JP2014066641A - 大腸菌ｏ１５７の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】病原性の大腸菌Ｏ１５７による汚染や感染の排除を効果的に行うために、食品等の被検試料から、迅速かつ精度よく大腸菌Ｏ１５７を特異的に検出することのできるイムノクロマト法による検出方法やそれに用いることができるイムノクロマト用大腸菌Ｏ１５７検出キットを提供すること。
【解決手段】被検試料をポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテル、塩化ベンザルコニウム等の界面活性剤で処理し、この処理物に大腸菌Ｏ１５７に対する抗体を作用させて病原性大腸菌Ｏ１５７を検出する。大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体は、異なるエピトープを認識する２種のモノクローナル抗体であることが好ましい。
【選択図】なし

Description

本発明は、大腸菌Ｏ１５７を検出する方法に関し、より詳しくは被検試料を界面活性剤で処理した処理物に大腸菌Ｏ１５７に対する抗体を作用させて検出する大腸菌Ｏ１５７の検出方法や、Ｏ１５７に対する抗体と界面活性剤とを備えたことを特徴とする大腸菌Ｏ１５７検出用キットに関する。

大腸菌Ｏ１５７とは、細胞の表面にある細胞壁由来のＯ抗原として１５７番目に発見された抗原を有する大腸菌を意味する。また、大腸菌の中でもベロ毒素を産生する菌は、腸管出血性大腸菌とも呼ばれ、菌が含まれている食品を摂取した場合等に、激しい腹痛、水様性の下痢、血便をひき起こすほか、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）などの合併症を起こすことが知られている。特に大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７による食中毒症状は、近年社会問題ともなっており、臨床検査における当該菌の検出精度の向上が重要視されている。

大腸菌Ｏ１５７の産生するベロ毒素の検出方法として、基盤表面上の単分子層を介して、末端にガラクトースを含む糖鎖誘導体を固定させた、大腸菌Ｏ１５７の生産するベロ毒素の検出センサー（例えば、特許文献１参照）や、カリックスクラウン誘導体の層が表面に形成された支持体を用いる、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７産生ベロ毒素の検出法（例えば、特許文献２参照）が報告されている。また、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の産生するベロ毒素（Ｓｔｘ）１のＢサブユニット上の５５番目のアスパラギンを特異的に認識するモノクローナル抗体や、かかるモノクローナル抗体を用いてＳｔｘ１を特異的に測定することを特徴とする免疫測定法（例えば、特許文献３参照）が報告されている。

抗原抗体反応を利用した大腸菌Ｏ１５７の検出方法としては、透明基板、該透明基板上に配置される金属膜及び該金属膜上に疎水結合あるいは静電結合で配置される大腸菌Ｏ１５７に対する抗体を備えている表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ（例えば、特許文献４参照）や、大腸菌Ｏ１５７と特異的に結合する抗体を感作した不溶性粒子と被検試料とを接触させ、抗原抗体反応により生ずる凝集の程度を分析する大腸菌Ｏ１５７の分析方法（例えば、特許文献５参照）が報告されている。

大腸菌Ｏ１５７の検出において、界面活性剤が用いられる例としては、微生物の抗原エピトープを露出させるための組成物であって、一般的強化培地及び少なくとも１つの構造改変有機化学薬品を含有する前記組成物（例えば、特許文献６参照）において、界面活性剤溶液は保存された抗原エピトープとの接触性を向上させるために使用されうる旨の記載があるが、前記組成物の作用は、内部特異的抗原を露出し得る欠陥細胞壁を生じる様に、標的微生物の代謝経路の改変であることが明記されており、前記組成物と検査試料との混合液に界面活性剤溶液を接触することにより、かかる作用が好ましい態様となることが示されており、界面活性剤溶液単独での使用は示されていない。

さらに、種々の大腸菌Ｏ１５７の検出のためのイムノクロマトストリップが市販されているが、そのほとんどの検出限界濃度は、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬ以上であり、さらなる検出精度の向上が求められている。

特開２００２−０２２７４５号公報 特開２００８−２３３０１１号公報 特開２００２−２７５２００号公報 特開平１１−２４２０３１号公報 特開平１１−１３３０２９号公報 特表２００２−５２８０５２号公報

本発明の課題は、迅速かつ精度よく大腸菌Ｏ１５７を特異的に検出することのできるイムノクロマト法や、それに用いることができるイムノクロマト用大腸菌Ｏ１５７検出キットを提供することにある。

本発明者らは、食品等の被検試料に大腸菌Ｏ１５７に対する抗体を作用させて、大腸菌Ｏ１５７の検出を行う従来法の改良を行うために、様々な試行錯誤を重ねてきたが、食品等の被検試料を界面活性剤で処理し、次いで加熱した加熱処理物に大腸菌Ｏ１５７に対する抗体を作用させた場合に、界面活性剤を使用しない場合と比較して大腸菌Ｏ１５７の検出精度が高くなることを見いだした。発明者らはさらに研究を続け、界面活性剤としてカテゴリーの異なる、非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００や陽イオン性界面活性剤である塩化ベンザルコニウムを用い、異なるエピトープを認識する２種以上のモノクローナル抗体を作用させた場合に、顕著に検出精度が高くなることをさらに見いだし、かかる検出方法は、交差反応性が低く、偽陽性の割合が従来品と比較して非常に小さいことを確認して、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、
［１］大腸菌Ｏ１５７を検出する方法であって、被検試料を界面活性剤で処理し、この処理物に大腸菌Ｏ１５７に対する抗体を作用させて大腸菌Ｏ１５７を検出することを特徴とする大腸菌Ｏ１５７の検出方法；
［２］処理物が、被検試料を界面活性剤で処理し、次いで加熱した加熱処理物であることを特徴とする上記［１］記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法；
［３］大腸菌Ｏ１５７に対する抗体が、大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法；
［４］大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体が、大腸菌Ｏ１５７の加熱処理菌体に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする上記［３］記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法；
［５］大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体が、異なるエピトープを認識する２種以上のモノクローナル抗体であることを特徴とする上記［３］又は［４］記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法；
［６］異なるエピトープを認識する２種以上のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする上記［５］記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法；
［７］大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ−１３４７）が産生するモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−１７Ｂ３、又はハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ−１３４６）が産生するモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−２０Ｂ６であることを特徴とする上記［３］〜［６］のいずれか記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法；
［８］界面活性剤が、非イオン性界面活性剤又は陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする上記［１］〜［７］のいずれか記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法；
［９］非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテルであることを特徴とする上記［８］記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法；
［１０］陽イオン性界面活性剤が、塩化ベンザルコニウムであることを特徴とする上記［８］記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法；
［１１］１×１０^３ＣＦＵ／ｍＬ以下の大腸菌Ｏ１５７を検出できることを特徴とする上記［１］〜［１０］のいずれか記載の検出方法；
［１２］大腸菌Ｏ１５７に対する抗体と界面活性剤とを備えたことを特徴とする大腸菌Ｏ１５７検出用キット；
［１３］大腸菌Ｏ１５７に対する抗体が、大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする上記［１２］記載の大腸菌Ｏ１５７検出用キット；
［１４］大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体が、大腸菌Ｏ１５７の加熱処理菌体に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする上記［１３］記載の大腸菌Ｏ１５７検出用キット；
［１５］大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体が、異なるエピトープを認識する２種以上のモノクローナル抗体であることを特徴とする上記［１３］又は［１４］記載の大腸菌Ｏ１５７検出用キット；
［１６］異なるエピトープを認識する２種以上のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする上記［１５］記載の大腸菌Ｏ１５７検出用キット；
［１７］大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ−１３４７）が産生する大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−１７Ｂ３、又はハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ−１３４６）が産生する大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−２０Ｂ６であることを特徴とする上記［１３］〜［１６］のいずれか記載の大腸菌Ｏ１５７検出用キット；
［１８］界面活性剤が、非イオン性界面活性剤又は陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする上記［１２］〜［１７］のいずれか記載の検出キット；
［１９］非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテルであることを特徴とする上記［１８］記載の大腸菌Ｏ１５７検出用キット；
［２０］陽イオン性界面活性剤が、塩化ベンザルコニウムであることを特徴とする上記［１８］記載の検出キット；
［２１］界面活性剤と大腸菌Ｏ１５７に対する抗体とを併用することを特徴とする大腸菌Ｏ１５７検出精度の向上方法；
に関する。

本発明の大腸菌Ｏ１５７の検出方法によると、食品等の被検試料における病原性の大腸菌Ｏ１５７を効果的に検出でき、大腸菌Ｏ１５７による食品汚染や感染を効果的に排除できる。

本発明の大腸菌Ｏ１５７の検出方法としては、被検試料を界面活性剤で処理し、この処理物に大腸菌Ｏ１５７に対する抗体（以下「抗大腸菌Ｏ１５７抗体」ともいう。）を作用させて、大腸菌Ｏ１５７を検出する方法であれば特に制限されず、また本発明の大腸菌Ｏ１５７検出用キットとしては、大腸菌Ｏ１５７に対する抗体と界面活性剤とを備えたキットであれば特に制限されず、上記大腸菌Ｏ１５７としては、病原性大腸菌Ｏ１５７を好適に例示することができ、病原性大腸菌Ｏ１５７としては、Ｏ１５７：Ｈ７株やＯ１５７：ＨＮＴ株やＯ１５７：Ｈ−株を好適に例示することができる。

上記被検試料としては、水、飲料、鶏肉・豚肉・牛肉等の食肉や食肉加工品、魚介類や水産加工品、牛乳、チーズ等の乳製品、野菜、漬物等の野菜加工品、果物などの食品や、動物やヒトの尿、糞便、吐瀉物、血液、組織等の生体試料を例示することができ、固形物の場合は、固形物の表面を滅菌水や滅菌大腸菌Ｏ１５７用液体培地で洗浄した洗浄液や、固形物を粉砕した後に滅菌水や滅菌大腸菌Ｏ１５７用液体培地で懸濁した懸濁液やその上清液を被検試料とすることができる。上記滅菌水には、被検試料のｐＨ等の条件を調整する緩衝剤が含まれていてもよい。

上記界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate：ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤、塩化ベンザルコニウム等の陽イオン性界面活性剤、３−[(３−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート（3-(3-cholamidepropyl)dimethylammonio-1-propanesulphonate：ＣＨＡＰＳ）等の両性界面活性剤、ポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテル（商品名としては例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標））、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名としては例えばＴｗｅｅｎ２０（登録商標））、ポリオキシエチレン(９)オクチルフェニルエーテル（商品名としては例えばＮＰ−４０（登録商標））等の非イオン性界面活性剤を挙げることができ、ＳＤＳ、塩化ベンザルコニウム、ポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートが好ましく、塩化ベンザルコニウム、ポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテルがより好ましく、ポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテルが特に好ましい。

上記界面活性剤を被検試料に添加することにより、界面活性剤を添加しない場合と比較してより高い精度で大腸菌Ｏ１５７を検出することができ、例えば、液体被検試料中、１×１０^４ＣＦＵ／ｍＬ未満の、好ましくは５×１０^３ＣＦＵ／ｍＬ未満の大腸菌Ｏ１５７を検出することができる。

上記界面活性剤として、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテルを用いる場合の添加濃度（終濃度）としては、０．０１〜１０(v/v)％が好ましく、０．０５〜１．５(v/v)％がより好ましく、０．２〜１．０（v/v)％がさらに好ましく、０．３〜０．７(v/v)％が特に好ましい

上記界面活性剤として、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを用いる場合の添加濃度（終濃度）としては、０．０１〜１０(v/v)％が好ましく、０．０５〜２．０(v/v)％がより好ましく、０．０７〜１．０(v/v)％がさらに好ましく、０．０８〜０．２(v/v)％が特に好ましい。

上記界面活性剤として、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン(９)オクチルフェニルエーテルを用いる場合の添加濃度（終濃度）としては、０．００５〜０．０９(v/v)％が好ましく、０．０１〜０．０８(v/v)％がより好ましく、０．０３〜０．０７(v/v)％がさらに好ましい。

上記界面活性剤として、陽イオン性界面活性剤である塩化ベンザルコニウムを用いる場合の添加濃度（終濃度）としては、０．００１〜１．０(v/v)％が好ましく、０．００５〜０．５(v/v)％がより好ましく、０．０１〜０．１(v/v)％がさらに好ましく、０．０３〜０．０７(v/v)％が特に好ましい。

上記界面活性剤として、両性界面活性剤であるＣＨＡＰＳを用いる場合の添加濃度（終濃度）としては、０．２〜２．０(v/v)％が好ましく、０．３〜１.２(v/v)％がより好ましい。

上記界面活性剤として、陰イオン性界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリウムを用いる場合の添加濃度（終濃度）としては、０．０２〜０．５（v/v)％が好ましく、０．０３〜０．１２(v/v)％がより好ましい。

上記界面活性剤として、陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳを用いる場合の添加濃度（終濃度）としては、０．０１〜１(v/v)％が好ましく、０．０５〜０．５(v/v)％がより好ましく、０．０７〜０．２(v/v)％がさらに好ましく、０．０８〜０．１２(v/v)％が特に好ましい。

上記被検試料を界面活性剤で処理する方法としては、必要に応じて希釈した前記洗浄液、懸濁液やその上清液等の液状被検試料に界面活性剤を添加して混合・撹拌する方法や、固形状被検試料の表面を、界面活性剤を含有する滅菌水や滅菌大腸菌Ｏ１５７用液体培地で洗浄する方法や、固形状被検試料を粉砕した後に、界面活性剤を含有する滅菌水や滅菌大腸菌Ｏ１５７用液体培地で懸濁する方法を例示することができる。そして、被検試料を界面活性剤で処理した処理物、特に大腸菌Ｏ１５７用培地を含む処理物は、あらかじめ培養することにより調製された培養調製物とすることができる。上記滅菌水には、被検試料のｐＨ等の条件を調整する緩衝剤が含まれていてもよい。また、被検試料を界面活性剤で処理した処理物を、６０〜１５０℃で１〜６０分、好ましくは、９０〜１２１℃で５〜２０分加熱処理物とすることが好ましい。

上記大腸菌Ｏ１５７用培地としては、トリプトソーヤブイヨン（日水製薬社製)、ＴＡ１０ Ｂｒｏｔｈ(プリマハム社製)、ノボビオシン加ｍＥＣ培地(メルク社製)、ノボビオシン加ｍＴＳＢ培地(メルク社製)、ｍＥＣ培地(日水製薬社製)を挙げることができ、上記培養(増菌)に適した温度としては、３２〜５０℃、好ましくは３３〜４８℃、より好ましくは３４〜４５℃を挙げることができ、培養する時間としては、３〜４８時間、好ましくは４〜３６時間、より好ましくは５〜３０時間、特に好ましくは５〜２４時間を挙げることができる。

本発明の検出方法や検出用キットに用いられる抗体の種類としては、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体を例示することができ、モノクローナル抗体がその認識部位の特異性の点で好ましい。上記抗体の免疫グロブリンのクラスとしては特に制限されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のいずれのアイソタイプであってもよいが、ＩｇＧが好ましい。また、上記抗体の形態としては、大腸菌Ｏ１５７を検出することができれば、全抗体であっても、抗体断片であってもよく、かかる抗体断片としては、Ｆａｂ断片やＦ（ａｂ’）_２断片等の抗体断片、ＣＤＲ、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）などを挙げることができ、例えば、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、Ｆ（ａｂ’）_２断片は抗体をペプシン等で処理することにより調製することができる。

上記抗大腸菌Ｏ１５７抗体の抗体産生細胞の調製方法としては、大腸菌Ｏ１５７の生菌や、大腸菌Ｏ１５７を加熱処理して得た加熱菌体若しくはその粉砕処理物を、そのまま又は適当なアジュバントと共に免疫原として哺乳動物に投与し、免疫感作させる方法を例示することができるが、実際に得られる抗体と被検試料に含まれる抗原とを反応させる際の処理方法を考慮すると、大腸菌Ｏ１５７の加熱処理菌体を免疫源とすることが、簡便性と安全性の点で好ましい。上記哺乳動物としては、ラット、マウス、ウサギを挙げることができるが、作製の簡便性からマウスを用いることが好ましく、マウスに由来するモノクローナル抗体が好適に用いられる。投与箇所としては、静脈内、皮下、腹腔内を例示することができ、免疫を行う間隔としては、数日から数週間間隔が好ましく、１〜４週間間隔がより好ましい。抗大腸菌Ｏ１５７抗体産生細胞の分離は、最終の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に免疫動物から採取することにより行われるが、抗体産生細胞としては、脾臓細胞やリンパ節細胞や末梢血由来細胞が好ましく、脾臓細胞がより好ましい。

上記大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体（以下「抗大腸菌Ｏ１５７モノクローナル抗体」ともいう）の調製方法としては、ケラーとミルシュタインによるハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985）等の公知の方法を用いることができるが、上記抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合をおこない、上記大腸菌Ｏ１５７を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、培養培地又は腹水からモノクローナル抗体を採取するハイブリドーマ法を好適に挙げることができる。加熱菌体を免疫源とした場合、得られたモノクローナル抗体の中から、大腸菌Ｏ１５７加熱菌体抗原に結合できるモノクローナル抗体を複数選択し、サンドイッチＥＬＩＳＡにより大腸菌Ｏ１５７加熱菌体抗原を高精度に分析できるモノクローナル抗体の組合せ、例えばモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−１７Ｂ３とＯ１５７Ｗ−２０Ｂ６との組合せを選択することが好ましい。

上記ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ウサギ由来細胞等一般に入手可能な株化細胞を用いることができるが、上記抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましく、また、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ、陽性ハイブリドーマとして生存できる性質を有することが好ましく、具体的には、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、ＮＳ０／１等のマウスミエローマ細胞株、ＹＢ２／０等のラットミエローマ細胞株などを挙げることができる。

上記細胞融合の方法としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地において、抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法等により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、大腸菌Ｏ１５７を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。前記のとおり、抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取することができるが、培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、例えば、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。

抗大腸菌Ｏ１５７モノクローナル抗体等の大腸菌Ｏ１５７に対する抗体は標識化抗体として用いることができる。標識化抗体作製に用いられる標識物質としては、単独で又は他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質であればよく、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、金コロイド等を使用することができ、酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等を、蛍光物質としては、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等を、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等を、放射性物質としては^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ等を、それぞれ例示することができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、発光剤等を用いることができる。

上記被検試料を界面活性剤で処理した処理物に大腸菌Ｏ１５７に対する抗体を作用させて大腸菌Ｏ１５７を検出する方法としては、上記処理物に不溶性担体に結合した上記抗体を作用させて、前記処理物中の大腸菌Ｏ１５７を捕捉させて抗原抗体複合体とし、さらに標識化した大腸菌Ｏ１５７に対する抗体を反応させるサンドイッチ法や、上記処理物に磁気ビーズを結合した大腸菌Ｏ１５７に対する標識化抗体を作用させて抗原抗体複合体とし、磁力により分離して、該抗原抗体複合体中の標識物質を検出する磁気ビーズ法や、上記処理物に標識化した大腸菌Ｏ１５７に対する抗体を作用させた抗原抗体複合体を凝集沈殿させた後、遠心分離により分離して、抗原抗体複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法や、イムノクロマト法、二重免疫拡散法、放射免疫拡散法など公知の免疫測定法を利用することができるが、上記処理物に大腸菌Ｏ１５７に対する抗体として、それぞれ異なるエピトープを認識する２種以上のモノクローナル抗体を作用させて検出する方法、例えば不溶性担体に結合した大腸菌Ｏ１５７を認識するモノクローナル抗体と、異なるエピトープを認識する標識された大腸菌Ｏ１５７を認識するモノクローナル抗体（標識化第二抗体）を用いるサンドイッチ（二抗体）法や、異なるエピトープを認識する２種以上のモノクローナル抗体の少なくとも一つがイムノクロマト用に用いられる金コロイド等の標識物で標識されたモノクローナル抗体を用いるイムノクロマト法が好ましい。

上記不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等を挙げることができ、また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管、ラテックスビーズ状等の種々の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は特に限定されるものでなく、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。

上記イムノクロマト法による大腸菌Ｏ１５７の検出方法としては、上記処理物に、抗大腸菌Ｏ１５７抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体を作用させることにより抗原抗体複合体とし、イムノクロマトストリップ上を毛管現象等により移動する途中に、前記イムノクロマトストリップの所定の位置に固定されている前記金コロイド標識抗体とは異なるエピトープを認識する抗大腸菌Ｏ１５７抗体が、前記抗原抗体複合体を補足することで現れる着色ラインの有無によって定性分析する方法を挙げることができる。

上記イムノクロマトストリップの作製方法としては、例えば、抗体を、ＰＢＳ溶液で調製し、メンブレンに直線状に塗布し乾燥させ、その後、ＢＳＡやＴｗｅｅｎ２０等を含むＰＢＳで３０〜４０℃にてブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた抗体固定化メンブレンを調製し、処理物のスポット用のガラスウール製サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、処理物吸収用吸収パッドの順にそれぞれ貼り付ける方法を例示することができる。

上記金コロイドを結合した金コロイド標識抗体の作製方法としては、従来公知の方法を含め特に制限されず、例えば、炭酸カリウム溶液で調製した金コロイド溶液に、ホウ酸緩衝液に抗大腸菌Ｏ１５７抗体、好ましくは大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体を溶解した溶液を加え、室温で５分〜２時間、好ましくは１５〜６０分間反応した後、ＢＳＡ溶液を加えて反応させ、遠心分離する方法を挙げることができる。また、上記金コロイド標識抗体は、例えばガラスウール製コンジュゲートパッド等に塗布し、乾燥させることにより金コロイド標識抗体担持体とすることが保存性の点から好ましく、その場合は、使用時に上記被検試料を界面活性剤で処理した処理溶液等に溶解して検出試薬として使用することができる。

上記展開支持体は、例えば、金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含む緩衝液を、メンブレンに直線状に塗布し乾燥させた後、ブロッキング処理することにより作製することができる。

本発明の大腸菌Ｏ１５７検出用キットとして、好ましくは、大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体と界面活性剤、より好ましくはそれぞれ異なるエピトープを認識する２種以上の大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体と界面活性剤、さらに好ましくはそれぞれ異なるエピトープを認識する２種以上の大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体と非イオン性界面活性剤又は陽イオン性界面活性剤、特に好ましくはそれぞれ異なるエピトープを認識する２種以上の大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体とポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテル又は塩化ベンザルコニウムとを含み、さらに、上記モノクローナル抗体を溶解する緩衝液や、培養液(培地)や上記処理物を調製するための調製液や、取扱説明書等の添付文書等を含んでいてもよい。また、より好ましい態様の本発明の大腸菌Ｏ１５７検出用キットとしては、前記イムノクロマト法におけるテストストリップを挙げることができる。この場合、異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることが好ましい。

本発明におけるモノクローナル抗体としては、特に、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ−１３４７）が産生するモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−１７Ｂ３、及び／又はハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ−１３４６）が産生するモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−２０Ｂ６を好適に挙げることができ、これらハイブリドーマは、平成２４年（２０１２年）６月２５日（受託日）付で特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託されている。

以下、実施例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

１．抗大腸菌Ｏ１５７モノクローナル抗体の作製
１−１ 材料及び方法
（１）大腸菌Ｏ１５７抗原溶液の調製
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ４３８９４）株(以下「ＡＴＣＣ４３８９４株」ともいう。)は、ＡＴＣＣより購入した。ＡＴＣＣ４３８９４株をＴＡ１０ Ｂｒｏｔｈ(プリマハム社製)で培養後、集菌、洗浄し、ダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬社製）に溶解し、１００℃にて１５分間加熱処理することにより得た加熱処理菌体を、２．０×１０^９ＣＦＵ／ｍＬ溶液として調製し、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管した。

（２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社製）１０尾を用いた。初回免疫は、上記抗原溶液が５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに不完全フロイントアジュバント（Difco社製）を等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製した初回免疫用抗原エマルジョンを作製した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μＬ腹腔内に接種した。追加免疫も、初回免疫と同様に行い、２週間の間隔で５〜２０回行った。

（３）血中抗体価の測定
初回及び追加免疫で上記抗原溶液を注射後１週間経過時に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間静置後、遠心分離を行って血清を得た。これらの血清の１０倍希釈液を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories社製）を用いた。

（４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がった上記マウスに、上記抗原溶液１００μＬを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０（Gibco社製）で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 μm, Becton Dickinson社製）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０^６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson社製）に分注し、５％ＣＯ_２雰囲気下３７℃にて培養した。

（５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清をＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗大腸菌Ｏ１５７抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＡＴＣＣ４３８９４株抗原に対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９cells/wellとなるように９６ウェルの細胞培養用プレートに移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０^６cells/wellとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。

（６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、各ウェルの培養上清について、ＡＴＣＣ４３８９４株加熱菌体に対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにて調べた。その結果、１６種類の抗体産生ハイブリドーマを選抜した。

（７）腹水の採取及びモノクローナル抗体の精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍＬ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０^６cellsの選抜したハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein Ｇカラム（アマシャム ファルマシア社製）により精製した。

（８）モノクローナル抗体のクラス、サブクラス及びタイプ
モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen社製）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。

１−２ 結果
（１）抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７モノクローナル抗体の特性とクラス、サブクラス
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に対するモノクローナル抗体を１６種類得た。結果を以下の表１に示す。

（表１中、＋は大腸菌Ｏ１５７抗原に反応し陽性であることを示す。）

（２）抗体の組合せ条件
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を検出するための２つのモノクローナル抗体の組合せは、サンドイッチＥＬＩＳＡ及び作製したイムノクロマトストリップにおける、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ＡＴＣＣ４３９４加熱菌体及びその他の菌体に対する検出精度の点から選出した。抜粋したイムノクロマトストリップにおける大腸菌Ｏ１５７およびその他の菌に対する反応性の結果を以下の表２に示す。

上記表２の結果から明らかなとおり、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ−１３４７）が産生するモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−１７Ｂ３と、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ−１３４６）が産生するモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−２０Ｂ６とを検出精度の高い組合せとして選択した。

１．イムノクロマトによる大腸菌Ｏ１５７の検出
（１）金コロイド標識モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−１７Ｂ３とモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−２０Ｂ６について、２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ アルドリッチ社製）５ｍＬに各モノクローナル抗体の溶液を５００μＬ添加し、室温にて３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μＬ加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ_５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッドに６８μＬ／ｃｍ^２となるよう塗布し、乾燥させた。

（２）抗体固定化メンブレンの作製
モノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−１７Ｂ３とモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−２０Ｂ６とについて、それぞれＰＢＳで４ｍｇ／ｍＬとなるように溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃にて２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。

（３）イムノクロマトストリップの組立
上記コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検試料を界面活性剤で処理した処理物のスポット用のガラスウール製サンプルパッド、処理物吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。

（４）イムノクロマト法における抗体の組合せ条件
上記のイムノクロマトストリップにおいて、Ｏ１５７Ｗ−２０Ｂ６が金コロイド標識モノクローナル抗体であって、Ｏ１５７Ｗ−１７Ｂ３がニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布される場合に、より検出精度が高くなることを確認した。したがって、これ以降の実施例においては、金コロイド標識モノクローナル抗体としてＯ１５７Ｗ−２０Ｂ６を用いることとして、本発明のイムノクロマトストリップとしての検討を行った。

１．界面活性剤の検討
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ４３８９４）株を供試菌株として、各種の界面活性剤の添加効果の検討を行った。検討した界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳ（ナカライテスク社製）とデオキシコール酸ナトリウム（和光純薬工業社製）、陽イオン性界面活性剤である塩化ベンザルコニウム（和光純薬工業社製）、両性界面活性剤であるＣＨＡＰＳ（同仁化学研究所社製）、非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマ アルドリッチ社製）、Ｔｗｅｅｎ２０（エムピーバイオジャパン社製）、ＮＰ−４０（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社製）であった。日水製薬社製のトリプトソーヤブイヨン（カゼイン製ペプトン １７ｇ／Ｌ、ダイズ製ペプトン ３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム ５ｇ／Ｌ、ブドウ糖 ２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム ２．５ｇ／Ｌ）を培養液として用いて大腸菌Ｏ１５７（ＡＴＣＣ４３８９４）株について、培地に添加後３５℃にて２４時間培養した。細菌数を１．０×１０^４、１．０×１０^３、５．０×１０^２、１．０×１０^２ＣＦＵ／ｍＬとなるように調整し、各希釈液１ｍＬに、以下の表３に示す終濃度となるように各界面活性剤を添加し、沸騰水中にて１５分加熱して本発明における処理物とした。該処理物１００μＬを、金コロイド標識モノクローナル抗体を含む検出試薬と混合し、金コロイド標識モノクローナル抗体を作用させた後、上記本発明のイムノクロマトストリップに適用し、１５分後に目視で着色ライン検出の有無を判定した。結果を以下の表３に示す。

２．結果
（１）界面活性剤無添加
上記表３から明らかなとおり、界面活性剤を添加しない場合は、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬでは、「±：ラインが薄く、熟練者であれば陽性と判定可能」であり、検出限界濃度は１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬであることを確認した。

（２）非イオン性界面活性剤添加
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度が０．５％である場合、１．０×１０^３ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において「＋ｗ：ラインやや薄いが、経験がなくても陽性と判定可能」であり、５．０×１０^２ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において「±：ラインが薄く、熟練者であれば陽性と判定可能」であり、界面活性剤を添加しない場合と比較して検出精度が２０倍程度顕著に高くなり、検出限界濃度は５．０×１０^２ＣＦＵ／ｍＬであることを確認した。また、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度が１％である場合、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において「＋：明確に陽性と判定可能」であり、濃度が０．１％である場合でも１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において「＋ｗ」であり、界面活性剤を添加しない場合と比較して検出精度が高く、検出限界濃度は、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬ未満であることを確認した。

Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．５〜１．０％である場合、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において「＋ｗ」であり、界面活性剤を添加しない場合と比較して検出精度が高くなり、検出限界濃度は１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬ未満であることを確認した。Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．１％である場合、１．０×１０^３ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において「±」であり、検出限界濃度は、１．０×１０^３ＣＦＵ／ｍＬであることを確認した。また、ＮＰ−４０の濃度が０．０５％である場合、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において「＋ｗ」であり、界面活性剤を添加しない場合と比較して検出精度が高くなり、検出限界濃度は１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬ未満であることを確認した。

（３）陽イオン性界面活性剤添加
塩化ベンザルコニウムの濃度が０．０５％である場合、１．０×１０^３ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において「＋ｗ」であり、５．０×１０^２ＣＦＵ／ｍＬの細菌数では「±」であり、界面活性剤を添加しない場合と比較して検出精度が２０倍程度高くなり、検出限界濃度は５．０×１０^２ＣＦＵ／ｍＬであることを確認した。また、塩化ベンザルコニウムの濃度が０．０１％や０．１％である場合でも１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において「＋ｗ」であり、界面活性剤を添加しない場合と比較して検出精度が高くなり、検出限界濃度は１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬ未満であることを確認した。

（４）陰イオン性界面活性剤添加
ＳＤＳの濃度が０．１％である場合、１．０×１０^３ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において「±」であり、界面活性剤を添加しない場合と比較して検出精度が１０倍高くなり、検出限界濃度は１．０×１０^３ＣＦＵ／ｍＬであることを確認した。デオキシコール酸ナトリウムの濃度が０．０５％や０．１０％である場合に、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において「＋ｗ」であり、界面活性剤を添加しない場合と比較して検出精度が高くなり、検出限界濃度は１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬ未満であることを確認した。

（５）両性界面活性剤添加
ＣＨＡＰＳの濃度が０．５％や１．０％である場合、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において、「＋ｗ」であり、界面活性剤を添加しない場合と比較して検出精度が高くなり、検出限界濃度は１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬ未満であることを確認した。

２．ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
大腸菌Ｏ１５７の異なる１０種類の菌株を供試菌株とし、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて検出精度の検討を行った。上記トリプトソーヤブイヨンを用いて１０種類の各供試菌株を３５℃にて２４時間培養後、１．０×１０^２、１．０×１０^３、１．０×１０^４、１．０×１０^５、１．０×１０^６ＣＦＵ／ｍＬとなるよう調製した。その後調製液１ｍＬに、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を終濃度０．５％となるように添加し、沸騰水中にて１５分加熱して処理物とした。本発明のイムノクロマトストリップを用いて、各濃度のＴｒｉｔｏｎＸ‐１００の添加の効果を評価した。また、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を添加しない場合（ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００無添加）についても同様に評価した。結果を以下の表４に示す。

上記表４から明らかなとおり、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＡＴＣＣ４３８９４株、ＲＩＭＤ０５０９１８９６株、ＲＩＭＤ０５０９１９２４株、ＲＩＭＤ０５０９１８７１株、ＲＩＭＤ０５０９１８９１株、ＲＩＭＤ０５０９１９２９株、ＲＩＭＤ０５０９１９８０株においては、検出精度がほぼ１０倍となった。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＲＩＭＤ０５０９１９７４株においては、検出精度がほぼ１００倍となった。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＲＩＭＤ０５０９１９４４株、大腸菌Ｏ１５７：ＨＮＴのＲＩＭＤ０５０９１８９４株においては、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬにおいて「±」が「＋ｗ」となった。したがって、上記Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１０の１０種類の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のいずれの株においても、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を添加しない場合と比較して検出精度が顕著に高くなり、ＲＩＭＤ０５０９１９８０株を除き検出限界濃度が１０^４ＣＦＵ／ｍＬ未満であることが確認された。

１．Ａ社ストリップ
Ａ社より販売されているＯ１５７用テストストリップ（Ａ社ストリップ）を用いて、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００添加の効果を検討した。抽出サンプルの調製は実施例３と同様に行い、添付の説明書に従い抽出サンプル１５０μＬを試験管に分注し、ストリップを試験管に添加し、１５分後に目視で判定を行った。実施例３同様、大腸菌Ｏ１５７の菌株番号の異なる１０種類の菌株を供試菌株として、各濃度のＴｒｉｔｏｎＸ‐１００の添加の効果を評価した。また、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を添加しない場合についても同様に評価した。結果を以下の表５に示す。

上記表５から明らかなとおり、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＡＴＣＣ４３８９４株、ＲＩＭＤ０５０９１８９６株、ＲＩＭＤ０５０９１８９１株、ＲＩＭＤ０５０９１９４４株、及びＲＩＭＤ０５０９１９８０株においては、検出精度がほぼ１０倍となった。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＲＩＭＤ０５０９１８７１株及びＲＩＭＤ０５０９１９７４株においては、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において「±」が「＋ｗ」となり、ＲＩＭＤ０５０９１９２９株においては、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬの細菌数において「＋ｗ」が「＋」となった。ＲＩＭＤ０５０９１９２４株と大腸菌Ｏ１５７：ＨＮＴのＲＩＭＤ０５０９１８９４株における検出精度は変わらなかった。したがって、Ａ社ストリップを使用した場合であっても上記Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１０の１０種類の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のほとんどの株において、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を添加しない場合と比較してＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を添加した場合に検出精度が概ね高くなることが確認された。

２．Ｂ社ストリップ
Ｂ社より販売されているＯ１５７用テストストリップ（Ｂ社ストリップ）を用いて、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００添加の効果を検討した。抽出サンプルの調製は実施例３と同様に行い、添付の説明書に従い抽出サンプル１ｍＬを試験管に分注し、ストリップを試験管に添加し、１０分後に目視で判定を行った。実施例３同様、大腸菌Ｏ１５７の菌株番号の異なる１０種類の菌株を供試菌株として、各濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００の添加の効果を評価した。また、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加しない場合についても同様に評価した。結果を以下の表６に示す。

上記表６から明らかなとおり、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＡＴＣＣ４３８９４株、ＲＩＭＤ０５０９１９２４株、ＲＩＭＤ０５０９１８７１株、ＲＩＭＤ０５０９１８９１株、ＲＩＭＤ０５０９１９２９株においては、検出精度がほぼ１０倍となった。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＲＩＭＤ０５０９１９７４株においては、１．０×１０^３ＣＦＵ／ｍＬにおいて「±」が「＋ｗ」となった。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＲＩＭＤ０５０９１９８０株及び大腸菌Ｏ１５７：ＨＮＴのＲＩＭＤ０５０９１８９４株においては、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬにおいて「±」が「＋ｗ」となった。ＲＩＭＤ０５０９１８９６株とＲＩＭＤ０５０９１９４４株における検出精度は変わらなかった。したがって、Ｂ社ストリップを用いた場合、上記Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１０の１０種類の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のほとんどの株において、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を添加しない場合と比較してＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を添加した場合に検出精度が概ね高くなることが確認された。

１．培地の検討
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ４３８９４）株を供試菌株として、プリマハム社製のＴＡ１０ Ｂｒｏｔｈ（トリプトース１０．０ｇ／Ｌ、肉エキス５．０ｇ／Ｌ、酵母エキス５．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ブドウ糖０．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム７．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１５．０ｇ／Ｌ、塩類０．９５ｇ／Ｌ）、メルク社製のノボビオシン加ｍＥＣ培地、メルク社製のノボビオシン加ｍＴＳＢ培地の３種類の培養液を用いて、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００又は塩化ベンザルコニウムを添加した場合の効果の検討を行った。上記ＡＴＣＣ４３８９４株を３５℃にて２４時間培養後、細菌数を１．０×１０^６、１．０×１０^５、１．０×１０^４、５．０×１０^３、１．０×１０^３、５．０×１０^２ＣＦＵ／ｍＬに調整した。その後調製液１ｍＬに、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を終濃度０．５％となるように又は塩化ベンザルコニウムを終濃度０．０５％となるように添加し、沸騰水中にて１５分加熱して処理物とした。処理物１００μlを前記検出試薬（金コロイド標識モノクローナル抗体）と反応させた後、上記本発明のイムノクロマトストリップを添加し、１５分後に目視で判定を行った。結果を以下の表７に示す。

上記表７から明らかなとおり、界面活性剤を用いない場合、上記３種類の培養液で培養したときの検出限界濃度はいずれも１．０×１０^４ＣＦＵ／ｍＬであった。ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を終濃度０．５％となるように培養液に添加した場合、上記３種類のいずれの培地においても検出限界濃度は１．０×１０^３ＣＦＵ／ｍＬとなった。塩化ベンザルコニウムを終濃度０．０５％となるように培養液に添加した場合、ＴＡ１０ Ｂｒｏｔｈにおける検出限界濃度は１．０×１０^３ＣＦＵ／ｍＬであり、ノボビオシン加ｍＥＣ培地、ノボビオシン加ｍＴＳＢ培地における検出限界濃度は共に５．０×１０^３ＣＦＵ／ｍＬであった。したがって、培地の種類によって多少のばらつきはあるものの、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、又は０．０５％の塩化ベンザルコニウムを培養液に添加した場合には、検出精度が顕著に高くなることが確認された。

１．交差反応性の検討
大腸菌Ｏ１５７以外の６０種類の菌を供試菌株として、交差反応性試験を行った。上記トリプトソーヤブイヨンを培地として用い、各供試菌を３５℃にて２４時間培養後、細菌数１．０×１０^８ＣＦＵ／ｍＬとなるように調製した。その後調製液１ｍＬに、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を終濃度０．５％となるように添加し、沸騰水にて１５分加熱して抽出サンプルとした。抽出サンプル１００μＬを、金コロイド標識モノクローナル抗体を含む検出試薬と反応させた後、上記本発明のイムノクロマトストリップ（テストストリップ）に適用し、１５分後に目視で判定を行った。結果を以下の表８に示す。
また、前記Ａ社ストリップ及びＢ社ストリップについても、実施例４と同様に添付の説明書に従い、目視で判定を行った。結果を以下の表８に示す。

上記表８から明らかなとおり、６０種類の各供試菌において、本発明のイムノクロマトストリップとＡ社ストリップは、Ｎｏ．４のシトロバクター・フレウンディ（Citrobacter freundii）ＮＢＲＣ１６６２４株及びＮｏ．５７のサルモネラ・アーバナ（Salmonella Urbana）ＡＴＣＣ９２６１株に対して陽性を示した。シトロバクター・フレウンディとサルモネラ・アーバナは、大腸菌Ｏ１５７と共通のＯ抗原を有することが報告されており［（Nishiuchi et al. 2000. Structure and serologic properties of O-specific polysaccharide from Citrobacter freundii possessing cross-reactivity with Escherichia coli O157:H7. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 28, 163-170）及び（南弘一他. 2000. 腸管出血性大腸菌Ｏ１５７と共通抗原をもつ Salmonella Urbana(Ｏ３０) による重度の神経学的後遺症を残したサルモネラ症の1例. 小児感染免疫 12(1), 19-22）］、ここでの結果と一致した。したがって、上記本発明のイムノクロマトストリップとＡ社ストリップは、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を添加しても、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７との共通のＯ抗原以外の抗原との交差反応性がないことが確認された。

また、Ｂ社ストリップは、少なくともＴｒｉｔｏｎＸ‐１００を添加した場合、上記シトロバクター・フレウンディＮＢＲＣ１６６２４株及びＮｏ．５７のサルモネラ・アーバナＡＴＣＣ９２６１株に加え、シトロバクター・ローデンチウムＮＢＲＣ１０５７２３株、クロノバクター・サカザキＢＲＣ１０２４１６株、エドワードシエラ・タルダＮＢＲＣ１０５６８８株、エルウィニア・カロトボラＩＦＯ３３８０株、エシェリヒア・ブラッタエＮＢＲＣ１０５７２５株、大腸菌Ｏ１１１：Ｈ−のＲＩＭＤ０５０９２０１４株とＡＴＣＣ３３７８０株、大腸菌Ｏ１１１：Ｈ８ＲＩＭＤ０５０９２０２６株、大腸菌Ｏ２６：Ｈ４６ＲＩＭＤ０５０９６２４株、エシェリヒア・ファグソニイＮＢＲＣ１０２４１９株、エシェリヒア・ハーマンニイＡＴＣＣ３３６５０株、ＡＴＣＣ３３６５１株、ハフニア・アルベイＡＴＣＣ１３３３７株、プロテウス・ミラビリスＮＢＲＣ１０５６９７株、プロビデンシア・アルカリファシエンスＮＢＲＣ１０５６８７株、サルモネラ・パラチフスＢ ＡＴＣＣ５１９６２株等とも交差反応を示し、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＯ抗原を特異的に検出できないことが確認された。

本発明の大腸菌Ｏ１５７の検出方法は、被検試料を界面活性剤で処理することにより、界面活性剤を使用しない場合と比較して、検出精度が非常に高く、また、交差反応性が低く、偽陽性の割合が従来品と比較して非常に小さいことが確認された。したがって、本発明は、病原性大腸菌Ｏ１５７による汚染や感染を防止する上で有用であり、食品産業において特に利用できる。

Claims (21)

1. 大腸菌Ｏ１５７を検出する方法であって、被検試料を界面活性剤で処理し、この処理物に大腸菌Ｏ１５７に対する抗体を作用させて大腸菌Ｏ１５７を検出することを特徴とする大腸菌Ｏ１５７の検出方法。
2. 処理物が、被検試料を界面活性剤で処理し、次いで加熱した加熱処理物であることを特徴とする請求項１記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法。
3. 大腸菌Ｏ１５７に対する抗体が、大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１又は２記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法。
4. 大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体が、大腸菌Ｏ１５７の加熱処理菌体に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法。
5. 大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体が、異なるエピトープを認識する２種以上のモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３又は４記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法。
6. 異なるエピトープを認識する２種以上のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法。
7. 大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ−１３４７）が産生するモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−１７Ｂ３、又はハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ−１３４６）が産生するモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−２０Ｂ６であることを特徴とする請求項３〜６のいずれか記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法。
8. 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤又は陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法。
9. 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテルであることを特徴とする請求項８記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法。
10. 陽イオン性界面活性剤が、塩化ベンザルコニウムであることを特徴とする請求項８記載の大腸菌Ｏ１５７の検出方法。
11. １×１０^３ＣＦＵ／ｍＬ以下の大腸菌Ｏ１５７を検出できることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載の検出方法。
12. 大腸菌Ｏ１５７に対する抗体と界面活性剤とを備えたことを特徴とする大腸菌Ｏ１５７検出用キット。
13. 大腸菌Ｏ１５７に対する抗体が、大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１２記載の大腸菌Ｏ１５７検出用キット。
14. 大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体が、大腸菌Ｏ１５７の加熱処理菌体に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１３記載の大腸菌Ｏ１５７検出用キット。
15. 大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体が、異なるエピトープを認識する２種以上のモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１３又は１４記載の大腸菌Ｏ１５７検出用キット。
16. 異なるエピトープを認識する２種以上のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１５記載の大腸菌Ｏ１５７検出用キット。
17. 大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ−１３４７）が産生する大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−１７Ｂ３、又はハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ−１３４６）が産生する大腸菌Ｏ１５７に対するモノクローナル抗体Ｏ１５７Ｗ−２０Ｂ６であることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか記載の大腸菌Ｏ１５７検出用キット。
18. 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤又は陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれか記載の検出キット。
19. 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテルであることを特徴とする請求項１８記載の大腸菌Ｏ１５７検出用キット。
20. 陽イオン性界面活性剤が、塩化ベンザルコニウムであることを特徴とする請求項１８記載の検出キット。
21. 界面活性剤と大腸菌Ｏ１５７に対する抗体とを併用することを特徴とする大腸菌Ｏ１５７検出精度の向上方法。