CN102076713A - 改进的基于纤连蛋白的结合分子及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了与特定靶抗原结合的基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子。本发明还提供了与两个或更多个靶标同时结合的双特异性Fn3基结合分子。本发明Fn3基结合分子还可连接在一起形成多特异性Fn3基结合分子，和/或可与非Fn3部分例如人血清白蛋白(HSA)缀合，以改进半衰期和稳定性。本发明还提供了Fn3基结合分子的产生、筛选以及应用于多种治疗及诊断应用中的方法。

Description

改进的基于纤连蛋白的结合分子及其用途

优先权信息

本申请要求2008年5月2日递交的美国临时专利申请系列号61/050,142的优选权，其内容在此全文并入作为参考。

相关信息

本说明书通篇引述的任何专利、专利申请和参考文献的内容在此全文并入作为参考。

发明背景

能够与期望的靶表位特异性结合的分子作为治疗剂和医学诊断工具均具有极大意义。此类分子的公知实例是单克隆抗体。对于几乎任何结构表位，都可以选择出特异性地并以高亲和力与之结合的抗体。所以，抗体常规地用作为研究工具和FDA批准的治疗剂，从而治疗性和诊断性单克隆抗体的全球市场目前价值约$300亿。

然而，单克隆抗体具有许多缺点。例如，经典抗体是大而复杂的分子。它们具有杂四聚体结构，含有通过分子间二硫键和分子内二硫键连接在一起的两条轻链和两条重链。这种结构复杂性使得不能容易地在简单的原核系统中表达抗体，而需要在更为精细(和昂贵)的哺乳动物细胞系统中产生抗体。抗体的大尺寸也限制了其治疗效力，因为它们往往不能够有效穿透某些组织间隙。另外，治疗性抗体因为拥有Fc区，偶尔会触发不期望的效应细胞功能和/或凝血级联反应。另外，双特异性或多特异性抗体的制备往往涉及困难复杂的操作(参见例如Josefina等，(1997)，Nature Biotechnology，15：159-163；和Wu等(2007)Nature Biotechnology，25：1290-1297)。

从而本领域需要能够以高亲和力和特异性与期望靶标特异性结合的备选结合分子。也需要生产双特异性或多特异性结合分子的简单方法。

发明概述

本发明提供了可以与靶抗原特异性结合因而可用于广泛种类的治疗和诊断应用的、基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子。本发明基于意料不到的惊人发现，即含有至少一个修饰的底环的Fn3保留结构和构象稳定性，并能够与靶分子结合。此外，本发明还基于发现的新的双特异性基于Fn3的结合分子，其中单个Fn3分子能够通过利用Fn3的顶部和底部环而结合一个或多个靶分子。本发明还提供了简单有效的方法生成双特异性和多特异性基于Fn3的结合分子。

从而，在一个实施方案中，本发明涉及单特异性Fn3基结合分子，其利用底部AB、CD、EF环或C-末端结合一个或多个靶标，例如人血清白蛋白(HSA)、溶菌酶(“底部单特异性Fn3基结合分子”)。这些底部单特异性Fn3基结合分子能够连接在一起(例如以珍珠样方式)形成同时与多个靶标结合的多特异性Fn3基结合分子，和/或可与一个或多个非Fn3部分(例如功能部分)，例如人血清白蛋白(HSA)、抗体Fc区或聚乙二醇(PEG)，缀合，以例如提高Fn3基结合分子的半衰期和稳定性。

在另一实施方案中，底部单特异性Fn3基结合分子可与利用顶部BC、DE或FG环的Fn3基结合分子组合，以产生双特异性Fn3基结合分子。本发明还提供了同时与两个或更多个靶标结合的双特异性Fn3基结合分子。这些双特异性Fn3基结合分子还可连接在一起(例如以珍珠样方式)形成同时与多个靶标结合的多特异性Fn3基结合分子，和/或可与一个或多个如上文所述非Fn3部分(例如功能部分)缀合。本发明还提供了筛选Fn3基结合分子文库对靶标、一般是靶蛋白的特异性结合的方法，以及在例如原核或真核系统中制备Fn3基结合分子的方法。此外，本发明提供了包含Fn3基结合分子的组合物(例如治疗组合物)，以及此类组合物在多种治疗和诊断应用中的用途。

从而，一方面，本发明提供了包含Fn3结构域的Fn3基结合分子，其中与野生型Fn3结构域(例如SEQ ID NO：1)相比，该Fn3结构域在底部AB、CD、EF环区或C-末端之一个或多个中有至少一个氨基酸被改变，以产生与特定靶标结合的非Fn3结合序列。在一个具体实施方案中，底部AB、CD、EF环区或C-末端中改变的氨基酸残基包括SEQ ID NO：1第15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95或96位的一或多个氨基酸。该非Fn3结合序列可以是例如CDR区(例如抗体CDR区)或T细胞受体的全部或部分。

另一方面，本发明涉及包含第一Fn3结构域的Fn3基结合分子，其中与包含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比，该Fn3结构域在底部AB、CD、EF环区或C-末端之一个或多个中有至少一个氨基酸被改变，以产生与第一靶标结合的非Fn3结合序列，并且其中与包含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比，第二Fn3结构域在底部AB、CD、EF环区或C-末端之一个或多个中有至少一个氨基酸被改变，以产生与第二靶标结合的非Fn3结合序列。

另一方面，本发明提供了包含Fn3结构域的双特异性Fn3基结合分子，其中与野生型Fn3结构域(例如SEQ ID NO：1)相比，该Fn3结构域在底部AB、CD、EF环区或C-末端之一个或多个中有至少一个氨基酸被改变，以产生与第一靶标结合的非Fn3结合序列，且其中与野生型Fn3结构域(包含例如SEQ ID NO：1)相比，该Fn3结构域在顶部BC、DE、或FG环区之一个或多个中有至少一个氨基酸被改变，以产生与第二靶标结合的非Fn3结合序列。在一个具体实施方案中，底部AB、CD、EF环区或C-末端中改变的氨基酸残基包括SEQ ID NO：1第15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95或96位的一个或多个氨基酸，而顶部BC、DE或FG环区中改变的氨基酸残基包括SEQ ID NO：1第21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、51、52、53、54、55、56、76、77、78、79、80、80、81、82、83、84、85、86、87或88位的一个或多个氨基酸。从而，本发明此类双特异性Fn3基结合分子可以与同一分子或不同分子上存在的两个或更多个靶标同时结合。

另一方面，本发明提供了多特异性Fn3基结合分子，其含有连接在一起(例如以珍珠样方式)的两个或更多个前述权利要求中任一项的Fn3基结合分子，从而结合同一分子或不同分子上的两个或更多个靶标。

本发明“Fn3基结合分子”(这在下文包括双特异性和多特异性Fn3基结合分子)还可与一个或多个非Fn3部分结合或连接，所述非Fn3部分可以例如在体内给药时增加Fn3基结合分子的半衰期。适宜的非Fn3部分包括但不限于抗体Fc区、人血清白蛋白(HSA)(或其部分)、聚乙二醇(PEG)和/或与前述蛋白质或具有增加的半衰期的其他血清蛋白结合的多肽例如转铁蛋白。从而，另一方面，本发明提供了缀合物，其包括与非Fn3部分连接的一个或多个Fn3基结合分子。

又在另一实施方案中，本发明Fn3基结合分子和缀合物与野生型Fn3结构域(例如SEQ ID NO：1)相比还包含至少一个修饰的氨基酸残基用于连接功能部分。在一个实施方案中，修饰的氨基酸包括在选自如下的一个或多个区域中半胱氨酸或非天然氨基酸残基的取代或添加：环区、β链区、β样链区、C-末端区、位于C-末端和最C-末端的β链(或β样链)之间的区域、N-末端区、以及位于N-末端和最N-末端的β链(或β样链)之间的区域。

本发明Fn3基结合分子可基于野生型Fn3序列(例如具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的人Fn3)以及此类野生型序列的修饰形式，如本文所讨论的那样。例如，Fn3基结合分子可以是嵌合体，具有来自至少两个不同纤连蛋白组件的Fn3β链。

本发明还提供了组合物，包含本发明Fn3基结合分子和缀合物，用适宜的载体配制。

本发明Fn3基结合分子和缀合物可用在多种治疗和诊断应用中，包括但不限于任何可以使用抗体的应用。例如，此类应用包括治疗和诊断自身免疫病、癌症和感染性疾病。

本发明的其他特征和优点将会因如下详细说明和权利要求书而变得显而易见，例如编码Fn3基结合分子的多样化核酸文库。

附图的简短说明

图1显示了Fn3基结合分子的带状图，其中构成配体结合表面的环和构架残基突出显示。

图2图示了Fn3顶部和底部环面的示意图。

图3A为单特异性Fn3基结合分子的示意图，显示了顶部或者底部的环能够进行修饰以结合单个靶标即靶标A。

图3B为双特异性Fn3基结合分子的示意图，显示了顶部和底部的环均能够进行修饰以结合单个靶标即靶标A。双特异性Fn3基结合分子还可用于结合两个不同的靶标，其中顶环结合一个靶标即靶标A，而底环结合第二靶标即靶标B。

图4A为多特异性Fn3基结合分子的示意图，其包含连接在一起的、带有底环修饰的两个底部单特异性Fn3结构域。

图4B为多特异性Fn3基结合分子的示意图，其包含连接在一起的、带有顶部和底部环修饰的两个双特异性Fn3结构域。

图5A为多特异性Fn3基结合分子的示意图，其包含连接在一起的、带有底环修饰的多个单特异性Fn3结构域。

图5B为多特异性Fn3基结合分子的示意图，其包含连接在一起的、带有顶部和底部环修饰的多个双特异性Fn3结构域。

图6为用于克隆纤连蛋白cDNA的载体图。

图7的表格显示了选择的多个单特异性Fn3基结合分子的氨基酸序列，其利用底环或C-末端结合人血清白蛋白。

图8的表格显示了选择的多个单特异性Fn3基结合分子的氨基酸序列，其利用底环或C-末端结合溶菌酶。

图9显示了利用底环或C-末端结合人血清白蛋白该特定靶标的、His标记的单特异性Fn3基结合分子的人血清白蛋白特异性ELISA分析。

图10是SDS-PAGE凝胶，显示在大肠杆菌中成功表达了利用底环或C-末端结合特定靶标的单特异性Fn3基结合分子。

图11是SDS-PAGE凝胶，显示从大肠杆菌裂解物中成功纯化了利用底环或C-末端结合特定靶标的单特异性Fn3基结合分子。

图12是SDS-PAGE凝胶，显示从大肠杆菌裂解物中成功纯化了利用底环或C-末端结合特定靶标的双特异性Fn3基结合分子。

图13显示了利用底环或C-末端以及顶环结合不同靶分子的双特异性Fn3基结合分子的ELISA分析。分离自克隆87和克隆89的双特异性Fn3基结合分子具有结合VEGFR2的顶环和结合人血清白蛋白的底环。该数据显示单个Fn3基结合分子能够工程化从而顶环结合VEGFR2而底环结合HSA。

图14显示了分离自克隆87的、利用顶环结合VEGFR2的双特异性Fn3基结合分子的Biacore结合研究。

图15显示了分离自克隆87的、利用底环或C-末端结合HSA的双特异性Fn3基结合分子的Biacore结合研究。

发明详述

为了确保清楚地理解说明书和权利要求书，下文便利地提供了如下定义。

定义

如本文所用，术语“III型纤连蛋白结构域”或“Fn3结构域”是指，来自任何生物体的野生型Fn3结构域、以及从来自两种或两种以上不同的Fn3结构域的β链构建的嵌合Fn3结构域。如本领域已知的那样，天然存在的Fn3结构域具有β夹心结构，该结构由7个称作A、B、C、D、E、F和G的β链组成，其中这7个β链通过称作AB、BC、CD、DE、EF和FG环的6个环连接(见例如，Bork和Doolittle，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 89：8990，1992；Bork等，Nature Biotech.15：553，1997；Meinke等，J.Bacteriol.175：1910，1993；Watanabe等，J.Biol.Chem.265：15659，1990；Main等，1992；Leahy等，1992；Dickinson等，1994；美国专利6,673,901；专利协作条约公布WO/03104418；以及美国专利申请2007/0082365，上述文献的所有教导特此并入此处作为参考)。三个环(BC、DE和FG环)位于结构域的顶部，而三个环(AB、CD和EF环)位于结构域的底部(见图1)。在一个特定实施方案中，Fn3结构域来自人纤连蛋白的第10个Fn3结构域(¹⁰Fn3)(SEQ ID NO：1)。

如本文所用，术语“Fn3基结合分子”或“基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子”是指已经经过改变而包含了一个或多个非Fn3结合序列的Fn3结构域。在具体实施方案中，与相应的野生型Fn3结构域相比，底部AB、CD和/或EF环中的一个或多个被改变，以含有一个或多个非Fn3结合序列。在另一实施方案中，与相应的野生型Fn3结构域相比，改变底部AB、CD和EF环之一个或多个以及顶部BC、DE和FG环之一个或多个，以含有一个或多个非Fn3结合序列。此类分子在本文称为“双特异性Fn3基结合分子”。在另一实施方案中，两个或多个Fn3基结合分子或双特异性Fn3基结合分子连接在一起。此类分子在本文称为“多特异性Fn3基结合分子”。

术语“非Fn3结合序列”是指不存在于天然(例如，野生型)Fn3结构域中的氨基酸序列，其与特定靶标结合。此类非Fn3结合序列典型地可以通过修饰(例如，通过替代和/或添加)野生型Fn3结构域(例如在底环和/或顶环区内)而引入。这可通过例如野生型Fn3结构域内氨基酸残基的随机或预定突变实现。此外或者备选地，非Fn3结合序列可以是部分地或者完全地外源的，即，源自不同基因或氨基酸来源。例如，外源序列可以源自对于已知靶抗原具有已知结合特异性的抗体的高变区，例如一个或多个CDR区。此类CDR可以来自单抗体链(例如，轻链或重链的可变区)或来自不同抗体链的组合。CDR还可来自两种不同抗体(例如，具有不同特异性)。在一个特定实施方案中，CDR来自纳米抗体，例如，驼样重链。

如本文所用的术语“单特异性”是指包含Fn3结构域、与一个或多个靶分子结合的Fn3基结合分子，其中仅Fn3结构域的底部区域或Fn3结构域的顶部区域但不是两者同时用于结合。例如，底部单特异性Fn3基结合分子仅利用Fn3结构域的底环例如AB、CD或EF环或者C-末端结合靶标，而顶部单特异性Fn3基结合分子仅利用Fn3结构域的顶环例如BC、DE和FG环结合靶标。应理解并非顶部或底部区域的所有3个环均需要用来结合靶分子。

单特异性Fn3结构域也可连接在一起(例如以珍珠样方式)形成多特异性Fn3基结合分子，其包含例如连接在一起的至少两个单特异性Fn3结构域。对于底部单特异性结合分子，每一个Fn3结构域利用至少一个底环或C-末端区域与一个或多个靶分子结合。在一个实施方案中，该多特异性Fn3基结合分子与同一靶分子(例如靶标A)的不同靶区域结合。例如，一个Fn3结构域可与靶标A的第一靶区域结合，而另一Fn3结构域可与靶标A的第二靶区域结合。这可用来增加Fn3基结合分子对靶分子的亲合力。在另一实施方案中，多特异性Fn3基结合分子与多个靶分子结合。例如，一个Fn3结构域可与靶标A结合，而另一个Fn3结构域可与靶标B(例如半衰期延长剂)结合。而在另一实施方案中，多特异性Fn3基结合分子包含至少两个与靶标A的不同靶区域结合的单特异性Fn3结构域和至少两个与靶标B的不同靶区域结合的单特异性Fn3结构域。技术人员将会理解任何数目的Fn3结构域均能够以这样的方式相连，以创建能够与同一靶分子或不同靶分子的不同靶区域结合的多特异性Fn3基结合分子。

如本文所用的术语“双特异性”是指既利用Fn3结构域的底部区域又利用Fn3结构域的顶部区域与一个或多个靶标结合的Fn3基结合分子。例如，双特异性Fn3基结合分子可以包含既利用该分子的底环例如AB、CD或EF环或者C-末端、又利用该分子的顶环例如BC、DE和FG环结合靶标的Fn3结构域。双特异性Fn3基结合分子可用于结合同一靶分子，例如靶标A，该靶分子可与双特异性Fn3基结合分子的顶部和底部均结合(见图3b)。可选地，双特异性Fn3基结合分子可用于结合两个不同的靶分子，例如靶标A和靶标B。在这种情况下，顶环可用于结合靶标A，而底环可以用于结合靶标B，或者反之亦然(见图3b)。双特异性Fn3基结合分子也可连接在一起(例如以珍珠样方式)形成多特异性Fn3基结合分子。

如本文所用的术语“多特异性”是指该Fn3基结合分子包含至少两个连接在一起的单特异性Fn3基结合分子或者至少两个连接在一起的双特异性Fn3基结合分子。

术语“互补决定区(CDR)”是指来自抗体可变结构域或来自T细胞受体的高变环。CDR在抗体可变区中的定位已有精确定义(参见Kabat，E.A.等Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，1991，和Chothia，C.等，J.Mol.Biol.196：901-917，1987，其并入本文作为参考)。术语“单域抗体”是指任何天然存在的单可变结构域抗体和相应的工程化结合片段，包括如Domantis(Domantis/GSK(Cambridge，UK)所述的人结构域抗体、或如下文所定义的驼类纳米抗体(camelid nanobody)。

术语“单链抗体”是指由利用重组方法通过合成接头连接在一起的轻链可变区抗原结合部分和重链可变区抗原结合部分，其中所述接头使之形成单个蛋白质链，在该链中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 85：5879-5883)。

术语“驼类纳米抗体”是指这样的驼类抗体区域，该区域为缺乏轻链的小单可变结构域，其可以通过遗传工程化产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质而获得，从而得到小分子量的抗体衍生蛋白质。参见例如WO07042289和1998年6月2日授权的美国专利No.5,759,808；还请参见Stijlemans，B.等，2004。工程化的驼类抗体及抗体片段文库可商购获得，例如购自Ablynx，Ghent，比利时。同其他非人源抗体一样，驼类抗体的氨基酸序列可以重组改变，以获得与人序列更密切类似的序列，即，该纳米抗体可以“人源化”。因而能够使驼类抗体在人中的天然低的抗原性进一步降低。

术语“靶标”是指本发明Fn3基结合分子所识别的抗原或表位。靶标包括但不限于：蛋白质、肽、糖和/或脂质上存在的表位。

术语“缀合物”是指与一个或多个非Fn3部分化学或遗传连接的Fn3基结合分子。

术语“非Fn3部分”是指赋予与之结合的分子额外功能的生物或化学实体。在一个特定实施方案中，非Fn3部分是多肽，例如人血清白蛋白(HSA)或化学实体，例如聚乙二醇(PEG)，其可以增加Fn3基结合分子的体内半衰期。

术语“非天然氨基酸残基”是指不存在于天然(野生型)Fn3结构域中的氨基酸残基。此类非天然氨基酸残基可以通过取代天然氨基酸和/或通过向天然Fn3氨基酸序列中插入非天然氨基酸而引入。还可以掺入非天然氨基酸残基，以赋予Fn3基结合分子期望的功能，例如连接功能性部分(例如PEG)的能力。

术语“聚乙二醇”或“PEG”指聚亚烷基二醇化合物或其衍生物，有或无偶联剂、或以偶联或活化部分衍生。

术语“特异性结合”或“与……特异性结合”是指，按照表面等离子体共振测量，在标准生理盐和pH条件下于室温，Fn3基结合分子以至少1×10^-6M的亲和力与靶标结合、和/或以比其对非特异性抗原的亲和力高至少2倍(优选至少10倍)的亲和力与靶标结合的能力。

概述

本发明提供了与靶抗原特异性结合的基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子。本发明提供了与一个或多个靶分子结合的、在底部AB、CD、EF环区或C-末端之至少一个或多个中具有修饰的、单特异性Fn3结合分子。本发明还提供了双特异性Fn3基结合分子，其以两个相对的结合位点结合相同靶分子或同时结合两个或更多个靶抗原。本发明Fn3基结合分子也可连接在一起(例如以珍珠样方式)形成多特异性Fn3基结合分子，和/或可与非Fn3部分例如人血清白蛋白(HSA)缀合，以提高半衰期和稳定性。与其他结合分子，例如抗体非常相似，Fn3基结合分子可用在多种治疗和诊断应用中。

单特异性Fn3基结合分子

一方面，本发明提供了单特异性Fn3基结合分子，其与野生型Fn3结构域相比被改变(例如，在底部和/或顶部环区)，以产生与特定靶标结合的非Fn3结合序列。在一个实施方案中，单特异性Fn3基结合分子利用底部AB、CD、EF环或C-末端结合一个或多个靶分子。

从而，在一个实施方案中，本发明提供了包含Fn3结构域的Fn3基结合分子，其中与野生型Fn3结构域相比，该Fn3结构域中的至少一个氨基酸被改变，以产生与特定靶标结合的非Fn3结合序列。在特别的实施方案中，野生型Fn3结构域是人Fn3结构域，例如人¹⁰Fn3(SEQ ID NO：1)。另外，邻近环区的一个或多个β链中的一个或多个氨基酸残基与野生型Fn3结构域相比也可突变，以贡献额外的非Fn3结合序列或可与非Fn3部分相连的残基。底部AB、CD、EF环区或C-末端以及邻近β链中可改变的具体氨基酸残基包括例如，SEQ ID NO：1第15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95或96位的氨基酸。

例如，例示性的非Fn3结合序列可以包括抗体或T细胞受体的互补决定区(CDR)的全部或部分。

另一方面，本发明提供了Fn3基结合分子文库，其可用来鉴定与特定的期望靶标结合的Fn3基结合分子。在一个实施方案中，文库含有Fn3基结合分子，其中与野生型Fn3结构域例如人¹⁰Fn3(SEQ ID NO：1)相比，每一个Fn3基结合分子均在底部AB、CD、EF环区或C-末端之一个或多个中含有至少一个氨基酸改变。AB、CD、EF环区以及β链中可改变的具体氨基酸残基包括例如，SEQ ID NO：1第15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95或96位的氨基酸。

在另一实施方案中，文库含有Fn3基结合分子，其中与野生型Fn3结构域例如人¹⁰Fn3(SEQ ID NO：1)相比，每一个Fn3基结合分子均在顶部BC、DE或FG环区之一个或多个中含有至少一个氨基酸改变。BC、DE或FG环区以及β链中可改变的具体氨基酸残基包括例如，SEQ ID NO：1第21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、51、52、53、54、55、56、76、77、78、79、80、80、81、82、83、84、85、86、87或88位的氨基酸。

文库多样性可例如，通过随机诱变、“模糊突变(walk through mutagenesis)”或“精确突变(look through mutagenesis)”一个或多个公开的SEQ ID NO：1中残基而生成(7,195,880；6,951,725；7,078,197；7,022,479；5,922,545；5,830,721；5,605,793，5,830,650；6,194,550；6,699,658；7,063,943；5,866,344和专利协作条约公开WO06023144)。

可选地，Fn3基结合分子可通过组合来自一个或多个不同文库成员的非Fn3结合序列而生成。在特定的实施方案中，双特异性Fn3基结合分子通过将来自一个文库成员的底部AB、CD、EF环区或C-末端之一个或多个的非Fn3结合序列和来自另一文库成员的顶部BC、DE或FG环区之一个或多个的非Fn3结合序列一起组合到单个双特异性Fn3基结合分子之中而生成。

编码本文所述的Fn3基结合分子文库的核酸或其变体可利用本领域公认的方法构建，包括但不限于：基于PCR的或酶介导的基因工程法，从头开始的DNA或RNA合成，和/或盒式诱变。

Fn3基结合分子的适宜靶标包括但不限于：半衰期延长剂(例如HSA)、溶菌酶、细胞受体、细胞受体配体、细菌或病毒(参见图1)。在一个特定实施方案中，靶标参与人类疾病，例如自身免疫病、癌症或感染性疾病。

本说明书特别描述了如下新的Fn3基结合分子的鉴定和生产，所述Fn3基结合分子利用Fn3分子的底环与靶标例如HSA结合。利用本发明的方法已经生成了数以百计的克隆，而代表性的一些已经如实施例4所示进行了表征。图7显示了从该Fn3支架蛋白文库中分离的与HSA结合的多个代表性序列(SEQ ID NO：7-41)。

此外，发现许多独立随机化的环倾向于趋于一共有序列，该共有序列可能参与HSA的结合(SEQ ID NO：42)。因此，预期具有此共有序列的多肽将可用作为HSA结合剂，即使在此共有序列从其所鉴定自的蛋白质环境中分离出来时也是如此。

图8显示了从该Fn3支架蛋白文库中分离的与溶菌酶结合的多个代表性序列(SEQ ID NO：43-116)。实施例5中的数据显示了代表性的一些Fn3基结合蛋白对HSA的结合研究。结果显示Fn3结合分子可利用具有结合靶标能力的修饰的底环来生成。

该数据显示，可生成至少一个底环被修饰的Fn3基结合分子的文库，以便其与靶标结合。对于该HSA文库，底环与野生型Fn3保持相同的长度。对于溶菌酶文库，底环长度变化不等，而对蛋白质结构没有不利影响。此外，这些具有修饰的底环的单特异性Fn3基结合分子维持构象稳定性，并且能够表达和纯化而保留结合能力。因而，本发明的方法可用来生成具有至少一个修饰的底环的Fn3基结合分子、以及利用底部面与靶标结合的Fn3基结合分子的文库。

双特异性Fn3基结合分子

如前面部分所讨论的那样，另一方面，本发明提供了能够同时与两个或更多个靶标结合的双特异性Fn3基结合分子。此类双特异性Fn3基结合分子在同一蛋白质结构域内包含两个或更多个非Fn3结合序列。这可通过改变顶部和底部AB、BC、CD、DE、EF或FG环区中的任意两个或更多个而包含非Fn3结合序列来实现(见图1)。在特别的实施方案中，双特异性Fn3基结合分子在顶部和底部环区中均改变，以创建两个分开的结合特异性。

从而，在一个实施方案中，本发明提供了包含Fn3结构域的双特异性Fn3基结合分子，其中与野生型Fn3结构域(例如SEQ ID NO：1)相比，该Fn3结构域底部AB、CD、EF环区之一个或多个中的至少一个氨基酸改变，以创建与第一靶标结合的非Fn3结合序列，且其中与野生型Fn3结构域(例如SEQ ID NO：1)相比，该Fn3结构域顶部BC、DE和FG环区之一个或多个中的至少一个氨基酸改变，以创建与第二靶标结合的非Fn3结合序列。底部AB、CD、EF环区或C-末端以及邻近β链中可改变的具体氨基酸残基包括例如，SEQ ID NO：1第15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95或96位的氨基酸。BC、DE和FG环区以及邻近β链中可改变的具体氨基酸残基包括例如，SEQ ID NO：1第21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、51、52、53、54、55、56、76、77、78、79、80、80、81、82、83、84、85、86、87或88位的氨基酸。

本发明双特异性Fn3基结合分子同时与两个或更多个靶标结合。靶标可存在于同一分子上，从而同一靶分子的两个区域由于双特异性Fn3基结合结构域与该靶标的结合而并置。可选地，靶标可存在于不同的分子上，从而这两个不同的分子由于双特异性Fn3基结合分子与靶标的结合而并置。靶标还可以是相同的，从而双特异性Fn3基结合分子能够簇集靶分子，与抗体能够簇集分子的方式一样。

适宜的靶标包括之前上文所述的那些，单独地或与可以增强双特异性Fn3基结合分子理化性能的分子(例如半衰期延长剂，例如HSA、抗体Fc受体或PEG)上存在的靶标组合。适宜的靶标还包括赋予附加功能特性的分子，例如细胞毒性、标记或成像部分，如本文所述的那样。适宜的靶标还能用来诱导双特异性Fn3基结合分子二聚化，条件是这两个双特异性Fn3基结合结构域分子能够与该靶标同时结合。例如，两个双特异性Fn3基结合分子可以以独特型/抗独特型的关系起作用。在这种情况下，Fn3结合分子的一个结合位点将与靶分子结合，而该Fn3结合分子的第二结合位点将与该Fn3结合分子上的结合区结合。例如，双特异性Fn3结合分子的底环可以与靶标A结合，而该双特异性分子的顶环可以与第二双特异性Fn3结合分子结合。这将引起Fn3结合分子以这样的方式多聚化，该方式使得底环靶标结合位点可用于结合靶标A，而顶环结合位点引起与第二Fn3结合分子的自我缔合。

本说明书特别描述了新的双特异性Fn3分子的鉴定和生产，其利用同一Fn3分子的底环和顶环两者与两个不同的靶分子例如HSA和VEGFR2结合。利用本发明的方法已经生成了数以百计的克隆，特别是一个克隆即克隆89在实施例6和7中更详细地描述。克隆89是双特异性Fn3基结合分子，其中该Fn3分子的底环与HSA结合，而同一Fn3分子的顶环与VEGFR2结合(SEQ ID NO：120)。

双特异性Fn3结合分子还可通过首先鉴定具有期望功能(例如与HSA结合)的单特异性Fn3基结合分子来创建。该单特异性Fn3基结合分子仅在两结合界面之一(即，要么是顶环，要么是底环，但并非两者)具有环变异。一旦鉴定到具有期望功能的适宜的单特异性Fn3基结合分子，则利用该分子作为支架来生成文库，其中改变该Fn3分子的相对面的环，从而生成双特异性Fn3基结合分子文库。此双特异性Fn3基结合分子文库随之用来进行针对第二靶分子的筛选，以鉴定与两个靶标结合的双特异性实体。例如，单特异性Fn3基结合分子可利用至少一个底环与HSA结合。这种单特异性Fn3基结合分子用作为支架来生成文库，其中变化分子的至少一个顶环，以便其与第二靶标例如VEGFR2结合，由此创建双特异性Fn3基分子文库。此双特异性Fn3基分子文库可用来针对VEGFR2靶标进行筛选。

VEGFR2是VEGF信号传递的促血管生成作用的一级介导者。VEGFR-2由VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D结合和激活。在内皮细胞中，VEGFR-2激活将刺激细胞增殖和迁移；在体内，VEGFR-2激活将触发血管生成，并增加血管系统的透性。增加的血管生成已充分确立为肿瘤生长和多种视网膜病的重要特征，而增加的血管系统透性是许多炎性反应的重要事件(参见例如WO2005056764)。

本申请数据显示，具有修饰的底环的双特异性Fn3基结合分子维持构象稳定性，并且能够表达和纯化而保留结合能力。技术人员将会理解，利用本文公开的本发明方法能够生成任何双特异性Fn3基结合分子。可设计所述双特异性分子以与任何目的靶标结合。例如，所述双特异性分子可与同一靶标的不同结合位点结合。可选地，所述双特异性分子可与不同的靶分子结合。

多特异性Fn3基结合分子

另一方面，本发明提供了多特异性Fn3基结合分子，其包含连接在一起(例如遗传或化学地)的两个或更多个单特异性Fn3基结合分子或双特异性Fn3基结合分子。多特异性Fn3基结合分子包含至少一个单体Fn3基结合分子，所述单体分子利用底环AB、CD、EF之至少一个与靶标结合。

在一个实施方案中，多特异性Fn3基结合分子包含以珍珠样方式连接在一起的两个或更多个Fn3基结合分子，其中每个个体Fn3基结合分子各与特定靶标结合。同双特异性Fn3基结合分子一样，此类靶标可存在于同一分子或不同分子上，从而不同的分子因为多特异性Fn3基结合分子的结合而并置。靶标还可相同，从而多特异性Fn3基结合分子能够簇集靶分子，与抗体的方式类似。亲合力也可以通过同一靶分子与Fn3基结合分子上能够独立地与靶分子不同区域结合的两个结合位点结合而增加。

多种Fn3基结合分子可掺入到多特异性Fn3基结合分子中，包括具有单结合特异性的Fn3基结合分子，双特异性Fn3基结合分子，或两类Fn3基结合分子的组合。从而，多特异性Fn3基结合分子的适宜靶标包括上文针对Fn3基结合分子和双特异性Fn3基结合分子所述的那些。

多特异性Fn3基结合分子可利用本领域公认的方法产生。例如，Fn3基结合分子可以遗传连接，从而多特异性Fn3基结合分子表达为单个多肽。这种连接可以是直接的或者通过附加的氨基酸“接头”序列而赋予。适宜的非限制性方法和接头描述在例如US20060286603和WO04041862A2中。例示性的多肽接头包括但不限于：GS接头例如GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：118)、GSGSGSGSGS(SEQ ID NO：121)、PSTSTST(SEQ ID NO：122)和EIDKPSQ(SEQ ID NO：123)及其多聚体。实施例6显示了如何利用G-S接头制备多特异性Fn3基结合分子。具体地，多特异性Fn3基结合分子利用GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：118)接头序列创建，该接头序列将利用顶环结合VEGFR2的第一单特异性Fn3基结合分子与利用底环结合HSA的第二单特异性Fn3基结合分子连接在一起(SEQ ID NO：119)。

利用接头序列生成的多特异性Fn3基结合分子就与靶分子的结合而言具有改进的空间位阻，从而使得能够利用较短的接头序列将两个或更多个单体Fn3基结合分子连接在一起。较短的接头序列导致较小的免疫原性反应，且不太可能被切割掉。

可选地，多特异性Fn3基结合分子可利用本领域已知的方法通过化学缀合个体Fn3基结合分子而制备。多种偶联剂或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括例如：蛋白质A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-SMCC)(参见例如Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 82：8648)。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等(1985)Science 229：81-83)和Glennie等(1987)J.Immunol.139：2367-2375)中所述的那些。优选的缀合剂是SATA和sulfo-SMCC，两者均可购自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。半胱氨酸残基可引入到Fn3结合分子的特定位置上(参见例如)，然后利用试剂例如DPDPB或DTME(可购自Pierce)与巯基交联以将两个分子连接在一起。

实施例6和7描述了新的双特异性Fn3分子的鉴定和生产，其利用以接头序列连接在一起的两个分开的单特异性Fn3分子与两个不同的靶标即HSA和VEGFR2结合。在该具体实施例中，一个单体Fn3基结合分子利用底环与HSA结合，而另一单特异性Fn3基结合分子利用顶环结合VEGFR2。利用本发明的方法已经生成了数以百计的克隆，且已经表征了代表性的一些，特别是克隆89。数据显示，具有修饰的底环的该多特异性Fn3基结合分子维持构象稳定性，并且能够表达和纯化而保留结合能力。技术人员将会理解，利用本发明的方法能够生成任何多特异性Fn3基结合分子。可设计此类多特异性结合分子以与单个靶标结合。可选地，可设计多特异性结合分子以与两个或更多个靶标结合。

Fn3基结合分子的缀合物

另一方面，本发明提供了缀合物，其含有与一个或多个非Fn3部分相连的Fn3基结合分子。此类非Fn3部分能够例如赋予Fn3基结合分子额外的功能或理化性能。在一个实施方案中，Fn3基结合分子与抗体Fc结构域(或其部分)连接或融合。使分子与Fc结构域例如IgG1的Fc结构域融合的方法在本领域已知(参见例如U.S.5,428,130)。此类缀合物由于Fc与FcRn结合的能力(这在IgG稳态中起着关键作用，保护与之结合的分子免于代谢)，而具有增加的循环半衰期。

在另一实施方案中，Fn3基结合分子与一或多个人血清白蛋白(HSA)多肽或其部分融合。HSA成熟形式为585个氨基酸的蛋白质，负责重大比例的血清渗透压，而且也可以作为内源和外源配体的载体起作用。白蛋白作为载体分子的角色及其惰性性质对于用作体内多肽的载体和转运蛋白的用途而言是期望的性能。作为白蛋白融合蛋白组分的白蛋白用作多种蛋白质的载体的用途已经在WO 93/15199、WO 93/15200和EP 413 622中提出。此外，也已经提出(EP 399 666)使用HSA的N-末端片段与多肽融合。从而，通过将本发明的分子与白蛋白、或白蛋白的片段(部分)或变体、或足以稳定本发明蛋白质和/或其活性的、能够结合HAS的分子(“抗HSA结合剂”)进行遗传或化学融合或缀合，本发明分子可以被稳定化以延长保质期，和/或使得分子的活性在溶液中、在体外、和/或在体内得以保留延长的时间。

白蛋白与其他蛋白质的融合可以通过基因操作使编码HSA或其片段的DNA与编码蛋白质的DNA连接而实现。然后用融合的核苷酸序列转化或转染适宜的宿主，其中所述融合的核苷酸序列被安排在适宜的质粒上以致可以表达融合多肽。表达可以由例如原核或真核细胞在体外实现，或由例如转基因生物在体内实现。与HSA融合相关的其他方法可见于例如WO 2001077137和WO 200306007，并入本文作为参考。在一具体实施方案中，融合蛋白质的表达在哺乳动物细胞系例如CHO细胞系中进行。

本发明其他Fn3基结合分子缀合物包括与非Fn3基结合分子例如其他肽或蛋白质(例如抗体或受体的配体)相连的Fn3基结合分子，以生成结合至少两个不同的结合位点或靶分子的分子。

本发明Fn3基结合分子缀合物可利用本领域已知的方法通过使组成分子相连而制备。例如，组成分子可利用可用来进行共价缀合的多种偶联剂或交联剂来化学连接。交联剂的实例包括蛋白质A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-SMCC)(参见例如Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 82：8648)。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等(1985)Science 229：81-83)和Glennie等(1987)J.Immunol.139：2367-2375)中所述的那些。优选的缀合剂是SATA和sulfo-SMCC，两者均可购自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。

可选地，组成分子可以在同一载体上编码并作为单个蛋白质在宿主细胞中表达。制备此类融合蛋白质的方法描述在例如美国专利No.5,260,203；美国专利No.5,455,030；美国专利No.4,881,175；美国专利No.5,132,405；美国专利No.5,091,513；美国专利No.5,476,786；美国专利No.5,013,653；美国专利No.5,258,498和美国专利No.5,482,858中。

又在另一实施方案中，本发明提供了与聚乙二醇(PEG)缀合的Fn3基结合分子，以例如增加分子的生物学(例如血清)半衰期。使蛋白质聚乙二醇化的方法在本领域公知。例如，Fn3基结合分子可与聚乙二醇部分，例如PEG的活性酯或醛衍生物，在一个或多个PEG基团可以与所述分子连接的条件下反应。术语“聚乙二醇化部分”、“聚乙二醇部分”或“PEG部分”包括聚亚烷基二醇化合物或其衍生物，有或无偶联剂或以偶联或活化部分衍生(例如，以硫醇、三氟甲磺酸(triflate)、tresylate、氮杂环丙烷(azirdine)、环氧乙烷(oxirane)，或优选以马来酰亚胺部分衍生，例如PEG-马来酰亚胺)。其他适当的聚亚烷基二醇化合物包括但不限于马来酰亚胺基单甲氧基聚乙二醇、活化的聚乙二醇聚丙二醇，而且还包括如下类型的荷电或中性聚合物：葡聚糖、多聚乙酰神经氨酸、或其他基于糖的聚合物、氨基酸的聚合物、和生物素衍生物。

选择适宜官能团用于PEG衍生物以该分子上或将与PEG偶联的分子上可利用的反应基团的类型为基础来进行。对于蛋白质而言，典型的反应性氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。还可以利用N-末端氨基基团和C-末端羧酸。

优选，聚乙二醇化借助于与活性PEG分子(或类似的活性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应而进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已经被用来衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇，或聚乙二醇-马来酰亚胺。聚乙二醇化蛋白质的方法在本领域已知，并且可应用于本发明。参见例如WO 2005056764、U.S.7,045,337、U.S.7,083,970、U.S.6,927,042、Nishimura等的EP 0 154 316和Ishikawa等的EP 0 401 384。Fn3基结合分子可以工程化以纳入至少一个半胱氨酸氨基酸或至少一个非天然氨基酸以促进聚乙二醇化。

Fn3基结合分子缀合物与其特定靶标的结合可通过多种测定法来确认，例如，可以放射性标记融合物并用在放射性免疫测定法(RIA)中(参见例如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986，并入本文作为参考)。放射性同位素可通过诸如应用γ-计数器或闪烁计数器或者通过放射自显影法等方法来检测。

本发明其他Fn3基结合分子缀合物包括与标签(例如生物素)或化学品(例如免疫毒素或化疗剂)相连的Fn3基结合分子。此类化学品包括细胞毒性剂，即，任何对细胞有害(例如杀伤)的物质。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质类固醇、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，以及它们的类似物或同系物。治疗剂还包括例如抗代谢物(例如，氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)，烷化剂(例如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡氮芥(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二氨铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类药物(例如，柔红霉素(以前称作道诺霉素)和多柔比星)，抗生素(例如，放线菌素D(以前称作放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨曲霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。能够与本发明Fn3基结合分子缀合的治疗性细胞毒素的其他实例包括duocarmycins、刺孢霉素、美登素和auristatins，以及它们的衍生物。

细胞毒素可以利用本领域可用的接头技术与本发明Fn3基结合分子缀合。已经用来与细胞毒素缀合的接头类型的实例包括但不限于：腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽接头。例如，接头可以选择为易被溶酶体区室内的低pH断裂、或者易被蛋白酶(例如优先地在肿瘤组织中表达的蛋白酶，例如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D))断裂的接头。有关细胞毒素、接头的类型以及缀合治疗剂的方法的更多讨论还参见Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。

本发明Fn3基结合分子还可以与放射性同位素缀合以生成细胞毒性放射性药物，也称为放射性免疫缀合物。能够与Fn3基结合分子缀合用于诊断或治疗用途的放射性同位素的实例包括但不限于：碘¹³¹、铟¹¹¹、钇⁹⁰和镥¹⁷⁷。制备放射性免疫缀合物的方法在本领域已经确立。放射性免疫缀合物的实例可商购获得，包括替伊莫单抗(ibritumomab)、tiuxetan和托西莫单抗(tositumomab)，且类似的方法可用来应用本发明的分子制备放射性免疫缀合物。

本发明Fn3基结合分子缀合物可用来调节给定的生物学反应，且药物部分不应理解为局限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是拥有期望生物学活性的蛋白质或多肽。例如，此类蛋白质可以包括酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质诸如肿瘤坏死因子或干扰素-γ等；或生物学反应调节剂，例如，淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。

缀合此类治疗性部分的技术公知，并且可应用于本发明的分子，参见例如Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编辑)，243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，″Antibodies For Drug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等(编辑)，623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编辑)，475-506页(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)，303-16页(Academic Press 1985)，和Thorpe等，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。

本发明Fn3基结合分子还可以通过羟乙基淀粉化(hesylation)修饰，其利用与药物相连的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物以修饰药物特征。HES是可以被机体酶代谢的、衍生自蜡质玉米淀粉的、修饰的天然聚合物。这种修饰通过增加分子的稳定性以及减小肾脏清除而使循环半衰期延长，导致增加的生物学活性。此外，HES化潜在地改变免疫原性或变应原性。通过改变不同的参数，例如HES的分子量，可以定制范围广泛的HES药物缀合物。

DE 196 28 705和DE 101 29 369描述了在无水二甲亚砜(DMSO)中借助于羟乙基淀粉的相应醛糖内酯使羟乙基淀粉分别与血红蛋白和两性霉素B的游离氨基偶联的可行方法。由于因为溶解度的原因或者是蛋白质变性的原因使用无水非质子溶剂往往是不可行的(特别是在蛋白质的情况下)，故也可利用HES在水性介质中偶联的方法。例如，通过水溶性碳化二亚胺EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)的介导，可以偶联已在链还原端选择性氧化为醛糖酸的羟乙基淀粉(PCT/EP 02/02928)。可应用于本发明的其他羟乙基淀粉化方法描述在例如U.S.20070134197、U.S.20060258607、U.S.20060217293、U.S.20060100176和U.S.20060052342中。

本发明Fn3基结合分子还可利用糖残基来修饰。修饰蛋白质的糖残基或使蛋白质糖基化的方法在本领域已知(参见例如Borman(2006)Chem.& Eng.News 84(36)：13-22和Borman(2007)Chem.& Eng.News 85：19-20)，并且可应用于本发明的分子。

另外地或可选地，可制备本发明Fn3基结合分子，其具有改变的糖基化类型，例如岩藻糖残基量减小的低岩藻糖基化模式，或平分型GlcNac结构增加的Fn3基结合分子。此类糖修饰可通过例如在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达Fn3基结合分子来实现。具有改变的糖基化机器的细胞在本领域已有描述，并且可用作为宿主细胞表达本发明重组的Fn3基结合分子，由此产生糖基化改变的本发明Fn3基结合分子。例如，Hang等的EP 1,176,195描述了编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因被功能性破坏了的细胞系，从而在这样的细胞系中表达的抗体呈现低岩藻糖基化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系即Lecl3细胞，其使岩藻糖与Asn(297)连接的糖相连的能力下降，也导致该宿主细胞中表达的抗体低岩藻糖基化(还请参见Shields，R.L.等，2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。产生具有人样糖基化模式的多肽的方法也已经由EP1297172B1以及源于Glycofi的其他同族专利描述过。

生成Fn3基结合分子的方法

1)核酸和氨基酸改变

具有一个或多个氨基酸或核苷酸修饰(例如，改变)的本发明Fn3基结合分子可通过多种已知方法生成。一般，此类修饰的Fn3基结合分子可通过重组方法产生。而且，由于遗传密码的简并性，可利用多种核酸序列来编码每个期望的分子。

例示性的本领域公认的制备编码起始分子的氨基酸序列变体的核酸分子的方法包括但不限于：通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变以及盒式诱变早先制备的编码分子的DNA来制备。

定点诱变是制备取代变体的优选方法。此技术在本领域公知(参见例如Carter等Nucleic Acids Res.13：4431-4443(1985)和Kunkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 82：488(1987))。简言之，在进行DNA定点诱变时，亲本DNA通过如下方式改变：首先使编码期望突变的寡核苷酸与此亲本DNA的单链杂交。杂交后，利用杂交的寡核苷酸作为引物，而利用该亲本DNA单链作为模板，利用DNA聚合酶合成完整的第二链。从而，编码期望突变的寡核苷酸被掺入到所得的双链DNA中。

PCR诱变也适合于制备起始分子的氨基酸序列变体。参见Higuchi，in PCR Protocols，177-183页(Academic Press，1990)；和Vallette等，Nuc.Acids Res.17：723-733(1989)。简言之，当小量模板DNA在PCR中用作为起始材料时，可利用在序列上与模板DNA相应区域稍有差异的引物来生成相对大量的特定DNA片段，该片段仅在引物有别于模板的位置上与模板序列存在差异。

另一种制备变体的方法，即盒式诱变，是以Wells等Gene 34：315-323(1985)描述的技术为基础的。起始材料是含有待突变的起始多肽DNA的质粒(或其他载体)。鉴定亲本DNA中待突变的密码子。所鉴定的突变位点的每一侧必需有独特的限制性内切酶位点。如果不存在这样的限制性位点，则可以利用上述寡核苷酸介导的诱变方法将其引入在起始多肽DNA的适当位置上。在这些位点切割质粒DNA以使之线性化。利用标准方法合成编码两限制性位点之间的DNA序列但含有期望突变的双链寡核苷酸，其中两条寡核苷酸链分开合成，然后利用标准技术杂交在一起。这种双链寡核苷酸称为盒。此盒设计为具有与线性化质粒末端适配的5’和3’端，从而能够直接连接到质粒中。这样该质粒含有突变的DNA序列了。

可选地，或另外地，可确定编码分子的多肽变体的期望氨基酸序列，并合成产生编码此氨基酸序列变体的核酸序列。

本领域普通技术人员将会理解，可以进一步修饰本发明Fn3基结合分子，从而改变其氨基酸序列(例如与野生型不同)，但期望的活性不变。例如，可对蛋白质进行导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代的其他核苷酸取代。例如，分子中的非必需氨基酸残基可以替换为相同侧链家族的其他氨基酸残基。在另一实施方案中，一段氨基酸链可以替换为结构上类似的、差别在于侧链家族成员的顺序和/或组成的链，即可进行保守取代，其中氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。

具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已经定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

除了氨基酸取代，本发明还考虑起始分子氨基酸序列的其他修饰，以生成功能上等同的分子。例如，可以缺失一个或多个氨基酸残基。一般而言，根据本发明的此实施方案，缺失不超过1个至约10个残基。包含一个或多个氨基酸缺失的Fn3基结合分子将优选保留起始多肽分子的至少约80％、优选至少约90％、最优选至少约95％。

还可以制备氨基酸插入变体，其保留原始Fn3结构域或Fn3基结合分子的功能。例如，可以将至少一个氨基酸残基(例如，1个或2个氨基酸残基，一般不超过10个残基)引入到分子中，在另一实施方案中，可以在Fn3结构域或单个Fn3基结合分子中组合种种氨基酸修饰。

在一个实施方案中，对Fn3结构域进行氨基酸取代，以包括半胱氨酸或其他非天然氨基酸，从而适合于通过公知的缀合方法使部分(moiety)与该Fn3基结合分子缀合。尤其是，本发明涉及具Fn3支架的Fn3基结合分子的特定氨基酸变体，其中一个或多个丝氨酸残基被半胱氨酸或非天然氨基酸取代。能够取代的丝氨酸残基包括但不限于：Ser 1432、Ser 1436、Ser 1458、Ser 1475和Ser 1504。能够取代的Fn3支架的其他氨基酸位置包括但不限于V1426、L1434、T1473和T1486。非天然存在的氨基酸可利用例如Ambrex技术(参见例如US 7,045,337；7,083,970)取代到Fn3支架中。

2)用于鉴定Fn3基结合分子的筛选测定法

可采用多种筛选测定法来鉴定本发明Fn3基结合分子。基本上任何选择对期望抗原的结合的体外或体内筛选方法均可利用。

在一个实施方案中，在细胞、病毒或噬菌体表面展示Fn3基结合分子，并利用固定化抗原对其进行选择。适宜的筛选方法描述在美国专利No.7,063,943；6,699,658；7,063,943和5866344中。此类表面展示可能要求创建Fn3基结合分子和正常存在于细胞、病毒或噬菌体外表面上的适宜蛋白质之间的融合蛋白质。适宜制备此类融合物的蛋白质在本领域公知。

在另一实施方案中，利用体外表型-基因型关联展示例如核糖体或多核糖体展示来筛选Fn3基结合分子。此类“分子进化”方法为本领域公知(参见例如美国专利No.6,194,550和7,195,880)。

筛选方法可以包括一个或多个体外或体内亲和力成熟步骤。可采用任何亲和力成熟方法，引起Fn3结构域或CDR中的氨基酸变化，提高Fn3基结合分子与期望抗原的结合。这些氨基酸变化可以例如，借助于随机诱变、“模糊诱变(walk through mutagenesis)”和“精确诱变(look through mutagenesis)”而实现。例如，此类诱变可利用易错PCR，利用酵母或细菌“增突”株，在从头合成所有或部分Fn3基结合分子期间掺入随机或确定的核酸变化而实现。实施亲和力成熟和/或诱变的方法描述在例如，美国专利No.7,195,880；6,951,725；7,078,197；7,022,479；5,922,545；5,830,721；5,605,793，5,830,650；6,194,550；6,699,658；7,063,943；5866344和专利协作条约公开WO06023144中。此类亲和力成熟方法可能还需要增加抗原结合筛选测定法的严紧度，以选择对抗原具有提高的亲和力的Fn3基结合分子。本领域公认的增加蛋白质-蛋白质相互作用测定法的严紧度的方法可在本文使用。在一个实施方案中，改变一个或多个测定条件(例如，测定缓冲液的盐浓度)以减小Fn3基结合分子对期望抗原的亲和力。在另一实施方案中，缩短允许Fn3基结合分子与期望抗原结合的时间长度。在另一实施方案中，在蛋白质-蛋白质相互作用测定法中增添竞争性结合步骤。例如，首先使Fn3基结合分子与期望的固定化抗原结合。然后添加特定浓度的非固定化抗原，其起与固定化抗原竞争结合的作用，从而对抗原具有最低亲和力的Fn3基结合分子从固定化的抗原上洗脱出来，导致选择出具有提高的抗原结合亲和力的Fn3基结合分子。测定条件的严紧度还可以通过增加添加到测定中的非固定化抗原的浓度来增加。

本发明的筛选方法还可能需要多轮选择，以富集抗原结合性提高的一种或多种Fn3基结合分子。在一个实施方案中，在每一轮选择中，向Fn3基结合分子中引入进一步的氨基酸突变。在另一实施方案中，在每一轮选择中，增加与期望抗原结合的严紧度，以选择抗原亲和力增加的Fn3基结合分子。

在本发明双特异性Fn3基结合分子的情况下，优选独立地筛选每一种结合特异性。从而，利用其中AB、CD和EF环之一个或多个中的一个或多个氨基酸改变了的第一Fn3基结合分子文库进行第一筛选，以鉴定与第一靶标结合的Fn3基结合分子个体。利用其中BC、DE和FG环之一个或多个中的一个或多个氨基酸改变了的第二Fn3基结合分子文库进行第二筛选，以鉴定与第二靶标结合的Fn3基结合分子个体。利用本领域公认的方法确定自两个筛选鉴定的单特异性Fn3基结合分子个体的氨基酸序列。双特异性Fn3基结合分子通过将来自这些Fn3基结合分子个体的第一和第二靶标结合序列组合到单个嵌合Fn3基结合分子中而生成。

3)制备方法

本发明Fn3基结合分子一般通过重组表达产生。编码所述分子的核酸插入到表达载体中。编码所述分子的DNA区段于表达载体中有效连接确保其表达的控制序列。表达控制序列包括但不限于：启动子(例如天然相伴或异源的启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。优选表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦载体已经掺入到适当的宿主中，则将宿主维持在适合于高水平表达所述核苷酸序列、以及收集和纯化该交叉反应性Fn3基结合分子的条件下。

这些表达载体一般可作为游离体或者宿主染色DNA的一个部分而在宿主生物体中复制。通常表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)，以允许检测转化了期望的DNA序列的那些细胞(参见例如Itakura等，美国专利4,704,362)。

大肠杆菌是一种尤其可用于克隆本发明多核苷酸(例如DNA序列)的原核宿主。其他适合于应用的微生物宿主包括芽孢杆菌属(bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，以及其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，例如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和多种假单胞菌属(Pseudomonas)菌种。

其他微生物例如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)和毕赤氏酵母属(Pichia)为例示性的酵母宿主，适宜载体按期望具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括例如来自醇脱氢酶、异细胞色素C(isocytochrome C)以及负责甲醇、麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

除了微生物，哺乳动物组织培养物也可以用来表达和生产本发明的多肽(例如编码免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。参见Winnacker，From Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.(1987)。实际上优选真核细胞，因为本领域已经研发了许多能够分泌异源蛋白质(例如完整免疫球蛋白)的适宜宿主细胞系，包括CHO细胞系、多种COS细胞系、HeLa细胞、293细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞以及杂交瘤。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(Queen等，Immunol.Rev.89：49(1986))，以及必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列为来源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。参见Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。

可选地，编码序列可掺入到转基因中，以引入到转基因动物的基因组中，随后在转基因动物乳汁中表达(参见例如Deboer等，U.S.5,741,957，Rosen，U.S.5,304,489和Meade等，U.S.5,849,992)。适宜的转基因包括轻链和/或重链编码序列，有效连接于来自乳腺特异性基因例如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子。

含目的多核苷酸序列和表达控制序列的载体可通过公知的方法转移到宿主细胞中，所用方法取决于细胞宿主的类型。例如，可以短暂热击化学感受态原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂转染(lipofection)、生物轰击(biolistics)或基于病毒的转染可用于其它细胞宿主(一般参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，第二版，1989)。其他用来转化哺乳动物细胞的方法包括应用polybrene、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(一般参见Sambrook等，同前)。为产生转基因动物，转基因可显微注射到受精卵中，或者可掺入到胚胎干细胞的基因组中，并将此类细胞的细胞核转移到去核卵细胞中。

本发明Fn3基结合分子一经表达，则可按照本领域的标准方法纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、HPLC纯化、凝胶电泳等(一般参见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。对于制药用途，优选基本上纯的、至少约90-95％均质的分子，最优选98-99％或更高均质性。

4)将CDR移植到Fn3基结合分子上的方法

一方面，本发明描述了Fn3基结合分子，其与野生型Fn3结构域相比发生了改变以含有抗体或T细胞受体的互补决定区(CDR)的全部或部分。

任何抗体或T细胞受体可变区的CDR区或其抗原结合片段均适合于移植。CDR可从任何动物的抗体或T细胞受体库(repertoire)中获得，包括但不限于：啮齿类动物、灵长类动物、驼类动物或鲨鱼。在特别的实施方案中，CDR从单域抗体例如纳米抗体的CDR1、CDR2和CDR3获得。在更具体的实施方案中，单域抗体例如纳米抗体的CDR1、2和3移植到Fn3结构域的AB、BC、CD、DE、EF或FG环之任一中，由此向Fn3基结合分子提供原始纳米抗体的靶结合特异性。驼类抗体和抗体片段的工程化文库可商购获得，例如Ablynx，Ghent，比利时。抗体库(repertoire)可来自用一种或多种抗原刺激的动物，或来自未用抗原刺激过的幼稚动物。另外或者可选地，CDR可从通过体外或体内文库筛选方法所产生的抗体或其抗原结合片段获得，所述方法包括但不限于体外多聚核糖体或核糖体展示、噬菌体展示或酵母展示技术。这包括非由体外或体内文库筛选方法最初产生的、而是利用体外或体内筛选方法随后经历了诱变或一个或多个亲和力成熟步骤的抗体。此类体外或体内文库筛选方法或亲和力成熟方法的实例描述在美国专利No.7,195,880；6,951,725；7,078,197；7,022,479；5,922,545；5,830,721；5,605,793，5,830,650；6,194,550；6,699,658；7,063,943；5866344以及专利协作条约公开WO06023144中。

鉴定抗体CDR的方法在本领域公知(参见Kabat等，U.S.Dept.of Health and Human Services，″Sequences of Proteins of Immunological Interest″(1983)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；MacCallum 等，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))。可以分离和测序编码特定抗体的核酸，并通过相对于确立的抗体序列命名法来检查所编码的蛋白质而推出CDR序列。将高变区或CDR移植到本发明基于Fn3的结合支架中的方法包括例如，基因工程法、从头核酸合成或基于PCR的基因组装(参见例如美国专利No.5,225.539)。

上述技术允许鉴定适宜的支架环，用来选择和呈递高变区或CDR。不过，可以调用其他法则，基于Fn3结构域和供体抗体的结构建模，进一步改进高变区的合身性以及呈递。

一方面，可以突变Fn3结构域任一β链中的特定氨基酸残基，以允许CDR环采取保留或提高抗原结合的构象。这种方法可应用结构建模和序列比较的组合，通过类似于将CDR移植到异源抗体构架中的方式来进行。在一个实施方案中，邻近CDR的Fn3结构域残基以类似于Queen等(参见美国专利No.6,180,370；5,693,762；5,693,761；5,585,089；7,022,500)实施的方式进行突变。在另一实施方案中，落在CDR残基一个范德华半径范围内的Fn3结构域残基以类似于Winter等(参见美国专利No.6,548,640；6,982,321)实施的方式进行突变。在另一实施方案中，不靠近CDR残基、但根据Fn3结构域和供体抗体的结构建模预测将调节CDR残基构象的Fn3结构域残基，以类似于Carter等或Adair等(见美国专利No.6,407,213；6,639,055；5,859,205；6,632,927)实施的方式进行突变。

组合物

本发明Fn3基结合分子具有体内治疗用途。从而，本发明还提供了组合物，例如药物组合物，含有与可药用载体配制在一起的一种或组合的Fn3基结合分子(或其变体、融合物和缀合物)。本发明的药物组合物还可以在组合治疗中给药，即与其他药剂组合。例如，组合治疗可包括本发明的组合物连同至少一种或多种其他治疗剂，例如抗炎药、抗癌药和化疗剂。

本发明的药物组合物还可联合放射治疗给药。与其他基于Fn3的分子共给药也涵盖在本发明中。

如本文所用，“可药用载体”包括任何及所有生理上相容的溶剂、分散介质、衣料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(例如，通过注射或输注)。取决于给药路径，活性化合物，即抗体、双特异性和多特异性分子，可用保护化合物免受酸及其他可能使化合物失活的天然条件作用的材料进行包衣。

“可药用盐”是指保留亲本化合物的期望生物学活性而不带来任何不期望的毒性效应的盐(参见例如Berge，S.M.，等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及无毒有机酸(例如脂肪族单羧酸和脂肪族二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂肪族磺酸和芳族磺酸等)的那些盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等)以及无毒有机胺(例如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些盐。

本发明的组合物可通过多种本领域公知的方法给药。如技术人员将会理解的那样，给药路径和/或给药方式将取决于期望的结果。活性化合物可用防止化合物快速释放的载体配制，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可利用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多制备此类制剂的方法被授予专利或是本领域技术人员普遍已知。参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

为通过某些给药路径给药本发明的化合物，可能需要用防止化合物失活的材料包衣化合物，或与该材料共给药化合物。例如，化合物可以在适当的载体例如脂质体或稀释剂中对受试者给药。可药用的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规脂质体(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。

可药用载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于即时制备无菌注射液或分散液的无菌粉剂。此类介质和试剂用作药物活性物质的用途在本领域已知。除非与活性化合物不相容，否则任何常规介质或试剂均可以考虑在本发明药物组合物中使用。增补活性化合物也可掺入到组合物中。

治疗性组合物一般必需是无菌的，并在生产和储存条件下稳定。组合物可以配制为溶液、微乳、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)，及其适宜的混合物。恰当的流动性可例如通过应用衣料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂来维持。在许多情况下，优选在组合物中纳入等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可注射组合物的延时吸收可通过在组合物中纳入延迟吸收的药剂来实现，例如单硬脂酸盐和明胶。

无菌可注射溶液可通过按需要将处于适当溶剂中的所需量的活性化合物与一种或组合的上文列举的成分掺在一起、接着微滤除菌来制备。一般而言，分散体通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和来自上文列举的那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从之前的无菌过滤溶液得到活性成分外加任何其他期望成分的粉剂。

调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单个大剂量(bolus)，可以在一段时间给药几个分剂量，或者可以按照治疗情形的紧急性的指示，成比例地降低或增加剂量。例如，本发明Fn3基结合分子可以每周一次或两次皮下注射给药，或者每月一次或两次皮下注射。

特别有利的是以剂量单位形式配制胃肠外组合物，以易于给药和统一剂量。如本文所用的剂量单位形式是指适于作为单个剂量用于待治疗受试者的、物理上离散的单位；每个单位含有经计算可以产生期望治疗效果的预定量的活性化合物以及所需的药物载体。本发明剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：(a)活性化合物的独特特征和欲实现的特定治疗效果，和(b)个体敏感性对配制此类活性化合物用于治疗造成的本领域固有限制。

可药用抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

对于治疗组合物，本发明的制剂包括适合于口服、鼻腔、局部(包括颊和舌下)、直肠、阴道和/或胃肠外给药的那些。制剂可以便利地以单位剂量形式存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单个剂量形式的活性成分量将取决于待治疗的受试者和具体的给药方式。可与载体材料组合以产生单个剂量形式的活性成分量一般是产生治疗效果的组合物的量。一般而言，在100％当中，该量范围将是约0.001％至约90％的活性成分，优选约0.005％至约70％，最优选约0.01％至约30％。

本发明适合于阴道给药的制剂还包括含有本领域已知适当的载体的栓剂、棉塞剂、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂。用于局部或透皮给药本发明组合物的剂型包括粉剂、喷雾剂、膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与可药用的载体、与任何可能需要的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。

如本文所用的短语“胃肠外给药”和“经胃肠外给药”表示除消化道和局部给药之外的给药方式，通常通过注射，并且包括，但不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、包膜内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

本发明的药物组合物中可采用的适宜水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适宜的混合物，植物油，例如橄榄油，和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。恰当的流动性可例如通过应用衣料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂来维持。

这些组合物还可以含有助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。防止存在微生物既可以通过同前的灭菌方法、又可以通过纳入多种抗细菌剂和抗真菌剂来确保，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。还可能期望在组合物中纳入等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可注射药物形式的延时吸收可以通过纳入延迟吸收的药剂来实现，例如单硬脂酸铝和明胶。

当本发明的化合物作为药物对人和动物给药时，它们可以单独地或作为含有例如0.001-90％(更优选0.005-70％，例如0.01-30％)活性成分连同可药用载体的药物组合物给予。

不管选择的给药路径如何，本发明的化合物(其可以以适宜的水合形式应用)和/或本发明的药物组合物均可以通过本领域技术人员已知的常规方法配制成可药用的剂型。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得对于具体的患者、组合物和给药方式而言能有效实现期望治疗反应、而对该患者无毒的活性成分量。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药路径，给药时间，所采用具体化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所采用的具体组合物组合应用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、总体健康和既往病史，以及医学领域公知的类似因素。具有本领域普通技术水平的医师或兽医能够容易地确定和开处有效量的所需药物组合物。例如，医师或兽医可以以比为实现期望治疗效果所需低的水平开始药物组合物中的本发明化合物的剂量，并逐渐增加剂量，直至实现期望的效果。一般而言，本发明组合物适宜的日剂量将使化合物的量为有效产生治疗效果的最低剂量。这样的有效剂量一般将取决于上文所述的因素。优选给药是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下，优选在靠近靶部位处给药。如果期望，治疗组合物的有效日剂量可以在一整天中以适当的时间间隔分开为两个、三个、四个、五个、六个或更多个分剂量来给药，任选以单位剂量的形式。虽说可以单独给药本发明的化合物，但是优选以药物制剂(组合物)形式给药所述化合物。

治疗组合物可用本领域已知的医疗装置给药。例如，在优选的实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针头皮下注射装置给药，例如美国专利No.5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中所述的装置。可用于本发明的植入物和器件的公知实例包括：美国专利No.4,487,603，其公开了以可控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利No.4,486,194，其公开了通过皮肤给药药物的治疗装置；美国专利No.4,447,233，其公开了以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利No.4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，其公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统；以及美国专利No.4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。许多其他此类植入物、递送系统和器件为本领域技术人员已知。

在某些实施方案中，可配制本发明的分子以确保体内恰当的分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水的化合物。为确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(如果期望的话)，可例如在脂质体中配制之。有关制备脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体可以含有选择性运输到特定细胞或器官中的一个或多个部分，从而增强靶向药物递送(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。例示性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如授予Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)，其不同类型以及所发明分子的组分可以含在本发明制剂中；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；还请参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。在本发明的一个实施方案中，本发明的治疗化合物配制在脂质体中；在更优选的实施方案中，脂质体包括靶向部分。在最优选的实施方案中，脂质体中的治疗化合物通过在靠近肿瘤或感染的部位快速浓注来递送。组合物必须具有达到易于注射程度的流动性。其在制备和储存条件下必需稳定，并且必需防止其遭到微生物如细菌和真菌的污染。

在另一实施方案中，可配制本发明的分子以防止或减小跨胎盘运输。这可通过本领域已知的方法进行，例如通过聚乙二醇化Fn3基结合分子。更多参考可见Cunningham-Rundles C，Zhuo Z，Griffith B，Keenan J.(1992)Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates.Resistance to enzymatic degradation.J Immunol Methods.152：177-190；以及Landor M.(1995)Maternal-fetal transfer of immunoglobulins，Ann Allergy Asthma Immunol 74：279-283。这在Fn3基结合分子用于治疗或预防复发性自然流产时尤其有利。

化合物抑制癌症的能力可在能预测人肿瘤中的功效的动物模型系统中进行评价。可选地，组合物的这种特性可通过利用技术人员已知测定法研究化合物的抑制能力、例如体外抑制作用来评价。治疗有效量的治疗化合物能够降低肿瘤大小，或以其他方式缓解受试者症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的个头、受试者症状的严重程度以及所选择的具体组合物或给药路径等因素来确定这样的量。

就组合物可通过注射器递送而言，组合物必需是无菌流动的。除了水，载体可以是等渗缓冲盐水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适宜的混合物。例如，可通过应用衣料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂来维持恰当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中纳入等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇、和氯化钠。可注射组合物的长期吸收可通过在组合物纳入延迟吸收的药剂来实现，例如单硬脂酸铝或明胶。

当活性化合物如上文所述进行了适当的保护时，化合物可以口服给药，例如，用惰性稀释剂或可同化可食用的载体。

治疗和诊断应用

可以构建本文所述的Fn3基结合分子以结合任何目的抗原或靶标。此类靶标包括但不限于：簇结构域(cluster domains)、细胞受体、细胞受体配体、生长因子、白介素、蛋白质变应原、细菌或病毒(参见图1)。还可以修饰本文所述的Fn3基结合分子，以具有增加的稳定性和半衰期，以及其他功能部分。相应地，这些分子可在使用抗体的所有领域中采用以替代抗体，包括研究、治疗和诊断领域。另外，由于这些分子拥有比抗体优越的溶解性和稳定性特性，本文所述的抗体模拟物还可以在破坏或失活抗体分子的条件下应用。

例如，可向培养中(例如体外或离体)或受试者(例如体内)中的细胞施用这些分子，以治疗、预防或诊断多种紊乱。如本文所用的术语“受试者”旨在包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物。当Fn3分子与其他药剂一起给药时，两者可以按任何次序或同时给药。

在一个实施方案中，本发明Fn3基结合分子(及其变体、融合物和缀合物)可用来检测该分子所结合的靶标和/或双特异性/多特异性Fn3基结合分子所结合的靶标的水平。例如，这可通过使样品(例如体外样品)和对照样品与所述分子在允许分子和靶标之间形成复合物的条件下接触来实现。检测分子和靶标之间形成的任何复合物，并在样品和对照之间进行比较。例如，可利用本发明的组合物进行本领域公知的标准检测方法，如ELISA、FACS和流式细胞计测定法。

同样落在本发明范围内的是试剂盒，其含有本发明的组合物(例如，Fn3基结合分子、其变体、融合物和缀合物)和使用说明。试剂盒可进一步含有至少一种其他试剂或一种或多种其他本发明Fn3基结合分子(例如，具有互补活性、与区别于第一分子的靶抗原上的表位结合的抗体)。试剂盒一般包括表明试剂盒内含物的目的用途的标签。术语标签包括试剂盒上或与之附随提供的、或以其他方式与试剂盒相伴的任何书面或记录材料。

如上文所述，本发明的分子可以在研究、治疗和诊断领域的所有方面采用。可利用本发明Fn3基结合分子(及其变体、融合物和缀合物)治疗的例示性疾病/紊乱包括但不限于：自身免疫病、癌症、感染及其他病原性适应症。

可利用本发明Fn3基结合分子的自身免疫病的具体实例包括但不限于如下：多发性硬化及其他脱髓鞘病；类风湿性关节炎；炎性肠病；系统性红斑狼疮；I型糖尿病；炎性皮肤病；Sjogren氏综合症；和移植排斥。

可利用本发明Fn3基结合分子的癌症的具体实例包括但不限于如下：肺癌；乳腺癌；前列腺癌；膀胱癌；黑色素瘤；非霍奇金淋巴瘤；结肠直肠癌；胰腺癌；子宫内膜癌；肾癌；皮肤癌(非黑色素瘤)；白血病；和甲状腺癌。

VEGF相关疾病的具体实例包括例如与不当血管生成相关的许多病情，包括但不限于自身免疫病(例如类风湿性关节炎、炎性肠病或银屑病)；心脏紊乱(例如动脉粥样硬化或血管再狭窄)；视网膜病(例如泛化增生性视网膜病、糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性或新生血管性青光眼)；肾病(例如糖尿病肾病；恶性肾硬化；血栓性微血管病综合症；移植排斥；炎性肾病；肾小球肾炎；膜增生性肾小球肾炎；溶血性尿毒症综合征和高血压性肾硬化)；血管母细胞瘤；血管瘤；甲状腺增生；组织移植；慢性炎症；Meigs综合症；心包积液；胸腔积液；自身免疫病；糖尿病；子宫内膜异位；慢性哮喘；不期望的纤维化(特别是肝纤维化)和癌症，以及因癌症引起的并发症，例如胸腔积液和腹水。Fn3基结合分子可用来治疗或预防过度增生性疾病或癌症以及癌症的转移扩散。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、软骨癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴结癌、神经组织癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、骨骼肌癌、皮肤癌、脊髓癌、脾癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、气管癌、泌尿生殖道癌、输尿管癌、尿道癌、子宫癌或阴道癌。其他可治疗的病情可见美国专利号6,524,583，在此并入作为参考。描述过VEGFR-2结合多肽用途的其他参考文献包括：McLeod DS等，Invest Ophthalmol Vis Sci.2002年2月；43(2)：474-82；Watanabe等Exp Dermatol.2004年11月；13(11)：671-81；Yoshiji H等，Gut.2003 Sep；52(9)：1347-54；Verheul等，Oncologist.2000；5 Suppl 1：45-50；Boldicke等，Stem Cells.2001；19(1)：24-36。如本文所述，血管生成相关疾病包括但不限于：血管生成依赖性癌症，包括例如实体瘤、血液传播肿瘤例如白血病以及肿瘤转移。良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和脓性肉芽肿；炎性紊乱，例如免疫和非免疫性炎症；慢性关节风湿病和银屑病；眼部血管生成性疾病，例如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶体后纤维增生症、虹膜红变；Osler-Webber氏综合症；心肌血管新生；斑块内新生血管形成；毛细血管扩张；血友病性关节病；血管纤维瘤；和创面肉芽(wound granulation)以及创面愈合；毛细血管扩张、银屑病、硬皮病、脓性肉芽肿、冠状动脉侧支病、肢体缺血后血管发生、角膜疾病、虹膜红变、关节炎、糖尿病性新生血管形成、骨折、血管发生(vasculogenesis)、造血(参见例如WO2005056764)。

可利用本发明Fn3基结合分子的感染的具体实例包括但不限于如下：细胞、真菌、细菌和病毒感染。

本发明进一步通过如下实施例举例说明，其不应阐释为进一步的限制。本申请通篇引述的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容明确并入本文作为参考。

实施例

实施例1

生产基于纤连蛋白的结合分子文库

一般而言，除非另有说明，本发明的实施采用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(特别是例如抗体技术)的常规技术、和多肽制备的标准技术。参见例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology)，510，Paul，S.，Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：A Practical Approach(Practical Approach Series，169)，McCafferty编辑，Irl Pr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等，C.S.H.L.Press，Pub.(1999)；和Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，John Wiley & Sons(1992)。适合用来实施本发明的其他方法、技术和序列见美国专利No.7,153,661；7,119,171；7,078,490；6,703,199；6,673,901和6,462,189。

利用人纤连蛋白10(Fn3¹⁰)来设计、分离和工程化单特异性结合剂。首先利用标准选择方法独立地自两个文库分离初始结合剂。然后诱变该富集的群体，并进行后续多轮随机诱变和富集，以获得期望的单特异性结合剂。

文库构建

使用如SEQ ID NO：1所示的野生型Fn3¹⁰序列作为基础，生成利用顶部或底部环的结合剂的文库。

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEI(SEQ ID NO：1)

利用计算模建，选择野生型Fn3¹⁰的两组可变区进行随机化。第一组包含接触溶剂的顶环BC、DE和FG，命名为文库A，并在SEQ ID NO：2中黑体显示的区域随机化。

文库A(具有接触溶剂的顶环BC、DE和FG的β-夹层结构)。

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISW

RYYRITYGETGGNSPVQEFTV

TATISGLKPGVDYTITVYAVT

PISINYRTEI(SEQ ID NO：2)

第二组包含接触溶剂的底环AB、CD、EF和C-末端，命名为文库B，并在斜体显示的下划线区域随机化。

文库B(具有接触溶剂的底环AB、CD、EF和C-末端的β-夹层结构)。

VSDVPRDLEVVAAT

LLISWDAPAVTVRYYRITYG

QEFTVPGSKSTATI

GDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINY

T

(SEQ ID NO：3)

在德国GeneartAG公司优化对应于两个文库的DNA序列用于大肠杆菌中进行表达。分别将SEQ ID NO：2和3的粗体或下划线斜体区域合成为简并位置。文库由合成的简并寡核苷酸和凝胶纯化的对应于全长片段的基因来组装。扩增利用末端引物进行，而随后将扩增文库连接到克隆载体pCR-Script中得到起始文库。然后独立筛选文库A和B，以如下文实施例2所述鉴定单特异性结合剂。

实施例2

筛选单特异性纤连蛋白基结合分子

本发明描述了如何对实施例1所述的文库A和B中生成的纤连蛋白单特异性结合剂进行筛选。利用同源重组法将文库A和B均独立亚克隆到酵母展示载体例如pYD1(Invitrogen)中，并利用标准分子生物学技术转化到适宜菌株例如EBY100中。

基本上按照Lipovsek，D.等(J MoI Biol.2007 May 11；368(4)：1024-41)之前公开的方法，进行些许微小改动，呈递和选择针对鸡蛋溶菌酶的纤连蛋白基结合剂。独立地筛选两个文库，寻找鸡蛋清溶菌酶的结合剂。

(i)利用磁珠分选来选择对鸡蛋清溶菌酶的结合

对于所有选择，呈现¹⁰Fn3基分子的文库A或B的酵母培养物在含半乳糖的培养基(90％SG-CAA/10％SD-CAA，50μg/mL卡那霉素，100U/mL青霉素G，200U/mL链霉素)中于30℃诱导18小时。10⁹诱导的文库A或B的酵母细胞用25mL冰冷的磷酸缓冲盐水(PBS)，pH 7.4，2mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5％牛血清白蛋白(BSA)洗涤，然后在5mL含有1μM生物素化鸡蛋清溶菌酶(HEL-b，Sigma，St.Louis，MO)的相同缓冲液中室温轻摇孵育1小时。孵育后，样品在冰上冷却，用25mL冰冷PBS，pH 7.4，2mM EDTA，0.5％BSA洗涤，并重悬于2.5mL相同的缓冲液中。向酵母中添加100-μL等份试样的链霉亲和素微磁珠(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，并在冰上孵育10分钟。向样品中添加冰冷PBS，pH 7.4，2mM EDTA，0.5％BSA至总体积25mL，之后即刻在AutoMACS细胞分离器(Miltenyi Biotec)上利用阳性筛选稀有细胞的预设程序(possel_s)进行分离。选择的细胞收集在6mL SD-CAA，pH 4.5，50μg/mL卡那霉素，100U/mL青霉素G，200U/mL链霉素中；通过系列稀释接着涂在SD-CAA琼脂板上来定量；并在50mL相同培养基中于30℃培养2天。

(ii)利用荧光激活细胞分选来选择对鸡蛋清溶菌酶的结合

后续多轮选择通过FACS进行，以2×10⁶至3×10⁶诱导的酵母细胞开始。细胞用1mL PBS，pH 7.4，0.1％BSA洗涤，重悬于100μL含有生物素化鸡蛋清溶菌酶的相同缓冲液中，并在室温轻摇孵育1小时。

在用1mL冰冷PBS，pH 7.4，0.1％BSA洗涤之后，细胞用抗体和链霉亲和素标记。利用FITC缀合的小鼠单克隆抗c-myc抗体(AbD Serotec)来标记表面展示c-myc标记的抗体模拟物的酵母，并利用PE标记的链霉亲和素(Invitrogen)或抗生物素抗体(Miltenyi)来标记与结合溶菌酶的抗体模拟物相连的HEL-b。对用FITC缀合的小鼠抗c-myc抗体和PE缀合的链霉亲和素(Invitrogen)标记的酵母细胞进行FACS分选。

双标记的酵母细胞在Dako MoFlo高速细胞分选仪上以488nm激发光、6000-10,000细胞/秒进行分选。调整门控，以收集具有最高的0.1-1％的HEL-b-相关信号(PE)并处于表达相关信号(FITC)的前半部内的酵母细胞。通过使用相同抗体和链霉亲和素试剂但在无HEL-b的情况下标记的样品副本，以避免选择结合检测试剂而非溶菌酶的细胞。

对于所有文库，头两轮FACS分选在用1μM HEL-b标记的酵母上进行。一旦在存在而非不存在HEL-b时观察到用PE标记的细胞群，则HEL-b的浓度在后续轮中降低一个数量级。选择的细胞收集在0.5mL SD-CAA，pH 4.5，50μg/mL卡那霉素，100U/mL青霉素G，200U/mL链霉素中。收集的细胞在5mL相同的培养基中于30℃震荡培养2天至饱和，之后诱导并标记以进行下一轮分选。

经数轮FACS分选之后，将最终的富集群涂布在SDCAA板上，并于30℃孵育2天。利用Genetix Clonepix挑取单菌落，并重新列阵到含SD-CAA培养基的96孔板中。经24小时孵育之后，通过离心收集细胞，并重悬于SD-GAA培养基中，以诱导表面表达的独特Fn3分子。阳性克隆通过标准ELISA鉴定。纯化对应于独特Fn3阳性克隆的质粒DNA，并测序以鉴定单特异性结合剂。

一旦从文库A或B中鉴定并选择到单特异性结合剂，则可独立地利用其生成治疗性分子。尤其是，由文库B生成的利用Fn3分子底环的单特异性结合剂，可用来生成针对目的靶标的新治疗性结合分子。来自文库B的多个单特异性结合剂可用接头组合以产生能够与单个靶标(例如TNF)的一个或多个区域结合的Fn3结合分子。可选地，来自文库B的包含Fn3结合分子的结合剂还可设计成与多个靶标的一个或多个区域(例如HAS和TNF的一个或多个区域)结合。

另外，从文库A和文库B生成的单特异性结合剂可利用标准分子生物学技术组合，以如下文实施例3所述生成双特异性和多特异性结合剂。

实施例3

生成双功能纤连蛋白基结合分子

在人Fn3的X-射线结构上计算建模所述随机化区域，表明通过组合文库A和B各自的单特异性结合剂能够创建双特异性纤连蛋白结合分子。这些结合分子可工程化，从而它们识别相同靶分子上不同的区域，或者双特异性或多特异性纤连蛋白分子的不同结合位点能够与两个或更多个不同靶标上的不同区域结合。

例如，对应于结合剂A(通过筛选文库A获得)的适宜序列和对应于结合剂A(通过筛选文库B获得)的适宜序列可组合成为单个分子以生成双特异性分子。

通过筛选文库A(具有接触溶剂的顶环BC、DE和FG的β-夹层结构)鉴定的结合剂A。

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWXXXXXXXRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPXXXXTATISGLKPGVDYTITVYAVTXXXXXXXXXXPISINYRTEI(SEQ ID NO：4)

其中X是任意氨基酸序列。

通过筛选文库B(具有接触溶剂的底环AB、CD、EF和C-末端的β-夹层结构)鉴定的结合剂B。

VSDVPRDLEVVAATZZSLLISWDAPAVTVRYYRITYGZZZZZZZVQEFTVPGSKSTATIZZZZZGZDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYZTZZ(SEQ ID NO：5)

其中Z是任意氨基酸序列。

通过组合筛选文库A(具有接触溶剂的顶环BC、DE和FG的β-夹层结构)和B(具有接触溶剂的底环AB、CD、EF和C-末端的β-夹层结构)所获得的序列而鉴定的结合剂C。将两个序列合并成一个分子得到双特异性结合剂C。

VSDVPRDLEVVAATZZSLLISWXXXXXXXRYYRITYGZZZZZZZVQEFTVPXXXXTATIZZZZZGZDYTITVYAVTXXXXXXXXXXPISINYZTZZ(SEQ ID NO：6)

其中X和Z是任意氨基酸序列。

然后在德国Geneart AG公司合成并优化对应于结合剂C的组合氨基酸序列的DNA以在大肠杆菌中表达。克隆到大肠杆菌中和随后的纯化遵循第4章(制备方法)所列的标准方案。

可选地，双功能Fn3基结合分子可通过将两个或更多个单特异性Fn3基结合分子连接起来而生成。

实施例4

生成利用底环结合靶标的单特异性纤连蛋白基结合分子

重复实施例2所述的实验细节以生成利用纤连蛋白底环结合半衰期延长剂HSA的单特异性Fn3基结合分子。使用另外的文库生成利用底环结合溶菌酶的单特异性Fn3基结合分子。

(a)从酵母中分离富集库

经数轮选择后，测定所选群的序列。利用Zymoprep试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)从各选择的酵母群的1mL饱和培养物中提取质粒DNA，并将2μL质粒转化到电感受态Top 10大肠杆菌(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。对96个克隆进行了质粒小量制备物制备和序列分析。

(b)亚克隆到大肠杆菌中

编码富集的纤连蛋白库的基因克隆到图6所示的pNAT40载体中，并将构建体转化到电感受态Acella大肠杆菌菌株(Gaithersburg，MD)中。选择和测序了许多克隆。所选的潜在Fn3基HSA结合剂克隆的氨基酸序列，连同共有结合序列(SEQ ID NO：42)示于图7。图8显示了所选的潜在Fn3基溶菌酶结合剂克隆的氨基酸序列。

选择HSA文库的个体克隆，通过菌落挑取器(colony picker)(Genetix Clonepix2，Boston，MA)用于接种96深孔板中含100μg/ml卡那霉素的1ml过夜表达培养基(OvernightExpress media，Novagen，Gibbstown，NJ)，并于37℃剧烈震荡培养过夜。第二天通过3000rpm离心15分钟收获细胞沉淀，弃掉上清液。深孔板在-80℃冷冻两次各30分钟，并在室温融化。随后，添加含TBS、具有0.2mg/ml溶菌酶和1mM EDTA的250μl裂解缓冲液，板在室温孵育1小时，接着添加含0.1mg/ml DNasel、10mM MgCl₂的250μl TBS，在室温孵育另外1小时。

裂解的细胞悬液转移到96孔Multiscreen HTS(Millipore，Billerica，MA)上，通过离心使上清液澄清。澄清的含有潜在Fn3基HSA结合剂的上清液随后用来进行ELISA试验，如下文实施例5所述。

实施例5

单特异性纤连蛋白基结合分子的结合表征

该实施例首次举例说明了能够通过修饰Fn3的至少一个底环(例如环AB、CD和/或EF)而，成功产生利用所述底环结合靶标的Fn3基分子，而生成Fn3基结合分子。在该实施例中，研究了潜在的基于Fn3的HSA结合剂。

为评价结合特征，使用了ELISA试验。预处理ELISA板(Nunc Maxisorb)的每个孔用100μl 1.0μg/mL HSA的PBS溶液包被，盖上塑料膜，并在4℃孵育过夜。第二天除去包被液，板用PBS洗涤两次。每孔通过添加200μL 25mg/ml酪蛋白/PBS来封闭孔，并在潮湿密闭容器中于37℃孵育1小时。在除去封闭液并用PBS洗涤两次之后，添加50μl事先制备的表达潜在单特异性结合剂的大肠杆菌裂解物，并震动孵育1小时。随后板用PBS/Tween 20(0.05％)缓冲液洗涤5次，接着添加于0.25％酪蛋白/PBS中稀释的HRP缀合的抗His标签抗体(Abeam，Cambridge，MA)制品，每孔50μL。孵育1小时之后，除去His标签抗体溶液，且板用PBS/Tween 20(0.05％)洗涤5次。最后ELISA通过添加底物溶液(SureBlue TMB微孔底物溶液，KPL)显色，每孔50μL。选择阳性克隆，随后进行表达筛选以鉴定候选物用于大规模生产。

图9显示了来自所选克隆的His标记的纤连蛋白的人血清白蛋白特异性ELISA分析的代表性非限制性实例。向ELISA板的孔中添加可溶性纤连蛋白Fn10结构域的粗裂解物，所述ELISA板用HSA抗原包被，且另外用PBS+1％酪蛋白封闭。基于Fn3的HSA结合剂的检测利用单克隆HRP缀合的抗His抗体进行。ELISA如上文所述通过TMB底物显色。通过ELISA读数器测量450nm的OD值(Y轴)。每个柱代表一个个体克隆提取物。数据显示，许多克隆为阳性Fn3基HSA结合剂，展示出比背景高约3倍的结合。该结果首次证明纤连蛋白分子的底环可用来结合靶标例如HSA。

为纯化表达的单特异性Fn3基HSA结合剂，将澄清的裂解液转移到96孔深孔板中，并添加20μL 50％(v/v)荷载Ni²⁺的MagneHis珠浆(Promega)。利用KingFisher机器人(Thermo Scientific)进行自动纯化。在30分钟孵育后，珠子以1ml洗涤缓冲液/孔(50mM磷酸盐，1M NaCl，20mM咪唑，pH 7.6)洗涤两次。最后结合的纤连蛋白用200μl PBS+300mM咪唑pH 7.6洗脱。等分试样的粗提取物和洗脱物通过SDS凝胶电泳分析(数据未显示)。

为进一步证明底部Fn3基HSA结合剂能够成功地表达，在大肠杆菌中进行小规模总体表达实验。来自24个构建体的总体表达的样品在26孔Novex BisTris 4-2％NuPAGE凝胶(Invitrogen)上进行分析。泳道1含有分子量大小标准SeeBlue plus2(Invitrogen)。结果显示了具有修饰底环的纤连蛋白分子在大肠杆菌中的成功表达。在绝大多数所选的克隆中出现约16kDa(对应于纤连蛋白Fn10(～11-12kDa)加上N-末端His标签、S标签和prescission切割位点)的蛋白质条带，如图10所示。这些结果进一步证明所述单特异性Fn3基结合分子能够成功在大肠杆菌中表达并保留结合活性。

为证明表达的蛋白质能够纯化而对蛋白质结构无不利影响(例如降解)，如上文所述纯化样品，并在26孔Novex BisTris 4-2％NuPAGE凝胶(Invitrogen)上进行分析。泳道1含有分子量大小标准Mark 12(Invitrogen)。在大多数克隆中清晰地出现了16kDa的条带，如图10所示。质谱分析证实了正确分子量处存在纯化了的纤连蛋白，如表1所示。

表1：基于Fn3的纤连蛋白结合分子的质谱分析

克隆编号	分子量
		克隆1	16076
克隆2	16265
		克隆3	12112
克隆4	ND
		克隆5	16395
克隆6	ND
		克隆7	16274
克隆8	16321
		克隆9	ND
克隆10	ND
		克隆11	ND
克隆12	16274
		克隆13	16394

克隆14	ND
		克隆15	ND
克隆16	ND
		克隆17	ND
克隆18	16482
		克隆19	16275
克隆20	16380
		克隆21	16274
克隆22	18319
		克隆23	ND
克隆24	ND

ND＝未测

总的来说，所述结果首次表明能够生成Fn3基结合分子，其中修饰至少一个底环从而其与靶标结合。迄今为止，一般是分析顶环与靶标的结合，主要是因为与底环相比，顶环与抗体序列的比对更佳。本文提供的结果证明，能够修饰底环而不会不利地影响分子的稳定性。因而，能够生成Fn3基结合分子文库，其中修饰至少一个底环从而其与靶标结合。对于HSA文库，底环保持与野生型Fn3相同的长度而被修饰。对于溶菌酶文库，底环与野生型Fn3相比长度变化，而对蛋白质结构无不利影响。此外，这些具有修饰底环的单特异性Fn3基结合分子维持构象稳定性，并且能够表达和纯化同时保留结合能力。因而，本发明的方法能够用来生成具有至少一个修饰的底环的Fn3基结合分子以及利用底面结合靶标的Fn3基结合分子的文库。

实施例6

生成和表征多特异性基于纤连蛋白的结合分子

该实施例展示了多特异性Fn3基结合分子的生产和表征，其中两个单独的单特异性Fn3基结合分子利用接头序列以珍珠样方式连接在一起，以生成多特异性例如双特异性分子。双特异性分子设计如下。下文所示的VEGFR2结合序列(SEQ ID NO：117)利用短GS接头序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：118)与图7标识、下文所示的鉴定的底部HSA结合剂(SEQ ID NO：8)融合，以生成下文所示SEQ ID NO：119的多特异性Fn3基结合分子。所述构建体通过DNA2.0合成，并亚克隆到表达载体pjExpress 401中。克隆、纯化和ELISA遵循上文所列的标准方案。

VEGFR顶侧序列

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPLATISGLKPGVDYTITVYAVTKERNGRELFTPISINYRT(SEQ ID NO：117)

图7的底侧序列8

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGRTDAKSTRKEFTVPGSKSTATIGELKRGRDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRPEK(SEQ ID NO：8)

利用GS接头融合的VEGFR2-图7底侧序列8(克隆87)

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPLATISGLKPGVDYTITVYAVTKERNGRELFTPISINYRTGGGGSGGGGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGRTDAKSTRKEFTVPGSKSTATIGELKRGRDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRPEKENLYFQGHHHHHH(SEQ ID NO：119)

该多特异性分子的ELISA结合研究示于图13，并在实施例7中更详细地讨论。

为证明多特异性Fn3基结合分子能够由该分子的大规模表达而纯化，使用

等所述的方法(

等Nature Methods(2008)5，135-146)。利用10ml起子培养物(～1/100终培养物体积)接种含25ug/ml卡那霉素的基本培养基，并于37℃175rpm孵育过夜。第二天早上，利用10ml起始培养物接种到2.8L Fernbach摇瓶的具有100ug/ml卡那霉素的1升过夜表达培养基中。细胞于37℃175rpm孵育，直至600nm(OD600)的光密度达到1-1.5。然后使培养物温度降至18℃以开启表达，且培养物在18℃维持过夜进行持续表达。通过4500xg离心10分钟收获细胞。称重细胞，并添加1倍体积(v/w)的裂解缓冲液(0.1M磷酸钠，pH 8.0，1.0M NaCl，20mM咪唑，10％(v/v)甘油，1mM TCEP和20单位/ml Benzonase)。向细胞悬液中添加1mg/ml溶菌酶，在冰上孵育30分钟之后，悬液间歇超声破碎1-2分钟。裂解物用2-3倍体积的裂解缓冲液稀释，并加入1ml Ni-NTA树脂。通过在250ml锥形瓶中于4℃缓慢震摇上清液1小时进行结合。树脂收集在20ml一次性柱中，并用上样缓冲液(0.05M磷酸钠，pH 8.0，0.5M NaCl，20mM咪唑，5％(v/v)甘油，0.5mM TCEP)洗涤直至不再有蛋白质洗脱出(每为20-30柱体积)。结合的蛋白质用洗脱缓冲液(0.05M磷酸钠，pH 8.0，0.5M NaCl，0.3M咪唑，5％(v/v)甘油，0.5mM TCEP)洗脱。鉴定峰值级分，汇集在一起，并上样到用缓冲液S(50mM Hepes，50mM NaCl pH 7.6)平衡的MonoS 5/50 GL柱(GE)上。Ni-NTA洗脱物用缓冲液S进行10倍稀释，并上样到预平衡柱上。用10倍体积的缓冲液S洗涤之后，蛋白质用线性梯度(缓冲液S中50mM至1M NaCl)洗脱。级分通过SDS-PAGE和质谱分析。

图12中左图显示了克隆87不同纯化步骤的SDS-PAGE。泳道1，总蛋白。泳道2，粗提物；泳道3，Ni-NTA流过液；泳道4，Ni-NTA洗涤液；泳道5，Ni-NTA，洗脱物；泳道6，Mono S洗脱物。右图显示了纯化样品(MW 23404 D)的质谱，与克隆87的切割掉N-末端甲硫氨酸的蛋白质的预期质量一致。

实施例7

生成和表征双特异性基于纤连蛋白的结合分子

该实施例展示了双特异性Fn3基结合分子的生产和表征，其中单个纤连蛋白分子的顶环和底环均被修饰，从而该单个纤连蛋白分子能够结合两个分开的靶标，例如VEGFR2和HSA。

双特异性分子通过将底侧HSA结合环序列移植到顶侧VEGFR2结合剂上生成，由此产生具有双功能的分子，其中同一Fn3分子的顶环和底环两者可用来结合两个不同的靶分子。为创建双特异性分子，底侧结合剂(SEQ ID NO：8)环(示于上文)移植到VEGFR2结合剂(SEQ ID NO：117)(示于上文)上，即切下所述底环并将其插入到VEGFR2结合剂中，得到VEGFR2-HAS(SEQ ID NO：120)分子。所述构建体通过DNA2.0合成，并亚克隆到表达载体pjExpress 401中。克隆、纯化和ELISA遵循上文所列的标准方案。

VEGFR2/底侧SEQ ID NO：8合并分子(克隆89)

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGRTDAKSTRKEFTVPLQPPLATIGELKRGRDYTITVYAVTKERNGRELFTPISINYRPEKENLYFQGHHHHHH(SEQ ID NO：120)

(a)来自实施例6和7的双重特异性纤连蛋白结合分子的ELISA：

来自实施例6和7的多特异性和双特异性结合剂的结合特征评估如下。VEGFR2-Fc融合蛋白固定在预处理的ELISA板(NuncMultisorb)上，另外用PBS+1％酪蛋白封闭。向孔中添加等分试样野生型Fn10(泳道1)、克隆87(多特异性)(泳道2)、克隆89(双特异性)(泳道3)和PBS的澄清裂解物，并在室温孵育1小时。这些以不同的浓度1、2和3进行。在用PBS/0.05％吐温洗涤5次之后，孔与溶于PBS的1μg/ml HSA孵育。检测利用HRP缀合的鸡抗人HSA抗体(Abeam)进行。ELISA用TMP底物显色，并测量450nm的OD值。结果示于图13。

用粗提物中存在的多特异性和双特异性Fn3基结合分子均获得了一致可再现的结果，表明克隆87(多特异性)和克隆89(双特异性)与HSA和VEGFR2均结合。数据证明能够产生多特异性和双特异性Fn3分子，其中单特异性纤连蛋白结合分子之一具有至少一个能够结合HSA的修饰底环(AB、DE、FG)(见图13)。

多特异性Fn3分子(克隆87)具有借助于G-S接头连接在一起的两个独立的单特异性Fn3分子。一个单特异性Fn3分子具有与HSA结合的修饰底环，而另一个单特异性Fn3分子具有与VEGFR2结合的修饰顶环。所得多特异性分子保留利用各单特异性纤连蛋白分子与两个不同靶标结合的能力。该数据显示单特异性Fn3分子能够以珍珠样方式连接在一起以创建多特异性Fn3分子；接头并不干扰各单体Fn3分子的结合能力；且多特异性Fn3分子能够与两个不同的靶标结合而没有任何空间位阻问题。

双特异性纤连蛋白分子(克隆89)是工程化的单个纤连蛋白分子，从而底环与HSA结合，而顶环与VEGFR2结合。该单个双特异性纤连蛋白分子与HSA和VEGFR2两者成功地结合。图13显示，单个双特异性纤连蛋白分子能够与HSA和VEGFR2两者结合而没有任何空间位阻问题。该数据首次显示，能够产生双特异性纤连蛋白分子；所述双特异性纤连蛋白分子各侧环的结合能力得以保留；在底环和顶环同时均被修饰下，双特异性纤连蛋白分子的结构构象得以维持；顶环和底环彼此独立地发挥功能以结合单独的靶标；且双特异性Fn3分子能够与两个不同的靶标结合而没有任何空间位阻问题。

(b)来自实施例6和7的双重特异性纤连蛋白结合分子的Biacore：

利用BIAcore T100(GE)测量纤连蛋白基支架结合性蛋白对靶标的结合动力学。抗人IgG(GE，人IgG捕获试剂盒)Fc特异性抗体固定在CM5传感器芯片上，将可溶性VEGFR2-huFc融合蛋白捕获在表面上。可溶性纤连蛋白克隆87(多特异性)以于缓冲液0(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐温20，pH 7.4)中的100nM(顶线)和200nM(底线)注射。获取各浓度的传感图，并测定速率常数ka(k_on)和kd(k_off)。亲和力常数KD根据速率常数k_off/k_on的比值计算。

克隆87的结果示于图14和15，分别针对结合VEGFR2的顶环和结合HSA的底环。该数据表明，包含以G-S接头连接在一起的两个独立单特异性Fn3分子的多特异性纤连蛋白利用底环和顶环成功地与两个单独的靶分子结合。

对克隆89即单个双特异性Fn3分子重复进行了相同的实验，并获得了相似的结果(数据未显示)。

总的来说，这些结果首次表明了能够产生多特异性和双特异性纤连蛋白分子。这些分子在大肠杆菌中成功表达，纯化而无降解，保留结合能力，且能够与两个单独的靶标结合。

等同物

本领域技术人员将会意识到或者仅仅通过常规实验就能够确认本文所述本发明具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在涵盖在如下权利要求书的范围内。

Claims (43)

1.包含Fn3结构域的基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，其中与包含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比，该Fn3结构域的底部AB、CD、EF环区或C-末端之一个或多个中的至少一个氨基酸被改变，以产生与特定靶标结合的非Fn3结合序列。

2.权利要求1的Fn3基结合分子，其中所述至少一个氨基酸残基选自下组：SEQ ID NO：1第15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95和96位的氨基酸。

3.权利要求1或2的Fn3基结合分子，其中非Fn3结合序列包含抗体或T细胞受体的互补决定区(CDR)的全部或部分。

4.权利要求1的Fn3基结合分子，其中特定靶标是半衰期延长剂。

5.权利要求4的Fn3基结合分子，其中半衰期延长剂是人血清白蛋白。

6.权利要求1的Fn3基结合分子，其中特定靶标是溶菌酶。

7.包含第一Fn3结构域的Fn3基结合分子，其中与包含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比，该Fn3结构域底部AB、CD、或EF环区或C-末端之一个或多个中的至少一个氨基酸被改变，以产生与第一靶标结合的非Fn3结合序列，且其中与包含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比，第二Fn3结构域的底部AB、CD、或EF环区或C-末端之一个或多个中的至少一个氨基酸被改变，以产生与第二靶标结合的非Fn3结合序列。

8.权利要求7的Fn3基结合分子，其中所述第一和第二靶标存在于同一分子上。

9.权利要求7的Fn3基结合分子，其中所述第一和第二靶标存在于不同的分子上。

10.包含第一Fn3结构域的Fn3基结合分子，其中与包含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比，该Fn3结构域的底部AB、CD、或EF环区或C-末端之一个或多个中的至少一个氨基酸被改变，以产生与半衰期延长剂结合的非Fn3结合序列，且其中与包含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比，第二Fn3结构域的底部AB、CD、或EF环区或C-末端之一个或多个中的至少一个氨基酸被改变，以产生与第二靶标结合的非Fn3结合序列。

11.权利要求10的Fn3基结合分子，其中半衰期延长剂是人血清白蛋白。

12.权利要求10的Fn3基结合分子，其中第二靶标是VEGFR2。

13.包含Fn3结构域的双特异性Fn3基结合分子，其中与包含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比，该Fn3结构域的底部AB、CD、或EF环区或C-末端之一个或多个中的至少一个氨基酸被改变，以产生与第一靶标结合的非Fn3结合序列，且其中与包含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比，该Fn3结构域的顶部BC、DE或FG环区之一个或多个中的至少一个氨基酸被改变，以产生与第二靶标结合的非Fn3结合序列。

14.权利要求13的双特异性Fn3基结合分子，其中所述底部AB、CD或EF环区中的至少一个氨基酸选自下组：SEQ ID NO：1第15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95和96位的氨基酸，且其中所述顶部BC、DE或FG环区中的至少一个氨基酸选自下组：SEQ ID NO：1第21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、51、52、53、54、55、56、76、77、78、79、80、80、81、82、83、84、85、86、87和88位的氨基酸。

15.权利要求13或14的双特异性Fn3基结合分子，其中非Fn3结合序列包含抗体或T细胞受体的互补决定区(CDR)的全部或部分。

16.权利要求13至15中任一项的双特异性Fn3基结合分子，其中所述第一和第二靶标存在于同一分子上。

17.权利要求13至14的双特异性Fn3基结合分子，其中所述第一和第二靶标存在于不同的分子上。

18.包含Fn3结构域的双特异性Fn3基结合分子，其中与包含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比，该Fn3结构域的底部AB、CD、或EF环区或C-末端之一个或多个中的至少一个氨基酸被改变，以产生与半衰期延长剂结合的非Fn3结合序列，且其中与包含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比，该Fn3结构域的顶部BC、DE或FG环区之一个或多个中的至少一个氨基酸被改变，以产生与第二靶标结合的非Fn3结合序列。

19.权利要求18的双特异性Fn3基结合分子，其中半衰期延长剂是人血清白蛋白。

20.权利要求18的双特异性Fn3基结合分子，其中第二靶标是VEGFR2。

21.多特异性Fn3基结合分子，包含两个或更多个前述权利要求中任一项的Fn3基结合分子。

22.权利要求21的多特异性Fn3基结合分子，其中每一个所述Fn3基结合分子与不同的靶标结合。

23.权利要求22的多特异性Fn3基结合分子，其中所述不同的靶标存在于同一分子上。

24.权利要求22的多特异性Fn3基结合分子，其中所述不同的靶标存在于不同的分子上。

25.前述权利要求中任一项的Fn3基结合分子，其与增加该Fn3基结合分子半衰期的非Fn3部分结合。

26.包含两个或更多个单特异性Fn3基结合分子的多特异性Fn3基结合分子，其中至少一个单特异性Fn3基结合分子在Fn3结构域的底部AB、CD、EF环区或C-末端之一个或多个中包含与含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比改变了的至少一个氨基酸，以产生与第一靶标结合的非Fn3结合序列；且其中第二单特异性Fn3基结合分子在Fn3结构域的顶部BC、DE或FG环区之一个或多个中包含与含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比改变了的至少一个氨基酸，以产生与第二靶标结合的非Fn3结合序列，其中所述第一和第二单特异性Fn3基结合分子通过接头序列相连。

27.权利要求26的多特异性Fn3基结合分子，还包含第三单特异性Fn3基结合分子，其在Fn3结构域的顶部BC、DE或FG环区之一个或多个中具有与含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比改变了的至少一个氨基酸，以产生与一个或多个靶标结合的非Fn3结合序列，且其中第二和第三单特异性Fn3基结合分子通过接头序列相连。

28.权利要求26的多特异性Fn3基结合分子，其中第一靶标是半衰期延长剂。

29.权利要求28的多特异性Fn3基结合分子，其中半衰期延长剂是人血清白蛋白。

30.权利要求26的多特异性Fn3基结合分子，其中第二靶标是VEGFR2。

31.权利要求26的多特异性Fn3基结合分子，其中接头序列是G-S接头序列。

32.Fn3基结合分子，包含SEQ ID NO：119(克隆87)。

33.Fn3基结合分子，包含SEQ ID NO：120(克隆89)。

34.缀合物，其包含与一个或多个非Fn3部分连接的前述权利要求中任一项的Fn3基结合分子。

35.权利要求34的缀合物，其中非Fn3部分包含或结合增加Fn3基结合分子半衰期的分子。

36.权利要求34-35中任一项的Fn3基结合分子或缀合物，其中非Fn3部分包含选自下组的分子：抗体Fc区、人血清白蛋白(HSA)和聚乙二醇(PEG)。

37.前述权利要求中任一项的Fn3基结合分子或缀合物，其还包含与含SEQ ID NO：1的野生型Fn3结构域相比至少一个修饰的氨基酸残基，用来连接功能部分。

38.权利要求37的Fn3基结合分子或缀合物，其中修饰的氨基酸残基包括半胱氨酸残基或非天然氨基酸残基的添加或取代。

39.前述权利要求中任一项的Fn3基结合分子或缀合物，其包含来自两个或更多个不同Fn3结构域的β链。

40.组合物，包含前述权利要求中任一项的Fn3基结合分子或缀合物以及载体。

41.治疗受试者的疾病的方法，所述疾病选自下组：自身免疫病、癌症和感染性疾病，所述方法包括向受试者施用前述权利要求中任一项的Fn3基结合分子、缀合物或组合物。

42.检测样品中的蛋白质的方法，包括标记前述权利要求中任一项的Fn3基结合分子或缀合物，使标记的结合分子或缀合物与样品接触，并检测Fn3基结合分子或缀合物和蛋白质之间的复合物形成。

43.多样化核酸文库，其编码权利要求1、7、10、18、21和26中任一项的Fn3基结合分子。

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