CN106519036B - 抗cd47和egfr的双功能蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤免疫学领域，具体公开了一种抗CD47和EGFR的双功能蛋白及其制备方法与应用。所述双功能蛋白EGFR/CD47‑BsAb‑Ig(简称Bi‑SP)包含抗EGFR侧的重链、抗EGFR侧的轻链以及抗CD47侧的Fc融合蛋白。采用本发明提供的制备方法制备的所述双功能蛋白Bi‑SP，可同时具有Panitumumab和SIRPα突变体的功能，能阻断CD47介导及EGFR诱导的肿瘤细胞的增殖。此外，该双功能蛋白Bi‑SP可以和传统的IgG分子一样，最大程度地保留了传统单克隆抗体结构，因为有Fc片段的存在，可以用普通的Protein A柱亲和层析法纯化，利于大规模的生产纯化。

Description

抗CD47和EGFR的双功能蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫学领域，具体地说，涉及一种抗CD47和EGFR的双功能蛋白。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病，在各种致死性的疾病中高居第二位。近年来，恶性肿瘤的发病率明显上升，同时，其治疗效果较差，晚期易发生转移，预后不佳。目前临床上，所采用的常规治疗方法如放化疗和手术治疗很大程度缓解了疼痛，但这些疗法的副作用及局限性仍很大，疗效难以进一步提高。

正常细胞的增殖是通过各自的配体严格激活其生长因子受体来控制的，比如生长因子受体酪氨酸激酶。癌细胞也是在生长因子受体的激活下增殖的，但失去了正常增殖时的严格控制。这种失控可能是由很多因素引起的，比如生长因子的过度表达或生长因子受体的过度表达，以及由生长因子调控的生化途径的自发性激活。参与致癌的受体包括表皮生长因子受体(EGFR)，来源于血小板的生长因子受体(PDGFR)，类胰岛素生长因子受体(IGFR)，神经生长因子受体(NGFR)和成纤维生长因子受体(FGF)等。

表皮生长因子受体(即EGFR)也称作c-erbB l/Herl，其家族成员都是生长因子受体酪氨酸激酶，它们在细胞表面与特异的生长因子或天然配体相互作用，如与EGF或TGFα相互作用，由此活化受体酪氨酸激酶。EGFR在调节肿瘤细胞的生长、修复和生存、新生血管生成、侵袭和转移中具有重要的作用，同时在相当一部分的人类肿瘤中都有表达。在很多恶性肿瘤中，EGFR的表达往往与较差的预后和较低的生存率相关。由此可知，如果有药物能阻断EGFR的活性，那将会抑制其磷酸化和信号传导，从而起到多重途径的抗肿瘤作用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。在一些研究中，EGFR抑制剂与多种化疗药物和放疗药物联合作用于一些肿瘤细胞株时，表现出累加和协同作用。

肿瘤的发生发展是个多因素多机制多种因子参与的过程。CD47即整合素相关蛋白(Integrin-Associated Protein，IAP)，表达于细胞表面，可结合巨噬细胞表面的信号调节蛋白-α(Signal-RegμLatory Proteinα，SIRPα)进而磷酸化SIRPα的胞质内免疫受体酪氨酸抑制性基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motifs，ITIMs)，招募磷酸酶SHP-1后向巨噬细胞发出“别吃我(Don’t eat me)”的抑制性信号。CD47分子在肿瘤细胞表面的广泛表达抑制了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬效应。据此，研究人员开发了可激活巨噬细胞吞噬效应的CD47拮抗剂(CD47 antagonists)。CD47拮抗剂将通过封闭CD47和SIRPα结合而激活巨噬细胞的吞噬作用，增强抗肿瘤免疫反应，最终达到抑制肿瘤生长的目的。

由此可见，如果能同时阻断CD47和EGFR，不但可以抑制EGFR信号激活导致的肿瘤细胞增殖，也将阻断CD47介导的肿瘤抑制性信号，激活对肿瘤的免疫反应，故可能会比单独阻断EGFR或CD47有更好的抑制肿瘤生长增殖的协同作用，对肿瘤的治疗将具有重要意义。

CD47拮抗剂主要包括靶向CD47的抗体和SIRPα突变体两种。研究表明，靶向CD47的单克隆抗体Ab400在体外和体内试验中都显示了对肝细胞癌生长的显著抑制效应。同样，在用于对乳腺癌、结肠癌等实体肿瘤治疗时，靶向CD47抗体也显示了有效抑瘤效果。最近研究表明，工程化改造的SIRPα突变体(SIRPα-Fc)具有对CD47更高的亲和力且显示出对多种肿瘤的抑制效应，亦是一种极具潜力的CD47拮抗剂。EGFR抑制剂主要包括单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、配体-毒素和免疫毒素联结物，以及反义核苷酸和EGFR/配体主导的疫苗等。靶向EGFR的抗体可以抑制表达EGFR的肿瘤细胞株的生长，在肺癌及结直肠癌的治疗疗中，显示了明显的抑瘤效果。帕妥木单抗(Panitumumab，ABX-EGF，AMG954，商品名：VECTIBIX)为全人源的IgG2类单克隆抗体，其亲和力约为5×10^-11mol/L。该抗体是由Amgen公司生产和销售，2006年9月FDA批准帕妥木单抗用于治疗表达EGFR的转移性结直肠癌。其主要作用机制即是阻断EGF与肿瘤细胞表面EGFR的结合，诱导EGFR内化，进而抑制肿瘤细胞的生长。

但是，单抗联合应用具有多方面的限制。首先，临床上应用两种抗体的安全性和效果至今未有详尽的报道，可能存在安全风险；另外，联合应用两种抗体也存在调节障碍和造价太高的缺陷，限制了其临床应用。

因此，采用基因工程技术构建一个可以同时阻断两个靶点的双功能蛋白，既能阻断EGFR，又能阻断CD47，进而更有效的抑制肿瘤的生长和增殖，这一直是本领域的技术人员亟待解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种抗CD47和EGFR的双功能蛋白及其制备方法，所述双功能蛋白既可以抑制EGFR，也能拮抗CD47，可用于制备抗肿瘤药物。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种抗CD47和EGFR的双功能蛋白EGFR/CD47-BsAb-Ig(简称Bi-SP)，所述双功能蛋白包含抗EGFR侧的重链、抗EGFR侧的轻链以及抗CD47侧的Fc融合蛋白。

所述抗EGFR侧的重链、抗EGFR侧的轻链以及抗CD47侧的Fc融合蛋白可通过在CHO细胞内形成二硫键组成得到一种即可抑制EGFR，又可拮抗CD47的双功能蛋白。

为了避免在上述元件的组成过程中发生抗EGFR侧抗体或抗CD47侧融合蛋白的自我连接或组合，本发明对上述抗EGFR侧的重链和抗CD47侧的Fc融合蛋白中的恒定区CH3区进行了定点突变，具体如下：在抗EGFR侧重链恒定区CH3引入四个突变，包括SEQ ID NO.2中第348位由苏氨酸转变为色氨酸，第350位由亮氨酸转变为丙氨酸，第474位酪氨酸转变为缬氨酸，第330位酪氨酸转变为半胱氨酸。在Bi-SP的抗CD47侧Fc区引入两个突变，包括SEQ IDNO.12中第166位由苏氨酸转变为色氨酸及第152位丝氨酸转变为半胱氨酸。经突变后抗CD47侧Fc段和抗EGFR侧重链恒定区可通过这些氨基酸形成类似于“锁匙结构(Knob-in-hole)”的结合模式，大大增加了正确配对的几率，降低了形成自身配对的可能性。

基于上述调整，所述双功能蛋白具体包含SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16及SEQ IDNO.18所示的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供了前述双功能蛋白的制备方法，包括如下步骤：

S1、构建分别含有SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列的载体，并将其用脂质体法共转染至宿主细胞中进行培养，筛选稳定表达双功能蛋白的细胞克隆；

S2、对细胞培养物进行分离纯化，得到双功能蛋白Bi-SP。

需要说明的是，本发明所述的载体可为本领域常规使用的载体，例如pCDNA3.1、pDHFF等。表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

可选地，如在本发明的具体实施方式中，使用真核表达载体pcDNA3.1。

进一步地，用于表达所述双功能蛋白的宿主细胞可为原核细胞，例如DH5α、BL21(DE3)、TG1等；也可为哺乳动物或昆虫宿主细胞，COS、CHO、NSO、sf9及sf21等均可适用于本发明。

作为优选，本发明选择CHO-K1细胞(ATCC)作为宿主细胞进行双功能蛋白的表达。

进一步地，宿主细胞的培养条件为本领域常规培养条件，例如使用含10％血清的DMEM培养基进行培养。

进一步地，S2中，用含600μg/mL G418和250μg/mL Zeocin的选择培养基筛选稳定表达双功能蛋白的细胞克隆。利用上述方法，可将双功能蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。更进一步地，可以利用亲和层析的方法对本发明公开的双功能蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规方法例如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的双功能蛋白。

本发明对Bi-SP进行亲和力检测，发现其完好地保留了Panitumumab和SIRPα突变体的亲和力。利用Bi-SP进行下一步实验，包括肿瘤细胞增殖、体内抑瘤和促巨噬细胞吞噬等实验，实验结果表明，本发明公开的双功能蛋白Bi-SP同时具有Panitumumab和SIRPα突变体的功能，它能够能阻断CD47介导及EGFR诱导的肿瘤细胞的增殖。此外，该双功能蛋白Bi-SP可以和传统的IgG分子一样，最大程度地保留了传统单克隆抗体结构，因为有Fc片段的存在，可以用普通的Protein A柱亲和层析法纯化，利于大规模的生产纯化。实验表明，在相同剂量下，双功能蛋白Bi-SP具有明显优于Panitumumab的抗肿瘤治疗效果。

三方面，基于前述技术方案，可同时表达SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16及SEQ IDNO.18所示的氨基酸序列的宿主细胞，以及包括分别含有SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的载体的载体组合也在本发明的保护范围之内。

第四方面，本发明还提供了含有前述双功能蛋白Bi-SP的组合物。

以及，提供了前述双功能蛋白Bi-SP或含有其的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明公开的上述双功能蛋白Bi-SP，和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的全人源抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述全人源抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量应使双功能蛋白的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含双功能蛋白的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。

本发明中所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还减少或防止转移。

本发明中双功能蛋白Bi-SP及含有其的组合物在对包括人在内的动物给药，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。

本发明公开的双功能蛋白Bi-SP及含有其的组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括：

1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT－207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6－巯基嘌呤(6－MP)和6－TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；

2、激素类抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；

3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素－2；胸腺肽类；

4、单克隆抗体：西妥昔Cetuximab(C225)；赫赛汀单抗(Trastuzumab)贝伐单抗(Avastin)；

5、其他包括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的双功能蛋白Bi-SP及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

本发明的有益效果在于：

本发明采用基因工程技术构建一个可以同时阻断两个靶点的双功能蛋白，既能阻断EGFR，又能阻断CD47，进而更有效的抑制肿瘤的生长和增殖。

附图说明

图1为双功能蛋白结构示意图；

图2为双功能蛋白的SDS-PAGE验证试验；第一泳道为蛋白质分子量对照品，第二泳道为双功能蛋白Bi-SP，第三泳道为帕妥木单抗(Panitumumab)，第四泳道为SIRPα突变体蛋白；

图3为双功能蛋白与EGFR及CD47结合活性实验结果；

图4为双功能蛋白与EGFR及CD47双阳性细胞结合的流式细胞术验证结果；

图5为双功能蛋白激活巨噬细胞的免疫荧光实验；

图6为双功能蛋白抑制荷瘤小鼠A431细胞肿瘤生成实验；

图7为双功能蛋白抑制荷瘤小鼠H292细胞肿瘤生成实验。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括MolecμLarCloning(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.，1989)：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

本发明中所涉及的定义如下：

Bi-SP：靶向CD47和EGFR的双功能蛋白；Panitumumab：帕尼单抗；SIRPα突变体-Fc：信号调节蛋白-α可结晶片段融合蛋白；CD47：整合素相关蛋白；EGFR：表皮生长因子受体；TKI：酪氨酸激酶抑制剂；IgG：免疫球蛋白G；ELISA：酶联免疫吸附试验；SPR：表面等离子共振技术；CI：置信区间；LC，抗体轻链；HC，抗体重链；CRC：结肠癌；ECD：细胞外区域；SEC：分子筛层析；CCK-8：活细胞计数试剂盒8；SDS-PAGE：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

实施例1人抗体轻、重链恒定区和Fc区基因的克隆

用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22：197-207)和文献(Nucleic Acids Research，1982，10：4071-4079)报道的序列分别设计引物扩增IgG1型抗体重链和轻链恒定区基因，PCR反应均采用热启动，反应条件：94℃5分钟；94℃45秒，60℃45秒，72℃70秒，30个循环；72℃10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12分别显示了恒定区Fc段(Fc)的核苷酸和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH、pGEM-T/CL、pGEM-T/Fc。

实施例2双功能蛋白Bi-SP的构建

具体构建方法：全基因合成Panitumumab的重、轻链可变区基因，Panitumumab的轻、重链可变区序列请参见专利文献(WO9850433)，SIRPα突变体的序列参见Science 341，88(2013)。Panitumumab的重链可变区与人IgG1抗体的重链恒定区连接，组成了Bi-SP的抗EGFR侧重链基因；PCR克隆出SIRPα与人IgG1抗体的重链恒定区Fc段连接，组成了Bi-SP的抗CD47侧融合蛋白基因。Panitumumab的轻链可变区通过overlap PCR的方法与人IgG1抗体的轻链恒定区连接，组成了Bi-SP的抗EGFR侧轻链基因。将上述重、轻链基因及融合蛋白基因分别装入真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen公司产品)。上述质粒一起用脂质体法转染CHO-K1细胞(ATCC)，并用含600μg/mL G418和250μg/mL Zeocin的选择培养基筛选稳定表达双功能蛋白的细胞克隆。利用Protein A柱通过亲和层析从细胞培养物的上清纯化双功能蛋白Bi-SP。

下面以Bi-SP为例详细说明双功能蛋白的构建表达过程：

Bi-SP抗EGFR侧的重链和轻链可变区及抗CD47侧SIRPα突变体分别为Bi-SPVH，Bi-SPVL及Bi-SPSIRPα，经Overlap PCR合成后回收目的条带并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序，分别得到pGEM-T/Bi-SPVH(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6)，pGEM-T/Bi-SPVL(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)及pGEM-T/Bi-SPSIRPα(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)。PCR采用Roche公司的高保真扩增系统，反应条件均为：95℃5分钟；94℃50秒，55℃45秒，72℃55秒，30个循环；72℃10分钟。

采用Overlap PCR将pGEM-T/Bi-SPVH基因与pGEM-T/CH中的重链恒定区基因连接，并克隆到pGEM-T载体中，挑选正确克隆后以HindIII和EcoRI酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的质粒pCDNA3.1(+)用T4DNA连接酶进行连接，构建真核表达载体pCDNA3.1/ZEO(+)(Bi-SPVHCH)(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.16)。

采用Overlap PCR将pGEM-T/Bi-SIRPα基因与pGEM-T/Fc中的Fc段基因连接，并克隆到pGEM-T载体中，挑选正确克隆后以HindIII和EcoRI酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的质粒pCDNA3.1(+)用T4DNA连接酶进行连接，构建真核表达载体pCDNA3.1/ZEO(+)(Bi-SPSIRPαFc)(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ NO：17和SEQ NO:18)。

采用Overlap PCR将pGEM-T/Bi-SPVL中的Bi-SPVL基因与pGEM-T/CL中的轻链恒定区基因相连，并克隆到pGEM-T载体中，挑选正确克隆后以HindIII和EcoRI酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的质粒pCDNA3.1(+)用T4 DNA连接酶进行连接，构建真核表达载体pCDNA3.1/ZEO(+)(Bi-SPVLCL)(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示)。

于3.5cm组织培养皿中接种3×10⁵个CHO-K1细胞，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒9μg(质粒pCDNA3.1(+)pCDNA3.1/ZEO(+)(Bi-SPVHCH)3μg，pCDNA3.1/ZEO(+)(Bi-SPVLCL)3μg，pCDNA3.1/ZEO(+)(Bi-SP SIRPαFc)3μg)和20μLLipofectamine2000Reagent[Invitrogen公司产品]分别溶于500μL无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3mL无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO₂孵箱培养4小时后补加2mL含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO₂孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/mLG418和250μg/mL Zeocin的选择培养基筛选抗性克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化双功能蛋白Bi-SP。将Bi-SP用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。Bi-SP的结构如图1所示，左侧为Bi-SP的抗EGFR侧重链与轻链，右侧为Bi-SP的抗CD47侧的SIRPα突变体Fc融合蛋白。

实验例1双功能蛋白纯度的验证试验

配制含有SDS 10％丙烯酰胺浓度的聚丙烯酰胺凝胶，将抗体Panitumumab，融合蛋白SIRPα及双功能蛋白Bi-SP分别上样进行凝胶电泳试验，以分析各组分的纯度。结果如图2所示，Bi-SP的纯度在90％以上。

实验例2双功能蛋白Bi-SP与EGFR和CD47的结合活性检测

将EGFR(R&D公司产品)用0.05mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)稀释成2μg/mL，50μL/孔，4℃包被过夜。10％脱脂奶室温封闭2h后，加入不同浓度的双功能蛋白，SIRPα突变体和Panitumumab(Amgen公司产品)，50μL/孔，每个浓度取3个平行孔，室温孵育2h。弃上清液，PBS洗涤3次，加入按效价稀释好的HRP标记的CD47，50μL/孔，室温孵育45min。PBS充分洗涤后，TMB显色后，置酶标仪(酶标比色仪，美国BIO-Rad公司)中测定450nm吸光度(A450)值。实验结果如图3所示，图中纵坐标为450nm的光密度值(或称吸光度值)，横坐标为抗体浓度的对数。SIRPα和Panitumumab仅能结合CD47或EGFR，因此读值接近于0，而Bi-SP组显示了随加入抗体浓度升高，相应OD值也增高的浓度依赖性效应。通过此试验证实了Bi-SP既可结合CD47又可结合EGFR的结合特性。实验结果表明：因双功能蛋白Bi-SP可结合EGFR也可结合CD47，而显现出浓度依赖效应呈S曲线。Panitumumab和SIRPα突变体因只能结合EGFR或CD47，因此无结合活性。以上实验结果表明，构建的双功能蛋白Bi-SP同时保留了亲本Panitumumab和SIRPα突变体的结合活性。

实验例3流式细胞术分析

将EGFR和CD47双阳性的肺癌H292和表皮癌A431细胞用2％FCS-PBS重悬成1×10⁶个/mL，分别加入不同稀释度的Bi-SP和对照品IgG，置于4℃孵育1h，用2％FCS-PBS洗细胞2遍。再加入FITC标记的羊抗人IgG(H+L)的二抗于4℃孵育1h，用2％FCS-PBS洗细胞2遍后在流式细胞仪上进行分析，计算染色阳性细胞的百分数并比较各抗体的相对亲和力。实验结果如图4所示，图中横坐标为抗体的浓度，纵坐标为平均荧光强度。流式细胞术的结果表明，Bi-SP对CD47和EGFR双阳性的细胞结合具有浓度依赖性结合，呈现S曲线。对照组为加入无关IgG组。实验结果表明Bi-SP可以结合EGFR和CD47双阳性的A431和H292细胞，即Bi-SP可以同时结合细胞表面的EGFR和CD47。

实验例4双功能蛋白Bi-SP体外促进巨噬细胞对肿瘤细胞吞噬实验

利用无血清培养基灌洗小鼠腹腔，灌洗液制备鼠腹腔巨噬细胞，具体方法如下：对三只NOD-SCID小鼠提前5天腹腔注射1-2mL巯基乙酸盐培养基；5天后，颈椎脱臼法处死小鼠。用注射器抽取5mL含有双抗的RPMI-1640无血清培养基注入腹腔；用棉球轻揉腹部1-2分钟后吸取细胞悬液；1000rpm离心5min后，用无血清RPMI-1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养；接着利用荧光显微镜观察吞噬效果，其具体方法如下：以5×10⁴个/孔的密度将腹腔来源的鼠巨噬细胞铺在24孔板中培养过夜；将5×10⁶个A431或H292细胞标记上羧基荧光素乙酰乙酸酯(CFSE)。将培养巨噬细胞的培养基更换为不添加血清的培养基，饥饿处理2小时。每孔加入2×10⁵个CFSE标记的肿瘤细胞；接下来加入以下组别的抗体，每组三个复孔，终浓度为10μg/mL：(1)IgG组；(2)Bi-SP组，37℃孵育2-3小时。用培养基洗涤细胞三次，在共聚焦荧光显微镜下观察拍照，计算每100个巨噬细胞(三个视野)中CFSE阳性细胞的比率。实验结果如图5所示，A图为Bi-SP组处理后，较之对照组IgG抗体处理，巨噬细胞对A431细胞吞噬效能显著增强。B图为统计学数据，显示了Bi-SP处理组被吞噬的细胞数目与IgG组比较有显著差异。C图为Bi-SP组处理后，较之对照组IgG抗体处理，巨噬细胞对H292细胞吞噬效能显著增强。D图为统计学数据，显示了Bi-SP处理组被吞噬的细胞数目与IgG组比较有显著差异。实验结果表明，Bi-SP可以有效促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。

实验例5双功能蛋白Bi-SP体内抑制肿瘤细胞生长实验

以表皮癌A431细胞或肺癌H292细胞皮下接种雌性NOD-SCID鼠，在接种肿瘤细胞后待肿瘤组织达到80mm³-120mm³，静脉注射以下3组，每组6只小鼠：①人IgG对照组②Bi-SP③Panitumumab。每周注射2次，共注射4周。给药过程中，每隔2日观察肿瘤生长情况，测量肿瘤大小以评价Bi-SP的抑瘤作用。实验结果如图6和图7所示，图6中横坐标为A431肿瘤的荷瘤小鼠接受药物处理的时间，纵坐标为肿瘤体积，箭头为两次药物注射的时间，表明经过一段时间的药物Bi-SP治疗后，较之无关IgG治疗组及Panitumumab组，Bi-SP组显示了显著的肿瘤消退趋势，差异有统计学意义，图7中横坐标为H292肿瘤的荷瘤小鼠接受药物处理的时间，纵坐标为肿瘤体积，箭头为两次药物注射的时间，表明经过一段时间的药物Bi-SP治疗后，较之无关IgG治疗组及Panitumumab组，Bi-SP组显示了显著的肿瘤消退趋势，差异有统计学意义。实验结果表明，Bi-SP可以有效抑制荷瘤小鼠身上的肿瘤生长，且其抑瘤效果显著强于Pan组和IgG对照组组。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 新乡医学院

<120> 抗CD47和EGFR的双功能蛋白及其制备方法与应用

<130> KHP161116843.4Q

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人IgG1重链恒定区

<400> 1

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttggtgag 300

aggccagcac agggagggag ggtgtctgct ggaagccagg ctcagcgctc ctgcctggac 360

gcatcccggc tatgcagccc cagtccaggg cagcaaggca ggccccgtct gcctcttcac 420

ccggaggcct ctgcccgccc cactcatgct cagggagagg gtcttctggc tttttcccca 480

ggctctgggc aggcacaggc taggtgcccc taacccaggc cctgcacaca aaggggcagg 540

tgctgggctc agacctgcca agagccatat ccgggaggac cctgcccctg acctaagccc 600

accccaaagg ccaaactctc cactccctca gctcggacac cttctctcct cccagattcc 660

agtaactccc aatcttctct ctgcagagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc 720

accgtgccca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc 780

tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct 840

cttcctcagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca 900

aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc 960

acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca 1020

agacaaagcc gcgggaagag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg 1080

tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc 1140

tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg tgggacccgt ggggtgcgag 1200

ggccacatgg acagaggccg gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac cgctgtacca 1260

acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg 1320

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1380

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1440

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1500

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1560

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccc ggtaaa 1596

<210> 2

<211> 524

<212> PRT

<213> 人IgG1重链恒定区

<400> 2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Gly Glu Arg Pro Ala Gln Gly Gly Arg Val Ser Ala Gly Ser

100 105 110

Gln Ala Gln Arg Ser Cys Leu Asp Ala Ser Arg Leu Cys Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Gly Gln Gln Gly Arg Pro Arg Leu Pro Leu His Pro Glu Ala Ser

130 135 140

Ala Arg Pro Thr His Ala Gln Gly Glu Gly Leu Leu Ala Phe Ser Pro

145 150 155 160

Gly Ser Gly Gln Ala Gln Ala Arg Cys Pro Pro Arg Pro Cys Thr Gln

165 170 175

Arg Gly Arg Cys Trp Ala Gln Thr Cys Gln Glu Pro Tyr Pro Gly Gly

180 185 190

Pro Cys Pro Pro Lys Pro Thr Pro Lys Ala Lys Leu Ser Thr Pro Ser

195 200 205

Ala Arg Thr Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Ser Asn Ser Gln Ser Ser

210 215 220

Leu Cys Arg Ala Gln Ile Leu Gln Asn Ser His Met Pro Thr Val Pro

225 230 235 240

Arg Ala Ser Pro Gly Leu Ala Leu Gln Leu Lys Ala Gly Gln Val Pro

245 250 255

Ser Ser Leu His Pro Gly Thr Gly Pro Ser Arg Val Leu Thr Arg Pro

260 265 270

Pro Pro Ser Leu Pro Gln His Leu Asn Ser Trp Gly Asp Arg Gln Ser

275 280 285

Ser Ser Ser Pro Gln Asn Pro Arg Thr Pro Ser Ser Pro Gly Pro Leu

290 295 300

Arg Ser His Ala Trp Trp Trp Thr Ala Thr Lys Thr Leu Arg Ser Ser

305 310 315 320

Ser Thr Gly Thr Trp Thr Ala Trp Arg Cys Ile Met Pro Arg Gln Ser

325 330 335

Arg Gly Lys Ser Ser Thr Thr Ala Arg Thr Val Trp Ser Ala Ser Ser

340 345 350

Pro Ser Cys Thr Arg Thr Gly Met Ala Arg Ser Thr Ser Ala Arg Ser

355 360 365

Pro Thr Lys Pro Ser Gln Pro Pro Ser Arg Lys Pro Ser Pro Lys Pro

370 375 380

Lys Val Gly Pro Val Gly Cys Glu Gly His Met Asp Arg Gly Arg Leu

385 390 395 400

Gly Pro Pro Ser Ala Leu Arg Val Thr Ala Val Pro Thr Ser Val Pro

405 410 415

Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg

420 425 430

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly

435 440 445

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

450 455 460

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

465 470 475 480

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

485 490 495

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

500 505 510

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

515 520

<210> 3

<211> 318

<212> DNA

<213> 人Kappa轻链恒定区

<400> 3

actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgt 318

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 人Kappa轻链恒定区

<400> 4

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 5

<211> 357

<212> DNA

<213> pGEM-T/Bi-SPVH

<400> 5

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtgatt actactggac ctggattcgg 120

cagtccccag ggaagggact ggagtggatt ggacacatct attacagtgg gaacaccaat 180

tataacccct ccctcaagag cagactcacc atatcaattg acacgtccaa gactcagttc 240

tccctgaagc tgagttctgt gaccgctgcg gacacggcca tttattactg tgtgcgagat 300

cgagtgactg gtgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttca 357

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> pGEM-T/Bi-SPVH

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly

20 25 30

Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 324

<212> DNA

<213> pGEM-T/Bi-SPVL

<400> 7

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc aggcgagtca ggacatcagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaaactcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatattg caacatattt ctgtcaacac tttgatcatc tcccgctcgc tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acga 324

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> pGEM-T/Bi-SPVL

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu

85 90 95

Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 9

<211> 354

<212> DNA

<213> Bi-SP抗CD47侧SIRPα突变体

<400> 9

gaagaagaac tgcagatcat ccagccggac aaatctgttt ctgttgcggc gggtgaatct 60

gcgatcctgc actgcaccat cacctctctg ttcccggttg gtccgatcca gtggttccgt 120

ggtgcgggtc cggcgcgtgt tctgatctac aaccagcgtc agggtccgtt cccgcgtgtt 180

accaccgttt ctgaaaccac caaacgtgaa aacatggact tctctatctc tatctctaac 240

atcaccccgg cggacgcggg cacctactac tgcatcaaat tccgtaaagg ttctccggac 300

accgaattta aatctggtgc gggcaccgaa ctgtctgttc gtgcgaaacc gtct 354

<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> Bi-SP抗CD47侧SIRPα突变体

<400> 10

Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser

115

<210> 11

<211> 696

<212> DNA

<213> Bi-SP抗CD47侧Fc段

<400> 11

gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt gcaccctgcc cccatcccgg 420

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg tcctgcgccg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctcgtgagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa 696

<210> 12

<211> 232

<212> PRT

<213> Bi-SP抗CD47侧Fc段

<400> 12

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 13

<211> 642

<212> DNA

<213> Bi-SP抗EGFR侧轻链

<400> 13

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc aggcgagtca ggacatcagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaaactcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatattg caacatattt ctgtcaacac tttgatcatc tcccgctcgc tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 14

<211> 214

<212> PRT

<213> Bi-SP抗EGFR侧轻链

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu

85 90 95

Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 15

<211> 1953

<212> DNA

<213> Bi-SP中抗EGFR侧重链

<400> 15

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtgatt actactggac ctggattcgg 120

cagtccccag ggaagggact ggagtggatt ggacacatct attacagtgg gaacaccaat 180

tataacccct ccctcaagag cagactcacc atatcaattg acacgtccaa gactcagttc 240

tccctgaagc tgagttctgt gaccgctgcg gacacggcca tttattactg tgtgcgagat 300

cgagtgactg gtgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttcagct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tggtgagagg 660

ccagcacagg gagggagggt gtctgctgga agccaggctc agcgctcctg cctggacgca 720

tcccggctat gcagccccag tccagggcag caaggcaggc cccgtctgcc tcttcacccg 780

gaggcctctg cccgccccac tcatgctcag ggagagggtc ttctggcttt ttccccaggc 840

tctgggcagg cacaggctag gtgcccctaa cccaggccct gcacacaaag gggcaggtgc 900

tgggctcaga cctgccaaga gccatatccg ggaggaccct gcccctgacc taagcccacc 960

ccaaaggcca aactctccac tccctcagct cggacacctt ctctcctccc agattccagt 1020

aactcccaat cttctctctg cagagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc 1080

gtgcccaggt aagccagccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag 1140

agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt 1200

cctcagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg 1260

acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg 1320

aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga 1380

caaagccgcg ggaagagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc 1440

tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc 1500

cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccgtggg gtgcgagggc 1560

cacatggaca gaggccggct cggcccaccc tctgccctga gagtgaccgc tgtaccaacc 1620

tctgtcccta cagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atgccgggat 1680

gagctgacca agaaccaggt cagcctgtgg tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1740

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1800

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1860

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1920

acgcagaaga gcctctccct gtctcccggt aaa 1953

<210> 16

<211> 643

<212> PRT

<213> Bi-SP中抗EGFR侧重链

<400> 16

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly

20 25 30

Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Glu Arg Pro Ala Gln Gly

210 215 220

Gly Arg Val Ser Ala Gly Ser Gln Ala Gln Arg Ser Cys Leu Asp Ala

225 230 235 240

Ser Arg Leu Cys Ser Pro Ser Pro Gly Gln Gln Gly Arg Pro Arg Leu

245 250 255

Pro Leu His Pro Glu Ala Ser Ala Arg Pro Thr His Ala Gln Gly Glu

260 265 270

Gly Leu Leu Ala Phe Ser Pro Gly Ser Gly Gln Ala Gln Ala Arg Cys

275 280 285

Pro Pro Arg Pro Cys Thr Gln Arg Gly Arg Cys Trp Ala Gln Thr Cys

290 295 300

Gln Glu Pro Tyr Pro Gly Gly Pro Cys Pro Pro Lys Pro Thr Pro Lys

305 310 315 320

Ala Lys Leu Ser Thr Pro Ser Ala Arg Thr Pro Ser Leu Leu Pro Asp

325 330 335

Ser Ser Asn Ser Gln Ser Ser Leu Cys Arg Ala Gln Ile Leu Gln Asn

340 345 350

Ser His Met Pro Thr Val Pro Arg Ala Ser Pro Gly Leu Ala Leu Gln

355 360 365

Leu Lys Ala Gly Gln Val Pro Ser Ser Leu His Pro Gly Thr Gly Pro

370 375 380

Ser Arg Val Leu Thr Arg Pro Pro Pro Ser Leu Pro Gln His Leu Asn

385 390 395 400

Ser Trp Gly Asp Arg Gln Ser Ser Ser Ser Pro Gln Asn Pro Arg Thr

405 410 415

Pro Ser Ser Pro Gly Pro Leu Arg Ser His Ala Trp Trp Trp Thr Ala

420 425 430

Thr Lys Thr Leu Arg Ser Ser Ser Thr Gly Thr Trp Thr Ala Trp Arg

435 440 445

Cys Ile Met Pro Arg Gln Ser Arg Gly Lys Ser Ser Thr Thr Ala Arg

450 455 460

Thr Val Trp Ser Ala Ser Ser Pro Ser Cys Thr Arg Thr Gly Met Ala

465 470 475 480

Arg Ser Thr Ser Ala Arg Ser Pro Thr Lys Pro Ser Gln Pro Pro Ser

485 490 495

Arg Lys Pro Ser Pro Lys Pro Lys Val Gly Pro Val Gly Cys Glu Gly

500 505 510

His Met Asp Arg Gly Arg Leu Gly Pro Pro Ser Ala Leu Arg Val Thr

515 520 525

Ala Val Pro Thr Ser Val Pro Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

530 535 540

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

545 550 555 560

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

565 570 575

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

580 585 590

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

595 600 605

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

610 615 620

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

625 630 635 640

Pro Gly Lys

<210> 17

<211> 1050

<212> DNA

<213> Bi-SP抗CD47侧Fc融合蛋白

<400> 17

gaagaagaac tgcagatcat ccagccggac aaatctgttt ctgttgcggc gggtgaatct 60

gcgatcctgc actgcaccat cacctctctg ttcccggttg gtccgatcca gtggttccgt 120

ggtgcgggtc cggcgcgtgt tctgatctac aaccagcgtc agggtccgtt cccgcgtgtt 180

accaccgttt ctgaaaccac caaacgtgaa aacatggact tctctatctc tatctctaac 240

atcaccccgg cggacgcggg cacctactac tgcatcaaat tccgtaaagg ttctccggac 300

accgaattta aatctggtgc gggcaccgaa ctgtctgttc gtgcgaaacc gtctgagccc 360

aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 420

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 480

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 540

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 600

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 660

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 720

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 780

ctgaccaaga accaggtcag cctgtcctgc gccgtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 840

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 900

ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 960

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1020

cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 1050

<210> 18

<211> 350

<212> PRT

<213> Bi-SP抗CD47侧Fc融合蛋白

<400> 18

Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

115 120 125

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

145 150 155 160

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

165 170 175

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

180 185 190

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

195 200 205

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

210 215 220

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

225 230 235 240

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

245 250 255

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

260 265 270

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

275 280 285

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

290 295 300

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

305 310 315 320

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

325 330 335

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345 350

Claims (10)

1.一种抗CD47和EGFR的双功能蛋白Bi-SP，其特征在于，所述双功能蛋白包含抗EGFR侧的重链、抗EGFR侧的轻链以及抗CD47侧的Fc融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的双功能蛋白Bi-SP，其特征在于，所述双功能蛋白包含SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.16及SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列。

3.权利要求1或2所述双功能蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、构建分别含有SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列的载体，并将其共转染至宿主细胞中进行培养，筛选稳定表达双功能蛋白的细胞克隆；

S2、对细胞培养物进行分离纯化，得到双功能蛋白Bi-SP。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载体为真核表达载体pcDNA3.1。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为CHO-K1细胞。

6.根据权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，用含600μg/mL G418和250μg/mLZeocin的选择培养基筛选稳定表达双功能蛋白的细胞克隆。

7.一种宿主细胞，其特征在于，同时表达SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16及SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列。

8.一种载体组合，其特征在于，包括分别含有SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15及SEQ IDNO.17所示的核苷酸序列的载体。

9.含有权利要求1或2所述的双功能蛋白Bi-SP的组合物。

10.权利要求1或2所述的双功能蛋白Bi-SP在制备抗肿瘤药物中的应用。