JP2018118978A - 改善されたフィブロネクチンベースの結合分子およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

【課題】高い親和性および特異性で所望の標的に特異的に結合できるモノクローナル抗体代替結合分子の提供。【解決手段】第一の非Ｆｎ３結合配列および第二の非Ｆｎ３結合配列を含む二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子であって、前記第一の非Ｆｎ３結合配列は、該第一の非Ｆｎ３結合配列の底部ＡＢループ領域、ＣＤループ領域もしくはＥＦループ領域またはＣ末端の１個以上において、野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改変された少なくとも１個のアミノ酸を有し、かつ前記第一の非Ｆｎ３結合配列は、第一の標的に結合し、および前記第二の非Ｆｎ３結合配列は、該Ｆｎ３ドメインの上部ＢＣループ領域、ＤＥループ領域もしくはＦＧループ領域の１個以上において、野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改変された少なくとも１個のアミノ酸を有し、かつ前記第二の非Ｆｎ３結合配列は、前記第一の標的と異なる分子に存在する第二の標的に結合する、結合分子。【選択図】なし

Description

優先権情報
本願は、２００８年５月２日に出願した米国仮出願第61/050,142号の優先権を主張し、
その内容をそれらの全体において、参照により本明細書に組み込む。
関連情報
本明細書を通じて言及されているあらゆる特許、特許出願および文献の内容は、それら
の全体において、参照により本明細書の一部とする。

発明の背景
所望の標的エピトープと特異的に結合することができる分子は、治療および医学的診断
ツールとして極めて重要である。このクラスの分子の周知の例は、モノクローナル抗体で
ある。ほぼあらゆる構造エピトープと特異的に、そして高い親和性で結合する抗体が、選
択され得る。その結果、抗体は研究ツールおよびＦＤＡ承認治療薬として日常的に使用さ
れており、治療用および診断用モノクローナル抗体の世界市場は現在約３０，０００，０
００，０００ドルにも上る。

しかし、モノクローナル抗体は、多数の欠点を有する。例えば、標準的な抗体は大きく
、複雑な分子である。それらは２本の軽鎖と２本の重鎖を含み、鎖内および鎖間ジスルフ
ィド結合によって結合した、異種四量体構造を有する。この構造的複雑さによって、単純
な原核細胞系における抗体の容易な発現が妨げられており、より複雑な（そしてより高価
な）哺乳類細胞系での抗体の産生が必要である。抗体のサイズが大きいことによっても、
しばしば効果的に特定の組織空間に侵入することができないため、それらの治療上有効性
が限定される。治療用抗体は、Ｆｃ領域を有するため、望ましくないエフェクター細胞機
能および／または凝固カスケードを惹起することがある。さらに、二重特異性または多重
特異性抗体の作成は、しばしば困難かつ複雑な方法を含む（例えば、Josefina et al., (
1997), Nature Biotechnology, 15: 159-163; および Wu et al. (2007) Nature Biotech
nology, 25: 1290-1297参照）。

したがって、当該技術分野において、高い親和性および特異性で所望の標的に特異的に
結合することができる代替結合分子が求められている。また、二重特異性または多重特異
性結合分子を作成するための単純な方法も必要とされている。

発明の概要
本発明は、標的抗原に特異的に結合し、したがって広範な治療および診断適用に用いる
ことができる、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子を提供する。
本発明は、少なくとも１個の修飾底部ループを含むＦｎ３が構造的および立体構造的安定
性を保持しており、標的分子に結合できるという予期せぬ驚くべき発見に基づく。さらに
また、本発明は、Ｆｎ３の上部および底部ループの両方を用いることによって、１個のＦ
ｎ３分子が１種以上の標的分子に結合できる、新たな二重特異性なＦｎ３ベースの結合分
子の発見に基づく。本発明はまた、二重特異性および多重特異性なＦｎ３ベースの結合分
子を作成する単純な、効果的な方法も提供する。

したがって一つの態様において、本発明は、１種以上の標的、例えばヒト血清アルブミ
ン（ＨＳＡ）、リゾチームに結合するために底部ＡＢ、ＣＤ、ＥＦループまたはＣ末端を
用いる、単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子（底部単一特異性なＦｎ３ベースの結合分
子）に関する。これらの底部単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子を（例えば数珠状に）
一体に連結して、複数の標的に同時に結合する多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子を形
成することができ、そして／または１個以上の非Ｆｎ３部分（例えば機能的部分）と複合
化することができ、そして／または例えばＦｎ３ベースの結合分子の半減期および安定性
を改善するために、１個以上の非Ｆｎ３部分（例えば機能的部分）、例えばヒト血清アル
ブミン（ＨＳＡ）、抗体Ｆｃ領域またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合化する
ことができる。

別の態様において、底部単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、二重特異性なＦｎ３
ベースの結合分子を作成するために上部ＢＣ、ＤＥまたはＦＧループを用いるＦｎ３ベー
スの結合分子と組み合わせてもよい。本発明はさらに、二種以上の標的と同時に結合する
二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子を提供する。これらの二重特異性Ｆｎ３ベースの結
合分子はまた、一体に（例えば数珠状に）連結して、複数の標的に同時に結合する多重特
異性なＦｎ３ベースの結合分子を形成することができ、そして／または上記のとおり１個
以上の非Ｆｎ３部分（例えば機能的部分）と複合化することができる。本発明はさらに、
標的、典型的には標的タンパク質に特異的に結合するかについて、Ｆｎ３ベースの結合分
子のライブラリーをスクリーニングする方法、ならびに例えば原核細胞または真核細胞系
においてＦｎ３ベースの結合分子を作成する方法を提供する。さらに、本発明は、Ｆｎ３
ベースの結合分子を含む組成物（例えば治療用組成物）、ならびに多様な治療および診断
適用におけるかかる組成物の使用を提供する。

したがって一つの局面において、本発明は、Ｆｎ３ベースの結合分子であって、Ｆｎ３
ドメインを含んでなり、ここで該Ｆｎ３ドメインの底部ＡＢ、ＣＤもしくはＥＦループ領
域またはＣ末端の１個以上における少なくとも１個のアミノ酸が野生型Ｆｎ３ドメイン（
例えば配列番号１）と比較して改変されて、特定の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列が作
成されている、結合分子に関する。具体的な態様において、ＡＢ、ＣＤもしくはＥＦルー
プ領域またはＣ末端において変化されているアミノ酸残基は、配列番号１の15、16、38、
39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95または96番アミノ酸の１個以
上を含む。非Ｆｎ３結合配列は、例えばＣＤＲ領域（例えば抗体ＣＤＲ領域）またはＴ細
胞受容体の全部または一部であってよい。

別の局面において、本発明は、Ｆｎ３ベースの結合分子であって、第一のＦｎ３ドメイ
ンを含んでなり、ここで該Ｆｎ３ドメインの底部ＡＢ、ＣＤもしくはＥＦループ領域また
はＣ末端の１個以上における少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１を含む野生型Ｆｎ
３ドメインと比較して改変されて、第一の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列が作成されて
おり、そして第二のＦｎ３ドメインの底部ＡＢ、ＣＤもしくはＥＦループ領域またはＣ末
端の１個以上における少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ドメ
インと比較して改変されて、第二の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列が作成されている、
結合分子に関する。

別の局面において、本発明は、二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子であって、Ｆｎ３
ドメインを含んでなり、ここで該Ｆｎ３ドメインの底部ＡＢ、ＣＤ、ＥＦループ領域また
はＣ末端の１個以上における少なくとも１個のアミノ酸が野生型Ｆｎ３ドメイン（例えば
配列番号１）と比較して改変されて、第一の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列が作成され
ており、そしてＦｎ３ドメインの上部ＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ領域の１個以上におけ
る少なくとも１個のアミノ酸が野生型Ｆｎ３ドメイン（例えば配列番号１）と比較して改
変されて、第二の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列が作成されている、結合分子を提供す
る。具体的な態様において、底部ＡＢ、ＣＤ、ＥＦループ領域またはＣ末端における変化
されたアミノ酸残基は、配列番号１の15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61
、62、63、64、93、95または96番アミノ酸の１個以上を含み、上部ＢＣ、ＤＥまたはＦＧ
ループ領域における変化されたアミノ酸残基は、配列番号１の21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、51、52、53、54、55、56、76、77、78、79、80、80、81、82、83、84、
85、86、87または88番アミノ酸の１個以上を含む。したがって、かかる本発明の二重特異
性なＦｎ３ベースの結合分子は、同じ分子または異なる分子の２個以上の標的に同時に結
合する。

別の局面において、本発明は、多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子であって、上記の
いずれかのＦｎ３ベースの結合分子の２個以上を含み、それらが同じ分子または異なる分
子の２個以上の標的に結合するように一体に連結されている（例えば数珠状に）結合分子
を提供する。

本発明の「Ｆｎ３ベースの結合分子」（以後、これは二重特異性および多重特異性なＦ
ｎ３ベースの結合分子を含む）はまた、例えばインビボで投与したとき該Ｆｎ３ベースの
結合分子の半減期を延長する１個以上の非Ｆｎ３部分に結合するか、またはそれと連結し
ていてもよい。好適な非Ｆｎ３部分は、抗体Ｆｃ領域、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（
またはその一部）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／または上記タンパク質も
しくは半減期の延長を伴う他の血清タンパク質、例えばトランスフェリンに結合するポリ
ペプチドを含むが、これらに限定されない。したがって、別の局面において、本発明は、
非Ｆｎ３部分と連結した１個以上のＦｎ３ベースの結合分子を含む複合体を提供する。

さらに別の態様において、本発明のＦｎ３ベースの結合分子および複合体はさらに、機
能的部分を付加するための、野生型Ｆｎ３ドメイン（例えば配列番号１）と比較して修飾
されたアミノ酸を少なくとも１個含んでいる。一つの態様において、該修飾されたアミノ
酸は、ループ領域、ベータストランド領域、ベータ様ストランド領域、Ｃ末端領域、Ｃ末
端と最もＣ末端側のベータストランド（またはベータ様ストランド）間の領域、Ｎ末端領
域およびＮ末端と最もＮ末端側のベータストランド（またはベータ様ストランド）間の領
域から選択される１個以上の領域における、システインまたは非天然アミノ酸残基の置換
または付加を含む。

本発明のＦｎ３ベースの結合分子は、野生型Ｆｎ３配列（例えば配列番号１のアミノ酸
配列を有するヒトＦｎ３）および本明細書に記載のとおりかかる野生型配列の修飾型に基
づいていてよい。例えば、Ｆｎ３ベースの結合分子は、少なくとも２個の異なるフィブロ
ネクチンモジュールに由来するＦｎ３ベータストランドを有するキメラであってよい。

また本発明は、本発明のＦｎ３ベースの結合分子または複合体を含み、好適な担体で製
剤された組成物を提供する。

本発明のＦｎ３ベースの結合分子および複合体は、多様な治療および診断適用、例えば
抗体を使用することができる適用を含むがこれに限定されない適用に使用できる。かかる
適用は、例えば自己免疫疾患、がんおよび感染症の処置および診断を含む。

Ｆｎ３ベースの結合分子をコードするまだら状核酸ライブラリーのような本発明の他の
特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなる。

強調を付したリガンド結合表面を構成するループおよびフレームワーク残基を有するＦｎ３ベースの結合分子のリボン図を示す。 Ｆｎ３の上部および底部ループ表面を示す模式図を図示する。 図３ａは上部または底部ループのいずれかを修飾して１個の標的、標的Ａに結合できることを示す、単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子の模式図である。図３ｂは上部および底部ループの両方を修飾して１個の標的、標的Ａに結合できることを示す、二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子の模式図である。二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は２個の異なる標的に結合させるために用いてもよく、その場合は上部ループが１個の標的、標的Ａに結合し、底部ループが第二の標的、標的Ｂに結合する。 底部ループに修飾を有する２個の底部単一特異性なＦｎ３ドメインを含み、これらが一体に連結されている多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子の模式図である。 上部および底部ループに修飾を有する２個の二重特異性なＦｎ３ドメインを含み、これらが一体に連結されている多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子の模式図である。 底部ループに修飾を有する複数の単一特異性なＦｎ３ドメインを含み、これらが一体に連結されている多重特異性なＦｎ３ベースの模式図である。 上部および底部ループに修飾を有する複数の二重特異性なＦｎ３ドメインを含み、これらが一体に連結されている多重特異性なＦｎ３ベースの模式図である。 フィブロネクチンｃＤＮＡをクローニングするために用いるベクターの図である。 底部ループまたはＣ末端を用いてヒト血清アルブミンに結合する、選択した数の単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子のアミノ酸配列を示す表である。 底部ループまたはＣ末端を用いてリゾチームに結合する、選択した数の単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子のアミノ酸配列を示す表である。 底部ループまたはＣ末端を用いてリゾチームに結合する、選択した数の単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子のアミノ酸配列を示す表である。 底部ループまたはＣ末端を用いて特異的標的としてヒト血清アルブミンに結合するヒスチジンタグ化単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子の、ヒト血清アルブミン特異的ＥＬＩＳＡ分析を示すグラフである。 底部ループまたはＣ末端を用いて特異的標的に結合する単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子の、大腸菌における発現の成功を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。 底部ループまたはＣ末端を用いて特異的標的に結合する単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子の、大腸菌溶解物からの精製の成功を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。 底部ループまたはＣ末端を用いて特異的標的に結合する二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子の、大腸菌溶解物からの精製の成功を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。 底部ループまたはＣ末端と、上部ループの両方を用いて異なる標的分子に結合する二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子のＥＬＩＳＡ分析を示すグラフである。クローン８７およびクローン８９から単離した二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、ＶＥＧＦＲ２に結合する上部ループと、ヒト血清アルブミンに結合する底部ループを有する。このデータは、１個のＦｎ３ベースの結合分子を操作して上部ループがＶＥＧＦＲ２に結合し、底部ループがＨＳＡに結合するようにできることを示している。 上部ループを用いてＶＥＧＦＲ２に結合する、クローン８７から単離した二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子の、Biacore結合試験を示すグラフである。 底部ループを用いてＨＳＡに結合する、クローン８７から単離した二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子の、Biacore結合試験を示すグラフである。

発明の詳細な説明
本明細書および特許請求の範囲の理解を明確にするため、次の定義が簡便には提供され
る。

定義
本明細書において使用するとき、用語「フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン」また
は「Ｆｎ３ドメイン」は、いずれかの生物由来の野生型Ｆｎ３ドメインならびに２個以上
の異なるＦｎ３ドメイン由来のベータストランドから構築したキメラＦｎ３ドメインを意
味する。当該技術分野において知られているとおり、天然に生じるＦｎ３ドメインはＡＢ
、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループと称される６個のループで連結された、Ａ、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧと称される７個のベータストランドから成るベータサンドイ
ッチ構造を有する（例えば、Bork and Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 89:89
90, 1992; Bork et al, Nature Biotech. 15:553, 1997; Meinke et al., J. Bacteriol.
175:1910, 1993; Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265:15659, 1990; Main et al, 19
92; Leahy et al., 1992; Dickinson et al., 1994; 米国特許第6,673,901号; ＰＣＴ公
報WO/03104418;および米国特許出願第2007/0082365号参照、これらの全教示を参照により
本明細書の一部とする）。３個のループはドメインの上部に存在し（ＢＣ、ＤＥおよびＦ
Ｇループ）、３個のループはドメインの底部に存在する（ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループ）
（図１参照）。本発明の特定の態様において、該Ｆｎ３ドメインはヒトフィブロネクチン
の第１０Ｆｎ３ドメイン（^１０Ｆｎ３）に由来する（配列番号１）。

本明細書において使用するとき、用語「Ｆｎ３ベースの結合分子」または「フィブロネ
クチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子」は、１個以上の非Ｆｎ３結合配列を含
むように改変されているＦｎ３ドメインを意味する。具体的な態様において、１個以上の
底部ＡＢ、ＣＤおよび／またはＥＦループが、対応する野生型Ｆｎ３ドメインと比較して
改変されて、１個以上の非Ｆｎ３結合配列を含む。別の態様において、１個以上の底部Ａ
Ｂ、ＣＤまたはＥＦループと、１個以上の上部ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが、対応する
野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改変されて、１個以上の非Ｆｎ３結合配列を含む。かか
る分子は「二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子」と本明細書において称される。さらな
る態様において、２個以上のＦｎ３ベースの結合分子または二重特異性なＦｎ３ベースの
結合分子が一体に連結されている。かかる分子は、「多重特異性なＦｎ３ベースの結合分
子」と本明細書において称される。

用語「非Ｆｎ３結合配列」は、天然に生じる（例えば野生型）Ｆｎ３ドメイン中には存
在せず、特定の標的に結合するアミノ酸配列を意味する。かかる非Ｆｎ３結合配列は典型
的には、野生型Ｆｎ３ドメインを修飾して（例えば置換および／または付加によって）導
入される。これは例えば、野生型Ｆｎ３ドメイン内のアミノ酸残基のランダムまたは所定
の変異によって得ることができる。さらにまたはあるいは、非Ｆｎ３結合配列は、部分的
または完全に異種であってよく、すなわち異なる遺伝子源またはアミノ酸源に由来してよ
い。例えば、異種配列は、抗体の超可変領域、例えば既知の標的抗原に対して既知の結合
特異性を有する１個以上のＣＤＲ領域に由来していてよい。かかるＣＤＲは一本の抗体鎖
（例えば軽鎖または重鎖の可変領域）または異なる抗体鎖の組合せに由来していてよい。
ＣＤＲはまた、２種の異なる抗体（例えば異なる特異性を有する）に由来していてもよい
。特定の態様において、ＣＤＲはナノ抗体、例えばラクダ様重鎖に由来している。

本明細書において使用するとき、用語「単一特異性」は、Ｆｎ３ドメインの底部領域ま
たはＦｎ３ドメインの上部領域のみ（両方ではない）が結合に使用されるＦｎ３ドメイン
を含む、１個以上の標的分子に結合するＦｎ３ベースの結合分子を意味する。例えば、底
部単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、Ｆｎ３ドメインのＡＢ、ＣＤもしくはＥＦル
ープのような底部ループまたはＣ末端のみを用いて標的に結合するが、上部単一特異性な
Ｆｎ３ベースの結合分子は、Ｆｎ３ドメインのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのような上部
ループのみを用いて標的に結合するものである。上部または底部の３個のループの全てが
標的分子との結合に使用される必要がないことが理解される。

単一特異性Ｆｎ３ドメインは一体に（例えば数珠状に）連結されて、例えば少なくとも
２個の単一特異性なＦｎ３ドメインを含み、これらが一体に連結されている多重特異性な
Ｆｎ３ベースの結合分子を形成してもよい。底部単一特異性な結合分子について、各Ｆｎ
３ドメインは少なくとも１個の底部ループまたはＣ末端領域を用いて１個以上の標的分子
に結合する。一つの態様において、この多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、同じ標
的分子（例えば標的Ａ）の異なる標的領域に結合する。例えば、１個のＦｎ３ドメインが
標的Ａの第一の標的領域に結合し、別のＦｎ３ドメインが標的Ａの第二の標的領域に結合
できる。これを用いて、標的分子に対するＦｎ３ベースの結合分子の結合活性を上昇させ
ることができる。別の態様において、多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は複数の標的
分子に結合する。例えば、１個のＦｎ３ドメインが標的Ａに結合して、別のＦｎ３ドメイ
ンが標的Ｂ（例えば半減期エクステンダー）に結合できる。さらに別の態様において、多
重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、標的Ａの異なる標的領域に結合する少なくとも２
個の単一特異性なＦｎ３ドメインと、標的Ｂの異なる標的領域に結合する少なくとも２個
の単一特異性なＦｎ３ドメインを含む。当業者は、任意の数のＦｎ３ドメインをこの方法
で連結して、同じ標的分子または異なる標的分子の異なる標的領域に結合できる多重特異
性なＦｎ３ベースの結合分子を作成できると理解する。

本明細書において使用するとき、用語「二重特異性」は、Ｆｎ３ドメインの底部領域と
Ｆｎ３ドメインの上部領域の両方を用いて１個以上の標的に結合するＦｎ３ベースの結合
分子を意味する。例えば、二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、該分子のＡＢ、ＣＤ
もしくはＥＦループのような底部ループまたはＣ末端と該分子のＢＣ、ＤＥもしくはＦＧ
ループのような上部ループの両方を用いて標的に結合するＦｎ３ドメインを含んでなる。
二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子を用いて、該二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子
の上部および底部の両方に結合できる同一の標的分子、例えば標的Ａに結合させることが
できる（図３ｂ参照）。あるいは、二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子を用いて、２種
の異なる標的分子、例えば標的Ａと標的Ｂに結合させてもよい。この場合は、上部ループ
を用いて標的Ａに結合させ、底部ループを用いて標的Ｂに結合させるか、あるいは上部ル
ープを用いて標的Ｂに結合させ、底部ループを用いて標的Ａに結合させることができる（
図３ｂ参照）。二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子を一体に（例えば数珠状に）連結さ
せて、多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子を形成させてもよい。

本明細書において使用するとき、用語「多重特異性」は、一体に連結した少なくとも２
個の単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子または一体に連結した少なくとも２個の二重特
異性なＦｎ３ベースの結合分子を含んでなるＦｎ３ベースの結合分子を意味する。

用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗体可変ドメインまたはＴ細胞受容体由来の超
可変ループを意味する。抗体可変領域内のＣＤＲの位置は、正確に定義されている（Kaba
t, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,
U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991
およびChothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987参照、これらを参照によ
り本明細書の一部とする）。用語「シングルドメイン抗体」は、例えばDomantis（Domant
is / GSK (Cambridge, UK)）に記載のヒトドメイン抗体または下記定義のラクダナノ抗体
を含む、いずれかの天然に生じる一可変ドメイン抗体または対応する操作された結合フラ
グメントを意味する。

用語「一本鎖抗体」は、軽鎖可変領域の抗原結合部分と重鎖可変部分の抗原結合部分と
が、例えば組換え方法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が対となって１価の分子を形成する
一本のタンパク質鎖に該鎖をさせることができる合成リンカーによって結合している抗体
を意味する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えばBird et al. (1988) S
cience 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 85:58
79-5883参照）。

用語「ラクダナノ抗体」は、軽鎖を含まない小さな１個の可変ドメインであり、標的に
対して高い親和性を有する低分子タンパク質を得て、低分子量抗体由来タンパク質を得る
ために遺伝子操作して得ることができるラクダ抗体の領域を意味する。例えば、WO070422
89および１９９８年６月２日取得の米国特許第5,759,808号参照；また、例えばStijleman
s, B. et al., 2004, J Biol Chem. 279(2): 1256-61も参照されたい。ラクダ抗体および
抗体フラグメントの操作ライブラリーは、例えばAblynx、Ghent、Belgiumから商業的に入
手可能である。非ヒト起源の他の抗体に関して、ラクダ抗体のアミノ酸配列を組換えによ
って変化させて、ヒト配列により近い配列を得ることができ、すなわちナノ抗体は「ヒト
化」してもよい。これは、ヒトに対するそもそも低いラクダ抗体の抗原性をさらに低下さ
せる。

用語「標的」は、本発明のＦｎ３ベースの結合分子が認識する抗原またはエピトープを
意味する。標的は、タンパク質に存在するエピトープ、ペプチド、糖および／または脂質
を含むが、これらに限定されない。

用語「複合体」は、１個以上の非Ｆｎ３部分と化学的または遺伝的に結合したＦｎ３ベ
ースの結合分子を意味する。

用語「非Ｆｎ３部分」は、それが結合している分子にさらなる機能性を与える生物学的
または化学的要素を意味する。特定の態様において、非Ｆｎ３部分はポリペプチド、例え
ばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＦｎ３ベースの結合分子のインビボでの半減期を
延長する化学的要素、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

用語「非天然アミノ酸残基」は、天然に生じる（野生型）Ｆｎ３ドメインには存在しな
いアミノ酸残基を意味する。かかる非天然アミノ酸残基は、天然に生じるアミノ酸の置換
および／または天然に生じるアミノ酸Ｆｎ３配列への非天然アミノ酸の挿入によって導入
することができる。非天然アミノ酸残基は、Ｆｎ３ベースの結合分子に所望の機能性、例
えば機能的部分（例えばＰＥＧ）と結合する能力を付与するように、導入してもよい。

用語「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、カップリング剤を含むかまたは
含まない、あるいはカップリングまたは活性化部分で誘導体化されたかあるいはされてい
ない、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を意味する。

用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、表面プラズモン共鳴によって測定
したとき、室温で標準的な生理的塩およびｐＨ条件下で、標的と少なくとも１×１０^−６
Ｍの親和性で結合し、そして／または非特異的抗原についての親和性よりも少なくとも２
倍（好ましくは少なくとも１０倍）の親和性で標的と結合する、Ｆｎ３ベースの結合分子
の能力を意味する。

概略
本発明は、標的抗原と特異的に結合するフィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベー
スの結合分子を提供する。本発明は、１個以上の標的分子に結合する底部ＡＢ、ＣＤ、Ｅ
Ｆループ領域またはＣ末端の少なくとも１個以上の修飾を有する、単一特異性なＦｎ３結
合分子を提供する。本発明はさらに、２個の異なる結合節を有する同じ標的分子または２
種以上の標的抗原に同時に結合する、二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子を提供する。
本発明のＦｎ３ベースの結合分子はまた、一体に（例えば数珠状に）連結して、多重特異
性なＦｎ３ベースの結合分子を形成するか、そして／または半減期および安定性を改善す
るためにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような非Ｆｎ３部分と複合化されていてよい。
Ｆｎ３ベースの結合分子は、抗体のような他の結合分子と同様に、多様な治療および診断
適用に用いることができる。

単一特異性なＦｎ３結合分子
一つの局面において、本発明は、野生型Ｆｎ３ドメインと比較して（例えば底部および
／または上部ループ領域において）改変されて、特定の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列
が作成されている単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子を提供する。一つの態様において
、単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子はＡＢ、ＣＤ、ＥＦループまたはＣ末端を用いて
１個以上の標的分子に結合する。

したがって一つの態様において、本発明は、Ｆｎ３ベースの結合分子であって、Ｆｎ３
ドメインを含んでなり、ここで該Ｆｎ３ドメインの底部ＡＢ、ＣＤもしくはＥＦループ領
域またはＣ末端の１個以上における少なくとも１個のアミノ酸が野生型Ｆｎ３ドメインと
比較して改変されて、特定の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列が作成されている結合分子
を提供する。特定の態様において、野生型Ｆｎ３ドメインはヒトＦｎ３ドメイン、例えば
ヒト^１０Ｆｎ３（配列番号１）である。さらに、ループ領域に隣接する１個以上のベータ
ストランドにおける１個以上のアミノ酸残基も、野生型Ｆｎ３ドメインと比較して変異さ
れて、非Ｆｎ３部分に結合できるさらなる非Ｆｎ３結合配列または残基をもたらしてもよ
い。改変してよい底部ＡＢ、ＣＤ、ＥＦループ領域またはＣ末端および隣接ベータストラ
ンドにおける具体的なアミノ酸残基は、例えば配列番号１の15、16、38、39、40、41、42
、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95または96番アミノ酸を含む。

例示的な非Ｆｎ３結合配列は、例えば抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはＴ細胞受
容体の全部または一部を含む。

別の局面において、本発明は、具体的な所望の標的に結合するＦｎ３ベースの結合分子
を同定するために使用できる、Ｆｎ３ベースの結合分子のライブラリーを提供する。一つ
の態様において、該ライブラリーは、野生型Ｆｎ３ドメイン、例えばヒト^１０Ｆｎ３（配
列番号１）と比較して底部ＡＢ、ＣＤ、ＥＦループ領域またはＣ末端の１個以上に少なく
とも１個のアミノ酸改変を各々含む、複数のＦｎ３ベースの結合分子を含む。改変してよ
い底部ＡＢ、ＣＤ、ＥＦループ領域またはＣ末端およびベータストランドにおける具体的
なアミノ酸残基は、例えば配列番号１の15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、
61、62、63、64、93、95または96番アミノ酸を含む。

別の態様において、ライブラリーは、野生型Ｆｎ３ドメイン、例えばヒト^１０Ｆｎ３（
配列番号１）と比較して上部ＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ領域の１個以上に少なくとも１
個のアミノ酸改変を各々含む、複数のＦｎ３ベースの結合分子を含む。改変してよい上部
ＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ領域およびベータストランドにおける具体的なアミノ酸残基
は、例えば配列番号１の21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、51、52、53、54、55
、56、76、77、78、79、80、80、81、82、83、84、85、86、87または88番アミノ酸を含む
。

ライブラリーの多様性は、例えば配列番号１に開示された残基の１個以上の、ランダム
突然変異、「ウォークスルー（walk though）変異誘発」または「ルックスルー（look th
rough）変異誘発」によって作成できる（7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479;
5,922,545; 5,830,721; 5,605,793、5,830,650; 6,194,550; 6,699,658; 7,063,943; 5,
866,344 およびＰＣＴ公開公報WO06023144）。

あるいは、Ｆｎ３ベースの結合分子は、１個以上の異なるライブラリーメンバー由来の
非Ｆｎ３結合配列を組み合わせて作成してもよい。具体的な態様において、二重特異性な
Ｆｎ３ベースの結合分子は、１個のライブラリーメンバーの底部ＡＢ、ＣＤ、ＥＦループ
領域またはＣ末端の１個以上由来の非Ｆｎ３結合配列を、別のライブラリーメンバーの上
部ＢＣ、ＤＥまたはＦＧループの１個以上に由来する非Ｆｎ３結合配列と共に、１個の二
重特異性なＦｎ３ベースの結合分子に組み合わせることで作成される。

本明細書に記載のＦｎ３ベースの結合分子のライブラリーをコードする核酸またはその
変異体は、ＰＣＲを利用するかもしくは酵素仲介遺伝子操作、最初からのＤＮＡもしくは
ＲＮＡ合成、および／またはカセット変異誘発を含むがこれらに限定されない当業者に認
識されている方法を用いて構築できる。

Ｆｎ３ベースの結合分子の好適な標的は、半減期エクステンダ（例えばＨＳＡ）、リゾ
チーム、細胞受容体、細胞受容体リガンド、細菌またはウィルスを含むがこれらに限定さ
れない（図１参照）。具体的な態様において、標的は、ヒトの疾患、例えば自己免疫疾患
、がんまたは感染症に関与している。

本明細書はとりわけ、Ｆｎ３分子の底部ループを用いて標的、例えばＨＳＡに結合する
新規なＦｎ３ベースの結合分子の同定および作成について記載している。本発明の方法を
用いて数百種類のクローンを作成し、代表的な数個を実施例４に示すように特徴付けた。
図７はＨＳＡに結合するＦｎ３足場タンパク質のこのライブラリーから単離した代表数の
配列を示す（配列番号７〜４１）。

さらにまた、多くの独立的にランダム化したループがＨＳＡ結合に参加する可能性があ
るコンセンサス配列（配列番号４２）に集中する傾向があることを見出した。したがって
、このコンセンサス配列を有するポリペプチドが、それらが同定されたタンパク質の前後
関係から分離されたとしても、ＨＳＡ結合物質として有用であると期待される。

図８はリゾチームに結合するＦｎ３足場タンパク質のこのライブラリーから単離した代
表的な数の配列を示す（配列番号４３〜１１６）。実施例５のデータは、代表的な数個の
Ｆｎ３ベースの結合タンパク質のＨＳＡに対する結合試験を示す。この結果は、標的に結
合する能力を有するＦｎ３結合分子が修飾底部ループによって作成できることを示してい
る。

このデータは、少なくとも１個の底部ループが標的に結合するように修飾されているＦ
ｎ３ベースの結合分子のライブラリーを作成できることを示している。ＨＳＡライブラリ
ーについて、底部ループは野生型Ｆｎ３と同じ長さを保っていた。リゾチームライブラリ
ーについて、底部ループの長さは、タンパク質の構造に有害な影響を与えることなく、変
化した。さらに、これらの修飾された底部ループを有する単一特異性なＦｎ３ベースの結
合分子は、立体構造的安定性を維持し、結合能を維持しながら発現され、精製可能である
。したがって、本発明の方法を用いて、少なくとも１個の修飾された底部ループを有する
Ｆｎ３ベースの結合分子、ならびに底部表面を用いて標的に結合するＦｎ３ベースの結合
分子のライブラリーを作成することができる。

二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子
一部は上記のとおり、別の局面において、本発明は、２個以上の標的に同時に結合でき
る二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子を提供する。かかる二重特異性なＦｎ３ベースの
結合分子は、同じタンパク質ドメイン内に２個以上の非Ｆｎ３結合配列を含む。これは、
上部および底部ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦまたはＦＧループ領域の２個以上を改変し
て非Ｆｎ３結合配列を含めることによって得られる（図１参照）。特定の態様において、
二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、２個の別々の結合特異性を作成するために上部
と底部ループ領域の両方において改変されている。

したがって一つの態様において、本発明は、二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子であ
って、Ｆｎ３ドメインを含んでなり、ここで該Ｆｎ３ドメインの底部ＡＢ、ＣＤまたはＥ
Ｆループ領域の１個以上における少なくとも１個のアミノ酸が野生型Ｆｎ３ドメイン（例
えば配列番号１）と比較して改変されて、第一の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列を作成
されており、そして該Ｆｎ３ドメインの上部ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域の１個以上
における少なくとも１個のアミノ酸が野生型Ｆｎ３ドメイン（例えば配列番号１）と比較
して改変されて、第二の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列を作成されている結合分子を提
供する。改変してよい底部ＡＢ、ＣＤ、ＥＦループ領域またはＣ末端および隣接ベータス
トランドにおける具体的なアミノ酸残基は、例えば配列番号１の15、16、38、39、40、41
、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95または96番アミノ酸を含む。改変してよ
い上部ＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ領域および隣接ベータストランドにおける具体的なア
ミノ酸残基は、例えば配列番号１の21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、51、52、
53、54、55、56、76、77、78、79、80、80、81、82、83、84、85、86、87または88番アミ
ノ酸を含む。

本発明の二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、２個以上の標的に同時に結合する。
標的は同じ分子に存在していてよく、同じ標的分子の２個の領域が該標的と二重特異性な
Ｆｎ３ベースの結合分子の結合によって並列される。あるいは、標的は異なる分子に存在
していてよく、２個の異なる分子が該標的と二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子の結合
によって並列される。標的は同一であってもよく、抗体が分子を集合させることができる
のと同様に、二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子が標的分子を集合させることができる
。

好適な標的は、上記のものを単独で、あるいは半減期エクステンダー、例えばＨＳＡ、
抗体ＦｃレセプターまたはＰＥＧのような、二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子の物理
的特性を向上する分子に存在する標的と組み合わせて含む。好適な標的は、本明細書に記
載のとおり、さらなる機能的特性、例えば細胞傷害性、標識またはイメージング部分を与
える分子も含む。２個の二重特異性なＦｎ３ベースの結合ドメイン分子が標的に同時に結
合できるとき、好適な標的を用いて、二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子の二量体化を
誘導してもよい。例えば、２個の二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子がイディオタイプ
／抗イディオタイプな関係で働き得る。この場合、Ｆｎ３結合分子の１個の結合部位が標
的分子に結合するが、Ｆｎ３結合分子の第二の結合部位はＦｎ３結合分子の結合領域に結
合する。例えば、二重特異性なＦｎ３結合分子の底部ループが標的Ａに結合し得るが、該
二重特異性な分子の上部ループは第二の二重特異性なＦｎ３結合分子に結合し得る。これ
は、底部ループ標的結合部位が標的Ａとの結合に利用可能であり、上部ループ結合部位が
第二のＦｎ３結合分子との自己会合を導くように、Ｆｎ３結合分子の多量体化を導く。

本明細書はとりわけ、同じＦｎ３分子の底部ループと上部ループの両方を用いて２個の
異なる標的分子、例えばＨＳＡおよびＶＥＧＦＲ２に結合する、新規な二重特異性なＦｎ
３分子の同定および作成について記載する。本発明の方法を用いて数百個のクローンを作
成して、１個、特にクローン８９が実施例６および７においてより詳細に説明される。ク
ローン８９は、Ｆｎ３分子の底部ループがＨＳＡと結合し、同じＦｎ３分子の上部ループ
がＶＥＧＦＲ２に結合する二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子である（配列番号１２０
）。

二重特異性なＦｎ３結合分子は、所望の機能、例えばＨＳＡとの結合能を有する単一特
異性なＦｎ３ベースの結合分子をまず同定して、作成してもよい。この単一特異性なＦｎ
３ベースの分子は、２個の結合表面の一方にのみループ変動を有する（すなわち、上部ル
ープか底部ループのいずれかであって、両方ではない）。所望の機能を有する好適な単一
特異性なＦｎ３ベースの結合分子を同定した後、次いでこの分子を足場として用いて、Ｆ
ｎ３分子の逆の表面のループが改変されているライブラリーを作成し、したがって二重特
異性なＦｎ３ベースの結合分子のライブラリーを作成する。次いでこの二重特異性なＦｎ
３ベースの結合分子のライブラリーを用いて、２個の標的に結合する二重特異性なものを
同定するために、第二の標的分子に対するスクリーニングを行う。例えば、単一特異性な
Ｆｎ３ベースの結合分子は少なくとも１個の底部ループを用いてＨＳＡに結合できる。こ
の単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子を足場として用いて、該分子の少なくとも１個の
上部ループが第二の標的、例えばＶＥＧＦＲ２に結合するように改変されているライブラ
リーを作成して、二重特異性なＦｎ３ベースの分子のライブラリーを作成する。この二重
特異性なＦｎ３ベースの分子のライブラリーを用いて、ＶＥＧＦＲ２標的に対するスクリ
ーニングを行うことができる。

ＶＥＧＦＲ２はＶＥＧＦシグナル伝達の血管新生促進効果の一次メディエーターである
。ＶＥＧＦＲ−２はＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄに結合し、活性化さ
れる。内皮細胞において、ＶＥＧＦＲ−２活性化刺激細胞増殖および移動、ならびにイン
ビボでのＶＥＧＦＲ−２活性化は、血管新生を惹起し、脈管構造の透過性を向上させる。
血管新生の増加は、腫瘍増殖および多様な網膜症の重要な特徴として十分に確立されてお
り、また脈管構造の透過性の向上は多くの炎症性応答における重要な事象である（例えば
WO2005056764参照）。

このデータは修飾された底部ループを有する二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子が立
体構造安定性を維持し、結合活性を保持したまま発現され、精製され得ることを示してい
る。当業者は、本明細書に記載の本発明の方法を用いて、いずれかの二重特異性なＦｎ３
ベースの結合分子を作成できると理解する。二重特異性な分子は、いずれかの興味のある
標的に結合するように設計できる。例えば、二重特異性な分子は、同じ標的の異なる結合
部位に結合できる。あるいは、二重特異性な分子は、異なる標的分子に結合できる。

多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子
別の局面において、本発明は、２個以上の単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子または
二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子を含み、それらが一体に（例えば遺伝子的または化
学的に）連結されている多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子を提供する。多重特異性な
Ｆｎ３ベースの結合分子は、少なくとも１個の底部ループＡＢ、ＣＤ、ＥＦを用いて標的
に結合する、少なくとも１個の単量体Ｆｎ３ベースの結合分子を含む。

一つの態様において、多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、数珠状に連結されてお
り、各Ｆｎ３ベースの結合分子がそれぞれ特定の標的に結合する、２個以上のＦｎ３ベー
スの結合分子を含んでなる。二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子について、かかる標的
は同じ分子または異なる分子に存在していてよく、異なる分子は該多重特異性なＦｎ３ベ
ースの結合分子の結合によって並列される。標的は同一であってもよく、多重特異性なＦ
ｎ３ベースの結合分子は、抗体と同様に、標的分子を集合させることができる。

多様なＦｎ３ベースの結合分子、例えば単一の結合特異性を有するＦｎ３ベースの結合
分子、二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子または両方のタイプのＦｎ３ベースの結合分
子の組合せが、多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子に組み込まれてよい。したがって、
多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子の好適な標的は、Ｆｎ３ベースの結合分子および二
重特異性なＦｎ３ベースの結合分子において記載したものを含む。

多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、当該技術分野において知られている方法を用
いて作成できる。例えば、Ｆｎ３ベースの結合分子が１個のポリペプチドとして発現され
るように、Ｆｎ３ベースの結合分子を遺伝子的に連結してよい。この連結は、直接である
か、あるいはさらなるアミノ酸「リンカー」配列によって行ってよい。好適な非限定的な
方法およびリンカーは、例えば US20060286603 および WO04041862A2に記載されている。
例示的なポリペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１８）、ＧＳＧＳ
ＧＳＧＳＧＳ（配列番号１２１）、ＰＳＴＳＴＳＴ（配列番号１２２）およびＥＩＤＫＰ
ＳＱ（配列番号１２３）のようなＧＳリンカーならびにそれらの多量体を含むが、それら
に限定されない。実施例６はＧ−Ｓリンカーを用いてどのように多重特異性なＦｎ３ベー
スの結合分子を作成するかを示している。具体的には、多重特異性なＦｎ３ベースの結合
分子は、上部ループを用いてＶＥＧＦＲ２に結合する第一の単一特異性なＦｎ３ベースの
結合分子と、底部ループを用いてＨＳＡに結合する第二の単一特異性なＦｎ３ベースの結
合分子を連結するＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１８）リンカー配列を用いて作成す
る（配列番号１１９）。

リンカー配列を用いて作成した多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は標的分子との結
合について改善された立体障害を有し、したがってより短いリンカー配列を２個以上の単
量体Ｆｎ３ベースの結合分子を一体に連結するために使用できる。より短いリンカー配列
は、免疫原性応答を低減し、分裂する可能性を低減する。

あるいは、多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、当該技術分野において既知の方法
を用いて、個々のＦｎ３ベースの結合分子を化学的に複合体化して作成できる。多様なカ
ップリング剤または架橋剤が共有複合化のために使用できる。架橋剤の例には、例えばプ
ロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（
ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレ
ンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky
et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci
. U.S.A 82:8648参照）。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-
132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83)、および Glennie et al. (1987) J. I
mmunol. 139: 2367-2375)に記載のものを含む。好ましい複合化剤はＳＡＴＡおよびスル
ホ−ＳＭＣＣであり、いずれもPierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手可能である
。システイン残基をＦｎ３結合分子の特定の位置で導入して（例えば参照）、ＤＰＤＰＢ
またはＤＴＭＥ（Pierceから入手可能）のようなスルホヒドリルと物質を架橋して、２個
の分子を一体に連結できる。

実施例６および７は、リンカー配列で一体に連結する２個の別々の単一特異性なＦｎ３
分子を用いて、２個の異なる標的、ＨＳＡとＶＥＧＦＲ２に結合する新規な二重特異性な
Ｆｎ３分子の同定および作成について記載している。この具体例において、１個の単量体
Ｆｎ３ベースの結合分子は、底部ループを使用してＨＳＡに結合し、他方の単一特異性な
Ｆｎ３ベースの結合分子は上部ループを使用してＶＥＧＦＲ２に結合する。本発明の方法
を用いて数百個のクローンを作成し、代表的な数個、特にクローン８９を特徴付けた。こ
のデータは、修飾された底部ループを有する多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、立
体構造安定性を維持し、結合活性を保持したまま発現され、精製され得ることを示してい
る。当業者は本発明の方法を用いて、任意の数の多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子を
作成できると理解する。かかる多重特異性な結合分子は、１個の標的に結合するように設
計してもよい。あるいは、多重特異性な結合分子は２個以上の標的に結合するように設計
してもよい。

Ｆｎ３ベースの結合分子の複合体
別の局面において本発明は、１個以上の非Ｆｎ３部分と連結したＦｎ３ベースの結合分
子を含んでなる複合体を提供する。かかる非Ｆｎ３部分は、例えばＦｎ３ベースの結合分
子にさらなる機能的または物理化学的特性を与えることができる。一つの態様において、
Ｆｎ３ベースの結合分子は、抗体Ｆｃドメイン（またはその一部）に連結または融合する
。分子とＦｃドメイン、例えばＩｇＧ１のＦｃドメインを融合する方法は、当該技術分野
において既知である（例えばU.S. 5,428,130参照）。かかる複合体は、ＩｇＧホメオスタ
シスにおいて重要な機能を提供して、異化からそれと結合する分子を保護するＦｃＲｎと
結合するＦｃの能力のため、延長された循環系半減期を有する。

別の態様において、Ｆｎ３ベースの結合分子は１個以上のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ
）ポリペプチドまたはその一部と融合する。成熟形態では５８５アミノ酸のタンパク質で
あるＨＳＡは、血清の浸透圧の大部分に関与しており、内因性および外因性リガンドのキ
ャリヤーとして機能する。キャリヤー分子としてのアルブミンの役割およびその不活性性
は、インビボでペプチドのキャリヤーおよびトランスポーターとして使用するために望ま
しい特性である。多様なタンパク質のキャリヤーとしてのアルブミン融合タンパク質とし
てのアルブミンの使用は、WO 93/15199、WO 93/15200およびEP 413 622において示唆され
ている。ポリペプチドと融合するためのＨＳＡのＮ末端フラグメントの使用も提案されて
いる（EP 399 666）。したがって、本発明の分子とアルブミンまたはアルブミンのフラグ
メント（一部）または変異体あるいはタンパク質および／またはその活性を安定化するた
めに十分なＨＳＡと結合することができる分子（抗ＨＳＡバインダー）とを遺伝子的また
は化学的に融合または結合させることによって、該分子は安定化されて、保存期間が延長
され、そして／または溶液中、インビトロおよび／またはインビボで長期間、分子の活性
が保持される。

アルブミンと他のタンパク質との融合は、ＨＳＡをコードするＤＮＡまたはそのフラグ
メントを、該タンパク質をコードするＤＮＡと結合させるように、遺伝子操作することに
よって達成することができる。次いで、融合ポリペプチドを発現するように好適なプラス
ミドを設計した該融合ヌクレオチド配列で、好適な宿主を形質転換またはトランスフェク
トする。発現は、例えば原核細胞または真核細胞から、インビトロで、あるいは例えばト
ランスジェニック生物から、インビボで実施することができる。ＨＳＡ融合に関するさら
なる方法は、例えばWO 2001077137およびWO 200306007に見出すことができ、これらを参
照により本明細書の一部とする。具体的な態様において、融合タンパク質の発現は、哺乳
類細胞系、例えばＣＨＯ細胞系において実施する。

他の本発明のＦｎ３ベースの結合分子複合体は、少なくとも１個の異なる結合部位また
は標的分子に結合する分子を作成するために、非Ｆｎ３ベースの結合分子、例えば別のペ
プチドまたはタンパク質（例えば抗体または受容体のリガンド）に連結したＦｎ３ベース
の結合分子を含む。

本発明のＦｎ３ベースの結合分子複合体は、当該技術分野において既知の方法を用いて
、構成分子を結合させて作成できる。例えば、多様なカップリング剤または架橋剤を共有
複合化に使用して、構成分子を化学的に結合させることができる。架橋剤の例には、例え
ばプロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテー
ト（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェ
ニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）
プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル
）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpov
sky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A 82:8648参照）。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78,
118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83)、および Glennie et al. (1987)
J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載のものを含む。好ましい複合化剤はＳＡＴＡおよび
スルホ−ＳＭＣＣであり、いずれもPierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手可能で
ある。

あるいは、構成分子を同じベクターにコード化して、宿主細胞において１個のタンパク
質として発現させることができる。かかる融合タンパク質を作製する方法は、例えば米国
特許5,260,203; 米国特許5,455,030; 米国特許4,881,175; 米国特許5,132,405; 米国特許
5,091,513; 米国特許5,476,786; 米国特許5,013,653; 米国特許5,258,498; および米国特
許5,482,858に記載されている。

さらに別の態様において、本発明は、例えば分子の生物学的（例えば血清）半減期を延
長するため、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合化したＦｎ３ベースの結合分子を
提供する。タンパク質をＰＥＧ化するための方法は当該技術分野において既知である。例
えば、１個以上のＰＥＧ基が該分子に結合する条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたは
アルデヒド誘導体のようなＰＥＧ部分とＦｎ３ベースの結合分子を反応させる。用語「ペ
グ化部分」、「ポリエチレングリコール部分」または「ＰＥＧ部分」は、ポリアルキレン
グリコール化合物、あるいはカップリング剤またはカップリングもしくは活性化部分での
誘導体化（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジルジン、オキシランま
たは好ましくはマレイミド部分と、例えばＰＥＧ−マレイミド）ありまたはなしでのその
誘導体を含む。他の適切なポリアルキレングリコール化合物は、マレイミドモノメトキシ
ＰＥＧ、活性化ＰＥＧポリプロピレングリコール、あるいは次のタイプの荷電もしくは中
性ポリマーを含むが、これらに限定されない：デキストラン、コロミン酸または他の糖ベ
ースのポリマー、アミノ酸のポリマーおよびビオチン誘導体。

ＰＥＧ誘導体のための好適な官能基の選択は、分子上の利用可能な反応基のタイプまた
はＰＥＧと結合させる分子のタイプに基づく。タンパク質について、典型的な反応性アミ
ノ酸は、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸
、セリン、スレオニン、チロシンを含む。Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボン酸も使用
することができる。

好ましくは、ペグ化は反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのア
シル化反応またはアルキル化反応によって実施される。本明細書において使用するとき、
用語「ポリエチレングリコール」は他のタンパク質の誘導体化に使用されているあらゆる
形態のＰＥＧ、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリ
エチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを含む。タンパク質をペ
グ化する方法は当該技術分野において既知であり、本発明に適用することができる。例え
ば、WO 2005056764, U.S.7,045,337, U.S.7,083,970, U.S.6,927,042, Nishimura et al.
によるEP 0 154 316およびIshikawa et alによるEP 0 401 384を参照されたい。Ｆｎ３ベ
ースの結合分子は、ペグ化を促進するため、少なくとも１個のシステインアミノ酸または
少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むように操作されていてもよい。

Ｆｎ３ベースの結合分子複合体とその特異的標的との結合は、多様なアッセイによって
確認することができ、例えば融合体をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において、放射活
性によって標識し、使用することができる（例えば、Weintraub, B., Principles of Rad
ioimmunoassays, Seventh Training Course on Radiolidang Assay Techniques, The End
ocrine Society, March, 1986参照、これらを参照により本明細書の一部とする）。放射
性同位体は、γカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような方法によっ
て、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。

他の本発明のＦｎ３ベースの結合分子複合体は、タグ（例えばビオチン）または化学物
質（例えば免疫毒素または化学療法剤）と結合したＦｎ３ベースの結合分子を含む。かか
る化学物質は、細胞に有害な（例えば殺す）任意の薬物である細胞傷害剤を含む。例えば
、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、
ミトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン
、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロ
ン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチ
コイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびプロマイシン
ならびにそれらのアナログまたはホモログを含む。治療薬物はまた、例えば代謝拮抗剤（
例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−
フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ、
クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ
）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、
ミトマイシンＣおよびcis-ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）
、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（正式にはダウノマイシン）およびドキソ
ルビシン）、抗菌剤（例えばダクチノマイシン（正式にはアクチノマイシン）、ブレオマ
イシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））および抗有糸分裂剤（例え
ばビンクリスチンおよびビンブラスチン）を含む。本発明のフィブロネクチンベースの結
合分子と結合することができる他の治療用細胞傷害剤の例は、デュオカルマイシン、カリ
ケアマイシン、マイタンシンおよびアウリスタチンならびにそれらの誘導体を含む。

細胞傷害剤は、当該技術分野において利用可能なリンカー技術を用いて、本発明のＦｎ
３ベースの結合分子と結合することができる。細胞傷害剤と結合するために使用されるリ
ンカータイプの例は、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチ
ド含有リンカーを含むが、これらに限定されない。リンカーは、例えばリソソーム区画内
での低ｐＨによる切断に受容性であるか、あるいは腫瘍組織において優先的に発現されて
いるプロテアソーム、例えばカテプシン（例えばカテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）のようなプロテ
アソームによる切断に受容性であるように選択してもよい。細胞傷害剤のタイプ、リンカ
ーおよび治療薬物を複合化する方法のさらなる説明は、Saito, G. et al. (2003) Adv. D
rug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother
. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. R
ev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig
. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev
. 53:247-264も参照されたい。

本発明のＦｎ３ベースの結合分子は、細胞傷害放射性薬物（放射性免疫複合体とも称す
る）を作成するために、放射性同位体と複合化してもよい。診断または治療に使用するた
めにフィブロネクチンベースの結合分子と複合化することができる放射性同位体の例は、
ヨウ素^１３１、インジウム^１１１、イットリウム^９０およびルテチウム^１７７を含むが、
これらに限定されない。放射性免疫複合体を作成する方法は、当該技術分野において確立
されている。放射性免疫複合体の例は、イブリツモマブ、チウキセタンおよびトシツモマ
ブを含む商業的に入手可能なものであり、同様の方法を用いて、本発明の分子を使用して
放射性免疫複合体を作成することができる。

本発明のＦｎ３ベースの結合分子複合体を使用して、所定の生物学的応答を修飾するこ
とができ、そして薬物部分は伝統的な化学治療薬物に限るものとして構成されない。例え
ば、薬物部分は所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよ
い。かかるタンパク質は、例えば酵素的に活性な毒物またはそのフラグメント、例えばア
ブリン、リシンＡ、シュードモナス属外毒素、またはジフテリア毒素；腫瘍壊死因子また
はインターフェロンγのようなタンパク質；または生物学的応答調節剤、例えばリンホカ
イン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インタ
ーロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）
、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または他の増殖因子を含み得る。

かかる治療部分を複合化する技術は周知であり、本発明の分子に適用可能である。例え
ばArnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer T
herapy”, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp.
243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Deliv
ery”, Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (
Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Ca
ncer Therapy: A Review”, Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Ap
plications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And
Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Th
erapy”, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.
(eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)および Thorpe et al., “The Preparation
And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62:119-
58 (1982)を参照されたい。

本発明のＦｎ３ベースの結合分子は、薬物特性を修飾するために、薬物と結合したヒド
ロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）誘導体を用いたＨＥＳ化によって修飾してもよい。ＨＥ
Ｓは、体の酵素によって分解される、ロウ様トウモロコシデンプン由来の修飾された天然
ポリマーである。この修飾のため、分子の安定性が上昇し、腎クリアランスが低下するこ
とによって循環系半減期が延長されて、生物学的活性の上昇がもたらされる。さらにまた
、ＨＥＳ化は免疫原性およびアレルゲン性を強力に変化させる。ＨＥＳの分子量のような
異なるパラメーターを変化させて、広範なＨＥＳ薬物複合体をカスタマイズすることがで
きる。

DE 196 28 705 および DE 101 29 369は、ヒドロキシエチルデンプンの対応するアルド
ノラクトンを介して、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中でヒドロキシエチルデン
プンをヘモグロビンおよびアンホテリシンＢの遊離アミノ基と結合させることができる方
法をそれぞれ開示している。特にタンパク質の場合に、溶解性またはタンパク質の変性の
理由で、無水非極性溶媒を使用することができないことが多いため、水性媒体中でＨＥＳ
によるカップリング法も利用可能である。例えば、鎖の還元末端でアルドン酸に選択的に
酸化されているヒドロキシエチルデンプンのカップリングは、水溶性カルボジイミドＥＤ
Ｃ（１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）の仲介によっ
て可能である（PCT/EP 02/02928）。本発明に適用することができるさらなるＨＥＳ化法
は、例えばU.S. 20070134197, U.S. 20060258607, U.S. 20060217293, U.S. 20060100176
および U.S.20060052342に記載されている。

本発明のＦｎ３ベースの結合分子はまた、糖残基によって修飾されていてもよい。タン
パク質を糖残基で修飾するかあるいはタンパク質をグリコシル化する方法は、当該技術分
野において既知であり（例えば、Borman (2006) Chem.＆Eng. News 84(36):13-22およびB
orman (2007) Chem.＆Eng. News 85:19-20参照）、本発明の分子に適用可能である。

さらにまたはあるいは、フコシル残基の量が少ない低フコシル化パターンのような別の
タイプのグリコシル化を有する本発明のＦｎ３ベースの結合分子、あるいは増加した二分
（bisecting）ＧｌｃＮａｃ構造を有するＦｎ３ベースの結合分子を作成することができ
る。かかる糖修飾は、例えば改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞中でＦｎ３ベ
ースの結合分子を発現させることによって実施することができる。改変されたグリコシル
化機構を有する細胞は当該技術分野において説明されており、これは本発明の組換えＦｎ
３ベースの結合分子を発現させて、それによって改変されたグリコシル化を有する本発明
のＦｎ３ベースの結合分子を作成する宿主細胞として使用することができる。例えば、Ha
ng et al.によるEP 1,176,195には、機能的に破壊された、フコシルトランスフェラーゼ
をコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系であって、かかる細胞系において発現された
抗体が低フコシル化を示す細胞系が記載されている。PrestaによるＰＣＴ公報WO 03/0358
35は、フコースとＡｓｎ（２９７）結合糖の結合能が低下しており、また宿主細胞におい
て発現された抗体の低フコシル化をもたらす変異ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞について
記載している（Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照）
。ヒト様グリコシル化パターンを有するポリペプチドを作成する方法は、GlycofiのEP129
7172B1および他のパテントファミリーにも記載されている。

Ｆｎ３ベースの結合分子を作成する方法
１）核酸およびアミノ酸変化
１個以上のアミノ酸またはヌクレオチド修飾（例えば変化）を有する本発明のＦｎ３ベ
ースの結合分子は、多様な既知の方法によって作成することができる。典型的には、かか
る修飾されたＦｎ３ベースの結合分子は、例えば、組換え法によって作成することができ
る。さらに、遺伝子コードの縮重のため、多様な核酸配列を用いて各々所望の分子をコー
ドすることができる。

出発分子のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子を作成するための、当該技術分野
において認識されている方法の例は、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド介在）突然
変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発および該分子をコードする前に作成されたＤＮＡのカセッ
ト突然変異誘発による作成を含むが、これらに限定されない。

部位特異的突然変異誘発は、置換変異体を作成するための好ましい方法である。この技
術は当該技術分野において周知である（例えば、Carter et al. Nucleic Acids Res. 13:
4431-4443 (1985)およびKunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 82:488 (1987)
参照）。簡潔には、ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発の実施において、親ＤＮＡは最初に
、かかる親ＤＮＡの一本鎖と所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイ
ズさせて変化させる。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、プラ
イマーとして上記ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを使用し、そしてテンプレート
として上記親ＤＮＡの一本鎖を使用して、全第二鎖を合成する。かくして、所望の変異を
コードするオリゴヌクレオチドは、得られた二本鎖ＤＮＡに組み込まれる。

ＰＣＲ突然変異誘発も、出発分子のアミノ酸配列変異体を作成するために好適である。
Higuchi, in PCR Protocols, pp.177-183 (Academic Press, 1990);および Vallette et
al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989)を参照されたい。簡潔には、ＰＣＲにおいて少
量のテンプレートＤＮＡを出発物質として使用するとき、テンプレートＤＮＡの対応する
領域とはわずかに配列が異なるプライマーを使用して、プライマーがテンプレートと異な
る位置でのみテンプレート配列と異なる特定のＤＮＡフラグメントを比較的大量に作成す
ることができる。

変異体を作成するための別の方法であるカセット突然変異誘発は、Wells et al., Gene
34:315-323 (1985)に記載の技術に基づく。出発物質は、変異される出発ポリペプチドＤ
ＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異される親ＤＮＡのコドンを同
定する。同定した変異部位（複数でも可）の両側に、固有の制限エンドヌクレアーゼ部位
が存在していなければならない。かかる制限部位が存在しないとき、出発ポリペプチドＤ
ＮＡの適切な位置でそれらを導入するため、上記オリゴヌクレオチド介在突然変異誘発方
法を用いてそれらを作成することができる。これらの部位でプラスミドＤＮＡを切断して
、直線にする。制限部位間のＤＮＡ配列をコードするが所望の変異を含む二本鎖オリゴヌ
クレオチドは、標準的な方法を用いて合成され、ここで該オリゴヌクレオチドの２本の鎖
は別個に合成され、次いで標準的な技術を用いて一体にハイブリダイズする。この二本鎖
オリゴヌクレオチドは、カセットと称される。このカセットは、直線化されたプラスミド
の末端と適合可能である５’および３’末端を有するように設計され、それはプラスミド
と直接ライゲートすることができる。そうしてこのプラスミドは、変異ＤＮＡ配列を含む
。

あるいはまたはさらに、本分子のポリペプチド変異体をコードする所望のアミノ酸配列
を決定することができ、かかるアミノ酸配列変異体をコードする核酸配列を合成的に作製
することができる。

本発明のＦｎ３ベースの結合分子は、アミノ酸配列が（例えば野生型とは）異なるが、
所望の活性には変化がないように、さらに修飾されていてもよいことが、当業者には理解
される。例えば、「非本質的な」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導くさらなるヌクレオ
チド置換が該タンパク質に行われていてもよい。例えば、分子中の非本質的なアミノ酸残
基は、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換されていてもよい。他の態様に
おいて、一連のアミノ酸が、順序および／または側鎖ファミリーメンバーの組成において
異なる構造的に類似した一連のもので置換されていてもよく、すなわちあるアミノ酸残基
が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換された保存的置換を行うことができる。

同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されており
、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギ
ン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、
セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、
ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）
、ベータ分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族性側鎖（例
えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。

アミノ酸置換に加えて、本発明は、機能的に均等な分枝を作成するための、出発分子ア
ミノ酸配列の他の修飾を意図する。例えば、１個以上のアミノ酸残基を欠失させてもよい
。一般に、本発明のこの態様に従って、１〜約１０個以下の残基が欠失される。１個以上
のアミノ酸欠失を含むフィブロネクチン分子は、好ましくは出発ポリペプチド分子の少な
くとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％を
保持している。

元のＦｎ３ドメインまたはＦｎ３ベースの結合分子機能を保持したアミノ酸挿入変異体
を作成してもよい。例えば、本分子に少なくとも１個のアミノ酸残基（例えば１〜２個の
アミノ酸残基、一般に１０残基以下）を導入することができる。他の態様において、アミ
ノ酸修飾は、１個のＦｎ３ドメインまたはＦｎ３ベースの結合分子内で組み合わせてもよ
い。

一つの態様において、アミノ酸置換は、システインまたはＦｎ３ベースの結合分子と部
分の結合に好適な他の非天然アミノ酸を含むように、周知の結合方法を使用して、Ｆｎ３
ドメインで実施される。特に本発明は、Ｆｎ３足場を有するＦｎ３ベースの結合分子の特
定のアミノ酸変異体であって、１個以上のセリンアミノ酸残基がシステインまたは他の非
天然アミノ酸で置換されている変異体に関する。置換され得るセリンアミノ酸残基は、Ｓ
ｅｒ １４３２、Ｓｅｒ １４３６、Ｓｅｒ １４５８、Ｓｅｒ １４７５およびＳｅｒ １
５０４を含むが、これらに限定されない。置換され得るＦｎ３足場の他のアミノ酸位置は
、Ｖ １４２６、Ｌ １４３４、Ｔ １４７３およびＴ １４８６を含むが、これらに限定さ
れない。天然には生じないアミノ酸は、例えばＡｍｂｒｅｘ技術を用いてＦｎ３足場に置
換され得る（例えばUS 7,045,337; 7,083,970参照）。

２）Ｆｎ３ベースの結合分子を同定するためのスクリーニングアッセイ
多様なスクリーニングアッセイを使用して、本発明のＦｎ３ベースの結合分子を同定す
ることができる。所望の抗原との結合について選択するいずれかのインビトロまたはイン
ビボスクリーニング方法が、本質的には、使用できる。

一つの態様において、Ｆｎ３ベースの結合分子は細胞、ウイルスまたはバクテリオファ
ージの表面に提示され、固定化抗原を用いた選択に供される。スクリーニングのための好
適な方法は、米国特許7,063,943; 6,699,658; 7,063,943および5866344に記載されている
。かかる表面ディスプレイ法は、Ｆｎ３ベースの結合分子と通常細胞、ウイルスまたはバ
クテリオファージの外側表面に存在する好適なタンパク質との融合タンパク質の作成を必
要とし得る。かかる融合体を作成するための好適なタンパク質は、当該技術分野において
周知である。

他の態様において、Ｆｎ３ベースの結合分子は、リボソームまたはポリソームディスプ
レイのようなインビトロ表現型−遺伝子型連鎖ディスプレイを用いてスクリーニングされ
る。かかる「分子進化」の方法は、当該技術分野において周知である（例えば米国特許6,
194,550および7,195,880参照）。

スクリーニング方法は、１回以上のインビトロまたはインビボ親和性成熟段階を含んで
いてもよい。所望の抗原とＦｎ３ベースの結合分子の結合を改善するＦｎ３ドメインまた
はＣＤＲにおけるアミノ酸変化をもたらすあらゆる親和性成熟アプローチを使用すること
ができる。これらのアミノ酸変化は、例えばランダム突然変異誘発、「ウォークスルー突
然変異誘発」および「ルックスルー突然変異誘発」によって達成され得る。かかる突然変
異誘発は、例えば誤りがちな（error-prone）ＰＣＲ、酵母または細菌の「ミューテータ
ー」株、Ｆｎ３ベースの結合分子の全部または一部の最初からの合成中でのランダムまた
は所定の核酸変化の導入を用いて、達成され得る。親和性成熟および／または突然変異誘
発を実施する方法は、例えば米国特許7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479; 5,
922,545; 5,830,721; 5,605,793, 5,830,650; 6,194,550; 6,699,658; 7,063,943; 58663
44およびＰＣＴ公報WO06023144に記載されている。かかる親和性成熟方法は、改善された
抗原親和性を有するＦｎ３ベースの結合分子を選択するために抗原結合スクリーニングア
ッセイのストリンジェンシーを上昇することがさらに必要であり得る。タンパク質−タン
パク質相互作用のストリンジェンシーを上昇させるための当該技術分野において知られて
いる方法をここで用いてよい。一つの態様において、所望の抗原に対するＦｎ３ベースの
結合分子の親和性を低下させるために、１個以上のアッセイ条件（例えばアッセイバッフ
ァーの塩濃度）を変化させる。別の態様において、Ｆｎ３ベースの結合分子が所望の抗原
と結合することができる時間を短くする。他の態様において、タンパク質間相互作用アッ
セイに競合的結合工程を加える。例えば、Ｆｎ３ベースの結合分子は最初に、所望の固定
化抗原と結合させる。次いで、固定化抗原と競合して結合する特定の濃度の非固定化抗原
を加えて、抗原に対して最も低い親和性を有するＦｎ３ベースの結合分子を固定化抗原か
ら溶出させて、改善された抗原結合親和性を有するＦｎ３ベースの結合分子を選択する。
該アッセイ条件のストリンジェンシーは、アッセイに加える非固定化抗原の濃度を上昇さ
せて、さらに上昇させることができる。

本発明のスクリーニング法はまた、改善された抗原結合性を有する１種以上のＦｎ３ベ
ースの結合分子を富化するため、複数回の選択を必要としてもよい。一つの態様において
、選択のそれぞれの回でさらにアミノ酸変異をＦｎ３ベースの結合分子に導入する。他の
態様において、選択のそれぞれの回で所望の抗原との結合のストリンジェンシーを上昇し
て、増加した抗原親和性を有するＦｎ３ベースの結合分子を選択する。

本発明の二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子の場合には、各結合特異性について独立
してスクリーニングすることが好ましい。従って、ＡＢ、ＣＤまたはＥＦループの１個以
上における１個以上のアミノ酸が改変されているＦｎ３ベースの結合分子の第一ライブラ
リーを用いて、第一の標的に結合する個々のＦｎ３ベースの結合分子を同定する第一スク
リーニングを行う。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの１個以上における１個以上のアミノ酸
が改変されているＦｎ３ドメインの第二ライブラリーを用いて、第二の標的に結合する個
々のＦｎ３ベースの結合分子を同定する別個の第二スクリーニングを行う。両方のスクリ
ーニングから同定した個々の単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子のアミノ酸配列を、当
該技術分野において既知の方法を用いて、決定する。個々のＦｎ３ベースの結合分子由来
の第一および第二の標的結合配列を１個のキメラＦｎ３ベースの結合分子に組み合わせて
、二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子を作成する。

３）製造方法
本発明のＦｎ３ベースの結合分子は典型的には、組み換え発現によって作成する。該分
子をコードする核酸を発現ベクターに挿入する。該分子をコードするＤＮＡセグメントは
、それらの発現を確実に行うため発現ベクターの調節配列と作動可能に連結している。発
現調節配列は、プロモーター（例えば天然関連または異種プロモーター）、シグナル配列
、エンハンサー要素および転写終止配列を含むが、これらに限定されない。好ましくは、
発現調節配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベク
ター内の真核プロモーター系である。ベクターが適切な宿主に取り込まれると、ヌクレオ
チド配列の高レベル発現に適した条件下で該宿主を維持し、交叉反応するＦｎ３ベースの
結合分子を回収および精製する。

これらの発現ベクターは典型的には、エピソームとして、あるいは宿主染色体ＤＮＡの
不可欠な部分として、宿主生物内で複製可能である。一般に、発現ベクターは所望のＤＮ
Ａ配列で形質転換された細胞の検出を可能とするため、選択マーカー（例えばアンピシリ
ン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性）を含む
（例えば、Itakura et al., 米国特許4,704,362参照）。

大腸菌は本発明のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ配列）をクローン化するために特に
有用な原核宿主である。使用に好適な他の微生物宿主は、枯草菌のような細菌およびサル
モネラ、セラチアおよび多様なシュードモナス属の種のような他の腸内細菌を含む。

酵母のような他の微生物も発現に有用である。サッカロマイセスおよびピキアは、望ま
しい発現調節配列（例えばプロモーター）、複製起点、終止配列等を有する好適なベクタ
ーを有する、例示的な酵母宿主である。典型的なプロモーターは、３−ホスホグリセリン
酸キナーゼおよび他の解糖酵素を含む。とりわけ誘導可能な酵母プロモーターは、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロームＣ、ならびにメタノール、マルトースおよびガ
ラクトース利用に関与する酵素由来のプロモーターを含む。

微生物に加えて、哺乳類組織培養物も本発明のポリペプチド（例えば免疫グロブリンま
たはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）を発現し、生産するために使用す
ることができる。Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (198
7)を参照されたい。ＣＨＯ細胞系、多様なＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、骨
髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマを含む、異種タンパク質（例えばイン
タクトな免疫グロブリン）を分泌することができる多くの好適な宿主細胞系真核細胞が当
該技術分野において開発されているめ、実際には真核細胞が好まれる。これらの細胞の発
現ベクターは、複製起点、プロモーターおよびエンハンサーのような発現調節配列（Quee
n et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)）、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位
、ポリアデニル化部位および転写終止配列のような必要なプロセッシング情報部位を含ん
でいてもよい。好ましい発現調節配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイ
ルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターである
。Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)を参照されたい。

あるいは、コーディング配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入および続く
トランスジェニック動物の乳における発現のために、トランス遺伝子に組み込まれていて
もよい（例えば、Deboer et al.のU.S. 5,741,957、Rosenの U.S. 5,304,489およびMeade
et al.のU.S. 5,849,992参照）。好適なトランス遺伝子は、カゼインまたはベータラク
トグロブリンのような乳腺特異的遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーと作動可
能に結合した、軽鎖および／または重鎖のコード配列を含む。

目的のポリヌクレオチド配列および発現調節配列を含むベクターは、細胞宿主のタイプ
に依存して変化する周知の方法で、宿主細胞に移すことができる。例えば、化学的に形質
転換受容性のある原核細胞は、短時間に熱ショックを与えることができ、一方でリン酸カ
ルシウム処置、エレクトロポレーション、リポフェクション、遺伝子銃またはウイルスを
利用したトランスフェクションが、他の細胞宿主には使用され得る（一般に、Sambrook e
t al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed.
, 1989)参照）。哺乳類細胞を形質転換するために使用される他の方法は、ポリブレン、
プロトブラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクシ
ョンの使用を含む（一般に、Sambrook et al., supra参照）。トランスジェニック動物の
作成のために、トランス遺伝子を受精卵母細胞にマイクロインジェクションすることがで
き、あるいは胚幹細胞のゲノムに組み込んで、かかる細胞の核を除核した卵母細胞に移す
ことができる。

発現されると、本発明のＦｎ３ベースの結合分子は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニ
ティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動等を含む当該技
術分野において標準的な方法に従って精製することができる（一般に、Scopes, Protein
Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982))参照）。少なくとも約９０〜９５％の均
一性の実質的に純粋な分子が好ましく、医薬的使用のためには９８〜９９％またはそれ以
上の均一性が最も好ましい。

４）Ｆｎ３ベースの結合分子にＣＤＲを移植する方法
一つの局面において、本発明は、野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改変されて、抗体の
相補性決定領域（ＣＤＲ）またはＴ細胞受容体の全部または一部を含むＦｎ３ベースの結
合分子を特徴とする。

抗体のＣＤＲもしくはＴ細胞受容体可変領域またはそれらの抗原結合フラグメントが移
植に好適である。ＣＤＲは、げっ歯類、霊長類、ラクダまたはサメを含むがこれらに限定
されないいずれかの動物の抗体またはＴ細胞受容体レパートリーから得ることができる。
特定の態様において、ＣＤＲはシングルドメイン抗体、例えばナノ抗体のＣＤＲ１、ＣＤ
Ｒ２およびＣＤＲ３から得られる。より具体的な態様において、ナノ抗体のようなシング
ルドメイン抗体のＣＤＲ１、２および３がＦｎ３ドメインのＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、Ｅ
ＦおよびＦＧループに移植されて、それによって元のナノ抗体の標的結合特異性をＦｎ３
ベースの結合分子に付与する。ラクダ抗体および抗体フラグメントの操作ライブラリーは
、例えばAblynx、Ghent、Belgiumから商業的に入手可能である。抗体レパートリーは、１
種以上の抗原でチャレンジした動物または抗原でチャレンジされていないそのままの動物
に由来するものであってよい。さらにまたはあるいは、ＣＤＲはインビトロポリソームま
たはリボソームディスプレイ、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイ技術を含む
がこれらに限定されないインビトロまたはインビボライブラリースクリーニング法によっ
て作成した抗体またはその抗原結合フラグメントから得ることができる。これは、インビ
トロまたはインビボライブラリースクリーニング法によって当初は作成されないが、次い
で突然変異誘発またはインビトロまたはインビボスクリーニング法を用いた１回以上の親
和性変異段階を実行した抗体を含む。かかるインビトロまたはインビボライブラリースク
リーニング法または親和性成熟方法の例は、例えば米国特許7,195,880; 6,951,725; 7,07
8,197; 7,022,479; 5,922,545; 5,830,721; 5,605,793, 5,830,650; 6,194,550; 6,699,6
58; 7,063,943; 5866344およびＰＣＴ公報WO06023144に記載されている。

抗体ＣＤＲを同定する方法は、当該技術分野において周知である（Kabat et al., U.S.
Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological In
terest” (1983); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); MacCallum et
al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)参照）。特定の抗体をコードする核酸を単離し
、配列決定することができ、該ＣＤＲ配列は確立された抗体配列命名法に関してコードさ
れたタンパク質の調査によって演繹される。超可変領域またはＣＤＲを本発明のＦｎ３ベ
ースの結合足場に移植する方法は、例えば遺伝子操作、デノボ核酸合成またはＰＣＲ利用
遺伝子アセンブリを含む（例えば、米国特許第5,225.539号参照）。

上記技術によって、超可変領域またはＣＤＲの選択および提示のために好適な足場ルー
プを同定することができる。しかし、Ｆｎ３ドメインおよびドナー抗体の構造モデリング
に基づいた超可変領域のフィットおよび提示をさらに改善するため、さらなる基準が敷か
れ得る。

一つの局面において、Ｆｎ３足場のいずれかのベータ鎖における特定のアミノ酸残基を
変異させて、抗原との結合性を保持ないし改善する立体配置をＣＤＲループに採用させる
ことができる。この方法は、構造モデリングと配列比較の組合せを用いて、異種抗体フレ
ームワークにＣＤＲを移植する方法と同様に実施することができる。一つの態様において
、ＣＤＲと隣接するＦｎ３残基をQueen et al.が実施した方法と同様に変異させる（米国
特許6,180,370; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 7,022,500参照）。他の態様におい
て、ＣＤＲ残基の１ファンデルワールス半径内のＦｎ３ドメイン残基をWinter et al.が
実施した方法と同様に変異させる（米国特許6,548,640; 6,982,321参照）。他の態様にお
いて、ＣＤＲ残基と隣接していないが、Ｆｎ３ドメインおよびドナー抗体の構造モデリン
グに基づいてＣＤＲ残基の立体配置を変更すると予測されるＦｎ３残基を、Carter et al
.またはAdair et alが実施した方法と同様に変異させる（米国特許6,407,213; 6,639,055
; 5,859,205; 6,632,927参照）。

組成物
本発明のＦｎ３ベースの結合分子は、インビボでの治療上有用性を有する。したがって
、本発明はまた、薬学的に許容される担体と共に製剤された、Ｆｎ３ベースの結合分子（
またはその変異体、融合体および複合体）の１種または組合せを含む組成物、例えば医薬
組成物を提供する。本発明の医薬組成物はまた、組合せ療法で、すなわち他の薬物と組み
合わせて投与してもよい。例えば、組合せ療法は、本発明の組成物と少なくとも１種以上
のさらなる治療薬物、例えば抗炎症剤、抗癌剤および化学療法剤を含んでいてもよい。

本発明の医薬組成物はまた、放射線療法と組み合わせて投与してもよい。他のＦｎ３ベ
ースの結合分子との共投与も本発明に含まれる。

本明細書において使用するとき、「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合性であ
る、いずれかおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化
剤および吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄
または上皮投与（例えば注射または輸液による）に好適である。投与経路に依存して、活
性化合物、すなわち抗体、二重特異性および多重特異性分子は、酸および化合物を不活性
化し得る他の天然条件から該化合物を保護するための物質でコーティングしてもよい。

「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持しており、いずれ
かの望ましくない毒性効果に関与しない塩を意味する（例えば、Berge, S.M., et al. (1
977) J. Pharm. Sci. 66:1-19参照）。かかる塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含
む。酸付加塩は、非毒性無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化
水素酸、亜リン酸等、ならびに非毒性有機酸、例えば脂肪族モノおよびジカルボン酸、フ
ェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族性スルホ
ン酸等に由来するものを含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カ
リウム、マグネシウム、カルシウム等、ならびに非毒性有機アミン、例えばＮ，Ｎ’−ジ
ベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタ
ノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等に由来するものを含む。

本発明の組成物は、当該技術分野において既知の多様な方法によって投与することがで
きる。当業者に理解されるとおり、投与経路および／または形態は、望まれる結果に従っ
て変化する。活性化合物は、該化合物を速やかな放出から保護するための担体と共に製剤
されていてもよい（例えばインプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を
含む制御放出製剤）。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート
、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使
用してもよい。かかる製剤の製造のための多様な方法が特許化されているか、あるいは一
般に当業者に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery
Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい
。

ある投与経路で本発明の化合物を投与するために、その不活性化から保護するための物
質で該化合物をコーティングするか、あるいはそれと共に該化合物を投与する必要がある
場合がある。例えば、化合物は対象に適切な担体、例えばリポソームまたは希釈剤中で投
与してもよい。薬学的に許容される希釈剤は、生理食塩水および水性バッファー溶液を含
む。リポソームは、水中油中水ＣＧＦエマルジョンおよび常套のリポソームを含む（Stre
jan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27）。

薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液または分散剤および滅菌注射液または分散剤を
即時製造するための滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬物
の使用は、当該技術分野において既知である。いずれかの常套の媒体または薬物が本活性
化合物と非適合性である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用が意図される
。補助的な活性化合物も本組成物に含まれていてよい。

治療用組成物は典型的には、滅菌されており、製造および貯蔵条件下で安定でなければ
ならない。該組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に好適
な他の秩序構造として製剤することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオー
ル（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび脂質ポリエチレングリコール等）
およびそれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、
例えばレシチンのようなコーティング物質の使用によって、分散剤の場合は必要な粒子サ
イズを維持することによって、そして界面活性剤の使用によって、維持することができる
。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのようなポ
リアルコールまたは塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の延長された吸
収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることに
よってもたらされ得る。

滅菌注射液は、上記成分の１種または組合せと共に、適切な溶媒中に必要量の活性化合
物を含めて、所望により、次いで滅菌マイクロフィルトレーションして製造することがで
きる。一般に、分散剤は、基礎分散媒および必要な上記の他の成分を含む滅菌ビークルに
、活性化合物を含めることによって製造する。滅菌注射液の製造のための滅菌粉末の場合
、好ましい製造方法は真空乾燥および凍結−乾燥（凍結乾燥）であり、これによって有効
成分とその予め滅菌濾過した溶液のいずれかのさらなる所望の成分の粉末を得る。

投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば治療応答）を得るために調節される。例え
ば、１回ボーラスを投与し、複数回分割用量をゆっくり時間を掛けて投与するか、あるい
は用量を治療状況の緊急性によって示されるとおりに比例的に減少または増加することが
できる。例えば、本発明のＦｎ３ベースの結合分子は、皮下注射で週に１または２回、あ
るいは皮下注射で月に１または２回投与することができる。

投与の簡便さおよび投与量の均一性のため、非経腸組成物を単位投与形態に製剤するこ
とが特に有利である。単位投与形態は、本明細書において使用するとき、処置する対象へ
の単位投与量として好適な物理的に分離した単位を意味し；各単位は、必要な医薬担体と
共に、所望の治療効果を奏するように計算された所定の量の活性化合物を含む。本発明の
単位投与形態についての説明は、（ａ）活性化合物の特異的な特徴および得られるべき具
体的な治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性の処置のための活性化合物のような配合の
分野に内在する制限に基づいて説明され、そしてそれらに直接的に依存する。

薬学的に許容される抗酸化剤の例は、（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、
塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（
２）油溶性抗酸化剤、例えばアスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール
（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガラート、ア
ルファ−トコフェロール等；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジ
アミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等を含む。

治療用組成物について、本発明の製剤は、経口、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）
、直腸、膣および／または非経腸投与に適したものを含む。製剤は、簡便には単位投与形
態で存在していてよく、薬学の分野において既知のいずれかの方法によって製造すること
ができる。単剤形態を製造するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量
は、処置する対象および具体的な投与形態に従って変化する。単剤形態を製造するために
担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果を奏する組成物
の量である。一般に、この量は１００％中、約０．００１％〜約９０％の有効成分、好ま
しくは約０．００５％〜約７０％、最も好ましくは約０．０１％〜約３０％である。

膣投与に適している本発明の製剤はまた、適切であると当該技術分野において知られて
いる担体を含んだペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー
製剤を含む。本発明の組成物の局所または経皮投与用投与形態は、粉末、スプレー、軟膏
、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤を含む。活性化合
物は、滅菌条件下で薬学的に許容される担体と、そして必要であり得るいずれかの保存剤
、バッファーまたはプロペラントと共に混合することができる。

用語「非経腸投与」および「非経腸的に投与」は、本明細書において使用するとき経腸
投与および局所投与以外の、通常は注射による投与形態を意味し、静脈内、筋肉内、動脈
内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮膚内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内
、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および輸液を含むが、これらに限
定されない。

本発明の医薬組成物に使用することができる好適な水性および非水性担体の例は、水、
エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレング
リコール等）およびそれらの好適な混合物、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有
機エステル、例えばエチルオレエートを含む。適切な流動性は、例えばレシチンのような
コーティング物質の使用によって、分散剤の場合は必要な粒子サイズを維持することによ
って、そして界面活性剤の使用によって、維持することができる。

これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを
含んでいてもよい。微生物の存在の防止は、上記滅菌方法ならびに多様な抗菌剤および抗
真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含めることの両
方によって、保証され得る。糖、塩化ナトリウム等のような等張化剤を組成物に含めるこ
とが望まれることもある。さらに、注射用医薬形態の延長された吸収は、モノステアリン
酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる物質を含めることによってもた
らされ得る。

本発明の化合物が医薬としてヒトおよび動物に投与されるとき、それらは単独で、また
は例えば０．００１〜９０％（より好ましくは、０．００５〜７０％、例えば０．０１〜
３０％）の有効成分と薬学的に許容される担体を組み合わせて含む医薬組成物として、投
与することができる。

選択した投与経路に拘わらず、好適な水和物形態で使用されてもよい本発明の化合物お
よび／または本発明の医薬組成物は、当業者に既知の常套の方法によって薬学的に許容さ
れる投与形態に製剤される。

本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与レベルは、具体的な患者、組成物および
投与形態について、患者に毒性なく、所望の治療応答を得るために有効である有効成分の
量が得られるように、変化してよい。選択される投与レベルは、使用する具体的な本発明
の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用する
具体的な化合物の排出速度、処置の期間、使用する具体的な組成物と組み合わせて用いる
他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的
健康および薬歴等の医学分野で周知の要因を含む、多様な薬物動態因子に依存する。当該
技術分野における通常の技術を有する医師または獣医は、必要な医薬組成物の有効量を容
易に決定し、予測することができる。例えば、医師または獣医は、医薬組成物において使
用する本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を得るために必要とされる量よりも少な
いレベルで開始し、所望の効果が得られるまで用量を漸増することができる。一般に、本
発明の組成物の好適な１日用量は、治療効果を奏するために有効な最低用量である化合物
の量である。かかる有効用量は、一般に、上記要因に依存する。投与は静脈内、筋肉内、
腹腔内または皮下であることが好ましく、好ましくは標的部位の近くに投与する。所望に
より、治療用組成物の有効１日用量は、１日の適切な間隔で、所望により単位投与形態で
、２、３、４、５、６またはそれ以上の分割用量として別々に投与することが好ましいこ
ともある。本発明の化合物を単独で投与することは可能であるが、医薬製剤（組成物）と
して化合物を投与することが好ましい。

治療用組成物は、当該技術分野において既知の医薬デバイスによって投与することがで
きる。例えば好ましい態様において、本発明の治療用組成物は、無針皮下注射器、例えば
米国特許5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824または4,
596,556に記載のデバイスによって投与することができる。本発明に有用な周知のインプ
ラントおよびモジュールの例は、制御された速度で医薬を供給するためのインプラント可
能なマイクロ輸液ポンプを記載する米国特許4,487,603、皮膚を介して医薬を投与するた
めの治療用デバイスを記載する米国特許4,486,194、正確な輸液速度で医薬を送達するた
めの医薬輸液ポンプを記載する米国特許4,447,233、連続的薬物送達のための、インプラ
ント可能な流速可変型輸液装置を記載する米国特許4,447,224、複数のチャンバー区画を
有する浸透薬物送達システムを記載する米国特許4,439,196、ならびに浸透薬物送達シス
テムを記載する米国特許4,475,196を含む。多様な他のかかるインプラント、送達システ
ムおよびモジュールが当業者に既知である。

ある態様において、本発明の分子は、インビボでの適切な分散を確実にするために製剤
され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高親水性化合物を除外する。本発明の
治療化合物がＢＢＢを通過することを確保するため（所望により）、それらは例えばリポ
ソーム中に製剤されていてよい。リポソームを製造する方法に関しては、例えば米国特許
4,522,811；5,374,548；および5,399,331を参照されたい。リポソームは特定の細胞また
は臓器に選択的に移動され、したがって標的薬物送達を向上する１種以上の部分を含んで
いてもよい（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照）。例示的
な標的部分は、葉酸またはビオチン（例えば、Low et al.の米国特許5,416,016参照）；
マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗
体（P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimi
crob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性プロテインＡ受容体（Briscoe et al. (19
95) Am. J. Physiol. 1233:134）、本発明の製剤ならびに本発明の分子の成分を含み得る
異なる種；ｐ１２０（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）を含み；K. K
einanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (19
94) Immunomethods 4:273も参照されたい。本発明の一つの態様において、本発明の治療
化合物は、リポソームに製剤され；より好ましい態様において、リポソームは標的部分を
含む。最も好ましい態様において、リポソーム中の治療化合物は、腫瘍または感染に近い
部位にボーラス注射によって送達される。組成物は、容易に注射針を通過できる程度に流
動的でなければならない。それは製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌お
よび真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。

さらなる態様において、本発明の分子は、胎盤を通過する輸送を防止または低減するよ
うに製剤されていてもよい。これは当該技術分野において既知の方法、例えばＦｎ３ベー
スの結合分子のＰＥＧ化によって行うことができる。さらなる参考文献は、Cunningham-R
undles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethy
lene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J Im
munol Methods. 152:177-190; および Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of i
mmunoglobulins, Ann Allergy Asthma Immunol 74:279-283を挙げることができる。これ
は、Ｆｎ３ベースの結合分子が自然発生的流産の再発を処置または予防するために使用さ
れるとき、特に関係する。

がんを阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における効果の予測が可能な動物モデル系に
おいて評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に既知のインビト
ロでの阻害アッセイによって、本化合物の阻害能を試験することによって評価することが
できる。治療上有効量の治療化合物は、腫瘍のサイズを減少させることができ、あるいは
対象の症状を緩和することができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度およ
び選択した具体的な化合物または投与経路のような要因に基づいて、かかる量を決定する
ことができる。

組成物は滅菌されており、そして該組成物がシリンジによって送達可能である程度に流
動的でなければならない。水に加えて、担体は等張緩衝化食塩水、エタノール、ポリオー
ル（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等）
およびそれらの好適な混合物であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコー
ティング物質の使用によって、分散剤の場合は必要な粒子サイズを維持することによって
、そして界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、組成物中に等
張化剤、例えば糖、マンニトールまたはソルビトールのようなポリアルコールおよび塩化
ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期間の吸収は、吸収遅延剤、例えば
モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含めることによってもたらさ
れ得る。

活性化合物が上記のとおり好適に保護されているとき、該化合物は例えば不活性希釈剤
または同化食用担体と共に経口的に投与してもよい。

治療および診断適用
本明細書に記載のＦｎ３ベースの結合分子は、いずれかの目的の抗原または標的に結合
するように構築することがでる。かかる標的は、クラスタードメイン、細胞レセプター、
細胞レセプターリガンド、増殖因子、インターロイキン、タンパク質アレルゲン、細菌ま
たはウイルスを含むが、これらに限定されない（図１参照）。本明細書に記載のＦｎ３ベ
ースの結合分子は、増加した安定性および半減期、ならびにさらなる機能的部分を有する
ように修飾してもよい。したがって、これらの分子は、研究、治療および診断分野を含む
、抗体が使用されているあらゆる領域において抗体の代わりに使用することができる。さ
らに、これらの分子は抗体よりも優れた溶解性および安定性を有するため、本明細書に記
載の抗体模倣物はまた、抗体分子を破壊もしくは不活性化する条件下で使用することもで
きる。

例えばこれらの分子は、例えばインビトロまたはエクスビボで、培地中の細胞に、ある
いは例えばインビボで対象に、多様な障害の処置、予防または診断のために、投与するこ
とができる。用語「対象」は、本明細書において使用するとき、ヒトおよび非ヒト動物を
含むことを意図する。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば哺乳類および非ヒト哺乳類
、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類およびは虫
類を含む。Ｆｎ３分子が別の薬物と共に投与されるとき、これら２つは順次または同時に
投与することができる。

一つの態様において、本発明のＦｎ３ベースの結合分子（およびその変異体、融合体お
よび複合体）は、該分子によって結合される標的および／または二重特異性／多重特異性
なＦｎ３ベースの結合分子によって結合される標的のレベルを検出するために使用するこ
とができる。これは、例えばサンプル（例えばインビトロサンプル）と対照サンプルを該
分子と、該分子と標的の複合体の形成が可能な条件下で接触させることによって、達成す
ることができる。該分子と標的間で形成されたいずれかの複合体を検出して、サンプルと
対照で比較する。例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳおよびフローサイトメトリー分析のよう
な当該技術分野において周知の標準的な検出方法が、本発明の組成物を用いて実施され得
る。

また、本発明の組成物（例えば、フィブロネクチンベースの結合分子、その変異体、融
合体および複合体）と使用のための指示書を含むキットも本発明の範囲に含まれる。該キ
ットはさらに、少なくとも１種のさらなる試薬または１種以上のさらなる本発明のＦｎ３
ベースの結合分子（例えば第一の分子と異なる標的抗原のエピトープに結合する相補的活
性を有する抗体）を含んでいてもよい。キットは典型的には、キットの内容物の意図した
使用を記載したラベルを含む。用語ラベルは、キット上またはキットと共に供給されるい
ずれかの記載されたかあるいは記録された物体か、あるいはそれ以外のキットに伴うもの
を含む。

上記のとおり、本発明の分子は、研究、治療および診断分野のあらゆる領域で使用する
ことができる。本発明のＦｎ３ベースの結合分子（およびその変異体、融合体および複合
体）を使用して処置することができる疾患／障害の例は、自己免疫障害、がん、感染症、
および他の病原性適応症を含む。

本発明のＦｎ３ベースの結合分子が使用できる自己免疫疾患の具体例は以下のものを含
むが、それらに限定されない：多発性硬化症および他の脱髄疾患；リウマチ様関節炎；炎
症性腸疾患；全身性エリトマトーデス；Ｉ型糖尿病；炎症性皮膚疾患；ショーグレン症候
群；および移植拒絶。

本発明のＦｎ３ベースの結合分子が使用できるがんの具体例は以下のものを含むが、そ
れらに限定されない：肺がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん；黒色腫；非ホジキンリン
パ腫；結直腸癌；膵臓がん；子宮内膜がん；腎臓がん；皮膚がん（非黒色腫）；白血病お
よび甲状腺がん。

ＶＥＧＦに関連した疾患の具体例は、例えば不適切な血管形成に関連した多くの状態を
含み、例えば以下のものを含むが、それらに限定されない：自己免疫疾患（例えばリウマ
チ様関節炎、炎症性腸疾患または乾癬）；心臓疾患（例えばアテローム性動脈硬化症また
は血管再狭窄）；網膜症（例えば一般的な増殖性網膜症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変
性または血管新生緑内障）；腎臓病（例えば糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性微小血
管症、移植拒絶、炎症性腎疾患、糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、溶血性尿
毒症症候群および高血圧性腎硬化症）；血管芽細胞腫；血管腫；甲状腺過形成；組織移植
；慢性炎症；メーグス症候群；心嚢液貯留；胸水；自己免疫疾患；糖尿病；子宮内膜症；
慢性喘息；望ましくない線維症（特に肝線維症）およびがん、ならびにがんによって引き
起こされる合併症、例えば胸水および腹水。Ｆｎ３ベースの結合分子は、過増殖性疾患ま
たはがんおよびがんの転移拡散の処置または予防に使用できる。がんの非限定的な例は、
膀胱がん、血液のがん、脳がん、乳がん、軟骨がん、結腸がん、腎臓がん、肝臓がん、肺
がん、リンパ節のがん、神経組織のがん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、骨格筋のが
ん、皮膚がん、脊髄がん、脾臓がん、胃がん、睾丸がん、胸腺がん、甲状腺がん、気管が
ん、尿生殖路がん、尿管がん、尿道がん、子宮がんまたは膣がんを含む。さらなる処置可
能な状態は、米国特許6,524,583（ここに参照により本明細書に組み込む）に見られる。
ＶＥＧＦＲ−２結合ポリペプチドについての使用を記載している他の文献は以下のものを
含む：McLeod DS et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002 Feb;43(2):474-82; Watana
be et al. Exp Dermatol. 2004 Nov;13(11):671-81; Yoshiji H et al., Gut. 2003 Sep;
52(9): 1347-54; Verheul et al., Oncologist. 2000;5 Suppl 1:45-50; Boldicke et al
., Stem Cells. 2001;19(1) :24-36。本明細書に記載する血管形成関連疾患は、以下のも
のを含むがそれらに限定されない：血管形成依存性のがん、例えば固形腫瘍、血液伝播性
腫瘍、例えば白血病、ならびに腫瘍転移；良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫瘍、神経線
維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽種；炎症性疾患、例えば免疫および非免疫炎症；慢性
関節リウマチおよび乾癬；目の血管形成疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄
斑変性、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障、後水晶体繊維増殖症、ルベオーシス；オス
ラー・ウェーバー症候群；心筋血管新生；プラーク心血管形成；毛細血管拡張症；血友病
関節；血管線維腫；ならびに創傷肉芽形成および創傷治癒；毛細血管拡張症、乾癬、強皮
症、化膿性肉芽種、冠状動脈側枝（cororany collaterals）、虚血肢血管形成、角膜疾患
、虹彩血管新生、関節炎、糖尿病性血管新生、骨折、脈管形成、造血（例えばWO20050567
64参照）。

本発明のＦｎ３ベースの結合分子が使用できる感染症の具体例は、細胞性、真菌性、細
菌性およびウイルス性のものを含むが、これらに限定されない。

本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これはさらなる限定を構成するべ
きではない。全ての図面および本明細書を通じて言及した全ての文献、特許および公開さ
れた特許出願の内容は、明示的に参照により本明細書に引用する。

実施例１
フィブロネクチンベースの結合分子のライブラリーの作成
一般に、特に定めのない限り、本発明の実施は、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術
、免疫学（例えば特に抗体技術）およびポリペプチド調製における標準的な技術を使用す
る。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbo
r Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular
Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical App
roach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodi
es: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); および Curr
ent Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992
)を参照されたい。本発明の実施に使用するのに好適な他の方法、技術および配列は、米
国特許7,153,661; 7,119,171; 7,078,490; 6,703,199; 6,673,901; および 6,462,189に
見出すことができる。

第１０ヒトフィブロネクチンタンパク質（Ｆｎ３^１０）を用いて、単一特異性なバイン
ダーを設計し、単離し、操作した。標準的な選択方法を用いて、２つのライブラリーから
独立して、最初のバインダーをまず単離した。次いでこの富化集団を突然変異誘発し、ラ
ンダム突然変異の逐次ラウンドおよび富化を行って、所望の単一特異性なバインダーを得
た。

ライブラリー構成
配列番号１の野生型Ｆｎ３^１０配列を基礎として用いて、上部または底部ループを用い
るバインダーのライブラリーを作成した。
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGD
SPASSKPISINYRTEI (配列番号１)

コンピューターモデリングを用いて、２セットの野生型Ｆｎ３^１０の可変領域を選択し
、ランダム化した。溶媒に曝される上部ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧを含む第一のセット
をライブラリーＡとして、配列番号２で太字で示す領域においてランダム化した。
ライブラリーＡ（溶媒に曝される上部ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧを有するベータサンド
イッチ）：

溶媒に曝される底部ループＡＢ、ＣＤ、ＥＦおよびＣ末端を含む第二のセットをライブ
ラリーＢとして、イタリック体で示す下線の領域においてランダム化した。
ライブラリーＢ（溶媒に曝される底部ループＡＢ、ＣＥ、ＥＦおよびＣ末端を有するベー
タサンドイッチ）：

２つのライブラリーに対応するＤＮＡ配列を、Geneart AG, Germanyでの大腸菌におけ
る発現に最適化した。配列番号２および３の太字または下線を付したイタリック体の領域
はそれぞれ、変性位置として合成した。全長フラグメントゲル精製に対応する合成的に変
性されたオリゴヌクレオチドおよび遺伝子該ライブラリーから構築した。末端プライマー
で増幅を行い、続いてクローニングベクターpCR-Scriptに増幅したライブラリーをライゲ
ートして、出発ライブラリーを得た。ライブラリーＡおよびＢは次いで、下記実施例２に
記載のとおり、単一特異性なバインダーを同定するために独立してスクリーニングした。

実施例２
単一特異性なフィブロネクチンベースの結合分子のスクリーニング
本実施例は、実施例１に記載のライブラリーＡおよびＢから作成した単一特異性なフィ
ブロネクチンバインダーについてどのようにスクリーニングするかを説明する。ライブラ
リーＡおよびＢはいずれも独立して、pYD1 (Invitrogen)のような酵母ディスプレイベク
ターに、相同組換え法を用いてサブクローン化して、EBY100のような好適な株に、標準的
な分子生物学的技術を用いて形質転換する。

ニワトリリゾチームに対するフィブロネクチンベースのバインダーの提示および選択は
、本質的にLipovsek、D. et alにより公開されているプロトコール（J Mol Biol. 2007 M
ay 11;368(4):1024-41）に従って、いくつかのわずかな改変を加えて実施した。両方のラ
イブラリーを独立して、ニワトリ卵白リゾチームに対するバインダーについてスクリーニ
ングした。

(i) 磁性ビーズ選別を用いたニワトリ卵白リゾチームに対結合の選択
全ての選択について、^１０Ｆｎ３ベースの分子のライブラリーＡまたはライブラリーＢ
を提示する酵母培養物をガラクトース含有培地（90％ SG-CAA/10％ SD-CAA、50 μg/mL
カナマイシン、100 U/mL ペニシリンＧ、200 U/mL ストレプトマイシン）中、３０℃で１
８時間誘導した。誘導された１０^９個のライブラリーＡまたはＢの酵母細胞を25 mLの氷
冷リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）pH 7.4、2 mMのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ
）、0.5％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で洗浄し、次いで1 μMのビオチニル化ニワト
リ卵白リゾチーム（HEL-b、Sigma、St. Louis、MO）を含む同じバッファー 5mL中、室温
で１時間、緩やかに振盪しながらインキュベートした。インキュベーションの後、サンプ
ルを氷上で冷やし、25 mLの氷冷ＰＢＳ pH 7.4、2 mMのＥＤＴＡ、0.5％のＢＳＡで洗浄
し、2.5 mLの同じバッファーに再懸濁した。磁性Streptavidin MicroBeads (Miltenyi Bi
otec、Auburn、CA)の100 μLのアリコートを酵母に加え、氷上で１０分間インキュベート
した。氷冷ＰＢＳ pH 7.4、2 mMのＥＤＴＡ、0.5％のＢＳＡをサンプルに加えて全量を25
mLとした後、すぐにこれをAutoMACS Cell Separator (Miltenyi Biotec)で、レア細胞の
ポジティブ選択のために予めセットされたプログラム(possel_s)を用いた分離に供した。
選択した細胞を6 mLのSD-CAA、pH 4.5、50 μg/mLのカナマイシン、100 U/mLのペニシリ
ンＧ、200 U/mLのストレプトマイシン中に回収し；連続希釈で定量した後、SD-CAA寒天プ
レートに播種し；50 mLの同じ培地中、３０℃で２日間増殖させた。

(ii) 蛍光活性化細胞選別を用いたニワトリ卵白リゾチームに対する結合の選択
2×10⁶〜3×10⁶個の誘導された酵母細胞で開始して、ＦＡＣＳによって続く選択ラウン
ドを行った。細胞を1 mLのＰＢＳ、pH 7.4、0.1％ ＢＳＡで洗浄し、ビオチニル化ニワト
リ卵白リゾチームを含む同じバッファー 100 μL中に再懸濁して、室温で緩やかに振盪し
ながら１時間インキュベートした。

1 mLの氷冷ＰＢＳ、pH 7.4、0.1％ ＢＳＡで洗浄した後、細胞を抗体およびストレプト
アビジンで標識した。マウスモノクローナルＦＩＴＣ複合化抗ｃ−ｍｙｃ抗体（AbD Sero
tec）を用いてｃ−ｍｙｃタグ化抗体模倣物の表面ディスプレイのために酵母を標識し、
ＰＥ標識化ストレプトアビジン（Invitrogen）または抗ビオチン抗体（Miltenyi）を用い
てリゾチーム結合抗体模倣物に関するＨＥＬ−ｂを標識した。ＦＩＴＣ複合化マウス抗ｃ
−ｍｙｃ抗体およびＰＥ複合化ストレプトアビジン（Invitrogen）で標識した酵母細胞に
ついて、ＦＡＣＳソートを実施した。

488 nmのレーザーを備えたDako MoFloハイスピードセルソーターで、6000〜10,000 細
胞／ｓで二重標識された酵母細胞を選別した。最も高い0.1〜1％のＨＥＬ−ｂ関連シグナ
ル（ＰＥ）および発現関連シグナル（ＦＩＴＣ）の上半分で酵母細胞を回収するようにゲ
ートを調節した。同じ抗体およびストレプトアビジン試薬で標識したがＨＥＬ−ｂなしで
の２回目のサンプルを用いて、リゾチームではなく検出試薬に結合した細胞を選択するこ
とを回避した。

全てのライブラリーについて、1 μMのＨＥＬ−ｂで標識した酵母に最初の２回のＦＡ
ＣＳ選別を実施した。ＨＥＬ−ｂの存在下であって非存在下ではなくＰＥで標識した細胞
集団が観察されると、続くラウンドでのＨＥＬ−ｂの濃度を１オーダー下げる。選択した
細胞を0.5 mLのSD-CAA、pH 4.5、50 μg/mLのカナマイシン、100 U/mLのペニシリンＧお
よび200 U/mLのストレプトマイシン中に回収した。回収した細胞を5 mLの同じ培地中、３
０℃で２日間振盪しながら飽和まで増殖させた後、次の選別ラウンドのために誘導し、標
識した。

数ラウンドのＦＡＣＳ選別の後、最後の富化された集団をSDCAAプレートに播種し、３
０℃で２日間インキュベートした。個々のコロニーはGenetix Clonepixを用いて取り出し
、SD-CAA配置を含む96ウェルプレートに再アレイした。２４時間インキュベートした後、
遠心分離して細胞を回収し、表面で発現される固有のＦｎ３分子の誘導のためにSD-GAA培
地に再懸濁した。標準的なＥＬＩＳＡでポジティブクローンを同定した。固有のＦｎ３ポ
ジティブクローンに対応するプラスミドＤＮＡを精製し、配列決定して、単一特異性なバ
インダーを同定した。

単一特異性なバインダーを同定し、ライブラリーＡまたはＢのいずれかから選択した後
、それらを独立して用いて治療用分子を作成できる。特に、Ｆｎ３分子の底部ループを用
いてライブラリーＢから作成した単一特異性なバインダーを用いて、目的の標的に対する
新規な治療用結合分子を作成できる。ライブラリーＢからの多様な単一特異性なバインダ
ーをリンカーと組み合わせて、１個の標的（例えばＴＮＦ）の１個以上の領域に結合でき
るＦｎ３結合分子を作成できる。あるいは、ライブラリーＢからのバインダーを含むＦｎ
３結合分子は、複数の標的の１個以上の領域（例えばＨＳＡおよびＴＮＦの１個以上の領
域）に結合するようにも設計できる。

さらに、ライブラリーＡおよびライブラリーＢから作成した単一特異性なバインダーは
、標準的な分子生物学的技術を用いて、下記実施例３に記載のとおりに二重特異性または
多重特異性なバインダーを作成するために組み合わせることができる。

実施例３
二重特異性なフィブロネクチンベースの結合分子の作成
ヒトＦｎ３のＸ線構造におけるランダム化領域のコンピューターモデリングは、ライブ
ラリーＡおよびＢのそれぞれの単一特異性なバインダーを組み合わせて、二重特異性なフ
ィブロネクチン結合分子を作成できることを示している。これらの結合分子は、それらが
同じ標的分子の異なる領域を認識するか、あるいは二重特異性または多重特異性なフィブ
ロネクチン分子の異なる結合部位が２種以上の異なる標的の異なる領域に結合できるよう
に操作可能である。

例えば、バインダーＡ（ライブラリーＡをスクリーニングして得た）に対応する好適な
配列と、バインダーＢ（ライブラリーＢをスクリーニングして得た）に対応する好適な配
列を１個の分子に組み合わせて、二重特異性な分子を作成できる。
ライブラリーＡをスクリーニングして同定したバインダーＡ（溶媒に曝される上部ループ
ＢＣ、ＤＥ、ＦＧを有するベータサンドイッチ）：

ここでＸは任意のアミノ酸配列である。

ライブラリーＢをスクリーニングして同定したバインダーＢ（溶媒に曝される底部ループ
ＡＢ、ＣＥ、ＥＦおよびＣ末端を有するベータサンドイッチ）：

ここでＺは任意のアミノ酸配列である。

ライブラリーＡをスクリーニングして得た配列（溶媒に曝される上部ループＢＣ、ＤＥ
、ＦＧを有するベータサンドイッチ）とライブラリーＢをスクリーニングして得た配列（
溶媒に曝される上部ループＢＣ、ＤＥ、ＦＧを有するベータサンドイッチ）を組み合わせ
てバインダーＣを同定した。２つの配列を１つの分子に組み合わせると、二重特異性なバ
インダーＣが導かれる。

ここでＸおよびＺは任意のアミノ酸配列である。

次いで、バインダーＣの組み合わされたアミノ酸配列に対応するＤＮＡを合成し、Gene
art AG、Germanyでの大腸菌における発現に最適化した。大腸菌へのクローン化および続
く精製は、４章（製造方法）に記載の標準的なプロトコールに従う。
あるいは、二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、２個以上の単一特異性なＦｎ３ベ
ースの結合分子を連結して作成できる。

実施例４
底部ループを用いて標的に結合する単一特異性なフィブロネクチンベースの結合分子の作
成
実施例２に記載の実験の詳細を反復して、フィブロネクチンの底部ループを用いて半減
期エクステンダーであるＨＳＡに結合する単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子を作成し
た。別のライブラリーを用いて、底部ループを用いてリゾチームに結合する単一特異性な
フィブロネクチンベースの結合分子を作成した。

(a) 酵母からの富化ループの単離
数ラウンドの選択の後、選択した集団の配列を決定した。各選択した酵母集団の飽和培
養物1 mLからZymoprep キット（Zymo Research、Orange、CA）を用いてプラスミドＤＮＡ
を抽出し、2 μLのプラスミドをエレクトロ・コンピテントなTop10 大腸菌（Invitrogen
、Carlsbad、CA）に形質転換した。 プラスミドミニプレップを調製し、９６コロニーに
ついて配列決定した。

(b) 大腸菌へのサブクローニング
富化されたフィブロネクチンプールをコードする遺伝子を図６に示すpNAT40ベクターに
クローン化して、構築物をエレクトロ・コンピテントなAcella大腸菌株（Gaithersburg、
MD）に形質転換した。多数のクローンを選択肢、配列決定した。ＨＳＡに対する潜在的な
Ｆｎ３ベースのバインダーの選択したクローンのアミノ酸配列は、コンセンサス結合配列
（配列番号４２）と共に図７に示す。図８はリゾチームに対する潜在的なＦｎ３ベースの
バインダーの選択したクローンのアミノ酸配列を示す。

ＨＳＡライブラリーからの個々のクローンを選択し、使用して、コロニーピッカー（Ge
netix Clonepix2、Boston、MA）を用いて９６ディープウェルプレート中で、100 μg/ml
のカナマイシンを含むOvernightExpress培地（Novagen、Gibbstown、NJ）1 mlに播種して
、激しく撹拌しながら３７℃で一夜増殖した。翌日、3000 rpmで１５分間遠心分離し、上
清を破棄して細胞ペレットを回収した。ディープウェルプレートを−８０℃で３０分間、
２回凍結し、室温で解凍した。次いで、ＴＢＳ、0.2 mg/mlのリゾチームおよび1 mMのＥ
ＤＴＡを含む溶解バッファー250 μlを加え、プレートを室温で１時間インキュベートし
、次いで0.1 mg/mlのDNaseI、10 mMのＭｇＣｌ_２を含むＴＢＳ 250 μlを加えて、室温で
さらに１時間インキュベートした。

溶解した細胞懸濁液を９６ウェルMultiscreen HTS（Millipore、Billerica、MA）に移
し、遠心分離して上清を澄明にした。次いで、ＨＳＡに対する潜在的なＦｎ３ベースのバ
インダーを含む澄明にした上清を下記実施例５に記載のＥＬＩＳＡアッセイに用いた。

実施例５
単一特異性なフィブロネクチンベースの結合分子の結合特性
この実施例は、Ｆｎ３の底部ループの少なくとも１個（例えばＡＢ、ＣＤおよび／また
はＥＦ）を改変してＦｎ３ベースの結合分子を作成して、底部ループを用いて標的に結合
するＦｎ３ベースの分子の生産に成功した初めての例を示す。この実施例において、ＨＳ
Ａに対する潜在的なＦｎ３ベースのバインダーを試験した。

結合特性を評価するため、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。前処理したＥＬＩＳＡプレー
ト（Nunc Maxisorb）の各ウェルをＰＢＳ中プラスティックフィルムで被覆した100 μlの
1.0 μg/mL ＨＳＡでコーティングし、４℃で一夜インキュベートした。翌日、コーティ
ング溶液を除去し、ＰＢＳでプレートを２回洗浄した。ウェルあたり200 μLの25 mg/ml
カゼイン／ＰＢＳを加えてウェルをブロックし、湿潤密封容器中で３７℃で１時間インキ
ュベートした。ブロック溶液を除去し、50 μlのＰＢＳで２回洗浄した後、潜在的な単一
特異性なバインダーを発現する予め調製した大腸菌溶解物を加え、撹拌下で１時間インキ
ュベートした。次いで、ＰＢＳ／Tween 20（0.05％）バッファーでプレートを５回洗浄し
、次いで0.25％のカゼイン／ＰＢＳ中に希釈したＨＲＰ複合化抗Ｈｉｓタグ抗体（Abcam
、Cambridge、MA）をウェルあたり50 μL加えた。１時間インキュベートした後、Ｈｉｓ
タグ抗体溶液を除去し、ＰＢＳ／Tween 20 （0.05％）でプレートを５回洗浄した。最後
に、ウェルあたり50 μLの基質溶液（SureBlue TMB microwell substrate solution、KPL
）を加えてＥＬＩＳＡを現像した。ポジティブクローンを選択し、次いでスケールアップ
生産のための候補を同定するために発現をスクリーニングした。

図９は選択したクローンに由来するＨｉｓタグ化フィブロネクチンタンパク質の、ヒト
血清アルブミン特異的ＥＬＩＳＡ分析の非限定的な代表例を示す。ＨＳＡ抗原でコーティ
ングし、さらにＰＢＳと1％のカゼインでブロックしたＥＬＩＳＡプレートのウェルに、
可溶性フィブロネクチンＦｎ１０ドメインの粗溶解物を加えた。ＨＳＡに対するＦｎ３ベ
ースのバインダーの検出は、モノクローナルＨＲＰ複合化抗Ｈｉｓ抗体を用いて行った。
ＥＬＩＳＡを上記のとおり、ＴＭＢ基質で現像した。ＯＤ値（Ｙ軸）をＥＬＩＳＡリーダ
ーで450 nmで測定した。各バーはそれぞれのクローン抽出物を示す。このデータは、ＨＳ
Ａに対するポジティブＦｎ３ベースのバインダーである多数のクローンがバックグラウン
ドよりも約３倍高い結合を示すことを示している。この結果は、フィブロネクチン分子の
底部ループを用いてＨＳＡのような標的に結合できることを初めて示している。

発現されたＨＳＡに対する単一特異性なＦｎ３ベースのバインダーを精製するため、澄
明にした溶解物を９６ウェルディープブロックに移し、20 μLの50％（ｖ／ｖ）Ｎｉ^２＋
負荷MagneHisビーズ（Promega）のスラリーを加えた。KingFisher Robot (Thermo Scient
ific)を用いて自動精製を行った。３０分間インキュベートした後、1 mlの洗浄バッファ
ー／ウェル（50 mMのリン酸、1 MのＮａＣｌ、20 mMのイミダゾール、pH 7.6）でビーズ
を２回洗浄した。最後に、200 μlのＰＢＳと300 mMのイミダゾール、pH 7.6で結合した
フィブロネクチンタンパク質を溶出した。粗抽出物および溶出物のアリコートをＳＤＳゲ
ル電気泳動で分析した（データは示さず）。

ＨＳＡに対する底部側Ｆｎ３ベースのバインダーの発現が成功することをさらに示すた
め、大腸菌で小スケールの全発現実験を行った。２４個の構築物の全発現由来のサンプル
をNovex BisTris 4-2％ NuPAGEゲル、26ウェル(Invitrogen)で分析した。レーン１はサイ
ズマーカーSeeBlue plus2 (Invitrogen)を含む。この結果は、修飾された底部ループを有
するフィブロネクチン分子の大腸菌における発現が成功したことを示している。図１０に
示すとおり、選択したクローンの多くに約16kDaのタンパク質バンド（フィブロネクチン
Ｆｎ１０(約11〜12kDa)とＮ末端Ｈｉｓタグ、Ｓタグおよび正確な切断部位の合計に対応
する）が見られる。これらの結果はさらに、単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子が大腸
菌において成功裏に発現され、結合活性を保持していることを示している。

発現されたタンパク質がタンパク質構造に悪影響（例えば分解）なく精製され得ること
を示すため、上記のとおりサンプルを精製して、Novex BisTris 4-12％ NuPAGEゲル、26
ウェル(Invitrogen)で分析した。レーン１はサイズマーカーMark 12 (Invitrogen)を含む
。図１０に示すとおり、16 kDaのバンドがほとんどのクローンに明らかに見られる。表１
に示すとおり、質量分析によって、精製したフィブロネクチンの正しい分子量での存在を
確認する。

以上より、この結果は、少なくとも１個の底部ループが標的に結合するように改変され
エチルＦｎ３ベースの結合分子を作成できることを、初めて示している。今日まで、底部
ループと比較して上部ループが抗体配列とよりアラインメントしやすいため、典型的には
上部ループが標的との結合について分析されてきた。本明細書で提示する結果は、分子の
安定性に悪影響を及ぼすことなく、底部ループを改変できることを示している。したがっ
て、少なくとも１個の底部ループが標的に結合するように改変されているＦｎ３ベースの
結合分子のライブラリーを作成できる。ＨＳＡライブラリーについて、底部ループは野生
型Ｆｎ３と同じ長さに保って改変した。リゾチームライブラリーについて、底部ループは
野生型Ｆｎ３と比較して長さを変えたが、タンパク質の構造に悪影響はなかった。さらに
、改変された底部ループを有するこれらの単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子は、立体
構造安定性を維持しており、結合能を保ったまま発現され、精製できる。したがって、本
発明の方法を用いて、少なくとも１個の改変された底部ループを有するＦｎ３ベースの結
合分子のライブラリー、ならびに底部表面を用いて標的に結合するＦｎ３ベースの結合分
子を作成できる。

実施例６
多重特異性なフィブロネクチンベースの結合分子の作成および特徴付け
この実施例は、２個の別個の単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子が、多重特異性、例
えば二重特異性な分子を作成するためのリンカー配列を用いて数珠状に一体に連結されて
いる、多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子の作成および特徴付けを示す。二重特異性な
分子は次のとおりに設計した。図７において同定し、次に（配列番号８）示す底部側ＨＳ
Ａバインダーに、短いＧＳリンカー配列GGGGSGGGGS（配列番号１１８）を用いて下記ＶＥ
ＧＦＲ２結合配列（配列番号１１７）を融合して、下記の配列番号１１９を有する多重特
異性なＦｎ３ベースの結合分子を作成した。この構築物はDNA2.0で合成し、発現ベクター
pjExpress 401にサブクローン化した。クローニング、精製およびＥＬＩＳＡは上記の標
準的なプロトコールに従った。

ＶＥＧＦＲ上部側配列：

図７からの底部側配列８：

ＧＳリンカーと融合した図７からのＶＥＧＦＲ２底部配列８（クローン８７）：

多重特異性な分子のＥＬＩＳＡ結合試験は、図１３に示し、実施例７により詳細に記載
する。

多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子が該分子の大スケール発現から精製できることを
示すため、Graeslundらによって示された方法を用いた（Graeslund et al. Nature Metho
ds (2008) 5, 135 - 146）。出発培養物10 ml（〜1/100の最終培養体積）を用いて、25
μg/mlのカナマイシンを含むMinimal Mediaに播種し、３７℃、175 rpmで一夜インキュベ
ートした。翌朝、10 mlの出発培養物を用いて、2.8 LのFernbach撹拌フラスコ中の100 μ
g/mlのカナマイシンを含むOvernightExpress培地 1 リットルに播種した。600 nm (OD600
)で１〜１．５の光学密度が得られるまで３７℃、175 rpmで細胞をインキュベートした。
次いで培養温度を１８℃に下げて発現のスイッチを入れて、続く発現のために培養物を１
８℃で一夜維持した。4500 gで１０分間遠心分離して細胞を回収した。細胞を秤量し、１
体積(v/w)の溶解バッファー（0.1 Mのリン酸ナトリウム、pH 8.0、1.0 MのＮａＣｌ、20
mMのイミダゾール、10％(v/v)のグリセロール、1 mMのＴＣＥＰおよび20 単位/mlのBenzo
nase）を加えた。l mg/mlのリゾチームを細胞懸濁液に加え、氷上で３０分間インキュベ
ートした後、懸濁液を１〜２分間断続的に超音波処理した。溶解物を２〜３体積の溶解バ
ッファーで希釈し、1 mlのNi-NTA樹脂を加えた。250 mlのコニカルバイアル中、４℃で１
時間上清をゆっくりと撹拌して、結合を行った。樹脂を20 mlの使い捨てカラム中に回収
し、タンパク質が溶出しなくなるまで（それぞれ２０〜３０カラム体積）負荷バッファー
（0.05 Mのリン酸ナトリウム、pH 8.0、0.5 MのＮａＣｌ、20 mMのイミダゾール、5％(v/
v)のグリセロール、0.5 mMのＴＣＥＰ）で洗浄した。溶出バッファー（0.05 Mのリン酸ナ
トリウム、pH 8.0、0.5 MのＮａＣｌ、0.3 Mのイミダゾール、5％(v/v)のグリセロール、
0.5 mMのＴＣＥＰ）で結合したタンパク質を溶出させた。ピークフラクションを同定し、
一緒に貯留し、平衡化したMonoS 5/50 GLカラム(GE)にバッファーＳ（50 mMのHepes、50
mMのＮａＣｌ pH 7.6）と共にロードした。Ni-NTA溶出物をバッファーＳで１０倍に希釈
し、予め平衡化したカラムにロードした。１０体積のバッファーＳで洗浄した後、タンパ
ク質をバッファーＳ中50 mMから1 MのＮａＣｌの直線グラジエントで溶出した。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよび質量分析でフラクションを分析した。

図１２の左パネルは、クローン８７の異なる精製工程のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レー
ン１、全タンパク質；レーン２、粗抽出物；レーン３、Ni-NTA流出；レーン４、Ni-NTA
洗浄；レーン５、Ni-NTA溶出；レーン６、Mono S 溶出。右パネルは、クローン８７のＮ
末端メチオニン切断タンパク質の予期される質量と一致した精製サンプルのマススペクト
ル（MW 23404 D）を示す。

実施例７
二重特異性なフィブロネクチンベースの結合分子の作成および特徴付け
この実施例は、１個のフィブロネクチン分子が２個の別個の標的、例えばＶＥＧＦＲ２
とＨＳＡに結合するように改変された上部ループおよび底部ループを有する二重特異性な
Ｆｎ３ベースの結合分子の作成および特徴付けを示す。

底部側ＨＳＡ結合ループ配列を上部側ＶＥＧＦＲ２バインダーに作って二重特異性な分
子を作成して、同じＦｎ３分子の上部および底部ループの両方を用いて２個の異なる標的
分子に結合できる二重特異性機能を有する分子を作成した。二重特異性な分子を作成する
ために、底部ループを切除してＶＥＧＦＲ２バインダーにそれを挿入し、分子ＶＥＧＦＲ
２−ＨＡＳ（配列番号１２０）を得て、底部側バインダー（配列番号８）ループ（上記）
をＶＥＧＦＲ２バインダー（配列番号１１７）（上記）に作った。構築物はDNA2.0で合成
紙、発現ベクターpjExpress 401にサブクローン化した。クローニング、精製およびＥＬ
ＩＳＡは、上記の標準的なプロトコールに従った。
ＶＥＧＦＲ２／底部側配列番号８融合分子（クローン８９）

(a) 実施例６および７の二重特異性なフィブロネクチン結合分子のＥＬＩＳＡ：
実施例６および７の多重特異性および二重特異性なバインダーの結合特性を次のとおり
に評価した。ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質を前処理したＥＬＩＳＡプレート（Nunc
Multisorb）に不動化して、さらにＰＢＳと１％のカゼインでブロックした。野生型Ｆｎ
１０（レーン１）、クローン８７（多重特異性）（レーン２）、クローン８９（二重特異
性）（レーン３）およびＰＢＳの澄明な溶解物のアリコートをウェルに加え、室温で１時
間インキュベートした。これらは異なる濃度１、２および３で実行した。ＰＢＳ／0.05％
のTweenで５回洗浄し、該ウェルをＰＢＳ中 1 μg/mlのＨＳＡと共にインキュベートした
。ＨＲＰ複合化ニワトリ抗ヒトｈＳＡ抗体(Abcam)で検出を行った。ＥＬＩＳＡをＴＭＰ
基質で現像し、ＯＤ値を450 nmで測定した。結果を図１３に示す。

粗抽出物中に存在する多重特異性および二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子の両方に
ついて一貫して再現可能な結果が得られ、クローン８７（多重特異性）とクローン８９（
二重特異性）がＨＳＡとＶＥＧＦＲ２の両方に結合することが示された。このデータは、
単一特異性なフィブロネクチン結合分子の１個がＨＳＡに結合できる少なくとも１個の改
変された底部ループ（ＡＢ、ＤＥ、ＦＧ）を有するとき、多重特異性および二重特異性な
Ｆｎ分子が作成できることを示している（図１３参照）。

多重特異性なＦｎ３分子（クローン８７）は、Ｇ−Ｓリンカーを介して一体に連結した
２個の別々の単一特異性なＦｎ３分子を有する。一方の単一特異性なＦｎ３分子はＨＳＡ
に結合する改変された底部ループを有するが、他方の単一特異性なＦｎ３分子はＶＥＧＦ
Ｒ２に結合する改変された上部ループを有する。得られた多重特異性な分子は、各々の単
一特異性なフィブロネクチン分子を用いて２種の異なる標的に結合する能力を保有する。
このデータは、単一特異性なＦｎ３分子を数珠状に一体に連結して多重特異性なＦｎ３分
子を作成できること；リンカーは各単量体Ｆｎ３分子の結合能に干渉しないこと；そして
多重特異性なＦｎ３分子はなんら立体障害の問題なく２種の異なる標的に結合できること
を示している。

二重特異性なフィブロネクチン分子（クローン８９）は、底部ループがＨＳＡに結合し
、上部ループがＶＥＧＦＲ２に結合するように操作された１個のフィブロネクチン分子で
ある。１個の二重特異性なフィブロネクチン分子はＨＳＡとＶＥＧＦＲ２の両方にうまく
結合する。図１３は、なんら立体障害の問題なく１個の二重特異性なフィブロネクチン分
子がＨＳＡとＶＥＧＦＲ２の両方に結合できることを示している。このデータは、二重特
異性なフィブロネクチン分子が作成できること；該二重特異性なフィブロネクチン分子の
各側のループの結合能が保持されること；二重特異性な分子の構造確認が、同時に改変さ
れている底部および上部ループの両方で維持されること；上部および底部ループが互いに
独立して別個の標的に結合するために機能すること；そして二重特異性なＦｎ３分子がな
んら立体障害の問題なく２種の異なる標的に結合できることを、初めて示す。

(b) 実施例６および７の二重特異性なフィブロネクチン結合分子のBiacore：
BIAcore T100 (GE)を用いて標的に結合するフィブロネクチンベースの足場タンパク質
の結合カイネティクスを測定した。抗ヒトＩｇＧ（GE、ヒトＩｇＧ補足キット）。Ｆｃ特
異的抗体をCM5センサーチップに不動化して、可溶性ＶＥＧＦＲ２−ｈｕＦｃ融合タンパ
ク質をその表面に補足した。可溶性フィブロネクチンクローン８７（多重特異性）をバッ
ファー０（10 mMのＨＥＰＥＳ、150 mMのＮａＣｌ、0.005％のTween 20、pH 7.4）中に10
0 nM（トップライン）および200 nM（ボトムライン）で注入した。各濃度でセンサーグラ
ムを得て、速度定数ka(kon) および kd (koff)を決定した。アフィニティー定数ＫＤを速
度定数koff/konの比から計算した。

クローン８７についての結果を、上部ループ結合ＶＥＧＦＲ２および底部ループ結合Ｈ
ＳＡについてそれぞれ図１４および１５に示す。このデータは、Ｇ−Ｓリンカーで一体に
連結した２個の別個の単一特異性なＦｎ３分子を含む多重特異性なフィブロネクチンが、
底部および上部ループを用いて２個の別個の標的分子にうまく結合することを示す。

同じ実験をクローン８９について反復し、１個の二重特異性なＦｎ３分子および同様の
結果を得た（データは示さず）。

以上から、これらの結果は、多重特異性および二重特異性なフィブロネクチン分子を作
成可能であると初めて示す。これらの分子は大腸菌における発現に成功し、分解すること
なく精製でき、結合能を保持し、そして２個の別個の標的に結合できた。

均等
当業者は、常套未満の実験を用いて、本明細書に記載の本発明の具体的な態様の多様な
均等を認識し、あるいは確認することができる。かかる均等は、特許請求の範囲に含まれ
ることを意図する。

Claims (43)

1. フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）ベースの結合分子であって、Ｆｎ３ドメイン
   を含んでなり、ここで該Ｆｎ３ドメインの底部ＡＢ、ＣＤもしくはＥＦループ領域または
   Ｃ末端の１個以上における少なくとも１個のアミノ酸が配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ド
   メインと比較して改変されて、特定の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列が作成されている
   、結合分子。
2. 少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１の15、16、38、39、40、41、42、43、44、45
   、60、61、62、63、64、93、95および96番アミノ酸からなる群から選択される、請求項１
   のＦｎ３ベースの結合分子。
3. 非Ｆｎ３結合配列が、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはＴ細胞受容体の全部また
   は一部を含む、請求項１または２のＦｎ３ベースの結合分子。
4. 特定の標的が半減期エクステンダーである、請求項１のＦｎ３ベースの結合分子。
5. 半減期エクステンダーがヒト血清アルブミンである、請求項４のＦｎ３ベースの結合分
   子。
6. 特定の標的がリゾチームである、請求項１のＦｎ３ベースの結合分子。
7. Ｆｎ３ベースの結合分子であって、第一のＦｎ３ドメインを含んでなり、ここで該Ｆｎ
   ３ドメインの底部ＡＢ、ＣＤもしくはＥＦループ領域またはＣ末端の１個以上における少
   なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改変され
   て、第一の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列が作成されており、そして第二のＦｎ３ドメ
   インの底部ＡＢ、ＣＤもしくはＥＦループ領域またはＣ末端の１個以上における少なくと
   も１個のアミノ酸が、配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改変されて、第
   二の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列が作成されている、結合分子。
8. 第一および第二の標的が同一分子に存在する、請求項７のＦｎ３ベースの結合分子。
9. 第一および第二の標的が異なる分子に存在する、請求項７のＦｎ３ベースの結合分子。
10. Ｆｎ３ベースの結合分子であって、第一のＦｎ３ドメインを含んでなり、ここで該Ｆｎ
    ３ドメインの底部ＡＢ、ＣＤもしくはＥＦループ領域またはＣ末端の１個以上における少
    なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改変され
    て、半減期エクステンダーに結合する非Ｆｎ３結合配列が作成されており、そして第二Ｆ
    ｎ３ドメインの底部ＡＢ、ＣＤもしくはＥＦループ領域またはＣ末端の１個以上における
    少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改変さ
    れて、第二の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列が作成されている、結合分子。
11. 半減期エクステンダーがヒト血清アルブミンである、請求項１０のＦｎ３ベースの結合
    分子。
12. 第二の標的がＶＥＧＦＲ２である、請求項１０のＦｎ３ベースの結合分子。
13. 二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子であって、Ｆｎ３ドメインを含んでなり、ここで
    該Ｆｎ３ドメインの底部ＡＢ、ＣＤもしくはＥＦループ領域またはＣ末端の１個以上にお
    ける少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改
    変されて、第一の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列が作成されており、そして該Ｆｎ３ド
    メインの上部ＢＣ、ＤＥもしくはＦＧループ領域の１個以上における少なくとも１個のア
    ミノ酸が、配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改変されて、第二の標的に
    結合する非Ｆｎ３結合配列が作成されており、結合分子。
14. 底部ＡＢ、ＣＤまたはＥＦループ領域における少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号
    １の15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95および96番
    アミノ酸からなる群から選択され、そして上部ＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ領域における
    少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１の21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、
    51、52、53、54、55、56、76、77、78、79、80、80、81、82、83、84、85、86、87および
    88番アミノ酸からなる群から選択される、請求項１３の二重特異性なＦｎ３ベースの結合
    分子。
15. 非Ｆｎ３結合配列が抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはＴ細胞受容体の全部または
    一部を含む、請求項１３の二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子。
16. 第一および第二の標的が同一分子に存在する、請求項１３〜１５のいずれかの二重特異
    性なＦｎ３ベースの結合分子。
17. 第一および第二の標的が異なる分子に存在する、請求項１３〜１４のいずれかの二重特
    異性なＦｎ３ベースの結合分子。
18. 二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子であって、Ｆｎ３ドメインを含んでなり、ここで
    該Ｆｎ３ドメインの底部ＡＢ、ＣＤもしくはＥＦループ領域またはＣ末端の１個以上にお
    ける少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改
    変されて、半減期エクステンダーに結合する非Ｆｎ３結合配列が作成されており、そして
    該Ｆｎ３ドメインの上部ＢＣ、ＤＥもしくはＦＧループ領域の１個以上における少なくと
    も１個のアミノ酸が、配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改変されて、第
    二の標的に結合する非Ｆｎ３結合配列が作成されており、結合分子。
19. 半減期エクステンダーがヒト血清アルブミンである、請求項１８の二重特異性なＦｎ３
    ベースの結合分子。
20. 第二の標的がＶＥＧＦＲ２である、請求項１８の二重特異性なＦｎ３ベースの結合分子
    。
21. 請求項１〜２０のいずれかの２個以上のＦｎ３ベースの結合分子を含んでなる、多重特
    異性なＦｎ３ベースの結合分子。
22. Ｆｎ３ベースの結合分子がそれぞれ異なる標的に結合する、請求項２１の多重特異性な
    Ｆｎ３ベースの結合分子。
23. 異なる標的が同一分子に存在する、請求項２２の多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子
    。
24. 異なる標的が異なる分子に存在する、請求項２２の多重特異性なＦｎ３ベースの結合分
    子。
25. Ｆｎ３ベースの結合分子の半減期を延長する非Ｆｎ３部分に結合する、請求項１〜２４
    のいずれかのＦｎ３ベースの結合分子。
26. 多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子であって、２個以上の単一特異性なＦｎ３ベース
    の結合分子を含んでなり、ここで少なくとも１個の単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子
    が、配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改変されて、第一の標的と結合す
    る非Ｆｎ３結合配列を作成されているＦｎ３ドメインの底部ＡＢ、ＣＤもしくはＥＦルー
    プ領域またはＣ末端の１個以上における少なくとも１個のアミノ酸を含み；そして第二の
    単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子が、配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ドメインと比較
    して改変されて、第二の標的と結合する非Ｆｎ３結合配列を作成されているＦｎ３ドメイ
    ンの上部ＢＣ、ＤＥもしくはＦＧループ領域の１個以上における少なくとも１個のアミノ
    酸を含み、第一および第二の単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子がリンカー配列によっ
    て連結されている、結合分子。
27. 配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ドメインと比較して改変されて、１種以上の標的と結合
    する非Ｆｎ３結合配列を作成されているＦｎ３ドメインの上部ＢＣ、ＤＥもしくはＦＧル
    ープ領域の１個以上における少なくとも１個のアミノ酸を有する第三の単一特異性なＦｎ
    ３ベースの結合分子を含んでなり、第二の単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子と第三の
    単一特異性なＦｎ３ベースの結合分子がリンカー配列によって連結されている、請求項２
    ６の多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子。
28. 第一の標的が半減期エクステンダーである、請求項２６の多重特異性なＦｎ３ベースの
    結合分子。
29. 半減期エクステンダーがヒト血清アルブミンである、請求項２８の多重特異性なＦｎ３
    ベースの結合分子。
30. 第二の標的がＶＥＧＦＲ２である、請求項２６の多重特異性なＦｎ３ベースの結合分子
    。
31. リンカー配列がＧ−Ｓリンカー配列である、請求項２６の多重特異性なＦｎ３ベースの
    結合分子。
32. 配列番号１１９（クローン８７）を含む、Ｆｎ３ベースの結合分子。
33. 配列番号１２０（クローン８９）を含む、Ｆｎ３ベースの結合分子。
34. １個以上の非Ｆｎ３部分に連結された請求項１〜３３のいずれかのＦｎ３ベースの結合
    分子を含む、複合体。
35. 非Ｆｎ３部分が、Ｆｎ３ベースの結合分子の半減期を延長する分子を含むかまたはそれ
    と結合する、請求項３４の複合体。
36. 非Ｆｎ３部分が、抗体Ｆｃ領域、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびポリエチレング
    リコール（ＰＥＧ）からなる群から選択される分子を含む、請求項３４〜３５のいずれか
    のＦｎ３ベースの結合分子または複合体。
37. 機能的部分を付加するために配列番号１を含む野生型Ｆｎ３ドメインと比較して少なく
    とも１個の修飾アミノ酸残基をさらに含んでなる、請求項１〜３６のいずれかのＦｎ３ベ
    ースの結合分子または複合体。
38. 修飾アミノ酸残基が、システイン残基または非天然アミノ酸残基の付加または置換を含
    む、請求項３７のＦｎ３ベースの結合分子または複合体。
39. ２個以上の異なるＦｎ３ドメイン由来のベータストランドを含んでなる、請求項１〜３
    ８のいずれかのＦｎ３ベースの結合分子または複合体。
40. 請求項１〜３９のいずれかのＦｎ３ベースの結合分子または複合体と、担体を含む組成
    物。
41. 自己免疫疾患、がんおよび感染症からなる群から選択される疾患について対象を処置す
    る方法であって、請求項１〜４１のいずれかのＦｎ３ベースの結合分子、複合体または組
    成物を投与することを含んでなる方法。
42. サンプル中のタンパク質を検出する方法であって、請求項１〜３９のいずれかのＦｎ３
    ベースの結合分子または複合体を標識化し、該標識化した結合分子または複合体を前記サ
    ンプルと接触させ、そしてＦｎ３ベースの結合分子または複合体と前記タンパク質間の複
    合体形成を検出することを含んでなる方法。
43. 請求項１、７、１０、１８、２１および２６のいずれか一つのＦｎ３ベースの結合分子
    または複合体をコードする、まだら状核酸。

Images