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JP2002534119A - 自由システイン残基を有するタンパク質の生産方法 - Google Patents

自由システイン残基を有するタンパク質の生産方法

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JP2002534119A
JP2002534119A JP2000593732A JP2000593732A JP2002534119A JP 2002534119 A JP2002534119 A JP 2002534119A JP 2000593732 A JP2000593732 A JP 2000593732A JP 2000593732 A JP2000593732 A JP 2000593732A JP 2002534119 A JP2002534119 A JP 2002534119A
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エイチ． ドーアティ、ダニエル
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ボルダー バイオテクノロジー， インコーポレイテッド
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Application filed by ボルダー バイオテクノロジー， インコーポレイテッド filed Critical ボルダー バイオテクノロジー， インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、宿主細胞をシステインブロック剤に暴露する、自由システインを備えた可溶化タンパク質の新規な生産方法に関する。該方法によって生産された可溶化タンパク質はその有効性を増大させるべく修飾することが可能である。そのような修飾には、ＰＥＧ部分を取り付けてＰＥＧ化タンパク質を形成することが含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、一般的にはタンパク質の製造法、より特定的には、ジスルフィド結
合を形成していない「自由」システインを含む組換えタンパク質に関する。
【０００２】発明の背景 低コストの作用持続型「ユーザーフレンドリー」タンパク質製剤（ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃｓ）の開発には患者やヘルスケアプロバイダーから大きな関心が寄
せられている。タンパク質は、製造コストが高く、かつ、通常の小分子薬とは異
なり、一般に体内に吸収されにくい。さらにタンパク質は経口摂取すると消化さ
れる。したがって、タンパク質は、典型的には注射による投与を必要とする。注
射後、ほとんどのタンパク質は急速に体外に排泄されるので、頻繁に、多くの場
合毎日、注射する必要がある。患者は注射を嫌がり、その結果、注射の回数が減
り、薬効が低下する。エリスロポエチン（ＥＰＯ）などのある種のタンパク質は
、投与回数が少なくても（ＥＰＯの場合には毎週３回）有効であるが、これは、
それらのタンパク質がグリコシル化されるからである。グリコシル化には、哺乳
動物細胞発現系を用いて組換えタンパク質を製造する必要があるが、これには費
用がかかるので、タンパク質医薬品のコストが増大する。
【０００３】 したがって、患者やヘルスケアプロバイダーに対してタンパク質製剤のコスト
を低減させるタンパク質送出技術の開発が大いに求められている。この問題に対
する１つの解決法は、タンパク質を頻繁に注射しなくてすむように、体内におけ
るタンパク質製剤の循環半減期を延ばす方法を開発することである。また、この
解決法は、［ユーザーフレンドリー］タンパク質製剤、すなわち、頻繁に注射す
る必要の無いタンパク質製剤に対する患者の要求及び要望をも満足させる。
【０００４】 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によるタンパク質の共有結合修飾は、体内
におけるタンパク質の循環半減期を延ばす有用な方法であることが証明された（
Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，１９８４；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，１９８７；Ｍｅｙ
ｅｒｓら，１９９１）。タンパク質にＰＥＧを共有結合させると、タンパク質の
有効サイズが増大すると共に、タンパク質の体外へのクリアランス速度が低下す
る。ＰＥＧは数種のサイズで市販されており、異なるサイズのＰＥＧを用いるこ
とにより、ＰＥＧ修飾タンパク質の循環半減期を個々の適用に合わせることがで
きる。文献に記載されているＰＥＧ修飾の他のインビボ利点は、（タンパク質を
プロテアーゼから保護することによると考えられる）タンパク質の溶解度、安定
性の増大、及びタンパク質の免疫原性の低下である（Ｋａｔｒｅら，１９８７；
Ｋａｔｒｅ，１９９０）。
【０００５】 ＰＥＧ化タンパク質を得るための１つの公知方法は、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド（ＮＨＳ）−ＰＥＧなどの化合物を用いて、典型的にはリシン残基又はＮ
末端アミノ酸でＰＥＧを自由アミンに結合させる。この方法の重大な弱点は、通
常、タンパク質がＮ末端アミノ酸のほかに数個のリシンを含んでおり、ＰＥＧ部
分は任意の利用可能な自由アミンで非特異的にタンパク質に結合するために、不
均一な産物混合物が生成することである。多くのＮＨＳ−ＰＥＧ化タンパク質は
、比活性が低くかつ不均一性であるために商業用には不適である。不活化は、生
物活性に必要な１つ以上のリシン残基又はＮ末端アミノ酸を共有結合修飾するか
、又はタンパク質の活性部位近くでＰＥＧ部分を共有結合させた結果として生じ
る。
【０００６】 本出願に特に関連性があるのは、ＮＨＳ−ＰＥＧ試薬を含めたアミン反応性試
薬でヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を修飾すると、このタンパク質の生物活性が１
０分の１未満に低下するという知見である（Ｔｅｈ及びＣｈａｐｍａｎ，１９８
８；Ｃｌａｒｋら，１９９６）。ＧＨは下垂体から分泌される２２ｋＤａのタン
パク質である。ＧＨは、骨、軟骨及び筋肉の代謝を促進し、幼児期の身体成長を
促進する生体の主要ホルモンである。小児のＧＨ機能不全、ターナー症候群、腎
機能不全に起因する小人症（ｓｈｏｒｔ ｓｔａｔｕｒｅ）の治療には組換えヒ
トＧＨ（ｒｈＧＨ）が用いられる。ＧＨは、細菌中で産生させると、グリコシル
化されず、完全に活性である。このタンパク質はインビボでは半減期が短いので
、最大効力を得るためには毎日皮下注射により投与しなければならない（Ｍａｃ
Ｇｉｌｌｉｖｒａｙら，１９９６）。
【０００７】 作用持続型ｈＧＨの開発には大きな関心が寄せられている。ｈＧＨをアミン反
応性ＰＥＧ試薬でＰＥＧ化して作用持続型ｈＧＨを創出しようとする試みは、Ｐ
ＥＧ化すると生物活性が著しく低下してしまうためにあまり成功をおさめていな
い。さらに、ｈＧＨは多重部位でＰＥＧ化される（Ｃｌａｒｋら，１９９６）。
ｈＧＨは、Ｎ末端アミノ酸のほかに９個のリシンを含んでいる。これらのリシン
のいくつかは、受容体の結合に不可欠であることが知られているタンパク質領域
に位置している（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，１９８９；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及
びＷｅｌｌｓ，１９８９）。これらのリシン残基を修飾すると、ｈＧＨの受容体
結合及び生物活性が有意に低下する（ｄｅｌａ Ｌｌｏｓａら，１９８５；Ｍａ
ｒｔａｌら，１９８５；Ｔｅｈ及びＣｈａｐｍａｎ，１９８８；Ｃｕｎｎｉｎｇ
ｈａｍ及びＷｅｌｌｓ，１９８９）。ｈＧＨをＮＨＳ−ＰＥＧ試薬で修飾するの
は容易だが、ＮＨＳ−ＰＥＧタンパク質の生物活性がひどく低下し、５個の５ｋ
ＤａのＰＥＧ分子で修飾したＧＨタンパク質の場合には野生型ＧＨの生物活性の
わずか１％になってしまう（Ｃｌａｒｋら，１９９６）。この多重ＰＥＧ化ＧＨ
タンパク質のＥＣ50は、４４０ｎｇ／ｍｌすなわち約２０ｎＭである（Ｃｌａｒ
ｋら，１９９６）。ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨは、有意に低下した生物活性を有す
ることに加えて、ＰＥＧ分子の異なるメンバーが異なるアミノ酸残基でタンパク
質に結合するために極めて不均一性となり、それがこのタンパク質の潜在的治療
剤としての有用性に影響を与える。Ｃｌａｒｋら（１９９６）は、動物における
ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨの循環半減期を非修飾ＧＨに比べて有意に延長できるこ
とを証明した。ラットＧＨ欠失モデルでは、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨは、有意に
低下したインビトロ生物活性を有しているにもかかわらず有効であり、非修飾ｈ
ＧＨより投与回数を少なくすることができた（Ｃｌａｒｋら，１９９６）。しか
し、動物モデルで効力を得るためには、修飾タンパク質の比活性の低さから、高
用量のＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨ（ラット１匹当たり１回の注射毎に６０〜１８０
μｇ）が必要であった。より高い生物活性を保持するＰＥＧ化ｈＧＨタンパク質
を創出するさらに良い方法が必要なことは明らかである。また、均一なＰＥＧ−
ｈＧＨ産物を創出するようにｈＧＨをＰＥＧ化する方法の開発も必要である。
【０００８】 数種の他の重要な市販タンパク質の生物活性は、アミン反応性ＰＥＧ試薬によ
り有意に低下する。ＥＰＯは、タンパク質の生物活性に不可欠な数個のリシン残
基を含んでいる（Ｂｏｉｓｓｅｌら，１９９３；Ｍａｔｔｈｅｗｓら，１９９６
）が、ＥＰＯのリシン残基を修飾すると、生物活性がほぼ完全に失われる（Ｗｏ
ｊｅｈｏｗｓｋｉ及びＣａｓｌａｋｅ，１９８９）。αインターフェロン−２を
アミン反応性ＰＥＧで共有結合修飾すると、生物活性が４０〜７５％失われる（
Ｇｏｏｄｓｏｎ及びＫａｔｒｅ，１９９０；Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚら，１９９
５）。生物活性の喪失は、大型（例えば、１０ｋＤａ）ＰＥＧを用いると最大に
なる（Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚら，１９９５）。Ｇ−ＣＳｆをアミン反応性ＰＥ
Ｇで共有結合修飾すると、６０％を超える生物活性の喪失が生じる（Ｔａｎａｋ
ａら，１９９１）。ＩＬ−２をアミン反応性ＰＥＧで広範囲に修飾すると、９０
％を超える生物活性の喪失が生じる（Ｇｏｏｄｓｏｎ及びＫａｔｒｅ，１９９０
）。
【０００９】 第２の公知タンパク質ＰＥＧ化法は、システイン反応性ＰＥＧを用いてＰＥＧ
をシステイン残基に共有結合させる。種々の反応性基（例えば、マレイミド、ビ
ニルスルホン）を有する多くの高特異的システイン反応性ＰＥＧや種々のサイズ
のＰＥＧ（２〜４０ｋＤａ）が市販されている。これらのＰＥＧ試薬は、中性ｐ
Ｈでは、「自由」システイン残基、すなわち、ジスルフィド結合に関与していな
いシステイン残基に選択的に結合する。大部分のタンパク質のシステイン残基は
ジスルフィド結合に参加しているので、システイン反応性ＰＥＧを用いたＰＥＧ
化には利用できない。組換えＤＮＡ技術を用いたインビトロ突然変異誘発によっ
て、追加のシステイン残基をタンパク質のどこにでも導入することができる。新
たに付加された「自由」システインは、システイン反応性ＰＥＧを用いてＰＥＧ
分子を特異的に結合させるための部位として使うことができる。付加システイン
残基は、タンパク質のアミノ末端の前もしくはタンパク質のカルボキシ末端の後
に付加されるか、又はタンパク質の２個のアミノ酸の間に挿入されて、タンパク
質中に存在するアミノ酸の代替物となり得る。あるいは、天然型（ｎａｔｉｖｅ
）ジスルフィド結合に関与する２個のシステインのうちの１個を欠失させるか又
は別のアミノ酸と置き換えて、天然型システイン（通常なら、欠失又は置換され
たシステイン残基と一緒にジスルフィド結合を形成しているタンパク質中のシス
テイン残基）を自由にして、化学修飾に利用できるようにしてもよい。システイ
ンと置換されるアミノ酸は、セリン又はアラニンなどの中性アミノ酸であるのが
好ましい。成長ホルモンは２個のジスルフィド結合を有しており、これらのジス
ルフィド結合は、生物活性に影響を与えることなく、ヨードアセトイミドで還元
して、アルキル化することができる（Ｂｅｗｌｅｙら，１９６９）。４個のシス
テインはいずれも欠失又は別のアミノ酸による置換の適当な標的である。
【００１０】 数種の天然タンパク質は１個以上の「自由」システイン残基を含むことが知ら
れている。そのような天然タンパク質の例としては、ヒトインターロイキン（Ｉ
Ｌ）−２、βインターフェロン（Ｍａｒｋら，１９８４）、Ｇ−ＣＳＦ（Ｌｕら
，１９８９）及び塩基性繊維芽細胞増殖因子（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９２）が
挙げられる。ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ及びβインターフェロンが奇数のシステイン
残基を含んでいるのに対し、塩基性繊維芽細胞増殖因子は偶数のシステイン残基
を含んでいる。
【００１１】 しかし、自由システイン残基を含む組換えタンパク質の発現は、生理的条件下
では遊離スルフヒドリルの反応性のために問題が多かった。自由システインを含
む数種の組換えタンパク質がＥ．ｃｏｌｉなどの細菌中で細胞内タンパク質とし
て発現された。例としては、ＩＬ−２、βインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、塩基
性繊維芽細胞増殖因子などの天然タンパク質や、ＩＬ−２（Ｇｏｏｄｓｏｎ及び
Ｋａｔｒｅ，１９９０）、ＩＬ−３（Ｓｈａｗら，１９９２）、腫瘍壊死因子結
合タンパク質（Ｔｕｍａら，１９９５）、ＩＧＦ−Ｉ（Ｃｏｘ及びＭｃＤｅｒｍ
ｏｔｔ，１９９４）、ＩＧＦＢＰ−１（Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｅｒｇら，１９９７
）ならびにプロテアーゼネキシン及び関連タンパク質（Ｂｒａｘｔｏｎ，１９９
８）の人工設計システイン変異タンパク質がある。これらのタンパク質はすべて
細菌中で細胞内発現させると不溶性であった。不溶性タンパク質は、一連の変性
、還元、再折りたたみ手順を実施すると、天然型コンホメーションを再生するこ
とができる。これらのステップによって、細菌中でタンパク質を産生させる製造
プロセスの時間とコストが増大する。自由システイン残基を別のアミノ酸、例え
ばセリンに置き換えることにより、安定性と収率が改良されたＩＬ−２（Ｍａｒ
ｋら，１９８５）及びβインターフェロン（ＤｅＣｈｉａｒａら，１９８６）が
得られた。上記の余分なステップを排除するために、組換えタンパク質を可溶性
かつ生物学的活性形態で発現させることが望ましいであろう。
【００１２】 細菌中で可溶性組換えタンパク質を発現させる１つの公知方法は、これらのタ
ンパク質をペリプラズム空間又は培地中に分泌させる方法である。ＧＨなどのあ
る種の組換えタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズム中に分泌させると可溶性
の活性形態で発現するが、Ｅ．ｃｏｌｉ中で細胞内発現させると不溶性になるこ
とが知られている。分泌は、成長ホルモン又は他の目的タンパク質をコードする
ＤＮＡ配列をｓｔＩＩ（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら，１９８８）及びｏｍｐＡタンパク
質（Ｇｈｒａｙｅｂら，１９８４）由来のものなどの細菌シグナル配列をコード
するＤＮＡ配列と融合させることにより達成される。細菌中で組換えタンパク質
を発現させることは、組換えタンパク質の天然Ｎ末端を維持することができるの
で望ましい。組換えタンパク質を細胞内発現させるには、組換えタンパク質のア
ミノ末端にＮ末端メチオニンが存在することが必要である。メチオニンは、多く
のヒトタンパク質の成熟型のアミノ末端には通常存在していない。例えば、成熟
型ヒト成長ホルモンのアミノ末端アミノ酸はフェニルアラニンである。組換えタ
ンパク質を細菌中で効率的に発現させるためには、組換えタンパク質のアミノ末
端にアミノ末端メチオニンが存在しない場合、メチオニンをこの位置に付加しな
ければならない。典型的には、アミノ末端メチオニンの付加は、組換えタンパク
質をコードするＤＮＡ配列の前にＡＴＧメチオニンコドンを付加して行う。付加
されたＮ末端メチオニンは、特に組換えタンパク質が不溶性である場合、組換え
タンパク質から取り除かれないことが多い。ｈＧＨの場合がこれにあたり、この
場合、タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で細胞内発現させるとＮ末端メチオニンは取
り除かれない。付加Ｎ末端メチオニンは、潜在的にヒトの免疫反応を促進し得る
「非天然」タンパク質を生成する。これに反し、ｓｔＩＩ（Ｃｈａｎｇら，１９
８７）又はｏｍｐＡ（Ｃｈｅａｈら，１９９４）シグナル配列を用いてペリプラ
ズム空間中に分泌されるｈＧＨには付加メチオニンは存在せず、組換えタンパク
質は、天然型アミノ末端アミノ酸フェニルアラニンから始まる。天然型ｈＧＨタ
ンパク質配列は、ｓｔＩＩ（又はｏｍｐＡ）シグナル配列と成熟ｈＧＨタンパク
質の開始部分との間でｓｔＩＩ−ｈＧＨタンパク質（又はｏｍｐＡ−ｈＧＨタン
パク質）を切断する細菌酵素のために維持される。ペリプラズム空間は、ジスル
フィド結合の形成を促進する酸化的環境であると考えられているが、タンパク質
のジスルフィドイソメラーゼとウシ膵臓トリプシンインヒビターとを共発現させ
ると、Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズムからの正しく折りたたまれたタンパク質の収率
が６倍も増大した（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら，１９９６）。この結果は、ペリプ
ラズムタンパク質の折りたたみがときどき非能率的になることがあるので、タン
パク質を大規模生産するためには改良の余地があることを示唆しているといえよ
う。
【００１３】 ｈＧＨは、２個のジスルフィド結合を形成する４個のシステインを有している
。ｈＧＨは、ｓｔＩＩ又はｏｍｐＡシグナル配列を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉペリプ
ラズム中に分泌させることができる。分泌されたタンパク質は可溶性かつ生物学
的に活性である（Ｈｓｉｕｎｇら，１９８６）。ｈＧＨの主要分泌形態は、ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に基
づく見かけ分子量２２ｋＤａを有する単量体である。組換えｈＧＨは、浸透ショ
ック法（Ｋｏｓｈｌａｎｄ及びＢｏｔｓｔｅｉｎ，１９８０）を用いてペリプラ
ズム空間から単離することができるが、浸透ショック法は、選択的に、細胞内タ
ンパク質ではなくペリプラズムタンパク質を浸透ショック緩衝液中に放出する。
次いで、放出されたｈＧＨをカラムクロマトグラフィーにかけて精製する（Ｈｓ
ｉｕｎｇら，１９８６）。
【００１４】 自由システイン残基（５システイン；２Ｎ＋１）を含むｈＧＨ変異型を分泌さ
せるために類似の方法を試みたときに、組換えｈＧＨ変異型は、ｈＧＨ用に開発
された標準浸透ショック法及び精製法を用いて単離すると多量体や集塊を形成す
ることがわかった。浸透ショック溶解物中で非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うか
又はカラムクロマトグラフィーによるタンパク質精製中に、極くわずかな単量体
ＧＨ変異タンパク質を検出することができた。
【００１５】 αインターフェロン（ＩＦＮ−α２）も２個のジスルフィド結合を形成する４
個のシステイン残基を含んでいる。ＩＦＮ−α２は、ｓｔＩＩシグナル配列を用
いてＥ．ｃｏｌｉペリプラズム中に分泌させることができる（Ｖｏｓｓら，１９
９４）。分泌されたタンパク質は可溶性かつ生物学的に活性である（Ｖｏｓｓら
，１９９４）。ＩＦＮ−α２の主要分泌形態は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づく見か
け分子量１９ｋＤａを有する単量体である。分泌された組換えＩＦＮ−α２は、
カラムクロマトグラフィーにかけて精製することができる（Ｖｏｓｓら，１９９
４）。
【００１６】 自由システイン残基（５システイン；２Ｎ＋１）を含むＩＦＮ−α２変異型を
分泌させるために類似の方法を試みたとき、組換えＩＦＮ−α２変異型は、ＩＦ
Ｎ−α２用に開発された標準精製法を用いて単離すると、多量体及び集塊を形成
することがわかった。ＩＦＮ−α２変異型は、ＩＦＮ−α２とは極めて異なる態
様でカラムから溶出され、ＩＦＮ−α２用に開発されたカラムクロマトグラフィ
ー法を用いて、極くわずかな単量体ＩＦＮ−α２タンパク質を精製することがで
きた。
【００１７】 自由システイン残基を含むタンパク質の代替合成法は、翻訳後に、スクシンイ
ミジル６−［（３−２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート〔
ピアース ケミカル カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ）から市販されているＬＣ−ＳＰＤＰ〕との化学反応を経てチオール基を
タンパク質中に導入する方法である。ＬＣ−ＳＰＤＰはリシン残基と反応して遊
離スルフヒドリル基を生成する。この試薬をマレイミドタンパク質修飾試薬（Ｓ
ｙｔｋｏｗｓｋら，１９９８）と共に用いて、化学架橋された二量体ＥＰＯを調
製した。ＥＰＯ中の種々のリシン残基が非特異的に修飾されるために、精製後、
化学架橋ＥＰＯタンパク質のヘテロロガスな混合物が回収された。化学架橋ＥＰ
Ｏタンパク質の薬物動態学及びインビボ効力が強化されていることが観測された
。
【００１８】 タンパク質のサイズを増大させかつタンパク質のインビボ効力を高めるために
用いられている別の方法は、化学架橋試薬を用いてタンパク質を二量重合するこ
とを含む。ＧＨは、２個のＧＨ受容体を架橋させて細胞シグナルを形質導入する
と考えられている。ＧＨ−ＧＨ二量体は、受容体の二量重合の強化及びその後の
細胞内シグナルの増幅を促進し得る。
【００１９】 化学架橋二量体ｈＧＨタンパク質は、Ｍｏｃｋｒｉｄｇｅら（１９９８）によ
って記載されている。水溶性架橋試薬１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いてＧＨをランダムに誘導体化し、主生
成物としてアミド結合二量体を得たが、用いたＥＤＣ試薬の濃度によっては、ア
ミド結合多量体も生成した。最終タンパク質製剤は、インビボ効力の増強が観測
されたもの、ＥＤＣ試薬と、タンパク質中のリシン、アスパラギン酸及びグルタ
ミン酸残基ならびにアミノ末端及びカルボキシ末端を含めた種々のアミノ酸との
非特異的反応のために不均一であった。そのような製剤をヒトに注射することは
、ＥＤＣの毒性や、タンパク質間に形成された非天然アミド結合に対する免疫原
性応答の可能性のために望ましくないであろう。精製タンパク質のばらつきのな
いバッチを生成することも製造規模の点で困難であろう。
【００２０】 したがって、多大な努力が費やされたにもかかわらず、依然として、タンパク
質分子量を拡大することにより作用持続型組換えタンパク質の均一製剤を生成す
方法が必要とされている。また、自由システイン残基を含む組換えタンパク質を
高収率で分泌、回収し得る方法も必要である。本発明は、これらの要求を満たす
だけでなく、関連利点をも提供する。
【００２１】発明の要旨 本発明は、自由システインを有する可溶性タンパク質を得る方法に関する。本
発明の方法は、一般に、可溶性タンパク質を発現し得る宿主細胞を得るステップ
と、宿主細胞をシステインブロック剤に暴露するステップと、宿主細胞から可溶
性タンパク質を単離するステップとによって成就される。１つの実施態様におい
て、タンパク質は、宿主細胞によって培地中に分泌されるのではなく、システイ
ンブロック剤の存在下に宿主細胞を破壊し、破壊された宿主細胞の可溶性画分か
ら可溶性タンパク質を単離又は精製する。別の実施態様では、可溶性タンパク質
は宿主細胞によって培地中に分泌され、宿主細胞は、可溶性タンパク質の合成前
、合成時又は合成後にシステインブロック剤に暴露される。
【００２２】 適当な宿主細胞としては、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞が挙げられる
。宿主細胞は細菌細胞、特にＥ．ｃｏｌｉであるのが好ましい。 本発明の方法によって生産される可溶性タンパク質は、組換えタンパク質、特
に、タンパク質のシステイン変異型又は変異タンパク質である。本発明の方法は
、ヒト成長ホルモン、ＥＰＯ及びインターフェロン、特にαインターフェロン、
それらの誘導体又はアンタゴニストを含むがそれらには限定されないタンパク質
の生産に有用である。他のタンパク質には、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメ
ンバー、血小板由来増殖因子−Ａ、血小板由来増殖因子−Ｂ、神経成長因子、脳
由来神経栄養性因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、血管
内皮細胞増殖因子、又はそれらの誘導体もしくはアンタゴニストが含まれる。免
疫グロブリンのＨ鎖又はＬ鎖のシステイン変異タンパク質も企図される。
【００２３】 有用なシステインブロック剤としては、例えば、金属イオン存在下の、シスチ
ン、シスタミン、ジチオグリコール酸、酸化グルタチオン、ヨウ素、過酸化水素
、ジヒドロアスコルビン酸、テトラチオネート、Ｏ−ヨードソベンゾエート又は
酸素を含めた任意のチオール反応性化合物などがある。
【００２４】 さらに、本発明の方法は、ＰＥＧ部分を可溶性タンパク質に結合させて、ＥＰ
Ｇ部分が自由システインを介して可溶性タンパク質に結合しているＰＥＧ化タン
パク質を生成する種々の方法をも包含する。２個以上の可溶性タンパク質の共役
を含む高次多量体タンパク質も本発明の範囲内に含まれる。
【００２５】 さらに、本発明は、本明細書に開示されている方法によって製造されたＰＥＧ
化タンパク質を含めた可溶性タンパク質及びそれらの誘導体を包含する。そのよ
うなＰＥＧ化タンパク質としては、単ＰＥＧ化ｈＧＨ、ＥＰＯ及びαインターフ
ェロンがある。
【００２６】 また、本発明は、本明細書に記載の方法により得られた可溶性タンパク質をＰ
ＥＧ化する方法をも提供する。そのような方法は、タンパク質を精製するステッ
プと、ジスルフィド還元剤を用いてタンパク質を少なくとも部分的に還元するス
テップと、タンパク質をシステイン反応性部分に暴露するステップとを含む。場
合により、修飾システインタンパク質を非修飾タンパク質から分離することがで
きる。
【００２７】 成長ホルモン、ＥＰＯ及びαインターフェロンによって治療可能な症状を治療
する方法も本発明の範囲内に含まれる。可溶性タンパク質又はＰＥＧ化誘導体を
含めたそれらの誘導体を、公知の成長ホルモン、ＥＰＯ又はαインターフェロン
が有効である症状に罹患している患者に投与する。
【００２８】発明の説明 本発明は、自由システイン残基を有するタンパク質を得る新規方法を提供する
。さらに、本発明は、これらの新規方法によって生産された新規タンパク質、特
に組換えタンパク質と共に、そのような組換えタンパク質の誘導体をも提供する
。上記タンパク質を製造するための新規方法は、一般に （ａ） 自由システインを有するタンパク質を発現し得る宿主細胞を得るステッ
プと （ｂ） 宿主細胞をシステインブロック剤に暴露するステップと （ｃ） 宿主細胞からタンパク質を単離するステップ によって達成される。
【００２９】 １つの実施態様において、本発明の方法は、システインブロック剤の存在下に
宿主細胞を破壊するステップと、その後で、破壊された細胞の可溶性画分からタ
ンパク質を単離するステップとを含む。
【００３０】 タンパク質が原核生物又は真核生物宿主細胞によって培地中に分泌される他の
実施態様において、本発明の方法は （ａ） 自由システインを有するタンパク質を発現し得る宿主細胞を得るステッ
プと （ｂ） 宿主細胞を、自由システイン残基を有するタンパク質の合成時又は合成
後にシステインブロック剤に暴露するステップと （ｃ） 培地中の他の細胞成分からタンパク質を単離するステップ を含む。
【００３１】 上述のように、これらの方法の第１ステップは、自由システイン残基を有する
タンパク質を発現し得る宿主細胞を得ることである。適当な宿主細胞は、原核生
物細胞又は真核生物細胞であってよい。組換えタンパク質の発現に用い得る適当
な宿主細胞の例としては、細菌、酵母、昆虫及び哺乳動物の細胞がある。細菌細
胞、なかでもＥ．ｃｏｌｉが特に有用である。
【００３２】 本明細書に用いられている限りにおいて、用語「自由システイン残基を有する
タンパク質」とは、２Ｎ＋１個のシステイン残基（ここで、Ｎは０もしくは任意
の整数）を含む任意の天然又は組換えタンパク質ペプチド、及び２Ｎ個のシステ
イン（ここで、通常、２個以上のシステインはジスルフィド結合に参加していな
い）を含むタンパク質又はペプチドを意味する。したがって、本発明の方法は、
自由システインを有する任意のタンパク質又はペプチド、特に、１個以上の自由
システインを有するか及び／又は天然ではジスルフィド結合を形成している２個
以上のシステインを有する（本明細書では、「システイン変異タンパク質」もし
くは「システイン変異型」と称される）システイン付加変異組換えタンパク質の
発現、回収及び精製の強化に有用である。本発明の方法により、天然宿主細胞が
発現する自由システインを有する天然タンパク質の発現、回収及び精製を強化す
ることもできるが、本明細書の説明は、主として例証目的のみのために、組換え
タンパク質に言及している。さらに、組換えタンパク質は、ヒト、ペット動物及
び家畜を含めた任意の動物種由来であってよい。
【００３３】 したがって、本発明は多様な組換えタンパク質を包含する。これらのタンパク
質には、グリア由来神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）、トランスフォーミング増殖因
子−β１（ＴＧＦ−β１）、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、インヒビンＡ、イン
ヒビンＢ、骨形態形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）、ＢＭＰ−４、インヒビン
α、ミューレル管抑制物質（ＭＩＳ）、ＯＰ−１（骨原性タンパク質−１）が含
まれるがそれらには限定されず、これらはすべて、ＴＦＧ−βスーパーファミリ
ーのメンバーである。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの単量体サブユニットは、
ある種の構造的特徴を共有している。これらの単量体サブユニットは、一般に、
４個の分子内ジスルフィドを形成する高度に保存された８個のシステイン残基を
含んでいる。典型的には、保存された９番目のシステインは、単量体形態のタン
パク質中では自由であるが、単量体サブユニットのホモ二量重合又はヘテロ二量
重合時に形成される細胞間ジスルフィド結合に参加する。ＴＧＦ−βスーパーフ
ァミリーの他のメンバーは、Ｍａｓｓａｇｕｅ（１９９０）、Ｄａｏｐｉｎら（
１９９２）、Ｋｉｎｇｓｌｅｙ（１９９４）、Ｋｕｔｔｙら（１９９８）及びＬ
ａｗｔｏｎら（１９９７）によって記載されており、これらの文献は本明細書に
文献援用される。
【００３４】 免疫グロブリンのＨ鎖単量体及びＬ鎖単量体も、細胞内ジスルフィドに参加す
るシステイン残基と共に自由システインを含んでいる（Ｒｏｉｔｔら，１９８９
及びＰａｕｌ，１９８９）。これらの自由システインは、通常、Ｈ鎖ホモ二量重
合、Ｈ鎖−Ｌ鎖ヘテロ二量重合、（Ｈ鎖−Ｌ鎖）へテロ二量体のホモ二量重合な
どの多量重合事象や、ＩｇＭの場合における（Ｈ鎖−Ｌ鎖）へテロ二量体の五量
重合などの高次アセンブリーの結果としてジスルフィド結合に参加するに過ぎな
い。したがって、本発明の方法は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、
ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌性ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＥなどのヒト免疫
グロブリンのＨ鎖及び／もしくはＬ鎖（又はそれらの種々のドメイン）の発現、
回収及び精製の強化に用いることができる。他の種由来の免疫グロブリンも同様
に、発現、回収、精製し得る。Ｃｈａｍｏｗ ＆ Ａｓｈｋｅｎａｚｉ（１９９
６）に記載されているような免疫グロブリン又は免疫グロブリンドメインに遺伝
子融合されたタンパク質も同様に、発現、回収、精製することができる。
【００３５】 本発明の方法は、成長ホルモンスーパーファミリーのメンバーを含めた追加の
組換えタンパク質の発現、回収、精製を強化することもできる。以下のタンパク
質は、成長ホルモン（ＧＨ）スーパー遺伝子ファミリー〔Ｂａｚａｎ（１９９０
）；Ｂａｚａｎ（１９９１）；Ｍｏｔｔ及びＣａｍｐｂｅｌｌ（１９９５）；Ｓ
ｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ及びＩｈｌｅ（１９９６）；Ｍａｒｔｉｎら（１９９０
）；Ｈａｎｎｕｍら（１９９４）〕の遺伝子によってコードされる：成長ホルモ
ン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボ
ポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４
、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−
１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチンＭ、毛
様体神経栄養性因子、白血病抑制因子、αインターフェロン、βインターフェロ
ン、γインターフェロン、Ωインターフェロン、τインターフェロン、顆粒球コ
ロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ
−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、カルジオトロフ
ィン−１（ＣＴ−１）、幹細胞因子及びｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド（「ＧＨス
ーパー遺伝子ファミリー」）。遺伝子クローニング及びシーケンシングによって
、将来、この遺伝子ファミリーの追加のメンバーが同定されると予想される。Ｇ
Ｈスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、一般に限られたアミノ酸又はＤＮＡ
配列同一性しか有していないという事実にもかかわらず、類似した二次及び三次
構造を有している。構造的特徴を共有することにより、この遺伝子ファミリーの
新規なメンバーの同定が容易になる。
【００３６】 １群のタンパク質が、「シスチンノット」と称される共有構造モチーフに基づ
いて構造的スーパーファミリーとして分類されている。シスチンノットは、位相
的に「結ばれた」３個の細胞内ジスルフィド結合を形成する保存された６個のシ
ステイン残基によって規定されている（ＭｃＤｏｎａｌｄ及びＨｅｎｄｒｉｃｋ
ｓｏｎ，１９９３）。また、これらのタンパク質は、ホモ二量体又はヘテロ二量
体も形成し、場合によって、二量重合は、分子間ジスルフィドの形成を伴うこと
がある。このファミリーのメンバーには、ＴＧＦ−βスーパーファミリーや、血
小板由来増殖因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、ＰＤＧＦ−Ｂ、神経成長因子（ＮＧＦ
）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）
、ＮＴ−４、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などの他のタンパク質が含
まれる。システイン及び他のシステインブロック試薬も、この構造モチーフを有
するタンパク質の発現、回収、精製を強化することができる。
【００３７】 さらに、本発明の方法は、他の組換えタンパク質及び／又はそれらのタンパク
質のシステイン付加変異型の発現、回収、精製を強化することもできる。タンパ
ク質群には、プロテアーゼや他の酵素、プロテアーゼ阻害剤、部位カイン、部位
カインアンタゴニスト、アレルゲン、ケモカイン、ゴナドトロピン、ケモタクチ
ン（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｎｓ）、脂質結合タンパク質、下垂体ホルモン、成長
因子、ソマトメダン（ｓｏｍａｔｏｍｅｄａｎｓ）、免疫グロブリン、インター
ロイキン、インターフェロン、可溶性受容体、ワクチン及びヘモグロビンが含ま
れる。タンパク質の特定の例としては、例えば、レプチン、インスリン、インス
リン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、スーパーオキシドジムスターゼ、カタラーゼ、
アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、繊維芽細胞増殖因子、アルギナーゼ、フェニル
アラニンアンモニア、アンギオスタチン、エンドスタチン、Ｆａｃｔｏｒ ＶＩ
ＩＩ、Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ、インターロイキン１受容体アンタゴニスト、プロテ
アーゼネキシン及び抗トロンビンＩＩＩが挙げられる。
【００３８】 ＰＥＧ化から利益を得る、したがって、システイン付加修飾の適当な候補とな
る他のタンパク質変異型としては、低溶解度又は凝集傾向を有するタンパク質も
しくはペプチド、タンパク分解を受けやすいタンパク質もしくはペプチド、機械
的安定性の改良を必要とするタンパク質もしくはペプチド、体外に急速に排泄さ
れるタンパク質もしくはペプチド、又は望ましくない免疫原性もしくは抗原性を
有するタンパク質もしくはペプチドが挙げられる。
【００３９】 所望の場合、天然タンパク質の変異タンパク質は、一般に、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１５巻：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編（１９９３）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，
Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ及びＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ら
編（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡに概説されているような部位特異的ＰＣＲベース突然変異誘発を用いて構築
することができる。典型的には、タンパク質のコード配列にタンパク質内の特定
の位置でアミノ酸がシステイン残基に置き換わるヌクレオチド変化を組み込むよ
うにＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを設計する。また、そのような突然変
異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーは、タンパク質のコード配列のカルボキ
シ末端又はアミノ末端に追加のシステイン残基１個を組み込むように設計するこ
ともできる。後者の場合、所望なら、１個以上の追加のアミノ酸残基を付加シス
テイン残基のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に組み込むこともできる。さ
らに、望ましい場合、タンパク質コード配列内の特定の位置に挿入変異としてシ
ステイン残基を組み込むようにオリゴヌクレオチドを設計し得る。この場合も、
１つ以上の追加のアミノ酸をシステイン残基と一緒に挿入してもよく、これらの
アミノ酸はシステイン残基のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に配置し得る
。
【００４０】 突然変異誘発性オリゴを得るための配列の選択は、所望のシステイン残基が配
置される位置及び有用な制限エンドヌクレアーゼ部位の近さによって決められる
。一般に、鋳型へのオリゴのアニーリングを促進するために、変異、すなわちミ
スマッチセグメントを、オリゴの真中近くに配置するのが望ましい。また、突然
変異誘発性オリゴは、適当なベクター中にすぐにクローニングし得る断片を生成
するようにＰＣＲ産物を切断し得るように、唯一の制限部位にわたるのが望まし
い。１例としては、変異タンパク質の発現に用い得るもの、又は変異遺伝子を切
り出して、直ぐにこの遺伝子を上記発現ベクター中にクローニングするのに都合
の良い制限部位を提供するものがある。一般に、突然変異誘発性オリゴは、８０
塩基長以下のものを用いるのが望ましく、３０〜４０塩基長であればなお好まし
い。変異部位と制限部位とは、合成オリゴヌクレオチドの合成に望ましい間隔よ
りもっと離れている場合がある。そのような場合には、ＰＣＲを何回も実施して
、ＰＣＲ産物が所望の有用な制限部位を含むか又は適切な位置に制限部位を組み
込むべく突然変異誘発の目標に設定された遺伝子を再設計もしくは再合成し得る
ように、ＰＣＲ産物の長さを増分延長させることができる。あるいは、いわゆる
「Ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ」（Ｂａｒｉｋ，Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１５巻，２７７−２８６ペー
ジ：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編（１９９３）Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）又は「Ｇｅｎｅ Ｓｐｌｉｃｉ
ｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｎｓｉｏｎ」（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ
．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１５巻，
２５１−２６１ページ：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編（１９
９３）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）（これらの
文献はどちらも本明細書に文献援用される）などの変型ＰＣＲ突然変異誘発プロ
トコルを用いてそのような突然変異を構築することもできる。
【００４１】 次いで、宿主細胞をシステインブロック剤に暴露する。１つの実施態様におい
て、ブロック剤は、細胞破壊時に存在し、好ましくは細胞を破壊する前に添加す
る。細胞破壊は、例えば、フレンチプレッシャーセル（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓ
ｓｕｒｅ Ｃｅｌｌ）などの機械的破壊、酵素消化、音波処理、ホモジナイゼー
ション、ガラスビーズ渦動（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）、界面活性剤処理、有機溶剤
、凍結融解、アルミナ又は砂による粉砕などによって実施し得る（Ｂｏｌｌａｇ
ら，１９９６）。
【００４２】 代替実施態様において、システインブロック剤は、宿主細胞が所望タンパク質
を発現するように誘導される前、間又は後に宿主細胞に暴露し得る。例えば、宿
主細胞は、システインブロック剤の存在下に培養してもよく、これは、培地中に
分泌されるタンパク質、例えばエリスロポエチンなどを発現させる場合に好まし
いであろう。あるいは、宿主細胞をシステインブロック剤に暴露する前又は暴露
しているときに、所望のタンパク質を、ペリプラズムもしくは培地中に分泌され
るタンパク質又は細胞質タンパク質として発現するように、宿主細胞を誘導して
もよい。細胞の起源に応じて、そのような発現を細胞質中で誘発させるか又は分
泌を誘導したりするために、例えば、以下の実施例に記載の方法を含めた当業に
おいて公知の方法を用いることができる。タンパク質をペリプラズム空間に輸送
するために多様なシグナルペプチドが用いられ、成功をおさめている。そのよう
なシグナルペプチドの例としては、ｏｍｐＡ、ｓｔＩＩ、ＰｈｏＡシグナル（Ｄ
ｅｎｅｆｉｅら，１９８９）、ＯｍｐＴ（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９６）、Ｌａ
ｍＢ及びＯｍｐＦ（Ｈｏｆｆｍａｎ及びＷｒｉｇｈｔ，１９８５）、β−ラクタ
マーゼ（Ｋａｄｏｎａｇａら，１９８４）、エンテロトキシン ＬＴ−Ａ、ＬＴ
−Ｂ（Ｍｏｒｉｏｋａ−Ｆｕｊｉｍｏｔｏら，１９９１）及びＳ．ａｕｒｅｕｓ
由来のプロテインＡ（Ａｂｒａｈｍｓｅｎら，１９８６）などの原核生物シグナ
ル配列がある。ある種のタンパク質の分泌を促進する多くの非天然合成シグナル
配列も当業者には公知である。
【００４３】 ペリプラズム中に分泌されるタンパク質の場合、浸透ショック処理を用いて宿
主細胞の外層膜を選択的に破壊し、ペリプラズムタンパク質を放出させることが
できる。浸透ショック緩衝液は、例えば、Ｈｓｉｕｎｇら（１９８６）に記載さ
れているか、又は以下の実施例に記載されている浸透ショック緩衝液及び手順を
含めた、当業では公知の任意のものであってよい。培地中に分泌されるタンパク
質の場合、培地は、細胞が発現してタンパク質を分泌している間、システインブ
ロック剤を含んでいるのが好ましい。システインブロック剤は、タンパク質分泌
後に培地に添加することもできるが、但しタンパク質の精製前に添加する。
【００４４】 システインブロック剤は、約０．１μＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で培地に
添加し得る。培地中のシステインブロック剤の濃度は、約５０μＭ〜約５ｍＭで
あるのが好ましい。
【００４５】 特定の定理に拘束されるのは本意ではないが、本発明の方法に用いられるシス
テインブロック剤は、「自由」システイン残基に共有結合して混合ジスルフィド
を形成することにより、自由システイン残基を安定化し、タンパク質の多量重合
及び集合を阻止すると考えられる。あるいは、浸透ショック緩衝液中の酸化剤の
存在は、タンパク質がペリプラズム空間に分泌された後で不完全変性が生じた場
合には、タンパク質の再折りたたみプロセスを増加させるかもしれない。しかし
、上述のように、ペリプラズムタンパク質の再折りたたみは非能率的になること
がある。この理由から、浸透ショック緩衝液にシステインを添加すると、たとえ
システインが通常はジスルフィド結合を形成するにしても、整数のシステイン残
基を含む組換えタンパク質の回収が増大すると考えられる。さらに、本発明者ら
は、細菌増殖時に発酵培地にシステイン又は類似化合物を添加するのは有利であ
ると考える。何故なら、細菌の外層膜が多孔質性であるために、これらの化合物
はペリプラズム中に拡散する筈だからである。タンパク質の折りたたみ及び自由
システインのブロッキングは、細胞の回収及び溶解の前に実施し得る。タンパク
質の早期安定化は、タンパク分解を防ぎ、組換えタンパク質の高回収率に寄与し
得る。
【００４６】 自由システインを含むタンパク質を安定化するシステインブロック剤として多
くのチオール反応性化合物を用いることができる。ブロック剤は、システインの
ほかに、シスタミン、ジチオグリコール酸、酸化グルタチオン、５，５′−ジチ
オビス（２−ニトロ安息香酸）（エルマン試薬）、ピリジンジスルフィドなどの
ジスルフィド結合を含む試薬、Ｒ−Ｓ−Ｓ−ＣＯ−ＯＣＨ3タイプの化合物、ジ
ホルミルシスチン、ジアセチルシスチン、ジグリシルシスチン、ジアラニルシス
チン、ジグルタミニルシスチン、シスチニルジグリシン、シスチニルジグルタミ
ン、ジアラニルシスチン二無水物、シスチンフェニルヒダントイン、ホモシスチ
ン、ジチオジプロピオン酸、ジメチルシスチンなどの他のシスチン誘導体、又は
、ジスルフィド交換反応を受け得る任意のジチオールもしくは化学物質をさらに
含み得る。混合ジスルフィドの製造には、スルフェニルハロゲン化物を用いても
よい。システイン付加タンパク質変異型の安定化に利用できる他のチオールブロ
ック剤としては、遊離チオールと可逆反応し得る化合物が含まれる。これらの作
用物質には、ある種の重金属塩又は亜鉛、水銀及び銀の有機誘導体が含まれる。
他のメルカプチド生成剤又は可逆的チオール反応性化合物が、Ｒ．Ｃｅｃｉｌ及
びＪ．Ｒ．ＭｃＰｈｅｅ（１９５９）ならびにＴｏｒｃｈｉｎｓｋｉｉ（１９７
１）により記載されている。
【００４７】 一般方法の最終ステップでは、所望のタンパク質を、可溶性細胞質画分、可溶
性ペリプラズム画分、又は培地の可溶性画分から回収及び精製する。培地、細胞
質画分、又はペリプラズム画分からタンパク質を回収及び精製する任意の方法を
用いることができる。このような回収法及び精製法（例えば、遠心分離、濾過、
透析、（分子ふるい分け手順を含む）クロマトグラフィーなどを含む）は当業者
に周知であるか、又は当業者により容易に決定される。所望のタンパク質を回収
及び精製するのに適した方法は、そのタンパク質の性質と意図した用途によって
ある程度決まる。
【００４８】 本発明は、適切に処理されている回収されたインターフェロンのパーセントを
著しく増加させる、可溶性インターフェロン、特にαインターフェロンを産生す
る新規の方法をさらに提供する。これらの方法は、インターフェロンを発現する
ことができる宿主細胞を、約５〜約６．５、好ましくは約５．５〜約６．５のｐ
Ｈ範囲で培養することを含む。高ｐＨを用いた公表済みの報告（Ｖｏｓｓら（１
９９４））でしか５０％の適切に処理されたインターフェロンが得られなかった
が、低ｐＨでの本発明の新たな方法を用いて約８０〜９０％が回収された。
【００４９】 単量体ｈＧＨシステイン変異型のいくつかが、これらのタンパク質を精製する
ために用いられたクロマトグラフィー手順の間にジスルフィド結合２量体ｈＧＨ
タンパク質を形成したことを発見した。システインをカラム緩衝液から除去した
場合に、ジスルフィド結合ｈＧＨ２量体は形成した。ジスルフィド結合２量体ｈ
ＧＨタンパク質は、このタンパク質を精製するために用いられたカラムクロマト
グラフィーステップの間に、単量体ｈＧＨタンパク質とは異なる挙動を示すので
、ジスルフィド結合２量体ｈＧＨタンパク質を精製するために新たな手順を開発
した。思いがけずに、ジスルフィド結合２量体ｈＧＨタンパク質はインビトロバ
イオアッセイにおいて生物学的に活性であることを発見した。生物学的に活性で
あり均一なジスルフィド結合２量体ｈＧＨタンパク質は新規である。従って、さ
らに、本発明は、これらの生物学的に活性であり均一なジスルフィド結合２量体
ｈＧＨタンパク質にも関する。以下の実施例で説明するように、３量体、４量体
などのさらに上位のマルチマーも意図される。
【００５０】 次いで、所望であれば、精製されたタンパク質をさらに処理することができる
。例えば、このタンパク質を、様々なシステイン反応性ＰＥＧ試薬を用いて自由
システイン部位でＰＥＧ化し、その後、単ＰＥＧ化タンパク質を精製することが
できる。用語「単ＰＥＧ化」は、タンパク質の特定部位での単一ＰＥＧ分子の共
有結合により修飾されたタンパク質を意味すると定義される。当業者に周知の任
意の方法（例えば、以下の実施例、特に、実施例１１に記載の方法を含む）を使
用することができる。
【００５１】 Ｂｒａｘｔｏｎ（１９９８）は、タンパク質のシステイン変異タンパク質、特
に、ＧＨ及びエリスロポエチンのシステイン変異タンパク質をＰＥＧ化する方法
を教示している。特に、Ｂｒａｘｔｏｎ（１９９８）は、システイン変異タンパ
ク質をＰＥＧ化するために用いられる緩衝液には還元剤が含まれるべきではない
ことを教示している。Ｂｒａｘｔｏｎ（１９９８）により示された還元剤の例は
、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）であ
る。同様の方法を用いて、ＧＨ、エリスロポエチン、及びαインターフェロンの
システイン変異タンパク質をＰＥＧ化すると、これらのシステイン変異タンパク
質はＰＥＧ化しないことを発見した。今や、これらの精製システイン変異タンパ
ク質の還元剤による処理が、これらのタンパク質のＰＥＧ化に必要とされること
が発見された。特定のどの理論にも縛られることを望まないが、本発明者らは、
混合ジスルフィドを還元し、自由システインがＰＥＧ試薬と反応できるようにタ
ンパク質中の自由システイン残基を暴露するために還元剤が必要とされると考え
ている。従って、本発明はまた、ＧＨ、エリスロポエチン、αインターフェロン
、及び２Ｎ＋１システイン残基を含有する他のタンパク質、２Ｎシステイン残基
を含有するタンパク質（２Ｎシステイン残基の２つ以上が自由である）のシステ
イン変異タンパク質（特に、自由システイン残基が混合ジスルフィドによりブロ
ックされている変異タンパク質及びタンパク質）をＰＥＧ化する方法に関する。
【００５２】 さらに、本発明は、本明細書中に開示された方法により産生された精製単ＰＥ
Ｇ化タンパク質変異型に関する。前記変異型は、生物学的に活性であるだけでな
く、タンパク質依存性哺乳動物細胞増殖アッセイにおいて高い比活性を保持して
いる。このようなタンパク質変異型として、例えば、以下の精製された単ＰＥＧ
化システイン変異タンパク質：ｈＧＨ、ＥＰＯ、及びαＩＦＮが挙げられる。例
えば、単ＰＥＧ化ｈＧＨ変異型のインビトロ生物活性は、ＮＨＳ−ＰＥＧ試薬を
用いてＰＥＧ化されているｈＧＨの生物活性より１０〜１００倍高い。
【００５３】 単ＰＥＧ化ｈＧＨの１つの実施態様では、ポリエチレングリコールをｈＧＨの
Ｃ−Ｄループに接着させ、結果として生じた単ＰＥＧ化ｈＧＨは、約１１０ｎｇ
／ｍｌ（５ｎＭ）未満の、好ましくは、約５０ｎｇ／ｍｌ（２．３ｎＭ）未満の
ＥＣ50を有する。あるいは、ポリエチレングリコール部分をｈＧＨのへリックス
Ａに近接する領域に接着させることができ、結果として生じる単ＰＥＧ化ｈＧＨ
は、約１１０ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）未満の、好ましくは約１１ｎｇ／ｍｌ（０．
５ｎＭ）未満の、より好ましくは約２．２ｎｇ／ｍｌ（０．１ｎＭ）未満のＥＣ 50 を有する。
【００５４】 単ＰＥＧ化ＥＰＯの１つの実施態様では、ポリエチレングリコールをＥＰＯの
Ｃ−Ｄループに接着させ、結果として生じた単ＰＥＧ化ＥＰＯは、約１０００ｎ
ｇ／ｍｌ（２１ｎＭ）未満の、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ（約６ｎＭ）未満
の、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ（約０．６ｎＭ）未満の、最も好ましくは
約１ｎｇ／ｍｌ（約０．０６ｎＭ）未満のＥＣ50を有する。あるいは、ポリエチ
レングリコール部分をＥＰＯのＡ−Ｂループに接着させることができ、結果とし
て生じる単ＰＥＧ化ＥＰＯは、約１００ｎｇ／ｍｌ（約５ｎＭ）未満の、好まし
くは２０ｎｇ／ｍｌ（約１ｎＭ）未満の、より好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ（約０
．０５ｎＭ）未満のＥＣ50を有する。
【００５５】 単ＰＥＧ化αＩＦＮの１つの実施態様では、ポリエチレングリコールをαＩＦ
ＮのへリックスＡに近接する領域に接着させ、結果として生じた単ＰＥＧ化αＩ
ＦＮは、約１００ｐｇ／ｍｌ（約５ｐＭ）未満の、より好ましくは約５０ｐｇ／
ｍｌ（約２．５ｐＭ）未満の、最も好ましくは約２２ｎｇ／ｍｌ（約１．２ｐＭ
）未満のＥＣ50を有する。あるいは、ポリエチレングリコール部分をＩＦＮ−α
２のＣ−Ｄループに接着することができ、結果として生じる単ＰＥＧ化ＩＦＮ−
α２は、約１００ｐｇ／ｍｌ（約５ｐＭ）未満のＥＣ50を有する。
【００５６】 ２５を超える別個のＩＦＮ−α遺伝子がある（Ｐｅｓｔｋａ，１９８７）。Ｉ
ＦＮ−αファミリーのメンバーは様々な程度のアミノ酸相同性を有し、一部重複
する生物活性を示す。異なるＩＦＮ−αタンパク質の領域を結合することにより
作成された非天然組換えＩＦＮ−αは、様々な臨床開発段階にある（Ｈｏｒｉｓ
ｂｅｒｇｅｒ及びＤｉＭａｒｃｏ，１９９５）。ＩＦＮ−αの各位置で最もよく
見られるアミノ酸を組み込んでいる非天然「コンセンサス」インターフェロン（
Ｂｌａｔｔら，１９９６）もまた説明されている。ＩＦＮ−α２のシステイン変
異タンパク質をＰＥＧ化するのに適した部位は、ＩＦＮ−α遺伝子ファミリーの
他のメンバー及び非天然ＩＦＮ−αに直接適用できなければならない。Ｋｉｎｓ
ｔｌｅｒら（１９９６）は、単ＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンについて
述べた。ここで、このタンパク質は、Ｎ末端にある非天然メニオニン残基で選択
的に単ＰＥＧ化されている。ＰＥＧ化タンパク質の生物活性は、非修飾コンセン
サスインターフェロンと比較して約１／５に減少した（Ｋｉｎｓｔｌｅｒら，１
９９６）。
【００５７】 さらに、本発明は、互いに、又は化学基と共有結合又は結合して、上位のマル
チマー（例えば、２量体、３量体、及び４量体）を生成することができるタンパ
ク質変異型を提供する。このような上位のマルチマーは、当業者に周知の方法に
従って、又は以下の実施例１５に記載のように生成することができる。例えば、
このような結合は、対応する未変性タンパク質より大きな分子量を有するｈＧＨ
、ＥＰＯ、又はαＩＦＮ付加物を生成することができる。結合に適した化学基は
、好ましくは、無毒かつ非免疫原性の化学基である。これらの化学基として、炭
水化物又はポリオールなどのポリマーが挙げられる。
【００５８】 本発明のシステイン変異タンパク質に接着して、「ＰＥＧ化」タンパク質を形
成するのに有用な「ＰＥＧ部分」として、任意の適切なポリマー（例えば、直鎖
又は分枝鎖ポリオール）が挙げられる。好ましいポリオールは、エチレンオキシ
ド単位からなる合成ポリマーであるポリエチレングリコールである。分子ふるい
分けクロマトグラフィーにより約３０〜５００，０００の見かけの分子量を有す
るＰＥＧ化タンパク質変異型を得ることができるように、エチレンオキシド単位
は変化してもよい。ＰＥＧ部分のサイズは、その循環半減期に直接影響する（Ｙ
ａｍａｏｋａら（１９９４））。従って、特定の治療用途又は好ましい投与計画
のために、ＰＥＧ部分のサイズ又は構造を変えることにより、異なる循環半減期
を有するタンパク質変異型を作成することができる。従って、本発明は、分子ふ
るい分けクロマトグラフィーにより決定されるように約３０ｋＤａを超える、よ
り好ましくは約７０ｋＤａを超える見かけの分子量を有し、ＥＣ50が約４００ｎ
ｇ／ｍｌ（１８ｎＭ）未満、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）未満、より好
ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ（０．５ｎＭ）未満、さらにより好ましくは約２．２
ｎｇ／ｍｌ（０．１ｎＭ）未満である、ＧＨタンパク質変異型を含む。さらに、
本発明は、分子ふるい分けクロマトグラフィーにより決定されるように約３０ｋ
Ｄａを超える、より好ましくは約７０ｋＤａを超える見かけの分子量を有し、Ｅ
Ｃ50が約１０００ｎｇ／ｍｌ（２１ｎＭ）未満、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ（
６ｎＭ）未満、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ（０．６ｎＭ）未満、さらによ
り好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ（０．０６ｎＭ）未満である、ＥＰＯタンパク質変
異型を含む。さらに、本発明は、分子ふるい分けクロマトグラフィーにより決定
されるように約３０ｋＤａを超える、より好ましくは約７０ｋＤａを超える見か
けの分子量を有し、ＩＣ50が約１９００ｐｇ／ｍｌ（１００ｐＭ）未満、好まし
くは４００ｐｇ／ｍｌ（２１ｐＭ）未満、より好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ（
５ｎＭ）未満、さらにより好ましくは約３８ｐｇ／ｍｌ（２ｐＭ）未満である、
αＩＦＮ（ＩＦＮ−α）タンパク質変異型を含む。
【００５９】 システイン修飾のための反応性ＰＥＧ末端基として、ビニルスルホン、マレイ
ミド、及びヨードアセチル部分が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＧ
末端基は自由チオールに特異的であり、その反応がタンパク質に無害な条件下で
起こるべきである。
【００６０】 アンタゴニストｈＧＨ変異型はまた、化学的誘導体化が受容体結合を妨げない
が、シグナリングプロセスを阻害するシステイン付加変異型ＧＨを用いて調製す
ることができる。ＧＨアンタゴニストの投与によって利益を得る疾患として、先
端肥大症、血管性眼疾患、糖尿病性腎障害、血管形成術後の再狭窄、及び成長ホ
ルモン反応性悪性腫瘍などが挙げられる。
【００６１】 本明細書中で使用する用語「誘導体」は、本方法により発現及び回収されたタ
ンパク質の任意の変異型を意味する。このような変異型として、ＰＥＧ化バージ
ョン、２量体及び上位の変異型、アミノ酸変異型、融合タンパク質、炭水化物の
変化、リン酸化又は天然タンパク質で見られる他の付着基、及び本明細書中に開
示される他の任意の変異型が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】 本発明により産生される化合物は、様々なインビトロ及びインビボでの用途に
用いることができる。本発明のタンパク質及びその誘導体は、野生型、天然、又
は以前から知られている修飾された対応物について周知の研究、診断、又は治療
目的に用いることができる。インビトロでの用途として、例えば、本発明のタン
パク質を用いて、他のタンパク質をスクリーニング、検出、及び／又は精製する
ことが挙げられる。
【００６３】 治療用途のために、当業者は、適切な用量、投与回数、及び投与経路を容易に
決定することができる。このような決定を下す要因として、投与しようとするタ
ンパク質の性質、治療しようとする疾患、患者の服薬遵守の可能性、患者の年齢
及び体重などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物はまた、
身体内の特定の標的に付着するか、又は標的への送達を指向する、治療薬の循環
半減期を増すための送達ビヒクルとして使用することができる。
【００６４】 以下の実施例は制限するものとして意図されず、本発明の特定の実施態様を例
示するだけである。 実施例１ ヒト成長ホルモンのインビトロバイオアッセイの開発 ウサギＧＨ受容体で安定にトランスフェクトされたマウスＦＤＣ−Ｐ１細胞株
を用いるｈＧＨ細胞増殖アッセイを開発した（Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎら，１９９５
）。マウスＦＤＣ−Ｐ１細胞株をアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入
し、１０％ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプ
トマイシン、２ｍＭグルタミン、及び１７〜１７０単位／ｍｌマウスＩＬ−３を
添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＤＣ−Ｐ１培地）において日常的に増殖させ
た。
【００６５】 Ａ．ウサギＧＨ受容体をコードするｃＤＮＡのクローニング ウサギＧＨ受容体を、順方向プライマーＢＢ３（５’−ＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣ
ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＴＴ−３’）（配列
番号１）及び逆方向プライマーＢＢ３６（５’−ＣＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡ
ＧＡＧＣＣＡＴＴＡＧＡＴＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＴＧＧＧ−３’）（配列番号２
）を用いたＰＣＲによりクローニングした。ＢＢ３は、開始メチオニンと受容体
のアミノ末端部分をコードするＤＮＡ配列にアニールする。ＢＢ３は、開始メチ
オニンの前に最適化されたＫＯＺＡＫ配列と、クローニング用のＢａｍＨＩ部位
を含む。ＢＢ３６は、ウサギＧＨ受容体ｍＲＮＡの３’非翻訳領域にアニールし
、クローニング用のＸｂａＩ及びＳａｌＩ制限部位を含む。ＰＣＲ増幅用の鋳型
を生成するために、ウサギ肝臓ポリ（Ａ）+ｍＲＮＡ（クロンテック社（ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ，Ｉｎｃ）から購入）を一本鎖ｃＤＮＡの第一鎖合成の基質として使
用した。一本鎖ｃＤＮＡの第一鎖合成を、ベーリンガーマンハイム社（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ）のＲＴ−ＰＣＲ（ＡＭＶ）用１ｓ
ｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて達成した。
並列第一鎖ｃＤＮＡ合成を、プライマーとしてランダムヘキサマー又はＢＢ３６
を用いて行った。第一鎖合成産物を鋳型として用いた次のＰＣＲ反応を、プライ
マーＢＢ３及びＢＢ３６を用いて行った。ランダムヘキサマー又はＢＢ３６によ
り増幅されたｃＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ反応で、予想された約１．９ｋ
ｂのＰＣＲ産物が観察された。ランダムヘキサマーで増幅されたｃＤＮＡを、Ｂ
ａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化した。ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩは、ウサギＧＨ受容
体遺伝子が内部ＢａｍＨＩ部位を含むので２つの断片（約３６５ｂｐ及び約１６
００ｂｐ）を生成する。両断片をゲル生成した。次いで、完全長ウサギＧＨ受容
体ｃＤＮＡを２つのステップでクローニングした。最初に、約１６００ｂｐ Ｂ
ａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片を、これらの同じ２つの酵素で消化されているｐＣＤＮ
Ａ３．１（＋）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ））にクローニングした。これらのクローンは妥当な頻度で容易に得ら
れ、制限消化及びその後の配列決定により決定される欠失の証拠を示さなかった
。ウサギ受容体ｃＤＮＡクローンを完全にするために、１６００ｂｐ ＢａｍＨ
Ｉ−ＸｂａＩ断片を含む配列決定されたプラスミドの１つをＢａｍＨＩで消化し
、ウシアルカリホスファターゼで処理し、ゲル精製し、ウサギＧＨ受容体遺伝子
の５’部分を含むゲル精製された約３６５ｂｐのＢａｍＨＩ断片と連結した。こ
の連結物による形質転換体をつつき、制限消化及びＰＣＲにより分析して、約３
６５ｂｐの断片の存在を確認し、ウサギＧＨ受容体遺伝子の末端部分に対するそ
の方向を決定した。次いで、１つの完全長クローンの配列を確認した。ｐＢＢＴ
１１８と呼び、このプラスミドを用いて、ＦＤＣ−Ｐ１細胞を安定にトランスフ
ェクトした。
【００６６】 Ｂ．ウサギＧＨ受容体を発現する、安定にトランスフェクトされたＦＤＣ−Ｐ
１細胞の選択 エンドトキシンを含まないｐＢＢＴ１１８ ＤＮＡを、キアゲン社「Ｅｎｄｏ
−Ｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」を用いて調
製し、これを用いてＦＤＣ−Ｐ１細胞をトランスフェクトした。マウスＩＬ−３
を、アールアンドディーシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から購入した
。ＦＤＣ−Ｐ１細胞を、ギブコ社（ＧＩＢＣＯ）から購入したＤＭＲＩＥ−Ｃカ
チオン化脂質試薬を用い、製造業者が推奨する説明書に従って、プラスミドｐＢ
ＢＴ１１８でトランスフェクトした。簡単には、６ウェル組織培養ディッシュ中
で４５分間、４μｇのプラスミドＤＮＡを、１ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（ギブ
コ社（ＧＩＢＣＯ））に溶解した４〜３０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬と複合体化
した。複合体形成の後、２００μｌのマウスＩＬ−３添加ＯｐｔｉＭＥＭ培地に
溶解した２×１０6個のＦＤＣ−Ｐ１細胞を各ウェルに添加し、混合物を３７℃
で４時間放置した。マウスＩＬ−３の最終濃度は１７単位／ｍｌであった。２ｍ
ｌの１５％ウシ胎児血清含有ＦＤＣ−Ｐ１培地を各ウェルに添加し、細胞を３７
℃で一晩放置した。翌日、トランスフェクトされた細胞を、ＩＬ−３（１７Ｕ／
ｍｌ）、ｈＧＨ（５ｎＭ）、及びウシ胎児血清ではなく１０％ウマ血清を添加し
たＦＤＣ−Ｐ１培地１５ｍｌを含有するＴ−７５組織培養フラスコに移した。ウ
シ胎児血清にはＦＤＣ−Ｐ１細胞の増殖促進活性が含まれるので、ウマ血清を使
用した。３日後に、細胞を遠心分離し、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８、１７Ｕ／
ｍｌ ＩＬ−３、５ｎＭ ｈＧＨ、１０％ウシ血清を含有する新鮮なＦＤＣ−Ｐ
１培地に再懸濁し、３７℃でインキュベートした。２〜３日毎に、培地を交換し
た。各トランスフェクションからの細胞を、新鮮な培地とマウスＩＬ−３（１７
Ｕ／ｍｌ）又はｈＧＨ（５ｎＭ）のいずれかを含むＴ−７５組織培養フラスコに
分けた。Ｇ４１８耐性細胞を、ＩＬ−３とｈＧＨの両方を含むフラスコから得た
。バイオアッセイに用いた形質転換体は、ｈＧＨを含むフラスコに由来した。１
２個の独立した細胞株を限界希釈により選択した。これらの細胞株のうち５個（
ＧＨ−Ｒ３、−Ｒ４、−Ｒ５、−Ｒ６、及びＲ９）は、ｈＧＨに対して優れた増
殖反応を示した。予備実験により、ｈＧＨについてのＥＣ50は各細胞株で似てい
るが、増殖反応の大きさは株によって異なることが分かった。ＧＨ−Ｒ４細胞株
を最も詳細に研究し、以下で示すアッセイに用いた。１０％ウマ血清、５０単位
／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、４
００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８、及び２〜５ｎＭ下垂体ｈＧＨ又はｒｈＧＨを含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地において、これらの細胞株を日常的に増殖させた。
【００６７】 Ｃ．ウサギＧＨ受容体を発現するＦＤＣ−Ｐ１を用いたｈＧＨバイオアッセイ
の開発 Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎら（１９５５）により説明されたＭＴＴ細胞増殖アッセイ
の改良版を、ｈＧＨ生物活性を測定するために開発した。本発明者らのアッセイ
では、有機溶媒で可溶化しなければならない不溶性産物を生じるＭＴＴではなく
、可溶性産物を生じる色素ＭＴＳの取り込み及び減少が測定される。ＭＴＳを使
用する利点は、有機溶媒で細胞を溶解する必要なくウェルの吸光度を測定できる
ことである。
【００６８】 ＧＨ−Ｒ４細胞を、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０培地で３回
洗浄し、１×１０5個細胞／ｍｌの濃度で、アッセイ培地（フェノールレッドを
含まないＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ウマ血清、５０単位／ｍｌペニシリン、
５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８）に懸濁した
。４０ｍｌマイクロリットルの細胞懸濁液（５×１０3個細胞）を、９６ウェル
平底組織培養プレートのウェルに添加した。タンパク質サンプルの３倍連続希釈
物をアッセイ培地で調製し、５０μｌの体積でマイクロ力価ウェルに添加し、ウ
ェルあたり１００μｌの最終体積にした。タンパク質サンプルを、トリプリケー
トウェルでアッセイした。プレートを、加湿５％ＣＯ2組織培養インキュベータ
ーにおいて３７℃で６６〜７２時間インキュベートした。このとき、２０μｌの
ＭＴＳ／ＰＥＳ（ＰＥＳは電子結合剤（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃｏｕｐｌｅｒ）で
ある）試薬混合物（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ試薬，プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））
を各ウェルに添加した。４９０ｎｍでのウェルの吸光度を２〜４時間後に測定し
た。トリプリケートウェルの吸光度値（平均＋／−標準偏差）を計算した。対照
ウェルには培地が含まれたが、細胞は含まれなかった。サンプルウェルの吸光度
値から対照ウェルの吸光度値（一般に０．０６〜０．２吸光度単位）を引いた。
対照実験により、吸光度の信号が２の吸光度値まで細胞数と相関することが証明
された。全てのアッセイに、ヒト下垂体ＧＨ標準が含まれた。アッセイ培地にＧ
４１８が含まれず、ウマ血清の代わりにウシ胎児血清を使用したことを除いて、
親ＦＤＣ−Ｐ１細胞株を用いた実験を前記のように行った。
【００６９】 実施例２ ｒｈＧＨのクローニング及び発現 Ａ．ヒト成長ホルモン（ＧＨ）をコードするｃＤＮＡのクローニング ヒトＧＨ ｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術とプライマーＢ
Ｂ１及びＢＢ２を用いて、ヒト下垂体一本鎖ｃＤＮＡ（クロンテック社、パロア
ルト、カルフォルニア州（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，
ＣＡ）から市販されている）から増幅した。ＢＢ１の配列は、（５’−ＧＧＧＧ
ＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧ−
３’）（配列番号３）である。ＢＢ２の配列は、（５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴ
ＣＡＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣ−３’）（配列番号４）であ
る。成熟ＧＨの第１アミノ酸であるフェニルアラニンの前に開始メチオニンと、
クローニング用のＳａｌＩ及びＮｄｅＩ部位をコードするように、プライマーＢ
Ｂ１を設計した。逆方向プライマーＢＢ２は、クローニング用のＢａｍＨＩ部位
を含む。ＰＣＲ反応物は、２０ｐｍｏｌの各オリゴプライマー、ＩＸ ＰＣＲ緩
衝液（ＭｇＣｌ2を含むＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ緩衝液）、２００μＭ濃度の
４つの各ヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、２ｎｇの一本鎖ｃＤＮＡ、２．
５単位のＴａｑポリメラーゼ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
））、及び２．５単位のＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ，Ｉｎｃ））を含んだ。ＰＣＲ反応条件は、９６℃３分、（９５℃１分
、６３℃３０秒、７２℃１分）の３５サイクル、その後、７２℃１０分であった
。使用したサーモサイクラーは、Ａｍｐｌｉｔｒｏｎ ＩＩ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ（サーモライン社（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ））であった。適切な６
００ｂｐ ＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、同様
に消化したプラスミドｐＵＣ１９（ニューイングランドバイオラボ社、ビバリー
、マサチューセッツ州（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒ
ｌｙ，ＭＡ）から市販されている）にクローニングした。この連結混合物でＥ．
ｃｏｌｉ ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培
地上で選択した。いくつかのコロニーをＬＢ培地で一晩増殖させ、プラスミドＤ
ＮＡを、キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．
，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から購入したミニプラスミドＤＮＡ単離キットを用
いて単離した。クローンＬＢ６は、正しいＤＮＡ配列を有することが決定された
。
【００７０】 Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために、クローンＬＢ６をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで
消化し、適切な６００ｂｐ断片をゲル精製し、同じ酵素で消化され、ウシアルカ
リホスファターゼで処理されているプラスミドｐＣＹＢ１（ニューイングランド
バイオラボ社、ビバリー、マサチューセッツ州（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から市販されている）にクローニングした
。この連結混合物でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株を形質転換し、ＬＢアンピシリン
プレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを、いくつかの形質転換体から単離し
、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩでの消化によりスクリーニングした。正しいクローン
を同定し、ｐＣＹＢ１：ｗｔＧＨ（ｐＢＢＴ１２０）と名付けた。このプラスミ
ドで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株又はＷ３１１０株（ニューイングランドバイ
オラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）及びアメリカンタイプカ
ルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能）を形質転換した。
【００７１】 Ｂ．ｓｔＩＩ−ＧＨの構築 野生型ＧＨクローンＬＢ６（ｐＵＣ１９：野生型ＧＨ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ ｓ
ｔＩＩシグナル配列を含むＧＨクローンを構築するための鋳型として用いた。ｓ
ｔＩＩ配列を、その長さのために、２つの連続ＰＣＲ反応により付加した。第１
の反応は、順方向プライマーＢＢ１２及び逆方向プライマーＢＢ１０を用いた。
ＢＢ１０は、配列（５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＧＡＡＴＣＣＡＣＡＧＣ
ＴＣＣＣＣＴＣ３’）（配列番号５）を有する。ＢＢ１２は、配列（５’−ＧＣ
ＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＣＴＴＡ
ＣＧＣＡＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧ−３’）（配列番号
６）を有する。ＰＣＲ反応は、野生型ＧＨの増幅について説明した通りであった
。適切な６３０ｂｐ ＰＣＲ産物を、ＱｉａｅｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔ
ｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ））を用いてゲル精製し、
水で５０倍に希釈し、２μｌを第２のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。第２の
ＰＣＲ反応は、逆方向プライマーＢＢ１０及び順方向プライマーＢＢ１１を用い
た。ＢＢ１１は、配列（５’ＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧ
ＡＡＣＡＴＣＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣ
ＴＣＴＡＴＣＧ３’）（配列番号７）を有する。プライマーＢＢ１１は、クロー
ニング用のＸｂａＩ及びＮｄｅＩ部位を含む。ＰＣＲ条件は、第１の反応につい
て説明した通りであった。約６６０ｂｐのＰＣＲ産物を、ＸｂａＩ及びＢａｍＨ
Ｉで消化し、ゲル精製し、同様に切断したプラスミドｐＣＤＮＡ３．１（＋）（
インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にクローニングした。クローンｐＣ
ＤＮＡ３．１（＋）：：ｓｔＩＩ−ＧＨ（５Ｃ）又は「５Ｃ」は、正しいＤＮＡ
配列を有することが決定された。
【００７２】 クローン「５Ｃ」をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同様に切断したｐＢＢ
Ｔ１０８（ＰｓｔＩ部位を欠く、ｐＵＣ１９の誘導体。このプラスミドを以下で
説明する）にクローニングした。正しいインサートを有するクローンを、これら
の酵素での消化後に同定した。このクローン（ｐＢＢＴ１１１と呼ぶ）を、Ｎｄ
ｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ｓｔＩＩ−ＧＨ融合遺伝子を含む６６０ｂｐ断片を
ゲル精製し、同じ酵素で消化され、ウシアルカリホスファターゼで処理されてい
るプラスミド発現ベクターｐＣＹＢ１（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ））にクローニングした。ｓｔＩＩ−ＧＨ
挿入物を含む組換えプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼ消化により同定した
。さらなる研究のために１つの単離物を選択し、ｐＢＢＴ１１４と呼んだ。この
プラスミドで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株又はＷ３１１０株（ニューイングラ
ンドバイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）及びアメリカン
タイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能）を形質転換した。
【００７３】 Ｃ．ｏｍｐＡ−ＧＨの構築 野生型ＧＨクローンＬＢ６（ｐＵＣ１９：野生型ＧＨ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ ｏ
ｍｐＡシグナル配列を含むＧＨクローンを構築するための鋳型として用いた。ｏ
ｍｐＡ配列を、その長さのために、２つの連続ＰＣＲ反応により付加した。第１
の反応は、順方向プライマーＢＢ７（５’ＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧ
ＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣ
ＣＴＴＡＴＣＣＡＧ３’）（配列番号８）及び逆方向プライマーＢＢ１０（５’
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＧＡＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＣＣＴＣ３’）（
配列番号５）を用いた。約４ｎｇのプラスミドＬＢ６を一本鎖ｃＤＮＡではなく
鋳型として用い、ＰＣＲ条件が、９６℃３分、（９５℃１分；６３℃３０秒；７
２℃１分）の３０サイクル、その後、７２℃１０分であったことを除いて、ＰＣ
Ｒ反応は、野生型ＧＨの増幅について説明した通りであった。約６３０ｂｐ Ｐ
ＣＲ産物を、ＱｉａｅｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲ
ン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ））を用いてゲル精製し、水で５０倍に希釈し、２
μｌを第２のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。第２のＰＣＲ反応は、逆方向プ
ライマーＢＢ１０及び順方向プライマーＢＢ６（５’ＣＣＣＣＧＴＣＧＡＣＡＣ
ＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣ
ＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣ３’）（配列番号９）を用いた。ＰＣＲ条件は、第１の
反応について説明した通りであった。約６６０ｂｐ ＰＣＲ産物をゲル精製し、
ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１
９（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ
ｓ）、又はＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＣＤＮＡ３．１（＋）（インビ
トロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした（ＳａｌＩ及びＸ
ｈｏＩは、適合する一本鎖突出部を生じる）。いくつかのクローンを配列決定し
、ｐＵＣ１９（８／８）クローンには全てｏｍｐＡ配列領域に誤りが含まれるこ
とを発見した。たった１つのｐＣＤＮＡ３．１（＋）クローンを配列決定し、こ
のクローンには、ｏｍｐＡ領域に配列あいまい性が含まれていた。正しいｏｍｐ
Ａ−ＧＨ融合を作成するために、２つの配列決定されたクローンの遺伝子部分（
これらは、便利な制限部位により分離した異なる誤りを含む）を組換え、Ｐｓｔ
Ｉ部位を欠くｐＵＣ１９誘導体（下記のｐＢＢＴ１０８を参照のこと）にクロー
ニングした。結果として生じたプラスミド（ｐＢＢＴ１１２と呼ぶ）は、Ｎｄｅ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片として、ｐＢＢＴ１０８のこれらの同じ部位にクローニング
されたｏｍｐＡ−ＧＨ融合遺伝子を有する。このプラスミドをｐＢＢＴ１１２と
呼び、下記のように、ＰＣＲに基づくＧＨの部位特異的変異誘発に用いる。
【００７４】 Ｄ．ＰｓｔＩ ｐＵＣ１９（ｐＢＢＴ１０８）の構築 選択したシステイン置換変異及び挿入変異の構築のための、クローニングされ
たＧＨ遺伝子の変異誘発を容易にするために、ＰｓｔＩ部位を欠く、プラスミド
ｐＵＣ１９（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏＬａｂｓ））の誘導体を以下の通りに構築した。ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ
をＰｓｔＩで消化し、その後、製造業者により供給された、２００μＭ ｄＮＴ
Ｐを添加した反応緩衝液を用いて、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジー
ン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により７５℃で処理した。これらの条件下で、
ポリメラーゼは、ＰｓｔＩ消化により作られた３’一本鎖突出部を消化するが、
二本鎖領域を消化せず、その最終結果は、ＰｓｔＩ認識部位の真ん中４塩基から
なる一本鎖４塩基の欠失である。結果として生じる分子は、二本鎖、すなわち「
平滑」末端を有する。これらの酵素反応の後、線状単量体を、ＱｉａｅｘＩＩ
Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ）
）を用いてゲル精製した。この精製されたＤＮＡを、製造業者のプロトコールに
従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ））で処理し、ＰｓｔＩで消化し、これを用いてＥ
．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。形質転換体をつつき、ＰｓｔＩ及びＢａ
ｍＨＩを用いた制限消化により分析した。ＰｓｔＩ部位で切断されなかったが、
すぐ隣のＢａｍＨＩ部位で切断された形質転換体の１つをつつき、ｐＢＢＴ１０
８と呼んだ。
【００７５】 Ｅ．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｍｅｔ−ｈＧＨ及びｓｔＩＩ−ｈＧＨの発現 ｍｅｔ−ｈＧＨをコードするｐＢＢＴ１２０とｓｔＩＩ−ｈＧＨをコードする
ｐＢＢＴ１１４で、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を形質転換した。親ベクターｐ
ＣＹＢ１でもまたＷ３１１０を形質転換した。結果として生じる株に以下の名称
を与えた。
【００７６】 ＢＯＢ１３０：Ｗ３１１０（ｐＣＹＢ１）＝ベクターのみ ＢＯＢ１３３：Ｗ３１１０（ｐＢＢＴ１２０）＝ｍｅｔ−ｈＧＨ ＢＯＢ１３２：Ｗ３１１０（ｐＢＢＴ１１４）＝ｓｔＩＩ−ｈＧＨ これらの株を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（
ＬＢ）で一晩増殖させた。飽和した一晩培養物を、Ａ600で約０．０２５Ｏ．Ｄ
．まで、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢで希釈し、振盪フラスコ中で
３７℃でインキュベートした。培養Ｏ．Ｄ．が約０．２５〜０．５に達したとき
に、組換えタンパク質の発現を誘導するために、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭ
まで添加した。最初の実験のために、培養物を、誘導後０、１、３、５、及び約
１６時間後にサンプリングした。誘導培養物と非誘導培養物のサンプルをペレッ
ト化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（所望であれば１％β−メルカプ
トエタノール（ＢＭＥ）を添加する）に再懸濁した。サンプルを、予め成形され
た１４％Ｔｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動した。ゲル
をクマシーブルーで染色するか、ウエスタンブロッティングにより分析した。
【００７７】 ｍｅｔ−ｈＧＨを発現するＢＯＢ１３３株と、ｓｔＩＩ−ｈＧＨを発現するＢ
ＯＢ１３２からの全細胞溶解物のクマシー染色により、リサーチダイアグノステ
ィクス社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）から購入し
た精製ｒｈＧＨ標準と共に移動した約２２ｋＤａのバンドが示された。ｒｈＧＨ
バンドは、一晩誘導後の誘導培養物において最も顕著であった。ユナイテッドス
テイツバイオロジカル社（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｉｎｃ．）から購入したポリクローナルウサギ抗ｈＧＨ抗血清を用いたウエス
タンブロットにより、誘導後３時間及び１６時間でのＢＯＢ１３２及びＢＯＢ１
３３の誘導培養物の溶解物中にｒｈＧＨが存在することが確認された。ｒｈＧＨ
は、誘導後３でも１６時間でも対照ＢＯＢ１３０株（ベクターのみ）誘導培養物
のウエスタンブロッティングにより検出されなかった。
【００７８】 ＢＯＢ１３２（ｓｔＩＩ−ｈＧＨを発現する）の誘導培養物を前記のように調
製し、Ｋｏｄｈｌａｎｄ及びＢｏｔｓｔｅｉｎ（１９８０）の分析手順に基づい
て浸透圧衝撃にかけた。この手順は、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜を破壊し、ペリプラズム
の内容物を周囲の培地に放出する。その後の遠心分離により、可溶性ペリプラズ
ム成分（上清に回収される）が、細胞質性不溶性ペリプラズム成分及び細胞関連
成分（ペレットに回収される）から分離される。詳細に述べると、ｓｔＩＩ−ｈ
ＧＨプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を、１００μｇ／ｍｌアンピ
シリンを含むＬＢにおいて３７℃で一晩増殖させた。飽和した一晩培養物を、Ａ 600 で約０．０３Ｏ．Ｄ．まで１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ ２５
ｍｌで希釈し、２５０ｍｌ振盪フラスコ中で３７℃でインキュベートした。培養
Ｏ．Ｄ．が約０．４に達したときに、組換えタンパク質の発現を誘導するために
、１００ｍＭ ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭで添加した。次いで、誘導培養物
を、３７℃で一晩（約１６時間）インキュベートした。誘導された一晩培養物は
Ａ600で３．３Ｏ．Ｄ．に達し、４Ｏ．Ｄ．（１．２ｍｌ）を、Ｅｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ ５４１５モデル微量遠心器において４℃で５分間１４，０００ｒｐｍで遠
心分離した。細胞ペレットを、磨砕及びボルテックスにかけることにより氷冷２
０％スクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に約１０Ｏ．Ｄ．
まで再懸濁し、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を最終濃度１７ｍＭで添加した。再懸濁
された細胞を、氷上で１０分間インキュベートし、前記のように遠心分離した。
結果として得られたペレットを、磨砕及びボルテックスにかけることにより１０
Ｏ．Ｄ．で氷冷水に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。次いで、再
懸濁された細胞を前記のように遠心分離し、結果として得られた上清（可溶性ペ
リプラズム画分）と細胞ペレット（不溶性ペリプラズム画分及び細胞関連画分）
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００７９】 ＢＯＢ１３２により合成されたｒｈＧＨの大部分は可溶性であり、ペリプラズ
ムに局在することを発見した。ペリプラズムｒｈＧＨタンパク質は、精製された
下垂体ｈＧＨ標準とはサイズで区別がつかなかった。このことから、ｓｔＩＩシ
グナル配列はタンパク質分泌間に除去されたことが分かる。
【００８０】 実施例３ ｒｈＧＨの精製及び生物活性 Ａ．野生型ｒｈＧＨの精製 有意な量の野生型ｒｈＧＨを精製するために、ＢＯＢ１３２（ｓｔＩＩ−ｈＧ
Ｈを発現する）の培養物３３０ｍｌを誘導し、一晩培養し、Ｈｓｉｕｎｇら（１
９８６）により記載された調製手順に基づいて浸透圧衝撃にかけた。詳細に述べ
ると、ｓｔ−ＩＩ ｈＧＨプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を、１
００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢにおいて３７℃で一晩増殖させた。飽和
した一晩培養物を、Ａ600で０．０３Ｏ．Ｄ．まで、１００μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含むＬＢ ２×２５０ｍｌ（総体積５００ｍｌ）で希釈し、２Ｌ振盪フラ
スコ中で３７℃でインキュベートした。培養物のＯ．Ｄ．が約０．４に達したと
きに、組換えタンパク質の発現を誘導するために、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍ
Ｍで添加した。誘導培養物を、３７℃で一晩（約１６時間）インキュベートした
。誘導された一晩培養物がＡ600で約３．８Ｏ．Ｄ．に達し、これを、Ｓｏｒｖ
ａｌ ＲＣ−５遠心器及びＧＳＡローターを用いて、４℃で５分間８，０００ｒ
ｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを混合し、磨砕により約４７Ｏ．Ｄ．まで、
氷冷２０％スクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁し
、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を最終濃度約２５ｍＭで添加した。再懸濁された細胞
を氷上で１０分間インキュベートし、８５４ローターを用いてＩＥＣ Ｃｅｎｔ
ｒａ ＭＰ４Ｒ遠心器で、４℃で７分間８，５００ｒｐｍで、遠心分離した。結
果として得られたペレットを、磨砕及びボルテックスにかけることにより４７Ｏ
．Ｄ．で氷冷水に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。再懸濁された
細胞を、前記のようにＩＥＣ遠心器で遠心分離し、結果として得られた上清可溶
性ペリプラズム画分）と細胞ペレット（不溶性ペリプラズム画分及び細胞関連画
分）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。再度、ゲルは、産生されたｒｈＧＨが
可溶性で、ペリプラズムにあり、下垂体ｈＧＨ標準とサイズで区別できないこと
を示した。
【００８１】 ｒｈＧＨを、Ｂｅｃｋｅｒ及びＨｓｉｕｎｇ（１９８６）により説明された手
順に従って２つのステップで精製した。浸透圧衝撃からの上清を、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した５ｍｌ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｈｉ
ＴｒａｐＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードし、結合タンパク質を、１５カ
ラム体積の５０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌ直線勾配を用いて溶出した。カラム画分
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。約１００〜１２５ｍＭの塩濃度で溶出する
画分２２〜２５をｈＧＨについて濃縮し、プールし、濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ
２００ＨＲ １０／３０サイズ画分（ｓｉｚｉｎｇ）カラムによりさらに画分
した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラムからの画分３４〜３６（ＭＷ標準の溶出プロフィ
ールに基づいて約２１〜２２ｋＤａのＭＷを示す）にはｒｈＧＨの大部分が含ま
れ、これらの画分をプールし、凍結アリコートとして−８０℃で保存した。２８
０ｎｍでの吸光度により、及びＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（バ
イオラドラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を
用いることにより決定された、ｒｈＧＨの最終収率は約２ｍｇであった。非還元
型下垂体ｈＧＨは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合、還元型下垂体ｈＧＨ
よりわずかに小さな見かけの分子量で移動した。この分子量変化は、適切なジス
ルフィド結合形成を表している。本発明者らの精製ｒｈＧＨは、還元及び非還元
条件下で下垂体ｈＧＨと共に移動した。このことから、ｒｈＧＨは適切にフォー
ルディングされ、ジスルフィド結合していることが分かる。以下に示したデータ
から、ｒｈＧＨの生物活性は下垂体ｈＧＨの生物活性と区別がつかないことが分
かる。
【００８２】 Ｂ．下垂体ｈＧＨ及びｒｈＧＨのバイオアッセイ結果 親ＦＤＣ−Ｐ１細胞株は、マウスＩＬ−３に対して強い増殖反応性を示すが、
下垂体ｈＧｈに対しては示さない。ＩＬ−３の非存在下で、ＦＤＣ−Ｐ１細胞の
大部分は死滅し、０．２未満の吸光度値を示す。対照に、ウサギ成長ホルモン受
容体で形質転換されたＦＤＣ−Ｐ１細胞は、細胞数及び吸光度値の用量依存性増
加により証明されるように、下垂体ｈＧＨに反応して増殖する。この効果につい
てのＥＣ50（最大半分の刺激を達成するのに必要とされるタンパク質濃度）は、
文献（Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎら，１９９５）において報告されたものと同様に、様
々な実験で０．７５〜１．２ｎｇ／ｍｌの下垂体ｈＧＨ（０．０３〜０．０５ｎ
Ｍ）の範囲である。親ＦＤＣ−Ｐ１株と、ウサギ成長ホルモン受容体で形質転換
されたＦＤＣ−Ｐ１細胞との著しい差は、後者の細胞がＩＬ−３又はｈＧＨの非
存在下で生き残り、さらに高い吸光度値（アッセイと、ゼロ成長因子対照ウェル
におけるＭＴＳとのインキュベーションの長さに応じて一般に０．６〜１．１）
をもたらすことである。ウサギ成長ホルモン受容体形質転換体の最初のプールと
単離された５つ全ての独立した成長ホルモン受容体細胞株は、同じ効果を示した
。第２のセットの独立して単離したウサギ成長ホルモン受容体形質転換体を用い
て、同様の結果が得られた。Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎら（１９９５）は同様の効果を
観察した。このことは、ＩＬ−３／ＧＨに依存しない生存が形質転換手順の結果
であることを示唆している。成長ホルモン受容体細胞株は、成長のためにＩＬ−
３もｈＧＨも必要としないが、ＩＬ−３及びｈＧＨに対する強い増殖反応性をな
お示した。ｈＧＨ非存在下での高い吸光度値の実際の効果は、ｈＧＨ反応の「ウ
ィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）」（最大吸光度値と最小吸光度値との差）を減らすこ
とである。このウィンドウは、Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎら（１９９５）により報告さ
れたものと同様に、一貫してゼロ成長因子値の４０〜７０％の範囲であった。
【００８３】 本発明者により調製された下垂体ＧＨ及び野生型ｒｈＧＨは、バイオアッセイ
において同様の用量反応曲線を有し、ＥＣ50は、様々な実験で０．６〜１．２ｎ
ｇ／ｍｌの範囲であった（表１）。
【００８４】
【表１】 実施例４ ｈＧＨシステイン変異タンパク質の構築 システイン置換変異Ｔ１３５Ｃは、次のように構築した。アミノ酸残基１３５を
スレオニンに対するコドンＡＣＴを、システインをコードするコドンＴＧＴに変
え、近傍ＢＧｌＩＩ部位をスパンするように変異誘発性逆方向オリゴヌクレオチ
ドＢＢ２８（５＞ＣＴＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＧ
ＣＴＧＣＣＡＴＣ＞３）（配列番号１０）を設計した。このオリゴを、ｏｍｐＡ
−ＧＨ融合遺伝子の結合領域とアニールするが変異を形成しないＢＢ３４（５＞
ＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴ＞３）（配列番号１１）と
一緒にＰＣＲで使用した。ＰＣＲは、１×ＰＣＲ緩衝液（１．５ｍＭ ＭｇＣｌ 2 を含むパーキンエルマー緩衝液）中に、４種類の核酸ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びｄ
Ｔ各２００μＭ、各オリゴヌクレオチドプライマー０．５μＭ、鋳型としてｐＢ
ＢＴ１１２（上述）を５ｐｇ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキン
エルマー社、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）１．２５単位、及びＰｆｕＤＮＡポリ
メラーゼ（ストラタジーン社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．１２５単位を含む反
応溶液５０μｌ中で行った。反応は、ロボサイクラーグラジエント９６サーマル
サイクラー（ストラタジーン社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で行った。用いたプ
ログラムは、９５℃３分、その後［９５℃６０秒、４５℃又は５０℃又は５５℃
７５秒、７２℃６０秒］を２５サイクル、その後６℃のまま。ＰＣＲ反応物をア
ガロースゲル電気泳動で調べた結果、三つのアニーリング温度すべてで、約４３
０ｂｐのかなりの量の生成物が得られることがわかった。４５℃での反応生成物
を、ＱＬＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン社、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精
製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで消化した。推定上のＴ１３５Ｃ変異を含む、得
られた２７８ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩ断片をゲルで精製し、ＢｇｌＩＩ及び
ＰｓｔＩで消化され、ゲルで精製された、ｓｔＩＩ−ＧＨ融合遺伝子（上述）を
有するｐＵＣ１９誘導体であるｐＢＢＴ１１１に連結した。この連結による形質
転換体は、最初にＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩによる消化によりスクリーニングし、
その後１クローンの配列を決定し、Ｔ１３５変異が存在すること及びＰＣＲ反応
によって又は合成オリゴヌクレオチドによって潜在的に導入され得る他の変異が
存在しないことを確認した。配列を決定したクローンは、ＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩ
断片すべてに正しい配列を有することがわかった。
【００８５】 ＢＢ２８の代わりに変異形成逆方向オリゴヌクレオチドＢＢ２９（５＞ＣＴＧ
ＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＴＴＣ
＞３）（配列番号１２）を用い、クローニングのためにＰＣＲ反応をアニーリン
グ温度５０℃で行った点を除いて、Ｔ１３５Ｃについて上述した手順を用いて、
置換変異Ｓ１３２Ｃを構築した。配列を決定した２クローンのうちの一つが正し
い配列を有することがわかった。
【００８６】 似た手順を用い、しかし異なるクローニング戦略を用いて、置換変異Ｔ１４８
Ｃを構築した。変異形成順方向オリゴヌクレオチドＢＢ３０（５＞ＧＧＧＣＡＧ
ＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＣＴＧＣＡＡＣ
ＴＣＡＣＡＣＡＡＣ＞３）（配列番号１３）を、ＧＨコード領域の大部分の３´
末端にアニールし、すぐ下流のＢａｍＨＩ部位にスパンする非変異形成逆方向プ
ライマーＢＢ３３（５＞ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＧＡＡ
ＴＣＣＡＣＡＧＣＴ＞３）（配列番号１４）を用いるＰＣＲで使用した。ＰＣＲ
は、アニーリング温度を４６、５１及び５６℃とした以外は上述のように行った
。上述のようにＰＣＲ及びゲル分析を行った後、４６及び５１℃での反応生成物
をクローニング用に保存した。これらをＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、得
られる１８８ｂｐの断片をゲルで精製し、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化され
たｐＢＢＴ１１１にクローニングし、メーカー指示の手順に従って、子ウシアル
カリホスファターゼ（プロメガ社、Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理し、ゲルで精製した
。この連結による形質転換体を、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩによる消化で分析し
、１８８ｂｐのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ変異形成ＰＣＲ断片が正しい方向にクロ
ーニングされているクローンを同定した。何故ならＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩは
適合する末端を生成するからであり、このクローニング段階は方向特異的ではな
い。調べた六つのクローンのうちの五つが正しい方向を向いていることがわかっ
た。これらの一つの配列が決定され、Ｔ１４８Ｃ変異を含むことが示された。こ
のクローンの１８８ｂｐのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ変異形成ＰＣＲ断片の残りの
配列は正しいことが確認された。
【００８７】 置換変異Ｓ１４４Ｃの構築は、ＢＢ３０の代わりに変異形成順方向オリゴヌク
レオチドＢＢ３１（５＞ＧＧＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＴ
ＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＣ＞３）（配列番号１５）を用いた以外、Ｔ１４８Ｃ変異
の構築と同じであった。六つのクローンのうちの二つが正しい方向を向いている
ことがわかった。これらの一つの配列を決定し、望むＳ１４４Ｃ変異を含むこと
がわかった。このクローンの１８８ｂｐのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ変異形成ＰＣ
Ｒ断片の残りの配列もまた正しいことが確認された。
【００８８】 ＧＨの天然のカルボキシ末端にシステイン残基を加える変異もまた構築された
。ｓｔｐ１９２Ｃと名付けたこの変異の構築は、Ｔ１４８Ｃ変異タンパク質の構
築に関して上記の手順を用いて実施しが、異なるオリゴヌクレオチドプライマー
を用いた。ＧＨのカルボキシ末端ｐｈｅ残基のコドンとＴＡＡ翻訳停止コドン間
にシステイン用のコドンＴＧＣを挿入し、近接ＢａｍＨＩ部位をスパンする変異
形成逆方向オリゴヌクレオチドＢＢ３２（５＞ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣ
ＴＴＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣ＞３）（配列番号１
６）を、上記のＢＢ３４と一緒に用いた。上述のようにＰＣＲ及びゲル分析の後
、クローニングのために４６℃の反応を用いた。調べた六つのクローンのうち三
つが、正しい方向を向いていることがわかった。これらのうちの一つの配列が決
定され、望むｓｔｐ１９２Ｃ変異を含むことが示された。このクローンの１８８
ｂｐのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ変異形成ＰＣＲ断片の残りの配列は正しいことが
確認された。
【００８９】 置換変異Ｓ１００Ｃは、アミノ酸残基１００のセリンのコドンＡＧＣを、シス
テインをコードするコドンＴＧＣに変える変異形成逆方向オリゴヌクレオチドＢ
Ｂ２５（５＞ＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣ
ＧＡＡＧＡＣ＞３）（配列番号１７）を用いて構築した。ＢＢ２５もまた、近接
ＮａｒＩ部位にスパンする。ＢＢ２５及びＢＢ３４を用いるＰＣＲ反応は、Ｔ１
３５Ｃ変異の構築のために上述したＰＣＲ手順を用いて行った。ＰＣＲ産物をゲ
ル分析した後、５０℃でのアニーリング反応の生成物を、ＱＩＡクイックＰＣＲ
精製キット（キアゲン社、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＰｓｔＩとＮａｒＩ
で消化した。得られる１７８ｂｐの断片をゲルで精製し、ＰｓｔＩとＮａｒＩで
消化し、ゲルで精製されたｐＢＢＴ１１１に連結した。この連結による形質転換
体から単離されたプラスミドを、ＰｓｔＩ及びＮａｒＩでの消化でスクリーニン
グし、一つのプラスミドの配列を決定し、１７８ｂｐのＰｓｔＩ−ＮａｒＩ断片
には、Ｓ１００Ｃ変異が存在し、他のいかなる変異も存在しないことを確認した
。
【００９０】 ＰＣＲでＢＢ２５の代わりに変異形成逆方向オリゴヌクレオチドＢＢ２６（５
＞ＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＡ
ＣＡＣＴＣＣＴ＞３）（配列番号１８）を用い、クローニングのためにアニーリ
ング温度４５℃でＰＣＲ反応を行った点を除いて、Ｓ１００Ｃのための上記の手
順を用いて置換変異Ａ９８Ｃを構築した。一つのクローンの配列を決定し、正し
い配列を有することがわかった。
【００９１】 置換変異Ａ３４Ｃは、次のように構築した。アミノ酸残基３４のアラニンをコ
ードするコドンＧＣＣを、システインをコードするコドンＴＧＣに変え、Ｐｓｔ
Ｉ部位をスパンするように、変異形成逆方向オリゴＢＢ２３（５＞ＧＣＧＣＴＧ
ＣＡＧＧＡＡＴＧＡＡＴＡＣＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＴＧＧＧＡＴＡＴＡＧＣＡ
ＴＴＣＴＴＣＡＡＡＣＴＣ＞３）（配列番号１９）を設計した。ＳｔＩＩリーダ
ー配列のコード配列の５’末端にアニールし、イニシエーターメチオニンコドン
と重なるＮｄｅＩ部位をスパンするＢＢ１１（５＞ＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡ
ＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴ
ＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧ＞３）（配列番号２０）と一緒に、このオ
リゴヌクレオチドをＰＣＲ反応に用いた。
【００９２】 １．５ｍＭのＭｇＣｌ2、四つの核酸ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びｄＴ各２００μＭ
、各オリゴヌクレオチドプライマー０．２μＭ、鋳型としてｐＢＢＴ１１１（上
述）を１ｎｇ、ＴａｃＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ社、Ｐｒｏｍｅｇａ）０．
８単位、及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）０．３３単位を含む１×ＰＣＲ緩衝液（プロメガ社、Ｐｒｏｍｅｇａ）５
０μｌ中でＰＣＲ反応を行った。反応は、ロボサイクラーグラジエント９６サー
マルサイクラー（ストラタジーン社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で行った。用いた
プログラムは、９６℃３分、その後［９５℃６０秒、５０℃又は５５℃又は６０
℃７５秒、７２℃６０秒］を２５サイクル、その後６℃のまま。ＰＣＲ反応生成
物をアガロースゲル電気泳動で分析した結果、三つの異なるアニーリング温度す
べてで期待した大きさ（約２２０ｂｐ）の意味のある生産物を与えた。５０℃及
び５５℃での反応生成物を保存し、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン
社、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで消化した。推定上
のＡ４３Ｃ変異を含む、得られた２０７ｂｐのＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ断片をゲルで
精製し、ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで消化されたｐＢＢＴ１１１に連結し、アルカリ
フォスファターゼで処理し、ゲルで精製した。この連結反応による形質転換体を
、始めにＮｄｅＩ及びＰｓｔＩでの消化でスクリーニングし、次に一つのクロー
ンの配列を決定し、Ａ３４Ｃ変異が存在し、ＰＣＲ反応によって、又は合成オリ
ゴヌクレオチドによってもたらされ得る、それ以外の変異が存在しないことを確
認した。配列を決定したクローンは、ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ断片の全部に正しい配
列を持つことがわかった。
【００９３】 ＢＢ２３の代わりに変異形成逆方向オリゴヌクレオチドＢＢ２４（５＞ＧＣＧ
ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＴＡＣＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＴＧＧ＞３）（配列
番号２１）を用いる点を除いて、Ａ３４Ｃについて上で述べた手順を用いて置換
変異Ｓ４３Ｃを構築した。
【００９４】 置換変異Ｔ３Ｃは、二つの連続するＰＣＲ段階で構築した。第一段階で望む変
異を作り、第二段階で最初の反応のＰＣＲ産物を延長し、有用なクローニング部
位を含ませた。アミノ酸残基３のスレオニンのコドンＡＣＣを、システインをコ
ードするコドンＴＧＣに変え、ｓｔＩＩ−ｈＧＨ融合遺伝子の結合部分にスパン
しアニールするように、変異形成順方向オリゴヌクレオチドＢＢ７８（５＞ＧＣ
ＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＣＴＴＡ
ＣＧＣＡＴＴＣＣＣＡＴＧＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧ＞３）（配列番号２
２）を設計した。上述したＢＢ３３と一緒に第一段階のＰＣＲでＢＢ７８を使用
した。
【００９５】 １．５ｍＭのＭｇＣｌ2、四つの核酸ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びｄＴ各２００μＭ
、各オリゴヌクレオチドプライマー０．２μＭ、鋳型としてｐＢＢＴ１１１（上
述）を１ｎｇ、ＴａｃＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ社、Ｐｒｏｍｅｇａ）１．
５単位、及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）０．２５単位を含む１×ＰＣＲ緩衝液（プロメガ社、Ｐｒｏｍｅｇａ）５
０μｌ中で第一段階のＰＣＲ反応を行った。反応は、ロボサイクラーグラジエン
ト９６サーマルサイクラー（ストラタジーン社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で行っ
た。用いたプログラムは、９６℃３分、その後［９４℃６０秒、６０℃７５秒、
７２℃６０秒］を２５サイクル、その後６℃のまま。ＰＣＲ反応生成物をエタノ
ールで析出させ、約６３０ｂｐの生成物をゲルで精製し、１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．５）２０μｌ中に溶かした。このゲル精製断片を１００倍に希釈
し、希釈した断片２μｌを第二のＰＣＲ段階の鋳型として用いた。第二のＰＣＲ
段階は、オリゴヌクレオチドＢＢ１１及びＢＢ３３（ともに上述）を使用し、第
一段階のＰＣＲ反応で使用した反応条件を用いた。第二段階ＰＣＲ反応物を、ア
ガロースゲル電気泳動で精製し、期待される約６７０ｂｐの断片を観察した。Ｐ
ＣＲ反応生成物はＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン社、Ｑｉａｇｅｎ
）を用いて精製し、ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで消化した。推定上のＴ３Ｃ変異を含
む、得られた２０７ｂｐのＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ断片をゲルで精製し、ＮｄｅＩ及
びＰｓｔＩで消化され、アルカリフォスファターゼで処理され、ゲルで精製され
たｐＢＢＴ１１１に連結した。この連結による形質転換体を、最初にＮｄｅＩ及
びＰｓｔＩによる消化でスクリーニングし、次に一つのクローンの配列を決定し
、Ｔ３Ｃ変異が存在し、ＰＣＲ反応により、又は合成オリゴヌクレオチドにより
もたらされ得る、その他の変異が存在しないことを確認した。配列を決定したク
ローンは、ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ断片すべてに正しい配列を有することがわかった
。
【００９６】 置換変異Ａ１０５Ｃは、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １５： ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ
Ｗｈｉｔｅ， Ｂ． Ａ． （１９９３） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉ
ｎｃ．， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ中ｐ．２５１−２６１のＨｏｒｔｏｎ， Ｒ．
Ｍ． によって一般的に記述された「重なり延長による変異形成」の技術を用
いて構築された。この技術を用いれば、図１に示すように、標的ＤＮＡ断片から
、二つの異なる断片が増幅される。一つの断片は、プライマーａ及びｂを用いて
生成し、生成物ＡＢとなる。プライマーｂとｃは、それぞれ生成物ＡＢとＣＤの
右端と左端に同じ配列の変化をもたらす。生成物ＡＢとＣＤは、ＡＢの上部の鎖
をＣＤの底部の鎖にアニールさせる「重なり」と、その逆という同じ（変異）配
列の断片を共有する。プライマーａとｄを用い、生成物ＡＢとＣＤを鋳型として
加えた、次のＰＣＲ反応で、ＤＮＡポリメラーゼによる、これらのアニールした
重なりの伸長は、全長変異分子ＡＤを作る。
【００９７】 異なるオリゴヌクレオチドプライマーを使用する点を除いて、Ａ１０５Ｃ構築
のための最初のＰＣＲ反応は、上記のＴ３Ｃの構築で述べた反応と同様に行った
。用いたプライマー対は、（ＢＢ２７＋ＢＢ３３）及び（ＢＢ１１＋ＢＢ７９）
である。ＢＢ１１とＢＢ３３は、上で説明した。ＢＢ２７とＢＢ７９は、アミノ
酸残基１０５のアラニンのコドンＧＣＣを、システインをコードするコドンＴＧ
Ｃに変える、相補的変異形成オリゴヌクレオチドである。ＢＢ２７の配列は５＞
ＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＧＣＡＡＣＧＴＣ＞３（
配列番号２３）であり、ＢＢ７８の配列は５＞ＧＡＣＧＴＴＧＣＴＧＴＣＡＧＡ
ＧＣＡＧＣＣＧＴＡＣＡＣＣＡＧＧＣＴ＞３（配列番号２４）である。（ＢＢ２
７×ＢＢ３３）及び（ＢＢ１１×ＢＢ７９）のＰＣＲ反応生成物をエタノールで
析出し、ゲルで精製し、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）２０μｌに溶
解した。分離用ゲルは、各ＰＣＲ反応からの主な生成物が、（ＢＢ２７×ＢＢ３
３）反応では期待される大きさ約２９０ｂｐ、（ＢＢ１１×ＢＢ７９）反応では
期待される大きさ約４０８ｂｐであることを示した。これらの二つの変異形成断
片を次に、次のＰＣＲ反応で一緒に「スプライシング」した。この反応では、最
初の反応生成物からのゲル精製断片各１μｌを鋳型として加え、ＢＢ１１及びＢ
Ｂ３３をプライマーとして用いた。又は、最初の（ＢＢ２７×ＢＢ３３）及び（
ＢＢ１１×ＢＢ７９）反応に用いたのと同じ条件でＰＣＲ反応を行った。第二の
ＰＣＲ反応生成物の一部をアガロースゲル電気泳動で分析し、期待される約６７
０ｂｐのバンドが観察された。ＰＣＲ反応生成物の大半を、次にＱＩＡクイック
精製キット（キアゲン社、Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで
消化した。推定上のＡ１０５Ｃ変異を含む、得られ２７６ｂｐのＢｇｌＩＩ−Ｐ
ｓｔＩ断片をゲルで精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで消化され、ゲルで精製さ
れたｐＢＢＴ１１１に連結した。この連結反応からの形質転換体を最初にＢｇｌ
ＩＩ及びＰｓｔＩで消化し、次に一つのクローンの配列を決定し、Ａ１０５Ｃ変
異が存在し、ＰＣＲ反応によって、又は合成オリゴヌクレオチドによってもたら
され得る他の変異は存在しないことを確認した。配列を決定したクローンは、Ｂ
ｇｌＩＩ−ＰｓｔＩ断片すべてに正しい配列を有することがわかった。
【００９８】 ペリプラズムに分泌されるタンパク質としてＥ．ｃｏｌｉに発現させるために
、１１の変異タンパク質をコードするｓｔＩＩ−ｈＧＨ遺伝子を、ｐＵＣ１９系
ｐＢＢＴ１１１誘導体から約６５０ｂｐのＮｄｅＩ−ＸｂａＩ断片として切り出
し、ｒｈＧＨを発現させるために用いられてきたｐＣＹＢ１発現ベクターにサブ
クローニングした。発現実験のために、これらのプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉＷ
３１１０に導入した。
【００９９】 実施例４及び２３で述べる手順に似た手順を用いて、ＧＨの他のシステイン変
異タンパク質を構築することができる。システイン変異タンパク質は、ＧＨコー
ド配列における天然アミノ残基をシステインに置換する置換変異、ＧＨコード配
列における二つの天然アミノ酸間にシステインを挿入する挿入変異、又はＧＨコ
ード配列の最初のアミノ酸Ｆ１の前にシステイン残基を加える又はＧＨコード配
列の最後のアミノ酸Ｆ１９１の後にシステイン残基を加える付加変異の可能性が
ある。システイン残基は、ＧＨコード配列のどこにおいても、どのアミノ酸とも
置換でき、どの二つのアミノ酸の間にも挿入できる。ＧＨのシステイン残基を置
換又は挿入する好ましい部位は、ヘリックスＡのすぐ前の領域、Ａ−Ｂループ、
Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループ及びヘリックスＤから末端の領域である。他の好ま
しい部位は、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤヘリックスの最初の又は最後の三つのアミノ酸で
ある。この領域でシステイン置換を行うのに好ましい部位は、Ｆ１、Ｐ２、Ｐ５
、Ｅ３３、Ｋ３８、Ｅ３９、Ｑ４０、Ｑ４６、Ｎ４７、Ｐ４８、Ｑ４９、Ｔ５０
、Ｓ５１、Ｓ５５、Ｓ５７、Ｔ６０、Ｑ６９、Ｎ７２、Ｎ９９、Ｌ１０１、Ｖ１
０２、Ｙ１０３、Ｇ１０４、Ｓ１０６、Ｅ１２９、Ｄ１３０、Ｇ１３１、Ｐ１３
３、Ｒ１３４、Ｇ１３６、Ｑ１３７、Ｋ１４０、Ｑ１４１、Ｔ１４２、Ｙ１４３
、Ｋ１４５、Ｄ１４７、Ｎ１４９、Ｓ１５０、Ｈ１５１、Ｎ１５２、Ｄ１５３、
Ｓ１８４、Ｅ１８６、Ｇ１８７及びＧ１９０である。システイン残基は、これら
のアミノ酸の直前又は直後にも挿入できる。システイン残基を付加できる一つの
好ましい部位は、本実施例で＊−１Ｃと呼ぶＦ１の前であろう。
【０１００】 ＧＨの天然システイン残基の一つを他のアミノ酸に置換することによって自由
システインを含むＧＨ変異タンパク質を構築することもできる。置換される前の
システイン残基とジスルフィド結合を形成していた天然システイン残基は、今や
自由になる。この必須でないシステイン残基は、他の１９のアミノ酸のどれで置
換してもよいが、セリン又はアラニン残基と置換するのが好ましい。自由システ
イン残基は、Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉら（１９９８）による手順のような手順を用い
て、天然アミノ酸の化学修飾によってＧＨに導入することもできる。
【０１０１】 実施例１〜１５で述べた手順に似た手順を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核
細胞中でタンパク質を発現し、それらのタンパク質を精製し、それらのタンパク
質をＰＥＧ化し、インビトロ生物検定における生物活性を測定することができる
。ＧＨ変異タンパク質は、実施例１６〜１９で述べる手順に似た手順又は本技術
に習熟した者が熟知する他の手順を用いて、昆虫又は哺乳類のような真核細胞中
でも発現できる。もし分泌が必要ならば、真核細胞由来のタンパク質を分泌させ
るために天然のＧＨシグナル配列又は他のシグナル配列を用いてもよい。
【０１０２】 実施例５ シスチン付加はシステイン変異タンパク質Ｔ３Ｃの回収率を改善する Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ３ｍ
ｌ中で一夜生育させた。一夜培養し、生育が飽和に達した培養液を、１００μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ３００ｍｌで、６００ｎｍでのＯ．Ｄ．が０．
０３になるように希釈し、２Ｌの振盪フラスコ中、３７℃で培養した。培養液の
Ｏ．Ｄ．が０．４２０に達した時、１００ｍＭのＩＰＴＧを１．５ｍｌ加えて最
終濃度が０．５ｍＭになるようにし、組換えタンパク質の発現を誘導した。誘導
した培養液は、３７℃で一夜（約１６時間）培養した。
【０１０３】 誘導し一夜培養した培養液の６００ｎｍでのＯ．Ｄ．が３．６に達した時、１
３５ｍｌ×２本に分け、ソーヴァル社（Ｓｏｒｖａｌ）ＲＣ−５遠心分離機のＧ
ＳＡローターを用い、４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を
捨て、細胞ペレットを次のように浸透圧衝撃処理にかけた。細胞ペレットを氷冷
緩衝液Ａ［２０％スクロース、１０ｍＭトリス・塩酸、ｐＨ７．５］又は緩衝液
Ｂ［２０％スクロース、１０ｍＭトリス・塩酸、ｐＨ７．５、５．５ｍＭシスチ
ン（ｐＨを７．５〜８．０に調節）］１０ｍｌ中Ｏ．Ｄ．が４９になるように再
懸濁した。ペレットを崩壊させて再懸濁し、撹拌し、０．２５ＭのＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ８．０を１ｍｌ加え、最終濃度が約２５ｍＭになるようにした。再懸濁した細
胞を３０分間氷冷し、ＳＳ−３４ローターで、４℃、８５００ｒｐｍで１０分間
遠心分離した。上清を捨て、ペレットを崩壊させて再懸濁し、氷冷した緩衝液Ｃ
［５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２］又は緩衝液Ｄ［５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭシスチン（ｐＨを７．５〜８．０に調節）］１０ｍｌ中
で撹拌した。再懸濁しった細胞ペレットを、ＳＳ−３４ローターで、４℃、８５
００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られる上清（可溶性ペリプラズム画分）を
回収し、−８０℃で保存した。種々の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果、可
溶性ペリプラズム画分中に回収される単量体ｈＧＨ種の量がかなり改善できるこ
とがわかった。シスチンで処理したサンプルで、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上
で約２２ｋＤａの単一バンドとしてｈＧＨの大部分が泳動すること、そしてその
バンドは脳下垂体ｈＧＨと同じ速度で泳動することが観察された。シスチンが存
在しない場合には、単量体の範囲に多くの異なる分子量の分子種が観察された。
ウエスタンブロッティングを用いてゲルを展開すると、より大きい分子量のタン
パク質集合体が見える。
【０１０４】 実施例６ ＧＨシステインを加えた変異型の発現及び精製のための一般的な方法 ｈＧＨシステイン変異タンパク質の単離のための標準的な手順は次の通りであ
る。ＳｔＩＩ−ｈＧＨ変異タンパク質プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０
株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ中で飽和するまで生育させる。
一夜培養した培養液を通常、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ中で６
００ｎｍでのＯ．Ｄ．が０．０２５〜０．０３０になるまで希釈し、振盪フラス
コ中で３７℃で生育させる。６００ｎｍでの培養液のＯ．Ｄ．が０．３００〜０
．５００に達した時、ＩＰＴＧを最終濃度が０．５ｍＭになるように加え、発現
を誘導する。誘導した培養液を３７℃で一夜培養する。誘導して、一夜培養した
培養液をソーヴァル社（Ｓｏｒｖａｌ）ＲＣ−５遠心分離機で４℃、８，０００
〜１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られるペレットを、培養液の量
に応じて、ＫｏｓｈｌａｎｄとＢｏｓｔｅｉｎ（１９８０）又はＨｓｉｕｎｇら
（１９８６）の手順に基づいて浸透圧衝撃にかけた。浸透圧衝撃のために、細胞
ペレットを２０％スクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中にＯ
．Ｄ．が２５〜５０になるように再懸濁した。５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及
び／又は５ｍＭのシスチン（ｐＨを７．５〜８．０に調節）を再懸濁緩衝液に含
有させる場合もあった。再懸濁したペレットを１５〜３０分間氷冷し、上記のよ
うに遠心分離した。上清を捨て、ペレットを６００ｎｍでのＯ．Ｄ．が２５〜５
０になるように、５又は１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に再懸濁し
た。５又は２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び／又は５ｍＭのシスチン（ｐＨ
を７．５〜８．０に調節）を再懸濁緩衝液に含有させる場合もあった。再懸濁し
たペレットを１５〜３０分間氷冷し、上記のように遠心分離した。得られる上清
は可溶性ペリプラズム成分を含み、ペレットは不溶性ペリプラズム及び細胞関連
成分から成る。
【０１０５】 シスチンを浸透圧衝撃緩衝液に添加すると、システイン変異タンパク質の多く
の回収率をかなり改善し、安定化した。シスチンが存在するとシステイン変異タ
ンパク質は、大部分が単量体であったが、シスチンが存在しないとｈＧＨの単量
体、二量体及び、より高次の集合体の混合物が、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウ
エスタンブロットで観察された。それらは大部分還元されている又は野性型ｒｈ
ＧＨには存在しないので、より高次の集合体は恐らくタンパク質中に加えられた
システイン残基の結果であろう。浸透圧衝撃緩衝液にシスチンを添加すると、こ
の問題がほとんど解決された。シスチンが、変異タンパク質中の自由システイン
残基と反応し、安定な混合ジスルフィド結合を形成し、ジスルフィド結合の混合
と凝集を阻止したものと我々は考えている。我々はまた、第二のジチオール、シ
スタミンも試験し、ｈＧＨのシステイン変異タンパク質に似た安定効果を有する
ことを認めた。酸化型グルタチオンのような他のジチオールもまた恐らく、自由
システインを含むタンパク質の回収率も向上させるであろう。
【０１０６】 分析した１１のｈＧＨ変異タンパク質のうちの六つが、単離と精製のために充
分なレベルで発現した。Ａ３４Ｃ、Ｓ４３Ｃ、Ａ９８Ｃ、Ｓ１００Ｃ及びＳ１３
２Ｃに関する浸透圧衝撃の上清の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、正しい分
子量の位置には、ほとんど又はまったくタンパク質が存在しなかった。これらの
変異タンパク質の発現レベルは比較的低いので、回収率が改善されたかどうかを
観察するのが困難である。全細胞溶解物の予備的分析の結果、これらの変異型の
タンパク質は発現されているが不溶性であることがわかった。Ｔ３Ｃ、Ａ１０５
Ｃ、Ｔ１３５Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｔ１４８Ｃ及びｓｔｐ１９２Ｃ変異タンパク質は
、浸透圧衝撃緩衝液中にシスチンが存在する場合には、回収率がかなり改善する
ことがわかった。シスチンが存在しない場合には、Ａ１０５Ｃは試験しなかった
。一般的なタンパク質精製手順を下で説明する。
【０１０７】 ＷＴ−ｒｈＧＨは、イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィーによって精製
した。システイン変異タンパク質は、イオン交換、疎水的相互作用（ＨＩＣ）、
金属キレート化親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、分子ふるいクロマトグ
ラフィー（ＳＥＣ）又はこれらの技術の組み合わせを含む種々のクロマト手順に
よって精製した。一般的に、ｈＧＨ変異タンパク質は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０で平衡化したＱ−セファロース高流速樹脂（ファルマシア社、Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）を用いる新鮮な浸透圧衝撃上清から得た。カラムは、２０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗い、結合したタンパク質を、２０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中０から２５０ｍＭまでＮａＣｌ濃度を直線的に増加
させながら１０倍の体積で溶出させた。ｈＧＨ変異タンパク質を含む画分は、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングで同定した。これらの画分を集め
、凍結状態で保存した。浸透圧衝撃混合物からｈＧＨ変異タンパク質を得るには
、代わりの樹脂を用いることができる。すなわちＨＩＣ、陽イオン交換樹脂又は
親和性樹脂である。
【０１０８】 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のためには、Ｑカラムを室温ま
で暖め、ＮａＣｌを最終濃度が２Ｍになるように加えた。予め２ＭＮａＣｌ、２
０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化しておいたブチル−セファロース
高流速樹脂に保存サンプルをかけた。２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．５中２Ｍから
０ＭへのＮａＣｌ濃度の逆勾配を用いて、樹脂からｈＧＨ変異タンパク質を溶出
した。ｈＧＨ変異タンパク質を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロ
ッティングで同定し保存した。
【０１０９】 １０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化したニッ
ケルキレート化樹脂（キアゲン社、Ｑｉａｇｅｎ）に直接ＨＩＣ保存溶液をかけ
た場合もあった。洗浄段階の後、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ
、ｐＨ７．５中０〜３０ｍＭのイミダゾール濃度勾配を用いて変異タンパク質を
回収した。恐らくＨ１８、Ｈ２１及びＥ１７４によって形成される二価金属結合
部位によって、ｈＧＨはニッケルに高い親和性を持つのであろう。結果として、
金属キレート化カラムを用いることによって非常に高い純度でｈＧＨを得ること
ができる（Ｍａｉｓａｎｏら、１９８９）。試験した全ての変異タンパク質が、
ニッケルカラムにしっかり結合し、野性型ｒｈＧＨに似たイミダゾール濃度（約
１５ｎＭ）で溶出した。
【０１１０】 実施例７ Ｔ３Ｃの精製 １０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐＱ
−セファロースカラム（ファルマシアバイオテク社、スエーデンウプサラ所在、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に、シスチン存在で調製
した可溶性ペリプラズマ画分（実施例５）をかけ、０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ濃
度の直線勾配の溶出液２０カラム体積で、結合したタンパク質を溶出した。カラ
ムにかけ、回収した画分を１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｔ３Ｃは、１７
０〜２００ｍＭの塩濃度で溶出し、ＷＴ−ｈＧＨよりかなり遅れた。驚いたこと
にＴ３Ｃ変異タンパク質は、カラムにかけた時には単量体として存在したが、Ｑ
カラムから溶出した後、安定なジスルフィドホモ二量体として大部分が回収され
た。還元された時、Ｔ３Ｃ変異タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上では野性
型ｈＧＨと一緒に移動した。Ｑカラム精製段階の間に二量体形成が起きた。シス
チンは、Ｑカラム緩衝液又は他のカラム段階に用いられる緩衝液中には存在しな
かった。さらに、どのような濃縮又は精製段階を通過しても、Ｔ３Ｃは二量体の
ままであった。Ｑカラムからの保存液を、最終ＮａＣｌ濃度０．５Ｍに調節され
、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５で予め平衡化した
１ｍｌのＮｉ−アガロースカラム（キアゲン社、Ｑｉａｇｅｎ）にかけた。洗浄
段階の後、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５中０〜３
０ｍＭのイミダゾール濃度勾配を用いて高純度のＴ３Ｃ二量体を回収した。Ｔ３
Ｃ二量体は、生物検定で活性であった（実施例１０及び表１）。
【０１１１】 Ａ１０５Ｃ、Ｔ１３５Ｃ及びｓｔｐ１９２Ｃ変異タンパク質もまたＱカラムか
らジスルフィド結合二量体として回収された。一度シスチンが除かれると、恐ら
く加えられたシステイン残基によって、ある変異タンパク質は安定なジスルフィ
ド結合二量体を形成できるようにみえる。これらのタンパク質の単量体形は、す
べてのカラム緩衝液中にシスチン又は他のジチオール化合物及び／又はシステイ
ンブロック剤を含有させることによって、そして／又はジスルフィド再結合を避
けるために緩衝液のｐＨを７より低く維持することによって安定化され得たと我
々は確信する。
【０１１２】 実施例８ Ｔ１４８Ｃの精製 変異タンパク質Ｔ １４８Ｃを発現するＥ．Ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０を、１００
μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ３ｍｌの中で一晩育成した。一晩の培養で飽
和状態になった培養物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ５００ｍｌ
の中で、Ａ600において吸光度０．０２５になるまで希釈し、２５０ｍｌずつに
分割し、２基のＬ型振とうフラスコを使って３７℃で培養した。培養物の吸光度
がおよそ０．３５に達すると、１００ｍＭのＩＰＴＧ１．２５ｍｌをそれぞれの
フラスコに加え、最終的に０．５ｍＭにまで濃縮し、遺伝子組換えタンパク質の
発現を誘発した。誘発された培養物は、３７℃で一晩（約１６時間）培養した。
【０１１３】 一晩の培養で誘発された培養物は、６００ｎｍにおける吸光度がおよそ３．５
に達したが、これをＧＳＡローターを備えたソーバルＲＣ−５の遠心機を使って
、４℃で１０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を取り去り、細胞ペレ
ットに以下のような浸透性衝撃処理を施した。細胞ペレットを０度の２０％スク
ロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５．０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ
Ｈ８．０、５．０ｍＭのシステイン（ｐＨは７．５乃至８．０に調節）内で、磨
砕と攪拌によって、吸光度およそ４３まで再懸濁させた。再懸濁した細胞を、氷
上で１５分間培養し、ＳＳ−３４ローターを備えたソーバル遠心機を使用して、
４℃で１０分間、８５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、ペレットを、０
℃に冷やした１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ、ｐＨ ８．０の
ＥＤＴＡ、５ｍＭのシステイン（ｐＨは７．５から８．０に調整）内で、磨砕と
攪拌によって吸光度がおよそ４３になるまで再懸濁させた。再懸濁した細胞を、
氷上で３０分間培養し、ＳＳ−３４ローター内で、４℃で１０分間、８５００ｒ
ｐｍで遠心分離し、その結果できた上清（溶解性細胞周辺画分）を取りだし、−
８０℃で保存した。
【０１１４】 Ｔ１４８Ｃの二次培養については、次の２点以外は同様に行われた。１）誘発
する培養物の量を２００ｍｌとし、３７℃で一晩培養した後、６００ｎｍにおけ
る吸光度がおよそ４．０に達した。２）細胞ペレットの懸濁の際に、Ａ６００に
おける吸光度がおよそ３０になった。
【０１１５】 上記の調整品から得られた水溶性細胞周辺画分を結合し、１０ｍＭ、ｐＨ８．
０のトリス溶液１リットルを使って、４℃で一晩透析した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ８．０ｐＨの緩衝液内で平衡化した５ｍｌのハイトラップＱセファロ
ース１カラム（ファルマシア・バイオテック社、スウェーデン、ウプサラ市所在
）に透析保持物を入れ、０乃至２５０ｍＭの線状勾配のＮａＣｌを２０カラム使
用して、結合タンパク質を溶出した。次いでカラム画分を１４％のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（ノヴェックス社、カリフォルニア州サンディエゴ所在 Ｎｏｖｅｘ、 Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって分析した。塩濃度６０乃至８０ｍＭにおいて
、溶出した変異タンパク質Ｔ１４８Ｃは急激にピークに達した。適当な画分をプ
ールし、セントリコン１０濃縮機（アミックス社、マサチューセッツ州ビバリー
所在）で濃縮した。濃縮したプールを、２０ｍＭ、ｐＨ ７．５の リン酸ナト
リウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ内で平衡化したスーパーデクス２００ＨＲ １０
／３０カラム（ファルマシア・バイオテック社、スウェーデン、ウプサラ市）に
よって、更に精製した。このカラム画分を、再びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析
し、変異タンパク質Ｔ１４８Ｃを含む画分をプールした。観察の結果、Ｑセファ
ロースのカラムから回収後も、変異タンパク質Ｔ１４８Ｃは単量体のままであり
、またスーパーデクスのカラムから溶出の際、分子量は野生型のｈＧＨ（ヒト成
長ホルモン）と同様であった。Ｑセファローズ及び分子ふるい分けクロマトグラ
フィーによって調製された変異タンパク質Ｔ１４８Ｃを、ＬｏｔＡと呼ぶ。
【０１１６】 この他、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５Ｍ、ｐＨ７．５のＮａＣｌで平
衡化したニッケルキレート樹脂（キアゲン社Ｑｕｉａｇｅｎ）に、Ｑプールを直
接加えることも出来る。洗浄ステップに従い、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０
．５Ｍ、ｐＨ７．５のＮａＣｌ内にある０乃至３０ｍＭのイミジゾール成分を使
ってＴ１４８Ｃを回収した。Ｑセファロースとニッケル親和性クロマトグラフィ
ーで製造したタンパク質Ｔ１４８ＣをＬｏｔＢと呼ぶ。システインを使わずに、
浸透圧衝撃によってＴ１４８Ｃの上清を、Ｑセファロースカラムで精製すること
も試みられた。浸透性衝撃緩衝液にシステインが含まれていないことを除き、前
回と同じ方法が用いられた。しかし、Ｔ１４８Ｃタンパク質生成物は、広範囲の
塩濃度でＱカラムから溶出し、回収率は低く、タンパク質製品の純度もシステイ
ンを使ったＴ１４８Ｃサンプルよりも劣っていた。
【０１１７】 実施例９ Ｓ１４４Ｃの精製 Ｓ１４４Ｃ 変異型を含むＥ．Ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０を、１００μｇ/ ｍｌのア
ンピシリンを含む３ｍｌのＬＢで一晩培養した。一晩の培養で飽和状態になった
培養物を、１００μｇ/ ｍｌのアンピシリンを含む２５０ｍｌのＬＢ内で、６０
０ｎｍにおいて吸光度０．０３まで希釈し、二基のＬ型振とうフラスコを使って
３７℃で培養した。培養物の吸光度がおよそ０．３に達したとき、１００ｍＭの
ＩＰＴＧ１．２５ｍｌを加えて最終濃度を０．５ｍＭにし、遺伝子組換えタンパ
ク質の発現を誘発した。誘発された培養物を、３７℃で一晩（約１６時間）培養
した。
【０１１８】 一晩の培養で誘発された培養物は６００ｎｍにおいておよそ吸光度３．３に達
したが、これをＧＳＡロータを備えたソーバルｒＣ−５遠心分離機を使って、４
℃で１０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を取り去り、細胞ペレット
に以下のような浸透圧衝撃処理を施した。細胞ペレットを０度の２０％スクロー
ス、１０ｍＭ、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５．０ｍＭ、ｐＨ８．０のＥＤ
ＴＡ、 ５．０ｍＭのシステイン（ｐＨは７．５から８．０に調節）内で、磨砕
と攪拌によって、吸光度およそ３３まで再懸濁させ、０．２５Ｍ、ｐＨ８．０の
ＭＤＴＡを加えて、最終濃度を２５ｍＭにした。再懸濁した細胞を、氷上で３０
分間培養し、ＳＳ−３４ロータを備えたソーバル遠心機を使用して、４℃で１０
分間、８５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、０℃に冷や
した１ｍＭ、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ、５ｍＭのシステイン（ｐ
Ｈは７．５乃至８．０に調整）内で、磨砕と攪拌によって吸光度がおよそ３３に
なるまで再懸濁させた。再懸濁した細胞を、氷上で３０分間培養し、ＳＳ−３４
ローター内で、４℃で１０分間、８５００ｒｐｍで遠心分離し、その結果できた
上清（溶解性細胞周辺画分）を回収し、−８０℃で保存した。
【０１１９】 上記調製物から得た水溶性細胞質画分を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ８．
０ｐＨで平衡化した５ｍｌのハイトラップＱセファロース１カラム（ファルマシ
ア・バイオテック社、スウェーデン、ウプサラ市所在）に入れ、２０カラム容量
の０乃至２５０ｍＭＮａＣｌの線形勾配を利用して、結合タンパク質を溶出した
。次いでカラム画分を１４％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ノヴェックス社、カリフォル
ニア州サンディエゴ所在 Ｎｏｖｅｘ、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって
分析し、Ｓ１１４Ｃ変異タンパク質を含むむ画分、１２５乃至１５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ部分をプールして凍結させた。Ｓ１４４Ｃ変異タンパク質は単量体であった
。
【０１２０】 実施例１０ ｈＧＨのシステイン変異タンパク質の生物活性 精製されたシステイン変異タンパク質Ｔ３Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｔ１４８Ｃの生物
活性を、実施例１に説明した細胞増殖検定法を用いて測定した。タンパク質濃度
はブラッドフォード検定法で決定した。この三種類の変異タンパク質は生物学的
に活性であった。全ての変異タンパク質は、検定の誤差内で、下垂体ｈＧＨと同
じ、最大刺激レベルに達した。Ｔ３Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｔ１４８Ｃ の変異タンパ
ク質の平均ＥＣ50は、脳下垂体ｈＧＨ及びｒｈＧＨ（表１）のものと同様であっ
たＴ３Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｔ１４８Ｃ。変異タンパク質Ｔ１４８Ｃの独立した見本
を二つ、Ｓ１４４ＣとＴ３Ｃをそれぞれ１つずつ（全てシステインの存在下で調
製された）について、複数回、検定を行った（表１）。部分的に精製された変異
タンパク質Ａ１０５Ｃ、Ｔ１３５Ｃ、ｓｔｐ１９２Ｃもまた検定され、生物活性
を示している。
【０１２１】 実施例１１ システイン変異タンパク質のＰＥＧ化と精製とに関する一般的方法 ＧＨ変異タンパク質は、システインに反応する市販のさまざまなＰＥＧ ｍａ
ｌｅｉｍｉｄｅ（ＰＥＧ ビニルスルホン）試薬を使って、ＰＥＧ化することが
出来る。一般的には、タンパク質をこうした試薬でＰＥＧ化する方法は、ＷＯ９
４１２２１９（コックス及びマクダーモン）、 ＷＯ９４２２４６６（コックス
及びラッセル）に記されているものと同一で、この両者とも本稿リファレンス中
に、大きな改変なしに収められている。自由システインを最高にＰＥＧ化するた
めには、一般的に、遺伝子組換えタンパク質をジチオスレイトール（ＤＴＴ）、
トリス（２−カルボキシル）ホスファイン塩酸（ＴＣＥＰ） あるいはほかの還
元剤によって、部分的に還元する。自由システインは、部分的な還元が行われな
い限り、システイン反応性ＰＥＧには比較的反応が鈍い。それぞれの変異タンパ
ク質を部分的に還元するのに必要な還元剤の量は、さまざまなｐＨと温度におけ
る還元剤の濃度を考慮して、経験的に決める。還元剤の濃度は、ふつう０．５モ
ルの等モル濃度から１０倍モル濃度にまでわたる。温度は４℃から３７℃が望ま
しい。ｐＨ値は６．５乃至９．０にわたるが、７．５乃至８．５が望ましい。最
適な状況もまた、還元剤の種類と暴露時間によって変化する。正当な条件下では
、もっとも安定性のないジスルフィド（一般的には分子間ジスルフィドあるいは
混合ジスルフィド）は、より熱力学的に安定した未変性のジルスフィドに比べ、
より早く分裂する。一般的に、５乃至１０倍モル濃度のＤＴＴを室温で３０分使
うというのが効果的である。部分的な還元は、タンパク質が逆相カラムから離れ
る際の、溶解グラフの微動によって検出することが出来る。二量体ｈＧＨの場合
は、分子量の変動を、非・還元的条件下で行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によっ
て見ることが出来る。この時、タンパク質を過度に還元し、余剰のシステイン残
分を過度に暴露しないようにないように気をつけなければならない。過度の還元
は、層ＨＰＬＣによって（過度に還元したタンパク質は、完全に還元され、変性
したタンパク質同様の保持時間を示す）、またＰＥＧ化反応（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上の分子量変化で検出できる）に伴う二つのＰＥＧを含むＧＨ分子の出現によっ
て も検出することが出来る。野生型のＧＨは、未変化の分子内ジスルフィドを
還元しない条件下ではＰＥＧ化しないため、制御剤として機能しうるのである
過剰な還元剤は、分子ふるい分けクロマトグラフィーあるいは透析によって、Ｐ
ＥＧ化の前に取り除くことが出来る。 TCEP は、自由チオール基を含んでいない
ため、ＰＥＧ化試薬を添加する前に除去する必要はない。部分的に還元したタン
パク質を多様な濃度のＰＥＧマルチマイドあるいはＰＥＧビニルスルホンに反応
させ、（一般にはＰＥＧ：タンパク質分子率が、１：１、５：１、１０：１、５
０：のものを用いる）二つの試薬の最上の率を決定する。タンパク質のＰＥＧ化
は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、分子量の変化によって観察できる。
２値のＰＥＧ化産物を作らずに、単値のＰＥＧ化産物を出来るだけ多く作る製品
を作る最低量のＰＥＧが、一般には最上と考えられる（８０％が単価のＰＥＧ産
物に変換されることが一般的には好ましいと考えられている）。一般には、単量
体のＰＥＧ化タンパク質は、非ＰＥＧ化タンパク質と無反応ＰＥＧから、分子ふ
るい分け、イオン変換、親和、逆相、疎水性の相互クロマトグラフィーなどによ
って精製できる。２層の生物的抽出、塩の沈殿など、他の生成プロトコルも使用
できる。精製されたＰＥＧ化タンパク質は実施例１に記された細胞増殖検定によ
って検定でき、個別の活動を決定する。
【０１２２】 実験の実施によって、ＰＥＧ分子が正しい部位においてタンパク質に付着する
ことを証明することが出来る。これは化学的なあるいは分解によるタンパク質の
消化と、分子ふるい分け・イオン変換・逆相クロマトグラフィー及びそれに続く
アミノ酸配列によるＰＥＧ化ペプチド（分子量が大きい）の精製とによってなさ
れる。ＰＥＧと共役するアミノ酸は、アミノ酸配列中に、空白として現れる。
【０１２３】 実施例１２ ＰＥＧ−Ｔ３Ｃの調製と精製 適正な還元剤とＰＥＧ濃度を決定し、タンパク質の過度の還元を避けるために
、予備的な測定研究を行った。還元されていないＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、二量体
の非還元単体種への変換によるタンパク質の部分的還元を観察した。精製したＴ
３Ｃ二量体の分割量１μｇを室温で６０分間、ＴＣＥＰの濃度をあげながら培養
した。直後に非・還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、反応を分析した。過度の還元
と変性なしに有効な量の単量体Ｔ３C を生む量のＴＣＥＰが、続く実験に使われ
た。ＴＣＥＰはＰＥＧ化反応に支障をきたさないため、タンパク質とＴＣＥＰ混
合物とをＰＥＧ添加の前に透析する必要がなく、小規模の実験には使いやすい還
元剤である。より大きい規模の実験におけるタンパク質還元には、ＤＴＴのよう
な値段の安い還元剤が好まれる。一般に、タンパク質は、至適時間、還元剤と共
に処理される。反応のｐＨはジスルフィドの再組織を制限するために６．５ある
いはそれ以下に調整する。還元剤は透析あるいは液体クロマトグラフィーで除去
する。 その後ｐＨを６．５以上、望ましくは７．５から８．５に再調整し、Ｐ
ＥＧ試薬を添加する。
【０１２４】 ｐＨ ７．５における測定実験は、室温で６０分間使われた５倍モル濃度のＴ
ＣＥＰが、タンパク質を過度に還元することなしに、Ｔ３Ｃ二量体種の大半を、
適当なジスルフィド結合をした単量体に変換することを示した。制御実験は、予
想通り、Ｔ３Ｃ二量体種がＰＥＧ化されるためには、ＴＣＥＰと共に還元される
必要があることを示した。こうした反応コンディションは、反応スケール１００
μｇに達する。１０分後に１０倍モル濃度のマレイミドＰＥＧ（フルカ社）５ｋ
ＤａをＴ３Ｃ、ＴＣＥＰ に添加し、ＰＥＧ化反応を室温で６０分間行った。サ
ンプルをすばやく、２０ｍＭ、ｐＨ８．０の トリス液で平衡化した１ｍｌの
Ｑセルファースのカラムに入れた。カラムを２０ｍＭ、ｐＨ８．０のトリス液で
洗い、１０容量のＮａＣｌを線形勾配させながら、２０ｍＭ、ｐＨ８．のトリス
液内にある０乃至２５０ｍのＮａＣｌから、結合タンパク質を溶出した。単価の
ＰＥＧ化したＴ３を含む画分（Ｔ３Ｃに付着したＰＥＧ単分子）は、ＳＥＳ−Ｐ
ＡＧＥ及びウエスタンブロット法によって確認した。こうした画分をプールし、
凍らせて保存した。ＰＥＧ部分の存在は、タンパク質の樹脂への親和性を弱め、
ＰＥＧ化したタンパク質を非ＰＥＧ化タンパク質から分離させた。
【０１２５】 実施例１３ Ｓ１４４Ｃ及び他のシステイン変異タンパク質のＰＥＧ化 実施例１２でＴ３Ｃについて行ったのと同様に、適当な還元剤、ＰＥＧ試薬濃
度を決定し、タンパク質の過度の還元を避けるために、Ｓ１４４について予備的
な測定研究を行った。２倍モル濃度のＴＣＥＰと１０倍モル濃度の５ｋＤａマレ
イミドＰＥＧを使い、室温で二時間、ｐＨ７．５で、より大きな規模のＰＥＧ化
を実施した。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析すると、２つあるいはそれ以上
のＰＥＧを持つ幾つかの種を示した。これらを、実施例１２と同様に、Ｑセファ
ロースカラムを使用して、単価のＰＥＧ化したＳ１４４Ｃから分離した。別に５
ｋＤビニルサルフォンＰＥＧ（フルカ社）を使ってＰＥＧ化反応を実施し、同様
の還元条件下で、単価のＰＥＧ化Ｓ１４４Ｃを生成した。
【０１２６】 またＴ１４８Ｃ、ｓｔｐ １９２Ｃ、Ｔ１３５Ｃに関して、小規模のＰＥＧ化
反応を行った。すべてが５ｋＤマレイミドＰＥＧ及び／或いは５ｋＤａのビニル
サルフォンＰＥＧによって単体のＰＥＧ化タンパク質を生じた。
【０１２７】 実施例１４ ＰＥＧ−Ｔ３ＣとＰＥＧ−Ｓ１４４Ｃ ｈＧＨタンパク質の生物活性 ＰＥＧ−Ｔ３ＣとＰＥＧ−Ｓ１４４Ｃタンパク質の生物活性を、細胞増殖検出（
実施例１）で測定した。ＰＥＧ‐Ｔ３Ｃタンパク質は、垂体ｈＧＨ、非ＰＥＧ化
したＴ３Ｃタンパク質と同様の用量応答曲線を描き、同様に最高の刺激レベルに
達した。 ＰＥＧ‐Ｔ３ＣについてのＥＣ50平均値は、１．６ｎｇ／ｍｌ（０．
０７ｎＭ）（４回の実験で、それぞれ１．３、１．５、１．７、１．８ｎｇ／ｍ
ｌ）であった。ＰＥＧ−Ｔ３Ｃタンパク質の生物活性は、非特異的ＮＨＳ−ＰＥ
Ｇ試薬（クラークらにより記載された（１９６６）４４０ｎｇ／ｍｌ( ２０ｎＭ
) のＥＣ50）を使ってＰＥＧ化したｒｈＧＨの場合に比べ、少なくとも１００倍
であった。
【０１２８】 ＰＥＧ−Ｓ１４４ＣについてのＥＣ50平均値は、４３ｎｇ／ｍｌ( ２ｎＭ)(二
回の実験で４０、４５ｎｇ/ ｍｌ) であった。ＰＥＧ−Ｓ１４４Ｃの生物活性は
、非特異的ＮＨＳ−ＰＥＧ試薬（クラークらにより記載された（１９６６）４４
０ｎｇ／ｍｌ( ２０ｎＭ) のＥＣ50）を使ってＰＥＧ化したｒｈＧＨの場合に比
べ、およそ１０倍であった。
【０１２９】 実施例１５ ｈＧＨのジスルフィド連鎖３量体、ジスルフィド連鎖高次多量体の作成 １つ以上の「自由」システインを備えた付加的なｈＧＨ変異型を作成し、ｈＧ
Ｈについて、より高次のジスルフィド連鎖多量体を作ることが出来る。これらの
多量体には、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体及び更に高次の
多量体を含む。たとえば、個々の 「自由」システイン変異を起こすインビトロ
ＤＮＡプラスミドベクターを組替える遺伝子組換え技術を使って、２つの「自由
」システイン残基を持ったｈＧＨ変異型を作成することが出来る。あるいは、ｈ
ＧＨシステイン変異型の変異誘発を使って、付加的な「自由」システイン変異を
進めることも出来る。この手続きのどちらかをさらに反復させることで、ｈＧＨ
変異型を作成することが出来る。
【０１３０】 二個の自由システイン残基を持つｈＧＨ変異型を使って、ｈＧＨ３量体とより
高次の多量体を、以下のように作ることが出来る。こうした変異型は、実施例５
から９に述べたように、 Ｅ．Ｃｏｌｉ内に発現することがあり、浸透圧衝撃溶
解物の上清の中にある単量体として回収できる。さらに処理を進め、実施例６か
ら９に示したＱセファロース・クロマトグラフィーのようなジスルフィド結合生
成物を誘発した。こうした条件下では、ｔ３Ｃ及びｓｔｐ１９２Ｃなど一つの自
由システインを持ったｈＧＨ変異型の幾つかは、ジスルフィド連鎖の２量体に、
実質上量的な変換をする。同じあるいは類似の条件下で、例えばｔ３Ｃとｓｔｐ
１９２Ｃを結合させる２価の変異型のような、２つの自由システインを持つｈＧ
Ｈ変異型による分子間ジスルフィド生成物が生まれ、その結果としてｈＧＨ分子
の重合化が生じ、こうした高分子の鎖の長さは原則として制限がない。ｔ３Ｃ変
異型及び／或いはｓｔｐ１９２Ｃ変異型のような、ただ一つの自由システインを
持つｈＧＨ分子を重合反応に加えることで、鎖の長さは制限、及びある程度まで
抑制できる。成長する高分子とただ一つの自由システインを持つ分子との間にで
きたジスルフィド結合生成物は、未熟な高分子の持つ２つの高分子化部位のうち
、一方の伸長を「キャップ」つまり防止する。ただ一つの自由システインを持つ
第二のｈＧＨ分子と、未熟な高分子のもう一方の高分子化部位との反応は、高分
子化を終了させ、高分子の長さを決定させる。高分子の平均長さは、 反応の科
学量論、つまり２つの自由システインを持つｈＧＨ分子と一つの自由システイン
を持つｈＧＨ分子との比率によって制御できる。比率が低いと平均的に短めの高
分子となり、ひり津が高いと長めの高分子となる。より複雑な「分岐した」高分
子は、三つあるいはそれ以上の自由システインを持つｈＧＨ 変異型と、一つだ
けの自由システインを持つｈＧＨ体との反応から作成される。
【０１３１】 それぞれ異なる大きさを持つ高分子は、引き続き分子ふるい分けクロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーそ
の他により精製される。ＧＨについて記されたのと同じ手法により、ジスルフィ
ド連鎖二量体と、より高度の多量体ＥＰＯとアルファ・インターフェロンが作り
出される。
【０１３２】 実施例１６ バキュロウイルス（ＢＶ）に発現した遺伝子組換えヒトエリスロポエチン（ｒ
ＥＰＯ）のクローニング、発現、精製 Ａ．ＥＰＯをコードしたｃＤＮＡをクローニングするヒトのＥＰＯをコードし
たｃＤＮＡを、順方向プライマーＢＢ４５（ ５＞ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧ
ＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧ＞３）（配列番号２５）と 逆方向プラ
イマーＢＢ４７（５＞ ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡ
ＣＡＣＣＴＧ＞ ３）（配列番号 ２６）とを使ったＰＣＲによってクローニン
グした。ＢＢ４５は、ＥＰＯコーディング配列の初発因子メチオニンとアミノ酸
末端とをコードした遺伝子配列をアニ−ルし、またクローニング目的のためにＢ
ａｍ ＨＩ部位を備えている（ジェイコブズら、１９８５年。リン他、１９８５
年）。ＢＢ４７は、翻訳されたストップ記号のすぐ下流にあるＥＰＯ ｍＲＮＡ
の非翻訳領域をアニ−ルし、クローニングを目的とするＥｃｏ ＲＩ抑制部位を
備えている。ヒトの肝臓細胞系Ｈｅｐ３から分離したＲＮＡ全体を、ＰＣＲ用の
一本鎖ｃＤＮＡの第1 鎖合成に使用した。
【０１３３】 細胞全体のＲＮＡ全体を調製するには、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（アメリカンタイプ・
カルチャー・コレクション）を、デルベッコ・モディファイド・イーグルズ・培
地（ＤＭＥＭ）内で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を使って成長させた。細
胞を１８時間、１３０μＭのＤｅｆｏｒｏｘａｍｉｎｅあるいは１００μＭ塩化
コバルトを使って処理し、ＥＰＯ発現を誘発した。どちらの複合物もＨｅｐ３Ｂ
細胞内の、ＥＰＯ ｍＲＮＡとタンパク質との発現を誘発することが知られてい
る（ワン及びセメンザ、１９９３年）。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙミニキット（キア
ゲン社）を使い、製造者の指示通りに細胞から単離した。塩化コバルト処理した
１．４×1 ０7 細胞からおよそ３２０μｇの全ＲＮＡを単離し、Ｄｅｆｅｒｏ
ｘａｍｉｎｅで処理した１．４×１０7細胞からおよそ２７０μｇの全ＲＮＡを
遊離した。一本鎖ｃＤＮＡの第１鎖合成を、ベーリンガーマンハイム社のファー
スト・ストランド・ｃＤＮＡ・シンセシス・キット・フォア・ＲＴ−ＰＣＲ（Ａ
ＭＶ）を使って完成し、プライマーとしてランダムヘキサマーを使った。続いて
鋳型として第１鎖合成物の生成物を、プライマーとしてＢＢ４５、ＢＢ４７を使
い、ＰＣＲ反応を実行した。反応生成物を、アガロースゲル上に注いだ際、予期
どおりの約６００ｂｐのＰＣＲ産物が観察された。ＰＣＲ産物はＢａｍ ＨＩと
Ｅｃｏ ＲＩによって消化し、Ｂａｍ ＨＩとＥｃｏＲＩによって切り取られた
ベクターｐＵＣ１９内でクローニングし、アルカリ性ホスフォターゼで処理した
。ＤＮＡシークエンシングにより、ＥＰＯ遺伝子を作る正しいシグナル配列を含
むクローンを確認した。プラスミドをｐ ＢＢＴ１３１と名付け、実施例１７の
記述通り、部位特異的突然変異誘発によるＥＰＯ変異型の構築に使用した。
【０１３４】 Ｂ．昆虫の細胞におけるＢｖ ｒＥＰＯの発現 ｐＢＢＴ１３１内のＥＰＯ ｃＤＮＡを、５’末端及び３’末端の双方で修飾
し、昆虫細胞において発現させた。５’末端においては、配列ＣＡＡＡを、イニ
シエーターＡＴＧのすぐ上流に加えて、翻訳を強化した。この配列は、バキュロ
ウイルス（エアーズら １９９４年；ランジャン及びハスネイン、１９９５年）
の提唱コンセンサス翻訳開始配列である。末端３’には、８アミノ酸ＦＬＡＧエ
ピトート配列（ａｓｐ−ｔｙｒ−ｌｙｓ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ｌ
ｙｓ）( 配列番号２７) を加え、精製システムを提供した。ＦＬＡＧエピトー
プを、柔軟性のあるリンカーｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ
−ｓｅｒ（配列番号２８）を通して、ＥＰＯ遺伝子と融合した。こうした修飾は
、望みの添加物をＥＰＯ配列に組みこむオリゴヌクレオチド・プライマーを使っ
たＰＣＲによりなされた。遺伝子の５’末端を修飾するためには、オリゴヌクレ
オチド・プライマーＢＢ６３（５＞ＣＧＣＣＧＡＴＣＣＡＡＡＡＴＧＧＧＧＧＴ
ＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴ＞３）( 配列番号２９) を使用した。ＢＢ６３はＣ
ＡＡＡ配列をＡＴＧの上流に添加し、イニシエーターであるメチオニンをコード
するＤＮＡ配列と、ＥＰＯコーディング配列のアミノ酸末端部とにアニ−ルし、
クローニングを目的とするＢａｍ ＨＩ部位を備えている。リンカーとＦＬＡＧ
配列を、逆方向プライマー ＢＢ６０（５＞ＧＴＣＴＴＴＧＴＡＣＴＣＣＧＡＧ
ＣＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＣＧＡＴＣＴ ＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡ
＞３）（配列番号３０）及びＢＢ６１（ ５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴ
ＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＣＧＡＧＣＣＴＣＣ＞３）（配列
番号３１）を」使って配列ＰＣＲ反応に加える。ＢＢ６０はＥＰＯコーディング
配列の３’末端をアニールし、融合したペプチドリンカー配列とＦＬＡＧ配列の
一部を含んでいる。 ＢＢ６１はリンカーとＦＬＡＧのジャンクションをアニ−
ルするＢＢ６０ 配列の断片と重なり、ＦＬＡＧ配列の残り、ついで翻訳停止コ
ドン（ＴＡＡ）及びＥｃｏＲＩ部位を、クローニングのために付加した。修飾さ
れたＥＰＯ ｃＤＮＡは、Ｂａｍ ＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてｐＵＣ１９内で
クローニングされて、この構造のＤＮＡ配列は確認された。結果として出来たプ
ラスミドを、ｐＢＢＴ１３２と命名し、実施例１７の通り、ＥＰＯ変異型の作成
に使用した。バキュロウイルスでの発現のため、「ＦＬＡＧ タッグした」ＥＰ
Ｏ ｃＤＮＡをｐＢＢＴ１３２の約６３０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｐＲＩ断片か
ら切断し、ゲル精製を行い、Ｂａｍ ＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断すると共にアル
カリホスファターゼ処理したバキュロウイルスの伝達ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ
４．５（インビトロジェン社 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）でクローニングする。
クローンを後の使用のために一つ抜き出し、ｐＢＢＴＩ３８と命名する。
【０１３５】 ｐＢＢＴ１３８ＤＮＡを使って、スポドプテラ・フルジペルダ由来の細胞系Ｓ
ｆ９と、線状化した（Ｂｓｕ３６Ｉで消化）Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅTM（インビト
ロジェン社 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）バキュロウイルスＤＮＡとを、細胞内に
同時移入する。Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅTMゲノムの設計によって、プラーク形成ウ
イルス粒子生成物は、線状Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅTMＤＮＡと、ｐＢｌｕｅＢａｃ
４．５ベクターとの間の遺伝子組換えが必要となり、結果として、クローニング
したＥＰＯ遺伝子がバキュロウイルスゲノムに組み込まれる。この義務的組み込
みにより、機能的なβ−ガラクトシダーゼ遺伝子もバキュロウイルスゲノムに組
み込まれる。この同時移入は、インビトロジェン社の「Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅTM キット」のプロトコルに従ってなされる。２×１０6個のＳｆ９細胞を使って約
１ｍｌの上清を作る。この上清の希釈物を、Ｓｆ９細胞について青色プラークの
形成に関し、２７℃で検出した。１０個の青色プラークを取り上げ、サブ培養し
た。それぞれのプラークを使って、１０％のＰＢＳを補充したグレイス昆虫培地
５ｍｌを含むＴ２５フラスコ内でＳＦ９細胞２．５×１０6を接種する。５日後
、これらの感染細胞（ＰＩストック）からの上清を収集し、ウエスタンブロット
によってＥＰＯの発現を検出した。上清１０個を１％のβメルカプトエタノール
（ＢＭＥ）を加えたＳＤＳサンプル緩衝剤にいれて、１４％のトリス・グリシン
・ポリアクリルアミド（ノヴェックス社 Ｎｏｖｅｘ）によって電気泳動した。
未感染のＳＦ９細胞の上清をネガティブコントロールとして含めた。電気泳動の
後、タンパク質を０．４５μｍニトロセルロース（ノヴェックス社 Ｎｏｖｅｘ
）に転移させた。ニトロセルロース膜を、０．０５％ のトウィーン２０、４％
と粉末ミルクを加えたトリス緩衝生理ＮａＣｌ水（ＴＢＳ）（ブロッキング緩衝
剤）に入れてブロックした。抗ＦＬＡＧ Ｍ２マウスＩｇＧ1モノクローナル抗
体（イーストマン・コダック社 Ｅａｓｔｍａｎ ＫＯＤＡＫ）をブロッキング
緩衝剤の中で、１：１５００あるいは１：２５００に希釈して使い、ブロットを
手順にしたがって４℃で一晩培養した。アルカリ性ホスファターゼ共役ヒツジ抗
マウスＩｇＧ1（バインディング部位社）をブロッキング緩衝剤の中で１：１０
００に希釈し、ブロットを室温で１時間培養した。ウエスタンブロットを、ＮＢ
ＴＢＣＩＰカラーディベロップメントサブスタンス( プロメガ社) を使って展開
させた。１０の分離体の内９が、ＥＰＯ発現に陽性反応を示した。ＢＶ ｒＥＰ
Ｏタンパク質の分子量は、還元条件下でおよそ３０ｋＤａであり、この分子量の
範囲内で、１本の大きいバンドと１ないし２本の小さいバンドを備え、これはグ
リコシル化されたタンパク質一般に認められる。
【０１３６】 陽性反応を示す２つの上清を、下記実施例１６のＤに記したインビトロのＥＰ
Ｏ生物検定で調べた。双方の上清が、ＥＰＯ依存細胞系の増加を用量依存性に刺
激し、ＥＰＯ活性を持っていることを示した。擬似感染をしたＳf ９細胞のコン
トロール上清と、ウェスタンブロットによりＥＰＯ発現が陰性であったバキュロ
ウイルスの１つの上清は、ＥＰＯ生物検定において、検出し得る活性は示さなか
った。
【０１３７】 大量の野生型ＢＶ ｒＥＰＯを生成し精製するために、ｂｖＢＢＴ１３８Ａと
名づけた、１つの陽性の組替えバキュロウイルスを更なる増幅用に選択した。分
離体１３８ｎｍのＰ１ストックを、５００ｍｌのスピナーフラスコ培養基内の１
０％のＰＢＳを補充したグレイス昆虫培地内で２７℃でサブ培養することにより
、高力価のウイルスストック５００ｍｌを用意した。グレイス昆虫培地は、およ
そ１００μＭのＬ−システインを含む。培養物の上清を７日後に採取し、約１０ 8 のプラーク形成ユニット/ ｍｌの力価をを有していることを見出した。この溶
解物のアリコートをＰ２ストックと名づけ、これを使って５００ｍｌの培養物を
感染させ、野生型ＢＶ ｒＥＰＯのより大規模な製造を行った。１０％のＰＢＳ
を補充したグレイス昆虫培地中の５００ｍｌのＳｆ９細胞の培養物を、スピナー
フラスコ内で１．０×１０6の力価まで成長させ、次いで１つのさまざまな感染
法でＢＢＴ１３８Ａに感染させた。３日後に培養物から上清を採取し、野生型の
ＢＶ ｒＥＰＯ−１３８Ａタンパク質を実施例１６ｃの通りに精製した。
【０１３８】 Ｃ．野生型バキュロウイルス製造のｒＥＰＯのアフィニティ精製 細胞の上清を、遠心分離と０．２μＭの濾過によって精製した。野生型のＢＶ
ｒＥＰＯを抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティゲル（イーストマン・コダック社）
を用いて１段階法で精製した。簡単に言うと、Ｍ２アフィニティゲルを ５カラ
ム量の５０ｍＭ トリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）、５カラ
ム量の０．１Ｍ グリシン ｐＨ３．５で洗い、次いでＴＢＳで平衡化する。浄
化したバキュロウイルス細胞の上清を、１５０ｍＭのＮａＣｌに調整し、平衡化
した樹脂を加えた。バッチローディングを、ローラボトル上で４℃で一晩続ける
。一晩のインキュベーション後、ファルマシアＸＫ１６／２０ ＦＰＬＣカラム
を使って樹脂を回収し、Ａ２８０が基準に達するまでＴＢＳで洗浄した。０．１
Ｍ グリシン ｐＨ３．５で結合タンパク質を溶出し、画分を集めて１．０Ｍ
トリスｐＨ９．０で中和する。必要に応じてＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液の
中に１％ＢＭＥを加えてカラム画分を調製し、既成の１４％トリスグリシン・ポ
リアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ＢＶ ｒＥＰＯの大半を含むＭ２アフ
ィニティカラムの画分をプールし、セントリコン１０スピンコンセントレイター
（アミコン社）で濃縮した。野生型ＢＶｒＥＰＯの最終収量は、ブラッドフォー
ドプロテインアセイキット（バイオラッドラボラトリーズ社）及びウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を基準にして決定したが、約３６０μｇであった。ＳＤＳゲル
のクーマシ−ブルー染色でタンパク質を測定すると、９０％以上の純度を示した
。
【０１３９】 Ｄ．野生型バキュロウイルスｒＥＰＯのインビボ生物活性 ヒトのＵＴ７／ｅｐｏ細胞系を使った細胞増殖検定（コマツ他、１９９１年）
を開発して、野生型のＢＶ ｒＥＰＯの生物活性を測定した。ヒトのＵＴ／ｅｐ
ｏ細胞系は、ハーバード大学医学部のＦ．バン博士から得たものである。この細
胞系は、ＥＰＯによって細胞の増殖と生存とを測定するものである（ボイセルほ
か、１９９３年）。該細胞は１０％のＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌ ペニシリン
、５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１ユニット／ｍｌ ｒＥＰＯ（ＣＨＯ
( チャイニーズハムスター卵巣) 細胞を発現させたもの。Ｒ＆Ｄシステムズ社で
購入）によって補充した、イソコフズ改変デルベッコ培地（ＩＭＤＭ）内に維持
した。生物検定に際し、I ＭＤＭ培地で細胞を三回洗い、１０％ ＦＢＳ、５０
ユニット／ｍｌ ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＩＭ
ＤＭ培地内で、１×１０5の細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞懸濁５０μｍ
（５×１０3細胞）を、平底９６ウェル型組織培養プレートの１テストウェル当
たりに当分量で割り当てた。テスト用に、タンパク質サンプルの三倍希釈液を、
１０％ ＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌ ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ ストレプ
トマイシンを含み、フェノールレッドを含まないＩＭＤＭに溶かして調製した。
５０μｇ／ｍｌ希釈タンパク質サンプルをテストウエルに加え、加湿した５％Ｃ
Ｏ2組織培養器の中で、３７℃で培養した。タンパク質サンプルを三つ一組のウ
エル内で測定した。６０から７２時間後、２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６Ａ
Ｑｗｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社）
を各ウェルに加え、組織培養器で１から４時間、３７℃で培養した。ウェルの吸
光度を、マイクロプレートリーダーを使って、４９０ｎｍで測定した。コントロ
ールウェルには培養液はいれたが、細胞は入れなかった。３つ組のコントロール
ウェルの平均吸光度を、３つ組のテストウェルそれぞれの組の平均値から引いた
。ＣＨＯ細胞で発現させたｒＥＰＯあるいは野生型のＢＶ ｒＥＰＯの連続希釈
液を、並行して分析した。
【０１４０】 ＵＴ７／ｅｐｏ細胞系は、細胞数と吸光度における用量依存性増加が示すとお
り、ｒＥＰＯに対し、強い増殖反応を見せた。吸光度は、数値２．０まで細胞の
数に比例した（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）．ｒＥＰＯが存在しない場合には、多くのＵＴ７
／ｅｐｏ細胞 は死に、吸光度は０．１以下になった。市販のＣＨＯ細胞発現ｒ
ＥＰＯと我々の用意した野生型ＢＶ ｒＥＰＯは、検定の誤差範囲内で同じ最高
刺激レベルに達し、生物検定における平均ＥＣ50は、約０．４から０．５ｎｇ／
ｍｌ（表２）であった。異なる日に行った検定でのこれらタンパク質についての
ＥＣ50の値は０．２１から０．６５５ｎｇ／ｍｌにわたった（表２）。従ってこ
れらのタンパク質サンプル間の比較は、同日に分析されたサンプルについて行っ
た。それらのＥＣ50値は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｓ ｆｏｒ ＣＨＯ ｒＥＰＯで報告されている値（０．０５−０．１ユニット
／ｍｌ又は約０．４−０．８ｎｇ／ｍｌ）と一致する。
【０１４１】 実施例１７ ＥＰＯシステイン変異タンパク質の構築、発現、精製、生物活性 Ａ．ＥＰＯシステイン変異タンパク質の作成 実施例４に示された成長ホルモン変異タンパク質の作成に使われる方法（イニ
スら、１９９０年。ホートンら、１９９３年）と同じ、ＰＣＲに基づく部位特異
的変異誘発方法を使用して、８つの変異ＥＰＯ遺伝子を作成した。Ａ−Ｂループ
内にあるＮ結合グリコシル化部位あるいはその近くで４つの変異タンパク質（Ｎ
２４Ｃ、Ｔ２６Ｃ、Ｎ３８Ｃ及びＴ４０Ｃ）、Ｂ−Ｃループ内のＮ結合グリコシ
ル化部位あるいはその近くで２つの変異タンパク質（Ｎ８３Ｃ、Ｓ８５Ｃ）、
Ｃ−Ｄループ内のＮ結合グリコシル化部位あるいはその近くで１つの変異タンパ
ク質（Ｓ１２６Ｃ）、そして自然のカルボキシ末端Ｒ１６６残基と、ペプチドリ
ンカーとＦＬＡＧ配列からなる１５アミノ酸カルボキシ末端延長部との間にシス
テインを加える１つの変異タンパク質（１６７Ｃ）を構築した。変異ＰＣＲの反
応の鋳型は、プラスミドｐＢＢＴ１３１であり、この場合、非修飾ＥＰＯ遺伝子
がＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてｐＵＣ１９でクローニングされる。ＰＣＲ
産物を、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル精製し、適当な制限酵素
によって切り取ったｐＢＢＴ１３２ベクターＤＮＡとライゲートし、アルカリホ
スファターゼ処理し、ゲル精製を行った。上記に詳しく述べたように、ｐＢＢＴ
１３２は、クローニングした修飾（ＦＬＡＧを組みこんだ）ＥＰＯ遺伝子を有す
るｐＵＣ１９変異型である。こうしたライゲーションからの形質転換体を成育し
、プラスミドＤＮＡを分離して配列決定する。クローニングした突然変異ＰＣＲ
断片全体の配列を決定し、問題の変異が存在することを確認すると共に、ＰＣＲ
反応によって、あるいは合成オリゴヌクレチドプライマーによって誘発される可
能性のある任意の追加的変異が存在しないことを確認した。
【０１４２】 システイン置換変異Ｎ２４Ｃを、以下のように構築した。変異順方向オリゴヌ
クレチドＢＢ６４（５＞ＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＴＧＴＡＴＣＡ
ＣＧＡＣＧＧＧＣＴＧＴＧＣＴ＞３）（配列番号３２）は、位置２４におけるア
スパラギンをコドンＡＴＴと変化させて、システインをコードするＴＧＴにし、
近くにあるＳｔｙｕ １部位 にも影響を及ぼす。このオリゴをＥＰＯのシグナ
ル配列に至るＤＮＡ配列３’にアニールするプライマー逆方向の非変異性プライ
マーＢＢ４７（５＞ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴ
ＧＧＡＣ＞３）（配列番号 ３３）と共に、ＰＣＲで使用した。１．５ｍＭのＭ
ｇＣｌ2、各プライマーを０．２μＭ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴ
Ｐをそれぞれ２００μＭ、１ｎｇの鋳型プラスミドｐＢＢＴ１１３（実施例１６
に記述）、１．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（プロメガ社）、０．２５ユニ
ットのＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社）を含む１Ｘ Ｐｒｏｍｅｇａ
ＰＣＲ緩衝液で５０μｌ ＰＣＲ反応を行った。反応は、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６サーマルサイクラー（ストラタジーン社）で行った。
反応のプログラムは次ぎの通りである：９６℃で三分間、［９５℃で１分間、６
０℃で１．２５分間、７２℃で１分間］を２５サイクル、次いで６℃で保持。Ｐ
ＣＲ反応の５μｌアリコートを、アガロースゲル電気泳動によって分析し、予期
した大きさ約４７０ｂｐの１つの断片を見出した。反応の残りは、ＱＩＡｑｕｉ
ｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（キアゲン社）を使って、業者のプロ
トコル通りに「片付け」、業者のプロトコル通りのＳｔｙＩとＢｓｒＧＩ（ニュ
ーイングランド・バイオラブズ社）で消化し、エタノール沈殿させ、２０μｌの
１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８の中で再懸濁し、２％のアガロースゲルの上
に注いだ。約４００ｂｐのＳｔｙＩ−ＢｓｒＧＩ断片は、ＱＵＩＡＥＸＩＩ Ｇ
ｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を使用して業者のプロトコ
ル通りにゲル精製した。この断片を、ＳｔｙＩとＢｓｒＧＩによって切断したｐ
ＢＢＴ１３２（実施例１６に記述）とライゲートし、ウシ腸アルカリホスファタ
ーゼ（ニューイングランド、バイオラブズ社）によって処理し、ゲル精製した。
ライゲーション反応を使ってＥ．Ｃｏｌｉを形質転換し、結果として出来た形質
転換体から得たプラスミドの配列を決定して、Ｎ２４Ｃ変異と、正しい配列と備
えたクローンを、約４００ｂｐのＳｔｙＩ−ＢｓｒＧＩ断片の残りを通じて確認
する。
【０１４３】 置換突然変異型Ｔ２６Ｃを作成して、その配列を、変異順方向オリゴＢＢ６５
（５＞ＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＣＧＡＧＡＡＡＴＣＴＧＴＡＣＧＧＧＣ
ＴＧＴＧＣＴ
【０１４４】 ＞３）（配列番号３４）をＢＢ６４の代わりに使用することを除き、上記のＮ２
４Ｃのものと同様なプロトコルを用いて確認した。 置換突然変異型Ｎ３８Ｃを、実施例４に示した「オーバーラップ延長による突
然変異」技術を使って作成する。異なるオリゴヌクレオチドプライマーを使用す
る点を除き、Ｎ３８Ｃの構築のための最初のあるいは「一次」のＰＣＲ反応は、
上記Ｎ２４Ｃの構築に記されているのと同様の方法で行った。使用したプライマ
ーの組は、（ＢＢ６６6 ＋ＢＢ４７）及び（ＢＢ６７＋ＢＢ４５）であった。Ｂ
Ｂ４７については上記に説明がある。順方向非変異性のプライマーＢＢ４５（５
＞ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧ＞３）（
配列番号３５）はＥＰＯの最初の７つのアミノ酸をコードするＥＰＯ配列にアニ
ールする。ＢＢ６６とＢＢ６７は、Ｎ３８のＡＡＴコドンをシステインのＴＧＴ
コードに変化させる。相補的な突然変異オリゴヌクレオチドである。ＢＢ６６の
配列は（５＞ＡＧＣＴＴＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧ
ＡＣＡＣＣ＞３）（配列番号３６）であり、ＢＢ６７の配列は（５＞ＧＧＴＧＴ
ＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＴＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＡＡＧＣＴ＞３）（配列番号
３７）である。（ＢＢ６６×ＢＢ４７）と（ＢＢ６７×ＢＢ４５）のＰＣＲ反応
は、予期通り、（ＢＢ６７×ＢＢ４７）は約４２０ｂｐ、（ＢＢ６７×ＢＢ４５
）は約２２０ｂｐの大きさの産物を与えた。ＰＣＲ産物はエタノール沈殿、ゲル
精製を行い、上記に詳しく述べたように、２０μｌの１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
で回収した。こうした突然変異画分を、後のあるいは「二次の」ＰＣＲ反応の中
で一緒に「スプライシング」する。この反応において、1 次反応のゲル精製した
ＰＣＲ産物をそれぞれ１μｌ使用し、ＢＢ４５とＢＢ４７をプライマーとして使
う。ほかの点では、第１次反応で使われている反応条件と同様である。二次のＰ
ＣＲのアリコートをアガロースゲルの電気泳動で分析し、予期されたー約６３０
ｂｐのバンドを観察した。二次ＰＣＲ反応のバルクを、ＱＩＡＱｕｉｃｋＰＣＲ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ( キアゲン社) を使い、業者のプロトコルに従って「
片付け」、ＳｔｙＩ及びＢｓｒＧＩ（ニューイングランドバイオラブ社）で業者
のプロトコルに従って消化し、エタノール沈殿し、２０μｌの１０ｍＭ ｐＨ８
．５ トリスに再懸濁させ、２％のアガロースゲルにかけた。約４００ｂｐのＳ
ｔｙＩ−ＢｓｒＧＩの問題の画分を、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社） を使い、業者のプロトコルに従ってゲル精製
した。この画分を、ＳｔｙＩとＢｓｒＧＩを使って切り取ったｐＢＢＴ１３２（
実施例１６に説明）とライゲートし、コウシ腸アルカリホスファターゼ（ニュー
イングランドバイオラブ社）で処理し、ゲル精製を行った。ライゲーション反応
を用いて、Ｅ．Ｃｏｌｉを形質転換し、結果として出来る形質変換体からのプラ
スミドを配列決定して、Ｎ３８Ｃ変異を含み、正しい配列を有するクローンを、
約４００ｂｐのＳｔｙＩ−ＢｓｒＧＩ断片を通じて確認した。
【０１４５】 置換変異Ｔ４０Ｃを構築し、配列を確認した。この時の方法は、Ｔ４０のＡＣ
ＴコドンをシステインのＴＧＴコドンに変える相補的変異プライマーＢＢ６８（
５＞ＡＧＣＴＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＴＡＴＣＴＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣ（
配列番号３８）及びＢＢ６９（５＞ＧＧＴＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＡＴ
ＴＣＴＣＡＴＴＴＣＡＡＧＣＴ＞３）（配列番号３９）が、１次ＰＣＲ反応での
ＢＢ６６とＢＢ６７にそれぞれ代わっていることを除き、上記のＮ３８Ｃの場合
と同じである。
【０１４６】 置換変異Ｎ８３Ｃを構築し、配列を確認した。この時の方法は、Ｎ８３のＡＡ
ＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変える相補的変異プライマーＢＢ７０（
５＞ＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＧＴＧ
ＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧ＞３）（配列番号４０）及びＢＢ７１（５＞ＣＡＧＧＧＧ
ＣＴＣＣＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＧＣ＞３）
（配列番号４１）が、１次ＰＣＲ反応でのＢＢ６６とＢＢ６７にそれぞれ代わっ
ていることを除き、上記のＮ３８Ｃの場合と同じである。１次ＰＣＲ反応の産物
の大きさは、さまざまであった。（ＢＢ７０×ＢＢ ４７）反応では、予想通り
約３００ｂｐの産物が生じ、（ＢＢ７１×ＢＢ４５）反応では、予想通り約３６
０ｂｐの産物が生じた。
【０１４７】 置換変異Ｓ８５Ｃを構築し、配列を確認した。この時の方法は、Ｎ８５のＴＣ
ＣコドンをシステインのＴＧＣコドンに変える相補的変異プライマーＢＢ７２（
５＞ＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＧＡＧＣ
ＣＣＣＴＧ＞３）（配列番号４２）及びＢＢ７３（５＞ＣＡＧＧＧＧＣＴＣＣＣ
ＡＣＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＴＴＧＡＣＣＡＡＣＡＧＧＧＣ＞３）（配列番号
４３）が、１次ＰＣＲ反応内でのＢＢ６６とＢＢ ６７にそれぞれ代わっている
ことを除き、上記のＮ３８Ｃの場合と同じである。１次ＰＣＲ反応の産物の大き
さは、さまざまであった。（ＢＢ ７２×ＢＢ ４７）反応では、予想通り約３
００ｂｐの産物が生じ、（ＢＢ７３×ＢＢ４５）反応では、予想通り約３６０ｂ
ｐの産物が生じた。
【０１４８】 置換変異Ｓ１２６Ｃを構築し、配列を確認した。この時の方法は、Ｓ１２６Ｃ
のＴＣＡコドンをシステインのＴＧＴコドンに変える相補的変異プライマーＢＢ
７４（５＞ＣＣＡＧＡＴＧＣＧＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣ＞３）（
配列番号４４）及びＢＢ７５（５＞ＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＣＧ
ＣＡＴＣＴＧＧＴＣＣＡＣＴＣ＞３）（配列番号４５）が、１次ＰＣＲ反応での
ＢＢ６６とＢＢ６７にそれぞれ代わっていることを除き、上記のＮ３８Ｃの場合
と同じである。１次ＰＣＲ反応の産物の大きさは、さまざまであった。（ＢＢ
７４×ＢＢ ４７）反応では予想通り約１７５ｂｐの産物が生じ、（ＢＢ７５×
ＢＢ４５）反応では、予想通り約４８０ｂｐの産物が生じた。
【０１４９】 さらにＥＰＯコーディング配列のカルボキシ末端アミノ酸のあとにシステイン
を加えた変異型を作成した。*１６７Ｃと名付けたこの変異型は、次のように作
成される。上記に、Ｎ２４Ｃ変異型構築について記したのと同じ条件下でＰＣＲ
反応を行った。ただし、オリゴヌクレチドＢＢ４５（上記参照）と逆方向変異オ
リゴヌクレチドＢＢ７７（５＞ＴＴＴＧＴＡＧＴＣＣＧＡＧＣＣＴＣＣＧＣＴＴ
ＣＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡ＞３）（配列番
号４６）を使い、Ｔａｑポリメラ−ゼ２．５単位とＰｆｕポリメラーゼ０．５単
位を使用した。ＢＢ７７は、ＥＰＯコーディング配列の末端２１残基にアニール
し、Ｒ１６６のＡＧＡコドンの後でシステインのＴＧＴコドンが加わったが、こ
れはＥＰＯコーディング配列の末端アミノ酸である。ＢＢ７７にはまた、７つの
アミノ酸リンカー（−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ‐ｇｌｙ−ｓｅ
ｒ）（配列番号２７）をコードする配列と、ＦＬＡＧエピトープ配列の一部が加
わった。このＰＣＲ反応の約６３０ｂｐ産物をゲル精製し、続くＰＣＲ反応での
鋳型として使った。続くＰＣＲ反応では、プライマーＢＢ４７とＢＢ６１（５＞
ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣ
ＣＧＡＧＣＣＴＣＣ
【０１５０】 ＞３）（配列番号３０）を使用する以外、同じ反応を使用した。ＢＢ６１には、
ＴＡＡ停止コドンとＥｃｏ ＲＩクローニング部位が続くＦＬＡＧエピトープ配
列の残りが加わっている。約６７５ｂｐのＰＣＲ反応産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ
ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｎ（キアゲン社）を使して業者のプロトコルに
従って「片付け」、ＳｔｙＩ及びＥｃｏＲＩ（ニューイングランドバイオラブ社
）を使って消化し、エタノール沈殿を行い、２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ８．５に再懸濁させ、２％のアガ゛ ロースゲルにかけた。約８６ｂｐ
の問題のＥｃｏＲＩ−ＢｓｒＧＩ断片を、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒ
ａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を使い、業者のプロトコルに従ってゲル精
製した。この断片をＥｃｏＲＩ−ＢｓｒＧＩで切り取ったｐＢＢＴ１３２（実施
例１６に記述）にライゲートし、コウシ腸アルカリホスフォターゼ（ニューイン
グランドバイオラブ社）で処理し、ゲル精製した。
【０１５１】 ライゲーション反応を使ってＥ．Ｃｏｌｉを形質転換し、結果として出来た形
質変換体からのプラスミドを配列決定して、*１６７Ｃ変異型と、正しい配列を
有するクローンを、約８６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢｓｒＧＩ断片を通じて確認した
。
【０１５２】 バキュロウイルスの発現のため、ｐＵＣ １９に基づく派生物ｐＢＢＴ１３２
から、８つの変異型をコードするＥＰＯ遺伝子を、約６３０ｂｐのＢａｍＨＩ−
ＥｃｏＲＩ断片として切り出し、野生型のＥＰＯの発現に使用したｐＢｌｕｅＢ
ａｃ４．５バクロウイルス移入ベクターでサブクローニングした。
【０１５３】 ここに記されたのと同様の手法をつかって、ほかのＥＰＯシステイン変異タン
パク質をつくることもできる。システイン変異タンパク質は、システインをＥＰ
Ｏコーディング配列内の天然アミノ残基に置きかえる置換変異型、ＥＰＯコーデ
ィング配列内の２つの天然アミノ酸の間にシステイン残基を挿入する挿入変異型
、ＥＰＯコーディング配列内の第１のアミノ酸Ａ１に先行するシステイン残基を
付加し、あるいはＥＰＯコーディング配列内の末端アミノ酸残基Ｒ１６６の後に
来るシステイン残基を付加する付加変異型などがある。システイン残基は、いか
なるアミノ酸とも置換でき、ＥＰＯコーディング配列のどこにおいても、どの２
つのアミノ酸の間にも挿入できるのである。ＥＰＯ中のシステイン残基の置換あ
るいは挿入の部位として望ましいのは、ＨｅｌｉｘＡより前の領域、Ａ−Ｂルー
プ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループ、へリックスＤより後の領域がある。ほかに望
ましい部位としては、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄへリックスの最初か最後の三つのアミノ酸
がある。これらの領域にある残基で、システイン置換体を作るのに望ましいもの
は、以下の通りである。Ａ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｒ４、Ｌ５、Ｄ８、Ｓ９、Ｉ２５、
Ｔ２７、Ｇ２８、Ａ３０、Ｅ３１、Ｈ３２、Ｓ３４、Ｎ３６、Ｉ３９、Ｄ４３、
Ｔ４４、Ｋ４５、Ｎ４７、Ｙ４９、Ａ５０、Ｋ５２、Ｒ５３、Ｍ５４、Ｅ５５、
Ｇ５７、Ｑ５８、Ｇ７７、Ｑ７８、Ａ７９、Ｓ８４、Ｑ８６、Ｗ８８、Ｅ８９、
Ｔ１０７、Ｒ１１０、Ａ１１１、Ｇ１１３、Ａ１１４、Ｑ１１５、Ｋ １１６、
Ｅ１１７、Ａ １１８、Ｓ１２０、Ｐ１２１、Ｐ１２２、Ｄ１２３、Ａ１２４、
Ａ１２５、Ａ１２７、Ａ１２８、Ｒ１３１、Ｔ１３２、Ｋ１５４、Ｙ１５６、Ｔ
１５７、Ｇ１５８、Ｅ１５９、Ａ１６０、Ｔ 1 ６３、Ｇ１６４、Ｄ１６５、Ｒ
１６６である。システイン残基はまた、これらのアミノ酸の直前か直後にも直接
挿入することも出来る。システイン残基を付加するのに望ましいもう一つの部位
は、Ａ１の前で、*−１Ｃと呼ばれている。
【０１５４】 また、別のアミノ酸を、ＥＰＯ内で天然システイン残基を置換することで、Ｅ
ＰＯ変異タンパク質を構築できる。通常、置換されたシステイン残基とジスルフ
ィド結合を形成する天然システイン残基は、自由である。非必須システイン残基
はほかの１９のアミノ酸のいずれとでも入れ替えられるが、セリンあるいはアラ
ニン残基が望ましい。また、自由システインの残基を、シトコウスキーら（１９
８８）によって記述されたような方法を使い、天然アミノ酸の化学的修飾によっ
て、ＥＰＯに導入することができる。
【０１５５】 実施例１６−１９に記されたのと同様の方法を使い、真核細胞（昆虫細胞や哺
乳類の細胞）、の中にタンパク質を発現させ、タンパク質を精製し、タンパク質
をＰＥＧ化し、インビトロ生物検定において、生物活性を測定することが出来る
。また実施例１‐１５に記されたのと同様の手法を使い、あるいは関係者によく
知られた関連の方法を使って、Ｅ．Ｃｏｌｉのような原核細胞の中に、ＥＰＯ変
異タンパク質を発現させることが出来る。
【０１５６】 Ｂ．ＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質の昆虫細胞での発現 発現実験では、上で説明した野生型ＥＰＯをコードするプラスミドｐＢＢＴ１
３８に関する手順を使用して、Ｓｆ９細胞を線形化したＢａｃ−Ｎ−ＢｌｕｃTM ＤＮＡとともに同時移入するために、変異型ＥＰＯをコードする８つのプラスミ
ドを使用した。トランスフェクション上清は、Ｓｆ９細胞上で、青色プラーク形
成について検定した。それぞれの変異型について、１０個の青色プラークを取り
出し、実施例１６において説明するように継代培養した。１０つのうち５つの上
清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによりスクリーニングし、ＥＰ
Ｏ変異型の発現を検出した。ウェスタンブロット分析は、野生型ＥＰＯに関して
実施例１６で説明した方法を使用して実施した。ウェスタンの結果は、各クロー
ンからスクリーニングした５つの上清のうち、少なくとも３つが、ＦＬＡＧタグ
付きＥＰＯタンパク質を含むことを示した。ウェスタンブロットの結果によって
更に、Ｎ結合グリコシル化部位（Ｎ２４Ｃ、Ｔ２６Ｃ、Ｎ３８Ｃ、Ｔ４０Ｃ、Ｎ
８３Ｃ、及びＳ８５Ｃ）でのグリコシル化を防止すべき変異タンパク質をコード
するプラスミドが、野生型ＢＶ ｒＥＰＯよりも小さな、約２，２００乃至２，
８００ダルトンの分子量を有するタンパク質を生成することも明らかになった。
対照的に、Ｏ−結合グリコシル化部位のＳ１２６変異タンパク質、及び*１６７
Ｃ（Ｃ末端システイン付加）は、野生型ＢＶ ｒＥＰＯと共に移動するＥＰＯタ
ンパク質を生成した。これらの結果は、昆虫の細胞が通常、Ｎ−結合グリコシル
化を行うという観察と、及びＯ−結合グリコシル化部位に結合する糖基が一般に
小さく、これによりタンパク質の分子量が最低限しか増加しないという観察とに
一致する。昆虫の細胞はＯ−結合グリコシル化を行うことが報告されている（Ｄ
ａｖｉｅｓ、１９９５）。
【０１５７】 更に多くの量のＥＰＯ変異タンパク質を精製する目的で、各変異タンパク質を
コードする一つの正の組換えバキュロウィルス単離体を更なる増幅のために選択
した。野生型単離体に関して上で説明した継代培養によって、それぞれの変異型
Ｐ１から、５００ｍｌの高滴定濃度ウィルス株を準備した。こうしたそれぞれの
Ｐ２溶解物のアリコートを、その後、実施例１６の野生型ＥＰＯに関して説明し
た手順を使用して、それぞれのＥＰＯ変異タンパク質の大規模な生成に関して、
５００ｍｌ培養物に伝染させるために使用した。バキュウロウィルス感染細胞か
らの５００ｍｌの上清は、その後、滅菌濾過を行い、４℃で保管した。ｒＥＰＯ
−Ｃｙｓ変異タンパク質は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌカラ
ム（イーストマン コダック）を使用し、交差汚染が発生しないように各変異タ
ンパク質に異なる樹脂のバッチを使用して精製した。５ｍｌの樹脂は、最初に５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＴＢＳ）で洗浄し、そ
の後０．１Ｍグリシン ｐＨ３．０で洗浄し、最後にＴＢＳ内で再び平衡状態に
した。ＮａＣｌをバキュウロウィルス培養濾過物に追加し、アフィニティ樹脂を
加える前に、０．１５Ｍの最終濃度にした。この樹脂は、ローラボトル器具上で
一晩、４℃でバッチロードした。翌朝、ＸＫ１６ Ｐｈａｒｍａｃｉａカラムを
使用して、この樹脂を取り出し、Ａ２８０が基準に達するまでＴＢＳで洗浄した
。ｒＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質は、０．１Ｍグリシン ｐＨ３．０で溶出し
た。画分（１．５ｍｌ）は、２０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ ｐＨ９．０
を含むチューブに収集し、溶液を中和した。クロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析に基づき、主に精製ｒＥＰＯ−Ｃｙｓタンパク質を含む画分をプールし、
凍結させた。５００ｍｌ上清培養物からのタンパク質回収には、変異タンパク質
に応じて、７５乃至８００μｇの幅があった（表２）。
【０１５８】 精製ｒＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質は、非還元条件下で、２７乃至３０ｋＤ
ａの見かけ分子量で移動し、単量体であるタンパク質と一致する。ｒＥＰＯ−Ｃ
ｙｓ変異タンパク質の見かけ分子量は、２つのクラスに分かれ、これはおそらく
グリコシル化の違いが原因である。Ｏ−グリコシル化部位（Ｓ１２６Ｃ）及びＣ
終端（*１６７Ｃ）での変異を含むｒＥＰＯ−Ｃｙｓタンパク質は、野生型ＢＶ
ｔＥＰＯと同様の位置で移動する。Ｎ−結合グリコシル化部位の一つでのグリ
コシル化を防止する変異を含むタンパク質（Ｎ３８Ｔ、Ｔ４０Ｃ、Ｎ８３Ｃ、及
びＳ８５Ｃタンパク質）は、２７乃至２８ｋＤａの見かけ分子量で移動し、野生
型ＢＶ ｒＥＰＯより僅かに小さい。驚くべきことに、Ｓ８５Ｃタンパク質は、
還元及び非還元条件下の両方でダブレットとして移動し、ダブレットの大きなバ
ンドはＮ−結合グリコシル化部位の一つでのグリコシル化に関して予測されたサ
イズで、小さなバンドは完全にグリコシル化した野生型ＢＶ ｒＥＰＯに関して
予測されるサイズだった。Ｓ８５Ｃに関して単離されたオリジナルの組換えバキ
ュロウィルスプラークすべてが、ダブレットとして移動するｒＥＰＯタンパク質
を生成しており、このダブレットが、野生型ＢＶ ＥＰＯ又はＳ１２６Ｃ又は*
１６７ＣプロテインによるＳ８５Ｃの汚染ではなく、Ｎ８３（又は別のアミノ酸
）での部分的なグリコシル化によるものであることを示唆している。いくつかの
変異タンパク質、例えば、Ｓ１２６Ｃ、*１６７Ｃは、変異タンパク質に応じて
、４５乃至５５ｋＤａの見かけ分子量で移動する少量の第二のタンパク質を有す
る。これは、ジスルフィド結合したｒＥＰＯ二量体に関して予測される分子量で
ある。これらのバンドはウェスタンブロットにおいて抗ＦＬＡＧ抗体と反応し、
ＳＤＳゲルが還元条件下で実行される時には存在しない。これらのデータは、４
５乃至５５ｋＤａがジスルフィド結合したｒＥＰＯ−Ｃｙｓ二量体を表すことを
示している。
【０１５９】 Ｃ．ＥＰＯシステイン変異タンパク質の生物活性 精製されたｒＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質の生物活性は、実施例１６で説明
したＵＴ７／ｅｐｏ細胞増殖検定によって測定した。タンパク質濃度は、ブラッ
ドフォード検定を使用して決定した。サンプルの数が多いため、変異タンパク質
は２種類のグループに区分し、変異タンパク質Ｔ２６Ｃ、Ｔ４０Ｃ、Ｎ８３Ｃ、
及びＳ１２６Ｃが一つのグループに含まれ、変異タンパク質Ｎ２４Ｃ、Ｎ３８Ｃ
、Ｓ８５Ｃ、及び＊１６７Ｃが第二のグループに含まれるようにした。１グルー
プ内の変異タンパク質は同日に分析した。野生型ＢＶ ｒＥＰＯ及びＣＨＯ ｒ
ＥＰＯは、検定における日による変化を制御するために同じ日に並行して分析し
た。すべての変異タンパク質はＵＴ７／ｅｐｏ細胞の増殖をシミュレートしてお
り、野生型ｒＥＰＯ制御タンパク質の３倍以内のＥＣ50を有する。Ｎ２４Ｃ、Ｔ
２６Ｃ、Ｎ８３Ｃ、Ｓ１２５ｃ、及び＊１６７Ｃ変異タンパク質の平均ＥＣ50は
、野生型ＢＶ ｒＥＰＯ及びＣＨＯ ｒＥＰＯの平均ＥＣ50と同様で、平均０．
３乃至０．８ｎｇ／ｍｌであった（表２）。Ｎ３８Ｃ及びＴ４０Ｃタンパク質の
平均ＥＣ50は、約１ｎｇ／ｍｌであった（表２）。
【０１６０】 Ｂｉｌｌら（１９９５）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、ＥＰＯシステイン変異タ
ンパク質、Ｎ２４Ｃ、Ｎ３８Ｃ、及びＮ８３Ｃの発現を報告している。我々の結
果とは対照的に、彼らは、これらのシステイン変異タンパク質の生物活性が、野
生型ＥＰＯと比較して、大幅に減少すると報告している。Ｎ３８Ｃ変異タンパク
質の生物活性は、野生型ＥＰＯの生物活性の２０％未満に減少し、Ｎ２４Ｃ及び
Ｎ８３Ｃ変異タンパク質の生物活性は、野生型ＥＰＯの生物活性の５％未満に減
少した。ＥＣ50は報告されていない。Ｂｉｌｌら（１９９５）は、システイン変
異タンパク質の活性減少は、タンパク質に導入された余分なシステイン残基から
生じたジスルフィド架橋の不正確な形成による不適当なフォールディングが原因
であると仮定した。彼らは、システイン変異タンパク質を精製するために使用す
る溶液に、システイン又はシステインブロック剤を使用していない。
【０１６１】 Ｂｉｌｌら（１９９５）の結果に基づくと、我々の精製Ｎ２４Ｃ、Ｎ３８Ｃ、
及びＮ８３Ｃ変異タンパク質が、野生型ＥＰＯと等しい、又は３倍以内の生物活
性を有するのは驚くべきことである。このデータは、ＥＰＯシステイン変異タン
パク質の発現及び精製に関する我々の方法により、Ｂｉｌｌら（１９９５）が利
用した方法に比べて、優れたインビトロ生物活性を有するタンパク質が生じたこ
とを示している。
【０１６２】
【表２】 実施例１８ ＥＰＯシステイン変異タンパク質のＰＥＧ化 Ａ．ＥＰＯシステイン変異タンパク質の小規模ＰＥＧ化 いくつかのシステイン変異タンパク質及び野生型ＥＰＯを、還元剤ＴＣＥＰで
の処理の後、５ｋＤＡシステイン反応ＰＥＧによるＰＥＧ化の能力について試験
した。タンパク質の過剰還元を回避しながら、ＰＥＧ化に適切なＴＣＥＰ及びＰ
ＥＧ試薬濃度を特定するために、Ｔ２６Ｃ変異タンパク質による滴定研究を実行
した。野生型ＢＶ ｒＥＰＯを対照として使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタ
ンパク質の部分還元を観察した。ビニルスルホン又はマレイミド５ｋＤａ ＰＥ
Ｇ（フルカ）のいずれかが１０乃至４０倍超過モル濃度で存在する、増加するＴ
ＣＥＰ（０．５Ｍ乃至６．０Ｍ超過）濃度を試験した。反応は、非還元ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより分析した。野生型ＢＶ ｒＥＰＯは、単ＰＥＧ化ＥＰＯ−Ｃｙｓ
変異タンパク質（ＥＰＯ−Ｃｙｓ変異タンパク質に結合した単一のＰＥＧ分子）
を大量に発生させるが、野生型ＢＶ ｒＥＰＯのＰＥＧ化を発生させない部分的
還元条件を特定するために、対照として、並行して処理した。５倍超過モル濃度
のＴＣＥＰと３０倍超過モル濃度の５ｋＤａビニルスルホンＰＥＧとにより、野
生型ＢＶ ｒＥＰＯのＰＥＧ化なしに、大量の単ＰＥＧ化Ｔ２６Ｃタンパク質が
発生した。
【０１６３】 Ｔ２６Ｃ変異タンパク質での発見に基づき、他のいくつかのシステイン変異タ
ンパク質のＰＥＧ化に以下の条件を使用した。精製したＢＶ ｒＥＰＯ及びＥＰ
Ｏ−Ｃｙｓ変異タンパク質のアリコート（１乃至２μｇ）を、５倍超過モル濃度
のＴＣＥＰと３０倍超過モル濃度の５ｋＤａビニルスルホンＰＥＧにより、ｐＨ
８．０で、１時間室温で培養した。反応は、ＳＤＳサンプル緩衝剤（還元剤なし
）で希釈することで停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。４つのシステ
イン変異タンパク質（Ｎ２４Ｃ、Ｔ２６Ｃ、Ｓ１２６Ｃ、及び*１６７Ｃ）が、
この条件下で容易に単ＰＥＧ化されたが、これは約３５ｋＤａで移動する新しい
タンパク質バンドの出現により明らかとなった。３５ｋＤａ種は単ＰＥＧ化ＥＰ
Ｏに関して予測されるサイズであり、約４０ｋＤａの分子量を有することが予測
される二重ＰＥＧ化種は、この反応条件下では、いずれのＥＰＯ−ｃｙｓ変異タ
ンパク質についても検出されなかった。コントロール実験によると、ＰＥＧ化の
ためにシステイン変異タンパク質をＴＣＥＰにより還元する必要があることが示
された。野生型ＢＶ ＥＰＯは、同一の部分還元条件下ではＰＥＧ化しなかった
。これらのデータは、ＰＥＧ分子が、Ｎ２４Ｃ、Ｔ２６Ｃ、Ｓ１２６Ｃ、及び*
１６７Ｃｙｓ変異タンパク質に導入された自由システインに取り付けられること
を示している。
【０１６４】 Ｂ．生物活性測定のためのＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃの調製 ＰＥＧ化タンパク質を生物活性測定のために精製できるように、大量のＴ２６
Ｃ及びＳ１２６Ｃタンパク質をＰＥＧ化した。ＰＥＧ化反応は、それぞれのタン
パク質７５μｇと、規模の小さな１μｇ反応において使用するのと同じモル分子
比率のＴＣＥＰ及び５ｋＤａ−ＰＥＧを含むように規模を大きくした。１時間後
、ＰＥＧ化混合物を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％グリセロ
ール（緩衝剤Ａ）により１０倍に希釈し、直ちに緩衝剤Ａにおいて平衡化した１
ｍｌ Ｑ−セファロスカラムにロードした。カラムは平衡緩衝剤により洗浄し、
結合したタンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％グリ
セロール内の０乃至１５０ｍＭ ＮａＣｌの直線１０体積増加塩勾配により溶出
した。ＰＥＧ部分の存在により、樹脂に関するタンパク質のアフィニティが減少
し、ＰＥＧ化タンパク質を非ＰＥＧ化タンパク質から分離することが可能になっ
た。単ＰＥＧ化タンパク質を含む画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクーマシ
ーブルー染色により特定した。ＰＥＧ−Ｔ２６Ｃを含むが、可視非誘導化体タン
パク質を含まない画分を、−８０℃で冷凍保存し、その後、バイオアッセイに使
用した。精製ＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃを入手するために同様の手順を使用した。バイ
オアッセイで使用するＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃ調製の純度を評
価するために、ウェスタンブロットを実施した。ウェスタンブロットは、実施例
１６で説明したように実施した。ウェスタンブロットにより、ＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ
及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃに関して予測されるサイズで強いシグナルが生じたが、
非ＰＥＧ化Ｓ１２６Ｃ及びＴ２６Ｃタンパク質に関して予測される位置で移動す
るタンパク質は検出されなかった。これらの結果から、精製ＰＥＧ化変異タンパ
ク質の中には非ＰＥＧ化タンパク質がほとんど存在していない（＜５％）と結論
した。
【０１６５】 Ｃ．ＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃシステイン変異タンパク質の生
物活性 精製ＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃタンパク質の生物活性を、実施
例１６で説明したＵＴ７／ｅｐｏ細胞増殖検定で測定した。ＰＥＧ−ＥＰＯ−Ｃ
ｙｓ変異タンパク質のタンパク質濃度は、製造業者が推奨する指示にしたがって
、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ）を使用して定量化した。
非ＰＥＧ化変異タンパク質及び野生型ＢＶ ｒＥＰＯのタンパク質濃度も、ＥＬ
ＩＳＡによって定量化した。ＥＬＩＳＡ検定は、同日に、すべてのタンパク質に
関して実施した。タンパク質サンプルの連続３倍希釈液を準備し、バイオアッセ
イにおいて分析した。それぞれの連続希釈液の未使用材料は−８０℃で冷凍保存
し、その後、ＥＬＩＳＡで分析し、開始材料の正確なタンパク質濃度を判断した
。それぞれのタンパク質サンプルのいくつかの連続希釈液を分析し、少なくとも
１種類の試験サンプルでのタンパク質濃度が、標準ＥＬＩＳＡ曲線の直線範囲、
つまり０．００２５乃至０．２ユニット／ｍｌ又は約０．０２乃至１．６ｎｇ／
ｍｌに入るようにした。それぞれのサンプルで、少なくとも２種類の連続希釈が
、この直線範囲に入った。
【０１６６】 ＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃ変異タンパク質の生物活性は、非修
飾Ｔ２６Ｃ及びＳ１２６Ｃタンパク質及び野生型ＢＶ ｒＥＰＯのものと同様だ
った。ＰＥＧ−Ｔ２６Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１２６Ｃ変異タンパク質の平均ＥＣ50は
、非ＰＥＧ化Ｔ２６Ｃ及びＳ１２６Ｃ変異タンパク質と野生型ＢＶ ｒＥＰＯと
に関して決定した平均ＥＣ50値と同様で、０．４８乃至０．８２ｎｇ／ｍｌの範
囲だった（表３）。生物活性のあるＰＥＧ化ＥＰＯタンパク質は、これまでに記
述されていない。
【０１６７】
【表３】 実施例１９ 哺乳類細胞でのＥＰＯシステイン変異細胞の発現及び精製 ＥＰＯシステイン変異細胞は、哺乳類細胞でも発現させ、条件培地から精製す
ることができる。ＥＰＯシステイン変異細胞は、哺乳類細胞の一時的トランスフ
ェクション、又はＥＰＯシステイン変異細胞を発現する安定に形質転換した哺乳
類細胞系を構築することで、発現させることができる。ヒトの治療の用途では、
ＥＰＯシステイン変異細胞は、リンカー及びＦＬＡＧ配列なしに発現するのが好
ましい。サルＣＯＳ細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可
能）は、当業者に広く知られる手順を使用する一時的トランスフェクション用に
使用可能である。多くの民間の供給源、例えばＧＩＢＣＯ／ＢＲＬは、脂質トラ
ンスフェクション試薬を販売し、一時的トランスフェクションによってＥＰＯシ
ステイン変異タンパク質を発現するのに使用できる詳細なプロトコルを提供して
いる。野生型ＥＰＯは、タンパク質を発現する安定転換チャイニーズハムスタ卵
巣（ＣＨＯ）細胞を使用して、ヒトでの使用のために製造されている。安定トラ
ンスフェクションＣＨＯ細胞系は、組換えタンパク質の高レベル発現のために広
く使用されている（Ｇｅｉｓｓｅら、１９９６；Ｔｒｉｌｌら、１９９５）。Ｃ
ＨＯ細胞では、遺伝子増幅によって、染色体が統合された異種遺伝子の高レベル
発現が達成できる。通常、問題となる遺伝子は、増幅を選択可能な標識遺伝子に
リンクされる。増幅の選択を提供する様々な遺伝子の記述（Ｋａｕｆｍａｎ、１
９９０）があるが、マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）が頻繁に利用され
る。この遺伝子の増幅は葉酸類似メトトレキサート（ＭＴＸ）に抵抗力を与え、
抵抗力のレベルは、ｄｈｆｒ遺伝子のコピー数によって増加する（Ａｌｔら、１
９７８）。ＭＴＸ選択の有用性は、ｄｈｆｒが欠如したＣＨＯ細胞系の可用性に
よって向上する（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ、１９８０）。
【０１６８】 当業者は、マウスｄｈｆｒ遺伝子を市販のｐＣＤＮＡ３．１発現ベクター（イ
ンビトロジェン）に組み込んだＥＰＯシステイン変異細胞用の発現ベクターを構
築可能であり、これはＧ４１８に抵抗力を与えるネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ（ＮＰＴ）遺伝子を含む。マウスｄｈｆｒ発現ベクターｐｄｈｆｒ２．
９は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手する（カタログ番号３
７１６５）。このｄｈｆｒ遺伝子はｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞系において選択可能で
あり、ＭＴＸ抵抗力に関する標準の選択によって増幅できる（Ｃｒｏｕｓｅら、
１９８３）。ｄｈｆｒコーディング配列は、約９００ｂｐのＢｇｌ ＩＩ断片と
してｐｄｈｆｒ２．５から切除し、発現ベクターｐＲＥＰ４（インビトロジェン
）のポリリンカーの固有ＢａｍＨＩ部位でクローニングできる。この構成では、
遺伝子が、ＣＨＯ細胞において機能することが知られている（Ｔｒｉｌｌら、１
９９５）強力なＲＳＶプロモータの下流、及びＳＶ４０から誘導されるポリアデ
ニル化部位の上流に配置される。このｄｈｆｒ発現カセットは、その後、Ｓａｌ
Ｉ断片としてｐＲＥＰ４から切除することが可能であり、これはＳａｌＩ部位が
プロモータとポリＡ追加部位の側面近くに存在するためである。オリゴヌクレオ
チドリンカを使用して、このＳａｌＩ断片を、ｐＣＤＮＡ３．１の固有ＢｇｌＩ
Ｉ部位においてクローニングできる。
【０１６９】 ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞等の哺乳類細胞における発現では、ＥＰＯシステイン変
異タンパク質ｃＤＮＡは、ＰＣＲに基づく変異誘発によって修飾できる。５’終
点において、哺乳類細胞での翻訳を促進させるために、翻訳開始ＡＴＧコドンの
前にコザックのコンセンサス配列を追加できる。３’終点において、リンカ及び
ＦＬＡＧ配列を削除することが可能で、自然コード配列及び翻訳終了信号が修復
される。これらの修飾ＥＰＯ ｃＤＮＡは、その後、一時的トランスフェクショ
ン実験のために、ｐＣＤＮＡ３．１のポリリンカーで、Ｂａｍ ＨＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片としてクローニング可能であり、或いは哺乳類細胞での安定発現のため
に、ｐＣＤＮＡ３．１：：ｄｈｆｒベクターのポリリンカーでクローニングでき
る。哺乳類細胞の発現に関して、システイン変異タンパク質をコードする変異Ｅ
ＰＯ遺伝子は、哺乳類細胞での翻訳を促進するために、５’終点にて修飾し、翻
訳開始ＡＴＧコドンの直前のコザックのコンセンサス配列（ＧＣＣＡＣＣ）に組
み込む。３’終点では、リンカー及びＦＬＡＧ配列が削除され、自然コード配列
及び翻訳終了信号が修復される。これらの修飾は、当業者に広く知られているさ
まざまな変異誘発手法によって達成できる。実施例４及び１７で説明したものに
基づくＰＣＲに基づく変異誘発手順を利用可能である。ＰＣＲプライマーＢＢ３
０２（５＞ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴ
ＧＴＣＣＴ＞３）（配列番号４７）及びＢＢ３０３（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴ
ＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣ＞３）（配列番号４８）を鋳
型として、ｐＵＣ１９又はｐＢｌｕｅＢａｃ４．５でクローニングされる変異Ｅ
ＰＯ遺伝子のＰＣＲに使用できる。順方向プライマーＢＢ３０２は、ＥＰＯ分泌
信号の最初の７個のアミノ酸をコードするＥＰＯ遺伝子配列をアニーリングし、
翻訳開始ＡＴＧコドンの直前にコザックのコンセンサス配列ＧＣＣＡＣＣを追加
し、クローニングの目的でＢａｍ ＨＩ部位を含める。逆方向プライマーＢＢ３
０３は、ＥＰＯコーディング配列のカルボキシ終端の７個のアミノ酸をコードす
る配列をアニールし、ＥＰＯコーディング配列の後にＴＧＡ翻訳停止コドンを追
加し、クローニングの目的でＥｃｏＲＩ部位を含める。これらのプライマーと、
これら２種類のプライマー間での変異を有する任意の変異ＥＰＯ遺伝子鋳型、例
えば成熟したＥＰＯコーディング配列のアミノ酸１乃至１５９でのアミノ酸置換
等を使用した個々のＰＣＲ反応の生成物は、精製可能なＰＣＲ産物を生成し、こ
れはＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化され、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）（インビト
ロジェン）等の哺乳類細胞での発現に適したベクターでクローニングされる。Ｐ
ＣＲプライマー３０２及び３０３もＥＰＯシステイン変異タンパク質の修飾に使
用可能で、この場合は、成熟ＥＰＯコーディング配列の最初のアミノ酸Ａｌより
前にシステイン残基が追加されるが、ＥＰＯシグナル配列より後ろには追加され
ない。カルボキシル終端の７個のアミノ酸をコードするＥＰＯ配列の変異、又は
実施例１７で説明した*１６７Ｃ変異では、ＢＢ３０３の位置で代替の逆方向プ
ライマーを使用する必要がある。これらのプライマーは、変異システインコドン
と、鋳型ターゲットと正確に一致するオリゴの３’終点での少なくとも２１のヌ
クレオチドと、クローニングを目的とするＥｃｏ ＲＩ部位とを含むように個別
に設計される。例えば、逆方向プライマーＢＢ３０４（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣ
ＴＣＡＡＣＡＴＣＴ ＧＴＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧ ＣＡＧＣＣ＞３）（配列番
号４９）及びＢＢ３０２を、哺乳類細胞発現系での発現に適した*１６７Ｃ変異
タンパク質をコードする修飾変異ＥＰＯ遺伝子を生成する鋳型として、ｐＵＣ１
９又はｐＢｌｕｅＢａｃ４．５でクローニングされるＥＰＯ＊１６７Ｃ遺伝子と
共に、ＰＣＲ反応において使用できる。
【０１７０】 ＣＯＳ又はｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞等の哺乳類細胞のトランスフェクションには
、内毒素のないプラスミドＤＮＡが好適である。ｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞系は、コ
ロンビア大学のＤｒ．Ｌ．Ｃｈａｓｉｎ（ＣＨＯ ＫＩ ＤＵＫＸ ＢＩＩ）等
の多数のソース、又は（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＣＨＯ ｄ
ｕｋ、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９０９６）から入手できる。この細胞は、１０％Ｆ
ＢＳ、グルタミン、グリシン、ヒポキサンチン、及びチミジンを補ったＦ１２／
ＤＭＥＭ培地で培養できる（Ｌｕｃａｓら、１９９６）。トランスフェクション
は、エレクトロポレーション、又はＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ギブコＢＲＬ
）等の当業者に広く知られるトランスフェクション試薬の使用により、ベンダプ
ロトコル及び又は文献で説明されているものを使用して実施できる（Ｋａｕｆｍ
ａｎ、１９９０）。７％透析ＦＣＳを補うと共にグルタミン、グリシン、ヒポキ
サンチン、及びチミジンが欠如させたＦ１２／ＤＭＥＭにおけるｄｈｆｒ+のト
ランスフェクタントを選択できる（Ｌｕｃａｓら、１９９６）。或いは、Ｇ４１
８抵抗（ｐＣＤＮＡ３．１のＮＰＴ遺伝子によりコードされる）を選択し、その
後、ｄｈｆｒ+表現型のトランスフェクタントを選別することができる。ｄｈｆ
ｒ+クローンは、選択培地で拡張し、市販のＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ
システムズから入手可能）を使用して、又は抗ＥＰＯ抗血清（Ｒ＆Ｄシステムズ
から入手可能）を使用したウェスタンブロットによって、ＥＰＯシステイン変異
タンパク質生成のためにスクリーニングした上清を培養できる。ＥＰＯシステイ
ン変異タンパク質を発現するクローンは、その後プールし、Ｋａｕｆｍａｎ（１
９９０）が説明するように、増加させた薬品濃度におけるＭＴＸ抵抗に関して、
複数回の選択を行うことができる。各回のＭＴＸ選択後、ＥＰＯシステイン変異
タンパク質生成に関して、個々のクローンをテストできる。これらの手順は文献
に詳しく説明されており、ＣＨＯ細胞における様々な異種タンパク質の発現に使
用されてきた（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０において検討されている）
【０１７１】 好ましくは、ＥＰＯシステイン変異タンパク質を発現するＣＨＯ細胞の成長に
は使用する培地は、システイン又は他のシステインブロック剤を含むべきである
。ＥＰＯシステイン変異タンパク質は、Ｉｍａｉら（１９９０）が説明したもの
と同様のプロトコルを使用して、ＣＨＯ細胞の条件培地から精製できる。遠心分
離によってＣＨＯ細胞を除去した後、当業者に広く知られる手法を使用して、カ
ラムクロマトグラフィーによって上清からＥＰＯシステイン変異タンパク質を精
製できる。ＥＰＯシステイン変異タンパク質の精製に利用できるカラムクロマト
グラフィーステップには、ブルーセファロース、ヒドロキシアパタイト、逆相、
疎水的相互作用、分子ふるい分け、及びイオン交換クロマトグラフィーが含まれ
る。
【０１７２】 実施例２０ ＩＦＮ−α２のクローニング、発現、及び精製 Ａ．ＩＦＮ−α２をコードするＤＮＡ配列のクローニング 少なくとも２５の異なるＩＦＮ−α遺伝子が、７０％以上のアミノ酸相同性を
共有するタンパク質をコードしている（Ｂｌａｔｔら、１９９６）。ＩＦＮ−α
種の間のＤＮＡ配列の相同性が高いため、ＩＦＮ−α２遺伝子を２つのステップ
でクローニングした。第一に、ＩＦＮ−α２遺伝子は、ＩＦＮ−α２遺伝子の上
流及び下流にある固有の配列に対応するプライマーを使用して、ヒトゲノムＤＮ
ＡからＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ産物は、ＩＦＮ−α２遺伝子をコー
ドしていることを確認するためにクローニング及び配列決定した。その後、ＩＦ
Ｎ−α２コーディング配列を、ＰＣＲによって修飾し、Ｅ．ｃｏｌｉ及び部位特
異的突然変異変異誘発における発現に関してサブクローニングした。ＩＦＮ−α
２をコードするＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック）からＰＣＲによっ
て増幅した。ＰＣＲ反応は、ＢＢ９３（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＡＴＧ
ＴＡＡＡ ＴＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧＴＧ＞３）（配列番号５０）及びＢＢ９４（
５＞ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＧＴＣＡＴＧＧＴ＞
３）（配列番号５１）によって実施した。ＢＢ９３は、ＩＦＮ−α２コーディン
グ配列の約３００ｂｐ上流（つまり５’）のゲノム配列をアニールし、クローニ
ングの目的でＥｃｏ ＲＩ部位を含む。ＢＢ９４は、ＩＦＮ−α２コーディング
配列の約１００ｂｐ下流（つまり３’）のゲノム配列をアニールし、クローニン
グの目的でＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。結果として生じた約１ｋｂのＰＣＲ産物
をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に消化してからアルカリホスフ
ァターゼ化したｐＣＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン）でクローニングし
た。ＩＦＮ−α２に関して正しいＤＮＡ配列を有するクローン（Ｈｅｎｃｏら、
１９８５）は、特定及び指定されたｐＢＢＴ１６０だった。
【０１７３】 Ｅ．ｃｏｌｉにおける細胞質発現に関して、ｐＢＢＴ１６０のクローニングＩ
ＦＮ−α２遺伝子は、ＰＣＲによって修飾され、ＩＦＮ−α２タンパク質の第一
の残基（Ｃ１）の直前のメチオニンコドンに組み込まれた。ＴＡＡ停止コドンは
カルボキシ終端残基、Ｅ１６５の後に追加された。同時に、その後の変異誘発に
便利な制限部位を提供するために、ＸｂａＩ及びＳａｌＩ部位が追加され、Ｂｇ
ｌＩＩが除去された。この反応において、ｐＢＢＴ１６０が鋳型として使用され
、プライマーＢＢ９９（５＞ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧＴＧＴＧＡＴＣＴ
ＧＣＣＴＣＡＡＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＴ
ＧＡＴＧＣＴＣ＞３）（配列番号５２）及びＢＢ１００（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴ
ＣＴＴＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣＡＡＧＴＴＴＧ
ＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＴＧＡＴ＞３）によって増幅され
た。ＢＢ９９は、成熟ＩＦＮ−α２のコーディング配列の５’終点をアニールし
、成熟ＩＦＮ−α２の第一のアミノ酸の前の開始メチオニンをコードする。ＢＢ
９９は、開始ＡＴＧの約３０ｂｐ下流のＸｂａ部位を導入するが、タンパク質の
アミノ酸配列は変化しない。ＡＴＧと重複するＨｉｎｄ ＩＩＩ部位及びＮｄｅ
Ｉ部位は、クローニングの目的で含めた。逆プライマー、ＢＢ１００は、コー
ディング配列の３’終点をアニールし、ＴＡＡ停止コドンを追加する。ＢＢ１０
０は、ＴＡＡコドンの約３０ｂｐ上流のＳａｌ Ｉ部位を導入し、更に約１５ｂ
ｐ上流の天然Ｂｇｌ ＩＩ部位を排除する。その結果、開始ＡＴＧの約１８５ｂ
ｐ下流に位置する天然Ｂｇｌ ＩＩ部位は、固有の部位となる。これらすべての
変更によって、アミノ酸配列は変化しない。Ｅｃｏ ＲＩ部位は、クローニング
の目的で、停止コドンのすぐ下流に追加された。約５２０ｂｐのＰＣＲ産物は、
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＥｃｏ ＲＩにより消化され、ゲル精製され、同様に消化
されるプラスミドｐＣＤＮＡ３．１（＋）でクローニングされた。一つのクロー
ンは、正しいＤＮＡ配列を持つと判断された。このプラスミドは指定ｐＢＢＴ１
６４だった。Ｅ．ｃｏｌｉでの細胞質発現に関して。ｐＢＢＴ１６４の約５２０
ｂｐのＮｄｅ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩ断片が、同様に消化される発現ベクター、ｐＣ
ＹＢ１（ニューイングランドバイオラブス）でクローニングされた。プラスミド
ベクターｐＣＹＢ１により、遺伝子を非融合タンパク質又は融合タンパク質とし
て発現することが可能になり、この構成は、タンパク質が非融合タンパク質とし
て発現するように作成された。結果として生じたプラスミドはｐＢＢＴ１７０と
呼ばれ、ｍｅｔ−ＩＦＮ−α２をコードする。ｍｅｔ−ＩＦＮ−α２を含むｐＢ
ＢＴ１６４のＮｄｅ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩ断片も、Ｎｄｅ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩに消
化されるｐＵＣ１８もサブクローニングされ、プラスミドｐＢＢＴ１６８が生成
された
【０１７４】 ＩＦＮ−α２は、ペリプラズム空間への分泌によって、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて
、活性形態で発現できる（Ｖｏｓｓら、１９９４）。分泌されたＩＦＮ−α２は
、Ｎ末端メチオニンが欠如しており、天然ＩＦＮ−α２と同一のアミノ酸配列を
有していた。ＩＦＮ−α２の分泌形態を発現するために、Ｅ．ｃｏｌｉ熱安定エ
ンテロトキシン（ＳＴＩＩ）遺伝子のリーダー配列（Ｐｉｃｋｅｎら、１９８３
）を、ＰＣＲによって、成熟ＩＦＮ−α２のコーディング配列に融合した。その
長さのため、ＳＴＩＩ配列は、２つの連続するＰＣＲ反応で追加した。第一の反
応では順方向プライマーＢＢ１０１（５＞ＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴ
ＣＴＣＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＣＴＴＡＣＧＣＡＴＧＴＧＡＴＣＴ ＧＣ
ＣＴＣＡＡＡＣＣＣＡＣ ＡＧＣ＞３）（配列番号５４）と逆方向プライマーＢ
Ｂ１００とをｐＢＢＴ１６４（上述）と共に鋳型として使用した。ＢＢ１０１の
３’終点（２１ｂｐ）は、成熟ＩＦＮ−α２のコーディング配列の５’終点をア
ニールする。ＢＢ１０１の５’セグメント（３９ヌクレオチド）は、ＳＴＩＩリ
ーダペプチドの部分をコードする。この反応の約５５０ｂｐのＰＣＲ産物は、ゲ
ル精製され、第二のＰＣＲ反応の鋳型として使用された。第二のＰＣＲ反応は、
逆方向プライマーＢＢ１００と前方向プライマーＢＢ１１（５’−ＣＣＣＣＣＴ
ＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧ ＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧ
ＧＣＡＴ ＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣ ＴＡＴＣＧ−３’）（配列番号
７）を使用した。ＢＢ１１は残りのＳＴＩＩリーダペプチドを追加し、ＳＴＩＩ
リーダーの開始ＡＴＧと重複するＮｄｅ Ｉ部位を含む。この反応の約５９０ｂ
ｐの産物を、Ｎｄｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉによって消化した。ＳＴＩＩリーダー配
列とＩＦＮ−α２のアミノ末端の約３０ｂｐとを含む約１００ｂｐのＮｄｅＩ−
Ｘｂａ Ｉ断片は、ゲル精製、Ｎｄｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉによって消化されたｐ
ＢＢＴ１６８［ｐＵＣ１８：：ｍｅｔ−ＩＦＮ−α２］によりライゲートし、ア
ルカリホスファターゼにより処理し、ゲル精製した。このステップにおいて、ｍ
ｅｔ−ＩＦＮ−α２遺伝子の約３０ｂｐのＮｄｅ Ｉ−Ｘｂａ Ｉアミノ終端セ
グメントは、ＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２ ＰＣＲ産物のＰＣＲによって誘導された
約１００ｂｐのＮｄｅ Ｉ−Ｘｂａ Ｉアミノ終端セグメントによって置換され
る。結果として生じたｐＵＣ１８：：ＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２構成の配列は、確
認され、そのプラスミドは指定ｐＢＢＴ１７７だった。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発
現に関して、ｐＢＢＴ１７７は、Ｎｄｅ Ｉ及びＥｃｏ ＲＩによって消化され
、ＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２遺伝子を含む約５７０ｂｐの断片はゲル精製され、ｉ
ａｃプロモータの管理下において発現ベクターｐＣＹＢ１でクローニングされた
。結果として生じたプラスミドは指定ｐＢＢＴ１７８だった。
【０１７５】 Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｒＩＦＮ−α２の発現 ｍｅｔ−ＩＦＮ−α２をコードするｐＢＢＴ１７０と、親ベクターのｐＣＹＢ
１とは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に転換された。これらの細胞株による実験で
は、ｍｅｔ−ＩＦＮ−α２の発現が生じた。分泌されたＩＦＮ−α２は天然ＩＦ
Ｎ−α２と同じアミノ酸配列を有するため、分泌されたＩＦＮ−α２は細胞質ｍ
ｅｔ−ＩＦＮ−α２に好適である。
【０１７６】 分泌されたｒＩＦＮ−α２の発現に関して、ｐＢＢＴ１７８［ｐＣＹＢ１：：
ＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２］及び親ベクターのｐＣＹＢ１はＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１
１０に転換された。結果として生じた細胞株は、指定ＢＯＢ２０２：Ｗ３１１０
（ｐＢＢＴ１７８）及びＢＯＢ１３０：Ｗ３１１０（ｐＣＹＢ１）だった。我々
は、５．０乃至７．０の範囲の初期ｐＨにおいて、リン酸及びＭＥＳ緩衝ＬＢ培
地でのＢＯＢ２０２の成長及びｒ−ＩＦＮ−α２発現を試験する一連の実験を実
施した。一晩経過した飽和培地を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む緩衝
ＬＢにおいて、Ａ600で０．００２５Ｏ．Ｄ．まで希釈し、振動フラスコ内にお
いて３７℃で培養した。培養Ｏ．Ｄ．が０．３乃至０．５まで達した時、ＩＰＴ
Ｇを追加して最終濃度を０．５ｍＭとし、ｒＩＦＮ−α２の発現を誘導した。最
初の実験では、誘導後０、１、３、５、及び約１６時間後に培養物をサンプルと
した。誘導及び非誘導培養物のサンプルは、クーマシーブルーで染色したプレキ
ャスト１４％Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル上で、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって分析した。予測されたＩＦＮ−α２の約１９ｋＤａの処理形態に加え
、予測よりも高い分子量（約２１．５ｋＤａ）形態のタンパク質が観察された。
高い分子量形態は、ＳＴＩＩリーダペプチドのタンパク質分解処理の欠如から生
じる可能性があり、リーダペプチドの分子量はこの仮説と一致する。我々の結果
は、低いｐＨが正しいサイズのｒＩＦＮ−α２バンドの蓄積を促進することを示
している。ｐＨ６．５以上では２１．５ｋＤａ形態が支配的で、ｐＨ６．０以下
では、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ｒＩＦＮ−α２標準（エンドゲン社（Ｅｎｄｏｇｅｎｄ
， Ｉｎｃ．））と共に移動する約１９ｋＤａのバンドが、タンパク質の支配的
な形態となることが観察された。ｐＨ６．０以下では、１９ｋＤａバンドが、Ｅ
．ｃｏｌｉ細胞によって発現するＩＦＮ−α２の少なくとも８０％、おそらくは
９０％以上を占める。この発見に基づき、更なる発現実験では、１００ｍＭ Ｍ
ＥＳによって緩衝処理し、ｐＨを５．５にしたＬＢ培地を使用した。Ｖｏｓｓら
（１９９４）も、ＳＴＩＩリーダー配列を使用したＥ．ｃｏｌｉペリプラズムへ
のＩＦＮ−α２の分泌を報告している。彼らは更に、培養ｐＨを７．０ではなく
６．７に維持した時、２１．５ｋＤａバンドに存在するｒＩＦＮ−α２の割合が
減少し、１９ｋＤａで移動する割合が増加したことを観察している。ｐＨ７．０
では、Ｖｏｓｓら（１９９４）は、ＳＴＩＩ：ＩＦＮ−α２融合タンパク質の１
０乃至３０％が処理され、１９ｋＤａ成熟ＩＦＮ−α２タンパク質が発生したと
報告している。正しく処理された１９ｋＤａ ＩＦＮ−α２タンパク質のパーセ
ンテージは、ｐＨ６．７でＥ．ｃｏｌｉを成長させることで５０乃至６０％増加
する可能性がある。しかしながら、このｐＨでも、大量（４０乃至５０％）のＳ
ＴＩＩ：ＩＦＮ−α２融合タンパク質が未処理のまま残り、正しく処理された１
９ｋＤａ ＩＦＮ−α２の生成量が減少する。Ｖｏｓｓら（１９９４）は、１９
ｋＤａで移動する分泌ｒＩＦＮ−α２の量を最大にするには、ｐＨ６．７が最適
であると提案している。Ｖｏｓｓら（１９９４）は、いくつかの成長パラメータ
を変化させ、正しく処理された１９ｋＤａ ＩＦＮ−α２タンパク質のパーセン
テージを高め、５０乃至６０％より大きくすることを試みたが、成功しなかった
。我々のデータは、ｐＨを６．５未満、好ましくは５．５乃至６．０に低下させ
ることで、非分割（２１．５ｋＤａ）ｒＩＦＮ−α２生成物に対する分割（１９
ｋＤａ）されたものの比率が最大になることを示している。こうした低いｐＨで
は、正しく処理された１９ｋＤａ ＩＦＮ−α２のパーセントは、細胞によって
合成されたＩＦＮ−α２全体の少なくとも８０％、おそらくは９０乃至１００％
までに増加する。
【０１７７】 ｒＩＦＮ−α２を発現した培養物には、Ｋｏｓｈｌａｎｄ及びＢｅｔｓｔｅｉ
ｎ（１９８０）の手順に基づいて、浸透圧衝撃を加えた。この手順により、Ｅ．
ｃｏｌｉの外膜が破裂し、ペリプラズムの内容物が周囲の培地に放出される。そ
の後の遠心分離により、細胞質からの可溶性ペリプラズム構成要素（上清内で回
収）、不溶性ペリプラズム構成要素、及び細胞に関連する構成要素（ペレット内
で回収）が分離される。ＢＯＢ２０２によって合成された１９ｋＤａ ｒＩＦＮ
−α２の約２５乃至５０％が上清内で回収された。２１．５ｋＤａのｒＩＦＮ−
α２は、可溶性ペリプラズム断片では観察されなかった。
【０１７８】 Ｃ．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｒＩＦＮ−α２の大規模な発現及び精製 野生型ｒＩＦＮ−α２タンパク質を精製するために、ＢＯＢ２０２の一晩経過
した新しい飽和培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ １００
ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）内で、０．０２ＯＤ＠Ａ600で接種した。通常は、
３２５ｍｌの培養物を、１６０乃至２００ｒｐｍの旋回水槽内で、３７℃の２リ
ットル振動フラスコによって成長させた。培養物が０．３乃至０．４ＯＤの濃度
に達した時、ＩＰＴＧを追加し、最終濃度を０．５ｍＭとした。誘導した培養物
を、その後約１６時間培養した。培養物には、Ｈｓｕｉｎｇら（１９８６）の手
順に基づいて、浸透圧衝撃を加えた。この細胞を遠心分離によってペレット化し
、氷温の２０％スクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）におい
て、−２５ＯＤ／ｍｌで再懸濁した。再懸濁した細胞は氷の上で１５分間培養し
、９５００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、ペレットを氷温の１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁し、氷の上で１５分間培養し、９５０
０×ｇで１０分間遠心分離した。結果として生じた上清（浸透圧衝撃溶解物）を
、直ちに処理するか、或いは−６０℃で保存した。
【０１７９】 ｒＩＮＦ−α２は以下のように精製した。浸透圧衝撃の上清のｐＨは３に調整
し、沈殿物をすべて除去するために遠心分離を行い、２０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５
．０（緩衝剤Ａ）により平衡化した５ｍｌ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＨｉＴｒａｐ
Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードした。結合タンパク質は、０乃至１０
０％の緩衝剤Ｂでの直線塩勾配（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＭＥＳ、１
０％エチレングリコール）により溶出させた。カラム断片は非還元ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって分析した。ｒＩＮＦ−α２は約２２５乃至２３５ｍＭ ＮａＣｌで
溶出した。ｒＩＮＦ−α２の濃度が高くなった断片をプールし、４０ｍＭリン酸
ナトリウム、ｐＨ６．０、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％トゥイーン２０において先
に平衡化した１ｍＬ Ｃｕ++ ＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティクロマトグラ
フィー）Ｈｉ Ｔｒａｐカラムで更に断片化した。ｒＩＮＦ−α２は、４０ｍＭ
リン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％トゥイーン２０における５．５乃
至４．１の逆ｐＨ勾配により溶出させた。ｒＩＮＦ−α２は、勾配が１００％緩
衝剤Ｂに達した後、溶出液のｐＨが最終的にｐＨ４．１に達した時に溶出した。
精製され、適切に畳まれたｒＩＮＦ−α２を含むＣｕ++ＩＭＡＣカラムからの断
片をプールし、冷凍したアリコートを−８０℃で保存した。初期の溶出断片の一
部では、少量のｒＩＮＦ−α２バリアントが検出できた。このバリアントは、不
完全なジスルフィド形成の結果で、生物活性があり、以前に記述されている（Ｋ
ｈａｎ ａｎｄ Ｒａｉ、１９９０）。このバリアントを含む断片は、精製ｒＩ
ＮＦ−α２の最終プールに追加しなかった。ｒＩＮＦ−α２の最終的な生成量は
、２８０ｎｍでの吸収度とブラッドフォード分析とによって決定され、２５０ｍ
ｌの培養物で約４００μｇだった。還元ＩＮＦ−α２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
って分析した時、非還元ＩＮＦ−α２よりも僅かに大きな見かけ分子量で移動す
る（ｍｏｒｅｈｅａｄら、１９８４）この見かけ分子量の変化は、ＩＮＦ−α２
における自然ジスルフィドの還元によるものである。我々のＩＮＦ−α２は、還
元及び非還元条件の両方で、市販のｒＩＮＦ−α２標準と共に移動する。
【０１８０】 Ｄ．野生型ｒＩＮＦ−α２のインビトロ生物活性 ＩＮＦ−αの生物活性は、インビトロ抗ウイルス検定又は細胞増殖抑制検定を
使用して測定できる。我々は、野生型ｒＩＮＦ−α２の生物活性を測定するため
の細胞成長抑制検定を開発した。ヒトＤａｕｄｉ Ｂ細胞系（アメリカンタイプ
カルチャコレクションは、ＩＮＦ−αの成長抑制特性に対して敏感で、ＩＮＦ−
αの生物活性の測定に一般的に利用される（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｅｚら、１９７
９；Ｅｖｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｓｔｋａ、１９８１）。Ｄａｕｄｉ細胞は、
１０％のＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌのペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌのスト
レプトマイシンを補った、ＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。バイオアッセイで
は、ＲＰＭＩ１６４０培地によって細胞を３回洗浄し、４×１０5細胞／ｍｌの
濃度で、１０％のＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌのペニシリン、及び５０μｇ／ｍ
ｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。５０μｌ（
２×１０4細胞）の細胞懸濁液を、フラットボトム９６ウェル組織培養プレート
の試験ウェル毎にアリコートとした。１０％のＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌのペ
ニシリン、及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０羽
位置において、連続する３倍の希釈の試験用タンパク質サンプルを準備した。５
０μｌの希釈タンパク質を試験ウェルに追加し、このプレートを３７℃で、加湿
５％ＣＯ２組織培養インキュベータにおいて培養した。４日後、２０μｌのＣｅ
ｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇ
ｅｎｔ（プロメガコーポレーション）をそれぞれのウェルに追加し、このプレー
トを３７℃で、組織培養インキュベータにおいて１乃至４時間培養した。マイク
ロプレートリーダを使用して、４９０ｎｍで吸収度を読み出した。対照ウェルは
培地を含むが、細胞を含まなかった。三つ組みの対照ウェルの平均吸収度の値は
、三つ組みの試験ウェルの各組について得られた平均値から減算した。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ発現ｒＩＦＮ−α２（エンドゲン社）の連続する希釈を並行して分析した。
ＩＣ50（半最大成長抑制に必要なタンパク質濃度）は、それぞれのサンプルにつ
いて計算し、タンパク質の生物活性の比較に使用した。
【０１８１】 Ｄａｕｄｉ細胞系の増殖は、ｒＩＮＦ−α２によって強く抑制され、これは吸
収度の値が投与量に従属して減少することにより明らかとなる。我々が準備した
市販のｒＩＦＮ−α２（エンドゲン）及び野生型ｒＩＦＮ−α２は、検定の誤差
内で、同じ成長抑制の最大レベルに達し、同じ平均ＩＣ50値である１３乃至１６
ｐｇ／ｍｌ（表４）を有した。これらのタンパク質のＩＣ50値は、別の日に実施
した検定では７乃至２９ｐｇ／ｍｌの範囲だったため（表４）、タンパク質の間
の比較は、同じ日に分析したサンプルに関して行った。
【０１８２】 実施例２１ ＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質の構築、発現、精製及び生物活性 Ａ．ＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質の構築 実施例４に記載のものと類似の部位特異的ＰＣＲ型突然変異導入法を使用して
、１７種の変異型ＩＦＮ−α２遺伝子を構築した。本発明者らは、ヘリックスＡ
より近位のアミノ末端領域の変異タンパク質１種［Ｑ５Ｃ］、Ａ−Ｂループの変
異タンパク質６種［Ｎ４５Ｃ、Ｑ４６Ｃ、Ｆ４７Ｃ、Ｑ４８Ｃ、Ａ５０Ｃ、及び
４３Ｃ４４（残基４３と残基４４の間へのシステインの挿入）］、短い２残基の
ＢＣループの変異タンパク質１種［Ｄ７７Ｃ］、ＣＤループの変異タンパク質４
種［Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ及びＴ１０８Ｃ］、Ｅヘリックスより
遠位のカルボキシ末端領域の変異タンパク質３種［Ｓ１６３Ｃ、Ｅ１６５Ｃ及び * １６６Ｃ（天然カルボキシ末端へのシステイン残基の付加）］を構築した。本
発明者らは、天然の非必須のＣ１−Ｃ９８ジスルフィド（Ｌｙｄｏｎら，１９８
５；Ｍｏｒｅｈｅａｄら，１９９４）を排除する、変異タンパク質Ｃ１Ｓ及びＣ
９８Ｓも構築した。ヘリックスＡより近位のアミノ末端領域におけるＣ１Ｓ置換
は、Ｃヘリックスに自由システイン（Ｃ９８）を生成させ、Ｃヘリックスにおけ
るＣ９８Ｓ置換は、ヘリックスＡより近位の領域に自由システイン（Ｃ１）を生
成させる。
【０１８３】 突然変異導入のため、ＩＦＮ−α２コーディング配列内の選択された位置への
システイン残基の取り込みを起こすヌクレオチド変化を取り込ませるためのＰＣ
Ｒプライマーオリゴヌクレオチドを設計した。可能な場合には、突然変異を導入
されたＰＣＲ断片を適切なプラスミドへクローニングするために使用される近傍
の制限部位も含まれるよう、突然変異導入オリゴを設計した。突然変異の位置の
十分近くに有用な制限部位が位置していない場合には、「オーバーラップ伸長に
よる突然変異導入」の技術を利用した（Ｈｏｒｔｏｎら，１９９３）。突然変異
導入ＰＣＲ反応に使用した鋳型は、ＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２遺伝子がＮｄｅＩ−
ＥｃｏＲＩ断片としてｐＵＣ１８へとクローニングされているプラスミドｐＢＢ
Ｔ１７７（実施例２０に記載）であった。ＰＣＲ産物を、適切な制限エンドヌク
レアーゼで消化し、ゲル精製し、同制限酵素で切断しておいたｐＢＢＴ１７７ベ
クターＤＮＡとライゲートさせ、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製した
。これらのライゲーションからの形質転換体を増殖させ、プラスミドＤＮＡを単
離し、配列決定した。目的の突然変異の存在を確認するため、そして、ＰＣＲ反
応又は合成オリゴヌクレオチドプライマーにより導入される可能性がある付加的
な突然変異が存在しないことを確認するため、クローニングされた、突然変異を
導入されたＰＣＲ断片の全体の配列を決定した。
【０１８４】 置換変異Ｑ５Ｃは、実施例４に記載されたような「オーバーラップ伸長による
突然変異導入」の技術を使用して構築した。Ｑ５Ｃ構築のための第一の、又は「
一次」ＰＣＲ反応は、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２μＭの各プライマー、２
００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ、１ｎｇの鋳型プラスミ
ドｐＢＢＴ１７７（実施例２０に記載）、１．５単位のＴａｑポリメラーゼ（プ
ロメガ社）並びに０．２５単位のＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社）を含
有する１×プロメガＰＣＲ緩衝液中で、５０μｌという反応容量で実施した。反
応は、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ９６サーマルサイクラー（スト
ラタジーン社）で実施した。反応プログラムは、９６℃３分、［９５℃１分、６
０℃１．２５分、７２℃１分］を２５サイクル、その後６℃で維持、であった。
使用したプライマー対は、［ＢＢ１２５×ＢＢ１３０］及び［ＢＢ１２６×ＢＢ
１２９］であった。ＢＢ１２５（５＞ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ
ＡＴＡ＞３）（配列番号５５）は、クローニングされたＩＦＮ−α２配列の約２
０ｂｐ上流のｐＵＣ１８ベクター配列とアニールする。ＢＢ１２６（５＞ＴＧＴ
ＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ＞３）（配列番号５６）は、クローニ
ングされたＩＦＮ−α２配列の約４０ｂｐ下流のｐＵＣ１８ベクター配列とアニ
ールする。ＢＢ１２９及びＢＢ１３０は、Ｑ５に対応するＣＡＡコドンを、シス
テインに対応するＴＧＴコドンに変化させる、相補的な突然変異導入オリゴヌク
レオチドである。ＢＢ１２９の配列は、（５＞ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＴＧＴ
ＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧ＞３）（配列番号５７）であり、ＢＢ１３０の配列は
、（５＞ＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡＣＡＡＧＧＣＡＧＡＴＣＡＣＡ＞３）（配
列番号５８）である。［ＢＢ１２５×ＢＢ１３０］ＰＣＲ反応が与える産物の予
想サイズは約１４０ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１２９］ＰＣＲ反応が与える産物
の予想サイズは約５６０ｂｐであった。ＰＣＲ産物は、発売元のプロトコルに従
いＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を使用して「精製」し、
２％アガロースゲル電気泳動にかけ、発売元のプロトコルに従いＱＩＡＥＸ Ｉ
Ｉゲル抽出キット（キアゲン社）を使用してゲル精製し、１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．５）２０μｌ中に回収した。次いで、突然変異を導入されたこれら
２つの断片を、それに続く、すなわち「２次」ＰＣＲ反応において共に「スプラ
イシング」した。この反応においては、ゲル精製された、一次反応の各ＰＣＲ産
物２μｌを鋳型として使用し、ＢＢ１２５及びＢＢ１２６をプライマーとして使
用した。反応容量は１００μｌであり、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ及び０
．５単位のＰｆｕポリメラーゼを利用した。その他の反応条件は、一次反応にお
いて使用した条件と同一であった。２次ＰＣＲの一部をアガロースゲル電気泳動
により分析し、約６７０ｂｐの予想されたバンドを観察した。２次ＰＣＲ反応の
バルクをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を使用して「精製
」し、発売元のプロトコルに従いＮｄｅＩ及びＸｂａＩ（ニューイングランドバ
イオラブズ社）で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して「精
製」し、２％アガロースゲル電気泳動にかけた。目的の約１００ｂｐのＮｄｅＩ
−ＸｂａＩ断片を、発売元のプロトコルに従いＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット
（キアゲン社）を使用して「精製」した。この断片を、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで
切断したｐＢＢＴ１７７（実施例２０に記載）とライゲートさせ、ウシ腸アルカ
リホスファターゼ（ニューイングランドバイオラブズ社）で処理し、ゲル精製し
た。ライゲーション反応物を使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、得られた形質
転換体由来のプラスミドを配列決定して、Ｑ５Ｃ変異を含有し、かつ約１００ｂ
ｐのＮｄｅＩ−ＸｂａＩセグメント全体に正確な配列を有するクローンを同定し
た。
【０１８５】 置換変異Ｃ１Ｓは、Ｃ１に対応するＴＧＴコドンをセリンに対応するＴＣＴコ
ドンに変化させる相補的突然変異導入プライマーＢＢ１２８（５＞ＡＧＧＣＡＧ
ＡＴＣＡＧＡＴＧＣＧＴＡＡＧＣ＞３）（配列番号５９）及びＢＢ１２７（５＞
ＧＣＴＴＡＣＧＣＡＴＣＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴ＞３）（配列番号６０）を、それ
ぞれＢＢ１３０及びＢＢ１２９の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用したこ
とを除けば、既に詳述したＱ５Ｃのためのプロトコルを使用して、構築し、配列
を確認した。［ＢＢ１２５×ＢＢ１１２８］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイ
ズは約１２０ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１２７］ＰＣＲ反応が与える産物の予想
サイズは約５７０ｂｐであった。
【０１８６】 置換変異Ｎ４５Ｃは、既に詳述したＱ５Ｃのためのプロトコルを、以下のよう
に改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｎ４５に対応するＡＡＣ
コドンを、システインに対応するＴＧＣコドンに変化させる相補的突然変異導入
プライマーＢＢ１３４（５＞ＣＴＴＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＡＡＣＴ
ＣＣＴＣ＞３）（配列番号６１）及びＢＢ１３３（５＞ＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＧ
ＣＴＧＣＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＡＧ＞３）（配列番号６２）を、それぞれＢＢ１
３０及びＢＢ１２９の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１２
５×ＢＢ１３４］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２５５ｂｐ、［ＢＢ
１２６×ＢＢ１３３］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４４０ｂｐであ
った。二次ＰＣＲ反応の産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（キアゲ
ン社）を使用して「精製」し、発売元のプロトコルに従いＢｇｌＩＩ及びＸｂａ
Ｉ（ニューイングランドバイオラブズ社）で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ
精製キットを使用して「精製」し、２％アガロースゲル電気泳動にかけた。目的
の約１５５ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ断片を、発売元のプロトコルに従いＱＩ
ＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット（キアゲン社）を使用してゲル精製した。この断片
を、ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩで切断しておいたｐＢＢＴ１７７とライゲートさせ
、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ニューイングランドバイオラブズ社）で処理
し、ゲル精製した。ライゲーション反応物を使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換し
、得られた形質転換体由来のプラスミドを配列決定して、Ｎ４５Ｃ変異を含有し
、かつ約１５５ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩセグメント全体に正確な配列を有す
るクローンを同定した。
【０１８７】 置換変異Ｆ４７Ｃは、既に詳述したＮ４５Ｃのためのプロトコルを、以下のよ
うに改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｆ４７に対応するＴＴ
Ｃコドンを、システインに対応するＴＧＣコドンに変化させる相補的突然変異導
入プライマーＢＢ１３６（５＞ＴＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＴＧ
ＣＣＡＡＡ＞３）（配列番号６３）及びＢＢ１３５（５＞ＴＴＴＧＧＣＡＡＣＣ
ＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＧＧＣＴＧＡＡ＞３）（配列番号６４）を、それぞれＢＢ
１３４及びＢＢ１３３の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１
２５×ＢＢ１３６］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２６０ｂｐ、［Ｂ
Ｂ１２６×ＢＢ１３５］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４３５ｂｐで
あった。
【０１８８】 挿入変異４３Ｃ４４は、既に詳述したＮ４５Ｃのためのプロトコルを、以下の
ように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。アミノ酸残基４３を
コードするコドンとアミノ酸残基４４をコードするコドンとの間に、システイン
に対応するＴＧＣコドンを挿入する相補的突然変異導入プライマーＢＢ１３２（
５＞ＴＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＴＧＣＣＡＡＡ＞３）（配列番
号６５）及びＢＢ１３１（５＞ＴＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＧＧ
ＣＴＧＡＡ＞３）（配列番号６６）を、それぞれＢＢ１３４及びＢＢ１３３の代
わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１２５×ＢＢ１３２］ＰＣＲ
反応が与える産物の予想サイズは約２５０ｂｐ、［ＢＢ１２６×ＢＢ１３１］Ｐ
ＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４４５ｂｐであった。
【０１８９】 置換変異Ｑ４６Ｃは、既に詳述したＮ４５Ｃのためのプロトコルを、以下のよ
うに改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｑ４６に対応するＣＡ
Ｇコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変異導
入プライマーＢＢ１５４（５＞ＡＧＣＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＴＴＧＣＣＡ
ＡＡＣＴＣ＞３）（配列番号６７）及びＢＢ１５３（５＞ＧＡＧＴＴＴＧＧＣＡ
ＡＣＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡＧＧＣＴ＞３）（配列番号６８）を、それぞれＢＢ
１３４及びＢＢ１３３の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。一次反応
は、パーキンエルマージーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍ
ｐ）（登録商標）ＰＣＲシステム２４００サーマルサイクラーで実施した。反応
プログラムは、９５℃５分、［９５℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃１分］を３
０サイクル、その後７２℃７分、４℃で維持、であった。［ＢＢ１２５×ＢＢ１
５４］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２６０ｂｐ、［ＢＢ１２６×Ｂ
Ｂ１５３］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４４０ｂｐであった。二次
ＰＣＲ反応は、パーキンエルマージーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｇ
ｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）ＰＣＲシステム２４００サーマルサイクラーで実施
した。この反応プログラムは、９６℃５分、［９５℃３０秒、６０℃３０秒、７
２℃１分］を２５サイクル、４℃で維持、であった。ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩに
よる消化の後、この反応の産物を、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精
製キットを使用して「精製」し、ゲル精製はせずに、ライゲーションを行った。
【０１９０】 置換変異Ｑ４８Ｃは、既に詳述したＱ４６Ｃのためのプロトコルを、以下のよ
うに改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｑ４８に対応するＣＡ
Ａコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変異導
入プライマーＢＢ１５６（５＞ＧＧＴＴＴＣＡＧＣＣＴＴＡＣＡＧＡＡＣＴＧＧ
ＴＴＧＣＣ＞３）（配列番号６９）及びＢＢ１５５（５＞ＧＧＣＡＡＣＣＡＧＴ
ＴＣＴＧＴＡＡＧＧＣＴＧＡＡＡＣＣ＞３）（配列番号７０）を、それぞれＢＢ
１５４及びＢＢ１５３の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１
２５×ＢＢ１５６］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２６５ｂｐ、［Ｂ
Ｂ１２６×ＢＢ１５５］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４３５ｂｐで
あった。
【０１９１】 置換変異Ａ５０Ｃは、既に詳述したＱ４６Ｃのためのプロトコルを、以下のよ
うに改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ａ５０に対応するＧＣ
Ｔコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変異導
入プライマーＢＢ１５８（５＞ＡＧＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧ
ＡＡＣＴＧ＞３）（配列番号７１）及びＢＢ１５７（５＞ＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡ
ＡＧＴＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＣＴ＞３）（配列番号７２）を、それぞれＢＢ
１５４及びＢＢ１５３の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１
２５×ＢＢ１５８］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２７０ｂｐ、［Ｂ
Ｂ１２６×ＢＢ１５７］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４４０ｂｐで
あった。
【０１９２】 置換変異Ｄ７７Ｃは、既に詳述したＱ５Ｃのためのプロトコルを、以下のよう
に改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｄ７７に対応するＧＡＴ
コドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変異導入
プライマーＢＢ１３８（５＞ＴＡＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＣＣＡＡＧＣＡＧ
ＣＡＧＡ＞３）（配列番号７３）及びＢＢ１３７（５＞ＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧ
ＧＴＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＴＡ＞３）（配列番号７４）を、それぞれＢＢ１
３０及びＢＢ１２９の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１２
５×ＢＢ１３８］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約３５０ｂｐ、［ＢＢ
１２６×ＢＢ１３７］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約３４５ｂｐであ
った。二次ＰＣＲ反応の産物は、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製
キット（キアゲン社）を使用して「精製」し、発売元のプロトコルに従いＢｇｌ
ＩＩ及びＳａｌＩ（ニューイングランドバイオラブズ社）で消化し、キアクイッ
ク（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットを使用して「精製」し、２％アガロー
スゲル電気泳動にかけた。目的の約２７５ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ断片を、
発売元のプロトコルに従いＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット（キアゲン社）を使
用してゲル精製した。この断片を、ＢｇｌＩＩ及びＳａｌＩで切断しておいたｐ
ＢＢＴ１７７とライゲートさせ、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ニューイング
ランドバイオラブズ社）で処理し、ゲル精製した。ライゲーション反応物を使用
してＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、得られた形質転換体由来のプラスミドを配列決
定して、Ｄ７７Ｃ変異を含有し、かつ約２７５ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩセグ
メント全体に正確な配列を有するクローンを同定した。
【０１９３】 置換変異Ｔ１０６Ｃは、既に詳述したＤ７７Ｃのためのプロトコルを、以下の
ように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｔ１０６に対応する
ＡＣＡコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変
異導入プライマーＢＢ１４０（５＞ＣＡＧＧＧＧＡＧＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＣ
ＣＣＡＣＣＣＣ＞３）（配列番号７５）及びＢＢ１３９（５＞ＧＧＧＧＴＧＧＧ
ＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＣＴＣＣＣＣＴＧ＞３）（配列番号７６）を、それぞれ
ＢＢ１３８及びＢＢ１３７の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［Ｂ
Ｂ１２５×ＢＢ１４０］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４３５ｂｐ、
［ＢＢ１２６×ＢＢ１３９］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２６０ｂ
ｐであった。
【０１９４】 置換変異Ｔ１０８Ｃは、既に詳述したＤ７７Ｃのためのプロトコルを、以下の
ように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｔ１０８に対応する
ＡＣＴコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変
異導入プライマーＢＢ１４２（５＞ＣＴＴＣＡＴＣＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴＣＴＧ
ＴＣＡＣＣＣＣ＞３）（配列番号７８）及びＢＢ１４１（５＞ＧＧＧＧＴＧＡＣ
ＡＧＡＧＴＧＴＣＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧ＞３）（配列番号７９）を、それぞれ
ＢＢ１３８及びＢＢ１３７の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［Ｂ
Ｂ１２５×ＢＢ１４２］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４４０ｂｐ、
［ＢＢ１２６×ＢＢ１４１］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２５０ｂ
ｐであった。
【０１９５】 置換変異Ｑ１０１Ｃは、既に詳述したＤ７７Ｃのためのプロトコルを、以下の
ように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｑ１０１に対応する
ＣＡＧコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然変
異導入プライマーＢＢ１６２（５＞ＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＴＡＴＣＡ
ＣＡＣＡＧＧＣ＞３）（配列番号８０）及びＢＢ１６１（５＞ＧＣＣＴＧＴＧＴ
ＧＡＴＡＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧ＞３）（配列番号８１）を、それぞれ
ＢＢ１３８及びＢＢ１３７の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。一次
反応は、パーキンエルマージーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｇｅｎｅ
Ａｍｐ）（登録商標）ＰＣＲシステム２４００サーマルサイクラーで実施した。
反応プログラムは、９５℃５分、［９５℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃１分］
を３０サイクル、その後７２℃７分、４℃で維持、であった。［ＢＢ１２５×Ｂ
Ｂ１６２］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４２５ｂｐ、［ＢＢ１２６
×ＢＢ１６１］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２７５ｂｐであった。
二次ＰＣＲ反応も、パーキンエルマージーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）ＰＣＲシステム２４００サーマルサイクラーで
実施した。この反応プログラムは、９６℃５分、［９５℃３０秒、６０℃３０秒
、７２℃１分］を２５サイクル、４℃で維持、であった。ＢｇｌＩＩ及びＳａｌ
Ｉによる消化の後、この反応の産物を、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣ
Ｒ精製キットを使用して「精製」し、ゲル精製はせずに、ライゲーションを行っ
た。
【０１９６】 置換変異Ｅ１０７Ｃは、既に詳述したＱ１０１Ｃのためのプロトコルを、以下
のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｅ１０７に対応す
るＧＡＧコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる相補的突然
変異導入プライマーＢＢ１６４（５＞ＣＡＴＣＡＧＧＧＧＡＧＴＡＣＡＴＧＴＣ
ＡＣＣＣＣＣＡＣ＞３）（配列番号８１）及びＢＢ１６３（５＞ＧＴＧＧＧＧＧ
ＴＧＡＣＡＴＧＴＡＣＴＣＣＣＣＴＧＡＴＧ＞３）（配列番号８２）を、それぞ
れＢＢ１６２及びＢＢ１６１の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［
ＢＢ１２５×ＢＢ１６４］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４４０ｂｐ
、［ＢＢ１２６×ＢＢ１６３］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２５５
ｂｐであった。
【０１９７】 置換変異Ｃ９８Ｓは、既に詳述したＱ１０１Ｃのためのプロトコルを、以下の
ように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｃ９８Ｓに対応する
ＴＧＴコドンを、セリンに対応するＴＣＴコドンに変化させる相補的突然変異導
入プライマーＢＢ１６０（５＞ＣＣＣＣＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣ
ＡＧＧＴＣ＞３）（配列番号８３）及びＢＢ１５９（５＞ＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧ
ＣＣＴＣＴＧＴＧＡＴＡＣＡＧＧＧＧ＞３）（配列番号８４）を、それぞれＢＢ
１６２及びＢＢ１６１の代わりに、一次ＰＣＲ反応において使用した。［ＢＢ１
２５×ＢＢ１６０］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約４１５ｂｐ、［Ｂ
Ｂ１２６×ＢＢ１５９］ＰＣＲ反応が与える産物の予想サイズは約２８５ｂｐで
あった。
【０１９８】 システイン置換変異Ｓ１６３Ｃは、以下のようにして構築した。１６３位のセ
リンに対応するコドンＡＧＴを、システインをコードするＴＧＴに変化させる、
近傍のＥｃｏＲＩ部位を含む突然変異導入逆向きオリゴヌクレオチドＢＢ１４３
（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣ
＞３）（配列番号８５）を設計した。このオリゴを、順向き非突然変異導入プラ
イマーＢＢ１２５と共に、ＰＣＲにおいて使用した。５０μｌのＰＣＲ反応を、
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２μＭの各プライマー、２００μＭのｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ、１ｎｇの鋳型プラスミドｐＢＢＴ１３１、１
．５単位のＴａｑポリメラーゼ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））並びに０．２
５単位のＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を
含有する１×プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ＰＣＲ緩衝液中で実施した。反応は、
ロボサイクラーグラジエント（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）９６
サーマルサイクラー（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））で実施した
。反応プログラムは、９６℃３分、［９５℃１分、６０℃１．２５分、７２℃１
分］を２５サイクル、その後６℃で維持、であった。ＰＣＲ反応物の一部５μｌ
を、アガロースゲル電気泳動により分析し、約６１０ｂｐと予想されるサイズの
単一断片が生成するのを見出した。反応物の残りは、発売元のプロトコルに従い
キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を使用して
「精製」し、発売元のプロトコルに従いＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩ（ニューイング
ランドバイオラブズ社）で消化し、エタノール沈殿し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．５）２０μｌ中に再懸濁させ、２％アガロースゲル電気泳動にかけた
。目的の約４２ｂｐのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、発売元のプロトコルに従い
ＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット（キアゲン社）を使用してゲル精製した。この
断片を、ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで切断しておいたｐＢＢＴ１３２とライゲート
させ、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ニューイングランドバイオラブズ社）で
処理し、ゲル精製した。ライゲーション反応物を使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転
換し、得られた形質転換体由来のプラスミドを配列決定して、Ｅ１０７Ｃ変異を
含有し、かつ約４２ｂｐのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩセグメント全体に正確な配列を
有するクローンを同定した。
【０１９９】 ＩＦＮ−α２コーディング配列のカルボキシ末端アミノ酸の後にシステインを
付加する変異も構築した。*１６７Ｃと名付けられたこの変異型は、前記のＳ１
６３Ｃ変異型の構築のためのプロトコルを、以下のように改変したものを使用し
て、構築した。Ｅ１６５に対応するＧＡＡコドンとＴＡＡ終止コドンとの間に、
システインに対応するＴＧＴコドンを付加する、近傍のＥｃｏＲＩ部位を含む突
然変異導入逆向きオリゴヌクレオチドＢＢ１４４（５＞ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴ
ＡＡＣＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣ＞３）（配列番号８６）
を、ＢＢ１４３の代わりにＰＣＲ反応において使用した。
【０２００】 置換変異Ｅ１６５Ｃは、既に詳述したＳ１６３Ｃのためのプロトコルを、以下
のように改変したものを使用して、構築し、配列を確認した。Ｅ１６５に対応す
るＧＡＡコドンを、システインに対応するＴＧＴコドンに変化させる、近傍のＥ
ｃｏＲＩ部位を含む突然変異導入逆向きオリゴヌクレオチドＢＢ１６５（５＞Ｃ
ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴ＞３）（配列番
号８７）を、ＢＢ１４３の代わりに、ＰＣＲ反応において使用した。ＰＣＲ反応
は、パーキンエルマージーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍ
ｐ）（登録商標）ＰＣＲシステム２４００サーマルサイクラーで実施した。反応
プログラムは、９５℃５分、［９５℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃１分］を３
０サイクル、その後７２℃７分、４℃で維持、であった。ＥｃｏＲＩ及びＳａｌ
Ｉによる消化の後、この反応の産物を、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣ
Ｒ精製を使用して精製した。
【０２０１】 細胞ペリプラズムへ分泌されるタンパク質としてのＥ．ｃｏｌｉにおける発現
のため、１７種の変異タンパク質をコードするＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２遺伝子を
、ｐＵＣ１８を基本としたｐＢＢＴ１７７誘導体から、約５９０ｂｐのＮｄｅＩ
−ＥｃｏＲＩ断片として切り出し、野生型ＳＴＩＩ−ＩＦＮ−α２を発現させる
ために使用したｐＣＹＢ１発現ベクターへサブクローニングした。発現実験のた
め、これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０へ導入した。
【０２０２】 本明細書に記載の方法と類似した方法を使用して、ＩＦＮ−α２のその他のシ
ステイン変異タンパク質を構築することが可能である。システイン変異タンパク
質は、ＩＦＮ−α２コーディング配列内の天然アミノ残基をシステインに置換す
る置換変異、ＩＦＮ−α２コーディング配列内の２つの天然アミノ酸の間にシス
テイン残基を挿入する挿入変異、又はＩＦＮ−α２コーディング配列の最初のア
ミノ酸Ｃ１より前にシステイン残基を付加するか、もしくはＩＦＮ−α２コーデ
ィング配列の末端アミノ酸残基Ｅ１６５より後にシステインを付加する付加変異
でありうる。システイン残基は、ＩＦＮ−α２コーディング配列内の任意の位置
において、任意のアミノ酸と置換されるか、又は任意の２つのアミノ酸の間に挿
入されうる。ＩＦＮ−α２中のシステインを置換又は挿入するための好ましい部
位は、ヘリックスＡより前の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループ
、Ｄ−Ｅループ、及びヘリックスＥより遠位の領域である。その他の好ましい部
位は、Ａヘリックス、Ｂヘリックス、Ｃヘリックス、Ｄヘリックス及びＥヘリッ
クスの最初又は最後の３つのアミノ酸である。システイン置換を作出するための
、これらの領域内の好ましい残基は、Ｄ２、Ｌ３、Ｐ４、Ｔ６、Ｈ７、Ｓ８、Ｑ
２０、Ｒ２２、Ｋ２３、Ｓ２５、Ｆ２７、Ｓ２８、Ｋ３１、Ｄ３２、Ｒ３３、Ｄ
３５、Ｇ３７、Ｆ３８、Ｑ４０、Ｅ４１、Ｅ４２、Ｆ４３、Ｇ４４、Ｋ４９、Ｔ
５２、Ｎ６５、Ｓ６８、Ｔ６９、Ｋ７０、Ｄ７１、Ｓ７２、Ｓ７３、Ａ７４、Ａ
７５、Ｄ７７、Ｅ７８、Ｔ７９、Ｙ８９、Ｑ９０、Ｑ９１、Ｎ９３、Ｄ９４、Ｅ
９６、Ａ９７、Ｇ１０２、Ｖ１０３、Ｇ１０４、Ｖ１０５、Ｐ１０９、Ｍ１１１
、Ｋ１１２、Ｅ１１３、Ｄ１１４、Ｓ１１５、Ｋ１３１、Ｅ１３２、Ｋ１３３、
Ｋ１３４、Ｙ１３５、Ｓ１３６、Ａ１３９、Ｓ１５２、Ｓ１５４、Ｔ１５５、Ｎ
１５６、Ｌ１５７、Ｑ１５８、Ｅ１５９、Ｓ１６０、Ｌ１６１、Ｒ１６２及びＫ
１６４である。システイン残基は、これらのアミノ酸の直ぐ前又は後にも挿入さ
れうる。システイン残基を付加するためのもう一つの好ましい部位は、本発明者
らが*−１Ｃと呼ぶ、Ｃ１の前であろう。
【０２０３】 ＩＦＮ−α２内の天然システイン残基のうちの１つを、他のアミノ酸と置換す
ることにより、自由システインを含有するＩＦＮ−α２変異タンパク質を構築す
ることもできる。その際、置換されたシステイン残基と、通常、ジスルフィド結
合を形成している天然システイン残基は、自由となる。非必須のシステイン残基
は、他の１９アミノ酸のうちの任意のものと交換されうるが、好ましくは、セリ
ン残基又はアラニン残基と交換される。自由システイン残基は、Ｓｙｔｋｏｗｓ
ｋｉら（１９９８）により記載された方法のような方法を使用した、天然アミノ
酸の化学的修飾によっても、ＩＦＮ−α２へ導入されうる。
【０２０４】 実施例２０〜２２に記載された方法と類似した方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ
においてタンパク質を発現させ、タンパク質を精製し、タンパク質をＰＥＧ化し
、それらの生物活性をインビトロのバイオアッセイにおいて測定することができ
る。ＩＦＮ−α２変異タンパク質は、実施例１６〜２０に記載された方法と類似
の方法、又は当業者に周知の関連した方法を使用して、昆虫又は哺乳動物の細胞
のような真核細胞においても発現されうる。
【０２０５】 Ｂ．ｒＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ発現 発現を調査するため、前記の野生型ｒＩＦＮ−α２の場合と同様にして、ｒＩ
ＦＮ−α２変異タンパク質の培養物を増殖させ、誘導した。典型的には、４５ｍ
ｌの培養物を、約１８０〜２００ｒｐｍの旋回振とう（ｇｙｒｏｔｏｒｙ ｓｈ
ａｋｅｒ）水浴中で、３７℃で、２５０ｍｌの振とうフラスコで増殖させた。本
発明者らは、振とうフラスコ培養物の激しい曝気が、浸透圧衝撃溶解物の上清中
のＩＦＮ−α２タンパク質のレベルを減少させるのを観察した。従って、本発明
者らは、曝気にとっては最適ではないが、可溶性ｒＩＦＮ−α２及びｒＩＦＮ−
α２変異タンパク質の産生にとっては好ましい条件を通常使用した。誘導された
培養物を、約１６時間インキュベートし、採集し、既に詳述した野生型ｒＩＦＮ
−α２の場合と同様の浸透圧衝撃にかけた。ただし、浸透圧衝撃法に使用する緩
衝液には、５ｍＭという最終濃度でシスチンを添加した。浸透圧衝撃緩衝液への
シスチンの添加は、最初に分析した２つの変異タンパク質Ｑ５Ｃ及びＳ１６３Ｃ
のためのクロマトグラフィー特性を有意に改善した。シスチンで処理していない
インターフェロン変異タンパク質は、一貫して、Ｓ−セファロース（Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）カラムからブロードのバンドとして溶出し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析した場合、予想される単量体分子量の位置、及びその周辺に複数の分
子量種を示した。これらの種は、不適切に折り畳まれた、又は不完全に折り畳ま
れたインターフェロン異型である可能性が最も高い。対照的に、浸透圧衝撃法に
おいてシスチンで処理したインターフェロン変異タンパク質は、シャープなバン
ドとしてＳ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムから溶出し、非還元Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合、インターフェロン野生型標準と同じ位置に
移動するただ１つのインターフェロン種からなっていた。精製されたインターフ
ェロン変異タンパク質のＳ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムからの
回収も、浸透圧衝撃緩衝液中にシスチンが含まれる場合、１．５倍から２倍、大
きかった。これらの結果に基づき、全てのシステイン変異タンパク質を精製する
ために使用する浸透圧衝撃緩衝液に、５ｍＭシスチンを添加した。
【０２０６】 変異タンパク質の浸透圧衝撃上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、大部分が、１９
ｋＤａのｒＩＦＮ−α２バンドのレベルが（野生型と比較して）減少しているこ
とを示した。２つの変異タンパク質Ｑ５Ｃ及びＳ１６３Ｃは、野生型インターフ
ェロンと等価なレベルで発現し、これらの各変異タンパク質、数百マイクログラ
ムが、以下に詳述するように、容易に精製された。８種の変異タンパク質（Ｃ１
Ｓ、４３Ｃ４４、Ｎ４５Ｃ、Ｑ４６Ｃ、Ｑ４８Ｃ、Ａ５０Ｃ、Ｄ７７Ｃ及びＴ１
０８Ｃ）は、浸透圧衝撃上清中に本質的に検出不可能であった。残りの７種の変
異タンパク質（Ｆ４７Ｃ、Ｃ９８Ｓ、Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ
１６５Ｃ、*１６６Ｃ）は、浸透圧衝撃上清中に、様々な程度に（野生型と比較
して）減少したレベルで検出された。これらの変異タンパク質のうちのいくつか
（Ｔ１０６Ｃ、Ｃ９８Ｓ、Ｅ１０７Ｃ及びＱ１０１Ｃ）は、浸透圧衝撃上清から
精製されたが、少量の純粋タンパク質しか回収されなかった。いくつかの変異タ
ンパク質Ｃ９８Ｓ、Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ及び*１６６Ｃは、比
較的高いレベルで発現したが、主に不溶型で、おそらく細胞ペリプラズムに蓄積
していた。これらのタンパク質は、還元条件下で、野生型ｒＩＦＮ−α２標準と
同じ位置に移動し、そのことはＳＴＩＩリーダーが除去されていることを示して
いる。変異タンパク質の相対発現レベルの定量的調査を、表４に要約する。
【０２０７】 Ｃ．ｒＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質の精製 ｒＩＦＮ−α２変異タンパク質を精製するため、典型的には、２リットルの振
とうフラスコ中の３２５ｍｌの培養物、又は２リットルのバッフル（ｂａｆｆｌ
ｅｄ）振とうフラスコ中の５００ｍｌの培養物を、約１７０〜２２０ｒｐｍの旋
回振とう水浴（ニューブランスウィックサイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕ
ｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））中で３７℃で増殖させた。実施例２０
に記載のようにして、培養物を増殖させ、誘導し、回収し、浸透圧衝撃にかけた
。得られた浸透圧衝撃上清は、直ちに処理するか、又は−８０℃で保存した。
【０２０８】 既に詳述したような野生型ｒＩＦＮ−α２の精製と同様にして、浸透圧衝撃上
清中の可溶性ＩＦＮ−α２変異タンパク質を、Ｓ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ）及びＣｕ++ＩＭＡＣクロマトグラフィーを使用して精製した。試験した
変異タンパク質全てが、銅カラムと強く結合し、野生型ｒＩＦＮ−α２と同様の
条件下で溶出した。この結果は、システイン変異タンパク質のコンフォメーショ
ンが、少なくとも金属結合ポケットを含む領域においては、天然型ｒＩＦＮ−α
２のコンフォメーションと類似していることを示している。
【０２０９】 精製されたシステイン変異タンパク質Ｑ５Ｃ、Ｃ９８Ｓ、Ｑ１０１Ｃ、Ｔ１０
６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｓ１６３Ｃ及び*１６６Ｃの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、変
異タンパク質が、約１９ｋＤａという予想分子量の位置に移動する単量体として
主に回収されることを示した。Ｃ９８Ｓは、天然型Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ−９８ジス
ルフィド結合が存在しないために、他のｒＩＦＮ−α２変異タンパク質より、わ
ずかに高分子量の位置に移動した。精製された変異タンパク質のいくつかは、少
量のジスルフィド結合ｒＩＦＮ−α２二量体を含有していた。二量体種の分子量
は、約３７〜３８ｋＤａであった。
【０２１０】 Ｄ．ｒＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質の生物活性 精製されたｒＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質Ｑ５Ｃ及びＳ１６３Ｃの
生物活性を、実施例２０に記載のダウジ（Ｄａｕｄｉ）増殖阻害アッセイにおい
て測定した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパ
ク質アッセイキット又はＢＣＡタンパク質アッセイキット（バイオラドラボラト
リーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びピアース社（Ｐｉ
ｅｒｃｅ））を使用して決定した。アッセイにおける日間変動をコントロールす
るため、市販の野生型ｒＩＦＮ−α２及び本発明者らが調製したｒＩＦＮ−α２
を、同一日に平行して分析した。変異タンパク質は、アッセイの誤差内で、野生
型ｒＩＦＮ−α２対照タンパク質と同程度にダウジ細胞の増殖を阻害した。Ｑ５
Ｃ変異タンパク質の平均ＩＣ50は、１３ｐｇ／ｍｌであり、それは、野生型ｒＩ
ＦＮ−α２タンパク質の平均ＩＣ50と類似していた。Ｓ１６３Ｃタンパク質の平
均ＩＣ50は、２７ｐｇ／ｍｌであった。これらのデータを表４に要約する。
【０２１１】
【表４】 実施例２２ ＰＥＧ−Ｑ５Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１６３ＣのＰＥＧ化、精製及び生物活性 Ａ．ＩＦＮ−αシステイン変異タンパク質のＰＥＧ化 タンパク質が自由システイン残基において単ＰＥＧ化されうる条件を同定する
ため、小規模なＰＥＧ化実験を、精製されたｒＩＦＮ−α２システイン変異タン
パク質を用いて実施した。タンパク質の未折り畳みの結果としての、予想される
よりも高い見かけの分子量へのシフトを検索するか、又は天然型ジスルフィドの
還元の結果として生成した、複数のＰＥＧ化種の出現を検索する、非還元ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより、タンパク質の過剰還元をモニターした。最初の力価測定実験
は、Ｑ５Ｃタンパク質を用いて実施した。精製されたＱ５Ｃ、１μｇを、様々な
量の過剰の５ｋＤａマレイミド−ＰＥＧの存在下で、１００ｍＭトリス（ｐＨ８
．５）中で、増加する濃度のＴＣＥＰ［トリス（２−カルボキシエチル）ホスフ
ィン］−ＨＣｌと共に、室温でインキュベートした。６０分後、反応を停止させ
、直ちに非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。野生型ｒＩＦＮ−α２を修飾
することなく、有意な量の単ＰＥＧ化Ｑ５Ｃタンパク質（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによると約２８ｋＤａの分子量）を生じるＴＣＥＰ及びＰＥＧ試薬の量を、さ
らなる実験に使用した。力価測定実験は、１０倍モル過剰のＴＣＥＰ及び２０倍
過剰の５ｋＤａマレイミドＰＥＧが、検出可能なジＰＥＧ化又はトリＰＥＧ化タ
ンパク質を生成させることなく、又は野生型ｒＩＦＮ−α２を修飾することなく
、約６０％の単ＰＥＧ化タンパク質を与えることを示した。
【０２１２】 これらの条件を使用して、いくつかの他のｒＩＦＮ−α２変異タンパク質もＰ
ＥＧ化した。精製された野生型ｒＩＦＮ−α２及びｒＩＦＮ−α２変異タンパク
質（Ｑ５Ｃ、Ｔ１０６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｓ１６３Ｃ）１μｇを、室温で、ｐＨ８
．５で、１０倍モル過剰のＴＣＥＰ及び２０倍モル過剰の５ｋＤＡマレイミドＰ
ＥＧと共に１時間インキュベートした。４種の変異タンパク質は、反応混合物の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づくと、様々な程度（３０〜６０％と推定される）に
単ＰＥＧ化された。野生型ｒＩＦＮ−α２は、これらの条件下で、検出可能なＰ
ＥＧ化を示さなかった。対照実験は、システイン変異タンパク質Ｑ５Ｃ、Ｔ１０
６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ及びＳ１６３Ｃが、ＰＥＧ化されるには、ＴＣＥＰによる還元
を必要とすることを示した。これらのデータは、ＰＥＧ分子が、Ｑ５Ｃ、Ｔ１０
６Ｃ、Ｅ１０７Ｃ及びＳ１６３Ｃのタンパク質に導入されたシステイン残基と接
着していることを示している。
【０２１３】 Ｂ．ＰＥＧ−Ｑ５Ｃ ＩＦＮ−α２及びＰＥＧ−Ｓ１６３Ｃの調製及び精製： ＰＥＧ化タンパク質の生物活性を測定するため、より大量のＱ５Ｃ及びＳ１６
３Ｃ変異タンパク質をＰＥＧ化した。Ｑ５Ｃタンパク質については、精製及び特
徴決定にとって十分な材料を与えるため、小規模実験に使用したＰＥＧ化条件を
タンパク質１４０μｇの規模に拡大した。より大規模なＰＥＧ化反応を、室温で
１時間実施し、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．０）で１０×に希釈し、ｐＨ３．０
に調整し、次いで、ｒＩＦＮ−α２変異タンパク質の最初の精製について記載し
た条件と類似の条件を使用して、迅速にＳ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
）カラムへ担荷させた。ＰＥＧ基の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を
減少させ、ＰＥＧ化タンパク質の非ＰＥＧ化タンパク質からの分離を可能にした
。Ｓ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムからのクロマトグラムは、約
１９０ｍＭ ＮａＣｌ及び２３０ｍＭ ＮａＣｌで溶出する２つの主要なタンパ
ク質ピークを示した。先に溶出する主要ピーク（約１９０ｍＭ ＮａＣｌで溶出
）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、単ＰＥＧ化Ｑ５Ｃであることが決定された。単
ＰＥＧ化Ｑ５Ｃの見かけの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると約２８ｋＤａで
ある。後に溶出する主要ピーク（２３０ｍＭ ＮａＣｌで溶出）は、未反応のＱ
５Ｃタンパク質であることが決定された。ＰＥＧ化Ｑ５Ｃを主に含有する、先に
溶出するピークからの画分をプールし、生物活性の測定に使用した。
【０２１４】 ＰＥＧ−Ｑ５Ｃについて記載したプロトコルと本質的に同一のプロトコルを使
用して、Ｓ１６３Ｃシステイン変異タンパク質を９０μｇの規模でＰＥＧ化し、
精製した。
【０２１５】 Ｃ．システイン変異タンパク質ＰＥＧ−Ｑ５Ｃ及びＰＥＧ−Ｓ１６３Ｃの生物
活性： 精製されたＰＥＧ−Ｑ５Ｃタンパク質の生物活性を、実施例２０に記載のダウ
ジ細胞アッセイにおいて測定した。タンパク質の濃度は、ブラッドフォード（Ｂ
ｒａｄｆｏｒｄ）色素結合アッセイを使用して決定した。ＰＥＧ−Ｑ５Ｃタンパ
ク質は、アッセイの誤差内で、野生型ｒＩＦＮ−α２及び未修飾Ｑ５Ｃタンパク
質と類似の用量−反応曲線を示し、同レベルの最大増殖阻害を達成した。ＰＥＧ
−Ｑ５Ｃ変異タンパク質の平均ＩＣ50は約２２ｐｇ／ｍｌであり、それは同一日
に分析された野生型ＩＦＮ−α２及び未修飾Ｑ５Ｃタンパク質について決定され
たＩＣ50値の２倍以内であった（表５）。ＰＥＧ−Ｑ５Ｃタンパク質の生物活性
は、非特異的なアミン反応性ＰＥＧ試薬でＰＥＧ化されたｒＩＦＮ−α２の生物
活性よりも有意に大きかった。後者のタンパク質は、ダウジ細胞アッセイにおけ
る１６４ｐｇ／ｍｌというＩＣ50を有している（Ｍｏｎｋａｒｓｈら，１９９７
）。これらのデータを表５に要約する。
【０２１６】 ＰＥＧ−Ｓ１６３Ｃタンパク質を用いた生物活性実験も実施した。ＰＥＧ−Ｓ
１６３Ｃタンパク質も、生物学的に活性であり、アッセイの誤差内で、野生型ｒ
ＩＦＮ−α２と同程度にダウジ細胞増殖を阻害した。ＰＥＧ−Ｓ１６３Ｃタンパ
ク質の平均ＩＣ50は、約４２ｐｇ／ｍｌであり、それはアミン−ＰＥＧ化ＩＦＮ
−αよりも優れていた。
【０２１７】
【表５】 実施例２３ ＰＥＧ化ＧＨシステイン変異タンパク質のインビボ効率は、下垂体切除（ＨＹ
ＰＯＸ）ラットにおいて試験することができる。これは、よく特徴決定されてい
るＧＨ欠損のモデルである（Ｃｏｘら，１９９４；Ｃｌａｒｋら，１９９６）。
ＧＨは、ＨＹＰＯＸラットにおいて体重増加並びに骨及び軟骨の成長を刺激する
（Ｃｏｘら，１９９４；Ｃｌａｒｋら，１９９６）。下垂体切除スプレーグドー
リー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットは、チャールズリバー社（Ｃｈａ
ｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（マサチューセッツ州ウィルミントン所在（Ｗｉｌｍｉ
ｎｇｔｏｎ，ＭＡ））のような商業的な供給元から購入することができる。典型
的には、ラットは、４０〜５０日齢の間に下垂体切除を受け、体重は約１２０ｇ
である。８匹のラットの群に、特定の間隔で、ｒｈＧＨ、ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＧＨ
又はプラセボ（媒体溶液）の皮下注射を与え、１０日間にわたり毎日、体重増加
を測定するべきである。摂食と関連した可能性のある変数を排除するため、１日
のうちの同じ時刻に毎日ラットを計量するべきである。全体的な体重増加に加え
、骨の成長（頸骨骨端の幅）を測定してもよい。屠殺時に、左右の近位頸骨骨端
を取り出し、ホルマリン固定する。固定された頸骨を、近位末端で矢状面で分割
し、硝酸銀で染色し、強い光に曝すことができる（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎら，１９
４９）。骨端軟骨板の幅は、マイクロメーター接眼レンズを備えた実体顕微鏡を
使用して測定することができる。各骨端について１０回の測定を行い、左右頸骨
の値の組み合わせについて平均＋／−ＳＥＭを計算するべきである。群間の比較
は、単独比較についてはスチューデントＴ検定、多重比較については一元配置分
散分析を使用して行うべきである。Ｐ＜０．０５を有意と見なすべきである。
【０２１８】 １０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＧで修飾されたＧＨシステイン変異タンパク
質の効率は、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、又は１回の注射により、ラットに
タンパク質を投与することにより試験することができる。皮下注射により１日２
回投与した非ＰＥＧ化ｈＧＨ５μｇ（１０μｇ ＢＩＤ）は、ＨＹＰＯＸラット
モデルにおいて強い成長反応を与える（Ｃｏｘら，１９９４；Ｃｌａｒｋら，１
９９６）。最初の実験においては、異なるラット群に、１匹当たり１回当たり０
．０８、０．４、２、１０又は５０μｇのＰＥＧ化Ｃｙｓ−ＧＨタンパク質の皮
下注射を与えるべきである。対照ラットには、媒体溶液のみを与えるべきである
。付加的な対照群には、ＰＥＧ化Ｃｙｓ−ＧＨタンパク質と同じ投薬計画を使用
して、非ＰＥＧ化ｒｈＧＨ（１０μｇ／ＢＩＤ）及び非ＰＥＧ化ｈＧＨ１０μｇ
を与えるべきである。ＰＥＧ化ＧＨシステイン変異タンパク質のＨＹＰＯＸラッ
トへの投与は、媒体処理群と比較して、体重増加及び頸骨骨端幅成長の増加をも
たらすはずである。
【０２１９】 ＰＥＧ化ＧＨシステイン変異タンパク質の効率は、齧歯類悪液質モデルにおい
ても試験することができる。体重減少を誘導するため、デキサメタゾン（ＤＥＸ
）を、ラットに投与することができる。正常スプレーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕ
ｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（２００〜２２５ｇ）の群に、デキサメタゾン（２０
０μｇ／匹；約１ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射を毎日与えるべきである。この量のデ
キサメタゾンは、８日間に約５〜６ｇの減少を誘導するはずである。異なる実験
において、１回、毎日、２日毎、３日毎又は４日毎に、媒体、又は様々な用量の
ＰＥＧ化ＧＨシステイン変異タンパク質をラットに投与することができる。異な
るラット群に、１匹当たり１回当たり０．０８、０．４、２、１０又は５０μｇ
のＰＥＧ化Ｃｙｓ−ＧＨタンパク質の皮下注射を与えるべきである。付加的な対
照は、ＤＥＸ又は注射を与えないラット群、ＤＥＸ及び非ＰＥＧ化ｒｈＧＨ（１
０μｇ ＢＩＤ）を与えるラット群、並びにＤＥＸ及び非ＰＥＧ化ｒｈＧＨ（実
験に応じて、毎日、２日毎、３日毎又は４日毎、即ちＰＥＧ化ＧＨシステイン変
異タンパク質を投与する頻度で１０μｇ）を与えるラット群を含む。毎日、動物
を計量するべきである。飼料及び水の消費量を、毎日監視するべきである。屠殺
時に、内部臓器を計量するべきである。統計分析は、ＨＹＰＯＸラット研究に関
する記載と同様にして実施するべきである。ＰＥＧ化ＧＨシステイン変異タンパ
ク質で処理した動物の体重減少は、媒体処理動物よりも、少ないはずである。
【０２２０】 ＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質のインビボ効率は、媒体処理動物と
比較したヘマトクリット及び赤血球生成の増加を、タンパク質が刺激することを
証明することにより、正常ラットにおいて測定することができる。ＥＰＯは、毎
日投薬した場合、ラットにおけるヘマトクリットの有意な増加を刺激する（Ｍａ
ｔｓｕｍｏｔｏら，１９９０；Ｖａｚｉｒｉら，１９９４；Ｂａｌｄｗｉｎら，
１９９８）。スプレーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットは、
チャールズリバー社（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（マサチューセッツ州ウィ
ルミントン所在（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ））のような商業的な供給元から
購入することができる。５匹のラットの群に、最大５日間、特定の間隔で、ＢＶ
ｒＥＰＯ、ＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質又はプラセボ（媒体溶液）
の皮下注射を与えるべきである。６日目に、動物を屠殺し、商業的な実験施設に
より実施されうるヘマトクリット及び総血球数（ＣＢＣ）の分析のため、血液サ
ンプルを収集するべきである。赤血球生成増加の証拠を検索するための組織病理
学的分析のため、赤血球生成組織（肝臓及び脾臓）を収集し、計量し、ホルマリ
ン固定するべきである。赤血球生成増加の証拠を検索するための単位粒子調製及
び組織病理学的分析のため、様々な長骨及び胸骨から骨髄を摘出するべきである
。群間の比較は、単独比較についてはスチューデントＴ検定、多重比較について
は一元配置分散分析を使用して行うべきである。Ｐ＜０．０５を有意と見なすべ
きである。ＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質は、媒体処理動物と比較し
て、ラットにおけるヘマトクリット及び赤血球生成の増加を刺激するはずである
。１０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＧで修飾されたＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変
異タンパク質の効率は、毎日、２日毎又は３日毎に投与した場合に、試験するこ
とができる。皮下注射により１日１回投与した非ＰＥＧ化ＥＰＯ、１００ＩＵ／
ｋｇ（約８００ｎｇ／ｋｇ）（ラット２００ｇ当たり１６０ｎｇ ＳＩＤ）は、
ヘマトクリットの有意な増加を与える（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，１９９０；Ｖａ
ｚｉｒｉら，１９９４；Ｂａｌｄｗｉｎら，１９９８）。最初の実験においては
、異なるラット群に、０．３２、１．６、８、４０又は１６０ｎｇのＰＥＧ化Ｅ
ＰＯシステイン変異タンパク質の皮下注射を与えるべきである。対照ラットには
、媒体溶液のみを与えるべきである。付加的な対照群には、非ＰＥＧ化ｒＥＰＯ
（１６０ｎｇ／ＳＩＤ）及び非ＰＥＧ化ｒＥＰＯ、１６０ｎｇを、ＰＥＧ化ＥＰ
Ｏシステイン変異タンパク質と同じ投薬計画を使用して与えるべきである。
【０２２１】 ＰＥＧ化ＥＰＯ変異タンパク質の効率は、化学療法により誘導された貧血モデ
ルにおいても試験することができる。シスプラチンにより誘導された貧血は、化
学療法により誘導された貧血の、よく特徴決定されている齧歯類モデルであり、
ヒト臨床環境との直接的な関連性を有している。ｒＥＰＯは、１００単位／ｋｇ
の１日用量で投与した場合、このモデルにおける貧血を回復させる（Ｍａｔｓｕ
ｍｏｔｏら，１９９０；Ｖａｚｉｒｉら，１９９４；Ｂａｌｄｗｉｎら，１９９
８）。スプレーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（約２００
ｇ）を、０日目に、貧血を誘導するためのシスプラチンの腹腔内注射（３．５ｍ
ｇ／ｋｇ）により処理し、様々な処理群に無作為に分類するべきである。１０ｋ
Ｄａ又は２０ｋＤａのＰＥＧで修飾されたＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパ
ク質の効率は、１回（１日目）、２日毎又は３日毎に投与した場合に、試験する
ことができる。異なるラット群に、１回当たり０．３２、１．６、８、４０又は
１６０ｎｇのＰＥＧ化ＥＰＯシステイン変異タンパク質の皮下注射を与えるべき
である。最大８日間、ラットに試験化合物を注射するべきである。１つの対照ラ
ット群には、ｒＥＰＯ（１００単位／ｋｇ）の皮下注射を毎日与えるべきである
。もう１つの対照群には、最初のシスプラチン注射は与えず、ＰＥＧ化ＥＰＯシ
ステイン変異タンパク質と同じ投薬スケジュールを使用して、生理ＮａＣｌ水の
注射を与えるべきである。９日目、ラットを屠殺し、総ＣＢＣ及び組織病理学の
分析のため、血液及び組織サンプルを得るべきである。ＰＥＧ化ＥＰＯシステイ
ン変異タンパク質は、媒体注射対照群と比較して、ラットにおけるヘマトクリッ
ト及び赤血球生成の増加を刺激するはずである。
【０２２２】 ＩＦＮ−α生物活性は、比較的種特異的であり、そのことが、研究されうる臨
床前動物モデルの範囲を制限している。ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２システイン変異タ
ンパク質のインビボ効率を測定するために使用されうる１つのモデルは、無胸腺
ヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片増殖の阻害である。ヒトＩＦＮ−α２
は、マウス細胞に対しては活性を示さず、ヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移
植片増殖の阻害は、ヒト腫瘍細胞に対する直接的な抗増殖効果を介して起こる。
ＩＦＮ−α２は、無胸腺マウスにおいて、多様な一次ヒト腫瘍異種移植片及びヒ
ト腫瘍細胞系の増殖を阻害する（Ｂａｌｋｗｉｌｌら，１９８５；Ｂａｌｋｗｉ
ｌｌら，１９８６；Ｊｏｈｎｓら，１９９２；Ｌｉｎｄｎｅｒ ａｎｄ Ｂｏｒ
ｄｅｎ，１９９７）。研究の第一終点は、処理マウスにける腫瘍の体積であるべ
きである。ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２システイン変異タンパク質の投与は、媒体処理
動物と比較して、マウスにおける腫瘍増殖（腫瘍の体積により測定される）を阻
害することが予想される。無胸腺ヌードマウスは、チャールズリバー社（Ｃｈａ
ｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）のような商業的な発売元から購入することができる。各
マウスに、０日目に、ＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ−３又はＭＣＦ−７腫瘍細胞（細胞系
は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能）２×１０6個を注
射し、無作為に、それぞれ１０匹からなる試験群に割り当てるべきである。腫瘍
細胞は、腋窩に最も近い乳腺を覆う真皮に注射するべきである。異なる試験群に
、特定の間隔で、即ち、毎日（ＳＩＤ）、２日毎（ＥＯＤ）又は３日毎（ＥＴＤ
）に、様々な用量の野生型ｒＩＦＮ−α２、１０ｋＤａ−ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２
システイン変異タンパク質、２０ｋＤａ−ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２システイン変異
タンパク質又はプラセボ（媒体溶液）の皮下注射を与えるべきである。腫瘍の体
積は、Ｌｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｂｏｒｄｅｎ（１９９７）に記載のようにして、
カリパスで腫瘍の長さ及び幅を測定することにより４日間隔で決定するべきであ
る。屠殺時に、腫瘍を切除し、計量するべきである。各試験群についての平均腫
瘍体積＋／−ＳＥＭを、各サンプル採取点について計算するべきである。群間の
比較は、単独比較についてはスチューデントＴ検定、多重比較については一元配
置分散分析を使用して行うべきである。皮下注射により１日１回投与した非ＰＥ
Ｇ化ＩＦＮ−α２、５μｇは、６週間後、無胸腺マウスにおけるＮＩＨ−ＯＶＣ
ＡＲ−３細胞及びＭＣＦ−７細胞の増殖を８０％阻害する（Ｌｉｎｄｎｅｒ ａ
ｎｄ Ｂｏｒｄｅｎ，１９９７）。いずれかの細胞系がこれらの研究に使用され
うる。ＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ−３細胞（ＡＴＣＣより入手可能）は、ＭＣＦ−７細
胞とは異なり、増殖にエストロゲンを必要としない。ＭＣＦ−７細胞を用いた異
種移植片実験は、マウスに卵巣摘出を施し、エストロゲンペレットを移植するこ
とを必要とする（Ｌｉｎｄｎｅｒ ａｎｄ Ｂｏｒｄｅｎ，１９９７）。最初の
実験においては、異なるマウス群に、毎日、２日毎又は３日毎の投薬スケジュー
ルを使用して、ｒＩＦＮ−α２、１０ｋＤａ−ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２システイン
変異タンパク質又は２０ｋＤａ−ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２システイン変異タンパク
質の１回につき１又は５μｇの皮下注射を与えるべきである。投薬は、腫瘍細胞
のマウスへの注射後、２日目に開始するべきである。対照マウスには、媒体溶液
のみを与えるべきである。２日毎及び３日毎の投薬実験においては、付加的な陽
性対照群に、未修飾ｒＩＦＮ−α２、５μｇの皮下注射を毎日与えるべきである
。
【０２２３】 参考文献
【０２２４】 本発明の種々の実施形態を詳細に述べてきたが、そのような実施形態の修飾及
び適合が生じうることは当業者には明らかである。しかしながら、そのような修
正及び適合が本発明の範囲内にあることは当然である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 標的ＤＮＡセグメントから２つの別個の断片を増幅させる、オー
バーラップ延長による突然変異誘発の図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/48 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｐ 5/02 14/505 7/06 14/56 43/00 １０５ 14/575 １１７ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｒ 1:19 14/505 1:91 14/56 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 14/575 Ａ６１Ｋ 37/36 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/24 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 37/66 Ｈ Ｃ１２Ｒ 1:19） 37/43 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ローゼンダール、メアリー エス． アメリカ合衆国 80020 コロラド州 ブ ルームフィールド フェアプレイ アベニ ュー 310 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA03 BA21 BA23 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA01 HA03 4B064 AG01 AG02 AG08 AG13 AG18 CA02 CA10 CC24 CD06 CE12 4C076 BB11 CC29 CC30 EE23A EE59 FF16 FF31 FF63 4C084 AA03 BA44 DA22 DA25 DB22 DB52 DB55 DB56 DB59 MA01 MA05 NA03 NA12 ZA552 ZB212 ZC022 ZC032 4H045 AA10 BA10 BA50 CA40 DA01 DA13 DA15 DA31 EA20 FA72 FA73 FA74

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 自由システインを有する可溶化タンパク質を得る方法であっ
    て、 （ａ）可溶化タンパク質を発現可能な宿主細胞を得る工程と、 （ｂ）前記宿主細胞をシステインブロック剤に暴露する工程と、 （ｃ）前記宿主細胞から可溶化タンパク質を単離する工程と から成る方法。
  2. 【請求項２】前記システインブロック剤の存在下で前記宿主細胞を破壊し、
    破壊された宿主細胞の可溶化画分から前記タンパク質を単離する工程をさらに含
    む、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記宿主細胞をシステインブロック剤に暴露する工程が、前記
    宿主細胞により可溶化タンパク質を合成する前か、合成している最中か、合成し
    た後で起こり、可溶化タンパク質は宿主細胞から分泌される、請求項１に記載の
    方法。
  4. 【請求項４】前記宿主細胞は細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細
    胞である、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】前記宿主細胞は細菌細胞である、請求項１乃至３のいずれかに
    記載の方法。
  6. 【請求項６】前記宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記可溶化タンパク質は組換えタンパク質である、請求項１乃
    至３のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】前記組換えタンパク質は成長ホルモン超遺伝子ファミリーのメ
    ンバーのシステイン変異タンパク質、その誘導体、又はそのアンタゴニストであ
    る、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記メンバーは成長ホルモンである、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記メンバーはエリスロポエチンである、請求項８に記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】前記インターフェロンはアルファインターフェロンアルファ
    （ＩＦＮ−α）である、請求項８に記載の方法。
  12. 【請求項１２】、前記アルファインターフェロンはインターフェロンアルフ
    ァ２（ＩＦＮ−α２）である、請求項８に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記組換えタンパク質はＴＧＦ−ベータ超遺伝子のメンバー
    のシステイン変異タンパク質、血小板由来増殖因子−Ａ、血小板由来増殖因子−
    Ｂ、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、ニューロト
    ロフィン−４、血管内皮細胞増殖因子、それらの誘導体、又はそれらのアンタゴ
    ニストである、請求項７に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記組換えタンパク質は免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のシ
    ステイン変異タンパク質であるかその誘導体である、請求項７に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記システインブロック剤がチオール反応性化合物である、
    請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記チオール反応性化合物が、シスチン、シスタミン、ジチ
    オグリコール酸、酸化型グルタチオン、ヨウ素、過酸化水素、ジヒドロアスコル
    ビン酸、テトラチオン酸、Ｏ−ヨードソベンゾエート、又は金属イオン存在下の
    酸素である、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記チオール反応性化合物がシスチンである、請求項１５に
    記載の方法。
  18. 【請求項１８】システイン反応性部分を前記単離タンパク質に取り付けて、
    システイン修飾タンパク質を形成する工程をさらに含む、請求項１乃至３のいず
    れかに記載の方法。
  19. 【請求項１９】ポリエチレングリコールを前記単離タンパク質に取り付けて
    、ＰＥＧ化タンパク質を形成する工程をさらに含む、請求項１乃至３のいずれか
    に記載の方法。
  20. 【請求項２０】約１１０ｎｇ／ｍｌよりも小さいＥＣ50を有するＰＥＧ化ヒ
    ト成長ホルモン（ｈＧＨ）又はその誘導体。
  21. 【請求項２１】ＰＥＧ部分が、前記ｈＧＨのＣ−Ｄループか、前記ｈＧＨの
    ヘリックスＡのすぐ前の領域に取り付けられる、請求項２０に記載のＰＥＧ化ｈ
    ＧＨ。
  22. 【請求項２２】約１０００ｎｇ／ｍｌよりも小さいＥＣ50を有するＰＥＧ化
    エリスロポエチン又はその誘導体。
  23. 【請求項２３】ＰＥＧ部分が、ＥＰＯのＣ−Ｄループ又はＡ−Ｂループに取
    り付けられる、請求項２２に記載のＰＥＧ化ＥＰＯ。
  24. 【請求項２４】約１００ｐｇ／ｍｌよりも小さいＥＣ50を有するＰＥＧ化ア
    ルファインターフェロン（ＩＦＮ−α２）又はその誘導体。
  25. 【請求項２５】ＰＥＧ部分がＩＦＮ−α２のヘリックスＡのすぐ前の領域か
    又はＣ−Ｄループに取り付けられる、請求項２４に記載のＰＥＧ化ＩＦＮ−α２
    。
  26. 【請求項２６】各々が自由システインを有する少なくとも２つのタンパク質
    から成り、前記タンパク質が前記自由システインを介して取り付けられている、
    多重結合タンパク質。
  27. 【請求項２７】成長因子、ＥＰＯ、又はアルファインターフェロンによって
    治療可能な症状の治療方法であって、 成長因子、ＥＰＯ、又はアルファインターフェロンを必要とする患者に有効量
    の成長因子、ＥＰＯ、又はアルファインターフェロンのシステイン変異型もしく
    はそれらの誘導体を投与して、前記症状を治療する工程から成る方法。
  28. 【請求項２８】前記誘導体は、成長因子、ＥＰＯ、又はアルファインターフ
    ェロンのＰＥＧ化システイン変異型である、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】請求項１乃至３のいずれかに従って生産されたタンパク質を
    共有結合により修飾する方法であって、 （ａ）可溶化タンパク質を精製する工程と、 （ｂ）前記タンパク質をジスルフィド還元剤で還元する工程と、 （ｃ）前記タンパク質をシステイン反応性部分に暴露して、システイン修飾タ
    ンパク質を得る工程と、から成る方法。
  30. 【請求項３０】システイン修飾タンパク質を、非修飾タンパク質から分離す
    る工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】システイン反応性部分は、ポリエチレングリコールである、
    請求項２９に記載の方法。
JP2000593732A 1999-01-14 2000-01-14 自由システイン残基を有するタンパク質の生産方法 Pending JP2002534119A (ja)

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