JP2013249314A - 複数の髄膜炎菌血清群に対する注射可能ワクチン - Google Patents

Abstract

【課題】血清群Ａ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに対する結合体ワクチンの改善。
【解決手段】注射可能免疫原性組成物であって、この組成物は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの少なくとも２種由来の莢膜サッカリドを含有し、ここで、この莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に結合されるか、および／またはオリゴサッカリドであり、ここで、（ｉ）この組成物は、用量あたり５０μｇ未満の髄膜炎菌サッカリドを含有するか、および／または（ｉｉ）この組成物が、以下（ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ；（ｂ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型；および／もしくは（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのうちの１種以上由来の抗原をさらに含有する。上記組成物におけるサッカリド抗原は、一般的に、キャリアに結合される。
【選択図】なし

Description

本明細書中に引用される全ての文書は、全体として参考として援用される。

（技術分野）
本発明は、ワクチンの分野（特に、細菌性髄膜炎に対するワクチンの分野）にある。

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、グラム陰性ヒト病原体であり［１］、細菌性髄膜炎を引き起こす。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの近縁であるが、髄膜炎菌を明らかに区別する１つの特徴は、全ての病原性髄膜炎に存在するポリサッカリド莢膜の存在である。

生物の莢膜ポリサッカリドに基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１２種の血清群が同定されている（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、２９Ｅ、Ｗ１３５、Ｘ、ＹおよびＺ）。血清群Ａ（「ＭｅｎＡ」）は、サハラ砂漠以南のアフリカにおける流行疾患の最も一般的な原因である。血清群Ｂおよび血清群Ｃは、先進国における主要な症例の原因であり、残りの症例は、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙにより引き起こされている。

分類のために使用されるのと同様に、上記莢膜ポリサッカリドは、ワクチン接種のために使用されている。血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｙおよび血清群Ｗ１３５由来の莢膜ポリサッカリドの注射可能四価ワクチンは、長年にわたり公知であり［２，３］、そしてヒトへの使用が許可されている。青年および成人において有効であるが、上記ワクチンは、弱い免疫応答および短時間の防御を誘導し、そして乳児において使用され得ない［例えば、４］。このワクチンにおけるポリサッカリドは、結合されておらず、そして１：１：１：１の重量比で存在する［５］。Ｍｅｎｃｅｖａｘ ＡＣＷＹ^ＴＭおよびＭｅｎｏｍｕｎｅ^ＴＭは、一旦それらの凍結乾燥形態から再構成されると、ともに５０μｇの各々の精製ポリサッカリドを含有する。血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの莢膜サッカリドはまた、結合体の形態で組み合わされており［６〜９］、四価ワクチン（例えば、非アジュバントＭｅｎａｃｔｒａ^ＴＭ製品）を与える。

結合体血清群Ｃオリゴサッカリドは、ヒトへの使用が承認されており、これらの結合体血清群Ｃオリゴサッカリドとしては、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭ［１０，１１］、Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ^ＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ^ＴＭが挙げられる。Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭ製品およびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃ^ＴＭ製品は、ＣＲＭ_１９７キャリアに結合されたオリゴサッカリド抗原を有し、ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ^ＴＭは、破傷風トキソイドキャリアに結合された（脱Ｏ−アセチル化された）完全なポリサッカリドを使用する。

しかし、血清群Ａ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに対する結合体ワクチンの改善、ならびにそれらの製造における改善が、必要とされ続けている。この必要性は、参考文献７に開示される製品、プロセスおよび使用によって取り組まれているが、さらなる改変および改善の余地が残っている。

（発明の開示）
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも２種由来の莢膜サッカリドを含有する注射可能免疫原性組成物を提供し、この莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に結合されるか、および／またはオリゴサッカリドであり、そして、この組成物は、用量あたり５０μｇ以下の髄膜炎菌サッカリドを含有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
注射可能免疫原性組成物であって、該組成物が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも３種由来の莢膜サッカリドを含有し、該莢膜サッカリドが、キャリアタンパク質に結合され、かつオリゴサッカリドであり、そして該組成物が、用量あたり５０μｇ未満の髄膜炎菌サッカリドを含有する、組成物。
（項目２）
注射可能免疫原性組成物であって、該組成物が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも２種由来の莢膜サッカリドを含有し、該莢膜サッカリドが、キャリアタンパク質に結合されるか、および／またはオリゴサッカリドであり、そして該組成物が、（ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ；（ｂ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型；および／または（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのうちの１種以上由来の抗原をさらに含有する、組成物。
（項目３）
項目１または項目２に記載の組成物であって、該組成物が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙから防御する抗原を含有する、組成物。
（項目４）
項目３に記載の組成物であって、該組成物が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａから防御する抗原をさらに含有する、組成物。
（項目５）
項目４に記載の組成物であって、前記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａから防御する抗原が、改変された血清群Ａ莢膜サッカリドであり、ここで、１つ以上のヒドロキシル基が、保護基により置換されている、組成物。
（項目６）
項目３または項目４に記載の組成物であって、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型から防御する抗原をさらに含有する、組成物。
（項目７）
項目３〜５のいずれか１項に記載の組成物であって、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂから防御する１種以上の抗原をさらに含有する、組成物。
（項目８）
項目７に記載の組成物であって、前記１種以上の抗原が、被験体への投与後、該被験体における抗体応答を誘導し得、該抗体応答が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの超毒性系統Ａ４、超毒性系統ＥＴ ５および系統３のうちの２つ以上に対して殺菌性である、組成物。
（項目９）
項目７または項目８に記載の組成物であって、前記１種以上の抗原が、以下の５種の抗原：（１）オリゴマー形態の「ＮａｄＡ」タンパク質；（２）「７４１」タンパク質；（３）「９３６」タンパク質；（４）「９５３」タンパク質；および（５）「２８７」タンパク質を含有する、組成物。
（項目１０）
項目９に記載の組成物であって、該組成物が、配列番号２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、配列番号７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドおよび配列番号８のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含有する、組成物。
（項目１１）
項目３〜６のいずれか１項に記載の組成物であって、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから防御する１種以上の抗原をさらに含有する、組成物。
（項目１２）
項目１１に記載の組成物であって、前記１種以上の抗原が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の莢膜サッカリドを含有する、組成物。
（項目１３）
項目１２に記載の組成物であって、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの５種〜１１種の間の異なる血清型由来の莢膜サッカリドを含有する、組成物。
（項目１４）
項目１１に記載の組成物であって、前記１種以上の抗原が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のポリペプチドを含有する、組成物。
（項目１５）
項目１４に記載の組成物であって、該組成物が、以下のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原：ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３０のうちの１種以上を含有する、組成物。
（項目１６）
項目１〜１５のいずれか１項に記載の組成物であって、該組成物中のサッカリド抗原が、キャリアタンパク質に結合されたオリゴサッカリドである、組成物。
（項目１７）
項目１６に記載の組成物であって、該組成物中のサッカリド抗原が、ＣＲＭ_１９７タンパク質、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのプロテインＤ、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドに結合されたオリゴサッカリドである、組成物。
（項目１８）
項目１６または項目１７に記載の組成物であって、前記結合体が、１：５（すなわち、タンパク質過剰）と５：１（すなわち、サッカリド過剰）との間のサッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する、組成物。
（項目１９）
項目１〜１８のいずれか１項に記載の組成物であって、該組成物が、用量あたり２５μｇ未満の髄膜炎菌サッカリドを含有する、組成物。
（項目２０）
項目１〜１９のいずれか１項に記載の組成物であって、該組成物が、アルミニウム塩アジュバントをさらに含有する、組成物。
（項目２１）
キットであって、以下：（ａ）必要に応じて項目５に記載のように化学改変された、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ由来の凍結乾燥形態の莢膜サッカリド；および（ｂ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ由来の液体形態の莢膜サッカリド
を備える、キット。
（項目２２）
項目２１に記載のキットであって、前記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ由来の凍結乾燥莢膜サッカリドが、アジュバントを含有せず、そして前記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ由来の液体莢膜サッカリドが、アジュバントを含有する、キット。
（項目２３）
項目１〜２０のいずれか１項に記載の組成物を調製するための方法であって、必要に応じて項目５に記載のように化学改変された、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ由来の凍結乾燥莢膜サッカリドと、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ由来の液体形態の莢膜サッカリドとを混合する工程を包含する、方法。
（項目２４）
患者において免疫応答を生じる方法であって、該方法が、項目１〜２０のいずれか１項に記載の組成物を患者に注射する工程を包含する、方法。
（項目２５）
（ｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ由来の莢膜結合オリゴサッカリド、ならびに（ｉｉ）以下：（ａ）血清群Ｂ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；（ｂ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型；および／または（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのうちの１種以上由来の抗原の、細菌性髄膜炎の予防および／または処置のための注射可能薬剤の製造における、使用。

本発明はまた、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも２種由来の莢膜サッカリドを含有する注射可能免疫原性組成物を提供し、この莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に結合されるか、および／またはオリゴサッカリドであり、そして、この組成物は、以下：（ａ）血清群Ｂ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；（ｂ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型；および／もしくは（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのうちの１種以上由来の抗原をさらに含有する。

１６種の好ましい本発明の組成物に含まれる抗原は、以下である：（１）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（２）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（３）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（４）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（５）Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型ならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（６）Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型ならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（７）Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型ならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（８）Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型ならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（９）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（１０）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（１１）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（１２）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（１３）Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（１４）Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（１５）Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ；（１６）Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ。

本発明の組成物におけるサッカリド抗原は、好ましくは、キャリアに結合される。本発明の組成物におけるサッカリド抗原は、好ましくは、オリゴサッカリドである。本発明の組成物におけるサッカリド抗原は、最も好ましくは、結合されたオリゴサッカリドである。

（髄膜炎菌サッカリド混合物）
本発明の組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも２種（すなわち、２種、３種または４種）由来の莢膜サッカリドを含有する。本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ（すなわち、非ＭｅｎＡサッカリド）由来のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓサッカリドを含有する。実際の免疫原性（例えば、ＥＬＩＳＡ力価）は減少され得るが、個々のサッカリド抗原の防御効力が、それらを組み合わせることにより除去されないことが好ましい。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１種より多い血清群由来のサッカリド混合物が、好ましい（例えば、血清群Ａ＋Ｃ由来のサッカリドを含有する組成物、血清群Ａ＋Ｗ１３５由来のサッカリドを含有する組成物、血清群Ａ＋Ｙ由来のサッカリドを含有する組成物、血清群Ｃ＋Ｗ１３５由来のサッカリドを含有する組成物、血清群Ｃ＋Ｙ由来のサッカリドを含有する組成物、血清群Ｗ１３５＋Ｙ由来のサッカリドを含有する組成物、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５由来のサッカリドを含有する組成物、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｙ由来のサッカリドを含有する組成物、血清群Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ由来のサッカリドを含有する組成物、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ由来のサッカリドを含有する組成物など）。好ましい組成物は、血清群Ｃおよび血清群Ｙ由来のサッカリドを含有する。他の好ましい組成物は、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ由来のサッカリドを含有する。莢膜サッカリドが血清群Ａおよび血清群Ｃのみ由来である組成物は、好ましくない（参考文献１０、１３および１４を参照）。

混合物が、血清群Ａおよび血清群Ｃの両方由来の莢膜サッカリドを含有する場合、ＭｅｎＡサッカリド：ＭｅｎＣサッカリドの比（ｗ／ｗ）は、１よりも大きくあり得る（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１以上）。

混合物が、血清群Ｙ由来の莢膜サッカリドと、血清群Ｃおよび血清群Ｗ１３５の一方または両方由来の莢膜サッカリドを含む場合、ＭｅｎＹサッカリド：ＭｅｎＷ１３５サッカリドの比（ｗ／ｗ）は、１より大きくあり得るか（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１以上）、および／またはＭｅｎＹサッカリド：ＭｅｎＣサッカリドの比（ｗ／ｗ）は、１未満であり得る（例えば、１：２、１：３、１：４、１：５以下）。

用量あたりの各々の髄膜炎菌サッカリド抗原の代表的な量は、１μｇと２０μｇとの間（例えば、約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇまたは約１０μｇ（サッカリドとして表される））である。

血清群Ａ：血清群Ｃ：血清群Ｗ１３５：血清群Ｙ由来のサッカリドについての好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１：１、１：１：１：２、２：１：１：１、４：２：１：１、８：４：２：１、４：２：１：２、８：４：１：２、４：２：２：１、２：２：１：１、４：４：２：１、２：２：１：２、４：４：１：２および２：２：２：１である。血清群Ｃ：血清群Ｗ１３５：血清群Ｙ由来のサッカリドについての好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１、１：１：２、１：１：１、２：１：１、４：２：１、２：１：２、４：１：２、２：２：１および２：１：１である。各々のサッカリドの実質的に等価な量を用いることが、好ましい。

（莢膜ポリサッカリドの精製）
髄膜炎菌莢膜ポリサッカリドは、代表的に、（例えば、陽イオン界面活性剤を用いた）ポリサッカリド沈殿、エタノール分別、（タンパク質を除去するための）冷フェノール抽出および（ＬＰＳを除去するための）超遠心の工程を包含するプロセスにより調製される［例えば、参考文献１５］。

しかし、より好ましいプロセスは［７］、ポリサッカリド沈殿、その後の低級アルコールを用いた沈殿ポリサッカリドの可溶化を含有する。沈殿は、陽イオン性界面活性剤（例えば、テトラブチルアンモニウム塩およびセチルトリメチルアンモニウム塩（例えば、臭化物塩）または臭化ヘキサジメトリンおよびミリスチルトリメチルアンモニウム塩）を用いて達成され得る。臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）は、特に好ましい［１６］。沈殿物質の可溶化は、低級アルコール（例えば、メタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなど）を用いて達成され得るが、エタノールは、ＣＴＡＢ−ポリサッカリド複合体を可溶化するために特に適切である。エタノールは、好ましくは、沈殿されたポリサッカリドに添加され、５０％と９５％との間の最終エタノール濃度（エタノールおよび水の総含量に基づく）を与える。

再可溶化後、上記ポリサッカリドは、夾雑物を除去するためにさらに処置され得る。これは、少量の汚染すら受容可能でない状況（例えば、ヒトワクチンの生成）において、特に重要である。これは、代表的に、１種以上の濾過工程（例えば、深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、活性炭素を通す濾過が使用され得るか、サイズ濾過および／または限外濾過）を包含する。

一旦濾過されて夾雑物が除去されると、上記ポリサッカリドは、さらなる処理および／またはプロセシングのために沈殿され得る。これは、（例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加による）陽イオン交換により都合よく達成され得る。

精製の代替として、本発明の莢膜サッカリドは、全合成または部分合成により得られ得る（例えば、Ｈｉｂ合成は、参考文献１７に開示され、ＭｅｎＡ合成は、参考文献１８に開示される）。

上記ポリサッカリドは、化学改変され得る。例えば、上記ポリサッカリドは、改変されて１つ以上のヒドロキシル基を保護基で置換し得る。これは、血清群Ａに対する加水分解を減少するために特に有用である［１９］（以下を参照のこと）。サッカリドの脱Ｏ−アセチル化はまた、実施され得る。

（血清群Ｂ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）
本発明のいくつかの組成物は、血清群Ｂ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の抗原を含有する。血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙとは異なり、ＭｅｎＢの莢膜サッカリドは、その自己抗原に対する類似性に起因して、ヒトにおける免疫原としての使用のために適切ではない。サッカリド抗原が、ＭｅｎＢのために使用される場合、従って、改変されたサッカリド（例えば、サッカリドのシアル酸残基のＮ−アセチル基が、Ｎ−アシル基で置換された改変されたサッカリド）を使用することが必要である。適切なＮ−アシル基は、Ｃ_１〜Ｃ_８アシル基（例えば、Ｎ−プロピオニル）である［２０］。しかし、サッカリド抗原を使用することよりも、ポリペプチド抗原を使用することが好ましい。

従って、上記組成物は、ＭｅｎＢ感染から防御する免疫応答および／またはＭｅｎＢに対して殺菌性である免疫応答を誘導する１種以上のポリペプチド抗原を含有し得る。より一般的には、上記組成物は、好ましくは、被験体への投与前に、その被験体において抗体応答を誘導し得、この抗体応答は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの超毒性系統Ａ４、超毒性系統ＥＴ−５および系統３のうちの２種以上（例えば、２種または３種）に対して殺菌性である。

ＭｅｎＢのＭＣ５８株のゲノム配列は、公開されており［２１］、そして適切な抗原が、コードポリペプチドより選択され得る［２２］。好ましい抗原は、参考文献２２〜参考文献３２に開示されている。単一抗原からなるよりも、本発明の組成物は、１０種以下（例えば、９種、８種、７種、６種、５種、４種、３種、２種）の精製された抗原の混合物を含有することが好ましく、そしてこの組成物が、抗原の複合体も未規定混合物も含有しないことが、特に好ましい（例えば、この組成物において、外膜小胞（ＯＭＶ）を含有しないことが好ましい）。

好ましい組成物は、以下の５種の抗原のうちの１種以上を含有する［３２］：（１）好ましくは、オリゴマー形態（例えば、トリマー形態）の「ＮａｄＡ」タンパク質；（２）「７４１」タンパク質；（３）「９３６」タンパク質；（４）「９５３」タンパク質；および（５）「２８７」タンパク質。

好ましいＭｅｎＢ抗原は、２９９６株、ＭＣ５８株、９５Ｎ４７７株および３９４／９８株のうちの１種において見出されるアミノ酸配列を含む。タンパク質２８７は、好ましくは、２９９６株由来であるか、または、より好ましくは、３９４／９８株由来である。タンパク質７４１は、好ましくは、血清群ＢのＭＣ５８株、２９９６株、３９４／９８株もしくは９５Ｎ４７７株由来であるか、または、血清群Ｃの９０／１８３１１株由来である。ＭＣ５８株が、より好ましい。タンパク質９３６、タンパク質９５３およびタンパク質ＮａｄＡは、好ましくは、２９９６株由来である。組成物が、特定のタンパク質抗原（例えば、７４１または２８７）を含有する場合、その組成物は、１種より多い変異体の形態で（例えば、同じタンパク質であるが、１種より多い株由来である）、その抗原を含有し得る。これらのタンパク質は、縦列タンパク質または別個のタンパク質として含有され得る。

ＭｅｎＢ由来の「ＮａｄＡ」（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌの付着因子Ａ）は、参考文献２５においてタンパク質「９６１」として開示されており（配列番号２９４３および配列番号２９４４）、そして参考文献２１において「ＮＭＢ１９９４」として開示されている（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号１１３５２９０４および７２２７２５６もまた参照のこと）。上記タンパク質の詳細な研究は、参考文献３３において見られ得る。本発明に従って使用される場合、ＮａｄＡは、種々の形態をとり得る。ＮａｄＡの好ましい形態は、トランケーション改変体または欠失改変体（例えば、参考文献２９〜３１に開示されているトランケーション改変体または欠失改変体）である。特に、そのＣ末端膜アンカーを有さないＮａｄＡ（例えば、本明細書中の配列番号１を与える、２９９６株の残基３５１〜残基４０５の欠失）が好ましく、本明細書中で、時に、例えば上付き「Ｃ」の使用（例えば、ＮａｄＡ^（Ｃ））により区別される。その膜アンカードメインを有さないＮａｄＡのＥ．ｃｏｌｉにおける発現は、培養物上清へのタンパク質の分泌をもたらし、同時にその２３マーリーダーペプチドの除去が生じる（例えば、２９９６株の３２７マーを残す［本明細書中で、配列番号２］）。そのリーダーペプチドを有さないポリペプチドは、本明細書中で、時に、上付き「ＮＬ」の使用（例えば、ＮａｄＡ^（ＮＬ）またはＮａｄＡ^{（Ｃ）（ＮＬ）}）により区別される。好ましいＮａｄＡポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：（ａ）配列番号２に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）；および／または（ｂ）配列番号１の少なくともｎ個連続したアミノ酸のフラグメントを含有するアミノ酸配列であって、ここで、ｎが、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）であるアミノ酸配列。（ｂ）についての好ましいフラグメントは、配列番号１のＣ末端および／またはＮ末端から、１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個以上）のアミノ酸が欠けている（例えば、ＮａｄＡ^（Ｃ）、ＮａｄＡ^（ＮＬ）、ＮａｄＡ^{（Ｃ）（ＮＬ）}）。他の好ましいフラグメントは、配列番号１由来のエピトープを含み、そして配列番号１の特に好ましいフラグメントは、配列番号２である。これらの種々の配列は、ＮａｄＡ改変体を含む（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、パラログ（ｐａｒａｌｏｇ）、変異体など）。種々のＮａｄＡ配列は、参考文献３４の図９に示される。

ＭｅｎＢ由来の「７４１」タンパク質は、参考文献２５（配列番号２５３５および配列番号２５３６）において開示され、そして参考文献２１において「ＮＭＢ１８７０」として開示される（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：７２２７１２８もまた参照のこと）。血清群Ａにおける対応するタンパク質［３５］は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号７３７９３２２を有する。７４１は、本来、リポタンパク質である。本発明に従って使用される場合、７４１タンパク質は、種々の形態をとり得る。７４１の好ましい形態は、トランケーション改変体または欠失改変体である（例えば、参考文献２９〜３１に開示されているトランケーション改変体または欠失改変体）。特に、７４１のＮ末端は、そのポリグリシン配列までを含めて欠失され得（すなわち、ＭＣ５８株の残基１〜残基７２の欠失［本明細書中で、配列番号３］）、この配列は、時に、本明細書中で、接頭辞「ΔＧ」の使用により区別される。この欠失は、発現を促進し得る。この欠失はまた、７４１の脂質化部位を除去する。好ましい７４１配列は、以下のアミノ酸配列を有する：（ａ）配列番号３に対して５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号３由来の少なくともｎ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であって、ここで、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である、アミノ酸配列。（ｂ）の好ましいフラグメントは、７４１由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号３のＣ末端および／またはＮ末端から、１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個以上）のアミノ酸が欠けている。これらの配列は、７４１改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルトログ、パラログ、変異体など）を含む。種々の７４１配列は、参考文献３１の配列番号１〜配列番号２２、参考文献３６の配列番号１〜配列番号２３および参考文献３７の配列番号１〜配列番号２９９において見出され得る。

タンパク質７４１は、抗髄膜炎菌抗体応答を誘発するための非常に有効な抗原であり、全ての髄膜炎菌血清群にわたって発現されている。系統発生的分析は、上記タンパク質が、２つの群に分かれること、およびそれらの分けられたもののうちの一方が、全体でさらに３つの改変体を与え［３８］、そして一方で、所与の改変体に対して生じた血清は、同じ改変体群内においては殺菌性であり、他の２つの改変体のうちの１つを発現する株に対しては活性ではないこと（すなわち、改変体間の交差防御ではなく、改変体内の交差防御が存在すること）を示している［３６，３８］。従って、最大の株交差（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｉｎ）効力のためには、組成物が、タンパク質７４１の１種より多い改変体を含有することが好ましい。各々の改変体由来の例示的配列を、本明細書中で、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２に与え、これらの配列は、脂質が天然のリポタンパク質形態で共有結合されるＮ末端システイン残基で始まる。従って、上記組成物が、以下のうちの少なくとも２種を含有することが好ましい：（１）配列番号１０に対して少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして／または配列番号１０由来の少なくともｘ個連続するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第１のタンパク質；（２）配列番号１１に対して少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして／または配列番号１１由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第２のタンパク質；ならびに（３）配列番号１２に対して少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして／または配列番号１２由来の少なくともｚ個連続するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第３のタンパク質。ａの値は、少なくとも８５（例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５以上）である。ｂの値は、少なくとも８５（例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５以上）である。ｃの値は、少なくとも８５（例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５以上）である。ａの値、ｂの値およびｃの値は、本質的に、互いに関連しない。ｘの値は、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｙの値は、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｚの値は、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｘの値、ｙの値およびｚの値は、本質的に、互いに関連しない。いずれの所与の７４１アミノ酸配列も、分類（１）、分類（２）および分類（３）のうちの１種よりも多くに分類されないことが好ましい。従って、いずれの所与の７４１配列も、分類（１）、分類（２）および分類（３）のうちのただ１種にのみ分類される。従って、以下が好ましい：タンパク質（１）が、タンパク質（２）に対してｉ％未満の配列同一性を有すること；タンパク質（１）が、タンパク質（３）に対してｊ％未満の配列同一性を有すること；およびタンパク質（２）が、タンパク質（３）に対してｋ％未満の配列同一性を有する。ｉの値は、６０以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０など）であり、最大がａである。ｊの値は、６０以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０など）であり、最大がｂである。ｋの値は、６０以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０など）であり、最大がｃである。ｉの値、ｊの値およびｋの値は、本質的に、互いに関連しない。

血清群Ｂ由来の「９３６」タンパク質は、参考文献２５（配列番号２８８３および配列番号２８８４）に開示され、「ＮＭＢ２０９１」は、参考文献２１に開示される（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：７２２７３５３もまた参照のこと）。血清群Ａにおける対応する遺伝子［３５］は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号７３７９０９３を有する。本発明に従って使用される場合、９３６タンパク質は、種々の形態をとり得る。９３６の好ましい形態は、トランケーション改変体または欠失改変体（例えば、参考文献２９〜３１に開示されているトランケーション改変体または欠失改変体）である。特に、９３６のＮ末端リーダーペプチドが、欠失され得る（例えば、９３６^（ＮＬ）［本明細書中で、配列番号４］を与える、ＭＣ５８株の残基１〜残基２３の欠失）。好ましい９３６配列は、以下のアミノ酸配列を有する：（ａ）配列番号４に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）；および／または（ｂ）配列番号４由来の少なくともｎ個連続したアミノ酸のフラグメントを含有するアミノ酸配列であって、ここで、ｎが、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である、アミノ酸配列。（ｂ）についての好ましいフラグメントは、９３６由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号４のＣ末端および／またはＮ末端由来の１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個以上）のアミノ酸が欠けている。これらの配列は、９３６改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルトログ、パラログ、変異体など）を含む。

血清群Ｂ由来の「９５３」タンパク質は、参考文献２５（配列番号２９１７および配列番号２９１８）に開示され、参考文献２１において「ＮＭＢ１０３０」として開示される（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：７２２６２６９もまた参照のこと）。血清群Ａにおける対応するタンパク質［３５］は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号７３８０１０８を有する。本発明に従って使用される場合、９５３タンパク質は、種々の形態をとり得る。９５３の好ましい形態は、トランケーション改変体または欠失改変体（例えば、参考文献２９〜３１に開示されているトランケーション改変体または欠失改変体）である。特に、９５３のＮ末端リーダーペプチドが、欠失され得る（例えば、９５３^（ＮＬ）［本明細書中で、配列番号５］を与える、ＭＣ５８株の残基１〜残基１９の欠失）。好ましい９５３配列は、以下のアミノ酸配列を有する：（ａ）配列番号５に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）；および／または（ｂ）配列番号５由来の少なくともｎ個連続したアミノ酸のフラグメントを含有するアミノ酸配列であって、ここで、ｎが、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である、アミノ酸配列。（ｂ）のための好ましいフラグメントは、９５３由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号５のＣ末端由来および／またはＮ末端由来の１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個以上）のアミノ酸が欠けている。これらの配列は、９５３改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルトログ、パラログ、変異体など）を含む。９５３の対立遺伝子形態は、参考文献２８の図１９において見られ得る。

血清群Ｂ由来の「２８７」タンパク質は、参考文献２５（配列番号３１０３および配列番号３１０４）に開示され、参考文献２１において「ＮＭＢ２１３２」として開示され、そして参考文献２２において「ＧＮＡ２１３２」として開示される（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：７２２７３８８もまた参照のこと）。血清群Ａにおける対応するタンパク質［３５］は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号７３７９０５７を有する。本発明に従って使用される場合、２８７タンパク質は、種々の形態をとり得る。２８７の好ましい形態は、トランケーション改変体または欠失改変体（例えば、参考文献２９〜３１に開示されているトランケーション改変体または欠失改変体）である。特に、２８７のＮ末端は、そのポリ−グリシン配列までを含めて欠失され得る（例えば、ΔＧ２８７［本明細書中で、配列番号６］を与える、ＭＣ５８株の残基１〜残基２４の欠失）。この欠失は、発現を促進し得る。好ましい２８７配列は、以下のアミノ酸配列を有する：（ａ）配列番号６に対して５０％以上の同一性を有する、アミノ酸配列（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）；および／または（ｂ）配列番号６由来の少なくともｎ個連続したアミノ酸のフラグメントを含有するアミノ酸配列であって、ここで、ｎが、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である、アミノ酸配列。（ｂ）のための好ましいフラグメントは、２８７由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号６のＣ末端由来および／またはＮ末端由来の１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個以上）のアミノ酸が欠けている。これらの配列は、２８７改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルトログ、パラログ、変異体など）を含む。２８７の対立遺伝子形態は、参考文献２８の図５および図１５、ならびに参考文献２５の実施例１３および図２１において見られ得る（配列番号３１７９〜配列番号３１８４）。

５種の基本ＭｅｎＢ抗原（ＮａｄＡ、７４１、９５３、９３６および２８７）は、５種の別個のタンパク質として組成物において存在し得るが、この抗原のうちの少なくとも２種は、単一のポリペプチド鎖（「ハイブリッド」タンパク質［参考文献２９〜３１］）として発現される（すなわち、それにより、５種の抗原が、５種より少ないポリペプチドを形成する）ことが好ましい。ハイブリッドタンパク質は、２つの理論上の利点を提供する：第１に、そのままでは不安定であり得るかまたは弱く発現され得るタンパク質が、その問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを付加することにより、補助され得る；第２に、２種の別個に有用なタンパク質を生成するために、用いる必要があるのは１度のみの発現および精製であるので、商業的製造が簡素化される。本発明の組成物に含まれるハイブリッドタンパク質は、５種の基本抗原のうちの２種以上（すなわち、２種、３種、４種または５種）を含有し得る。上記５種の抗原のうちの２種からなるハイブリッドが、好ましい。

５種の基本抗原の組み合わせ内で、ある抗原は、１種より多いハイブリッドタンパク質において存在し得るか、および／または非ハイブリッドタンパク質として存在し得る。しかし、抗原は、ハイブリッドとして存在するかまたは非ハイブリッドとして存在するかのいずれかが好ましいが、両方として存在することは好ましくない。しかし、ハイブリッド抗原および非ハイブリッド（好ましくは、リポタンパク質）抗原の両方としてタンパク質７４１を含むことは、有用であり得る（特に、７４１の１種より多い改変体が使用される場合）。

ハイブリッドタンパク質は、式ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨにより表され得、ここで：Ｘは、５種の基本抗原のうちの１種のアミノ酸配列であり；Ｌは、任意のリンカーアミノ酸配列であり；Ａは、任意のＮ末端アミノ酸配列であり；Ｂは、任意のＣ末端アミノ酸配列であり；そしてｎは、２、３、４または５である。

−Ｘ−部分が、野生型形態においてリーダーペプチド配列を有する場合、これは、ハイブリッドタンパク質に含まれ得るかまたは削除され得る。いくつかの実施形態において、上記リーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端に位置する−Ｘ−部分のリーダーペプチドを除いて、削除される（すなわち、Ｘ_１のリーダーペプチドは維持されるが、Ｘ_２．．．Ｘ_ｎのリーダーペプチドは、削除される）。このことは、全てのリーダーペプチドを削除し、かつＸ_１のリーダーペプチドを部分−Ａ−として使用することと等価である。

［−Ｘ−Ｌ−］の各々のｎの場合について、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してもよく、存在しなくてもよい。例えば、ｎ＝２である場合、上記ハイブリッドは、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨなどであり得る。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、代表的に、短い（例えば、２０以下（すなわち、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）のアミノ酸）。例としては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリ−グリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙ_ｎを含有する（ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上））およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓ_ｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上））が挙げられる。他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。有用なリンカーは、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドがＢａｍＨＩ制限酵素部位から形成されるＧＳＧＧＧＧ（配列番号９）であり、従って、クローニングおよび操作が容易になり、そして（Ｇｌｙ）_４テトラペプチドは、代表的なポリ−グリシンリンカーである。Ｘ_ｎ＋１が、ΔＧタンパク質であり、かつＬ_ｎがグリシンリンカーである場合、これは、Ｘ_ｎ＋１が、ΔＧタンパク質ではなく、かつＬ_ｎが存在しないことと等価であり得る。

−Ａ−は、任意のＮ末端アミノ酸配列である。−Ａ−は、代表的に、短い（例えば、４０以下（すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）のアミノ酸）。例としては、タンパク質輸送に関するリーダー配列またはクローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓ_ｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上））が挙げられる。他の適切なＮ−末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。Ｘ_１が、それ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、好ましくは、Ｎ末端メチオニンを提供するオリゴペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸を有する）である。

−Ｂ−は、任意のＣ末端アミノ酸配列である。−Ｂ−は、代表的に、短い（例えば、４０以下（すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）のアミノ酸）。例としては、タンパク質輸送に関する配列、クローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓ_ｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上）を含む）またはタンパク質安定性を増強する配列が挙げられる。他の適切なＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。

最も好ましくは、ｎは２である。本発明における使用のための２抗原ハイブリッドは、以下を含む：ＮａｄＡおよび７４１；ＮａｄＡおよび９３６；ＮａｄＡおよび９５３；ＮａｄＡおよび２８７；７４１および９３６；７４１および９５３；７４１および２８７；９３６よび９５３；９３６および２８７；９５３および２８７。２種の好ましいタンパク質は、以下である：Ｘ_１が９３６であり、かつＸ_２が７４１である；Ｘ_１が２８７であり、かつＸ_２が９５３である。

２種の特に好ましい本発明のハイブリッドタンパク質は、以下のとおりである：

これらの２種のタンパク質は、ＮａｄＡと（特に、配列番号２と）組み合わせて使用され得る。従って、本発明との使用のためのＭｅｎＢ抗原の好ましい組成物は、従って、配列番号２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、配列番号７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドおよび配列番号８のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む。これは、好ましくは、本発明との使用のためのＭｅｎＢ抗原の好ましい群である。

上述のように、ＭｅｎＢ抗原を含有する本発明の組成物は、好ましくは、ＭｅｎＢの超毒性系統Ａ４、超毒性系統ＥＴ−５および系統３のうちの２種または３種に対して有効な血清殺菌性抗体応答を誘導し得る。それらは、超毒性系統のサブグループＩ、サブグループＩＩＩ、サブグループＩＶ−１またはＥＴ−３７複合体の１種以上に対する殺菌性抗体応答および他の系統（例えば、超侵襲性系統）に対する殺菌性抗体応答をさらに誘導し得る。これらの抗体応答は、マウスにおいて都合よく測定され、そしてワクチン効力の標準的な指標である［例えば、参考文献２２の巻末の注１４を参照のこと］。血清殺菌活性（ＳＢＡ）は、補体媒介性の細菌殺傷を測定し、そしてヒトまたはウサギ乳仔の補体を用いてアッセイされ得る。ＷＨＯ基準は、ワクチンが、レシピエントの９０％より多くにおいて、少なくとも４倍のＳＢＡ上昇を誘導することを要求している。

上記組成物は、これらの超毒性系統内の各々および全てのＭｅｎＢ株に対して殺菌性抗体応答を誘導する必要はない；むしろ、特定の超毒素系統内の血清群Ｂ 髄膜炎菌の４種のさらなる株の任意の所与の群に対して、上記組成物により誘導される抗体は、上記群のうちの少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％以上）に対して殺菌性である。好ましい株群は、以下の国のうちの少なくとも４つにおいて単離された株を含む：ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲおよびＣＵ。上記血清は、好ましくは、少なくとも１０２４（例えば、２^１０、２^１１、２^１２、２^１３、２^１４、２^１５、２^１６、２^１７、２^１８以上、好ましくは、少なくとも２^１４）の殺菌性力価を有する。すなわち、上記血清は、参考文献２２に記載されるように、１／１０２４に希釈される場合、特定の株の試験細菌の少なくとも５０％を殺傷可能である。好ましい組成物は、血清群Ｂ 髄膜炎菌の以下の株に対する殺菌応答を誘導し得る：（ｉ）クラスターＡ４由来、９６１−５９４５株（Ｂ：２ｂ：Ｐ１．２１，１６）および／またはＧ２１３６株（Ｂ：−）；（ｉｉ）ＥＴ−５複合体由来、ＭＣ５８株（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６ｂ）および／または４４／７６株（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６）；（ｉｉｉ）系統３由来、３９４／９８株（Ｂ：４：Ｐ１．４）および／またはＢＺ１９８株（Ｂ：ＮＴ：−）。より好ましい組成物は、９６１−５９４５株、４４／７６株および３９４／９８株に対する殺菌応答を誘導し得る。９６１−５９４５株およびＧ２１３６株は、ともにＮｅｉｓｓｅｒｉａ ＭＬＳＴ基準株である［参考文献３９におけるｉｄｓ ６３８および１００２］。ＭＣ５８株は、広範に利用可能であり（例えば、ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３３５）、そして参考文献２１において配列決定された株であった。４４／７６株は、広範に使用され、そして特徴付けられており(例えば、参考文献４０)、そしてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ＭＬＳＴ基準株の１つである［参考文献３９におけるｉｄ ２３７；参考文献４１における表２の３２行目］。３９４／９８株は、元々、ニュージーランドにおいて１９９８年に単離され、そしてこの株を用いたいくつかの研究が公開されている（例えば、参考文献４２および４３）。ＢＺ１９８株は、別のＭＬＳＴ基準株である［参考文献３９におけるｉｄ ４０９；参考文献４１における表２の４１行目］。上記組成物は、ＥＴ−３７複合体由来の血清群Ｗ１３５のＬＮＰ１７５９２株（Ｗ１３５：２ａ：Ｐ１．５，２）に対する殺菌性応答を、さらに誘導し得る。これは、フランスにおいて２０００年に単離されたＨａｊｉ株である。

本発明の組成物に含まれ得る他のＭｅｎＢポリペプチド抗原としては、以下：参考文献２３からの配列番号６５０；参考文献２３からの配列番号８７８；参考文献２３からの配列番号８８４；参考文献２４からの配列番号４；参考文献２５からの配列番号５９８；参考文献２５からの配列番号８１８；参考文献２５からの配列番号８６４；参考文献２５からの配列番号８６６；参考文献２５からの配列番号１１９６；参考文献２５からの配列番号１２７２；参考文献２５からの配列番号１２７４；参考文献２５からの配列番号１６４０；参考文献２５由来の配列番号１７８８；参考文献２５由来の配列番号２２８８；参考文献２５からの配列番号２４６６；参考文献２５からの配列番号２５５４；参考文献２５からの配列番号２５７６；参考文献２５からの配列番号２６０６；参考文献２５からの配列番号２６０８；参考文献２５からの配列番号２６１６；参考文献２５からの配列番号２６６８；参考文献２５からの配列番号２７８０；参考文献２５からの配列番号２９３２；参考文献２５からの配列番号２９５８；参考文献２５からの配列番号２９７０；参考文献２５からの配列番号２９８８、のアミノ酸配列のうちの１個を含むＭｅｎＢポリペプチド抗原が挙げられるかまたは：（ａ）上記配列に対して５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）の同一性を有する；および／もしくは（ｂ）上記配列由来の少なくともｎ個連続するアミノ酸のフラグメントを含み、ｎが７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である、アミノ酸配列、を含むポリペプチドが挙げられる。（ｂ）についての好ましいフラグメントは、関連配列由来のエピトープを含む。これらのポリペプチドのうちの１種より多く（例えば、２種、３種、４種、５種、６種）が含まれ得る。

（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型（Ｈｉｂ））
上記組成物がＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型抗原を含む場合、それは、代表的に、Ｈｉｂ莢膜サッカリド抗原である。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ由来のサッカリド抗原は、周知である。

有利なことに、上記Ｈｉｂサッカリドは、特に、子供において、その免疫原性を増強するために、キャリアタンパク質に共有結合される。一般的なポリサッカリド結合体の調製および特定のＨｉｂ莢膜ポリサッカリドの調製は、良く実証されている［例えば、参考文献４４〜５２など］。本発明は、あらゆる適切なＨｉｂ結合体を使用し得る。適切なキャリアタンパク質は、以下に記載され、そして、Ｈｉｂサッカリドに対する好ましいキャリアは、ＣＲＭ_１９７（「ＨｂＯＣ」）、破傷風トキソイド（「ＰＲＰ−Ｔ」）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体（「ＰＲＰ−ＯＭＰ」）である。

上記結合体のサッカリド部分は、ポリサッカリド（例えば、全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ））であり得るが、ポリサッカリドを加水分解してオリゴサッカリド（例えば、約１〜約５ｋＤａのＭＷ）を形成することが好ましい。

好ましい結合体は、アジピン酸リンカーを介してＣＲＭ_１９７へと共有結合されたＨｉｂオリゴサッカリドを含む［５３，５４］。破傷風トキソイドはまた、好ましいキャリアである。

Ｈｉｂ抗原の投与は、好ましくは、０．１５μｇ／ｍｌ以上の抗ＰＲＰ抗体濃度をもたらし、そして、より好ましくは、１μｇ／ｍｌ以上の抗ＰＲＰ抗体濃度をもたらす。

本発明の組成物は、１種より多いＨｉｂ抗原を含有し得る。

組成物が、Ｈｉｂサッカリド抗原を含有する場合、組成物はまた、水酸化アルミニウムアジュバントを含有することが好ましい。上記組成物がリン酸アルミニウムアジュバントを含有する場合、上記Ｈｉｂ抗原は、このアジュバントに吸着されてもよく［５５］、吸着されなくてもよい［１２］。吸着の防止は、抗原／アジュバントの混合の間の正確なｐＨ、適切な電荷ゼロ点を有するアジュバントおよび組成物中の種々の異なる抗原に対する適切な混合順序を選択することにより、達成され得る［５６］。

Ｈｉｂ抗原は、例えば、髄膜炎菌抗原と一緒に、凍結乾燥され得る。

（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
上記組成物が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原を含む場合、それは、代表的に、好ましくは、キャリアタンパク質に結合された莢膜サッカリド抗原である［例えば、参考文献５７〜５９］。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１種より多くの血清型由来のサッカリドを含有することが好ましい。例えば、２３種の異なる血清型由来のポリサッカリドの混合物が、広範に使用されており、５種と１１種との間の異なる血清群由来のポリサッカリドを有する結合体ワクチンも同様である［６０］。例えば、ＰｒｅｖＮａｒ^ＴＭ［６１］は、７種の血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）由来の抗原を含有し、各々のサッカリドは、個々に、還元的アミノ化によりＣＲＭ_１９７に結合され、０．５ｍｌ用量あたり２μｇの各々のサッカリド（４μｇの血清型６Ｂ）を有し、そして、結合体は、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着される。本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも血清型６Ｂ、血清型１４、血清型１９Ｆおよび血清型２３Ｆを含有する。結合体は、リン酸アルミニウムに吸着され得る。

肺炎球菌由来のサッカリド抗原の使用の代替として、上記組成物は、１種以上のポリペプチド抗原を含有し得る。肺炎球菌のいくつかの株のゲノム配列が、利用可能であり［６２，６３］、そして、逆ワクチン学の対象とされ［６４〜６７］、適切なポリペプチド抗原が同定され得る［６８，６９］。例えば、上記組成物は、参考文献７０で定義されたような、以下の抗原のうちの１種以上を含有し得る：ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３０。上記組成物は、これらの抗原のうちの１種より多く（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種または１４種）を含有し得る。

いくつかの実施形態において、上記組成物は、肺炎球菌由来のサッカリド抗原とポリペプチド抗原の両方を含有し得る。これらは、単純な混合物において使用され得るか、または上記肺炎球菌サッカリド抗原は、肺炎球菌タンパク質に結合され得る。このような実施形態のための適切なキャリアタンパク質としては、前の段落において列挙した抗原が挙げられる［７０］。

肺炎球菌抗原は、例えば、髄膜炎菌抗原および／またはＨｉｂ抗原と一緒に、凍結乾燥され得る。

（改変された血清群Ａ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓサッカリド）
本発明の組成物がＭｅｎＡサッカリド抗原を含有する場合、この抗原は、好ましくは、天然のサッカリドのヒドロキシル基の１つ以上が保護基により置換されている、改変されたサッカリドである［１９］。この改変は、加水分解に対する耐性を改善し、そして、上記血清群Ａ抗原が、凍結乾燥を必要とすることなく、液体形態で保存され、そして使用され得ることを意味する。

保護基を有するモノサッカリド単位の数は、変化し得る。例えば、全てまたは実質的に全てのモノサッカリド単位は、保護基を有し得る。あるいは、モノサッカリド単位の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が、保護基を有し得る。少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のモノサッカリド単位が、保護基を有し得る。

同様に、モノサッカリド単位の保護基の数は、変化し得る。例えば、モノサッカリド単位の保護基の数は、１であっても２であってもよい。上記保護基は、一般的に、モノサッカリド単位の４位および／または３位であり得る。

末端モノサッカリド単位は、天然のヒドロキシルの代わりに保護基を有してもよく、有さなくてもよい。さらなる反応（例えば、結合）のための手がかりを提供するために、末端モノサッカリド単位の遊離したアノマーヒドロキシル基を保持することが好ましい。アノマーヒドロキシル基は、還元的アミノ化により、（例えば、ＮａＢＨ_３ＣＮ／ＮＨ_４Ｃｌを用いて）アミノ基（−ＮＨ_２または−ＮＨ−Ｅ、ここで、Ｅは、窒素保護基である）に変換され得そして、次いで、他のヒドロキシル基が保護基へと変換された後、再生成され得る。

ヒドロキシル基を置換するための保護基は、そのヒドロキシル基の誘導体化反応を介して（すなわち、そのヒドロキシル基の水素原子を他の基に置換することにより）、直接利用可能であり得る。保護基として作用するヒドロキシル基の適切な誘導体は、例えば、カルバメート、スルホネート、カーボネート、エステル、エーテル（例えば、シリルエーテルまたはアルキルエーテル）およびアセタールである。このような保護基のいくつかの具体例は、アリル、Ａｌｏｃ、ベンジル、ＢＯＭ、ｔ−ブチル、トリチル、ＴＢＳ、ＴＢＤＰＳ、ＴＥＳ、ＴＭＳ、ＴＩＰＳ、ＰＭＢ、ＭＥＭ、ＭＯＭ、ＭＴＭ、ＴＨＰなどである。直接利用可能ではなく、そして上記ヒドロキシル基を完全に置換する他の保護基としては、Ｃ_１〜１２アルキル、Ｃ_３〜１２アルキル、Ｃ_５〜１２アリール、Ｃ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキル、ＮＲ^１Ｒ^２（Ｒ^１およびＲ^２は、以下の段落に定義される）、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２（Ｃ_１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３、ＣＣｌ_３などが挙げられる。好ましい保護基は、電子吸引基である。

好ましい保護基は、以下の式のものである：−Ｏ−Ｘ−Ｙまたは−ＯＲ^３、ここで、：Ｘは、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）またはＳＯ_２であり；Ｙは、Ｃ_１〜１２アルキル、Ｃ_１〜１２アルコキシ、Ｃ_３〜１２シクロアルキル、Ｃ_５〜１２アリールまたはＣ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルであり、それらの各々は、必要に応じて、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２（Ｃ_１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３またはＣＣｌ_３より独立して選択される１つ、２つまたは３つの基により置換され得るか；あるいはＹは、ＮＲ^１Ｒ^２であり；Ｒ^１およびＲ^２は、Ｈ、Ｃ_１〜１２アルキル、Ｃ_３〜１２シクロアルキル、Ｃ_５〜１２アリール、Ｃ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルから独立して選択されるか；あるいはＲ^１およびＲ^２は、結合してＣ_３〜１２飽和複素環式基を形成し得；Ｒ^３はＣ_１〜１２アルキルまたはＣ_３〜１２シクロアルキルであり、それらの各々は、必要に応じて、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２（Ｃ_１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３またはＣＣｌ_３より独立して選択される１つ、２つまたは３つの基により置換され得るか；あるいはＲ^３は、Ｃ_５〜１２アリールまたはＣ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルであり、それらの各々は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２（Ｃ_１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３またはＣＣｌ_３より選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの基により、必要に応じて置換され得る。Ｒ^３がＣ_１〜１２アルキルまたはＣ_３〜１２シクロアルキルである場合、それは、代表的に、上に定義されたような１つ、２つまたは３つの基により置換される。Ｒ^１およびＲ^２が結合してＣ_３〜１２飽和複素環式基を形成する場合、Ｒ^１およびＲ^２が、窒素原子と一緒になって、３個と１２個との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含む飽和複素環式基を形成することが意味される。上記複素環式基は、窒素原子以外に、１個または２個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、ＯまたはＳ）を含み得る。Ｃ_３〜１２飽和複素環式基の例は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、アゼチジニルおよびアジリジニルである。

保護基−Ｏ−Ｘ−Ｙおよび−ＯＲ^３は、標準の誘導体化手順（例えば、そのヒドロキシル基と、アシルハライド、アルキルハライド、スルホニルハライドなどとの反応）により、−ＯＨ基から調製され得る。従って、−Ｏ−Ｘ−Ｙの酸素原子は、好ましくは、上記ヒドロキシル基の酸素原子であり、一方で、−Ｏ−Ｘ−Ｙの−Ｘ−Ｙ基は、好ましくは、上記ヒドロキシル基の水素原子を置換する。

あるいは、上記保護基は、置換反応（例えば、光延型（Ｍｉｔｓｏｎｏｂｕ−ｔｙｐｅ）置換）を介して利用可能であり得る。ヒドロキシル基から保護基を調製するこれらの方法および他の方法は、周知である。

より好ましくは、上記保護基は−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ_３であるか［７１］、またはカルバメート基である−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^１Ｒ^２であり、ここで、Ｒ^１およびＲ^２は、Ｃ_１〜６アルキルより独立して選択される。より好ましくは、Ｒ^１およびＲ^２は、ともにメチルである（すなわち、上記保護基は、−ＯＣ（Ｏ）ＮＭｅ_２である）。カルバメート保護基は、グリコシド結合に対する安定化作用を有し、そして、緩和な条件下で調製され得る。

好ましい改変されたＭｅｎＡサッカリドは、ｎ個のモノサッカリド単位を含み、ここで、モノサッカリド単位の少なくともｈ％は、３位と４位の両方に−ＯＨ基を有さない。ｈの値は、２４以上（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００）であり、そして、好ましくは、５０以上である。−ＯＨ基の不在により、好ましくは、上に定義したような保護基が存在する。

他の好ましい改変されたＭｅｎＡサッカリドは、モノサッカリド単位を含み、ここで、モノサッカリド単位の少なくともｓ個は、３位に−ＯＨを有さず、かつ４位に−ＯＨを有さない。ｓの値は、少なくとも１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０）である。−ＯＨ基が不在により、好ましくは、上に定義したような保護基が存在する。

本発明との使用のために適切な、改変されたＭｅｎＡサッカリドは、以下の式を有し：

ここで、
ｎは、１〜１００の整数（好ましくは、１５〜２５の整数）であり、
Ｔは、式（Ａ）または式（Ｂ）：

からなり、
各々のＺ基は、ＯＨまたは上に定義されるような保護基より独立して選択され；そして
各々のＱ基は、ＯＨまたは上に定義されるような保護基より独立して選択され；
Ｙは、ＯＨまたは上に定義されるような保護基より選択され；
Ｅは、Ｈまたは窒素保護基であり；
そして、ここで、Ｑ基の約７％より多く（例えば、８％、９％、１０％以上）は、保護基である。

ｎ＋２個のＺ基の各々は、互いと同じでもよく、異なっていてもよい。同様に、ｎ＋２個のＱ基の各々は、互いと同じでもよく、異なっていてもよい。全てのＺ基が、ＯＨであり得る。あるいは、Ｚ基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％が、ＯＡｃであり得る。好ましくは、Ｚ基の約７０％がＯＡｃであり、Ｚ基のうちの残りは、ＯＨまたは上に定義されるような保護基である。Ｑ基の少なくとも約７％は、保護基である。好ましくは、Ｑ基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％までもが、保護基である。

本発明の好ましい組成物は、２８日間、３７℃で保存され得、そして、その期間の後は、結合されたＭｅｎＡサッカリドの初期総量のうちのｆ％未満が、結合されておらず、ここで、ｆは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５以下である。

（オリゴサッカリド）
莢膜サッカリドは、一般的に、オリゴサッカリドの形態で使用される。これらは、精製莢膜ポリサッカリドの（例えば、加水分解による）フラグメント化により都合よく形成され、通常、その後に、所望される大きさのフラグメントが精製される。

ポリサッカリドのフラグメント化は、好ましくは、オリゴサッカリドにおいて３０未満（例えば、血清群Ａについては、１０と２０との間、好ましくは、約１０；血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについては、１５と２５との間、好ましくは、約１５〜２０；血清群Ｃについては、１２と２２との間；など）の最終平均重合度（ＤＰ）を与えるように実施される。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーまたは比色定量アッセイにより、都合よく測定され得る［７２］。

好ましいＭｅｎＣサッカリド抗原は、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭにおいて使用されるように、参考文献１０において開示される。

加水分解が実施される場合、その加水分解物は、一般的に、短い長さのオリゴサッカリドを除去するために、大きさが調整される［７３］。これは、種々の方法（例えば、限外濾過、その後のイオン交換クロマトグラフィー）により達成され得る。血清群Ａについては、約６以下の重合度を有するオリゴサッカリドは、好ましくは、除去され、そして、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについては、約４未満の重合度を有するオリゴサッカリドは、好ましくは、除去される。

（共有結合）
本発明の組成物における莢膜サッカリドは、通常、キャリアタンパク質に結合される。一般的に、結合は、サッカリドをＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原へと変換することにより、サッカリドの免疫原性を増強し、従って、免疫記憶を開始させる。結合は、小児ワクチンのために特に有用であり［例えば、参考文献７４］、そして周知の技術である［例えば、参考文献４４〜５２などに概説される］。

好ましいキャリアタンパク質は、細菌性トキシンまたは細菌性トキソイドである（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）。ＣＲＭ_１９７ジフテリアトキソイド［７５〜７７］は、特に好ましい。他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［７８］、合成ペプチド［７９，８０］、熱ショックタンパク質［８１，８２］、百日咳菌タンパク質［８３，８４］、サイトカイン［８５］、リンホカイン［８５］、ホルモン［８５］、成長因子［８５］、種々の病原体由来抗原由来の複数のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［８６］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ［８７，８８］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［８９］、鉄取り込みタンパク質［９０］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のトキシンＡまたはトキシンＢ［９１］などが挙げられる。好ましいキャリアは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅプロテインＤおよびＣＲＭ_１９７である。

本発明の組成物内で、例えば、キャリア抑制の危険性を減少するために、１種より多いキャリアタンパク質を使用することが可能である。従って、異なるキャリアタンパク質が、異なる血清群のために使用され得る（例えば、血清群Ａサッカリドは、ＣＲＭ_１９７に結合され得、一方、血清群Ｃサッカリドは、破傷風トキソイドに結合され得る）。特定のサッカリド抗原のために１種より多いキャリアタンパク質を使用することもまた、可能である（例えば、血清群Ａサッカリドは、２種の群で存在し得、いくつかは、ＣＲＭ_１９７に結合され、そして、その他は、破傷風トキソイドに結合される）。しかし、一般的に、すべてのサッカリドのために同じキャリアタンパク質を使用することが好ましい。

単一のキャリアタンパク質は、１種より多いサッカリド抗原を運搬し得る［９２］。例えば、単一のキャリアタンパク質は、血清群Ａ由来のサッカリドおよび血清群Ｃ由来のサッカリドに結合していてもよい。この目的を達成するために、サッカリドは、結合反応の前に混合され得る。しかし、一般的に、各々の血清群に対して別々の結合体を有することが好ましい。

１：５（すなわち、タンパク質過剰）と５：１（すなわち、サッカリド過剰）との間のサッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する結合体が、好ましい。１：２と５：１との間の比が、好ましく、１：１．２５と１：２．５との間の比は、より好ましい。過剰なキャリアタンパク質は、ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣについて好適であり得る。

結合体は、遊離のキャリアタンパク質とともに使用され得る［９３］。所与のキャリアタンパク質が、本発明の組成物において遊離形態および結合形態の両方で存在する場合、この非結合形態は、好ましくは、全体として、組成物におけるキャリアタンパク質総量の５重量％以下であり、そして、より好ましくは、２重量％未満で存在する。

必要な場合は任意の適切なリンカーを用いて、あらゆる適切な結合反応が使用され得る。

上記サッカリドは、代表的に、結合前に活性化されるかまたは官能基化される。活性化は、例えば、シアン化試薬（例えば、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート［９４，９５など］））を含み得る。他の適切な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する；参考文献５０のイントロダクションもまた参照のこと。

リンカー基を介した結合が、任意の公知の手順（例えば、参考文献９６および参考文献９７に記載の手順）を用いて作製され得る。結合の１種のタイプは、ポリサッカリドの還元的アミノ化、結果として生じるアミノ基とアジピン酸リンカー基の一端とのカップリング、そして、次いで、タンパク質とアジピン酸リンカー基の他端とのカップリングを含む［４８，９８，９９］。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド［１００］、ニトロフェニル−エチルアミン［１０１］、ハロアシルハライド［１０２］、グリコシド結合［１０３］、６−アミノカプロン酸［１０４］、ＡＤＨ［１０５］、Ｃ_４〜Ｃ_１２部分［１０６］などが挙げられる。リンカーの使用の代替としては、直接の結合が使用され得る。タンパク質への直接の結合は、ポリサッカリドの酸化、その後のタンパク質による還元的アミノ化（例えば、参考文献１０７および参考文献１０８に記載される）を含み得る。

上記サッカリドへのアミノ基の導入（例えば、末端＝Ｏ基を−ＮＨ_２に置換することによる）、その後のアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）による誘導体化およびキャリアタンパク質との反応を含むプロセスが、好ましい。別の好ましい反応は、例えば、ＭｅｎＡまたはＭｅｎＣのための、プロテインＤキャリアによるＣＤＡＰ活性化を使用する。

結合後、遊離のサッカリドおよび結合されたサッカリドは、分離され得る。多くの適切な方法が存在し、これらの方法としては、疎水性クロマトグラフィー、接線（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）限外濾過、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）などが挙げられる［参考文献１０９および１１０などもまた参照のこと］。

本発明の組成物が、結合されたオリゴサッカリドを含有する場合、オリゴサッカリド調製が結合の前に行われることが好ましい。

（本発明の組成物の調製）
本発明の組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの少なくとも２種由来の莢膜サッカリドを含有する。上記サッカリドは、好ましくは、別個に調製され（任意のフラグメント化、結合などを含む）、次いで、混合されて本発明の組成物を与える。

しかし、上記組成物が、血清群Ａ由来の莢膜サッカリドを含有する場合、その血清群Ａサッカリドは、加水分解の可能性を最小にするために、使用直前まで他のサッカリドと組み合わされないことが好ましい。このことは、（代表的に、適切な賦形剤と一緒になった）凍結乾燥形態の血清群Ａ成分および（また、適切な賦形剤と一緒になった）液体形態の他の血清群成分を有することにより、都合よく達成され得、その液体成分は、使用のための準備時に、凍結乾燥されたＭｅｎＡ成分を再構成するために使用される。アルミニウム塩アジュバントが使用される場合、液体ワクチンを含む上記バイアル中に、アジュバントを含み、そして、アジュバントを含まない上記ＭｅｎＡ成分を凍結乾燥することが好ましい。

従って、本発明の組成物は、以下を備えるキットから調製され得る：（ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ由来の凍結乾燥形態の莢膜サッカリド；ならびに（ｂ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙうちの１種以上（例えば、１種、２種、３種）由来の液体形態の莢膜サッカリド。本発明はまた、本発明の組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ由来の凍結乾燥莢膜サッカリドと、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙうちの１種以上（例えば、１種、２種、３種）由来の莢膜サッカリドであって、その１種以上のサッカリドが液体形態にある、莢膜サッカリド、とを混合する工程を包含する。

本発明はまた、本発明の組成物を提供し、この組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ由来の莢膜サッカリドを含有し、ここで、サッカリドは、液体形態にある。この組成物は、再構成のために、凍結乾燥血清群Ａサッカリド抗原とともにパッケージングされ得るか、またはこの組成物は、例えば、血清群Ａに対する免疫が所望されない場合、そのままで組成物として使用され得る。

本発明はまた、以下を備えるキットを提供する：（ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの２種以上由来の、全て凍結乾燥形態の莢膜サッカリドを含む、第１の容器；ならびに（ｂ）液体形態の（ｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの０種または１種由来の莢膜サッカリド、ならびに必要に応じて（ｉｉ）髄膜炎菌莢膜サッカリドを含まないさらなる抗原（以下を参照のこと）、を含む、第２の容器。ここで、容器（ｂ）の内容物による容器（ａ）の内容物の再構成が、本発明の組成物を提供する。

（本発明の組成物の提示）
本発明の組成物は、種々の方法において提示され、パッケージングされ得る。

上記組成物は、バイアルにおいて提示され得るか、またはそれらは、事前に充填されたシリンジにおいて提示され得る。上記シリンジは、針と一緒かまたは針なしで提供され得る。シリンジは、上記組成物の単一用量を含むのに対し、バイアルは、単一用量を含んでも複数用量を含んでもよい。注射可能組成物は、通常、液体の溶液または懸濁液である。あるいは、それらは、注射前の液体ビヒクルへの溶解または懸濁のための固体形態（例えば、凍結乾燥）で、提示され得る。

本発明の組成物は、単位用量形態または複数用量形態でパッケージングされ得る。複数用量形態のために、バイアルが、事前に充填されているシリンジよりも好ましい。有効投薬容量は、慣用的に確立され得るが、注射のための上記組成物の代表的なヒト用量は、０．５ｍｌの容量を有する。

本発明の組成物が使用直前に調製される場合（例えば、血清群Ａサッカリドが、凍結乾燥形態で提示される場合）かつキットとして提示される場合、そのキットは、２つのバイアルを備え得るか、またはそのキットは、１つの事前に充填されたシリンジと１つのバイアルとを備え得、そのシリンジの内容物は、注射前に、そのバイアルの内容物を元に戻すために使用される。

各々の用量内で、個々のサッカリド抗原の量は、一般的に、１μｇ〜５０μｇの間であり（サッカリドの質量として測定される）、各々の約２．５μｇ、約５μｇまたは約１０μｇが好ましい。従って、１：１：１：１、１：１：１：２、２：１：１：１、４：２：１：１、８：４：２：１、４：２：１：２、８：４：１：２、４：２：２：１、２：２：１：１、４：４：２：１、２：２：１：２、４：４：１：２および２：２：２：１のＡ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙ重量比で、図１により表される量は、好ましくは、約２．５μｇ、約５μｇまたは約１０μｇである。従って、１：１：１：１比のＡ：Ｃ：Ｗ：Ｙ組成物およびサッカリドあたり１０μｇのために、用量あたり４０μｇのサッカリドが、投与される。好ましい組成物は、用量あたりおよそ以下のμｇのサッカリドを有する：

好ましい本発明の組成物は、用量あたり５０μｇ未満の髄膜炎菌サッカリドを含有する。他の好ましい組成物は、用量あたり４０μｇ以下の髄膜炎菌サッカリドを含有する。他の好ましい組成物は、用量あたり３０μｇ以下の髄膜炎菌サッカリドを含有する。他の好ましい組成物は、用量あたり２５μｇ以下の髄膜炎菌サッカリドを含有する。他の好ましい組成物は、用量あたり２０μｇ以下の髄膜炎菌サッカリドを含有する。他の好ましい組成物は、用量あたり１０μｇ以下の髄膜炎菌サッカリドを含有するが、理想的には、本発明の組成物は、用量あたり少なくとも１０μｇの髄膜炎菌サッカリドを含有する。

本発明の組成物は、好ましくは、無菌である。本発明の組成物は、好ましくは、発熱物質を含まない。それらは、好ましくは、例えば、ｐＨ６とｐＨ８との間、一般的には、約ｐＨ７に緩衝化される。組成物が水酸化アルミニウム塩を含有する場合、ヒスチジン緩衝液を使用することが好ましい［１１１］。本発明の組成物は、ヒトに関して等張であり得る。

（アジュバント）
上記組成物は、一般的に、１つ以上のアジュバントを含む。上記アジュバントは、それらが混合されて本発明の組成物を形成する前および／または後にサッカリドに添加され得るが、異なるサッカリドの混合前に、アジュバントとサッカリド抗原とを合わせることが好ましい。

しかし、各々のサッカリドが、このような混合前にアジュバント添加されなければならない必要はない。１つのサッカリド調製物において、過剰なアジュバントが含まれ得、それにより、さらなる非アジュバント添加サッカリド抗原が添加される場合、その過剰分は、所望される最終濃度に希釈される。１つの特定の実施形態において、本発明の組成物が凍結乾燥抗原（例えば、凍結乾燥血清群Ａ成分）から調製される場合、その凍結乾燥材料にアジュバントを含まないことが、好ましくあり得る。

本発明の組成物に含まれるために好ましいアジュバントは、アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム（オキシヒドロキシド（ｏｘｙｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）を含む）、アルミニウムホスフェート（ヒドロキシリン酸塩を含む）、アルミニウムスルフェートなど）である［参考文献１１２の第８章および第９章］。アルミニウムヒドロキシホスフェートが、特にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅサッカリド抗原を含有する組成物において、特に好ましく、そして、代表的なアジュバントは、０．６ｍｇ Ａｌ^３＋／ｍｌを含む、０．８４と０．９２との間のモル比でＰＯ_４／Ａｌを有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。低用量のリン酸アルミニウムの吸着が、例えば、５０μｇ／結合体／用量と１００μｇ／結合体／用量の間のＡｌ^３＋で使用され得る。組成物中に、１つより多くの結合体が存在する場合、全ての結合体が、吸着される必要はない。Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ^ＴＭＭｅｎＣ結合体が、水酸化物アジュバントを使用するのに対して、Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ^ＴＭは、リン酸塩を使用する。

リン酸カルシウムは、別の好ましいアジュバントである。

アルミニウム塩に加えて使用され得るかまたはアルミニウム塩の代わりに使用され得る他のアジュバントとしては、以下が挙げられる。

（Ａ．無機質含有組成物）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な無機質含有組成物としては、無機塩（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩）が挙げられる。本発明は、無機塩（例えば、水酸化物（例えば、オキシヒドロキシド）、ホスフェート（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート）、スルフェートなど）［例えば、参考文献１１２の第８章および第９章を参照のこと］、または異なる無機化合物の混合物を含み、上記組成物は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）をとり、そして、吸着が好ましい。上記無機質含有組成物はまた、無機塩の粒子として処方され得る［１１３］。

（Ｂ．油エマルジョン）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン（例えば、ＭＦ５９）が挙げられる［参考文献１１２の第１０章；参考文献１１４もまた参照のこと。］（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０および０．５％Ｓｐａｎ ８５、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いて、サブミクロン粒子に処方される）。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）もまた、使用され得る。

（Ｃ．サポニン処方物［参考文献１１２の第２２章］）
サポニン処方物はまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根および花においてさえ見られる、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの不均一な群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ（モリナの木（Ｍｏｌｉｎａ ｔｒｅｅ））の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広範に研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライドベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ））から市販品として得られ得る。サポニンアジュバント処方物としては、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）および液体処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭとして市販される。

サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。これらの技術を用いて、特定の精製フラクションが同定され、これらのフラクションとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、上記サポニンは、ＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、参考文献１１５に開示されている。サポニン処方物はまた、ステロール（例えば、コレステロール）を含有し得る［１１６］。

サポニンとコレステロールとの組み合わせが、使用され、免疫刺激複合体（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特な粒子を形成し得る［参考文献１１２の第２３章］。ＩＳＣＯＭとしてはまた、代表的に、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）が挙げられる。任意の公知のサポニンが、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、上記ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献１１６〜１１８にさらに記載されている。必要に応じて、上記ＩＳＣＯＭは、さらなる洗剤を含まなくてもよい［１１９］。

サポニンベースのアジュバントの開発の概説は、参考文献１２０および１２１に見られ得る。

（Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子）
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）はまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。これらの構造は、一般的に、必要に応じてリン脂質と組み合わされるかまたはリン脂質とともに処方されたウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含む。それらは、一般的に、非病原性、非複製性であり、そして、一般的に、あらゆる天然ウイルスゲノムを含まない。上記ウイルスタンパク質は、ウイルス全体から、組換え的に生成されるかまたは単離され得る。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用のために適切なこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス由来のタンパク質（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス由来のタンパク質（例えば、コアタンパク質またはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス由来のタンパク質、麻疹ウイルス由来のタンパク質、シンドビスウイルス由来のタンパク質、ロタウイルス由来のタンパク質、口蹄疫ウイルス由来のタンパク質、レトロウイルス由来のタンパク質、ノーウォークウイルス由来のタンパク質、ヒトパピローマウイルス由来のタンパク質、ＨＩＶ由来のタンパク質、ＲＮＡファージ由来のタンパク質、Ｑβファージ由来のタンパク質（例えば、コートタンパク質）、ＧＡファージ由来のタンパク質、ｆｒファージ由来のタンパク質、ＡＰ２０５ファージ由来のタンパク質およびＴｙ由来のタンパク質（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献１２２〜１２７においてさらに議論されている。ビロソームは、例えば、参考文献１２８においてさらに議論されている。

（Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体）
本発明における使用のために適切なアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体（例えば、腸内細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドならびにＡＤＰリボシル化トキシンおよびそれらの無毒性誘導体）を含む。

ＬＰＳの無毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３つの脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、４つ、５つまたは６つのアシル化鎖との混合物である。３ 脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小さい粒子」形態は、参考文献１２９に開示されている。このような３ｄＭＰＬの「小さい粒子」は、０．２２μｍメンブレンを通って滅菌濾過されるために充分小さい［１２９］。他の無毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９））が挙げられる［１３０，１３１］。

リピドＡ誘導体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のリピドＡ誘導体（例えば、ＯＭ−１７４）が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献１３２および１３３に記載されている。

本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフ（グアノシンへのホスフェート結合により連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列が挙げられる。二本鎖ＲＮＡおよびパリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。

ＣｐＧは、ヌクレオチド改変体／アナログ（例えば、ホスホロチオエート改変体）を含み得、そして、二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献１３４、１３５および１３６は、可能なアナログ置換（例えば、グアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置換）を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１３７〜１４２において、さらに議論されている。

上記ＣｐＧ配列（例えば、ＧＴＣＧＴＴモチーフまたはＴＴＣＧＴＴモチーフ）は、ＴＬＲ９に関与し得る［１４３］。上記ＣｐＧ配列（例えば、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ）は、Ｔｈ１免疫応答誘導に対して特異的であり得るか、または、上記ＣｐＧ配列（例えば、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）は、Ｂ細胞応答誘導に対して、より特異的であり得る。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１４４〜１４６において議論されている。好ましくは、上記ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。

好ましくは、上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端がレセプター認識のために利用可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が、それらの３’末端に結合され、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成し得る。例えば、参考文献１４３および１４７〜１４９を参照のこと。

細菌ＡＤＰ−リボシル化トキシンおよびその無毒性誘導体が、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好ましくは、上記タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ由来（「ＣＴ」）または百日咳由来（「ＰＴ」）である。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化トキシンの使用は、参考文献１５０に記載されており、そして、非経口的アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化トキシンの使用は、参考文献１５１に記載されている。上記トキシンまたはトキソイドは、好ましくは、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方を含むホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）の形態である。好ましくは、上記Ａサブユニットは、無毒化変異を含み；好ましくは、上記Ｂサブユニットは、変異していない。好ましくは、上記アジュバントは、無毒化ＬＴ変異体（例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２）である。アジュバントとしてのＡＤＰ−リボシル化トキシンおよびその無毒性誘導体（特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）の使用は、参考文献１５２〜１５９において見られ得る。アミノ酸置換についての多くの参考文献は、好ましくは、参考文献１６０に記載のＡＤＰ−リボシル化トキシンのＡサブユニットおよびＢサブユニットの整列に基づき、特に、本明細書中で、その全体が参考として援用される。

（Ｆ．ヒト免疫調節因子）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なヒト免疫刺激因子としては、サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１６１］など）［１６２］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子）が挙げられる。

（Ｇ．生体接着因子および粘膜接着因子）
生体接着因子および粘膜接着因子はまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。適切な生体接着因子としては、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［１６３］または粘膜接着因子（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカリドおよびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が挙げられる。キトサンおよびその誘導体はまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る［１６４］。

（Ｈ．微粒子）
微粒子はまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。生分解性かつ無毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）と、ポリ（ラクチド−グリコリド）とから形成される微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、そして、最も好ましくは、直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が、好ましく、必要に応じて、処理されて、（例えば、ＳＤＳによる）負に荷電した表面または（例えば、カチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）による）正に荷電した表面を有する。

（Ｉ．リポソーム（参考文献１１２の第１３章および第１４章））
アジュバントとしての使用のために適切なリポソーム処方物の例は、参考文献１６５〜１６７に記載されている。

（Ｊ．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物）
本発明における使用のために適切なアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる［１６８］。このような処方物としては、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１６９］および少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤［１７０］が、さらに挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群より選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。

（Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、参考文献１７１および１７２において記載されている。

（Ｌ．ムラミルペプチド）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。

（Ｍ．イミダゾキノロン化合物）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なイミダゾキノロン化合物の例としては、参考文献１７３および１７４にさらに記載される、Ｉｍｉｑｕａｍｏｄおよびその相同体（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ」）が挙げられる。

本発明はまた、上に定義されるアジュバントの１つ以上の組み合わせを含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物が、本発明において使用され得る：（１）サポニンおよび水中油エマルジョン［１７５］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１７６］：（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）［１７７］；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組み合わせ［１７８］；（６）マイクロフルイダイズされてサブミクロンエマルジョンにされるか、またはボルテックスされてより大きい粒子サイズのエマルジョンを生じるかのいずれかの、１０％ スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０^ＴＭ、５％ プルロニックブロック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋ）ポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ；（７）２％ スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ならびにモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁構成要素を含むＲｉｂｉ^ＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ））；ならびに（８）１つ以上の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）。

免疫刺激因子として作用する他の物質は、参考文献１１２の第７章に開示されている。

リン酸アルミニウムが使用される場合、１つ以上のサッカリドをアルミニウム塩に吸着することが可能であるが、そうではないことが好ましく、そして、このことは、溶液中に遊離のリン酸イオンを含むことにより（すなわち、リン酸緩衝液の使用により）助けられる。水酸化アルミニウムが使用される場合、上記サッカリドを上記塩に吸着することが好ましい。アジュバントとしての水酸化アルミニウムの使用は、血清群Ａ由来のサッカリドのために好ましくあり得る。

本発明の組成物において、いくつかの抗原を水酸化アルミニウムに吸着することが可能であるが、他の抗原をリン酸アルミニウムと会合させることも可能である。例えば、四価のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群の組み合わせのために、以下の順列が利用可能である：

三価のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群の組み合わせのために、以下の順列が利用可能である：

（組成物のさらなる成分）
上に記載される抗原に加えて、本発明の組成物は、髄膜炎菌タンパク質抗原を含有し得る。

非髄膜炎菌でかつ非ナイセリア属の抗原（好ましくは、髄膜炎菌成分に対する免疫応答を減少しないもの）もまた、含まれ得る。例えば、参考文献１７９は、上記Ｈｉｂサッカリドと一緒のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂおよび血清群Ｃ由来のオリゴサッカリドの組み合わせを開示している。肺炎球菌、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ジフテリア、破傷風、ポリオおよび／またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来の抗原が、好ましい。特に好ましい抗原としては、以下が挙げられる：
−ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド）［例えば、参考文献１８０の第３章］
−破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド）［例えば、参考文献１８０の第４章］
−Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ハロトキシン（ＰＴ）および糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）（必要に応じて、また、ペルタクチンならびに／または凝集原２および凝集原３と組み合わせて）［例えば、参考文献１８１および１８２］
−細胞性破傷風抗原
−Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、不活性化ウイルス）［例えば、１８３，１８４］
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原）［例えば、１８４，１８５］、表面抗原は、好ましくは、リン酸アルミニウムに吸着される［１８６］
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ微小小胞［１８７］、「天然ＯＭＶ」［１８８］、小水胞または外膜小胞［例えば、参考文献１８９〜１９０，１９１，１９２，１９３，１９４など］の調製物。これらは、例えば、免疫原性を増強する（例えば、過剰発現免疫原）、毒性を減少する、莢膜ポリサッカリド合成を阻害する、ＰｏｒＡ発現をダウンレギュレートするなどのために、遺伝的に操作されている細菌から調製され得る［１９５〜１９６，１９７，１９８］。それらは、過剰水胞化（ｈｙｐｅｒｂｌｅｂｉｎｇ）株から調製され得る［１９９〜２００，２０１，２０２］。非病原性ナイセリア属由来の小胞が、含まれ得る［２０３］。ＯＭＶは、洗剤を使用することなく調製され得る［２０４，２０５］。ＯＭＶは、それらの表面に、非ナイセリア属タンパク質を発現し得る［２０６］。ＯＭＶは、ＬＰＳ欠失であり得る。ＯＭＶはまた、組換え抗原と混合され得る［１８９，２０７］。異なるクラスＩ外膜タンパク質サブタイプを有する細菌由来の小胞が、使用され得る（例えば、各々３種のサブタイプを示す２種の異なる遺伝的に操作された小胞集団を使用する６種の異なるサブタイプ［２０８，２０９］、または各々３種のサブタイプを示す３種の異なる遺伝的に操作された小胞集団を使用する９種の異なるサブタイプなど）。有用なサブタイプとしては、以下が挙げられる：Ｐ１．７，１６；Ｐ１．５−１，２−２；Ｐ１．１９，１５−１；Ｐ１．５−２，１０；Ｐ１．１２−１，１３；Ｐ１．７−２，４；Ｐ１．２２，１４；Ｐ１．７−１，１；Ｐ１．１８−１，３，６。

−ポリオ抗原（例えば、ＩＰＶ）［例えば、２１０，２１１］。

上記混合物は、これらのさらなる抗原のうちの１種以上を含有し得、必要な場合、無毒化（例えば、化学的手段および／または遺伝的手段による百日咳トキシンの無毒化）され得る。

ジフテリア抗原が、上記混合物中に含有される場合、破傷風抗原および百日咳抗原もまた、含有することが好ましい。同様に、破傷風抗原が含有される場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原もまた、含有することが好ましい。同様に、百日咳抗原が含有される場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原もまた含有されることが好ましい。このようなＤＴＰ併用は、凍結乾燥結合体を再構成するために使用され得る。

上記混合物中の抗原は、代表的に、少なくとも各々１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的に、任意の所与の抗原の濃度は、その抗原に対する、免疫応答を誘発するために充分である。

上記混合物中のタンパク質の使用の代替として、上記抗原をコードする核酸が、使用され得る。従って、上記混合物のタンパク質成分は、そのタンパク質をコードする核酸（好ましくは、（例えば、プラスミド形態の）ＤＮＡ）により置換され得る。同様に、本発明の組成物は、サッカリド抗原を模倣するタンパク質（例えば、ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）［２１２］または抗イディオタイプ抗体）を含有し得る。これらは、個々のサッカリド成分を置換し得るか、または、それらを補充し得る。例として、上記ワクチンは、ＭｅｎＣ［２１３］またはＭｅｎＡ［２１４］の莢膜ポリサッカリドのペプチド模倣物を、そのサッカリド自体の代わりに、含有し得る。

本発明の組成物は、特に、複数の用量様式でパッケージングされる場合、抗菌剤を含有し得る。

本発明の組成物は、低いレベル（例えば、０．０１％未満）で、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート）（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０））を含有し得る。

本発明の組成物は、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含有し、張度を与え得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌの濃度が、代表的である。

本発明の組成物は、一般的に、緩衝液を含有する。リン酸緩衝液が、代表的である。

本発明の組成物は、特に、その組成物が凍結乾燥される場合またはその組成物が凍結乾燥物質から再構成されている物質を含有する場合に、例えば、約１５ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌ（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）で、糖アルコール（例えば、マンニトール）またはジサッカリド（例えば、スクロース［２１５］またはトレハロース［２１６］）を含有し得る。凍結乾燥のために、組成物のｐＨは、凍結乾燥前に約６．１に調整され得る。

本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも３種由来の結合された莢膜サッカリドを含有する組成物を提供し、ここで、この組成物は、スクロースを含有する。上記サッカリドは、好ましくは、オリゴサッカリドである。上記組成物は、用量あたり５０μｇ以下（例えば、４０μｇ以下、３０μｇ以下、２０μｇ以下、１０μｇ以下）の髄膜炎サッカリド総量を含有し得る。好ましい組成物は、以下を含有する：血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５；血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｙ；血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５、血清群Ｙ；および血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの４種全て。改変されたＭｅｎＡサッカリドが、使用され得る。上記組成物は、水性形態でも乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態）でもよい。水性形態にある場合、スクロースの濃度は、好ましくは、５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの間（例えば、約２５ｍｇ／ｍｌ）である。凍結乾燥形態にある場合、上記組成物は、アルミニウム塩アジュバントを含有しないことが好ましい。上記組成物は、以下のうちの１種以上由来の抗原をさらに含有し得る：（ａ）血清群Ｂ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；（ｂ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型；および／または（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ。

（免疫原性）
本発明の組成物は、免疫原性である。好ましい免疫原性組成物は、ワクチンである。本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を防ぐため）または治療的（すなわち、感染後の疾患処置のため）のいずれかであり得るが、代表的に、予防的である。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、上に記載される抗原に加えて、代表的に、「薬学的に受容可能なキャリア」を含有し、これらとしては、それ自体が、その組成物を受容する個体に有害な抗体の生成を誘導しない、任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、スクロース、トレハロース［２１６］、ラクトース、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）および不活性ウイルス粒子）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。上記ワクチンはまた、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロールなど）を含有し得る。さらに、補助的な物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）が、存在し得る。無菌で発熱物質を含まず、リン酸緩衝化された生理食塩水は、代表的なキャリアである。薬学的に受容可能な賦形剤の詳細な議論は、参考文献２１７で入手可能である。

ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の各々の抗原、および必要に応じて、任意の他の上述の成分を含有する。「免疫学的有効量」により、個体に対するその量の投与が、単一用量においてかまたはある一連のものの一部としてのいずれかで、処置または予防のために有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康状態および身体的状態、年齢、処置されるべき分類学群（例えば、非ヒト霊長類、ヒトなど）、その個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される予防の程度、そのワクチンの処方、処置する医師による医学的状態の評価および他の関連因子に依存して変化する。上記量は、慣習的な試験を通して決定され得る比較的広範な範囲にわたり、そして、用量あたりの各々の髄膜炎菌サッカリド抗原の代表的な量は、１μｇと２０μｇとの間（例えば、約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇまたは約１０μｇ（サッカリドとして示される））である。

本発明の組成物の免疫原性は、その組成物を、試験被験体（例えば、１２ヶ月齢〜１６ヶ月齢の小児、または動物モデル［２１８］）に投与し、そして、抗莢膜ＩｇＧ全体および高アビディティ抗莢膜ＩｇＧの血清殺菌性抗体（ＳＢＡ）およびＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含む標準的なパラメータを決定することにより、決定され得る。これらの免疫応答は、一般的に、上記組成物の投与後、約４週間で決定され、そして、その組成物の投与前に決定された値と比較される。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ増加が、好ましい。上記組成物の１用量より多くが投与される場合、１回より多くの投与後決定が行われ得る。

本発明の好ましい組成物は、患者において、ヒト被験体の受容可能な百分率に対して各々の抗原成分についての血清防御基準より優れた抗体力価を与え得る。宿主がその力価より上ではその抗原に対してセロコンバージョンされると考えられる関連する抗体力価を有する抗原は、周知であり、そして、このような力価は、ＷＨＯのような機関により公開されている。好ましくは、被験体の統計学的に有意なサンプルのうちの８０％より多く、より好ましくは、９０％より多く、さらにより好ましくは、９３％より多く、そして最も好ましくは、９６〜１００％が、セロコンバージョンされる。

（本発明の組成物の投与）
本発明の組成物は、注射可能である。

非経口的注射は、皮下、腹腔内、静脈内または筋内であり得る。大腿または上腕への筋内投与が、好ましい。注射は、針（例えば、皮下針）を介し得るが、針を介さない注射が、代替的に使用され得る。代表的な筋内用量値は、０．５ｍｌである。

投与は、単一用量スケジュールでも複数用量スケジュールでもよい。複数用量は、初回免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて使用され得る。初回用量スケジュールの後、追加用量スケジュールにが行われ得る。初回用量の間（例えば、４〜１６週の間）および初回免疫（ｐｒｉｍｉｎｇ）と追加免疫（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）との間の適切なタイミングは、慣用的に決定され得る。

投与は、一般的に、動物に対してであり、そして、特に、ヒト被験体が処置され得る。上記組成物は、小児および十代の人をワクチン接種するために、特に有用である。

（医学的方法および医学的用途）
本発明は、患者において免疫応答を上昇させる方法を提供し、この方法は、本発明の組成物を患者に注射する工程を包含する。上記免疫応答は、好ましくは、髄膜炎菌疾患に対して防御的であり、そして、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を含み得る。上記患者は、好ましくは、小児である。

上記方法は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して既に初回免疫されている患者において、追加免疫応答を上昇させ得る。

本発明はまた、動物における免疫応答を上昇させるための注射可能な薬物の製造における、以下の使用を提供する：（ｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも２種由来の莢膜サッカリドであって、ここで、この莢膜サッカリドが、キャリアタンパク質に結合されるか、および／またはオリゴサッカリドである、莢膜サッカリド、ならびに（ｉｉ）以下：（ａ）血清群Ｂ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；（ｂ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型；および／または（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのうちの１種以上由来の抗原。この薬物は、好ましくは、細菌性髄膜炎の予防および／または処置のためである。

治療処置の効力を評価する１つの方法は、本発明の組成物の投与後に細菌感染をモニタリングする工程を包含する。予防処置の効力を評価する１つの方法は、上記組成物の投与後に投与された抗原に対する免疫応答をモニタリングする工程を包含する。

（異種宿主）
本発明の組成物における使用のためのポリペプチドの発現が、天然宿主（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）において行われ得る一方で、好ましくは、異種宿主が使用される。上記異種宿主は、原核生物（例えば、細菌）であっても真核生物であってもよい。Ｅ．ｃｏｌｉが好ましいが、他の適切な宿主としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などが挙げられる。

（一般論）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味する（例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなり得るか、またはさらなる何かを含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ））。

数値ｘに関する用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは、例えば、ｘ±１０％を意味する。

単語「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、「完全に（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）」を除外しない（例えば、「実質的に」Ｙを含まない組成物は、完全にＹを含まなくてよい）。必要な場合、単語「実質的に」は、本発明の定義から除外され得る。

細菌株は、下付きとして示され得る（例えば、７４１_ＭＣ５８は、ＭＣ５８株由来のタンパク質７４１である）。別に述べられなければ、（例えば、下付きではない）本明細書中で言及されるタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの２９９６株由来であり、これは、「基準」株として見なされ得る。しかし、本発明は、一般的に、株により制限されないことが理解される。上で言及したように、タンパク質に対する一般的な言及（例えば、「２８７」、「９１９」など）は、あらゆる株由来のそのタンパク質を包含すると見なされ得る。これは、代表的に、９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の２９９６に対する配列同一性を有する。ハイブリッドタンパク質が使用される場合、そのハイブリッド内の個々の抗原（すなわち、個々の−Ｘ−部分）は、１種以上の株由来であり得る。例えば、ｎ＝２である場合、Ｘ_２は、Ｘ_１と同じ株由来であっても異なる株由来であってもよい。ｎ＝３である場合、その株は、（ｉ）Ｘ_１＝Ｘ_２＝Ｘ_３（ｉｉ）Ｘ_１＝Ｘ_２≠Ｘ_３（ｉｉｉ）Ｘ_１≠Ｘ_２＝Ｘ_３（ｉｖ）Ｘ_１≠Ｘ_２≠Ｘ_３または（ｖ）Ｘ_１＝Ｘ_３≠Ｘ_２などであり得る。

用語「アルキル」とは、直鎖形態および分枝鎖形態の両方のアルキル基をいう。上記アルキル基は、−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−より選択される１個、２個または３個のヘテロ原子で中断され得る。上記アルキル基はまた、１個、２個または３個の二重結合および／または三重結合で中断され得る。しかし、用語「アルキル」は、通常、ヘテロ原子の隔たりまたは二重結合もしくは三重結合の中断を有さないアルキル基をいう。Ｃ_１〜１２アルキルに対して言及がなされる場合、そのアルキル基は、１と１２との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ₁、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含み得ることが意味される。同様に、Ｃ_１〜６アルキルに対して言及がなされる場合、そのアルキル基は、１と６との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ₁、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６）を含み得ることが意味される。

用語「シクロアルキル」としては、シクロアルキル基、ポリシクロアルキル基およびシクロアルケニル基、ならびにこれらとアルキル基との組み合わせ（例えば、シクロアルキルアルキル基）が挙げられる。上記シクロアルキル基は、−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−より選択される１個、２個または３個のヘテロ原子で中断され得る。しかし、用語「シクロアルキル」は、通常、ヘテロ原子の中断を有さないシクロアルキル基をいう。シクロアルキル基の例としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロへキセニル基、シクロヘキシルメチル基およびアダマンチル基が挙げられる。Ｃ_３〜１２シクロアルキルに対して言及がなされる場合、そのシクロアルキル基は、３と１２との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含み得ることが意味される。

用語「アリール」とは、芳香族基（例えば、フェニルまたはナフチル）をいう。Ｃ_５〜１２アリールに対して言及がなされる場合、そのアリール基は、５と１２との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含み得ることが意味される。

用語「Ｃ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキル」とは、ベンジル、フェニルエチルおよびナフチルメチルのような基をいう。

窒素保護基としては、シリル基（例えば、ＴＭＳ、ＴＥＳ、ＴＢＳ、ＴＩＰＳ）、アシル誘導体（例えば、フタルイミド、トリフルオロアセトアミド、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（ＺまたはＣｂｚ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ））、スルホニル誘導体（例えば、β−トリメチルシリルエタンスルホニル（ＳＥＳ））、スルフェニル誘導体、Ｃ_１〜１２アルキル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル、９−フェニルフルオレニルなどが挙げられる。好ましい窒素保護基は、Ｆｍｏｃである。

糖環は、開環形態および閉環形態で存在し得、そして、閉環形態が本明細書中の構造式で示される一方で、開環形態もまた、本発明に含まれることが理解される。

クローニングまたは精製などを容易にするために含まれる配列は、本発明に必ずしも寄与せず、そして、除外または除去されてもよい。

本発明のポリペプチドは、種々の手段（例えば、組換え発現、細胞培養物からの精製、（少なくとも部分的な）化学合成など）により、種々の形態（例えば、天然、融合、非グリコシル化、脂質付加（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）など）で調製され得る。本発明のポリペプチドは、好ましくは、実質的に純粋な形態で調製される（すなわち、他のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓも宿主細胞タンパク質も実質的に含まない）。

本発明に従う核酸は、多くの方法（例えば、（少なくとも部分的な）化学合成により、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物自体からなど）で調製され得、そして、種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）を採り得る。本発明に従う核酸は、好ましくは、実質的に純粋な形態で調製される（すなわち、他のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓも宿主細胞核酸も実質的に含まない）。用語「核酸」としては、ＤＮＡおよびＲＮＡ、そしてまた、それらのアナログ（例えば、改変された骨格（例えば、ホスホロチオエートなど）を含むＤＮＡおよびＲＮＡ、およびまたは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）が挙げられる。本発明は、（例えば、アンチセンス目的またはプローブ化（ｐｒｏｂｉｎｇ）目的のための）上に記載されている配列に対して相補的な配列を含む核酸を含む。

血清群に続いて、髄膜炎菌分類は、血清型、血清サブタイプ（ｓｅｒｏｓｕｂｔｙｐｅ）および免疫型（ｉｍｍｕｎｏｔｙｐｅ）を含み、そして、標準的な学名は、血清群、血清型、血清サブタイプおよび免疫型を列挙し、各々は、コロンにより隔てられる（例えば、Ｂ：４：Ｐ１．１５：Ｌ３，７，９）。血清群Ｂにおいて、いくつかの系統が、しばしば、疾患を引き起こし（超侵襲性）、いくつかの系統は、他よりも重篤な疾患形態を引き起こし（超毒性）、そして、その他は、ほとんど稀にしか疾患を引き起こさない。７種の超毒性系統が認識されており、すなわち、サブグループＩ、サブグループＩＩＩおよびサブグループＩＶ−１、ＥＴ−５複合体、ＥＴ−３７複合体、Ａ４クラスターおよび系統３と呼ばれる。これらは、マルチローカス酵素電気泳動（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｅｎｚｙｍｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＭＬＥＥ）により規定されているが、マルチローカス配列分類（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ）（ＭＬＳＴ）もまた、髄膜炎菌を分類するために使用されている［参考文献４１］。

（発明を実施する形態）
（１．ヒト筋内投与のための髄膜炎菌サッカリド組成物）
ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５、ＭｅｎＹおよび必要に応じて、ＭｅｎＡ由来のオリゴサッカリド結合体を、参考文献７に開示されるように調製した。これらを、以下の６つの組成物の各々０．５ｍｌ用量を調製するために使用した（０．５ｍｌ用量あたりの量）。

これらのワクチンを、単一用量（これは、１２ヶ月より大きい小児において、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭに関して有効である）でかまたは４週間後の第２の注射と一緒かのいずれかで、１２〜１６ヶ月齢の幼児に対し、大腿領域に筋内注射により投与する。血清ＢＣＡおよびＩｇＧが、ワクチン接種前とワクチン接種後で比較され得る（例えば、２用量が受容される場合、４週間、そして、次いで、８週間）。

（２．２バイアル組成物）
ヒトの用途のための結合体を、２つの別個のバイアルに調製した。バイアル１は、スクロースおよびリン酸二水素化カリウムと一緒に、ＭｅｎＡ結合体の凍結乾燥粉末を含んでいた。バイアル２は、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、リン酸ナトリウム緩衝液、および必要に応じて、懸濁して存在するリン酸アルミニウムアジュバントと一緒に、ＭｅｎＣ結合体、ＭｅｎＷ１３５結合体およびＭｅｎＹ結合体を含んでいた。使用前に、バイアル１を、バイアル２からの０．６ｍｌの液体で再構成し、投与のために利用可能な０．５ｍｌを与えた。

３用量を調製した。再構成形態において、ワクチンは、以下の抗原を含んでいた：

再構成形態において、ワクチンは、以下の他の成分を含んでいた：

従って、６種のワクチンが利用可能であった−３つの異なる用量（１０μｇ、２０μｇまたは４０μｇのサッカリド総量）、各々は、リン酸アルミニウムアジュバントを含むかまたは含まない。

最も多いサッカリド用量を有するアジュバント添加されたワクチンを、１８歳〜４５歳の健康なヒト被験体に投与した。比較のために、コントロール被験体は、以下のいずれかを受容した：（ａ）同時に、異なる腕に、（緩衝液中で再構成された）バイアル１およびバイアル２生成物または（ｂ）Ｍｅｎｃｅｖａｘ^ＴＭ。各々の患者群は、３０人を含む。

ワクチン接種の前および２８日後に血液を採取し、免疫応答を評価し、そして、検査室安全性パラメータを収集した（全血球算定、血液化学分析、肝臓および腎臓の機能試験ならびに尿検査）。このワクチンは充分に耐えられ、予期せぬ有害な効果はなかった。研究の間、検査室パラメータの有意に異常な変化は生じなかった。

（ＥＬＩＳＡにより測定して）血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ−１３５、血清群Ｙに特異的なＳＢＡおよびＩｇＧを、血清サンプルにおいて決定した。ＳＢＡ力価を、６０分に５０％以上の殺傷を与える最終血清希釈の逆数として表した。ＩｇＧ測定のために、修正されたＥＬＩＳＡを実施し、高アビディティ抗体をアッセイした。機能性抗体の検出のために、補体の２つの異なる外因性供給源（ウサギ乳仔補体供給源およびヒト補体供給源）を有するＳＢＡを使用した。

高アビディティＩｇＧの結果は、以下のとおりであった（９５％の信頼区間を有する平均ＧＭＣ（μｇ／ｍＬ））：

ＳＢＡの結果は、以下のとおりであった（応答者％および平均ＧＭＴ、ともに９５％のＣＩを有する）：

各々の血清群について、かつ各々のワクチン群（ＡＣＷＹ、Ａ＋ＣＷＹおよびＭｅｎｃｅｖａｘコントロール）において、ウサギ補体アッセイおよびヒト補体アッセイの両方により測定された高アビディティＥＬＩＳＡ抗莢膜ＩｇＧ ＧＭＣおよびＳＢＡ ＧＭＴは、注射後に上昇した。ワクチン注射後２９日目に、各々の血清群に対して１：４以上のヒト補体ＳＢＡ力価を有する被験体の百分率は、結合体ワクチンにおいては、９０％〜１００％の間にわたり、そして、コントロール群においては、８３％〜１００％の間にわたった。ウサギ補体供給源を用いて、各々の血清群に対して１：１２８以上のＳＢＡ力価を有する被験体の百分率は、結合体ワクチンについて、９３％〜１００％の間にわたり、そして、コントロール群について、９０％〜１００％の間にわたった。

全体的に、免疫応答（ＧＭＣおよびＧＭＴ）は、Ｍｅｎｃｅｖａｘコントロール群よりも、結合体群においてより良好であった。改善は、特に、血清群Ｗ−１３５について見られた。従って、本発明の結合体ワクチンは、安全であり、充分に耐性であり、そして、承認されている四価ポリサッカリドワクチンによる免疫後に観察される機能的免疫応答と、等価またはそれより良好な機能的免疫応答を誘導する。

（３．改変されたＭｅｎＡサッカリドの使用）
莢膜ポリサッカリドを、ＭｅｎＡから精製し、そして、加水分解してＭｅｎＡオリゴサッカリドを得た。上記ポリサッカリド（２ｇ）を、５０℃で、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７５）中、１０ｍｇ／ｍＬのポリサッカリド濃度で、４時間加水分解した［７３］。加水分解後、その溶液をロータリーエバポレーションにより乾燥した。

上記オリゴサッカリドを、以下の反応スキームを用いて活性化した：

上記オリゴサッカリドをＤＭＳＯに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのサッカリド濃度を与えた。次いで、オリゴサッカリド：ＣＤＩの１：２０のモル比に従って、２１．２６２ｇのＣＤＩを添加し、そして、その反応混合物を１６時間室温で攪拌した。結果として生じたＭｅｎＡ−ＣＤＩ化合物を、８０：２０（ｖ／ｖ）のアセトン：ＤＭＳＯ混合液中で、選択的沈殿およびその後の遠心により精製した。遊離イミダゾールの対結合イミダゾール比を決定することにより、活性化反応の効率が約６７．９％であることを算出した。

第２の反応工程において、上記ＭｅｎＡ−ＣＤＩオリゴサッカリドを、約１０ｍｇ／ｍＬのサッカリド濃度で、ＤＭＳＯに溶解した。ＭｅｎＡ−ＣＤＩ単位：ＤＭＡの１：１００のモル比に従って、３６．２８８ｇの９９％ジメチルアミンヒドロクロリド（すなわち、Ｒ^１およびＲ^２＝Ｍｅ）を添加し、そして、その反応混合液を１６時間室温で攪拌した。反応生成物を、凍結乾燥し、そして、１０ｍｇ／ｍＬの水溶液に再溶解した。

低分子量反応試薬を除去する（特に、オリゴサッカリド調製物からジメチルアミン（ＤＭＡ）を除去する）ために、３．５ｋＤａ ＭＷＣＯメンブレン（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ^ＴＭ）を通す透析工程を実施した。４回の透析工程を実施した：（ｉ）２Ｌの１Ｍ 塩化ナトリウムに対して１６時間（透析係数１：２０）、（ｉｉ）２Ｌの０．５Ｍ 塩化ナトリウムに対して１６時間（透析係数１：２０）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）２ＬのＷＦＩに対して１６時間（透析係数１：２０）。精製を改善するために、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）工程をまた、１ｋＤａ ＭＷＣＯメンブレン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ^ＴＭ）を通して実施した。

精製されたＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡ生成物を、２５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン（Ｆｌｕｋａ^ＴＭ）中、ｐＨ６．５に緩衝化した。

上記改変されたＭｅｎＡサッカリド（ＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡ）の結合体の調製については、全体のプロセスは以下のとおりであった：
−オリゴサッカリドフラグメントを与えるためのポリサッカリドの加水分解
−上記オリゴサッカリドフラグメントの大きさ分類
−上記大きさ分類されたオリゴサッカリドの末端アルデヒド基の還元的アミノ化
−ＣＤＩ反応前のＦｍｏｃ基による末端−ＮＨ_２基の保護
−ＤＭＡ反応の間の−ＮＨ_２基の内因性脱保護
−ＳＩＤＥＡ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアジピン酸）による末端−ＮＨ_２基の活性化
−ＣＲＭ_１９７タンパク質への共有結合。

改変されたＭｅｎＡオリゴサッカリド結合体は、高温で、その天然の対応物よりも、加水分解に対してよりずっと耐性であった。例えば、３７℃で、２８日後、解離されたサッカリドの百分率は、改変されたオリゴサッカリドについては６．４％であるのに対し、天然抗原については２３．５％である。さらに、改変されたオリゴサッカリドにより誘導される力価は、天然の糖構造を用いて得られた力価より、有意に低くはない。

改変されたＭｅｎＡ結合体は、改変されていないオリゴサッカリドの結合体の代替物として、ＭｅｎＣ結合体、ＭｅｎＷ１３５結合体およびＭｅｎＹ結合体と組み合わされる。

（４．ＭｅｎＢ抗原の添加）
上に記載されるように、凍結乾燥ＭｅｎＡ結合体の再構成前に、ＭｅｎＢ抗原ΔＧ２８７−９５３（配列番号７）、９３６−ΔＧ７４１（配列番号８）およびＮａｄＡ（配列番号２）を、最も多い用量の液体Ｃ−Ｗ１３５−Ｙ混合物に添加して、用量あたり最終濃度２０μｇの３種のポリペプチドの各々を与えた。従って、再構成されたワクチンは、以下の抗原を含む：

（５．Ｈｉｂ抗原の添加）
凍結乾燥ＨｂＯＣ結合体を、凍結乾燥ＭｅｎＡ結合体と混合し、そして、液体Ｃ−Ｗ１３５−Ｙ混合物により、両方を一緒に再構成して以下のワクチンを与える：

（６．肺炎球菌抗原の添加）
上に記載されるように、凍結乾燥ＭｅｎＡ結合体の再構成前に、肺炎球菌結合体抗原を、中間の用量の液体Ｃ−Ｗ１３５−Ｙ混合物に添加して、用量あたり最終濃度２μｇの各々の血清型（血清型６Ｂについては２つ）を与える。従って、再構成されたワクチンは、以下の抗原を含む：

本発明は、例としてのみ記載され、そして、本発明の範囲内および精神内のままで、改変がなされ得ることが、理解される。

（参考文献（これらの内容は、全体が本明細書中に参考として援用される））

Claims (1)

1. 本明細書に記載の発明。