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CN103180341B - 特异于流感h5血凝素主要中和表位的单克隆抗体 - Google Patents

特异于流感h5血凝素主要中和表位的单克隆抗体 Download PDF

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CN103180341B CN201080069750.4A CN201080069750A CN103180341B CN 103180341 B CN103180341 B CN 103180341B CN 201080069750 A CN201080069750 A CN 201080069750A CN 103180341 B CN103180341 B CN 103180341B
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Abstract

本发明涉及特异于流感H5血凝素主要中和表位的鼠单克隆抗体4C2或者嵌合或人源化单克隆抗体，以及其活性片段。本发明还涉及使用所述鼠或者嵌合或人源化单克隆抗体或其片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。

Description

特异于流感H5血凝素主要中和表位的单克隆抗体
序列提交 
本申请连同电子形式的序列表一起提交。所述序列表命名为2577_203_sequence_listing.txt，创建于在2010年8月20日。电子形式序列表的信息以其整体援引嫁入本文。 
发明背景 
本发明涉及特异于流感H5血凝素主要中和表位的鼠单克隆抗体4C2或者嵌合或人源化单克隆抗体及其活性片段。本发明还涉及使用所述鼠或者嵌合或人源化单克隆抗体或其片段来预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。 
本文用于说明本发明背景或提供有关实施的补充细节的出版物和其他材料被引入作为参考，为了方便起见在文献目录中分别分组。 
最近出现的甲型流感病毒H5N1菌株以及它们在人类中造成的高死亡率引起了关于未来流感大流行的忧虑。抗流行性H5N1菌株的预防和治疗措施引起大量兴趣，全世界范围都在努力来预防另一次大流行的爆发。但现有的疫苗策略受到流感菌株抗原变异的阻碍。需要抗体内源合成的现有疫苗策略在大流行病情况下无法提供针对H5N1感染的立刻预防。目前得到许可的抗病毒药物包括M2离子通道抑制剂(Rimantidine和Amantidine)和神经氨酸酶抑制剂(Oseltamivir和Zanamivir)。已知H5N1病毒对M2离子通道抑制剂有抗性(Beigel等,2005)。H5N1病毒的新毒株正被分离，它们还对神经氨酸酶抑制剂即oseltamivir和zanamivir有抗性(Le等,2005,de Jong和Hien,2006)。神经氨酸酶抑制剂还需要高剂量和延长的治疗(de Jong和Hien,2006)，增加了有害副作用的可能性。因此，流感治疗的交替性策略被准许。 
使用单克隆抗体(mAb)的被动免疫疗法已经被看作治疗许多传染病的可靠选择。目前，对使用抗流感病毒HA1蛋白的中和抗体的治疗方法存在大量关注。这种蛋白方便作为靶标，因为它在病毒的表面，针对该蛋白的 抗体可以有效的中和病毒。因此，抗H5血凝素(HA)中和表位的单克隆抗体可以是激活人免疫的有吸引力的选择，尤其是针对那些处于流感感染高风险的个体，即，对主动免疫反应较差的免疫受损患者，婴儿，幼儿或老人。通过输注人恢复期血清的被动免疫与流感大流行期间死亡率的50%降低有关，证明有效的抵抗H5N1甲型流感病毒感染(Kong and Zhou,2004;Luke等,2006)。重要的是任何mAb产品应当提供抗H5N1流感流行毒株的广泛预防，并且应当防止体内中和渗漏突变体(escape mutant)的选择。 
发明概述 
本发明涉及特异于流感H5血凝素主要中和表位的单克隆抗体及其活性片段。本发明还涉及使用所述单克隆抗体或其片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。 
因此，在第一个方面，本发明提供特异于流感H5血凝素主要中和表位的单克隆抗体及其活性片段，即抗原结合片段(本文中也称为抗体片段)。在一个实施方案中，单克隆抗体是鼠单克隆抗体4C2。在第二个实施方案中，单克隆抗体是嵌合或人源化的单克隆抗体。具体来说，所述嵌合或人源化的单克隆抗体特异性地结合鼠单克隆抗体4C2所特异性结合的H5血凝素的构象表位。在一个实施方案中，单克隆抗体(鼠单克隆抗体或嵌合或人源化的单克隆抗体)或其片段特异性结合H5血凝素(HA)的构象表位，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸155(Ser)和189(Arg)。在另一个实施方案中，轻链可变区的互补决定区(CDR)(LCDR)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列之内(本文中也称为HM448828，其是小鼠轻链可变区的氨基酸序列)。在另外的实施方案中，轻链可变CDR的氨基酸序列是∶LCDR1:QDISGH(SEQ ID NO:5);LCDR2:HGT(SEQ ID NO:6);和LCDR3:VQYVQFPWT(SEQ ID NO:7)。在一个实施方案中，重链可变区的互补决定区(CDR)(HCDR)在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列之内(本文中也称为HM448827，其是小鼠重链可变区的氨基酸序列)。在另一个实施方案中，重链可变CDR的氨基酸序列是∶HCDR1:GYTFTTYW(SEQ ID NO:8);HCDR2:IDPYDSET(SEQ ID NO:9);和HCDR3:VRGGSTVAYFGV(SEQ ID NO:10)。 
在一个实施方案中，编码HM448828的DNA包含SEQ ID NO:1所示 的核苷酸序列。在另一个实施方案中，编码HM448827的DNA包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。在一个实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，通过标准克隆技术从人抗体生成细胞获得重链和轻链恒定区。在另一个实施方案中，人重链恒定区是人IgG1重链恒定区。在另一个实施方案中，人IgG1重链恒定区包含SEQ ID NO:22(GenBank登录号AAX09634.1)所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，编码该氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID NO:21(GenBank登录号AY885218.1)所示。在一个实施方案中，人轻链恒定区是人κ轻链恒定区。在另一个实施方案中，人κ轻链恒定区包含SEQ ID NO:24(GenBank登录号AAA58989.1)所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，编码该序列的核酸序列如SEQ ID NO:23(GenBank登录号J00241.1)所示。 
在另一个实施方案中，本发明提供核酸，其编码本文描述的鼠单克隆抗体4C2或者嵌合或人源化单克隆抗体或其抗原结合片段。核酸序列的实例包括本文描述的那些。在另外的实施方案中，本发明提供包含所述核酸的载体。在另外的实施方案中，本发明提供包含并表达所述载体的细胞。 
在第二个方面，本发明提供使用所述鼠单克隆抗体4C2或嵌合或人源化单克隆抗体或其片段来预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含本文描述的鼠单克隆抗体4C2或嵌合或人源化的单克隆抗体以及药用可接受的稀释剂或载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文所述单克隆抗体的抗原结合片段和药用可接受的稀释剂或载体。在另外的实施方案中，药物组合物包含编码所述抗体或抗体片段的核酸分子和药用可接受的稀释剂或载体。在另外的实施方案中，药物组合物包含含有所述核酸的载体和药用可接受的稀释剂或载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含表达所述载体的细胞和药用可接受的稀释剂或载体。 
在一个实施方案中，本发明提供一种方法，以减少对象的流感H5N1病毒感染，或降低对象流感H5N1病毒感染的风险，抑制对象被一种或更多种流感H5N1病毒毒株或分离物感染，或预防一种或更多种流感H5N1病毒毒株或分离物的流感感染或疾病。在这种实施方案中，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本文所述鼠单克隆抗体4C2或嵌合或人 源化单克隆抗体，或其抗原结合片段，包含编码所述抗体或抗体片段的多核苷酸的核酸分子；包含所述多核苷酸的载体；或表达所述载体的细胞。在一个实施方案中，对象是免疫受损的，是婴儿，是幼儿或是老人。在另一个实施方案中，施用提供治疗益处。在另外的实施方案中，治疗益处包括在对象中抑制流感病毒滴度的增加，降低流感病毒滴度，抑制流感病毒复制的增加，降低流感病毒复制，抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，或降低与流感病毒感染相关的一种或更多种症状或并发症的进展，严重性，频率，持续时间或概率。在一个实施方案中，症状或并发症选自恶寒，发烧，咳嗽，喉咙痛，鼻充血，窦充血，鼻感染，窦感染，身体疼痛，头痛，疲劳，肺炎，支气管炎，耳感染，耳痛和死亡。在另一个实施方案中，治疗益处包括促进对象从流感H5N1病毒感染的康复。在另外的实施方案中，给对象施用的物质在对象的流感H5N1病毒感染之前，基本上同时或之后进行施用。 
附图简述 
图1A和1B显示4C2mAb在小鼠中的预防功效。在用来自进化枝1A/HK/213/2003(图1A)或进化枝2.1病毒A/TLL013/06(图1B)的5MLD50小鼠适应的印度尼西亚HPAI H5N1攻击前一天，每组小鼠用2.5mg/kg，5mg/kg或10mg/kg的4C2mAb进行预治疗。在整个14天观察期监测小鼠的存活。结果表示为存活百分比。 
图2A和2B显示4C2mAb在小鼠中的治疗功效。在用来自进化枝1A/HK/213/2003(图2A)和进化枝2.1病毒A/TLL013/06(图2B)的小鼠适应的印度尼西亚HPAI H5N1攻击后一天，每组小鼠用2.5mg/kg，5mg/kg和10mg/kg的4C2mAb进行治疗。在整个14天观察期监测小鼠的存活。结果表示为存活百分比。 
图3A和3B显示嵌合4C2在小鼠中的预防功效。在用来自进化枝1A/HK/213/2003(图3A)或进化枝2.1病毒A/TLL013/06(图3B)的5MLD50小鼠适应的印度尼西亚HPAI H5N1攻击前一天，每组小鼠用2.5mg/kg，5mg/kg或10mg/kg的ch4C2进行预治疗。在整个14天观察期监测小鼠的存活。结果表示为存活百分比。 
图4A和4B显示嵌合4C2在小鼠中的治疗功效。在用来自进化枝1 A/HK/213/2003(图4A)和进化枝2.1病毒A/TLL013/06(图4B)的小鼠适应的印度尼西亚HPAI H5N1攻击后一天，每组小鼠用2.5mg/kg，5mg/kg和10mg/kg的ch4C2进行治疗。在整个14天观察期监测小鼠的存活。结果表示为存活百分比。 
发明详述 
本发明涉及对流感H5血凝素的主要中和表位特异的鼠单克隆抗体4C2或嵌合或人源化单克隆抗体及其活性片段。本发明还涉及使用所述鼠或嵌合或人源化单克隆抗体或其片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。 
“分离的”表示不含与其天然存在的至少一些组分的生物分子。 
如本文使用的术语“抗体”是本领域公知的术语，应被理解为表示结合已知抗原的分子或分子的活性片段，尤其表示免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含特异性结合抗原的结合位点的分子。免疫球蛋白是一种蛋白，其包括基本上由免疫球蛋白κ和λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因编码的一种或更多种多肽。轻链被分为κ或λ。重链被分为γ、μ、α、δ或ε，分别依次定义免疫球蛋白类型，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重链的亚型也是已知的。例如，人的IgG重链可以是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型中的任一种。本发明的免疫球蛋白可以具有任意类型(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)或亚型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。 
如本文使用的涉及抗体的“特异性结合”表示与结构不同的抗原相比，抗体与其靶抗原以更大的亲和力结合。 
已知典型的免疫球蛋白结构单位包括四聚体。每个四聚体由多肽链的两个相同对组成，每对具有一条“轻”链（大约25kD）和一条“重”链（大约50-70kD）。每条链的N端限定一个大约100到110个或者更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链（VL）和可变重链（VH）分别表示这些轻链和重链。 
抗体以以下形式存在：全长完整的抗体或大量的良好表征的片段(通过用各种肽酶肽酶或化学试剂消化而产生)。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区的二硫键处消化抗体产生F(ab)'2，Fab的二聚体，其自身是通过二硫键与 VH-CH1连接的轻链。在温和条件下F(ab)'2可以被还原以断裂铰链区的二硫键从而将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有铰链区部分的Fab(对于其他抗体片段更详细的说明参见，Fundamental Immunology,W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993))。尽管各种抗体片段是根据完整抗体的消化来限定，技术人员将理解任意的各种抗体片段可以从头合成或化学合成或利用重组DNA方法合成。因此，如本文使用的术语抗体还包括通过完整抗体的修饰或从头合成产生的抗体片段或利用重组DNA方法获得的抗体和片段。 
本发明范围内的“抗体”期包括嵌合或人源化单克隆抗体，及其活性片段。结合已知抗原的分子的活性片段的实例包括分离的轻链和重链，Fab,Fab/c,Fv,Fab',和F(ab')2片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物和上文提及的任意抗体和片段的表位结合片段。 
通过多种技术这些活性片段可以来源于本发明的抗体。例如，可以用酶诸如胃蛋白酶切割单克隆抗体，并进行HPLC凝胶过滤。然后收集包含Fab片段的相应组分，并通过膜过滤等进行浓缩。关于分离抗体活性片段的常规技术的进一步说明参见例如Khaw等(1982);Rousseaux等(1986)。 
重组制备的抗体可以是常规的全长抗体，已知来源于蛋白水解消化的活性抗体片段，独特的活性抗体片段诸如Fv或单链Fv(scFv)，结构域缺失的抗体等。Fv抗体的大小约50Kd，包括轻链和重链的可变区。单链Fv（“sFv”）多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其可以由直接连接或通过肽编码接头连接的包括VH-和VL-编码序列的核酸来表达。参见Huston等(1988)。将抗体V区的天然聚集的，但化学分离的轻和重多肽链转化为sFv分子的大量结构，所述sFv分子将折叠形成与抗原结合簇结构基本上类似的三维结构。参见，例如美国专利号5,091,513;5,132,405和4,956,778。 
结合位点是指参与抗原结合的抗体分子部分。抗原结合簇由重("H")和轻("L")链的N端可变("V")区氨基酸残基组成。抗体可变区包括3个高度变异的伸展(stretch)(称为“高变区”或“互补决定区”(CDR))，其插入称为“骨架区”(FR)的更保守的侧翼伸展之间。在抗体分子中，轻链的3个高变区(LCDR1,LCDR2和LCDR3)和重链的3个高变区(HCDR1,HCDR2和HCDR3)在三维空间中彼此相对排列以形成抗原结合表面或口袋。因此抗体结合位点表示组成抗体CDR的氨基酸和组成结合位点口袋的任意框架残 基。 
可以利用本领域公知的方法确定特定抗体中构成结合位点的氨基酸残基的性质。参见，例如，美国专利申请公开号2010/0080800。可以使用本领域公知的方法诸如分子建模和X射线结晶来确定特定抗体中氨基酸残基的性质，所述氨基酸残基在CDR之外，但通过具有侧链(其是结合位点内层的一部分)仍构成结合位点的一部分(即，它可以用于通过结合位点进行链接)。参见，例如，Riechmann等(1988)。 
嵌合抗体是其中一个或更多个抗体区域来源于一个动物物种，而一个或更多个抗体区域来自于不同动物物种的抗体。优选的嵌合抗体是包括来自灵长类动物免疫球蛋白区域的嵌合抗体。用于人临床使用的嵌合抗体通常理解为具有来自非人动物例如啮齿类的可变区以及来自人的恒定区。与此相反，人源化抗体使用来自非人抗体的CDR，而大部分或全部可变框架区和全部恒定区来自人免疫球蛋白。人嵌合抗体通常理解为具有来自啮齿类的可变区。典型的人嵌合抗体具有人重链恒定区和人轻链恒定区，而重链和轻链的可变区来自于啮齿类抗体。嵌合抗体可以包括人恒定区天然氨基酸序列和天然啮齿类可变区序列的一些变化。可以利用本领域公知的方法制备嵌合和人源化抗体，包括CDR移植方法(参见，例如，美国专利号5,843,708;6,180,370;5,693,762;5,585,089;5,530,101)，链改组策略(参见，例如，美国专利号5,565,332;Rader等(1998))，分子建模策略(美国专利号5,639,641)，等等。 
就双链抗体来说如本文使用的“人源化抗体”是其中至少一条链被人源化的抗体。人源化抗体链具有可变区，其中一个或更多个框架区是人的。单链的人源化抗体是其中所述链具有可变区(其中一个或更多个框架区是人的)的抗体。人源化抗体链或其片段的可变区的非人部分来源于非人来源，尤其是非人抗体，通常是啮齿类来源。对人源化抗体的非人贡献通常以至少一个CDR区域(其间置在来源于一个(或更多个)人免疫球蛋白的框架区之间)的形式提供。此外，可以改变框架支持物残基以保持结合亲和力。 
人源化抗体还可以包括恒定区(例如，就轻链来说，至少一个恒定区或其部分，和就重链来说，优选的3个恒定区)。如果存在，人源化抗体的恒定区通常是人的。获得“人源化抗体”的方法是本领域技术人员公知的。参见，例如，美国专利申请公开号2010/0080800。 
如本文使用的术语恒定区(CR)是指免疫球蛋白的恒定区基因。恒定区基因编码提供效应物功能的抗体分子部分。对于嵌合人抗体和人源化抗体来说，通常非人(例如，鼠)恒定区被人恒定区取代。所述嵌合或人源化抗体的恒定区通常来源于人免疫球蛋白。重链恒定区可以选自5种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。此外，各种亚型(诸如重链的IgG亚型)的重链负责不同的效应物功能，因此，通过选择所需的重链恒定区，可以产生具有所需效应物功能的抗体。可在本发明范围内使用的恒定区是γ1(IgG1)，尤其是γ1(IgG1)同种型的Fc区，γ3(IgG3)，特别是γ4(IgG4)。轻链恒定区可以具有κ或λ型，优选的具有κ型。在一个实施方案中，轻链恒定区是人κ恒定链(Hieter等(1980))，重恒定链是人IgG4恒定链。 
如本文使用的术语可变区(VR)是指抗体每对轻链和重链中的结构域，它们直接参与抗体与抗原的结合。每条重链在一端具有可变区(VH)，然后是大量恒定区。每条轻链在一端具有可变区(VL)，在另一端具有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一恒定区连接，轻链可变区与重链可变区连接。 
如本文使用的术语框架区(FR)是指位于抗体重链和轻链可变区内的一个或更多个框架区(参见Kabat等(1992);Johnson and Wu(2001);http：\\immuno.bme.nwa.edu)。这类表述包括插入抗体轻链和重链可变区的CDR之间的那些氨基酸序列区域。 
根据标准序列限定法(Kabat等(1992))和结构限定法(例如，诸如Chothia和Lesk(1987))确定CDR和FR残基。当这两种方法导致稍微不同的CDR鉴别时，结构限定法是优选的，但通过序列限定方法鉴别的残基被认为是用于确定将何种框架残基引入共有序列的重要FR残基。 
术语“单克隆抗体”也是本领域公知的，表示作为单克隆抗体生成细胞产物的抗体。通常通过将常规短寿命的产生抗体的B细胞与快速生长的细胞(诸如癌细胞(有时称为“永生化”细胞))融合来制备单克隆抗体。获得的杂交细胞，或杂交瘤，快速增殖，制备出产生抗体的克隆。 
术语“片段”是指抗体或抗体链的一部分，其包括比完整或全部抗体或抗体链更少的氨基酸残基。可以通过完整或全部抗体或抗体链的化学或酶处理来获得片段。还可通过重组方法获得片段。示例性片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc和/或和Fv片段。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其结合抗原或与完整抗体(即，与作为它们来源的完 整抗体)竞争进行抗原结合(即，特异性结合)。通过重组DNA技术或者通过酶或者化学切割完整的免疫球蛋白来产生结合片段。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv、单链、和单链抗体。 
具有降低免疫原性的人源化抗体是指相对于亲本抗体(例如，鼠抗体)显示降低免疫原性的人源化抗体。 
基本上保留亲本抗体结合特性的人源化抗体是指一种人源化抗体，其保留特异性结合被亲本抗体(用于产生所述人源化抗体)识别的抗原的能力。优选的人源化抗体将显示与亲本抗体相同的或基本上相同的抗原结合亲和力和亲合力。理想地，抗体的亲和力不低于亲本抗体亲和力的10%，更优选的不低于约30%，和最优选的亲和力不低于亲本抗体的50%。用于测定抗原结合亲和力的方法是本领域公知的，包括半最大结合测定，竞争测定，和Scatchard分析。 
此外，术语“治疗有效量”是指当给人或动物施用时，足以在所述人或动物中产生治疗功效的抗体量。本领域技术人员按照常规方法可以方便的确定有效量。 
如本文使用的，术语“治疗”和“预防”是指由于施用预防或治疗剂引起的对象中一种或更多种病症症状复发或发作的预防。 
在第一个方面，本发明提供对流感H5血凝素的主要中和表位特异的单克隆抗体及其活性片段，即抗原结合片段(本文中也称为抗体片段)。在一个实施方案中，单克隆抗体是鼠单克隆抗体4C2。鼠单克隆抗体4C2由小鼠杂交瘤4C2产生。根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)，在2010年8月3日将小鼠杂交瘤4C2保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection),10801University Blvd.,Manassas,VA20110,USA，分配的登录号为PTA-11241。本发明还涉及产生鼠单克隆抗体4C2的杂交瘤。在第二个实施方案中，单克隆抗体是嵌合或人源化的单克隆抗体。具体来说，所述嵌合或人源化的单克隆抗体与鼠单克隆抗体4C2特异性结合的H5血凝素的构象表位特异性结合。在一个实施方案中，单克隆抗体(鼠单克隆抗体或嵌合或人源化的单克隆抗体)或其片段特异性结合H5血凝素(HA)的构象表位，其中所述构象表位由成熟HA蛋白的氨基酸155(Ser)和189(Arg)组成。在另一个实施方案中，轻链可变区的互补决定区(CDR)(LCDR)位于SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列内(本文中也称为HM448828，其是小鼠轻 链可变区的氨基酸序列)。在另一个实施方案中，轻链可变CDR的氨基酸序列是：LCDR1:QDISGH(SEQ ID NO:5);LCDR2:HGT(SEQ ID NO:6);和LCDR3:VQYVQFPWT(SEQ ID NO:7)。在一个实施方案中，重链可变区的互补决定区(CDR)(HCDR)位于SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列内(本文中也称为HM448827，其是小鼠重链可变区的氨基酸序列)。在另一个实施方案中，重链可变CDR的氨基酸序列是∶HCDR1:GYTFTTYW(SEQ ID NO:8);HCDR2:IDPYDSET(SEQ ID NO:9);和HCDR3:VRGGSTVAYFGV(SEQ ID NO:10)。 
在一个实施方案中，编码HM448828的DNA包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，编码HM448827的DNA包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。在一个实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链和轻链恒定区是人的。在另一个实施方案中，人重链恒定区是人IgG1重链恒定区。在另一个实施方案中，人IgG1重链恒定区包含SEQ ID NO:22(GenBank登录号AAX09634.1)所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，编码该氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID NO:21(GenBank登录号AY885218.1)所示。在一个实施方案中，人轻链恒定区是人kappa轻链恒定区。在另一个实施方案中，人kappa轻链恒定区包括SEQ ID NO:24(GenBank登录号AAA58989.1)所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，编码该序列的核酸序列如SEQ ID NO:23(GenBank登录号J00241.1)所示。 
在另一个实施方案中，本发明提供一种核酸，其编码本文描述的鼠单克隆抗体4C2或嵌合或人源化单克隆抗体或其抗原结合片段。核酸序列的实例包括本文描述的那些。在另外的实施方案中，本发明提供包括所述核酸的载体。在另外的实施方案中，本发明提供包括并表达所述载体的细胞。 
在一个实施方案中，利用本文描述的技术，以及技术人员公知的技术，通过将人重链和轻链恒定区与小鼠重链和轻链可变区组合来制备人源化抗体。在另一个实施方案中，制备人源化抗体，其中编码人源化VL和VH序列(其分别包含本文描述的小鼠轻链和重链可变区的CDR)的DNA序列是合成的。 
用于合成编码已知序列蛋白的DNA的方法是本领域公知的。使用这种 方法，合成编码本发明所述人源化抗体的DNA序列，然后在适于表达重组抗体的载体系统中进行表达。这可以在任意载体系统中实现，所述载体系统提供本发明所述的人源化抗体序列，诸如包括人恒定区序列和小鼠可变区序列(其被连接以产生功能性(抗原结合)抗体)的融合蛋白的表达。 
具体来说适于表达重组抗体和人源化抗体的表达载体、宿主细胞以及适于表达这类抗体的方法是本领域公知的。参见，例如，美国专利号7,074,406。 
已知能够表达功能免疫球蛋白的宿主细胞包括举例来说哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，COS细胞，骨髓瘤细胞，细菌诸如大肠杆菌，酵母细胞诸如酿酒酵母，以及其他宿主细胞。在这些细胞中，考虑到它们有效表达和分泌免疫球蛋白的能力，许多研究人员使用CHO细胞。 
基本上，通过两种常规方法之一实现人源化抗体的重组表达。在第一种方法中，用单个载体(其提供融合到所选恒定区的重链和轻链可变序列的表达)转染宿主细胞。在第二种方法中，用两种载体(其分别提供融合到所选恒定区的可变重链或轻链序列的表达)转染宿主细胞。 
在第二个方面，本发明提供使用所述鼠单克隆抗体4C2或嵌合或人源化单克隆抗体或其片段来预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包括本文描述的鼠单克隆抗体4C2或嵌合或人源化的单克隆抗体以及药用可接受的稀释剂或载体。在另一个实施方案中，药物组合物包括本文所述单克隆抗体的抗原结合片段和药用可接受的稀释剂或载体。在另外的实施方案中，药物组合物包括编码所述抗体或抗体片段的核酸分子和药用可接受的稀释剂或载体。在另外的实施方案中，药物组合物包括包含所述核酸的载体和药用可接受的稀释剂或载体。在另一个实施方案中，药物组合物包括表达所述载体的细胞和药用可接受的稀释剂或载体。 
在一个实施方案中，本发明提供一种方法，以减少对象的流感H5N1病毒感染、或降低对象流感H5N1病毒感染的风险、抑制一种或更多种流感H5N1病毒毒株或分离物对对象的感染、或预防一种或更多种流感H5N1病毒毒株或分离物的流感感染或疾病。在这种实施方案中，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本文所述鼠单克隆抗体4C2或嵌合或人源化单克隆抗体，或其抗原结合片段，包括编码所述抗体或抗体片段的多 核苷酸的核酸分子；包括所述多核苷酸的载体；或表达所述载体的细胞。在一个实施方案中，对象是免疫受损的，是婴儿，是幼儿或是老人。在另一个实施方案中，施用提供治疗益处。在另外的实施方案中，治疗益处包括在对象中抑制流感病毒滴度的增加，降低流感病毒滴度，抑制流感病毒复制的增加，降低流感病毒复制，抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，或降低与流感病毒感染相关的一种或更多种症状或并发症的进展，严重性，频率，持续时间或概率。在一个实施方案中，症状或并发症选自恶寒，发烧，咳嗽，喉咙痛，鼻充血，窦充血，鼻感染，窦感染，身体疼痛，头痛，疲劳，肺炎，支气管炎，耳感染，耳痛和死亡。在另一个实施方案中，治疗益处包括促进对象从流感H5N1病毒感染的康复。在另外的实施方案中，给对象施用的物质在对象的流感H5N1病毒感染之前，基本上同时或之后进行施用。 
利用已知技术，可以将本发明的抗体制备为生理上可接受的制剂，并包括药用可接受的载体，稀释剂和/或赋形剂。例如，本发明的抗体及如本文所述包括任意功能等同的抗体或其功能部分与药用可接受的载体，稀释剂和/或赋形剂混合以形成治疗组合物。合适的药物载体，稀释剂和/或赋形剂是本领域公知的，包括，例如，磷酸缓冲盐溶液，水，乳液诸如油/水乳液，各种类型的湿润剂，无菌溶液，等等。 
可以根据本领域技术人员已知的标准方法实现本发明药物组合物的制备。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Ed.D.B.Troy,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,2006，其援引加入本文。 
可以按照合适的药学有效量给对象施用固体、液体或气雾剂形式的本发明组合物。固体组合物的实例包括丸剂，乳剂，和可植入的剂量单位。丸剂可以口服施用。治疗乳剂可以局部施用。可植入的剂量单位可以局部施用，例如，在肿瘤部位，或例如皮下植入用于治疗组合物的全身释放。液体组合物的实例包括适合于肌内，皮下，静脉内，动脉内注射的制剂，以及用于局部和眼内施用的制剂。气雾剂的实例包括用于给肺施用的吸入剂。 
可以通过标准施用途径施用组合物。通常，可以通过局部、口服、直肠、鼻、皮内(interdermal)、腹腔内、或肠胃外(例如，静脉内、皮下、或肌 内)途径施用组合物。此外，组合物可以掺入缓释基质诸如可生物降解的聚合物，可植入所需输送位置(例如，肿瘤部位)附近的多聚体。所述方法包括施用单剂量，按照预定时间间隔施用重复剂量，以及持续施用预定时间段。如本文使用的缓释基质是由材料(通常是可通过酶或酸/碱水解或通过溶解可降解的多聚体)制成的基质。一旦插入身体，基质受到酶和体液的作用。缓释基质希望选自生物相容性材料诸如脂质体，多乳酸化合物(聚乳酸)，聚乙醇酸交酯(羟基乙酸的多聚体)，聚乳酸共乙交酯(乳酸和羟基乙酸的共聚物)，聚酐，聚(邻)酯，多肽，透明质酸，胶原，硫酸软骨素，羧酸，脂肪酸，磷脂，多糖，核酸，聚氨基酸，氨基酸诸如苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，多核苷酸，聚乙烯丙烯，聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。优选的可生物降解基质是以下基质中的一种：聚乳酸，聚乙醇酸交酯，或聚乳酸共乙交酯(乳酸和羟基乙酸的共多聚体)。 
所述组合物可以与包括生物活性物质或化合物(尤其至少一种化合物)的其它组合物联合施用，所述化合物选自抗氧化应激化合物，抗凋亡化合物，金属螯合剂，DNA修复抑制剂诸如Pirenzepin和代谢物，3-氨基-1-丙烷磺酸(3APS)，1,3-丙烷二磺酸盐(1,3PDS),α-分泌酶活化剂，β-和γ-分泌酶抑制剂，tau蛋白，神经递质，β-片层结构破坏剂，淀粉样β清除/去除细胞组分的引诱剂，N端截短淀粉样β包括焦谷氨酸化淀粉样β3-42的抑制剂，抗炎分子，“非典型抗精神病药”诸如，例如氯氮平，齐拉西酮，利培酮，阿立哌唑或奥氮平或胆碱酯酶抑制剂(ChEI)诸如他克林，利斯的明，多奈哌齐，和/或加兰他敏，M1激动剂和其他药物包括任意淀粉样或tau调节药物和营养补充剂诸如，例如，维生素B12，半胱氨酸，乙酰胆碱前体，卵磷脂，胆碱，银杏，乙酰基-L-肉碱，艾地苯醌，丙戊茶碱，或黄嘌呤衍生物，以及本发明的抗体和，任选的，药用可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂以及用于治疗疾病的方法。 
蛋白药学活性物质的量是每剂量1ng到10mg的量。通常，施用方案应当在0.1μg到10mg本发明抗体的范围内，特别是1.0μg到1.0mg的范围内，更特别的是1.0μg到100μg的范围内，而位于这些范围内的单个数值也属于本发明。如果通过连续输注进行施用，更合适的剂量是在0.01μg到10mg单位/公斤体重/小时的范围内，而位于这些范围内的单个数值也属于本发明。 
施用通常是肠胃外的，例如静脉内。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液，悬液和乳液。非水性溶剂包括但不限于，丙二醇，聚乙二醇，植物油诸如橄榄油，和注射用有机酯诸如油酸乙酯。水性溶剂可以选自水，醇/水溶液，乳液或悬液包括盐水和缓冲培养基。肠胃外赋形剂包括氯化钠溶液，Ringer's葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸盐Ringer's，或非挥发油。静脉内赋形剂包括液体和营养补充物，电解质补充物(诸如基于Ringer's葡萄糖的那些)等等。还可以存在防腐剂，诸如，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等。 
药物组合物还可以包括蛋白载体诸如，例如，血清白蛋白或免疫球蛋白，尤其是人来源的。根据预期用途，本发明的药物组合物中还可以存在生物活性剂。 
在本发明中，通过表位作图来表征抗HA2gp单克隆抗体(mAb)组的相应表位。在用HPAI H5N1病毒感染攻击的小鼠中鉴定这些mAb的治疗和预防功效。在鼠模型中鉴定这些mAb中的一种针对两种来自进化枝1和2.1的高致病性H5N1病毒株的预防和治疗功效。通过观察体重减轻，存活率以及感染小鼠肺中病毒载量清除的动力学来确定功效。从这种mAb制备嵌合或人源化mAb。 
除非另外指出，本发明的实施使用以下常规技术：化学，分子生物学，微生物学，重组DNA，遗传学，免疫学，细胞生物学，细胞培养和转基因生物学，这都在本领域技术范围内。参见，例如，Maniatis等,1982,Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York);Sambrook等,1989,Molecular Cloning,2nd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York);Sambrook and Russell,2001,Molecular Cloning,3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York);Ausubel等,1992),Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,including periodic updates);Glover,1985,DNA Cloning(IRL Press,Oxford);Russell,1984,Molecular biology of plants:a laboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.);Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992);Guthrie and Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press,New York,1991);Harlow and Lane,1988, Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984);Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984);Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986);B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);Methods In Enzymology,Vols.154and155(Wu等eds.),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987);Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986);Riott,Essential Immunology,6th Edition,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1988;Fire等,RNA Interference Technology:From Basic Science to Drug Development,Cambridge University Press,Cambridge,2005;Schepers,RNA Interference in Practice,Wiley–VCH,2005;Engelke,RNA Interference(RNAi):The Nuts&Bolts of siRNA Technology,DNA Press,2003;Gott,RNA Interference,Editing,and Modification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Human Press,Totowa,NJ,2004;Sohail,Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application,CRC,2004。 
实施例
[0010]本发明参考下列实施例进行描述，提供所述实施例是为了说明而不是旨在以任何方式限制本发明。使用本领域公知的标准技术或下文具体描述的技术。 
实施例1：材料和方法 
病毒：H5N1人流感病毒，来自进化枝2.1A/印度尼西亚/CDC669/2006,A/印度尼西亚/TLL012/2006,A/印度尼西亚/TLL013/2006,A/印度尼西亚/TLL014/2006和A/印度尼西亚/CDC326/2006获自印度尼西亚的卫生部(MOH)。***通过反向遗传学(RG)(WHO,2005)拯救来自不同进化枝(进化枝0-A/香港/156/97，进化枝1.0-A/香港/213/2004，进化枝4.0-A/鹅/贵阳/337/06和进化枝8.0-A/鸡/河南/12/04)的病毒。简单来说，将合成的HA和NA基 因克隆入双启动子质粒用于甲型流感反向遗传学。双启动子质粒获自疾病预防和控制中心(Center for Disease Control and Prevention),Atlanta,GA,USA。利用Lipofectamine2000(Invitrogen Corp.USA)将包含HA和NA的质粒以及源自A/波多黎各/8/34(H1N1)的剩余6种基因质粒转染293T和MDCK细胞的共培养物，拯救重配株病毒。将原病毒苗(stock viruses)在11天龄含胚鸡蛋的尿囊腔中35°C增殖36-91小时。根据CDC/NIH和WHO的建议，并得到新加坡农业食品与兽医局(Agri-Food and Veterinary Agency)和卫生部(MOH)的批准，在BSL3+防范设施中进行所有涉及高致病性病毒的实验。 
Mab产生：用溶于0.1ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)的来自A/印度尼西亚/TLL014/2006的灭活全病毒(用等体积的佐剂Montanide ISA563(SEPPIC,France)乳化)按照2周的定期间隔给BALB/c小鼠皮下免疫两次。在将脾细胞与SP2/0细胞融合前3天，小鼠利用相同的病毒抗原进行加强。将融合细胞种于96孔板，并通过如下所述的免疫荧光测定筛选它们的上清液。通过进行有限稀释至少3次，将产生mAb的杂交瘤克隆。如下所述根据它们的血细胞凝集抑制活性检测阳性mAb。按照制造商实验方案中的描述，使用商品化的分型试剂盒(Amersham Bioscience,England)将来自所选阳性mAb的免疫球蛋白进行分型。使用Protein A琼脂糖凝胶珠(Millipore)纯化mAb。通过SDS-PAGE分析确定抗体纯度。然后如下所述，通过标准血细胞凝集抑制测定检测mAb的中和活性。 
免疫荧光测定(IFA)：用AIV H5N1毒株感染在96孔板培养的MDCK细胞。在感染24-48小时后，将细胞在室温用4%多聚甲醛固定30分钟，并用磷酸缓冲盐溶液(PBS),pH7.4清洗3次。将固定细胞与杂交瘤培养上清液在37°C温育1小时，磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗，然后与1:40稀释的偶联异硫氰酸荧光(FITC)的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako,Denmark)温育。再用PBS清洗细胞，通过广视野表面荧光显微镜(Olympus IX71)鉴定抗体结合。 
血细胞凝集抑制测定：按照先前的描述(Webster等,1991)，进行血细胞凝集抑制(HI)测定。简单来说，在V形底96孔板中将mAb系列稀释(2倍)，并与4HA单位的病毒H5N1病毒混合。将板在室温下温育30分钟，每孔添加1%鸡RBCs。血细胞凝集抑制终点是其中观察不到凝集的最高mAb 稀释度。 
渗漏突变体的分离和分析：按照先前的描述(Kaverin等,2007)，通过渗漏突变体的表征对mAb4C2识别的表位作图。简单来说，将H5N1病毒与过量的mAb温育1小时，然后接种入11天龄的含胚鸡蛋。为了分离体内渗漏突变体，将来自治疗小鼠的肺部样品直接接种入含胚蛋。蛋在37°C温育48h。收集病毒，用于含胚鸡蛋中有限稀释法的克隆，并噬斑纯化渗漏突变体。从尿囊液提取RNA。逆转录(RT)-PCR扩增血凝素基因，并克隆入TA-克隆载体(Promega)，对数个克隆进行测序。通过与亲本病毒的序列进行比较，分析单个克隆的序列。 
嵌合IgG1表达质粒的克隆：按照(Jostock等,2004)的描述设计表达载体。简单来说，利用下列引物扩增编码kappa轻链和IgG1重链的人抗体恒定区：人IgG1恒定重链：正向引物5’-CTCGAGCGACCTCCACCAAGG-3’(SEQ ID NO:11)和反向引物5’-TCTAGACTCGGAGAGGGACAGAG-3’(SEQ ID NO:12)；人恒定kappa kappa轻链：正向引物5’-CTGCAGATCACGCGAACTGTGGCT GC-3’(SEQ ID NO:13)和反向引物5’-GGCGCGCCCGAAGTTGTCCCCTCTCACAA TCATC ATC-3’(SEQ ID NO:14)。将扩增的kappa轻链和IgG1重链的恒定区克隆入改造的pCMV/myc/ER质粒，在它们之间插入脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)。引入独特的限制性酶切位点，以允许在框架与恒定区之间插入重链和轻链的可变区。从mAb4C2杂交瘤细胞制备mRNA，并用于利用随机六聚物的第一链cDNA合成。利用小鼠scFv重组抗体噬菌体系统(Amersham Biosciences)的引物和试验方案，利用总cDNA作为模板来扩增可变重链和轻链。将最终产物克隆入pCR-Script(Stratagene,USA)用于测序。然后如下设计序列特异性引物：4C2特异性可变轻链：正向引物5’-GG TAAGGGGTTAACAGTAGCAGG-3’(SEQ ID NO:15)和反向引物5’-CTTTGGCCTC TCTGGGATAGAAG-3’(SEQ ID NO:16)；4C2特异性可变重链：正向引物5’-CACGATGATAATATGGCCACAACC-3’(SEQ ID NO:17)和反向引物5’-CACCG GTTGGGGGAAGTAGTACT-3’(SEQ ID NO:18)。这些引物用于可变区的扩增，然后将其克隆入表达载体。4C2特异性可变轻链编码序列如SEQ ID NO:3所示，4C2特异性可变重链编码序列如SEQ ID NO:1所示。这种构建体的表达产生嵌合抗体，其包含33%的 序列作为来自小鼠的小鼠可变区和67%的序列作为人IgG1恒定区。 
嵌合抗体的瞬时表达和纯化：利用Freestyle293表达系统(Invitrogen,USA)表达嵌合抗体，以获得在给定的无血清培养基中产生的抗体。利用293fectin(Invitrogen,USA)将上述构建体转染入293-F细胞，转染后120小时收集上清液。利用Protein A琼脂糖凝胶珠(Millipore)纯化嵌合抗体4C2(ch-mAb4C2或ch4C2)。通过SDS-PAGE确定嵌合抗体的纯度，并使用利用HRP标记的抗人Ig(DAKO)的免疫印迹分析来确认人恒定区的引入。 
微量中和测定：按照先前的描述(Prabakaran等,2008)，通过微量中和测定分析抗H5N1毒株的单克隆抗体的中和活性。简单来说，将10倍稀释的mAb进一步系列稀释(2倍)，并与10050%组织培养感染性量(TCID50)的H5N1毒株不同进化枝在室温下温育1小时，一式两份铺板在96孔板生长的MDCK细胞。通过Reed和Muench方法确定每种H5N1毒株在MDCK细胞培养物中的TCID50。将其中通过光学显微镜没有观察到细胞病变效应的最高mAb稀释度确定为中和滴度。 
攻击研究：4-6周龄的近交SPF BALB/c小鼠用于攻击研究。用5MLD50(小鼠致死剂量50%)的两种不同H5N1毒株(来自进化枝1的RG-A/香港/213/2003和来自进化枝2.1的A/印度尼西亚/TLL013/06)鼻内感染小鼠(每组n=10)。所有动物实验都根据Guides for Animal Experiments Performed at NIID和实验方案进行。 
预防功效：为了测定预防功效，在病毒攻击前，用2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg或0mg/kg(PBS)的单克隆抗体(4C2或ch4C2)腹膜内预治疗小鼠。24小时后，用5MLD50的两种不同H5N1株攻击小鼠。每天观察小鼠的体重和死亡率，直至所有动物死亡或直至攻击后14天。 
治疗功效：为了确定嵌合mAb的治疗功效，用5MLD50两种不同的H5N1毒株攻击小鼠组。病毒攻击后24小时，用2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg或0mg/kg(PBS)的单克隆抗体(4C2或ch4C2)通过腹膜内途径治疗小鼠。每天观察小鼠的体重和死亡率，直至所有动物死亡或直至攻击后14天。 
实施例2：鼠mAb4C2的表征和嵌合 
针对不同H5N1病毒株的有效中和，筛选一组抗流感血凝素(HA)的 mAb。利用中和渗漏突变体的挑选，分析参与形成4C2mAb表位的氨基酸。包括信号蛋白的HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，成熟HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。从4C2mAb的多个渗漏变体分离的完整HA基因的测序在氨基酸位置155(Ser到Ile)和189(Arg到Lys)(相对于SEQ ID NO:20所示的成熟HA蛋白)载有单个点突变。基于其与H5N1病毒的反应性和高HI活性(表1)和中和滴度(表2)选择mAb4C2用于小鼠模型的治疗研究。 
表1：抗H5N1毒株不同进化枝的4C2mAb的血细胞凝集抑制滴度 
病毒株 H5N1病毒进化枝 HI滴度
A/印度尼西亚/TLL014 进化枝2.1 512
A/印度尼西亚/TLL013 进化枝2.1 512
A/印度尼西亚/CDC669/06 进化枝2.1 512
A/香港/156/97 进化枝0 256
A/鹅/贵阳/337/06 进化枝4 256
A/鸡/河南/12/04 进化枝8 512
RG-A/香港/213/2004 进化枝1 256
A/鸡/新加坡/Sg02H3N2 - <4
A/黑翅雀鹎/印度尼西亚/F89/H7N1 - <4
利用不同的病毒测量鼠4C2(1mg/ml)的血细胞凝集抑制滴度。 
表2：抗H5N1毒株不同进化枝的4C2mAb的微量中和滴度 
病毒株 H5N1病毒进化枝 抗H5N1毒株#的微量中和滴度
A/印度尼西亚/TLL014 进化枝2.1 320
A/印度尼西亚/TLL013 进化枝2.1 640
A/印度尼西亚/CDC669/06 进化枝2.1 320
A/香港/156/97 进化枝0 320
A/鹅/贵阳/337/06 进化枝4 320
A/鸡/河南/12/04 进化枝8 640
RG-A/香港/213/2004 进化枝1 320
A/鸡/新加坡/Sg02H3N2 - <10
A/黑翅雀鹎/印度尼西亚/F89/H7N1 - <10
利用H5N1病毒的不同进化枝测量mAb4C2(1mg/ml)的病毒微量中和。 
*各n-mAb的浓度为1mg/ml 
#100TCID50的各病毒株用于微量中和测定 
实施例3：用4C2mAb预防性治疗保护小鼠免受致死性病毒攻击 
我们在用H5N1病毒的进化枝1或进化枝2.1毒株进行攻击的小鼠中检查了4C2mAb的保护功效。在用5MLD50的两种H5N1病毒进化枝进行致死性攻击后，用5mg/kg或10mg/kg4C2的单剂量预治疗的所有小鼠未死亡(100%保护)(图1A，1B)，而未治疗的对照小鼠在攻击后6天死于病毒感染。此外，甚至用最低浓度2.5kg/mg4C2预治疗的小鼠分别显示针对进化枝1(图1A)和进化枝2.1(图1B)的70和80%保护。 
实施例4：用4C2治疗性治疗保护小鼠免受致死性病毒攻击 
为了确定4C2mAb针对H5N1致死性攻击的治疗功效，用5MLD50的进化枝1或进化枝2.1病毒株攻击小鼠。病毒攻击后24小时，用2.5mg、5mg/kg或10mg/kg4C2治疗小鼠。在5mg/kg和10mg/kg的浓度mAb4C2能够100%的保护小鼠免遭两种进化枝病毒攻击(图2A和2B)。甚至在2.5mg/kg它也能够保护80%的小鼠免遭进化枝1和进化枝2.1病毒的致死性攻击。 
实施例5：鼠mAb4C2的嵌合(chimerization) 
为了mAb产生嵌合单克隆抗体(ch-mAb)，从而使恒定区被人源恒定区取代，但可变区维持鼠来源的。这种方式产生的嵌合mAb是66.6%人源化的。嵌合抗体仍然保留鼠mAb的原始特性(结果未显示)。采用这种方式，制备嵌合或人源化mAb。 
实施例6：ch4C2的预防性治疗保护小鼠免受致死性病毒攻击 
我们在用H5N1病毒的进化枝1或进化枝2.1毒株进行攻击的小鼠中检查了ch4C2的保护功效。在用5MLD50的两种H5N1病毒进化枝进行致死性攻击后，用5mg/kg或10mg/kg ch4C2的单剂量预治疗的所有小鼠未死亡(100%保护)(图3A，3B)，而未治疗的对照小鼠在攻击后6天死于病毒感染。此外，甚至用最低浓度2.5kg/mg ch4C2预治疗的小鼠分别显示针对进化枝1(图3A)和进化枝2.1(图3B)的80和90%保护。 
实施例7：ch4C2的治疗性治疗保护小鼠免受致死性病毒攻击 
为了确定ch4C2针对H5N1致死性攻击的治疗功效，用5MLD50的进化枝1或进化枝2.1病毒株攻击小鼠。病毒攻击后24小时，用2.5mg、5mg/kg或10mg/kg ch4C2治疗小鼠。在5mg/kg和10mg/kg的浓度，ch4C2能够100%的保护小鼠免受两种进化枝病毒攻击(图4A和4B)。甚至在2.5mg/kg它也能够保护70%的小鼠免受进化枝1和进化枝2.1病毒的致死性攻击。 
利用渗漏突变体分析的表位作图显示Ser155和Arg189是mAb4C2表位的主要决定簇。此外，在高抗原性150环(150's loop)和189氨基酸位置处表位氨基酸的存在解释了其高中和能力。因此，在本研究中我们挑选鼠抗体4C2用于抗致死性H5N1感染的预防和治疗研究。此外，我们挑选该抗体用于嵌合，并将嵌合抗体后续用于抗致死性H5N1感染的预防和治疗研究。此外，抗体的被动施用仍然是探索抗大流行性感冒的策略。在小鼠模型中，单剂量4C2mAb或ch4C2的预防或治疗性施用显示抗致死性H5N1流感的100%保护。使用10m/kg和5mg/kg4C2或ch4C2，我们观察到针对抗H5N1病毒的进化枝1和2.1的100%保护。5mg/kg的剂量提供足够保护和病毒攻击后9天有效的病毒清除，而10mg/kg的剂量在病毒攻击后6天就清除病毒。利用4C2或ch4C2的治疗可能有助于控制感染的初期病程，从而允许动物建立有效免疫应答。我们的研究表明，利用mAb4C2或嵌合mAb ch4C2的被动免疫疗法是高致病性H5N1感染的预防和治疗的有效方法，提供未来流感大流行时所需的即刻免疫。利用本领域公知的技术，通过移植互补决定区，能将本文产生的嵌合抗体进一步人源化。嵌合抗体能在猿猴中进行临床前鉴定。小鼠研究的预防和治疗中单剂量的有效性显示，即使嵌合抗体自身不引起免疫应答，抗体的功效仍然得到维持。 
在描述本发明的背景(尤其是下列权利要求的背景)下，术语“一个(a)”和“一个(an)”和“the”以及类似对象的使用应解释为包括单数和复数，除非在本文中另外指出或根据背景明显矛盾。术语“包含(comprising)”，“具有(having)”，“包括(including)”和“含有(containing)”应理解为开放式的术语(即，表示包括但不限于），除非另作说明。本文数值范围的描述仅仅旨在作为分别涉及属于所述范围的每个单独值的简写方法，除非本文另外指出，每个单独值被包括进说明书就好像它是在本文单独描述的。例如，如果公 开了范围10-15，那么11，12，13，和14也被公开。本文描述的所有方法可以按照任何合适的顺序进行，除非本文另外指出，或另外根据背景明显抵触。本文提供的任意和所有实施例或示例性语言（例如，“诸如”）的使用仅仅是为了更好的说明本发明，不是为了给本发明的范围做出限制，除非另有要求。说明书中没有语言应理解为指示任何未要求的要素是实施本发明必需的。 
应理解本发明的方法和组合物可以整合入各种形式的实施方案，本文只公开了其中一些。本文描述了本发明的实施方案，包括本发明人已知用于实施本发明的最佳方式。在阅读上述说明书后，这些实施方案的变化对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。本发明人预期有经验的技术人员酌情使用这类变化，本发明人认为可以在本文具体描述之外实施本发明。因此，本发明包括适用法律许可的所附权利要求中叙述的主题的所有改变和等同形式。此外，本发明包括上述元件采用其所有可能变化的任何组合，除非本文另外指出，或根据背景明显抵触。 
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Claims (19)

1.特异性结合H5血凝素的构象表位的单克隆抗体或抗体片段，其中所述H5血凝素的构象表位是以登录号PTA-11241保藏于美国典型培养物保藏中心的杂交瘤4C2产生的鼠单克隆抗体4C2所特异性结合的构象表位，并且其中所述构象表位包含成熟H5血凝素的氨基酸155(Ser)和氨基酸189(Arg)，并且其中互补决定区是：
LCDR1:QDISGH(SEQ ID NO:5)；
LCDR2:HGT(SEQ ID NO:6)；
LCDR3:VQYVQFPWT(SEQ ID NO:7)
HCDR1:GYTFTTYW(SEQ ID NO:8)；
HCDR2:IDPYDSET(SEQ ID NO:9)；和
HCDR3:VRGGSTVAYFGV(SEQ ID NO:10)。
2.权利要求1的单克隆抗体或片段，其中所述单克隆抗体是以登录号PTA-11241保藏于美国典型培养物保藏中心的杂交瘤4C2所产生的鼠单克隆抗体4C2。
3.权利要求1的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体或其片段是来源于以登录号PTA-11241保藏于美国典型培养物保藏中心的杂交瘤4C2产生的鼠单克隆抗体4C2的嵌合或人源化单克隆抗体。
4.权利要求1的单克隆抗体或抗体片段，其中H5血凝素由SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列组成。
5.权利要求1到4任一项的单克隆抗体或抗体片段，其中轻链可变区的互补决定区在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列之内。
6.权利要求1到4任一项的单克隆抗体或抗体片段，其中重链可变区的互补决定区在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列之内。
7.权利要求1到4任一项的单克隆抗体或抗体片段，其中轻链可变区的互补决定区在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列之内，并且重链可变区的互补决定区在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列之内。
8.权利要求1到4任一项的单克隆抗体或抗体片段，其中轻链可变区由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。
9.权利要求1到4任一项的单克隆抗体或抗体片段，其中重链可变区由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成。
10.权利要求1到4任一项的单克隆抗体或抗体片段，其中轻链可变区由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，并且重链可变区由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成。
11.核酸，其编码权利要求1到10任一项的单克隆抗体或抗体片段。
12.载体，其包含权利要求11的核酸。
13.细胞，其包含并表达权利要求12的载体。
14.药物组合物，其包含物质和药用可接受的稀释剂或载体，其中所述物质选自(a)权利要求1到10任一项的单克隆抗体或抗体片段、(b)包含编码所述单克隆抗体或抗体片段的核酸的核酸分子、(c)包含所述核酸的载体和(d)表达所述载体的细胞。
15.一种物质在制备用于用于减少对象的流感H5N1病毒感染、或降低对象感染流感H5N1病毒的风险、或抑制一种或更多种流感H5N1病毒毒株或分离物对对象的感染、或预防一种或更多种流感H5N1病毒毒株或分离物的流感感染或疾病的药物中的应用，所述物质选自(a)权利要求1到10任一项的单克隆抗体或抗体片段、(b)包含编码所述单克隆抗体或抗体片段的核酸的核酸分子、(c)包含所述核酸的载体和(d)表达所述载体的细胞。
16.权利要求15的应用，其中所述对象是免疫受损的、是婴儿、是幼儿或是老人。
17.权利要求15的应用，其中所述物质提供治疗益处。
18.权利要求17的应用，其中所述治疗益处包括(a)抑制流感病毒滴度的增加，(b)降低流感病毒滴度，(c)抑制流感病毒复制的增加，(d)降低流感病毒复制，(e)抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，(f)降低对象中与流感病毒感染相关的一种或更多种症状或并发症的进展、严重性、频率、持续时间或概率，或(g)促进对象从流感病毒感染的康复。
19.权利要求18的应用，其中所述症状或并发症选自恶寒、发烧、咳嗽、喉咙痛、鼻充血、窦充血、鼻感染、窦感染、体痛、头痛、疲劳、肺炎、支气管炎、耳感染、耳痛和死亡。
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