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CN103649110A - 用于诊断和治疗中的r2r1/2 - Google Patents

用于诊断和治疗中的r2r1/2 Download PDF

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CN103649110A
CN103649110A CN201280016753.0A CN201280016753A CN103649110A CN 103649110 A CN103649110 A CN 103649110A CN 201280016753 A CN201280016753 A CN 201280016753A CN 103649110 A CN103649110 A CN 103649110A
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albumen
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J·M·M·R·阿尔森斯
R·K·L·范布雷姆普特
P·J·佩特斯
R·A·德霍赫特
M·C·德勒伊特
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Leiden Teaching Hospital Leiden University Medical Center
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Janssen Pharmaceutica NV
Leiden Teaching Hospital Leiden University Medical Center
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Abstract

本发明源于这样的发现：命名为R2R1和R2R2的两种基因在组织发育和癌症生物学中起重要作用。特别地，本发明人已经发现这两种基因在肺细胞中表达并且是肺上皮细胞和内皮细胞晚期分支形态发生所必需的，并且支持肺的精细化三维结构的发育/维持。这些基因在鳞状分化程序和(表达Kit14的)祖细胞库的发育/维持中是必需的。并且，本发明人已经鉴定了这些基因在癌症生物学中、特别是在与获得永生和转移性表型(包括癌症进展和转移)以及肺和心脏发育相关的过程中的重要作用。因此，本发明提供用于治疗心脏和肺疾病以及癌症的化合物和方法。

Description

用于诊断和治疗中的R2R1/2
发明领域
本发明提供支持肺的精细化三维结构的发育/维持的新基因以及用于治疗肺疾病和/或病症的药物和组合物。
发明背景
中间丝(Krt6)、EDC(表皮分化复合物)和SCC(分层上皮分泌的蛋白基因复合物(Stratified epithelium-secreted protein gene complex))基因的表达允许细胞在有害环境中的存活。这种表达模式导致鳞状分化并且成为皮肤上皮细胞的标志。本发明人发现这种转录程序对于肺结构的精细化(晚期分支形态发生)也是至关重要的：远端呼吸道和血管中的细胞需要在富含氧的环境中采用扁平形状并且获得机械灵活性。由中间丝组和相关的EDC与SCC基因编码的蛋白允许这种细胞形状和灵活性。同时，肺需要维持能够分化成能够结合此类蛋白的细胞的祖细胞。这些祖细胞或基细胞典型地表达中间丝基因Krt14。
肺暴露于极大量的机械和氧化压力，并且在这一方面与皮肤相似。上文提及的鳞状分化程序是防御的第一线。排列在远端呼吸道和肺的血管中的细胞需要经受住这种压力并且在细胞死亡的情形中需要由祖细胞的集合替代。
这种系统的失灵代表两种人病理学：
1.支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)：早产的婴儿的肺对诸如机械压力的肺损伤更敏感。此外，肺损伤后存活的早产儿的肺治愈后通常伴有严重的瘢痕或支气管肺发育不良。这些肺具有有限的或发育不全的再生潜力。
2.慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)：成人COPD患者的肺似乎不适当地响应诸如吸烟的有害刺激。尽管他们发育了针对这些刺激的屏障，但是他们在细胞死亡时缺乏再生能力导致肺呼吸道和血管的变形。BPD和COPD均导致显著的发病率和死亡率。
发明概述
本发明源于这样的发现：两种基因在组织发育和癌症生物学中起重要作用。特别地，本发明人已经发现这两种基因在肺细胞中表达并且是肺上皮细胞和内皮细胞晚期分支形态发生所必需的，并且支持肺的精细化的三维结构的发育/维持。这些基因在鳞状分化程序和(表达Krt14的)祖细胞库的发育/维持中是重要的。并且，本发明人已经鉴定了这些基因在癌症生物学中、特别是在与获得永生和转移性表型(包括癌症进展和转移)以及心脏发育相关的过程中的重要作用。
本发明人已经确定了这些基因的鼠和人形式的序列。考虑到它们作为呼吸道细胞再生基因(regenerative genes for respiratory cells)的协同表达和功能，本发明人已经将这些基因命名为R2R1和R2R2。为了简要，本说明书大部分将使用术语“R2R1/2”，其旨在表示更长词组“R2R1和/或R2R2”。
因此，述及R2R1/2应该理解为包括这些基因的所有的哺乳动物形式，例如，包括人和啮齿动物(小鼠、兔、豚鼠、大鼠等)形式。此外，除了包括完整的R2R1和/或R2R2基因序列，应该理解这些命名还包括本文所述的任意基因的片段、部分、突变体、衍生物和/或同源物/直向同源物。在这一方面，应该理解术语“R2R1”包括由指定为2200001I15Rik或RIKENcDNA2200001I15的cDNA编码的鼠序列以及指定为FAM25A，FAM25B，FAM25C，FAM25D，FAM25E，FAM25G和FAM25HP的七种人同源物。
另外，适当地，术语“R2R1/2”包括R2R1和/或R2R2基因或其片段或部分的蛋白样产物。
特别地，术语“R2R1/2”或实际上术语“R2R1”或“R2R2”中的任一个包括下述SEQ ID NOS：1-12给出的序列或其片段、部分、类似物、变体或衍生物。
以下提供鼠R2R1基因的示例性转录物的序列作为SEQ ID NO：1：
SEQ ID NO：1
acactgacacggaccgaaggagtggaaaaagctttacctgtcactgtctgctgccatacgATGCTGGGAGGCCTGGGGAAGCTGGCGGCCGAGGGCCTGGCCCACCGCACAGAG AAAGCCACTGGGGGAGCAGTTCACGCAGTGGAAGAGGTGGTGAGCGAGGTGGTGGGC CACGCCAAGGAGGTTGGAGAGAAGACCATTAATGACGCCCTAAAGAAAGCCCAAGAA TCAGGAGACAGGGTGGTGAAGGAGGTCACTGAGAAGGTCACCCACACCATCACTGAT GCTGTTACCCATGCGGCAGAAGGCCTGGGAAGACTGGGACAGtgagcctgcctaccagcatggctggcccttcctgaaggtcaataaagagtgtgaaacgtgaaaaaaaaaaaaaaaataacaaaaaaaaaaaaaaaaaa
该序列的编码或翻译部分用下划线表示，并且包括大约267个核苷酸。SEQ ID NO：1的这个具体的部分已被指定为SEQ ID NO：2。
本领域的技术人员应该理解这267个翻译的核苷酸产生包含89个氨基酸的蛋白，所述蛋白具有下述序列(指定为SEQ ID NO：3)：
SEQ ID NO：3
MLGGLGKLAAEGLAHRTEKATGGAVHAVEEVVSEVVGHAKEVGEKTINDALKKAQESGDRVVKEVTEKVTHTITDAVTHAAEGLGRLGQ
另外，本发明人已经确定R2R1基因的示例性的人转录物的完整序列，并且以下以SEQ ID NO：4给出该序列：
SEQ ID NO：4
actctctgctgccacacgATGCTGGGAGGCCTGGGGAAGCTGGCTGCCGAAGGCCTG GCCCACCGCACCGAGAAGGCCACCGAGGGAGCCATTCATGCCGTGGAAGAAGTGGTG AAGGAGGTGGTGGGACACGCCAAGGAGACTGGAGAGAAAGCCATTGCTGAAGCCATA AAGAAAGCCCAAGAGTCAGGGGACAAAAAGATGAAGGAAATCACTGAGACAGTGACC AACACAGTCACAAATGCCATCACCCATGCAGCAGAGAGTCTGGACAAACTTGGACAGtgagtgcacctgctaccacggcccttccccagtctcaataaaaagccatgacatgtg
该序列的编码或翻译部分用下划线表示，并且包括大约267个核苷酸。SEQ ID NO：4的这个具体的部分已被指定为SEQ ID NO：5。
本领域的技术人员应该理解这267个翻译的核苷酸产生包含89个氨基酸的蛋白，所述蛋白具有下述序列(指定为SEQ ID NO：6)：
SEQ ID NO：6
MLGGLGKLAAEGLAHRTEKATEGAIHAVEEVVKEVVGHAKETGEKAIAEAIKKAQESGDKKMKEITETVTNTVTNAITHAAESLDKLGQ
以下以SEQ ID NO：7给出鼠R2R2基因的示例性的转录物的序列：
SEQ ID NO：7
GtgactggctgctgtctctagttgttgaggcctcttgggatctyggcgctmacmccwtgctytagwgactccgatagctcccrmggctccagtgsasmcctcggkcggnggnagggaaaaggcacttgctggtagctctgctcacccgcactgggacctggagctggaggactaagaagacagacggctgctgcttgccacagcctggaccATGGACCCCCATGAGAT GGTTGTGAAGAATCCATATGCCCACATCAGCATTCCTCGGGCTCACCTGCGCTCTGA CCTGGGGCAGCAGTTAGAGGAGGTTCCTTCTTCATCTTCCTCCTCTGAGACTCAGCC TCTGCCTGCAGGAACATGTATCCCAGAGCCAGTGGGCCTCTTACAAACTACTGAAGC CCCTGGGCCCAAAGGTATCAAGGGCATCAAGGGTACTGCTCCTGAGCACGGCCAGCA GACCTGGCAGTCACCCTGCAATCCCTATAGCAGTGGGCAACGTCCATCGGGACTGAC TTATGCTGGCCTGCCACCTGTAGGGCGTGGTGATGACATTGCCCACCACTGCTGCTG CTGCCCTTGCTGCTCCTGCTGCCACTGTCCTCGCTTCTGCCGTTGTCACAGCTGTTG TGTTATCTCCtagctgactattgaacctccagggctgtgcagcccaggttcctgctcaatgccaaagtgttgctggacatcaggagcagccgttgtcatgagcatcagccatttcctgccctgagcaggggagcctgtccaccagcgttcagctgtagccttctggaatagggttccagccactagccatgttggcaacaacagggacacccttcacgtcctgcaagactttggcaataaagcaggatgagcgttgctgnncctgntgaaaanaaamwaaawacwgccgttgtcacarcygttrtgttatctmmkagstgacwattgtaammtycagrgctgtrmagcccrggkksckgctcaatgccaaagtgttgmtgsmcmtcrggrgsrgccaagctttacgcggtacccgggattttttttgtacaaaaaggggccccctattagg
该序列的编码或翻译部分用下划线表示，并且包括大约426个核苷酸。SEQ ID NO：7的这个具体的部分已被指定为SEQ ID NO：8。
本领域的技术人员应该理解这426个翻译的核苷酸产生包含142个氨基酸的蛋白，所述蛋白具有下述序列(指定为SEQ ID NO：9)：
SEQ ID NO：9
MDPHEMVVKNPYAHISIPRAHLRSDLGQQLEEVPSSSSSSETQPLPAGTCIPEPVGLLQTTEAPGPKGIKGIKGTAPEHGQQTWQSPCNPYSSGQRPSGLTYAGLPPVGRGDDIAHHCCCCPCCSCCHCPRFCRCHSCCVIS
另外，本发明人已经确定R2R2基因的示例性的人转录物的完整序列，并且以下以SEQ ID NO：10给出该序列：
SEQ ID NO：10
cttgaacccgggaggcagaggttgcagtgagccgagatcgcgcagctgcactccagcctgggcaacagagcaagactccatctcagaaaagaagcagaaagcctccaagagccaatggctctcaagcatcttggtctctgctaagaagaggctcagaggcttagaagccctgcctcgccggggctttgaggtgtgtgagcaatggctggggactgcaggcccgggaatctgagggcctcaccccacttcctttccagagccgtgacctcaggctcacctcctgccctcctctcaggcaagctgcagatgccctttagggcccaggccatgccccggatgtgaggggctgagtcactggtttggcagtgcccctcagagcccaggcctgggctgccacccacctgaggacgagggctgggccagctgtcgtgctccagttgctggggcctcttgggatcttgggaaccccatctctgagccccgccccATGGCCCCGCCCCTCCCAAGGAGGGA AAAGGCGGCTGCCAGTCGCTCAACTCAGGCACTGGGACCTAGAGCTCAGAAGACCGA GAGGACAGACTGCCGTGTTGCCACCACAGGCTGGACCATGGACCCCCAAGAGATGGT CGTCAAGAACCCATATGCCCACATCAGCATCCCCCGGGCTCACCTGCGGCCTGACCT GGGGCAGCAGTTAGAGGTGGCTTCCACCTGTTCCTCATCCTCGGAGATGCAGCCCCT GCCAGTGGGGCCCTGTGCCCCAGAGCCAACCCACCTCTTGCAGCCGACCGAGGTCCC AGGGCCCAAGGGCGCCAAGGGTAACCAGGGGGCTGCCCCCATCCAGAACCAGCAGGC CTGGCAGCAGCCTGGCAACCCCTACAGCAGCAGTCAGCGCCAGGCCGGACTGACCTA CGCTGGCCCTCCGCCCGCGGGGCGCGGGGATGACATCGCCCACCACTGCTGCTGCTG CCCCTGCTGCCACTGCTGCCACTGCCCCCCCTTCTGCCGCTGCCACAGCTGCTGCTG CTGTGTCATCTCCtagcccagcccaccctgccagggccaggacccagacttcagcaaatgtggctcacacagtgccgggacatgccgggacatgcggggtggctgttgtcatgggcgtctgccccttcacaccaggcactggggctcagacccaccaggaaggtggccgttcagcccgagctcctgaaacggaatcccaggtcctggctggagagggacacccctgattaccttaaggcccaggcaataaagcagggtgatcttc
该序列的编码或翻译部分用下划线表示，并且包括大约552个核苷酸。SEQ ID NO：10的这个具体的部分已被指定为SEQ ID NO：11。
本领域的技术人员应该理解这552个翻译的核苷酸产生包含184个氨基酸的蛋白，所述蛋白具有下述序列(指定为SEQ ID NO：12)：
SEQ ID NO：12
MAPPLPRREKAAASRSTQALGPRAQKTERTDCRVATTGWTMDPQEMVVKNPYAHISIPRAHLRPDLGQQLEVASTCSSSSEMQPLPVGPCAPEPTHLLQPTEVPGPKGAKGNQGAAPIQNQQAWQQPGNPYSSSQRQAGLTYAGPPPAGRGDDIAHHCCCCPCCHCCHCPPFCRCHSCCCCVIS
因此，本发明涉及由指定为SEQ ID NOS：1，2，4，5，7，8，10和11的序列编码的基因以及其任意片段、部分、突变体、变体、衍生物和/或同源物/直向同源物。典型地，片段、部分、突变体、变体、衍生物和/或同源物/直向同源物是有功能或有活性的——也就是说，它们保留野生型R2R1/2基因的功能。
术语“突变体”可以包括天然存在的突变体或通过引入一个或多个核酸添加、缺失、取代或倒置人工产生的那些突变体。
本领域技术人员容易理解与上文详述的人和鼠R2R1/2基因同源的基因可能存在于多种不同的物种中，例如，包括其他哺乳动物物种。同源基因可以表现出低至约20或30％的序列同源性或同一性，然而，在另一些情形中，同源基因可以表现出与上文给出的多种核苷酸序列至少40，50，60，6570，75，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％的同源性。因此，来自其他物种的同源基因应该包括在本发明范围之内。
使用本文所述的多种核酸和氨基酸序列，本领域技术人员能够容易地鉴定诸如其他哺乳动物等的其他物种中的相关序列。例如，可以使用本文所述的探针探测从特定物种的获得的核酸以得到同源或密切相关的序列。
另外，应该理解本发明还涉及本发明包括的基因的产物，并且特别是由SEQ ID NOS：3，6，9和12编码的肽。此外，这些蛋白的任一种的片段、部分、类似物、变体、衍生物或同源和/或相同蛋白也在本发明范围之内。典型地，片段、部分、衍生物、变体和/或同源物是有功能的或有活性的——也就说，它们保留野生型R2R1/2蛋白的功能。
另外，与由SEQ ID NOS：3，6，9和12编码的蛋白的任一种同源/相同的蛋白、多肽/肽也在本发明范围之内。认为与本文所述的任一种序列同源或相同的蛋白或多肽/肽序列可以表现出少至20％或30％的序列同一性/同源性。然而，同源/相同的序列可以是至少40，50，60，65，70，75，80，85，90，95，96，97，98或99％同源或相同的。在这种情况下，本发明涉及本文所述的蛋白或多肽/肽序列的任一种的片段，应该理解片段可以包含约10个至n-1个之间任何数目的氨基酸(其中“n”是完整序列中氨基酸的数目)。例如，片段可以包含约10，15，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120或约125个氨基酸(氨基酸的最大数目由完整序列中氨基酸的数目决定)——这样的片段/部分可以称为肽片段。在一个实施方案中，所述肽片段可以是抗原性和/或免疫原性的——即，它们保留结合表现出针对天然(完整)抗原(诸如由SEQ ID NOs：3，6，9和12编码的那些)的特异性、亲和性和/或选择性的抗体的能力。
本领域技术人员容易理解，对于本文所述的多种核酸序列和多肽，在从任意给定的物种分离的R2R1/2基因和蛋白之间可能存在由于例如多态性导致的天然变异。另外，本领域公知遗传密码的简并性允许密码子中的一个或多个碱基的取代而不改变一级氨基酸序列。因此，为了产生编码与本文所述的抗原序列基本上相同的肽或蛋白序列的变体核酸序列，可以利用遗传简并性。实际上，本发明提供的序列可以显示相对于参照序列(例如，上述任一种序列)表现为一个或多个氨基酸/核酸取代、添加、缺失和/或倒置的蛋白和/或基因。
因此，应该理解所有此类变体、特别是有功能的或展现需要的活性的变体都应该包括在本发明范围之内。
在其他实施方案中，本发明涉及本文所述的任一种R2R1/2序列的衍生物。术语“衍生物”可以包括R2R1/2基因或肽序列，其相对于本文所述的那些序列包含一个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或倒置。
另外，或备选地，本发明所述的多种肽的类似物可以通过向一级序列中引入一个或多个保守氨基酸取代而产生。本领域技术人员应该理解术语“保守取代”旨在包括用具有相似性质并且基本上不改变天然(或野生型)蛋白的物理化学性质和/或结构或功能的备选氨基酸取代蛋白或肽的一个或多个氨基酸的行为。这种类型的类似物也包括在本发明范围之内。
如本领域公知的，遗传密码的简并性允许取代密码子中的一个或多个碱基而不改变一级氨基酸序列。因此，尽管已知本申请所述的序列编码本文所述的R2R1/2蛋白，但是可以利用密码的简并性来产生编码相同的一级氨基酸序列的变体核酸序列。
如所述，本发明人已经描述了R2R1/2基因(及其蛋白产物)参与肺和心脏形态发生事件(诸如细胞信号传导/转变等)，并且支持肺和心脏的三维结构的发育。因此，本发明的第一方面提供R2R1/2基因和/或R2R1/2蛋白，其用作用于治疗影响细胞/组织发育/结构、分化、增殖和/或形态发生的疾病的药物。例如，所述R2R1/2基因和/或R2R1/2蛋白可以用于治疗例如肺和/或心脏疾病和/或病症以及癌症——特别是影响肺或心脏系统的组织的癌症。
在特定的实施方案中，本发明可以提供R2R1/2基因和/或R2R1/2蛋白，其用于调节细胞转变事件，诸如，例如，间质到上皮转变(MET)事件和参与相反过程(reverse process)(上皮到间质转变(EMT))的事件。
在第二方面，本发明提供R2R1/2基因和/或R2R1/2蛋白，其用于治疗肺疾病和/或病症或其用于制备用于治疗肺疾病和/或病症的药物。
在另一个方面，本发明提供R2R1基因和/或蛋白，其用于治疗心脏疾病。在一个实施方案中，R2R1基因和/或蛋白可以用于治疗影响心脏细胞/组织的发育/结构、分化、增殖和/或形态发生的疾病。在一个实施方案中，本发明提供R2R1基因和/或蛋白，其用于治疗影响室间隔的发育和/或形成的疾病和/或病症。
在另一个方面，本发明提供R2R1基因和/或蛋白，其用于治疗癌症。在一个实施方案中，所述R2R1基因和/或蛋白可以用于治疗影响多种组织的癌症，所述多种组织包括例如肺和/或心脏组织。更一般地，本发明可以延伸至对涉及异常/缺陷性MET/EMT过程的任意癌症的治疗。至少一些可以用本发明的基因和/或蛋白治疗的癌症的实例在下文详述。
重申术语“R2R1”、“R2R2”和“R2R1/2”不仅包括上文所述的完整的基因/肽序列，还包括其片段、类似物、同源物、直向同源物、变体和衍生物。
术语“肺疾病”或“肺病症”可以包括肺的病理学，诸如影响肺发育或肺组织的3D结构的病理学。例如，“肺疾病”可以包括影响衬里肺呼吸道的上皮细胞、肺血管网络的内皮细胞和/或这些细胞的分化和/或生长的疾病和/或病症。因此，肺疾病可以包括影响肺形态发生途径和事件的疾病。影响特定肺细胞类型(例如，鳞状上皮细胞)的分化或祖细胞(基细胞)群体的产生和/或维持的肺疾病和/或病症也可以用本文所述的化合物、药物和方法治疗。通过具体的实例，诸如支气管肺发育不良(BPD)和/或慢性阻塞性肺疾病(COPD)可以使用本文所述的化合物治疗。在其他实施方案中，术语“肺疾病”或“肺病症”可以包括细胞增殖或肿瘤病症，诸如癌症，例如，包括非小细胞肺癌(NSCLC)和/或小细胞肺癌(SCLC)。
术语“心脏疾病”或“心脏病症”可以包括心脏的病理学，诸如影响心脏发育或心脏组织的3D结构的那些。心脏疾病可以包括影响心脏形态发生途径和事件的疾病，特别是影响间质到上皮和上皮到间质转变的疾病。通过具体的实例，诸如房和室间隔缺损、房室管缺损、心(房室)瓣膜畸形和冠状动脉的疾病可以用本文所述的化合物治疗。
还应该理解，由于已经表明本文所述的R2R1/2基因/蛋白在形态发生事件(诸如细胞信号传导等)中起作用并且支持复杂组织诸如肺和/或心脏的三维结构的发育，它们可以应用于再生药物中。例如，当使用干细胞(例如，成体、胚胎或重编程的体细胞(诸如iPS细胞))来修复或重建例如损伤或患病的组织时，本发明提供的所述蛋白和/或基因可以用于促进组织发育。
R2R1/2蛋白和基因在肺和心脏的形态发生事件中起重要作用，作为上皮到间质和间质到上皮转变的的“守门员(gatekeeper)”。因此，它们可以应用于癌症生物学和癌症治疗。例如，诸如局部癌症向癌症转移的转化的疾病可以使用本文所述的化合物进行治疗。
除了提供涉及本文所述的R2R1/2基因和/或蛋白的各种应用和药物，本发明还提供治疗患有本文所述的任一种疾病和/或病症的受试者的方法，所述疾病和/或病症包括上文列出的任一种心脏/肺疾病和/或病症。因此，本发明的第三方面提供治疗心脏/肺疾病和/或病症的方法，所述方法包括给需要所述治疗的受试者施用治疗有效量的本文所述的R2R1和/或R2R2基因和/或R2R1和/或R2R2蛋白的步骤。
当心脏或肺疾病或病症由缺乏或缺陷性R2R1/2基因和/或蛋白表达/功能导致或与其相关时，本文所述的功能性R2R1/2基因或蛋白的应用可以提供恢复正常的(或野生型)R2R1/2基因/蛋白功能从而治疗和/或减轻所述疾病或病症的症状的方式。
应该理解，本文所述的应用、药物和治疗方法可以需要产生重组R2R1/2基因/蛋白，并且因此，本发明还考虑产生和/或表达重组R2R1/2基因和/或蛋白的方法。本领域技术人员应该理解可以利用PCR技术从多种来源(包括，例如，肺组织)选择性得到R2R1/2基因序列。这些序列可以与多种表达或调节控制序列连接，所述表达或调节控制序列诸如例如启动子、操纵子、诱导子、增强子和/或沉默元件、核糖体结合位点和/或终止子序列。本领域技术人员可以对任何给定的宿主选择适当的调节或表达控制序列。在另一个实施方案中，可以将PCR来源的R2R1/2基因序列引入到载体(诸如质粒或表达盒)中。在一个实施方案中，所述载体还包含辅助蛋白纯化步骤的标签或标记的核苷酸序列。
可以用所述载体转化宿主细胞并且保持在适于诱导R2R1/2基因序列表达和重组R2R1/2生产的条件下。可以使用多种技术——所述技术可以另外称为转染流程，将其中已经克隆了R2R1/2基因序列(或其片段)的载体引入或转染到细胞中。转染流程利用使得细胞膜对化合物诸如核酸通透的条件。例如，可以使用电穿孔、热激、化合物(诸如例如磷酸钙、磷酸锶)、显微注射技术和/或基因枪促进载体(包括表达载体)的转染到细胞中。
用于纯化以这种方式产生的重组蛋白的技术是已知的，并且当重组蛋白带有标签或标记时，这些可以包括使用例如亲和层析技术。
综上所述，本发明的第四和第五方面分别提供包含R2R1/2基因序列的表达载体和其中转化了所述表达载体的宿主细胞。
除了提供R2R1/2基因和/或蛋白作为治疗多种疾病和/或病症(例如，心脏和/或肺疾病和/或病症)的方式之外，本发明还提供能够调节R2R1/2基因的表达的化合物，所述化合物可以用于治疗由R2R1/2基因/蛋白过表达导致的病症或与R2R1/2基因/蛋白过表达相关的病症。所述化合物可以是寡核苷酸，优选反义寡核苷酸，例如，其可以采取DNA和/或RNA的形式。在一个实施方案中，所述寡核苷酸是本领域已知为小的/短的干扰RNA和/或沉默RNA(以下称为siRNA)的RNA分子。所述siRNA寡核苷酸可以采用天然RNA双链体或已经以某种方式修饰(例如通过化学修饰)而成为核酸酶抗性的双链体的形式。另外地，或备选地，所述siRNA寡核苷酸可以采用短发夹RNA(shRNA)表达的形式或与本文所述的siRNAs相对应或包含本文所述的siRNAs的质粒构建体的形式。
本发明提供的寡核苷酸可以设计成调节R2R1/2基因的表达。通过分析天然的或野生型R2R1/2序列，和在诸如BIOPREDsi的算法的帮助下，本领域技术人员能够容易地确定或计算预测对这些基因具有最佳敲低作用的核酸序列(例如，参见http://www.biopredsi.org/start.html)。因此，技术人员可以产生并且检测不同寡核苷酸的阵列或文库，从而确定其是否能够调节R2R1/2基因的表达。
综上所述，本文所述的反义寡核苷酸和/或siRNA分子可以用于(i)治疗本文所述的任一种疾病和/或病症——特别是(ii)治疗肺疾病和/或病症，(iii)治疗心脏疾病和/或病症和(iv)治疗癌症。此外，本文所述的反义寡核苷酸和/或siRNA分子可以用于制备用于治疗上述(i)-(iv)列出的疾病的药物或用于治疗患有所述疾病和/或病症的受试者的方法。
另外，能够与R2R1/2蛋白结合的抗体(或其抗原结合片段)可以用于治疗本文所述的疾病和/或病症包括，例如，心脏和/或肺疾病和/或病症。对于由R2R1/2蛋白过表达导致的疾病和/或病症，阻断或中和R2R1/2蛋白功能的抗体可以是特别有用的。用于产生单克隆抗体(mAbs)的技术是公知的，并且可以容易地用来产生对R2R1和/或R2R2蛋白中的任一种或其片段特异性的mAbs。类似地，用来产生多克隆抗体的方法也是充分建立的，并且可以用来产生对R2R1和/或R2R2蛋白中的任一种或其片段特异性的抗体。
用于治疗本文所述的疾病和/或病症(例如，心脏和/或肺疾病和/或病症或癌症)的其他化合物可以包括，例如，蛋白、肽、氨基酸、碳水化合物和其他小的有机分子。
除了上述之外，分离的R2R1/2核苷酸和/或蛋白序列可以用作设计用于离体和/或原位检测和表达研究的探针和/或引物的基础。典型的检测研究包括，例如，聚合酶链式反应(PCR)、杂交研究、测序流程和免疫学和/或Southern/Northern印迹检测技术。
原则上，由上述序列设计的任意多核苷酸(或寡核苷酸)或多肽片段可以用于所述检测和/或表达研究。
典型地，用作探针和/或引物的多核苷酸片段包含10-30个核苷酸(尽管对于某些应用其他长度可能是有用的)并且表现出一定程度的针对特定序列的特异性，并且将不与不相关的序列结合。类似地，用作探针的多肽片段也可以是相对短的，并且典型地包含5-20个氨基酸(尽管对于某些应用其他略短或略长的长度可能是有用的)。
应该容易理解认真选择引物/探针序列以及使用严格(优选高度严格)的杂交条件将使任意非选择性结合减至最低。
因此，与本文所述的核苷酸序列的全部或一部分具有至少50％、至少75％、至少90％或至少95％互补性的寡核苷酸探针和/或引物序列以及那些具有准确(即100％)的互补性的寡核苷酸探针和/或引物序列也被考虑包括于本发明内。
探针/引物与核酸序列(诸如本文所述的任一种)的杂交可以在约40℃-75℃的温度在含有0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的2-6x SSC(即2-6x NaCl17.5g/l和8.8g/l的柠檬酸钠(SC))缓冲的盐水中进行。当然，取决于探针/引物与所述序列之间的相似性程度，可以使用具有减少的SSC浓度的缓冲液(即，含有0.1％SDS的1xSSC，含有0.1％SDS的0.5xSSC和含有0.1％SDS的0.1xSSC)。
与本文公开的氨基酸序列的全部或部分具有至少30％，50％，70％，75％，80％，85％，90％或95％同一性的多肽探针以及那些具有准确的同一性(即，100％同一性)的多肽探针也被考虑在本发明的范围之内。
因此，本发明的另一个方面提供设计来与选自由SEQ ID NOS：1；2；4；5；7；8；10和11组成的组的序列的全部或部分杂交的寡核苷酸探针和/或引物。另外，另一个方面提供设计来与选自由SEQ ID NOS：3；6；9和12组成的组的序列的全部或部分结合的多肽探针。
在另一个方面，本发明提供诊断肺疾病或病症和/或对肺疾病或病症的易感性的方法，其中所述方法包括确定受试者中的R2R1和/或R2R2基因是否异常表达。
诊断为患有，例如，癌症和/或心脏和/或肺疾病和/或病症的受试者可能表现出异常的(即，增加的或减少的)R2R1和/或R2R2基因/蛋白表达。术语“异常表达”应该理解为包括相对于在来源于健康受试者或没有患有所述疾病和/或病症(即心脏或肺疾病和/或病症或癌症)的受试者的样品中观察到的表达增加和/或减少的基因表达水平。
术语“样品”应该理解为包括体液样品，诸如全血、血浆、血清、唾液、汗液和/或精液。在其他情形中，可以使用诸如活组织检查和/或刮片的“样品”。特别地，可以使用肺活组织检查和/或刮片。另外，样品可以包括组织或腺体分泌，并且可以利用洗涤流程来获得分泌到例如肺中的流体样品。适当的洗涤流程可以包括支气管-肺泡灌洗步骤。本领域技术人员应该理解上述样品可以产生大量的R2R1/2核酸(即DNA或RNA)和/或R2R1/2蛋白、肽(或其片段)。此外，这些方法可以包括提供来自怀疑患有肺疾病和/或病症的受试者或可能处于发生肺疾病和/或病症的危险中的受试者的样品的第一步。
R2R1和/或R2R2基因/蛋白表达水平的增加可以与上述任一种疾病和/或病症或对其的易感性相关。例如，R2R1/2基因/蛋白表达的增加可以指示过量的细胞增殖和/或分化——并且可能与，例如，肿瘤病症如癌症(即肺癌)相关。R2R1和/或R2R2基因/蛋白表达的减少可以指示以差的或受损的心脏/肺发育为特征的病理学病症。所述病症可以导致组织损伤(由于在心脏/肺内作用的机械压力导致)、瘢痕、丧失心脏/肺的结构完整性以及变形的或受损的肺呼吸道或心脏结构。
技术人员应该熟悉可以用来鉴定蛋白和/或基因诸如R2R1/2基因和/或蛋白在诸如上文列出的样品中的水平的技术。
例如，所述技术可以包括基于聚合酶链式反应(PCR)的技术，诸如实时PCR(另外已知为定量PCR)。在本案中，实时-PCR可以用来确定编码R2R1和/或R2R2蛋白的基因的表达水平。典型地，并且为了量化特定的核酸序列的表达水平，可以使用反转录酶PCR来将相关的mRNA反转录为互补DNA(cDNA)。优选地，反转录酶流程可以使用设计来特异性扩增目的mRNA序列的引物。然后，可以使用PCR来扩增通过反转录产生的cDNA。
典型地，使用设计与特定序列特异性杂交的引物来扩增cDNA，并且用于PCR的核苷酸可以用荧光或放射性标记的化合物标记。
本领域技术人员应该熟悉使用标记的核苷酸来允许定量PCR过程中产生的DNA的量的技术。简言之，并且例如，可以通过监测在PCR循环过程中结合的标记的核苷酸的量来确定标记的扩增的核酸的量。
关于本文所述的基于PCR的技术的其他信息可以见于，例如，由CarlW.Dieffenbach&Gabriela S.Dveksler编写的PCR Primer：A LaboratoryManual(PCR引物：实验室手册)，第二版：Cold Spring Harbour LaboratoryPress和由Joseph Sambrook&David Russell编写的Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)：Cold Spring HarbourLaboratory Press。
可以用于确定样品中R2R1和/或R2R2基因的表达水平的其他技术包括，例如，Northern和/或Southern印迹技术。Northern印迹可以用来确定样品中存在的特定mRNA的量，并且因此，可以用来确定R2R1和/或R2R2基因表达的量。简言之，mRNA可以提取白，例如，基于细胞的系统或不含细胞的系统(所述系统被用技术人员已知的技术修饰以包括可表达的R2R1和/或R2R2基因)并且进行电泳。然后，可以使用设计来杂交(即，与之互补)目的mRNA序列的核酸探针——在本案中，编码R2R1和/或R2R2蛋白的mRNA，来检测和定量样品中存在的特定mRNA的量。
另外，或备选地，可以通过微阵列分析方式鉴定R2R1和/或R2R2基因表达的水平。所述方法包括使用包含来源于R2R1和/或R2R2基因的核酸的DNA微阵列。为了鉴定R2R1和/或R2R2基因表达的水平，本领域技术人员可以从进行本发明第一方面所述的方法的系统(例如，基于细胞的或不含细胞的系统)提取核酸，优选mRNA，并且将其进行扩增流程，诸如反转录PCR，以产生cDNA。优选地，可以使用对特定的mRNA序列特异性的引物——在本案中，为编码R2R1和/或R2R2基因的序列。
所扩增的R2R1和/或R2R2cDNA可以进行进一步的扩增步骤，任选地在存在标记的核苷酸(如上文所述)的条件下。然后，所述任选标记的扩增的cDNA可以与微阵列在允许与所述微阵列的DNA结合的条件下接触。以这种方式，可以鉴定R2R1和/或R2R2基因表达的水平。
关于上述技术的进一步的信息可以见于，例如，由Carl W.Dieffenbach&Gabriela S.Dveksler编写的PCR Primer：A Laboratory Manual((PCR引物：实验室手册)，第二版：Cold Spring Harbour Laboratory Press和由JosephSambrook&David Russell编写的Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)：Cold Spring Harbour Laboratory Press。
为了确定样品中R2R1/2蛋白的水平，可以使用利用能够结合R2R1/2蛋白的试剂的免疫学技术。
在一个实施方案中，上述诊断方法可以包括下述步骤：使基底(或其部分)与待检测的样品在允许样品中存在的任意R2R1/2蛋白与所述基底的缔合、相互作用、结合和/或固定的条件下接触。
适当的基底可以包括，例如，玻璃，硝基纤维素、纸、琼脂糖和/或塑料。基底，诸如例如，塑料材料，可以采用微量滴定板的形式。
备选地，要与待检测的样品接触的基底可以包括能够结合R2R1/2蛋白的试剂。优选地，能够结合R2R1/2蛋白的试剂与所述基底(或至少其部分)结合。适当的结合试剂可以包括，例如，抗体，诸如单克隆或多克隆抗体和/或其他类型的肽或能够结合R2R1/2蛋白的的小分子。应该理解，该定义适用于本文提及的所有类型的结合试剂。因此，所述基底(或其部分)可以与待检测的样品在允许能够结合R2R1/2蛋白的试剂与样品中存在的任意R2R1/2蛋白之间的结合或相互作用的条件下接触。
与所述基底结合或与能够结合R2R1/2蛋白的试剂结合的任意R2R1/2蛋白可以用另一种能够结合R2R1/2蛋白的试剂(以下称为“一级结合试剂”)来检测。另外，或备选地，所述一级结合试剂可以具有对R2R1/R2R2蛋白：基底复合物或包含R2R1/2蛋白与上述能够结合R2R1/2蛋白的试剂的复合物的亲和性或可以与其结合。
所述一级结合试剂可以缀合到允许其被检测的结构部分(以下称为“可检测的结构部分”)上。例如，所述一级试剂可以缀合到能够通过比色化学发光反应报道水平的酶上。这样缀合的酶可以包括，但不限于，辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AlkP)。另外，或备选地，所述一级结合试剂可以缀合到荧光分子上，诸如例如，荧光团上，诸如FITC、罗丹明或德克萨斯红上。可以缀合到结合试剂上的其他类型的分子包括放射性标记的结构部分。
备选地，与所述基底结合或与能够结合R2R1/2蛋白的试剂结合的任意R2R1/2蛋白可以通过另一种结合试剂(以下称为“二级结合试剂”)的方式检测，所述另一种结合试剂具有针对一级结合试剂的亲和性。优选地，所述二级结合试剂缀合到可检测的结构部分上。
与R2R1/2蛋白结合的一级结合试剂(或与其结合的二级结合试剂)的量可以代表所检测的样品中存在的R2R1/2蛋白的水平。
在一个实施方案中，用于鉴定R2R1/2蛋白的水平的方法可以采用“浸条(dip-stick)”检测的形式，其中基底(或其部分)与待检测的样品在允许样品中存在的任意R2R1/2蛋白与所述基底或结合或固定在所述基底上的结合试剂的结合的条件下接触。
在另一个实施方案中，所述方法可以采用免疫测定，诸如例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)的形式。ELISA可以采用“捕获”ELISA的形式，其中，待检测的样品与基底接触，并且样品中存在的任意R2R1/2蛋白被结合或固定在所述基底上的结合试剂(能够结合所述R2R1/2蛋白)“捕获”或结合。备选地，样品可以与基底在允许样品中存在的任意R2R1/2蛋白与基底之间“直接”结合的条件下接触。
上述ELISA方法中的每一种可以包括“直接的”R2R1/2蛋白检测步骤或“间接的”鉴定步骤。包括所述步骤的ELISAs可以称为“直接”ELISAs或“间接”ELISAs。
“直接的”ELISA可以包括使待检测的样品与基底在允许样品中存在的任意R2R1/2蛋白与所述基底和/或结合在所述基底上的结合试剂之间的结合的条件下接触。在任选的封闭步骤后，可以通过能够结合所述R2R1/2蛋白的试剂(即，一级结合试剂)的方式检测结合的R2R1/2蛋白。优选地，所述一级结合试剂缀合到可检测的结构部分上。
“间接的”ELISA可以包括另一个步骤：在将R2R1/2蛋白与一级结合试剂接触后，使用另一种具有针对所述一级结合试剂的亲和性或特异性的结合试剂(二级结合试剂)。优选地，所述二级结合试剂可以缀合到可检测的结构部分上。
可以用来鉴定样品中R2R1/2蛋白的水平的其他免疫学技术包括，例如，免疫组织化学，其中结合试剂，诸如能够结合R2R1/2蛋白的抗体，与样品(优选组织样品)在允许样品中存在的任意R2R1/2蛋白与所述R2R1/2蛋白结合试剂之间的结合的条件下接触。典型地，在样品与结合试剂接触之前，所述样品用例如诸如Triton X100的去污剂处理。所述技术可以称为“直接的”免疫组织化学染色。
备选地，待检测的样品可以进行间接免疫组织化学染色流程，其中，在样品已经与R2R1/2蛋白结合试剂接触后，使用另一种结合试剂(二级结合试剂)来检测R2R1/2蛋白/结合试剂复合物，所述另一种结合试剂(二级结合试剂)对所述R2R1/2蛋白结合试剂特异性、具有针对所述R2R1/2蛋白结合试剂的亲和性或能够结合所述R2R1/2蛋白结合试剂。
技术人员应该理解在直接和间接免疫组织化学技术中，所述结合试剂或二级结合试剂可以缀合到可检测的结构部分上。优选地，所述结合试剂或二级结合试剂可以缀合到能够通过比色化学发光反应报道所结合的结合试剂或二级结合试剂的水平的结构部分上。
为了鉴定样品中存在的R2R1/2蛋白的水平，技术人员可以将免疫组织化学染色的结果与关于参照样品进行的免疫组织化学染色的结果进行比较。例如，与参照样品相比，具有更多或更少的结合的R2R1/2蛋白结合试剂(或二级结合试剂)的样品可能是由患有特定的疾病和/或病症的受试者提供的。
利用能够结合所述R2R1/2蛋白的应用的其他技术包括，例如，诸如Western印迹或点印迹的技术。Western印迹可以包括将样品进行电泳，以制备或解析样品的各种成分，例如，蛋白样成分。然后，解析的成分可以转移到基底上，诸如硝基纤维素上。为了鉴定样品中存在的任意R2R1/2蛋白，所述基底可以与能够结合R2R1/2蛋白的结合试剂在允许样品中存在的任意R2R1/2蛋白与所述能够结合R2R1/2蛋白的试剂之间的结合的条件下接触。
备选地，能够结合R2R1/2蛋白的试剂可以缀合到可检测的结构部分上。
备选地，基底可以与另一种具有针对能够结合R2R1/2蛋白的结合试剂的亲和性的结合试剂接触。有利地，所述另一种结合试剂可以缀合到可检测的结构部分上。
在点印迹的情形中，样品或其部分可以与基底接触，以使样品中存在的任何R2R1/2蛋白结合或固定在所述基底上。任意结合的或固定的R2R1/2蛋白的鉴定可以按上述进行。
在任意上述技术中，所检测的一级或二级结合试剂的量代表样品中存在的R2R1/2蛋白的量或与样品中存在的R2R1/2蛋白的量成比例。此外，由本文所述的任一种诊断方法或全部诊断方法得到的结果可以与由来源于已知没有患有或不易患特定的疾病或病症(诸如例如，心脏和/或肺疾病或病症和/或癌症)的健康受试者的参照或对照样品得到的结果进行比较。
本发明的另一个方面提供鉴定或获得调节R2R1和/或R2R2基因的表达的试剂的方法，所述方法包括使所述R2R1和/或R2R2基因与测试试剂接触并且检测R2R1/2基因表达的任意调节的步骤。
本领域技术人员应该理解诸如在本发明第9方面所述的方法可以在诸如例如被修饰以包括R2R1和/或R2R2基因的基于细胞或不含细胞的系统中进行。例如，可以用包含R2R1或R2R2基因中任一种的核酸转染细胞。在一个实施方案中，核酸可以采用载体(例如，上述质粒或表达盒)的形式。
在一个实施方案中，由上述方法得到的结果可以与由对照方法得到的结果进行比较，在对照方法中，R2R1和/或R2R2基因没有与测试试剂接触。以这种方式，可以确定所述试剂是否能够调节R2R1和/或R2R2基因的表达。当R2R1和/或R2R2基因的表达水平低于或高于在对照方法中检测到的表达水平时，所述测试试剂可以有效用作R2R1和/或R2R2基因表达的调节剂。当表达水平与在对照方法中观察到的水平相同时，所述测试试剂很可能不能够调节R2R1和/或R2R2基因的表达。
适当的测试试剂可以采用核酸(例如，上文所述的反义寡核苷酸)、蛋白、肽、氨基酸、抗体(及其片段)、碳水化合物和其他小的有机分子的形式。
在另一个方面，本发明提供包含上述R2R1/2基因/蛋白、本文所述的反义寡核苷酸(DNA或RNA)和/或通过本发明第9方面提供的方法鉴定的能够调节R2R1和/或R2R2基因/蛋白的表达和功能的任一种试剂以及药用赋形剂、载体或稀释剂的药物组合物。所述组合物可以应用于，例如，治疗本文所述的多种疾病和/或病症，包括上述心脏和/或肺疾病和/或癌症。
优选地，本发明提供的药物组合物配制为无菌药物组合物。适当的赋形剂、载体或稀释剂可以包括，例如，水、盐水、磷酸缓冲的盐水、葡萄糖、甘油、乙醇、离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如血清白蛋白)、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水盐或电介质诸如硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶质硅石、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧基甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂等、或它们的组合。
例如，所述药物制剂可以配制成适于口服、肠胃外或局部给药的形式。在一个实施方案中，所述药物组合物可以这样配制以使其可以被吸入。通过吸入给药的组合物可以采用可以被喷雾并作为液滴吸入的精细粉末或溶液的形式。本领域技术人员应该熟悉可以用来通过例如吸入将组合物直接递送到肺的装置。组合物的液滴或颗粒尺寸可以改变，以使药物可以进入肺的不同区域。例如，一旦吸入，小的粒子或液滴可以深入穿透到肺组织中，并且在一些情形中可以到达肺泡。
配制用于局部给药的药物组合物可以呈现为在水性或非水性液体中的油膏、溶液或混悬液，或呈现为水包油液体乳剂。
能够调节R2R1和/或R2R2基因的化合物，诸如例如，通过本文所述的方法鉴定的那些或本文所述的R2R1/2基因/蛋白片段、反义寡核苷酸和抗体，可以进一步用作细胞分化的调节剂。如所述，本发明人已经确定了R2R1和R2R2基因及其产物参与调节肺上皮细胞、特别是由肺上皮祖细胞或基细胞群体(即，Krt14+ve细胞)产生的鳞状上皮细胞的分化的途径。
调节细胞(例如，肺上皮细胞)分化的化合物可以特别有效的用于治疗诸如BPD的病症，BPD产生损伤的和有瘢痕的肺，具有减小的或发育不全的再生潜力。因此，通过给药或使用调节细胞分化的化合物，可以改善或恢复肺的再生潜力。本领域技术人员容易理解能够增强或促进R2R1和/或R2R2基因表达或恢复这些基因的功能的化合物可以是特别有用的。
在另一个方面，本发明提供用于研究组织发育和/或细胞转变事件以及特定的疾病和/或病症(包括心脏和/或肺疾病和/或病症以及癌症)的动物模型。在一个实施方案中，所述动物模型可以通过操作或调节(即，上调或下调)R2R1/2基因/蛋白的表达而产生。另外或备选地，动物模型可以通过破坏R2R1/2基因表达而产生。如上述，本文多种人和鼠R2R1/2基因/蛋白序列的公开内容确保技术人员能够容易地原位操作/调节这些序列，从而产生动物模型。例如，可以产生“敲除”动物，即，减少或基本上消除R2R1/2基因序列的表达。所述模型有效用于检测潜在用于治疗本文所述的疾病和/或病症的药物的作用和/或用于确定特定的基因的功能或作用。备选地，也可以产生其中R2R1/2基因/蛋白的表达被上调的动物模型。以这种方式，可以检测目的在于抑制上调的R2R1/2基因/蛋白表达的药物的功效和功能。还可以研究这些动物中上调的R2R1/2基因蛋白表达的作用。
在其他实施方案中，可以向R2R1/2基因序列中引入取代、添加、缺失和/或倒置，从而对所述蛋白的活性施加改变并且帮助阐明特定的结构域、氨基酸等的功能。另外，或备选地，敲除动物，诸如上文所述的那些，可以转化本文所述的任一种基因序列。在研究变体或突变的R2R1/2基因的作用或能够抑制所述变体或突变的序列的表达或功能的药物或化合物的功效的情形中，这是特别有用的。
详述
现在将参考下述附图详细描述本发明，其中所述附图显示：
图1.来自E16.5的Vegf+/+的内皮细胞和上皮细胞的比较。y-轴上的火山点显示在检测细胞来源的作用时(基于LIMMA)每种基因的显著性。x-轴显示比较2种组织时的倍数变化。Ker+细胞表达构建类型的上皮基因，而il+细胞转录代表性的内皮基因。突出显示内皮Cldn5和上皮Foxal，原因在于这两种基因在无监督的谱图分析的Y-轴(PC2)也作为上部基因存在(见图3)。
图2.激光捕获显微解剖方法的示意图。将胚胎的胸部(A)切成8mm的切片并且置于载玻片上(B)。用抗-`pan`角蛋白和GS-IB4异凝集素对这些组织切片的双重免疫组织化学染色(C)分离具有上皮细胞(D)特异性的肺呼吸道细胞与具有内皮细胞(E)特征的周围细胞。通过激光捕获显微解剖分离的特定的细胞组显示在F和G中(L＝肺，H＝心脏)。
图3.使用第一主分量(principal component)(在X-轴上的PCI)和第二主分量(在Y-轴上的PC2)的谱图分析。在PCI中揭示时间效应或胎龄(可解释数据组中35％的变化)。在Sftpc胚胎期晚期表达的基因的基因探针也位于X-轴上。PC2中出现细胞来源(il+相对于ker+细胞)的差异。与内皮基因(`ENDO`)家族的基因探针相反，上皮基因(`EPI`)的基因探针也位于Y-轴上。不同的样品组在谱图中沿着PCI(胚胎期)和PC2(细胞来源)分开。Ker+样品集中在Y-轴的上皮侧，il+样品集中在内皮侧。样品还沿着X-轴按照其胚胎期分布。晚期胚胎期的样品也位于X-轴上。下图显示3种表达模式：(1)显示上皮细胞和内皮细胞关于Foxal表达的差异，(2)显示胚胎期对于Afp表达的作用和(3)显示胚胎期关于Hmr表达的基因型依赖性模式。
图4.比较来自Vegf+/+和Vegf120/120基因型的上皮细胞。A.y-轴上的火山点显示用于检测在Vegf+/+和Vegf120/120基因型之间胚胎期表达模式是否不同的每种基因的显著性(基于LIMMA)。x-轴显示在E16.5比较这2个基因型，即E16.5的Vegf+/+相对于Vegf120/120时诱导的倍数变化。突出显示在野生型ker+细胞中Krt6a、EDC和SCC基因的上调。B.通过抗-细胞角蛋白4，5，6，8，10，13和18染色限定的E16.5Vegf+/+肺中的呼吸道上皮细胞。远端呼吸道细胞发育扁平或鳞状的细胞形态(黄色箭头)，这与其紧邻的邻近细胞相反(白色箭头)。C.染色体3的不同表达的分配。这突出显示与野生型相比Vegf120/120的EDC中基因的下调。
图5A.IF＝锚定在含有Dscl的桥粒(橙色)上的中间丝角蛋白(红色)组。Pkpl(紫色)连接中间角蛋白丝与附着型连接的钙粘蛋白(黄色)。Pkpl还调节桥粒的蛋白浓度。EDC和SCC簇基因与中间丝角蛋白相互作用。星形符号突出显示在中间丝网络中上调的基因和基因簇。Eps8l1(编码肌动蛋白-加帽蛋白)的上调协调中间丝与肌动蛋白重塑。
B.y-轴上的火山点显示用于检测Vegf+/+与Vegf120/120基因型的内皮细胞之间胚胎期的表达模式是否不同(基于LIMMA)的每种基因的显著性。x-轴显示比较这2种基因型，即E16.5的Vegf+/+相对于Vegf120/120时诱导的倍数变化。突出显示Krt，Dscl，Pkpl，EDC和SCC簇基因。在野生型Vegf+/+il+细胞中上调的Krt基因与在等价的野生型ker+细胞中表达的Krt基因不同。Krt14和Krt1为标志性基细胞基因。
C.在野生型E16.5胚胎肺中GS-IB4异凝集素染色细胞(il+细胞)的免疫荧光图(40x放大)。Il+细胞具有与远端呼吸道的ker+细胞相同的结构模式。
图6.基于抗-细胞角蛋白4-5-6-8-10-13-18染色细胞的组的LIMMA分析的火山点。(关于微阵列数据的线性模型：通过Vegf基因型和时间的两向相互作用检测Vegf120/120敲除的同窝仔与野生型同窝仔在胚胎期表达模式上的差异)。突出显示RIKEN cDNA2200001I15基因和RIKENcDNA2310002J15基因。
图7.基于GS-IB4结合细胞的LIMMA分析的火山点。(关于微阵列数据的线性模型：通过Vegf基因型和时间的两向相互作用检测Vegf120/120敲除的同窝仔与野生型同窝仔在胚胎期表达模式上的差异)。突出显示RIKEN cDNA2200001I15基因和RIKEN cDNA2310002J15基因。
图8.人hR4RA转录物(＝人R2R1)相对于小鼠R4Ra转录物(＝小鼠R2R1)的cDNA s序列比对。应该注意到由测序的RIKEN cDNA2200001I15基因克隆构建的最大的叠连序列(contig)称为‘小鼠R4Ra转录物(＝小鼠R2R1)’。
图9.翻译的人hR4RA(＝人R2R1)转录物相对于翻译的小鼠R4Ra(＝小鼠R2R1)转录物的蛋白序列比对。
图10.人hR4RD转录物(＝人R2R2)相对于小鼠R4Rd转录物(＝小鼠R2R2)的cDNA序列比对。应该注意到，由测序的RIKEN cDNA2310002J15基因克隆构建的最大的叠连序列称为‘小鼠R4Rd转录物(＝小鼠R2R2)’。
图11.翻译的人hR4RD(＝人R2R2)转录物相对于翻译的小鼠R4Rd(＝小鼠R2R2)转录物的蛋白序列比对。
图12.VEGF-A(在小鼠胚胎的发育的室间隔中R2R1的VEGF164依赖性上调。红色＝野生型，蓝色＝VEGF120/120敲除小鼠，缺少VEGF164同种型。
图13.在人成体原代肺上皮细胞中人R2R2同源基因(＝C9orf196)随时间(24-72h)的表达。
图14.VEGF165的siRNA敲除导致负责基细胞程序和鳞状分化程序的基因的敲低。在人原代支气管上皮细胞(PBEC`s)中的siRNA敲低可靠地建模目的基因的基因敲低的作用。(a)RTqPCR：siRNA介导的VEGFA和VEGF165表达的敲低导致KRT14(基细胞标记)表达的敲低。KRT14相对表达(PGK1标准化的)，VEGFA和VEGF165相对于siRNA绘图。包括两个阴性对照(称为nr10和11)。包括针对KRT14表达的siRNA作为阳性对照。siRNAVEGFA针对所有的VEGFA同种型。
图15A-J：在PBEC's中由siRNA介导的VEGFA的敲低导致的整体基因表达改变。整体基因表达的改变与在Vegf120/120敲除小鼠中观察到的改变完全匹配。图(a)-(j)描述在施用针对VEGF的siRNA24h后基因表达的变化的显著性。图(a)-(j)通过自动化途径分析产生。所有的途径都参与角质形成细胞分化：基细胞再生和鳞状分化。
图16A-C：针对人R2R1和R2R2同源基因的siRNA's。人R2R1同源基因包括含有指定为FAM25A，FAM25B，FAM25C，FAM25D，FAM25E，FAM25G和FAM25HP的七个人种内同源基因(paralogue)的FAM25家族。这些是由指定为2200001I15Rik或RIKEN cDNA2200001I15的cDNA序列编码的鼠序列的小鼠的人同源基因。FAM25种内同源基因的相似性排除不同种内同源基因的特异性的RTqPCR。FAM25种内同源基因在诸如HT HG-U133或HT HG-U219的Affymetrix人基因表达阵列上也是不存在的。我们已经选择RTqPCR引物-探针组Hs04194072_ml(AppliedBiosystems)用于测量FAM25家族的差异性基因表达。Applied Biosystems说明该引物-探针组未区分不同的种内同源基因。关于其下调针PBEC's中Hs04194072_ml表达的能力选择针对FAM25家族设计的三种siRNA's。我们已经将这些siRNA's分别编号为nr18、20和22。图(a)示例在PBEC's中施用各种siRNA's24小时后FAM25(Hs04194072_ml)表达(PGK1标准化的)的下调。人R2R2同源基因：基于其下调PBEC's中C9orf169表达的能力选择两种针对C9orf169设计的siRNA's(编号15和17)(浓度分别为5和20nM)。通过微阵列分析和RTqPCR评估C9orf169表达。在Affymetrix HT HG-U219人基因表达阵列上存在关于C9orf169的探针。图(b)示例在PBEC's中施用各种siRNA's24h后C9orf169表达的下调(通过微阵列分析评估)。施用针对FAM25家族或VEGFA的siRNA's对C9orf169表达没有影响。针对R2R1(人FAM25家族)和R2R2(人C9orf169)的siRNA's下调KRT14表达并且反应与在施用针对VEGFA的siRNA's后观察到的反应相似，VEGF165siRNA介导的FAM25家族和C9orf169的敲低导致KRT14基因表达(基细胞标记)的下调。在施用针对C9orf169的siRNA's后这种反应是最明显的。图(c)示例在PBEC's.中施用各种siRNA's24h后KRT14表达(PGK1标准化的)的下调。为比较的缘故，还包括针对VEGFA和KRT14的siRNA's。
图17：是R2R同源基因的作用的示意图。R2R同源基因的表达导致对HIF1A信号传导(赋予氧耐受性)(Box5)和特定的(PERP)抗-细胞凋亡途径的调节(Box4)的同时调节。这将允许强上皮细胞(具有针对压力的主要的防御屏障)的产生(再生)，而没有带来无限生长潜力。换言之，特定的抗-细胞凋亡途径的调节不是对细胞凋亡的一般耐受的‘允许’。对细胞凋亡的一般耐受性将导致细胞无限增殖的危险状况：细胞发展成癌细胞。该途径是基于siRNA介导的人R2R1同源基因(FAM25家族)和人R2R2同源基因(C9orf169)的敲低的微阵列分析构建的。
图18：R2R同源基因对于VEGFA-VEGF165途径中的‘角质形成细胞再生和分化’(Box1)和‘细胞凋亡调节’(Box2)是重要的。R2R同源基因对‘角质形成细胞的再生和分化’(Box1)的基因表达的作用在图18A和18B中是明显的。R2R同源基因对‘细胞凋亡调节’(Box2)的基因表达的作用在图18C中是明显的。它们是Box3，4和5的最后的终点作用。
图19A-B：对细胞呼吸的作用(见图17中Box3)是高度特异性的：siRNA介导的R2R同源基因的敲低将下调氧化磷酸化。R2R同源基因的表达将上调氧化磷酸化。我们可以观察到这种作用在线粒体ATP5A1-ATP合酶(转运H+)的表达中最明显(profound)(图19A)。针对R2R同源基因的siRNA`s将下调ATP5A1表达。图19B示例在氧化磷酸化途径的基因表达的整体变化中ATP5A1的表达。
图20：R2R同源基因对P53-P63信号传导的作用(见图17的Box4)。通过siRNA介导的人R2R同源基因的敲低下调PERP(TP53细胞凋亡效应子)。`PERP是上皮完整性所需要的p63-调节的基因。p63是成层上皮细胞发育的主要调节剂，其对于说明该多面程序是必需的和充分的。Perp，其为一种最初鉴定为p53肿瘤抑制基因的细胞凋亡相关靶标的四跨膜蛋白，是在体内明显参与调节该发育程序的p63的第一直接靶标：这由Rebecca A.Ihrie等人在2005年证实(Cell，Vol.120，843-856，3月25日，2005)(斜体引用的作者在文章的摘要中)。该图证明在siRNA介导的人R2R同源基因的敲低后PERP表达的下调。
图21：在施用FAM25nr20(针对人同源基因R2R1)后在P53途径的基因表达的整体变化中的PERP表达的概况。
图22：在施用FAM25nr18(针对人同源基因R2R1)后在P53途径的基因表达的整体变化中的PERP表达的概况。
图23：在施用C9orf169nr15(针对人同源基因R2R2)后在P53途径的基因表达的整体变化中的PERP表达的概况。
图24：在施用C9orf169nr17(针对人同源基因R2R2)后在P53途径的基因表达的整体变化中的PERP表达的概况。
图25A-C：通过表达人R2R同源基因精密调节HIF1A的表达(见图17中的Box5)。siRNA介导的人R2R同源基因的敲低将下调HIF1A表达(图25A)。下游HIF1A对细胞呼吸(氧化磷酸化)的作用在3中描述(见图17细胞呼吸)。R2R同源基因驱动‘PERP型p53-p63’和HIF1A表达。因此，装配有HIF1A武装(armory)的‘强壮’的上皮细胞可能在VEGFA/VEGF165的影响下发展无限生长的潜力。然而，我们同时观察到上皮细胞被排除进入无限增殖状态。R2R同源基因的表达将作用为可能使细胞无限增殖的基因表达的制动器(brake)。在BCL2A1的情形中这是非常明显的(图25B)，BCL2A1是一种抗-细胞凋亡基因，其表达赋予癌细胞对治疗的抗性。siRNA介导的R2R同源基因的敲低导致BCL2A1表达上调。R2R同源基因作用为BCL2A1表达的制动器。如果需要，R2R同源基因还将促进允许细胞进入细胞凋亡的基因的表达。这得到siRNA介导的R2R同源基因的敲低的证实：所述敲低将引起MAP2K4的下调(图25C)，MAP2K4是肺腺癌的肿瘤抑制基因。
表1.在野生型和Vegf120/120敲除的抗-细胞角蛋白4-5-6-8-10-13-18染色细胞中在E16.5的差异性基因表达的SAM分析中最高基因列表中的RIKEN cDNA2200001I15基因和RIKEN cDNA2310002J15基因。
表2.在野生型和Vegf120/120敲除的GS-IB4染色细胞中在E16.5的差异性基因表达的SAM分析中最高基因列表中的RIKEN cDNA2200001I15基因和RIKEN cDNA2310002J15基因。
表3.根据时期(age)和Vegf基因型状态的胚胎分布。wt/wt＝纯合野生型(Vegf+/+)，120/wt＝杂合Vegf120/+，120/120＝纯合Vegf120/120敲除。(NG＝由于差的胚胎形态没有进行基因分型的)。
表1
Figure BDA0000390683660000271
表2.
Figure BDA0000390683660000281
Figure BDA0000390683660000291
表3.
Figure BDA0000390683660000292
Figure BDA0000390683660000293
Figure BDA0000390683660000301
导论
R2R基因、转录物和各自的蛋白在VEGF小鼠敲除模型中发现。Vegf120/120敲除小鼠不能产生Vegf164和Vegf188同种型(Vegf164是人VEGF165的同源基因)。Vegf120/120敲除小鼠的肺在出生时是发育不全的，并且在Vegf120/120敲除的胚胎肺中周围呼吸道和血管分化被严重损害。基因组学方法导致这样的发现：小鼠中的Vegf164和人中的VEGF165驱动非常特异性的基因表达程序。该程序由两种成分组成。第一种成分时呼吸道上皮的基细胞的产生(再生)：基细胞至少是邻近的呼吸道的细胞群体的来源。基细胞还通过建立半桥粒和黏着斑连接而产生强的细胞间连接。基细胞通过中间丝蛋白KRT14和KRT5加强其细胞内的结构。这两种蛋白粘着在(半)桥粒上。
第二种成分是分化程序：其为呼吸道衬里的细胞的‘强化程序’(‘鳞状分化’)。这些细胞需要在出生时就是强壮的，因为它们将暴露于机械压力和高水平的氧。通过加强细胞结构的蛋白家族，这种强化成为可能。该蛋白家族由中间丝组和加强中间丝的蛋白(SPRR蛋白，LOR，HRNR等)组成。这两种程序可以总结在‘角质形成细胞分化’、‘表皮细胞分化’、‘中间丝重组’、‘角化包膜’、‘角质形成细胞分化’、‘细胞骨架重塑角蛋白丝’的标题下。
尽管试图使用VEGF165蛋白来再生人中损伤的肺，但是VEGFA和VEGF165是生物体中广泛多样性过程的重要调节剂。因此，施用VEGFA或VEGF165将导致太多的副作用。
在小鼠中由Vegf164驱动的和在人中由VEGF165驱动的基因表达程序中发现两种新基因(R2R1和R2R2)。这些新基因，其转录物和翻译蛋白与基细胞和鳞状细胞基因表达程序的基因及其下游产物无关。
进行实验来证明这些基因是基细胞和鳞状细胞分化程序的重要调节剂。这些实验中的一个最重要的发现是这些基因是细胞中HIF1α和PERP表达的重要调节剂。在我们的实验中，R2R基因是正调节剂并且对该机制的干预开创了癌症治疗的治疗可能性。
材料和方法
小鼠胚胎和组织处理。所有的动物实验均由莱顿大学医学中心的动物伦理委员会(Animal Ethics Committee ofLeiden University Medical Center)核准并且按照NIH出版的实验室动物护理和应用指南(Guide for the Careand Use of Laboratory Animals)进行。杂合体Vegf+/120小鼠杂交以得到Vegf120/120胚胎和Vegf+/+野生型同窝仔。将阴道栓的上午定义为为胚胎日(E)0.5。怀孕的雌鼠通过颈脱位法处死。在无菌PBS中分离E12.5，14.5和16.5胚胎。在不含RNA酶的条件下小心切下胚胎胸，置于组织冷冻介质(TBS，Triangle Biomedical Sciences，Durham NC)中，冷冻并且保存在-80℃。胚胎根据时期和母体起源的分布表示在表S1中。
切成低温恒温切片(8μm)并且附着在SuperFrost Plus显微镜载玻片(Menzel Gmbh&Co K G，Braunschweig德国)上。不同时期的胚胎胸的切片和进一步的免疫组织化学处理随机进行。
免疫组织化学和激光捕获显微解剖。在心脏两心室视图的水平下选择来自每个胚胎胸的三张组织切片。这些在一个批次中进行免疫组织化学处理。通过将载玻片从-80℃冰箱中取出后在2分钟过程中放置在冷丙酮(4℃)中而固定低温恒温切片。所有的进一步的免疫组织化学步骤都在4℃进行，并且所有的缓冲液和抗体溶液保存在4℃。通过将RNAsecure(25x，AM7006，Ambion TX)在需要的缓冲液中稀释至1x而制备不含RNA酶的PBS或D-PBS缓冲液。所有的抗体溶液都在PBS中制备，而异凝集素GS-IB4缀合物是稀释在D-PBS中。向每种抗体溶液中加入Superase.In(AM2696，Ambion，Austin，TX)至终浓度为1U/μl。将载玻片晾干，并且组织切片用疏水屏障笔(hydrophobic barrier pen)画上界线。在将该载玻片放置在冷金属板(4℃)上时，向每个组织切片应用30μl PBS并且排干。随后，将30μl浓度为10μg/100μl的小鼠抗角蛋白pan(4，5，6，8，10，13，18)单克隆抗体(MAB1636，Chemicon)滴到样本上。2分钟后，排干抗体溶液，并且用250μl PBS轻轻润洗组织切片。然后应用30μl浓度为10μg/100μl的Alexa-fluor-488鸡抗-小鼠IgG(H+L)缀合物(A21200，Invitrogen CA)2分钟，接着再用250μl PBS轻轻洗涤。最后，使用30μl浓度为10μg/100μl的异凝集素GS-IB4Alexa Fluor594缀合物(I21413，Invitrogen，CA)的第三轮2分钟染色完成该染色步骤。将组织切片在室温脱水：75％EtOH(30sec)，95％EtOH(30sec)，100％EtOH(30sec)，100％EtOH(120sec)，二甲苯(180sec)。在脱水步骤后立即在Veritas显微解剖仪(Arcturus BioscienceInc.，Mountain View，CA)上进行激光捕获的显微解剖。我们从在心脏两心室视图水平的三个组织切片的胚胎肺中的肺内呼吸道或血管切下3x300至400个细胞(作为一式三份样品)。关于小鼠抗角蛋白pan单克隆抗体/鸡抗-小鼠IgG Alexa-fluor-488缀合物的细胞染色鉴定为绿色荧光细胞(蓝色滤波片)。这些绿色荧光细胞定义为呼吸道上皮细胞(ker+细胞)，并且随机切下，而不管其邻近或远端呼吸道的形态。关于异凝集素GS-IB4Alexa-fluor-594缀合物的细胞染色鉴定为红色荧光细胞(绿色滤波器)。这些细胞定义为具有内皮特征的间质细胞(il+细胞)。在这三个胚胎时间点(E12.5，14.5，16.5)没有观察到关于两种标记的细胞的染色。事实上，绿色和红色荧光细胞可以彼此观察为阳性/阴性图像。显微解剖的ker+或il+细胞收集在Gene Amp管(Applied Biosystems，Foster City CA)中，管中充满75μl含有0.14Mβ-巯基乙醇和200ng聚肌苷酸(Sigma)的RNeasy裂解缓冲液(RLT；Qiagen，Hilden，德国)。
RNA分离、扩增、标记和微阵列杂交。激光-捕获的样品在42℃温育20分钟，然后在冰上冷却。在进一步处理之前，将样品保存在-80℃。解冻后，向每份样品中加入等体积的70％乙醇，然后转移到RNeasyMinElute Spin柱(Qiagen)上。按照供应商的使用说明清洁RNA，洗脱在14μl不含RNA酶的水中，并且通过真空干燥调节至4μl。需要进行两轮线性mRNA扩增，以产生足够量的cRNA。按照GeneChip真核样品和阵列处理手册(GeneChip Eukaryotic Sample and Array Processing Manual)(Affymetrix，Santa Clara，CA)进行两轮cDNA合成和生物素-标记的cRNA的合成。对于“spike-in”对照，其为GeneChip Poly-A RNA对照试剂盒(Affymetrix)。使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion，Austin，TX)体外转录第一轮扩增中的第二cDNA链，产生112-457ng aRNA。第二轮扩增，使用GeneChip体外转录(IVT)标记试剂盒由100ng第一轮aRNA起始，产生11-86μg的cRNA。标记的RNA与小鼠基因组MG-430_2.0GeneChip阵列(Affymetrix)杂交。杂交使用12.5μg生物素-标记的RNA在45℃在持续的旋转下进行16小时。阵列在Affymetrix Fluidics stations用链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(SAPE)染色，然后用抗-链霉抗生物素蛋白抗体染色和第二次SAPE染色。随后，用Agilent Laserscanner(Affymetrix)扫描阵列。
统计学分析。使用FARMS(Factor Analysis for Robust MicroarraySummarization)1总结Affymetrix探针水平数据。将原始数据用log2转化，以得到正常分布的数据。第一，应用无监督的多变量投影法，Spectral MapAnalysis2，来减少高量纲数据(highly dimensional data)的复杂性(n基因相对于p样品)。谱图分析提供该数据组中呈现的主要基因簇和受试者的没有偏见的鉴定。第二，以LIMMA(Linear Models for Microarray Data(关于微阵列数据的线性模型))3进行关于两种细胞来源(ker+相对于il+细胞)之间的差异性基因表达的检验，由于该方法使用跨基因信息，使得该分析甚至对于具有小阵列数目的实验也是稳定的3。第三，通过Vegf基因型和时间的两向相互作用，同样使用LIMMA3检验Vegf120/120敲除和野生型同窝仔之间在胚胎期表达模式方面的差异。因为我们仅对比较E16.5相对于E14.5和E12.5的时间模式感兴趣，所以汇集E12.5和E14.5数据。该检验分别在ker+和il+样品上进行，原因在于这两种组织来源于相同的胚胎。如LIMMA的模型假设所有样品是随机和独立地收集的。如果同时分析ker+和il+，则关于这种依赖性的校正将需要太复杂的模型。通过LIMMA分析还揭示了从组织类型的单一相互作用的基因组变异(ker+相对于il+样品)。使用MACT(Microarray Chromosome Analysis Tool(微阵列染色体分析工具))进行沿着整个基因组的差异性表达的分配。
结果/讨论
出生时，在肺中，O2和CO2需要穿过远端呼吸道和血管的大界面进行交换。小鼠中的胚胎肺发育在E(＝概念日后)16.51进行显著的转换。在此时，缠绕的呼吸道和血管树通过增殖和限定其远端分支而出芽。在出生前，远端呼吸道或呼吸管通过细分成薄壁小囊而增殖。这些小囊最终发育成出生后的肺泡2。薄壁呼吸道需要扁平细胞来促进气体转运。因此，在大约E16.5发生的向扁平呼吸道细胞的表型分化是胚胎肺发育中的关键时期。覆盖呼吸道的上皮细胞起源于分支的前肠内胚层。从E16.5，在远端呼吸道中的上皮细胞开始变平，而近端细胞保持其柱形形状。这些细胞中最远的细胞将作为小囊和肺泡的衬里，并且到E18.5发育成扁平的或甚至是鳞状形态。毛细管用扁平内皮细胞衬里，并且代表血管树的远端血管。覆盖肺血管的内皮细胞来源于中胚层间质。它们的生长需要密切配合其上皮对应物的生长，从而提供出生时开始气体交换的大的肺泡-毛细管界面。内胚层来源的呼吸道上皮与周围的中胚层间质之间相互的交互通讯(crosstalk)在早期肺形态发生时就开始了3，4。在E9.5开始，由周围的中胚层中的间质细胞产生的Fgf10对于分支内胚层是最重要的开端。与至少Shh，Bmp，TGF-β和Wnt信号传导因子的密切相互作用调节其早期分支机制。然而，作为在E16.5的晚期细胞形态变化和上皮-内皮交互通讯的基础的分子机制理解得很少。
为了获得关于E12.5后晚期肺分化的进一步的了解，我们开发了RNA-友好的免疫组织化学染色流程，用于发育的呼吸道中的上皮细胞的激光捕获显微解剖。我们推论由在不同胚胎期享有共同的上皮抗原的呼吸道细胞分离的RNA的下游基因表达模式应该随时间突出其转录变化。该程序应该至少反映上皮特征，优选肺呼吸道类型的上皮特征。在关于在不同胚胎期普遍表达的内皮标记而标记的肺细胞上检验相同的假设。另外，在本方法中结合具有晚期异常肺分支形态发生的小鼠敲除模型。我们选择Vegf120/120模型，因为在这些Vegf120/120敲除胚胎肺中周围呼吸道和血管分化被严重损害5，6，7。预测野生型上皮和内皮细胞表达一组呼吸道和血管分化基因，而在其Vegf120/120敲除对应体中缺少这些基因。Vegf120/120小鼠缺少VEGF-A同种型164和188，但是仍然表达同种型120。与更可溶的VEGF120变体相比，VEGF-A同种型164和188(VEGF164和VEGF188)更紧密地结合在细胞外基质上，并且局部聚集在远端呼吸道周围。标准观点阐述肺上皮细胞分泌这些VEGF-A同种型，而VEGF164和VEGF188通过刺激受体酪氨酸激酶Flkl(VEGF受体-2)和Fltl(VEGF受体-1)而鼓励肺内皮细胞的局部生长。内皮细胞的限制性扩展使肺血管树精细化并且允许上皮细胞的匹配性生长8，9。这种上皮-内皮交互通讯通过在远端呼吸道的肺泡和肺血管系统的毛细血管之间形成紧密的连接而允许出生时的气体交换。然而，这种类型的相互作用不能解释在围绕远端呼吸道上皮细胞的间质细胞中存在VEGF-A。
在从E12.5，E14.5和E16.5分离的胚胎胸部切下的冷冻组织切片上进行免疫组织化学染色(图2)。胚胎的基因组分布显示在表S1中。在我们的研究的胚胎时间框架中，我们选择这样的抗体，所述抗体表现出关于结合上皮或内皮抗原的充分的带宽。选择抗-细胞角蛋白(针对细胞角蛋白4，5，6，8，10，13和18)用于标记内衬呼吸道的上皮细胞(ker+细胞)，因为原始的和分化的上皮细胞普遍表达不同角蛋白的中间丝。在相同组织切片中的内皮细胞用异凝集素GS-IB4(Griffonia simplicifolia)Alexa-fluor-594缀合物染色，其结合小鼠(il+细胞)中的早期10和晚期内皮细胞11，12。在这三个胚胎时间点没有观察到关于两种免疫组织化学标记的细胞染色。通过激光捕获显微解剖选择性分离三百至四百个ker+和il+细胞。两轮线性mRNA扩增产生足够的cRNA用于与Affymetrix小鼠430_2.0Genechips杂交。
第一，我们检验下游基因表达模式是否反映关于胚胎期和上皮相对于内皮起源的差异。基因表达数据的研究性、无监督的分析揭示在胚胎发育过程中的基因表达变化解释数据组中的最大变化(35％)。该变化在图上充分表示在谱图的第一主分量(X-轴或PC1)中13(图3)。展示在三个胚胎阶段的最强的表达变化的基因位于X-轴的末端。这些基因中的一种，表面活性剂缔合的蛋白C(Sftpc)，已知在胚胎发生过程中具有重要的生理上调，并且其足量的蛋白产物是出生时正常呼吸所必需的14，15。第二主分量(Y-轴或PC2)，解释数据组中另外17％的变化，可能分配给细胞起源的基因表达差异。PC2轴上最远端探针组中的一些代表已知是肺上皮或内皮高度特征性的基因。在八个最远端探针组中，我们鉴定了CD93抗原(CD93)16和claudin5(Cldn5)17作为示例性的内皮基因，在Y-轴的相反侧，双箭头盒A1(Foxal)18和角蛋白8(Krt8)19作为表达的上皮基因。在谱图上不同样品的重合位置显示其沿着前两个主分量的分布。ker+和il+组沿着PC2按照其细胞来源清楚分离(图3)。Ker+样品分组为上皮类型基因和il+样品集合为内皮类型基因。两种细胞起源在相同胚胎期在PC1上集中在一起。这表明整体发育基因表达变化对于上皮(ker+)和内皮(il+)细胞是相似的。综合来看，当应用无监督的数据-驱动分析(unsupervised data-drivenanalysis)时，关于细胞起源(ker+相对于il+细胞)和胚胎期，样品簇集在一起。谱图分析强调选择性激光捕获显微解剖揭示了基因表达模式的良好的解析。样品的组织来源(ker+相对于il+)的独立的监督的单变量(逐个基因(gene-by-gene))分析进一步证实ker+和il+细胞在基因组水平上分别对应上皮或内皮细胞(图1)。
接着，在il+和ker+细胞中绘制与Vegf120/120敲除表型中的异常分支形态发生相关的转录模式。对于每种基因，我们检验Vegf120/120敲除和野生型(Vegf+/+)同窝仔之间该基因在胚胎期的表达模式是否显著不同。在Vegf+/+与Vegf120/120之间的阶段依赖性表达模式的这种差异揭示三个方向的基因组路标(genomic roadmap)。有几种基因仅在Vegf+/+基因型中鉴定为随胚胎期明显上调，例如Hmr(图2)。Vegf120/120基因型显示在所述阶段依赖性诱导中的损害。
首先，在Vegf120/120敲除的肺的呼吸道中的结构缺陷的原因变得明显。野生型ker+细胞与其Vegf120/120敲除对应体相比，在E16.5高度表达多余的44种上皮-特异性基因。一组表皮分化复合物(EDC)的基因主导该表达模式(图4)。S100a8和S100a9绘制在该EDC亚组中，并且已知为VEGF-A响应性20化学吸引物。还存在EDC的其他成分，如小的富含脯氨酸的区域(Sprr)基因和表皮角化包膜的晚期组分。在野生型ker+细胞中，在E16.5，细胞骨架角蛋白Krt2-6与该EDC亚组共表达。丝氨酸-半胱氨酸蛋白酶抑制剂和三种SCC基因(分层上皮分泌的蛋白基因)复合物组成上调的基因集合(图4)。
在野生型il+细胞中的胚胎期和基因型之间的相互作用研究也揭示在E16.5有限的基因组的明显的上调。与Vegf120/120敲除细胞相比，该反应导致在野生型il+细胞中在E16.5采用上皮-特异性转化程序。在野生型ker+细胞中，EDC簇、SCC簇、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和专有的角蛋白基因随胚胎期明显上调。Riken1110020A10，对应于Dsc1基因，在野生型il+细胞中在E16.5被高度上调。此外，Pkp1(亲斑蛋白1)在E16.5展现出相同的转录模式(图5)。似乎有高逻辑性模式驱动这些基因的簇集的上调。角蛋白是赋予细胞结构强度的中间丝蛋白，在上皮细胞中最典型21。由EDC和SCC簇编码的蛋白，以及丝氨酸-半胱氨酸蛋白酶抑制剂加强这种角蛋白网络。Dsc1(桥粒芯蛋白1)编码形成桥粒的形状的蛋白中的一种22，23。中间角蛋白丝与细胞内桥粒连接，其与缺口和粘着连接一起形成细胞连接。由Pkp1编码的蛋白特别是桥粒蛋白含量的正调节剂24，25并且本身是桥粒复合物的组分。Pkp1还连接中间角蛋白丝与粘着连接的钙粘蛋白。这些结果将通过VEGF-A同种型164和188的受体酪氨酸激酶刺激鉴定为肺中组装桥粒/中间丝机制的主要开关。这种机制在Wnt/β-连环蛋白-依赖性粘着连接(E-钙粘蛋白)之上为细胞骨架和细胞间结构增加了另一种结构单元(building block)。事实上，在野生型il+细胞中在E16.5的Eps8l1上调甚至揭示了与肌动蛋白的直接干扰，肌动蛋白是与中间丝系统不相关的一种重要的结构蛋白。这些细胞骨架和桥粒基因的协同的和簇集的表达允许远端呼吸道中扁平或鳞状细胞排列的成形。
第二，除了编码特定结构蛋白的基因的活化之外，一个感兴趣的发现是野生型il+细胞中在E16.5的Mapkapk3上调。在压力和促分裂原反应(如内皮细胞的VEGF-A刺激)中，Mapkapk3整合在ERK和p38信号传导26途径中。Cdkn2b(p15ink4b或Ink4b)(其为Ink4b-ARF-Ink4a肿瘤抑制基因基因座的一部分)同时上调。大量证据指出通过相关的polycomb组(Pcg)抑制物复合物对该基因座的抑制。当通过激活或过表达Mapkapk3解离Pcg复合物时，发生该基因座的去抑制作用27。细胞中的这种制动踏板(brake pedal)允许增殖刺激过程中的分化28，并且此处首次在体内证实。实际上，在肺中，允许il+细胞的上皮转化的细胞周期停滞是VEGF164-和VEGF188-依赖性的。有趣的是，Krt5，Krt14和Tcfap2c的上调与呼吸道上皮中基细胞祖先的表达特点显著相似29。基细胞表型仅在出生时在肺呼吸道上皮中出现，并且典型地结合异凝集素。另一方面，Krt1，EDC和SCC簇基因表达是鳞状分化程序。蛋白△Np63和TAap63分别推动角蛋白祖细胞和鳞状分化程序。编码这两种蛋白的Trp63基因在野生型il+细胞中上调。如提及的，在研究的时间点没有观察到关于抗-细胞角蛋白(抗-4，5，6，8，10，13和18)和异凝集素GS-IB4二者的细胞染色。因此，缺少抗-细胞角蛋白抗体的Krt1和Krt14结合允许鉴定野生型il+细胞在E16.5的特异性表皮转化程序。ker+上皮细胞产生这种上皮转录程序似乎是不可能的。这需要失去关于抗-细胞角蛋白抗体的结合能力才能避免ker+标记。同时，ker+细胞必须获得排他性的异凝集素GS-IB4染色。结果，我们提议肺il+细胞携带在E16.5成长为上皮成熟度的细胞储备库。换言之，肺间质il+细胞包括具有内皮和上皮能力的细胞。
第三，在野生型抗-细胞角质蛋白4-5-6-8-10-13-18染色的上皮细胞和野生型GS-IB4结合细胞中，在E16.5，由Affymetrix探针1437019at(RIKEN cDNA2200001I15基因)代表的基因和由Affymetrix探针1437145_s_at(RIKEN cDNA2310002J15基因）代表的基因均被上调。我们发现这两种基因(缺少生物学注解)与鳞状和基细胞转录程序密切地共同表达。它们在分化的呼吸道细胞的产生和再生方面起重要作用。(图6，图7，表1，表2)。从由已测序的克隆构建的最长的叠连序列开始，我们发现了RIKEN cDNA2200001I15基因转录物(图8)和RIKEN cDNA2310002J15基因转录物(图10)的人同源基因。此外，蛋白序列比对证实关于RIKEN cDNA2200001I15基因(图9)和RIKEN cDNA2310002J15基因(图11)的各自翻译的蛋白存在人同源蛋白。我们为RIKEN cDNA2200001I15基因、转录物和蛋白的哺乳动物同源基因提议名称R2R1，为RIKEN cDNA2310002J15基因、转录物和蛋白的哺乳动物同源基因提议名称R2R2，原因在于这些基因及其蛋白产物负责呼吸系统中的再生功能(regenerative function in the respiratory system)。
第四，我们发现VEGF-A在ker+和il+细胞中表达，而不在野生型或Vegf120/120敲除状态表达。此外，编码VEGF受体1的基因(Flk-1或Kdr)在il+细胞中丰富表达，但是在ker+细胞中在早至E14.5时也显著增加。这种VEGF-A和VEGF受体表达模式挑战传统的间质观点：间质被动等待来自肺上皮的VEGF-A刺激。其与最近的工作基本上一致，最近的工作证明内皮细胞的存活需要内源性VEGF-A表达和白分泌信号传导30，31。从野生型相对于Vegf120/120敲除的il+细胞的基因组特点看来，il+细胞是负载传送上皮转化刺激的细胞也是明显的。野生型il+细胞中在E16.5的Fgfbp1，Lgals7，Lgals3和Il18的上调表示这些刺激。编码成纤维细胞生长因子-结合蛋白1的基因(Fgfbp1)的上调表明原始的FGF-控制的肺出芽也在肺分化的最终阶段起作用。Fgfbpl通过汇聚FGF2起作用并且是上皮组织响应来自间质的FGF刺激的生长和分化的精细调节剂。在这一方面，FGF受体2基因(Fgfr2)在ker+和il+隔室中丰富表达。
总之，进行了在不同胚胎期享有特异性标记的细胞的选择性激光捕获显微解剖。这允许关于胚胎期、细胞起源和Vegf基因型区分基因表达模式。由该方法揭示的转录程序突出中间丝和桥粒网络在肺结构的精细化中的重要性。这种机制在Wnt/β-连环蛋白-依赖性粘着连接(E-钙粘蛋白)之上为细胞骨架和细胞间结构增加了另一种结构单元。中间丝为将暴露于大量的机械压力和氧化压力的细胞提供需要的强度。不令人惊讶的是，肺细胞采用与暴露于相同的攻击的皮肤细胞相同的防御基因组程序。与细胞骨架的混杂性平行的是，在胚胎期晚期，il+细胞获得基细胞祖细胞程序，并且该程序是VEGF164-188-依赖性的。
我们已经证实FAM25家族的下调和C9orf169基因表达的下调降低KRT14表达。此外，我们知晓FAM25家族(人R2R1同源基因)和C9orf169(人R2R2同源基因)的表达被VEGFA/VEGF165上调。这些基因在VEGFA/VEGF165途径中怎样作用?siRNA介导的R2R同源基因敲低可以用来揭示R2R同源基因在该途径中的特异性作用。事实上，R2R同源基因的作用是调节细胞中的VEGFA/VEGF165反应。在肺上皮中，VEGFA和VEGF165同种型的基本表达是高的。上皮功能和结构比其内皮对应体要复杂得多。因此，在内皮中典型的VEGFA/VEGF165‘生长和增殖’作用需要在内皮中更加精细化。这是怎样实现的呢?表达R2R同源基因导致对HIF1A信号传导(武予氧耐受性)和特定的(PERP)抗-细胞凋亡途径的调节的同时调节。这将允许强上皮细胞(具有针对压力的主要的防御屏障)的产生(再生)，而没有带来无限生长潜力。换言之，特定的抗-细胞凋亡途径的调节不是对细胞凋亡的一般耐受的‘允许’。对细胞凋亡的一般耐受性将导致细胞无限增殖的危险状况：细胞发展成癌细胞。
本研究对某些人肺病带来了新的光明。在早产的新生儿中，当婴儿早产分娩时，晚期胚胎肺发育被破坏。肺泡中不足水平的表面活性剂蛋白在大量的早产儿中导致严重的呼吸窘迫。在新生儿肺中滴注表面活性剂已经辅助早产儿呼吸窘迫的预防和治疗。然而，机械换气的高氧水平和拉伸力仍然导致慢性肺损伤或者支气管肺发育不良(BPD)。加速早产儿的远端呼吸道中的鳞状分化可以防止这种变虚弱的状况。中间丝网络和基细胞库的同步补充对于寻找某些成人肺病的治愈也可能是无比重要的。采用鳞状表型伴有一些EDC簇基因的表达表征具有慢性阻塞性肺疾病(COPD)的成人呼吸道中的鳞状化生。然而，这种针对有害刺激的防御机制伴有再生性基细胞的丢失32。相反，胚胎继续发育鳞状分化程序，同时通过充分定义的路标建立基细胞储库。这种路标作为中间丝或基细胞转录机制中的药理学干预的指导。还指出转化的il+细胞作为肺上皮细胞的来源。
R2R1和R2R2的功能特征
已经在小鼠胚胎中证实了中间丝组基因的VEGF-A(小鼠同种型VEGF164＝同种型VEGF165)依赖性表达。这些中间丝基因的表达导致肺间质细胞中的肺上皮细胞的分化和基细胞程序的发育。
此外，还已经在成人原代上皮细胞中证实中间丝基因的VEGF-A(小鼠同种型VEGF164＝同种型VEGF165)依赖性表达。通过VEGF-A同种型VEGF165对这些细胞的刺激导致中间丝基因表达的上调。这些细胞中的中间丝基因表达通过同种型VEGF165特异性siRNA`s被下调。总之，中间丝基因的表达作为呼吸道分化和再生的变更(paradigm)。R2R1和R2R2在这一表达程序中起着特异性作用。
R2R1
在小鼠中，R2R1的表达是VEGF-A(小鼠同种型VEGF164＝人同种型VEGF165)依赖性的。肺的间质细胞(GS-IB4阳性染色细胞)获得基本上皮细胞基因表达程序。R2R1的表达对于间质到上皮的转变(MET)是必要的。
现在已经在除了肺之外的胚胎组织中证实R2R1在MET中的作用：通过MET实现心脏室间隔的完整性。在小鼠中，R2R1在发育中的室间隔中高度表达，并且是VEGF-A(小鼠同种型VEGF164＝人同种型VEGF165)依赖性的。相反，在发育中的右心室流出道中没有发现R2R1的表达：已知这种结构的发育是不依赖MET的(见图12)。
R2R1是小鼠和人种间质到上皮转变的候选基因：该基因的表达转导VEGF-A(小鼠同种型VEGF164＝人同种型VEGF165)对MET的作用。MET的相反过程是EMT(上皮到间质转变)。EMT是癌症进展和转移的必要部分。因此，R2R1可以在癌症生物学和治疗中起重要作用。
此外，计算(in silico)分析揭示R2R1的蛋白产物可能与核糖体相互作用。除了科学影响之外，R2R1蛋白结构域核糖体的相互作用对癌症生物学和MET领域中的药物开发具有意义。
R2R2
已经发现R2R2在成人原代肺上皮细胞中非常高度地表达。在体外，已经发现R2R1的表达随时间上调并且是VEGF-A(同种型VEGF165)依赖性的。R2R2蛋白产物对于成人肺上皮的正常分化和维持是重要的(见图13)。

Claims (12)

1.包括R2R1/2基因的多核苷酸，所述多核苷酸用于治疗选自由下列组成的组的一种或多种疾病和/或病症：
(a)心脏疾病和/或病症；
(b)肺疾病和/或病症；和
(c)癌症；
其中所述R2R1/2基因由下列序列编码，该序列选自由指定为SEQ IDNOS：1，2，4，5，7，8，10和11的序列或与其至少60％相同的序列组成的组。
2.包括R2R1/2蛋白的多肽，所述多肽用于治疗选自由下列组成的组的一种或多种疾病和/或病症：
(a)心脏疾病和/或病症；
(b)肺疾病和/或病症；和
(c)癌症；
其中所述R2R1/2蛋白由下列序列编码，该序列选自由指定为SEQ IDNOS：3，6，9和12的序列或与其至少60％相同的序列组成的组。
3.能够调节R2R1/2基因表达的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸用于治疗选自由下列组成的组的一种或多种疾病和/或病症：
(a)心脏疾病和/或病症；
(b)肺疾病和/或病症；和
(c)癌症。
4.能够与R2R1/2蛋白或其片段结合的抗体或其抗原结合片段。
5.权利要求4的抗体，其中所述R2R1/2蛋白由下列序列编码，该序列选自由指定为SEQ ID NOS：3，6，9和12的序列或与其至少60％相同的序列组成的组。
6.权利要求4或5的抗体，所述抗体用于治疗选自由下列组成的组的一种或多种疾病和/或病症：
(a)心脏疾病和/或病症；
(b)肺疾病和/或病症；和
(c)癌症。
7.诊断选自由下列组成的组的一种或多种疾病和/或病症的方法：
(a)心脏疾病和/或病症；
(b)肺疾病和/或病症；和
(c)癌症；和
(d)对(a)至(c)中任一项的易感性或易患素质；
所述方法包括检测待测受试者提供的样品中R2R1和/或R2R2基因表达水平的步骤，其中检测到R2R1和/或R2R2基因在所述样品中的异常水平指示上述(a)-(c)中提供的一种或多种疾病和/或病症和/或对上述(a)-(c)中提供的一种或多种疾病和/或病症的易感性或易患素质。
8.权利要求7的方法，其中所述方法包括使用设计为在严格条件下与选自由(a)SEQ ID NOS：1；2；4；5；7；8；10和/或11组成的组的序列的全部或部分杂交的寡核苷酸探针和/或引物。
9.鉴定或获得调节R2R1和/或R2R2基因表达的试剂的方法，所述方法包括使R2R1和/或R2R2基因与测试试剂接触和检测R2R1/2基因表达的任何调节的步骤。
10.药物组合物，所述药物组合物包括SEQ ID NOS：1，2，4，5，7，8，10和11或与其至少60％相同的序列提供的R2R1/2基因，以及药用赋形剂、载体或稀释剂。
11.药物组合物，所述药物组合物包括由SEQ ID NOS：3，6，9和12或与其至少60％相同的序列提供的R2R1/2蛋白，以及药用赋形剂、载体或稀释剂。
12.用于研究心脏和/或肺疾病或病症或者癌症的动物模型，其中所述动物模型通过调节或破坏R2R1/2基因产生。
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