JP2013538056A - インフルエンザｈ５赤血球凝集素の主要中和エピトープに特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２、あるいはインフルエンザＨ５赤血球凝集素の主要中和エピトープに特異的なキメラまたはヒト化モノクローナル抗体、およびその活性断片に関する。本発明はまた、こうしたネズミまたはキメラもしくはヒト化モノクローナル抗体あるいはその断片を用いたＨ５Ｎ１インフルエンザの予防および治療にも関する。
Description
配列提出
[0001]本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は２５７７＿２０３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと題され、２０１０年８月２０日に作成されている。配列表の電子形式の情報は、その全体が本明細書に援用される。
[0001]本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は２５７７＿２０３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと題され、２０１０年８月２０日に作成されている。配列表の電子形式の情報は、その全体が本明細書に援用される。
[0002]本発明は、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２、あるいはインフルエンザＨ５赤血球凝集素の主要中和エピトープおよびその活性断片に特異的なキメラまたはヒト化モノクローナル抗体に関する。本発明はまた、こうしたネズミまたはキメラもしくはヒト化モノクローナル抗体あるいはその断片を用いたＨ５Ｎ１インフルエンザの予防および治療のための方法および組成物にも関する。
[0003]本発明の背景の理解を容易にするか、または実施に関するさらなる詳細を提供するために、本明細書に用いる刊行物および他の題材は、本明細書に援用され、そして便宜のため、それぞれ、参考文献一覧に集められる。
[0004]インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１株が最近出現し、そしてこれらによってヒトにおいて引き起こされる死亡率が高いことから、将来のインフルエンザ・パンデミックの可能性に関する懸念が生じてきた。さらなるパンデミック大流行を防止するため、世界規模で、循環Ｈ５Ｎ１株に対する予防的および療法的手段に大きな関心が集まっており、そして努力がなされてきている。現在のワクチン戦略は、インフルエンザ株の抗原性変動によって妨害されてきている。抗体の内因性合成を要する現在のワクチン戦略は、パンデミック事象においては、Ｈ５Ｎ１感染に対して、即時性の保護を提供しないであろう。現在認可されている抗ウイルス薬剤には、Ｍ２イオンチャネル阻害剤（リマンチジンおよびアマンチジン）およびノイラミニダーゼ阻害剤（オセルタミビルおよびザナミビル）が含まれる。Ｈ５Ｎ１ウイルスは、Ｍ２イオンチャネル阻害剤には耐性であることが知られる（Ｂｅｉｇｅｌら、２００５）。ノイラミニダーゼ阻害剤、すなわちオセルタミビルおよびザナミビルにもまた耐性である、より新しい株のＨ５Ｎ１ウイルスが単離されてきている（Ｌｅら、２００５、ｄｅ ＪｏｎｇおよびＨｉｅｎ、２００６）。ノイラミニダーゼ阻害剤はまた、高用量および長期の治療を必要とし（ｄｅ ＪｏｎｇおよびＨｉｅｎ、２００６）、望ましくない副作用の可能性を増加させる。したがって、インフルエンザ治療のための代替戦略が必要とされる。
[0005]モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた受動免疫療法は、多くの感染性疾患の治療のための実行可能なオプションと見なされてきている。現在、インフルエンザウイルスのＨＡ１タンパク質に対する中和抗体を用いた療法的アプローチが注目を集めてきている。このタンパク質は、ウイルス表面上にあるため、ターゲットとするのが容易であり、そしてこのタンパク質に対する抗体は、ウイルスを効率的に中和可能である。したがって、Ｈ５赤血球凝集素（ＨＡ）の中和エピトープに対するモノクローナル抗体は、特に、インフルエンザ感染の高いリスクにある個体、すなわち能動免疫によく反応しない免疫無防備状態患者、乳児、幼児または高齢者には、ヒトの能動的ワクチン接種に対する魅力的な代替物でありうる。ヒト回復期血清の輸血による受動免疫は、インフルエンザパンデミック中の死亡率の５０％減少と関連づけられており、そしてＨ５Ｎ１インフルエンザＡウイルス感染に対して有効であることが示された（ＫｏｎｇおよびＺｈｏｕ、２００４； Ｌｕｋｅら、２００６）。いかなるｍＡｂ産物も、Ｈ５Ｎ１インフルエンザの循環株に対して広い防御を提供するべきであり、そしてｉｎ ｖｉｖｏで、中和エスケープ突然変異体の選択を防御すべきであることが重要である。
Ｂｅｉｇｅｌら、２００５
Ｌｅら、２００５
ｄｅ ＪｏｎｇおよびＨｉｅｎ、２００６
ＫｏｎｇおよびＺｈｏｕ、２００４
Ｌｕｋｅら、２００６
[0006]本発明は、インフルエンザＨ５赤血球凝集素の主要中和エピトープに特異的なモノクローナル抗体およびその活性断片に関する。本発明はまた、こうしたモノクローナル抗体またはその断片を用いたＨ５Ｎ１インフルエンザの予防および治療のための方法および組成物にも関する。
[0007]したがって、第一の側面において、本発明は、インフルエンザＨ５赤血球凝集素の主要中和エピトープに特異的なモノクローナル抗体、およびその活性断片、すなわち抗原結合断片（本明細書において抗体断片とも称する）を提供する。１つの態様において、モノクローナル抗体はネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２である。第二の態様において、モノクローナル抗体は、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体である。特に、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２が特異的に結合するＨ５赤血球凝集素の三次元エピトープに特異的に結合する。１つの態様において、モノクローナル抗体（ネズミ・モノクローナル抗体、あるいはキメラまたはヒト化モノクローナル抗体いずれか）またはその断片は、Ｈ５赤血球凝集素（ＨＡ）の三次元エピトープに特異的に結合し、ここで、三次元エピトープは、成熟ＨＡタンパク質のアミノ酸１５５（Ｓｅｒ）および１８９（Ａｒｇ）で構成される。別の態様において、軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣＤＲ）は、配列番号２に示すアミノ酸配列（本明細書において、ＨＭ４４８８２８とも称され、マウス軽鎖可変領域のアミノ酸配列である）内に位置する。さらなる態様において、軽鎖可変ＣＤＲのアミノ酸配列は： ＬＣＤＲ１： ＱＤＩＳＧＨ（配列番号５）； ＬＣＤＲ２： ＨＧＴ（配列番号６）；およびＬＣＤＲ３： ＶＱＹＶＱＦＰＷＴ（配列番号７）である。１つの態様において、重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ）は、配列番号４に示すアミノ酸配列（本明細書において、ＨＭ４４８８２７とも称され、マウス重鎖可変領域のアミノ酸配列である）内に位置する。別の態様において、重鎖可変ＣＤＲのアミノ酸配列は： ＨＣＤＲ１： ＧＹＴＦＴＴＹＷ（配列番号８）； ＨＣＤＲ２： ＩＤＰＹＤＳＥＴ（配列番号９）；およびＨＣＤＲ３： ＶＲＧＧＳＴＶＡＹＦＧＶ（配列番号１０）である。
[0008]１つの態様において、ＨＭ４４８８２８をコードするＤＮＡは、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む。別の態様において、ＨＭ４４８８２７をコードするＤＮＡは、配列番号３に示すヌクレオチド配列を含む。１つの態様において、軽鎖可変領域は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。別の態様において、重鎖可変領域は、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。１つの態様において、重鎖および軽鎖定常領域は、標準的クローニング技術によって、ヒト抗体産生細胞から得られる。別の態様において、ヒト重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。さらなる態様において、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、配列番号２２に示すアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＸ０９６３４．１）を含む。さらなる態様において、このアミノ酸配列をコードする核酸配列を配列番号２１（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ８８５２１８．１）に示す。１つの態様において、ヒト軽鎖定常領域は、ヒトカッパ鎖軽鎖定常領域である。別の態様において、ヒトカッパ軽鎖定常領域は、配列番号２４に示すアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ５８９８９．１）を含む。さらなる態様において、この配列をコードする核酸を配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ００２４１．１）に示す。
[0009]別の態様において、本発明は、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２、または本明細書記載のキメラもしくはヒト化モノクローナル抗体、あるいはその抗原結合断片を提供する。核酸配列の例には、本明細書記載のものが含まれる。さらなる態様において、本発明は、核酸を含む、ベクターを提供する。さらなる態様において、本発明は、ベクターを含み、そして発現している細胞を提供する。
[0010]第二の側面において、本発明は、こうしたネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２、またはキメラもしくはヒト化モノクローナル抗体、あるいはその活性断片を用いた、Ｈ５Ｎ１インフルエンザの予防および治療のための方法および組成物を提供する。１つの態様において、本発明は、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２、あるいは本明細書記載のキメラまたはヒト化モノクローナル抗体、および薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む、薬学的組成物を提供する。別の態様において、薬学的組成物は、本明細書記載のモノクローナル抗体の抗原結合断片および薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む。さらなる態様において、薬学的組成物は、前記抗体または抗体断片をコードする核酸分子および薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む。さらなる態様において、薬学的組成物は、前記核酸を含むベクターおよび薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む。別の態様において、薬学的組成物は、前記ベクターを発現している細胞および薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む。
[0011]１つの態様において、本発明は、被験体におけるインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス感染を減少させるか、あるいは被験体におけるインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス感染のリスクを低下させるか、１またはそれより多いインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス株または単離体による被験体の感染を阻害するか、あるいは１またはそれより多いインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス株または単離体によるインフルエンザ感染または疾患を予防する方法を提供する。この態様において、方法は、その必要がある被験体に、療法的有効量のネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２、または本明細書記載のキメラもしくはヒト化モノクローナル抗体、あるいはその抗原結合断片、前記抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子；前記ポリヌクレオチドを含むベクター；あるいは前記ベクターを発現している細胞を投与する工程を含む。１つの態様において、被験体は、免疫無防備状態であるか、乳児、幼児または高齢者である。別の態様において、投与は療法的利益を提供する。さらなる態様において、療法的利益は、インフルエンザウイルス力価の増加を阻害するか、インフルエンザウイルス力価を減少させるか、インフルエンザウイルス複製の増加を阻害するか、インフルエンザウイルス複製を減少させるか、インフルエンザウイルス増殖の増加を阻害するかまたはインフルエンザウイルス増殖を減少させるか、あるいは被験体におけるインフルエンザウイルス感染と関連する１またはそれより多い症状または合併症の進行、重症度、頻度、期間または可能性を減少させることを含む。１つの態様において、症状または合併症は、悪寒、発熱、咳、咽頭炎、鼻閉、副鼻腔鬱血、鼻感染、副鼻腔感染、体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳感染症、耳の痛みおよび死より選択される。別の態様において、療法的利益は、インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス感染からの被験体の回復を加速することを含む。さらなる態様において、被験体に投与される剤は、被験体のインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス感染の前、感染と実質的に同時、または感染後である。
[0016]本発明は、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２、あるいはインフルエンザＨ５赤血球凝集素の主要中和エピトープに特異的なキメラまたはヒト化モノクローナル抗体、およびその活性断片に関する。本発明はまた、こうしたネズミまたはキメラもしくはヒト化モノクローナル抗体あるいはその断片を用いたＨ５Ｎ１インフルエンザの予防および治療のための方法および組成物にも関する。
[0017]「単離された」によって、天然には一緒に存在する構成要素の少なくともいくつかから遊離した生物学的分子を意味する。
[0018]用語、単数または複数の「抗体」は、本明細書において、当該技術分野に認識される用語であり、そして既知の抗原に結合する分子または分子の活性断片、特に免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原に特異的に結合する結合部位を含有する分子を指すと理解される。免疫グロブリンは、免疫グロブリン・カッパおよびラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子によって実質的にコードされる１またはそれより多いポリペプチドを含むタンパク質である。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これらは次に、それぞれ、免疫グロブリン・クラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを定義する。重鎖のサブクラスもまた知られる。例えば、ヒトにおけるＩｇＧ重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスのいずれであってもよい。本発明記載の免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）またはサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）であってもよい。
[0019]本明細書において、抗体に関して「特異的に結合する」は、抗体が、構造的に異なる抗原（単数または複数）に対するよりも、より高いアフィニティでターゲット抗原に結合することを意味する。
[0020]典型的な免疫グロブリン構造単位は、四量体を含むことが知られる。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一対で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する、約１００〜１１０またはそれより多いアミノ酸の可変領域を定義する。用語、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
[0021]抗体は、全長の損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体として、あるいは多様なペプチダーゼまたは化学薬品での消化によって産生されるよく性質決定された多数の断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域において、ジスルフィド連結下の抗体を消化して、Ｆ（ａｂ’）２を生じ、これは、それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結されている軽鎖である、Ｆａｂの二量体である。Ｆ（ａｂ’）２を穏やかな条件下で還元して、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結を破壊して、それによってＦ（ａｂ’）２二量体をＦａｂ’一量体にすることも可能である。Ｆａｂ’一量体は、本質的にはＦａｂ断片であり、ヒンジ領域の一部を伴う（他の抗体断片の、より詳細な説明に関しては、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ． Ｅ． Ｐａｕｌ監修， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照されたい）。損なわれていない抗体の消化に関して、多様な抗体断片が定義されているが、当業者は、任意の抗体断片を、化学的にまたは組換えＤＮＡ方法論を利用することによってのいずれかで新規に合成可能であることを認識するであろう。したがって、用語、抗体にはまた、本明細書においてまた、全抗体の修飾によって産生されるかまたは新規合成された抗体断片、あるいは組換えＤＮＡ方法論を用いることによって得られた抗体および断片が含まれる。
[0022]キメラまたはヒト化モノクローナル抗体、ならびにその活性断片を含む「抗体」が、本発明の範囲内にあるよう意図される。既知の抗原に結合する分子の活性断片の例には、分離された軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片が含まれ、Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーの産物、ならびに上述の任意の抗体および断片のエピトープ結合断片が含まれる。
[0023]これらの活性断片は、いくつかの技術によって、本発明の抗体から得られうる。例えば、モノクローナル抗体を、ペプシンなどの酵素で切断し、そしてＨＰＬＣゲルろ過に供してもよい。次いで、Ｆａｂ断片を含有する適切な分画を収集し、そして膜ろ過等によって濃縮してもよい。抗体の活性断片を単離するための一般的な技術のさらなる説明に関しては、例えば、Ｋｈａｗら（１９８２）； Ｒｏｕｓｓｅａｕｘら（１９８６）を参照されたい。
[0024]組換え的に作製される抗体は、慣用的な全長抗体、タンパク質分解性消化から知られる活性抗体断片、ユニークな活性抗体断片、例えばＦｖまたは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ドメイン欠失抗体等であってもよい。Ｆｖ抗体は、サイズ約５０Ｋｄであり、そして軽鎖および重鎖の可変領域を含む。一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、共有連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体であり、そしてこれは、直接連結されたか、またはペプチドをコードするリンカーによって連結されたかいずれかの、ＶＨおよびＶＬコード配列を含む核酸から発現されてもよい。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）を参照されたい。抗体Ｖ領域由来の、天然には凝集しているが、化学的には分離されている軽鎖および重鎖ポリペプチドを、抗原結合部位の構造と実質的に類似の三次元構造にフォールディングするであろうｓｃＦｖ分子に変換するためのいくつかの構造。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号；第５，１３２，４０５号および第４，９５６，７７８号を参照されたい。
[0025]結合部位は、抗原結合に関与する抗体分子の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。抗体可変領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られるより保存された隣接ストレッチの間に挿入された、「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と称される、３つの非常に多様なストレッチを含む。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）および重鎖の３つの超可変領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）が、抗原結合表面またはポケットを形成するように、互いに対して三次元空間において配置される。したがって、抗体結合部位は、抗体のＣＤＲを構成するアミノ酸、および結合部位ポケットを構成する任意のフレームワークを指す。
[0026]当該技術分野に周知の方法を用いて、結合部位を構成する特定の抗体におけるアミノ酸残基の同一性を決定してもよい。例えば、米国特許出願公報第２０１０／００８０８００号を参照されたい。ＣＤＲ外部であるが、にもかかわらず、結合部位の裏打ちの一部である側鎖を有する（すなわち結合部位を通じて連結に利用可能である）ことによって、結合部位の一部を構成する、特定の抗体におけるアミノ酸残基同一性は、分子モデリングおよびＸ線結晶学などの当該技術分野に周知の方法を用いて決定可能である。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）を参照されたい。
[0027]キメラ抗体は、抗体の１またはそれより多い領域が、動物の１つの種由来であり、そして抗体の１またはそれより多い領域が、動物の異なる種由来であるものである。好ましいキメラ抗体は、霊長類免疫グロブリン由来の領域を含むものである。ヒト臨床使用のためのキメラ抗体は、典型的には、非ヒト動物、例えばげっ歯類由来の可変領域と、ヒト由来の定常領域を有すると理解される。対照的に、ヒト化抗体は、大部分のまたはすべての可変フレームワーク領域を含む非ヒト抗体由来のＣＤＲ、およびヒト免疫グロブリン由来のすべての定常領域を用いる。ヒト・キメラ抗体は、典型的には、げっ歯類由来の可変領域を有すると理解される。典型的なヒト・キメラ抗体は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域とともに、げっ歯類抗体から得られる重鎖および軽鎖両方の可変領域を有する。キメラ抗体には、ヒト定常領域の天然アミノ酸配列および天然げっ歯類可変領域配列に対するいくつかの変化が含まれてもよい。キメラおよびヒト化抗体は、ＣＤＲ移植アプローチ（例えば、米国特許第５，８４３，７０８号；第６，１８０，３７０号；第５，６９３，７６２号；第５，５８５，０８９号；第５，５３０，１０１号）、鎖シャッフリング戦略（例えば米国特許第５，５６５，３３２号； Ｒａｄｅｒら（１９９８））、分子モデリング戦略（米国特許第５，６３９，６４１号）等を含む、当該技術分野に周知の方法によって調製可能である。
[0028]「ヒト化抗体」は、本明細書において、二本鎖抗体の場合、少なくとも１つの鎖がヒト化されているものである。ヒト化抗体鎖は、フレームワーク領域の１またはそれより多くがヒトである可変領域を有する。一本鎖であるヒト化抗体は、フレームワーク領域の１またはそれより多くがヒトである可変領域を、鎖が有するものである。ヒト化抗体鎖またはその断片の可変領域の非ヒト部分は、非ヒト供給源、特に非ヒト抗体、典型的にはげっ歯類起源のものに由来する。ヒト化抗体に対する非ヒト寄与は、典型的には、１つの（またはそれより多い）ヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域の中に分散された、少なくとも１つのＣＤＲ領域の形で提供される。さらに、結合アフィニティを保持するよう、フレームワーク支持残基を改変させてもよい。
[0029]ヒト化抗体は、定常領域をさらに含んでもよい（例えば、軽鎖の場合、少なくとも１つの定常領域またはその部分、そして重鎖の場合、好ましくは３つの定常領域）。存在する場合、ヒト化抗体の定常領域は、一般的にヒトである。「ヒト化抗体」を得るための方法は、当業者に周知である。例えば、米国特許出願第２０１０／００８０８００号を参照されたい。
[0030]用語、定常領域（ＣＲ）は、本明細書において、免疫グロブリンの定常領域遺伝子を指す。定常領域遺伝子は、エフェクター機能を与える抗体分子の部分をコードする。キメラヒト抗体およびヒト化抗体に関しては、典型的には非ヒト（例えばネズミ）定常領域をヒト定常領域で置換する。本キメラまたはヒト化抗体の定常領域は、典型的にはヒト免疫グロブリンに由来する。重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ：アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマまたはミューのいずれから選択されてもよい。さらに、多様なサブクラスの重鎖（例えば重鎖のＩｇＧサブクラス）は、異なるエフェクター機能に関与し、そしてしたがって、所望の重鎖定常領域を選択することによって、所望のエフェクター機能を持つ抗体を産生可能である。本発明の範囲内で使用可能な定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、特にガンマ１（ＩｇＧ１）アイソタイプのＦｃ領域、ガンマ３（ＩｇＧ３）および特にガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ型のものであってもよく、好ましくはカッパ型のものである。１つの態様において、軽鎖定常領域は、ヒトカッパ定常領域（Ｈｉｅｔｅｒら（１９８０））であり、そして重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４定常鎖である。
[0031]用語、可変領域（ＶＲ）は、本明細書において、抗原への抗体の結合に直接関与する、抗体中の軽鎖および重鎖各対内のドメインを指す。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、その後、いくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、そしてもう一方の端に、いくつかの定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと整列し、そして軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。
[0032]用語、フレームワーク領域（ＦＲ）は、本明細書において、抗体の軽鎖および重鎖の可変領域内のフレームワーク領域の１またはそれより多くを指す（Ｋａｂａｔら（１９９２）； ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ（２００１）； ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗａ．ｅｄｕを参照されたい）。これらの発現には、抗体の軽鎖および重鎖の可変領域内のＣＤＲ間に挿入されるアミノ酸配列が含まれる。
[0033]ＣＤＲおよびＦＲ残基は、標準的配列定義（Ｋａｂａｔら（１９９２）、および構造定義（例えばＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）におけるようなもの）にしたがって決定される。これらの２つの方法が、ＣＤＲのわずかに異なる同一性を生じる場合、構造定義が好ましいが、配列定義法によって同定される残基は、どのフレームワーク残基をコンセンサス配列に移入するかを決定するために重要なＦＲ残基を考慮する。
[0034]用語「モノクローナル抗体」もまた、当該技術分野によく認識され、そしてこれは単一のクローニングされた抗体産生細胞の産物である抗体を指す。モノクローナル抗体は、典型的には、通常の短命である抗体産生Ｂ細胞を、迅速に増殖する細胞、例えば癌細胞（ときに「不死」細胞と呼ばれる）に融合させることによって作製される。生じるハイブリッド細胞、またはハイブリドーマは、迅速に増殖し、抗体を産生するクローンを生成する。
[0035]用語「断片」は、損なわれていないまたは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の部分または一部を指す。断片は、損なわれていないまたは完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理を通じて得られうる。断片はまた、組換え手段によっても得られうる。例示的な断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃおよび／またはＦｖ断片が含まれる。用語「抗原結合断片」は、抗原に結合するか、または損なわれていない抗体（すなわちこれらが得られた損なわれていない抗体）と抗原結合（すなわち特異的結合）に関して競合する、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片を指す。結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、あるいは損なわれていない免疫グロブリンの酵素的または化学的切断によって、産生される。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ、一本鎖、および一本鎖抗体が含まれる。
[0036]免疫原性が減少したヒト化抗体は、親抗体、例えばネズミ抗体に比較して、減少した免疫原性を示すヒト化抗体を指す。
[0037]親抗体の結合特性を実質的に保持するヒト化抗体は、こうしたヒト化抗体を産生するのに用いられた親抗体によって認識される抗原に特異的に結合する能力を保持するヒト化抗体を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、親抗体と同じかまたは実質的に同じ抗原結合アフィニティおよびアビディティを示すであろう。理想的には、抗体のアフィニティは、親抗体アフィニティの１０％未満ではなく、より好ましくは約３０％未満ではなく、そして最も好ましくは、アフィニティは、親抗体の５０％未満ではないであろう。抗原結合アフィニティをアッセイするための方法は当該技術分野に周知であり、そしてこれには、最大半量結合アッセイ、競合アッセイ、およびスキャッチャード分析が含まれる。
[0038]さらに、用語「療法的有効量」は、ヒトまたは動物に投与した際、前記ヒトまたは動物において、療法的効果を生じるのに十分である抗体の量を指す。有効量は、ルーチンの方法にしたがって、当業者によって容易に決定される。
[0039]本明細書において、用語「治療する」、「防止する」、「防止すること」および「防止」は、予防的または療法的剤の投与から生じる、被験体における、障害の１またはそれより多い症状の再発または開始の防止を指す。
[0040]第一の側面において、本発明は、インフルエンザＨ５赤血球凝集素の主要中和エピトープに特異的なモノクローナル抗体、およびその活性断片、すなわち抗原結合断片（本明細書において抗体断片ともまた称する）を提供する。１つの態様において、モノクローナル抗体はネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２である。ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２は、マウス・ハイブリドーマ４Ｃ２によって産生される。マウス・ハイブリドーマ４Ｃ２は、ブダペスト条約の条項の下に、２０１０年８月３日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０， ＵＳＡに寄託され、そして寄託番号ＰＴＡ−１１２４１を割り当てられた。本発明はまた、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２を産生するハイブリドーマにも関する。第二の態様において、モノクローナル抗体は、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体である。特に、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２が特異的に結合するＨ５赤血球凝集素の三次元エピトープに特異的に結合する。１つの態様において、モノクローナル抗体（ネズミ・モノクローナル抗体あるいはキメラまたはヒト化モノクローナル抗体）またはその断片は、Ｈ５赤血球凝集素（ＨＡ）の三次元エピトープに特異的に結合し、ここで、三次元エピトープは、成熟ＨＡタンパク質のアミノ酸１５５（Ｓｅｒ）および１８９（Ａｒｇ）で構成される。別の態様において、軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣＤＲ）は、配列番号２に示すアミノ酸配列（マウス軽鎖可変領域のアミノ酸配列であり、本明細書においてＨＭ４４８８２８とも称される）内に位置する。さらなる態様において、軽鎖可変ＣＤＲのアミノ酸配列は： ＬＣＤＲ１： ＱＤＩＳＧＨ（配列番号５）； ＬＣＤＲ２： ＨＧＴ（配列番号６）；およびＬＣＤＲ３： ＶＱＹＶＱＦＰＷＴ（配列番号７）である。１つの態様において、重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ）は、配列番号４に示すアミノ酸配列（マウス重鎖可変領域のアミノ酸配列であり、本明細書においてＨＭ４４８８２７とも称される）内に位置する。別の態様において、重鎖可変ＣＤＲのアミノ酸配列は： ＨＣＤＲ１： ＧＹＴＦＴＴＹＷ（配列番号８）； ＨＣＤＲ２： ＩＤＰＹＤＳＥＴ（配列番号９）；およびＨＣＤＲ３： ＶＲＧＧＳＴＶＡＹＦＧＶ（配列番号１０）である。
[0041]１つの態様において、ＨＭ４４８８２８をコードするＤＮＡは、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む。別の態様において、ＨＭ４４８８２７をコードするＤＮＡは、配列番号３に示すヌクレオチド配列を含む。１つの態様において、軽鎖可変領域は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。別の態様において、重鎖可変領域は、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。１つの態様において、重鎖および軽鎖定常領域はヒトである。別の態様において、ヒト重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。さらなる態様において、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、配列番号２２に示すアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＸ０９６３４．１）を含む。さらなる態様において、このアミノ酸配列をコードする核酸配列を配列番号２１（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ８８５２１８．１）に示す。１つの態様において、ヒト軽鎖定常領域はヒトカッパ軽鎖定常領域である。別の態様において、ヒトカッパ軽鎖定常領域は、配列番号２４に示すアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ５８９８９．１）を含む。さらなる態様において、この配列をコードする核酸を配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ００２４１．１）に示す。
[0042]別の態様において、本発明は、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２または本明細書記載のキメラもしくはヒト化モノクローナル抗体あるいはその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。核酸配列の例には、本明細書記載のものが含まれる。さらなる態様において、本発明は、核酸を含むベクターを提供する。さらなる態様において、本発明は、ベクターを含み、そして発現している細胞を提供する。
[0043]１つの態様において、本明細書に記載する技術、ならびに当業者に周知の技術を用いて、ヒト重鎖および軽鎖定常領域をマウス重鎖および軽鎖可変領域と合わせることによって、ヒト化抗体を調製する。別の態様において、それぞれ、本明細書記載のマウス軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲを含有するヒト化ＶＬおよびＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列を合成して、ヒト化抗体を調製する。
[0044]既知の配列のタンパク質をコードするＤＮＡを合成するための方法は、当該技術分野に周知である。こうした方法を用いて、本発明の本ヒト化抗体をコードするＤＮＡ配列を合成し、そして次いで、組換え抗体の発現に適したベクター系において発現する。これは、本発明の本ヒト化抗体配列を提供する任意のベクター系において達成可能であり、例えば機能する（抗原結合）抗体を産生するように会合しているヒト定常ドメイン配列およびマウス可変ドメイン配列を含む融合タンパク質を発現させる。
[0045]組換え抗体および特にヒト化抗体の発現に適した発現ベクター、宿主細胞、ならびにこうした抗体の発現に適した方法は、当業者に周知である。例えば米国特許第７，０７４，４０６号を参照されたい。
[0046]機能する免疫グロブリンを発現可能であることが知られる宿主細胞には、他の宿主細胞の中でも、例えば、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞、細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。これらのうち、ＣＨＯ細胞は、免疫グロブリンを有効に発現しそして分泌する能力があるため、多くの研究者によって用いられる。
[0047]本質的に、ヒト化抗体の組換え発現は、２つの一般的な方法の一方によって達成される。第一の方法において、宿主細胞は選択された定常領域に融合した重鎖および軽鎖可変配列両方の発現を提供する、単一ベクターでトランスフェクションされる。第二の方法において、宿主細胞は、それぞれ、選択された定常領域に融合した可変重鎖または軽鎖配列のいずれかの発現を提供する、２つのベクターでトランスフェクションされる。
[0048]第二の側面において、本発明は、こうしたネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２またはキメラもしくはヒト化モノクローナル抗体あるいはその断片を用いた、Ｈ５Ｎ１インフルエンザの予防および治療のための方法および組成物を提供する。１つの態様において、本発明は、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２あるいは本明細書記載のキメラまたはヒト化モノクローナル抗体、および薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む、薬学的組成物を提供する。別の態様において、薬学的組成物は、本明細書記載のモノクローナル抗体の抗原結合断片、および薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む、薬学的組成物を提供する。さらなる態様において、薬学的組成物は、前記抗体または抗体断片をコードする核酸分子、および薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む。さらなる態様において、薬学的組成物は、前記核酸を含むベクター、および薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む。別の態様において、薬学的組成物は、前記ベクターを発現している細胞、および薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む。
[0049]１つの態様において、本発明は、被験体において、インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス感染を減少させるか、あるいは被験体におけるインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス感染のリスクを低下させるか、１またはそれより多いインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス株または単離体による被験体の感染を阻害するか、あるいは１またはそれより多いインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス株または単離体によるインフルエンザ感染または疾患を予防する方法を提供する。この態様において、方法は、その必要がある被験体に、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２、または本明細書記載のキメラもしくはヒト化モノクローナル抗体、あるいはその抗原結合断片、前記抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子；前記ポリヌクレオチドを含むベクター；あるいは前記ベクターを発現している細胞の療法的有効量を投与する工程を含む。１つの態様において、被験体は免疫無防備状態であるか、乳児、幼児または高齢者である。別の態様において、投与は療法的利益を提供する。さらなる態様において、療法的利益は、インフルエンザウイルス力価増加の阻害、インフルエンザウイルス力価減少、インフルエンザウイルス複製増加の阻害、インフルエンザウイルス複製減少、インフルエンザウイルス増殖増加の阻害またはインフルエンザウイルス増殖減少、あるいは被験体におけるインフルエンザウイルス感染に関連する１またはそれより多い症状または合併症の進行、重症度、頻度、期間または可能性の減少を含む。１つの態様において、症状または合併症は、悪寒、発熱、咳、咽頭炎、鼻閉、副鼻腔鬱血、鼻感染、副鼻腔感染、体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳感染症、耳の痛みおよび死より選択される。別の態様において、療法的利益は、インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス感染からの被験体の回復を加速する工程を含む。さらなる態様において、被験体に投与される剤は、被験体のインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス感染の前、感染と実質的に同時、または感染後に投与される。
[0050]本発明記載の抗体は、生理学的に許容されうる配合物中で調製可能であり、そして既知の技術を用いて、薬学的に許容されうるキャリアー、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよい。例えば、任意の機能的に同等な抗体またはその機能する部分も含む、本発明にしたがった、そして本明細書に記載されるような抗体を、薬学的に許容されうるキャリアー、希釈剤および／または賦形剤と組み合わせて、療法的組成物を形成する。適切な薬学的キャリアー、希釈剤および／または賦形剤は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、多様なタイプの湿潤剤、無菌溶液等が含まれる。
[0051]本発明記載の薬学的組成物の配合は、当業者に知られる標準的方法論にしたがって達成可能である。例えば、本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， 第２１版， Ｄ．Ｂ． Ｔｒｏｙ監修， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ２００６を参照されたい。
[0052]本発明の組成物を、適切な薬学的に有効な用量で、固形、液体またはエアロゾルの形で、被験体に投与してもよい。固形組成物の例には、丸剤、クリーム、および移植可能投薬単位が含まれる。丸剤は経口投与可能である。療法クリームは局所投与可能である。移植可能投薬単位は、局部、例えば腫瘍部位で投与可能であるし、または療法的組成物の全身放出のために、例えば皮下で、移植されてもよい。液体組成物の例には、筋内、皮下、静脈内、動脈内注射に適応した配合物、ならびに局所および眼内投与のための配合物が含まれる。エアロゾル配合物の例には、肺に投与するための吸入装置配合物が含まれる。
[0053]投与の標準経路によって組成物を投与してもよい。一般的に、組成物は、局所、経口、直腸、鼻、皮内、腹腔内、または非経口（例えば静脈内、皮下、または筋内）経路によって投与されてもよい。さらに、組成物を、持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーに取り込み、該ポリマーを送達が望ましい場所の近傍で、例えば腫瘍部位で移植してもよい。該方法には、単一用量の投与、あらかじめ決定された時間間隔での反復用量の投与、およびあらかじめ決定された期間に渡る持続投与が含まれる。持続放出マトリックスは、本明細書において、酵素的または酸／塩基加水分解によって、あるいは溶解によって分解可能な材料、通常、ポリマーで作製されるマトリックスである。体内に挿入されると、マトリックスは酵素および体液による作用を受ける。持続放出マトリックスは、望ましくは、生体適合性物質、例えばリポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ ａｃｉｄ））、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド・コ・グリコリド（乳酸およびグリコール酸のコポリマー）、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコンによって選択される。好ましい生分解性マトリックスは、ポリラクチド、ポリグリコリドまたはポリラクチド・コ・グリコリド（乳酸およびグリコール酸のコポリマー）のいずれか１つのマトリックスである。
[0054]組成物を、生物学的活性物質または化合物、特に酸性ストレス、抗アポトーシス化合物、金属キレーター、ＤＮＡ修復阻害剤、例えばピレンゼピンおよび代謝産物、３−アミノ−１−プロパンスルホン酸（３ＡＰＳ）、１，３−プロパンジスルホネート（１，３ＰＤＳ）、アルファ−セクレターゼ活性化剤、ベータおよびガンマ−セクレターゼ阻害剤、タウタンパク質、神経伝達分子、ベータシート破壊剤、アミロイドベータ一掃／枯渇細胞性構成要素の誘引剤、ピログルタミン化アミロイドベータ３−４２を含むＮ末端一部切除アミロイドベータ阻害剤、抗炎症分子、「非定型抗精神病薬」、例えばクロザピン、ジプラシドン、リスペリドン、アリピプラゾールまたはオランザピンまたはコリンエステラーゼ阻害剤（ＣｈＥＩ）、例えばタクリン、リバスチグミン、ドネペジル、および／またはガランタミン、Ｍ１アゴニスト、ならびに任意のアミロイドまたはタウ修飾薬剤および栄養補助剤を含む他の薬剤、例えばビタミンＢ１２，システイン、アセチルコリン前駆体、レシチン、コリン、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｏｌｏｂａ）、アセチル−Ｌ−カルニチン、イデベノン、プロペントフィリン、またはキサンチン誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含む他の組成物と組み合わせて、本発明記載の抗体と一緒に、そして場合によって、薬学的に許容されうるキャリアーおよび／または希釈剤および／または賦形剤、ならびに疾患治療のための方法と一緒に投与してもよい。
[0055]タンパク質性の薬学的活性物質は、用量あたり１ｎｇ〜１０ｍｇの量で存在してもよい。一般的に、投与措置は、本発明記載の抗体０．１μｇ〜１０ｍｇの間の範囲、特に１．０μｇ〜１．０ｍｇの範囲、そしてより詳細には１．０μｇ〜１００μｇの間の範囲であるべきであり、これらの範囲内に属するすべての個々の数値もまた、本発明の一部である。投与が連続注入を通じて起こる場合、より適切な投薬量は、１時間あたり、体重キログラムあたり０．０１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲内であってもよく、これらの範囲内に属するすべての個々の数値もまた、本発明の一部である。
[0056]投与は、一般的に、非経口的、例えば静脈内であってもよい。非経口投与用の調製物には、無菌水性または非水性溶液、懸濁物およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒には、限定されるわけではないが、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。水性溶媒は、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁物からなる群より選択されてもよく、生理食塩水および緩衝媒体を含む。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル溶液、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充剤、電解質補充剤（例えば、リンゲルのデキストロースに基づくものなど）およびその他が含まれる。保存剤、例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガス等もまた存在してもよい。
[0057]薬学的組成物は、さらに、特にヒト起源の、タンパク質性キャリアー、例えば血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどを含んでもよい。意図される使用に依存して、さらなる生物学的活性剤が、本発明の薬学的組成物中に存在してもよい。
[0058]本発明において、エピトープ・マッピングによって、それぞれのエピトープに関して、ＨＡ２ｇｐに対する一団のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を性質決定した。ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１ウイルス感染に曝露されたマウスにおいて、これらのｍＡｂの療法的および予防的有効性を評価した。ネズミモデルにおいて、クレード１および２．１由来の２つの非常に病原性であるＨ５Ｎ１ウイルス株に対して、これらのｍＡｂの１つの予防的および療法的有効性を評価した。感染マウスの体重喪失、生存および肺におけるウイルス負荷クリアランスの動力学の観察によって、有効性を決定した。キメラまたはヒト化ｍＡｂをこのｍＡｂから調製した。
[0059]本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の技術範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の慣用技術を使用する。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら， １９８２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）； Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）； ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ， ２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第３版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）； Ａｕｓｕｂｅｌ ら， １９９２）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， 定期的改訂を含む）； Ｇｌｏｖｅｒ， １９８５， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）； Ｒｕｓｓｅｌｌ， １９８４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）； Ａｎａｎｄ， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク， １９９２）； ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク， １９９１）； ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ． Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ監修 １９８４）； Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ． Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ監修 １９８４）； Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８７）； Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．）； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｓ． １５４および１５５（Ｗｕら監修）， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９８７）； Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ． Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ監修， １９８６）； Ｒｉｏｔｔ， Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第６版， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， オックスフォード， １９８８； Ｆｉｒｅら， ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｆｒｏｍ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ケンブリッジ， ２００５； Ｓｃｈｅｐｅｒｓ， ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ， ２００５； Ｅｎｇｅｌｋｅ， ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）： Ｔｈｅ Ｎｕｔｓ ＆ Ｂｏｌｔｓ ｏｆ ｓｉＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓ， ２００３； Ｇｏｔｔ， ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ， Ｅｄｉｔｉｎｇ， ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）， Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， ニュージャージー州トトワ， ２００４； Ｓｏｈａｉｌ， Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ： Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， ＣＲＣ， ２００４を参照されたい。
[0060]本発明は、以下の実施例に言及することによって記載され、該実施例は、例示のために提供され、そしていかなる方式でも本発明を限定することを意図されない。当該技術分野に周知の標準的技術、または以下に特に記載する技術を利用した。
実施例１
材料および方法
[0061]ウイルス：クレード２．１ Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６、Ａ／インドネシア／ＴＴＬ０１２／２００６、Ａ／インドネシア／ＴＬＬ０１３／２００６、Ａ／インドネシア／ＴＬＬ０１４／２００６およびＡ／インドネシア／ＣＤＣ３２６／２００６由来のＨ５Ｎ１ヒト・インフルエンザウイルスを、インドネシア保健省（ＭＯＨ）から得た。＊＊＊異なるクレード由来のウイルス（クレード０−Ａ／香港／１５６／９７、クレード１．０−Ａ／香港／２１３／２００４、クレード４．０−Ａ／ガチョウ（ｇｏｏｓｅ）／貴陽／３３７／０６およびクレード８．０−Ａ／ニワトリ（ｃｈｉｃｋｅｎ）／河南／１２／０４）は、逆遺伝学（ＲＧ）（ＷＨＯ、２００５）によってレスキューされた。簡潔には、合成ＨＡおよびＮＡ遺伝子を、インフルエンザＡ逆遺伝学用の二重プロモータープラスミド内にクローニングした。二重プロモータープラスミドは、疾病対策予防センター、米国・ジョージア州アトランタより得られた。リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を用いて、２９３ＴおよびＭＤＣＫ細胞の共培養内に、ＨＡおよびＮＡを含有するプラスミドを、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）由来の残りの６つの遺伝子のプラスミドとともにトランスフェクションすることによって、リアソータント・ウイルスをレスキューした。ストックウイルスを１１日齢の胚発育鶏卵の尿膜腔中、３５℃で３６９１時間増殖させた。高い病原性のウイルスを伴うすべての実験を、ＣＤＣ／ＮＩＨおよびＷＨＯ推奨にしたがって、ＢＳＬ ３＋封じ込め施設中で行い、そしてまた、これらは、シンガポールの農畜産物管理庁およびＭＯＨによって認可された。
材料および方法
[0061]ウイルス：クレード２．１ Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６、Ａ／インドネシア／ＴＴＬ０１２／２００６、Ａ／インドネシア／ＴＬＬ０１３／２００６、Ａ／インドネシア／ＴＬＬ０１４／２００６およびＡ／インドネシア／ＣＤＣ３２６／２００６由来のＨ５Ｎ１ヒト・インフルエンザウイルスを、インドネシア保健省（ＭＯＨ）から得た。＊＊＊異なるクレード由来のウイルス（クレード０−Ａ／香港／１５６／９７、クレード１．０−Ａ／香港／２１３／２００４、クレード４．０−Ａ／ガチョウ（ｇｏｏｓｅ）／貴陽／３３７／０６およびクレード８．０−Ａ／ニワトリ（ｃｈｉｃｋｅｎ）／河南／１２／０４）は、逆遺伝学（ＲＧ）（ＷＨＯ、２００５）によってレスキューされた。簡潔には、合成ＨＡおよびＮＡ遺伝子を、インフルエンザＡ逆遺伝学用の二重プロモータープラスミド内にクローニングした。二重プロモータープラスミドは、疾病対策予防センター、米国・ジョージア州アトランタより得られた。リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を用いて、２９３ＴおよびＭＤＣＫ細胞の共培養内に、ＨＡおよびＮＡを含有するプラスミドを、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）由来の残りの６つの遺伝子のプラスミドとともにトランスフェクションすることによって、リアソータント・ウイルスをレスキューした。ストックウイルスを１１日齢の胚発育鶏卵の尿膜腔中、３５℃で３６９１時間増殖させた。高い病原性のウイルスを伴うすべての実験を、ＣＤＣ／ＮＩＨおよびＷＨＯ推奨にしたがって、ＢＳＬ ３＋封じ込め施設中で行い、そしてまた、これらは、シンガポールの農畜産物管理庁およびＭＯＨによって認可された。
[0062]Ｍａｂ産生：等体積のアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５６３（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）で乳化された０．１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＡ／インドネシア／ＴＬＬ０１４／２００６由来の不活性化全ウイルスを用い、２週間の定期的な間隔で、ＢＡＬＢ／ｃマウスを２回、皮下免疫した。同じウイルス抗原でマウスを追加免疫し、３日後に、ＳＰ２／０細胞と脾臓細胞を融合させた。融合した細胞を９６ウェルプレートに植え付け、そして以下に記載するような免疫蛍光アッセイによって、その上清をスクリーニングした。ｍＡｂを産生したハイブリドーマを、少なくとも３回の限界希釈によってクローニングした。以下に記載するように、陽性ｍＡｂを、その赤血球凝集素阻害活性に関して試験した。選択される陽性ｍＡｂ由来の免疫グロブリンを、製造者のプロトコルに記載されるように、商業的アイソタイピングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、英国）を用いてアイソタイピングした。プロテインＡセファロースビーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、ｍＡｂを精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、抗体純度を確認した。次いで、以下に記載するような標準的赤血球凝集素阻害アッセイによって、中和活性に関してｍＡｂを試験した。
[0063]免疫蛍光アッセイ(ＩＦＡ)：９６ウェルプレート中で培養したＭＤＣＫ細胞を、ＡＩＶ Ｈ５Ｎ１株に感染させた。感染２４〜４８時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで、室温で３０分間固定し、そしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で３回洗浄した。固定細胞をハイブリドーマ培養上清と、３７℃で１時間インキュベーションし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、そして次いで、１：４０希釈のフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化ウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ、デンマーク）とインキュベーションした。細胞を再びＰＢＳ中でリンスし、そして広視野落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１）によって抗体結合を評価した。
[0064]赤血球凝集素阻害アッセイ：赤血球凝集素阻害（ＨＩ）アッセイを、先に記載されるように実行した（Ｗｅｂｓｔｅｒら、１９９１）。簡潔には、ｍＡｂを、Ｖ底９６ウェルプレート中で連続希釈（２倍）し、そして４ ＨＡ単位のＨ５Ｎ１ウイルスと混合した。プレートを室温で３０分間インキュベーションし、そして１％ニワトリＲＢＣを各ウェルに添加した。赤血球凝集素阻害終点は、凝集が観察されない最高ｍＡｂ希釈であった。
[0065]エスケープ突然変異体の単離および分析： ｍＡｂ ４Ｃ２によって認識されるエピトープを、先に記載されるような（Ｋａｖｅｒｉｎら、２００７）エスケープ突然変異体の性質決定によって、マッピングした。簡潔には、Ｈ５Ｎ１ウイルスを、過剰量のｍＡｂと１時間インキュベーションし、そして次いで、１１日齢の胚発育鶏卵内に接種した。ｉｎ ｖｉｖｏエスケープ突然変異体を単離するため、治療したマウス由来の肺試料を、胚発育卵内に直接接種した。卵を３７℃で４８時間インキュベーションした。ウイルスを採取し、そして胚発育鶏卵において、限界希釈でクローニングに用い、そしてエスケープ突然変異体をプラーク精製した。尿膜腔液からＲＮＡを抽出した。赤血球凝集素遺伝子を逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅し、そしてＴＡクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングし、そしていくつかのクローンを配列決定した。親ウイルスの配列と比較することによって、個々のクローンの配列を分析した。
[0066]キメラＩｇＧ１発現プラスミドのクローニング：発現ベクターの設計は、記載されるとおりであった（Ｊｏｓｔｏｃｋら， ２００４）。簡潔には、以下のプライマーを用いて、ヒト抗体定常領域をコードするカッパ軽鎖およびＩｇＧ１重鎖を増幅した：ヒトＩｇＧ１定常重鎖：順方向プライマー ５’−ＣＴＣＧＡＧＣＧＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧ−３’（配列番号１１）および逆方向プライマー ５’−ＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＧＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１２）；ヒト定常カッパ軽鎖：順方向プライマー ５’−ＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＣＧＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴ ＧＣ−３’（配列番号１３）および逆方向プライマー ５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＡＡＧＴＴＧＴＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＡ ＴＣＡＴＣ ＡＴＣ−３’（配列番号１４）。カッパ軽鎖およびＩｇＧ１重鎖の増幅された定常領域を、これらの間に挿入された脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）とともに、修飾ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ＥＲプラスミド内にクローニングした。ユニークな制限部位を導入して、定常領域とインフレームに、重鎖および軽鎖の可変領域の挿入を可能にした。ｍＡｂ ４Ｃ２ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製し、そしてランダム六量体を用いた第一鎖ｃＤＮＡ合成において用いた。プライマーおよびマウスｓｃＦｖ組換え抗体ファージ系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコルを用いて、可変重鎖および軽鎖の両方を増幅するために、総ｃＤＮＡをテンプレートとして用いた。配列決定のため、生じた産物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）内にクローニングした。次いで、配列特異的プライマーを以下のように設計した： ４Ｃ２特異的可変軽鎖：順方向プライマー ５’−ＧＧ ＴＡＡＧＧＧＧＴＴＡＡＣＡＧＴＡＧＣＡＧＧ−３’（配列番号１５）および逆方向プライマー ５’−ＣＴＴＴＧＧＣＣＴＣ ＴＣＴＧＧＧＡＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号１６）； ４Ｃ２特異的可変重鎖：順方向プライマー ５’−ＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＣ−３’（配列番号１７）および逆方向プライマー ５’−ＣＡＣＣＧ ＧＴＴＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＡＣＴ−３’（配列番号１８）。これらのプライマーを可変領域の増幅に用い、これを次いで、発現ベクター内にクローニングした。４Ｃ２特異的可変軽鎖コーディング配列を配列番号３に示し、そして４Ｃ２特異的可変重鎖コーディング配列を配列番号１に示す。この構築物の発現は、ネズミ由来のマウス可変領域として配列の３３％、そしてＩｇＧ１のヒト定常領域として配列の６７％を含有するキメラ抗体の産生を導く。
[0067]キメラ抗体の一過性発現および精製：定義された血清不含培地中で産生された抗体を得るため、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて、キメラ抗体を発現させた。２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて、２９３−Ｆ細胞内に上述の構築物をトランスフェクションし、そしてトランスフェクション１２０時間後、上清を収集した。プロテインＡセファロースビーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、キメラ抗体４Ｃ２（ｃｈ−ｍＡｂ ４Ｃ２またはｃｈ４Ｃ２）を精製した。キメラ抗体の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、そしてＨＲＰ標識抗ヒトＩｇ（ＤＡＫＯ）を用いたイムノブロット分析を用いて、ヒト定常領域の導入を確認した。
[0068]マイクロ中和アッセイ： Ｈ５Ｎ１株に対するモノクローナル抗体の中和活性を、先に記載されるように（Ｐｒａｂａｋａｒａｎら， ２００８）、マイクロ中和アッセイによって分析した。簡潔には、１０倍希釈ｍＡｂをさらに連続希釈（２倍）し、そして１００ ５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）の異なるクレードのＨ５Ｎ１株と、室温で１時間インキュベーションし、そして９６ウェルプレート中で増殖させたＭＤＣＫ細胞上に２つ組でプレーティングした。各Ｈ５Ｎ１株のＭＤＣＫ細胞培養におけるＴＣＩＤ５０を、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法によって決定した。光学顕微鏡によって、細胞変性効果がまったく観察されない最高のｍＡｂ希釈として、中和力価を評価した。
[0069]曝露研究：４〜６週齢の近交系ＳＰＦ ＢＡＬＢ／ｃマウスを曝露研究に用いた。マウス（群あたりｎ＝１０）を、５ＭＬＤ５０（マウス致死用量５０％）の２つの異なるＨ５Ｎ１株（クレード１由来のＲＧ−Ａ／香港／２１３／２００３およびクレード２．１由来のＡ／インドネシア／ＴＬＬ０１３／０６）に鼻内感染させた。すべての動物実験は、ＮＩＩＤで行われる動物実験のためのガイドおよび実験プロトコルにしたがって行われた。
[0070]予防有効性：予防有効性を決定するため、ウイルス曝露前に、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは０ｍｇ／ｋｇ（ＰＢＳ）のモノクローナル抗体（４Ｃ２またはｃｈ４Ｃ２）でマウスを腹腔内前治療した。２４時間後、５ＭＬＤ５０の２つの異なるＨ５Ｎ１株にマウスを曝露した。動物が死ぬまでまたは曝露の１４日後まで、マウスを毎日観察して、体重および死亡率を監視した。
[0071]療法有効性：キメラｍＡｂの療法有効性を決定するため、マウス群を、２つの異なるＨ５Ｎ１株５ＭＬＤ５０に曝露した。ウイルス曝露の２４時間後、マウスを、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは０ｍｇ／ｋｇ（ＰＢＳ）のモノクローナル抗体（４Ｃ２またはｃｈ４Ｃ２）で、腹腔内経路を通じて治療した。動物が死ぬまでまたは曝露の１４日後まで、マウスを毎日観察して、体重および死亡率を監視した。
実施例２
ネズミｍＡｂ ４Ｃ２の性質決定およびキメラ化
[0072]インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）に対する一団のｍＡｂを、異なる株のＨ５Ｎ１ウイルスの効率的な中和に関してスクリーニングした。中和エスケープ突然変異体の選択を用いて、４Ｃ２ ｍＡｂのエピトープを形成する際に関与するアミノ酸を分析した。シグナルタンパク質を含む、ＨＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１９に示し、そして成熟ＨＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。４Ｃ２ ｍＡｂに対する多数のエスケープ変異体から単離された完全ＨＡ遺伝子の配列は、アミノ酸１５５位（ＳｅｒからＩｌｅ）および１８９位（ＡｒｇからＬｙｓ）で単一点突然変異を所持した（配列番号２０に示す成熟ＨＡタンパク質に関して）。Ｈ５Ｎ１ウイルスとの反応性、ならびに高いＨＩ活性（表１）および中和力価（表２）に基づくマウスモデルにおいて、療法研究のため、ｍＡｂ ４Ｃ２を選択した。
ネズミｍＡｂ ４Ｃ２の性質決定およびキメラ化
[0072]インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）に対する一団のｍＡｂを、異なる株のＨ５Ｎ１ウイルスの効率的な中和に関してスクリーニングした。中和エスケープ突然変異体の選択を用いて、４Ｃ２ ｍＡｂのエピトープを形成する際に関与するアミノ酸を分析した。シグナルタンパク質を含む、ＨＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１９に示し、そして成熟ＨＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。４Ｃ２ ｍＡｂに対する多数のエスケープ変異体から単離された完全ＨＡ遺伝子の配列は、アミノ酸１５５位（ＳｅｒからＩｌｅ）および１８９位（ＡｒｇからＬｙｓ）で単一点突然変異を所持した（配列番号２０に示す成熟ＨＡタンパク質に関して）。Ｈ５Ｎ１ウイルスとの反応性、ならびに高いＨＩ活性（表１）および中和力価（表２）に基づくマウスモデルにおいて、療法研究のため、ｍＡｂ ４Ｃ２を選択した。
表１
Ｈ５Ｎ１株の異なるクレードに対する４Ｃ２ ｍＡｂの赤血球凝集素阻害力価
Ｈ５Ｎ１株の異なるクレードに対する４Ｃ２ ｍＡｂの赤血球凝集素阻害力価
ネズミｍＡｂ ４Ｃ２（１ｍｇ／ｍｌ）の赤血球凝集素阻害力価を異なるウイルスで測定した。
表２
Ｈ５Ｎ１株の異なるクレードに対する４Ｃ２ ｍＡｂのマイクロ中和力価
Ｈ５Ｎ１株の異なるクレードに対する４Ｃ２ ｍＡｂのマイクロ中和力価
ｍＡｂ ４Ｃ２（１ｍｇ／ｍｌ）のウイルスマイクロ中和をＨ５Ｎ１ウイルスの異なるクレードで測定した。
＊各ｎ−ｍＡｂ濃度１ｍｇ／ｍｌ
＃マイクロ中和アッセイに用いた各ウイルス株１００ＴＣＩＤ５０
実施例３
４Ｃ２ ｍＡｂでの予防的治療は、致死性ウイルス曝露からマウスを保護する
[0073]本発明者らは、Ｈ５Ｎ１ウイルスのクレード１またはクレード２．１株に曝露されたマウスにおける４Ｃ２ ｍＡｂの保護有効性を調べた。単一用量の５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの４Ｃ２で前治療されたすべてのマウスは、Ｈ５Ｎ１ウイルスの５ＭＬＤ５０の両クレードでの致死性曝露後、死から保護され（１００％保護）（図１Ａ、１Ｂ）、一方、すべての未治療対照マウスは、曝露後第６日までに、ウイルス感染によって死亡した。さらに、２．５ｋｇ／ｍｇの最低濃度の４Ｃ２で前治療されたマウスであっても、クレード１（図１Ａ）およびクレード２．１（図１Ｂ）ウイルス曝露に対して、それぞれ７０および８０％の保護を示した。
＃マイクロ中和アッセイに用いた各ウイルス株１００ＴＣＩＤ５０
実施例３
４Ｃ２ ｍＡｂでの予防的治療は、致死性ウイルス曝露からマウスを保護する
[0073]本発明者らは、Ｈ５Ｎ１ウイルスのクレード１またはクレード２．１株に曝露されたマウスにおける４Ｃ２ ｍＡｂの保護有効性を調べた。単一用量の５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの４Ｃ２で前治療されたすべてのマウスは、Ｈ５Ｎ１ウイルスの５ＭＬＤ５０の両クレードでの致死性曝露後、死から保護され（１００％保護）（図１Ａ、１Ｂ）、一方、すべての未治療対照マウスは、曝露後第６日までに、ウイルス感染によって死亡した。さらに、２．５ｋｇ／ｍｇの最低濃度の４Ｃ２で前治療されたマウスであっても、クレード１（図１Ａ）およびクレード２．１（図１Ｂ）ウイルス曝露に対して、それぞれ７０および８０％の保護を示した。
実施例４
４Ｃ２での療法的治療は、致死性ウイルス曝露からマウスを保護する
[0074]Ｈ５Ｎ１致死性曝露に対する４Ｃ２ ｍＡｂの療法的有効性を決定するため、マウスを５ＭＬＤ５０のクレード１またはクレード２．１ウイルス株に曝露した。ウイルス曝露２４時間後、マウスを２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの４Ｃ２で治療した。ｍＡｂ ４Ｃ２は、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの濃度で、ウイルスの両クレードからマウスを１００％保護可能であった（図２Ａおよび２Ｂ）。２．５ｍｇ／ｋｇであっても、クレード１およびクレード２．１ウイルスでの致死性曝露に対して、マウスの８０％を保護可能であった。
４Ｃ２での療法的治療は、致死性ウイルス曝露からマウスを保護する
[0074]Ｈ５Ｎ１致死性曝露に対する４Ｃ２ ｍＡｂの療法的有効性を決定するため、マウスを５ＭＬＤ５０のクレード１またはクレード２．１ウイルス株に曝露した。ウイルス曝露２４時間後、マウスを２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの４Ｃ２で治療した。ｍＡｂ ４Ｃ２は、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの濃度で、ウイルスの両クレードからマウスを１００％保護可能であった（図２Ａおよび２Ｂ）。２．５ｍｇ／ｋｇであっても、クレード１およびクレード２．１ウイルスでの致死性曝露に対して、マウスの８０％を保護可能であった。
実施例５
ネズミｍＡｂ ４Ｃ２のキメラ化
[0075]定常領域がヒト起源のもので置き換えられるが、可変領域がネズミ起源のままであるように、ｍＡｂに関してキメラ・モノクローナル抗体（ｃｈ−ｍＡｂ）を生成した。この方式で生成されたキメラｍＡｂは、６６．６％ヒト化された。キメラ抗体は、ネズミｍＡｂの元来の特性をなお保持した（結果未提示）。この方式で、キメラまたはヒト化ｍＡｂを調製した。
ネズミｍＡｂ ４Ｃ２のキメラ化
[0075]定常領域がヒト起源のもので置き換えられるが、可変領域がネズミ起源のままであるように、ｍＡｂに関してキメラ・モノクローナル抗体（ｃｈ−ｍＡｂ）を生成した。この方式で生成されたキメラｍＡｂは、６６．６％ヒト化された。キメラ抗体は、ネズミｍＡｂの元来の特性をなお保持した（結果未提示）。この方式で、キメラまたはヒト化ｍＡｂを調製した。
実施例６
ｃｈ４Ｃ２での予防的治療は、致死性ウイルス曝露からマウスを保護する
[0076]本発明者らは、Ｈ５Ｎ１ウイルスのクレード１またはクレード２．１株に曝露されたマウスにおけるｃｈ４Ｃ２の保護有効性を調べた。単一用量の５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのｃｈ４Ｃ２で前治療されたすべてのマウスは、Ｈ５Ｎ１ウイルスの５ＭＬＤ５０の両クレードでの致死性曝露後、死から保護され（１００％保護）（図３Ａ、３Ｂ）、一方、すべての未治療対照マウスは、曝露後第６日までに、ウイルス感染によって死亡した。さらに、２．５ｋｇ／ｍｇの最低濃度のｃｈ４Ｃ２で前治療されたマウスであっても、クレード１（図３Ａ）およびクレード２．１（図３Ｂ）ウイルス曝露に対して、それぞれ８０および９０％の保護を示した。
ｃｈ４Ｃ２での予防的治療は、致死性ウイルス曝露からマウスを保護する
[0076]本発明者らは、Ｈ５Ｎ１ウイルスのクレード１またはクレード２．１株に曝露されたマウスにおけるｃｈ４Ｃ２の保護有効性を調べた。単一用量の５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのｃｈ４Ｃ２で前治療されたすべてのマウスは、Ｈ５Ｎ１ウイルスの５ＭＬＤ５０の両クレードでの致死性曝露後、死から保護され（１００％保護）（図３Ａ、３Ｂ）、一方、すべての未治療対照マウスは、曝露後第６日までに、ウイルス感染によって死亡した。さらに、２．５ｋｇ／ｍｇの最低濃度のｃｈ４Ｃ２で前治療されたマウスであっても、クレード１（図３Ａ）およびクレード２．１（図３Ｂ）ウイルス曝露に対して、それぞれ８０および９０％の保護を示した。
実施例７
ｃｈ４Ｃ２での療法的治療は、致死性ウイルス曝露からマウスを保護する
[0077]Ｈ５Ｎ１致死性曝露に対するｃｈ４Ｃ２の療法的有効性を決定するため、マウスを５ＭＬＤ５０のクレード１またはクレード２．１ウイルス株に曝露した。ウイルス曝露２４時間後、マウスを２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのｃｈ４Ｃ２で治療した。ｃｈ４Ｃ２は、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの濃度で、ウイルスの両クレードからマウスを１００％保護可能であった（図４Ａおよび４Ｂ）。２．５ｍｇ／ｋｇであっても、クレード１およびクレード２．１ウイルスでの致死性曝露から、マウスの７０％を保護可能であった。
ｃｈ４Ｃ２での療法的治療は、致死性ウイルス曝露からマウスを保護する
[0077]Ｈ５Ｎ１致死性曝露に対するｃｈ４Ｃ２の療法的有効性を決定するため、マウスを５ＭＬＤ５０のクレード１またはクレード２．１ウイルス株に曝露した。ウイルス曝露２４時間後、マウスを２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのｃｈ４Ｃ２で治療した。ｃｈ４Ｃ２は、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの濃度で、ウイルスの両クレードからマウスを１００％保護可能であった（図４Ａおよび４Ｂ）。２．５ｍｇ／ｋｇであっても、クレード１およびクレード２．１ウイルスでの致死性曝露から、マウスの７０％を保護可能であった。
[0078]エスケープ突然変異体分析を用いたエピトープマッピングによって、Ｓｅｒ１５５およびＡｒｇ１８９がｍＡｂ ４Ｃ２のエピトープの主要決定因子であることが立証された。また、高い抗原性の１５０のループおよび１８９アミノ酸位にエピトープのアミノ酸が存在することが、高い中和能を説明する。したがって、本研究において、本発明者らは、致死性Ｈ５Ｎ１感染に対する予防的および療法的研究のため、ネズミ抗体４Ｃ２を選択した。さらに、本発明者らは、キメラ化のため、そしてそれに続く、致死性Ｈ５Ｎ１感染に対する予防的および療法的研究におけるキメラ抗体の使用のため、この抗体を選択した。さらに抗体の受動的投与は、パンデミック・インフルエンザに対して探究可能な戦略を残す。単一用量の４Ｃ２ ｍＡｂまたはｃｈ４Ｃ２の予防的または療法的投与は、マウスモデルにおいて、致死性Ｈ５Ｎ１インフルエンザに対する１００％保護を示した。本発明者らは、１０ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの４Ｃ２またはｃｈ４Ｃ２を用いて、Ｈ５Ｎ１ウイルスのクレード１および２．１に対する１００％保護を観察した。５ｍｇ／ｋｇの用量は、十分な保護を提供し、そしてウイルス曝露９日後、ウイルス排除を達成したが、１０ｍｇ／ｋｇの用量は、ウイルス曝露のわずか６日後にウイルスを排除した。４Ｃ２またはｃｈ４Ｃ２での療法は、おそらく、感染の初期の経過を制御するのを補助し、したがって、動物が有効免疫反応を生じるのを可能にする。本発明者らの研究によって、ｍＡｂ ４Ｃ２またはキメラｍＡｂ ｃｈ４Ｃ２を用いた受動免疫療法の使用は、非常に病原性であるＨ５Ｎ１感染の予防および治療の両方において、有効なツールとなる可能性もあり、将来のインフルエンザ・パンデミックを封じ込めるのに必要とされる即時免疫を提供する。当該技術分野に周知の技術を用いた相補性決定領域を移植することによって、本明細書で産生されるキメラ抗体をさらにヒト化してもよい。キメラ抗体を、ヒトに近い（ｓｕｂ−ｈｕｍａｎ）霊長類において、前臨床的に評価してもよい。マウス研究における予防および治療両方に関して単一用量が有効であったため、キメラ抗体がそれ自体に対する免疫反応を誘導する場合であってさえ、抗体有効性はなお維持されうることが示される。
[0079]本発明を説明する背景において（特に、以下の請求項の背景において）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の参照対照の使用は、本明細書に別に示されるか、または背景によって明らかに矛盾しているのでない限り、単数形および複数形の両方を含むと見なされるものとする。用語「含む」、「有する」、「含まれる」および「含有する」は、別に示さない限り、無制限の（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）用語と見なされるものとする（すなわち「限定されるわけではないが含む」を意味する）。本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書に別に示さない限り、範囲内に属する各別個の値に個々に言及する簡略化法として働くよう意図され、そして各別個の値は、本明細書に個々に言及されるかのように、本明細書内に取り込まれる。例えば、範囲１０〜１５が開示された場合、１１、１２、１３、および１４もまた開示される。本明細書記載のすべての方法は、本明細書に別に示さない限り、または背景によって明らかに矛盾しているのではない限り、任意の適切な順で、実行可能である。本明細書に提供するあらゆる例、または例示的な言い方（例えば「例えば」）の使用は、単に、本発明の理解をより容易にすることを意図し、そして別に請求しない限り、本発明の範囲に対して限定を課さない。本明細書における言い方のいずれも、任意の非請求要素が、本発明の実施に必須のものであることを示すとは見なされないものとする。
[0080]多様な態様の形で、本発明の方法および組成物を取り込み可能であり、わずかにいくつかのみが本明細書に開示されていることが認識されるであろう。本発明の態様を本明細書に記載し、これには、本発明を実行するため、本発明者らに知られる最適な様式が含まれる。これらの態様の変型は、前述の説明を読むと、一般の当業者には明らかであろう。本発明者らは、当業者が、こうした変型を適切に使用することを予期し、そして本明細書に特に記載するものとは異なって本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明には、適用可能な法律によって許可されるような、付随する請求項に列挙される主題のすべての修飾および同等物が含まれる。さらに、本明細書に別に示さない限り、または背景によって明らかに矛盾しない限り、すべてのありうる変型における上述の要素の任意の組み合わせが本発明に含まれる。
参考文献一覧
Claims (23)
- Ｈ５赤血球凝集素の三次元エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体または抗体断片であって、三次元エピトープが、アミノ酸１５５（Ｓｅｒ）およびアミノ酸１８９（Ａｒｇ）で構成される、前記モノクローナル抗体または抗体断片。
- Ｈ５赤血球凝集素の三次元エピトープが、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２が特異的に結合するものである、請求項１のモノクローナル抗体または抗体断片。
- モノクローナル抗体が、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２である、請求項１のモノクローナル抗体または断片。
- モノクローナル抗体またはその断片が、ネズミ・モノクローナル抗体４Ｃ２由来のキメラまたはヒト化モノクローナル抗体である、請求項１のモノクローナル抗体または抗体断片。
- Ｈ５赤血球凝集素が、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含む、請求項１のモノクローナル抗体または抗体断片。
- 軽鎖可変領域の相補性決定領域が、配列番号２に示すアミノ酸配列内である、請求項１〜５のいずれか一項のモノクローナル抗体または抗体断片。
- 相補性決定領域が：
ＬＣＤＲ１： ＱＤＩＳＧＨ（配列番号５）；
ＬＣＤＲ２： ＨＧＴ（配列番号６）；および
ＬＣＤＲ３： ＶＱＹＶＱＦＰＷＴ（配列番号７）
である、請求項６のモノクローナル抗体。 - 重鎖可変領域の相補性決定領域が、配列番号４に示すアミノ酸配列内である、請求項１〜５のいずれか一項のモノクローナル抗体または抗体断片。
- 相補性決定領域が：
ＨＣＤＲ１： ＧＹＴＦＴＴＹＷ（配列番号８）；
ＨＣＤＲ２： ＩＤＰＹＤＳＥＴ（配列番号９）；および
ＨＣＤＲ３： ＶＲＧＧＳＴＶＡＹＦＧＶ（配列番号１０）
である、請求項８のモノクローナル抗体。 - 軽鎖可変領域の相補性決定領域が、配列番号２に示すアミノ酸配列内であり、そして重鎖可変領域の相補性決定領域が、配列番号４に示すアミノ酸配列内である、請求項１〜５のいずれか一項のモノクローナル抗体または抗体断片。
- 相補性決定領域が：
ＬＣＤＲ１： ＱＤＩＳＧＨ（配列番号５）；
ＬＣＤＲ２： ＨＧＴ（配列番号６）；
ＬＣＤＲ３： ＶＱＹＶＱＦＰＷＴ（配列番号７）；
ＨＣＤＲ１： ＧＹＴＦＴＴＹＷ（配列番号８）；
ＨＣＤＲ２： ＩＤＰＹＤＳＥＴ（配列番号９）；および
ＨＣＤＲ３： ＶＲＧＧＳＴＶＡＹＦＧＶ（配列番号１０）
である、請求項１０のモノクローナル抗体。 - 軽鎖可変領域が、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項のモノクローナル抗体または抗体断片。
- 重鎖可変領域が、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項のモノクローナル抗体または抗体断片。
- 軽鎖可変領域が、配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、そして重鎖可変領域が、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項のモノクローナル抗体または抗体断片。
- 請求項１〜１４のいずれか一項のモノクローナル抗体または抗体断片をコードする、核酸。
- 請求項１６の核酸を含む、ベクター。
- 請求項１６のベクターを含み、そして発現している細胞。
- 剤および薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む、薬学的組成物であって、剤が、（ａ）請求項１〜１４のいずれか一項のモノクローナル抗体または抗体断片、（ｂ）前記モノクローナル抗体または抗体断片をコードする核酸を含む核酸分子、（ｃ）前記核酸を含むベクター、および（ｄ）前記ベクターを発現している細胞からなる群より選択される、前記薬学的組成物。
- 被験体におけるインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス感染を減少させるか、あるいは被験体におけるインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス感染のリスクを低下させるか、あるいは１またはそれより多いインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス株または単離体による被験体の感染を阻害するか、あるいは１またはそれより多いインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス株または単離体によるインフルエンザ感染または疾患を予防する方法であって、その必要がある被験体に、（ａ）請求項１〜１４のいずれか一項のモノクローナル抗体または抗体断片、（ｂ）前記モノクローナル抗体または抗体断片をコードする核酸を含む核酸分子、（ｃ）前記核酸を含むベクター、および（ｄ）前記ベクターを発現している細胞からなる群より選択される剤の療法的有効量を投与する工程を含む、前記方法。
- 被験体が免疫無防備状態であるか、乳児、幼児または高齢者である、請求項１９の方法。
- 投与が療法的利益を提供する、請求項１９の方法。
- 療法的利益が、（ａ）インフルエンザウイルス力価の増加を阻害するか、（ｂ）インフルエンザウイルス力価を減少させるか、（ｃ）インフルエンザウイルス複製の増加を阻害するか、（ｄ）インフルエンザウイルス複製を減少させるか、（ｅ）インフルエンザウイルス増殖の増加を阻害するかまたはインフルエンザウイルス増殖を減少させるか、（ｆ）被験体におけるインフルエンザウイルス感染と関連する１またはそれより多い症状または合併症の進行、重症度、頻度、期間または可能性を減少させるか、あるいは（ｇ）インフルエンザウイルス感染からの被験体の回復を加速することを含む、請求項２１の方法。
- 症状または合併症が、悪寒、発熱、咳、咽頭炎、鼻閉、副鼻腔鬱血、鼻感染、副鼻腔感染、体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳感染症、耳の痛みおよび死からなる群より選択される、請求項２２の方法。
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