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JP2017525698A - Ｓｉｒｐ−アルファ免疫グロブリン融合タンパク質 - Google Patents

Ｓｉｒｐ−アルファ免疫グロブリン融合タンパク質 Download PDF

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JP2017525698A JP2017508075A JP2017508075A JP2017525698A JP 2017525698 A JP2017525698 A JP 2017525698A JP 2017508075 A JP2017508075 A JP 2017508075A JP 2017508075 A JP2017508075 A JP 2017508075A JP 2017525698 A JP2017525698 A JP 2017525698A
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エー．イー． ジズルスパージャー，ノラ
エー．イー． ジズルスパージャー，ノラ
シルカー，アループ
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メルク パテント ゲーエムベーハー
メルク パテント ゲーエムベーハー
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Abstract

本発明は、ＣＤ４７および腫瘍細胞抗原の両方に結合するように設計される免疫グロブリン融合タンパク質を開示する。免疫グロブリン融合タンパク質は、ＣＤ４７に結合するＳＩＲＰα部分および腫瘍細胞抗原についての抗原結合部位を含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、内容が参照により本明細書に組み込まれる２０１４年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０３８，１９６号の優先権および利益を主張する。
発明の分野
本発明は、一般に、疾患促進細胞、例えば、腫瘍細胞上のＣＤ４７および表面抗原に結合する能力を有する融合タンパク質に関する。
発明の背景
マクロファージは、食作用により疾患細胞、例えば、癌細胞を一掃する主要な食細胞である。マクロファージが標的細胞の食作用を行うか否かは、食作用促進および抗食作用シグナルの相対強度に依存する。
正常な健常細胞は、食作用を免れる。それというのも、正常細胞上でユビキタスに発現されるＣＤ４７は、マクロファージ上のシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）と相互作用し、自己「ドント・イート・ミー（don’t eat me）」シグナルをトリガーするためである。
しかしながら、癌細胞はそれらの生存率を向上させるように適応するため、それらは、正常免疫制御機序を破壊してＣＤ４７を過剰発現することにより免疫サーベイランスを逃れ、それらをマクロファージに対して耐性とする。例えば、ＣＤ４７は、食作用を回避するためにヒト白血病細胞上で上方調節されることが示されている（Jaiswal et al.,Cell,138:271-285,2009）。さらに、ＣＤ４７は、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）幹細胞上で高度に発現され、予後不良因子である（Majeti et al,Cell,138:266-299,2009）。生存機序としてのＣＤ４７過剰発現は、抗体オプソニン化腫瘍細胞が免疫細胞上の活性化Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）にエンゲージして抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発すると予測されるという事実にもかかわらず、なぜ多くの治療抗体が制限された抗腫瘍効力を有するのかを部分的に説明する。
したがって、ＣＤ４７の発現を介して食作用を回避する腫瘍細胞の能力を妨害する治療法が当技術分野において必要とされている。
発明の概要
本明細書において、腫瘍細胞抗原およびＣＤ４７の両方に特異的な免疫グロブリン融合タンパク質により腫瘍細胞を標的化する方法および組成物が記載される。具体的には、免疫グロブリン融合タンパク質は、腫瘍細胞抗原に特異的な免疫グロブリン部分を含み、ＣＤ４７に特異的な第２の部分を有する。
一態様において、本発明は、ＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質を対象とする。融合タンパク質は、配列番号６の残基３〜１１５または配列番号８の３〜１１４に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントのＩｇＶ細胞外ドメインを含む。融合タンパク質は、疾患促進細胞上の表面抗原に結合する免疫グロブリン分子またはその一部も含む。一実施形態において、疾患促進細胞は腫瘍細胞であり、表面抗原は腫瘍抗原である。
ある実施形態において、免疫グロブリン融合タンパク質は、配列番号６の残基３〜１１５または配列番号８の３〜１１４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＳＩＲＰαバリアントを含む。
ある実施形態において、免疫グロブリン融合タンパク質は、配列番号６の残基１〜１１５または配列番号８の１〜１１４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＳＩＲＰαバリアントを含む。
一部の実施形態において、ＩｇＶ細胞外ドメインは、配列番号６の残基１〜１１５である一方、他の実施形態において、ＩｇＶ細胞外ドメインは、配列番号８の残基１〜１１４である。一部の実施形態において、ＩｇＶ細胞外ドメインは、配列番号６の残基３〜１１５である一方、他の実施形態において、ＩｇＶ細胞外ドメインは、配列番号８の残基３〜１１４である。さらに他の実施形態において、ＩｇＶ細胞外ドメインは、配列番号１９３の残基１〜１１４または配列番号１９４の残基１〜１１５または配列番号１９５の残基１〜１１５または配列番号１９６の残基１〜１１５または配列番号１９７の残基１〜１１４または配列番号１９８の残基１〜１１４または配列番号１９９の残基１〜１１５または配列番号２００の残基１〜１１４または配列番号１９０の残基１〜１１５である。
他の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号６の残基１〜３４３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＳＩＲＰαのＩｇＶ細胞外ドメインは、野生型ヒトＳＩＲＰα ＩｇＶ細胞外ドメインである。
他の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号１９３の残基１〜１１４または配列番号１９４の残基１〜１１５または配列番号１９５の残基１〜１１５または配列番号１９６の残基１〜１１５または配列番号１９７の残基１〜１１４または配列番号１９８の残基１〜１１４または配列番号１９９の残基１〜１１５または配列番号２００の残基１〜１１４または配列番号１９０の残基１〜１１５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある実施形態において、免疫グロブリン融合タンパク質のＳＩＲＰαバリアントは、配列番号６または８に対応する６、２７、３１、３７、５４、５６、６６、または７２位の１つ以上におけるアミノ酸の改変を有する。改変は、アミノ酸の置換、欠失、または挿入であり得る。好ましい実施形態において、改変は、置換である。
ある実施形態において、免疫グロブリン融合タンパク質のＳＩＲＰαバリアントは、Ｖ６Ｉ、Ｖ２７Ｉ、Ａ２７Ｉ、Ｉ３１Ｒ、Ｉ３ＩＴ、Ｑ３７Ｗ、Ｑ３７Ｈ、Ｅ５４Ｐ、Ｈ５６Ｐ、Ｓ６６Ｑ、Ｌ６６Ａ、およびＭ７２Ｒからなる群から選択される配列番号６または配列番号８の６、２７、３１、３７、５４、５６、６６、または７２位に対応する位置における１つ以上の置換を含む。一実施形態において、置換は、Ｖ６Ｉに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｖ２７ＩまたはＡ２７Ｉに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｉ３１Ｒに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｉ３１Ｔに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｑ３７Ｗに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｑ３７Ｈに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｅ５４Ｐに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｈ５６Ｐに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｓ６６ＱまたはＬ６６Ｑに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｍ７２Ｒに対応する。
ある実施形態において、免疫グロブリン融合タンパク質のＳＩＲＰαバリアントは、配列番号６または配列番号８の４、６、２７、３１、３５、３７、４７、５２、５３、５４、５６、６６、６７、６８、７２、９２または９４位に対応する位置の１つ以上におけるアミノ酸の改変を有する。改変は、アミノ酸の置換、欠失、または挿入であり得る。好ましい実施形態において、改変は、置換である。
ある実施形態において、免疫グロブリン融合タンパク質のＳＩＲＰαバリアントは、以下の置換の１つ以上を含む：
ａ．Ｌ４Ｖである、４位に対応する位置における置換；
ｂ．Ｖ６Ａ、Ｖ６Ｃ、Ｖ６Ｄ、Ｖ６Ｅ、Ｖ６Ｇ、Ｖ６Ｉ、Ｖ６Ｌ、Ｖ６Ｍ、Ｖ６Ｎ、Ｖ６Ｑ、Ｖ６Ｓ、もしくはＶ６Ｔから選択される６位に対応する位置における置換；
ｃ．Ａ２７Ｃ、Ａ２７Ｄ、Ａ２７Ｇ、Ａ２７Ｈ、Ａ２７Ｉ、Ａ２７Ｋ、Ａ２７Ｌ、Ａ２７Ｎ、Ａ２７Ｑ、Ａ２７Ｒ、Ａ２７Ｓ、Ａ２７Ｔ、もしくはＡ２７Ｖ；もしくはＶ２７Ａ、Ｖ２７Ｃ、Ｖ２７Ｄ、Ｖ２７Ｇ、Ｖ２７Ｈ、Ｖ２７Ｉ、Ｖ２７Ｋ、Ｖ２７Ｌ、Ｖ２７Ｎ、Ｖ２７Ｑ、Ｖ２７Ｒ、Ｖ２７Ｓ、もしくはＶ２７Ｔから選択される２７位に対応する位置における置換；
ｄ．Ｉ３１Ａ、Ｉ３１Ｃ、Ｉ３ＩＥ、Ｉ３１Ｋ、Ｉ３１Ｑ、Ｉ３１Ｒ、Ｉ３１Ｔ、もしくはＩ３１Ｖから選択される３１位に対応する位置における置換；
ｅ．Ｐ３５Ａ、Ｐ３５Ｃ、Ｐ３５Ｅ、Ｐ３５Ｇ、Ｐ３５Ｎ、Ｐ３５Ｑ、もしくはＰ３５Ｓから選択される３５位に対応する位置における置換；
ｆ．Ｑ３７Ａ、Ｑ３７Ｃ、Ｑ３７Ｅ、Ｑ３７Ｇ、Ｑ３７Ｈ、Ｑ３７Ｋ、Ｑ３７Ｌ、Ｑ３７Ｍ、Ｑ３７Ｎ、Ｑ３７Ｒ、Ｑ３７Ｓ、Ｑ３７Ｔ、もしくはＱ３７Ｗから選択される３７位に対応する位置における置換；
ｇ．Ｅ４７Ａ、Ｅ４７Ｃ、Ｅ４７Ｄ、Ｅ４７Ｆ、Ｅ４７Ｇ、Ｅ４７Ｈ、Ｅ４７Ｉ、Ｅ４７Ｋ、Ｅ４７Ｌ、Ｅ４７Ｍ、Ｅ４７Ｎ、Ｅ４７Ｑ、Ｅ４７Ｒ、Ｅ４７Ｓ、Ｅ４７Ｔ、Ｅ４７Ｖ、Ｅ４７Ｗ、もしくはＥ４７Ｙから選択される４７位に対応する位置における置換；
ｈ．Ｑ５２Ａ、Ｑ５２Ｃ、Ｑ５２Ｅ、Ｑ５２ＨもしくはＱ５２Ｍから選択される５２位に対応する位置における置換；
ｉ．Ｋ５３Ｒである、５３位に対応する位置における置換；
ｊ．Ｅ５４ＤもしくはＥ５４Ｐから選択される５４位に対応する位置における置換；
ｋ．Ｈ５６Ａ、Ｈ５６Ｃ、Ｈ５６Ｄ、Ｈ５６Ｅ、Ｈ５６Ｆ、Ｈ５６Ｇ、Ｈ５６Ｉ、Ｈ５６Ｋ、Ｈ５６Ｌ、Ｈ５６Ｍ、Ｈ５６Ｎ、Ｈ５６Ｐ、Ｈ５６Ｑ、Ｈ５６Ｒ、Ｈ５６Ｓ、Ｈ５６Ｔ、Ｈ５６Ｖ、Ｈ５６Ｗ、もしくはＨ５６Ｙから選択される５６位に対応する位置における置換；
ｌ．Ｌ６６Ａ、Ｌ６６Ｃ、Ｌ６６Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｌ６６Ｆ、Ｌ６６Ｇ、Ｌ６６Ｈ、Ｌ６６Ｉ、Ｌ６６Ｋ、Ｌ６６Ｍ、Ｌ６６Ｎ、Ｌ６６Ｐ、Ｌ６６Ｑ、Ｌ６６Ｓ、Ｌ６６Ｔ、Ｌ６６Ｖ、Ｌ６６Ｗ、もしくはＬ６６Ｙ；もしくはＳ６６Ａ、Ｓ６６Ｃ、Ｓ６６Ｄ、Ｓ６６Ｅ、Ｓ６６Ｆ、Ｓ６６Ｇ、Ｓ６６Ｈ、Ｓ６６Ｉ、Ｓ６６Ｋ、Ｓ６６Ｌ、Ｓ６６Ｍ、Ｓ６６Ｎ、Ｓ６６Ｐ、Ｓ６６Ｑ、Ｓ６６Ｔ、Ｓ６６Ｖ、Ｓ６６Ｗ、もしくはＳ６６Ｙから選択される６６位に対応する位置における置換；
ｍ．Ｔ６７Ａ、Ｔ６７Ｃ、Ｔ６７Ｄ、Ｔ６７Ｅ、Ｔ６７Ｆ、Ｔ６７Ｇ、Ｔ６７Ｈ、Ｔ６７Ｉ、Ｔ６７Ｌ、Ｔ６７Ｍ、Ｔ６７Ｎ、Ｔ６７Ｑ、Ｔ６７Ｒ、Ｔ６７Ｓ、Ｔ６７Ｖ、Ｔ６７Ｗ、もしくはＴ６７Ｙから選択される６７位に対応する位置における置換；
ｎ．Ｋ６８Ｒである、６８位に対応する位置における置換
ｏ．Ｍ７２Ａ、Ｍ７２Ｃ、Ｍ７２Ｄ、Ｍ７２Ｅ、Ｍ７２Ｆ、Ｍ７２Ｇ、Ｍ７２Ｈ、Ｍ７２Ｉ、Ｍ７２Ｋ、Ｍ７２Ｌ、Ｍ７２Ｎ、Ｍ７２Ｑ、Ｍ７２Ｒ、Ｍ７２Ｓ、Ｍ７２Ｔ、Ｍ７２Ｖ、Ｍ７２Ｗ、もしくはＭ７２Ｙから選択される７２位に対応する位置における置換；
ｐ．Ｖ９２Ａ、Ｖ９２Ｃ、Ｖ９２Ｄ、Ｖ９２Ｅ、Ｖ９２Ｇ、Ｖ９２Ｉ、Ｖ９２Ｍ、Ｖ９２Ｎ、Ｖ９２Ｑ、Ｖ９２Ｒ、Ｖ９２Ｓ、もしくはＶ９２Ｔから選択される９２位に対応する位置における置換；および／または
ｑ．Ｆ９４Ｌである、９４位に対応する位置における置換。
一部の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、野生型ＳＩＲＰαと比較してＣＤ４７についてのＳＩＲＰαバリアントの結合親和性を減少させる改変、好ましくは、置換を有する。さらに他の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、野生型ＳＩＲＰαと比較してＣＤ４７についてのＳＩＲＰαバリアントの結合親和性を増加させる改変、好ましくは、置換を有する。
ある実施形態において、免疫グロブリン分子は、インタクト抗体である一方、他の実施形態において、免疫グロブリン分子は、抗体の抗原結合部分である。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン分子は、抗体可変ドメインである抗体の一部である。一部の実施形態において、抗体可変ドメインは、抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単鎖抗体、ミニボディ（minibody）、ダイアボディ（diabody）、または単一ドメイン抗体（ナノボディ（nanobody））である。一実施形態において、インタクト抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブである。
他の実施形態において、免疫グロブリン分子は、Ｆｃ領域である抗体の抗原結合部分であり、Ｆｃ領域は、抗原結合部位、例えば、Ｆｃａｂ部分を含有するように遺伝子操作されている。一部の実施形態において、免疫グロブリン分子がＦｃａｂである場合、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、そのＮ末端により免疫グロブリン分子に連結されている一方、他の実施形態において、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、免疫グロブリン分子にそのＣ末端を介して連結されている。
一部の実施形態において、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、そのＮ末端により免疫グロブリン分子に連結されている一方、他の実施形態において、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、そのＣ末端を介して免疫グロブリン分子に連結されている。他の実施形態において、免疫グロブリン分子がインタクト抗体である場合、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、重鎖のＣ末端、または軽鎖のＣ末端に、場合により、リンカーを介して連結されている。他の実施形態において、免疫グロブリン分子がインタクト抗体である場合、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、重鎖のＮ末端、または軽鎖のＮ末端に、場合により、リンカーを介して連結されている。
さらに他の実施形態において、免疫グロブリン分子またはその一部は、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントにリンカー部分を介して連結されている。リンカー部分は、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントに、ＳＩＲＰα部分のＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて融合させることができる。
さらに他の実施形態において、免疫グロブリン分子またはその一部は、そのＮ末端を介してＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントに、場合により、リンカー部分を介して連結されている一方、他の実施形態において、免疫グロブリン分子またはその一部は、そのＣ末端を介してＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントに、場合により、リンカー部分を介して連結されている。他の実施形態において、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、抗体軽鎖またはその一部のＮ末端に連結されている一方、別の実施形態において、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、抗体軽鎖またはその一部のＣ末端に連結されている。他の実施形態において、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、抗体重鎖またはその一部のＮ末端に連結されている一方、別の実施形態において、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、抗体重鎖またはその一部のＣ末端に連結されている。ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントおよび免疫グロブリン分子またはその一部間のリンカーは、一部の実施形態において企図される。
ある実施形態において、免疫グロブリン分子またはその一部が結合する腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＧＤ２、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＤ１９から選択される。
別の実施形態において、本発明は、配列番号１９０の残基１〜１１５に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントのＩｇＶ細胞外ドメイン；および疾患促進細胞上の表面抗原に結合する免疫グロブリン分子またはその一部を含むＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質を対象とする。疾患促進細胞は腫瘍細胞であり得、抗原は腫瘍抗原であり得る。
一実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号１９０の残基１〜１１５に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号１９０の６、２７、３１、３７、５４、５６、６６、または７２位に対応する１つ以上の位置におけるアミノ酸の改変を有する。さらなる実施形態において、改変は、Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ａ２７Ｉ；Ｉ３１Ｒ；Ｉ３１Ｔ；Ｑ３７Ｗ；Ｑ３７Ｈ；Ｅ５４Ｐ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｑ；Ｌ６６Ｑ；およびＭ７２Ｒからなる群から選択される。
別の実施形態において、本発明は、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合部分および配列番号６の残基３〜１１５または配列番号８の３〜１１４に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントのＩｇＶ細胞外ドメインを含むＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質を対象とする。
さらなる実施形態において、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、配列番号６の残基３〜１１５または配列番号８の３〜１１４に対して少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。
さらに別の実施形態において、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、配列番号６の残基１〜１１５または配列番号８の１〜１１４に対して少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。
さらなる実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合部分は、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、フツキシマブ（futuximab）、イムガツズマブ、またはネシツムマブから選択される抗体からの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含有する。さらに別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合部分は、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、フツキシマブ、イムガツズマブ、またはネシツムマブから選択される抗体からの相補性決定領域を含有する。さらに別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合部分は、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、フツキシマブ、イムガツズマブ、またはネシツムマブから選択される抗体からの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含有する。いっそうさらなる実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、フツキシマブ、イムガツズマブ、またはネシツムマブから選択される。別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブである。
別の実施形態において、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合部分の重鎖または軽鎖のＮ末端に、場合により、リンカーを介して連結されている。別の実施形態において、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントは、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合部分の重鎖または軽鎖のＣ末端に、場合により、リンカーを介して連結されている。
さらなる実施形態において、ＳＩＲＰα−抗ＥＧＦＲ免疫グロブリン融合タンパク質は、配列番号６または配列番号８の６、２７、３１、３７、５４、５６、６６または７２位に対応する位置の１つ以上における改変を有するＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントのＩｇＶ細胞外ドメインを含む。一実施形態において、改変は、Ｑ３７Ｗに対応する置換である。別の実施形態において、改変は、Ｖ６Ｉ、Ｃ２７Ｉ、Ａ２７１、Ｉ３１Ｒ、Ｑ３７Ｗ、Ｑ３７Ｈ、Ｅ５４Ｐ、Ｈ５６Ｐ、Ｓ６６Ｑ、Ｌ６６Ｑ、およびＭ７２Ｒから選択される置換に対応する１つ以上の置換である。
さらなる実施形態において、本発明は、腫瘍細胞抗原に結合する免疫グロブリン分子またはその一部および配列番号６の残基３〜１１５または配列番号８の３〜１１４に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントのＩｇＶ細胞外ドメインを含むＣＤ４７結合部分を有する免疫グロブリン融合タンパク質を対象とする。融合タンパク質は、抗ＣＤ４７抗体に対する％赤血球（ＲＢＣ）結合平均蛍光強度（ＭＦＩ）を１００％において較正する場合、３５％以下の％ＲＢＣ結合ＭＦＩを有する。抗ＣＤ４７抗体は、Ｂ６Ｈ１２／ｈｕＩｇＧ１である。融合タンパク質は、非赤血球上のＣＤ４７にも結合する。一実施形態において、非赤血球は、腫瘍細胞である。
一部の実施形態において、免疫グロブリン融合タンパク質は、配列番号６の残基３〜１１５または配列番号８の３〜１１４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントのＩｇＶ細胞外ドメインを有する。
一部の実施形態において、免疫グロブリン融合タンパク質は、配列番号６の残基１〜１１５または配列番号８の１〜１１４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントのＩｇＶ細胞外ドメインを有する。
一部の実施形態において、腫瘍細胞抗原は、ＥＧＦＲである。一部の実施形態において、免疫グロブリン分子は、インタクト抗体である。例えば、インタクト抗体は、一部の実施形態において抗ＥＧＦＲ抗体である一方、ある実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブである。
一実施形態において、融合タンパク質は、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満の％ＲＢＣ結合ＭＦＩを有する。一実施形態において、％ＲＢＣ結合ＭＦＩは、１０％未満である。
さらに別の実施形態において、融合タンパク質は、０〜１％、０〜２％、０〜３％、０〜４％、１〜２％、１〜３％、１〜４％、２〜３％、２〜４％、３〜４％、３〜７％、３〜１０％または５〜１０％の％ＲＢＣ結合ＭＦＩを有する。
さらに別の実施形態において、融合タンパク質は、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下の％ＲＢＣ結合ＭＦＩを有する。
さらなる実施形態において、抗体部分は、抗ＥＧＦＲ抗体である。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブである一方、別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、パニツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、フツキシマブ、イムガツズマブ、またはネシツムマブである。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載のＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質をコードする核酸を含む。本明細書に記載の免疫グロブリン融合タンパク質は、２つ以上のペプチド鎖のアセンブリを要求し得るため、本発明は、発現時にアセンブルして融合タンパク質を形成する個々のペプチド鎖をコードするために要求される核酸を企図する。別の態様において、本発明は、本明細書に記載の免疫グロブリン融合タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含む細胞を含む。さらに別の態様において、本発明は、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を可能とする条件下でそのような細胞を維持することにより、免疫グロブリン融合タンパク質を産生する方法を含む。
さらなる態様において、本発明は、薬学的に許容可能な担体を含む、医薬有効量の本明細書に記載の免疫グロブリン融合タンパク質を含む医薬組成物を対象とする。
いっそうさらなる実施形態において、本発明は、有効量の本明細書に記載の免疫グロブリン融合タンパク質を投与することにより、癌を治療する方法を対象とする。治療することができる癌としては、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝臓癌、鼻咽腔癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、または骨髄異形成症候群が挙げられる。
図面の簡単な説明
図１Ａ〜Ｏは、本発明の融合タンパク質の異なるＤＮＡおよびタンパク質構築物を模式的に説明する。抗体−ＳＩＲＰα融合タンパク質の発現のためのＤＮＡ構築物の２つの模式図を示す。ＤＮＡ構築物１（上段）は、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、それに続く軽鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ（Ｈ）−ＣＨ２−ＣＨ３）が任意選択リンカー（Ｌ）を介して遺伝子的に融合しているＳＩＲＰαをコードする。ＤＮＡ構築物２（下段）は、抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、それに続く軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）をコードする。 ２つのポリペプチド構成要素（すなわち、軽鎖および重鎖）が、図１Ａに示されるＤＮＡ構築物によりそれぞれコードされる四量体構造を有する抗体−ＳＩＲＰα融合タンパク質の模式図である。 Ｆｃ融合タンパク質の２つの模式図を示す。これらは左から右に（１）ＳＩＲＰα−Ｆｃおよび（２）Ｆｃ−ＳＩＲＰαである。 四価二重特異的抗体の発現のための３つのＤＮＡ構築物を示す。ＤＮＡ構築物１（上段）は、第１の抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ（１））、それに続く重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ（Ｈ）−ＣＨ２−ＣＨ３）が任意選択リンカー（Ｌ）を介して遺伝子的に融合している第２の抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ（２））、それに続く軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）をコードする。ＤＮＡ構築物２（中段）は、第１の抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ（１））、それに続く軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）をコードする。ＤＮＡ構築物３（下段）は、第２の抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ（２））、それに続く重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、およびアッパーヒンジ領域（Ｈ＊）をコードする。 ３つのポリペプチド構成要素が図１Ｄに示されるＤＮＡ構築物によりコードされる六量体構造を有する四価二重特異的抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）の模式図である。 抗体−ＳＩＲＰαの発現のためのＤＮＡ構築物の模式図である。ＤＮＡ構築物１（上段）は、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、それに続く重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ（Ｈ）−ＣＨ２−ＣＨ３）をコードする。ＤＮＡ構築物２（下段）は、抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、それに続く軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）が任意選択リンカー（Ｌ）を介して遺伝子的に融合しているＳＩＲＰαをコードする。 図１Ｆに示されるＤＮＡ構築物によりコードされる２つのポリペプチド構成要素を含む四量体構造を示す抗体−ＳＩＲＰαの模式図である。 ＳＩＲＰα−抗体の発現のためのＤＮＡ構築物の模式図である。ＤＮＡ構築物１（上段）は、ＳＩＲＰαが任意選択リンカー（Ｌ）を介して遺伝子的に融合している重鎖定常ドメイン（ヒンジ（Ｈ）−ＣＨ２−ＣＨ３）が任意選択リンカー（Ｌ）を介して遺伝子的に融合している抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、それに続く重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、およびアッパーヒンジ領域（Ｈ）をコードする。ＤＮＡ構築物２（下段）は、抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、それに続く軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）をコードする。 図１Ｈに示されるＤＮＡ構築物によりコードされる２つのポリペプチド構成要素を含む四量体構造を示すＳＩＲＰα−抗体の模式図である。 ＳＩＲＰα−Ｆｃ−ｓｃＦｖの発現のためのＤＮＡ構築物の模式図である。ＤＮＡ構築物は、ＳＩＲＰαが任意選択リンカー（Ｌ）を介して遺伝子的に融合している重鎖定常ドメイン（ヒンジ（Ｈ）−ＣＨ２−ＣＨ３）が任意選択リンカー（Ｌ）を介して遺伝子的に融合している抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が任意選択リンカー（Ｌ）を介して遺伝子的に融合している抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする。 図１Ｊに示されるＤＮＡ構築物によりコードされるポリペプチド構成要素を含む二量体構造を示すＳＩＲＰα−Ｆｃ−ｓｃＦｖの模式図である。 ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＳＩＲＰαの発現のためのＤＮＡ構築物の模式図である。ＤＮＡ構築物は、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が任意選択リンカー（Ｌ）を介して遺伝子的に融合している抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が任意選択リンカー（Ｌ）を介して遺伝子的に融合している重鎖定常ドメイン（ヒンジ（Ｈ）−ＣＨ２−ＣＨ３）が任意選択リンカー（Ｌ）を介して遺伝子的に融合しているＳＩＲＰαをコードする。 図１Ｌに示されるＤＮＡ構築物によりコードされるポリペプチド構成要素を含む二量体構造を示すｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＳＩＲＰαの模式図である。 ＳＩＲＰα−Ｆｃａｂの発現のためのＤＮＡ構築物の模式図である。ＤＮＡ構築物は、ＳＩＲＰαが任意選択リンカー（Ｌ）を介して遺伝子的に融合している、抗原に結合するように改変された定常ドメイン３を有する重鎖定常ドメイン（ヒンジ（Ｈ）−ＣＨ２−ＣＨ３）をコードする。 図１Ｎに示されるＤＮＡ構築物によりコードされるポリペプチド構成要素を含む二量体構造を示すＳＩＲＰα−Ｆｃａｂの模式図である。鎖間ジスルフィド結合を、２つのポリペプチド鎖間の短いバーとして示す。リンカーは任意選択である。 カニクイザルにおける赤血球カウントに対する抗ＣＤ４７Ｂ６Ｈ１２の効果を示す棒グラフである。 カニクイザルにおけるヘマトクリットレベルに対する抗ＣＤ４７Ｂ６Ｈ１２の効果を示す棒グラフである。 実施例２に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の２つのポリペプチドの発現の分析を示す。 実施例２に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による完全四量体分子のアセンブリの分析を示す。 ＣＤ４７を発現する細胞（ＣＤ４７形質移入ＣＨＯ細胞）への抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の結合を示す。 ＣＤ４７を発現する細胞（白血球濃縮全血）への抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の結合を示す。 ＣＤ２０およびＣＤ４７の両方を発現する細胞（Raji細胞）への抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の結合を示す。 ＣＤ２０およびＣＤ４７の両方を発現する細胞（Namalwa細胞）への抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の結合を示す。 Daudi細胞による注射および四価二重特異的抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７による処理後のマウスの生存率を示す。 Raji細胞による注射および四価二重特異的抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７による処理後のマウスの生存率を示す。 実施例４に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの２つのポリペプチドの発現の分析を示す。 実施例４に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による完全四量体分子のアセンブリの分析を示す。 実施例４に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による完全四量体分子のアセンブリの分析を示す。 ＣＤ４７を発現する細胞（ＣＤ４７形質移入ＣＨＯ細胞）への抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαタンパク質の結合を示す。 ＣＤ４７を発現する細胞（白血球濃縮全血）への抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαタンパク質の結合を示す。 ＥＧＦＲおよびＣＤ４７の両方を発現する細胞（Ａ５４９細胞）への抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαタンパク質の結合を示す。 Ａ５４９標的細胞および遺伝子操作Jurkatエフェクター細胞を使用するＡＤＣＣアッセイにおける抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２のインビトロ活性を示す。 マウスにおける抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の薬物動態分析を示す。 マウスにおける同所性Ａ５４９肺腫瘍モデルにおける抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２による処理後のマウスの生存率を示す（逆向き黒色三角：アイソタイプ対照；黒色丸：抗ＥＧＦＲ；黒色三角：ＳＩＲＰα−Ｆｃ；黒色菱形：抗ＥＧＦＲおよびＳＩＲＰα−Ｆｃ；白色丸：抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２）。 実施例５に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の２つのポリペプチドの発現の分析を示す。 実施例５に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による完全四量体分子のアセンブリの分析を示す。 ＣＤ４７を発現する細胞（ＣＤ４７形質移入ＣＨＯ細胞）への抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の結合を示す。 ＣＤ４７を発現する細胞（白血球濃縮全血）への抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の結合を示す。 ＨＥＲ２およびＣＤ４７の両方を発現する細胞（ＢＴ４７４細胞）への抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の結合を示す。 実施例７に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ｍｕＳＩＲＰαの２つのポリペプチドの発現の分析を示す。 実施例７に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による完全四量体分子のアセンブリの分析を示す。 ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ４７を発現するＡ２０細胞への抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ｍｕＳＩＲＰαの結合を示す。 実施例８に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα（Ｎ１１０Ｑ）の２つのポリペプチドの発現の分析を示す。 実施例８に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による完全四量体分子のアセンブリの分析を示す。 ＣＤ４７を発現する細胞（ＣＤ４７形質移入ＣＨＯ細胞）への抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα（Ｎ１１０Ｑ）の結合を示す。 実施例１０に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）の２つのポリペプチドの発現の分析を示す。 実施例１０に記載のおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による完全四量体分子のアセンブリの分析を示す。 実施例１０に記載のＣＤ４７を発現する細胞（ＣＤ４７形質移入ＣＨＯ細胞）へのＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）の結合を示す。 実施例１０に記載のＡ５４９細胞および遺伝子操作Jurkatエフェクター細胞を使用するＡＤＣＣアッセイにおけるＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）のインビトロ活性を示す。 同所性Ａ５４９肺腫瘍モデルにおけるＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）による処理後のマウスの生存率を示す（逆向き黒色三角：アイソタイプ対照；黒色丸：抗ＥＧＦＲ；×：抗ＥＧＦＲおよびＳＩＲＰα−Ｆｃ；白色丸：抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２；黒色菱形：ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ））。 実施例１５に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）のポリペプチドの発現の分析を示す。 実施例１５に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による完全二量体分子のアセンブリの分析を示す。 ＣＤ４７を発現する細胞（ＣＤ４７形質移入ＣＨＯ細胞）へのＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）の結合を示す。 ＨＥＲ２およびＣＤ４７の両方を発現する細胞（ＢＴ４７４細胞）へのＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）の結合を示す。 実施例９に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαＶ２の２つのポリペプチドの発現の分析を示す。 実施例９に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による完全四量体分子のアセンブリの分析を示す。 実施例９に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による完全四量体分子のアセンブリの分析を示す。 ＣＤ４７を発現する細胞（ＣＤ４７形質移入ＣＨＯ細胞）への抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαＶ２の結合の分析を示す。 実施例１８に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の２つのポリペプチドの発現の分析を示す。 実施例１８に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による完全四量体分子のアセンブリの分析を示す。 同所性Ａ５４９肺腫瘍モデルにおける抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２または抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）による処理後のマウスの生存率を示す。 実施例１９に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の２つのポリペプチドの発現の分析を示す。 実施例１９に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による完全四量体分子のアセンブリの分析を示す。 Daudi播種性リンパ腫モデルにおける抗ＣＤ２０およびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２またはＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の組合せによる処理後のマウスの生存率を示す。 既知ヒトＳＩＲＰαアレルのＩｇＶドメイン：ＩｇＶ（Ｖ１）（配列番号６の残基１〜１１５）、ＩｇＶ（Ｖ２）（配列番号８）、ＩｇＶ（Ｖ３）（配列番号１９３）、ＩｇＶ（Ｖ４）（配列番号１９４）、ＩｇＶ（Ｖ５）（配列番号１９５）、ＩｇＶ（Ｖ６）（配列番号１９６）、ＩｇＶ（Ｖ７）（配列番号１９７）、ＩｇＶ（Ｖ８）（配列番号１９８）、ＩｇＶ（Ｖ９）（配列番号１９９）、およびＩｇＶ（Ｖ１０）（配列番号２００）のアラインメントを示す。
発明の詳細な説明
本発明は、向上した腫瘍標的化およびエフェクター機能を有する免疫グロブリン融合タンパク質を対象とする。一般に、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、ＣＤ４７結合剤部分および免疫グロブリン部分を含む。免疫グロブリン部分は、疾患促進細胞上の表面抗原に結合する一方、ＣＤ４７結合剤部分は、同一細胞上のＣＤ４７に結合する。一実施形態において、本発明は、腫瘍特異的免疫グロブリン部分を、ＣＤ４７に結合する部分に遺伝子的に結合させることを含む。好ましいＣＤ４７結合剤は、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαのバリアントである。したがって、本発明のある実施形態は、ＣＤ４７を発現する腫瘍細胞に結合する免疫グロブリン融合タンパク質を対象とする。
ＣＤ４７は、全てのヒト細胞上でユビキタスに発現される。腫瘍細胞、特に癌幹細胞はより高レベルのＣＤ４７を発現するが、造血幹細胞もＣＤ４７を過剰発現する。したがって、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント、またはＣＤ４７についての十分な結合親和性を有する別のＣＤ４７結合剤は、癌細胞および正常細胞、例として、５０億個の細胞／ｍＬにおいて循環中で存在し、血液容量の約半分を占める赤血球を区別する可能性が低い。したがって、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、腫瘍細胞上の腫瘍抗原への高い親和性結合およびＣＤ４７についての低い結合親和性を有するように設計される。これは、正常細胞上のＣＤ４７への免疫グロブリン融合タンパク質の弱い結合をもたらす。こうして、免疫グロブリン融合タンパク質は、正常細胞を標的化しないように設計され、それによりＣＤ４７のユビキタス発現から生じる正常細胞に対する毒性を避け、さらに正常細胞上でユビキタスに発現されるＣＤ４７が、そうでなければ抗体療法に典型的な週１回または２週１回レジメン（regiment）と不適合である不所望な薬物動態をもたらす抗ＣＤ４７療法についての薬物シンク（drug sink）になるのを防止する。この理由のため、融合部分が低い親和性でＣＤ４７に結合する一方、ＳＩＲＰαと相互作用するＣＤ４７の能力を依然として遮断することが好ましい。
本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、（１）腫瘍細胞上の腫瘍特異的抗原についての高い結合親和性を有し；（２）同一腫瘍細胞上のＣＤ４７への融合部分の低い親和性結合により提供される追加のアビディティを介して向上した腫瘍標的化を達成し；（３）ＣＤ４７「ドント・イート・ミー」シグナルの遮断および免疫エフェクター細胞のＦｃ依存性活性化の組合せを介して強力なＡＤＣＰおよびＡＤＣＣを誘発し；（４）正常細胞、例として、赤血球上のＣＤ４７への低い親和性結合により毒性を回避する。重要なことに、ＣＤ４７結合剤、例えば、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントが、ＦｃＲエンゲージメントに最適でない構成で抗体部分のＦｃ領域に結合している場合、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰにより誘導される正常細胞に対する毒性はさらに低下し、例えば、天然抗体と類似するアミノからカルボキシルへの向きを有するＸ−Ｆｃ構成は、Ｆｃ−Ｘ構成よりも高いＡＤＣＣ活性を誘発する。
本発明によれば、免疫グロブリン融合タンパク質の標的化特異性は、主として抗体部分の、ユビキタスに発現される抗原のＣＤ４７ではなくそのコグネイト腫瘍特異的抗原への結合によりドライブされる。さらに、標的化特異性は、腫瘍細胞上で過剰発現されるＣＤ４７への融合相手のシス結合により提供されるアビディティ効果によりさらに向上する。シスの良好な二重特異的標的化は、相対受容体密度および細胞表面上の２つの標的の物理的局在にかなり依存する。このような向上した腫瘍標的化は、抗ＣＤ４７抗体および他のＣＤ４７遮断剤と比較して優れた効力および安全性の両方に関してより良好な治療指数を提供するはずである。
ＣＤ４７結合剤
本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、ＣＤ４７に結合し得る部分を含む。一実施形態において、ＣＤ４７結合剤としては、ＣＤ４７に対する抗体が挙げられる。他の実施形態において、ＣＤ４７結合剤は、ＣＤ４７についての結合親和性を有する非抗体タンパク質または分子、例えば、ＣＤ４７受容体に結合するリガンドである。例えば、一実施形態において、融合タンパク質のＣＤ４７結合剤部分は、抗ＣＤ４７抗体である。好ましい実施形態において、ＣＤ４７結合剤は、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント、またはＳＩＲＰαの親和性最適化バリアントである。
「ＳＩＲＰα」は、野生型シグナル調節タンパク質アルファまたは野生型シグナル調節タンパク質アルファもしくはシグナル調節タンパク質アルファの天然または天然存在アレルバリアントのアミノ酸配列を有する組換えもしくは非組換えポリペプチドのアミノ酸配列を指す。一実施形態において、ＳＩＲＰαは、野生型哺乳動物ＳＩＲＰαである一方、好ましい実施形態において、ＳＩＲＰαは、野生型ヒトＳＩＲＰαである。優性野生型ヒトＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ１）の成熟形態についてのアミノ酸配列を、表４に配列番号６として提供する。一実施形態において、ＳＩＲＰαは、シグナル配列を含む一方、別の態様において、ＳＩＲＰαは、タンパク質の成熟形態を指す。
一実施形態によれば、ＳＩＲＰαは、ＳＩＲＰα細胞外ドメイン、すなわち、膜貫通および細胞ドメインを除外するように遺伝子操作されたＳＩＲＰαタンパク質である。別の実施形態において、ＳＩＲＰαは、少なくとも細胞外ドメインを含む。一実施形態において、ＳＩＲＰαタンパク質は、ヒトＳＩＲＰα細胞外ドメインである。野生型ＳＩＲＰαＶ１の細胞外ドメインの配列は、配列番号６の残基１〜３４３である。
さらに別の実施形態において、ＳＩＲＰαは、細胞外ドメインのＳＩＲＰα ＩｇＶドメインである。一実施形態において、ＳＩＲＰα ＩｇＶドメインは、ヒトＳＩＲＰα ＩｇＶドメインである。例えば、一実施形態において、ＳＩＲＰα ＩｇＶドメインは、配列番号６の残基１〜１１５である一方、別の実施形態において、ＳＩＲＰα ＩｇＶは、配列番号８の残基１〜１１４である一方、さらに別の実施形態において、ＳＩＲＰα ＩｇＶは、配列番号６の残基３〜１１５である一方、さらに別の実施形態において、ＳＩＲＰα ＩｇＶは、配列番号８の残基３〜１１４である。別の実施形態において、ＳＩＲＰα ＩｇＶドメインは、配列番号１９３の残基１〜１１４である。別の実施形態において、ＳＩＲＰα ＩｇＶドメインは、配列番号１９４の残基１〜１１５である。別の実施形態において、ＳＩＲＰα ＩｇＶドメインは、配列番号１９５の残基１〜１１５である。別の実施形態において、ＳＩＲＰα ＩｇＶドメインは、配列番号１９６の残基１〜１１５である。別の実施形態において、ＳＩＲＰα ＩｇＶドメインは、配列番号１９７の残基１〜１１４である。別の実施形態において、ＳＩＲＰα ＩｇＶドメインは、配列番号１９８の残基１〜１１４である。別の実施形態において、ＳＩＲＰα ＩｇＶドメインは、配列番号１９９の残基１〜１５５である。別の実施形態において、ＳＩＲＰα ＩｇＶドメインは、配列番号２００の残基１〜１１４である。さらに別の実施形態において、ＳＩＲＰαは、少なくとも細胞外ドメインのＳＩＲＰα ＩｇＶドメインを含む。
本発明はまた、ＳＩＲＰαの「バリアント」を含む。ＳＩＲＰαの「バリアント」は、野生型ＳＩＲＰαと比較して１つ以上のアミノ酸により変更されたＳＩＲＰαアミノ酸配列と定義される。バリアントは、置換されたアミノ酸が類似の構造または化学的特性を有する「保存的」変化、例えば、イソロイシンによるロイシンの置き換えを有し得る。より希に、バリアントは、「非保存的」変化、例えば、トリプトファンによるグリシンの置き換えを有し得る。類似のマイナーバリエーションとしては、アミノ酸欠失もしくは挿入、またはその両方を挙げることもできる。
一実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、野生型ＳＩＲＰαと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
別の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、野生型ＳＩＲＰα細胞外ドメインと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号６の残基１〜３４３と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
さらに別の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、野生型ＳＩＲＰα細胞外ドメインのＩｇＶドメイン、例えば、一実施形態において配列番号６の残基１〜１１５、別の実施形態において配列番号８の残基１〜１１４、さらに別の実施形態において配列番号１９３の残基１〜１１４、さらに別の実施形態において配列番号１９４の１〜１１５、さらに別の実施形態において配列番号１９５の１〜１１５、さらに別の実施形態において配列番号１９６の１〜１１５、さらに別の実施形態において配列番号１９７の１〜１１４、さらに別の実施形態において配列番号１９８の１〜１１４、さらに別の実施形態において配列番号１９９の１〜１１５、またはさらに別の実施形態において配列番号２００の１〜１１４と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。１つの特定の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号６の残基１〜１１５のＩｇＶドメインと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。別の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号８の残基１〜１１４のＩｇＶドメインと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。別の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号１９３の残基１〜１１４のＩｇＶドメインと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。別の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号１９４の残基１〜１１５のＩｇＶドメインと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。別の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号１９５の残基１〜１１５のＩｇＶドメインと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。別の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号１９６の残基１〜１１５のＩｇＶドメインと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。別の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号１９７の残基１〜１１４のＩｇＶドメインと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。別の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号１９８の残基１〜１１４のＩｇＶドメインと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。別の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号１９９の残基１〜１１５のＩｇＶドメインと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。別の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号２００の残基１〜１１４のＩｇＶドメインと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。別の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号１９０の残基１〜１１４のＩｇＶドメインと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。配列番号１９０は、１０の既知ヒトＳＩＲＰα ＩｇＶドメインのコンセンサス配列である。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の一致率を決定するため、配列を最適な比較目的のためにアラインする（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために第１のアミノ酸または核酸配列中にギャップを導入することができる）。２つの配列間の一致率は、それらの配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％相同性＝（同一位置の数／位置の総数）×１００）。２つの配列間の相同率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin and Altschul,(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-77のとおり修正されたKarlin and Altschul,(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264-68のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul et al.,(1990) J.Mol.Biol.,215:403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれる。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２により実施することができる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により実施することができる。比較目的のためにギャップ付きアラインメントを得るため、Gapped BLASTをAltschul et al.,(1997) Nucleic Acids Research,25(17):3389-3402に記載のとおり利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。
一部の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、野生型ＳＩＲＰαと比較して細胞外ドメインの可変ドメイン中の１つ以上の突然変異を含む。本発明により企図される突然変異を以下に記載し、以下の実施例６に見出される表１および２、ならびに以下の実施例１７に見出される表３にも提供する。
一実施形態において、本発明のＳＩＲＰαバリアントは、配列番号６または配列番号８または配列番号１９０に対応する６、２７、３１、３７、５４、５６、６６、または７２位の１つ以上に対応する位置におけるアミノ酸の改変を有する。改変は、欠失、置換、または挿入であり得る。好ましい実施形態において、改変は、置換である。他の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号６または配列番号８または配列番号１９０に対応する６、２７、３１、３７、５４、５６、６６、または７２位に対応する２つ以上における、３つ以上における、４つ以上における、５つ以上における、６つ以上における、７つ以上における、または８つの位置におけるアミノ酸の改変を有する。
さらなる実施形態において、本発明のＳＩＲＰαバリアントは、以下の１つ以上の置換を有する：Ｖ６Ｉ、Ｖ２７Ｉ、Ａ２７Ｉ、Ｉ３１Ｒ、Ｉ３ＩＴ、Ｑ３７Ｗ、Ｑ３７Ｈ、Ｅ５４Ｐ、Ｈ５６Ｐ、Ｓ６６Ｑ、Ｌ６６Ａ、およびＭ７２Ｒ。一実施形態において、置換は、Ｖ６Ｉに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｖ２７ＩまたはＡ２７Ｉに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｉ３１Ｒに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｉ３１Ｔに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｑ３７Ｗに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｑ３７Ｈに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｅ５４Ｐに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｈ５６Ｐに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｓ６６ＱまたはＬ６６Ｑに対応する。別の実施形態において、置換は、Ｍ７２Ｒに対応する。
一実施形態において、本発明のＳＩＲＰαバリアントは、配列番号６または配列番号８または配列番号１９０の４、６、２７、３１、３５、３７、４７、５２、５３、５４、５６、６６、６７、６８、７２、９２または９４位に対応する１つ以上の位置におけるアミノ酸の改変を有する。改変は、アミノ酸の欠失、置換、または挿入であり得る。好ましい実施形態において、改変は、置換である。他の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントは、配列番号６または配列番号８または配列番号１９０の４、６、２７、３１、３５、３７、４７、５２、５３、５４、５６、６６、６７、６８、７２、９２または９４位に対応する２つ以上における、３つ以上における、４つ以上における、５つ以上における、６つ以上における、７つ以上における、８つ以上における、９つ以上における、１０以上における、１１以上における、１２以上における、１３以上における、１４以上における、１５以上における、１６以上における、または１７の位置におけるアミノ酸の改変を有する。
さらなる実施形態において、本発明のＳＩＲＰαバリアントは、以下の１つ以上の置換を有する：
ａ．Ｌ４Ｖである、４位に対応する位置における置換；
ｂ．Ｖ６Ａ、Ｖ６Ｃ、Ｖ６Ｄ、Ｖ６Ｅ、Ｖ６Ｇ、Ｖ６Ｉ、Ｖ６Ｌ、Ｖ６Ｍ、Ｖ６Ｎ、Ｖ６Ｑ、Ｖ６Ｓ、もしくはＶ６Ｔから選択される６位に対応する位置における置換；
ｃ．Ａ２７Ｃ、Ａ２７Ｄ、Ａ２７Ｇ、Ａ２７Ｈ、Ａ２７Ｉ、Ａ２７Ｋ、Ａ２７Ｌ、Ａ２７Ｎ、Ａ２７Ｑ、Ａ２７Ｒ、Ａ２７Ｓ、Ａ２７Ｔ、もしくはＡ２７Ｖ；もしくはＶ２７Ａ、Ｖ２７Ｃ、Ｖ２７Ｄ、Ｖ２７Ｇ、Ｖ２７Ｈ、Ｖ２７Ｉ、Ｖ２７Ｋ、Ｖ２７Ｌ、Ｖ２７Ｎ、Ｖ２７Ｑ、Ｖ２７Ｒ、Ｖ２７Ｓ、もしくはＶ２７Ｔから選択される２７位に対応する位置における置換；
ｄ．Ｉ３１Ａ、Ｉ３１Ｃ、Ｉ３ＩＥ、Ｉ３１Ｋ、Ｉ３１Ｑ、Ｉ３１Ｒ、Ｉ３１Ｔ、もしくはＩ３１Ｖから選択される３１位に対応する位置における置換；
ｅ．Ｐ３５Ａ、Ｐ３５Ｃ、Ｐ３５Ｅ、Ｐ３５Ｇ、Ｐ３５Ｎ、Ｐ３５Ｑ、もしくはＰ３５Ｓから選択される３５位に対応する位置における置換；
ｆ．Ｑ３７Ａ、Ｑ３７Ｃ、Ｑ３７Ｅ、Ｑ３７Ｇ、Ｑ３７Ｈ、Ｑ３７Ｋ、Ｑ３７Ｌ、Ｑ３７Ｍ、Ｑ３７Ｎ、Ｑ３７Ｒ、Ｑ３７Ｓ、Ｑ３７Ｔ、もしくはＱ３７Ｗから選択される３７位に対応する位置における置換；
ｇ．Ｅ４７Ａ、Ｅ４７Ｃ、Ｅ４７Ｄ、Ｅ４７Ｆ、Ｅ４７Ｇ、Ｅ４７Ｈ、Ｅ４７Ｉ、Ｅ４７Ｋ、Ｅ４７Ｌ、Ｅ４７Ｍ、Ｅ４７Ｎ、Ｅ４７Ｑ、Ｅ４７Ｒ、Ｅ４７Ｓ、Ｅ４７Ｔ、Ｅ４７Ｖ、Ｅ４７Ｗ、もしくはＥ４７Ｙから選択される４７位に対応する位置における置換；
ｈ．Ｑ５２Ａ、Ｑ５２Ｃ、Ｑ５２Ｅ、Ｑ５２ＨもしくはＱ５２Ｍから選択される５２位に対応する位置における置換；
ｉ．Ｋ５３Ｒである、５３位に対応する位置における置換；
ｊ．Ｅ５４ＤもしくはＥ５４Ｐから選択される５４位に対応する位置における置換；
ｋ．Ｈ５６Ａ、Ｈ５６Ｃ、Ｈ５６Ｄ、Ｈ５６Ｅ、Ｈ５６Ｆ、Ｈ５６Ｇ、Ｈ５６Ｉ、Ｈ５６Ｋ、Ｈ５６Ｌ、Ｈ５６Ｍ、Ｈ５６Ｎ、Ｈ５６Ｐ、Ｈ５６Ｑ、Ｈ５６Ｒ、Ｈ５６Ｓ、Ｈ５６Ｔ、Ｈ５６Ｖ、Ｈ５６Ｗ、もしくはＨ５６Ｙから選択される５６位に対応する位置における置換；
ｌ．Ｌ６６Ａ、Ｌ６６Ｃ、Ｌ６６Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｌ６６Ｆ、Ｌ６６Ｇ、Ｌ６６Ｈ、Ｌ６６Ｉ、Ｌ６６Ｋ、Ｌ６６Ｍ、Ｌ６６Ｎ、Ｌ６６Ｐ、Ｌ６６Ｑ、Ｌ６６Ｓ、Ｌ６６Ｔ、Ｌ６６Ｖ、Ｌ６６Ｗ、もしくはＬ６６Ｙ；もしくはＳ６６Ａ、Ｓ６６Ｃ、Ｓ６６Ｄ、Ｓ６６Ｅ、Ｓ６６Ｆ、Ｓ６６Ｇ、Ｓ６６Ｈ、Ｓ６６Ｉ、Ｓ６６Ｋ、Ｓ６６Ｌ、Ｓ６６Ｍ、Ｓ６６Ｎ、Ｓ６６Ｐ、Ｓ６６Ｑ、Ｓ６６Ｔ、Ｓ６６Ｖ、Ｓ６６Ｗ、もしくはＳ６６Ｙから選択される６６位に対応する位置における置換；
ｍ．Ｔ６７Ａ、Ｔ６７Ｃ、Ｔ６７Ｄ、Ｔ６７Ｅ、Ｔ６７Ｆ、Ｔ６７Ｇ、Ｔ６７Ｈ、Ｔ６７Ｉ、Ｔ６７Ｌ、Ｔ６７Ｍ、Ｔ６７Ｎ、Ｔ６７Ｑ、Ｔ６７Ｒ、Ｔ６７Ｓ、Ｔ６７Ｖ、Ｔ６７Ｗ、もしくはＴ６７Ｙから選択される６７位に対応する位置における置換；
ｎ．Ｋ６８Ｒである、６８位に対応する位置における置換
ｏ．Ｍ７２Ａ、Ｍ７２Ｃ、Ｍ７２Ｄ、Ｍ７２Ｅ、Ｍ７２Ｆ、Ｍ７２Ｇ、Ｍ７２Ｈ、Ｍ７２Ｉ、Ｍ７２Ｋ、Ｍ７２Ｌ、Ｍ７２Ｎ、Ｍ７２Ｑ、Ｍ７２Ｒ、Ｍ７２Ｓ、Ｍ７２Ｔ、Ｍ７２Ｖ、Ｍ７２Ｗ、もしくはＭ７２Ｙから選択される７２位に対応する位置における置換；
ｐ．Ｖ９２Ａ、Ｖ９２Ｃ、Ｖ９２Ｄ、Ｖ９２Ｅ、Ｖ９２Ｇ、Ｖ９２Ｉ、Ｖ９２Ｍ、Ｖ９２Ｎ、Ｖ９２Ｑ、Ｖ９２Ｒ、Ｖ９２Ｓ、もしくはＶ９２Ｔから選択される９２位に対応する位置における置換；および／または
ｑ．Ｆ９４Ｌである、９４位に対応する位置における置換。
ＣＤ４７への結合についてのＳＩＲＰαバリアントの親和性を決定するため、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用することができる。例示的なプロトコルにおいて、Biacore 4000装置（GE Healthcare）を使用してアミンカップリング化学反応を使用して精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Jackson Immuno Research Laboratories）をCM5チップ上に固定化する。Biacore CM-5チップ、エタノールアミン、ＮＨＳ／ＥＤＣカップリング試薬および緩衝液を、Biacore（GE Healthcare）から入手する。固定化ステップを、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡおよび０．００５％のＰ２０界面活性剤）中で３０μｌ／分の流速において実施する。センサ表面を、ＮＨＳ（０．０５Ｍ）およびＥＤＣ（０．２Ｍ）の混合物により７分間活性化させる。ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中で約３０μｇ／ｍｌの濃度において７分間インジェクトする。エタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）を７分間インジェクトしていかなる残留活性化基もブロックする。平均１２，０００応答単位（ＲＵ）の捕捉抗体をそれぞれのフローセル上に固定化する。同一のＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡおよび０．００５％のＰ２０界面活性剤）を使用して動的結合実験を実施し、２５℃において平衡化する。０．５および１μｇ／ｍｌにおいてＳＩＲＰαバリアントを３０μｌ／分の流速において２分間インジェクトし、次いで同一流速において３０秒間緩衝液洗浄することにより、動的データを回収する。ヒトＣＤ４７−Ｈｉｓを、異なる濃度において３分間結合させ、次いで解離ステップを３０μｌ／分の流速において１０分間行う。BIA評価ソフトウェアにより１：１ラングミュア結合モデルを使用してデータをフィットさせる。動的速度定数を会合および解離相のフィットから決定し、それらの定数の比からＫＤを導出する。
ＣＤ４７への結合についてのＳＩＲＰαバリアントのアビディティを決定する代替的な方法において、細胞結合アッセイを使用することができる。例示的なプロトコルにおいて、ＣＤ４７により形質移入されたウェル当たり２×１０５個のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度の抗体と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートする。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞をＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ＊）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定する。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析する。データをGraph Pad Prismによりシグモイド曲線（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答−変数傾斜（４つのパラメータ））にフィットさせることにより、ＥＣ５０を計算する。
これらの突然変異をＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαを含む融合タンパク質中に導入する場合、得られるバリアントは、一般に、治療タンパク質として有用であるために十分なＳＩＲＰα生物学的活性を有する。一部の実施形態において、ＳＩＲＰαバリアントの生物学的活性は、野生型ＳＩＲＰαまたは野生型ＳＩＲＰαを含む融合タンパク質の生物学的活性の少なくとも０．０１倍、０．０３倍、０．０６倍、０．１倍、０．３倍、０．６倍、１倍、３倍、５倍、６倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍または１００倍である。本発明のＳＩＲＰαバリアントの生物学的活性は、インビトロまたはインビボアッセイにおいて試験することができる。ＣＤ４７を発現する細胞に対するＳＩＲＰαの生物学的活性を決定するためのインビトロアッセイは、当技術分野において十分確立されている。例えば、生物学的活性は、Liu et.al.（J.Mol.Bio.,365:680,2007）により記載されている白血球移動アッセイにおいて決定することができる。
免疫グロブリン部分
本明細書において使用される用語「抗体」は、インタクト抗体（例えば、インタクトモノクローナル抗体）を意味する。一部の実施形態において、「抗体」は、抗体の抗原結合断片を含む。抗原結合断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、および単一ドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」または「ナノボディ」または「ラクダ科抗体（camelid）」）が挙げられる。さらに他の実施形態において、抗体は、最適化、遺伝子操作または化学コンジュゲートされたインタクト抗体または抗体の抗原結合断片（例えば、完全ヒト抗体を含むファージディスプレイ抗体、半合成抗体または完全合成抗体）を含む。最適化された抗体の例は、親和性成熟抗体である。遺伝子操作された抗体の例は、Ｆｃ最適化抗体、および多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）である。毒素部分にコンジュゲートしている抗体は、化学コンジュゲート抗体の一例である。一部の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ｌｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＡであり得る。
本明細書において使用される用語「免疫グロブリン」または「免疫グロブリン分子」は、本明細書に定義される抗体または抗体の抗原結合断片を意味するが、抗体の一部、例えば、重鎖または軽鎖可変または定常領域も含む。免疫グロブリンの一部の例としては、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ、ＶＨ１、ＣＬおよびＶＬドメインならびにＦｃ領域が挙げられる。さらに、「免疫グロブリン」は、抗原結合部位を含むように遺伝子操作されたＦｃ断片または領域（「Ｆｃａｂ」）を含む。例えば、一実施形態において、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、腫瘍抗原についての結合特異性を有する「Ｆｃａｂ」部分を含む。「Ｆｃａｂ」は、当技術分野において、例えば、国際公開第２００８／００３１０３号および国際公開第２０１２／００７１６７号において考察されている。さらに、実施例１５は、免疫グロブリン部分がＨＥＲ２に対するＦｃａｂである本発明の免疫グロブリン融合タンパク質の一例を提供する。一部の実施形態において、「免疫グロブリン」は、さらなる可変もしくは定常重鎖もしくは軽鎖領域が、それがなければインタクトな抗体に付加された、または可変もしくは定常領域が元の位置から抗体内の新たな位置に再局在化または再配置された遺伝子操作抗体を含む。例えば、図１Ｅは、四価二重特異的抗体、すなわち、第２の可変領域を含むように遺伝子操作された抗体である免疫グロブリンを示す。再局在化または再配置の一例を、図１Ｉに示し、免疫グロブリン部分が、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、それに続く重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、およびアッパーヒンジ領域（Ｈ）に融合しているＦｃ領域である。
本発明によれば、融合部分、例えば、ＳＩＲＰαは、腫瘍抗原への抗体の結合に悪影響を与えないように免疫グロブリンに遺伝子的に結合させることができる。好ましくは、融合部分は、ＦｃＲエンゲージメントに最適でない構成でＦｃに結合しており、正常細胞に対する縮小したＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ活性をもたらす。一部の実施形態において、Ｆｃ領域は、改変ＦｃＲ結合能力を保持し、または有する。ヒト抗体断片（例えば、親および最適化バリアント）は、規定のエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ））を有するある定常（すなわち、Ｆｃ）領域を含有するように遺伝子操作することができる。ヒト定常領域は、当技術分野において公知である。
全長抗体と同一または同等の結合特徴を有する抗体の断片も存在し得る。このような断片は、１つまたは両方のＦａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片を含有し得る。抗体断片は、全長抗体の６つ全てのＣＤＲを含有し得るが、全てよりも少ないそのような領域、例えば、３、４または５つのＣＤＲを含有する断片も機能的である。
本発明によれば、一実施形態における免疫グロブリン融合タンパク質の免疫グロブリン部分は、インタクト抗体である。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン部分は、四価二重特異的抗体である。この実施形態を、例えば、図１Ｅに例示する。ある実施形態において、ＳＩＲＰα部分は、例えば、図１Ｂまたは図１Ｍにおいて重鎖のＣ末端に融合している一方、他の実施形態において、ＳＩＲＰα部分は、例えば、図１Ｇにおいて軽鎖のＣ末端に融合している。ＳＩＲＰα部分は、免疫グロブリン部分に任意選択のリンカーにより融合させることができる。
いっそうさらなる実施形態において、免疫グロブリン部分は、例えば、図１Ｉにおける、Ｃ末端においてＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むように遺伝子操作され、軽鎖が重鎖可変領域に結合しているＦｃである。一部の実施形態において、ＳＩＲＰα部分は、Ｆｃ部分のＮ末端に、場合により、リンカーを介して融合している。他の実施形態において、ＳＩＲＰα部分は、軽鎖のＣ末端または重鎖のＣ末端に、場合により、リンカーを介して融合している。
さらに別の実施形態において、免疫グロブリン部分は、そのＣ末端においてｓｃＦｖに結合しているＦｃ部分である。この実施形態を、例えば、図１Ｋに例示する。このような実施形態において、ＳＩＲＰα部分は、Ｆｃ領域のＮ末端に、場合により、リンカーを介して融合させることができる。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン部分は、そのＣ末端においてＦｃ領域に結合しているｓｃＦｖである。この実施形態を、例えば、図１Ｍに例示する。このような実施形態において、ＳＩＲＰα部分は、Ｆｃ領域のＣ末端に、場合により、リンカーを介して融合させることができる。
さらなる実施形態において、免疫グロブリン部分は、抗原結合ドメインを含むように遺伝子操作されたＦｃ領域である。例えば、一部の実施形態において、Ｆｃ領域は、例えば、ＣＨ３ドメイン中の抗原結合ドメインを含むように遺伝子操作されたＦｃ領域であるＦｃａｂ領域である。この実施形態を、例えば、図１Ｏに例示する。一部の実施形態において、ＳＩＲＰα部分は、ＦｃまたはＦｃａｂ領域のＮ末端に、場合により、リンカーを介して融合させることができる一方、他の実施形態において、ＳＩＲＰα部分は、そのＣ末端に、場合により、リンカーを介して融合させることができる。
さらに別の実施形態において、免疫グロブリン部分は、Ｆａｂである。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン部分は、Ｆａｂ’である。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン部分は、Ｆ（ａｂ’）２である。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン部分は、Ｆｖである。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン部分は、ｓｃＦｖである。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン部分は、ミニボディである。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン部分は、ダイアボディである。いっそうさらなる実施形態において、免疫グロブリン部分は、単一ドメイン抗体（ナノボディ）である。
本明細書に開示の免疫グロブリン部分のいずれも、免疫グロブリン部分のＮ末端においてまたは免疫グロブリン部分のＣ末端においてＣＤ４７結合剤に結合させることができる。免疫グロブリン部分がインタクト抗体であり、または重鎖（または重鎖の一部）および軽鎖（または軽鎖の一部）の両方を含む実施形態において、ＣＤ４７結合剤は、好ましくは、重鎖のＣ末端に付着しており；しかしながら、ＣＤ４７結合剤は、軽鎖のＣ末端に、または重鎖のＮ末端に、または軽鎖のＮ末端に付着させることができることも企図される。免疫グロブリン部分がＦｃまたはＦｃａｂである実施形態において、ＣＤ４７結合剤は、好ましくは、Ｆｃ部分のＮ末端に付着しているが、一部の実施形態において、ＣＤ４７結合剤は、Ｆｃ部分のＣ末端に付着している。一実施形態において、ＣＤ４７結合剤は、免疫グロブリン部分のＮ末端に融合している。別の実施形態において、ＣＤ４７結合剤は、免疫グロブリン部分のＣ末端に融合している。
本発明の免疫グロブリン融合タンパク質の作出において有用であり得る当技術分野において公知の抗体としては、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、フツキシマブ、モドツキシマブ、イムガツズマブ、ネシツムマブ；抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ チウキセタン、オカラツズマブ、オクレリズマブ、トシツモマブＩ−１３１、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ；および抗ＨＥＲ２抗体、例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ、マルゲツキジマブ；および抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびダバルマブが挙げられる。別の実施形態において、本発明は、上記抗体の公知重鎖および／または軽鎖配列の改変を、それらの改変抗体がユニーク重鎖および軽鎖相補性決定領域または非改変抗体の抗原についての結合特異性を保持するために十分な相補性決定領域を保持する限り企図する。
リンカー配列
本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、融合タンパク質のＣＤ４７結合剤部分を、融合タンパク質の抗体または免疫グロブリン部分と結合させるリンカー配列を含み得る。好ましいリンカーは、変動長さのＧｌｙ４Ｓｅｒフレキシブルリンカーである。例えば、リンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであり、種々の実施形態によれば、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。一実施形態において、ｎ＝４である。変動長さのＧｌｙ４Ｓｅｒフレキシブルリンカーは、標的化およびエフェクター機能を最適化するために導入することができる。
一実施形態において、一実施形態においてＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントであり得るＣＤ４７結合剤は、抗体または免疫グロブリン部分に、ＣＤ４７結合剤のＮ末端を融合タンパク質の免疫グロブリン部分の抗体のＣ末端と連結するポリペプチドリンカー配列を介して結合している。
別の実施形態において、一実施形態においてＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントであり得るＣＤ４７結合剤は、抗体または免疫グロブリン部分に、ＣＤ４７結合剤のＣ末端を融合タンパク質の抗体または免疫グロブリン部分のＮ末端と連結するポリペプチドリンカー配列を介して結合している。
本発明はまた、融合タンパク質のＣＤ４７結合剤部分および融合タンパク質の抗体または免疫グロブリン部分が化学リンカーであることを企図する。
腫瘍細胞抗原
本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、ＣＤ４７に特異的であるのに加え、腫瘍細胞抗原に特異的であるように設計される。上記のとおり、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、ＣＤ４７および腫瘍細胞抗原の両方に二重特異的であることにより、健常細胞上のＣＤ４７への結合を回避する所望のアウトカムを達成し得る。したがって、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、任意の腫瘍抗原に特異的であり得る。例示的な腫瘍細胞抗原としては、限定されるものではないが、４−１ＢＢ、４Ｆ２、ａ−ルイスｙ、Ａ２ａＲ、ＡＡＴＫ、ＡＣＫＲ、ＡＣＶＲ、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１、ＡＤＩＰＯＲ１、ＡＤＩＰＯＲ２、ＡＤＯＲＡ１、ＡＤＯＲＡ２、ＡＤＯＲＡ３、ＡＤＲ、ＡＧＴＲ、ＡＨＲ、ＡＬＫ、ＡＭＨＲ２、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴ４、ＡＰＬＮＲ、ＡＰＲＩＬＲ、ＡＲ、ＡＶＰＲ１Ａ、ＡＶＰＲ１Ｂ、ＡＶＰＲ２、ＡＸＬ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７ＲＰ１、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＡＩ１、ＢＡＩ２、ＢＤＫＲＢ１、ＢＤＫＲＢ２、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ２、ＢＲＤ８、ＢＲＳ３、ＢＴＬＡ、Ｃ３ＡＲ１、Ｃ５ＡＲ１、Ｃ５ＡＲ２、ＣＡＬＣＲ、ＣＡＳＲ、ＣＣＫＡＲ、ＣＣＫＢＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ１１、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６６、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９７、ＣＤ１１２、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２０６、ＣＤ２４４、ＣＤ３００、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＬＳＲ、ＣＨＲＭ１、ＣＨＲＭ２、ＣＨＲＭ３、ＣＨＲＭ４、ＣＨＲＭ５、ＣＩＩＴＡ、ＣＭＫＬＲ１、ＣＮＲ１、ＣＮＲ２、ＣＮＴＦＲ、ＣＲＨＲ１、ＣＲＨＲ２、ＣＲＩＭ１、ＣＲＬＦ１、ＣＲＬＦ２、ＣＲＬＦ３、ＣＳＰＧ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２Ｒ、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＴＬＡ４、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＹＳＬＴＲ１、ＣＹＳＬＴＲ２、Ｃｒｉｐｔｏ、ＤＡＲＣ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ジゴキシン、ＤＩＩ４、ＤＲＤ１、ＤＲＤ２、ＤＲＤ３、ＤＲＤ４、ＤＲＤ５、ＤＴＲ４、ＥＤＡ２Ｒ、ＥＤＡＲ、ＥＤ−Ｂ、ＥＤＮＲＡ、ＥＤＮＲＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＬＴＤ１、ＥＭＲ１、ＥＭＲ２、ＥＭＲ３、ＥＭＲ４Ｐ、ＥＮＧ、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＲ、エピシアリン、ＥＰＯＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＥＳＲＲ、Ｆ２Ｒ、Ｆ４／８０、ＦＡＳ、ＦＣＥＲ２、ＦＣＧＲ１、ＦＤＦ、ＦＦＡＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲＬ１、フィブリン、ＦＫＢＰ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＮ１４、ＦＯＬＲ１、ＦＰＲ１、ＦＳＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ１０、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、Ｇ−２８、ＧＡＢＢＲ、ＧＡＬ９、ＧＡＬＲ、ＧＣＧＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＮＦＲ、ＧＨＲ、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＳＲ、ＧＩＰＲ、ＧＩＴＲ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＬＰ２Ｒ、ＧＭ３、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＧＮＲＨＲ、ＧＰＢＡＲ１、ＧＰＥＲ、Ｇｒ−１、ハプテン、ＨＣＡＲ、ＨＣＲＴＲ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１０、ＨＬＡ−ＤＲＢ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＰＶ１６、ＨＰＶＥ６、ＨＰＶＥ７、ＨＭＧＢ１、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＨＲＨ、ＨＴＲｌ、ＨＴＲ２、ＨＴＲ３、ＨＴＲ４、ＨＴＲ５、ＨＴＲ６、ＨＴＲ７、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＤＯ、ＩＦＮＡＲ、ＩＦＮＧＲ、ＩＦＮＬＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＬ１０Ｒ、ＩＬ１１Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ１ＲＬ、ＩＬ２０Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ２８ＲＡ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ３１ＲＡ、ＩＬ３５Ｒ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＮＳＲ、ＩＮＳＲＲ、ＩＲＡＫ、ＩＲＰ−２、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ１０、ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡ７、ＩＴＧＡ８、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢ８、ＫＡＲ、ＫＩＲ、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＫＩＴ、Ｌ６抗原、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、ＬＥＰＲ、ルイスＹ、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＬＨＣＧＲ、ＬＩＦＲ、ＬＩＲ、ＬＭＴＫ２、ＬＭＴＫ３、ＬＰＡＲ、ＬＰＨＮ、ＬＴＢ４Ｒ、ＬＴＢＲ、ＬＴＫ、リゾチーム、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＳ１、ＭＡＳ１Ｌ、ＭＣ１Ｒ、ＭＣ２Ｒ、ＭＣ３Ｒ、ＭＣ４Ｒ、ＭＣ５Ｒ、ＭＣＨＲ、ＭＥＲＴＫ、メソテリン、ＭＥＴ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＩＲ、ＭＩＧ、ＭＬＮＲ、ＭＰＬ、ＭＲＧＰＲＤ、ＭＲＧＰＲＥ、ＭＲＧＰＲＦ、ＭＲＧＰＲＧ、ＭＲＧＰＲＸ１、ＭＲＧＰＲＸ２、ＭＲＧＰＲＸ３、ＭＲＧＰＲＸ４、ＭＳＴ１Ｒ、ＭＴＮＲ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＳＫ、ＮＡＩＰ、ＮＣＡＭ１、ＮＧＦＲ、ＮＩＰ−ｃａｐ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６、ＮＬＲＣ、ＮＬＲＰ、ＮＬＲＸ１、ＮＭＢＲ、ＮＭＵＲ１、ＮＭＵＲ２、ＮＯＤＩ、ＮＯＤ２、ＮＰＢＷＲ１、ＮＰＢＷＲ２、ＮＰＦＦＲ、ＮＰＲ１、ＮＰＲ２、ＮＰＲ３、ＮＰＳＲ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＮＰＹ２Ｒ、ＮＰＹ４Ｒ、ＮＰＹ５Ｒ、ＮＰＹ６Ｒ、ＮＲ０Ｂ１、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｈ５Ｐ、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＮＴＲＫ、ＮＴＳＲ２、ＯＧＦＲ、ＯＰＲ、ＯＳＭＲ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸＥＲ１、ＯＸＧＲ１、ＯＸＴＲ、Ｐ２ＲＹ、ＰＤ−１、ＰＤＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＧＲ、ＰＧＲＭＣ２、ホスファチジルセリン、ＰＬＡＰ、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＸＮ、ＰＰＡＲ、ＰＲＬＨＲ、ＰＲＬＲ、ＰＯＤＸＬ、ＰＲＯＫＲ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＧＤＲ、ＰＴＧＤＳ、ＰＴＧＥＲ、ＰＴＧＦＲ、ＰＴＧＩＲ、ＰＴＨ１Ｒ、ＰＴＨ２Ｒ、ＰＴＰＲ、ＱＲＦＰＲ、ＲＡＮＫ、ＲＡＲ、ＲＥＬＴ、ＲＥＴ、ＲＯＢＯ、ＲＯＲ、ＲＯＳ１、ＲＸＦＰ、ＲＸＲ、ＲＹＫ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＳＩＰＲ、ＳＣＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＢ１、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆ、ＳＤＣ、ＳＬＡＭ７、ＳＭＯ、ＳＯＲＴ１、ＳＰＯＣＫ２、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＴＲ、ＳＴ２、ＳＴＹＫ１、ＳＵＣＮ１、ＴＡＡＲ、ＴＡＣＲ、ＴＡＧ７２、ＴＢＸＡ２Ｒ、ＴＥＫ、ＴＧＦＢＲ、ＴＨＲ、ＴＩＥ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ１、ＴＩＭ２、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＴＬＲ１、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＮＣ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＰＲＡ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＴＲＨＲ、ＴＳＨＲ、ＴＵＢＢ３、ＴＷＥＡＫＲ、ＴＹＲＯ３、ＵＴＳ２Ｒ、ＶＣＡＭ１、ＶＤＲ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＩＰＲ１、ＶＩＰＲ２、ＶＩＳＴＡ、およびＸＣＲ１が挙げられる。
腫瘍細胞抗原に対する抗体を調製する方法は当技術分野において公知であり、それとしては、ハイブリドーマベース法、ファージディスプレイベース法、および酵母ディスプレイが挙げられる。
さらに、公知の方法により任意の腫瘍細胞抗原に対する新たな抗体を作出し、それにより生成された抗体を使用して本発明の免疫グロブリン融合タンパク質を作出することが可能である。
免疫グロブリン融合タンパク質の特性
上記のとおり、免疫グロブリン融合タンパク質による任意のレベルのＣＤ４７結合が融合タンパク質の治療的使用について許容可能なレベルのままであるように、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、疾患産生細胞、例えば、腫瘍細胞上のＣＤ４７に結合する能力を有する一方、正常細胞、特に赤血球（red blood cell）（赤血球（erythrocyte））上のＣＤ４７に結合せず、または少なくとも許容可能に低いレベルにおいて結合することが望まれる。
したがって、本発明は、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質を、赤血球（red blood cell）（赤血球（erythrocyte））への対照の結合と比較した赤血球へのそれらの相対結合により特徴付けすることができることを企図する。エリスロサイトへの本発明の免疫グロブリン融合タンパク質の相対結合の試験の一例を、以下の実施例１７に提供する。
例えば、対照としてのＣＤ４７抗体への％赤血球結合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を同定するためにフローサイトメトリーのような技術を使用し、その値を１００％に設定して、融合タンパク質の相対％赤血球結合ＭＦＩを計測することができる。一実施形態において、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、１００％において較正されたＲＢＣ ＭＦＩを有する対照抗体と比較して３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満の赤血球結合ＭＦＩを有する。他の実施形態において、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質の％ＲＢＣ ＭＦＩは、抗ＣＤ４７抗体の％ＲＢＣ ＭＦＩを１００％において較正する場合、０〜１％、０〜２％、０〜３％、０〜４％、０〜５％、０〜６％、０〜７％、０〜８％、０〜９％、０〜１０％、０〜１５％、０〜２０％、０〜２５％、０〜３０％、０〜３５％、１〜２％、１〜３％、１〜４％、１〜５％、１〜６％、１〜７％、１〜８％、１〜９％、１〜１０％、１〜１５％、１〜２０％、１〜２５％、１〜３０％、１〜３５％、２〜３％、２〜４％、２〜５％、２〜６％、２〜７％、２〜８％、２〜９％、２〜１０％、３〜４％、３〜５％、３〜６％、３〜７％、３〜８％、３〜９％、３〜１０％、４〜５％、４〜６％、４〜７％、４〜８％、４〜９％、４〜１０％、５〜６％、５〜７％、５〜８％、５〜９％、５〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、６〜７％、６〜８％、６〜９％、６〜１０％、７〜８％、７〜９％、７〜１０％、８〜９％、８〜１０％、９〜１０％、１０〜１５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、または１０〜３５％である。さらに別の実施形態において、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質の％ＲＢＣ ＭＦＩは、抗ＣＤ４７抗体の％ＲＢＣ ＭＦＩを１００％において較正する場合、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下である。一実施形態において、対照として使用される抗ＣＤ４７抗体は、軽鎖および重鎖アミノ酸配列が表４に配列番号１４６（軽鎖）および配列番号１４８（重鎖）として見出されるＢ６Ｈ１２／ｈｕＩｇＧ１である。融合タンパク質は、非赤血球上のＣＤ４７にも結合する。非赤血球は、一実施形態において、腫瘍細胞である。
本発明はまた、本発明の融合タンパク質をそれらの赤血球凝集プロファイルに基づき同定する方法を企図する。赤血球に対する本発明の免疫グロブリン融合タンパク質の赤血球凝集を試験する一例を、以下の実施例１８に提供する。
融合タンパク質の使用
本明細書に開示の融合タンパク質は、種々の形態の癌を治療するために使用することができる。治療するために本発明の免疫グロブリン融合タンパク質を使用することができる癌の非限定的なリストとしては、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ、基底細胞皮膚癌、乳癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、隆起性皮膚線維肉腫、ユーイング腫瘍ファミリー、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胃癌、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、膠芽細胞腫、頭頸部癌、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、咽頭および下咽頭癌、白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、肝臓癌、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、メルケル細胞癌、黒色腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経内分泌癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、腎臓癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、肉腫−成人軟部肉腫、扁平上皮皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。
癌細胞を、治療有効量の融合タンパク質に曝露させて癌細胞の増殖を阻害する。一部の実施形態において、融合タンパク質は、癌細胞増殖を少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％だけ阻害する。
一部の実施形態において、融合タンパク質を治療法において使用する。例えば、融合タンパク質を使用して哺乳動物（例えば、ヒト患者）における腫瘍成長を阻害することができる。一部の実施形態において、哺乳動物における腫瘍成長を阻害するための融合タンパク質の使用は、哺乳動物に治療有効量の融合タンパク質を投与することを含む。他の実施形態において、融合タンパク質は、腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用することができる。
本明細書において使用される「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、哺乳動物における、例えば、ヒトにおける疾患の治療を意味する。これとしては、（ａ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を停止させること；および（ｂ）疾患を緩和させること、すなわち、病状の退行を引き起こすことが挙げられる。
一般に、治療有効量の活性構成要素は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。投与される量は、可変要素、例えば、治療すべき疾患または適応症のタイプおよび程度、患者の一般的健康状態、抗体のインビボ効能、医薬配合物、ならびに投与経路に依存する。初回投与量を上限レベルを超えて増加させて所望の血中レベルまたは組織レベルを急速に達成することができる。あるいは、初回投与量は、最適量よりも少なくてよく、投与量は、治療過程の間に徐々に増加させることができる。最適用量は、定型的な実験により決定することができる。非経口投与について、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間、あるいは０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの間、あるいは１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの間、あるいは２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間、あるいは５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間の用量を投与し、例えば、治療サイクル当たり週１回、隔週１回、３週１回、または月１回で与えることができる。
治療的使用のため、本発明の融合タンパク質を、好ましくは、薬学的に許容可能な担体と組み合わせる。本明細書において使用される「薬学的に許容可能な担体」は、過度の毒性も刺激もアレルギー応答も他の問題も合併症もなしで妥当な利益／リスク比に見合うヒトおよび動物の組織との接触における使用に好適な緩衝液、担体、および賦形剤を意味する。担体は、配合物の他の成分と適合性であり、レシピエントに有害でないという意味で「許容可能」であるべきである。薬学的に許容可能な担体としては、医薬投与と適合性である緩衝液、溶媒、分散媒、コーティング、等張および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において公知である。
融合タンパク質、例えば、本明細書に開示のものを含有する医薬組成物は、単位剤形中で提供することができ、任意の好適な方法により調製することができる。医薬組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように配合すべきである。投与経路の例は、静脈内（ＩＶ）、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜、および直腸投与である。医薬組成物は、治療的治療のための非経口、鼻腔内、局所、経口、または例えば、経皮手段による外用投与を目的とする。医薬組成物は、非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内、または皮下注射により）、または経口摂取により、または血管もしくは癌病態を発症した区域における局所施与もしくは関節内注射により投与することができる。追加の投与経路としては、血管内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、脳室内、硬膜外内（intraepidural）、ならびに鼻腔内、眼内、強膜内、眼窩内、直腸、局所、またはエアロゾル吸入投与が挙げられる。
本発明は、許容可能な担体、好ましくは、水性担体、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ中などで溶解または懸濁された上記薬剤を含む非経口投与のための組成物を提供する。組成物は、生理学的条件に近似させるために要求される薬学的に許容可能な助剤物質、例えば、ｐＨ調整および緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤、洗浄剤などを含有し得る。本発明はまた、錠剤、カプセル剤などの配合のための不活性成分、例えば、結合剤または増量剤を含有し得る経口送達のための組成物を提供する。さらに、本発明は、クリーム剤、軟膏剤などの配合のための不活性成分、例えば、溶媒または乳化剤を含有し得る外用投与のための組成物を提供する。
融合タンパク質の好ましい投与経路は、ＩＶ注入である。有用な配合物は、薬学分野において周知の方法により調製することができる。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.（Mack Publishing Company,1990）参照。非経口投与に好適な配合物構成要素としては、無菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩；および張度調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースが挙げられる。
静脈内投与について、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF,Parsippany,NJ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、微生物に対して保存すべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体プロピレングリコール）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。
医薬配合物は、好ましくは、無菌である。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を介する濾過により達成することができる。組成物を凍結乾燥する場合、フィルタ滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に実施することができる。水溶液は、即時使用のために包装し、または凍結乾燥し、凍結乾燥調製物は、投与前に無菌水性担体と組み合わせる。調製物のｐＨは、典型的には、３〜１１の間、より好ましくは、５〜９の間または６〜８の間、最も好ましくは、７〜８の間、例えば、７〜７．５である。固体形態で得られる組成物は、固定量の上記の１つまたは複数の薬剤をそれぞれ含有する複数の単一用量単位で、例えば、錠剤またはカプセル剤の密封包装で包装することができる。
融合タンパク質産生
本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、一般に、融合タンパク質を発現するように遺伝子操作された１つまたは複数の核酸を含有する哺乳動物細胞を使用して組換えにより産生する。本発明の免疫グロブリン融合タンパク質が、融合タンパク質のアセンブリのために２つ以上の発現させるべきポリペプチド鎖を要求する場合、本発明は、ポリペプチド鎖のそれぞれをコードする核酸を１つまたは複数の細胞内に含有させて免疫グロブリン融合タンパク質の組換え産生を容易にすることを企図する。例えば、一実施形態において、核酸は、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質の重鎖またはその一部をコードする一方、別の核酸は、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質の軽鎖またはその一部をコードする。重鎖もしくはその一部をコードする核酸または軽鎖もしくはその一部をコードする核酸のいずれかは、ＣＤ４７結合部分、例えば、本明細書に記載のＳＩＲＰα部分をコードする核酸配列も含む。さらなる実施形態において、細胞は、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質の重鎖またはその一部をコードする核酸を含有し、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質の軽鎖またはその一部をコードする核酸を含有する。本発明の免疫グロブリン融合タンパク質の重鎖もしくはその一部をコードする核酸またはその軽鎖もしくはその一部をコードする核酸のいずれかは、ＣＤ４７結合部分、例えば、本明細書に記載のＳＩＲＰα部分をコードする核酸も含有する。
融合タンパク質発現および産生の例示的方法を、例えば、以下の実施例２および４に記載するが、広範な好適なベクター、細胞系およびタンパク質産生法を使用して生物医薬を産生し、本発明の融合タンパク質の合成において使用することができた。このような方法は当業者の知識の範囲内である。
実施例
実施例１：カニクイザルにおける赤血球に対する抗ＣＤ４７ Ｂ６Ｈ１２の効果
赤血球（ＲＢＣ）に対する抗ＣＤ４７ Ｂ６Ｈ１２モノクローナル抗体（キメラＢ６Ｈ１２−ヒトＩｇＧ４（Lindberg et al,JBC 269:1567,1994）のインビボ効果を、カニクイザルにおいて評価した。３匹のサルの群は、それぞれ１２ｍｇ／ｋｇにおけるＢ６Ｈ１２の単一静脈内投与を０日目に受けた。血液試料を−１０（ベースラインレベルを得るために注射１０日前）、ＲＢＣカウントおよびヘマトクリット（ＨＣＴ）決定のために単一静脈内投与の０、１、３、５および７日後に採取した。図２Ａ〜Ｂは、５日目までの５．８×１０９個から３．７×１０９個のＲＢＣ／ｍＬへの赤血球の強力な低減、すなわち、４０％の減少（図２Ａ）が、ヘマトクリットレベルの対応する低減（図２Ｂ）と一緒に存在したことを示す。したがって、抗ＣＤ４７抗体による処理は、重症貧血をもたらし得る。
実施例２：抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質
２（Ａ）抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの構築および発現
例示的な抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの生成は、抗ＣＤ２０ ２Ｂ８（リツキシマブ）モノクローナル抗体（Reff et al,Blood 83:435,1994）およびＳＩＲＰαタンパク質（Jiang et al,JBC 274: 559,1999）をベースとする。２Ｂ８についてのＦａｂ軽鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２に提供する。２Ｂ８についてのＦａｂ重鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号３および配列番号４に提供する。ＳＩＲＰαアレルＶ１のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号５および配列番号６に提供する。ＳＩＲＰαアレルＶ２のＩｇＶドメインのＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に提供する。抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２は、抗ＣＤ２０重鎖ポリペプチドのＣ末端を、ＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインに（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成した。
抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の発現のため、図１Ａにおけるように以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：（１）以下のエレメント：抗ＣＤ２０重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３アイソタイプＩｇＧ１、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびＳＩＲＰαＶ２をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ２０）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−ＳＩＲＰαＶ２（配列番号１１）ならびに（２）抗ＣＤ２０軽鎖可変ドメイン、それに続くヒトカッパ軽鎖定常ドメインをコードする構築物ＶＬ（抗ＣＤ２０）−ＣＬ（配列番号１）。これら２つの例示的構築物についての対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１２および配列番号２に示す。
抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２発現のための２つのベクターのセットを、Expi293細胞中にExpi293fectin（Life Technologies,Grand Island,NY）を使用して一過的に同時形質移入した。タンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる単一ステップで精製した。２つのポリペプチドの発現および完全四量体分子のアセンブリを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ上で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、精製タンパク質試料をＤＴＴにより還元し、NuPAGE MES 4-12% Gel上で２００Ｖにおいて３５分間ランさせ、次いでクーマシー染色した。ゲル上の２つの主要バンドは、予測ＭＷおよび正確な化学量論比を＞９５％純度で有した（図３Ａ）。図３Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は予測ＭＷ（６３，２３ｋＤａ）および抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示す。ＳＥＣのため、精製タンパク質試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１および３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ２により平衡化されたTSK-GEL Super SW3000ＳＥＣカラム４．６×３００ｍｍ（Tosoh Biosciences、東京、日本）上で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２についての約１７２ｋＤａの予測ＭＷにおけるピークを示した（図３Ｂ）。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＣＤ２０および抗ＣＤ４７（抗ＣＤ２０ｈｕＩｇＧＩおよび抗ＣＤ４７ｈｕＩｇＧ１）ならびにＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２）（図１Ｃ）を対照として生成して抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαフォーマットと比較した。
２（Ｂ）（ｉ）細胞上で発現されたＣＤ４７への抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰａの結合
細胞表面上で発現されたＣＤ４７に結合する抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の能力を計測し、対照分子と比較した。ＣＤ４７により形質移入されたウェル当たり２×１０５個のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度のタンパク質と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２、抗ＣＤ４７、ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２がＣＤ４７形質移入ＣＨＯ細胞上で発現されたＣＤ４７に結合したが、ＣＤ２０は発現されないため抗ＣＤ２０が結合しなかったことを示す（図４Ａ）。Ｆｃ−ＳＩＲＰαＶ２および抗ＣＤ４７は類似のＥＣ５０（７〜８ｎＭ）で結合したが、ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃはより良好に結合した（ＥＣ５０＝３ｎＭ）。しかしながら、蛍光中央値は、抗ＣＤ４７について最大であり、次いでＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃであり、Ｆｃ−ＳＩＲＰαＶ２および抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２については最小であった。
血球の細胞表面上で発現されたＣＤ４７に結合する抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の能力を計測し、対照分子と比較した。健常ヒトドナーからの新鮮全血をデキストラン沈殿により白血球について濃縮し、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した。ウェル当たり２×１０５個の白血球濃縮ヒト全血細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された５０μｇ／ｍｌのタンパク質と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、タンパク質検出およびフローサイトメトリーによる細胞ソーティングのために細胞をＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中１：２００希釈のＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）、１：１００希釈のＰＥマウス抗ヒトＣＤ２３５ａ（BD Biosciences,San Jose,CA）、および１：１００希釈のｅＦｌｕｏｒ４５０マウス抗ヒトＣＤ４５（eBioscience,San Diego,CA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、抗ＣＤ４７が赤血球および白血球上で発現されたＣＤ４７に結合したが、抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２、ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２が白血球上で発現されたＣＤ４７にのみ結合し、赤血球上で発現されたＣＤ４７に結合しなかったことを示す（図４Ｂ）。
２（Ｂ）（ｉｉ）細胞上で発現された両方の抗原への結合による抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαのアビディティの実証
ＣＤ２０を過剰発現し、ＣＤ４７を発現するヒトＲａｍｏｓＢ細胞リンパ腫細胞、およびＣＤ４７を過剰発現し、ＣＤ２０を発現するヒトNamalwaＢ細胞リンパ腫細胞上で、細胞表面上のＣＤ２０およびＣＤ４７への抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の結合を計測した。ウェル当たり２×１０５個のRajiまたはNamalwa細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度のタンパク質と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、RajiおよびNamalwa細胞の両方への抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２結合が、対照分子と比較していくぶん向上したことを示し（図４Ｃ〜Ｄ）、アビディティ効果を示唆する。フルオロフォア標識がＣＤ４７へのＳＩＲＰαの結合を停止させたため、結合を抗Ｆｃ検出によりアッセイした。しかしながら、Ｃ末端に付着している追加のタンパク質部分を有するＦｃ領域への抗Ｆｃ結合が、追加部分を有さない同一のＦｃ領域と比較して縮小することが細胞結合アッセイにおいて既に見出されており（データ示さず）、理論により拘束されるものではないが、Ｆｃ融合タンパク質への抗Ｆｃ結合がそれに関して立体障害を受け得ることを示唆する。したがって、抗Ｆｃによる抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２および抗ＣＤ２０の類似結合の観察は、抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２細胞結合の量を過小評価する可能性が高く、実際、細胞への抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２結合についてのアビディティ効果を示唆する。同一細胞上の２つの腫瘍標的への結合により腫瘍細胞への結合のアビディティを利用する抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の能力は、より特異的な標的化およびより少ないインビボ副作用をもたらし得る。
実施例３：抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７二重特異的抗体
３（Ａ）抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７の説明
ＣＤ２０およびＣＤ４７に対する例示的な四価二重特異的抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）の生成は、抗ＣＤ２０ ２Ｂ８（リツキシマブ）モノクローナル抗体（Reff et al,Blood 83:435,1994）および抗ＣＤ４７ Ｂ６Ｈ１２モノクローナル抗体（Lindberg et al,JBC 269:1567,1994）をベースとする。ＣＤ２０およびＣＤ４７に対する抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７ＴｅｔＢｉＡｂにおいて、抗ＣＤ２０重鎖ポリペプチドのＣ末端は、抗ＣＤ４７Ｆａｂ軽鎖のＮ末端にＧ４Ｓリンカーを介して結合している（図１Ｄ＋Ｅ）。抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７の構築、発現、および結合特性は、国際特許出願公開の国際公開第２０１４／１４４３５７号に記載されている。
３（Ｂ）抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７のインビボ生物学的活性
抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαのための代用物としての抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７の有用性は、以下のインビボ実験により示された。播種性リンパ腫モデルＳＣＩＤマウスに、５×１０６個のＣＤ２０＋ヒトDaudiリンパ腫細胞または１×１０６個のＣＤ２０＋ヒトRajiリンパ腫細胞のいずれかを静脈内注射し、次いで２５μｇ／マウスの抗体アイソタイプ対照、２５μｇ／マウスの抗ＣＤ２０、２５μｇ／マウスの抗ＣＤ４７、または等モル量の四価二重特異的抗体である４２μｇ／マウスの抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７を腹腔内注射した。全ての群（ｎ＝１０〜１１）は、週２回の処理を３週間受け、結果を一般的健康状態、例えば、死亡前に１０〜１４日だけ生じる麻痺、およびマウスの生存率として報告した。抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７四価二重特異的抗体による処理は、Daudi（図５Ａ）およびRaji（図５Ｂ）腫瘍モデルの両方で２つの単独療法よりも優れていることが見出された。類似の結果が、抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαについて予測される。
実施例４：抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質
４（Ａ）抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの構築および発現
例示的な抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの生成は、抗ＥＧＦＲ Ｃ２２５（セツキシマブ）モノクローナル抗体（Kawamoto,PNAS 80:1337,1983）およびＳＩＲＰαタンパク質（Jiang et al,JBC 274: 559,1999）をベースとする。Ｃ２２５についてのＦａｂ軽鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号１３および配列番号１４に提供する。Ｃ２２５についてのＦａｂ重鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号１５および配列番号１６に提供する。ＳＩＲＰαアレルＶ１のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号５および配列番号６に提供する。ＳＩＲＰαアレルＶ２のＩｇＶドメインのＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に提供する。例示的な抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ１は、抗ＥＧＦＲ重鎖ポリペプチドのＣ末端を、ＳＩＲＰαＶ１のＩｇＶドメインに（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成した。例示的な抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２は、抗ＥＧＦＲ重鎖ポリペプチドのＣ末端を、ＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインに（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）４、または（Ｇ４Ｓ）５リンカーを介して結合させることにより生成した。
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ１の発現のため、図１Ａにおけるように以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：（１）以下のエレメント：抗ＥＧＦＲ重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３アイソタイプＩｇＧ１、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびＳＩＲＰαＶ１のＩｇＶドメインをコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−ＳＩＲＰαＶ１（配列番号１７）ならびに（２）抗ＥＧＦＲ軽鎖可変ドメイン、それに続くヒトカッパ軽鎖定常ドメインをコードする構築物ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＬ（配列番号１３）。これら２つの構築物についての対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１８および配列番号１４に示す。
変動リンカー長さを有する抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の発現のため、図１Ａにおけるように以下の４つの遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：（１）以下のエレメント：抗ＥＧＦＲ重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３アイソタイプＩｇＧ１、それに続く（Ｇ４Ｓ）３リンカーおよびＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）３−ＳＩＲＰαＶ２（配列番号６９）、（２）以下のエレメント：抗ＥＧＦＲ重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３アイソタイプＩｇＧ１、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−ＳＩＲＰαＶ２（配列番号１９）、（３）以下のエレメント：抗ＥＧＦＲ重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３アイソタイプＩｇＧ１、それに続く（Ｇ４Ｓ）５リンカーおよびＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）５−ＳＩＲＰαＶ２（配列番号７１）、ならびに（４）以下のエレメント：抗ＥＧＦＲ軽鎖可変ドメイン、それに続くヒトカッパ軽鎖定常ドメインをコードする構築物ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＬ（配列番号１３）。これら４つの構築物についての対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７０、２０、７２および配列番号１４に示す。
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２発現のための２つのベクターのそれぞれのセットを、Expi293細胞中にExpi293fectin（Life Technologies,Grand Island,NY）を使用して一過的に同時形質移入した。タンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる単一ステップで精製した。２つのポリペプチドの発現および完全四量体分子のアセンブリを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）上で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、精製タンパク質試料をＤＴＴにより還元し、NuPAGE MES 4-12% Gel上で２００Ｖにおいて３５分間ランさせ、次いでクーマシー染色した。ゲル上の２つの主要バンドは、予測分子量（ＭＷ）および正確な化学量論比を＞９５％純度で有した（図６Ａ）。図６Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は予測ＭＷ（６４，２３ｋＤａ）および抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ１の２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示し、レーン３は予測ＭＷ（６４，２３ｋＤａ）および抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−（Ｇ４Ｓ）３−ＳＩＲＰαＶ２の２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示し、レーン４は予測ＭＷ（６４，２３ｋＤａ）および抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＳＩＲＰαＶ２の２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示し、レーン５は予測ＭＷ（６４，２３ｋＤａ）および抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＳＩＲＰαＶ２の２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示す。ＳＥＣのため、精製タンパク質試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１および３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ２により平衡化されたTSK-GEL Super SW3000ＳＥＣカラム４．６＿３００ｍｍ（Tosoh Biosciences、東京、日本）上で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαタンパク質のそれぞれについての約１７３ｋＤａの予測ＭＷにおけるピークを示した（図６Ｂ（ｉ）〜（ｉｖ））。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＥＧＦＲおよび抗ＣＤ４７（抗ＥＧＦＲ ｈｕＩｇＧ１および抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）ならびにＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ、Ｆｃ−ＳＩＲＰαＶ２、およびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２ＣＣ）（図１Ｃ）を対照として生成して抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαフォーマットと比較した。Ｆｃ−ＳＩＲＰαＶ２ＣＣは、ＳＩＲＰαＥＣＤ部分が、アレルＶ１のＩｇＣドメインに連結されているアレルＶ２のＩｇＶドメインを有するＦｃ融合タンパク質である（配列番号１９２）。
４（Ｂ）（１）細胞上で発現されたＣＤ４７への抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの結合
細胞表面上で過剰発現されたＣＤ４７に結合する例示的な抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの能力を計測し、対照分子と比較した。ＣＤ４７により形質移入されたウェル当たり２×１０５個のＣＨＯ細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度の抗体と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαタンパク質、抗ＣＤ４７、ＳＩＲＰα−ＦｃＶ２およびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２がＣＤ４７形質移入ＣＨＯ細胞上で発現されたＣＤ４７に結合したが、ＥＧＦＲは発現されないため抗ＥＧＦＲが結合しなかったことを示す（図７Ａ）。抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ｈｕＳＩＲＰαＶ２は、ＣＨＯ細胞上で発現されたＣＤ４７に、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ｈｕＳＩＲＰαＶ１よりも良好に結合した。ＦｃおよびＳＩＲＰα間のリンカーの長さによっては、細胞上で発現されたＣＤ４７についてのＳＩＲＰαの親和性は変化しなかった。ＳＩＲＰα−ＦｃＶ２はＣＤ４７形質移入ＣＨＯ細胞上で発現されたＣＤ４７に、Ｆｃ−ＳＩＲＰαＶ２よりも良好に結合し、それはＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２ＣＣよりも良好に結合したことも見出された（データ示さず）。
血球の細胞表面上で発現されたＣＤ４７に結合する例示的な抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの能力を計測し、対照分子と比較した。健常ヒトドナーからの新鮮全血をデキストラン沈殿により白血球について濃縮し、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した。ウェル当たり２×１０５個の白血球濃縮ヒト全血細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された５０μｇ／ｍｌのタンパク質と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、タンパク質検出およびフローサイトメトリーによる細胞ソーティングのために細胞をＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中１：２００希釈のＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）、１：１００希釈のＰＥマウス抗ヒトＣＤ２３５ａ（BD Biosciences,San Jose,CA）、および１：１００希釈のｅＦｌｕｏｒ４５０マウス抗ヒトＣＤ４５（eBioscience,San Diego,CA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、抗ＣＤ４７が赤血球および白血球上で発現されたＣＤ４７に結合したが、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２、ＳＩＲＰα−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαが白血球上で発現されたＣＤ４７にのみ結合し、赤血球上で発現されたＣＤ４７に結合しなかったことを示す（図７Ｂ）。
４（Ｂ）（ｉｉ）細胞上で発現された両方の抗原への結合による抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαのアビディティの実証
ＥＧＦＲを過剰発現し、ＣＤ４７を発現するヒトＡ５４９扁平上皮癌細胞上で、細胞表面上のＥＧＦＲおよびＣＤ４７にアビディティにより結合する例示的な抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの能力を計測した。ウェル当たり２×１０５個のＡ５４９細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度の抗体と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、Ａ５４９細胞への抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の結合が、抗ＥＧＦＲのものと類似したことを示す（図７Ｃ）。抗Ｆｃ検出は、追加のＣ末端部分を有するＦｃ融合タンパク質の細胞への結合を過小評価する可能性が高いため（実施例２Ｂ（ｉｉ）に記載のとおり）、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαおよび抗ＥＧＦＲの類似結合の観察は、細胞への抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα結合についてのそのアビディティ効果を示唆する。ＣＨＯ細胞上で発現されたＣＤ４７への結合とは対照的に、Ａ５４９腫瘍細胞上の内因性ＣＤ４７への抗ＣＤ４７の結合が、ＳＩＲＰα−Ｆｃよりもかなり良好であり、次いでそれはＦｃ−ＳＩＲＰαよりもかなり良好であったことは、注目に値する。さらに、理論により拘束されるものではないが、アビディティは、向上したインビトロＡＤＣＣ（図８）および向上したインビボ抗腫瘍活性（図９Ｂ）の両方に関して観察される抗ＥＧＦＲと比較して増加した抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２融合タンパク質の生物学的活性に寄与する可能性が高い。同一細胞上の２つの腫瘍標的への結合により腫瘍細胞への結合のアビディティを利用する抗ＥＧＦＲ−ｈｕｌｇＧ１−ＳＩＲＰαの能力は、より特異的な標的化およびより少ないインビボ副作用をもたらし得る。
４（Ｃ）抗ＥＧＦＲ−ｈｕｌｇＧ１−ＳＩＲＰαの薬物動態分析
抗ＥＧＦＲ−ｈｕｌｇＧ１−ＳＩＲＰαの薬物動態分析をマウス中への注射後に計測し、対照分子と比較した。Charles River Laboratoriesからの３６匹の健常雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）を少なくとも３日間馴化させた。分子のそれぞれについての２つの投与レベル（単一ＩＶボーラス）をマウスに１００μＬ／マウス（マウス当たり２０もしくは２００μｇ、または約１もしくは１０ｍｇ／ｋｇに相当）の容量で与えた。投与日、３６匹のマウスを６つの群に無作為に割り付け（Ｎ＝６／群）、それぞれの群は１用量／１分子をマウス尾静脈を介して静脈内でそれぞれ受けた。マウス体重を記録した。同一用量／物品（Ｎ＝６）を受けたマウスを、２つの下位群（ｎ＝３）にさらに分類した。４回の採血をそれぞれの下位群から行い、すなわち、ある下位群は、１時間、２４時間、７２時間および１６８時間である一方、別の下位群は７時間、４８時間、１２０時間および２４０時間であった。示される時点において、ヘパリン化マイクロガラスキャピラリーを使用して少量の血液試料を採取し、凝固防止のためにヘパリンによりコートされたチューブ中で回収した。細胞を除去するための遠心分離後、血漿中のタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡにより決定し、抗ヒトＩｇＧ Ｈ＋Ｌ（Jackson Immunoresearch,West Grove,PA）による捕捉によりアッセイし、次いで抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαを検出するためのペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Jackson Immunoresearch,West Grove,PA）により検出した。
結果は、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２が抗体と同様にクリアランスされたことを示す（図９Ａ）。最初の時点における初回の分布相の２倍降下後、血漿濃度は、約８日間の循環半減期に従って線形的に下落した。曝露は用量依存的であり、１０日後のＡＵＣは２０μｇ用量について２０５９ｈ＊μｇ／ｍｌであり、２００μｇ用量について１３１６４ｈ＊μｇ／ｍｌであった。クリアランスは用量依存的であり、２０μｇ用量については０．４９ｍＬ／ｈ．ｋｇであり、２００μｇ用量については０．７６ｍＬ／ｈ．ｋｇであった。
４（Ｄ）（ｉ）抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαのインビトロ生物学的活性
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαのインビトロ生物学的活性は、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて示される。６×１０４個のヒトＡ５４９扁平上皮癌細胞を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに移し、３７℃において一晩インキュベートした。細胞からの培地を除去し、０．０２〜１６００ｎｇ／ｍｌの濃度についての組換え抗体の段階希釈物により置き換えた。３７℃における１５〜３０分のインキュベーション後、抗体およびＡ５４９細胞を含有するプレートのそれぞれのウェルに、１．５×１０５個のエフェクター細胞（ＦｃγＲＩＩＩａ受容体、Ｖ１５８（高親和性）バリアント、およびホタルルシフェラーゼの発現をドライブするＮＦＡＴ応答エレメントを安定的に発現する遺伝子操作Jurkat細胞（Promega Madison,WI））を添加した（エフェクター細胞と標的細胞との比２．５：１）。２４時間のインキュベーション後、Bio-Glo試薬（Promega Madison,WI）を添加し、１５分間のインキュベーション後のルミネセンスを計測することにより、ルシフェラーゼ活性を介してＡＤＣＣ活性を計測した。
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２は、抗ＥＧＦＲ、ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２よりも有意に高いＡＤＣＣ活性を有することが見出された（図８）。理論により拘束されるものではないが、抗ＥＧＦＲと比較してかなり向上した抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２のインビトロ活性は、同一細胞上のＥＧＦＲおよび融合タンパク質間のより高い親和性の相互作用が生じたらＣＤ４７へのアビディティドライブ結合により引き起こされる可能性が最も高く、同一細胞上の２つの腫瘍標的の同時結合をもたらす。
４（Ｄ）（ｉｉ）抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαのインビボ生物学的活性
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの有用性は、インビボ実験により示される。同所性肺腫瘍モデルにおいて、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、２．５×１０６個のヒトＡ５４９−ｌｕｃ扁平上皮癌細胞を静脈内注射し、次いで２５０μｇ／マウスの抗体アイソタイプ対照、２５０μｇ／マウスの抗ＥＧＦＲ、２５０μｇ／マウスの抗ＣＤ４７、１３２μｇ／マウスのＳＩＲＰα−Ｆｃ、２５０μｇ／マウスの抗ＥＧＦＲおよび１３２μｇ／マウスのＳＩＲＰα−Ｆｃの組合せ、または等モル量の融合タンパク質である２９２μｇ／マウスの抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２を腹腔内注射した。全ての群（ｎ＝７）は、週２回の処理を３週間受け、結果を肺からの生物発光シグナル、一般的健康状態、例えば、死亡前に１０〜１４日だけ生じる麻痺、およびマウスの生存率として報告した。
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２による処理は、２つの単独療法よりも優れていることが見出された（図９Ｂ）。具体的には、生存日数中央値に基づくと、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２は、抗ＥＧＦＲよりも有意に有効であった（４０日対３１日、ｐ＝０．０１７５）。さらに、全生存率に基づくと、ＳＩＲＰα−Ｆｃが標的Ａ５４９細胞にＦｃ−ＳＩＲＰαよりも良好に結合するという事実にもかかわらず、融合タンパク質は、２つの単独療法の組合せよりもいくぶん有効であった。理論により拘束されるものではないが、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の向上した抗腫瘍活性は、同一細胞上のＥＧＦＲおよび融合タンパク質間のより高い親和性の相互作用が生じたらＣＤ４７へのアビディティドライブ結合により引き起こされる可能性が最も高く、向上したインビボＡＤＣＰおよびＡＤＣＣをもたらす。ＥＧＦ／ＥＧＦＲおよびＳＩＲＰα／ＣＤ４７相互作用の両方を同時に遮断すること、したがって、これら２つの経路のシグナリングを防止することも、向上したインビボ抗腫瘍活性に寄与し得る。
実施例５：抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質
５（Ａ）抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの構築および発現
例示的な抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの生成は、抗ＨＥＲ２ ４Ｄ５（トラスツズマブ）モノクローナル抗体（Carter et al,PNAS 89:4285,1992）およびＳＩＲＰαタンパク質（Jiang et al,JBC 274: 559,1999）をベースとする。４Ｄ５についてのＦａｂ軽鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号２１および配列番号２２に提供する。４Ｄ５についてのＦａｂ重鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号２３および配列番号２４に提供する。ＳＩＲＰαアレルＶ２のＩｇＶドメインのＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に提供する。抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２は、抗ＨＥＲ２重鎖ポリペプチドのＣ末端を、ＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインに（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成した。
抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の発現のため、図１Ａにおけるように以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：（１）以下のエレメント：抗ＨＥＲ２重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをコードする構築物ＶＨ（抗ＨＥＲ２）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−ＳＩＲＰαＶ２（配列番号２５）ならびに（２）以下のエレメント：抗ＨＥＲ２軽鎖可変ドメイン、それに続くヒトカッパ軽鎖定常ドメインをコードする構築物ＶＬ（抗ＨＥＲ２）−ＣＬ（配列番号２１）。これら２つの構築物についての対応するアミノ酸を、それぞれ配列番号２６および配列番号２２に示す。
抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの発現のために、２つのベクターを、Expi293細胞中にExpi293fectin（Life Technologies,Grand Island,NY）を使用して一過的に同時形質移入した。タンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる単一ステップで精製した。２つのポリペプチドの発現および完全四量体分子のアセンブリを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）上で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、精製タンパク質試料をＤＴＴにより還元し、NuPAGE MES 4-12% Gel上で２００Ｖにおいて３５分間ランさせ、次いでクーマシー染色した。ゲル上の２つの主要バンドは、予測分子量（ＭＷ）および正確な化学量論比を＞９５％純度で有した（図１０Ａ）。図１０Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は予測ＭＷ（６４，２３ｋＤａ）および抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示す。ＳＥＣのため、精製タンパク質試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１および３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ２により平衡化されたTSK-GEL Super SW3000ＳＥＣカラム４．６×３００ｍｍ（Tosoh Biosciences、東京、日本）上で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２についての約１７３ｋＤａの予測ＭＷにおけるピークを示した（図１０Ｂ）。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＨＥＲ２および抗ＣＤ４７（抗ＨＥＲ２ ｈｕＩｇＧ１および抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）ならびにＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２）（図１Ｃ）を対照として生成して抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαフォーマットと比較した。
５（Ｂ）（ｉ）細胞上で発現されたＣＤ４７への抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの結合
細胞表面上で発現されたＣＤ４７に結合する抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの能力を計測し、対照分子と比較した。ＣＤ４７により形質移入されたウェル当たり２×１０５個のＣＨＯ細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度の抗体と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２、抗ＣＤ４７、ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２がＣＤ４７形質移入ＣＨＯ細胞上で過剰発現されたＣＤ４７に結合したが、ＨＥＲ２は発現されないため抗ＨＥＲ２が結合しなかったことを示す（図１１Ａ）。ここでも、ＳＩＲＰα−Ｆｃは、Ｆｃ−ＳＩＲＰαよりも高い蛍光中央値を示した。
血球の細胞表面上で発現されたＣＤ４７に結合する抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの能力を計測し、対照分子と比較した。健常ヒトドナーからの新鮮な全血をデキストラン沈殿により白血球について濃縮し、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した。ウェル当たり２×１０５個の白血球濃縮ヒト全血細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された５０μｇ／ｍｌのタンパク質と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、タンパク質検出およびフローサイトメトリーによる細胞ソーティングのために細胞をＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中１：２００希釈のＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）、１：１００希釈のＰＥマウス抗ヒトＣＤ２３５ａ（BD Biosciences,San Jose,CA）、および１：１００希釈のｅＦｌｕｏｒ４５０マウス抗ヒトＣＤ４５（eBioscience,San Diego,CA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、抗ＣＤ４７が赤血球および白血球上で発現されたＣＤ４７に結合したが、抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２、ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２が白血球上で発現されたＣＤ４７にのみ結合し、赤血球上で発現されたＣＤ４７に結合しなかったことを示す（図１１Ｂ）。
５（Ｂ）（ｉｉ）両方の抗原を発現する細胞に対する抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの結合アビディティ
ＨＥＲ２を過剰発現し、ＣＤ４７を発現するヒトＢＴ４７４乳腺／乳腺腺癌細胞上で、細胞表面上のＨＥＲ２およびＣＤ４７にアビディティにより結合する抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの能力を計測した。ウェル当たり２×１０５個のＢＴ４７４細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度の抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα、Ｆｃ−ＳＩＲＰα、抗ＨＥＲ２、および抗ＣＤ４７と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、ＢＴ４７４細胞への抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２結合が、対照分子と比較して個々にまたは組合せのいずれでも向上することを示し（図１１Ｃ）、アビディティについての証拠を提供する。上記実施例において説明されるとおり、抗Ｆｃベース検出は、細胞への抗体−ＳＩＲＰα融合タンパク質の結合を過小評価する可能性が高い。したがって、抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２および抗ＨＥＲ２の類似結合の観察は、細胞への抗ＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα結合についてのアビディティ効果を示唆する。同一細胞上の２つの腫瘍標的への結合により腫瘍細胞への結合のアビディティを利用する抗ＨＥＲ２−ｈｕｌｇＧ１−ＳＩＲＰαの能力は、より特異的な標的化およびより少ないインビボ副作用をもたらし得る。
実施例６：抗ＧＤ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質
例示的な抗ＧＤ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの生成は、抗ＧＤ２ １４．１８モノクローナル抗体（Hank et al,Clin. Cancer Re.15:5923,2009）およびＳＩＲＰαタンパク質（Jiang et al,JBC 274:559,1999）をベースとする。１４．１８についてのＦａｂ軽鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号２７および配列番号２８に提供する。１４．１８についてのＦａｂ重鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号２９および配列番号３０に提供する。ＳＩＲＰαアレルＶ２のＩｇＶドメインのＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に提供する。抗ＧＤ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２は、抗ＧＤ２重鎖ポリペプチドのＣ末端を、ＳＩＲＰαＶ２に（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成する。
抗ＧＤ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の発現のため、図１Ａにおけるように以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングする：（１）以下のエレメント：抗ＧＤ２重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをコードする構築物ＶＨ（抗ＧＤ２）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−ＳＩＲＰαＶ２（配列番号３１）ならびに（２）以下のエレメント：抗ＧＤ２軽鎖可変ドメイン、それに続くヒトカッパ軽鎖定常ドメインをコードする構築物ＶＬ（抗ＧＤ２）−ＣＬ（配列番号２７）。これら２つの構築物についての対応するアミノ酸を、それぞれ配列番号３２および配列番号２８に示す。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＧＤ２および抗ＣＤ４７（抗ＧＤ２ ｈｕＩｇＧ１および抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）ならびにＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２）（図１Ｃ）を対照として生成して抗ＧＤ２−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαフォーマットと比較する。
実施例７：抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質
７（Ａ）抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの構築および発現
例示的な抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの生成は、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体アベルマブ（国際特許出願公開の国際公開第２０１３／０７９１７４号）およびＳＩＲＰαタンパク質（Jiang et al,JBC 274:559,1999）をベースとする。抗ＰＤ−Ｌ１についてのＦａｂ軽鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号３３および配列番号３４に提供する。抗ＰＤ−Ｌ１についてのＦａｂ重鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号３５および配列番号３６に提供する。ＳＩＲＰαアレルＶ２のヒトＩｇＶドメインのＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に提供する。ネズミＳＩＲＰαのＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号３７および配列番号３８に提供する。抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ｍｕＳＩＲＰαは、抗ＰＤ−Ｌ１重鎖ポリペプチドのＣ末端を、ｍｕＳＩＲＰαのＩｇＶドメインに（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成した。
抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ｍｕＳＩＲＰαの発現のため、図１Ａにおけるように以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：（１）以下のエレメント：抗ＰＤ−Ｌ１重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびｍｕＳＩＲＰαのＩｇＶドメインをコードする構築物ＶＨ（抗ＰＤ−Ｌ１）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−ｍｕＳＩＲＰα（配列番号４１）ならびに（２）以下のエレメント：抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖可変ドメイン、それに続くヒトカッパ軽鎖定常ドメインをコードする構築物ＶＬ（抗ＰＤ−Ｌ１）−ＣＬ（配列番号３３）。これら２つの構築物についての対応するアミノ酸を、それぞれ配列番号４２および配列番号３４に示す。
抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ｍｕＳＩＲＰαの発現のため、２つのベクターを、Expi293細胞中にExpi293fectin（Life Technologies,Grand Island,NY）を使用して一過的に同時形質移入した。タンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる単一ステップで精製した。２つのポリペプチドの発現および完全四量体分子のアセンブリを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）上で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、精製タンパク質試料をＤＴＴにより還元し、NuPAGE MES 4-12% Gel上で２００Ｖにおいて３５分間ランさせ、次いでクーマシー染色した。ゲル上の２つの主要バンドは、予測分子量（ＭＷ）および正確な化学量論比を＞９５％純度で有した（図１２Ａ）。図１２Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は予測ＭＷ（６４，２３ｋＤａ）および抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ｍｕＳＩＲＰαの２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示す。ＳＥＣのため、精製タンパク質試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１および３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ２により平衡化されたTSK-GEL Super SW3000ＳＥＣカラム４．６×３００ｍｍ（Tosoh Biosciences、東京、日本）上で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ｍｕＳＩＲＰαについての約１７３ｋＤａの予測ＭＷにおけるピークを示した（図１２Ｂ）。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ４７（抗ＰＤ−Ｌ１ ＩｇＧ１および抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）ならびにＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ、Ｆｃ−ｈｕＳＩＲＰαＶ２、およびＦｃ−ｍｕＳＩＲＰα）（図１Ｃ）を対照として生成して抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαフォーマットと比較する。
７（Ｂ）両方の抗原を発現する細胞上の抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαの結合アビディティ
ＰＤ−Ｌ１を過剰発現し、ＣＤ４７を発現するマウスＡ２０Ｂ細胞リンパ腫細胞上で、細胞表面上のＰＤ−Ｌ１およびＣＤ４７にアビディティにより結合する抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ｍｕＳＩＲＰαの能力を計測した。ウェル当たり２×１０５個のＡ２０細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度の抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ｍｕＳＩＲＰα、Ｆｃ−ｍｕＳＩＲＰα、および抗ＰＤ−Ｌ１と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、Ａ２０細胞への抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ｍｕＳＩＲＰα結合が、対照分子の結合と比較して一般に向上することを示し（図１３Ｃ）、アビディティについての証拠を提供する。上記実施例において説明されるとおり、抗Ｆｃベース検出は、細胞への抗体−ＳＩＲＰα融合タンパク質の結合を過小評価する可能性が高い。したがって、抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ｍｕＳＩＲＰαおよび抗ＰＤ−Ｌ１の類似結合の観察は、細胞への抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ｍｕＳＩＲＰα結合についてのアビディティ効果を示唆する。同一細胞上の２つの腫瘍標的への結合により腫瘍細胞への結合をアビディティを利用する抗ＰＤ−Ｌ１−ｈｕＩｇＧ１−ｍｕＳＩＲＰαの能力は、より特異的な標的化およびより少ないインビボ副作用をもたらし得る。
実施例８：抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα（非グリコシル化）免疫グロブリン融合タンパク質
８（Ａ）抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα（非グリコシル化）の構築および発現
例示的な抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα（非グリコシル化）の生成は、抗ＥＧＦＲ Ｃ２２５（セツキシマブ）モノクローナル抗体（Kawamoto,PNAS 80: 1337,1983）およびＮ１１０Ｑ突然変異を有するＳＩＲＰαタンパク質（Jiang et al,JBC 274:559,1999）をベースとする。非グリコシル化ＳＩＲＰαは、Ｎ１１０Ｑを介して、グリコシル化ＳＩＲＰαよりも不良にＣＤ４７に結合することが示された（Ogura et al,JBC 279:13711,2004）。Ｃ２２５についてのＦａｂ軽鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号１３および１４に提供する。Ｃ２２５についてのＦａｂ重鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号１５および１６に提供する。ＳＩＲＰαアレルＶ１のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号５および６に提供する。抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ１（Ｎ１１０Ｑ）は、抗ＥＧＦＲ重鎖ポリペプチドのＣ末端を、ＳＩＲＰαＶ１（Ｎ１１０Ｑ）のＩｇＶドメインに（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成する。
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ１（Ｎ１１０Ｑ）の発現のため、図１Ａにおけるように以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：（１）以下のエレメント：抗ＥＧＦＲ重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３アイソタイプＩｇＧ１、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびＳＩＲＰαＶ１（Ｎ１１０Ｑ）のＩｇＶドメインをコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−ＳＩＲＰαＶ１（Ｎ１１０Ｑ）（配列番号４３）、２）以下のエレメント：抗ＥＧＦＲ軽鎖可変ドメイン、それに続くヒトカッパ軽鎖定常ドメインをコードする構築物ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＬ（配列番号１３）。これら２つの構築物についての対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４４および配列番号１４に示す。
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ１（Ｎ１１０Ｑ）の発現のため、２つのベクターを、Expi293細胞中にExpi293fectin（Life Technologies,Grand Island,NY）を使用して一過的に同時形質移入した。タンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる単一ステップで精製した。２つのポリペプチドの発現および完全四量体分子のアセンブリを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）上で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、精製タンパク質試料をＤＴＴにより還元し、NuPAGE MES 4-12% Gel上で２００Ｖにおいて３５分間ランさせ、次いでクーマシー染色した。ゲル上の２つの主要バンドは、予測分子量（ＭＷ）および正確な化学量論比を＞９５％純度で有した（図１４Ａ）。図１４Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は予測ＭＷ（６４，２３ｋＤａ）および抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ１（Ｎ１１０Ｑ）の２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示す。ＳＥＣのため、精製タンパク質試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１および３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ２により平衡化されたTSK-GEL Super SW3000ＳＥＣカラム４．６×３００ｍｍ（Tosoh Biosciences、東京、日本）上で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ１（Ｎ１１０Ｑ）についての約１７３ｋＤａの予測ＭＷにおけるピークを示した（図１４Ｂ）。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＥＧＦＲおよび抗ＣＤ４７（抗ＥＧＦＲ ｈｕＩｇＧ１および抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）ならびにＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２）（図１Ｃ）を対照として生成して抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαフォーマットと比較する。
８（Ｂ）細胞上で発現されたＣＤ４７への抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα（非グリコシル化）の結合
細胞表面上で過剰発現されたＣＤ４７に結合する抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ１（Ｎ１１０Ｑ）の能力を計測し、対照分子と比較した。ＣＤ４７により形質移入されたウェル当たり２×１０５個のＣＨＯ細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度の抗体と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ１（Ｎ１１０Ｑ）が形質移入ＣＨＯ細胞上で発現されたＣＤ４７に結合したことを示す（図１５）。従来の報告（Ogura et al,JBC 279:13711,2004）とは異なり、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ｈｕＳＩＲＰαＶ１（Ｎ１１０Ｑ）は、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ｈｕＳＩＲＰαＶ１と同様に十分にＣＤ４７に結合した。
実施例９：抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質
９（Ａ）抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαの構築および発現
例示的な抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαの生成は、抗ＥＧＦＲ Ｃ２２５（セツキシマブ）モノクローナル抗体（Kawamoto,PNAS 80:1337,1983）およびＳＩＲＰαタンパク質（Jiang et al,JBC 274:559,1999）をベースとする。Ｃ２２５についてのＦａｂ軽鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号１３および配列番号１４に提供する。Ｃ２２５についてのＦａｂ重鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号１５および配列番号１６に提供する。ＳＩＲＰαアレルＶ１のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号５および配列番号６に提供し、ＳＩＲＰαアレルＶ２のＩｇＶドメインのＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に提供する。特定の実施形態において、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαは、抗ＥＧＦＲ軽鎖ポリペプチドのＣ末端を、ＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインに（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成し、いかなるリンカーも用いず直接、または（ＧＸＳ）Ｙ（Ｘ、Ｙ＝０、１、２、３、４、５、６、７、８以上）を用いて融合させることもできる。
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαＶ２の発現のため、図１Ｆにおけるように以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：（１）以下のエレメント：抗ＥＧＦＲ重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３アイソタイプＩｇＧをコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３（配列番号４５）ならびに（２）以下のエレメント：抗ＥＧＦＲ軽鎖可変ドメイン、それに続くヒトカッパ軽鎖定常ドメイン、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをコードする構築物ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＬ−（Ｇ４Ｓ）２−ＳＩＲＰαＶ２（配列番号４７）。これら２つの構築物についての対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４６および配列番号４８に示す。
抗ＥＧＦＲ−ｄｓ１−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαＶ２の発現のため、図１Ｆにおけるように以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：（１）以下のエレメント：軽鎖融合の脱安定化を補うための安定化突然変異（ｄｓ１：Ｇ４４Ｃ）（Orcutt et al,PEDS 23:221,2010）を有する抗ＥＧＦＲ重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３アイソタイプＩｇＧをコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）（ｄｓ１−Ｇ４４Ｃ）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３（配列番号７３）ならびに（２）以下のエレメント：安定化突然変異（ｄｓ１：Ａ１００Ｃ）を有する抗ＥＧＦＲ軽鎖可変ドメイン、それに続くヒトカッパ軽鎖定常ドメイン、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをコードする構築物ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）（ｄｓ１−Ａ１００Ｃ）−ＣＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＳＩＲＰαＶ２（配列番号７７）。これら２つの構築物についての対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７４および配列番号７８に示す。
抗ＥＧＦＲ−ｄｓ２−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαの発現のため、図１Ｆにおけるように以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：（１）以下のエレメント：軽鎖融合の脱安定化を補うための安定化突然変異（ｄｓ２：Ｑ１０５Ｃ（Orcutt et al,PEDS 23:221,2010）を有する抗ＥＧＦＲ重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３アイソタイプＩｇＧをコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）（ｄｓ２−Ｑ１０５Ｃ）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３（配列番号７５）ならびに（２）以下のエレメント：安定化突然変異（ｄｓ２：Ｓ４３Ｃ）を有する抗ＥＧＦＲ軽鎖可変ドメイン、それに続くヒトカッパ軽鎖定常ドメイン、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをコードする構築物ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）（ｄｓ２−Ｓ４３Ｃ）−ＣＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＳＩＲＰαＶ２（配列番号７９）。これら２つの構築物についての対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７６および配列番号８０に示す。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＥＧＦＲおよび抗ＣＤ４７（抗ＥＧＦＲ ｈｕＩｇＧ１および抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）ならびにＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２）（図１Ｃ）を対照として生成して抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαフォーマットと比較する。
重鎖ＣＨ１ドメイン中の２つの突然変異（配列番号４６のＳ１３１ＣおよびＣ２２２Ｓ）を導入することによりＩｇＧ４の重鎖および軽鎖ジスルフィド対合フォーマットを導入することにより、安定化の代替的方法を試験した。通常、重鎖Ｃ２２２と対合する軽鎖Ｃ末端システインは、目下、Ｃ１３１とジスルフィド結合を形成する。さらに、この突然変異重鎖は、よりいっそう高い安定性向上のためのｄｓ１またはｄｓ２突然変異のいずれかを有し得、それぞれの（ｄｓ１またはｄｓ２）軽鎖と対合している。
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαの発現のため、２つのベクターのそれぞれを、Expi293細胞中にExpi293fectin（Life Technologies,Grand Island,NY）を使用して一過的に同時形質移入した。タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる単一ステップで精製した。２つのポリペプチドの発現および完全四量体分子のアセンブリを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）上で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、精製タンパク質試料をＤＴＴにより還元し、NuPAGE MES 4-12% Gel上で２００Ｖにおいて３５分間ランさせ、次いでクーマシー染色した。ゲル上の２つの主要バンドは、予測分子量（ＭＷ）および正確な化学量論比を＞９５％純度で有した（図２１Ａ）。図２１Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は予測ＭＷ（４９,３６ｋＤａ）および抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαの２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示し、レーン３は予測ＭＷ（４９，３６ｋＤａ）および抗ＥＧＦＲ−ｄｓ１−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαの２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示し、レーン４は予測ＭＷ（４９，３６ｋＤａ）および抗ＥＧＦＲ−ｄｓ２−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαの２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示す。ＶＨおよびＶＬドメインの野生型配列は、ｄｓ１およびｄｓ２突然変異が軽鎖融合を安定化させるという予測とは異なり、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上の最小数の追加バンドを有した。ＳＥＣのため、精製タンパク質試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１および３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ２により平衡化されたTSK-GEL Super SW3000ＳＥＣカラム４．６×３００ｍｍ（Tosoh Biosciences、東京、日本）上で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαについての約１７２ｋＤａの予測ＭＷにおけるピークを示した（図２１Ｂ）。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＥＧＦＲおよび抗ＣＤ４７（抗ＥＧＦＲ ｈｕＩｇＧ１および抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）ならびにＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２）（図１Ｃ）を対照として生成して抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαフォーマットと比較する。
９（Ｂ）細胞上で発現されたＣＤ４７への抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαの結合
細胞表面上で過剰発現されたＣＤ４７に結合する抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαＶ２の能力を計測し、対照分子と比較した。ＣＤ４７により形質移入されたウェル当たり２×１０５個のＣＨＯ細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度の抗体と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。結果は、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１／抗ＥＧＦＲ−ＬＣ−ＳＩＲＰαＶ２が形質移入ＣＨＯ細胞上で発現されたＣＤ４７に結合したが、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２ほど十分に結合しなかったことを示す（図２１Ｃ）。
実施例１０：ＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）免疫グロブリン融合タンパク質
１０（Ａ）ＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）の構築および発現
例示的なＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）の生成は、抗ＥＧＦＲ Ｃ２２５（セツキシマブ）モノクローナル抗体（Kawamoto,PNAS 80:1337,1983）およびＳＩＲＰαタンパク質（Jiang et al,JBC 274:559,1999）をベースとする。Ｃ２２５についてのＦａｂ軽鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号１３および配列番号１４に提供する。Ｃ２２５についてのＦａｂ重鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号１５および配列番号１６に提供する。ＳＩＲＰαアレルＶ２のＩｇＶドメインのＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に提供する。ＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）は、ＳＩＲＰαをＦｃ重鎖のＮ末端に（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して結合させ、次いで抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ重鎖をＦｃ重鎖のＣ末端に（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成した。
ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）の発現のため、図１Ｈにおけるように以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：（１）以下のエレメント：ＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメイン、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびシステイン（軽鎖とのジスルフィド結合を天然に形成する）がセリンに突然変異しているヒト重鎖ヒンジ領域（ＥＰＫＳＳ、配列番号５０）、それに続く定常ドメイン２および３、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカー、および抗ＥＧＦＲ重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１、それに続くヒンジ領域（ＥＰＫＳＣ、配列番号５１、抗ＥＧＦＲ軽鎖とのジスルフィド架橋を可能とするため）をコードする構築物ＳＩＲＰαＶ２−（Ｇ４Ｓ）２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１（配列番号４９）ならびに（２）以下のエレメント：抗ＥＧＦＲ軽鎖可変ドメイン、それに続くヒトカッパ軽鎖定常ドメインをコードする構築物ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＬ（配列番号１３）。これら２つの構築物についての対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５２および配列番号１４に示す。
ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）の発現のため、２つのベクターを、Expi293細胞中にExpi293fectin（Life Technologies,Grand Island,NY）を使用して一過的に同時形質移入した。タンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる単一ステップで精製した。２つのポリペプチドの発現および完全四量体分子のアセンブリを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）上で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、精製タンパク質試料をＤＴＴにより還元し、NuPAGE MES 4-12% Gel上で２００Ｖにおいて３５分間ランさせ、次いでクーマシー染色した。ゲル上の２つの主要バンドは、予測分子量（ＭＷ）および正確な化学量論比を＞９５％純度で有した（図１６Ａ）。図１６Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は予測ＭＷ（６４，２３ｋＤａ）およびＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）の２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示す。ＳＥＣのため、精製タンパク質試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１および３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ２により平衡化されたTSK-GEL Super SW3000ＳＥＣカラム４．６×３００ｍｍ（Tosoh Biosciences、東京、日本）上で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体ＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）についての約１７３ｋＤａの予測ＭＷにおけるピークを示した（図１６Ｂ）。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＥＧＦＲおよび抗ＣＤ４７（抗ＥＧＦＲ ｈｕＩｇＧ１および抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）ならびにＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２）（図１Ｃ）を対照として生成してＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）フォーマットと比較する。
１０（Ｂ）細胞上で発現されたＣＤ４７へのＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）の結合
細胞表面上で過剰発現されたＣＤ４７に結合するＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）の能力を計測し、対照分子と比較した。ＣＤ４７により形質移入されたウェル当たり２×１０５個のＣＨＯ細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度の抗体と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、ＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）がＣＤ４７形質移入ＣＨＯ細胞上で発現されたＣＤ４７に結合したことを示す（図１７Ａ）。ＳｉＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）または対照ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃの結合は、抗ＣＤ４７のものと類似し、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ｈｕＳＩＲＰαＶ２またはＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２のものよりも良好であった。
１０（Ｃ）（ｉ）ＳＩＲＰａ−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）のインビボ生物学的活性
ＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）のインビトロ生物学的活性は、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて示される。６×１０４個のヒトＡ５４９扁平上皮癌細胞を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに移し、３７℃において一晩インキュベートした。細胞からの培地を除去し、０．０２〜１６００ｎｇ／ｍｌの濃度についての組換え抗体の段階希釈物により置き換えた。３７℃における１５〜３０分間のインキュベーション後、抗体およびＡ５４９細胞を含有するプレートのそれぞれのウェルに、１．５×１０５個のエフェクター細胞（ＦｃγＲＩＩＩａ受容体、Ｖ１５８（高親和性）バリアント、およびホタルルシフェラーゼの発現をドライブするＮＦＡＴ応答エレメントを安定的に発現する遺伝子操作Jurkat細胞（Promega Madison,WI））を添加した（エフェクター細胞と標的細胞との比２．５：１）。２４時間のインキュベーション後、Bio-Glo試薬（Promega Madison,WI)を添加し、１５分間のインキュベーション後のルミネセンスを計測することにより、ルシフェラーゼ活性を介してＡＤＣＣ活性を計測した。
ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）は、抗ＥＧＦＲよりも低いＡＤＣＣ活性を有するが、Ｆｃ−ＳＩＲＰαＶ２よりも高いＡＤＣＣ活性を有することが見出された（図１７Ｂ）。Ｆｃドメインに対する結合ドメインの向きは、ＡＤＣＣ活性を決定する。したがって、ＳＩＲＰα−ＦｃＶ２はＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２（図１７Ｂ）よりも高い活性を有し、抗ＥＧＦＲはＦｃ−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）（データを示さないが、活性は観察されず）よりも高い活性を有する。理論により拘束されるものではないが、ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）の抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）部分は細胞にＳＩＲＰα部分よりも高い親和性で結合したため、それは最適なＡＤＣＣ活性についての向きでＦｃを位置決めし得る。
１０（Ｃ）（ｉｉ）ＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）のインビボ生物学的活性
ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）の有用性は、インビボ実験により示される。同所性肺腫瘍モデルにおいて、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、２．５×１０６個のヒトＡ５４９−ｌｕｃ扁平上皮癌細胞を静脈内注射し、次いで４００μｇ／マウスの抗体アイソタイプ対照、２５０μｇ／マウスの抗ＥＧＦＲ、２５０μｇ／マウスの抗ＥＧＦＲおよび１３６μｇ／マウスのＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃの組合せ、２９８μｇ／マウスの抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２、または等モル量の融合タンパク質である２９８μｇ／マウスのＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）を腹腔内注射した。全ての群（ｎ＝７）は、週２回の処理を３週間受け、結果を肺からの生物発光シグナル、一般的健康状態、例えば、死亡前に１０〜１４日だけ生じる麻痺、およびマウスの生存率として報告した。
ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）融合タンパク質による処理は、ＥＧＦＲへの類似の結合およびＣＤ４７への優れた結合を有するにもかかわらず、組合せおよび抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２よりもわずかに劣ることが見出された（それぞれ、生存中央値４０日、４２日および４３．５日、図１８）。図１７Ｂに示されるＡＤＣＣの低減は、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２と比較して減少したＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（Ｆａｂ）の抗腫瘍効力の原因となり得る。
実施例１１：ＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）免疫グロブリン融合タンパク質
例示的なＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）の生成は、ＳＩＲＰαタンパク質（Jiang et al,JBC 274:559,1999）および抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）Ｃ２２５（米国特許第７，８２０，１６５号）をベースとする。ＳＩＲＰαアレルＶ２のＩｇＶドメインのＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に提供する。抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）Ｃ２２５のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号５３および配列番号５４に提供する。ＳＩＲＰＶ２α−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）は、ＳＩＲＰαのＩｇＶドメインを、Ｆｃ重鎖のＮ末端に（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して結合させ、次いで抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）をＦｃ重鎖のＣ末端に（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成する。
ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）Ｃ２２５の発現のため、図１Ｊにおけるように以下の遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：以下のエレメント：ＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメイン、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびシステイン（軽鎖とのジスルフィド結合を天然に形成する）がセリンに突然変異しているヒト重鎖ヒンジ領域（ＥＰＫＳＳ、配列番号５０）、それに続く定常ドメイン２および３、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよび抗ＥＧＦＲ重鎖可変ドメイン、それに続く（Ｇ４Ｓ）３リンカーおよび抗ＥＧＦＲ軽鎖可変ドメインをコードする構築物ＳＩＲＰαＶ２−（Ｇ４Ｓ）２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−Ｃ２２５（ＶＨ）−（Ｇ４Ｓ）３−Ｃ２２５（ＶＬ）（配列番号５５）。この構築物についての対応するアミノ酸配列を配列番号５６に示す。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＥＧＦＲおよび抗ＣＤ４７（抗ＥＧＦＲ ｈｕＩｇＧ１および抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）、ｓｃＦｖフォーマットの抗ＥＧＦＲ（抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ））、ならびにＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２）（図１Ｃ）を対照として生成してＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）フォーマットと比較した。
実施例１２：抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−ＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質
例示的な抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−ＳＩＲＰαの生成は、抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）Ｃ２２５（米国特許第７，８２０，１６５号）およびＳＩＲＰαタンパク質（Jiang et al,JBC 274:559,1999）をベースとする。抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）Ｃ２２５のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号５３および配列番号５４に提供する。ＳＩＲＰαアレルＶ２のＩｇＶドメインのＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に提供する。抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−ＳＩＲＰαＶ２は、抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）をＦｃ重鎖のＮ末端に（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して結合させ、次いでＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをＦｃ重鎖のＣ末端に（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成する。
抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）Ｃ２２５−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−ＳＩＲＰαＶ２の発現のため、図１Ｌにおけるように以下の遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：以下のエレメント：抗ＥＧＦＲ重鎖可変ドメイン、それに続く（Ｇ４Ｓ）３リンカーおよび抗ＥＧＦＲ軽鎖可変ドメイン、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびシステイン（軽鎖とのジスルフィド結合を天然に形成する）がセリンに突然変異しているヒト重鎖ヒンジ領域（ＥＰＫＳＳ、配列番号５０）、それに続く定常ドメイン２および３、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをコードする構築物Ｃ２２５（ＶＨ）−（Ｇ４Ｓ）３−Ｃ２２５（ＶＬ）−（Ｇ４Ｓ）２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−ＳＩＲＰαＶ２（配列番号５７）。この構築物についての対応するアミノ酸配列を、配列番号５８に示す。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＥＧＦＲおよび抗ＣＤ４７（抗ＥＧＦＲ ｈｕＩｇＧ１および抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）、ｓｃＦｖフォーマットの抗ＥＧＦＲ（抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ））、ならびにＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２）（図１Ｃ）を対照として生成して抗ＥＧＦＲ（ｓｃＦｖ）−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−ＳＩＲＰαＶ２フォーマットと比較した。
実施例１３：ＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）免疫グロブリン融合タンパク質
ＳＩＲＰα−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）の生成は、ＳＩＲＰαタンパク質（Jiang et al,JBC 274:559,1999）および抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）ＣＨＲＩ−１９Ｆｖ１（Nicholson et al,Molecular Immunology 34:1157,1997）をベースとする。ＳＩＲＰαアレルＶ２のＩｇＶドメインのＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に提供する。ＣＨＲＩ−１９Ｆｖ１のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号５９および配列番号６０に提供する。ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）は、ＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをＦｃ重鎖のＮ末端に（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して結合させ、次いで抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）をＦｃ重鎖のＣ末端に（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成する。
ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）の発現のため、図１Ｊにおけるように以下の遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：以下のエレメント：ＳＩＲＰαＶ２、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびシステイン（軽鎖とのジスルフィド結合を天然に形成する）がセリンに突然変異しているヒト重鎖ヒンジ領域（ＥＰＫＳＳ、配列番号５０）、それに続く定常ドメイン２および３、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよび抗ＣＤ１９重鎖可変ドメイン、それに続く（Ｇ４Ｓ）３リンカーおよび抗ＣＤ１９軽鎖可変ドメインをコードする構築物ＳＩＲＰαＶ２−（Ｇ４Ｓ）２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−ＣＨＲＩ−１９Ｆｖ１（ＶＨ）−リンカー−ＣＨＲＩ−１９Ｆｖ１（ＶＬ）（配列番号６１）。この構築物についての対応するアミノ酸配列を配列番号６２に示す。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＣＤ４７（抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）、ｓｃＦｖフォーマットの抗ＣＤ１９（抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ））、Ｆｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２）（図１Ｃ）を対照として生成してＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）フォーマットと比較する。
実施例１４：抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−ＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質
例示的な抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−ＳＩＲＰαの生成は、抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）ＣＨＲＩ−１９Ｆｖ１（Nicholson et al,Molecular Immunology 34:1157,1997）およびＳＩＲＰαタンパク質（Jiang et al,JBC 274: 559,1999）をベースとする。ＣＨＲＩ−１９Ｆｖ１のＤＮＡおよびタンパク質配列をそれぞれ配列番号５９および配列番号６０に提供する。ＳＩＲＰαアレルＶ２のＩｇＶドメインのＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に提供する。抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−ＳＩＲＰαＶ２は、抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）をＦｃ重鎖のＮ末端に（Ｇ４Ｓ）２ リンカーを介して結合させ、次いでＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをＦｃ重鎖のＣ末端に（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成する。
抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−ＳＩＲＰαＶ２の発現のため、図１Ｌにおけるように以下の遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：以下のエレメント：抗ＣＤ１９重鎖可変ドメイン、それに続く（Ｇ４Ｓ）３リンカーおよび抗ＣＤ１９軽鎖可変ドメイン、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびシステイン（軽鎖とのジスルフィド結合を天然に形成する）がセリンに突然変異しているヒト重鎖ヒンジ領域（ＥＰＫＳＳ、配列番号５０）、それに続く定常ドメイン２および３、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをコードする構築物ＣＨＲＩ−１９Ｆｖ１（ＶＨ）−リンカー−ＣＨＲＩ−１９Ｆｖｌ（ＶＬ）−（Ｇ４Ｓ）２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−ＳＩＲＰαＶ２（配列番号６３）。この構築物についての対応するアミノ酸配列を配列番号６４に示す。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＣＤ４７（抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）、ｓｃＦｖフォーマットの抗ＣＤ１９（抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ））、およびＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２）（図１Ｃ）を対照として生成して抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）−Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１）−ＳＩＲＰαＶ２フォーマットと比較する。
実施例１５：ＳＩＲＰα−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）免疫グロブリン融合タンパク質
１５（Ａ）ＳＩＲＰα−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）の構築および発現
例示的なＳＩＲＰα−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）の生成は、ＳＩＲＰαタンパク質（Jiang et al,JBC 274:559,1999）および抗ＨＥＲ２ Ｆｃａｂ Ｈ１０−０３−６（Wozniak-Knopp et al,PEDS 23:289,2010）をベースとする。ＳＩＲＰαアレルＶ２のＩｇＶドメインのＤＮＡおよびタンパク質配列をそれぞれ配列番号７および配列番号８に提供する。Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ配列番号６５および配列番号６６に提供する。ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）は、ＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをＦｃａｂ（ＨＥＲ２）のＮ末端に（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して結合させることにより生成する。
ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）の発現のため、図１Ｆにおけるように以下の遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：以下のエレメント：ＳＩＲＰαＶ２、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびシステイン（軽鎖とのジスルフィド結合を天然に形成する）がセリンに突然変異しているヒト重鎖ヒンジ領域（ＥＰＫＳＳ、配列番号５０）、それに続くＨＥＲ２にＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループを介して結合するように改変された定常ドメイン２および定常ドメイン３をコードする構築物ＳＩＲＰαＶ２−（Ｇ４Ｓ）２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３（抗ＨＥＲ２）（配列番号６７）。この構築物についての対応するアミノ酸配列を配列番号６８に示す。
ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）の発現のため、ベクターを、Expi293細胞中にExpi293fectin（Life Technologies,Grand Island,NY）を使用して一過的に形質移入した。タンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる単一ステップで精製した。分子の発現を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）上で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、精製タンパク質試料をＤＴＴにより還元し、NuPAGE MES 4-12% Gel上で２００Ｖにおいて３５分間ランさせ、次いでクーマシー染色した。ゲル中の主要バンドは、予測分子量（ＭＷ）を＞９５％純度で有した（図１９Ａ）。図１９Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２はＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）の予測ＭＷ（４０ｋＤａ）を示す。ＳＥＣのため、精製タンパク質試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１および３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ２により平衡化されたTSK-GEL Super SW3000ＳＥＣカラム４．６×３００ｍｍ（Tosoh Biosciences、東京、日本）上で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）についての約８０ｋＤａの予測ＭＷにおけるピークを示した（図１９Ｂ）。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＨＥＲ２および抗ＣＤ４７（抗ＨＥＲ２ ｈｕＩｇＧ１および抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）、Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）、およびＦｃ−融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−ＦｃおよびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２）（図１Ｃ）を対照として生成してＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）フォーマットと比較した。
１５（Ｂ）（ｉ）細胞上で発現されたＣＤ４７へのＳＩＲＰα−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）の結合
細胞表面上で発現されたＣＤ４７に結合するＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）の能力を計測し、対照分子と比較した。ＣＤ４７により形質移入されたウェル当たり２×１０５個のＣＨＯ細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度の抗体と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）、抗ＣＤ４７、およびＳＩＲＰα−Ｆｃが形質移入ＣＨＯ細胞上で発現されたＣＤ４７に結合したが、ＨＥＲ２は発現されないため抗ＨＥＲ２およびＦｃａｂ（ＨＥＲ２）が結合しなかったことを示す（図２０Ａ）。
１５（Ｂ）（ｉｉ）両方の抗原を発現する細胞上のＳＩＲＰα−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）の結合アビディティ
ＨＥＲ２を過剰発現し、ＣＤ４７を発現するヒトＢＴ４７４乳腺／乳腺腺癌細胞上で、細胞表面上のＨＥＲ２およびＣＤ４７にアビディティにより結合するＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）の能力を計測した。ウェル当たり２×１０５個のＢＴ４７４細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度のＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）、ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ、Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）、抗ＨＥＲ２、および抗ＣＤ４７と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。
結果は、ＢＴ４７４細胞へのＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）結合が、特により低い濃度においてＦｃａｂ（ＨＥＲ２）の結合と比較して向上したことを示し（図２０Ｂ）、アビディティについての強力な証拠を提供する。同一細胞上の２つの腫瘍標的への結合により腫瘍細胞への結合をアビディティを利用するＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃａｂ（ＨＥＲ２）の能力は、より特異的な標的化およびより少ないインビボ副作用をもたらし得る。
実施例１６：ＣＤ４７結合に影響を与えるＳＩＲＰα残基を同定するコンピュータ利用法
当業者が精通するコンピュータ利用法を使用してＣＤ４７へのＳＩＲＰαの結合に影響を与え得るＳＩＲＰα残基を同定し、ＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合親和性を減少または増加させる潜在性を有する突然変異を予測し、実験により追求する価値のある候補を同定した。手短に述べると、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα複合体の結晶構造を分析してＣＤ４７結合に影響を与えることが予測されるＳＩＲＰα残基位置を同定した。
コンピュータによる突然変異誘発をＳＩＲＰα位置の選択セットに対して実施して野生型ＳＩＲＰαと比較した種々の推定突然変異の結合エネルギーの差についての値を得、野生型ＳＩＲＰαに対して低減したＣＤ４７についての親和性または増加した親和性のいずれかを有することが予測される突然変異を分類するために閾値を設定した。低減または増加した親和性ＳＩＲＰαバリアントの指定のために設定する閾値が重複したため、表１および表２（以下参照）に列記されるコンピュータにより予測された突然変異の有意な重複も存在した。
主として表２からの単一点突然変異を含有する３３のＳＩＲＰαバリアントを、さらなる実験による特徴付けのために選択した（実施例１７の表３参照）。
実施例１７：抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαバリアント
１７（Ａ）抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαバリアントの構築および発現
抗体−ＳＩＲＰαバリアントを、実施例４に記載の抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２に関して生成した。ＳＩＲＰαアレルＶ２のＩｇＶドメイン中の突然変異を表３（配列番号８を参照）に列記する。抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２バリアントは、抗ＥＧＦＲ重鎖ポリペプチドのＣ末端をバリアントＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインに（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成した。
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２バリアントのそれぞれの発現のため、図１Ａにおけるように以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：（１）それぞれのバリアントについて表３に列記される特定の突然変異をコードするように改変される配列を有する構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−ＳＩＲＰαＶ２（配列番号１９）；この構築物は、以下のエレメントをコードした：抗ＥＧＦＲ重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３アイソタイプＩｇＧ１、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびバリアントＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインならびに（２）以下のエレメント：抗ＥＧＦＲ軽鎖可変ドメイン、それに続くヒトカッパ軽鎖定常ドメインをコードする構築物ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＬ（配列番号１３）。これら２つの構築物についての対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２０（配列は、表３に列記される特定の突然変異を含むように改変しなければならない）および配列番号１４に示す。
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２バリアントのそれぞれの発現のため、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２バリアントのそれぞれについての２つのベクターのセットを、Expi293細胞中にExpi293fectin（Life Technologies,Grand Island,NY）を使用して一過的に同時形質移入した。タンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる単一ステップで精製した。２つのポリペプチドの発現および完全四量体分子のアセンブリを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）上で確認した。ＳＥＣのため、精製タンパク質試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１および３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ２により平衡化されたTSK-GEL Super SW3000ＳＥＣカラム４．６＿３００ｍｍ（Tosoh Biosciences、東京、日本）上で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２についての約１７３ｋＤａの予測ＭＷにおけるピークを示した。全てのＳＥＣピークに対する単量体ピークの割合を表３のそれぞれのバリアントについて報告した。
さらに、野生型抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（「ＷＴ」）、キメラ抗体Ｂ６Ｈ１２／ｈｕＩｇＧ１（「抗ＣＤ４７」）、および複数の突然変異を有する抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（「１Ｄ４」（Ｖ２７Ｉ／Ｋ５３Ｒ／Ｓ６６Ｔ／Ｋ６８Ｒ／Ｆ１０３Ｖ）、（Weiskopf,Science 341:88,2013）；「ＡＳ２」（Ｋ５３Ｒ／Ｓ６６Ｔ／Ｋ６８Ｒ）；および「ＡＳ１」（Ｌ４Ｖ／Ｖ２７Ｉ／Ｉ３１Ｔ／Ｋ５３Ｒ／Ｓ６６Ｔ／Ｋ６８Ｒ／Ｆ９４Ｌ））を陽性対照として生成し、抗ＥＧＦＲを陰性対照として生成した。
１７（Ｂ）（ｉ）細胞上で発現されたＣＤ４７への抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαバリアントの結合
細胞表面上で過剰発現されたＣＤ４７に結合する抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２バリアントの能力を計測し、対照分子と比較した。高レベルのＣＤ４７を発現するように形質移入されたウェル当たり２×１０５個のＣＨＯ細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度の抗体と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。それぞれのバリアントについて、ＣＨＯ細胞上で発現されたＣＤ４７への結合について、Graph Pad Prismによりデータをシグモイド曲線（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答−変数傾斜（４つのパラメータ））にフィットさせることによりＥＣ５０を計算し、表３に報告した。
結果は、多くの抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２バリアント、例として、Ｖ６Ｉ、Ｖ２７Ｉ、Ｉ３１Ｒ、Ｉ３１Ｔ、Ｑ３７Ｈ、Ｑ３７Ｗ、Ｈ５６Ｐ、およびＳ６６Ｑが、形質移入ＣＨＯ細胞上で発現されたＣＤ４７に、野生型抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２よりも高い親和性で結合したことを示す（表３）一方、バリアントＥ５４ＰおよびＭ７２Ｒは類似の親和性で結合した。予測されるとおり、陽性対照の抗ＣＤ４７、１Ｄ４、ＡＳ２、およびＡＳ１もＣＤ４７により大きい親和性で結合し、陰性対照の抗ＥＧＦＲは結合しなかった。それというのも、ＥＧＦＲは発現されないためである。結果は、ＳＩＲＰα中の単一点突然変異がＣＤ４７についてのＳＩＲＰαの親和性を増加させるために十分であることを示す。
固有結合親和性を比較するため、すなわち、高い受容体密度において生じる二価エンゲージメントに起因するアビディティ効果を最小化するため、低レベルのＣＤ４７を発現する細胞への抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２バリアントおよび対照分子の結合を決定した。ウェル当たり２×１０５個のＣＤ４７ＬＯヒトＲａｍｏｓリンパ腫細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された変動濃度の抗体と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で１：２００希釈されたＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）と氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。それぞれのバリアントについて、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されたＣＤ４７への結合について、Graph Pad Prismによりデータをシグモイド曲線（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答−変数傾斜（４つのパラメータ））にフィットさせることによりＥＣ５０を計算し、表３に報告した。
結果は、多くの抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２バリアント、例として、Ｖ６Ｉ、Ｖ２７１、Ｉ３１Ｒ、Ｉ３１Ｔ、Ｑ３７Ｈ、Ｑ３７Ｗ、Ｅ５４Ｐ、Ｈ５６Ｐ、Ｓ６６Ｑ、およびＭ７２ＲがＲａｍｏｓ細胞上で発現されたＣＤ４７に、野生型抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２よりも高い親和性で結合したが（表３）、バリアント間のＥＣ５０値の差は、ＣＤ４７ＨＩ細胞について見られる差と比較して大きかったことを示す。予測されるとおり、陽性対照の抗ＣＤ４７、１Ｄ４、ＡＳ２、およびＡＳ１もＣＤ４７により大きい親和性で結合し、陰性対照の抗ＥＧＦＲはＲａｍｏｓ細胞に結合しなかった。それというのも、ＥＧＦＲは発現されないためである。
血球の細胞表面上で発現されたＣＤ４７に結合するより高い親和性の抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２バリアントの能力を計測し、対照分子と比較した。健常ヒトドナーからのウェル当たり２×１０５個の新鮮全血細胞を、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中で希釈された５０μｇ／ｍｌのタンパク質と９６ウェルプレート中で氷上で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％のＦＢＳにより洗浄した後、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２バリアントの結合を検出するためのＰＢＳ＋１％のＦＢＳ中１：２００希釈のＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）および赤血球を選択するための１：１００の希釈のＰＥマウス抗ヒトＣＤ２３５ａ（BD Biosciences,San Jose,CA）と細胞を氷上で６０分間インキュベートした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドにより固定した。細胞をフローサイトメトリー（MACSQuant,Miltenyi Biotec,Cologne,Germany）により分析した。５０μｇ／ｍｌのそれぞれの抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２バリアントにおける蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を決定し、表３に報告した。さらに、赤血球への結合の程度を抗ＣＤ４７ ＭＦＩの％（（１００×（タンパク質のＭＦＩ）／（抗ＣＤ４７のＭＦＩ））として表現した。
結果は、既に示されたとおり（図７Ｂ）、抗ＣＤ４７が赤血球上で発現されたＣＤ４７に結合するが、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２が結合しない（表３）ことを裏付けた。抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２バリアントのいくつか、例として、Ｖ６Ｉ、Ｖ２７Ｉ、Ｉ３１Ｔ、Ｑ３７Ｈ、Ｅ５４Ｐ、およびＭ７２Ｒは、野生型抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（抗ＣＤ４７結合の３％以下）と同様に、赤血球への結合の欠落を保持した。しかしながら、他のバリアント、例として、Ｉ３１ＲおよびＳ６６Ｑは、陽性対照１Ｄ４（５３％）、ＡＳ２（１２％）、およびＡＳ１（３７％）と同様に、いくらかの赤血球への結合レベル（それぞれ、抗ＣＤ４７結合の１２％および２１％）を有した。Ｑ３７ＷおよびＨ５６Ｐのみが赤血球に弱く結合した（抗ＣＤ４７結合の４％）。
癌の治療における抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα融合タンパク質の治療指数を潜在的に改善するため、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαと比較してＣＤ４７ＨＩおよびＣＤ４７ＬＯ細胞上のＣＤ４７への結合の最適な増加、および赤血球への結合の相対欠落（特に、抗ＣＤ４７と比較して）を有する抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαバリアントを選択することが望ましいことがある。例えば、野生型抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαと比較して約５倍から約３０倍のＣＤ４７ＬＯ細胞への結合の増加、および抗ＣＤ４７と比較して約３０％以下、約１０％以下、約５％以下、または約３％以下の赤血球への結合を有するバリアントを選択することができる。このような基準を満たす場合、例示的バリアント抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の生物学的活性をさらに特徴付けした。異なる腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２０またはＨＥＲ２を標的化する抗体−ＳＩＲＰα融合タンパク質の治療指数を改善するため、類似の基準を使用して最適なＳＩＲＰαバリアントを選択することができることが企図される。
実施例１８：抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα（Ｑ３７Ｗ）
１８（Ａ）抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα（Ｑ３７Ｗ）の構築および発現
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の発現のため、実施例１７からの抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）ベクターを、Expi293細胞中にExpi293fectin（Life Technologies,Grand Island,NY）を使用して一過的に同時形質移入した。タンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる単一ステップで精製した。２つのポリペプチドの発現および完全四量体分子のアセンブリを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）上で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、精製タンパク質試料をＤＴＴにより還元し、NuPAGE MES 4-12% Gel上で２００Ｖにおいて３５分間ランさせ、次いでクーマシー染色した。ゲル上の２つの主要バンドは、予測分子量（ＭＷ）および正確な化学量論比を＞９５％純度で有した（図２２Ａ）。図２２Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は予測ＭＷ（６４，２３ｋＤａ）および抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示す。ＳＥＣのため、精製タンパク質試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１および３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ２により平衡化されたTSK-GEL Super SW3000ＳＥＣカラム４．６＿３００ｍｍ（Tosoh Biosciences、東京、日本）上で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）についての約１７３ｋＤａの予測ＭＷにおけるピークを示した（図２２Ｂ）。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＥＧＦＲおよび抗ＣＤ４７（抗ＥＧＦＲ ｈｕＩｇＧ１および抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）ならびにＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ、Ｆｃ−ＳＩＲＰαＶ２、およびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ））（図１Ｃ）ならびに野生型抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２を対照として生成して抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）と比較した。
１８（Ｂ）抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα（Ｑ３７Ｗ）のインビトロ生物学的活性
赤血球を赤血球凝集させる抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の能力を決定し、対照分子と比較した。ウェル当たり３０〜５０μｌの新鮮ヒト全血細胞を、１００μｌのＨＢＳＳ＋０．５％のＢＳＡの総容量で１、３、１０および３０μｇ／ｍｌの試験タンパク質と、９６ウェルプレート中で３７℃において２〜４時間インキュベートした。プレートを遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを１００μｌのＰＢＳにより再懸濁させた。ウェルを、ＲＢＣの完全可溶化（赤血球凝集なし）、部分的なペレットおよび可溶化（＋赤血球凝集）および可溶化なしの細胞の緻密ペレット（＋＋赤血球凝集）間で順位付けした。
結果は、抗ＣＤ４７が赤血球を赤血球凝集させるが（３μｇ／ｍｌにおいて＋赤血球凝集、ならびに１０および３０μｇ／ｍｌにおいて＋＋赤血球凝集）、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２は全ての試験濃度において赤血球凝集させないことを裏付け、図７Ｂに示される赤血球結合の欠落と相関した（データ示さず）。赤血球への抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の増加した結合にもかかわらず、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）も、全ての試験濃度において、赤血球を赤血球凝集させなかった。このデータは、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）が、赤血球関連毒性を増加させない結合の増加により、より良好な治療指数を達成し得るというさらなる補強証拠を提供する。
１８（Ｃ）抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα（Ｑ３７Ｗ）のインビボ生物学的活性
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の有用性は、インビボ実験により示される。同所性肺腫瘍モデルにおいて、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、２．５×１０６個のヒトＡ５４９−ｌｕｃ扁平上皮癌細胞を静脈内注射し、次いで４００μｇ／マウスの抗体アイソタイプ対照、２５０μｇ／マウスの抗ＥＧＦＲ、２９８μｇ／マウスの抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２、または等モル量の融合タンパク質である２９８μｇ／マウスの抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）を腹腔内注射した。全ての群（ｎ＝８）は、週２回の処理を３週間受け、結果を肺からの生物発光シグナル、一般的健康状態、例えば、死亡前に１０〜１４日だけ生じる麻痺、およびマウスの生存率として報告した。
抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）融合タンパク質による処理は、２つの単独療法および抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２よりも優れていることが見出された（図２３）。融合タンパク質のＳＩＲＰαＶ２部分中の単一Ｑ３７Ｗ突然変異の導入は、生存日数中央値を、野生型抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２についての４３．５日から５５日に改善し、差は高度に有意である（ｐ＝０．００１９）。結果は、ＣＤ４７についてのＳＩＲＰαの親和性の増加が、向上した抗腫瘍効力をもたらしたことを明らかに示し、理論により拘束されるものではないが、それは向上したアビディティドライブＣＤ４７結合、および免疫細胞による排除のためのＡ５４９細胞の標的化により最も容易に説明することができる。次いで、野生型抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２は、抗ＥＧＦＲ抗体よりも有効であり、生存日数中央値を３５．５日から４３．５日に延長させ（ｐ＝０．０１８７）、事前の実験（図９Ｂ）において観察されたものを裏付けた。したがって、このデータは、抗ＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）が、赤血球関連毒性を増加させない効力の改善により、より良好な治療指数を達成し得るというさらなる補強証拠を提供する。
実施例１９：抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα（Ｑ３７Ｗ）
１９（Ａ）抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰα（Ｑ３７Ｗ）の構築および発現
例示的な抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の生成は、実施例２に記載の抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２をベースとする。抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）は、抗ＣＤ２０重鎖ポリペプチドのＣ末端を、Ｑ３７Ｗ突然変異を含有するバリアントＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインに（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して結合させることにより生成した。
抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の発現のため、図１Ａにおけるように以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組換えＤＮＡ技術によりアセンブルし、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含有）中にクローニングした：（１）以下のエレメント：抗ＣＤ２０重鎖可変ドメイン、それに続くヒト重鎖定常ドメイン１〜３アイソタイプＩｇＧ１、それに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびＱ３７Ｗにおける突然変異を有するバリアントＳＩＲＰαＶ２のＩｇＶドメインをコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ２０）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）４−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）（突然変異Ｑ３７ＷをコードするＳＩＲＰαアレルＶ２により変更された配列番号１１）ならびに（２）抗ＣＤ２０軽鎖可変ドメイン、それに続くヒトカッパ軽鎖定常ドメインをコードする構築物ＶＬ（抗ＣＤ２０）−ＣＬ（配列番号１）。これら２つの構築物についての対応するアミノ酸配列を、それぞれ、ＳＩＲＰαアレルＶ２突然変異Ｑ３７Ｗをさらに含有する配列番号１２および配列番号２に示す。
抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）発現のための２つのベクターのセットを、Expi293細胞中にExpi293fectin（Life Technologies,Grand Island,NY）を使用して一過的に同時形質移入した。タンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる単一ステップで精製した。２つのポリペプチドの発現および完全四量体分子のアセンブリを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ上で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、精製タンパク質試料をＤＴＴにより還元し、NuPAGE MES 4-12% Gel上で２００Ｖにおいて３５分間ランさせ、次いでクーマシー染色した。ゲル上の２つの主要バンドは、予測ＭＷおよび正確な化学量論比を＞９５％純度で有した（図２４Ａ）。図２４Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は予測ＭＷ（６３，２３ｋＤａ）および抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２の２つのポリペプチドの正確な化学量論比（１：１）を示す。ＳＥＣのため、精製タンパク質試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１および３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ２により平衡化されたTSK-GEL Super SW3000ＳＥＣカラム４．６×３００ｍｍ（Tosoh Biosciences、東京、日本）上で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）についての約１７２ｋＤａの予測ＭＷにおけるピークを示した（図２４Ｂ）。
さらに、標準的なモノクローナル抗体フォーマットの抗ＣＤ２０および抗ＣＤ４７（抗ＣＤ２０ ｈｕＩｇＧ１および抗ＣＤ４７ ｈｕＩｇＧ１）ならびにＦｃ融合タンパク質フォーマットのＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＶ２−Ｆｃ、Ｆｃ−ＳＩＲＰαＶ２、およびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ））（図１Ｃ）ならびに実施例２からの野生型抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２を対照として生成して抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）と比較した。
１９（Ｂ）抗ＣＤ２０とＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）との組合せのインビボ生物学的活性
抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２と比較して改善された抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の生物学的活性についての指標として、マウスにおける播種性リンパ腫モデルを使用して抗ＣＤ２０と、Ｆｃ−ＳＩＲＰαＶ２またはＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）とのいずれかの組合せを試験した。ＳＣＩＤマウスに、５×１０６個のＣＤ２０＋ヒトDaudiリンパ腫細胞を静脈内注射し、次いで２５μｇ／マウスの抗体アイソタイプ対照、２５μｇ／マウスの抗ＣＤ２０、２５μｇ／マウスの抗ＣＤ２０および１４μｇ／マウスのＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２の組合せ、または２５μｇ／マウスの抗ＣＤ２０および１４μｇ／マウスのＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の組合せを腹腔内注射した。全ての群（ｎ＝１０）は、週２回の処理を３週間受け、結果を一般的健康状態、例えば、死亡前に１０〜１４日だけ生じる麻痺、およびマウスの生存率として報告した。
本実験は依然として完了されていない一方、処理開始の１００日後において、抗ＣＤ２０およびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の組合せにより処理された１０匹のマウスの１０匹、ならびに抗ＣＤ２０およびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２の組合せにより処理された１０匹のマウスの８匹が、抗ＣＤ２０単独により処理された１０匹のマウスの６匹と比較して依然として生存することが見出された（図２５）。したがって、これまでのところ、抗ＣＤ２０およびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）の組合せによる処理が、抗ＣＤ２０およびＦｃ−ＳＩＲＰαＶ２の組合せよりも優れており、次いでそれは抗ＣＤ２０単独療法よりも優れていることが見出された。抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２（Ｑ３７Ｗ）も、抗ＣＤ２０−ｈｕＩｇＧ１−ＳＩＲＰαＶ２と比較して改善された活性を有することが予測される。

Claims (71)

  1. ＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質であって、
    配列番号６の残基３〜１１５または配列番号８の残基３〜１１４に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントのＩｇＶ細胞外ドメインと；
    疾患促進細胞上の表面抗原に結合する免疫グロブリン分子またはその一部と
    を含むＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質。
  2. 前記疾患促進細胞が腫瘍細胞であり、前記表面抗原が腫瘍抗原である、請求項１に記載のＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質。
  3. 前記ＳＩＲＰαバリアントが、配列番号６の残基３〜１１５または配列番号８の残基３〜１１４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  4. 前記ＳＩＲＰαバリアントが、配列番号６の残基１〜１１５または配列番号８の残基１〜１１４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  5. 前記ＳＩＲＰαバリアントが、配列番号１９３の残基１〜１１４、配列番号１９４の残基１〜１１５、配列番号１９５の残基１〜１１５、配列番号１９６の残基１〜１１５、配列番号１９７の残基１〜１１４、配列番号１９８の残基１〜１１４、配列番号１９９の残基１〜１１５、配列番号２００の残基１〜１１４、および配列番号１９０の残基１〜１１５からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  6. 前記ＩｇＶ細胞外ドメインが、配列番号６の残基１〜１１５、配列番号８の残基１〜１１４、配列番号１９３の１〜１１４、配列番号１９４の残基１〜１１５、配列番号１９５の残基１〜１１５、配列番号１９６の残基１〜１１５、残基１９７の残基１〜１１４、配列番号１９８の残基１〜１１４、配列番号１９９の残基１〜１１５、配列番号２００の残基１〜１１４、および配列番号１９０の残基１〜１１５からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  7. 前記ＳＩＲＰαバリアントが、配列番号６の残基１〜３４３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  8. 前記ＳＩＲＰαバリアントが、配列番号６または配列番号８の６、２７、３１、３７、５４、５６、６６、または７２位に対応する１つ以上の位置におけるアミノ酸の改変を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  9. 前記改変が、Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ａ２７Ｉ；Ｉ３１Ｒ；Ｉ３１Ｔ；Ｑ３７Ｗ；Ｑ３７Ｈ；Ｅ５４Ｐ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｑ；Ｌ６６Ｑ；およびＭ７２Ｒからなる群から選択される置換である、請求項８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  10. 前記改変が、Ｖ６Ｉである、請求項８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  11. 前記改変が、Ｖ２７ＩまたはＡ２７Ｉである、請求項８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  12. 前記改変が、Ｉ３１Ｒである、請求項８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  13. 前記改変が、Ｉ３１Ｔである、請求項８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  14. 前記改変が、Ｑ３７Ｗである、請求項８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  15. 前記改変が、Ｑ３７Ｈである、請求項８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  16. 前記改変が、Ｅ５４Ｐである、請求項８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  17. 前記改変が、Ｈ５６Ｐである、請求項８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  18. 前記改変が、Ｓ６６ＱまたはＬ６６Ｑである、請求項８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  19. 前記改変が、Ｍ７２Ｒである、請求項８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  20. 前記ＳＩＲＰαバリアントが、配列番号６または配列番号８の４、６、２７、３１、３５、３７、４７、５２、５３、５４、５６、６６、６７、６８、７２、９２、または９４位に対応する１つ以上の位置におけるアミノ酸の改変を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  21. 前記改変が、アミノ酸の置換、欠失、または挿入である、請求項２０に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  22. 前記改変が置換である、請求項２１に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  23. 前記置換が、
    ａ．Ｌ４Ｖである、４位に対応する位置における置換；
    ｂ．Ｖ６Ａ、Ｖ６Ｃ、Ｖ６Ｄ、Ｖ６Ｅ、Ｖ６Ｇ、Ｖ６Ｉ、Ｖ６Ｌ、Ｖ６Ｍ、Ｖ６Ｎ、Ｖ６Ｑ、Ｖ６Ｓ、もしくはＶ６Ｔから選択される配列番号６もしくは配列番号８の６位に対応する位置における置換；
    ｃ．Ａ２７Ｃ、Ａ２７Ｄ、Ａ２７Ｇ、Ａ２７Ｈ、Ａ２７Ｉ、Ａ２７Ｌ、Ａ２７Ｎ、Ａ２７Ｋ、Ａ２７Ｑ、Ａ２７Ｒ、Ａ２７Ｓ、Ａ２７Ｔ、Ａ２７Ｖから選択される配列番号６の２７位に対応する位置；もしくはＶ２７Ａ、Ｖ２７Ｃ、Ｖ２７Ｄ、Ｖ２７Ｇ、Ｖ２７Ｈ、Ｖ２７Ｉ、Ｖ２７Ｋ、Ｖ２７Ｌ、Ｖ２７Ｎ、Ｖ２７Ｑ、Ｖ２７Ｒ、Ｖ２７Ｓ、Ｖ２７Ｔから選択される配列番号８の２７位に対応する位置における置換；
    ｄ．Ｉ３１Ａ、Ｉ３１Ｃ、Ｉ３ＩＥ、Ｉ３１Ｋ、Ｉ３１Ｑ、Ｉ３１Ｒ、Ｉ３１Ｔ、もしくはＩ３１Ｖから選択される配列番号６もしくは配列番号８の３１位に対応する位置における置換；
    ｅ．Ｐ３５Ａ、Ｐ３５Ｃ、Ｐ３５Ｅ、Ｐ３５Ｇ、Ｐ３５Ｎ、Ｐ３５Ｑ、もしくはＰ３５Ｓから選択される配列番号６もしくは配列番号８の３５位に対応する位置における置換；
    ｆ．Ｑ３７Ａ、Ｑ３７Ｃ、Ｑ３７Ｅ、Ｑ３７Ｇ、Ｑ３７Ｈ、Ｑ３７Ｋ、Ｑ３７Ｌ、Ｑ３７Ｍ、Ｑ３７Ｎ、Ｑ３７Ｒ、Ｑ３７Ｓ、Ｑ３７Ｔ、もしくはＱ３７Ｗから選択される配列番号６もしくは配列番号８の３７位に対応する位置における置換；
    ｇ．Ｅ４７Ａ、Ｅ４７Ｃ、Ｅ４７Ｄ、Ｅ４７Ｆ、Ｅ４７Ｇ、Ｅ４７Ｈ、Ｅ４７Ｉ、Ｅ４７Ｋ、Ｅ４７Ｌ、Ｅ４７Ｍ、Ｅ４７Ｎ、Ｅ４７Ｑ、Ｅ４７Ｒ、Ｅ４７Ｓ、Ｅ４７Ｔ、Ｅ４７Ｖ、Ｅ４７Ｗ、もしくはＥ４７Ｙから選択される配列番号６もしくは配列番号８の４７位に対応する位置における置換；
    ｈ．Ｑ５２Ａ、Ｑ５２Ｃ、Ｑ５２Ｅ、Ｑ５２Ｈ、もしくはＱ５２Ｍから選択される配列番号６もしくは配列番号８の５２位に対応する位置における置換；
    ｉ．Ｋ５３Ｒである、５３位に対応する位置における置換；
    ｊ．Ｅ５４ＤもしくはＥ５４Ｐから選択される配列番号６もしくは配列番号８の５４位に対応する位置における置換；
    ｋ．Ｈ５６Ａ、Ｈ５６Ｃ、Ｈ５６Ｄ、Ｈ５６Ｅ、Ｈ５６Ｆ、Ｈ５６Ｇ、Ｈ５６Ｉ、Ｈ５６Ｋ、Ｈ５６Ｌ、Ｈ５６Ｍ、Ｈ５６Ｎ、Ｈ５６Ｐ、Ｈ５６Ｑ、Ｈ５６Ｒ、Ｈ５６Ｓ、Ｈ５６Ｔ、Ｈ５６Ｖ、Ｈ５６Ｗ、もしくはＨ５６Ｙから選択される配列番号６もしくは配列番号８の５６位に対応する位置における置換；
    ｌ．Ｌ６６Ａ、Ｌ６６Ｃ、Ｌ６６Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｌ６６Ｆ、Ｌ６６Ｇ、Ｌ６６Ｈ、Ｌ６６Ｉ、Ｌ６６Ｋ、Ｌ６６Ｍ、Ｌ６６Ｎ、Ｌ６６Ｐ、Ｌ６６Ｑ、Ｌ６６Ｓ、Ｌ６６Ｔ、Ｌ６６Ｖ、Ｌ６６Ｗ、Ｌ６６Ｙから選択される配列番号６の６６位に対応する位置；もしくはＳ６６Ａ、Ｓ６６Ｃ、Ｓ６６Ｄ、Ｓ６６Ｅ、Ｓ６６Ｆ、Ｓ６６Ｇ、Ｓ６６Ｈ、Ｓ６６Ｉ、Ｓ６６Ｉ、Ｓ６６Ｋ、Ｓ６６Ｌ、Ｓ６６Ｍ、Ｓ６６Ｎ、Ｓ６６Ｐ、Ｓ６６Ｑ、Ｓ６６Ｒ、Ｓ６６Ｖ、Ｓ６６Ｗ、Ｓ６６Ｙから選択される配列番号８の６６位に対応する位置における置換；
    ｍ．Ｔ６７Ａ、Ｔ６７Ｃ、Ｔ６７Ｄ、Ｔ６７Ｅ、Ｔ６７Ｆ、Ｔ６７Ｇ、Ｔ６７Ｈ、Ｔ６７Ｉ、Ｔ６７Ｌ、Ｔ６７Ｍ、Ｔ６７Ｎ、Ｔ６７Ｑ、Ｔ６７Ｒ、Ｔ６７Ｓ、Ｔ６７Ｖ、Ｔ６７Ｗ、もしくはＴ６７Ｙから選択される配列番号６もしくは配列番号８の６７位に対応する位置における置換；
    ｎ．Ｋ６８Ｒである、６８位に対応する位置における置換；
    ｏ．Ｍ７２Ａ、Ｍ７２Ｃ、Ｍ７２Ｄ、Ｍ７２Ｅ、Ｍ７２Ｆ、Ｍ７２Ｇ、Ｍ７２Ｈ、Ｍ７２Ｉ、Ｍ７２Ｋ、Ｍ７２Ｌ、Ｍ７２Ｎ、Ｍ７２Ｑ、Ｍ７２Ｒ、Ｍ７２Ｓ、Ｍ７２Ｔ、Ｍ７２Ｖ、Ｍ７２Ｗ、もしくはＭ７２Ｙから選択される配列番号６もしくは配列番号８の７２位に対応する位置における置換；
    ｐ．Ｖ９２Ａ、Ｖ９２Ｃ、Ｖ９２Ｄ、Ｖ９２Ｅ、Ｖ９２Ｇ、Ｖ９２Ｉ、Ｖ９２Ｍ、Ｖ９２Ｎ、Ｖ９２Ｑ、Ｖ９２Ｒ、Ｖ９２Ｓ、もしくはＶ９２Ｔから選択される配列番号６もしくは配列番号８の９２位に対応する位置における置換；および／または
    ｑ．Ｆ９４Ｌである、９４位に対応する位置における置換
    から選択される１つ以上である、請求項２１または２２に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  24. 前記免疫グロブリン分子またはその一部が、抗体可変ドメインを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  25. 前記免疫グロブリン分子またはその一部が、抗原結合部位を含有するように遺伝子操作されたＦｃ領域を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  26. 抗原結合部位を含有するように遺伝子操作された前記Ｆｃ領域が、Ｆｃａｂ部分を含む、請求項２５に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  27. 前記免疫グロブリン分子が、インタクト抗体を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  28. 前記免疫グロブリン分子が、抗体の抗原結合部分を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  29. 前記ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントが、抗体軽鎖またはその一部に連結されている、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  30. 前記ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントが、抗体重鎖またはその一部に連結されている、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  31. Ｆａｂ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、または単鎖抗体を含む免疫グロブリン分子の一部を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  32. 前記免疫グロブリン分子またはその一部が、前記ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントにリンカー部分を介して連結されている、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  33. 前記ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントが、そのＮ末端において前記免疫グロブリン分子またはその一部に連結されている、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  34. 前記ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントが、そのＣ末端において前記免疫グロブリン分子またはその一部に連結されている、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  35. 前記ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントが、前記免疫グロブリン分子またはその一部のＮ末端に連結されている、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  36. 前記ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントが、前記免疫グロブリン分子またはその一部のＣ末端に連結されている、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  37. 前記腫瘍抗原が、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＧＤ２、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＤ１９からなる群から選択される、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  38. 前記抗体が、抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項２７に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  39. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブである、請求項３８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  40. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブの相補性決定領域を含む、請求項３８に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  41. ＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質であって、
    配列番号１９０の残基１〜１１５に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントのＩｇＶ細胞外ドメイン；および
    疾患促進細胞上の表面抗原に結合する免疫グロブリン分子またはその一部
    を含むＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質。
  42. 前記疾患促進細胞が、腫瘍細胞であり、前記表面抗原が、腫瘍抗原である、請求項４１に記載のＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質。
  43. 前記ＳＩＲＰαバリアントが、配列番号１９０の残基１〜１１５に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質。
  44. 前記ＳＩＲＰαバリアントが、配列番号１９０の６、２７、３１、３７、５４、５６、６６、または７２位に対応する１つ以上の位置におけるアミノ酸の改変を含む、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  45. 前記改変が、Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ａ２７Ｉ；Ｉ３１Ｒ；Ｉ３１Ｔ；Ｑ３７Ｗ；Ｑ３７Ｈ；Ｅ５４Ｐ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｑ；Ｌ６６Ｑ；およびＭ７２Ｒからなる群から選択される、請求項４４に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  46. ＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質であって、
    抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合部分；および
    配列番号６の残基１〜１１５または配列番号８の残基１〜１１４に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントのＩｇＶ細胞外ドメイン
    を含むＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質。
  47. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項４６に記載のＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質。
  48. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブの相補性決定領域を含む、請求項４６に記載のＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質。
  49. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブである、請求項４６に記載のＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質。
  50. 前記ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、フツキシマブ、イムガツズマブおよびネシツムマブからなる群から選択される、請求項４６に記載のＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質。
  51. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、フツキシマブ、イムガツズマブおよびネシツムマブから選択される抗体の相補性決定領域を含む、請求項５０に記載のＳＩＲＰα免疫グロブリン融合タンパク質。
  52. 前記ＳＩＲＰαバリアントが、配列番号６または配列番号８の６、２７、３１、３７、５４、５６、６６、または７２位に対応する１つ以上の位置におけるアミノ酸の改変を含む、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  53. 前記改変が、Ｖ６Ｉ；Ｖ２７Ｉ；Ａ２７Ｉ；Ｉ３１Ｒ；Ｉ３１Ｔ；Ｑ３７Ｗ；Ｑ３７Ｈ；Ｅ５４Ｐ；Ｈ５６Ｐ；Ｓ６６Ｑ；Ｌ６６Ｑ；およびＭ７２Ｒからなる群から選択される置換である、請求項５２に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  54. 前記ＳＩＲＰαバリアントが、配列番号６または配列番号８の３７位に対応する位置におけるアミノ酸の改変を含み、前記置換が、Ｑ３７Ｗである、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  55. 免疫グロブリン融合タンパク質であって、
    腫瘍細胞抗原に結合する免疫グロブリン分子またはその一部；および
    配列番号６の残基３〜１１５または配列番号８の３〜１１４に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントのＩｇＶ細胞外ドメインを含むＣＤ４７結合部分
    を含み；
    抗ＣＤ４７抗体に対する％赤血球（ＲＢＳ）結合平均蛍光強度（ＭＦＩ）を１００％において較正する場合、３５％以下の％ＲＢＣ結合ＭＦＩを有し、前記抗ＣＤ４７抗体は、Ｂ６Ｈ１２／ｈｕＩｇＧ１であり、
    非赤血球上のＣＤ４７抗原にも結合する、
    免疫グロブリン融合タンパク質。
  56. ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントの前記ＩｇＶ細胞外ドメインが、配列番号６の残基３〜１１５または配列番号８の３〜１１４に対して少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  57. ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントの前記ＩｇＶ細胞外ドメインが、配列番号６の１〜１１５または配列番号８の１〜１１４に対して少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５５または５６に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  58. 前記腫瘍細胞抗原が、ＥＧＦＲである、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  59. 前記免疫グロブリン分子が、インタクト抗体である、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  60. 前記抗体が、抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項５９に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  61. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブである、請求項６０に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  62. ３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満の％ＲＢＣ結合ＭＦＩを有する、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  63. ０〜１％、０〜２％、０〜３％、０〜４％、１〜２％、１〜３％、１〜４％、２〜３％、２〜４％、３〜４％、５〜１０％、３〜７％、または３〜１０％の％ＲＢＣ結合ＭＦＩを有する、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  64. ５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下の％ＲＢＣ結合ＭＦＩを有する、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  65. 前記非赤血球が、腫瘍細胞である、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質。
  66. 請求項１〜６５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸。
  67. 請求項６６に記載の１つまたは複数の核酸を含む細胞。
  68. 請求項６７に記載の細胞を、請求項６６に記載の１つまたは複数の核酸の発現を可能とする条件下で維持することにより免疫グロブリン融合タンパク質を産生する方法。
  69. 医薬有効量の請求項１〜６５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
  70. 有効量の請求項１〜６５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン融合タンパク質を癌の治療が必要とされる哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌を治療する方法。
  71. 前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝臓癌、鼻咽腔癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、または骨髄異形成症候群である、請求項７０に記載の方法。
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