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CN112710848B - Fgf10在制备诊断肺损伤试剂的应用 - Google Patents

Fgf10在制备诊断肺损伤试剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了FGF10在制备诊断肺损伤试剂的应用。本发明是首次发现FGF10，特别是FGF10、YKL‑40蛋白和AFP‑L3的组合能够作为诊断肺损伤，特别是慢性阻塞性肺炎的诊断标志物，能够有效提高慢性阻塞性肺炎的检测特异性。

Description

FGF10在制备诊断肺损伤试剂的应用
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体是FGF10在制备诊断肺损伤试剂的应用。
背景技术
呼吸系统疾病是一种常见病、多发病，主要病变在气管、支气管、肺部及胸腔，病变轻者多咳嗽、胸痛、呼吸受影响，重者呼吸困难、缺氧，甚至呼吸衰竭而致死。在城市的死亡率占第3位，而在农村则占首位。更应重视的是由于大气污染、吸烟、人口老龄化及其他因素，使国内外的慢性阻塞性肺病(简称慢阻肺，包括慢性支气管炎、肺气肿、肺心病)、支气管哮喘、肺癌、肺部弥散性间质纤维化，以及肺部感染等疾病的发病率、死亡率有增无减。
据2006年全国部分城市及农村前十位主要疾病死亡原因的统计数，呼吸系统疾病(不包括肺癌)在城市的死亡病因中占第四位(13.1％)，在农村占第三位(16.4％)。由于大气污染、吸烟、工业经济发展导致的理化因子、生物因子吸人以及人口年龄老化等因素，使近年来呼吸系统疾病如肺癌、支气管哮喘的发病率明显增加，慢性阻塞性肺疾病居高不下(40岁以上人群中超过8％)。肺结核发病率虽有所控制，但近年又有增高趋势。肺血栓栓塞症已经构成了重要的医疗保健问题，肺动脉高压近年来也日益受到关注。肺部弥漫性间质纤维化及免疫低下性肺部感染等疾病发病率日渐增多。艾滋病的主要死亡原因为肺部感染，特别是卡氏肺囊虫肺炎。从2002年底以来，在中国及世界范围内暴发的传染性非典型肺炎(严重急性呼吸综合征，SARS)疫情，由于多发生于中青年，其传染性强，病死率高，又缺乏针对性的药物，因而引起了群众的恐慌，同时给国民经济造成巨大损失。目前在多个国家出现的人禽流感病死率超过60％。而禽流感病毒侵人体内主要的靶器官也是肺。这正说明呼吸系统疾病对中国人民健康危害仍是很大的，其防治任务艰巨。
慢性阻塞性肺病(COPD)是不可逆的气流阻塞和气道炎症的肺损伤疾病，其严重程度通常是渐进性的，并且与吸烟或生物质污染物暴露有关。近年来严重影响到了人类的身体健康，患病几率大，据我国调查显示慢阻肺的患病率高达8.2％；且并发症较多，比如高血压、肺癌、骨质疏松、抑郁等疾病；致死率高，到2020年将成为全球第3大致死疾病；经济负担加重，世界卫生组织有资料表明2020年慢阻肺将居全球疾病第5位经济负担，严重影响患者的生存质量。肺泡灌洗液是直接接触COPD病灶部位的生物样品，能真实反映COPD病理生理过程中肺部的代谢物变化，基于代谢组学的方法表征COPD模型大鼠肺泡灌洗液中的代谢物轮廓，筛选鉴定出潜在生物标志物，为临床诊断治疗COPD做出理论参考。
目前，COPD的发病机制尚未完全阐明，现在普遍认为中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞引起的气道、肺实质及肺血管的慢性炎症使COPD的特征性改变。此外，蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化应激等也与COPD的发生发展密切相关，故据此将COPD相关生物学标志物分为：(1)炎症性生物学标志物，包括炎症细胞及炎症因子，如中性粒细胞、巨噬细胞、白介素(interleukin，IL)家族等如IL-2，IL-4，IL-6等，这类标志物虽然敏感性较强，但特异性较差；(2)蛋白酶和抗蛋白酶生物学标志，如细胞外基质蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)-8、MMP-9等；(3)肺源性标志物，如肺表面活性蛋白(surfactantprotein，SP)-D、Clara细胞蛋白(Claracellprotein，CC)16、趋化因子配体(CCChemokineLigand，CCL)-18等。后两类标志物在患者血清中和在肺泡灌洗液中检测结果差异较大，故有必要对COPD的标记物进行进一步的研究。因此，需要开发新的特异性好、稳定性好的新的标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺损伤诊断试剂，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明一方面涉及FGF10(成纤维细胞生长因子10)在制备诊断肺损伤试剂中的应用。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的肺损伤是慢性阻塞性肺炎(COPD)。
在本发明的另一个优选实施方式中，FGF10、YKL-40蛋白(人软骨糖蛋白)和AFP-L3(甲胎蛋白异质体)同时在制备诊断肺损伤试剂中的应用。
本发明另一方面还涉及一种诊断肺损伤的诊断试剂，其包括检测血清中FGF10、YKL-40蛋白(人软骨糖蛋白)和AFP-L3(甲胎蛋白异质体)浓度的试剂。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的检测血清中FGF10、YKL-40蛋白(人软骨糖蛋白)和AFP-L3(甲胎蛋白异质体)浓度的试剂为ELISA试剂盒。
本发明另一方面还涉及一种诊断慢性阻塞性肺炎的生物标志物，其包括FGF10、YKL-40蛋白和AFP-L3。
有益效果
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明是首次发现FGF10，特别是FGF10、YKL-40蛋白(人软骨糖蛋白)和AFP-L3(甲胎蛋白异质体)的组合能够作为诊断呼吸系统疾病，特别是慢性阻塞性肺炎的诊断标志物，能够有效提高慢性阻塞性肺炎的检测特异性。
附图说明
图1为实验小鼠血清中FGF10的浓度比较图。
图2为实验小鼠血清中YKL-40蛋白的浓度比较图。
图3为实验小鼠血清中AFP-L3的浓度比较图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1
吸烟诱导慢性阻塞性肺病大鼠模型是目前常用的研究该疾病的动物模型，适合用来研究慢性阻塞性肺病进展过程中病理生理及形态学的变化。
利用该动物模型模拟慢性阻塞性肺病的发病过程，观察疾病从发病到早期及不断进展的整体变化，对临床上早期诊断慢性阻塞性肺病、监测慢性阻塞性肺病的病情进展有重要的指导意义。
动物实验建模
模型构建：将被动吸烟组大鼠放入吸烟箱，每4只一组，采用香烟烟熏，每次被动吸烟6支，1支/10分钟，每次共计被动吸烟1小时，2次/天(间隔时间至少6小时)；对照组大鼠正常饲养，不加任何干预。
样本收集流程：被动吸烟共计8周，每吸烟一周便将大鼠置于代谢笼中收集尿液样本。同时收尿当天早晨测量模型组大鼠和正常大鼠的体重。
在大鼠被动吸烟8周后，将实施例1中的2只大鼠安乐死并开胸取肺组织用福尔马林固定，取左肺组织常规脱水、透明、浸蜡、包埋切成0.3-0.4mm厚的切片后，进行HE染色和AB-PAS染色，经HE染色检测，被动吸烟8周组大鼠肺部支气管粘膜上皮细胞变性、坏死、粘连、部分脱落、腔内分泌物滞留，说明慢性阻塞性肺病造模成功。经AB-PAS染色检测，被动吸烟8周组大鼠杯状细胞数目增多肥大，分泌亢进，说明慢性阻塞性肺病造模成功
试验方法与结果
将小鼠建模成功3h后，麻醉建模成功的小鼠和作为对照的健康小鼠，固定，摘眼球提取小鼠血标本，血标本采用ELISA(酶联免疫吸附剂测定)试剂盒方法检测FGF10、YKL-40蛋白(人软骨糖蛋白)和AFP-L3(甲胎蛋白异质体)的含量，具体检测方法为：
1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清。
2.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为6ng/L，4ng/L，2ng/L，1ng/L，0.5ng/L)。
3.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
4.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
5.配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。
6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
7.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
8.温育：操作同4。
9.洗涤：操作同6。
10.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
11.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
12.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
检测结果如图1～3所示，结果为：建模3h后在慢性阻塞性肺炎模型小鼠血清中发现FGF10明显减少，而YKL-40蛋白和AFP-L3都明显升高，表明在慢性阻塞性肺炎中，FGF10、YKL-40蛋白和AFP-L3的组合可以作为诊断标志物。
实施例2
选取2019年10月温州医科大学附属第一医院急诊留察室存在的慢性阻塞性肺炎的12例患者以及12例急性肺损伤患者作为阳性对照(备注：选取的所有患者均诊断明确)。分别采取离体血清标本以ELISA(酶联免疫吸附剂测定)试剂盒方法检测FGF10、YKL-40蛋白和AFP-L3，结果显示，12例慢性阻塞性肺炎患者中，FGF10低于正常值、YKL-40蛋白和AFP-L3超过正常值的为9例，另有2例为FGF10低于正常值，YKL-40蛋白同时超过正常值但AFP-L3正常,1例为FGF10低于正常值，YKL-40蛋白和AFP-L3正常。而作为阳性对照组的急性肺损伤患者中，没有1例同时满足FGF10低于正常值、YKL-40蛋白和AFP-L3同时超过正常值。由此说明，采用FGF10、YKL-40蛋白和AFP-L3作为慢性阻塞性肺炎的诊断标志物具有较高的特异性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (2)

1.FGF10、YKL-40蛋白和AFP-L3同时在制备诊断肺损伤试剂中的应用，所述的肺损伤是慢性阻塞性肺炎，所述试剂为检测血清中FGF10、YKL-40蛋白和AFP-L3浓度的试剂。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的检测血清中FGF10、YKL-40蛋白和AFP-L3浓度的试剂为ELISA试剂盒。
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