[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

JP2015503912A - ヒトアルギナーゼおよびpeg化ヒトアルギナーゼとその使用方法 - Google Patents

ヒトアルギナーゼおよびpeg化ヒトアルギナーゼとその使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2015503912A
JP2015503912A JP2014549336A JP2014549336A JP2015503912A JP 2015503912 A JP2015503912 A JP 2015503912A JP 2014549336 A JP2014549336 A JP 2014549336A JP 2014549336 A JP2014549336 A JP 2014549336A JP 2015503912 A JP2015503912 A JP 2015503912A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
arginase
pegylated
mutated
mpeg
cysteine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2014549336A
Other languages
English (en)
Inventor
ニン マン チェン,
ニン マン チェン,
リー ツン,
リー ツン,
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BIO CANCER TREATMENT INTERNATIONAL Ltd (SHANGHAI)
Bio Cancer Treatment International Ltd Shanghai
Original Assignee
BIO CANCER TREATMENT INTERNATIONAL Ltd (SHANGHAI)
Bio Cancer Treatment International Ltd Shanghai
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BIO CANCER TREATMENT INTERNATIONAL Ltd (SHANGHAI), Bio Cancer Treatment International Ltd Shanghai filed Critical BIO CANCER TREATMENT INTERNATIONAL Ltd (SHANGHAI)
Publication of JP2015503912A publication Critical patent/JP2015503912A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/78Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46Hydrolases (3)
    • A61K38/50Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • A61P35/02Antineoplastic agents specific for leukemia
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • A61P35/04Antineoplastic agents specific for metastasis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y305/00Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/03Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amidines (3.5.3)
    • C12Y305/03001Arginase (3.5.3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本発明は、部位特異的変異アルギナーゼおよびその調製方法、アルギナーゼ関連疾患を治療する薬剤を調製する際に上記部位特異的変異アルギナーゼを使用する方法を提供する。本発明は、PEG化アルギナーゼおよびその調製方法、アルギナーゼ関連疾患を治療する薬剤を調製する際に上記PEG化アルギナーゼを使用する方法も提供する。【選択図】図1

Description

本願の特許請求の範囲は、中国特許出願番号201110445968.8、出願日2011年12月27日、発明の名称「ヒトアルギナーゼおよびPEG化ヒトアルギナーゼとその使用方法」、および中国特許出願番号201210069626.9、出願日2012年3月16日、発明の名称「ヒトアルギナーゼおよびPEG化ヒトアルギナーゼとその使用方法」を優先権主張の基礎とし、それら全体を参照して本願に取り入れている。
(配列表に関して)
添付した配列表のハードコピーおよび対応するコンピューターで読み取り可能形式は、それら全体を参照して双方とも本願に取り入れている。
本発明は、アルギナーゼ、その調製方法、およびアルギナーゼ関連疾患の治療におけるその使用方法を提供する。特に、本発明は、部位特異的変異アルギナーゼ、その調製方法、およびアルギナーゼ関連疾患の治療におけるその使用方法を提供する。本発明は、PEG化アルギナーゼ、その調製方法、およびその使用方法も提供する。
アルギニンは、ヒトを含む哺乳動物において重要なアミノ酸であり、細胞の増殖や成長を含む、さまざまな生理的プロセスに関与している。例えば、アルギニンは、ポテンシャルシグナル分子である一酸化窒素(NO)の合成のための即時前駆体である。NOは、神経伝達物質、機能筋弛緩薬または血管拡張薬として機能する。NOの生合成は、Ca++を触媒とする一酸化窒素合成酵素およびNADPH依存性反応を含む。アルギニンの他の機能は、ポリアミン、スペルミジンまたはスペルミンの前駆体となること、および他の生理的プロセスに関与することである。
研究では、アルギニンが8μMより少ない場合、癌細胞は不可逆的な死に至る(非特許文献1)。細胞の成長における影響について研究によれば、アルギニンを除去すると、細胞周期のG0期にある通常の細胞は、休止期に入り、重大な損傷なしに数週間は生存し続ける。アルギニンの濃度を通常の水準まで戻すと、細胞は通常の細胞周期に戻る。ある腫瘍細胞は、細胞周期G1期のR点からアルギニンが欠乏するS期まで進行すると、すぐにアポトーシスを起こす。アルギニンが欠乏する結果としての腫瘍細胞のアポトーシスは、不可逆的である。したがって、科学者は、特に、肝臓癌や黒色腫のような栄養要求性腫瘍に関しては、体内のアルギニンの量を制御することによって癌を治療しようと考え始めている。このアプローチは、乳癌、肺小細胞癌、前立腺癌、リンパ腫および白血病を含む、さまざまな腫瘍の抑制についての研究に使われている。
アルギナーゼは、L−アルギニンの加水分解を触媒してオルニチンと尿素にする酵素である。一般的に、アルギナーゼは、尿素を生産する動物(哺乳動物、軟骨魚類、両生類、カメ類)の肝臓、腎臓および精巣において、尿素周期の酵素の1つとして発現する。アルギナーゼは、哺乳動物の尿素周期の最終段階を触媒し、アルギニンをオルニチンおよび尿素に変える。ヒトを含む多くの哺乳動物では、アルギナーゼのファミリーは、アルギナーゼIとアルギナーゼIIを含む。アルギナーゼIは主に肝臓細胞で発現し、アルギナーゼIIは主に腎臓および赤血球で発現する。
アルギナーゼを製造する方法は2つある。1つは、アルギナーゼを作り出す有機体から分離する方法であり、もう1つは、組み換え遺伝子工学技術によるものである。後者には有利な点がある。例えば、実験では、大量のアルギナーゼが大腸菌(E.coli)により生産できることが示された。しかしながら、組み換え遺伝子工学技術によりアルギナーゼを製造することには、酵素活性が低いまたは安定性に乏しい、および生体内での半減期が短いなどの技術的な問題があり、臨床実験への応用が制限される。
特許文献1では、Hisタグを有する組み換えヒトアルギナーゼIを用いたアルギニンの除去による、ヒト悪性腫瘍に対する医薬組成物および治療方法が開示されており、この中で、アルギナーゼの表面のN末端またはアミン基で、分子量5000(MW5000)のポリエチレングリコールと、共有結合することにより、アルギナーゼを修飾している。修飾したヒトアルギナーゼは、ヒト血清中で3日間の半減期を有しており、安定性が増加した。
特許文献2では、Hisタグを有する修飾ヒトアルギナーゼが開示されており、この中で、168および303システインはセリンに置き換えられ、アルギナーゼは分子量20KDaのポリエチレングリコールでPEG化されている。特許文献1で開示された組み換えヒトアルギナーゼと同様に、付加的なペプチド断片であるHisタグには、アルギナーゼのアミノ酸配列が含まれる。多くの国々の薬剤規制機関は、これらのペプチド断片を使用することを推奨しない。例えば、中国食品薬品監督管理局は、「人への使用に関する組み換えDNA製品の品質管理の技術的ガイドライン」において、製造工程を簡便化する目的で導入されるHisタグのような付加的なペプチド断片は、最終製品から可能な限り除去すべきだと指摘している。
特許文献3では、部位特異的に修飾したアルギナーゼが開示されおり、このアルギナーゼにおいて、3つのシステインが保持され、別のシステイン残基はN末端の3番目のアミノ酸残基を置換するために導入され、分子量20KDaのメトキシポリエチレングリコールマレイミドでPEG化される。上記ヒトアルギナーゼは、元からある3つのシステイン残基を担持しているので、PEG化生成物は不均質なる傾向があり、歩留まりが低く、さらに精製も困難である。
本発明の技術分野では、アルギニンに関する病気や疾患を治療するための、より良いアルギナーゼおよびその誘導体への需要がある。
US7951366B2 US20100247508A1 WO 2011/008495A2
Srorr & Burton, 1974, The effects of arginine deficiency on lymphoma cells.Br.J.Cancer 30, 50
本発明では、単離した、実質的に純粋なアルギナーゼを提供する。アルギナーゼは、哺乳動物の尿素合成における尿素再循環経路の最終段階にある酵素であり、アルギニンをオルニチンおよび尿素に変換する。ヒトと含む多くの哺乳動物では、アルギナーゼのファミリーに、アルギナーゼIおよびアルギナーゼIIを含む。さまざまな由来のアルギナーゼIについての研究では、異なる由来のアルギナーゼIは、多くの保存配列と活性部位を有するが、その配列は異なるだろうということが示されている。原口らの報告(1987, Proc. Natl. Acad. Sc1. 84, 412-415)のように、野生型ヒトアルギナーゼIは、SEQ ID NO.1のアミノ酸配列を有しており、アミノ酸位置45、168および303に3つのシステインを含む。野生型ヒトアルギナーゼIは、ヌクレオチド配列SEQ ID NO.2を有する。
本発明において、「単離した」の語は、非天然の形態をいう。「実質的に純粋」の語は、生成物が、生成やタンパク質修飾に由来する他の成分を含むことがあるが、そのような他の成分は実質的に存在しないか存在しても非常にわずかであることを意味する。
本発明において、アミノ酸部位の位置についての記述は、当業者が通常使用するものである。例えば、「SEQ ID NO.xの配列の位置45」または「SEQ ID NO.xの配列の位置45のCys(システイン)」または「Cys45」は、すべて、アミノ酸配列の45番目のアミノ酸残基または位置45のシステインを示す。
1つの態様において、本発明はアルギナーゼが、
(1)位置45、168および303にあるシステインのうちの1つ、2つまたは3つが変異している、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列、または
(2)1つ以上のアミノ酸を置換、除去、挿入、付加、または転置した(1)に規定するアミノ酸配列
を含むヒトアルギナーゼIであって、アルギナーゼ活性を有する、変異アルギナーゼを提供する。
1つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるシステインは、独立して非極性アミノ酸に変異する。その側鎖の特性により、アミノ酸は、極性または非極性のアミノ酸に区別することができる。非荷電の、またはわずかに極性化された側鎖を有するアミノ酸は、非極性アミノ酸とよばれ、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびプロリンが挙げられる。
1つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるシステインは、独立してグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異する。システインは、独立してアラニンに変異することが好ましい。本発明では、非イオン極性のアミノ酸であるシステインが非極性アミノ酸(例えばアラニン)に変異する場合に、ヒトアルギナーゼIの酵素活性は著しく増加することを、図らずも発見した。変異アルギナーゼと基質との間の結合が強化されることが理由の1つとして考えられる。
1つの態様では、本発明のアルギナーゼにおける位置45、168および303のシステインのうちの1つが、変異する。本発明ではさらに、位置303のシステインが変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインはアラニンに変異する。
1つの態様では、本発明のアルギナーゼにおける位置45、168および303のシステインのうちのいずれか2つが、変異する。さらに本発明では、位置45および303のシステインが変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異する。
1つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるSEQ ID NO.1のアミノ酸配列の位置168および303のシステインが、変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異する。
1つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるSEQ ID NO.1のアミノ酸配列の位置45および303のシステインが、変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異する。
1つの態様では、本発明のアルギナーゼにおけるSEQ ID NO.1のアミノ酸配列の位置45、168および303のシステインが、変異する。好ましくは、上記システインは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異する。
本発明のアルギナーゼは、野生型アルギナーゼよりも高い酵素活性を有する。本発明のアルギナーゼは、通常、少なくともおよそ500U/mgの比活性を有し、好ましくは、活性は少なくともおよそ700U/mgであり、さらに好ましくは、活性は少なくともおよそ800U/mgである。本発明のアルギナーゼは、通常、野生型アルギナーゼよりも高い酵素活性を有する。
本発明における1つの態様では、アルギナーゼは、SEQ ID NO.2のヌクレオチド配列を有しており、その中で、SEQ ID NO.1のアミノ酸配列における位置45、168および303のアミノ酸残基システインに対する少なくとも1つのコドンが置換さていれる。アミノ酸は、ポリヌクレオチドによってコード化される。メッセンジャーRNAにおける3つのヌクレオチドコドンは、1つのアミノ酸を定義づける。本発明における1つの態様では、ヌクレオチドの置換は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンをコード化するコドンによって置換されるコドンTGTである。コドンTGTは、アラニンをコード化するコドンによって置換されるのが好ましい。
本発明における1つの態様では、アラニンをコード化する上記コドンは、GCT、GCC、GCA、GCGであり、好ましくはGCTである。
1つの態様において、本発明では、タンパク質を発現できる宿主におけるアルギナーゼまたは変異アルギナーゼの遺伝子を発現することを含む、上述したアルギナーゼの調製方法を提供する。本発明のアルギナーゼの調製方法は、通常、以下の主な工程を含む。所望の遺伝子またはヌクレオチド断片は、PCRまたは合成方法により得られる。所望の遺伝子を有するDNA断片は、独立して複製でき、組み換えDNA分子を形成する選択マーカーを有する、プラスミド、ファージまたはウィルスのような、ベクターと結合している。DNA断片のベクターとの連結は、主にホモポリマーの末端、相補末端、ブラントエンド、または人工のリンカーによってなされる。組み換えDNAは、増殖して発現されるように、宿主細胞に導入されなければならない。組み換えDNA分子が宿主細胞に導入されて増殖するように、ベクターのさまざまな性質により、形質移入、形質転換、形質導入が行われる。適切な遺伝子工学的宿主は、当該分野で知られており、大腸菌、イースト菌、昆虫細胞などを含む。
本発明は、単離した、実質的に純粋なPEG化アルギナーゼも提供する。上記PEG化アルギナーゼにおけるアルギナーゼは、既に定義づけた。1つの態様において、SEQ ID NO.1のアミノ酸配列における本発明の上記アルギナーゼの位置45、168および303のシステインのうちの1つ、2つまたは3つが変異する。好ましくは、上記システインは非極性アミノ酸に変異し、さらに好ましくは、上記システインはアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、特に好ましくは、上記システインはアラニンに変異する。本発明のPEG化アルギナーゼは、上記アルギナーゼをPEG化することで得られる。上記PEG化アルギナーゼにおいて、ポリエチレングリコール分子は、アルギナーゼのアミノ酸残基と共有結合している。本発明において、アルギナーゼは、それぞれ、少なくとも1つのポリエチレングリコール分子と結合して、PEG化アルギナーゼを形成する。
1つの態様において、本発明は、アルギナーゼが、
(1)位置45、168および303にあるシステインのうちのいずれか1つ、2つまたは3つが変異している、SEQ ID NO.1のアミノ酸配列、または
(2)1つ以上のアミノ酸における置換、除去、挿入、付加または転置が(1)に規定するアミノ酸配列に導入されたアミノ酸配列
を含むヒトアルギナーゼIであって、アルギナーゼ活性を有する、PEG化アルギナーゼを提供する。
1つの態様において、本発明のPEG化アルギナーゼにおけるシステインは、独立して非極性アミノ酸に変異する。20個のアミノ酸の構造は、その側鎖の相違によって異なる。非荷電またはわずかに極性化された側鎖を有するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびプロリンのような、非極性アミノ酸に属す。
1つの態様において、PEG化アルギナーゼIは、CまたはN末端に付加されるHisタグ配列のような、精製において用いられるタグ配列を含まない。Hisタグ融合タンパク質は、タンパク質発現のもっとも一般的な手段であり、容易に精製できる利点を有し、タンパク質の活性に重大な影響を与えない。可溶型または封入体のいずれかのタンパク質発現生成物は、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィにより精製され得る。一方、潜在的な免疫原性の特性により、中国食品薬品監督管理局は、「人への使用に関する組み換えDNA製品の品質管理の技術的ガイドライン」において、製造工程を簡便化する目的で導入されるHisタグのような付加的なペプチド断片は、最終製品から可能な限り除去されるべきだと指摘している。
本発明において、アルギナーゼのPEG化は、化学装飾によって行うことができ、上記化学装飾は、カップリング剤(PEG化試薬ともいう)を有するポリエチレングリコール誘導体を用いて、ポリエチレングリコール分子をアルギナーゼと共有結合することにより行うことができる。一般的なポリエチレングリコール分子は、それぞれの末端に水酸基を有する。メトキシポリエチレングリコール(mPEG)は、一方の末端がメトキシ基でブロックされているポリエチレングリコールである。もっとも一般的に研究されているペプチドまたはタンパク質の修飾において用いられるPEG化試薬は、メトキシポリエチレングリコール(mPEG)の誘導体である。修飾は、主に、アミノ基、カルボキシル基またはチオール基に対するものを含む。一般的なPEG化方法の1つは、ポリエチレングリコールまたはPEG化試薬を、リジン表面のε-NHまたはタンパク質のN末端α−NHと共有結合することであり、例えばメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルブチラート(mPEG−SBA)、mPEG−スクシンイミジルプロピオナート(mPEG−SPA)、mPEG−スクシンイミジルスクシナート(mPEG−SS)、mPEG−スクシンイミジルカーボナート(mPEG−SC)、mPEG−スクシンイミジルグルタラート(mPEG―SG)、mPEG−N−ヒドロキシル−スクシンイミド(mPEG―NHS)、mPEG―トレシラートおよびmPEG―アルデヒドが挙げられる。チオール基の高い求核性の特性によれば、他の一般的なPEG化方法は、特にタンパク質のチオール基と結合する、ポリエチレングリコールまたはPEG化試薬を選択的に使用することであり、例えばmPEG−マレイミド、mPEG−オルト−ピリジル−ジスルフィド、mPEG−ビニルスルホンおよびmPEG−ヨードアセトアミドを用いてペプチドまたはタンパク質のチオール基を修飾する。ヒトアルギナーゼは、アミノ酸配列の位置45、168または303に位置する3つのシステイン残基を有し、チオール基を標的とするPEG分子と共有結合することにより部位特異的に変異させることができる。
本発明のアルギナーゼIのアミノ酸配列は、アミノ基のPEG化が可能な部位として、24個のリジンおよびN末端アミノ基を含む。タンパク質の3次元構造における位置が異なるため、それぞれのPEG化の程度は異なる。ピモール(PyMOL)または スイスPDVビューアー(Swiss−PdbViewer)によるアルギナーゼの3次元構造分析からは、24個のε−アミノ基のうちの12個は、立体障害または周囲の基と形成される水素結合により、PEG化するのは難しいことがわかった。K4、K33、K41、K75、K89、K150、K155、K191、K224、K284、K313およびK322のε−アミノ基は、アミノ基を標的とするPEG試薬による反応が進行しやすく、K191、K224、K89、K284のε−アミノ基は、PEG化において最も容易に接近できる部位である。
1つの態様では、上記のPEG化試薬は、メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート(mPEG−SPA)、mPEG−スクシンイミジルブチラート(mPEG−SBA)、mPEG−スクシンイミジルスクシナート(mPEG−SS)、mPEG-スクシンイミジルカルボナート(mPEG−SC)、mPEG−スクシンイミジルグルタラート(mPEG−SG)、mPEG−N−ヒドロキシル−スクシンイミド(mPEG−NHS)、mPEG−トレシラートおよびmPEG−アルデヒドから選択される。さらに本発明では、上記PEG化試薬はメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナートであり、好ましくは、上記PEG化試薬は平均分子量5Kのメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート5000である。
PEGの分子量の選択は、生体活性および薬物動態学的特性を総合的に勘案して行う。研究では、体内での修飾タンパク質薬剤の動作時間は、結合したPEGの数と分子量と相関関係があることが示された。タンパク質は、修飾するPEG分子が大きすぎると、その活性を失うことがある。本発明で用いるPEGは、3〜40Kの範囲の分子量を有し、直線型または分岐型である。本発明で用いるPEGは、当該技術分野で用いられるPEG誘導体とすることができる。本発明で用いるPEGは、特定の種類に限定されない。
1つの態様において、上記アルギナーゼの分子それぞれと結合するPEG分子の全分子量は、およそ20〜70Kであり、好ましくは、全分子量はおよそ30〜60Kである。
1つの態様において、PEG化において用いられるPEG分子はそれぞれ、およそ2〜40Kの平均分子量を有し、好ましくは、平均分子量はおよそ5〜20Kであり、さらに好ましくは、平均分子量はおよそ5Kである。
1つの態様において、PEG化において用いられるPEG分子はそれぞれ、およそ5Kの平均分子量を有する。アルギナーゼ分子はそれぞれ、およそ4〜13個のPEG分子と結合する。好ましくは、アルギナーゼ分子はそれぞれ、6〜12個のPEG分子と結合する。
アルギナーゼ分子のそれぞれと結合するPEG分子の数は、タンパク質/PEG試薬の割合、反応時間、温度など、PEG化反応に影響を与えるパラメータを調整することで制御することができる。例えば、アルギナーゼ分子のそれぞれが、4〜13個のPEG分子と、好ましくは6〜12個の分子と結合するように制御することができる。
1つの態様において、本発明のPEG化アルギナーゼは、アミノ反応性PEG試薬を、K191、K224、K89、K284のアミノ基、またはN末端のα−アミノ基のような、アルギナーゼ表面のリジンのε−アミノ基と共有結合することによって形成され、またはK4、K33、K41、K75、K150、K155、K313およびK322の位置でさらにPEG化される。アルギナーゼの分子それぞれと結合するPEG分子の数は、タンパク質/PEG試薬の割合、反応時間または温度のような、PEG化反応に影響を与えるパラメータを調整することにより、およそ4〜13個のPEG分子、好ましくは6〜12個の分子に制御することができる。
1つの態様において、PEG化アルギナーゼのSEQ ID NO.1のアミノ酸配列における位置45、168および303の3つのシステインのうちの1つ(例えば、システイン45、システイン168またはシステイン303)は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異する。好ましくは、上記システインはアラニンに変異し、その場合、上記PEG化アルギナーゼのPEG分子はそれぞれ、およそ5Kの平均分子量を有し、上記PEG化アルギナーゼのアルギナーゼ分子はそれぞれ、およそ4〜13個のPEG分子、好ましくは6〜12個の分子と結合している。本発明のさらなる態様では、上記PEG化は、メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート5000を用いて行われる。
1つの態様において、PEG化アルギナーゼのSEQ ID NO:1のアミノ酸配列における位置168および303のシステインは、独立して、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異する。好ましくは、上記システインはアラニンに変異し、この場合、上記PEG化アルギナーゼのPEG分子のそれぞれは、およそ5Kの平均分子量を有し、上記PEG化アルギナーゼのアルギナーゼ分子はそれぞれ、およそ4〜13個のPEG分子と、好ましくは6〜12個の分子と結合している。本発明のさらなる態様では、上記PEG化は、メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート5000を用いて行う。
1つの態様において、PEG化アルギナーゼのSEQ ID NO:1のアミノ酸配列における位置45および303のシステインは、独立して、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異する。好ましくは、上記システインはアラニンに変異し、この場合、上記PEG化アルギナーゼのPEG分子のそれぞれは、およそ5Kの平均分子量を有し、上記PEG化アルギナーゼのアルギナーゼ分子はそれぞれ、およそ4〜13個のPEG分子と、好ましくは6〜12個の分子と結合している。本発明のさらなる態様では、上記PEG化は、メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート5000を用いて行う。
1つの態様において、PEG化アルギナーゼSEQ ID NO:1のアミノ酸配列における位置45および168のシステインは、独立して、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異する。好ましくは、上記システインはアラニンに変異し、この場合、上記PEG化アルギナーゼのPEG分子のそれぞれは、およそ5Kの平均分子量を有し、上記PEG化アルギナーゼのアルギナーゼ分子はそれぞれ、およそ4〜13個のPEG分子と、好ましくは6〜12個の分子と結合している。本発明のさらなる態様では、上記PEG化は、メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート5000を用いて行う。
1つの態様において、PEG化アルギナーゼのSEQ ID NO:1のアミノ酸配列における位置45、168および303のシステインは、独立して、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異する。好ましくは、上記システインはアラニンに変異し、この場合、上記PEG化アルギナーゼのPEG分子のそれぞれは、およそ5Kの平均分子量を有し、上記PEG化アルギナーゼのアルギナーゼ分子はそれぞれ、およそ4〜13個のPEG分子と、好ましくは6〜12個の分子と結合している。本発明のさらなる態様では、上記PEG化は、メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート5000を用いて行う。
本発明のPEG化アルギナーゼは、実質的に均質である。実質的に均質であるとは、生成物はPEG化アルギナーゼを実質的に含むが、未反応の(すなわち、PEG化していない)タンパク質や重合体のPEG化アルギナーゼをわずかに含み得ることを意味する。本発明は、純度が90%以上、好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上のPEG化アルギナーゼを提供する。本発明において、「PEG化アルギナーゼの純度」とは、全アルギナーゼ(PEGと共有結合したアルギナーゼ、PEGと共有結合していないアルギナーゼ、および重合体のPEG化アルギナーゼ)のうち、PEG化アルギナーゼ(すなわち、PEGと共有結合したアルギナーゼ)の百分率を意味する。一般に、生成物には、PEGと共有結合していないアルギナーゼや重合体のアルギナーゼを含むので、さらなる精製が要求される。精製技術として一般に用いられる方法は、当該技術分野で知られており、陽イオン交換クロマトグラフィおよびタンゲンシャルフロー濾過を含む。
本発明のPEG化アルギナーゼは、血液または血清において、少なくとも0.5日の半減期を有し、好ましくは、上記アルギナーゼは少なくとも2.5日の半減期を有し、さらに好ましくは、上記アルギナーゼは少なくとも3.5日の半減期を有する。アルギナーゼの半減期は、当該分野で公知の通常用いられる方法により測定することができる。血液または血清中のアルギナーゼと使用した動物モデルでのアルギナーゼとの半減期を測定したデータには確かに関連性がある。代謝率の高い動物(たとえば、ラット)において得られた半減期のデータは、通常、代謝率の低い動物(たとえば、ヒト)よりも短い。
本発明は、PEG化アルギナーゼの調製方法を提供する。上記PEG化は、PEG分子をアルギナーゼのアミノ酸残基に結合することで達成される。本発明のPEG化アルギナーゼにおいて、アルギナーゼ分子はそれぞれ、PEG分子と結合してPEG化アルギナーゼを形成している。
本発明において、部位特異的なPEG化は化学修飾によってなされるが、この場合、化学修飾は、アルギナーゼ上の基をPEG試薬と共有結合することで行われる。上記化学修飾は特異的であって、つまり、PEG分子は、特定の基と結合する試薬を用いて、アルギナーゼの特定のアミノ酸残基のみと結合する。
本発明は、上述したアルギナーゼまたはPEG化アルギナーゼの応用/使用方法、またはアルギナーゼに関連疾患を治療する際の、それらを含む医薬組成物も提供する。当該分野において公知である上記アルギナーゼ関連疾患には、哺乳動物の体内におけるアルギニン量に関連する体調/病気/疾患が含まれる。そのような体調/病気/疾患には、高アルギニン血症が含まれる。アルギナーゼが欠乏することにより、患者の体内のアルギニンは尿素に分解することもオルニチン代謝周期に加わることもできず、血液中のアルギニン量は、通常の血液の値よりも7〜10倍も高くなり、脳脊髄液または尿におけるアルギニン量と同時に排泄物における尿素排泄も増加する。さらに、上記体調/病気/疾患には、アルギニン依存増殖または腫瘍が含まれる。細胞の成長における影響についての研究では、アルギニンを除去した場合に、細胞周期のG0期にある通常の細胞は休止期に入り、重大な損傷なしに数週間は生存し続けることがわかった。アルギニンの濃度が通常の水準まで戻ると、細胞は通常の細胞周期に戻る。増殖中の細胞や腫瘍は、しかしながら、細胞周期のG1期のR点を経て、アルギニンが欠乏するS期に入って、すぐにアポト―シスをおこす。アルギニンの欠乏による過形成細胞または腫瘍細胞のアポトーシスは、不可逆的である。そのため、科学者は、体内のアルギニン量を制御することによって、過形成または腫瘍を治療することを考え始めた。
本発明は、医薬組成物も提供し、この場合、本発明の上記医薬組成物の有効成分は、上述したアルギナーゼまたはPEG化アルギナーゼである。上記医薬組成物の剤型は、固形体、液剤、乳剤、分散剤、ミセル、リポソームの形態をとり得るが、この場合、処方には、有効成分として本発明のヒトアルギナーゼまたはPEG化アルギナーゼのうちの1つ以上含まれており、有機または無機のキャリアー、または非経口の使用法に適切な医薬品添加物と混合される。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、着色剤および香料を添加できる。本発明の単離した実質的に純粋なヒトアルギナーゼまたはPEG化アルギナーゼのうちの1つ以上は、有効成分として、体調や病気に対して所望の効果を奏するのに十分な量が含まれる。医薬組成物は、錠剤、丸薬、トローチ剤、水和または油性の懸濁剤、分散した粉剤または粒剤、または乳剤、硬いまたは柔らかいカプセル、またはシロップのような、経口投与に適する形態で処方される。経口投与の処方は、当該分野で公知の技術にしたがって、消化管のなかでゆっくりと分解し吸収されるようにカプセル化することで、長時間効果が持続する。処方は、無菌の注射可能な液剤また懸濁剤の形態でもよい。上記懸濁剤は、当該分野において公知の方法により、分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を用いて調製することができる。
本発明の医薬組成物は、さらに、固形体、液剤、懸濁剤、ミセル、またはリポソームの形態で処方され得る。1つの態様では、医薬組成物は、経口投与または注射可能な形態に処方される。
図1は、野生型アルギナーゼIのヌクレオチド配列を示す。 図2は、還元条件におけるヒトアルギナーゼIのSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。 図3は、高圧液体クロマトグラフィ分析によるヒトアルギナーゼの発現を示す。 図4は、還元条件および非還元条件でのSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による野生型および変異アルギナーゼIの試験結果を示す。 図5は、還元条件および非還元条件における精製した変異アルギナーゼI(rhArgI−A303、rhArgI−A168/303およびrhArgI−A45/303)のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。 図6は、還元条件および非還元条件における精製した変異アルギナーゼI(rhArgI−A45/168およびrhArgI−A45/168/303)のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。図6aは、精製した変異アルギナーゼI(rhArgI−A45/168およびrhArgI−A45/168/303)の非還元条件のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。 図6bは、精製した変異アルギナーゼI(rhArgI−A45/168およびrhArgI−A45/168/303)の還元条件でのSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。 図7は、PEG化ヒトアルギナーゼIの非還元条件でのSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。 図8は、PEG化アルギナーゼIの質量分析を示す。図8aは、PEG化アルギナーゼI:A168/303−Y40Kの質量分析を示す。 図8bは、PEG化アルギナーゼI:A45/303−Y40Kの質量分析を示す。 図8cは、PEG化アルギナーゼI:RP−V−J5Kの質量分析を示す。 図8dは、PEG化アルギナーゼI:RP−M2−J5Kの質量分析を示す。 図8eは、PEG化アルギナーゼI:RP−M3−J5Kの質量分析を示す。 図8fは、PEG化アルギナーゼI:RP−M4−J5Kの質量分析を示す。 図8gは、PEG化アルギナーゼI:RP−M7−J5Kの質量分析を示す。 図9は、PEG化アルギナーゼの質量分析の連結した数値を示す。
この発明を、以下に述べる実施例を用いてさらに説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を説明しており、説明する実施例に限定されない。上述の記載および実施例を参考にすれば、当業者は本発明の重要な特質を決定することができ、発明の意図および範囲を逸脱することなく、他の使用方法や条件に適用する場合にさまざまな方法で本発明を変更し修正することができる。つまり、本発明に対する前述のいかなる変更/修正によれば、ここで示しまた説明したこと以外でも、当業者には明白であり、それらの修正は、付加した請求項の範囲の一部を形成することが意図されている。
例1:Hisタグを有さない組み換えヒトアルギナーゼIプラスミドpET30a(+)−rhアルギナーゼ−Vの発現および構築。
ヒトアルギナーゼI遺伝子配列は、1987年に公表された(Haraguchi. Y. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci, 84, 412-415)。ヒトアルギナーゼ遺伝子は、テンプレートとしてヒト肝臓5’ストレッチプラスcDNAライブラリ(クロンテック社)、および前述のアルギナーゼI配列により設計されたプライマーARG−V(+)およびARG−V(−)を用いて、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)によって増大した。プライマーARG−V(+)は、NdeI制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、ARG−V(−)プライマーは、XhoI制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。分子生物学の通常の検査技法を用いれば、ヒトアルギナーゼIのPCR生成物が得られ、アルガロースゲル電気泳動により確認された。上記増大したヒトアルギナーゼIのPCR生成物および商業的に入手可能な発現ベクターpET30a(+)は、制限エンドヌクレアーゼ、NdeIおよびXhoI(プロメガ社)で、それぞれ37℃1.5時間で消化された。消化された断片は、T4DNAリガーゼにより16℃で一晩連結され、得られた連結組み換えプラスミドは、DH5α大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。その形質転換細胞は、LB寒天平板を含むカナマイシン(30μg/ml)上に流し入れ培養することで選択した。正しい挿入断片を含むプラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化分析によって同定した。正しい組み換えヒトアルギナーゼI発現プラスミドは、以下pET30a(+)−rhアルギナーゼ−Vとするが、正しい配列およびヒトアルギナーゼI遺伝子の挿入を確実にするために、順番に配列することによって分析する。挿入断片の大きさは、長さで969個分の塩基対である。図1に示すように、SEQ ID NO.2のヌクレオチド配列を有する。
ARG-V(+):
5' GGAATTCCATATGAGCGCCAAGTCCAGAACCATAG 3'
NdeI
ARG-V(-):
5' CCGCTCGAGTTATTACTTAGGTGGGTTAAGGTAGTCAATAGG 3'
XhoI
例2:Hisタグを有さない組み換えヒトアルギナーゼIプラスミドDNApET30a(+)−rhアルギナーゼ−Vの発現、および標的タンパク質の精製。
100μlのコンピテントBL21(DE3)細胞は氷上で解凍した。1μlのpET30a(+)−V組み換えプラスミドは、そのコンピテント細胞に加えられ、30分間氷上で培養した。その混合物は、42℃の水浴中で90秒間ヒートショック処理をし、その後氷上で2分間培養した。500μlのLB培養液を、形質転換細胞に加え、37℃、150rpmで1時間振とう培養した。培養後、200μlの形質転換細胞の懸濁液を、カナミシンLB寒天平板上に平らに流し広げ、逆さまにして37℃の培養器で16時間培養した。
組み換えプラスミドで形質転換した1つのコロニーを選択し、25mlのLB培養液に移して、光学濃度600nm(OD600nm)が0.6〜0.8に達するまで、37℃、150rpmで振とう培養した。最終濃度0.2mMのIPTGを、標的たんぱく質の発現を3時間で誘発するようにその培養液に加えた。選択したクローンの標的タンパク質発現は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を用いて分析した。高度にタンパク質発現するクローンは、遺伝子操作バクテリアとしてグリセロールストックに保管した。
遺伝子操作バクテリア細胞は、15Lの発酵槽で流加培養した。OD600nmが12〜13に達したとき、最終濃度0.2mMのIPTGを、標的タンパク質の発現を3〜4時間で誘発するために培養液に加えた。誘発したバクテリア細胞は、集められて溶解された。その後の標的タンパク質の分離および精製のため、細胞ライセートは遠心分離され、その上澄み液は集められた。
標的タンパク質の精製は、CM陽イオン液体クロマトグラフィを用いて行った。Tris−HClは、サンプルローディングの前にカラムを平衡にするために用いた。バクテリア細胞のライセート上澄み液をカラムにロードして、その後、弱く結合するまたは非特異的に結合する不純物を除去するために、カラム容量3個分の平衡バッファーで洗浄した。安定化したUV280nmを読み取るときに、標的タンパク質は、Tris−HClおよびNaClを含む溶離バッファーを用いて溶離した。カラムから溶離したタンパク質のピークは、集められて、SDS−PAGEおよび高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)で分析した。
実験結果は、図2および3に示した。
図2に、ヒトアルギナーゼI発現量のSDS−PAGE分析の結果を示す。それぞれのレーンの試料は以下のとおりである。
1.タンパク質分子量標準、2.バクテリアライサート上澄み液、3.精製したHisタグを有さないヒトアルギナーゼI、4.CM陽イオン交換カラムのフロースルー。
図3に、精製したヒトアルギナーゼIのHPLC分析の結果を示す。
図2および3に示すように、上記のクロマトグラフィの手法により得られたアルギナーゼの純度は、90%を超える。
例3:ヒトアルギナーゼIの部位特異的変異形成(rhArgI)。
部位特異的な変異は、クイックチェンジ(QuickChange)部位特異的変異形成キット(ストラタジーン社)を用いて、ヒトアルギナーゼIのアミノ酸配列における位置45、168および303に導入した。野生型ヒトアルギナーゼを含む組み換えプラスミドpET30a−rhアルギナーゼI−Vは、テンプレートとして用いた。位置45、168および303におけるシステインをコード化するコドン(TGT)は、独立してアラニンをコード化するコドン(GCT)に変異し、結果として1つ、2つまたは3つの部位が変異した変異体となった。ヒトアルギナーゼIの部位45、168および303における置換コドンGCTの導入を目的とするプライマーを以下に示す。
ARG-m45(+):
5' GAGAAACTTAAAGAACAAGAGGCTGATGTGAAGGATTATGGGG 3'
ARG-m45(-):
5' CCCCATAATCCTTCACATCAGCCTCTTGTTCTTTAAGTTTCTC 3'
ARG-m168(+):
5' GATTCTCCTGGGTGACTCCCGCTATATCTGCCAAGGATATTG 3'
ARG-m168(-):
5' CAATATCCTTGGCAGATATAGCGGGAGTCACCCAGGAGAATC 3'
ARG-m303(+):
5' GTTGCAATAACCTTGGCTGCTTTCGGACTTGCTCGGG 3'
ARG-m303(-):
5' CCCGAGCAAGTCCGAAAGCAGCCAAGGTTATTGCAAC 3'
PCRは、変異形成キットで与えられる指示どおりに行った。非変異の親DNAテンプレートは、制限エンドヌクレアーゼDpnIで消化した。変異プラスミドは、コンピテント細胞に形質転換し、配列により確認した。システインをコード化するコドン(TGT)からアラニンをコード化するコドン(GCT)への変異を含む変異アルギナーゼプラスミドで形質転換したクローンを選択し、LB培養液に広げた。標的とする変異プラスミドは、ウィザードプラスミニ準備キットを用いて分離した。
アミノ酸位置303、168または45でアラニン変異体となる1つのシステインを有する変異ヒトアルギナーゼIは、それぞれrhArgI−A303、rhArgI−A168またはrhArgI−A45と表される。アミノ酸位置168と303、アミノ酸位置45と303、およびアミノ酸位置45と168でアラニン変異体となる2つのシステインを有する変異ヒトアルギナーゼIは、それぞれrhArgI−A168/303、rhArgI−A45/303、およびrhArgI−A45/168と表される。アミノ酸位置45、168および303でアラニン変異体となる3つのシステインを有する変異ヒトアルギナーゼIは、rhArgI−A45/168/303と表される。上記アルギナーゼ変異挿入断片を含むプラスミドは、pET30a(+)−rhArgI−A303、pET30a(+)−rhArgI−A168、pET30a(+)−rhArgI−A45、pET30a(+)−rhArgI−A168/303、pET30a(+)−rhArgI−A45/303、pET30a(+)−rhArgI−A45/168、pET30a(+)−rhArgI−A45/168/303と表される。
100μlのコンピテントBL21(DE3)細胞は、氷上で解凍した。1μlの変異構成物をBL21(DE3)コンピテント細胞に加え、30分間氷上で培養した。その混合物は、42℃で90秒間ヒートショック処理をし、その後、2分間氷上で培養した。500μlのLB培養液を形質転換細胞に加え、37℃、150rpmで1時間振とう培養した。培養後、200μlの形質転換細胞の懸濁液を、カナミシンLB寒天平板上に平らに流し広げ、逆さまにして37℃で16時間培養した。
組み換えプラスミドで形質転換した1つのコロニーを選択し、25mlのLB培養液に移して、光学濃度600nm(OD600nm)が0.6〜0.8に達するまで、37℃、150rpmで振とう培養した。最終濃度0.2mMのIPTGを、標的たんぱく質の発現を3時間で誘発するようにその培養液に加えた。選択したクローンの標的タンパク質発現は、SDS−PAGEを用いて分析した。高度にタンパク質発現するクローンは、遺伝子操作バクテリアとしてグリセロールストックに保管した。
例4:部位特異的変異アルギナーゼIの発現およびタンパク質精製
変異アルギナーゼI(rhArgI)プラスミド(pET30a(+)−rhArgI−A303、pET30a(+)−rhArgI−A168、pET30a(+)−rhArgI−A45、pET30a(+)−rhArgI−A168/303、pET30a(+)−rhArgI−A45/303、pET30a(+)−rhArgI−A45/168またはET30a(+)−rhArgI−A45/168/303)で形質転換させた遺伝子操作大腸菌細胞は、15Lの発酵槽で流加培養した。OD600nmが12〜13に達したとき、最終濃度0.2mMのIPTGを、標的タンパク質の発現を3〜4時間で誘発するために培養液に加えた。バクテリア細胞は、集めて溶解した。その後のタンパク質の分離および精製のため、細胞ライセートは遠心分離され、その上澄み液は集められた。
標的タンパク質の精製は、CM陽イオン液体カラムを用いて行った。Tris−HClは、サンプルローディングの前にカラムを平衡にするために用いた。バクテリア細胞のライセート上澄み液をカラムにロードして、その後、弱く結合するまたは非特異的に結合する不純物を除去するために、カラム容量3個分の平衡バッファーで洗浄した。安定化したUV280nmを読み取るときに、標的タンパク質は、Tris−HClおよびNaClを含む溶離バッファーを用いて溶離した。カラムから溶離したタンパク質のピークは、変異アルギナーゼIのrhArgI−A303、rhArgI−A168、rhArgI−A45、rhArgI−A168/303、rhArgI−A45/303、rhArgI−A45/168およびrhArgI−A45/168/303を得るために集められた。
集めたタンパク質試料の純度は、SDS−APGEおよびHPLCで分析した。上記クロマトグラフィの手法を用いた場合、アルギナーゼの純度は90%を超えると測定された。
例5:部位特異的変異アルギナーゼI(rhArgI)の活性
アルギナーゼの活性は、ウレアーゼおよびグルタミン酸脱水素酵素を組み合わせた分光光度分析によって測定し、それを以下の模式図に示した。NADPHは、波長340nmに光吸収を有する。NADPHが酸化してNaDP+となると、340nmにおける吸収は減少する。アルギナーゼの活性は、NADPH(ΔE340=6220M−1cm−1)のモル吸光係数とともに、340nmにおける吸収の減少量を監視することで、相関付けて測定できる。
Figure 2015503912
アルギナーゼ活性の1単位(U)は、30℃、pH8.3の条件で、1μmolの尿素を放出することと定義した。
アルギナーゼの比活性は、下記式を用いて算出した。
比活性 (U/mg)=[(ΔA/Δt)×(1/ε)×10×(1/2)]/[E]
ΔA=340nmにおける吸光度の差
ε=NADPHミカエリスメンテン定数(Km)(6220M−1cm−1
[E]=反応混合液における酵素濃度(mg/mL)
上記の分析評価を用いると、さまざま変異アルギナーゼI(rhArgI−A303、rhArgI−A168/303、rhArgI−A45/303、rhArgI−A45/168およびrhArgI−A45/168/303)の比活性は、それぞれ、747±63U/mg、814±91U/mg、786±58U/mg、782±19U/mgおよび759±68 U/mgと測定された。野生型ヒトアルギナーゼIの比活性は491±42U/mgと測定され、位置168/303、45/303、45/168および45/168/303にある非極性非イオン性アミノ酸システインが非極性アミノ酸アラニンに変異した後に、アルギナーゼの活性が著しく増加することを説明している。
例6:野生型および変異アルギナーゼI(rhArgI)のSDS−PAGE分析
ポリアクリルアミドゲルは、従来の方法を用いて調製した。試料は、分析の前に還元条件(つまり、ジスルフィド分子間の結合またはその分子内結合を壊すために、β−メルカプトエタノールはサンプルローディングバッファーに含有される)または非還元条件件下で処理し、12%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、野生型およびさまざまな変異アルギナーゼIの分子内ジスルフィド架橋構造を解読した(図4、5、6a、6b)。
図4に、還元条件および非還元条件下で処理した後の野生型アルギナーゼIのSDS−PAGE分析の結果を示す。各レーンの試料は以下のとおりである。レーン1および3:バクテリア細胞ライセートの上澄み液、レーン2:精製したHisタグを有さないアルギナーゼ(非還元)、M:タンパク質分子量標準、レーン4:精製したHisタグを有さないヒトアルギナーゼI(還元)。
図5に、還元条件および非還元条件下での、精製した変異アルギナーゼI(rhArgI−A303、rhArgI−A168/303およびrhArgI−A45/303)のSDS−PAGE分析の結果を示す。各レーンの試料は以下のとおりである。レーン1:変異アルギナーゼI、rhArgI−A303(非還元)、レーン2:変異アルギナーゼI、rhArgI−A168/303(非還元)、レーン3:変異アルギナーゼI、rhArgI−A45/303(非還元)、M:タンパク質分子量標準、レーン4:変異アルギナーゼI、rhArgI−A303(還元)、レーン5:変異アルギナーゼI、rhArgI−A168/303(還元)、レーン6:変異アルギナーゼI、rhArgI−A45/303(還元)。
図6aに、非還元条件下での精製した変異アルギナーゼI(rhArgI−A45/168およびrhArgI−A45/168/303)のSDS−PAGE分析の結果を示す。各レーンの試料は以下のとおりである。M:タンパク質分子量標準、レーン1:変異アルギナーゼI、rhArgI−A45/168/303、レーン2:rhArgI−A45/168。
図6bに、還元条件下での精製した変異アルギナーゼI(rhArgI−A45/168およびrhArgI−A45/168/303)のSDS−PAGE分析の結果を示す。各レーンの試料は以下のとおりである。M:タンパク質分子量標準、レーン1:変異アルギナーゼI、rhArgI−A45/168/303、レーン2:rhArgI−A45/168。
還元条件および非還元条件下でのアルギナーゼIのSDS−PAGE分析から、野生型ヒトアルギナーゼIは、本発明における所定の実験条件下では、他のコンホメーションを有すること明らかになった。そのような条件下では、位置303のシステインが変異してアラニンとなる場合、他のコンホメーションも存在した。しかしながら、アミノ酸の位置45、168および303にある3つのシステイン残基のうち2つ(rhArgI−A168/303、rhArgI−A45/303またはrhArgI−A45/168)または全部のいずれかが、アルギナーゼに変異した場合、非還元条件下では1つのコンホメーションのみが検出された(図5および図6a)。既知の理論に何ら制限されるものではないが、非還元SDS−PAGEにおける野生型ヒトアルギナーゼIの多数のコンホメーションの存在は、所定条件下でのシステイン45、168および303によりもたらされた分子内ジスルフィド結合の形成によるものだと考えられる。システイン303のみがアラニンに変異した場合には、未変異のシステイン45および168間の分子内ジスルフィド結合の形成により、そのようなコンホメーションのアルギナーゼI変異も、非還元条件下でのSDS−PAGEにより検出されると発明者は考えている。位置45、168および303の3つのシステイン残基のうち2つまたは全部のいずれかが変異した場合(rhArgI−A168/303、rhArgI−A45/303、rhArgI−A45/168またはrhArgI−A45/168/303)、ジスルフィド結合の形成のすべての可能性がなくなり、SDS−PAGE分析では1つのコンホメーションのみが検出される。
例7:変異アルギナーゼI(rhArgI)のPEG化およびPEG化タンパク質の精製
(1)メトキシポリエチレングリコールマレイミドを用いたPEG化(mPEG−MAL 40000)。
部位特異的変異アルギナーゼI(rhArgI−A303/168またはrhArgI−A45/303)は、20mMのPBSバッファー(pH7.0)中のモル比の範囲1:5〜1:10で、メトキシポリエチレングリコールマレイミドとそれぞれ混合した。上記メトキシポリエチレングリコールマレイミドは、分子量4kDaの2つのポリエチレングリコール鎖からなるY字状の枝分かれである。PEG化反応は、室温で2〜4時間行った。反応の最後には、最終生成物を4℃の冷蔵庫に保管した。
部位特異的PEG化ヒトアルギナーゼIは、残存する未反応のタンパク質およびPEGを除去するため、マクロ(Macro)SPマトリックス陽イオン交換カラムを用いて分離、精製した。リン酸バッファーおよびリン酸バッファーを含むNaCl(1M)は、それぞれ平衡バッファーおよび溶離バッファーとして用いた。サンプルローディングの前に、PEG化タンパク質の試料は、試料の電気伝導度が平衡バッファーと同じになるまで蒸留水で希釈し、カラムは、カラム容量の5倍の平衡バッファーで平衡にした。サンプルローディングの後、カラムはさらにカラム容量の5倍の平衡バッファーで洗浄し、35%溶離バッファーで溶離した。タンパク質ピークを含む溶離液は、集めてG25カラムを用いて脱塩した。標的とするタンパク質は集めてSDS−PAGEで分析した。
(2)メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート(mPEG−SPA 5000)を用いたタンパク質のPEG化およびPEG化タンパク質の精製。
野生型およびさまざまな部位特異的変異アルギナーゼI(rhArgI−A303/168、rhArgI−A303/45、rhArgI−A45/168およびrhArgI−A45/168/303)のPEG化修飾を行った。反応条件は以下のとおりである。野生型またはさまざまな部位特異的変異アルギナーゼIは、タンパク質濃度は8mg/mlであり、それぞれ、20mKのPBSバッファー(pH8.5〜9.0)中のモル比の範囲が1:20〜1:30となるように、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート(mPEG−SPA 5000)を室温で2時間混合した。最終生成物は4℃の冷蔵庫で保管した。
上記PEG化生成物は、100KDaの限外濾過膜で限外濾過することで精製し、未反応のメトキシポリ(エチレングリコール)スクシンイミジルプロピオナートを除去した。PEG化生成物は、1:1の体積比で10mMのPBSバッファー(PH7.5)を混合し、元の体積になるように限外濾過した。この工程は15回繰り返し、標的タンパク質を集めて電気泳動により分析した。
(3)PEG化ヒトアルギナーゼIのSDS−PAGEおよび酵素活性分析
精製したmPEG−MAL−40KのPEG化アルギナーゼIおよびmPEG−SPA−5KのPEG化アルギナーゼIは、溶解して、8%SDS−PAGEで分析した。
その結果を図7に示す。
図7:PEG化アルギナーゼIのSDS−PAGE分析。各レーンの試料は以下のとおりである。
M:タンパク質分子量標準
RP−V−J5K:組み換え野生型アルギナーゼIは、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート(mPEG−SPA 5000)と反応させた。PEG化ヒトアルギナーゼI(RP−V−J5K)は、100kDaの限外濾過膜を用いて精製し、純度は95%を超える。
RP−M2−J5K:部位特異的変異アルギナーゼI(rhArgI−A168/303)は、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート(mPEG−SPA 5000)と反応させた。PEG化ヒトアルギナーゼI(RP−M2−J5K)は、100kDaの限外濾過膜を用いて精製し、純度は95%を超える。
RP−M3−J5K:部位特異的変異アルギナーゼI(rhArgI−A45/303)は、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート(mPEG―SPA 5000)と反応させた。PEG化ヒトアルギナーゼI(RP−M3−J5K)は、100kDaの限外濾過膜を用いて精製し、純度は95%を超える。
RP−M4−J5K:部位特異的変異アルギナーゼI(rhArgI−A45/168/303)は、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート(mPEG−SPA 5000)と反応させた。PEG化ヒトアルギナーゼI(RP−M4−J5K)は、100kDaの限外濾過膜を用いて精製し、純度は95%を超える。
RP−M7−J5K:部位特異的変異アルギナーゼI(rhArgI−A45/168)は、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート(mPEG−SPA 5000)と反応させた。PEG化ヒトアルギナーゼI(RP−M7−J5K)は、100kDaの限外濾過膜を用いて精製し、純度は95%を超える。
A168/303−Y40K:部位特異的変異アルギナーゼI(rhArgI−A168/303)は、Y字状に枝分かれしたポリエチレングリコールマレイミド40K(Y−MAL−40K)と反応させた。PEG化ヒトアルギナーゼIは、マクロキャップ(Macrocap)SPマトリックス陽イオン交換カラムで精製した。システイン45における1つのPEG鎖Y−MAL−40Kと結合したPEG化アルギナーゼIタンパク質(A168/303−Y40K)は、全反応生成物の85%を超える。
A45/303−Y40K:部位特異的変異アルギナーゼI(rhArgI−A45/303)は、Y字状に枝分かれしたポリエチレングリコールマレイミド40K(Y−MAL−40K)と反応させた。PEG化ヒトアルギナーゼIは、マクロキャップ(Macrocap)SPマトリックス陽イオン交換カラムで精製した。システイン168における1つのPEG鎖Y−MAL−40Kと結合したPEG化アルギナーゼIタンパク質(A45/303−Y40K)は、全反応生成物の85%を超える。
前述した2つの分光光度分析を用いて、異なるPEG化ヒトアルギナーゼIの活性を、NADPHの吸収の変化により測定し決定した。試験結果は、PEG化生成物がアルギナーゼ活性を維持することを示しており、この中で、A168/303−Y40KおよびA45/303−Y40Kの比活性は、それぞれ551±68U/mgおよび595±41U/mgであり、一方で、RP−M2−J5K、RP−M3−J5K、RP−M4−J5KおよびRP−M7−J5Kの比活性は、それぞれ、726±66U/mg、747±72 U/mg、712±69U/mgおよび838±8U/mgであった。PEG化野生型ヒトアルギナーゼI(RP−V−J5K)の比活性は、537±55U/mgと測定された。
(4)PEG化ヒトアルギナーゼIの分子量分布分析
異なるPEG化方法を用いて異なる部位をPEG化したヒトアルギナーゼIは、試験試料の分子量分布を測定するために、マトリックス支援レーザー脱着/イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI−TOF−MS)により分析した。すべての実験は、飛行時間に基づき、試料を脱離させてイオン化する窒素レーザーを備えた、ブルカーダルトニクス社オートフレックス(商標)TOF/TOFシステムにより行った。この装置は、加速電位+20kVの陽イオン線型モードで操作した。
実験結果は図8および9に示した。
図8aは、PEG化アルギナーゼIのA168/303−Y40Kの質量分析の結果を示しており、A168/303−Y40Kの分子量は、およそ77kDaである。
図8bは、PEG化アルギナーゼIのA45/303−Y40Kの質量分析の結果を示しており、A45/303−Y40Kの分子量は、およそ77kDaである。
図8cに、PEG化アルギナーゼIのRP−V−J5Kの質量分析の結果を示す。
図8dに、PEG化アルギナーゼIのRP−M2−J5Kの質量分析の結果を示す。
図8eに、PEG化アルギナーゼIのRP−M3−J5Kの質量分析の結果を示す。
図8fに、PEG化アルギナーゼIのRP−M4−J5Kの質量分析の結果を示す。
図8gに、PEG化アルギナーゼIのRP−M7−J5Kの質量分析の結果を示す。
図9は、PEG化アルギナーゼIのRP−V−J5K、RP−M2−J5K、RP−M3−J5K、RP−M4−J5KおよびRP−M7−J5Kの連結したグラフを示しており、mPEG−SPA5000を用いたアルギナーゼIのPEG化は、分子量範囲65〜95kDaの生成物を生成し、すなわち、いずれのアルギナーゼI分子も、それぞれ分子量は5000の6〜12個のPEG分子と結合した。
例8:部位特異的PEG化ヒトアルギナーゼIの生体内の薬物動態学的および薬力学的分析
異なるPEG化ヒトアルギナーゼIの薬物動態学的および薬力学的特性は、SP(Sprague−Dawley)系ラットに対する投与量3mg/kgの1回の静脈内投与の後で評価する。これらの研究は、ファーマレガシーラボラトリーズ有限会社(上海)で行った。血清アルギナーゼおよびアルギニンの分析のために、血液試料は投与前、投与後2分、1時間、4時間、24時間、72時間、120時間、168時間および240時間後に採取した。およそ0.4mlの血液試料は、イソフルランによる麻酔後それぞれの時点における眼窩の静脈を採取し、2mlの遠心管に移した。試料は、4000g、15分間、4℃で遠心分離するまで、室温に30分間放置した。
アルギナーゼIの血清濃度は、シャンハイエクセルバイオロジー社製の定量的サンドイッチ酵素免疫測定キッドにより測定した。抗ヒトアルギナーゼIモノクローナル抗体は、ELISAプレートのウェルの表面に塗布した。ヒトアルギナーゼIの試料またはタンパク質標準は、それぞれELISAプレートのウェルの中に添加し(100μl/ウェル)、密封テープで覆い、37℃で90分間培養して、モノクローナル抗体とヒトアルギナーゼIとの間に免疫複合体が形成されるようにした。培養後、プレートは5回洗浄し、ウェルにウサギ抗ヒトアルギナーゼIポリクロナール抗体を添加した(100μl/ウェル)。再び密封テープで覆い、さらに37℃で60分間培養した。2回目の培養後、再びプレートを5回洗浄し、各ウェルにHRP結合ヤギ抗ウサギIgGを添加し(100μl/ウェル)、30分間共培養した。さらに5回洗浄した後、発色基質をウェルに添加し、暗所で10〜15分間培養した。停止液を各ウェルに添加し、よく混合した。450nmにおける光学濃度を、停止液を添加後10分以内に測定した。標準曲線は、回帰方程式における二次的な適切な方法を用いて作成し、各試料のアルギナーゼIの濃度は、測定したOD値を用いて算出した。PKパラメータは、ウィンノリン(WinnoLin)の無区画分析法を用いて導き出した。さまざまな構造の部位特異的PEG化ヒトアルギナーゼI、A168/303−Y40K、A45/303−Y40K、RP−M2−J5K、RP−M3−J5K、RP−M4−J5KおよびRP−M7−J5Kの半減期(T1/2)の値は、それぞれ、27.2±3.8時間、15.1±0.6時間、40.7±13.2時間、53.5±14.2時間、59.5±9.9時間および50.5±13.0時間であった。PEG化野生型ヒトアルギナーゼIのRP−V−J5Kの半減期(T1/2)は、43.8±4.4時間であった。
表1:ラットにPEG化ヒトアルギナーゼIを1回投与したときの薬物動態的パラメータ(平均±標準偏差、n=6)
Figure 2015503912
血清アルギニン濃度は、HPLC−質量分析(アジレント製、API4000の三連四重極MSと組み合わせた1200HPLC)を用いて測定した。ラット血清の一定分量を490μlの脱イオン水で希釈した。アセトニトリル(380μl)を添加して、20μlの希釈した血清試料と混合した。その混合物を14,000rpmで14分間遠心分離し、その上澄み液をLC−MS/MSにロードし分析した。HPCLは、ベヌシル(Venusil)社製HILIC/VH951002−0カラムで、移動相Aとして0.1%TFA、移動相Bとして95%アセトニトリルを用いて、流量0.3mL/分で測定した。血清アルギナーゼ濃度は、投与前、投与後2分、1時間、4時間、24時間、72時間、120時間、168時間および240時間後に測定した。結果は、試験試料は異なる方法でPEG化されているのだが、すべての試験動物における血清アルギニン濃度は、非常に短い時間(5分以内)で検出限界(0.5μl/ml)より低い濃度まで落ち、ある時間内は持続可能な低いアルギニン濃度を維持する。その後、血清アルギニン濃度は徐々に増加するが、その増加率は異なる。RP−M2−J5K、RP−M3−J5K、RP−M4−J5K、またはRP−M7−J5Kを扱う研究群と比較すると、168/303−Y40KまたはA45/303−Y40Kを扱う研究群は、血清アルギニン濃度はより速く上昇した。投与後72時間では、168/303−Y40KまたはA45/303−Y40Kを1回投与した動物において、血清アルギニン濃度は、投与前の濃度の15〜20%まで回復した。投与後120時間では、A45/303−Y40Kを投与した動物において、血清アルギニン濃度は、ほぼ投与前の濃度まで回復した。一方、RP−M2−J5K、RP−M3−J5K、RP−M4−J5KまたはRP−M7−J5Kを投与した動物の血清アルギニン濃度は、長時間、持続可能な低い濃度を維持していた。投与後72時間では、血清アルギニンは、投与前の濃度の5%より低い濃度を維持し続けていた。
本発明は、高い比活性を有するヒトアルギナーゼを得るために、ヒトアルギナーゼIの位置45、168および303の3つのシステイン残基のうち、1つ、2つまたは全部のいずれかを変異させて、他のアミノ酸、特に、アラニンにする部位特異的変異形成を用いる。本発明におけるヒトアルギナーゼは、潜在的に免疫原性のHisタグを有するタンパク質配列を含まない。さらに、本発明は、アミン反応性ポリ(エチレングリコール)を用いてPEG化したヒトアルギナーゼを提供し、リジン表面のN末端α−NHまたはε−NHを修飾する。そのような修飾は哺乳動物における半減期を著しく増加させ、ラットの血清では40〜60時間とすることができる。

Claims (14)

  1. アルギナーゼであって、
    上記アルギナーゼがSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含み、
    上記SEQ ID NO:1の位置45、168および303のシステインのうちいずれか1つ、2つまたは全部が非極性アミノ酸に変異しているアルギナーゼ。
  2. 位置45、168または303の上記システインが、独立してアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、好ましくは上記システインがアラニンに変異している、請求項1に記載のアルギナーゼ。
  3. (1)位置45、168および303の上記システインのうちいずれか1つが変異し、好ましくは、位置303の上記システインが変異し、さらに好ましくは、上記システインがアラニンに変異し、または
    (2)位置45、168および303の上記システインのうちいずれか2つが変異し、例えば、位置45および位置303の上記システイン、または位置168および位置303の上記システイン、または位置45および位置168の上記システインが変異し、好ましくは、上記システインがアラニンに変異し、または、
    (3)位置45、168および303の上記システインが変異し、好ましくは、上記システインがアラニンに変異している、
    請求項1または2に記載のアルギナーゼ。
  4. 上記アルギナーゼが少なくともおよそ500U/mgの活性を有し、好ましくは、その活性が少なくともおよそ700U/mgであり、さらに好ましくは、その活性が少なくともおよそ800U/mgである、請求項1〜3のいずれかに記載のアルギナーゼ。
  5. PEG化アルギナーゼであって、
    上記アルギナーゼが請求項1〜4のいずれかに規定したものであって、
    上記アルギナーゼがPEG化修飾によりポリエチレングリコール(PEG)と結合している、PEG化アルギナーゼ。
  6. 上記アルギナーゼ分子それぞれと結合するPEG分子の全分子量がおよそ20〜70K、好ましくは、全分子量がおよそ30から60Kである、請求項5に記載したPEG化アルギナーゼ。
  7. PEG分子が、およそ2〜40Kの平均分子量であり、好ましくは、平均分子量がおよそ5〜20kであり、さらに好ましくは、平均分子量がおよそ5Kである、請求項5または6に記載のPEG化アルギナーゼ。
  8. PEG化が、PEG化試薬を用いてPEG分子が上記アルギナーゼの半量と共有結合することによりなされ、
    上記PEG化試薬が、リジン表面のε−NHまたはタンパク質のN末端α−NHと結合し、タンパク質におけるアミノ酸のチオール基またはカルボキシル基と結合しているPEG化試薬を含み、好ましくは、上記PEG化試薬がメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート(mPEG−SPA)、mPEG−スクシンイミジルブチラート(mPEG−SBA)、mPEG−スクシンイミジルスクシナート(mPEG−SS)、mPEG−スクシンイミジルカーボナート(mPEG−SC)、mPEG−スクシンイミジルグルタラート(mPEG−SG)、mPEG−N−ヒドロキシル−スクシンイミド(mPEG−NHS)、mPEG−トレシラートおよびmPEG−アルデヒドから選択され、さらに好ましくは、上記PEG化試薬がメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナートであり、好ましくは、上記PEG化試薬がメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピナート5000である、請求項5〜7のいずれかに記載のPEG化試薬。
  9. (1)SEQ ID NO:1の上記アミノ酸配列における位置45、168および303の上記システインのうちいずれか2つが、独立してアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、好ましくは、上記システインがアラニンに変異し、
    アルギナーゼ分子に結合するPEG分子がおよそ5Kの平均分子量を有し、アルギナーゼ分子はそれぞれおよそ4〜13個のPEG分子と結合し、好ましくは、アルギナーゼ分子はそれぞれ6〜12分子と結合する、
    または、
    (2)SEQ ID NO:1の上記アミノ酸配列における位置45、168および303の上記システインが、独立してアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンに変異し、好ましくは、上記システインがアラニンに変異し、
    アルギナーゼ分子に結合するPEG分子がおよそ5Kの平均分子量を有し、アルギナーゼ分子はそれぞれおよそ4〜13個のPEG分子と結合し、好ましくは、アルギナーゼ分子はそれぞれ6〜12分子と結合する、
    請求項5〜7のいずれかに記載のPEG化アルギナーゼ。
  10. 上記アルギナーゼが、血液または血清中で、少なくとも0.5日間の半減期を有し、好ましくは、上記アルギナーゼが少なくとも2.5日間の半減期を有し、さらに好ましくは、上記アルギナーゼが少なくとも3.5日間の半減期を有する、請求項5〜9のいずれかに記載のPEG化アルギナーゼ。
  11. 請求項1〜4のいずれかに記載のアルギナーゼまたは請求項5〜10のいずれかに記載のPEG化アルギナーゼの調製方法。
  12. アルギナーゼ関連疾患を治療するための薬剤の調製における請求項1〜4のいずれかに記載のアルギナーゼまたは請求項5〜10のいずれかに記載のPEG化アルギナーゼの使用方法であって、好ましくは、上記疾患が高アルギニン血症、アルギニン依存性過形成または、肝臓癌、黒色腫、乳癌、肺小細胞癌、前立腺癌、リンパ腫または白血病のような腫瘍から選択される、使用方法。
  13. 請求項1〜5のいずれかに記載のアルギナーゼまたは請求項6〜10のいずれかに記載のPEG化アルギナーゼを含むアルギナーゼ関連疾患を治療するための医薬組成物であって、
    上記疾患が、高アルギニン血症、アルギニン依存性過形成または、肝臓癌、黒色腫、乳癌、肺小細胞癌、前立腺癌、リンパ腫または白血病のような腫瘍から選択される、医薬組成物。
  14. アルギニン関連疾患を治療するための方法であって、請求項1〜5のいずれかに記載のアルギナーゼまたは請求項6〜10のいずれかに記載のPEG化アルギナーゼを投与することを含み、好ましくは、上記疾患が、高アルギニン血症、アルギニン依存性過形成または、肝臓癌、黒色腫、乳癌、肺小細胞癌、前立腺癌、リンパ腫または白血病のような腫瘍から選択される、治療方法。
JP2014549336A 2011-12-27 2012-12-23 ヒトアルギナーゼおよびpeg化ヒトアルギナーゼとその使用方法 Pending JP2015503912A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110445965.8 2011-12-27
CN201110445965 2011-12-27
CN201210069626.9 2012-03-16
CN201210069626.9A CN103184209B (zh) 2011-12-27 2012-03-16 人精氨酸酶和聚乙二醇化人精氨酸酶及其应用
PCT/CN2012/087241 WO2013097658A1 (zh) 2011-12-27 2012-12-23 人精氨酸酶和聚乙二醇化人精氨酸酶及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2015503912A true JP2015503912A (ja) 2015-02-05

Family

ID=48675657

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014549336A Pending JP2015503912A (ja) 2011-12-27 2012-12-23 ヒトアルギナーゼおよびpeg化ヒトアルギナーゼとその使用方法
JP2014549335A Pending JP2015503333A (ja) 2011-12-27 2012-12-23 ヒトアルギナーゼおよび部位特異的peg化ヒトアルギナーゼとその使用方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014549335A Pending JP2015503333A (ja) 2011-12-27 2012-12-23 ヒトアルギナーゼおよび部位特異的peg化ヒトアルギナーゼとその使用方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20150010522A1 (ja)
EP (2) EP2799539B1 (ja)
JP (2) JP2015503912A (ja)
KR (2) KR102076348B1 (ja)
CN (2) CN103184208B (ja)
BR (2) BR112014015803B1 (ja)
WO (2) WO2013097658A1 (ja)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015165374A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Bio-Cancer Treatment International Limited Methods and compositions for modulating the immune system with arginase i
MY190411A (en) * 2015-05-15 2022-04-21 Medimmune Llc Improved uricase sequences and methods of treatment
CN105112391B (zh) * 2015-09-22 2018-07-06 浙江道尔生物科技有限公司 一种人源精氨酸酶突变体及其制备方法和用途
EP3419615A1 (en) 2016-02-23 2019-01-02 Cancer Research Technology Ltd. Dietary product devoid of at least two non essential amino acids
AU2018313253B2 (en) 2017-08-11 2024-09-26 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Truncated guinea pig L-asparaginase variants and methods of use
TW201910513A (zh) * 2017-08-16 2019-03-16 香港商鎧耀波麗堂(香港)有限公司 胺基酸耗竭治療的組合物及方法
CN107937375B (zh) * 2017-11-30 2018-10-02 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司 一种人的精氨酸酶突变蛋白及其应用
TW201924715A (zh) * 2017-12-05 2019-07-01 美商艾瑞思有限公司 用於治療精胺酸酶1缺乏症之方法及組合物
JP2021520828A (ja) * 2018-04-19 2021-08-26 キンドレッド バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 医療用の変異体アスパラギナーゼポリペプチド
TW202200210A (zh) * 2020-04-17 2022-01-01 香港商康達醫藥科技有限公司 使用精胺酸酶治療病毒感染之方法
US12109184B2 (en) 2020-06-04 2024-10-08 Faeth Therapeutics, Inc. Personalized methods of treating cancer
CN112110982B (zh) * 2020-09-24 2021-12-07 科兴生物制药股份有限公司 一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法
WO2022115350A1 (en) * 2020-11-30 2022-06-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Arginase 1 binders for inhibiting arginase 1 activity
WO2022115344A1 (en) * 2020-11-30 2022-06-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Arginase 1 binders for inhibiting arginase 1 activity
KR102612477B1 (ko) 2021-07-14 2023-12-11 남세엔터테인먼트 유한회사 스트리머의 디지털 입력을 전송하는 제어 시스템, 제어 방법 및 이를 컴퓨터로 읽을 수 있는 저장 매체
CN114350698B (zh) * 2021-11-30 2023-07-18 新泰市佳禾生物科技有限公司 人重组精氨酸酶i生产菌及其构建方法
CN116334057B (zh) * 2022-08-16 2024-07-19 北京理工大学 一种利用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物构建的酶组装体及其制备方法和应用
WO2024105276A1 (en) 2022-11-20 2024-05-23 Universität Zürich Combination of polyamine pathway inhibitor drug and proline/arginine diet restriction

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002534119A (ja) * 1999-01-14 2002-10-15 ボルダー バイオテクノロジー, インコーポレイテッド 自由システイン残基を有するタンパク質の生産方法
WO2004001048A1 (en) * 2002-06-20 2003-12-31 Bio-Cancer Treatment International Limited Pharmaceutical composition and method of treatment of human malignancies with arginine deprivation
JP2005538709A (ja) * 2002-06-20 2005-12-22 バイオ−キャンサー・トリートメント・インターナショナル・リミテッド アルギニンを欠乏させることによってヒト悪性腫瘍を治療する医薬品及び方法
US20100247508A1 (en) * 2009-03-26 2010-09-30 Yun Chung Leung Site-directed pegylation of arginases and the use thereof as anti-cancer and anti-viral agents

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1345966A (zh) * 2000-09-26 2002-04-24 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人精氨酸酶35.42和编码这种多肽的多核苷酸
BRPI0408946A (pt) * 2003-03-28 2006-04-04 Biopolymed Inc material biologicamente ativo conjugado com polìmero biocompatìvel com complexo 1:1, seu processo de preparação e composição farmacêutica compreendendo o mesmo
CN1745847A (zh) * 2004-09-08 2006-03-15 康达医药科技有限公司 用精氨酸酶治疗肝炎的药物组合物和方法
RU2008137226A (ru) * 2006-03-17 2010-04-27 Байо-Кэнсер Тритмент Интернэшнл Лимитид (Cn) Способ и композиция для защиты от радиации
ES2574139T3 (es) * 2008-10-31 2016-06-15 Aerase, Inc. Composiciones de arginasas humanas modificadas por ingeniería y métodos para tratar el cáncer
US9382525B2 (en) * 2009-03-26 2016-07-05 The Hong Kong Polytechnic University Site-directed pegylation of arginases and the use thereof as anti-cancer and anti-viral agents
US8679479B2 (en) 2009-06-29 2014-03-25 Aerase, Inc. Methods for purifying pegylated arginase

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002534119A (ja) * 1999-01-14 2002-10-15 ボルダー バイオテクノロジー, インコーポレイテッド 自由システイン残基を有するタンパク質の生産方法
WO2004001048A1 (en) * 2002-06-20 2003-12-31 Bio-Cancer Treatment International Limited Pharmaceutical composition and method of treatment of human malignancies with arginine deprivation
JP2005538709A (ja) * 2002-06-20 2005-12-22 バイオ−キャンサー・トリートメント・インターナショナル・リミテッド アルギニンを欠乏させることによってヒト悪性腫瘍を治療する医薬品及び方法
US20100247508A1 (en) * 2009-03-26 2010-09-30 Yun Chung Leung Site-directed pegylation of arginases and the use thereof as anti-cancer and anti-viral agents

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
小澤美奈子 他, タンパク質VII−タンパク質工学−, vol. 第1版, JPN6016023340, 1993, pages 58 - 406, ISSN: 0003342270 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2799540A4 (en) 2015-08-26
US9109218B2 (en) 2015-08-18
JP2015503333A (ja) 2015-02-02
KR20140107616A (ko) 2014-09-04
EP2799540B1 (en) 2017-10-11
BR112014015803A2 (pt) 2020-10-27
BR112014015820A2 (pt) 2020-10-27
US20150010522A1 (en) 2015-01-08
BR112014015803B1 (pt) 2023-03-07
BR112014015820B1 (pt) 2022-08-09
CN103184208A (zh) 2013-07-03
EP2799539B1 (en) 2017-09-13
EP2799540A1 (en) 2014-11-05
WO2013097657A1 (zh) 2013-07-04
WO2013097658A1 (zh) 2013-07-04
KR102076348B1 (ko) 2020-02-11
CN103184209B (zh) 2015-09-16
KR20140108577A (ko) 2014-09-11
US20140363417A1 (en) 2014-12-11
CN103184209A (zh) 2013-07-03
KR102076364B1 (ko) 2020-02-11
EP2799539A4 (en) 2016-05-25
EP2799539A1 (en) 2014-11-05
CN103184208B (zh) 2015-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2015503912A (ja) ヒトアルギナーゼおよびpeg化ヒトアルギナーゼとその使用方法
US11285128B2 (en) Homogenous antibody drug conjugates via enzymatic methods
RU2747581C2 (ru) Конъюгированные иммуноглобулины с c-концевым лизином
EP3524618B1 (en) Gla domains as targeting agents
Tan et al. Polyethylene glycol conjugation of recombinant methioninase for cancer therapy
AU2011212885B2 (en) Engineered enzymes with methionine-gamma-lyase enzymes and pharmacological preparations thereof
WO2022089605A1 (en) Modified red blood cells and uses thereof for delivering agents
EP4282876A1 (en) Uricase-albumin conjugate, preparation method therefor, and use thereof
CN117730143A (zh) 通过缀合的n-末端甘氨酸修饰的细胞及其用途
US10406214B2 (en) Propionyl-CoA carboxylase compositions and uses thereof
WO2023103963A1 (en) Modified cells and uses thereof for delivering agents
KR20240049312A (ko) Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소-알부민 접합체, 그 제조방법 및 그 용도
JP2022505689A (ja) 治療的使用のための、遺伝子操作された霊長類シスチン/システイン分解酵素
JP2021510683A (ja) インビボ持続放出性組換え凝固因子viii及びその調製方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20150918

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160621

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20160920

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20170321