ES2574139T3 - Composiciones de arginasas humanas modificadas por ingeniería y métodos para tratar el cáncer - Google Patents

Abstract

Proteína arginasa I o arginasa II humana para su uso en un método de tratamiento de un paciente humano que tiene cáncer, particularmente un cáncer auxotrófico para arginina, que comprende administrar al paciente una formulación que comprende dicha proteína, teniendo dicha proteína arginasa I o arginasa II humana un sitio de unión a metales y comprendiendo al menos una sustitución de aminoácido en el sitio de unión a metales, en la que la proteína presenta un aumento en la hidrólisis de arginina que da como resultado una kcat/Km al menos dos veces mayor que la de una arginasa I humana nativa que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1 o una arginasa II humana nativa que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 2, en la que dicha proteína arginasa I o arginasa II humana comprende un cofactor metálico no nativo, y en la que dicho cofactor metálico no nativo es cobalto.

Description

DESCRIPCION

Composiciones de arginasas humanas modificadas por ingenierla y metodos para tratar el cancer Referenda cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense con n.° de serie 5 61/110.218, presentada el 31 de octubre de 2008.

Antecedentes de la invencion

1. Campo de la invencion

La invencion se refiere de manera general al tratamiento de cancer con enzimas que empobrecen la L-arginina en suero. En algunas realizaciones, el cancer es uno que no expresa, o es de otro modo deficiente en, 10 argininosuccinato sintetasa (ASS), ornitina transcarbamilasa (OTC), u otras enzimas requeridas para la bioslntesis de arginina.

2. Descripcion de la tecnica relacionada

Desde hace mas de 50 anos se ha reconocido que determinadas celulas tumorales tienen una alta demanda de aminoacidos, tales como L-arginina, y se destruyen en condiciones de empobrecimiento de L-arginina (Wheatley y 15 Campbell, 2002). En celulas humanas, la L-arginina se sintetiza en dos etapas; en primer lugar la argininosuccinato sintetasa (ASS) convierte L-citrulina y aspartato en argininosuccinato, seguido por conversion de argininosuccinato en L-arginina y fumarato mediante argininosuccinato liasa. La propia L-citrulina se sintetiza a partir de L-ornitina y fosfato de carbamollo mediante la enzima ornitina transcarbamilasa (OTC). Un gran numero de carcinomas hepatocelulares, melanomas y, tal como se descubrio recientemente, carcinomas de celulas renales (Ensor et al., 20 2002; Feun et al., 2007; Yoon et al., 2007) no expresan ASS y por tanto son sensibles al empobrecimiento de L-

arginina. La base molecular para la falta de expresion de ASS parece ser diversa e incluye regulacion genica aberrante y defectos de corte y empalme. Mientras que las celulas no malignas entran en quiescencia (Go) cuando se empobrecen en cuanto a L-arginina y por tanto permanecen viables durante varias semanas, las celulas tumorales tienen defectos en el ciclo celular que conducen al reinicio de la slntesis de ADN aunque se inhibe la 25 slntesis de protelnas, dando a su vez como resultado desequilibrios principales y muerte celular rapida (Shen et al., 2006; Scott et al., 2000). La toxicidad selectiva del empobrecimiento de L-arginina para HCC, melanoma y otras celulas cancerosas deficientes en ASS se ha demostrado ampliamente in vitro, en modelos de animal con xenoinjerto y en ensayos cllnicos (Ensor et al., 2002; Feun et al., 2007; Shen et al., 2006; Izzo et al., 2004). Recientemente Cheng et al. (2007) demostraron que muchas HCC celulas tambien son deficientes en la expresion 30 de ornitina transcarbamilasa y, por tanto, tambien son sensibles al empobrecimiento de L-arginina enzimatica.

Ademas, Carvajal et al. (2008, Molecular Biology of the Cell, Vol. 13, suplemento, pag. 546A) dan a conocer consecuencias de mutaciones de ligandos metalicos en arginasa I hepatica humana.

Ademas, Rehner et al. (1970, Medizin und Ernahrung, pags. 32-35) examinan los efectos de manganeso, cobalto y nlquel sobre la actividad de la arginasa hepatica.

35 Existe interes en el uso de enzimas hidrollticas de L-arginina para la terapia contra el cancer, especialmente el tratamiento de hepatocarcinomas, melanomas y carcinomas de celulas renales, que son formas comunes de cancer asociado con alta morbididad. Se han usado dos enzimas degradantes de L-arginina para la terapia contra el cancer: arginina desiminasa bacteriana y arginasas humanas. Desafortunadamente, ambas de las enzimas presentan inconvenientes significativos que presentan impedimentos principales para su uso cllnico (inmunogenicidad y baja 40 actividad catalltica y muy poca estabilidad en suero, respectivamente). Por tanto, el exito terapeutico de la terapia de empobrecimiento de L-arginina se basara en abordar estos inconvenientes.

Sumario de la invencion

La divulgacion se refiere de manera general a protelnas para su uso en el tratamiento de cancer con enzimas que empobrecen la L-arginina en suero. En algunas realizaciones, el cancer es uno que no expresa, o es de otro modo 45 deficiente en, argininosuccinato sintetasa (ASS), ornitina transcarbamilasa (OTC), u otras enzimas requeridas para la bioslntesis de arginina.

En algunos aspectos, la presente descripcion contempla protelnas arginasas en las que el cofactor metalico natural (Mn2+) se sustituye por otro metal. En realizaciones particulares, la protelna arginasa comprende una secuencia de aminoacidos de arginasa I humana o una secuencia de aminoacidos de arginasa II humana y un cofactor metalico 50 no nativo, concretamente cobalto (Co2+). Las protelnas arginasa I y II humanas de la presente invencion tienen dos

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sitios de Mn(II); uno cualquiera o ambos sitios pueden sustituirse para generar una protelna arginasa I o II mutada con un cofactor metalico no nativo. En algunas realizaciones, la protelna presenta una kcat/Km mayor de 400 mM'V1 a pH 7,4. En una realization particular, la protelna presenta una kcat/Km de entre 400 mM'V1 y 4.000 mM'V1 a pH 7,4. En otra realizacion, la protelna presenta una kcat/KM de entre 400 mM'V1 y 2.500 mM'V1 a pH 7,4 a 37°C. En una realizacion particular, la presente invention usa una protelna que comprende una secuencia de aminoacidos de arginasa I o II humana y un cofactor metalico no nativo, en la que dicha protelna muestra una kcat/Km mayor de 400 mM'V1 a 37°C, pH 7,4.

En algunas realizaciones, la arginasa nativa se modifica unicamente mediante la sustitucion del cofactor metalico. En otras realizaciones, la arginasa se modifica mediante la sustitucion del cofactor metalico ademas de otras modificaciones, tales como sustituciones, deleciones y truncamientos. En una realizacion particular, la divulgation usa una protelna que comprende una secuencia de aminoacidos nativa de arginasa I o II humana y un cofactor metalico no nativo, en la que la secuencia de aminoacidos carece de parte de la secuencia nativa, y en la que el cofactor metalico no nativo es cobalto. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de arginasa I humana comprende SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, la secuencia de aminoacidos de arginasa II humana comprende SEQ ID NO: 2. En aun otras realizaciones, la arginasa carece de una parte de la secuencia de tipo natural. En otras realizaciones, la secuencia de aminoacidos comprende una secuencia de arginasa I o arginasa II truncada. En una realizacion particular, la arginasa es arginasa II y carece de los primeros 21 aminoacidos de la secuencia de tipo natural. En otra realizacion, las arginasas nativas carecen de una metionina ^terminal.

En otro aspecto, la presente divulgacion emplea una protelna arginasa que comprende al menos una sustitucion de aminoacido, en la que la protelna presenta una actividad catalltica aumentada en condiciones fisiologicas y especialmente al pH de suero humano (pH 7,4) en comparacion con protelna arginasa I o II humana nativa. En algunas realizaciones, la protelna arginasa es una protelna arginasa I humana o protelna arginasa II humana. La protelna para su uso en la invencion comprende ademas un cofactor metalico no nativo, en la que el cofactor metalico no nativo es Co+2. La sustitucion del cofactor Mn+2 por Co+2 da como resultado un marcado aumento en la actividad catalltica y una drastica reduction en Km a pH fisiologico.

En una realizacion, la presente divulgacion usa una protelna arginasa I humana que comprende al menos una sustitucion de aminoacido en el sitio de union a metales, en la que la protelna presenta un aumento en la hidrolisis de arginina que da como resultado una kcat/Km al menos dos veces mayor que la de una arginasa I humana nativa que tiene sEq ID NO: 1. En otra realizacion, la presente divulgacion usa una protelna arginasa II humana que comprende al menos una sustitucion de aminoacido en el sitio de union a metales, en la que la protelna presenta un aumento en la hidrolisis de arginina que da como resultado una kcat/Km al menos dos veces mayor que la de una arginasa II humana nativa que tiene SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la protelna presenta una kcat/Km mayor de 400 mM'V1 a pH 7,4. En una realizacion particular, la protelna presenta una kcat/Km entre 400 mM'V1 y 4.000 mM'V1 a pH 7,4. En otra realizacion, la protelna presenta una kcat/KM de entre 400 mM'V1 y 2.500 mM'V1 a pH 7,4 a 37°C. En algunos aspectos, la invencion emplea mutaciones que aumentan la estabilidad de arginasas humanas en suero con respecto a la estabilidad de arginasas humanas nativas.

En algunas realizaciones, la sustitucion de aminoacido esta en His101, Asp124, His126, Asp128, Asp232, Asp234, Trp122, Asp181, Ser230, His120, Asp143, His145, Asp147, Asp251, Asp253, Trp141, Asp200, Ser249, Cys303 o Glu256. Se ha encontrado que varias mutaciones aumentan la actividad catalltica y reducen drasticamente la Km para L~arginina en condiciones fisiologicas. En algunas realizaciones, las mutaciones son mutaciones de sustitucion seleccionadas del grupo que consiste en Asp181Ser, Ser230Cys, Ser230Gly, Cys303Phe, Cys303Ile, Glu256Gln, Asp181Glu y Ser230Ala. En algunos aspectos, la presente invencion proporciona realizaciones en las que se introducen dos o mas mutaciones en arginasa humana. En algunas realizaciones, la protelna arginasa humana comprende al menos dos sustituciones de aminoacido. En una realizacion particular, las sustituciones son Asp181Glu y Ser230Ala.

En algunos aspectos, la presente divulgacion emplea arginasas que comprenden cambios adicionales con respecto a la protelna de tipo natural o nativa. En algunas realizaciones, los cambios incluyen sustitucion, deleciones (por ejemplo que carecen de parte de la secuencia nativa), truncamientos, o una combination de los mismos. En algunas realizaciones, la presente invencion tambien contempla arginasas nativas, en las que los unicos cambios en la secuencia de aminoacidos son deleciones. En una realizacion particular, la presente divulgacion contempla una protelna arginasa I humana, en la que la protelna carece de una metionina ^terminal. Tambien se contemplan otras deleciones y deleciones mas grandes para las diversas arginasas mutantes descritas en el presente documento. Por ejemplo, se ha notificado arginasa truncada que carece de los 14 aminoacidos C'terminales, dejando Arg~308 como el ultimo residuo en la secuencia (Mora et al., 2000). En aun otra realizacion, la arginasa carece de los primeros 21 aminoacidos de la secuencia de tipo natural.

En algunos aspectos, la presente divulgacion tambien contempla protelnas de fusion que comprenden una arginasa unida a una secuencia de aminoacidos distinta de arginasa. En una realizacion, la secuencia distinta de arginasa comprende al menos una parte de la region Fc de una inmunoglobulina, por ejemplo, para aumentar la semivida de la arginasa en suero cuando se administra a un paciente. La region Fc o parte de la misma puede ser cualquier

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region Fc adecuada. En una realizacion, la region Fc o parte de la misma es una region Fc de IgG. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos que tiene actividad arginasa se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de aminoacidos nativa o mutada de arginasa I humana y una secuencia de aminoacidos nativa o mutada de arginasa II humana. En una realizacion, se contempla una protelna de fusion dimerica de Fc-arginasa.

La arginasa en la protelna de fusion puede ser nativa, mutada y/o modificada de otro modo, por ejemplo, modificada con cofactor metalico. En algunas realizaciones, la arginasa puede contener deleciones, sustituciones, truncamientos o una combinacion de los mismos. En una realizacion particular, la presente invencion contempla una protelna de fusion que contiene Fc-arginasa, en la que la arginasa es una arginasa I. En una realizacion, la arginasa carece de una parte de la secuencia de tipo natural. En otra realizacion, la arginasa es arginasa I que carece de una metionina N-terminal. En aun otra realizacion, la arginasa es arginasa II, en la que la arginasa II carece de los primeros 21 aminoacidos de la secuencia de arginasa II de tipo natural. En algunas realizaciones, en la arginasa, que comprende ademas un cofactor metalico no nativo, uno cualquiera o ambos sitios pueden sustituirse para generar una protelna de fusion que comprende una secuencia de aminoacidos de arginasa I o II humana y un cofactor metalico no nativo, en la que el cofactor metalico no nativo es cobalto. En algunas realizaciones, la arginasa contiene una sustitucion. En una realizacion, la sustitucion es Glu256Gln. En otra realizacion, la sustitucion es Asp181Ser. En aun otra realizacion, la sustitucion es Ser230Cys. En todavla otra realizacion, la sustitucion es Ser230Gly. En aun otra realizacion, la sustitucion es Cys303Phe. En todavla otra realizacion, la sustitucion es Cys303Ile. En algunas realizaciones, la arginasa I humana comprende al menos dos sustituciones de aminoacido. En una realizacion, las sustituciones son Asp181Glu y Ser230Asp.

En algunos aspectos, la presente divulgacion emplea ademas acido nucleico que codifica para tales arginasas. El acido nucleico puede tener codones optimizados para su expresion en bacterias. Las bacterias pueden ser E. coli. En otros aspectos, la presente invencion emplea ademas vectores que contienen tales acidos nucleicos. El acido nucleico que codifica para la arginasa mutante puede estar operativamente unido a un promotor, incluyendo, pero sin limitarse a, promotores heterologos. En aspectos todavla adicionales, la presente divulgacion emplea ademas celulas huesped que comprenden tales vectores. Las celulas huesped pueden ser celulas huesped transfectadas o transformadas que expresan las arginasas mutantes. Las protelnas pueden expresarse de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, las protelnas pueden expresarse en una celula huesped de tal manera que la protelna esta glicosilada. Por ejemplo, las protelnas pueden expresarse en una celula huesped de tal manera que la protelna esta aglicosilada.

La presente invencion proporciona las protelnas arginasas descritas en el presente documento para su uso en metodos de tratamiento de sujetos que comprenden administrar dichas protelnas tal como se definen en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el cancer es uno que no expresa, o es de otro modo deficiente en, argininosuccinato sintetasa (ASS) u ornitina transcarbamilasa (OTC). En realizaciones particulares, el cancer humano es un cancer auxotrofico para arginina. Tal como se comento anteriormente, la protelna arginasa puede ser nativa, mutada, y/o modificada de otro modo. En una realizacion, la presente invencion contempla un uso en un metodo de tratamiento de un paciente humano con cancer que comprende administrar una formulacion que comprende una protelna de fusion, comprendiendo la protelna de fusion una secuencia de aminoacidos que tiene actividad arginasa y al menos una parte de la region Fc de una inmunoglobulina humana al paciente. En algunas realizaciones, la administracion se produce en condiciones tales que se destruye al menos una parte de las celulas cancerosas del cancer. En otra realizacion, la formulacion comprende una secuencia de aminoacidos que tiene actividad arginasa humana superior a la presentada por las arginasas humanas autenticas en condiciones fisiologicas y que comprende ademas una cadena de polietilenglicol unida. En alguna realizacion, la formulacion es una formulacion farmaceutica que comprende cualquiera de las protelnas arginasas comentadas anteriormente y unos excipientes farmaceuticamente aceptables. Tales excipientes farmaceuticamente aceptables los conocen bien los expertos en la tecnica. Se contempla que todas las variantes de arginasa anteriores son utiles para terapia en seres humanos.

El cancer puede ser cualquier tipo de cancer o tipo de tumor. En algunas realizaciones, el cancer es carcinoma hepatocelular, carcinoma de celulas renales, melanoma, cancer prostata o cancer pancreatico. En algunas realizaciones, la formulacion se administra por via topica, intravenosa, intradermica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostatica, intrapleural, intratraqueal, intraocular, intranasal, intravltrea, intravaginal, intrarrectal, intramuscular, subcutanea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericardiaca, intraumbilical, oral, mediante inhalacion, mediante inyeccion, mediante infusion, mediante infusion continua, mediante perfusion localizada banando directamente las celulas diana, a traves de un cateter o a traves de un lavado. En una realizacion, para aumentar la semivida en suero, las variantes de arginasa descritas en el presente documento estan “pegiladas”.

En una realizacion preferida se contempla que todas las arginasas, variantes y similares mencionadas anteriormente son protelnas purificadas o aisladas, y preferiblemente protelnas monomericas.

El uso del termino “o” en las reivindicaciones se usa para querer decir “y/o” a menos que se indique expllcitamente que se refiere unicamente a alternativas o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgacion

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respalda una definicion que se refiere unicamente a alternativas y a “y/o”.

A lo largo de esta solicitud, el termino “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la desviacion estandar de error para el dispositivo o metodo que este empleandose para determinar el valor.

Segun la ley de patentes de larga tradicion, las palabras “un” y “uno”, cuando se usan junto con la palabra “que comprende” en las reivindicaciones o la memoria descriptiva, indican uno o mas, a menos que se indique especlficamente.

El termino “terapeuticamente eficaz” tal como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad de celulas y/o composition terapeutica (tal como un polinucleotido terapeutico y/o polipeptido terapeutico) que se emplea en la presente invention para lograr un efecto terapeutico, tal como en la que al menos se mejora al menos un slntoma de un estado que esta tratandose, y/o al analisis de los procedimientos o materiales usados junto con estas celulas.

Otros objetos, caracterlsticas y ventajas de la presente invencion resultaran evidentes a partir de la siguiente description detallada. Sin embargo, debe entenderse que la description detallada y los ejemplos especlficos, aunque indican realizaciones especlficas de la invencion, se facilitan unicamente a modo de ilustracion.

Breve descripcion de las figuras

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invencion. La invencion puede entenderse mejor mediante referencia a uno o mas de esos dibujos en combination con la descripcion detallada de realizaciones especlficas presentadas en el presente documento.

La figura 1 muestra secuencias de acido nucleico de arginasa I (SEQ ID NO: 1) y arginasa II (SEQ ID NO: 2).

La figura 2 es una fotografla de una SDS-PAGE que muestra etapas de purification para arginasa I humana. L = Marcador de peso molecular; WC = fraction de celulas completas, SN = sobrenadante; FT = flujo a traves de una columna de iMaC; W = lavado de columna; E = fraccion de elucion de arginasa.

La figura 3 es un grafico representativo de la cinetica en estado estacionario de la hidrolisis de L-arginina mediante Co-hArgI (•) y Mn-hArgI (o) en un tampon Hepes 100 mM, pH 7,4, 37°C. Co-hArgI tenia una kcat de 240 ± 14 s-1, una Km de 190 ± 40 mM, y kcat/KM de 1.270 ± 330 mM"1s"1. Mn-ArgI tenia una kcat de 300 ± 12 s-1, una Km de 2.330 ± 260 mM, y kcat/KM de 129 ± 20 mM'V1.

La figura 4 es una representation grafica de kcat/KM frente a pH para Co-hArgI (•) con una pka de section ascendente de 7,5 y Mn-hArgI (■) con un pka de seccion ascendente de 8,5.

La figura 5 es un grafico que muestra la estabilidad de Co-hArgI y Mn-hArgI (1 mM) incubados en suero humano combinado a 37°C a lo largo del tiempo en suero humano combinado. Se extrajeron alicuotas a lo largo del tiempo y se sometieron a ensayo frente a 1 mM de L-Arg en un tampon Hepes 100 mM, pH 7,4, a 37°C. Mn-hArgI (o) presento una perdida exponencial de actividad con una vida de T1^ de 4,8 ± 0,8 h. En cambio, Co-hArgI (•) presento una perdida bifasica de actividad con una primera T1^ aparente de 6,1 ± 0,6 h seguida por una segunda T1^ mucho mas larga de 37 ± 3 h.

La figura 6 es un grafico que muestra perfiles de HPLC de los 20 aminoacidos convencionales incubados o bien con Co-hArgI (panel superior) o bien con tampon de dialisis (panel inferior). Co-hArgI incubada con los 20 aminoacidos convencionales dio como resultado la perdida de un unico pico a TA = 12,3 min, que coincide con el de controles de L-arginina, y la aparicion de un nuevo pico individual a TA = 18,8 min, que coincide con el de controles de L-ornitina.

Las figuras 7A-B son graficos que muestran la supervivencia de HCC en cultivo tisular cuando se trata con diversas variantes de arginasa (junto con controles). La figura 7A demuestra la supervivencia de cultivo tisular de HCC (Hep3b) cuando se trato con arginasa 0-100 nM (dia 5). Mn-hArgI (▲) dio como resultado una CI50 aparente de 5 ± 0,3 nM (~ 0,18 mg/ml). Las incubaciones con Co-hArgI (•) condujeron a un aumento de 15 veces en la citotoxicidad con una CI50 aparente de 0,33 ± 0,02 nM (~ 0,012 mg/ml). La figura 7B es un grafico que muestra el efecto de hArgI sobre el crecimiento de celulas de melanoma A375 (dia 5). Mn-hArgI (▲) dio como resultado una CI50 aparente de 4,1 ± 0,1 nM (~ 0,15 mg/ml). La incubation con Co-hArgI (•) condujo a un aumento de 13 veces en la citotoxicidad con una CI50 aparente de 0,32 ± 0,06 nM (~ 0,012 mg/ml).

La figura 8 es una fotografla de un gel de electroforesis no desnaturalizante que muestra que la variante hArgl- E256Q es monomerica a diferencia de la h-Argl de tipo natural trimerica.

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La figura 9 es un grafico representative de la cinetica en estado estacionario de la hidrolisis de L-arginina mediante Co-hArg-II (•) y Mn-hArg-II (o). Hidrolisis de L-Arg con hArg-II (•) sustituida con cobalto a pH 7,4 y 37°C, con una kcat de 182 ± 7 s-1, una Km de 126 ± 18 pM, y una kcat/ Km de 1.440 ± 260 mM'V1. Hidrolisis de L-Arg con hArg-II (o) sustituida con manganeso a pH 7,4 y 37°C, con una kcat de 48 ± 2 s-1, una Km de 2.900 ± 300 pM, y kcat/KM de 17 ± 2 mM-1s-1.

La figura 10 es un grafico que muestra el empobrecimiento de L-arginina en suero en el modelo de raton. Las concentraciones de L-Arg en suero de ratones Balb/c tratados con una unica dosis i.p. de Co-hArgI se mantienen <34 pM durante mas de 3 dlas.

La figura 11 es un grafico que muestra la reduccion de xenoinjerto de tumor de HCC cuando se trata con Co-hArgI en comparacion con controles. Se trataron ratones desnudos que portaban xenoinjertos de tumor de Hep3b dos veces mediante inyeccion i.p. o bien con PBS (o) o bien con Co-hArgI (•) en el dla 9 y en el dla 12. Se observo contraccion del tumor en los ratones tratados con Co-hArgI mientras que los tumores tratados con PBS crecieron sin control.

Figura 12, SDS-PAGE al 14-20% que muestra hArgI conjugada a PEG PM 5000, con un PM aparente de ~ 150 kDa. Description de las realizaciones ilustrativas

La presente invention se refiere a protelnas para su uso en metodos de tratamiento de pacientes que tienen cancer tal como se define en las reivindicaciones y por ejemplo usa enzimas que empobrecen la L-arginina en suero. En algunas realizaciones, el cancer es uno que no expresa, o es de otro modo deficiente en, argininosuccinato sintetasa (ASS), ornitina transcarbamilasa (OTC), u otras enzimas requeridas para la bioslntesis de arginina. Se contemplan enzimas tanto nativas como mutadas, as! como enzimas con cofactores metalicos modificados, enzimas fusionadas a otros polipeptidos as! como enzimas conjugadas a pollmeros que aumentan la persistencia en suero, por ejemplo, polietilenglicol de alto peso molecular.

I. Arginasa

La arginasa es una enzima que contiene manganeso. Es la enzima final del ciclo de la urea. La arginasa es la quinta y ultima etapa en el ciclo de la urea, una serie de reacciones bioflsicas en mamlferos durante la cual el organismo elimina amoniaco danino. Especlficamente, la arginasa convierte L-arginina en L-ornitina y urea.

La L-arginina es el sustrato donador de nitrogeno para la oxido nltrico sintasa (NOS), produciendo L-citrulina y NO. Aunque se ha notificado que la Km de arginasa (2-5 mM) es mucho mayor que la de NOS para L-arginina (2-20 pM), la arginasa tambien puede desempenar un papel en la regulation de la actividad de NOS. En determinadas condiciones la arginasa I se Cys-S-nitrosila, dando como resultado una mayor afinidad por L-arginina y una disponibilidad reducida de sustrato para NOS.

La arginasa es una enzima homo-trimerica con un plegamiento a/p de una lamina p de ocho cadenas paralelas rodeada por varias helices. La enzima contiene un agrupamiento de metales di-nuclear que es esencial para generar un hidroxido para el ataque nucleofilo en el carbono de guanidinio de L-arginina. El metal nativo para arginasa es Mn2+. Estos iones Mn2+ se coordinan con agua, orientando y estabilizando la molecula y permitiendo que el agua actue como nucleofilo y ataque a la L-arginina, hidrolizandola para dar ornitina y urea.

Los mamlferos tienen dos isozimas de arginasa (EC 3.5.3.1) que catalizan la hidrolisis de L-arginina para dar urea y L-ornitina. El gen de arginasa I esta ubicado en el cromosoma 6 (6q.23), se expresa altamente en el citosol de los hepatocitos y funciona en la elimination de nitrogeno como etapa final del ciclo de la urea. El gen de arginasa II se encuentra en el cromosoma 14 (14q.24.1). La arginasa II esta ubicada en la mitocondria en tejidos tales como rinon, cerebro y musculo esqueletico en los que se piensa que proporciona un suministro de L-ornitina para la bioslntesis de prolina y poliamina (Lopez et al., 2005).

Se han investigado las arginasas durante casi 50 anos como metodo para degradar la L-arginina extracelular (Dillon et al., 2002). Se han logrado algunos resultados cllnicos prometedores introduciendo arginasa mediante embolization arterial transhepatica; tras lo cual varios pacientes experimentaron una remision parcial de HCC (Cheng et al., 2005). Sin embargo, dado que la arginasa tiene una alta Km (~2-5 mM) y muestra muy baja actividad a valores de pH fisiologicos, se requiere una alta dosificacion para fines quimioterapico (Dillon et al., 2002). Aunque la arginasa nativa se aclara de la circulation en el plazo de minutos (Savoca et al., 1984), una unica inyeccion de PEG- arginasa PM 5000 en ratas fue suficiente para lograr un empobrecimiento de arginina casi completo durante ~3 dlas (Cheng et al., 2007).

Cheng et al. hicieron la sorprendente observation de que muchas llneas celulares de HCC humanas no expresan

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OTC (ademas de ASS) y por tanto son sensibles a PEG-arginasa (Cheng et al., 2007). En ratones en los que se implantaron celulas de hepatocarcinoma Hep3b, la administracion semanal de PEG-arginasa dio como resultado la ralentizacion del crecimiento tumoral que se acentuo mediante coadministracion de 5-fluorouracilo (5-FU). Sin embargo, se uso PEG-arginasa a dosis muy altas que no resultan practicas para la terapia en seres humanos, reflejando su actividad fisiologica inferior.

Para abordar estas cuestiones se ha sometido a prueba in vitro una enzima hidrolizante de arginina bacteriana, arginina desiminasa o ADI, que presenta buena cinetica y estabilidad. Una forma pegilada de ADI esta actualmente sometiendose a ensayos cllnicos en fase II/III. Desafortunadamente, ADI es una enzima bacteriana y por tanto induce fuertes respuestas inmunitarias y efectos adversos en la mayorla de los pacientes. Sin embargo, para aquellos pacientes que no desarrollan respuestas adversas significativas, un porcentaje impresionante muestra enfermedad estable o remision. No obstante, debido a su perfil inmunologico desfavorable, es poco probable que el empobrecimiento de L-arginina mediante ADI se convierta en un tratamiento convencional para el cancer de hlgado.

Para el uso cllnico, resulta esencial que la arginasa se modifique por ingenierla para permitir que persista durante periodos mas largos (por ejemplo, dlas) en la circulacion. En ausencia de cualquier modification, la arginasa humana tiene una semivida de tan solo unos pocos minutos en la circulacion principalmente debido a que su tamano no es lo suficientemente grande como para evitar la filtration a traves de los rinones. La arginasa humana no modificada es muy propensa a desactivacion en suero y se degrada con una semivida de tan solo cuatro horas. Por tanto, los presentes inventores desarrollaron formas novedosas y mejoradas de arginasa para investigation cllnica y posible uso terapeutico con persistencia en circulacion mejorada.

II. Variantes de arginasa

Los mamlferos tienen dos isozimas de arginasa (EC 3.5.3.1) que catalizan la hidrolisis de L-arginina para dar urea y L-ornitina. El gen de arginasa I esta ubicado en el cromosoma 6 (6q.23), se expresa altamente en el citosol de hepatocitos, y funciona en la elimination de nitrogeno como etapa final del ciclo de la urea. El gen de arginasa II se encuentra en el cromosoma 14 (14q.24.1). La arginasa II esta ubicada en la mitocondria en tejidos tales como rinon, cerebro y musculo esqueletico en los que se piensa que proporciona un suministro de L-ornitina para la bioslntesis de prolina y poliamina (Lopez et al., 2005).

La L-arginina es el unico sustrato para la oxido nltrico sintasa (NOS), produciendo L-citrulina y NO. Aunque se ha notificado que la KM de arginasa (2-5 mM) es mucho mayor que la de NOS para L-arginina (2-20 pM), la arginasa tambien puede desempenar un papel en la regulation de la actividad de NOS (Durante et al., 2007). En determinadas condiciones la arginasa I se Cys-S-nitrosila, dando como resultado una mayor afinidad por L-arginina y una disponibilidad reducida de sustrato para NOS (Santhanam et al., 2007). La arginasa es una enzima homo- trimerica con un plegamiento a/p de una lamina p de ocho cadenas paralela rodeada por varias helices. La enzima contiene un agrupamiento de metales di-nuclear que es esencial para generar un hidroxido para el ataque nucleofilo en el carbono de guanidinio de L-arginina (Cama et al., 2003; Dowling et al., 2008). El metal nativo para arginasa es Mn2+. La arginasa con el metal nativo (es decir Mn2+) muestra un pH optimo de 9. A pH fisiologico la enzima muestra una kcat/Km mas de 10 veces inferior en la hidrolisis de L-arginina (figura 4). La baja actividad catalltica presentada por la arginasa humana autentica con la enzima con Mn2+ nativa presenta un problema para la terapia en seres humanos ya que significa que tienen que usarse dosis no practicas de la enzima para lograr una reduction terapeuticamente relevante en los niveles en plasma de L-arginina.

En algunos aspectos, la presente invention contempla arginasas mutantes en las que el cofactor metalico natural (Mn2+) se sustituye por otro metal. Se ha encontrado que la sustitucion del cofactor metalico en arginasa humana ejerce un efecto beneficioso sobre la tasa de hidrolisis de L-arginina y la estabilidad en condiciones fisiologicas en comparacion con arginasa humana nativa con el cofactor metalico natural. La sustitucion del metal nativo (Mn2+) por otros cationes divalentes puede aprovecharse para desplazar el pH optimo de la enzima a valores inferiores y por tanto lograr altas tasas de hidrolisis de L-arginina en condiciones fisiologicas. Las protelnas arginasa I y II humanas para su uso en la presente invencion tienen dos sitios de Mn(II); por tanto, uno cualquiera o ambos sitios pueden sustituirse para generar una protelna arginasa I o II mutada con un cofactor metalico no nativo.

En la presente invencion, dicho cofactor metalico no nativo es cobalto (Co2+). La incorporation de Co2+ en lugar de Mn2+ en arginasa I humana o arginasa II humana da como resultado una actividad drasticamente superior a pH fisiologico. Se encontro que una enzima que contenla Co2+ (“Co-hArgI”) presentaba un aumento de 10 veces en la kcat/KM in vitro a pH 7,4, lo que a su vez se tradujo en un aumento de 15 veces en la citotoxicidad de HCC y un aumento de 13 veces en la citotoxicidad de melanoma en comparacion con la arginasa I humana que contiene Mn2+. Tambien se encontro que una preparation farmacologica de Co-hArgI podia aclarar L-Arg en suero durante mas de 3 dlas en ratones con una unica inyeccion. Ademas, se encontro que una preparacion farmacologica de Co-hArgI podia contraer xenoinjertos de tumor de HCC en ratones desnudos mientras que Mn-hArgI solo ralentizo el crecimiento tumoral (Ensor, Holsberg et al., 2002).

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En algunas realizaciones, la presente invencion emplea una protelna arginasa humana que comprende al menos una sustitucion de aminoacido en el sitio de union a metales. La estructura de arginasa muestra una hendidura de sitio activo que contiene dos iones Mn2+, denominandose el ion ubicado mas profundamente MnA coordinado con H101, D124, D128, D232 e hidroxido de puente. El otro metal se denomina Mne y se coordina mediante H126, D124, D232, D234 e hidroxido de puente (Christianson y Cox, 1999). Los residuos que comprenden el sitio de union a metales para la primera cubierta de arginasa I son H101, D124, H126, D128, D232 y D234 y para la segunda cubierta son W122, D181 y S230. De manera similar, los residuos que comprenden el sitio de union a metales para la primera cubierta de arginasa II son H120, D143, H145, D147, D251 D253 y para la segunda cubierta son W141, D200, S249.

Se ha mostrado que la arginasa requiere ambos iones Mn2+ para su actividad completa, sin embargo MnA puede disociarse de manera reversible dando como resultado una enzima con la mitad de su actividad catalltica (Scolnick et al., 1997). El metal (A) de hArgI se coordina con el imidazol de H101, que a su vez se une mediante hidrogeno al hidroxilo de S230. El metal (B) de hArgI se coordina con el imidazol de H126, que tiene un enlace de hidrogeno de la 2a cubierta con el carboxilo de D181. Las posiciones implicadas en la union del metal se sometieron a mutagenesis por saturacion y se examinaron las bibliotecas resultantes usando un ensayo con placa de pocillos de microtitulacion para determinar la actividad arginasa (descrito en mas detalle a continuation en los ejemplos) para aislar clones que expresaban protelnas que presentaban una mayor actividad catalltica. Se identificaron clones novedosos mediante secuenciacion, volvieron a transformarse en E. coli (BL21) y se purificaron y se caracterizaron cineticamente tal como se describe a continuacion en los ejemplos. Se purificaron variantes que presentaban actividad aparente > a la de tipo natural en mayor escala y se sometieron a ensayo para determinar sus parametros cineticos en estado estacionario de kcat y Km. Se encontro que las siguientes variantes tenlan constantes IWKm mayores que Co-hArgI: D181S, D181E/S230A (mutante doble que contiene dos sustituciones). De manera similar se encontro que las sustituciones de aminoacido S230C y S230G tenlan un efecto particularmente importante sobre la actividad catalltica y tambien sobre la estabilidad en suero. Adicionalmente, tambien se sometieron aminoacidos retirados del sitio de union a metales a mutagenesis por saturacion combinatoria. Por ejemplo, se encontro que una sustitucion C303P en Co-hArg I conferla una kcat/KM 10 veces superior con respecto a la Mn-hArg I nativa a pH 7,4. Muchas de estas formas variantes o mutantes de la arginasa se contemplan para su uso en el tratamiento de cancer, incluyendo en las que se preparan como protelnas de fusion, por ejemplo con una region Fc (o parte de la misma) de una inmunoglobulina (con el fin de aumentar la semivida).

Tambien se sometieron a prueba las variantes Cys303 para determinar la estabilidad en suero. Se encontro que una variante C303P, es decir una sustitucion de aminoacido individual en arginasa, muestra un aumento del ~60% en la estabilidad en suero lo que a su vez se traduce en un aumento de 30 veces en la citotoxicidad de HCC en comparacion con la enzima sustituida con Mn a pH 7,4. En una realization, la presente invencion contempla el tratamiento con esta enzima novedosa o esta enzima novedosa con mutaciones adicionales. En una realizacion particular, esta enzima novedosa se emplea para el tratamiento como protelna de fusion de arginasa-Fc que aprovecha la recirculation endosomica del dominio Fc de IgG para garantizar una larga persistencia en suero de la variante de arginasa. La larga persistencia en suero mejora el uso de arginasa como producto terapeutico.

III. Pegilacion

En determinados aspectos de la invencion, se dan a conocer metodos y composiciones relacionados con arginasa pegilada. Especlficamente, puede usarse la pegilacion de arginasa en un residuo de cistelna modificado por ingenierla (por ejemplo, que sustituye al tercer residuo del extremo N-terminal) para producir una composition de arginasa pegilada homogenea. Tambien se dan a conocer metodos para el aislamiento de arginasa pegilada basandose en la alteracion temporal de la polimerizacion.

La pegilacion es el procedimiento de union covalente de cadenas polimericas de polietilenglicol a otra molecula, normalmente un farmaco o protelna terapeutica. La pegilacion se logra de manera rutinaria mediante incubation de un derivado reactivo de PEG con la macromolecula diana. La union covalente de PEG a un farmaco o protelna terapeutica puede “enmascarar” al agente frente al sistema inmunitario del huesped (inmunogenicidad y antigenicidad reducidas), aumentar el tamano hidrodinamico (tamano en disolucion) del agente lo que prolonga su tiempo en circulation reduciendo el aclaramiento renal. La pegilacion tambien puede proporcionar solubilidad en agua a farmacos y protelnas hidrofobos.

La primera etapa en la pegilacion es la funcionalizacion adecuada del pollmero PEG en uno o ambos extremos terminales. Los PEG que se activan en cada extremo terminal con el mismo resto reactivo se conocen como “homobifuncionales”, mientras que si los grupos funcionales presentes son diferentes, entonces el derivado de PEG se denomina “heterobifuncional” o “heterofuncional”. Los derivados qulmicamente activos o activados del pollmero de PEG se preparan para unir el PEG a la molecula deseada.

La election del grupo funcional adecuado para el derivado de PEG se basa en el tipo de grupo reactivo disponible en la molecula que se acoplara al PEG. Para protelnas, los aminoacidos reactivos tlpicos incluyen lisina, cistelna, histidina, arginina, acido aspartico, acido glutamico, serina, treonina, tirosina. Tambien pueden usarse el grupo

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amino N-terminal y el acido carboxllico C-terminal.

Las tecnicas usadas para formar derivados de PEG de primera generacion son generalmente hacer reaccionar el pollmero de PEG con un grupo que es reactivo con grupos hidroxilo, normalmente anhldridos, cloruros de acido, cloroformiatos y carbonatos. En la qulmica de pegilacion de segunda generacion se ponen grupos funcional mas eficaces, tales como aldehldo, esteres, amidas, etc. a disposicion para la conjugation.

A medida que las aplicaciones de pegilacion se vuelven cada vez mas avanzadas y sofisticadas, ha habido un aumento en la necesidad de PEG heterobifuncionales para la conjugacion. Estos PEG heterobifuncionales son muy utiles en la union de dos entidades, en las que se necesita un separador hidrofilo, flexible y biocompatible. Grupos terminales preferidos para PEG heterobifuncionales son maleimida, vinilsulfonas, disulfuro de piridilo, amina, acidos carboxllicos y esteres de NHS.

Los agentes de modification, o grupos de union, mas comunes se basan en moleculas de metoxi-PEG (mPEG). Su actividad depende de anadir un grupo modificador de protelna al extremo de alcohol. En algunos casos se usa polietilenglicol (PEG-diol) como molecula precursora. Posteriormente se modifica el diol en ambos extremos con el fin de preparar una molecula unida a PEG hetero u homodimerica (tal como se muestra en el ejemplo con PEG-bis- vinilsulfona).

Las protelnas se pegilan generalmente en sitios nucleofilos tales como tioles no protonados (residuos de cisteinilo) o grupos amino. Los ejemplos de reactivos de modificacion especlficos de cisteinilo incluyen PEG-maleimida, PEG- yodoacetato, PEG-tioles y PEG-vinilsulfona. Los cuatro son muy especlficos de cisteinilo en condiciones leves y a pH de neutro a ligeramente alcalino, pero cada uno tiene inconvenientes. La amida formada con las maleimidas puede ser algo inestable en condiciones alcalinas de modo que puede haber cierta limitation en cuanto a las opciones de formulation con este grupo de union. El enlace amida formado con yodo-PEG es mas estable, pero el yodo libre puede modificar residuos de tirosina en algunas condiciones. Los PEG-tioles forman enlaces de disulfuro con tioles de protelnas, pero esta union tambien puede ser inestable en condiciones alcalinas. La reactividad de PEG-vinilsulfona es relativamente baja en comparacion con maleimida y yodo-PEG; sin embargo, el enlace tioeter formado es bastante estable. Su velocidad de reaction mas lenta tambien puede hacer que la reaction de PEG- vinilsulfona sea mas facil de controlar.

La pegilacion especlfica del sitio en residuos de cisteinilo nativos se lleva a cabo con poca frecuencia, ya que estos residuos estan habitualmente en forma de enlaces disulfuro o se requieren para la actividad biologica. Por otro lado, puede usarse mutagenesis dirigida al sitio para incorporar sitios de pegilacion cisteinilo para grupos de union especlficos de tiol. La mutation de cistelna debe disenarse de tal manera que sea accesible al reactivo de pegilacion y todavla sea biologicamente activa tras la pegilacion.

Los agentes de modificacion especlficos de amina incluyen PEG-ester de NHS, PEG-tresilato, PEG-aldehldo, PEG- isotiocianato, y varios otros. Todos reaccionan en condiciones suaves y son muy especlficos para grupos amino. El PEG-ester de NHS es probablemente uno de los agentes mas reactivos; sin embargo, su alta reactividad puede hacer que la reaccion de pegilacion sea diflcil de controlar a gran escala. PEG-aldehldo forma una imina con el grupo amino, que despues se reduce para dar una amina secundaria con cianoborohidruro de sodio. Al contrario que el borohidruro de sodio, el cianoborohidruro de sodio no reducira los enlaces disulfuro. Sin embargo, este producto qulmico es altamente toxico y debe manipularse con precaution, particularmente a pH inferior en el que se vuelve volatil.

Debido a los multiples residuos de lisina en la mayorla de las protelnas, la pegilacion especlfica del sitio puede ser un desaflo. Afortunadamente, dado que estos reactivos reaccionan con grupos amino no protonados, es posible dirigir la pegilacion a grupos amino de pK inferior realizando la reaccion a un pH inferior. Generalmente el pK del grupo alfa-amino es 1-2 unidades de pH inferior al del grupo epsilon-amino de residuos de lisina. Pegilando la molecula a pH 7 o inferior, puede alcanzarse con frecuencia una alta selectividad por el extremo N-terminal. Sin embargo, esto solo es viable si no se requiere la parte N-terminal de la protelna para su actividad biologica. Sin embargo, con frecuencia los beneficios farmaceuticos de la pegilacion compensan una perdida significativa de bioactividad in vitro, dando como resultado un producto con una bioactividad in vivo mucho mayor independientemente de la qulmica de pegilacion.

Hay varios parametros a tener en cuenta cuando se desarrolla un procedimiento de pegilacion. Afortunadamente, habitualmente no hay mas de cuatro o cinco parametros clave. El enfoque de “diseno de experimentos” para la optimization de las condiciones de pegilacion puede ser muy util. Para reacciones de pegilacion especlficas de tiol, los parametros a tener en cuenta incluyen: concentration de protelna, razon de PEG con respecto a protelna (en una base molar), temperatura, pH, tiempo de reaccion, y en algunos casos, la exclusion de oxlgeno. (El oxlgeno puede contribuir a la formation de disulfuro intermolecular por la protelna, lo que reducira el rendimiento del producto pegilado). Deben tenerse en cuenta los mismos factores (con la exception del oxlgeno) para la modificacion especlfica de amina excepto porque el pH puede ser incluso mas crltico, particularmente cuando se selecciona como diana el amino grupo N-terminal.

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Para modificaciones especlficas tanto de amina como de tiol, las condiciones de reaccion pueden afectar a la estabilidad de la protelna. Esto puede limitar la temperatura, concentracion de protelna y pH. Ademas, la reactividad del grupo de union de PEG debe conocerse antes de comenzar la reaccion de pegilacion. Por ejemplo, si el agente de pegilacion solo es activo al 70 por ciento, la cantidad de PEG usada debe garantizar que solo se cuentan las moleculas de PEG activo en la estequiometrla de reaccion de protelna con respecto a PEG. Posteriormente se describira como determinar la reactividad y cualidad de PEG.

IV. Protelnas y peptidos

En determinadas realizaciones, la presente invencion emplea composiciones novedosas que comprenden al menos una protelna o peptido, tal como multlmeros de arginasa estabilizados. Estos peptidos pueden estar comprendidos en una protelna de fusion o conjugados a un agente tal como se describio anteriormente.

A. Protelnas y peptidos

Tal como se usa en el presente documento, una protelna o peptido se refiere de manera general, pero no se limita a, una protelna de mas de aproximadamente 200 aminoacidos, hasta una secuencia de longitud completa traducida a partir de un gen; un polipeptido de mas de aproximadamente 100 aminoacidos; y/o un peptido de desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 100 aminoacidos. Por conveniencia, los terminos “protelna”, “polipeptido” y “peptido” se usan de manera intercambiable en el presente documento.

En determinadas realizaciones el tamano de al menos una protelna o peptido puede comprender, pero no se limita

a, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,

34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64,

65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95,

96, 97, 98, 99, 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230,

aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 275, aproximadamente 300, aproximadamente 325, aproximadamente 350, aproximadamente 375, aproximadamente 400, aproximadamente 425,

aproximadamente 450, aproximadamente 475, aproximadamente 500, aproximadamente 525, aproximadamente 550, aproximadamente 575, aproximadamente 600, aproximadamente 625, aproximadamente 650,

aproximadamente 675, aproximadamente 700, aproximadamente 725, aproximadamente 750, aproximadamente 775, aproximadamente 800, aproximadamente 825, aproximadamente 850, aproximadamente 875,

aproximadamente 900, aproximadamente 925, aproximadamente 950, aproximadamente 975, aproximadamente 1000, aproximadamente 1100, aproximadamente 1200, aproximadamente 1300, aproximadamente 1400,

aproximadamente 1500, aproximadamente 1750, aproximadamente 2000, aproximadamente 2250, aproximadamente 2500 o mas residuos de aminoacido.

Tal como se usa en el presente documento, un “residuo de aminoacido” se refiere a cualquier aminoacido que se produce de manera natural, cualquier derivado de aminoacido o cualquier agente mimetico de aminoacido conocido en la tecnica. En determinadas realizaciones, los residuos de la protelna o peptido son secuenciales, sin ningun grupo distinto de aminoacido que interrumpe la secuencia de residuos de aminoacido. En otras realizaciones, la secuencia puede comprender uno o mas restos distintos de aminoacido. En realizaciones particulares, la secuencia de residuos de la protelna o peptido puede estar interrumpida por uno o mas restos distintos de aminoacido.

Por consiguiente, el termino “protelna o peptido” abarca secuencias de aminoacidos que comprenden al menos uno de los 20 aminoacidos comunes encontrados en protelnas que se producen de manera natural, o al menos un aminoacido modificado o no habitual, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellos mostrados en la tabla 1 a continuacion.

Tabla 1

Aminoacidos modificados y no habituales

Abr.

Aminoacido Abr. Aminoacido

Aad

Acido 2-aminoadlpico EtAsn N-Etilasparagina

Baad

Acido 3-aminoadlpico Hyl Hidroxilisina

Bala

b-alanina, acido b-amino-propionico AHyl alo-Hidroxilisina

Abu

Acido 2-aminobutlrico 3Hyp 3-Hidroxiprolina

4Abu

Acido 4-aminobutlrico, acido piperidlnico 4Hyp 4-Hidroxiprolina

Acp

Acido 6-aminocaproico Ide Isodesmosina

Ahe

Acido 2-aminoheptanoico Alle alo-lsoleucina

Aib

Acido 2-aminoisobutlrico MeGly N-Metilglicina, sarcosina

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Abr.

Aminoacido Abr. Aminoacido

Baib

Acido 3-aminoisobutlrico Melle N-Metilisoleucina

Apm

Acido 2-aminopimelico MeLys 6-N-Metillisina

Dbu

Acido 2,4-diaminobutlrico MeVal N-Metilvalina

Des

Desmosina Nva Norvalina

Dpm

Acido 2,2'-diaminopimelico Nle Norleucina

Dpr

Acido 2,3-diaminopropionico Orn Ornitina

EtGly

N-Etilglicina

Pueden prepararse protelnas o peptidos mediante cualquier tecnica conocida por los expertos en la tecnica, incluyendo la expresion de protelnas, polipeptidos o peptidos mediante tecnicas de biologla molecular convencionales, el aislamiento de protelnas o peptidos a partir de fuentes naturales, o la slntesis qulmica de protelnas o peptidos. Anteriormente se han dado a conocer las secuencias de nucleotidos y de protelnas, polipeptidos y peptidos correspondientes a diversos genes, y pueden encontrarse en bases de datos informatizadas conocidas por los expertos habituales en la tecnica. Una de tales bases de datos son las bases de datos Genbank y GenPet de National Center for Biotechnology Information (disponibles en la world wide web en ncbi.nlm.nih.gov/). Las regiones codificantes para genes conocidos pueden amplificarse y/o expresarse usando las tecnicas dadas a conocer en el presente documento o tal como conoceran los expertos habituales en la tecnica. Alternativamente, los expertos en la tecnica conocen diversas preparaciones comerciales de protelnas, polipeptidos y peptidos.

B. Acidos nucleicos y vectores

En determinados aspectos de la invencion, pueden emplearse secuencias de acido nucleico que codifican para una protelna de fusion como arginasa multimerica estabilizada. Dependiendo de que sistema de expresion vaya a usarse, pueden seleccionarse secuencias de acido nucleico basandose en metodos convencionales. Por ejemplo, arginasa I y II humanas contienen multiples codones que se usan con poca frecuencia en E. coli que pueden interferir con la expresion, por tanto los respectivos genes o variantes de los mismos pueden tener codones optimizados para la expresion en E. coli. Tambien pueden usarse diversos vectores para expresar la protelna de interes, tal como una arginasa multimerica de fusion o una arginasa con sustitucion de cistelna. Los vectores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, vectores de plasmidos, vectores virales, vectores basados en transposones o liposomas.

C. Celulas huesped

Las celulas huesped, preferiblemente celulas eucariotas, utiles en la presente invencion son cualquiera que puede transformarse para permitir la expresion y secrecion de arginasa y multlmeros de fusion de la misma. Las celulas huesped pueden ser bacterias, celulas de mamlfero, levadura u hongos filamentosos. Diversas bacterias incluyen Escherichia y Bacillus. Las levaduras pertenecientes a los generos Saccharomyces, Kiuyveromyces, Hansenula o Pichia encontraran uso como celula huesped apropiada. Pueden usarse diversas especies de hongos filamentosos como huespedes de expresion, incluyendo los siguientes generos: Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus y Pyricularia.

Los ejemplos de organismos huesped que pueden usarse incluyen bacterias, por ejemplo, Escherichia coli MC1061, derivados de Bacillus subtilis BRB1 (Sibakov et al., 1984), Staphylococcus aureus SAI123 (Lordanescu, 1975) o Streptococcus lividans (Hopwood et al., 1985); levaduras, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae AH 22 (Mellor et al., 1983) y Schizosaccharomyces pombe; hongos filamentosos, por ejemplo, Aspergillus nidulans, Aspergillus awamori (Ward, 1989), Trichoderma reesei (Penttila et al., 1987; Harkki et al, 1989).

Los ejemplos de celulas huesped de mamlfero incluyen celulas de ovario de hamster chino (CHO-K1; ATCC CCL61), celulas de hipofisis de rata (GH1; ATCC CCL82), celulas HeLa S3 (ATCC CCL2.2), celulas de hepatoma de rata (H-4-II-E; ATCcCrL 1548), celulas de rinon de mono transformadas con SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) y celulas embrionarias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). Lo anterior es ilustrativo pero no limitativo de los muchos organismos huesped posible conocidos en la tecnica. En principio, todos los huespedes que puedan realizar secrecion pueden usarse, ya sean procariotas o eucariotas.

Las celulas huesped de mamlfero que expresan la arginasa y/o sus multlmeros de fusion se cultivan en condiciones empleadas normalmente para cultivar la llnea celular original. Generalmente, se cultivan celulas en un medio convencional que contiene sales fisiologicas y nutrientes, tales como medio convencional RPMI, MEM, IMEM o DMEM, normalmente complementado con suero al 5-10%, tal como suero bovino fetal. Las condiciones de cultivo tambien son convencionales, por ejemplo, se incuban cultivos a 37°C en cultivos estacionarios o rotativos hasta que se alcanzan los niveles deseados de las protelnas.

D. Purificacion de protelnas

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Los expertos en la tecnica conocen bien tecnicas de purificacion de protelnas. Estas tecnicas implican, en un nivel, la homogenizacion y el fraccionamiento en bruto de las celulas, tejido u organo para dar fracciones de polipeptido y distintas de polipeptidos. La protelna o polipeptido de interes puede purificarse adicionalmente usando tecnicas cromatograficas y electroforeticas para lograr una purificacion parcial o completa (o purificacion hasta homogeneidad) a menos que se especifique de otro modo. Metodos anallticos particularmente adecuados para la preparacion de un peptido puro son cromatografla de intercambio ionico, cromatografla por exclusion en gel, electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatografla de afinidad, cromatografla de inmunoafinidad e isoelectroenfoque. Un metodo particularmente eficaz de purificacion de peptidos es la cromatografla de llquidos de rapida resolucion (FPLC) o incluso cromatografla de llquidos de alta resolucion (HPLC).

Se pretende que una protelna o peptido purificado se refiera a una composicion, que puede aislarse de otros componentes, en la que la protelna o peptido se purifica hasta cualquier grado con respecto a su estado que puede obtenerse de manera natural. Por tanto, una protelna o peptido aislado o purificado tambien se refiere a una protelna o peptido libre del entorno en el que se produce de manera natural. Generalmente, “purificado” se referira a una composicion de protelna o peptido que se ha sometido a fraccionamiento para eliminar diversos otros componentes, y composicion que conserva sustancialmente su actividad biologica expresada. Cuando se usa el termino “sustancialmente purificado”, esta designacion se referira a una composicion en la que la protelna o peptido forma el componente principal de la composicion, tal como que constituye aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95% o mas de las protelnas en la composicion.

Los expertos en la tecnica conocen bien diversas tecnicas adecuadas para su uso en la purificacion de protelnas. Estas incluyen, por ejemplo, precipitacion con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y similares, o mediante desnaturalizacion termica, seguido por: centrifugacion; etapas de cromatografla tales como cromatografla por intercambio ionico, de filtracion en gel, de fase inversa, de hidroxilapatita y de afinidad; isoelectroenfoque; electroforesis en gel; y combinaciones de estas y otras tecnicas. Tal como se conoce de manera general en la tecnica, se cree que el orden de realizacion de las diversas etapas de purificacion puede cambiarse, o que determinadas etapas pueden omitirse, y todavla dar como resultado un metodo adecuado para la preparacion de una protelna o peptido sustancialmente purificado.

Los expertos en la tecnica conocen diversos metodos para cuantificar el grado de purificacion de la protelna o peptido a la vista de la presente divulgacion. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad especlfica de una fraccion activa, o evaluar la cantidad de polipeptidos dentro de una fraccion mediante analisis de SDS/PAGE. Un metodo preferido para evaluar la pureza de una fraccion es calcular la actividad especlfica de la fraccion, compararla con la actividad especlfica del extracto inicial, y calcular as! el grado de pureza en el mismo, evaluado mediante un “numero de veces de purificacion”. Evidentemente, las unidades reales empleadas para representar la cantidad de actividad dependeran de la tecnica de ensayo particular elegida para seguir la purificacion, y de si la protelna o peptido expresado muestra o no una actividad detectable.

No hay ningun requisito general de que la protelna o peptido tenga que proporcionare siempre en su estado mas purificado. De hecho, se contempla que productos sustancialmente menos purificados pueden tener utilidad en determinadas realizaciones. La purificacion parcial puede lograrse usando menos etapas de purificacion en combinacion, o usando diferentes formas del mismo esquema de purificacion general. Por ejemplo, se aprecia que una cromatografla en columna de intercambio cationico realizada usando un aparato de HPLC dara generalmente como resultado una purificacion de mas “veces” que la misma tecnica usando un sistema de cromatografla a baja presion. Los metodos que muestran un menor grado de purificacion relativa pueden tener ventajas en la recuperacion total de producto de protelna, o en mantener la actividad de una protelna expresada.

En determinadas realizaciones puede aislarse o purificarse una protelna o peptido, por ejemplo, una protelna de fusion multimerica de arginasa estabilizada o una arginasa, antes o despues de la pegilacion. Por ejemplo, puede comprenderse una cola de His o un epltopo de afinidad en una variante de arginasa de este tipo para facilitar la purificacion. La cromatografla de afinidad es un procedimiento cromatografico que se basa en la afinidad especlfica entre una sustancia que va a aislarse y una molecula a la que puede unirse especlficamente. Esto es un tipo de interaction de receptor-ligando. El material de columna se sintetiza acoplando covalentemente una de las parejas de union a una matriz insoluble. Despues el material de columna puede adsorber especlficamente la sustancia de la disolucion. Se produce elucion cambiando las condiciones a aquellas en las que no se producira la union (por ejemplo, pH alterado, fuerza ionica, temperatura, etc.). La matriz debe ser una sustancia que en si misma no adsorbe moleculas en ningun grado significativo y que tiene un amplio intervalo de estabilidad qulmica, flsica o termica. El ligando debe acoplarse de tal manera que no afecte a sus propiedades de union. El ligando tambien debe proporcionar una union relativamente estrecha. Y debe ser posible eluir la sustancia sin destruir la muestra o el ligando.

La cromatografla de exclusion molecular (SEC) es un metodo cromatografico en el que moleculas en disolucion se separan basandose en su tamano, o en terminos mas tecnicos, su volumen hidrodinamico. Habitualmente se aplica a moleculas grandes o complejos macromoleculares tales como protelnas y pollmeros industriales. Normalmente,

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cuando se usa una disolucion acuosa para transportar la muestra a traves de la columna, la tecnica se conoce como cromatografla de filtracion en gel, frente al nombre cromatografla de permeacion en gel que se usa cuando se usa un disolvente organico como fase movil.

El principio subyacente de SEC es que partlculas de diferentes tamanos se eluiran (filtraran) a traves de una fase estacionaria a diferentes velocidades. Esto da como resultado la separation de una disolucion de partlculas basada en el tamano. Siempre que todas las partlculas se carguen simultaneamente o casi simultaneamente, las partlculas del mismo tamano deberan eluirse juntas. Cada columna de exclusion molecular tiene un intervalo de pesos moleculares que pueden separarse. El llmite de exclusion define el peso molecular en el extremo superior de este intervalo y es en el que las moleculas son demasiado grandes como para atraparse en la fase estacionaria. El llmite de permeacion define el peso molecular en el extremo inferior del intervalo de separacion y es en el que las moleculas de un tamano lo suficientemente pequeno pueden penetrar completamente en los poros de la fase estacionaria y todas las moleculas por debajo de esta masa molecular son tan pequenas que se eluyen como una unica banda.

La cromatografla de llquidos de alta resolution (o cromatografla de llquidos a alta presion, HPLC) es una forma de cromatografla en columna usada con frecuencia en bioqulmica y qulmica analltica para separar, identificar y cuantificar compuestos. La HPLC usa una columna que contiene material de empaquetamiento cromatografico (fase estacionaria), una bomba que mueve la(s) fase(s) movil(es) a traves de la columna, y un detector que muestra los tiempos de retention de las moleculas. El tiempo de retention varla dependiendo de las interacciones entre la fase estacionaria, las moleculas que estan analizandose y el/los disolvente(s) usado(s).

V. Composiciones farmaceuticas

Se contempla que las arginasas para su uso en la presente invention pueden administrarse de manera sistemica o local para inhibir el crecimiento de celulas tumorales y, lo mas preferiblemente, para destruir celulas cancerosas en pacientes con cancer con canceres localmente avanzados o metastasicos. Pueden administrarse por via intravenosa, intratecal y/o intraperitoneal. Pueden administrarse solas o en combinacion con farmacos antiproliferativos. En una realizacion, se administran para reducir la carga de cancer en el paciente antes de la cirugla u otros procedimientos. Alternativamente, pueden administrarse tras la cirugla para garantizar que cualquier cancer restante (por ejemplo cancer que la cirugla no logro eliminar) no sobreviva.

No se pretende que la presente invencion se limite por la naturaleza particular de la preparation terapeutica. Por ejemplo, tales composiciones pueden proporcionarse en formulaciones junto con portadores, diluyentes y excipientes llquidos, en gel o solidos fisiologicamente tolerables. Etas preparaciones terapeuticas pueden administrarse a mamlferos para uso veterinario, tal como con animales domesticos, y uso cllnico en seres humanos de una manera similar a otros agentes terapeuticos. En general, la dosificacion requerida para la eficacia terapeutica variara segun el tipo de uso y modo de administration, as! como los requisitos particulares de sujetos individuales.

Tales composiciones se preparan normalmente como disoluciones o suspensiones llquidas, como productos inyectables. Diluyentes y excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solution salina, dextrosa, glicerol, o similares, y combinaciones de los mismos. Ademas, si se desea, las composiciones pueden contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes estabilizantes o de tamponamiento del pH.

Cuando se contemplan aplicaciones cllnicas, puede ser necesario preparar composiciones farmaceuticas (vectores de expresion, reservas de virus, protelnas, anticuerpos y farmacos) en una forma apropiada para la aplicacion prevista. Generalmente, las composiciones farmaceuticas empleadas en la presente invencion comprenden una cantidad eficaz de una o mas variantes de arginasa o agente adicional disuelta o dispersada en un portador farmaceuticamente aceptable. La frase “farmaceutica o farmacologicamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaction adversa, alergica u otra prejudicial cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, segun sea apropiado. La preparacion de una composition farmaceutica que contiene al menos una variante de arginasa, tal como una arginasa multimerica estabilizada o una arginasa pegilada aislada mediante el metodo dado a conocer en el presente documento, o principio activo adicional, la conoceran los expertos en la tecnica a la vista de la presente divulgation, tal como se muestra a modo de ejemplo por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., 1990. Ademas, para la administracion a animales (por ejemplo, seres humanos), se entendera que las preparaciones deben cumplir con las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridas por la Oficina de normas biologicas de la FDA.

Tal como se usa en el presente documento, “portador farmaceuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifungicos), agentes isotonicos, agentes retardantes de la absorcion, sales, conservantes, farmacos, estabilizadores de farmacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes de disgregacion, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, colorantes, tales materiales de este tipo y combinaciones de los

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mismos, tal como conocera un experto habitual en la tecnica (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., 1990). Excepto en la medida en que cualquier portador convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones farmaceuticas.

La presente invencion puede usar diferentes tipos de portadores dependiendo de si va a administrarse en forma solida, llquida o de aerosol, y si se necesita que sea esteril para vlas de administracion tales como inyeccion. Las protelnas, formulaciones y composiciones para su uso en la presente invencion pueden administrarse por via intravenosa, intradermica, transdermica, intratecal, intraarterial, intraperitoneal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, topica, intramuscular, subcutanea, mucosa, oral, topica, local, mediante inhalacion (por ejemplo, inhalacion de aerosol), inyeccion, infusion, infusion continua, perfusion localizada banando directamente las celulas diana, a traves de un cateter, a traves de un lavado, en composiciones lipldicas (por ejemplo, liposomas), o mediante otro metodo o cualquier combinacion de lo anterior tal como conocera un experto habitual en la tecnica (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., 1990).

Las variantes de arginasa pueden formularse en una composicion en una forma de base libre, neutra o de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libre de una composicion proteica, o que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorhldrico o fosforico, o acidos organicos tales como acidos acetico, oxalico, tartarico o mandelico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libre tambien pueden derivarse a partir de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o ferrico; o bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procalna. Tras la formulacion, las disoluciones se administraran de una manera compatible con la formulacion de dosificacion y en una cantidad tal como sea terapeuticamente eficaz. Las formulaciones se administran facilmente en una variedad de formas de dosificacion tales como formuladas para administraciones parenterales tales como disoluciones inyectables, o aerosoles para administracion a los pulmones, o formuladas para administraciones alimentarias tales como capsulas de liberation de farmaco y similares.

Adicionalmente segun la presente invencion, la composicion usada en la presente invencion adecuada para la administracion se proporciona en un portador farmaceuticamente aceptable con o sin un diluyente inerte. El portador debe ser asimilable e incluye portadores llquidos, semisolidos, es decir, pastas, o solidos. Excepto en la medida en que cualquier medio, agente, diluyente o portador convencional sea perjudicial para el receptor o para la eficacia terapeutica de la composicion contenida en el mismo, su uso en una composicion administrable para su uso en la puesta en practica de los metodos en el contexto de la presente invencion es apropiado. Los ejemplos de portadores o diluyentes incluyen grasas, aceites, agua, soluciones salinas, llpidos, liposomas, resinas, aglutinantes, cargas y similares, o combinaciones de los mismos. La composicion tambien puede comprender diversos antioxidantes para retrasar la oxidation de uno o mas componentes. Adicionalmente, la prevention de la action de microorganismos puede provocarse mediante conservantes tales como diversos agentes antibacterianos y antifungicos, incluyendo, pero sin limitarse a, parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal o combinaciones de los mismos.

Segun la presente invencion, la composicion se combina con el portador de cualquier manera conveniente y practica, es decir, mediante disolucion, suspension, emulsification, mezcla, encapsulation, absorcion y similares. Tales procedimientos son rutinarios para los expertos en la tecnica.

En una realization especlfica de la presente invencion, la composicion se combina o mezcla exhaustivamente con un portador solido o semisolido. El mezclado puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente tal como trituration. Tambien pueden anadirse agentes estabilizantes en el procedimiento de mezclado con el fin de proteger la composicion frente a la perdida de actividad terapeutica, es decir, desnaturalizacion en el estomago. Los ejemplos de estabilizadores para su uso en la composicion incluyen tampones, aminoacidos tales como glicina y lisina, hidratos de carbono tales como dextrosa, manosa, galactosa, fructosa, lactosa, sacarosa, maltosa, sorbitol, manitol, etc.

En realizaciones adicionales, la presente invencion puede implicar el uso de composiciones de vehlculo lipldico farmaceuticas que incluyen variantes de arginasa, uno o mas llpidos, y un disolvente acuoso. Tal como se usa en el presente documento, el termino “llpido” se definira para que incluya cualquiera de la amplia gama de sustancias que son caracterlsticamente insolubles en agua y extralbles con un disolvente organico. Esta amplia clase de compuestos la conocen bien los expertos en la tecnica, y tal como se usa el termino “llpido” en el presente documento, no se limita a ninguna estructura particular. Los ejemplos incluyen compuestos que contienen hidrocarburos alifaticos de cadena larga y sus derivados. Un llpido puede producirse de manera natural o ser sintetico (es decir, disenado o producido por el ser humano). Sin embargo, un llpido es habitualmente una sustancia biologica. Los llpidos biologicos se conocen bien en la tecnica, e incluyen, por ejemplo, grasas neutras, fosfollpidos, fosfogliceridos, esteroides, terpenos, lisollpidos, glicosfingollpidos, glicollpidos, sulfatidos, llpidos con acidos grasos unidos mediante eter y ester y llpidos polimerizables, y combinaciones de los mismos. Evidentemente, compuestos distintos de los descritos especlficamente en el presente documento que un experto en la tecnica entiende como llpidos tambien se consideran dentro del contexto de la presente invencion.

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Un experto habitual en la tecnica estara familiarizado con la gama de tecnicas que pueden emplearse para dispersar una composicion en un vehlculo lipldico. Por ejemplo, la arginasa multimerica estabilizada o arginasa pegilada puede dispersarse en una disolucion que contiene un llpido, disolverse con un llpido, emulsionarse con un llpido, mezclare con un llpido, combinarse con un llpido, unirse covalentemente a un llpido, estar contenida como suspension en un llpido, estar contenida o complejada con una micela o liposoma, o asociarse de otro modo con un llpido o estructura lipldica mediante cualquier medio conocido por los expertos habituales en la tecnica. La dispersion puede dar como resultado o no la formacion de liposomas.

La cantidad de dosificacion real de una composicion para su uso en la presente invencion administrada a un paciente animal puede determinarse mediante factores flsicos y fisiologicos tales como peso corporal, gravedad del estado, tipo de enfermedad que esta tratandose, intervenciones terapeuticas previas o concurrentes, idiopatla del paciente y la via de administracion. Dependiendo de la dosificacion y la via de administration, el numero de administraciones de una dosificacion preferida y/o una cantidad eficaz puede variar segun la respuesta del sujeto. En cualquier caso, el profesional responsable de la administracion determinara la concentration de principio(s) activo(s) en una composicion y dosis apropiada(s) para el sujeto individual.

En determinadas realizaciones, las composiciones farmaceuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente el 0,1% de un compuesto activo. En otras realizaciones, el compuesto activo puede comprender entre aproximadamente el 2% y aproximadamente el 75% del peso de la unidad, o entre aproximadamente el 25% y aproximadamente el 60%, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable en el mismo. Naturalmente, la cantidad de compuesto(s) activo(s) en cada composicion terapeuticamente util puede prepararse de tal manera que se obtendra una dosificacion adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Un experto en la tecnica de preparation de tales formulaciones farmaceuticas tendra en cuenta factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, semivida biologica, via de administracion, vida util de almacenamiento del producto, as! como otras consideraciones farmacologicas, y como tal, puede ser deseable una variedad de dosificaciones y reglmenes de tratamiento.

tambien puede comprender desde 5 microgramo/kg/peso corporal,

50 microgramo/kg/peso corporal,

200 microgramo/kg/peso corporal, 500 microgramo/kg/peso corporal, 5 miligramo/kg/peso corporal,

50 miligramo/kg/peso corporal,

200 miligramo/kg/peso corporal,

miligramo/kg/peso corporal, hasta

En otros ejemplos no limitativos, una dosis 1 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente

10 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 100 microgramo/ kg/peso corporal, aproximadamente 350 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 10 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 100 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente

350 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 500 1000 mg/kg/peso corporal o mas por administracion, y cualquier intervalo derivable en el mismo. En ejemplos no limitativos de un intervalo derivable a partir de los numeros indicados en el presente documento, puede administrarse un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg/peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg/peso corporal, de aproximadamente 5 microgramo/kg/peso corporal a aproximadamente 500 miligramo/kg/peso corporal, etc., basandose en los numeros descritos anteriormente.

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aproximadamente

aproximadamente

aproximadamente

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aproximadamente

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VII. Definiciones

El termino “aa” se refiere a aminoacido(s). Las sustituciones de aminoacido se indican mediante la position de aminoacido, por ejemplo 303, en la molecula usando un codigo de letras (la letra delante del numero indica el aminoacido que esta sustituyendose, mientras que la letra detras del numero indica el aminoacido que esta introduciendose).

Tal como se usa en el presente documento el termino “parte” cuando hace referencia a una protelna (como en “una parte de una protelna dada”) se refiere a fragmentos de esa protelna. El tamano de los fragmentos puede oscilar entre cuatro residuos de aminoacido y la secuencia de aminoacidos completa menos un aminoacido.

Tal como se usa en el presente documento los terminos “protelna” y “polipeptido” se refieren a compuestos que comprenden aminoacidos unidos a traves de enlaces peptldicos y se usan de manera intercambiable.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “protelna de fusion” se refiere a una protelna quimerica que contiene la protelna de interes (es decir, una arginasa humana o variante de la misma) unida (u operativamente unida) a un fragmento de protelna exogena (la pareja de fusion que consiste en una protelna distinta de arginasa). La pareja de fusion puede potenciar la semivida en suero, solubilidad, o ambas. Tambien puede proporcionar una etiqueta de afinidad (por ejemplo cola de his) para permitir la purification de la protelna de fusion recombinante de la celula huesped o el sobrenadante de cultivo, o ambos.

Los terminos “en combination operativa”, “en orden operativo” y “operativamente unido” se refieren a la union de secuencias de acido nucleico de tal manera que se produce una molecula de acido nucleico que puede dirigir la

transcripcion un gen dado y/o la slntesis de una molecula de protelna deseada. El termino tambien se refiere a la union de secuencias de aminoacidos de tal manera que se produce una protelna funcional.

Tal como se usa en el presente documento el termino “Km” se refiere a la constante de Michaelis-Menton para una enzima y se define como la concentracion del sustrato especlfico a la que una enzima dada proporciona la mitad de 5 su velocidad maxima en una reaccion catalizada por enzima.

Tal como se usa en el presente documento el termino kcat se refiere al numero de recambio o el numero de moleculas de sustrato que cada sitio de la enzima convierte en producto por unidad de tiempo, y en el que la enzima esta funcionando a maxima eficacia.

Tal como se usa en el presente documento el termino Kcat/Km es la constante de especificidad que es una medida de 10 con cuanta eficacia una enzima convierte un sustrato en un producto.

El termino “Mn-hArgI” se refiere una arginasa I humana con un cofactor Mn(II). El termino “Co-hArgI” se refiere una arginasa I humana (mutante o nativa) con un cofactor Co(II).

El termino “CI50” es la mitad (50%) de la concentracion inhibitoria (CI) maxima y por tanto una medida de la eficacia.

El termino “pegilado” se refiere a la conjugacion con polietilenglicol (PEG), que se ha usado ampliamente como 15 portador de farmacos, dado su alto grado de biocompatibilidad y facilidad de modification. (Harris et al., 2001). Se ha mostrado que la union a diversos farmacos, protelnas y liposomas mejora el tiempo de residencia y disminuye la toxicidad. (Greenwald et al., 2000; Zalipsky et al., 1997). PEG puede acoplarse (por ejemplo unirse covalentemente) a agentes activos a traves de los grupos hidroxilo en los extremos de la cadena y mediante otros metodos qulmicos; sin embargo, el propio PEG esta limitado a como maximo dos agentes activos por molecula. En un enfoque 20 diferente, se han explorado copollmeros de PEG y aminoacidos como biomateriales novedosos que conservaran las propiedades de biocompatibilidad de PEG, pero que tendran la ventaja anadida de numerosos puntos de union por molecula (proporcionando una mayor carga de farmaco), y que pueden disenarse sinteticamente para adaptarse a una variedad de aplicaciones (Nathan et al., 1992; Nathan et al., 1993).

El termino “gen” se refiere a una secuencia de ADN que comprende secuencias de control y codificante necesarias 25 para la production de un polipeptido o precursor del mismo. El polipeptido puede codificarse por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier parte de la secuencia codificante siempre que se conserve la actividad enzimatica deseada.

El termino “sujeto” se refiere a animales, incluyendo seres humanos.

El termino “de tipo natural” se refiere a un gen o producto genico que tiene las caracterlsticas de ese gen o producto 30 genico cuando se alsla de una fuente que se produce de manera natural. Un gen de tipo natural es aquel que se observa con la mayor frecuencia en una poblacion y por tanto se denomina arbitrariamente la forma “normal” o “de tipo natural” del gen. En cambio, el termino “modificado” o “variante” o “mutante” se refiere a un gen o producto genico que presenta modificaciones en la secuencia y/o las propiedades funcionales (es decir, caracterlsticas alteradas) en comparacion con el gen o producto genico de tipo natural. Se indica que pueden aislarse mutantes que 35 se producen de manera natural; estos se identifican por el hecho de que tienen caracterlsticas alteradas en comparacion con el gen o producto genico de tipo natural.

VIII. Kits

La presente invention puede implicar el uso de kits, tales como kits terapeuticos. Por ejemplo, un kit puede comprender una o mas composiciones farmaceuticas tal como se describen en el presente documento y 40 opcionalmente instrucciones para su uso. Los kits tambien pueden comprender uno o mas dispositivos para lograr la administration de tales composiciones. Por ejemplo, un kit objeto puede comprender una composition farmaceutica y un cateter para lograr la inyeccion intravenosa directa de la composicion en un tumor canceroso. En otras realizaciones, un kit objeto puede comprender ampollas precargadas de una arginasa multimerica estabilizada o arginasa pegilada aislada, opcionalmente formulada como producto farmaceutico, o liofilizada, para su uso con un 45 dispositivo de administracion.

Los kits pueden comprender un recipiente con una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales tales como vidrio o plastico. El recipiente puede contener una composicion que incluye un anticuerpo que es eficaz para aplicaciones terapeuticas o no terapeuticas, tal como se describio anteriormente. La etiqueta en el recipiente puede 50 indicar que la composicion se usa para una terapia o aplicacion no terapeutica especlfica, y tambien puede indicar instrucciones para su uso o bien in vivo o bien in vitro, tal como los descritos anteriormente. El kit comprendera normalmente el recipiente descrito anteriormente y uno o mas de otros recipientes que comprenden materiales

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deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y prospectos con instrucciones para su uso.

IX. Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar determinadas realizaciones preferidas y aspectos de la presente invencion y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la misma. En la siguiente divulgacion de experimentos, se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (Molar); pM (micromolar); mM (milimolar); N (normal); mol (moles); mmol (milimoles); pmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); pg (microgramos); l (litros); ml (mililitros); pl (microlitros); cm (centlmetros); mm (millmetros); pm (micrometros); nm (nanometros); °C (grados centlgrados); PM (peso molecular); PBS (solucion salina tamponada con fosfato); min (minutos).

EJEMPLO 1

SINTESIS Y EXPRESION GENICA DE ARGINASA I Y II HUMANAS

Los genes de arginasa I y II humanas contienen ambos multiples codones que se usan con poca frecuencia en E. coli que pueden interferir con la expresion. Por tanto, con el fin de optimizar la expresion de protelnas en E. coli, se ensamblaron los genes respectivos con oligonucleotidos con codones optimizados disenados con el software DNA- Works (Hoover et al., 2002). Cada constructo contiene un sitio de restriction NcoI N-terminal, una cola de His6 N- terminal en marco seguida por un sitio de proteasa de virus del grabado del tabaco (TEV) y un sitio BamHI C- terminal para simplificar la donation. La escision mediante proteasa de TEV elimina el peptido His6 y el Met N- terminal de arginasa. Se diseno un gen de arginasa II con un sitio de escision de proteasa de TEV y sin los primeros 21 aa nativos. Los primeros 21 aa son una supuesta secuencia de direccionamiento a la mitocondria y su elimination da como resultado un mayor rendimiento y estabilidad de la protelna (Colleluori et al., 2001). Tras la clonacion en un vector pET28a (Novagen), se hicieron crecer E. coli (BL21) que contenlan un vector de expresion de arginasa apropiado a 37°C usando medio de caldo Terrific (TB) que contenla kanamicina 50 pg/ml en matraces de agitation a 250 rpm hasta que se alcanzo una DO600 de 0,5-0,6. En ese punto se transfirieron los cultivos hasta 25°C, se indujeron con IPTG 0,5 mM y se dejo que expresaran protelna durante 12 h adicionales. Despues se recogieron los sedimentos celulares mediante centrifugation y se resuspendieron en un tampon de IMAC (NaPO4 10 mM/imidazol 10 mM/NaCl 300 mM, pH 8). Tras la lisis mediante una celula de presion francesa, se centrifugaron los lisados a 20.000 x g durante 20 min a 4°C, y se aplico el sobrenadante resultante a una columna de IMAC de cobalto o nlquel, se lavo con 10-20 volumenes de columna de tampon de IMAC, y despues se eluyo con un tampon de elucion de IMAC (NaPO4 50 mM/imidazol 250 mM/NaCl 300 mM, pH 8). Se incorpora el cation de metal divalente deseado mediante incubation con metal 10 mM (CoCl2 o MnSO4) durante 15 min a 50°-55°C, seguido por filtration a traves de un filtro de jeringa de 0,45 pm. Usando un dispositivo de filtro de centrifugacion con un MWCO de 10.000 (Amicon), despues se sometieron las protelnas a intercambio de tampon varias veces en una disolucion de Hepes 100 mM, glicerol al 10%, pH 7,4. Despues se congelaron inmediatamente allcuotas de enzima arginasa en nitrogeno llquido y se almacenaron a - 80°C. La arginasa purificada de esta manera tiene una homogeneidad de > 95% tal como se evalua mediante SDS-PAGE y tincion con Coomassie (figura 2). Se calcula que el rendimiento es de ~200 mg/l de cultivo basandose en el coeficiente de extincion calculado, £280 = 24.180 M'1cm'1 en una concentration de tampon final de clorhidrato de guanidinio 6 M, tampon fosfato 20 mM, pH 6,5 (Gill y von Hippel, 1989).

EJEMPLO 2

INCORPORACION Y DETERMINACION DEL CONTENIDO DE METAL EN ARGINASA I

Tal como se menciono en el ejemplo 1, la incorporation de Mn2+ y Co2+ puede lograrse mediante purification de arginasa, seguido por una etapa de incubacion con metal 10 mM a 50°C durante 10 min. Con el fin de determinar el contenido de metal final y la identidad de las preparaciones de arginasa, se diluyeron muestras de protelna de Mn- hArgI (145 pM), Co-hArgI (182 pM) y tampones de dialisis asociados (Hepes 100 mM, pH 7,4) en acido nltrico al 2% y se analizaron mediante espectrometrla de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-EM, Department of Geological Sciences, University of Texas en Austin) para cuantificar el contenido de cobalto, hierro, manganeso y zinc en la protelna restando la concentracion de metales encontrados en el tampon de dialisis de la concentracion de metal de las muestras de protelna finales y dividiendo entre la concentracion de protelna. Para determinar las concentraciones de protelna, se calculo un coeficiente de extincion para hArgI basandose en la secuencia de aminoacidos (Gill y von Hippel, 1989). Se calcularon todas las concentraciones de protelna para arginasa I basandose en el e2so = 24.180 M'1cm'1 calculado en una concentracion de tampon final de clorhidrato de guanidinio 6 M, tampon fosfato 20 mM, pH 6,5. Para comparacion, tambien se calculo la concentracion de arginasa mediante ensayo BCA usando diluciones de BSA como patron. Usando este metodo se encontro que muestras de arginasa incubadas con Co2+ contenlan 2,1 ± 0,5 equivalentes de Co y 0,4 ± 0,1 equivalentes de Fe, sin cantidades detectables de Zn o Mn. Las muestras incubadas con Mn2+ contienen 1,5 ± 0,2 equivalentes de Mn y 0,4 ± 0,1 equivalentes de Fe, y ninguna cantidad detectable de Zn o Co. Por tanto, la incubacion con calor es un metodo

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eficaz para la incorporacion de cobalto.

EJEMPLO 3

INCORPORACION Y DETERMINACION DEL CONTENIDO DE METAL EN ARGINASA II

Se logro la incorporacion eficaz de metal en arginasa II cultivando E.coli que albergaba el gen de ArgII en medio mlnimo hasta que se alcanzo una DO600 de 1, tras lo cual se expreso la protelna con IPTG 1 mM y CoCh 100 pM durante 12 h adicionales. Con el fin de determinar el contenido de metal final y la identidad de las preparaciones de arginasa, se diluyeron muestras de protelna de Co-hArgI (290 pM) y tapones de dialisis asociados (Hepes 100 mM, pH 7,4) en acido nltrico al 1% y se analizaron mediante espectrometrla de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-EM, Department of Geological Sciences, University of Texas en Austin) para cuantificar el contenido de cobalto, hierro, manganeso y zinc de la protelna restando la concentracion de metales encontrados en el tampon de dialisis de la concentracion de metal de las muestras de protelna finales y dividiendo entre la concentracion de protelna. Para determinar las concentraciones de protelna, se calculo un coeficiente de extincion para hArgI basandose en la secuencia de aminoacidos (Gill y von Hippel, 1989). Se calcularon todas las concentraciones de protelna para arginasa II basandose en el £280 = 22.900 M-1cm-1 calculado en una concentracion de tampon final de clorhidrato de guanidinio 6 M, tampon fosfato 20 mM, pH 6,5. Para comparacion, tambien se calculo la concentracion de arginasa mediante ensayo BCA usando diluciones de BSA como patron. Usando este metodo se encontro que las muestras de arginasa expresadas con Co2+ contenlan 1,35 ± 0,1 equivalentes de Co y 0,63 ± 0,1 equivalentes de Fe, sin cantidades detectables de Zn o Mn.

EJEMPLO 4

CINETICA EN ESTADO ESTACIONARIO DE COBALTO-ARGINASA I A PH FISIOLOGICO

Se uso la derivatizacion con diacetilmonoxina (DAMO) de productos de urea en presencia de acidos fuertes, tiosemicarbazida y Fe3+ con calentamiento para producir un cromoforo con una Imax de ~530 nm, para monitorizar la produccion de urea tras la hidrolisis de L-arginina mediante arginasa. La estructura del colorante no se conoce de manera definitiva, pero se plantea la hipotesis de que la reaccion es una condensacion de DAMO y urea/ureido que se estabiliza posiblemente mediante iones Fe3+ (Beale y Croft, 1961). Se construyo una curva patron de urea frente a A530 que se encontro que era lineal para urea entre 0 - 300 pM con un llmite de deteccion inferior de 1-2 pM. Se examino la cinetica en estado estacionario de Co-hArgI y Mn-hArgI a lo largo de un intervalo de concentraciones de L-arginina (0-40 pM) en un tampon Hepes 100 mM, pH 7,4, 37°C. Normalmente se realizaron las reacciones equilibrando 200 pl en tubos Eppendorf de 1,5 ml a 37°C en un bloque termico, iniciando la reaccion mediante la adicion de 5 pl de enzima durante 30 s y extinguiendo con 15 pl de HCl 12 N. Despues se mezclaron las reacciones y los blancos con 800 pl de reactivo de revelado de color (COLDER) (Knipp y Vasak, 2000) y se sometieron a ebullicion durante 15 min. Tras enfriar durante 10 min, se transfirieron las muestras a cubetas y se leyeron a 530 nm con un espectrofotometro. L-arginina tiene una absorbancia de fondo que hace necesaria la correccion, por tanto se incluyeron blancos de L-arginina para todas las concentraciones usadas. Despues se corrigieron los datos resultantes para compensar el fondo y se calcularon las concentraciones de producto formado a partir de la curva patron. Despues se divide el producto entre el tiempo y la concentracion de enzima usada y se representa graficamente v0/[E] frente a la concentracion de sustrato y se ajusta directamente con la ecuacion de Michaelis- Menten (figura 3), en la que v0/[E] = kcat*[S]/([S] + Km). Con este metodo, Co-hArgI tenia una kcat de 240 ± 14 s-1, una Km de 190 ± 40 pM, y kcat/KM de 1.270 ± 330 mM'V1, en comparacion con Mn-hArgI, que tenia una kcat de 300 ± 12 s-1, una Km de 2.330 ± 260 pM, y kcat/KM de 129 ± 20 mM'V1. El uso de cobalto como cofactor a pH fisiologico conduce a un aumento de 10 veces en la constante de especificidad.

EJEMPLO 5

CINETICA EN ESTADO ESTACIONARIO DE COBALTO-ARGINASA II A PH FISIOLOGICO

Se encontro que arginasa II purificada tal como se describio en el ejemplo 3 y caracterizada tal como se describio en el ejemplo 4 tenia una kcat de 182 ± 7 s-1, una Km de 126 ± 18 pM, y una kcat/KM de 1.440 ± 260 mM-1s-1 en comparacion con Mn-hArgII en la que se encontro una kcat de 48 ± 2 s-1, una Km de 2.900 ± 300 pM, y kcat/KM de 17 ± 2 mM-1s-1. El uso de cobalto como cofactor a pH fisiologico conduce a un aumento de 80 veces en la constante de especificidad para arginasa II.

EJEMPLO 6

EXAMEN EN PLACAS DE 96 POCILLOS PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD DE ARGINASA Y CLASIFICACION DE CLONES

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La hidrolisis mediante arginasa de L-arginina produce L-ornitina y urea. Se adapto el ensayo de hidrolisis de L- arginina del ejemplo 3 a formato de placa de 96 pocillos para la deteccion de urea y se uso para examinar bibliotecas de mutantes de protelna y para ordenar mediante clasificacion clones con la mayor actividad arginasa. Se seleccionaron clones que presentaban un aumento de mas de 2 veces en la actividad para su caracterizacion adicional. Se mostro que el ensayo tenia un intervalo dinamico de ~5-200 pM para la deteccion de producto de ureido. Pueden examinarse facilmente mas de 500 clones al dla mediante examen manual. La salida de senal, es decir, la intensidad de color, refleja tres parametros principales, concretamente la constante de especificidad (kcat/KM), la concentracion de enzima [Enz] y el tiempo (t). Si es necesario, pueden detectarse niveles de enzima en clones individuales mediante ELISA; sin embargo, generalmente la expresion enzimatica de arginasa varla menos de dos veces y por tanto las diferencias en la expresion no constituyen un problema significativo.

Se escogieron colonias individuales en placas de cultivo de 96 pocillos que contenlan 75 pl de medio de TB/pocillo que contenla kanamicina 50 pg/ml. Despues se hicieron crecer estos cultivos a 37°C en un agitador de placas hasta que se alcanzo una DO600 de 0,8-1, se enfriaron hasta 25°C, tras lo cual se anadieron 75 pl adicionales de medio que contenla kanamicina 50 pg/ml e IPTG 0,5 mM. Se realizo la expresion a 25°C con agitacion durante ~2 h, tras lo cual se transfirieron 100 pl de cultivo/pocillo a una placa de ensayo de 96 pocillos. Despues se centrifugaron las placas de ensayo para sedimentar las celulas, se retiro el medio y se sometieron las celulas a lisis mediante adicion de 50 pl/pocillo de reactivo de extraccion de protelnas B-PER (Pierce). Posteriormente se anadieron 50 pl/pocillo adicionales de L-arginina 200 pM, CoCl2 1 mM, en un tampon Hepes 100 mM, pH 7,4 y se dejaron reaccionar a 37°C. Tras reaccionar ~1-2 min, se anadieron 100 pl/pocillo de reactivo de revelado de color y se proceso la placa (Knipp y Vasak, 2000). Las colonias que tenlan la capacidad de producir urea dieron como resultado la formacion de un colorante rojo brillante con una Imax de 530 nm.

EJEMPLO 7

DEPENDENCIA DE LA TASA DE PH DE COBALTO-ARGINASA Y MANGANESO-ARGINASA

Para examinar la dependencia del pH de kcat/KM de arginasa sustituida con cobalto y manganeso, se determinaron las constantes cineticas en estado estacionario a lo largo de un amplio intervalo de valores de pH. Se usaron los siguientes tampones: acetato de sodio (pH 5-5,5), MES (pH 6-6,5), HePES (pH 7-7,8), Tris (pH 8-9), Capso (pH 910,5), todos a una concentracion de 100 mM. Se determinaron todas las cineticas al menos por triplicado a 37°C. Tras ajustar los datos cineticos a la ecuacion de Michaelis-Menten, se calcularon los valores de kcat/KM y se ajustaron a una ecuacion de Henderson-Hasselbach para determinar los valores de pka. Dado que ajustes a dos valores de pka mas proximos que 3,5 unidades tienden a subestimar ymax, se uso el metodo de Segel para calcular los valores de pka corregidos para cada seccion de los perfiles de kcat/KM (Segel, 1975). Los ajustes ajustados de kcat/KM frente a pH dieron como resultado una curva en forma de campana con Co-hArgI que tenia un pka de seccion ascendente de 7,5 ± 0,1 y un pka de seccion descendente de 9,8 ± 0,1. Mn-hArgI tambien tenia una curva en forma de campana con un pka de seccion ascendente de 8,5 ± 0,1 y una seccion descendente que presentaba un valor de pka aparente de 10,1 ± 0,1 (figura 4). Las enzimas Mn-hArgI y Co-ArgI mostraron un Apka de 1 unidad de pH. Este desplazamiento en el pka tras la sustitucion con Co confiere probablemente gran parte de la mejora observada en la constante de especificidad. A pH fisiologico, aproximadamente el 44% de Co-hArgI tendra enlace de hidroxido en contraposition al 7% con Mn-hArgI.

EJEMPLO 8

EL EFECTO DE MUTACIONES EN LA POSICION 303

Se construyo una biblioteca de saturation de codon NNS en la position 303 y se examino usando los siguientes cebadores mutagenicos: directo '5-cgatcacgttagcaNNSttcggtttagcccg (SEQ ID NO: 3), e inverso '5-

CGGGCTAAACCGAAsnnTGCTAACGTGATCG (SEQ ID NO: 4), usando el gen de hArgI como ADN de molde y cebadores terminales especificos; directo '5-

GATATACCATGGGTTCTTCTCACCATCATCACCACCACAGCTCTGGCG (SEQ ID NO: 5) e inverso '5-

CGAATTCGGATCCTCACTTCGGTGGATTCAGATAATCAATT (SEQ ID NO: 6). Se digirio el producto de PCR con NcoI y BamHI y se ligo en un vector pET28a con ADN ligasa de T4. Se transformo la ligation resultante directamente en E. coli (BL21), se sembro en placas de LB-kanamicina para su posterior examen tal como se describio en el ejemplo 4. Se aislaron clones que mostraban la mayor actividad y se secuencio el ADN. Se purificaron las variantes de enzimas respectivas tal como se describio en el ejemplo 1 y se incubaron con calor con cobalto tal como se describio en el ejemplo 2. Se purificaron todas las protelnas hasta una homogeneidad del >95% tal como se evaluo mediante SDS-PAGe. Se determino la cinetica de hidrolisis de arginina con un intervalo de concentraciones de L-arginina (0 - 2 mM) a 37°C en un tampon Hepes 100 mM, pH 7,4, y se ajustaron los datos resultantes a la ecuacion de Michaelis-Menten en Kaleidagraph. Cys303 sustituida por Phe o Ile condujo a un aumento de 2 veces y 1,6 veces en kcat/KM respectivamente en comparacion con Co-hArgI de tipo natural. Las sustituciones con Leu, Pro, His y Arg tuvieron aproximadamente el 90% de la actividad de tipo natural.

Tambien se sometieron a prueba las variantes de Cys303 para determinar la estabilidad en suero a 37°C de la siguiente manera: se anadieron enzimas purificadas a suero humano combinado (Innovative) a una concentracion de 1 mM y se incubaron a 37°C. Cada ~24 horas, se extrajeron allcuotas y se sometieron a prueba por triplicado para determinar su capacidad para hidrolizar L-arginina 1 mM en un tampon Hepes 100 mM, pH 7,4. Tras ~4 dlas se 5 ajustaron los datos resultantes a un modelo de disminucion o bien exponencial o bien loglstico para calcular valores de Ty2. Se uso la estabilidad de la enzima de tipo natural como patron y se calculo que tenia una Ty2 de 33 ± 3 h. Las enzimas sustituidas con Phe, Ile, Leu y His solo eran aproximadamente la mitad de estables que el tipo natural. Mn- hArgl (o) presentaron una perdida exponencial de actividad con una vida T1X de 4,8 ± 0,8 h. En cambio, Co-hArgI (•) presento una perdida bifasica de actividad con una primera T1X aparente de 6,1 ± 0,6 h seguida por una segunda T1X 10 mucho mas larga de 37 ± 3 h.

EJEMPLO 9

ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO

Se evaluo la selectividad de la arginasa humana modificada por ingenierla para la hidrolisis de arginina. Se incubo Co-hArgI (1 mM) o tampon de dialisis con los 20 aa (5 mM cada uno) durante 12 h a 37°C en un tampon fosfato 15 220 mM, pH 7,4. Se derivatizaron los patrones, controles y experimentos con OPA y FMOC (Agilent) y se separaron

en una columna de HPLC de fase inversa C18 (Agilent) (5 mm, 4,6 x 150 mm) esencialmente tal como se describe por Agilent Technologies (numero de publication: 5980-3088) excepto por la modification del protocolo de separation ligeramente reduciendo la velocidad de flujo en la mitad y duplicando el tiempo de adquisicion para obtener una mejor separacion de picos. Los 20 aminoacidos convencionales incubados con tampon de dialisis 20 mostraron 20 picos con buena resolution, y los 20 aminoacidos convencionales incubados con Co-hArgI mostraron 20 picos (figura 6) con desaparicion del pico de L-arginina (TR = 12,3 min) y aparicion de un nuevo pico con un tiempo de retention que coincidla con el de L-ornitina (TR =18,8 min). No se observo que ninguno de los otros aminoacidos se viera afectado por Co-hArg I.

EJEMPLO 10

25 PURIFICACION DE ALTO RENDIMIENTO Y EXAMEN DE LA CINETICA DE VARIANTES

Se desarrollo un esquema de purification a pequena escala para purificar rapidamente docenas de protelnas a la vez y llevar a cabo un analisis de la cinetica enzimatica de alto rendimiento. Se expresaron cultivos de 50 ml de hArg I en matraces de agitation de 125 ml tal como se describio en el ejemplo 1. Se recogieron 5 ml del cultivo resultante mediante centrifugation. Despues se sometieron a lisis los sedimentos celulares con 400 ml de reactivo de 30 extraction de protelnas B-PER (Pierce). Se mezclo la fraction soluble con 500 ml de tampon de lisis de IMAC y

100 ml de perlas de IMAC en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, se incubo durante dos minutos y se centrifugo a 3000 rpm durante 20 s en una centrifugadora de sobremesa. Se desecho el sobrenadante y se lavaron las perlas con 2 x 1 ml de tampon de lisis de IMAC mediante mezclado/centrifugacion y desechando el sobrenadante. Despues se eluyo hArg I de las perlas mediante adicion de 300 ml de tampon de elucion de IMAC y otra etapa de centrifugacion. Se 35 sometio el sobrenadante que contenla hArg I resultante a intercambio de tampon dos veces con un tampon Hepes 100 mM, pH 7,4 usando un dispositivo de concentracion por centrifugacion con un MWCO de 10.000 (YM-10 Amicon). Despues se cuantifico la protelna mediante A280, se calento en presencia de cobalto como anteriormente, y se evaluo la Co-hArg I resultante mediante SDS-PAGE tal como se describio en el ejemplo 1. Este metodo permite la purificacion de 12 - 16 protelnas en ~2 h con un rendimiento de 200 - 300 mg de proteina con una pureza del 90 - 40 95% tal como se evalua mediante SDS-PAGE.

Despues se sometieron a prueba las variantes de enzimas para determinar su capacidad para hidrolizar L-arginina mediante incubation de 24 nM de enzima con 200 mM de L-arginina en pocillos de placas de microtitulacion. Se recogieron alicuotas en diferentes puntos de tiempo y se extinguieron directamente en el reactivo de revelado de color acido (COLDER). Tras revelar el colorante y leer la absorcion, se ajustaron los datos de curva de progreso a 45 una ecuacion exponencial para estimar un valor de kcat/KM aparente.

EJEMPLO 11

MODIFICACION POR INGENIERIA DE LOS LIGANDOS DE METAL DE LA 2a CUBIERTA DE ARGINASA PARA ACTIVIDAD OPTIMA

La potencia catalitica de una metalohidrolasa surge en parte de su excepcional capacidad para reducir el valor de 50 pka normal del agua (~16) hasta un valor muy inferior y coordinarse con el ion hidroxido altamente reactivo para el

ataque en el sustrato. Tanto la clase de metal como su entorno local que comprende ligandos de 1a y 2a cubierta influyen sobre el pka de la molecula nucleofila de agua/hidroxido (Christianson y Cox, 1999). El metal (A) de hArgI se coordina con el imidazol de H101, que a su vez se une mediante hidrogeno al hidroxilo de S230. El metal (B) de

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hArgI se coordina con el imidazol de H126, que tiene un enlace de hidrogeno de la 2a cubierta con el carboxilo de D181. Se construyo una biblioteca de saturacion de codon NNS en las posiciones 181 y 230 usando los siguientes cebadores mutagenicos: (D181) directo '5- cattggcttacgtNNSgtcgacccagg (SEQ ID NO: 7), inverso '5- CCTGGGTCGACSNNACGTAAGCCAATG (SEQ ID NO: 8); (S230) directo '5-cgtccaatccatctgNNSttcgatgttgacg (SEQ ID NO: 9), inverso '5-CGTCAACATCGAASNNCAGATGGATTGGACG (SEQ ID NO: 10), junto con el gen de hArgI y cebadores terminales especlficos mediante PCR por extension de solapamiento. Tras la clonacion, se transformo la biblioteca en E. coli (BL21) y se examino tal como se describio en el ejemplo 4. Se identificaron clones novedosos mediante secuenciacion, volvieron a transformarse en E. coli (BL21) y se purificaron y caracterizaron cineticamente tal como se describio en el ejemplo 8. Se purificaron variantes que presentaban una actividad aparente > a la de tipo natural a mayor escala y se sometieron a ensayo para evaluar sus parametros cineticos en estado estacionario de kcat y Km. Se encontro que las siguientes variantes tenlan constantes de kcat/KM mayores que Co-hArgI: hArg I D181S: 1420 ± 200 s-1 mM-1, hArg I D181E/S230A: 1.450 ± 200 s-1 mM-1, hArg I S230C: 2.290 ± 200 s-1 mM-1, y hArg I S230G: 2.340 ± 70 s'1 mM-1.

EJEMPLO 12

CITOTOXICIDAD DE Co-ARG Y SUS VARIANTES HACIA CELULAS DE CARCINOMA HEPATOCELULAR Y MELANOMAS METASTASICOS

Con el fin de someter a prueba la citotoxicidad in vitro de arginasa modificada por ingenierla, se incubaron concentraciones variables (0 - 100 nM) de variantes Mn-ArgI, Co-ArgI o Co-hArgI con celulas HCC (Hep 3b) o celulas de melanoma (A375) (Coleccion americana de cultivos tipo) en placas de 96 pocillos a una densidad de sembrado de 500 celulas/pocillo, en medio DMEM complementado con suero bovino fetal. Tras 24 horas de incubacion a 37°C, se trataron las celulas con medio que contenla arginasa por triplicado a diversas concentraciones. La disolucion de control era una solucion salina equilibrada en medio. Se mantuvieron las celulas tratadas a 37°C y CO2 al 5%. Se sometieron a prueba las celulas mediante ensayo de MTT convencional (Sigma- Aldrich) en los dlas 1, 3, 5 y 7 mediante adicion de 100 pl/pocillo de MTT (5 mg/ml), y se incubaron durante 4 horas con agitacion suave de una a dos veces por hora. Despues de esto, se aspiro la disolucion y despues se anadieron 200 pl de DMSO a cada pocillo. Se interpreto la absorbancia a 570 nm para cada pocillo usando un lector de placas automatizado para determinar el numero relativo de celulas supervivientes en comparacion con controles. Se ajustaron los datos resultantes a una ecuacion exponencial para determinar un valor de CI50 aparente para la citotoxicidad de arginasa. La figura 7A muestra el efecto de la adicion de Mn-ArgI o Co-ArgI sobre el % de absorbancia de MTT de celulas HCC. Se calcularon los valores de CI50 a partir del dla 5, proporcionando un valor de CI50 para Mn-hArgI de 5 ± 0,3 nM (~ 0,18 pg/ml) y un valor de 0,33 ± 0,02 nM para Co-hArgI (~0,012 pg/ml). Por tanto, la enzima Co-ArgI parece ser 15 veces mas citotoxica que la enzima sustituida con Mn frente a HCC. Frente a la llnea celular de melanoma metastasico (A375), Mn-hArgI (figura 7B) dio como resultado una CI50 aparente de 4,1 ± 0,1 nM (~ 0,15 pg/ml). La incubacion con Co-hArgI condujo a un aumento de 13 veces en la citotoxicidad con una CI50 aparente de 0,32 ± 0,06 nM (~0,012 pg/ml).

EJEMPLO 13

MODIFICACION POR INGENIERIA DE UNA PROTEINA DE FUSION DE FC-ARGINASA PARA UNA SEMIVIDA IN VIVO POTENCIADA

Se ha empleado la fusion al dominio Fc de IgG de manera extensa para prolongar las semividas in vivo de polipeptidos terapeuticos tales como el inhibidor de TNF-a etanercept (Enbril®). El dominio Fc se une al receptor FcgRn, que se expresa en el endotelio vascular y muchos otros tejidos (Roopenian y Akilesh, 2007). La afinidad de FcgRn por el domino Fc de IgG depende fuertemente del pH. Se produce union al pH acido de compartimentos endosomicos permitiendo que la protelna se recircule sobre la superficie celular y por tanto escape de la degradation proteolltica. En la superficie celular, el domino Fc se libera de FcgRn porque la afinidad de union es muy baja a pH fisiologico. Se estima que la recirculation endosomica a traves de FcgRn aumenta la semivida en suero de inmunoglobulinas al menos 4-7 veces, hasta aproximadamente 7-14 dlas en seres humanos. Las fusiones con Fc aprovechan esta propiedad para dotar de una semivida larga a moleculas de vida corta. Sin embargo, la arginasa humana es un homotrlmero y por tanto si se fusiona a Fc de IgG, que es en si mismo un dlmero, el polipeptido Fc- arginasa resultante formara probablemente agregados de alto peso molecular.

Este problema se evito empleando formas mutantes de arginasa que interrumpen la trimerizacion y son estables en forma monomerica. Se han estudiado con cierto detalle la trimerizacion y la superficie de contacto de subunidades de arginasa I (Lavulo et al., 2001). Se ha mostrado que una sustitucion de un unico aa en Glu256Gln interrumpe la trimerizacion dando como resultado la formation de enzima arginasa I monomerica (Sabio et al., 2001). Se introdujo esta mutation en hArgI mediante el uso de dos cebadores mutagenicos: directo '5- ggtttaacgtatcgcCAGggcctgtatatcacgg (SEQ ID NO: 11) e inverso '5-

CCGTGATATACAGGCCCTGGCGATACGTTAAACC (SEQ ID NO: 12), y dos cebadores terminales especlficos (ejemplo 1) mediante PCR por extension de solapamiento, y clonacion en un vector pET28a. Tras la expresion y

purificacion de esta variante, los analisis cineticos en estado estacionario revelaron una actividad casi identica en comparacion con Co-hArgI con una kcat/KM de 1.320 s'1 nm-1. La figura 8 muestra un gel de PAGE no desnaturalizante que muestra que Co-hArgI-E256Q es un monomero, tal como se esperaba.

Despues se clono este constructo en vectores de expresion de Fc disponibles. El vector de expresion de Fc es un 5 constructo basado en un plasmido pTRC99a (Amersham) que contiene una secuencia llder de DsbA seguida por la region codificante de Fc de IgG, un sitio de restriction EcoRI y un codon de termination. Se coloco el gen de arginasa monomerica en marco detras de la region codificante de Fc digiriendo tanto el vector como el gen con EcoRI, y posteriormente se ligo y se transformo en E. coli (BL21) para la secuenciacion y expresion. Dado que Fc de IgG es normalmente una protelna glicosilada, hasta ahora la expresion de IgG recombinantes o de fusiones con Fc 10 se ha llevado a cabo en celulas de mamlfero recombinantes que, al contrario que las bacterias, pueden realizar glicosilacion con enlace en N. Sin embargo, aunque la glicosilacion en Asn297 es crltica para la union a los receptores de Fcg activadores e inhibidores (FcgRI-III en seres humanos) no tiene ningun efecto apreciable sobre la afinidad o la union dependiente del pH a FcgRn (Tao y Morrison, 1989; Simmons et al., 2002). Por tanto, los anticuerpos IgG aglicosilados expresados en bacterias muestran persistencia en suero en primates que casi no 15 puede distinguirse de la de anticuerpos completamente glicosilados expresados en celulas de mamlfero (Simmons et al., 2002). En contra de las nociones anteriores predominantes, los anticuerpos IgG y las protelnas de Fc pueden expresarse eficazmente en E.coli hasta niveles de g/l en fermentadores. La expresion en E. coli es tecnicamente mucho mas sencilla y mas rapida. Ademas, dado que la protelna resultante esta aglicosilada, no presenta heterogeneidad de glicanos, un problema importante en la expresion de glicoprotelnas terapeuticas (Jefferis, 2007). 20 Se purifica la protelna de fusion mediante cromatografla de protelna A y se cuantifica mediante cromatografla por filtration en gel FPLC el rendimiento de la fusion de Fc-arginasa dimerica correctamente plegada con respecto a polipeptidos que no logran dimerizarse. Esta formulation condujo a una forma altamente activa y muy estable de arginasa humana, adecuada para ensayos in vivo.

EJEMPLO 14

25 PEGILACION DE ARGINASA

Se purifico arginasa tal como se describio en el ejemplo 10 con una exception: tras la union a la columna de IMAC, se lavo la protelna extensamente (80-90 volumenes de columna) con un tampon de IMAC que contenla Triton 114 al 0,1% (esta etapa elimina la mayor parte de la endotoxina), 10-20 volumenes de columna de tampon de IMAC, y despues se eluyo con un tampon de elucion de IMAC (NaPO4 50 mM/imidazol 250 mM/NaCl 300 mM, pH 8). Se 30 sometio la arginasa a intercambio de tampon en un tampon NaPO4 100 mM a pH 8,3 usando un dispositivo de filtracion con un MWCO de 10.000 (Amicon). Usando un pequeno recipiente de reaction, se anadio ester carboximetllico de metoxi-PEG-succinimidilo con PM de 5000 (JenKem Technology) a arginasa a una razon molar de 40:1 y se dejo reaccionar durante 1 h a 25°C con agitation constante. Despues se llevo la mezcla resultante a 10 mM con CoCl2 y se calento a 50°C durante 10 minutos. Tras la centrifugation para eliminar cualquier precipitado, 35 se sometio extensamente la PEG-5000-arginasa a intercambio de tampon (PBS con glicerol al 10%) usando un dispositivo de filtracion con un MWCO de 100.000 (Amicon), y se esterilizo con un filtro de jeringa de 0,2 micrometres (VWR). Se analizo toda la enzima pegilada para determinar el contenido de lipopolisacarido (LPS) usando un kit de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) (Cape Cod Incorporated).

Se encontro que la Co-hArgI pegilada tenia una estabilidad en suero casi identica a la enzima de tipo natural y 40 presentaba un valor de kcat/KM de 1690 ± 290 s-1 mM-1. La figura 12 muestra un gel desnaturalizante del producto final con un PM aparente de ~ 150 kDa.

EJEMPLO 15

EMPOBRECIMIENTO EN SUERO DE L-ARG EN EL MODELO DE RATON

Se trataron ratones Balb/c mediante una unica inyeccion i.p. con 500 mg de Co-hArgI pegilada, preparada 45 farmacologicamente, o un volumen igual de PBS. Se sacrificaron los ratones mediante venopuncion cardiaca para la extraction de sangre en los puntos de tiempo de 0, 48, 72 y 96 h. Se mezclaron inmediatamente las muestras de sangre 50:50 (v/v) un tampon citrato de sodio 400 mM, pH 4, se dejaron coagular durante 30 min y se centrifugaron para la separation de suero. Despues se filtro el suero resultante con un dispositivo con un MWCO de 10.000 (Amicon) para la elimination de proteinas grandes y precipitados y se recogio el flujo pasante para su analisis. Se 50 derivatizaron patrones de L-arginina, suero de raton de control y experimentos con OPA (Agilent) y se separaron en una columna de HPLC de fase inversa C18 (Agilent) (5 mm, 4,6 x 150 mm) esencialmente tal como se describe por Agilent Technologies (numero de publication: 5980-3088) excepto por la modification del protocolo de separacion ligeramente reduciendo la velocidad de flujo en la mitad y duplicando el tiempo de adquisicion para obtener una mejor separacion de picos. Se construyo una curva patron de L-arginina representando graficamente el area del pico 55 de L-Arg frente a la concentration con el fin de cuantificar los niveles de L-Arg en suero. Una unica dosis de Co- hArgI preparada farmacologicamente fue suficiente para mantener L-Arg a o por debajo de limites de detection

5

10

15

20

25

30

35

durante mas de 3 dlas (figura 10).

EJEMPLO 16

TRATAMIENTO DE XENOINJERTO DE TUMOR DE HCC CON CO-HARGI

A ratones desnudos se les inyectaron por via subcutanea en el costado ~106 celulas HCC recogidas de un cultivo tisular confluente al 75%. Despues de que los tumores de HCC xenoinjertados hubieron crecido hasta ~0,5 cm3 de diametro (dla 9), se clasificaron los ratones en dos grupos. El grupo experimental recibio una inyeccion i.p. de 500 mg de Co-hArgI farmacologicamente optimizada en el dla 9 y en el dla 12. El grupo de control recibio inyecciones i.p. de PBS en los dlas 9 y 12. Tal como puede observarse en la figura 11, los tumores tratados con PBS hablan aumentado 3 veces de tamano en el dla 15. En marcado contraste, los tumores tratados con Co-hArgI hablan disminuido de tamano en el dla 15. Los tumores tratados con Mn-hArgI solo hablan mostrado un retraso en la tasa de crecimiento (Cheng et al., 2007). Co-hArgI parece ser un agente quimioterapico altamente eficaz frente a HCC tanto in vitro como in vivo.

Bibliografla

La siguiente bibliografla puede proporcionar detalles de procedimiento a modo de ejemplo u otros detalles complementarios a los expuestos en el presente documento.

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Cheng et al., Cancer Res., 67:4869-4877, 2007.

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Jefferis, Expert Opin. Biol. Ther., 7:1401-1413, 2007.

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Protelna arginasa I o arginasa II humana para su uso en un metodo de tratamiento de un paciente humano que tiene cancer, particularmente un cancer auxotrofico para arginina, que comprende administrar al paciente una formulacion que comprende dicha protelna, teniendo dicha protelna arginasa I o arginasa II humana un sitio de union a metales y comprendiendo al menos una sustitucion de aminoacido en el sitio de union a metales, en la que la protelna presenta un aumento en la hidrolisis de arginina que da como resultado una kcat/Km al menos dos veces mayor que la de una arginasa I humana nativa que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por SEQ ID NO: 1 o una arginasa II humana nativa que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por SEQ ID NO: 2, en la que dicha protelna arginasa I o arginasa II humana comprende un cofactor metalico no nativo, y en la que dicho cofactor metalico no nativo es cobalto.
2. 2. Protelna para su uso segun la reivindicacion 1, en la que la protelna presenta una kcat/Km de entre 400 mM'V1 y 4.000 mM'V1 a pH 7,4, en particular en la que la protelna presenta una kcat/KM de entre 400 mM'V1 y 2.500 mM'V1 a pH 7,4.
3. 3. Protelna para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2,

   i) en la que la protelna arginasa comprende una cadena polipeptldica; y/o

   ii) en la que la al menos una sustitucion de aminoacido esta en His101, Asp124, His126, Asp128, Asp232, Asp234, Trp122, Asp181, Ser230, His120, Asp143, His145, Asp147, Asp251, Asp253, Trp141, Asp200, Ser249, Cys303 o Glu256, preferiblemente en la que la al menos una sustitucion de aminoacido es Asp181Ser, Ser230Cys, Ser230Gly, Cys303Phe, Cys303Ile, Glu256Gln, Asp181Glu o Ser230Ala.
4. 4. Protelna para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la arginasa humana comprende al menos dos sustituciones de aminoacido, en particular en la que las sustituciones de aminoacido en dicha protelna arginasa I humana son Asp181Glu y Ser230Ala.
5. 5. Protelna para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la secuencia de aminoacidos comprende una secuencia de arginasa I o arginasa II truncada, en particular en la que la secuencia de aminoacidos carece de una metionina N-terminal o en la que la secuencia de aminoacidos carece de los primeros 21 aminoacidos de la secuencia de tipo natural.
6. 6. Protelna para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la protelna esta covalentemente unida a polietilenglicol.
7. 7. Protelna que comprende una secuencia de aminoacidos de arginasa I humana o una secuencia de aminoacidos de arginasa II humana y un cofactor metalico no nativo, en la que el cofactor metalico no nativo es cobalto, para su uso en un metodo de tratamiento de un paciente humano que tiene cancer, particularmente un cancer auxotrofico para arginina, que comprende administrar al paciente una formulacion que comprende dicha protelna.
8. 8. Protelna para su uso segun la reivindicacion 7,

   (a) en la que la arginasa I humana comprende una secuencia de aminoacidos codificada por SEQ ID NO: 1, o

   (b) en la que la arginasa II humana comprende una secuencia de aminoacidos codificada por SEQ ID NO: 2.
9. 9. Protelna para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en la que la secuencia de aminoacidos comprende una secuencia de arginasa I o arginasa II truncada, particularmente en la que la secuencia de aminoacidos carece de una metionina N-terminal o en la que la secuencia de aminoacidos carece de los primeros 21 aminoacidos de la secuencia de tipo natural.
10. 10. Protelna para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que la protelna esta covalentemente unida a polietilenglicol.
11. 11. Protelna para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en la que la secuencia de aminoacidos se caracteriza ademas tal como se especifica en las reivindicaciones 2 o 3, o en la que la protelna comprende ademas al menos dos sustituciones de aminoacido.
12. 12. Protelna de fusion que comprende la protelna segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende ademas un segmento peptldico heterologo, para su uso en un metodo de tratamiento de un paciente humano que tiene cancer, particularmente un cancer auxotrofico para arginina, que comprende administrar al paciente una

    formulacion que comprende dicha protelna de fusion, en particular en la que el segmento peptldico heterologo comprende la region Fc de una inmunoglobulina o una parte de la misma.
13. 13. Protelna para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que al paciente se le ha diagnosticado un carcinoma hepatocelular, carcinoma de celulas renales o melanoma.

    5 14. Protelna para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que la formulacion se administra por

    via topica, intravenosa, intradermica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostatica, intrapleural, intratraqueal, intraocular, intranasal, intravltrea, intravaginal, intrarrectal, intramuscular, subcutanea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericardiaca, intraumbilical, oral, mediante inhalacion, mediante inyeccion, mediante infusion, mediante infusion continua, mediante perfusion localizada banando 10 directamente las celulas diana, a traves de un cateter o a traves de un lavado.
14. 15. Protelna para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la formulacion farmaceutica comprende dicha protelna y un excipiente farmaceuticamente aceptable.