TWI527903B - 肉毒桿菌ａ型毒素融合瘤細胞株、其單株抗體、及包含該單株抗體的免疫檢測試劑及套組 - Google Patents

Description

肉毒桿菌A型毒素融合瘤細胞株、其單株抗體、及包含該單株抗體的免疫檢測試劑及套組

本發明提供一種可產生一融合瘤細胞株、一單株抗體以及包含該單株抗體之免疫檢測試劑及套組，其特徵在於該單株抗體係為抗肉毒桿菌A型毒素之專一性單株抗體。

肉毒桿菌(學名：Clostridium botulinum)是一種生長在常溫、低酸和缺氧環境中的革蘭氏陽性細菌，肉毒桿菌為極厭氧之產孢桿菌，其產生之毒素是主要致病因子。肉毒桿菌廣泛分布在自然界各處厭氧環境中，例如：土壤、蔬菜、水底淤泥、動物糞便以及受孢子污染的食品。

根據所產生肉毒桿菌毒素抗原性的不同，肉毒毒素可分為A、B、C、(Ca、Cb)、D、E、F、G、H這8個血清亞型。A型毒素：常見人類肉毒桿菌中毒毒素，毒性較強，能液化蛋白質。B型毒素：常見於自然界土攘，毒性較弱，部分液化蛋白質。C型毒素：僅對家禽、畜動物中毒，不對人類致病，不能液化蛋白質。D型毒素：僅對家禽、畜動物中毒，極少對人類致病，不能液化蛋白質。E型毒素：主要存在魚類，中毒案件常與魚類、海鮮類有關，可造成人類中毒，不能液化蛋白質。F型毒素：1958發現於丹麥，毒素與A、B型相似，部分液化蛋白質。G型毒素：能液化蛋白質，但不對人類致病。H型毒素為2013年新 發現之血清型，致病機轉不明。在人類有關肉毒桿菌中毒案件，大部份以A、B、E型毒素較常見，極少數為F與G型，C、D型常見於家禽、畜或鳥類。

其中，A型毒素係為最常見引起人類肉毒桿菌中毒之毒素，且因其毒性較強並能阻斷神經傳導物質乙醯膽鹼之釋放，致使中毒者神經元傳導受阻，導致局部或全身性的麻痺與呼吸困難。臨床稱之為肉毒桿菌中毒症(botulism)。若無良好的醫療照顧，則死亡率相當高。因此肉毒桿菌中毒個案常需要快速診斷與確實檢驗。

然而一般所使用的偵檢肉毒桿菌毒素的方法，包括PCR、ELISA、傳統致病原分離培養法等。由於肉毒桿菌中毒個案常需要快速診斷與檢驗，傳統肉毒桿菌的分離與毒素鑑定，需要厭氧培養及動物中和試驗，其中血清之毒素檢測需時5天，糞便之細菌培養需時14天，且厭氧操作技術需特製之厭氧操作平台，而非一般實驗室之抽氣櫃，且於細菌培養時需要特定之厭氧包以防此空氣進入培養皿，使培養皿內維持無氧環境，因此檢測之過程繁瑣並且耗時。但在肉毒桿菌中毒之時，若無即時以正確抗血清與特定之醫療方法治療，會造成高致死率。就防疫時效、快速鑑定以及即時之醫療照顧三者兼具之要求之層面而言，傳統類型之細菌培養與鑑定方法則無法達到此一需求，單株抗體的製備及篩選，有助於建立快速肉毒桿菌毒素蛋白檢測技術。

因此，本發明期望可提供一種A型肉毒桿菌毒素的融合瘤、單株抗體及其檢測套組/方法，此檢測套組/方法可快速檢測是否A型肉毒桿菌毒素中毒。

有鑑於此，本發明提一株鼠源融合瘤細胞株，可生產抗肉毒桿菌A型毒素(BoNT/A)之單株抗體，可以應用在酵素免疫分析法(ELISA)來檢測食物樣本及生物樣本中之肉毒桿菌A 型毒素。

本發本發明提供一種融合瘤細胞株，並於中華民國103年6月17日寄存於財團法人食品工業研究所，該融合瘤細胞株寄存編號為BCRC 960486，該融合瘤細胞株係由一親代細胞與一骨髓瘤細胞株融合而製成，該親代細胞係由將一肉毒桿菌A型毒素做為抗原免疫至一小鼠，並將該小鼠之一脾臟細胞取出而得，且該融合瘤細胞株可產生一單株抗體能夠專一性辨識一肉毒桿菌A型毒素(BoNT/A)，且對肉毒桿菌B型毒素(BoNT/B)與肉毒桿菌E型毒素(BoNT/E)不產生交叉反應。該單株抗體屬於IgG1亞型。

本發明亦提供前述單株抗體；較佳地，前述單株抗體能夠專一性辨識一肉毒桿菌A型毒素之重鏈，其係具有如SEQ ID NO.1之蛋白序列。

本發明又提供一免疫檢測套組，其係利用酵素連結免疫吸附分析法檢測待測檢體中的一待測抗原，其特徵在於該免疫檢測套組中含有本發明單株抗體，其可專一性辨識一肉毒桿菌A型毒素之重鏈，其係具有如SEQ ID NO.1之蛋白序列。

較佳地，前述免疫檢測套組進一步包含一偵測抗體及一訊號產生物質；該偵測抗體及該訊號產生物質係透過各種方式結合，在較佳地實施例中，其係透過共軛結合；前述訊號產生物質係包含，但不限於：放射性標記物、磷光標記物、冷光標記物、螢光標記物及酵素，於較佳實施例中，該冷光標記物係為一化學冷光標記物或一生物冷光標記物；前述酵素係包含，但不限於：過氧化氫酶(Hydrogen Peroxidase)、辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase，簡稱HRP)、鹼性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，簡稱AP)以及Beta-半乳糖苷酸酶(Beta-galactosidase)，於較佳實施例中，其係辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase，簡稱HRP)；前述免疫檢測套組進一步包含一受質，該受質可與該酵素反應而發生呈色反應。本發明免疫檢測套組包含習知之各種物 質，包含，但不限於：磷酸鹽緩衝溶液、Tween20緩衝溶液、阻隔試劑，如牛血清白蛋白、酪蛋白、動物明膠、微孔盤、雜交膜、試紙等。

較佳地，前述小鼠係為一BALB/c品系小鼠。

較佳地，前述骨髓瘤細胞株係來自NS-1細胞株。

本發明所提供之肉毒桿菌A型毒素單株抗體、以及可產生肉毒桿菌A型毒素單株抗體的融合瘤細胞株、以及肉毒桿菌A型毒素之免疫檢測試劑及套組，提供一種快速檢測肉毒桿菌A型毒素的方法，避免生物體感染而中毒。

1‧‧‧硬體支持物

10‧‧‧樣品墊(sample pad)

20‧‧‧共軛墊(conjugated pad)

30‧‧‧抗體塗布膜(antibody coated membrane)

40‧‧‧吸水墊(Absorption pad)

50‧‧‧單株抗體A(其可辨識A型肉毒桿菌毒素之重鏈)

60‧‧‧抗體B(其可辨識A型肉毒桿菌毒素之重鏈或輕鏈)

70‧‧‧扁平塑膠外殼

71‧‧‧判讀區視窗

72‧‧‧檢體視窗

80‧‧‧辣根过氧化物酶(HRP)

90‧‧‧肉毒桿菌A型毒素

100‧‧‧側向層析器(lateral-flow strip)

200‧‧‧固相吸附層

第1圖係為利用側向層析器，以本發明單株抗體來偵測肉毒桿菌A型毒素。

第2圖係為利用側向層析器(試紙)，以本發明單株抗體來偵測不同濃度肉毒桿菌A型毒素的結果。

第3圖係為利用側向層析器(試紙)，以本發明單株抗體來偵磷酸鹽緩衝溶液(做為對照組)、100ng/mL的蓖麻毒素、100ng/mL的肉毒桿菌B型毒素(BoNT/B)、100ng/mL的肉毒桿菌E型毒素(BoNT/E)、100ng/mL的肉毒桿菌A型毒素(BoNT/A)的結果。

第4圖係為利用側向層析器，以本發明單株抗體來偵測牛奶、火腿、豆腐、醬菜、果汁中100ng/mL肉毒桿菌A型毒素的結果。

第5圖係為利用酵素免疫檢測法(ELISA)，以本發明單株抗體來偵測肉毒桿菌A型毒素的示意圖。

第6圖係為利用酵素免疫檢測法(ELISA)，以本發明單株抗體來偵測連續稀釋之1~1000ng/mL的肉毒桿菌A型毒素(BoNT/A)、 1~1000ng/mL的肉毒桿菌B型毒素(BoNT/B)、1~1000ng/mL的肉毒桿菌E型毒素(BoNT/E)的結果。

本發明所述之免疫學原理、細胞培養、染色及蛋白質偵測等相關技術，以為相關技術領域具有通常知識者所能明瞭，故以下文中之說明，不再做完整描述。

本發明所提供之抗肉毒桿菌A型毒素之單株抗體、以及可產生肉毒桿菌A型毒素單株抗體的融合瘤細胞株、以及肉毒桿菌A型毒素之免疫檢測試劑及套組，具體實施例如下。

免疫檢測套組，其係利用三明治酵素連結免疫吸附試驗檢測待測檢體中的一待測抗原，其特徵在於該免疫檢測試劑中含有本發明之單株抗體。

1、小鼠免疫與抗肉毒桿菌A型毒素單株抗體之製備：

肉毒桿菌A型毒素之單株抗體的融合瘤細胞株，主要以肉毒桿菌菌株(ATCC7948)所生產之A型毒素做為免疫抗原，對BALB/c小鼠進行注射，使其產生免疫反應而產生抗體，再 經由融合瘤細胞株得到單株抗體，其經由下列方法製備：

A. BALB/C小鼠免疫

(a)取3隻BALB/c小鼠，將0.2mL佛朗氏完全佐劑(Complete Freund’s adjuvants)與A型肉毒桿菌類毒素製成乳劑，以腹腔注射方式施打，每隻小鼠注射10μg A型肉毒桿菌類毒素。

(b)14天後，將0.2mL佛朗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvants)與A型肉毒桿菌類毒素製成乳劑A，以腹腔注射方式分別施打 入3隻BALB/c小鼠體內。在第14天及第28天分別追加施打乳劑A並以眼窩採血方式採集老鼠血液，將老鼠血液靜置後離心以取得血清，再以ELISA檢測其抗體力價變化趨勢，當抗體力價達1：32000，追加施打1μg A型肉毒桿菌類毒素，五日後進行細胞融合試驗。

B. 骨髓瘤細胞培養：

(a)在小鼠預定進行融合前一週，取出先前保存在液態氮中的NS1骨髓瘤細胞(Myeloma cell,P3-NS-A-Ag4/1,NS-1)，進行細胞解凍。

(b)細胞保存瓶由液態氮中取出，迅速置於37℃回溫，待細胞接近完全溶解，以10mL不含血清之RPMI 1640培養液懸浮，離心800rpm，5分鐘，然後去上清液，以10mL含10%胎牛血清之RPMI 1640培養液懸浮骨瘤細胞，培養於25cm2細胞培養瓶(25T，cell culture flask)中，置入含5% CO2之培養箱進行培養。

(c)經16-24小時後，待其長滿細胞培養瓶後繼續繼代至75T細胞培養瓶，並持續以一比一的繼代以保持細胞的生長活性。

C. 細胞融合：

(a)利用頸椎脫離法犧牲老鼠後，以酒精擦拭胸、腹部後置於無菌操作台。

(b)使用無菌器械脫去皮毛及剪開肌肉打開腹腔，取出脾臟，置於不含血清之RPMI 1640培養液之無菌培養皿，並以10mL注射器抽吸RPMI 1640培養液，並重複將RPMI 1640培養液注入小鼠脾臟，將脾臟細胞沖出。

(c)處理好的脾臟細胞離心400x g，10分鐘。棄除上 清液，再重複上述動作一次，將雜質去除。

(d)將活性良好的骨髓瘤細胞自培養瓶拍下，離心400x g，10分鐘，去上清液，加入不含血清之RPMI 1640培養液懸浮，此動作共重複上述步驟兩次。

(e)取5x10⁷之骨髓瘤細胞及處理好的小鼠脾臟細胞混合，離心800 x g，5分鐘，棄除上清液，此動作重複一次。

(f)將離心下來的細胞敲鬆，在60秒內加入1mL 50%PEG 1500，繼續搖晃60秒，接著在60秒內加入1ml含10%血清的RPMI 1640培養液，接下來的2分鐘內加入9ml含10%血清的RPMI 1640培養液，離心400 x g，5分鐘。

(g)棄除上清液，以200mL含20%血清及10% OPTI-CLONE(ICN Biomedicals)-HAT-RPMI 1640培養液懸浮融合瘤細胞，並加至96孔微量培養盤上(Microwell-plate)進行融合瘤細胞培養。

D. 融合瘤細胞的培養：

經融合完成之細胞在96孔微量培養盤培養，共十盤，5-7天後視細胞生長情況換液。換液時抽出80-100μL，以不超過原體積之二分之一為原則，再加入新的含有HAT及血清之RPMI 1640培養液。

E. 融合瘤之篩選：

(a)進一步進行分析融合瘤細胞是否具有對抗A型肉毒桿菌毒素的抗體產生即為融合瘤篩選(screening)。所用方法如下：酵素免疫連結吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay；ELISA)，西方墨漬反應(Western blot)。

(b)利用酵素免疫分析法(ELISA,Enzyme-linked immuno sorbent assay)，來檢測具有分泌抗體能力 的融合瘤細胞。

(c)首先將A型肉毒桿菌毒素，以coating buffer(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,0.02% NaN3,pH 9.6)稀釋為1μg/mL後，加到96孔的ELISA免疫分析盤中(100μL/well)，放置於4℃隔夜，使A型肉毒桿菌毒素可結合在ELISA免疫分析盤上。第二天以PBST(為PBS中含0.1%的Tween 20)清洗ELISA免疫分析盤三次後，加入1%的BSA(溶於PBST中)(200μL/well)，進行blocking，以覆蓋未被抗原結合之空位(37℃，1小時)。再將免疫分析盤以PBST清洗三次後，加入融合瘤細胞培養液(50μL/well為1級抗體)，於37℃反應1小時。再以PBST清洗免疫分析盤五次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標幟的2級抗體(goat anti-mouse，以1：5000稀釋於1%的脫脂牛奶中)，(50μL/well)，於37℃反應1小時。最後以PBST清洗免疫分析盤五次後，加入100μL/well呈色劑3,3,5,5-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetra methylbenzidine，簡稱TMB)，於25℃中反應15分鐘。之後加入終止溶液0.16M的硫酸溶液來終止反應，以酵素免疫分析儀測定450nm(OD450)的吸光值。

(d)為了進一步分析融合瘤細胞，所分泌之抗體的專一性，並確定其可與A型肉毒桿菌毒素之輕鏈或重鏈反應，遂將經酵素免疫法分析後，具有反應的融合瘤細胞株進行西方點墨法(Western blot)的分析。首先A型肉毒桿菌毒素，經過十二硫酸脂鈉-多聚丙烯醯胺膠體(SDS-PAGE)電泳分 離蛋白質後，轉漬至硝化纖維紙(nitrocellulose paper,NC paper)上，進行西方點墨法的分析。

(e)以PBST(為PBS中含0.1%的Tween 20)清洗硝化纖維紙三次後，加入1%的BSA(溶於PBST中)，進行blocking，以覆蓋未被抗原結合之空位(37℃，1小時)。再將硝化纖維紙以PBST清洗三次後，加入融合瘤細胞培養液(1mL/well為1級抗體)，於37℃反應1小時。再以PBST清洗硝化纖維紙五次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標幟的2級抗體(goat anti-mouse，以1：5000稀釋於1%的脫脂牛奶中)，(10mL/well)，於37℃反應1小時。最後以PBST清洗硝化纖維紙五次後，加入10mL/well呈色劑，於25℃中反應10分鐘。

之後加入去離子水來終止反應，觀察抗體結合毒素部位之分子量。

F. 融合瘤細胞單株化：

(a)將具有對抗將具有對A型肉毒桿菌毒素抗體的融合瘤細胞株，利用極限稀釋法進行。

(b)取30個將具有對將具有對A型肉毒桿菌毒素抗體的融合瘤細胞，加200ml含20%血清及融合瘤反應試劑(Roche)之HT RPMI 1640培養液，各加入100μl之小鼠脾臟細胞或巨噬細胞做為伴飼細胞(feeder cell)，在96孔微量培養盤培養，10-14天觀察有無單株化形成。

(c)10-14天後所得單株化形成細胞群落即為本發明(寄存編號BCRC 960486)之融合瘤細胞。

G. 單株抗體種類之定性：

(a)經致病原免疫小鼠脾臟細胞融合瘤產生之單株抗 體之種類或亞種，將用小鼠融合瘤亞種分型組件Iso-strip(Roche公司)來測定。

(b)以Iso-strip來區別單株抗體是小鼠抗體種類中的IgA,IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3或IgM，其詳細步驟將依據廠商隨附之使用方法手冊。

H. 腹水之生產：

將0.5mL的降植烷(pristane)打入小鼠腹腔內，七天後將5x10⁶~1x10⁷前述本發明融合瘤細胞(寄存編號BCRC 960486)打入小鼠腹腔內，約7至14天後，小鼠腹部會逐漸膨大，接著每隔2至3天收集一次腹水，每次約2mL，每隻小鼠約共可收集5-10mL之腹水。將前述腹水經離心4500rpm，10分鐘後，取上清液，分裝至1.5mL器皿中，至於-20℃環境中備用。

I. 單株抗體純化

將protein G-sepharose以proteinG IgG binding buffer(Thermo)平衡之，然後將溶液B通入protein G-sepharose之管柱中，經5倍純化管柱體積之proteinG IgG binding buffer清洗，再以IgG Elution buffer(Thermo)沖洗出抗體，用Bio-Rad protein assay reagent測量蛋白質濃度，以1M、pH 9.0的Tris-HCl緩衝液中和其酸鹼度至pH 7，並分裝保存之，所得為本發明A型肉毒桿菌毒素單株抗體。

J. 單株抗體對不同抗原之交叉反應定性：

已經測知抗原性的單株抗體經量產純化後，將進一步以免疫墨漬法(Immunoblot)測定是否會交叉反應其他抗原。要點如下：不同致病原以溶解緩衝液溶解，其蛋白質經SDS-PAGE分開後轉漬至Nitrocellulose膜(Hybond-C Super；Amershan公司)上，經含5% 脫脂奶粉之PBS阻斷非特異結合後，加入待測單株抗體及HRP酵素結合之山羊抗小鼠免疫球蛋白反應後，轉變受質4-chloro-1-naphthol呈色。

2、以本發明單株抗體偵測肉毒桿菌A型毒素：

(a)將單株抗體7-3.2固著(coating)於96孔盤培養皿中，該單株抗體7-3.2係由融合瘤細胞(寄存標號BCRC 960486)所產生。

(b)取100uL(100ng/mL)肉毒桿菌A型加到以1% BSA磷酸鹽緩衝溶液處理過的含有本發明單株抗體96孔盤培養皿中，並置於37℃環境下反應60分鐘。

(c)以含有0.05% Tween-20之pH 7.4的磷酸鹽衝溶液清洗5次。

(d)加入其他不同株肉毒桿菌A型單株抗體與辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase，簡稱HRP)，形成溶液C，將溶液C加入上述反應96孔盤中，並置於37℃環境下反應60分鐘。

(e)將前述(d)步驟之96孔盤培養皿(即固相載體)以含有0.05% Tween-20之pH 7.4的磷酸鹽衝溶液清洗5次，再後加入100uL呈色劑3,3,5,5-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，簡稱TMB)於25℃中反應15分鐘。之後加入100uL終止溶液0.16M的硫酸溶液來終止反應，再吸取呈色反應上清液加至前述96孔盤中，並以ELISA讀機讀取波長450nm吸光值。

3、含抗肉毒桿菌A型毒素單株抗體之免疫檢測試劑：

本發明含有抗肉毒桿菌A型毒素單株抗體7-3.2 之偵測肉毒桿菌A型毒素能力，可透過側向層析檢測來驗證。

上述處理過的側向層析試驗器100取五個，在樣品墊(sample pad)30上分別加入濃度為磷酸鹽緩衝溶液(不含肉毒桿菌A型毒素，做為對照組)、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL的肉毒桿菌A型毒素100uL，測試液體會往吸水墊40(absorption pad)移動，等待10分鐘後觀察其偵測結果，其結果如第2圖所示。其中C段為對照條紋，T段則為樣本中的肉毒桿菌A型毒素與本發明單株抗體結合而顯示出的條紋。隨著肉毒桿菌A型毒素濃度越高，T段的條紋越深，顯示本發明單株抗體可專一性辨識肉毒桿菌A型毒素。

同樣地，上述處理過的側向層析試驗器100取五個，在樣品墊(sample pad)30上分別加入磷酸鹽緩衝溶液(做為對照組)、100ng/mL的蓖麻毒素、100ng/mL的肉毒桿菌B型毒素(BoNT/B)、100ng/mL的肉毒桿菌E型(BoNT/E)、100ng/mL的肉毒桿菌A型(BoNT/A)，其結果如第3圖所示，結果顯示只有肉毒桿菌A型毒素做為樣品在T段有條紋出現，顯示出本發明單株抗體可專一性辨識肉毒桿菌A型毒素。

接著，同樣地，取上述處理過的側向層析試驗器100取五個，在樣品墊(sample pad)30上分別加入摻有100ng/mL A型毒素之牛奶、火腿萃取液、豆腐萃取液、100ng/mL的泡菜萃取液及果汁，其結果如第4圖所示，結果顯示出牛奶、火腿、豆腐、泡菜、果汁皆可被偵測到含有肉毒桿菌A型毒素，而其中又以豆腐萃取液反應線條最為明顯。

4、含抗肉毒桿菌A型毒素單株抗體之免疫檢測試劑：

本發明含有抗肉毒桿菌A型毒素單株抗體之免 疫檢測試劑，可檢測待測樣本中的肉毒桿菌A型毒素，於較佳實施例中，係透過三明治免疫檢測法(Sandwich ELISA)來檢測肉毒桿菌A型毒素，示意圖第5圖所示，該免疫檢測試劑含有單株抗體A 50，其可辨識肉毒桿菌A型毒素之重鏈(SEQ ID NO.1)，並塗布在固相載體200上做為抓住肉毒桿菌A型毒素90的物質。

藉由上述ELISA來檢測以本發明單株抗體來偵測連續稀釋之1~1000ng/mL的肉毒桿菌A型毒素(BoNT/A)、1~1000ng/mL的肉毒桿菌B型毒素(BoNT/B)、1~1000ng/mL的肉毒桿菌E型毒素(BoNT/E)的結果，並以O.D.450nm波長讀取值，其結果如第6圖所示，結果顯示，只有肉毒桿菌A型毒素可被本發明免疫檢測試劑所偵測。

此外，使用本發明ELISA檢測試劑來偵測市售食品之外加肉毒桿菌A型含量，其結果如表一所示，結果顯示布丁、優格、火腿、熱狗、罐頭鮪魚、豆干皆可測得含有1,000pg/mL之外加肉毒桿菌A型毒素。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

寄存機構：財團法人食品工業發展研究所

寄存日期：103年6月17日

寄存編號：BCRC960486

<110> 國防醫學院

<120> 肉毒桿菌A型毒素融合瘤細胞株、其單株抗體、及包含該單株抗體的免疫檢測試劑及套組

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 448

<212> PRT

<213> Clostridium botulinum

<400> 1

50‧‧‧單株抗體A(其可辨識A型肉毒桿菌毒素之重鏈)

60‧‧‧抗體B(A型肉毒桿菌毒素之重鏈或輕鏈)

80‧‧‧辣根过氧化物酶(HRP)

90‧‧‧肉毒桿菌A型毒素

200‧‧‧固相吸附層

Claims (17)

1. 一融合瘤細胞株，其寄存編號為BCRC 960486，該融合瘤細胞株係由一親代細胞與一骨髓瘤細胞株融合而製成，該親代細胞係由將一肉毒桿菌A型毒素(BoNT/A)做為抗原免疫至一小鼠，並將該小鼠之一脾臟細胞取出而得，且該融合瘤細胞株可產生一單株抗體能夠專一性辨識一肉毒桿菌A型毒素(BoNT/A)之重鏈的胺基端。
2. 如申請專利範圍第1項之融合瘤細胞株，該融合瘤細胞株所產生之單株抗體能夠專一性辨識一肉毒桿菌A型毒素(BoNT/A)之重鏈，其係具有如SEQ ID NO.1之蛋白序列。
3. 如申請專利範圍第1項之融合瘤細胞株，該小鼠係為一BALB/c品系小鼠。
4. 如申請專利範圍第1項之融合瘤細胞株，該骨髓瘤細胞株係來自一BALB/c小鼠或一NS-1細胞。
5. 一種肉毒桿菌A型毒素(BoNT/A)單株抗體，其特徵在於該單株抗體係由申請專利範圍第1至第4項中任一項之融合瘤細胞株所產生，且能夠專一性辨識一肉毒桿菌A型毒素(BoNT/A)，且對似肉毒桿菌A型毒素不會產生非特異性反應。
6. 如申請專利範圍第5項之單株抗體，其能夠專一性辨識一肉毒桿菌A型毒素(BoNT/A)之重鏈，其係具有如SEQ ID NO.1之蛋白序列。
7. 一免疫檢測試劑，其係利用酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)檢測一待測抗原，其特徵在於該免疫檢測試劑中含有一申請專利範圍第5項之單株抗體。
8. 一免疫檢測套組，其係利用酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)檢測待測檢體中的一待測抗原，其特徵在於該免疫檢測套組中含有一申請專利範圍第5項之單株抗體。
9. 如申請專利範圍第8項之免疫檢測套組，進一步包含一偵測抗體及一訊號產生物質。
10. 如申請專利範圍第9項之免疫檢測套組，該偵測抗體及該訊號產生物質係透過共軛結合。
11. 如申請專利範圍第9項之免疫檢測套組，該訊號產生物質係選自下列所構成的群組之一：放射性標記物、磷光標記物、冷光標記物、螢光標記物及酵素。
12. 如申請專利範圍第11項所述之免疫檢測套組，該冷光標記物係為一化學冷光標記物或一生物冷光標記物。
13. 如申請專利範圍第11項所述之免疫檢測套組，該酵素系選自下列所構成的群組之一：過氧化氫酶(Hydrogen Peroxidase)、辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase，簡稱HRP)、鹼性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，簡稱AP)以及Beta-半乳糖苷酸酶(Beta-galactosidase)。
14. 如申請專利範圍第11項之免疫檢測套組，進一步包含一受質，該受質可與該酵素反應而發生呈色反應。
15. 一種免疫檢測方法，係利用一酵素連結免疫吸附試驗法(ELISA)進行檢測，包含有下列步驟：提供一固相載體(Solid phase carrier)：提供一單株抗體，該單株抗體具有申請專利範圍第5項所述之特徵；將該單株抗體施加(Applying)至該固相載體；提供一樣本抗原，該樣本抗原係與該單株抗體進行專一性結合；提供一待測檢體，該待測檢體可操作性地與該樣本 抗原進行免疫反應，藉以於該固相載體上形成一免疫複合物；提供一偵測試劑，該偵測試劑可操作性地與該免疫複合物進行免疫反應，並產生一訊號；以及偵測該訊號。
16. 如申請專利範圍第15項之免疫檢測方法，該樣本抗原係衍生自肉毒桿菌A型毒素(BoNT/A)。
17. 如申請專利範圍第15項之免疫檢測方法，該偵測試劑包含有一偵測抗體與一訊號產生物質。