ ｐｒｅｓｓを参照されたい。本明細書で提供されるリポソームの光増感剤の活性化では、任意の適切な吸収波長が使用される。この吸収波長は、細胞毒性又は蛍光発光、例えば、白熱電球、若しくは蛍光光源、若しくはフォトダイオード、例えば、発光ダイオードを含む可視光線を仲介するために当技術分野で公知の様々な方法を用いて供給することができる。レーザー光も局在リポソームへの光のｉｎ ｓｉｔｕ送達に使用される。

一部の実施形態では、本明細書で提供されるリポソームは、蛍光イメージングを用いてｉｎ ｖｉｖｏで画像化される。例えば、このような方法の使用により、本明細書で提供されるリポソームが標識された細胞又は組織の容易なリアルタイムのイメージング及び局在化が可能となる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるリポソームは、腹腔鏡及び／又は顕微内視鏡を用いてｉｎ ｖｉｖｏで画像化される。例えば、腹腔鏡の使用により、本明細書で提供されるリポソームが標識された細胞又は組織の容易なリアルタイムのイメージング及び局在化が可能となる。一部の実施形態では、リポソームを、光ファイバー顕微内視鏡を用いて画像化することができる。

本明細書で提供されるリポソームの多数の前臨床及び臨床応用を想定することができる。例えば、本明細書に記載のリポソームは、１）初期検出癌で；２）外科手術中の（例えば、癌細胞のリアルタイム検出を可能にすることによる）外科医の補助として；及び３）（例えば、処置前、その間、及びその後に存在する癌細胞を定量することによる）癌の処置の進捗を監視するための方法として使用することができる。

例えば、本明細書で提供されるリポソームは、外科手術方法、例えば、腫瘍の切除と組み合わせて対象に投与することができる。このリポソームは、外科手術前、その間、又はその後に個人に投与することができる。このリポソームは、例えば、残存癌細胞を画像化又は検出するために、腫瘍除去後に腫瘍又は周囲領域に非経口投与、静脈注射、又は注射することができる。例えば、このリポソームを使用して腫瘍の存在を検出して、外科手術切除を誘導することができる。一部の実施形態では、このリポソームを使用して、このような細胞の少なくとも一部（例えば、全て）が対象から除去されるまで、残存癌細胞の存在を検出して連続した外科手術処置を誘導することができる。従って、腫瘍の少なくとも一部を対象から除去するための誘導外科手術方法が提供され、この方法は、本明細書で提供されるリポソームを用意するステップ；このリポソームを少なくとも一部の癌細胞中に存在させるステップ；このリポソームの活性化後の画像（例えば、蛍光）を観察するステップ；及び対象に対して外科手術を行って、検出された癌細胞を含む腫瘍の少なくとも一部を除去するステップを含む。

ｉｎ ｖｉｔｒｏイメージング法に関しては、本明細書に記載のリポソーム及び組成物を様々なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで使用することができる。例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏイメージング法は、試料、例えば、生物学的試料（例えば、細胞）を、本明細書で提供される１つ以上のリポソームに接触させるステップ；リポソームを試料中の生物学的標的と相互作用させるステップ；光増感剤又はイメージング剤によって吸収可能な波長の光を試料に当てるステップを含む。

親水性フルオロフォアの安定した固定は、コレステロールに対する、リン脂質様１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）のリン酸頭基に対する、又はＰＥＧ化リン脂質、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＮＨ_２の末端に対するフルオロフォアのコンジュゲーションによって達成することができる。

銅フリーのクリック化学の高い化学選択性により、クリック化学反応物（例えば、歪んだシクロオクチン又はアジド部分）との交差反応なしで、様々な反応性実体のリポソーム表面へのモジュール式コンジュゲーション（ｍｏｄｕｌａｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）が可能となる。例えば、０．２％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＮＨ_２及びＤＩＢＯ修飾リゾリン脂質を含むリポソームを使用して、近赤外線色素のアミン−反応性ＮＨＳ−エステルをＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＮＨ_２の末端アミンにコンジュゲートして、深部組織をｉｎ ｖｉｖｏイメージングすることができる安定したクリック反応性リポソームのパネルを用意した。このような色素としては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤ、及びＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷが挙げられる。本明細書で提供されるリポソームは、フルオロフォア標識、標的部分のコンジュゲーション、又は選択性に影響を与えることなく、アミン含有脂質のアミン反応性色素との反応前に、膜内に１６：０ ＬｙｓｏＰＣ−ＢＰＤ（又は光線力学療法用のその他の脂質固定疎水性光増感剤）を含み得る。本明細書で提供されるリポソームはまた、フルオロフォア標識、標的部分のコンジュゲーション、又は選択性に影響を与えることなく、アミン含有脂質のアミン反応性色素との反応前にコア内に水性治療薬を含み得る。

本明細書で開示されるリポソームの投与は、任意の許容される投与方式によって行うことができる。一部の実施形態では、このリポソームは、非経口（例えば、静脈）投与される。

材料及び方法
ＢＰＤ光増感剤のリン脂質１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ及び２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣへの結合
ベンゾポルフィリン誘導体光増感剤のカルボン酸塩を、変更された合成プロトコルに従って、エステル化によってリン脂質１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）又はリン脂質１−アラキドイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２０：０のＬｙｓｏ ＰＣ）のヒドロキシル部分に結合した。Ｊ．Ｌｏｖｅｌｌ、Ｃ．Ｊｉｎ、Ｅ．Ｈｕｙｎｈ、Ｈ．Ｊｉｎ、Ｃ．Ｋｉｍ、Ｊ．Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ、Ｗ．Ｃｈａｎ、Ｗ．Ｃａｏ、Ｌ．Ｗａｎｇ、及びＧ．Ｚｈｅｎｇを参照されたい。マルチモジュール式バイオフォトニック造影剤として使用されるポルフィリン二重層によって形成されるポルフィソームナノ小胞である、２０１１ Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１０，３２４−３３２。１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ（クロロホルム中、９９．１３μｌ、２５ｍｇ／ｍｌストック）又は２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ（クロロホルム中、１１０．３５μｌ、２５ｍｇ／ｍｌストック）を１３×１００ｍｍのＰｙｒｅｘ（登録商標）管に入れ、１６ゲージの針からの窒素ガス流を用いてクロロホルムを蒸発させた。光増感剤ベンゾポルフィリン誘導体一酸環Ａ（ＢＰＤ、ベルテポルフィン、１７．９７ｍｇ、７１８．７９ｇ／モル）を乾燥１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ又は２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣに添加した。次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、３８．８１ｍｇ、１５５．２４ｇ／モル；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ、１５．２７ｍｇ、１２２．１７ｇ／モル；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、５２．２５μｌ、１２９．２４ｇ／モル、０．７４２ｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ又は２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣとＢＰＤ混合物との乾燥混合物に添加した。１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ／２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ：ＢＰＤ：ＥＤＣ：ＤＭＡＰ：ＤＩＰＥＡのモル比は、１：５：５０：２５：３００とした。この混合物をジクロロメタン（ＤＣＭ、５ｍｌ）に溶解し、磁気撹拌プレートを用いて暗所で２４時間、室温、２５００ｒｐｍで激しく撹拌した。１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤと２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤの脂質コンジュゲートを、Ａｎａｌｔｅｃｈ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｉｌｉｃａ Ｕｎｉｐｌａｔｅｓを用いて精製し、ＤＣＭ中、１０％メタノールで溶出した。ほとんどのシリカ画分（Ｒｆ約０．１４４）を含む極性１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ又は２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤをＴＬＣプレートから取り出して、５０ｍｌのポリプロピレン管に入れた。１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ又は２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤをＤＣＭ（３０ｍｌ）中、３３％メタノールでの１０分間の超音波処理によってシリカ画分から抽出した。シリカを１０分間の３，７００×ｇでの遠心分離によって沈殿させ、抽出された１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ又は２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤを含む上清を２５０ｍｌの丸底フラスコに収集した。シリカ画分をＤＣＭ中、３３％メタノールで更に２回洗浄し、全ての１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ又は２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ溶液を別々に２５０ｍｌの丸底フラスコで混合した。この溶媒混合物を、液体窒素トラップ凝縮装置に接続された４０℃での低圧下における回転蒸発により、抽出された１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ又は２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤから除去した。メタノール−ＤＣＭ溶媒混合物に既に溶解された残存シリカを、乾燥１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ又は２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ抽出物を１００％ＤＣＭに再溶解することによって除去した。不溶性シリカ沈殿物を、ポリプロピレンシリンジの末端に固定されたＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ（商標）ポリ（テトラフルオロエチレン）（ＰＴＦＥ）フィルター（０．２２μｍの細孔径、１３ｍｍの直径）を用いた濾過によって除去した。ＤＣＭを、回転蒸発を用いて、濾過された１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ又は２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ溶液から除去した。次いで、精製されたコンジュゲートをクロロホルム（５ｍｌ）に再溶解して、−２０℃の暗所で保存した。１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ又は２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤの濃度を、リン脂質コンジュゲートをＤＭＳＯで希釈し、３４，８９５Ｍ^−１．ｃｍ^−１の吸光係数_{ε６８７ｎｍ}を用いて紫外−可視吸収スペクトルを測定することによって決定した。

リポソームの合成
全てのリポソーム調合物を、水和脂質膜プロセスを用いて調製した。脂質膜を、全ての脂質及びドーパントのクロロホルム溶液から１３×１００ｍｍのＰｙｒｅｘ（登録商標）管で最初に調製した。脂質混合物を１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ、７３４．０４ｇ／モル）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩）（ＤＯＴＡＰ、カチオン性、６９８．５４ｇ／モル又は１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ナトリウム塩）（ＤＯＰＧ、アニオン性、７９７．０２６ｇ／モル）、コレステロール（３８６．６５／モル）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ_２０００、２８０５．５０ｇ／モル）、及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ジベンゾシクロオクチル（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ、３０７７．８０ｇ／モル）から調製した。前述の試薬の全てをＡｖａｎｔｉ（登録商標）Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から購入し、合計３４．０４３μモルの脂質に調製した。特段の記載がない限り、ＤＰＰＣ、ＤＯＴＡＰ（カチオン性）／ＤＯＰＧ（アニオン性）、コレステロール、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００、及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯは、それぞれ５８．２：７．９：２８．９：４．５：０．５のモルパーセント比で混合した。ＰＥＧ化ＤＳＰＥを常に合計５％に維持し、アジド誘導体化抗体への銅フリーのクリックコンジュゲーションを媒介するために０．５％をＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯの代わりとした。１つの実験では、ＰＥＧ化ＤＳＰＥのモルパーセントは、５％、４％、３％、２％、１％、及び０．５％に変更したが、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ：ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ_２０００の比率は１：１０に維持した。光増感剤−リン脂質コンジュゲート、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ又は２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤは、ＤＰＰＣ ２００ｎモル（０．６モル％）の一部を置換した。フリーのＢＰＤ疎水性取り込みを必要とするリポソームの調合では、非コンジュゲートＢＰＤのクロロホルム溶液をクロロホルム中の脂質混合物に添加した。全ての脂質を短時間ボルテックスし、クロロホルムを、連続的に回転させながら、１６ゲージの針からの窒素ガス流を用いて蒸発させて薄い脂質膜を形成した。残留クロロホルムを、脂質膜を真空下で２４時間保存することによって除去した。乾燥した脂質膜を、凍結融解ボルテックス法を用いて１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で水和した。１×ＤＰＢＳ（１ｍｌ）を脂質膜に添加し、Ｐｙｒｅｘ（登録商標）管を密閉してＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で包んだ。水性光増感剤、例えば、クロリンｅ６モノエチレンジアミンモノアミド（ＣＭＡ）を用いた実験では、脂質膜ボイド１６：０Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤを、ＣＭＡスタッキングを防止する賦形剤として４００μＭ ＣＭＡ及び１％ＰＥＧ_３００を含む１ｍｌのＰＢＳで水和した。次いで、この管を４２℃の暗い水槽で１０分間インキュベートし、最大速度で３０秒間ボルテックスし、次いで氷浴で１０分間インキュベートした。このサイクルを更に４回繰り返して、多重膜小胞を形成した。単分散単層リポソームを調製するために、多重膜小胞懸濁液（１ｍｌ）を、Ａｖａｎｔｉ（登録商標）Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒキットを用いて２つのポリカーボネート膜（０．１μｍの細孔径、１９ｍｍの直径）に通して４２℃で５回押し出した。リポソームを、暗い容器内において４℃で保存した。リポソーム調合物内の１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤの濃度を、リポソームをＤＭＳＯで希釈して均質化し、３４，８９５Ｍ^−１．ｃｍ^−１の吸光係数_{ε６８７ｎｍ}を用いて紫外−可視吸収スペクトルを測定することによって決定した。

リポソームペイロードの光誘発性放出
最適なＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ濃縮物及び２００ｎモルの１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤを含むリポソーム、又は最適なＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ濃縮物を含むが光増感剤を含まない対照としてのリポソームを上記のように調製したが、１００ｍＭ カルセイン二ナトリウム塩を含む１ｍｌのＰＢＳで水和した。リポソームを上記のように２つのポリカーボネート膜（０．１μｍの細孔径、１９ｍｍの直径）によって４２℃で５回押し出した。封入されなかったカルセイン二ナトリウム塩を、１×ＰＢＳに対する、Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析管（３００ｋＤａの分子量のカットオフ）内の１ｍｌのリポソームアリコートの４℃で４８時間の透析によって除去した。次いで、リポソームを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５が事前に充填されたｉｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰ Ｃｏｌｕｍｎｓに通して、残存する過剰なリポソームカルセイン二ナトリウム塩を除去した。カルセイン二ナトリウム塩の濃度を、７０，０００Ｍ^−１．ｃｍ^−１の_{ε４９２ｎｍ}を用いて測定し、１×ＰＢＳで、又は反応性分子種の失活剤として１０ｍＭ アジ化ナトリウムを含む１×ＰＢＳで２μＭに希釈した。リポソームを、１５０ｍＷ／ｃｍ^２の照射量で６９０ｎｍのダイオードレーザーを用いて照射し、フルエンスを１００Ｊ／ｃｍ^２まで徐々に上昇させた。リポソームペイロードの代理のカルセインの放出を蛍光脱消光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）の程度の関数として測定し、これを、４５０ｎｍの励起フィルター、４７５ｎｍのカットオフ、５００ｎｍ〜７０ｎｍからの発光プロフィールを用いてプレートリーダーによって測定した。

プロテインＺのセツキシマブへの部位特異的コンジュゲーション
プロテインＺのセツキシマブへの部位特異的コンジュゲーションを、既に公開されているプロトコルに従って行った。Ｊ．Ｈｕｉ、Ｓ．Ｔａｍｓｅｎ、Ｙ．Ｓｏｎｇ、及びＡ．Ｔｓｏｕｒｋａｓ、ＬＡＳＩＣ：Ｌｉｇｈｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ ＩｇＧｓ，２０１５ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６，１４５６−１４６０を参照されたい。遺伝子操作プロテインＺ分子は、３６５ｎｍの紫外光架橋によって共有結合型の架橋を媒介するために非天然アミノ酸ベンゾイルフェニルアラニン（ＢＰＡ）及びＩｇＧ結合部位を含んでいた。プロテインＺ構築物は、クリック化学のために５−カルボキシフルオレセイン分子（５−ＦＡＭ）及びアジド部分を有する末端カスタムペプチド（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃｕｓｔｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ）も含んでいた。セツキシマブの濃度を、紫外−可視分光光度法及び２１７，３１５Ｍ^−１．ｃｍ^−１の吸光係数_{ε２８０ｎｍ}（Ｅｘｐａｓｙ Ｐｒｏｔｏｐａｒａｍ Ｔｏｏｌｓを用いて得られた情報）を用いて決定した。部位特異的にコンジュゲートしたプロテインＺ分子に一致する５−ＦＡＭの濃度を、紫外−可視分光光度法及び８２，０００Ｍ^−１．ｃｍ^−１の吸光係数_{ε４９２ｎｍ}を用いて決定した。精製されたアジドセツキシマブ−プロテインＺは、リポソームへのクリックコンジュゲーションが必要となるまで４℃の暗所で保存した。

抗体及び標的部分の確率的アジド修飾
アジド部分を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルアジドポリ（エチレングリコール）４（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド、３８８．３７ｇ／モル）の抗体のリジン残基への確率的コンジュゲーションによってセツキシマブに確率的に導入した。同時に、セツキシマブをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＡＦ４８８−ＮＨＳ、６４３．４ｇ／モル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルに確率的にコンジュゲートさせた。無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド（１０ｍｇ／ｍｌ）のストック溶液及びＡＦ４８８−ＮＨＳ（１ｍｇ／ｍｌ）のストック溶液の両方を、抗体溶液の添加前に各分子の２．５倍モル過剰に一致する量でセツキシマブと混合した。次いで、セツキシマブ（１×ＤＰＢＳ中、２ｍｇ／ｍｌ、１４５７８１．６ｇ／モル（ＦＡＳＴＡ配列分析）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）を、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジドとＡＦ４８８−ＮＨＳとの混合物に添加し、４℃の暗所で２４時間、軌道回転によって混合した。未反応ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド及びＡＦ４８８−ＮＨＳを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５が事前に充填されたｉｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰ Ｃｏｌｕｍｎｓによってコンジュゲートしたセツキシマブから除去して、１×ＤＰＢＳで平衡にした。ＡＦ４８８及びＰＥＧ４−アジドにコンジュゲートした精製セツキシマブ（ＡＦ４８８−Ｃｅｔ−ＰＥＧ４−アジド）を収集し、４℃で２０分間の２，５００×ｇでの、３０ｋＤａ限外濾過管内での遠心分離によって濃縮した。セツキシマブの濃度を、紫外−可視分光光度法及び２１７，３１５Ｍ^−１．ｃｍ^−１の吸光係数_{ε２８０ｎｍ}（Ｅｘｐａｓｙ Ｐｒｏｔｏｐａｒａｍ Ｔｏｏｌｓを用いて得られた情報）を用いて決定した。ＡＦ４８８−Ｃｅｔ−ＰＥＧ４−アジド構築物にコンジュゲートしたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の濃度を、紫外−可視分光光度法及び７１，０００Ｍ^−１．ｃｍ^−１の吸光係数_{ε４９４ｎｍ}を用いて決定した。精製されたＡＦ４８８−Ｃｅｔ−ＰＥＧ４−アジドは、リポソームへのクリックコンジュゲーションが必要となるまで４℃の暗所で保存した。同じアプローチを抗ＨＥＲ−２抗体、トラスツズマブ、及びトランスフェリン、トランスフェリン受容体の天然リガンドでも行った。全ての確率的アジドリガンドは、リポソームへのクリックコンジュゲーションが必要となるまで４℃の暗所で保存した。

リポソームへの銅フリーのクリックコンジュゲーション
全てのリポソームを、リポソーム表面のＡＤＩＢＯと標的部分の機能的なアジドとの銅フリーのクリックコンジュゲーションにより、部位特異的にセツキシマブに、又は確率的にセツキシマブ、トラスツズマブにコンジュゲートさせた。リポソームと標的部分との間のクリックコンジュゲーションを室温で一晩行った。過剰な標的部分を、サイズ排除セファロースＣＬ−４Ｂゲル濾過クロマトグラフィーによってクリックコンジュゲートしたリポソームから除去し、十分な物理的及び分光学的同定後に４℃の暗所に保存した。

動的光散乱及びζ電位評価
それぞれの修飾後の全てのリポソームのｚ平均直径、多分散性指数、及びζ電位を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）を用いて測定した。ｚ平均直径及び多分散性指数の同時測定では、２μｌのリポソームを４ｍｌのポリスチレンの４つの光学キュベットに入れ、１ｍｌの１×ＤＰＢＳをリポソームに添加した。１２０秒の時間の温度平衡を、各試料で行われる３つの個々の測定前に行った。ζ電位測定を、Ｆｏｌｄｅｄ Ｚｅｔａ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｃｅｌｌを用いて行った。１０μｌのリポソームを１ｍｌの３ｍＭ ＮａＣｌで希釈して細胞に添加し、それぞれの試料に対して３つの個々の測定を行った。

細胞結合の選択性についてのフローサイトメトリー
全てのフローサイトメトリー分析は、同じ手順後にＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａを用いて行った。簡単に述べると、７５％コンフルエントの単層細胞培養物を１×ＰＢＳ（５ｍｌ）で１回洗浄し、５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び５ｍＭ エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）を含む１×ＰＢＳで１回洗浄し、新鮮なＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを含む１×ＰＢＳ（５ｍｌ）中、３７℃で１５分間、頻繁に撹拌しながらインキュベートした。次いで、トリプシンフリーの細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを含む１×ＰＢＳを吸引し、細胞をそれぞれの培養培地で再分散させて、コールターカウンターを用いてカウントした。５０，０００の細胞をそれぞれの条件の個々の１．５ｍｌの遠心管に入れ、１０００×ｇで５分間遠心分離して細胞をペレットにした。培地を吸引して、細胞ペレットを、それぞれの濃度で試験されるべきリポソーム調合物を含む１００μｌのそれぞれの培養培地で再分散させた。３７℃で３０分間、９０分間、又は１８０分間のインキュベーション後、細胞を１０００×ｇで５分間遠心分離して細胞をペレットにし、培地を吸引し、細胞ペレットを２００μｌの氷冷ＰＢＳで再分散させた。細胞は、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａサイトメトリー分析が行われるまで氷上に維持した。細胞からのＢＰＤ蛍光発光を、４０５ｎｍのレーザーからの励起を用いて検出し、細胞からの５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８の発光を、４８８ｎｍのレーザーからの励起を用いて達成し、細胞からのリサミンローダミンＢの発光を、４８８ｎｍのレーザーからの励起を用いて達成した。リポソームの細胞とのインキュベーション中、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度の遊離セツキシマブを用いて競合阻害アッセイを行った。

透過電子顕微鏡法
２００ｎモルの１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ又は０．１％ ＤＰＰＥ−リサミンローダミンＢを含むＡＤＩＢＯ修飾リポソームを既に述べたように調製した。両方のリポソームをセツキシマブ−プロテインＺに部位特異的にクリックコンジュゲートさせ、セファロースＣＬ−４Ｂゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製し、３０００×ｇにおいて、室温で３０分間遠心分離した３０ｋＤの分子量カットオフの４ｍｌのセルロース限外濾過管を用いる限外濾過遠心分離を用いて濃縮した。１０μｌの濃縮リポソームを銅メッシュ炭素被覆格子に１分間載せ、続いてリンタングステン酸で１０秒間染色した。試料を一晩乾燥させ、次いで、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１０透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて８０ｋＶの加速電圧及び４６，０００倍の拡大で画像化した。

共焦点顕微鏡法
ＯＶＣＡＲ−５（高ＥＧＦＲ）細胞を２０００細胞／ウェルの密度において血清含有ＲＰＭＩ培地で４８時間、ガラス底の９６ウェルプレートに播種した。培地を、１００ｎＭ １６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ当量の確率的にコンジュゲートした又はコンジュゲートしていないリポソームを含む新鮮な血清含有ＲＰＭＩ培地と交換した。細胞を、Ａ Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＮＴ共焦点顕微鏡を用いたインキュベーションの１時間後、６時間後、及び２４時間後に共焦点蛍光顕微鏡法を用いて画像化した。

細胞取り込み試験
目的の細胞を１００，０００細胞／ウェルの密度において９６ウェルプレートで２４時間、それぞれの血清含有培地に播種した。培地を、異なる電荷の所望のリポソームを含む新鮮な培地と交換し、３７℃でインキュベートした。必要な時点で、リポソームを含む培地を吸引し、細胞を１００μｌの１×ＰＢＳで３回洗浄し、次いでＳｏｌｖａｂｌｅ（登録商標）組織消化溶液で溶解した。２５μｌのアリコートにし、これを使用して、比色分析ＢＣＡ（登録商標）アッセイを用いて各ウェル内の細胞タンパク質濃度を定量した。残りの細胞消化物を使用して、蛍光を用いて取り込まれたＬｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ濃度を定量し、これを、得られたタンパク質濃度に対して最終的に正規化した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的光毒性
２００ｎモルの１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ及び最適な量のＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯを含むアニオン性リポソームを上記のように合成し、１１４の部位特異的セツキシマブ−プロテインＺ分子／リポソーム又は１１の確率的セツキシマブ分子／リポソームにクリックコンジュゲートさせた。非コンジュゲート抗体を、セファロースＣＬ−４Ｂゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製し、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤの濃度を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ紫外−可視分光光度計を用いて決定した。全てのリポソームを使用前に４℃の暗所で保存した。

Ａ４３１ヒト表皮癌細胞（高ＥＧＦＲ）及び野生型チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ＷＴ、ＥＧＦＲなし）を、血清含有Ｅ−ＭＥＭ培地（Ａ４３１細胞）では３０００細胞／ウェルの密度で、及び血清含有Ｆ１２Ｋ培地（ＣＨＯ−ＷＴ）では２５００細胞／ウェルの密度で、底が透明で壁が黒い９６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後、ウェルプレート内の培地を、セツキシマブに部位特異的に又は確率的にクリックコンジュゲートした所望の濃度のリポソームを含む新鮮な培地と交換し、３時間インキュベートした。次いで、リポソームを含む培地を新鮮な培地と交換し、細胞を、１５０ｍＷ／ｃｍ^２の照射量及び４０Ｊ／ｃｍ^２のフルエンスで６９０ｎｍのダイオードレーザーを用いて照射した。照射の２４時間後、培地を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を含む新鮮な培地と交換し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、細胞及びホルマザンＭＴＴ産物をＤＭＳＯで溶解し、プレートリーダーを用いて５７６ｎｍで吸光度を測定した。細胞生存率が代謝活性の関数として示され、これを未処置対照細胞に対して正規化した。

リポソームプラットフォームのモジュール式近赤外線色素標識
光増感１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤコンジュゲートの非存在下において、４．３％ ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ_２０００、０．５％ ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ、及び０．２％ ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＮＨ_２を含むアニオン性脂質膜を上記のように調製した。この脂質膜を１×ＰＢＳで水和し、上記のように２つの１００ｎｍのポリカーボネート膜から押し出した。近赤外線色素をアミノ末端ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＮＨ_２に直接コンジュゲートさせるために、色素ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤ、及びＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルのＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を、表面に到達可能なアミノリン脂質に対して５倍モル過剰でリポソームと反応させた。簡単に述べると、１ｍｌのリポソーム調合物中、０．０３４μモルの表面に到達可能なＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＮＨ_２部分を５倍モル過剰（０．１７１μモル）の色素ＮＨＳエステルと反応させた。リポソーム色素混合物を室温で２４時間、マグネチックスターラーを用いて２５００ｒｐｍで撹拌し、次いで４℃で４８時間、１×ＰＢＳで透析した。最終的に、リポソームを、表面ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ部分により、室温で２４時間、１リポソーム当たり５０の確率的アジドセツキシマブ分子又は１リポソーム当たり５０のアジドＩｇＧ分子にクリックコンジュゲートさせた。非コンジュゲート抗体を、セファロースＣＬ−４Ｂゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製し、リポソームにコンジュゲートした近赤外線色素の濃度を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ紫外−可視分光光度計を用いて決定した。全てのリポソームを４℃の暗所で保存した。

ｉｎ ｖｉｖｏでの動的二重トレーサーイメージング
ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤ又はＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷでモジュール標識されたＡＤＩＢＯ修飾リポソームを、それぞれ１リポソーム当たり５０のセツキシマブ分子又は１リポソーム当たり５０のＩｇＧ分子に確率的にクリックコンジュゲートさせた。セファロースＣＬ−４Ｂゲル濾過クロマトグラフィーを用いた精製後、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤ又はＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷの濃度を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ紫外−可視分光光度計を用いて決定した。雌スイスヌードマウス（６週齢）に、増殖因子低減マトリゲル（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｒｉｇｅｌ）中、１×１０^６のＵ２５１ヒト膠芽細胞（高ＥＧＦＲ）を下部左脇腹に皮下移植し、２週間成長させた。マウスに、１リポソームコンジュゲート当たり０．１ｎモルの色素当量の量でセツキシマブ標的ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤリポソームとＩｇＧ非標的ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷリポソームとの混合物を同時注射した。相対腫瘍蛍光強度を、Ｐｅａｒｌ（登録商標）Ｉｍｐｕｌｓｅ Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、標的ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤリポソーム及びＩｇＧ非標的ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ対照リポソームの両方について動的且つ縦方向に監視した。腫瘍を二重トレーサーナノプラットフォームの同時投与から最大１２０時間画像化した。

標的光増感リポソームプラットフォームの生体内分布
６週齢の雌スイスヌードマウスに、増殖因子低減マトリゲル中、１×１０^６のＡ４３１ヒト表皮癌細胞（高ＥＧＦＲ）を下部右脇腹に皮下移植し、細胞を２週間成長させた。次いで、マウスに、（１）１リポソーム当たり１０の確率的セツキシマブ分子にクリックコンジュゲートされた、又は（２）コンジュゲートされていない０．２５ｍｇ／ｋｇ ＢＰＤ当量の１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤリポソームを注射した。静脈投与の２４時間後に動物を屠殺し、器官を、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩ ｉｎ ｖｉｖｏ前臨床イメージングステーションを用いて画像化した。１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤリポソームの蛍光強度を、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析及び定量し、腫瘍の強度を器官のそれぞれの強度に対して正規化して組織選択性を定量した。

最適化試験
１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ脂質固定ベンゾポルフィリン誘導体光増感剤（１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ）
光増感剤がリポソームに安定して固定されていない場合、光増感剤又はフルオロフォアがナノリポソーム担体の膜から滲出し、選択性が低下することが観察された。疎水性フルオロフォア又は光増感剤の膜への安定した固定は、このフルオロフォア又は光増感剤のリゾリン脂質へのコンジュゲートによって達成することができる。

１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ及び２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣのベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）コンジュゲートを合成し、安定したリポソームを、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ及び２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤコンジュゲートをリン脂質二重層内に埋め込んで形成し、その表面は、アジド修飾標的リガンドのクリックコンジュゲーションのために完全に最適化されている。リポソームからの非特異的ＢＰＤ漏れを評価するために、ＯＶＣＡＲ−５細胞懸濁液（５０，０００細胞／条件）を、（１）非コンジュゲートＢＰＤ、（２）１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ、及び（３）２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤコンジュゲートで調合された様々な濃度のＢＰＤ当量のリポソームと共に３０分間インキュベートし、次いでフローサイトメトリーによってＢＰＤ取り込み量を分析した。図１は、（１）脂質二重層内に埋め込まれたＢＰＤを含むリポソーム、（２）１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤにコンジュゲートしたＢＰＤを含むリポソーム、及び（３）２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤにコンジュゲートしたＢＰＤを含むリポソームについての、ＯＶＣＡＲ−５細胞内のリポソーム調合物中のＢＰＤの濃度に対するＢＰＤ蛍光強度の中央値を示す。Ｌｙｓｏ ＰＣがコンジュゲートしていないＢＰＤは、ＢＰＤ平衡の濃度の増加に伴う蛍光強度の中央値の増加を示し、ＢＰＤの細胞内への非特異的漏れを示唆している。Ｌｙｓｏ ＰＣコンジュゲートＢＰＤを含むリソソームは、このような漏れを一切示さず、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ及び２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤで形成された安定したリポソームが、二重層内への疎水性ＢＰＤの閉じ込めで観察される光増感剤の細胞への非特異的な漏れを完全に遮断することを実証している。

クリック化学のための最適化された表面の機能化
銅フリーのクリック化学は、リポソームの表面が強い疎水性の歪んだシクロオクチン部分、例えば、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）で誘導体化された場合に可能である。

ＰＥＧ化
図２は、５％、４％、３％、２％、１％、及び０．５％のリン脂質１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ_２０００）の取り込みによって立体的に安定化された、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤを含むリポソームのＺ平均直径及び多分散性指数を示す。歪んだシクロオクチン（ＡＤＩＢＯ）−コンジュゲート脂質１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ジベンゾシクロオクチル（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ）によるクリック化学機能化では、１：１０のモル比のＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ：ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ_２０００が導入されて維持されたときに、リポソームは安定性を維持した。ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ_２０００を用いた疎水性のＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯの９倍モルの反安定化（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が全リポソーム安定性を促進すると考えられる。ＡＤＩＢＯのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルをリン脂質１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ_２）に結合した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ_２をリポソーム内に組み込んで、これを９倍モル量のＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ_２０００で反安定化させた。標的リガンドの安定したＡＤＩＢＯ機能化リポソームへの銅フリーのクリックコンジュゲーションも行った。図２６は、図示されているＰＥＧ鎖を有する１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ光増感剤を含むリポソームの構造概略図を示す。調合物の一例は、５７．６％のＤＰＰＣ、７．９％のＤＯＰＧ、２８．９％のコレステロール、４．５％のＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ_２０００、０．５％のＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ、及び０．６％の１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤを含む。

静電学
アニオン電荷及びカチオン電荷を、７．９％ １，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ、カチオン性）又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ、アニオン性）の取り込みによってベンゾポルフィリン誘導体光増感剤を含むリポソームに導入した。図３Ａ〜図３Ｃは、それぞれＤＯＴＡＰを含む、ＤＯＰＧを含む、又は追加の電荷を含まないＡＤＩＢＯ修飾、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ含有リポソームについてのζ電位、Ｚ平均直径、及び多分散性指数（ＰＤＩ）を示す。アニオン電荷又はカチオン電荷は、ＡＤＩＢＯ修飾、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ含有リポソームの静電安定性を更に提供することが分かった。図３Ｃに示されている荷電リポソームの中性リポソームに対する相対多分散性指数は、荷電脂質を導入しなくてもリポソームが凝集して沈殿することを示唆している。図４は、ＯＶＣＡＲ−５細胞、Ａ４３１細胞、及びＴ４７Ｄ細胞での非標的ＤＯＴＡＰ含有及びＤＯＰＧ含有リポソームの細胞最新情報の定量化（ｐモル１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ／μｇ細胞タンパク質）を示す。ＡＤＩＢＯ修飾、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ含有リポソームの非特異的取り込みが、アニオン荷電脂質ＤＯＰＧがリポソーム内に取り込まれたときに細胞株間でより均一であることが分かった。均一な非特異的な取り込みプロフィールは、正確な細胞標的を促進する。

光誘発性放出
カルセインを、フルオロフォアの自己消光に十分な高い濃度（１００ｍＭ）でリポソーム内に充填した。リポソーム調合物は、膜内に１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤを含んでいたか、又は対照として光増感剤を含んでいなかった。リポソーム形成後、全てのリポソーム外のカルセインフルオロフォアを透析及びゲル濾過によって精製し、リポソームを９６ウェルプレートに入れた。リポソームを６９０ｎｍの光で照射して、放出時に脱消光するリポソーム内のカルセインを放出させた。放出後のカルセインの脱消光（及び蛍光の増加）を、プレートリーダーを用いて測定し、照射前に対照に対して正規化した。図５は、（１）Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ（一番上のプロット）を含むリポソーム、（２）Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ及びアジド（真中のプロット）を含むリポソーム、及び（３）Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＰＢＤ（一番下のプロット）を含まないリポソームの６９０ｎｍの光でのフルエンス（光線量）に対する倍率放出を示す。リポソーム封入治療薬の代用である、消光濃度のフルオロフォアカルセイン二ナトリウム塩が、膜内１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ及び表面ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＤＩＢＯを含むリポソームの照射時に放出された。膜内１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤの放出は見られず、放出は１０ｍＭ アジ化ナトリウムの存在下で阻害された。これは、ＡＤＩＢＯ修飾、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ含有リポソームが、リポソームペイロードの光酸化及び光誘発性放出に対して不安定であることを示すと考えられる。理論に拘束されるものではないが、アジ化ナトリウムの存在下での光誘発性放出の抑制率が、このプロセスが光化学であり、反応性分子種に依存することを示唆すると考えられる。

標的リガンドのリポソームへの銅フリーのクリックコンジュゲーション
抗体のアジド修飾
歪んだシクロオクチンで事前に修飾されたリポソーム表面への標的部分の銅フリーのクリックコンジュゲーションでは、この標的部分にアジド基を付加する。光増感剤及び／又はイメージング剤を含む最適化リポソームプラットフォームへのＩｇＧクリックコンジュゲーションの原理の証明として、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ抗体、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））の部位特異的又は確率的アジド修飾を行った。アジド部分のセツキシマブへの部位特異的導入を、遺伝子操作プロテインＺ分子を用いて行い、この遺伝子操作プロテインＺ分子は、ＩｇＧ分子のＦｃ部分にのみ結合する（Ｈｕｉ，Ｊ．Ｚ．、Ａｌ Ｚａｋｉ，Ａ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｚ．、Ｐｏｐｉｋ，Ｖ．、Ｚｈａｎｇ，Ｈ．、Ｐｒａｋ，Ｅ．Ｔ．Ｌ、及びＴｓｏｕｒｋａｓ，Ａ．、Ｆａｃｉｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ ＩｇＧ ｏｎｔｏ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（２０１４）Ｓｍａｌｌ １０（１６）：３３５４−６３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｍｌｌ．２０１３０３６２９）。図６Ａは、銅フリーのクリック化学によってセツキシマブ−プロテインＺに結合したリポソーム表面の概略図である。プロテインＺは、任意のＩｇＧ分子（例えば、セツキシマブ）のＦｃ領域に部位特異的に結合して、非天然ベンゾイルフェニルアラニンアミノ酸によって光架橋している。ペプチド結合プロテインＺの末端アジドは、最適な表面モル比のＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ、歪んだシクロオクチン誘導体化リン脂質にクリックコンジュゲートしている。図６Ｂは、銅フリーのクリック化学によってアジド−セツキシマブＺに結合したリポソーム表面の概略図である。標的タンパク質（例えば、セツキシマブ）に確率的に付着したＰＥＧ４分子の末端アジドは、最適なモル比のＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ、歪んだシクロオクチン誘導体化リン脂質にクリックコンジュゲートしている。

図７Ａ及び図７Ｂは、それぞれ部位特異的アジドコンジュゲートの紫外−可視スペクトル及び構造概略図を示す。アジド部分のセツキシマブへの確率的導入は、ＰＥＧ４−アジドのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを用いて達成した。単一フルオロフォア（部位特異的セツキシマブでは５−ＦＡＭ、確率的セツキシマブではＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８）を各抗体コンジュゲートに導入した。プロテインＺのセツキシマブに対する比率は、１．１３±０．１７である。図８Ａ及び図８Ｂは、それぞれＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８を取り込んだ確率的アジドコンジュゲートの紫外−可視スペクトル及びその構造概略図を示す。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８のセツキシマブに対する比率は、１．００±０．０４である。

クリックコンジュゲーション
ＡＤＩＢＯ修飾、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ含有アニオン性リポソームへのアジド修飾セツキシマブの部位特異的及び確率的銅フリーのクリックコンジュゲーションをコンジュゲート抗体の様々な表面密度で行った。サイズ及び分散度のデータを動的光散乱によって収集した。図９は、部位特異的（図９Ａ）及び確率的（図９Ｂ）コンジュゲーションのリポソームサイズ（各図面の一番上のプロット）及び多分散性指数（各図面の下側のプロット）の比較を示す。図９Ａ及び図９Ｂによると、部位特異的及び確率的コンジュゲーションの両方が安定したリポソームを生じさせた。図１０は、８０ｋＶの加速電圧及び４６，０００倍の拡大で画像化された、セツキシマブ−プロテインＺに部位特異的にクリックコンジュゲートしたリポソームの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。図１１は、部位特異的（左の一番上のプロット）及び確率的（左の下側のプロット）コンジュゲーションについてのζ電位とコンジュゲーション効率との比較を示す。図１２は、部位特異的（一番上のプロット）及び確率的（下側のプロット）コンジュゲーションについての１リポソーム当たりのコンジュゲートしたセツキシマブの数とコンジュゲーション効率との比較を示す。少なくとも図１２に示されているデータに基づくと、セツキシマブのリポソームへの部位特異的クリックコンジュゲーションは、リポソームへの確率的クリックコンジュゲーションよりも著しく効率的であると考えられる。理論に拘束されることを望むものではないが、確率的コンジュゲーションで観察される低い効率は、一部のアジド基のＤＩＢＯ部分への低い到達可能性の結果であり、これは、抗体の任意の部分へのアジドのランダム導入の結果であり得ると考えられる。

Ａ４３１細胞におけるＢＰＤの蛍光強度の中央値とセツキシマブに結合した５−ＦＡＭプロテインＺとの間の相関性が図３０Ａ（高ＥＧＦＲ）に示され、Ｔ４７Ｄ細胞におけるこれらの相関性が図３０Ｂ（低ＥＧＦＲ）に示されている。高い相関係数は、リポソームにクリックコンジュゲーションしたセツキシマブの完全性を示唆する。

結合及び光毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択性
調製された全ての密度での部位特異的又は確率的セツキシマブコンジュゲーションで形成された標的リポソームのＥＧＦＲ選択性を、リポソーム細胞結合用のマーカーとしてのＢＰＤ蛍光を用いたフローサイトメトリーを用いて評価した。図１３は、Ａ４３１細胞（高ＥＧＦＲ；一番上のプロット）、Ｔ４７Ｄ細胞（低ＥＧＦＲ；真中のプロット）、及びＣＨＯ−ＷＴ細胞（ＥＧＦＲなし；下側のプロット）における結合選択性の比較を示す。図１４は、Ａ４３１細胞（高ＥＧＦＲ；一番上のプロット）、Ｔ４７Ｄ細胞（低ＥＧＦＲ；真中のプロット）、及びＣＨＯ−ＷＴ細胞（ＥＧＦＲなし；下側のプロット）におけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含むリポソーム−セツキシマブコンジュゲートの結合選択性の比較を示す。図１３及び図１４のそれぞれでは、選択性は、Ａ４３１細胞における１リポソーム当たりのセツキシマブの数の増加と共に上昇しているが、Ｔ４７Ｄ細胞及びＣＨＯ−ＷＴ細胞ではほとんど変化を示していない。図１４は、コンジュゲーションの確率的方法の選択性が部位特異的方法よりも細胞結合でより効率的であることを示す。

フローサイトメトリーのデータが図２８に示されており、このデータは、１リポソーム当たりｖ０、１０、５０、又は１００のセツキシマブ−プロテインＺコンジュゲート（Ｃｅｔ−Ｐｚ）と反応したリポソームからの光増感剤（ＢＰＤ）の強度の中央値を示す。リポソームを２５０ｎＭ又は５００ｎＭ ＢＰＤ当量の標的リポソームで、３７℃で３０分間、Ａ４３１細胞（高ＥＧＦＲ）又はＴ４７Ｄ（低ＥＧＦＲ）細胞と共にインキュベートした。より反応する１リポソーム当たり１００のＣｅｔ−Ｐｚが、１リポソーム当たり５０のＣｅｔ−Ｐｚと反応したリポソームに対して標的細胞の結合で有意な有益性を示さないことは明らかである。

図３１Ａ及び図３１Ｂは、フローサイトメトリーのデータを示し、ＢＰＤの強度の中央値は、５０，０００の個々に測定された細胞の平均である。細胞を、１リポソーム当たり５０のセツキシマブにクリックコンジュゲートしたリポソーム（図３１Ａ）及び非コンジュゲートリポソーム（図３１Ｂ）と共に３０分間、９０分間、又は１８０分間インキュベートした。データは、３つ全ての時点で、標的リポソームが非標的均等物と比較してＯＶＣＡＲ−５細胞（高ＥＧＦＲを発現する）に対して優先的結合を示すことを示す。リポソームの選択性（図３１Ｃ）は、標的リポソームと共にインキュベートされた細胞のＢＰＤの強度の中央値を、非特異的リポソームと共にインキュベートされた細胞のＢＰＤの強度の中央値で除した値を表している。

標的リポソームのＯＶＣＡＲ−５細胞への結合のセツキシマブ依存性を、１ｍｇ／ｍｌの遊離セツキシマブとのインキュベーションによって標的リポソームと細胞表面ＥＧＦＲとの相互作用を阻害して検証した。図１５は、標的リポソーム及び非特異的リポソーム、並びにＥＧＦＲが遮断されたときの標的リポソーム及び非特異的リポソームのフローサイトメトリーのデータを示す。細胞に結合した標的１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤリポソームから得られたＢＰＤ発光シグナルの中央値の低下によって説明されるように、３つ全ての時点（１８０分、９０分、及び３０分）で、遊離セツキシマブの存在が標的リポソームのＯＶＣＡＲ−５細胞への結合を完全に阻害した。

光毒性の選択性を、６９０ｎｍのレーザー照射を用いてＣＨＯ−ＷＴ細胞（ＥＧＦＲなし）及びＡ４３１細胞（高ＥＧＦＲ）で比較した。図１６は、セツキシマブに部位特異的及び確率的にコンジュゲートした１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤリポソームを用いた選択的光線力学療法後の細胞生存率を示す。照射なしでは、いずれの標的リポソームとのインキュベーションも、Ａ４３１細胞又はＣＨＯ−ＷＴ細胞のいずれの生存に対しても影響がない。標的リポソームがＣＨＯ−ＷＴ細胞に僅かなレベルの光毒性を誘導したが、Ａ４３１の生存率が約５０％に低減され、標的リポソームプラットフォームの選択癌療法を仲介する能力を強調している。生存の指標である代謝活性を、ＭＴＴ比色アッセイを用いたＰＤＴ処置の２４時間後に評価した（^＊＝Ｐ≦０．０５、^＊＊＝Ｐ≦０．０１、^＊＊＊＝Ｐ≦０．００１）。

図３２は、２０Ｊ／ｃｍ^２の６９０ｎｍのレーザー光でのＰＤＴ処置後のＡ４３１細胞及びＯＶＣＡＲ−５細胞（高ＥＧＦＲ）並びにＴ４７Ｄ細胞（低ＥＧＦＲ）のＭＴＴアッセイの結果を示す。確率的標的リポソームをこれらの細胞と共に２４時間インキュベートした。細胞生存率の指標である代謝活性を、ＭＴＳ比色アッセイを用いたＰＤＴ処置の２４時間後に評価した（^＊＝Ｐ≦０．０５、^＊＊＝Ｐ≦０．０１、^＊＊＊＝Ｐ≦０．００１）。Ｔ４７Ｄ細胞の細胞生存率は全てのＢＰＤ濃度で最も高く、細胞生存率はＢＰＤ濃度の上昇で低くなった。

ＮＨＳ−ＰＥＧ_４−Ｎ_３も任意の１級アミン含有標的リガンドに確率的にコンジュゲートすることができ、且つ同じ光増感ナノ構築物にクリックコンジュゲートすることができる。これは、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ−２抗体）、及びヒトトランスフェリン（トランスフェリン受容体の天然リガンド）のコンジュゲーションによって実証された。倍率選択性を、フローサイトメトリーを用いて得た。この倍率選択性は、標的受容体を過剰発現する細胞のＢＰＤ蛍光の中央値を、標的受容体をほとんど又は全く発現しない細胞のＢＰＤシグナルの中央値で除した値を表す（図１７）。赤い線は、１倍の選択性を表し、非標的細胞に対して、標的リポソームの標的細胞への優先的結合が存在しない。Ａ４３１細胞は、ＥＧＦＲ受容体を過剰発現するヒト表皮癌細胞であり、ＳＫＯＶ−３細胞は、ＨＥＲ−２受容体を過剰発現する卵巣癌細胞であり、Ｔ４７Ｄ細胞は、トランスフェリン受容体を過剰発現する乳房胸水癌細胞（ｂｒｅａｓｔ ｐｌｅｕｒａｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ）であり、ＣＨＯ細胞は、非癌性のチャイニーズハムスター卵巣細胞である。図１７は、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ−２抗体、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））及びトランスフェリン（トランスフェリン受容体の天然リガンド）の確率的アジド修飾が、ＡＤＩＢＯ修飾、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ含有リポソームにクリックしたときに結合の細胞選択性を示すことを実証している。

１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤが膜に閉じ込められていないＡＤＩＢＯ修飾リポソームに水溶性光増感剤クロリンｅ６モノエチレンジアミンモノアミド（ＣＭＡ）が充填され、セツキシマブに確率的にコンジュゲートしたときに細胞選択性を提供することを示す（図１８Ａ）。リポソームの概略図が図１８Ｂに示されている。

リポソーム膜から生じた光増感剤（ＢＰＤ）の強度の中央値（図２９Ａ）及びプロテインＺに付着した蛍光標識ペプチドから生じた５−ＦＡＭの蛍光強度の中央値（図２９Ｂ）を示すフローサイトメトリーのデータを得た。Ａ４３１（高ＥＧＦＲ）及びＴ４７Ｄ（低ＥＧＦＲ）細胞を、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、及び２５０ｎＭ ＢＰＤ当量の標的セツキシマブ−プロテインＺクリックリポソーム又は抗体コンジュゲーションを含まない非特異的リポソームと共に３７℃で３０分間インキュベートした。このデータは、蛍光標識セツキシマブ−プロテインＺのＥＧＦＲ依存性細胞結合と、クリックコンジュゲートリポソームの膜に埋め込まれた１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤとの間の強い正の相関が存在することを示す。この相関は、銅フリーのクリックコンジュゲートリポソームが、リポソームペイロードを標的癌細胞に均一に送達できる安定した実体であることを実証している。

選択的エンドサイトーシス：
標的リポソームプラットフォームの選択的細胞内送達が光線力学療法の細胞内導入、及び生物剤／化学療法剤の細胞内光誘発性送達を可能にする。図１９は、漸進的時間間隔でのＯＶＣＡＲ−５細胞における非標的及び確率的標的リポソームの共焦点蛍光顕微鏡画像を示し、標的リポソームの細胞内への内部移行を示唆している。この顕微鏡写真は、セツキシマブにクリックコンジュゲートした１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ含有リポソームを、時間依存的にＥＧＦＲを過剰発現するＯＶＣＡＲ−５細胞内に選択的に細胞内送達できることを実証している。

標的ナノ構築物のｉｎ ｖｉｔｒｏイメージング及びｉｎ ｖｉｖｏ生体イメージングのためのリポソームナノ構築物の蛍光標識。
親水性フルオロフォアの安定した固定は、（１）コレステロール、（２）リン脂質様１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）のリン酸頭基、又は（３）ＰＥＧ化リン脂質、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＮＨ_２の末端へのこれらのコンジュゲーションによって達成することができる。

モジュール式フルオロフォア標識
銅フリーのクリック化学の成分としてのＡＤＩＢＯの高い化学選択性は、ＡＤＩＢＯとの交差反応性なしで、異なる反応性実体のリポソーム表面へのモジュール式コンジュゲーションを可能にした。０．２％ ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＮＨ_２を、ＡＤＩＢＯ修飾リポソーム内に取り込み、近赤外線色素のアミン反応性ＮＨＳ−エステルとコンジュゲートさせて、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングに使用できる安定したクリック反応性リポソームのパネルを形成した（図２０）。ＡＤＩＢＯ修飾リポソームを標識するために使用される色素としては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤ、及びＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷが挙げられる。調製される調合物は、５８．２％のＤＰＰＣ、７．９％のＤＯＰＧ／ＤＯＴＡＰ、２８．９％のコレステロール、４．３％のＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ_２０００、０．５％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００−ＡＤＩＢＯ（抗体へのクリックコンジュゲーションのための）、及び０．２％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ_２（色素へのアミド結合のための）を含んでいた。全てのリポソームは、セツキシマブ又はｓｈａｍ ＩｇＧ１対照に確率的にクリックコンジュゲートした後に安定性を維持した。図２１Ａは、様々な色素を含むリポソームのサイズ及び多分散性指数を示し、図２１Ｂは、それぞれの紫外−可視スペクトルを示す。

蛍光標識リポソームのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択性
脂質固定フルオロフォアリサミンローダミンＢ−ＤＰＰＥを取り込んでいる調合物の一例が図３９Ａに示されている。ＡＤＩＢＯを取り込むために、５当量のジベンゾシクロオクチンＮＨＳエステル（ＡＤＩＢＯ−ＮＨＳ ０．４２６ｍＭ）を、１０％ ＤＭＳＯを含むｐＨ８の１００ｍＭ リン酸緩衝液中でアミンと反応させた。３つの試料（５０％（ｖ／ｖ）ＧＯＡ＿１１１＋５×ＡＤＩＢＯ １（一番上のプロット）、５０％（ｖ／ｖ）ＧＯＡ＿１１１＋５×ＡＤＩＢＯ ２（真中のプロット）、及び５０％（ｖ／ｖ）ＧＯＡ＿１１１＋５×ＡＤＩＢＯ ３（一番下のプロット））のサイズ及び多分散性指数が図３９Ｂに示されている。

ローダミンを含むリポソームを５０ｍＬのアリコートで１リポソーム当たり０、１０、５０、及び１００のセツキシマブ−プロテインＺと共に室温で一晩インキュベートした。各コンジュゲートを、セファロースＣＬ−４Ｂゲル濾過クロマトグラフィーを用いて非結合抗体から精製し、これを、紫外−可視分光法及び動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて特徴付けた。図４０は、各試料のサイズ及び多分散性指数を示す。

リサミンローダミンＢに結合した０．１％のＤＰＰＥをＡＤＩＢＯ修飾リポソーム内に取り込み、セツキシマブに部位特異的にクリックコンジュゲートさせた。図２２は、１リポソーム当たりのセツキシマブ−プロテインＺ（Ｃｅｔ−Ｐｚ）密度の関数としてリサミンローダミンＢの強度の中央値を示し、蛍光標識リポソームが、Ｔ４７Ｄ細胞（低ＥＧＦＲ；下側のプロット）と比較して、Ａ４３１細胞（高ＥＧＦＲ；上側のプロット）に選択的に結合することを実証している。最適な密度は、１リポソーム当たり１０〜５０のＣｅｔ−Ｐｚで生じる。

図３５は、５００ｎＭ リサミンローダミンＢ当量での、ＧＯＡ＿１１１−ＣｅｔＰｚ（１リポソーム当たり１０のＣｅｔＰｚ）リサミンローダミンＢの強度の中央値を用いた様々な癌細胞株の倍率選択性を示す。１００μＬのリポソーム試料を５０，０００の細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートした。高ＥＧＦＲ Ａ４３１細胞は、最も高い選択性を示す。

セツキシマブ−プロテインＺにコンジュゲートしたＢＰＤ−ローダミンリポソームを調製して、透過電子顕微鏡法によって画像化した。１リポソーム当たり０又は１０のセツキシマブを含む２００μｌのＧＯＡ＿１１３を調製し、次いで２０００×ｇの１００ｋＤａの限外濾過を２０分間行った。１０μｌの濃縮リポソームを銅メッシュ炭素被覆格子に１分間載せ、続いてリンタングステン酸で１０秒間染色した。試料を一晩乾燥させた。図３６は、前述の手順に従って処理されたリポソームの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。

図３４は、５００ｎＭ及び１００ｎＭの濃度のリサミンローダミンＢ（それぞれ一番上のプロット及びその下のプロット）でのＡ４３１細胞、並びに５００ｎＭ及び１００ｎＭの濃度のリサミンローダミンＢ（下側２つのプロット）でのＴ４７Ｄ細胞の最適なセツキシマブ−プロテインＺ密度を示す。最適な密度は、Ａ４３１では５００ｎＭで１リポソーム当たり１０のＣｅｔＰｚであり、Ａ４３１では１００ｎＭで１リポソーム当たり５０のＣｅｔＰｚである。

図３７は、ｎＭ当量のローダミンに対する倍率選択性を示し、セツキシマブにクリックコンジュゲートし、且つ脂質固定ローダミン色素及び疎水性によって閉じ込められた遊離ＢＰＤの両方を含むリポソームが、抗体コンジュゲーションのないリポソームと比較して異なるレベルの選択性を示すことを示す。脂質固定ローダミンは、抗体に共有結合的にコンジュゲートした膜内に固定されるため、ローダミン結合では最大４．５倍の選択性（ＦＡＣＳ蛍光シグナルによって決定される）が３０分で濃度依存的に見られる。遊離セツキシマブは、この選択性を阻害し、ローダミン（及びリポソーム）選択性がＥＧＦＲ結合に依存することを裏付けている。同じリポソーム内に疎水性により閉じ込められた遊離ＢＰＤは、非常に異なる選択性プロフィールを有し、非標的リポソームに対して標的リポソームで僅かに１．５倍の優先性が観察された。これらの観察に基づき、抗体コンジュゲーションはリポソーム選択性を提供するが、遊離ＢＰＤはリポソーム結合に関係なく漏れて細胞内に入る。

図３３は、１リポソーム当たりのセツキシマブ−プロテインＺ密度の関数として５−ＦＡＭの蛍光強度の中央値を示し、Ｔ４７Ｄ細胞（下側のプロット）と比較してＡ４３１細胞（上側のプロット）での高い選択性も実証している。最適な密度は、１リポソーム当たりの約１００のＣｅｔ−Ｐｚで生じる。

ｉｎ ｖｉｖｏ生体イメージング及び選択性
ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤ及びＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷで標識されたＡＤＩＢＯ修飾リポソームをそれぞれセツキシマブ又はヒトＩｇＧ１ ｓｈａｍ抗体対照に確率的にクリックコンジュゲートさせることができる。図２３は、時間に対するＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤ（上側のプロット）及びＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ（下側のプロット）の平均補正蛍光を示し、ｓｈａｍヒトＩｇＧ１対照にクリックコンジュゲートした同時注射ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識リポソームと比較した、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）にクリックコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ標識リポソームの皮下Ｕ２５１腫瘍に対する選択的結合性を実証している。

ＥＧＦＲを過剰発現する皮下Ｕ２５１マウス異種移植グリア芽腫腫瘍を各リポソームの０．１ｎモルの色素当量のマウスへの静脈注射後に画像化した（１リポソーム当たり５０の確率的ＰＥＧ−アジドセツキシマブ分子及び１リポソーム当たり５０の確率的ＰＥＧ−アジド非特異的ＩｇＧ分子にクリックコンジュゲートした標的リポソーム）。標的リポソームを近赤外線フルオロフォアＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤでタグ付けし、非特異的リポソームを近赤外線フルオロフォアＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷでタグ付けした。ＰＥＡＲＬイメージングシステムを用いる二重トレーサーイメージングアプローチを行った。標的リポソームは、ＩｇＧ１ ｓｈａｍコンジュゲートリポソームと比較して、投与の２４時間後に最大の選択性に達することが分かった。

標的光線療法剤１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤ含有リポソームの別個の生体内分布試験では、皮下Ａ４３１表皮癌腫瘍を有するマウスに非標的及び確率的セツキシマブ標的リポソームの０．２５ｍｇ／ｋｇ ＢＰＤ当量を注射した。腫瘍及び器官を注射の２４時間後に回収し、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤの生体内分布を定量的に画像化した。図２４は、標的リポソーム（各対の右のバー）が非標的リポソーム（バーの各対の左のバー）よりもＡ４３１腫瘍に対してより選択的であったことを示す。図２５は、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤの蛍光を使用して生体内分布を定量的に画像化し、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ−ＢＰＤリポソーム対照を含む非コンジュゲートＤＩＢＯと比較した、０．２５ｍｇ／ｋｇのＢＰＤ当量の投与から２４時間後の、皮下Ａ４３１（高ＥＧＦＲ）腫瘍を有するマウスでの確率的にクリックコンジュゲートしたリポソームの腫瘍選択性を確認できることを示す。

図３８は、ローダミン標識リポソーム（赤色）と共に３０分間インキュベートしたＭＧＧ６細胞ニューロスフェア（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３２４で染色された核、青色）の共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。図３８は、３０分で、セツキシマブ−抗ＥＧＦＲにクリックコンジュゲートした標的リポソームが、非標的リポソーム（図３８Ｂ）と比較して優先的結合（図３８Ａ）を示すことを示す。

本発明の多数の実施形態を説明してきた。それにも関わらず、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更形態がなされ得ることが理解されるであろう。従って、他の実施形態も以下の特許請求の範囲内である。

Claims (67)

1. ａ）リゾリン脂質及び光増感剤を含むコンジュゲート；
   ｂ）第１のリン脂質及び歪んだシクロオクチン部分を含む第１の誘導体化リン脂質；
   ｃ）第２のリン脂質及びポリエチレングリコールポリマーを含む第２の誘導体化リン脂質；及び
   ｄ）カチオン性脂質又はアニオン性脂質
   を含むリポソーム。
2. ａ）リゾリン脂質及び光増感剤を含むコンジュゲート；
   ｂ）第１のリン脂質及び標的部分を含む第１の誘導体化リン脂質；
   ｃ）第２のリン脂質及びポリエチレングリコールポリマーを含む第２の誘導体化リン脂質；及び
   ｄ）カチオン性脂質又はアニオン性脂質を含むリポソーム。
3. 前記光増感剤が疎水性である、請求項１又は２に記載のリポソーム。
4. 前記光増感剤がポルフィリン光増感剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリポソーム。
5. 前記光増感剤がベンゾポルフィリン部分を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリポソーム。
6. 前記光増感剤がベンゾポルフィリン誘導体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のリポソーム。
7. 前記リゾリン脂質が脂肪酸鎖に１４〜２２の炭素を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のリポソーム。
8. 前記リゾリン脂質が前記脂肪酸鎖に１６〜２０の炭素を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のリポソーム。
9. 前記リゾリン脂質が不飽和脂肪酸鎖を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のリポソーム。
10. 前記リゾリン脂質が、１６：０リゾリン脂質、２０：０リゾリン脂質、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のリポソーム。
11. 前記コンジュゲートがリゾリン脂質を含み、及び光増感剤が前記リポソーム中に約０．０１モルパーセント〜約１モルパーセントで存在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリポソーム。
12. 前記コンジュゲートがリゾリン脂質を含み、及び光増感剤が前記リポソーム中に約０．０５モルパーセント〜約０．５モルパーセントで存在する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のリポソーム。
13. 前記コンジュゲートがリゾリン脂質を含み、及び光増感剤が前記リポソーム中に約０．０８モルパーセント〜約０．１２モルパーセントで存在する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のリポソーム。
14. 前記コンジュゲートがリゾリン脂質を含み、及び光増感剤が前記リポソーム中に約０．１モルパーセントで存在する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のリポソーム。
15. 前記第１のリン脂質が、水素化大豆ホスホチジルコリン（ＨＳＰＣ）；１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＤＰＣ）；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＥＰＡ）；１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）；１，２−ジエライドイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＥＰＧ）；１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＯＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＬＰＡ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＬＰＳ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＭＰＡ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＭＰＳ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＯＰＡ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＯＰＳ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＰＰＡ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＰＰＳ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＳＰＡ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＳＰＳ）；１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ ３−ホスホコリン（ＭＰＰＣ）；１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＳＰＣ）；１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＭＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）；１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ）；１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＰＣ）；及び１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＯＰＣ）；１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＰＰＣ）、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のリポソーム。
16. 前記第１のリン脂質が１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である、請求項１５に記載のリポソーム。
17. 前記第１の誘導体化リン脂質がリンカーを更に含む、請求項１５又は１６に記載のリポソーム。
18. 前記リンカーがポリエチレングリコールである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のリポソーム。
19. 前記ポリエチレングリコールが約３５０ｇ／モル〜約３０，０００ｇ／モルの分子量を有する、請求項１８に記載のリポソーム。
20. 前記ポリエチレングリコールが、３５０ｇ／モル、５５０ｇ／モル、７５０ｇ／モル、１０００ｇ／モル、２０００ｇ／モル、３０００ｇ／モル、５０００ｇ／モル、１０，０００ｇ／モル、２０，０００ｇ／モル、及び３０，０００ｇ／モルからなる群から選択される分子量を有する、請求項１８又は１９に記載のリポソーム。
21. 前記ポリエチレングリコールが２０００ｇ／モルの分子量を有する、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のリポソーム。
22. 前記第１の誘導体化リン脂質がＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００を含む、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のリポソーム。
23. 前記歪んだシクロオクチンが、アザ−ジベンゾシクロオクチン（ＡＤＩＢＯ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、（ＯＣＴ）、アリールレスオクチン（ＡＬＯ）、モノフッ素化シクロオクチン（ＭＯＦＯ）、ジフッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）、又はジメトキシアザシクロオクチン（ＤＩＭＡＣ）部分を含む、請求項１又は３〜２２のいずれか一項に記載のリポソーム。
24. 前記リゾリン脂質へのコンジュゲーション前の前記歪んだシクロオクチンが、ジベンゾシクロオクチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＡＤＩＢＯ−ＮＨＳ）、ジベンゾシクロオクチン−Ｃ６−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−ＰＥＧ（４、５、１３又はｎ）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−Ｓ−Ｓ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−マレイミド、ジベンゾシクロオクチン−ＰＥＧ（４、５、１３又はｎ）−マレイミド、及び（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチルＮ−スクシンイミジルカーボネートからなる群から選択される、請求項１又は３〜２２のいずれか一項に記載のリポソーム。
25. 前記標的部分が、葉酸、ＲＧＤペプチド、天然タンパク質リガンド、アフィボディ、抗体、抗体断片、及びエンジニアリングされた抗体ベースのタンパク質からなる群から選択される、請求項２〜２２のいずれか一項に記載のリポソーム。
26. 前記標的部分が抗体である、請求項２〜２２のいずれか一項に記載のリポソーム。
27. 前記標的部分が、銅フリーのクリック化学を用いて前記第１の誘導体化リン脂質にコンジュゲートされている、請求項２〜２２又は２５のいずれか一項に記載のリポソーム。
28. 前記標的部分が、前記第１のリン脂質にコンジュゲートする前にアジド部分を含む、請求項２〜２２、２５又は２６のいずれか一項に記載のリポソーム。
29. 前記第１の誘導体化リン脂質が、前記第１のリン脂質と、歪んだシクロオクチン及びアジドを含む前記標的部分の反応産物とを含む、請求項２８に記載のリポソーム。
30. 前記歪んだシクロオクチンが、アザ−ジベンゾシクロオクチン（ＡＤＩＢＯ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、（ＯＣＴ）、アリールレスオクチン（ＡＬＯ）、モノフッ素化シクロオクチン（ＭＯＦＯ）、ジフッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）、又はジメトキシアザシクロオクチン（ＤＩＭＡＣ）部分を含む、請求項２９に記載のリポソーム。
31. 前記リン脂質へのコンジュゲーション前の前記歪んだシクロオクチンが、ジベンゾシクロオクチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＡＤＩＢＯ）、ジベンゾシクロオクチン−Ｃ６−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−ＰＥＧ（４、５、１３又はｎ）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−Ｓ−Ｓ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−マレイミド、ジベンゾシクロオクチン−ＰＥＧ（４、５、１３又はｎ）−マレイミド、及び（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチルＮ−スクシンイミジルカーボネートからなる群から選択される、請求項３０に記載のリポソーム。
32. 前記第２のリン脂質が、水素化大豆ホスホチジルコリン（ＨＳＰＣ）；１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＤＰＣ）；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＥＰＡ）；１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）；１，２−ジエライドイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＥＰＧ）；１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＯＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＬＰＡ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＬＰＳ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＭＰＡ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＭＰＳ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＯＰＡ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＯＰＳ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＰＰＡ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＰＰＳ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＳＰＡ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＳＰＳ）；１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ ３−ホスホコリン（ＭＰＰＣ）；１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＳＰＣ）；１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＭＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）；１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ）；１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＰＣ）；及び１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＯＰＣ）；１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＰＰＣ）；並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のリポソーム。
33. 前記第２のリン脂質が１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である、請求項３２に記載のリポソーム。
34. 前記第２の誘導体化リン脂質中の前記ポリエチレングリコールポリマーが約３５０ｇ／モル〜約３０，０００ｇ／モルの分子量を有する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のリポソーム。
35. 前記ポリエチレングリコールポリマーが、３５０ｇ／モル、５５０ｇ／モル、７５０ｇ／モル、１０００ｇ／モル、２０００ｇ／モル、３０００ｇ／モル、５０００ｇ／モル、１０，０００ｇ／モル、２０，０００ｇ／モル、及び３０，０００ｇ／モルからなる群から選択される分子量を有する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のリポソーム。
36. 前記ポリエチレングリコールポリマーが約２０００ｇ／モルの分子量を有する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のリポソーム。
37. 前記ポリエチレングリコールポリマーが、アルコキシル、カルボキシル、アミン、ビオチン、マレイミド、スクシニル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、シラン、ピリジルジチオール、又はシアノ部分で終端されている、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のリポソーム。
38. 前記第２の誘導体化リン脂質がＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ_２０００、又はこれらの組み合わせである、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のリポソーム。
39. 前記第２の誘導体化リン脂質が前記リポソーム中に約０．５モルパーセント〜約５モルパーセントの量で存在する、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のリポソーム。
40. 前記コンジュゲートの前記第２の誘導体化リン脂質に対するモル比が約１：１０である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のリポソーム。
41. 前記第２の誘導体化リン脂質が前記リポソーム中の前記コンジュゲートの量よりも約８倍〜約１０倍多い量で存在する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のリポソーム。
42. 前記リポソームがアニオン性脂質を含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリポソーム。
43. 前記アニオン性脂質がアニオン性リン脂質である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のリポソーム。
44. 前記アニオン性リン脂質が、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）；ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＭＰＧ）；ホスファチジルセリン（ＰＳ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）；及びリン酸ジセチル（ＤＣＰ）からなる群から選択される、請求項４３に記載のリポソーム。
45. 前記アニオン性脂質が前記リポソーム中に約５モルパーセント〜約１０モルパーセントの量で存在する、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のリポソーム。
46. 前記アニオン性脂質が前記リポソーム中に約７モルパーセント〜約９モルパーセントの量で存在する、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のリポソーム。
47. カチオン性脂質を含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリポソーム。
48. 前記カチオン性脂質がカチオン性リン脂質である、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリポソーム。
49. 前記カチオン性リン脂質が１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）である、請求項４８に記載のリポソーム。
50. 前記カチオン性脂質が前記リポソーム中に約５モルパーセント〜約１０モルパーセントの量で存在する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリポソーム。
51. 前記カチオン性脂質が前記リポソーム中に約７モルパーセント〜約９モルパーセントの量で存在する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリポソーム。
52. １つ以上の化学療法化合物；１つ以上のポリマーナノ粒子；１つ以上のタンパク質ベースのナノ粒子；１つ以上のデンドリマー構造；１つ以上のキトサンナノ粒子；１つ以上のポリグリカン構造；１つ以上の無機ナノ粒子；１つ以上のイメージング剤；１つ以上のキナーゼ阻害剤；１つ以上の生物製剤；及びこれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるカーゴを更に含む、請求項１又は２に記載のリポソーム。
53. 前記キナーゼ阻害剤が受容体チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項５２に記載のリポソーム。
54. 前記１つ以上の化学療法化合物の１つ以上が前記光増感剤との相乗作用を示す、請求項５３に記載のリポソーム。
55. １つ以上のリン脂質、スフィンゴ脂質、生物活性脂質、天然脂質、コレステロール、ステロール、又はこれらの組み合わせを更に含む、請求項１又は２に記載のリポソーム。
56. 前記１つ以上のリン脂質が、ホスファチジルコリン；ホスファチジン酸；ホスファチジルエタノールアミメ；ホスファチジルグリセロール；及びホスファチジルセリンからなる群から選択される、請求項５５に記載のリポソーム。
57. 前記１つ以上のリン脂質が、水素化大豆ホスホチジルコリン（ＨＳＰＣ）；１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＤＰＣ）；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＥＰＡ）；１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）；１，２−ジエライドイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＥＰＧ）；１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＯＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＬＰＡ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＬＰＳ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＭＰＡ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＭＰＳ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＯＰＡ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＯＰＳ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＰＰＡ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＰＰＳ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＳＰＡ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＳＰＳ）；１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ ３−ホスホコリン（ＭＰＰＣ）；１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＳＰＣ）；１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＭＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）；１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ）；１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＰＣ）；及び１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＯＰＣ）；１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＰＰＣ）；並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５５又は５６に記載のリポソーム。
58. 前記１つ以上のリン脂質の少なくとも１つが１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）である、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載のリポソーム。
59. 前記１つ以上のリン脂質が前記リポソーム中に約４０モルパーセント〜約８０モルパーセントで存在する、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載のリポソーム。
60. 前記１つ以上のリン脂質が前記リポソーム中に約５０モルパーセント〜約７０モルパーセントで存在する、請求項５５〜５９のいずれか一項に記載のリポソーム。
61. 前記１つ以上のリン脂質が前記リポソーム中に約５５モルパーセント〜約６５モルパーセントで存在する、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載のリポソーム。
62. 前記コレステロールが前記リポソーム中に約１５モルパーセント〜約４５モルパーセントで存在する、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載のリポソーム。
63. 前記コレステロールが前記リポソーム中に約２０モルパーセント〜約３０モルパーセントで存在する、請求項５５〜６２のいずれか一項に記載のリポソーム。
64. フルオロフォア、造影剤、又はこれらの組み合わせを更に含む、請求項１〜６３のいずれか一項に記載のリポソーム。
65. 請求項１〜６３のいずれか一項に記載のリポソーム及び薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物。
66. 患者の癌を処置する方法であって、
    （ａ）治療有効量の、請求項２〜２２又は２５〜６３のいずれか一項に記載のリポソームを前記患者に投与するステップ；及び
    （ｂ）前記患者に放射線を照射して前記リポソームを破壊するステップ
    を含む方法。
67. 患者の癌を画像化する方法であって、
    （ａ）治療有効量の、請求項１〜６３のいずれか一項に記載のリポソームを前記患者に投与するステップ；
    （ｂ）前記患者に放射線を照射して前記リポソームを破壊するステップ；及び
    （ｃ）前記患者を画像化するステップ
    を含む方法。