JP2014507943A - 診断および治療におけるr2r1/2 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
肺は大量の機械的ストレスおよび酸化ストレスにさらされるが、この点において皮膚と類似している。上記のように、扁平分化プログラムは第1防御線である。肺の遠位気道および血管に沿って並ぶ細胞は、このストレスに抵抗する必要があり、細胞死の場合には、前駆細胞のプールによって置き換えられる必要がある。
1.気管支肺異形成(BPD):未熟児で生まれる新生児の肺は、機械的ストレスなどの肺損傷をより受けやすい。同様に、肺損傷から助かった未熟児の肺は、多くの場合、顕著な瘢痕化または気管支肺異形成(BPD)を伴って治癒する。これらの肺は、乏しいかまたは不十分な再生能を示す。
2.慢性閉塞性肺疾患(COPD):成人COPD患者の肺は、喫煙などの侵害刺激に対して不適切に反応すると思われる。これらの肺は、これらの刺激に対するバリアを発達させるが、細胞死の場合、その再生能の欠如によって、肺の気道および血管の変形が生じる。BPDおよびCOPDは、共に顕著な疾病率死亡率をもたらす。
本発明は、2つの遺伝子が組織の発生および癌の生物学に重要な役割を果たしているという発見に基づく。特に、本発明者らは、これら2つの遺伝子が肺細胞において発現され、肺上皮および内皮の後期分枝形態形成に必要であり、肺の微細な三次元構造の発生/維持を持続させることを見出した。これらの遺伝子は、扁平分化プログラムおよび前駆細胞(Krt14を発現する)細胞プールの発生/維持に必須である。さらに、本発明者らは、癌の生物学、特に、不死化および転移表現型(癌の進展および転移を含む)の獲得に関連するプロセスならびに心臓の発生におけるこれらの遺伝子の非常に重要な役割を同定した。
本発明者らは、これらの遺伝子のマウスおよびヒト型配列を突き止めた。それらの協調的発現および呼吸細胞再生遺伝子としての機能を考慮して、本発明者らは、これらの遺伝子をR2R1およびR2R2と命名した。簡単にするために、本明細書の大部分において用語“R2R1/2”を用いるが、これはより長い句“R2R1および/またはR2R2”を表すものとする。
さらに、適切な場合には、用語“R2R1/2”は、R2R1および/またはR2R2遺伝子のタンパク質産物またはそれらの断片もしくは部分を含む。
特に、用語“R2R1/2”、すなわち用語“R2R1”または“R2R2”のいずれかは、以下の配列番号1〜12に示される配列またはそれらの断片、部分、アナログ、バリアントもしくは誘導体を含む。
配列番号1
acactgacacggaccgaaggagtggaaaaagctttacctgtcactgtctgctgccatacgATGCTGGGAGGCCTGGGGAAGCTGGCGGCCGAGGGCCTGGCCCACCGCACAGAGAAAGCCACTGGGGGAGCAGTTCACGCAGTGGAAGAGGTGGTGAGCGAGGTGGTGGGCCACGCCAAGGAGGTTGGAGAGAAGACCATTAATGACGCCCTAAAGAAAGCCCAAGAATCAGGAGACAGGGTGGTGAAGGAGGTCACTGAGAAGGTCACCCACACCATCACTGATGCTGTTACCCATGCGGCAGAAGGCCTGGGAAGACTGGGACAGtgagcctgcctaccagcatggctggcccttcctgaaggtcaataaagagtgtgaaacgtgaaaaaaaaaaaaaaaataacaaaaaaaaaaaaaaaaaa
翻訳されたこのヌクレオチド267個は、アミノ酸89個を含むタンパク質を生じさせ、これは以下の配列(配列番号3で示す)を有することは当業者には明らかであろう。
配列番号3
MLGGLGKLAAEGLAHRTEKATGGAVHAVEEVVSEVVGHAKEVGEKTINDALKKAQESGDRVVKEVTEKVTHTITDAVTHAAEGLGRLGQ
配列番号4
actgtctgctgccacacgATGCTGGGAGGCCTGGGGAAGCTGGCTGCCGAAGGCCTGGCCCACCGCACCGAGAAGGCCACCGAGGGAGCCATTCATGCCGTGGAAGAAGTGGTGAAGGAGGTGGTGGGACACGCCAAGGAGACTGGAGAGAAAGCCATTGCTGAAGCCATAAAGAAAGCCCAAGAGTCAGGGGACAAAAAGATGAAGGAAATCACTGAGACAGTGACCAACACAGTCACAAATGCCATCACCCATGCAGCAGAGAGTCTGGACAAACTTGGACAGtgagtgcacctgctaccacggcccttccccagtctcaataaaaagccatgacatgtg
この配列をコードする部分すなわちこの配列が翻訳された部分は下線部であり、ヌクレオチド約267個を含む。配列番号4のこの特定の部分は、配列番号5で示した。
翻訳されたこのヌクレオチド267個は、アミノ酸89個を含むタンパク質を生じさせ、これは以下の配列(配列番号6で示される)を有することは当業者には明らかであろう。
配列番号6
MLGGLGKLAAEGLAHRTEKATEGAIHAVEEVVKEVVGHAKETGEKAIAEAIKKAQESGDKKMKEITETVTNTVTNAITHAAESLDKLGQ
配列番号7
GtgactggctgctgtctctagttgttgaggcctcttgggatctyggcgctmacmccwtgctytagwgactccgatagctcccrmggctccagtgsasmcctcggkcggnggnagggaaaaggcacttgctggtagctctgctcacccgcactgggacctggagctggaggactaagaagacagacggctgctgcttgccacagcctggaccATGGACCCCCATGAGATGGTTGTGAAGAATCCATATGCCCACATCAGCATTCCTCGGGCTCACCTGCGCTCTGACCTGGGGCAGCAGTTAGAGGAGGTTCCTTCTTCATCTTCCTCCTCTGAGACTCAGCCTCTGCCTGCAGGAACATGTATCCCAGAGCCAGTGGGCCTCTTACAAACTACTGAAGCCCCTGGGCCCAAAGGTATCAAGGGCATCAAGGGTACTGCTCCTGAGCACGGCCAGCAGACCTGGCAGTCACCCTGCAATCCCTATAGCAGTGGGCAACGTCCATCGGGACTGACTTATGCTGGCCTGCCACCTGTAGGGCGTGGTGATGACATTGCCCACCACTGCTGCTGCTGCCCTTGCTGCTCCTGCTGCCACTGTCCTCGCTTCTGCCGTTGTCACAGCTGTTGTGTTATCTCCtagctgactattgaacctccagggctgtgcagcccaggttcctgctcaatgccaaagtgttgctggacatcaggagcagccgttgtcatgagcatcagccatttcctgccctgagcaggggagcctgtccaccagcgttcagctgtagccttctggaatagggttccagccactagccatgttggcaacaacagggacacccttcacgtcctgcaagactttggcaataaagcaggatgagcgttgctgnncctgntgaaaanaaamwaaawacwgccgttgtcacarcygttrtgttatctmmkagstgacwattgtaammtycagrgctgtrmagcccrggkksckgctcaatgccaaagtgttgmtgsmcmtcrggrgsrgccaagctttacgcggtacccgggattttttttgtacaaaaaggggccccctattagg
翻訳されたこのヌクレオチド426個は、アミノ酸142個を含むタンパク質を生じさせ、これは以下の配列(配列番号9で示される)を有することは当業者には明らかであろう。
配列番号9
MDPHEMVVKNPYAHISIPRAHLRSDLGQQLEEVPSSSSSSETQPLPAGTCIPEPVGLLQTTEAPGPKGIKGIKGTAPEHGQQTWQSPCNPYSSGQRPSGLTYAGLPPVGRGDDIAHHCCCCPCCSCCHCPRFCRCHSCCVIS
配列番号10
cttgaacccgggaggcagaggttgcagtgagccgagatcgcgcagctgcactccagcctgggcaacagagcaagactccatctcagaaaagaagcagaaagcctccaagagccaatggctctcaagcatcttggtctctgctaagaagaggctcagaggcttagaagccctgcctcgccggggctttgaggtgtgtgagcaatggctggggactgcaggcccgggaatctgagggcctcaccccacttcctttccagagccgtgacctcaggctcacctcctgccctcctctcaggcaagctgcagatgccctttagggcccaggccatgccccggatgtgaggggctgagtcactggtttggcagtgcccctcagagcccaggcctgggctgccacccacctgaggacgagggctgggccagctgtcgtgctccagttgctggggcctcttgggatcttgggaaccccatctctgagccccgccccATGGCCCCGCCCCTCCCAAGGAGGGAAAAGGCGGCTGCCAGTCGCTCAACTCAGGCACTGGGACCTAGAGCTCAGAAGACCGAGAGGACAGACTGCCGTGTTGCCACCACAGGCTGGACCATGGACCCCCAAGAGATGGTCGTCAAGAACCCATATGCCCACATCAGCATCCCCCGGGCTCACCTGCGGCCTGACCTGGGGCAGCAGTTAGAGGTGGCTTCCACCTGTTCCTCATCCTCGGAGATGCAGCCCCTGCCAGTGGGGCCCTGTGCCCCAGAGCCAACCCACCTCTTGCAGCCGACCGAGGTCCCAGGGCCCAAGGGCGCCAAGGGTAACCAGGGGGCTGCCCCCATCCAGAACCAGCAGGCCTGGCAGCAGCCTGGCAACCCCTACAGCAGCAGTCAGCGCCAGGCCGGACTGACCTACGCTGGCCCTCCGCCCGCGGGGCGCGGGGATGACATCGCCCACCACTGCTGCTGCTGCCCCTGCTGCCACTGCTGCCACTGCCCCCCCTTCTGCCGCTGCCACAGCTGCTGCTGCTGTGTCATCTCCtagcccagcccaccctgccagggccaggacccagacttcagcaaatgtggctcacacagtgccgggacatgccgggacatgcggggtggctgttgtcatgggcgtctgccccttcacaccaggcactggggctcagacccaccaggaaggtggccgttcagcccgagctcctgaaacggaatcccaggtcctggctggagagggacacccctgattaccttaaggcccaggcaataaagcagggtgatcttc
翻訳されたこのヌクレオチド552個は、アミノ酸184個を含むタンパク質を生じさせ、これは以下の配列(配列番号12で示される)を有することは当業者には明らかであろう。
配列番号12
MAPPLPRREKAAASRSTQALGPRAQKTERTDCRVATTGWTMDPQEMVVKNPYAHISIPRAHLRPDLGQQLEVASTCSSSSEMQPLPVGPCAPEPTHLLQPTEVPGPKGAKGNQGAAPIQNQQAWQQPGNPYSSSQRQAGLTYAGPPPAGRGDDIAHHCCCCPCCHCCHCPPFCRCHSCCCCVIS
当業者は、上で詳述したヒトおよびマウスR2R1/2遺伝子に相同性を示す遺伝子が、例えば他の哺乳動物種を含む多くの異なる種において見出され得ることを容易に理解するであろう。相同遺伝子は、配列相同性または同一性をおおよそ20または30%しか示さない場合もある。しかしながら、別の場合では、相同遺伝子は、上で示した種々のヌクレオチド配列に少なくとも40、50、60、6570、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%の相同性を示す場合もある。このように、他の種からの相同遺伝子は、本発明の範囲に含まれるものとする。
本明細書に記載の種々の核酸およびアミノ酸配列を用いれば、当業者は、他の種、例えば他の哺乳動物などにおける関連する配列を容易に同定することができるであろう。例えば、特定の種から得られる核酸は、相同なまたは密接に関連した配列のための本明細書に記載のプローブを用いてプローブすることができる。
さらに、配列番号3、6、9および12によってコードされるタンパク質のいずれかと相同な/同一であるタンパク質、ポリペプチド/ペプチドもまた本発明の範囲内である。本明細書に記載の配列のいずれかと相同または同一であるとみなされるタンパク質またはポリペプチド/ペプチド配列は、配列同一性/相同性を20%または30%しか示さない場合もある。しかしながら、相同な/同一の配列は、少なくとも40、50、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99%相同または同一である場合もある。本発明が、本明細書に記載のタンパク質またはポリペプチド/ペプチド配列のいずれかの断片に関する限り、断片はだいたい約10アミノ酸からn-1アミノ酸(ここで“n”は、全配列のアミノ酸数である)を含むことができることを理解すべきである。例えば、断片は、約10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120または約125アミノ酸(アミノ酸の最大数は、全配列のアミノ酸数によって決められる)を含むことができるが、このような断片/部分はペプチド断片と呼ぶことができる。一実施形態において、該ペプチド断片は抗原性および/または免疫原性であることができる。すなわち、それらは、天然(完全)抗原、例えば配列番号3、6、9および12によってコードされる抗原に特異性、親和性および/または選択性を示す抗体に結合する能力を保持する。
このように、すべてのこのようなバリアント、特に機能しうるかまたは所望の活性を示すバリアントは、本発明の範囲に含まれることが理解されなければならない。
これに加えて、あるいはこれに代えて、本明細書に記載の種々のペプチドのアナログは、その一次配列に1以上の保存的アミノ酸置換を導入することによって製造することができる。用語“保存的置換”は、同様な特性を有する代わりのアミノ酸でタンパク質またはペプチドの1以上のアミノ酸を置換する行為であって、天然(または野生型)タンパク質の物理化学的特性および/または構造または機能を実質的に変えない行為を含むことを意味することを、当業者は理解するであろう。このタイプのアナログもまた、本発明の範囲に含まれる。
当該分野で公知のように、遺伝コードの縮重は、一次アミノ酸配列を変化させずに、コドンにおける1以上の塩基の置換を可能にする。その結果として、本願に記載の配列は、本明細書に記載のR2R1/2タンパク質をコードすることが知られているとはいえ、コードの縮重を用いて、同じ一次アミノ酸配列をコードするバリアント核酸配列を得ることができる。
特定の実施形態において、本発明は、細胞移行事象、例えば、間葉上皮移行(MET)事象および、逆のプロセスである上皮間葉移行(EMT)に関与する事象の調節に使用するためのR2R1/2遺伝子および/またはR2R1/2タンパク質を提供することができる。
他の側面において、本発明は、心疾患の治療に使用するためのR2R1遺伝子および/またはタンパク質を提供する。一実施形態において、R2R1遺伝子および/またはタンパク質は、心臓細胞/組織の発生/構造、分化、増殖および/または形態形成に影響を及ぼす疾患の治療に使用することができる。一実施形態において、本発明は、心室中隔の発生および/または形成に影響を及ぼす疾患および/または状態の治療に使用するためのR2R1遺伝子および/またはタンパク質を提供することができる。
他の側面において、本発明は、癌の治療に使用するためのR2R1遺伝子および/またはタンパク質を提供する。一実施形態において、R2R1遺伝子および/またはタンパク質は、例えば、肺および/または心臓組織を含む種々の組織に影響を及ぼす癌を治療するため使用することができる。より一般的には、本発明は、異常/欠損MET/EMTプロセスを含む任意の癌の治療に広げることができる。本発明の遺伝子および/またはタンパク質を用いて治療することができる癌の少なくとも一部の例は、以下に詳述される。
用語“心疾患”または“心臓状態”は、心臓の病状、例えば心臓の発生または心臓組織の3D構造に影響を及ぼす病状を含むことができる。心疾患は、心臓の形態形成経路および事象、特に間葉上皮移行および上皮間葉移行に影響を及ぼす疾患を含むことができる。具体例として、疾患、例えば心房および心室中隔欠損、房室管型欠損、心臓(房室)弁および冠動脈の奇形は、本明細書に記載の化合物を用いて治療することができる。
R2R1/2タンパク質および遺伝子は、上皮間葉移行および間葉上皮移行の番人(gatekeeper)として肺および心臓の形態形成事象に重要な役割を果たしている。従って、それらは、癌の生物学および癌治療に応用されることができる。例として、疾患、例えば限局性癌の癌転移へのトランスフォーメーションは、本明細書に記載の化合物を用いて治療することができる。
本明細書に記載のR2R1/2遺伝子および/またはタンパク質を含む種々の使用および医薬を提供することに加えて、本発明はまた、上記で概説した心臓/肺疾患および/または状態のいずれかを含む、本明細書に記載の疾患および/または状態のいずれかを患っている被験者の治療方法を提供する。このように、本発明の第3の側面は、心臓/肺疾患および/または状態の治療方法であって、それを必要とする被験者に、本明細書に記載のR2R1および/またはR2R2遺伝子ならびに/あるいはR2R1および/またはR2R2タンパク質の治療的有効量を投与するステップを含む前記方法を提供する。
本明細書に記載の使用、医薬および治療法は、組換えR2R1/2遺伝子/タンパク質の製造を必要とする場合があることは明らかであろう。そのようなものとして、本発明はさらに、組換えR2R1/2遺伝子および/またはタンパク質の製造方法および/または発現方法を考える。PCR技術を利用して、肺組織などの種々の起源からR2R1/2遺伝子配列を選択的に得ることができることは、当業者には明らかであろう。これらの配列と、種々の発現制御配列または調節制御配列、例えば、プロモーター、オペレーター、誘導物質、エンハンサーおよび/またはサイレンサーエレメント、リボソーム結合部位ならびに/あるいはターミネーター配列とをライゲーションすることができる。当業者は、任意の所定の宿主のために、適切な調節制御配列または発現制御配列を選択することができる。他の実施形態において、PCR由来R2R1/2遺伝子配列をベクター(例えばプラスミドまたは発現カセット)に導入することができる。一実施形態において、前記ベクターはさらに、タンパク質精製法を助けるためのタグまたは標識のヌクレオチド配列を含むことができる。
このようにして製造された組換えタンパク質を精製するために用いられる技術は公知であり、組換えタンパク質がタグを付けられているかまたは標識されている場合、それらの技術はアフィニティークロマトグラフィー技術などの使用を含むことができる。
上記を考慮して、本発明の第4および第5の側面は、それぞれ、R2R1/2遺伝子配列を含む発現ベクターおよびそれによって形質転換された宿主細胞を提供する。
上記を考慮して、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび/またはsiRNA分子は、(i)本明細書に記載の疾患および/または状態のいずれかの治療、特に(ii)肺疾患および/または障害の治療、(iii)心疾患および/または状態の治療ならびに(iv)癌の治療のために使用することができる。さらにまた、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび/またはsiRNA分子は、上記の(i)〜(iv)で概略を述べた疾患を治療するための医薬の製造または、このような疾患および/または障害を患っている被験者の治療方法に使用することができる。
本明細書に記載の疾患および/または状態(例えば心臓および/または肺の状態および/もしくは障害または癌)の治療に有用な他の化合物は、例えばタンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物および他の有機小分子を含むことができる。
上記に加えて、単離されたR2R1/2ヌクレオチドおよび/またはタンパク質配列は、ex vivoおよび/またはin situでの検出および発現試験に使用するためのプローブおよび/またはプライマーの設計のための基礎として用いることができる。典型的な検出試験は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ハイブリダイゼーション試験、配列決定プロトコルならびに免疫学的および/またはサザン/ノーザンブロット法検出技術を含む。
前記の検出および/または発現試験において、原則として、前述の配列から設計された任意のポリヌクレオチド(もしくはオリゴヌクレオチド)またはポリペプチド断片を用いることができる。
プライマー/プローブ配列の注意深い選択およびストリンジェントな(好ましくは高ストリンジェントな)ハイブリダイゼーション条件の使用によって、任意の非選択的結合が最少化されることは、容易に理解されるであろう。
従って、本明細書に記載のヌクレオチド配列の全部または一部に対して少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%または少なくとも95%の相補性を有するオリゴヌクレオチドプローブおよび/またはプライマー配列ばかりでなく、それらに対して正確な(すなわち100%の)相補性を有するものもまた、本発明の範囲に含まれるとみなされなければならない。
本明細書に開示されたアミノ酸配列の全部または一部に対して少なくとも30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の同一性を有するポリペプチドプローブばかりでなく、それらに対して正確な(すなわち100%の同一性)を有するものもまた、本発明の範囲に含まれるとみなされなければならない。
他の側面において、本発明は、肺疾患もしくは状態および/またはそれらに対する罹病性の診断方法であって、被験者におけるR2R1および/またはR2R2遺伝子が異常に発現されているかどうかを決定することを含む前記方法を提供する。
癌および/または心臓および/または肺の疾患および/または状態などを患っていると診断された被験者は、異常な(すなわち増加したまたは減少した)R2R1および/またはR2R2遺伝子/タンパク質の発現を示すことができる。用語“発現異常”は、健常被験者または、疾患および/または状態(すなわち心臓または肺の疾患および/もしくは状態または癌)を患っていない被験者由来の試料中の発現に対して増加したおよび/または減少した遺伝子発現レベルを含むと理解されなければならない。
試料、例えば上記の試料中のタンパク質および/または遺伝子、例えばR2R1/2遺伝子および/またはタンパク質のレベルを同定するために用いることができる技術は、当業者には明らかであろう。
典型的には、cDNAは、特定の配列に特異的にハイブリダイズするように設計されたプライマーを用いて増幅され、PCRに用いられるヌクレオチドは、蛍光性または放射性標識化合物によって標識されることができる。
PCR中に生成されるDNAの量の定量を可能にするための標識したヌクレオチドを用いる技術は、当業者には明らかであろう。簡潔に言えば、例として、標識し増幅した核酸の量は、PCRのサイクリング中に取り込まれた標識ヌクレオチドの量をモニタリングすることによって決定することができる。
本明細書に記載のPCRベースの技術に関するさらなる情報は、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Second Edition Edited by Carl W. Dieffenbach & Gabriela S. Dveksler: Cold Spring Harbour Laboratory Press and Molecular Cloning: A Laboratory Manual by Joseph Sambrook & David Russell: Cold Spring Harbour Laboratory Press において見出すことができる。
これに加えて、あるいはこれに代えて、R2R1および/またはR2R2遺伝子の発現レベルは、マイクロアレイ解析によって同定することができる。このような方法は、R2R1および/またはR2R2遺伝子由来の核酸を含むDNAマイクロアレイの使用を含むであろう。R2R1および/またはR2R2遺伝子の発現レベルを同定するために、当業者は、核酸、好ましくは、本発明の第1の側面に記載の方法に供した系(細胞ベース系または無細胞系)からのmRNAを抽出し、それを増幅プロトコル、例えば逆転写酵素PCRにかけてcDNAを生成させることができる。好ましくは、特定のmRNA配列、本例においてはR2R1および/またはR2R2遺伝子をコードする配列に特異的なプライマーを用いることができる。
上記の技術に関するさらなる情報は、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Second Edition Edited by Carl W. Dieffenbach & Gabriela S. Dveksler: Cold Spring Harbour Laboratory Press and Molecular Cloning: A Laboratory Manual by Joseph Sambrook & David Russell: Cold Spring Harbour Laboratory Press において見出すことができる。
試料中のR2R1/2タンパク質のレベルを決定するために、R2R1/2タンパク質に結合することができる薬剤を利用する免疫学的技術を用いることができる。
適切な支持体は、例えば、ガラス、ニトロセルロース、紙、アガロースおよび/またはプラスチックを含むことができる。プラスチック材料などの支持体は、マイクロタイタープレートという形をとることができる。
あるいは、検査試料と接触させる支持体は、R2R1/2タンパク質(単数または複数)に結合することができる薬剤を含むことができる。好ましくは、R2R1/2タンパク質に結合することができる薬剤は、支持体(または少なくともその一部)に結合されている。適切な結合剤は、例えば、R2R1/2タンパク質に結合することができる抗体、例えばモノクローナルもしくはポリクローナル抗体および/または他の種類のペプチドもしくは小分子を含むことができる。この定義は、本明細書に記載のすべてのタイプの結合剤に適用されることが理解されるべきである。このように、支持体(またはその一部)は、R2R1/2タンパク質と結合することができる薬剤と試料中に存在する任意のR2R1/2タンパク質との間の結合または相互作用を可能にする条件下で検査試料と接触させることができる。
一次結合剤は、検出されることを可能にする部分(以下“検出可能部分”と呼ぶ)と結合することができる。例えば、この一次薬剤は、比色化学発光反応によってレベルを報告する酵素と結合することができる。このような複合酵素は、限定するものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)およびアルカリホスファターゼ(AlkP)を含むことができる。これに加えて、あるいはこれに代えて、一次結合剤は、蛍光分子、例えば蛍光発色団、例えばFITC、ローダミンまたはテキサスレッドなどと結合させることができる。結合剤に結合させることができる他の種類の分子は、放射性標識部分を含む。
R2R1/2タンパク質(単数または複数)に結合した一次結合剤(または、それらに対して結合した二次結合剤)の量は、試験される試料中に存在するR2R1/2タンパク質(単数または複数)のレベルを表すことができる。
一実施形態において、R2R1/2タンパク質のレベルを同定する方法は、支持体(またはその一部)と検査試料とが、試料中に存在する任意のR2R1/2タンパク質(単数または複数)の、それらに対して結合または固定される支持体または結合剤との結合を可能にする条件下で接触させる“ディップスティック”試験という形をとることができる。
他の実施形態において、本方法は、例えば酵素免疫測定法(ELISA)などの免疫学的アッセイという形をとることができる。ELISAは、検査試料が支持体と接触され、試料中に存在する任意のR2R1/2タンパク質(単数または複数)が、支持体に結合または固定された結合剤(R2R1/2タンパク質に結合することができる)によって“捕捉される”かまたは結合される“捕捉”ELISAという形をとることができる。あるいは、該試料は、試料中に存在する任意のR2R1/2タンパク質(単数または複数)と支持体との間の“直接”結合を可能にする条件下で支持体と接触させることができる。
“直接”ELISAは、検査試料と支持体とを、試料中に存在する任意のR2R1/2タンパク質(単数または複数)の、それらに対する支持体および/または結合剤との結合を可能にする条件下で接触させることを含むことができる。任意のブロッキングステップ後、結合したR2R1/2タンパク質(単数または複数)は、R2R1/2タンパク質に結合することができる薬剤(すなわち一次結合剤)を用いて検出することができる。好ましくは、一次結合剤は検出可能部分に結合される。
“間接”ELISAは、R2R1/2タンパク質(単数または複数)と一次結合剤とを接触させた後に、一次結合剤に親和性または特異性を有するさらなる結合剤(二次結合剤)を用いるさらなる段階を含むことができる。好ましくは、二次結合剤は、検出可能部分に結合されることができる。
あるいは、検査試料は、試料をR2R1/2タンパク結合剤と接触させた後、R2R1/2タンパク結合剤に特異的な、またはそれに親和性を有する、またはそれに結合することができるさらなる結合剤(二次結合剤)を用いてR2R1/2タンパク質/結合剤複合体を検出する間接免疫組織化学染色プロトコルに供されることができる。
直接および間接免疫組織化学技術のいずれにおいても、結合剤または二次結合剤は検出可能部分に結合されることができることは、当業者には明らかであろう。好ましくは、結合剤または二次結合剤は、比色化学発光反応によって、結合された結合剤または二次結合剤のレベルを報告することができる部分に結合される。
R2R1/2タンパク質に結合することができる薬剤の使用を利用する他の技術は、例えば、ウェスタンブロットまたはドットブロットなどの技術を含む。ウェスタンブロットは、試料を電気泳動にかけて、試料のタンパク質成分などを成分に分離または分割することを含むことができる。分割された成分は、次いで、支持体、例えばニトロセルロースに移行させることができる。試料中に存在する任意のR2R1/2タンパク質(単数または複数)を同定するために、試料中に存在する任意のR2R1/2タンパク質(単数または複数)とR2R1/2タンパク質(単数または複数)に結合することができる薬剤と間の結合を可能にする条件下で支持体をR2R1/2タンパク質(単数または複数)に結合することができる結合剤と接触させることができる。
あるいは、支持体は、R2R1/2タンパク質(単数または複数)に結合することができる結合剤(単数または複数)に親和性を有するさらなる結合剤と接触させることができる。好都合には、さらなる結合剤は検出可能部分に結合されることができる。
ドットブロットの場合は、試料またはその一部は、試料中に存在する任意のR2R1/2タンパク質(単数または複数)が支持体に結合されるかまたは固定されるように支持体と接触させることができる。結合されるかまたは固定される任意のR2R1/2タンパク質(単数または複数)の同定は、前述のように行うことができる。
上述の技術のいずれかにおいて、検出された一次結合剤または二次結合剤の量は、試料中に存在するR2R1/2タンパク質の量を表すかまたはそれに比例する。さらにまた、本明細書に記載の診断法の全部または一部から得られた結果は、特定の疾患または障害(例えば心臓および/または肺の疾患もしくは障害および/または癌など)を患っていないかまたはそれに罹患しやすくないことが知られている健常被験者由来の参照または対照試料から得られた結果と比較されることができる。
方法、例えば本発明のこの第9の側面に記載の方法は、系、例えば、R2R1および/またはR2R2遺伝子を含むように改変された細胞ベース系または無細胞系などにおいて行うことができることは当業者には明らかであろう。例として、細胞は、R2R1またはR2R2遺伝子のいずれかを含む核酸でトランスフェクトされることができる。一実施形態において、該核酸はベクター(例えば前述のプラスミドまたは発現カセット)という形をとることができる。
適切な試験薬剤は、核酸、例えば前述のアンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、抗体(およびその断片)、炭水化物ならびに他の有機小分子という形をとることができる。
さらなる側面において、本発明は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と共に、前述のR2R1/2遺伝子/タンパク質、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド(DNAもしくはRNA)および/または、本発明の第9の側面によって提供される方法によって同定され、R2R1および/またはR2R2遺伝子/タンパク質の発現または機能を調節することができる薬剤のいずれかを含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、例えば、心臓および/または肺の疾患および/または前述の癌を含む本明細書に記載の種々の疾患および/または状態の治療に適用されることができる。
前記医薬製剤は、例えば、経口、非経口または局所投与に適した形で処方されることができる。一実施形態において、医薬組成物は、それが吸入されることができるように処方されることができる。吸入によって投与される組成物は、エアロゾル化され液滴で吸入されることができる微細粉末または溶液という形をとることできる。吸入などによって組成物を肺に直接に送達するために用いることができる装置は、当業者にはよく知られているであろう。該組成物の液滴または粒度は、肺の種々の領域に薬物が到達することができるように変えることができる。例えば、ひとたび吸入されれば、小粒子または液滴は肺組織深部に達し、場合によっては肺胞に到達することができる。
局所投与のために処方される医薬組成物は、水性もしくは非水性液体での軟膏、溶液または懸濁液として、あるいは水中油型液体エマルションとして提供することができる。
細胞(例えば肺上皮細胞)の分化を調節する化合物は、障害、例えば損傷を受け、乏しいかまたは不十分な再生能を示す瘢痕化した肺を生じるBPDの治療に特に有用であることができる。このように、細胞分化を調節する化合物を投与または使用することによって、肺の再生能を改善または復帰させることを可能にすることができる。R2R1および/またはR2R2遺伝子の発現を増強または促進することができる化合物あるいはこれらの遺伝子の機能を復帰させる化合物は特に有用であることができることを、当業者は容易に理解するであろう。
ここで、以下の図面を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。
wt/wt=ホモ接合型野生型(Vegf+/+)、120/wt=ヘテロ接合型Vegf120/+、120/120=ホモ接合型Vegf120/120ノックアウト(NG=胎生学的形態が不十分なため遺伝子型が決定されなかった)
VEGFマウスノックアウトモデルにおいて、R2R遺伝子、転写物およびそれぞれのタンパク質を見出した。Vegf120/120ノックアウトマウスは、Vegf164およびVegf188アイソフォームを産生することができない(Vegf164はヒトVEGF165のホモログである)。Vegf120/120ノックアウトマウスの肺は出生時に発育不全であり、Vegf120/120ノックアウト胚の肺において末梢気道および血管分化は重度の障害を受ける。ゲノミクスアプローチによって、マウスにおけるVegf164およびヒトにおけるVEGF165は、大変特殊な遺伝子発現プログラムを駆動するという発見がもたらされた。このプログラムは2つの構成要素からなる。第一構成要素は、気道上皮の基底細胞の(再)生成である。基底細胞は、少なくとも近位気道の細胞集団の起源である。基底細胞はまた、ヘミデスモソームおよび局所接着結合を築くことによって強固な細胞間結合を生じさせる。基底細胞は、中間径フィラメントタンパク質KRT14およびKRT5によってそれらの細胞内構造を強化する。これらの2つのタンパク質は(ヘミ)デスモソームへ接着される。
マウスにおけるVegf164およびヒトにおけるVEGF165によって駆動される遺伝子発現プログラムにおいて、2つの新規遺伝子(R2R1およびR2R2)を見出した。これらの新規遺伝子、それらの転写物および翻訳されたタンパク質は、基底および扁平遺伝子発現プログラムの遺伝子およびそれらの下流産物には関連しない。
これらの遺伝子が基底および扁平分化プログラムの重要なモジュレーターであることを明らかにするために実験を試みた。これらの実験の最も重要な発見の1つは、これらの遺伝子が細胞におけるHIF1αおよびPERP発現の重要なモジュレーターであることである。我々の実験において、R2R遺伝子は正の調節因子であり、この機構を妨害することによって、癌治療の治療の可能性が開かれる。
マウス胚および組織調製
すべての動物実験は、ライデン大学医療センターの動物倫理委員会(Animal Ethics Committee of Leiden University Medical Center)に承認され、NIHによって発表された実験動物の管理と使用に関する指針(Guide for the Care and Use of Laboratory animals)に従って行った。ヘテロ接合型Vegf+/120マウスを交配させてVegf120/120胚およびVegf+/+野生型同腹子を得た。膣栓が認められた日の午前を胎生0.5日目(embryonic day(E)0.5)と定義した。頸椎脱臼によって妊娠雌を屠殺した。E12.5、14.5および16.5胚を滅菌PBS中に分離した。RNアーゼ不含条件下で胚の胸郭を注意深く切開し、組織冷凍培地(tissue freezing medium)(TBS、Triangle Biopmedical Sciences社、ダラム、ノースカロライナ州)中に入れ、凍結し、-80℃で保存した。胎齢および母親由来に従った胚の分布を表S1に示す。
クリオスタット切片(8μm)を切り、SuperFrost Plus顕微鏡スライド(Menzel Gmbh&Co KG、ブラウンシュヴァイク、ドイツ)に接着させた。種々の胎齢の胚の胸郭の切片化およびさらなる免疫組織化学処理は無作為に行った。
心臓の両心室レベル断面において、各胚の胸郭から3つの組織切片を選択した。これらを1バッチで免疫組織化学的に処理した。-80℃フリーザーから取り出してから2分の間に、スライドを冷アセトン(4℃)中に入れてクリオスタット切片を固定した。すべてのさらなる免疫組織化学ステップを4℃で行い、すべての緩衝液および抗体溶液を4℃に保った。所望の緩衝液でRNAsecure(25x、AM7006、Ambion社、テキサス州)を1xに希釈することによってRNアーゼ不含PBSまたはD-PBS緩衝液を調製した。すべての抗体溶液はPBSで調製したが、イソレクチンGS-IB4複合体はD-PBSで希釈した。最終濃度1U/μlでSuperase.In(AM2696、Ambion社、オースティン、テキサス州)を各抗体溶液に加えた。スライドを風乾し、撥水ペン(hydrophobic barrier pen)で組織切片を境界線で囲んだ。冷金属ブロック(4℃)上にスライドを乗せた後、PBS30μlを各組織切片に塗布し、水気を切った。続いて、濃度10μg/100μlのマウス抗pan keratin(4、5、6、8、10、13、18)モノクローナル抗体(MAB1636、Chemicon社)30μlを試料に滴下した。2分後に抗体溶液を切り、組織切片をPBS250μlで穏やかにリンスした。次いで、濃度10μg/100μlのAlexa-fluor-488ニワトリ抗マウスIgG(H+L)複合体(A21200、Invitrogen社、カリフォルニア州)30μlを2分間塗布し、次いで再度PBS250μlで穏やかに洗浄した。最後に、濃度10μg/100μlのイソレクチンGS-IB4 Alexa Fluor 594複合体(I21413、Invitrogen社、カリフォルニア州)30μlでの2分間の染色の第3サイクルによって染色手順を完了させた。組織切片を室温で75%EtOH(30秒)、95%EtOH(30秒)、100%EtOH(30秒)、100%EtOH(120秒)、キシレン(180秒)で脱水した。脱水ステップの直後に、Veritas Microdissection Instrument(Arcturus Bioscience社、マウンテンビュー、カリフォルニア州)でレーザー補足マイクロダイセクションを行った。我々は、心臓の両心室レベル断面における3つの組織切片の胚肺における肺内気道または血管から3x300〜400細胞(3連試料で)を切開した。マウス抗pan keratinモノクローナル抗体/ニワトリ抗マウスIgG Alexa-fluor-488複合体からの細胞染色は、緑色蛍光性細胞として同定された(青色フィルター)。これらの緑色蛍光性細胞は気道上皮細胞(ker+細胞)を示し、それらの近位または遠位気道形態にかかわらず、無作為に切開した。イソレクチンGS-IB4 Alexa-fluor-594複合体の細胞染色は赤色蛍光性細胞(緑色フィルター)として同定される。これらの細胞を、内皮の特徴を有する間葉細胞(il+細胞)と定義した。3つの胚時点(E12.5、14.5、16.5)では、両方のマーカーに関する細胞の染色は観察されなかった。実際、緑色および赤色蛍光性細胞は、互いにポジ像/ネガ像として観察することができた。マイクロダイセクションされたker+またはil+細胞は、0.14M β-メルカプトエタノールおよびポリイノシン酸(Sigma社)200ngを含むRNeasy溶解緩衝液(RLT;Qiagen社、ヒルデン、ドイツ)75μlで充填されたGene Ampチューブ(Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州)中に採取された。
レーザー捕捉された試料を42℃で20分間インキュベートし、次いで氷冷した。さらなる処理まで試料を-80℃で保存した。解凍後、等容量の70%エタノールを各試料に加え、次いでRNeasy MinEluteスピンカラム(Qiagen社)に移した。製造業者の使用説明書に従ってRNAをクリーンアップし、RNアーゼ不含水14μlで溶出し、真空乾燥によって4μlに調整した。十分な量のcRNAを生成させるためには、2ラウンドのリニアmRNA増幅が必要であった。2サイクルcDNA合成およびビオチン標識cRNAの合成は、GeneChip Eukaryotic Sample and Array Processing Manual(Affymetrix社、サンタクララ、カリフォルニア州)に従って行った。“スパイクイン(spike-in)”対照として、GeneChip Poly-A RNA対照キット(Affymetrix社)を用いた。MEGAscript T7キット(Ambion社、オースティン、テキサス州)を用いて、増幅の第1ラウンドにおいて第2cDNA鎖のin vitro転写を行い、aRNA 112〜457ngを得た。第1ラウンドのaRNA100ngから出発して増幅の第2ラウンドを行い、GeneChip in vitro転写(IVT)標識キットを用いてcRNA 11〜86μgを得た。標識RNAをマウスゲノムMG-430_2.0 GeneChipアレイ(Affymetrix社)にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、ビオチン標識RNA12.5μgを用い、連続回転下45℃で16時間行った。アレイは、Affymetrix Fluidicsステーションにおいてストレプトアビジン-フィコエリスリン(SAPE)を用いて染色し、次いで抗ストレプトアビジン抗体および二次SAPE染色で染色した。続いて、アレイをAgilent Laserscanner(Affymetrix社)で走査した。
Affymetrixプローブレベルデータは、FARMS(マイクロアレイロバスト集約のための因子分析)(Factor Analysis for Robust Microarray Summarization)1を用いて集約した。生の強度値をlog2変換して正規分布するデータを得た。第1に、高次元データ(n遺伝子対p試料)の複雑さを低減するために、教師なし多変量射影法(unsupervised multivariate projection method)であるスペクトルマップAnalysis2を適用した。Spectral Map Analysisは、データセット中に存在する遺伝子および被験者の主クラスターのバイアスのない同定を提供する。第2に、LIMMA(マイクロアレイデータのための線形モデル)(Linear Models for Microarray Data)3において、2つの細胞起源間の示差的遺伝子発現(ker+細胞対il+細胞)の試験を行った。なぜなら、この方法は遺伝子全体の情報を用いるため、少数のアレイを用いる実験であっても解析が安定に進められるからである3。第3に、再度LIMMAを用い、Vegf120/120ノックアウトと野生型同腹子との間の、胎齢を通じた発現プロファイルにおける差異を、Vegf遺伝子型と時間の二要因交互作用を通じて試験した。E12.5およびE14.5のデータをプールした。なぜなら、我々は、E16.5とE14.5およびE12.5の時間プロフィールの相違に唯一興味を持っていたからであった。この試験は、ker+およびil+試料に関して別々に行った。なぜなら、これらの2つの組織は同じ胚由来であったからである。LIMMAなどのモデルは、すべての試料が無作為に独立して採取されたと仮定する。もしker+およびil+が同時に解析されたとすれば、この依存状態の補正のために、複雑すぎるモデルを必要としただろう。組織型の単一の相互作用からのゲノム多様性(ker+試料対il+試料)もまたLIMMA解析によって担保されていない。全ゲノムに沿った示差的発現の割り付けは、MACT(Microarray Chromosome Analysis Tool)を用いて行った。
出生時には、肺において、O2およびCO2は、遠位気道および血管の広い界面の全域で交換される必要がある。マウスにおける胚肺発生は、E(=妊娠後日数)16.5に著しい変化をうける1。この時点において、絡み合った気道および脈管枝は、それらの遠位枝を増殖させ精密化させることによって急速に成長する。遠位気道または呼吸管は、出生前に薄肉の小嚢に再分裂することによって増殖する。これらの小嚢は、結局、出生後に肺胞へと分化する2。薄肉の気道は、ガス輸送を容易にするために平らな細胞を必要とする。従って、E16.5ごろに生じる平らな気道細胞への表現型分化は、胚肺発生において非常に重要な段階である。気道を覆う上皮細胞は、分枝中の前腸中胚葉由来のものである。E16.5から、遠位気道における上皮細胞は平らになることを開始するが、近位細胞はそれらの円柱状の形状を失わない。これらの細胞の最も遠位は、E18.5までには小嚢および肺胞を裏打ちし、平らなまたはさらには扁平な形態を発生させる。毛細血管は平らな内皮細胞で覆われ、脈管枝の遠位血管の役を果たす。肺血管を覆う内皮細胞は中胚葉間葉由来である。それらの増殖は、出生時にガス交換を開始するための広い肺胞毛細血管界面を提供するために、それらの上皮カウンターパートの増殖に密接に調和する必要がある。内胚葉由来気道上皮と周囲の中胚葉間葉との間の相互クロストークは、初期肺形態形成時に開始される3,4。E9.5に開始され、周囲の中胚葉における間葉細胞によって産生されるFgf10は、内胚葉分枝の最も重要な合図である。少なくともShh、Bmp、TGF-βおよびWntシグナル伝達因子との密接な相互作用は、この初期の分枝機構を調節する。しかしながら、E16.5における、その後の細胞の表現型の変化および上皮-内皮クロストークを支える分子機構はあまりわかっていない。
マウス胚において、中間径フィラメント遺伝子群のVEGF-A(マウスアイソフォームVegf164=アイソフォームVEGF165)依存性発現が確認された。これらの中間径フィラメント遺伝子の発現は、肺間葉細胞における肺上皮細胞の分化および基底細胞プログラムの発達をもたらす。
さらにまた、中間径フィラメント遺伝子のVEGF-A(マウスアイソフォームVegf164=アイソフォームVEGF165)依存性発現が、成人のヒト初代上皮細胞においても確認された。VEGF-AアイソフォームVEGF165によるこれらの細胞の刺激は、中間径フィラメント遺伝子発現のアップレギュレーションをもたらす。これらの細胞における中間径フィラメント遺伝子発現は、アイソフォームVEGF165特異的siRNAによってダウンレギュレートされる。要約すれば、中間径フィラメント遺伝子の発現は、気道の分化および再生のパラダイムとして役立つ。R2R1およびR2R2は、この発現プログラムにおいて特異的役割を果たす。
R2R1の発現は、マウスにおいてVEGF-A(マウスアイソフォームVegf164=ヒトアイソフォームVEGF165)依存性である。肺の間葉細胞(GS-IB4陽性染色細胞)は、基底上皮細胞遺伝子発現プログラムを獲得する。R2R1の発現は間葉上皮移行(MET)に必須である。
METにおけるR2R1の役割は、今回、肺よりも胚組織において確認された。心臓の心室中隔の完成はMETによって達成される。マウスにおいて、R2R1は発生中の心室中隔において強く発現されており、VEGF-A(マウスアイソフォームVegf164=ヒトアイソフォームVEGF165)依存性である。反対に、R2R1発現は発生中の右室流出路においては見られない。この構造の発達はMET非依存性であることが知られている(図12参照)。
R2R1は、間葉上皮移行のための、マウスおよびヒトにおける候補遺伝子である。この遺伝子の発現は、METにVEGF-A(マウスアイソフォームVegf164=ヒトアイソフォームVEGF165)効果を生じさせる。METの逆のプロセスはEMT(上皮間葉移行)である。EMTは癌の進展および転移の本質的部分である。従って、R2R1は、癌の生物学および治療において重要な役割を果たすことができる。
R2R2は、成人のヒト初代肺上皮細胞において大変強く発現されていることが見出された。in vitroでは、R2R1の発現は経時的にアップレギュレートされ、VEGF-A(アイソフォームVEGF165)依存性であることが見出された。R2R2タンパク質生成物は、成人肺上皮の正常な分化および維持にとって重要である(図13参照)。
Claims (12)
- (a)心疾患および/または状態;
(b)肺疾患および/または状態;ならびに
(c)癌;
からなる群から選択される1以上の疾患および/または状態の治療に使用するための、R2R1/2遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、R2R1/2遺伝子が、配列番号1、2、4、5、7、8、10および11に示される配列からなる群から選択される配列またはそれらに対して少なくとも60%同一の配列によってコードされる前記ポリヌクレオチド。 - (a)心疾患および/または状態;
(b)肺疾患および/または状態;ならびに
(c)癌;
からなる群から選択される1以上の疾患および/または状態の治療に使用するための、R2R1/2タンパク質を含むポリペプチドであって、R2R1/2タンパク質が、配列番号3、6、9および12に示される配列からなる群から選択される配列またはそれらに対して少なくとも60%同一の配列によってコードされる前記ポリペプチド。 - (a)心疾患および/または状態;
(b)肺疾患および/または状態;ならびに
(c)癌
からなる群から選択される1以上の疾患および/または状態の治療に使用するための、R2R1/2遺伝子の発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - R2R1/2タンパク質またはその断片に結合することができる抗体またはその抗原結合断片。
- R2R1/2タンパク質が、配列番号3、6、9および12に示される配列からなる群から選択される配列またはそれらに対して少なくとも60%同一の配列によってコードされる、請求項4に記載の抗体。
- (a)心疾患および/または状態;
(b)肺疾患および/または状態;ならびに
(c)癌
からなる群から選択される1以上の疾患および/または状態の治療に使用するための、請求項4または5に記載の抗体。 - (a)心疾患および/または状態;
(d)肺疾患および/または状態;
(c)癌;ならびに
(d)(a)〜(c)のいずれかの罹病性またはそれへの素因
からなる群から選択される1以上の疾患および/または状態の診断方法であって、検査される被験者によって提供される試料中のR2R1および/またはR2R2遺伝子発現のレベルを検出するステップを含む前記方法において、前記試料中のR2R1および/またはR2R2遺伝子レベルの異常の検出が、上記の(a)〜(c)に示される疾患および/または状態の1以上ならびに/あるいはその罹病性またはそれへの素因を示す前記方法。 - (a)配列番号1;2;4;5;7;8;10および/または11からなる群から選択される配列の全部または一部にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブおよび/またはプライマーの使用を含む、請求項7に記載の方法。
- R2R1および/またはR2R2遺伝子の発現を調節する薬剤の同定または製造方法であって、R2R1および/またはR2R2遺伝子と試験薬剤とを接触させ、R2R1/2遺伝子発現の調節を検出するステップを含む前記方法。
- 薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と共に、配列番号1、2、4、5、7、8、10および11によって提供されるR2R1/2遺伝子またはそれらに対して少なくとも60%同一の配列を含む医薬組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と共に、配列番号3、6、9および12によって提供されるR2R1/2タンパク質またはそれらに対して少なくとも60%同一の配列を含む医薬組成物。
- 心臓および/または肺の疾患または状態あるいは癌の研究のための動物モデルであって、R2R1/2遺伝子の調節または破壊によって作成された前記動物モデル。
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