DE68921895T3

DE68921895T3 - Meningococcales klasse i-aussenmembranprotein-vakzin.

Info

Publication number: DE68921895T3
Application number: DE68921895T
Authority: DE
Inventors: Ian Clarke; John Heckels; Peter Hoogerhout; Peter Paradiso; Jan Poolman; Robert Seid; Peter Van Der Ley; Emmanuel Wiertz
Original assignee: Nederlanden Staat; American Cyanamid Co
Current assignee: De Staat Der Nederlanden Represented By Deput; Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1988-12-19
Filing date: 1989-12-19
Publication date: 2003-05-22
Anticipated expiration: 2009-12-20
Also published as: EP0449958A1; AU640118B2; FI912965A0; DE68921895T2; EP0449958B2; ES2070312T3; DK175788B1; DK117491D0; WO1990006696A2; DE68921895D1; EP0449958B1; EP0449958B9; JPH06503465A; FI113009B; AU4821990A; DK117491A; NO912369L; NO912369D0; JP3436756B2; WO1990006696A3

Description

Hintergrund der Erfindung

Bakterielle Meningitis ist eine entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems, hervorgerufen durch Bakterienwachstum in den und benachbart zu den Leptomeninx. Meningitis ist eine akute Infektionserkrankung, die Kinder und Jugendliche angreift und wird von Neisseria meningitidis, unter anderen Erregern, einschließlich weiteren bakteriellen und viralen Pathogenen, verursacht.
Menirigococci werden in. Abhängigkeit vom Vorkommen von entweder Kapsel- oder Zellwändantigenen in serologische Gruppen unterteilt. Derzeit sind Serogruppen erkannt worden, die A, B, C, D, W-135, X, Y, Z und 29E, wie durch Seroagglutination aufgespalten, einschließen. Die für die Serogruppenspezifität verantwortlichen Polysaccharide der Gruppen A, B, C, X, W-135 und Y wurden gereinigt.
Die Übertragungsgeschwindigkeit für Meningococci ist viel höher als die Häufigkeit der Krankheit. Einige Personen sind zeitweilige Träger, während andere chronische Träger sind, die Meningococci entweder mehr oder weniger kontinuierlich oder in sporadischer Weise abgeben. Der Meningokokkenträgerstatus ist ein Immunisierungsvorgang und innerhalb zwei Wochen der Kolonisierung kann die Erzeugung von Antikörpern gegen Meningococci festgestellt werden. Es scheint, daß bakterielle Antikörper sowohl gegen Kapselpolysaccharid als auch gegen Zellwandantigene gerichtet sind.
Untersuchungen haben gezeigt, daß Meningokokken-Außenmembranen 3 bis 5 Hauptproteine aufweisen, wobei Proteine mit 41000 Mr oder 38000 Mr vorliegen, die Serotyp spezifische Determinanten tragen. Es gibt einen beträchtlichen Grad der Zwischenstammheterogenität in den Profilen der Außenmembranproteine auf elektrophoretischen Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelen (SDS- PAGE). Wie durch Peptidkartierungsuntersuchungen festgelegt, umfassen die Proteine 5 Klassen, bezeichnet mit 1 bis 5, auf der Grundlage üblicher Peptidstrukturen. Bakterizide monoklonale Antikörper wurden gegen die 46000 Mr-Proteine der Klasse 1 erzeugt, die sich im gewissen Rahmen unter den Stämmen der verschiedenen Serotypen aufteilen (Frasch, C. E. et al., (1985) Seite 633, "New Developments in Meningococcal Vaccines", in G. K. Schoolnik et al. (Herausgeber) The Pathogenic Neisseria, American Society of Microbiology, Washington D. C.).
Das Kapselpolysaccharid der Gruppen A, C, W-135 und Y von Meningokokken wurde zur Entwicklung von Impfstoffen gegen den Organismus entwickelt. Obwohl diese Impfstoffe in kurzer Zeit wirksam wurden, induzierten sie kein immunologisches Gedächtnis und die Patienten mußten innerhalb etwa 3 Jahren aufgefrischt werden, um deren Resistenz aufrecht zu erhalten. Das Polysaccharid der Gruppe B ist schlecht immunogen und erfolgversprechende Impfstoffe wurden nicht hergestellt. Eine mögliche Erklärung für die geringe Aktivität kann auf die Toleranz zu Polysaccharid der Gruppe B, induziert durch kreuzreaktive Antigene, die man im menschlichem Gewebe wie im Hirn findet, zurückzuführen sein. Außerdem zeigen Untersuchungen, dass die meisten der bakteriziden Antikörper in den konvaleszenten Seren von Patienten, die eine Meningokokkenerkrankung der Gruppe B hatten, gegen andere Membranproteine gerichtet sind.
Impfstoffe zum Schutz gegen Meningokokkenerkrankungen der Gruppe B wurden entwickelt, in denen nicht kovalente Komplexe der äußeren Membranproteine (OMP) und Polysaccharid der Gruppe B verabreicht wurden. Beuvery, et al. (1983) Infect. Immun. 40: 369- 380. Das Polysaccharid B induziert aber bekanntlich eine transiente IGM-Antikörperantwort, die keinen Immunschutz überträgt. Außerdem gibt es bei Meningokokken-Außenmembranproteinen von Stamm zu Stamm eine große Antigenvielfalt und Variabilität. Des weiteren liegen Lipopolysaccharide in den OMP vor und zeigen ebenfalls antigene Variabilität.
Es besteht Bedarf für sichere und wirksame Impfstoffe gegen Meningokokkenkrankheiten, die Immunität aus einer Infektion, insbesondere bei Kleinkindern und Älteren, bereitstellen.

Kurzdarstellung der Erfindung

Im ersten Aspekt der Erfindung stellen wir einen Impfstoff bereit, der gegen Meningokokkenkranheit wirksam ist, welcher eine wirksame Menge eines Außenmembran-Vesikels, isoliert aus einem gentechnisch hergestellten oder mutanten Meningokockenstamm umfaßt, wobei die Vesikel umfaßt: mindestens ein Klasse I-Außenmembranprotein, ein Fragment davon oder Oligopeptid, das ein Epitop davon enthält, von Meningokokken, wobei das Protein, Fragment davon oder Oligopeptid eine bakterizide Immunantwort im Wirt auslösen kann und kein Klasse 2/3-Außenmembranprotein von Meningokokken umfaßt und wobei das Außenmembranprotein der Meningokokken der Klasse I von einem mutanten Meningokokkenstamm herrührt, der sich hinsichtlich einem Außenmembranprotein Klasse 2/3 negativ verhält.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein im Wesentlichen gereinigtes Fragment von Klasse I-Außenmembranprotein von Neisseria meningitidis bereitgestellt, wobei das Fragment ein Molekulargewicht von etwa 25 kD oder weniger aufweist und kontinuierliche oder diskontinuierliche Epitope enthält, die mit bakteriziden Antikörpern gegen N. meningitidis reaktiv sind, wobei die Epitope in den Oberflächenschleifen von Klasse I-Außenmembranproteinen von Meningokokken in den Bereichen der Aminosäuren 24- 34 und 176-187 angeordnet sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird isolierte Nukleinsäure bereitgestellt, die für Protein Klasse I-OMP vollständiger Länge mit der Sequenz P 1.15 oder der Sequenz P 1.7, 16 kodiert, wie in der Figur von beigefügtem Beispiel 4 gezeigt. Gemäß einem weiteren, anderen Aspekt der Erfindung stellen wir ein isoliertes Oligonukleotid bereit, das für ein Epitop kodiert, angeordnet in den Oberflächenschleifen von Klasse I- Außenmembranproteinen von Meningokokken in den Bereichen der Aminosäuren 24-34 und 176-187 kodiert.
Gemäß einem weiteren, anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen wir ein Mittel zum Hervorrufen einer Schutzimmunantwort gegen Neisseria meningitidis bereit, umfassend a) ein Liposom, umfassend eines oder mehrere Klasse I-Außenmembranproteine von Meningokokken, jedoch nicht umfassend ein Klasse 2/3 Außenmembranprotein oder Fragment davon, die von Meningokokken stammen, und gegebenenfalls ein Adjuvans in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder b) ein Liposom, umfassend mindestens ein Oligopeptid, das ein kontinuierliches oder diskontinuierliches Epitop eines mit bakteriziden Antikörpern gegen N. meningitidis reaktiven Außenmembranproteins der Klasse I enthält, jedoch kein Epitop eines Außenmembranproteins der Klasse 2/3 umfaßt und gegebenenfalls ein Adjuvans in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei das/die Klasse I Außenmembranprotein(e) die Sequenz P 1.15, die Sequenz oder die SE = quenz P 1.7, 16, wie in der Figur von beigefügtem Beispiel 4 gezeigt, aufweist.
Gemäß weiteren, alternativen Aspekten der Erfindung stellen wir ein antigenes Konjugat bereit, umfassend ein Trägerprotein oder ein Epitop davon, an das ein Konjugat oder ein Fragment von einem Klasse I-Außenmembranprotein von Meningokokken konju giert ist, mit einem Molekulargewicht von 25 kD oder weniger, was ein Epitop enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP und HYTRQNNTDVF, mit der Maßgabe, dass das Trägerprotein keine β-Galactosidase ist und ein Genfusionspeptid oder -protein, umfassend ein Trägerprotein, Peptid oder Epitop davon, an das ein Klasse I-Außenmembranprotein von Meningokokken fusioniert ist, mit einem mittleren Molekulargewicht von 25 kD oder weniger, enthaltend ein Epitop, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP und HYTRQNNTDVF, mit der Maßgabe, dass das Trägerprotein keine β- Galactosidase ist.
Gemäß einem weiteren, anderen Aspekt der Erfindung wird ein Fusionsprotein bereitgestellt, umfassend ein Flagellinprotein mit einer Aminosäuresequenz für ein Epitop eines Außenmembranproteins von Meningokokken Klasse I, darin inseriert.
Wir stellen außerdem gemäß einem weiteren, alternativen Aspekt der Erfindung einen rekombinanten Mikroorganismus bereit, befähigt, ein Fragment eines Außenmembranproteins der Klasse I von Neisseria meningitidis zu exprimieren, das ein Molekulargewicht von 25 kD oder weniger aufweist, und welches ein kontinuierliches oder diskontinuierliches Epitop enthält, das mit OMPspezifischen Antikörpern der Klasse 1 gegen N. meningitidis reaktiv ist.
Gemäß einem weiteren, anderen Aspekt der Erfindung stellen wir einen mutanten Meningokokkenstamm bereit, der kein Außenmembranprotein der Klasse 2 und 3 erzeugen kann und den mutanten Meningokokkenstamm HIII5, CBS 636.89, der kein Außenmembranprotein von Klasse 2 und Klasse 3 erzeugen kann.
Gemäß einem weiteren, alternativen Aspekt der Erfindung stellen wir einen gentechnisch erzeugten Neisseriastamm bereit, der für Außenmembranproteine von Klasse 2/3 negativ ist und der in der Lage ist, ein Außenmembranprotein der Klasse I von Neisseria meningitidis zu exprimieren, ein genetisches Fusionsprotein davon oder ein kontinuierliches oder diskontinuierliches Epitop, das mit spezifischen OMP-Antikörpern der Klasse I gegen N. meningitidis reaktiv ist.
Außerdem wird gemäß einem weiteren, alternativen Aspekt der Erfindung ein gentechnisch hergestellter Mikroorganismus bereitgestellt, umfassend einen Neisseriastamm, der mehr als ein Außenmembranprotein der Klasse I von Neisseria meningitidis exprimieren kann, wobei jedes Protein jeweils mindestens ein kontinuierliches oder diskontinuierliches Epitop umfaßt, das mit OMP-spezifischen Antikörpern der Klasse I gegen N. meningitidis reaktiv ist.
Gemäß einem weiteren, alternativen Aspekt der Erfindung stellen wir ein Verfahren zur Expression mindestens eines Klasse I-Außenmembranproteins von Meningokokken bereit, befähigt zum Auslösen einer bakteriziden Immunantwort in einem Wirt, umfassend Inserieren mindestens eines Gens, das für ein Klasse I-Außenmembranprotein von Meningokokken kodiert, in einen rekombinanten Mikroorganismus, ausgewählt aus a) einem mutanten Meningokockenstamm, der für Außenmembranprotein der Klasse 2/3 negativ ist oder b) einen Meningokokkus der Gruppe A, B, C, W-135 oder Y, wobei der Mikroorganismus befähigt ist zur Expression des Gens als intaktes Protein, das befähigt ist, eine bakterizide Immunantwort in einem Wirt auszuschütten. Gemäß einem weiteren, alternativen Aspekt der Erfindung stellen wir einen gentechnisch hergestellten Neisseriastamm bereit, befähigt zur Expression eines nichtnativen, intakten Außenmembranproteins der Klasse I von Neisseria meningitidis, eines genetischen Fusionsproteins davon oder eines kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Epitops, das mit OMP spezifischen Klasse I-Antikörpern gegen N. meningitidis reaktiv ist.
Die Erfindung betrifft auch Fragmente von Außenmembranprotein (OMP) der Klasse I von Neisseria meningitidis und Oligopeptide, abgeleitet von Klasse I-OMP, die kontinuierliche oder diskontinuierliche Immunogene enthalten und somit Klasse I-OMP, Fragmente und Oligopeptide dieser Erfindung die Entwicklung von Impfstoffen gegen andere gramnegative Pathogene gestatten.

Kurzbeschreibung der Figuren

Fig. 1. Schema zur Verstärkung von Genen, die für Außenmembranprotein von Meningokokken der Klasse I durch PCR (Polymerase Chain Reaction) kodieren.
Fig. 2. 5'Gensequenz, die für VR1 (erster variabler Bereich) für Außenmembranproteine der Klasse I von verschiedenen N. meningitidis-Subtypen kodiert.
Fig. 3. 3'Gensequenzen, die für VR2 (zweiter variabler Bereich) von Außenmembranproteinen der Klasse I von verschiedenen N. meningitidis-Subtypen kodiert.
Fig. 4. Epitopraster durch Reaktion von monoklonalen Antikörpern mit Festphasendecapeptiden in der Breite der vorausgesagten Aminosäuresequenzen von Proteinen der Klasse I von Stämmen P1.7, 16, P1.16 und P1.15. Benachbarte Decapeptide unterschieden sich durch 5 Aminoreste. Die Anmerkungen zeigen den Stamm, von dem die Sequenz abgeleitet wurde, die verwendeten mAb und deren Subtypspezifität.
Fig. 5. Reaktion von monoklonalen Antikörpern mit Reihen von überlappenden Decapeptiden, die den variablen Bereichen von VR1 und VR2 entsprechen, mit benachbarten Peptiden, die sich durch einen einzelnen Aminosäurerest unterscheiden. Die Anmerkungen zeigen den Stamm, von dem die Sequenz abgeleitet war, die verwendeten mAb und deren Subtypspezifität.
Fig. 6. Konstruktion von rekombinanten Flagellinen, die verschiedene Bereichsepitope von N. meningitidis Klasse I-OMP Subtyp P1.6, 16 exprimieren.
Fig. 7. Struktur von rekombinanten Flagellinen, die verschiedene Bereichsepitope von N. meningitidis Klasse I-OMP Subtyp P1.6, 16 exprimieren.
Fig. 8. Repräsentatives Chromatogramm der Hochdruckflüssigchromatographie von rekombinantem Flagellin.
Fig. 9. Repräsentative Analyse von SDS-PAGE von rekombinantem Flagellin.
Fig. 10. Repräsentative Western-Blot-Analysen von Konjugat, das ein Epitop von N. meningitidis Klasse I-OMP konjugiert, zu CRM&sub1;&sub9;&sub7; umfaßt.
Fig. 11. Vermeintliche Konformation von N. meningitidis Klasse I-OMP Subtyp P1.16.

Beschreibung der Erfindung im einzelnen

Die Erfindung betrifft Impfstoffe, die isolierte OMV, Meningokokken-Klasse 1-OMP, Fragmente der OMP (beispielsweise hergestellt durch Anwenden von Bromcyan) und Oligopeptide, die Epitope der OMP tragen, umfassen, die Präparation von isolierten OMV, reine Außenmembranproteine der Klasse 1, unter Verwendung mutanter Stämme, die kein Aufenmembranprotein der Klasse 2/3 exprimieren, die Präparation von isolierten reinen OMV Klasse 1 Außenmembranproteinen mit Hilfe von klonierter DNA in rekombinanten DNA-Expressionsvektoren. Die Erfindung umfaßt auch die Anwendung von Gentechnik mit dem Ziel der Herstellung isolierter OMV, Klasse I-OMP oder Teilen davon, genetische Fusion von Klasse I-OMP, Teilen von Epitopen davon und die Präparation von multivalentem Klasse I-Außenmembranimpfstoff durch Peptidsynthese, da die Epitope mit einer kurzen Peptidkette synthetisch hergestellt werden können.
Es hat sich gezeigt, daß Außenmembranproteine von Meningokokken der Klasse 1 eine starke bakterizide Immunantwort auf Stämme induzieren, die geeignete Subtypepitope enthalten, ungeachtet der Tatsache, ob diese von Stämmen der Gruppe A, B, C, W- 135 und Y stammen. Der Polysaccharidimpfstoff kann verstärkt oder ersetzt werden durch einen Impfstoff gemäß der Erfindung als Impfstoff mit breiter, extensiver Wirkung gegen die meisten Serotypen. Die spezifisch für Außenmembran der Klasse 1 schützenden bakteriziden monoklonalen Antikörper reagieren stark mit Fragmenten, die abgespalten wurden und kurzen synthetischen Peptiden, die unter Verwendung der Aminosäuresequenz von Außenmembranproteinen der Klasse 1 hergestellt wurden. Da Meningokokkenerkrankung derzeit hauptsächlich durch Meningokokken der Gruppe B hervorgerufen wird und da Außenmembranproteine der Klasse 1, die in der Gruppe B von Meningokokken auftreten, auch in der Gruppe der Meningokokken A, C, W-135, Y vorkommen, sollten erfindungsgemäße Impfstoffe, die ein oder mehrere Epitope von OMP der Klasse 1, abgeleitet von Neisseria meningitidis Gruppe B, umfassen bei der Verhinderung der Erkrankung, hervorgerufen durch Gruppe A, C, W- 135 und Y, wirksam sein. Die Präparation eines derartigen Impfstoffs beginnt vorzugsweise mit mindestens zwei immunogenen oder schützenden Epitopen, die aus epidemiologischen Gründen ausgewählt wurden. Erfindungsgemäße Impfstoffe umfassen beispielsweise mindestens ein Protein, das entweder bei der OMV-Formulierung oder durch Reinigung aus mutanten Stämmen, die ein oder mehrere OMP der Klasse 1 erzeugen oder mindestens zwei Fragmenten, hergestellt durch Bromcyanfragmentierung, erhalten wird oder mindestens zwei synthetischen Peptiden, ausgewählt von etwa 10 Hauptepitopen oder Produkten, die durch Genexpression über rekombinante DNA-Technologie erhalten wurden, die die gewünschten Epitope enthalten. Um die Wirksamkeit zu einem breiten Bereich der Meningokokkenstämme maximal zu gestalten, ist eine höhere Anzahl an unterschiedlichen Schutzepitopen in dem Impfstoff besser. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Impfstoffe vorteilhaft Meningokokken A und C oder gegebenenfalls W-135- und Y-Polysaccharide und/oder Detergenzien enthalten. Vorzugsweise sind die Polysaccharide A und C an einen Protein- oder Polypeptid-träger kovalent gekuppelt. Diese Träger schließen beispielsweise isolierte OMV-, OMP-Protein der Klasse 1, T-Helfer-Epitope, bakterielle Toxine, Toxoide, nichttoxische Mutanten (CRM), rekombinantes Salmonella- Flagellin und virale Teilchen, vaie Rotavirus VP6-Protein, Hepatitis B-Oberflächenantigen oder Parvovirus VP1- und VP2-Proteine ein. Sowohl zwitterionogene, kationogene, anionogene, als auch nichtionogene Detergenzien können verwendet werden. Beispiele solcher Detergenzien sind Zwittergent 3-10, Zwittergent 3-14 (N- Tetra-decyl-N,N-dimethyl-3-ammonia-1-propansulfonat), Tween-20, Natriumdesoxycholat, Natriumcholat und Octylglucosid. Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können auch ein Absorptionsmittel enthalten, wie Aluminiumhydroxid, Calciumphosphat oder vorteilhafterweise Aluminiumphosphat. Die Fragmente, Proteine und Peptide können ebenfalls zu immunostimulierenden Komplexen (ISCOM), Liposomen oder Mikrokügelchen zur Abgabe und/oder Verwendung als Adjuvans im Zusammenhang mit anderen Adjuvantien verarbeitet werden, so daß größere Immunogenität erhalten wird.
Die Erfindung umfaßt isolierte OMV, im wesentlichen reine Außenmembranproteine von Meningokokken der Klasse 1 (oder eines Subtyps) und Fragmente von Proteinen, die Epitope davon enthalten. Die Fragmente können einen beliebigen Anteil des Molekulargewichts von 25 kD oder weniger aufweisen, der Epitope enthält, die durch schützende bakterizide Antikörper gegen N. meningitidis gebunden werden. Diese schließen proteolytische Fragmente und synthetische Oligopeptide ein, die von Aminosäuresequenzen umfaßt werden, die zumindestens teilweisse Epitopen der Klasse 1-OMP entsprechen.
Die isolierten OMV, Klasse-1-OMP, Fragmente oder epitopenthaltende Oligopeptide, abgeleitet davon, können Aminosäuresequenzen umfassen, die unterschiedlich, jedoch im wesentlichen biologisch äquivalent zu den natürlichen Sequenzen sind. Diese Sequenzen können Sequenzen einschließen, bei denen funktionell äquivalente Aminosäurereste gegen Reste innerhalb der Sequenz substituiert sind, die zu einer stillen Änderung führt. Beispielsweise können einer oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine weitere Aminosäure ähnlicher Polarität substituiert werden, die als funktionelles Äquivalent wirkt und zu einer stillen Änderung führt. Substitute für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können von anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Beispielsweise schließen die unpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Glycin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polarneutralen Aminosäuren schließen Serin, Ihreonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparagin- und Glutaminsäure ein.
Außerdem können isolierte OMV, die Klasse-1-OMP, Fragmente oder Oligopeptide zur Konjugation mit anderen Molekülen modifiziert werden (beispielsweise durch Binden von Kupplungsgruppen, wie die Aminosäuren Cystein und/oder Lysin oder andere Bindungsgruppen und/oder Abstandsgruppen) einschließlich weiterem OMP der Klasse 1 vom unterschiedlichen Subtyp, T-Zellenepitopen, B- Zellenepitopen, Tägerpeptiden oder Proteinen oder Hilfsmolekülen.
Wie nachstehend im einzelnen beschrieben, können Fragmente oder Oligopeptide von OMP der Klasse 1 in unterschiedlichsten Formen in Impfstoffen verwendet werden (beispielsweise einzeln, in Gemischen oder als Konjugate und genetische Fusionierungen, hergestellt durch rekombinante: DNA-Vektoren). Zu diesem Zweck können die Stoffe Isolation aus N. meningitidis durch proteolytischen Aufschluß, durch chemische Synthese oder durch Expression als rekombinante Moleküle hergestellt werden. Die Herstellungsverfahren und Verwendung der isolierten OMV, die Klasse 1-OMP und die Fragmente und die Oligopeptide der Klasse 1-OMP werden nachstehend beschrieben.
Proteinmodeling und Strukturanalyse von OMP der Klasse 1 wurden unter Verwendung der Prinzipien für verschiedene Außenmembranproteine von E. coli ausgeführt (Vogel, H. et al., J. Mol. Bio., 190: 191 (1986); Ference, T. et al., J. Mol. Bio., 201: 493 (1988) und Tommassen, J. in "Membrane Biogenesis", NATO ASI Series H16, S. 351 ff, Springer-Verlag, NY (1988)). Die von OMP der Klasse 1 abgeleitete Aminosäuresequenz wurde für Modelluntersuchungen und Vergleiche verwendet. Die Aminosäurehomologie wurde mit anderen gramnegativen Bakterien-Porinproteinen verglichen und die Ähnlichkeit wurde für die Proteinstruktur festgestellt. Freiliegende Oberflächenschleifen und Transmembranstruktur waren recht ähnlich zu diesen Porinproteinen. Mit der dargelegten Information, betreffend variable und konstante Bereichsschutzepitope von N. meningitidis und deren. Struktur kann man auf der Grundlage der Aminosäuresequenz voraussagen, wo sich Schutzepitope für andere pathogene gramnegative Bakterien, die zu bewerten sind, und in Impfstoffen für dieselben eingeschlossen werden sollen; aufhalten.

Herstellung von isolierten OMV

OMV können entweder aus der Überstandskultur oder aus bakteriellen Zellen nach Fragmentierung, wie beschrieben von Beuvery et al. (1983) Infect. Immun. 40: 369-380, hergestellt werden. OMV-tragende Proteine von mehr als einem Meningococcus können aus Stämmen isoliert werden, die zur Expression heterologer Proteine manipuliert wurden.

Herstellung und Reinigung von OMP der Klasse 1 und CNBr- Fragmente davon

Klasse 1- und Klasse 3-Außenmembranproteine können wie beschrieben von Beuvery, E. C., et al., Antonie von Leeuvenhoek J. Microbiol. 52: 232 (1986) isoliert werden. Die Herstellung von im wesentlichen reinem OMP der Klasse 1, frei von OMP von Klasse 2 oder 3, wird durch dieses Verfahren unter Verwendung von mutanten Meningokokkenstämmen erreicht, die keine OMP der Klasse 2/3 exprimieren. Ein bevorzugter Stamm zur Herstellung von OMP der Klasse 1 ist der HIII5-Stamm, hinterlegt als CBS 636.89.
Die Fragmente können durch Bromcyanaufschluß, beschrieben von Teerlink T. et al., J. Exp. Med. 166: 63 (1987) für ein gonokokkales Protein hergestellt werden. Das N-terminale Fragment wird als CB-1 bezeichnet und das C-terminale Fragment wird als CB-2 bezeichnet. Diese CNBr-Fragmente können über Umkehrphasen- HPLC an einer Vydax C4 oder an einer Aquapor R-300-Säule unter Verwendung eines Wasser/Acetonitrilgradienten gereinigt werden. Alternativ dazu kann das Fragment durch mehrfache Trichloressigsäure-Kaltfällung gereinigt werden. Diese Verfahren entfernen mehr als 95% der störenden. Verunreinigungen (beispielsweise Puffersalze, Detergenzien und Fragmentkontaminierungen).

Herstellung von Fragmenten und Oligopeptiden, die Epitope von OMP der Klasse 1 enthalten

A. Herstellung durch proteolytischen Aufschluß Oligopeptide, die Epitope enthalten, die mit bakteriziden Antikörpern gegen N. meningitidis reaktiv sind, können durch Aufschluß von OMP der Klasse 1, CB-1- oder CB-2-Fragmenten mit Proteinasen, wie endoLys-C, endoArg-C, endoclu-C uhd Staphylokokki nen V8-Proteinase hergestellt werden. Die aufgeschlossenen Fragmente können beispielsweise durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)-Techniken gereinigt werden.

B. Herstellung durch chemische Synthese

Oligopeptide dieser Erfindung können durch übliche Festpeptidsynthese (Barany, G. und Merrifield, R. B., The Peptides 2: 1-284, Gross, E. und Meienhofer, J., Herausgeber, Academic Press, New York) unter Verwendung von tert.-Butyloxycarbonylaminosäuren und Phenylacetamidomethylharzen (Mitchell, A. R. et al., J. Org. Chem. 43: 2845-2852 (1978)) oder 9-Fluorenylmethyloxycarbonylaminosäuren an einem Polyamidträger (Dryland, A. und Sheppard, R. C., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125-137 (1986)) hergestellt werden. Alternativ können synthetische Peptide durch Pepscansynthese hergestellt werden (Geysen, H. M. et al., J. Immunol. Methods 03: 259 (1987); Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 3998 (1984)), Cambridge Research Biochemicals, Cambridge, U. K., oder durch Standardflüssigphasenpeptidsynthese hergestellt werden und die Deletion oder Substitution von Aminosäuren (und einschließlich Extensionen und Additionen von Aminosäuren) auf anderen Wegen, die nicht wesentlich für die immunologischen Eigenschaften des Oligopeptids schädlich sind.

C. Herstellung durch rekombinante DNA-Techniken

OMP der Klasse 1, Fragmente und Oligopeptide, die Epitope von OMP der Klasse 1 zeigen, können durch rekombinante DNA- Techniken hergestellt werden. Irn allgemeinen erfordern diese die Gewinnung von DNA-Sequenzen, die für die gewünschten OMP-[Barlow et al., (1989) Mol. Micro., 3: 131], Fragment- oder Oligopeptidsequenzen kodieren und Einführen in ein geeignetes Vektor/Wirtsexpressionssystem einer oder mehrerer ähnlicher oder verschiedener DNA-Sequenzen von OMP der Klasse 1, wo sie exprimiert werden. Die DNA kann aus dem Gen bestehen, das für OMP der Klasse 1 kodiert oder einem Segment des Gens, das für ein funktionales Epitop des OMP kodiert. Die DNA kann an DNA fusioniert sein, die für andere Antigene von N. meningitidis kodiert (wie andere Außenmembranproteine, entweder derselben oder verschiedenen Klasse) oder Antigene anderer Bakterien, Viren, Parasiten oder Pilze zur Schaffung genetisch fusionierter (Teile eines üblichen Peptidgerüsts), multivalenter Antigene. OMP-Fragmente der Klasse 1 können beispielsweise an andere Außenmembranproteine der Klasse 1 vom verschiedenartigen Subtyp (oder Fragmente oder Epitope davon) von N. meningitidis unter Bereitstellung von Fusionsproteinen, die Mehrfach-Klasse 1-Außenmembranprotein-Subtypdeterminanten umfassen, fusioniert werden.
Gentechnik kann auch zur Charakterisierung, Modifizierung und/oder zur Anpassung der kodierten Peptide oder Proteine verwendet werden, beispielsweise ortsgerichtete Mutagenese zur Modifizierung eines OMP-Fragments in Bereichen außerhalb der Schutzdomäne, zum Beispiel zur Erhöhung der Löslichkeit des Subfragments, um eine einfache Reinigung zuzulassen. DNA kann ebenfalls zur Bewirkung einer Überproduktion von OMP-Fragmenten oder Kombinationen davon in verschiedenen Organismen manipuliert werden. DNA, die für OMP der Klasse 1 kodiert, Fragmente oder Oligopeptide, können synthetisiert oder isoliert und sequenziert werden, wie beschrieben von Barlow, A. K. et al. Infect. Immune 55: 2734-40 (1987) und Barlow, A. K. et al. Mol. Micro, 3: 131 (1989). OMP-Gene der Klasse 1 können aus bakterieller DNA durch die Verfahren von Mullis und Faloona, (1987) Method. Enzym. 155: 335-350, unter Verwendung der Primersequenzen, die darin offenbart sind, verstärkt werden. Verwandte DNA-Sequenzen von OMP der Klasse 1 von unterschiedlichen Untertypen können durch beschriebene Verfahren aus den hergeleiteten Aminosäuresequenzen erhalten werden.
Zahlreiche Wirt-Vektor--Systeme können zur Expression der erfindungsgemäßen Oligopeptide verwendet werden. Das Vektorsystem muß hauptsächlich mit der verwendeten Wirtszelle verträglich sein. Wirt-Vektor-Systeme schließen ein, sind jedoch nicht auf nachstehende beschränkt: Bakterien, transformiert mit Bakteriophagen DNA, Plasmid-DNA, Cosmid-DNA, Mikroorganismen, wie Hefe mit Hefevektoren, Säugerzellensysteme, infiziert mit Virus (beispielsweise Pockenvirus, Adenovirus, usw.), Insektenzellsysteme, infiziert mit Virus (beispielsweise Baculovirus). Die Expressionselemente dieser Vektoren schwanken hinsichtlich ihrer Stärke und ihren Eigenschaften. In Abhängigkeit vom verwendeten Wirt- Vektor-System kann ein beliebiges einer Vielzahl geeigneter Transkriptions- und Translationselemente verwendet werden.
Um eine effiziente Expression der klonierten DNA zu erhalten, muß in dem Expressionsvektor ein Promotor vorliegen. RNA- Polymerase bindet normalerweise an den Promotor und initiiert Transkription eines Gens oder einer Gruppe verbundener Gene und regulatorischer Elemente (genannt ein Operon). Promotoren schwanken hinsichtlich ihrer "Stärke", das heißt ihrer Fähigkeit, Transkription zu fördern. Es ist wünschenswert, starke Promotoren zu verwenden, um einen hohen Grad an Transkription zu erhalten und folglich einen hohen Grad an DNA-Expression. In Abhängigkeit von dem Wirtszellensystem kann ein beliebiger der Vielzahl an geeigneten Promotoren verwendet werden. Beispielsweise können E. coli, dessen Bakteriophagen oder Plasmide, Promotoren, wie der Lac-Promotor, trp-Promotor, recA-Promotor, ribosomale RNA-Promotor und PR- oder PL-Promotoren des Coliphagen Lambda und andere, einschließlich, jedoch nicht beschränkt darauf, lacUV5, ompF, bla, lpp und dergleichen, verwendet werden, um ein hohes Ausmaß an Transkription den benachbarten DNA-Segmenten zuzuführen. Zusätzlich können ein Hybrid trp-lacUV5 (tac)-Promotor oder ähnliche E. coli-Promotoren, hergestellt durch rekombinante DNA- oder andere synthetische DNA-Techniken, zur Bereitstellung von Transkription von inserierter DNA verwendet werden.
Bakterielle Wirtszellen und Expressionsvektoren können gewählt werden, die die Wirkung des Promotors inhibieren, sofern nicht spezifisch induziert. In bestimmten Operons ist die Zugabe spezifischer Inducer zur wirksamen Transkription inserierter DNA erforderlich; beispielsweise wird der lac-Operon durch Zugabe von Lactose oder IPTG (Isopropylthio-β-D-galactosid) induziert. Eine Vielzahl anderer Operons, wie trp, usw., werden in verschiedener Weise beherrscht. Das trp-Operon wird induziert, wenn Tryptophan in dem Nährmedium abwesend ist und der PL-Promotor von Lambda kann induziert werden durch eine Temperaturzunahme in den Wirtszellen, die einen temperaturempfindlichen Lambdarepressor enthalten, beispielsweise cI857. In dieser Weise können mehr als 95% der promotorgerichteten Transkription in nichtinduzierte Zellen inhibiert werden. Somit kann Expression des rekombinanten Peptids oder Proteins gesteuert werden. Dies ist wichtig, wenn das Expressionsprodukt der DNA letal ist oder für die Wirtszelle schädlich ist. In solchen Fällen können Transformanten unter derartigen Bedingungen gezüchtet werden, daß der Promotor nicht induziert wird, dann, wenn die Zellen eine geeignete Dichte im Nährmedium erreichen, kann der Promotot zur Herstellung des Proteins induziert werden.
Eine solches Promotor/Operatorsystem ist das "tac"- oder trp-lac-Promotor/Operatorsystem (Russell und Bennett, 1982, Gene 20: 2312-243; Deßoer, European Patent Application, 67, 540, eingereicht am 18. Mai 1982). Dieser Hybridpromotor wird durch Kombination des -35 Bp. (-35-Bereich) des trp-Promotors und des -10 Bp. (-10-Bereiches der Pribnow-Box) des lac-Promotors konstruiert (die Sequenzen der DNA, die die RNA-Polymerase-Bindungsstelle sind). Zusätzlich zur Aufrechterhaltung der starken Promotorei genschaften des Tryptophanpromotors wird tac auch durch den lac- Repressor gesteuert.
Beim Klonieren in einer eukaryotischen Wirtszelle können Verstärkersequenzen (beispielsweise 72 bp Tandemwiederholung von SV40 DNA oder die retroviralen langen endständigen Wiederholungen oder LTR, usw.) inseriert werden, um den Transkriptionswirkungsgrad zu erhöhen. Verstärkersequenzen sind ein Satz eukaryotischer DNA-Elemente, der den transkriptionalen Wirkungsgrad in einer Weise zu erhöhen scheint, relativ unabhängig von deren Stellung und Orientierung hinsichtlich eines benachbarten Gens. Im Gegensatz zu klassischen Promotorelementen (beispielsweise Polymerasebindungsstelle und der Goldberg-Hogness "TATA"-Box), die unmittelbar bei 5' zum Gen angeordnet sein muß, haben Verstärkersequenzen die bemerkenswerte Fähigkeit, stromaufwärts von, innerhalb oder stromabwärts des eukaryotischen Gens zu funktionieren, daher ist die Position der Verstärkersequenz hinsichtlich der inserierten DNA weniger kritisch.
Spezifische Startsignale sind ebenso erforderlich für eine effiziente Gentranskription und Translation in prokaryotischen Zellen. Diese Transkription- und Translationstartsignale können in der "Stärke", wie gemessen durch die Menge an genspezifischer Boten-RNA, beziehungsweise synthetisiertem Protein, variieren. Der DNA-Expressionsvektor, der einen Promotor enthält, kann auch eine beliebige Kombination verschiedener "starker" Transkriptions- und/oder Translationsstartsignale enthalten. Beispielsweise erfordert effiziente Translation in E. coli eine Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz von etwa 7 bis 9 Basen 5' zu dem Startkodon (ATG) zur Bereitstellung einer Ribosomenbindungsstelle. Somit können beliebige SD-ATG-Kombinationen, die von den Wirtszellenribosomen benutzt werden können, angewendet werden. Solche Kombinationen schließen ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt, SD-ATG-Kom bination von dem cro-Gen oder dem N-Gen des Coliphagen Lambda oder von E. coli Tryptophan E-, D-, C-, B- oder A-Genen.
Außerdem kann eine beliebige SD-ATG-Kombination durch rekombinante DNA oder andere Techniken, die den Zusatz synthetischer Nukleotide einbeziehen, verwendet werden.
Ein beliebiges der in der Insertion von DNA in einen Expressionsvektor beschriebenen Verfahren kann zur Ligierung eines Promotors oder eines anderen genetischen Steuerelements in eine spezifische Stelle innerhalb des Vektors verwendet werden. N. meningitidis-Sequenzen zur Expression können in einen Expressionsvektor an einer spezifischen Stelle in Bezug auf den Vektorpromotor und die Kontrollelemente ligiert werden, so daß, wenn das rekombinante DNA-Molekül in eine Wirtszelle eingeführt wird, die fremdgenetische Sequenz exprimiert werden kann (beispielsweise transkribiert oder translatiert) durch die Wirtszelle.
Der rekombinänte DNA-Vektor kann in geeignete Wirtszellen eingeführt werden (Bakterien, Viren, Hefe, Säugerzellen oder dergleichen) durch Transformation, Transduktion oder Transfektion, (in Abhängigkeit von dem Vektor/Wirtszellensystem). Wirtszellen, die den Vektor enthalten, werden auf der Basis der Expression eines oder mehrerer geeigneter Genmarker, die normalerweise in dem Vektor vorliegen, ausgesucht, wie Ampicillinresistenz oder Tetracyclinresistenz in pBR322, oder Thymidinkinaseaktivität in eukaryotischen Wirtssystemen. Expressionsvektoren können von Klonvektoren abgeleitet werden, die gewöhnlich eine Markerfunktion enthalten. Solche Klonvektoren können einschließen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, SV40 und Adenovirus, Pockenvirusvektoren, Insektenviren, wie Baculoviren, Hefevektor, Bakteriophagenvektoren, wie Lambda gt-WES-Lambda B, Charon 28, Charon 4A, Lambda gt-1-Lambda BC, Lambda gt-1-Lambda B, M13mp7, M13mp8, M13mp9 oder Plasmid-DNA-Vektoren, wie pBR322, pAC105, pVA51, pACYC177, pKH47, pACYC184, pUB110, pMB9, pBR325, Col E1, pSC101, pBR313, pML21, RSF2124, pCR1, RP4, pBR328 und dergleichen.
Expressionsvektoren, die die DNA-Inserts enthalten, können durch 3 allgemeine Ansätze identifiziert werden (1) DNA-DNA- Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen enthalten, welche homolog zu dem inserierten Gen sind; (2) Gegenwart oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen (beispielsweise Resistenz gegen Antibiotika, Transformation des Phenotyps, Thymidinkinaseaktivität, usw.); und (3) Expression von inserierten Sequenzen auf der Grundlage physikalischer immunologischer oder funktioneller Eigenschaften des Genprodukts.
Wenn ein vermeintlicher rekombinanter Klon, der die gewünschte OMP-Aminosäuresequenz der Klasse 1 exprimiert, identifiziert wurde, kann das Genprodukt wie nachstehend analysiert werden. Immunologische Analyse ist insbesondere wichtig, da das letztendliche Ziel die Verwendung der Genprodukte in Impfstofformulierungen und/oder als Antigene in diagnostischen Immungssays ist. Das exprimierte Peptid oder Protein könnte immunreaktiv mit bakteriziden Antikörpern gegen N. meningitidis sein. Diese Reaktivität kann durch immunologische Standardtechniken demonstriert werden, wie Radioimmunpräzipitierung, Radioimmunkompetition, ELISA oder Immunblots.
Ist das Genprodukt einmal identifiziert als OMP-Fragment der Klasse 1 oder ein Oligopeptid, das ein funktionelles Epitop davon enthält, kann es isoliert werden und durch übliche Techniken, einschließlich Chromatographie, gereinigt werden (beispielsweise Ionenaustausch-, Affinitäts- und Größenausschlußsäulenchromatographie), Zentrifugieren, Löslichkeitsunterschied oder durch ein anderes Standardverfahren zur Reinigung von Proteinen. Verschiedene Techniken bestehen zur Reinigung von heterologen Proteinen aus prokaryotischen Zellen. Siehe beispielsweise Olson, US- A-4 518 526, Wetzel, US-A-4 599 197 und Hung et al., US-A-4 734 362. Die hergestellte gereinigte Präparation sollte jedoch im wesentlichen frei von Wirtstoxinen sein, die für den Menschen gefährlich sein könnten. Insbesondere, wenn in gramnegativen Bakterien Wirtszellen exprimiert werden, wie E. coli oder Salmonella, sollte das gereinigte Peptid oder Protein im wesentlichen frei von Endotoxinkontamination sein.
Klasse 1-OMP, Fragmente und Oligopeptide der Erfindung können als univalente und multivalente Impfstoffe formuliert werden. Diese Materialien können, wie sie hergestellt worden sind, verwendet werden oder durch Verfahren isoliert werden, die vorstehend beschrieben wurden. Sie können gemischt, konjugiert oder fusioniert werden mit anderen Antigenen, einschließlich B- oder T-Zellen-Epitopen anderer Antigene. Zusätzlich können sie an ein Trägerprotein konjugiert werden, wie nachstehend für Oligopeptide beschrieben.
Wenn ein haptenes Oligopeptid verwendet wird (beispielsweise ein Peptid, das mit verwandten Antikörpern reagiert, jedoch nicht selbst eine Immunantwort auslöst); kann es an ein immunogenes Trägermolekül konjugiert werden. Konjugation zu einem immunogenen Träger kann das Oligopeptid immunogen machen. Die Konjugation kann durch Standardverfahren ausgeführt werden. Bevorzugte Trägerproteine für haptene Oligopeptide sind Toxine, Toxoide oder beliebige mutante kreuzreaktive Materialien (CRM) von Toxin von Tetanus, Diphtherie, Keuchhusten, Pseudomonas, E. coli, Staphylococcus und Streptococcus. Ein besonders bevorzugter Träger ist CRM&sub1;&sub9;&sub7; von Diphthematoxin, abgeleitet von P. diphtheriae-Stamm C7(β 197), der CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Protein liefert. Dieser Stamm hat die ATCC- Zugangs-Nr. 53281. Alternativ dazu kann ein Fragment oder ein Epitop des Trägerproteins oder ein anderes immunogenes Protein verwendet werden. Beispielsweise kann das Hapten zu einem T- Zellen-Epitop eines bakteriellen Toxins, Toxoids oder CRM gekuppelt werden. Siehe US-Patentanmeldung Serien Nr. 150 688, einge reicht am 1. Februar 1988, mit dem Titel "Synthetic Peptides Representing a T-Cell Epitope as a Carrier Molecule For Conjugate Vaccines", deren Lehren in die Beschreibung aufgenommen werden. Andere Träger schließen virale Teilchen ein, zusammengesetzt aus Rotavirus VP6, Hepatitis B Oberflächenantigen oder Parvovirus VP1 und VP2.
Die erfindungsgemäßen Peptide oder Proteine können als multivalente Untereinheitsimpfstoffe in Kombination mit Antigenen von N. meningitidis oder Antigenen anderer Organismen verabreicht werden. Einige der anderen Organismen schließen die pathogenen Bakterien H. influenzae, N. meningitidis, B. catarrhalis, N. gonorrhoeae, E. coli, S. pneumoniae, etc. ein. Beispielsweise können sie im Zusammenhang mit Oligo- oder Polysaccharid-Kapselkomponenten von N. meningitidis verabreicht werden. Die Kapselkomponenten können abgeleitet sein von beliebigen der serologischen Gruppen, einschließlich A, B, C, D, X, Y, Z, 29E und W135.
Außenmembranproteine der Klasse 1 von verschiedenen Subtypen können verwendet werden. Diese können in Kombination verwendet werden zum Hervorrufen bakterizider Antikörper gegen N. meningitidis. Beispielsweise kann ein Fragment, abgeleitet von Außenmembranprotein der Klasse 1 vom P1.7. 16-Subtyp zusammen mit Außenmembranproteinen oder Fragmenten von Außenmembranproteinen von anderen Subtypen verwendet werden, wie P1.1, P1.1, 16; P1.2; P1.6; P1.9; P1.15; P1.16 oder P1.4 (Abdillahi, H. et al. 1988 Micro Pathog. 4: 27) oder mit Meningokokken-Polysacchariden in Gemischen oder als chemische Konjugate. Zur kombinierten Verabreichung mit Epitopen von anderen Außenmembranproteinen können sie separat verabreicht werden, als Gemisch oder als Konjugat oder genetisches Fusionspeptid oder Protein. Die Konjugate können durch Standardtechniken gebildet werden zum Kuppeln von proteinischem Material oder Techniken zum Kuppeln von Saccharidpolymeren zu Proteinen. Fusionen können aus fusiohierten Genkonstruktionen, hergestellt durch rekombinante DNA-Techniken, die hier beschrieben sind, exprimiert werden.
Wie erwähnt, können Klasse 1-OMP, Fragmente oder beliebige Oligopeptide davon abgeleitet, im Zusammenhang mit Antigenen (beispielsweise Polymerkapseln oder Saccharideinheiten, Hüllen oder Oberflächenproteinen) von anderen pathogenen Organismen (beispielsweise Bakterien (eingekapselt oder nicht eingekapselt), Viren, Pilzen und Parasiten) verwendet werden. Zusätzliche Beispiele anderer Organismen sind RS-Viren, Rotavirus, Malariaparasiten und Cryptococcus neoformans.
Bei der Formulierung der Impfstoffmittel mit dem Peptid oder Protein, einzeln oder in verschiedenen Kombinationen beschrieben, wird das Immunogen zu einer geeigneten Konzentration eingestellt und mit einem geeigneten Impfstoffadjuvans formuliert. Geeignete Adjuvantien sind, jedoch nicht darauf beschränkt: Tenside, (beispielsweise Hexadecylamin, Octadecylamin, Octadecylaminosäureester, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid), Methoxyhexadecylglycerin und Pluronicpolyole, Polyamine, beispielsweise Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Carbopol, Peptide, beispielsweise Muramyldipeptid und Derivate, Dimethylglycin, Tuftsin, Ölemulsionen und Mineralgele, beispielsweise Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, usw., Lymphokine und immunstimulierende Komplexe (ISCOMS). Das Immunogen kann auch in Liposomen, Mikrokügelchen oder an Polysaccharide und/oder andere Polymere zur Verwendung in einer Impfstofformulierung eingesetzt werden.
Die Impfstoffe können einem Menschen oder einem Tier auf verschiedene Weise verabreicht werden. Diese schließen intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subcutane, orale und intranasale Wege der Verabreichung ein.

Lebendimpfstoffe

Die erfindungsgemäßen Peptide und Proteine können als Lebendimpfstoffe verabreicht werden. Dazu werden rekombinante Mikroorganismen hergestellt, die die Peptide oder Proteine exprimieren. Der Impfstoffrezipient wird mit dem rekombinanten Mikroorganismus inokuliert, der sich in dem Rezipienten vermehrt, OMP der Klasse 1, ein Fragment oder ein Oligopeptid davon exprimiert und eine Immunantwort auf N. meningitidis hervorruft. Lebendimpfstoffvektoren schließen ein: Adenovirus, Cytomegalovirus und vorzugsweise Pockenvirus, wie Vaccinia (Paoletti und Panicali, US-A-4 603 112) und abgeschwächte Salmonella-Stämme (Stocker, US-A-4 550 081 und Curtiss et al., Vaccine 6: 155-160 (1988)). Zusätzlich können OMP-Epitope der Klasse I in die Flagella von abgeschwächten Bakterienstämmen eingebracht werden.
Lebendimpfstoffe sind besonders vorteilhaft, da sie zu einer verlängerten Stimulierung führen, die wesentlich lang andauernde Immunität überträgt. Wenn die Immunantwort gegen eine folgende N. meningitidis-Infektion schützend ist, kann der Lebendimpfstoff selbst in einem präventiven Impfstoff gegen N. meningitidis verwendet werden.
Multivalente Lebendimpfstoffe können aus einzelnen oder wenigen rekombinanten Mikroorganismen präpariert werden, die verschiedene Epitope von N. meningitidis exprimieren (beispielsweise andere Außenmembranproteine von weiteren Subtypen oder Epitopen davon). Zusätzlich können Epitope anderer pathogener Mikroorganismen in den Impfstoff eingebracht werden. Beispielsweise ein Pockenvirus kann eingebaut werden, um Kodierungssequenzen für andere Epitope zusätzlich zu jenen von N. meningitidis zu enthalten. Ein solcher rekombinanter Virus selbst kann als Immunogen in einem multivalenten Impfstoff verwendet werden. Alternativ dazu kann ein Gemisch von Vaccinia oder anderen Viren, die jeweils ein verschiedenes Gen, das für verschiedene Epitope von Außenmembran proteinen von N. meningitidis exprimiert und/oder Epitope anderer Krankheiten, die Organismen hervorrufen, als multivalenter Impfstoff formuliert werden.
Ein inaktivierter Virusimpfstoff kann hergestellt werden.
Inaktivierte Impfstoffe sind "abgetötete" Impfstoffe, das heißt:
das Infektionsvermögen wurde zerstört, gewöhnlich durch chemische Behandlung (beispielsweise durch Formaldehydbehandlung). Idealerweise wird das Infektionsvermögen des Virus zerstört, ohne die Proteine zu beeinflussen, die die Immunogenizität des Virus tragen. Um inaktivierte Impfstoffe herzustellen, werden große Mengen an rekombinantem Virus erforderlich, der die gewünschten Epitope exprimiert, in einer Kultur unter Bereitstellung der erforderlichen Menge an relevanten Antigenen gezüchtet. Ein Gemisch von inaktivierten Viren, die verschiedene Epitope exprimieren, kann zur Formulierung von "mehrwertigen" Impfstoffen verwendet werden. In bestimmten Fällen können diese "mehrwertigen" inaktivierten Impfstoffe für Lebendimpfstofformulierung bevorzugt sein aufgrund der potentiellen Schwierigkeiten, die von gegenseitigen Störungen von zusammen verabreichten Viren erwachsen. Im anderen Fall kann inaktivierter Virus oder ein Gemisch von Viren formuliert werden in einem geeigneten Adjuvans, um die immunologische Antwort zu den Antigenen zu verstärken. Geeignete Adjuvantien schließen ein:
Tenside, beispielsweise Hexadecylamin, Octadecylaminosäureester, Octadecylamin, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N',N'bis(2-hydroxyethylpropandiamin), Methoxyhexadecylglycerin und Pluronicpolyole, Polyamine, beispielsweise Pyran, Dextransulfat, Poly IC, Carbopol, Peptide, beispielsweise Muramyldipeptid und Derivate davon, Dimethylglycin, Tuftsin, Ölemulsionen und Mineralgele, beispielsweise Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Lymphokine.

Beispielteil

Beispiel 1

Monoklonale Antikörper gegen OMP der Klasse 1 und deren biologische Aktivität

Artspezifische monoklonale Antikörper wurden gegen verschiedene Meningococci der Klasse 1 der Außenmembranproteine präpariert. Diese monoklonalen Antikörper erkennen die nachstehenden Subtypen: P1,1; P1,2; P1,6; P1,7; P1,9; P1,10; P1,15; P1,16 und P1,17 (nun P1,14 genannt). Die monoklonalen Antikörper sind als "Monoclonal Kit Serotyping Meningococci" von RIVM, Bilthoven, Niederlande, erhältlich. Alle diese monoklonalen Antikörper reagieren mit dem SDS (Natriumdodecylsulfat - sodium dodecyl sulfate) denaturiertem Protein, wenn mit Westernblotting geprüft. Es wird ebenfalls festgestellt, daß eine Vielzahl dieser monoklonalen Antikörper mit einem 25 Kd CNBr-Fragment von 42 Kd Klasse 1 Außenmembranprotein (siehe nachstehend) reagieren. Dieses Ergebnis impliziert, daß Außenmembranproteinepitope der Klasse 1 hauptsächlich vom linearen Typ sind und daher mit synthetischen Peptiden kopiert werden können. Die epidemiologischen Ergebnisse der Tests, ausgeführt durch die Anmelder, zeigen, daß die beschriebenen monoklonalen Antikörper die meisten der Gruppe A, B, C Meningokokken subtypisieren können, vaas eine begrenzte Heterogenizität ahnen läßt. Jedes Außenmembranprotein der Klasse 1 scheint auch zwei individuelle Typen spezifischer Epitope zu enthalten (Abdillahi und Poolman, Microb. Pathogen, 1988, 4: Seiten 27 bis 32, Idem FEMS Microbiol. Immunol. 47: Seiten 139 bis 144).
Das gereinigte Außenmembranprotein der Klasse 1 (siehe nachstehend), Subtyp P1,7.16, das von der Kultur der Klasse 2/3 freie Mutante (HIII5) stammt, schien eine bakterizide Antikörperantwort von 1 : 64 Serumverdünnung in einer Dosis von 2,5 ug bei Mäusen zu induzieren. Die monoklonalen Antikörper gegen Außenmembranproteine von Meningokokken der Klasse 1, Außenmembranproteine Klasse 2/3 und Lipopolysacchariden wurden hinsichtlich bak terizider Wirkung verglichen. Die monoklonalen Antikörper gegen Klasse 1-Außenmembranproteine schienen die stärkste bakterizide Aktivität zu haben (siehe Tabelle 1). Die bakterielle Antwort wurde gemäß Poolman, J. T. (1985) in Schoolnick, G. J. et al. Herausgeber, "The Pathogenic Neisseriae" ASM Publications, Washington, D. C., Seite 562, bestimmt.

Tabelle 1

Bakterizide Aktivität einer Zusammenstellung monoklonaler Antikörper, die gegen Klasse 1 (cl 1), Klasse 2/3 (cl 2/3) und Lipopolysaccharid (LPS) von Meningokokken gerichtet ist. (ND = nicht bestimmt).
Die bakterizide Aktivität dieser monoklonalen Antikörper scheint gut mit der in vivo Schutzaktivität, gemessen bei dem Rattenmeningitis-Modell von Saukkonen et al., 1987, Microbial Pathogen 3: 261, zu korrelieren.

Beispiel 1 A

Konstruktion von Meningokokkenstämmen, die Klasse 1-Mehrfachgene tragen

Ersatz von chromosomalen Genen durch Klone, leicht abweichender Versionen, wurde für Neisseria gonorrhoeae beschrieben.
(Stein, D. C., Clin. Microbiol. Rev. 2 (Ergänzung), 5146-5149 (1989).) Wir fanden, daß dieses Verfahren auf das Klasse 1-Gen in Neisseria meningitidis angewendet werden kann. Dieses wurde in folgender Weise ausgeführt:
(i) Das Klasse 1-Gen von Stamm 2996 (Subtyp P1.2) wurde in den Vektor pTZ19R kloniert. (Mead, D. A. et al., Protein Engineering 1, 67 (1986).) Das vollständige Gen wird an ein 2,2 kb XbaI-Fragment angeordnet, was zu einem XbaI aufgeschlossenen DNA- Vektor ligiert war.
(ii) Das entstandene Plasmid wurde zur Transformation von Stamm H44/76 (Subtyp P1.7, 16) verwendet. Zellen des Acceptorstamms wurden mit Plasmid DNA in Gegenwart von Mg²&spplus; und normalem Meningokokkenmedium inkubiert. Sie wurden anschließend verdünnt und plattiert und die erhaltenen Kolonien wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit P1.2-spezifische monoklonale Antikörper zu binden, getestet. Solche Transformanten wurden mit einer Häufigkeit von etwa 10&supmin;³ gefunden. Weitere Charakterisierung zeigte, daß der Ersatz des H44/76 Klasse 1-Gens tatsächlich stattfand. Ein wesentliches Merkmal der Methode ist die Anwesenheit eines Donorgens auf einem kreisförmigen PTasmid DNA-Molekül, das nicht in der Lage ist, N. meningitidis zu replizieren, da die Verwendung von linearisierter DNA zu keiner Transformante führt.
Konstruktion eines Stammes mit zwei Klasse-1-Genen wurde durch eine Modifizierung des vorstehend beschriebenen Verfahrens ausgeführt. Für diesen Zweck wurde das P1.2 Klasse-1-Gen in Klone von Klasse-5-Gen inseriert. Die Klasse 5-Gen-Familie weist zwei Merkmale auf, die sie besonders geeignet macht für diese Konstruktion. (Meyer, T. F. und Van Putten, J. P. M., Clin. Microbiol. Rev., 2 (Ergänzung) S139 bis 5145 (1989): (i) es gibt 4 oder 5 Klasse-5-Gene, die in dem Meningokokken-Genom vorliegen und (ii) Expression dieser Gene ist zum Wachstum unter Laborbedingungen nicht erforderlich. Ein Klasse-5-Gen wurde aus Stamm H44/76 klo niert und das P1.2-Gen wurde in eine SphI-Stelle angeordnet in oder sehr nahe zum Klasse-5-Gen inseriert. Das erhaltene Hybridplasmid, pMC22, wurde zur Transformation vom Stamm HIII5, einer Klas-se-3-Mangelmutante von H44.76, verwendet. Kolonien, die mit dem P1.2-spezifischen monoklonalen Antikörper reagieren, wurden isoliert und charakterisiert. Von 10 solchen Transformanten wurden 9 gefunden, die das P1.16-Epitop des Akzeptorstamms verloren hatten. Dies zeigt an, daß in allen diesen Fällen Rekombination nur zwischen den Klasse-1-Genen stattfand, was zu einem Subtypersatz führt. Es wurde jedoch eine Transformante gefunden, die sowohl Klasse-1-Subtypen, das heißt, P1.7, 16 und P1.2 bewirkt, was vermuten läßt, daß Rekombination zwischen Klasse-5- Gensequenzen an Plasmid und Chromosom stattgefunden haben muß. Dies wurde durch Western-Blotting bestätigt, wodurch aufzeigt wurde, daß die Anwesenheit von beiden Typen von Klasse-1-Protein vorliegt und durch Southern blotting, wodurch die Aneignung eines zweiten Klasse-1-Gens aufzeigt wurde.
In Fortführung dieser Konstruktion mit anderen Klasse-1- Subtypen ist es möglich, einen Stamm mit 4 oder 5 verschiedenen Klasse-1-Genen herzustellen. Dasselbe Klasse-5-Gen kann in jedem der nachfolgenden Transformationsschritte verwendet werden, die unterschiedlichen Klasse-5-Gene können kloniert werden und separat verwendet werden. Diese rekombinanten Stämme können zur Herstellung von Gemischen verschiedener gereinigter Klasse-1-OMP verwendet werden.

Beispiel 1 B

Reinigung von isolierten AMVn (OMV's) aus bakteriologischer Kultur

Die Reinigung wird gemäß Beuvery et al. (1983) Infect. immun. 40: 369-380 ausgeführt.
Diese Kultur kann mit den gewünschten Wildtypstämmen, mutanten Meningococcistämmen ohne Klasse-2/3-Außenmembranprotei nen und/oder homologen und heterologen rekombinanten Mikroorganismen, die einen oder mehrere der gewünschten Meningokokken- Klasse-1-Außenmembranproteine und/oder -Epitope durch Überproduktionsvektoren, entweder durch oder nicht durch Vorliegen von offenen Leserastern und/oder manipulierten Leserastern exprimiert werden, so daß Fusionsproteine oder Proteine mit ausgetauschten Epitopen hergestellt werden können.
Leicht verfügbare wilde Stämme sind: H44/76 (B:15:P1,7.16) (Holten E., Norwegen, hinterlegt als CBS 635-89); 187 (B:4:P1,7) (Etienne J., Frankreich); M1080 (B:1:P1,1.7) (Frasch C., USA); Swiss4 (B:9::P1,15) (Hirschel B., Schweiz); B2106I (B:4:P1,2) (Berger U., 'Westdeutschland); 395 (B:NT:P1,9) (Jonsdottir K., Island): M990 (B:6:P1,6) (Frasch C., USA); 2996 (B:2b:P1,2) RTVM, Niederlande; M982 (B:9:P1,9) (Frasch C., USA); 53446 (B:14:P1,6) (Frasch C., USA); H355 (B:15:P1,15) (Holten E., Norwegen); 6557 (B:17:P1,17) (Zollinger W., USA) und B40 (A:4:P1,10) (Achtmann M., Westdeutschland). Ein Beispiel einer negativen Mutante der Klasse 3 ist HIII5 (B:-:P1.16) hinterlegt als Nr. CBS 636.89.
Diese Stämme werden aus Vorkulturen bei -70ºC in Schüttelflaschen überimpft und aus diesen in 40, 150 oder 350 Liter Fermenterkulturen überführt. Dieses halbsynthetische Medium hat die nachstehende Zusammensetzung: L-Glutaminsäure 1,3 g/l, L- Cystein·HCl 0,02 g/l, Na&sub2;HPO&sub4;·2H&sub2;O 10 g/l, KCl 0,09 g/l, NaCl 6 g/l, NH&sub4;Cl 1,25 g/l, MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,6 g/l, Glucose 5 g/l, Fe(NO&sub3;)&sub3; 100 uMol, Hefedialysat.
Während der Züchtung in dem Fermenter wurden pH-Wert und pO&sub2; aufgezeichnet und automatisch zu einem pH von 7,0 bis 7,2 und zu einer Luftsättigung von 10% einreguliert. Die Zellen wurden zu einer frühen stationären Phase gezüchtet und mit Hilfe von Zentrifugieren geerntet und mit sterilem 0,1 M NaCl gewaschen und bei -20ºC gelagert oder gefriergetrocknet.

Beispiel 2

Reinigung von Außenmembranproteinen der Klasse 1 aus bakteriologischer Kultur

Diese Kultur kann mit den gewünschten Wildtypstämmen, mutanten Meningokokkenstämmen ohne Klasse-2/3-Außenmembranproteinen und/oder homologen oder heterologen rekombinanten Mikroorganismen, die eines oder mehrere der gewünschten Meningokokken- Klasse-1-Außenmembranproteine und/oder -Epitope durch überproduzierende Vektoren, entweder durch oder nicht durch Vorliegen von offenen Leserahmen und/oder manipulierten Leserahmen ausgeführt werden, so daß Fusionsproteine oder Proteine mit ausgetauschten Epitopen hergestellt werden können.
Leicht verfügbare wilde Stämme sind: H44/76 (B:15:P1,7.16) (Holten E., Norwegen, hinterlegt, als CBS 635-89); 187 (B:4:P1,7) (Etienne J., Frankreich); M1080 (B:1:P1,1.7) (Frasch C., USA); Swiss4 (B:4:P1,15) (Hirschel B., Schweiz); B2106I (B:4:P1,2) (Berger U., Westdeutschland); 395 (B:NT:P1,9) (Jonsdottir K., Island): M990 (B:6:P1,6) (Frasch C., USA); 2996 (B:2b:P1,2) RIVM, Niederlande; M982 (B:9:P1,9) (Frasch C., USA); S3446 (B:14:P1,6) (Frasch C., USA); H355 (B:15:P1,15) (Holten E., Norwegen); 6557 (B:17:P1,17) (Zollinger W., USA) und B40 (A:4:P1,10) (Achtmann M., Westdeutschland). Ein Beispiel einer negativen Mutante der Klasse 3 ist HIII5 (B:-:P1.16) hinterlegt als Nr. CBS 636.89.
Diese Stämme werden aus Vorkulturen bei -70ºC in Schüttelflaschen überimpft und aus diesen in 40, 150 oder 350 Liter Fermenterkulturen überführt. Dieses halbsynthetische Medium hat die nachstehende Zusammensetzung: L-Glutaminsäure 1,3 g/l, L- CysteinHCl 0,02 g/l, Na&sub2;HPO&sub4;·2H&sub2;O 10 g/l, KCl 0,09 g/l, NaCl 6 g/l, NH&sub4;Cl 1,25 g/l, MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,6 g/l, Glucose 5 g/l, Fe (NO&sub3;)&sub3; 100 uMol, Hefedialysat.
Während der Züchtung in dem Fermenter wurden pH-Wert und pO&sub2; aufgezeichnet und automatisch zu einem pH von 7,0 bis 7,2 und zu einer Luftsättigung von 10% einreguliert. Die Zellen wurden zu einer frühen stationären Phase gezüchtet und mit Hilfe von Zentrifugieren geerntet und mit sterilem 0,1 M NaCl gewaschen und bei -20ºC gelagert oder gefriergetrocknet.
Die bakterielle Masse wurde beispielsweise mit Hilfe von 0,5 M CaCl&sub2;, 1% (Gewicht/Volumen) Zwittergerit 3 bis 14 (Zw 3 bis 14) und 0,14 M NaCl, pH 4,0 unter Verwendung von 100 ml pro Gramm gefriergetrockneter bakterieller Masse extrahiert. Die Suspension wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann zentrifugiert (1 Stunde, 3000 · g), wonach der Überstand in steriler Weise gesammelt wurde. 20% Ethanol (Volumen/Volumen) wurden zu dem Überstand gegeben und nach Rühren für 30 Min. wurde das Produkt zentrifugiert (30 Min., 10000 · g), wonach der Überstand aseptisch gesammelt wurde. Der IJberstand wurde dann konzentriert durch Diafiltration in einem Amicon Hollow Fiber System (HID · 50, cut off 50000) und CaCl&sub2; und Ethanol wurden entfernt. Das Konzentrat wurde mit 0,1 M Natriumacetat, 25 mM EDTA, 0,05% Zw 3 bis 14 mit einem pH von 6,0 auf das ursprüngliche Volumen verdünnt und dann wiederum durch Diafiltration konzentriert. Dieses Verfahren wurde fünfmal wiederholt. Der pH-Wert des Endkonzentrats wurde auf einen Wert von 4,0 eingestellt. 20% (Volumen/Volumen) Ethanol wurden zu dem Konzentrat gegeben und nach Rühren für 30 Min. wurde das Produkt zentrifugiert (30 Min., 10000 g). Die gesamten Proteine wurden mit Hilfe der Säulenchromatographie in Gegenwart von Detergenz gereinigt, beispielsweise Zw 3 bis 14. Häufig wird Gelfiltration über Sephacryl S-300 sowie Ionenaustausch über DEAE-Sepharose angewendet (Beuvery et al. (1986) supra). Das verwendete Extraktionsverfahren, die Detergenzien, Säulenchromatographie, sind nicht nur anwendbare Verfahren, sondern dienen auch als Beispiele und dürfen nicht als einschränkend angesehen werden.

Beispiel 3

Herstellung und Charakterisierung von Klasse I OMP Peptidfragmenten

Bromcyan wurde zur Herstellung von Fragmenten von Meningokokken-Klasse-1-Außenmembranproteinen verwendet. Die gereinigten Außenmembranproteine von Klasse 1 oder von Gemischen von Klasse 1 oder 3 wurden in 70% (Volumen/Volumen) Ameisensäure aufgenommen und mit dem zehnfachen Überschuß CNBr für 16 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. CNBr und die Ameisensäure wurden mit Hilfe von Verdampfung entfernt und durch 0,2 M TrisHCl, 6 M Harnstofflösung, pH 7,2, ersetzt. Der Überstand wurde durch Gelfiltration über Sepharyl S-200 vorgereinigt und anschließend mit Hilfe von TSK-2000 Gelfiltration durch HPLC gereinigt. Beuvery et al., (1986) supra.

Enzymatischer Aufschluß von CB2-Fragmenten

Um Epitope weiterhin zu beschreiben, wurde das Meningokokken-CB2-Fragment Aufschluß mit EndoArg-C, EndoGlu-C oder V-8 unterzogen und die erhaltenen Fragmente durch HPLC isoliert. Kurz gesagt wurden 20 nMol CB2-Fragment in 1 ml 25 mM Phosphat/0,1 mM Trispuffer (pH 8,0), enthaltend 3 M Harnstoff, bei 37ºC mit 0,2 nMol EndoArg-C (1 mg/ml in destilliertem Wasser) aufgeschlossen oder 0,22 nMol von EndoGlu-C oder V-8 (1 mg/ml in destilliertem Wasser) für 14 bis 18 Stunden aufgeschlossen. Die erhaltenen aufgeschlossenen Fragmente wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Vydac-C4-Säule und mit einem Trifluoressigsäure- Acetonitrilgradienten getrennt. Der Hauptpeak, eluiert von dem EndoArg-C-Aufschluß, hatte ein scheinbares Molekulargewicht von 7 bis 9 kD, während der Hauptpeak, beobachtet nach EndoGlu-C oder V-8, ein scheinbares Molekulargewicht von 4 bis 6 kD hatte. Von den isolierten Peaks wurde anschließend durch Westernblot gezeigt, daß sie mit einem Pool von monoklonalen Antikörpern reagieren (Adam I, 62-D12-8, MN5-C11G und MN14-C116).
Das P1.16-Epitop scheint am C-endständigen CNBr-Fragment des Außenmembranproteins der Klasse 1 von Stamm H44/76 (B:15:P1,7.16) zu liegen. Weitere Charakterisierung des P1,16- Epitops wurde unter Verwendung von Aminosäuresequenzbestimmung von 17 kD (N-endständig) und 25 kD (C-endständig) CNBr-Fragmenten ausgeführt. Die C-terminalen 25 kD werden weiter mit V8-Protease, endoLysC, endoGlu-C und endoArg-C fragmentiert. Fragmente, die mit dem P1,16 monoklonalen Antikörper positiv waren, wurden, soweit es ging, sequenziert. Die Sequenzen wurden wie nachstehend erhalten:
N-Terminus des gesamten Proteins:
DVSLYGEIKAGVEDRNYQLQLTEAQUAAGN...
N-Terminus von 25kD C-terminalen CNBr-Fragment: (M) PVSVRYDSPEFSGFSGSVQFVPIONSKSAYTPAYYTKDTNNN...
Fragmente, die mit P1,16 monoklonalen Antikörpern reagieren, wurden unter Verwendung von V8-Proteasen und unter Verwendung von endoArg-C-Fragmentierung bei einem Molekulargewicht von 7 bis 9 kD, beziehungsweise 4 bis 6 kD, isoliert. Die N-ständigen Sequenzen davon sind wie nachstehend:
V8 7 bis 9 kD-Fragment:
FSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPAYYTKDTN...
Arg-C 4 bis 6 Kd-Fragment:
PVSVRYDSPEFSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPAYYTK...

Beispiel 4

DNA-Sequenzen von Genen für OMP der Klasse I

Aminosäuresequenzen von OMP der Klasse I wurden aus der Nucleotidsequenz der Strukturgene von vier OMP von Meningokokken der Klasse I mit verschiedenen Unterarten hergeleitet. Ein Vergleich mit vier Aminosäuresequenzen ermöglichte eine Voraussage der Zusammensetzung und des Ortes dieser Epitope. Die P1,7- und P1,16-Epitope wurden außerdem mit Hilfe der Peptidsynthese und durch Nachweis des Bindungsvermögens zu den betreffenden monoklonalen Antikörpern bestätigt.
Gene für OMP der Klasse I wurden in Lambda-gtll geklont (wie für P1,16 beschrieben von Barlow et al. (1987) Infect. Immun. 55: 2743-2740) und in M13-sequenzierende Vektoren subkloniert und die DNA-Sequenz wurde durch übliche Kettenterminationsdidesoxynucleotidtechniken ermittelt.
Die vollständig hergeleitete Aminosäuresequenz für Proteine P1,16; P1,15, P1,7.16; und P1,2 war wie nachstehend:
+ Anmerkung: Diese Aminosäure 15 ist zwischen ASS. 184 und 185 dieser Sequenz angeordnet.

Beispiel 5

DNA-Sequenzieren von Klasse-1-OMP-Genen von verschiedenen N. meningitidis Serosubtypen

Die Polymerasekettenreaktion (PCR)-Technik von Mullis und Faloona (Methods in Enzymol. 155: 335-50, 1987) wurde zur Verstär kung des vollständigen Klasse-1-OMP-Gens und der spezifischen Fragmente verwendet, gemäß dem Schema, dargestellt in Fig. 1.
Primers wurden auf einem Applied Biosystems 380B DNA- Synthesizer synthetisiert und in Standard-PCR 30-Zyklen-Verstärkungsreaktionen unter Verwendung von Taq-Polymerase in einem Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) gemäß den Empfehlungen des Zulieferers verwendet. Verstärkte Fragmente von etwa 1300, 900 und 450 bp wurden aus jedem Serosubtyp-Gen-DNA- Präparat aus den Primerkombinationen, dargestellt in Fig. 1, erzeugt. Die verwendeten Primers hatten die nachstehenden Sequenzen:
PR1: (41 Basen mit universeller Primerextension) TGT AAA ACG ACG GCC AGT TTG AAG ACG TAT CGG GRG TTT GC
PR2: (42 Basen mit universeller Primerextension) TGT AAA ACG ACG GCC AGT GGC GAA TTC GGT ACG CTG CGC GCC
PR3: (42 Basen mit universeller Primerextension) TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAT CAG GTA CAC CGC CTG ACG GGC
PR4: (40 Basen mit universeller Primerextension) TGT AAA ACG ACG GCC AGT GCA GAT TGG CAG TCA GAT TGC A
PR5: (40 Basen mit universeller Primerextension) TGT AAA ACG ACG GCC AGT GGG ATC GGT ACC TTT GGC TTG A
PR6: (40 Basen mit universeller Primerextension) TGT AAA ACG ACG GCC AGT AAC TGA TTC GCA ACG CGA CCG G
FWD: (24 Basen)
TTG AAG GAC GTA TCG GGT CTT TCG
REV: (23 Basen) GCA GAT TGG CAG TCA GAT TGC TT
Überschuß an einsträngigem Templat zum Sequenzieren wurde in einer "asymmetrischen PCR"-Verstärkung unter Verwendung von 100-fachem Überschuß an Primer, das eine 18 Basenextension am 5'- Ende aufweist, entsprechend den universell fluoreszierenden sequenzierenden Primers, verwendet mit einem Modell 370A Automated DNA Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. Taq-Polymerase wurde in einer Standard Didesoxynucleotid- Kettentermination-Sequenzierungsreaktion mit den durch PCR erzeugten einsträngigen Klasse 1-Genfragmenten als Templaten verwendet. Abgeleitete Sequenzen für Gensegmente von Stämmen H44/76 (P1.7,16), M1080 (P1.1,7), H355 (P1.15), 6940 (P1.6), 6557 (P1.14), 870227 (P1.10) und B40 (P1.10) sind in Fig. 2 und 3 dargestellt.

Beispiel 6

Bestätigung von Aminosäuresequenzen der Klasse 1 OMP Subtypepitope

Von diesen Gensequenzen, bestätigt durch direkte Sequenzierung von Klasse 1 OMP-Genen, wurde abgeleitet, daß die Sequenzen entsprechend der Aminosäuren 24 bis 34 und 176 bis 187 von P1.16 in den 4 Klasse 1 OMP-Sequenzen deutlich variabel sind. Drei Aminosäuresequenzen N-terminal oder C-terminal von diesen Stellen sollten ebenfalls für einen möglichen Einschluß in diese Epitope in Betracht gezogen werden, um Maximierung der Epitopstabilitätpräsentation und unerwartete Insertionen oder Deletionen in der nativen Proteinsequenz zu gestatten. Die DNA- und Aminosäuresequenzen der anderen OMP der Klasse 1 sollten außerdem mit der P1.7,16-Sequenz verglichen werden, um eine maximale Ausrichtung und Epitopvorhersage zu gestatten. Das erste variable Bereichsepitop und das zweite variable Bereichsepitop werden VR1 beziehungsweise VR2 genannt. Diese Bereiche kodieren die Subtypepitope, die mit Hilfe der Peptidsynthese bestätigt wurden und der Reaktion der Peptide mit P1.2; P1.7; P1.15 und P1.16 spezifischen monoklonalen Antikörpern.
Ein vollständiger Satz an überlappenden Decapeptiden, gestaffelt über 5 Aminosäuren, wurde unter Verwendung von der P1.16-Proteinsequenz hergestellt. Der anti-P1.16 monoklonale Antikörper, der mit dem Decapeptid YYTKDTNNNL aus P1.16 reagierte, reagierte wie erwartet und wie kein weiteres Decapeptid (Fig. 4).
Von überlappenden Decapeptiden, ausgestattet rät einer Aminosäuresequenz (1)-Verschiebung in Bereich 24 bis 34 und 176 bis 187 des Klasse-1-OMP von Stamm H44/76 (P1.7,16), MC50 (P1.16) und MC51 (P1.15) reagierten mehr als ein Peptid mit dem subtypspezifischen monoklonalen Antikörper. In den meisten Fällen reagierte eine oder mehrere dieser Gruppen überlappender Peptide mit dem subtypspezifischen monoklonalen Antikörper stärker als andere (Fig. 5).
Diese Peptide werden als VR1- und VR2-Epitope bezeichnet.
Bei dem P1.7,16-Stamm, bei dem die Sequenz YYTKNTNNNL vorliegt, übt die Änderung D zu N bei Rest 180 etwas Einfluß auf die Verminderung der Antikörperbindung aus. Die Sequenz HYTRQNNTDVF in P1.15 ist in derselben relativen Position in dem Protein wie P1.16-Epitop und verantwortlich zum Binden des anti-P1.15 monoklonalen Antikörpers. AQAANGGASG zeigt etwas Bindung und Peptide 1 bis 3 Aminosäuren stromabwärts zeigen weit größere Bindung zu P1.7 monoklonalen Antikörpern. Sequenz HFVQQTPQSQP von VR2 ist verantwortlich für die Bindung an anti-P1.2 monoklonale Antikörper. Es ist wahrscheinlich, daß die Sequenzen QPQVTNGVQGN und PPSKSQP in P1.16- und P1.15-Proteinen ebenfalls Epitope wiedergeben.

Beispiel 6 B

Klasse 1 OMP Konstantbereich-Epitopidentifizierung

Peptide, die Oberflächenschleifen bilden, wurden hergestellt und mit Tetanustoxoid konjugiert. Ein Biolynx 4170, automatische Peptidsynthesevorrichtung (Pharmacia/LKB) wurde zur Durchflußfestphasensynthese mit nachstehender Ausnahme verwendet. Im letzten Zyklus der Synthese SAMA-OPfp (0,5 mMol) Drijfhout, J. W. (1989), Dissertation, Leiden, Niederlande) wurde in Gegen wart von 1-Hydroxybenzotriazol (0,5 mMol) für 30 Minuten gekuppelt unter Verwendung eines Standardprotokolls mit Weglassen von Piperidinbehandlung (das heißt: "Fmoc-Entblockungsschritt", der in diesem Falle unerwünschte S-Entacetylierung hervorrufen würde). Diese werden als SAMA-Peptide bezeichnet.
Die Peptide und deren Oberflächenbereichanordnung, die mit TT konjugiert waren, waren wie nachstehend:
Konjugation von SAMA-Peptid an Tetanustoxoid wurde wie nachstehend ausgeführt. Eine Lösung von N-Succinimidylbromacetat (4,7 mg, 10 uMol) in DMF (100 ul) wurde mit einer Lösung von Tetanustoxoid (TT) (20 mg) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,8 (3,5 ml) vermischt. Nach einer Stunde wurden 1,8 ml des Reaktionsgemisches Gelfiltration unterzogen, unter Verwendung einer Sephadex PD-10-Säule (Pharmacia), ins Gleichgewicht gebracht mit 0,1 M Natriumphosphat, enthaltend 5 mM EDTA (PE-Puffer) pH 6,1.
Das bromacetylierte Tetanustoxoid wurde mit demselben Puffer eluiert und in 3,5 ml gesammelt. Die Lösung von bromacetyliertem Tetanustoxoid (1,2 ml) wurde zu dem SAMA-Peptid gegeben (4,5 mg, 3 uMol) und mit Helium entlüftet. Anschließend wurden 150 ul 0,2 M Hydroxylamin (in PE-Puffer, pH 6,1) zugegeben. Nach 16 h wurden übrige Bromacetylgruppen durch Zugabe von 2-Aminoethanthiolhydrochlorid (4 uMol) in Puffer, pH 6,1 (150 ul) blockiert. Nach einem weiteren Zeitraum von 16 h wurde das Peptid-TT-Konjugat durch Gelfiltration über eine Säule PD-10 unter Verwendung von PE-Puffer, pH 6,1, als Elutionsmittel, gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und bei 4ºC gelagert.
Zur Bestimmung der immunologischen Aktivität wurden 25 ug (Gesamtprotein) pro Dosis eines Peptid-TT-Konjugats subcutan bei Woche 0 und 4 in 6 bis 8 Wochen alte NIH-Zucht-Mäuse injiziert (Bemerkung: Vaccine LBV 017-TT und LBV 018-TT wurden bei 10 ug Gesamtprotein/Dosis verwendet.) Die Sera wurden 6 Wochen gesammelt nach der ersten Dosis und hinsichtlich Antikörperantwort durch ELISA (Beuvery, E. C. et al. (1983) Infect. and Immun. 40: 3690380) bewertet. Die nachstehenden Antigene wurden in Mikrotitervertiefungen aufgetragen: Außenmembranprotein (OMP), gereinigtes OMP Klasse 1 (Poolman, J. T. et al., (1989) Infect. and Immun. 57: 1005) und die unkonjugierten Peptide. Die bakterizide Aktivität (BC) der Sera wurde ebenfalls gemessen. (Poolman J. T. et al., (1985) supra.)
Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 2 ausgewiesen. Tabelle 2
* Zahlen in () weisen O. D.-Spiegel aus, die diesen Titer angeben und ND ist nicht bestimmt.
Diese Daten lassen vermuten, daß die konstanten geprüften Oberflächenschleifen der Klasse 1 und 2 OMP von N. meningitidis Schleife 5 mindestens einen Bereich zu repräsentieren scheint, der Antikörper erzeugen wird, der mit Klasse 1 und Klasse 2 OMP von vielen Stämmen von N. meningitidis kreuzreagiert.

Beispiel 7

Konstruktion von rekombinanten Flagellinen, die Meningokokkenepitope exprimieren

Zur Herstellung hybrider Flagella, die Epitope von Meningokokken Klasse 1-Epitopen enthalten, wurde eine Reihe von Oligonucleotiden auf der Grundlage von Primerproteinsequenzdaten und Epitopkartendaten entworfen. Zwei Oligonucleotide auf der Grundlage von VR1- oder VR2-Außenmembranepitopen P1.7.16 wurden derart ausgelegt, daß sie in Einzel- oder Mehrfachkopien in einen Klonierungsbereich innerhalb des Gens von S. muenchen Flagellin kloniert werden könnten. Translationsstoppsignale wurden in den nicht kodierenden Strang des Oligonucleotids eingeschlossen, um das Absuchen durch Expression der klonierten Inserts zu erleichtern.
Der Plasmidvektor pPX1650, der den gesamten kodierenden Bereich und Promotorbereiche für das Strukturgen für Flagellin H1-d von Salmonella muenchen (hinterlegt bei der ATCC, Zugriffs- Nr. 67685) enthält, wurde derart modifiziert, daß er verschiedene einmalige Klonierungsstellen enthält, die geeignet sind zur Insertion von entweder Oligonucleotiden oder Genfragmenten in jedem der drei Leseraster des Flagellingens (Fig. 6). Zunächst wurde pPX1650 mit EcoRV aufgeschlossen, das pPX1650 zweimal schneidet, 48 Basenpaare Abstand, und unter Bereitstellung eines Plasmids pPX1651 wieder ligiert, das eine einmalige EcoRV-Klonierungsstelle aufweist und das zu einer 16 Aminosäuredeletion in dem Flagellinprotein führt. pPX1651 wurde durch Absuchen von E. coli Rekombinanten auf Western-Blots, versehen mit polyklonalen Antikörpern als Sande, gerichtet gegen H1-d Flagellin identifiziert. pPX1651 wurde unter verschiedenen Kandidaten mit Flagellinen, die kleiner waren als Flagellin vom Wildtyp, identifiziert (von 1650) und durch Sequenzieren verifiziert. Als nächstes wurde pPX1651 mit BamH1 Restriktion unterzogen und nach Auffüllen der überstehenden Enden mit Klenow-Enzym religiert zur Entfernung der einmalig vorhandenen BamHl-Restriktionsenzymstelle in dem Polylinkerbereich des Vektors. Als letzter Schritt wurde der erhaltene Vektor mit EcoRV aufgeschlossen und der nachstehende Oligonucleotidlinker wurde inseriert:
5' ATG ATC GAT GGA TTC 3'
3' TAG TAG CTA CCT AAG 5'
Kandidaten wurden hinsichtlich neu erzeugter BamH-Stellen gesucht und verschiedene Kandidaten mit BamHl-Stellen wurden zur Orientierung der Linker durch die Doppelstrang-DNA-Sequenzierungsmethodologie abgesucht. Ein Kandidat mit dem Linker der vorstehenden Orientierung wurde als pPX1647 zurückbehalten:
5'... GAT ATC ATC GAT GGA TTC ATC...
EcoRV Clal BamH1
Plasmid pPX1647 (Fig. 7) wurde mit BamH aufgeschlossen und entweder Oligonucleotide für VR1 oder VR2 wurden in E. coli- Zellen kloniert. Absuchen hinsichtlich gewünschter Rekombinanten wurde durch Aufschluß von Plasrnid Minilysat-DNA mit entsprechenden diagnostischen Restriktionsenzymen und Absuchen hinsichtlich Expression durch Sondierung mit Hybridflagella in Bezug auf verminderte Beweglichkeit auf SDS-PAGE-Gelen mit spezifischem flagellarem Antiserum (H1-d) ausgeführt. Zahlreiche erhaltene Klone zeigten verminderte Beweglichkeit auf SDS-PAGE, was eine richtige Insertion von einem oder mehreren Oligonucleotiden für VR1 oder VR2 ausweist. Verschiedene von ihnen wurden zur Analyse durch DNA-Sequenzieren zurückbehalten. Klon CB1-2 führt zur Tandeminsertion von zwei Kopien von VR1 Oligonucleotid und Klon CB1-4 führt zur Insertion von vier Oligonucleotiden. CB2 P enthält gleichfalls einen Einzelinsert des VR2 Oligonucleotids und CB2 W zeigte das erwartete trimere Insert CB2 P-Klon enthielt eine einzelne Basenpaaränderung, die in einer Änderung von Leu zu Phe in dem exprimierten VR2-Fusionsprotein führt und wurde zur weiteren Untersuchung nicht zurückbehalten. Die rekombinanten Flagellinklone in E. coli wurden mit monoklonalen Antikörpern (Abdillahi und Poolman, Microbiol. Pathogenesis 4: 27 bis 32, 1988; RIVM, Niederlande), die für eine Reaktion mit entweder VR1- oder VR2- Epitopen bekannt sind, getestet. Monoklonale Adam-1 (P1.7) und Mn14-C11-6 (P1.7) reagieren mit Hybridflagellin, das 2 oder 4 Tandeminserts von VR1 enthält, reagieren jedoch nicht mit Klonen, die VR2 enthalten. Die schwächere Reaktion von beiden monoklonalen Antikörpern mit CB1-2 anstatt mit CB1-4 ist wahrscheinlich auf die Epitopdichte zurückzuführen. Aus dem gleichen Grunde reagieren monoklonale Antikörper 62 (P1,16) und Mn5-c11-G (P1.16) mit CB2 W-Klon, jedoch nicht mit. VR1-Inserts. Der CB2 P-Klon kann nicht mit einem VR2-Antikörper reagieren; wahrscheinlich aufgrund der Änderung von Leu zu Phe.
Jeder dieser Klone wurde in einen aroA S. Dublin-Stamm (SL5927) mit einer TnlO-Insertion in dem H1-d-Locus transformiert zur Prüfung der Funktion der Hybridflagella. Jeder der 4 Klone führte zu beweglichen Bakterien; die Motilität der Transformanten wurde durch den entsprechenden monoklonalen Antikörper inhibiert, einschließlich Klon CB2 P, was die Affinität des monoklonalen Antikörpers VR2 zu dem Epitop in intakten Flagella ausweist. Dieses Ergebnis weist aus, daß die Epitope an der Zellenoberfläche exponiert sind und für Antikörper zugänglich sind.
Hybridflagellin, das sowohl VR1- als auch VR2-Epitope enthält, wurde durch Spalten von entweder CB1-2, CB1-4 oder CB2 W mit BamHl und Klonieren des heterologen Epitops hergestellt. Klone CB12-7 und CB12-10 führen zu der Insertion im Raster einer Einzelkopie des VR2 Oligonucleotids hinter entweder 2 oder 4 VR1- Tandeminserts, Klon CB21-F ent stand aus einer Insertion einer Kopie von VR1-Epitop hinter 3 Tandemkopien von VR2. CB12-7 und CB12-10 werden nur durch VR1 monoklonale Antikörper erkannt und CB21-F wird nur durch VR2 monoklonale Antikörper erkannt. Diese Ergebnisse, zusammen mit der DNA-Analyse, die vorbestimmte Sequenzen aufzeigen, weisen aus, daß die Epitopdichte in den kombinierten Hybriden zu gering ist. Zur Herstellung eines Hybridflagellins mit erhöhter Dichte von sowohl VR1- als auch VR2-Epitopen wurden CB12-10 mit BamHl aufgeschlossen und VR2 kodierende Oligonucleotide wurden inseriert. Klon 12-10-6 enthält zwei weitere Tandeminserts von VR2-Epitop, die zu einem Hybridflagellinmolekül führen, in dem 4 Tandemkopien von VR1 von 3 Kopien von VR2 gefolgt werden. Wie in Fig. 3a und b gezeigt, haben 3 der Hybridflagellin-Impfstoffkandidaten die erwarteten Moleküleigenschaften. Das Flagellin (pCB1 · 4), das 4 Kopien von VR1 enthält, reagiert mit anti-H1-d (anti-Flagellin) und anti-VR1 monoklonalen Antikörpern, jedoch nicht mit anti-VR2 monoklonalen Antikörpern; das Flagellin (pCB2-W), das 3 Tandemkopien von VR2 enthält, reagiert mit anti-H1-d und anti-VR2-Antikörpern, jedoch nicht mit anti-VR1; das kombinierte Hybrid, das Kopien von VR1 enthält und 3 Kopien von VR2, reagiert sowohl mit anti-VR1 als auch anti-VR2 monoklonalen Antikörpern. Das kombinierte Hybrid spezifizierte Motilität, wenn es in einen nicht beweglichen Rezipienten S. Dublin-Stamm eingeführt wurde.
Für einen Untereinheitsimpfstoff ist es das Ziel, geeignete Impfstoffausgangskandidaten in hoher Menge und mit hoher Reinheit zu erhalten. Ein geeigneter Impfstoffkandidat kann aus den vorstehenden Konstruktionsformen aufgrund der Reaktivität zu monoklonalen Antikörpern und der Funktion der Flagella in den nicht beweglichen Salmonella Wirtsstämmen ausgewählt werden. Ein Untereinheitsflagellin-Impfstoff darf nicht alle funktionalen Aspekte von einem Stammflagellin zurückbehalten, sondern sollte mindestens Oberflächenlokalisierung für Reinigungszwecke behalten. Verschiedene Untereinheitsflagellin-Meningokokkenimpfstoffe wurden von den vorstehend beschriebenen Hybridmolekülen auf Grundlage der Reaktivität zu monoklonalen Antikörpern und implizierter Oberflächenlokalisierung auf Grundlage der Wiederherstellung von bakterieller Motilität ausgewählt. Drei Flagellinimpfstoffkandidaten enthielten entweder 4 Tandeminserts von VR1, 3 Tandeminserts von VR2 oder 4 VR1-Inserts, gefolgt von 3 VR2- Inserts. Da Flagellin ein Hauptprotein von Salmonella ist, ist es möglich, ausreichend Material zu Impfstoffuntersuchungen unter Verwendung der Techniken, die für eine Flagellareinigung eingeführt wurden, zu reinigen (Logan et al., J. Bacteriol. 169: 5072 bis 5077, 1987).

Beispiel 8

Anfängliche Reinigung von rekombinanten Flagellinmolekülen

Die 3 Hybridflagellinimpfstoffkandidaten und ein Wildtyp (abgeleitet von pPX1650) wurden in unterteilten 4-Liter-Fernbach- Kolben, die 1 l LB-Brühe enthielten, inokuliert. Bakterienkulturen wurden bei 37ºC unter Schütteln (200 U/min) für 22 bis 24 Stunden inkubiert. Unter diesen Züchtungsbedingungen wurde das meiste der Flagella von der bakteriellen Zelloberfläche abgestoßen und wurde im Überstand des Kulturmediums lokalisiert. Um geeignetes Material zu erhalten, wurden Flagella aus 6 bis 8 l Kulturmedium isoliert. Zur Gewinnung gereinigter Flagellinzubereitungen für Impfuntersuchungen wurden flagellare Filamente aus den bakteriellen Kulturüberständen durch nachstehendes Verfahren geerntet: Ammoniumsulfat wurde zum Kulturüberstand zugegeben, so daß die Endlösung 50% gesättigt war; die Lösung wurde bei 4ºC für einige Stunden schwach gerührt und das ausgefallene Material wurde durch Zentrifugieren in einem GSA-Rotor bei 5000 U/min für 30 Minuten gesammelt. Das gesammelte Ammoniumsulfat gefällte Material wurde in PBS wiederhergestellt und gegen PBS bei 4ºC für 12 bis 15 h dialysiert. Das dialysierte Material wurde Hochgeschwindigkeitszentrifugation bei 100000 G für 1 Stunde in einem SW-27-Rotor zu einem Pellet der flagellaren Filamente unterzogen. Das pelletierte Material, das vorwiegend aus Flagellin bestand, wurde weiterer Reinigung durch das nachstehende Verfahren unterzogen.

Beispiel 9

HPLC-Reinigung von rekombinanten Flagellinen

Zur Herstellung von hoch gereinigten Flagellinen wurde Salmonella, das die Konstruktionen exprimiert, insbesondere pCB12-10-6, wie vorstehend beschrieben, angezüchtet und die Zellen bei 10000 G pelletiert. Der Kulturüberstand wurde dann mit 50% Ammoniumsulfat gefällt, bei 10000 G zentrifugiert und in 30 ml PBS resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wurde gegen 10 mM Tris-Puffer (pH = 8,0), enthaltend 6 M Harnstoff, 1 mM PMSF, 2 mM NEM und 5 mM EDTA, über Nacht bei 4ºC dialysiert. Dialysiertes Material wurde dann über 2 DEAE-Sepharose-Minisäulen (3, 0 ml Volumen, 4,0 ml Eluent über jeder) geleitet. Die Säulen wurden (5 x) mit 50 mM NaCl in 10 mM Tris (pH = 8,0), enthaltend 6 M Harnstoff und dann mit 1 M NaCl in 10 mM Tris (pH = 8,0), enthaltend 6 M Harnstoff, eluiert. Die ersten 4 aufgefangenen Elutiorien (20 ml) von 50 mM NaCl wurden zusammengegeben und gegen 1,0 l 10 mM Acetatpuffer (pH = 4,0) in 6 M Harnstoff bei Raumtemperatur dialysiert. Die dialysierten Fraktionen wurden dann auf eine TSK SP PW-Kationenaustauscher-HPLC-Säule gegeben (75 mm · 300 mm). Die Säule wurde dann mit einer mobilen Phase, bestehend aus 10 mM Acetat (pH = 4,0), enthaltend 6 M Harnstoff, eluiert. Ein Gradient 0 bis 300 mM NaCl wurde in 10 mM Acetat (pH = 4,0), enthaltend 6M Harnstoff, über ein Intervall von 5 bis 30 min. aufgegeben. Nach 30 min verschob sich der Gradient von 300 mM zu 1 M NaCl in 100 mM Acetat in 6 M Harnstoff über die nächsten 5 Minuten. Die Flagellinkonstruktion wurde bei etwa 24 min gesammelt, was etwa 200 mM NaCl entspricht. Die Fraktion wurde gegen PBS dialysiert und Reinheit auf dem Material wurde durch Western-Blots unter Verwendung von anti-Flagellin-Antikörper bestimmt. Eine repräsentative HPLC-Analyse und SDS-PAGE sind in Fig. 8 beziehungsweise 9 gezeigt.

Beispiel 10

Herstellung von Meningokokken-Flagellin- Glycokonjugat

Gruppe C Meningokokkenkapselpolysaccharid (GCM CPS: lot Nr. 86 NM 01) wurde im wesentlichen gemäß Bundle et al., J. Biol. Chem. 249: 4797-801, 1974) hergestellt.
Neisseria meningitidis-Stamm C11 wurde vom Walter Reed Army Institute (Washington, DC) erhalten. Der Stamm wurde zweimal auf Schafblutagarplatten vorgezüchtet und anschließend zum Inokulieren eines flüssigen Keimkulturmediums Neisseria chemisch definierten Mediums, NCDM (Kenney et al., Bull. W. H. O. 37: 469-73, 1967) verwendet. Schließlich wurden 40 l eines flüssigen Mediums (NCDM) in einem Fermenter mit der Flüssigvorkultur inokuliert. Die Reinheit des Stamms wurde bei jeder Stufe geprüft. Nach Zentrifugieren wurde der Überstand durch Zugabe von Cetavlon zu einer Endkonzentration von 0,1% gefällt und der unlösliche Komplex wurde in kalte 1 M Calciumchlorid (CaCl&sub2;)-Lösung (Gotschlich et al., J. Exp. Med. 129: 1349-65, 1969) zurückgelöst. Ethanol (96%) wurde zu einer Endkonzentration von 25% (Volumen/Volumen) zugegeben. Nach 1 h wurde die Suspension zentrifugiert (1 h, 50000 G), der Überstand wurde gesammelt und dessen Ethanolkonzentration wurde auf 80% (Volumen/Volumen) erhöht. Nach 1 h ergab Zentrifugieren (20 Min., 5000 G) einen Niederschlag, der nacheinander mit absolutem Ethanol, Aceton und Diethylether gewaschen und dann im Vakuumexsikkator über Phosphorpentoxid (P&sub2;O&sub5;) zu einem Konstantgewicht getrocknet wurde. Dieses rohe CPS wurde bei -20ºC gelagert.
Zur Gewinnung einer reineren Präparation wurde CPS dann in Natriumacetatpuffer (1.10 Verdünnung einer gesättigten Lösung, pH 7,0) aufgelöst und viermal mit heißem Phenol extrahiert (Westphal et al., Z. Naturforsch. 7b: 148-55, 1952). Nach Dialyse der kombinierten wässerigen Phasen gegen 0,1 M CaCl&sub2;, gefolgt von Zentrifugieren (3 bis 5 h, 100000 G), wurde eine letztliche Ethanolfällung an dem klaren Überstand ausgeführt und die erhaltene Fällung wurde mit organischen Lösungsmitteln gewaschen und getrocknet, wie vorstehend beschrieben. Das reine CPS wurde dann bei -20ºC gelagert.
Bei jeder Stufe des Reinigungsverfahrens wurde CPS analysiert hinsichtlich Kohlenwasserstoff N-Acetylneuraminsäure, NANA- Gehalt (Svennerhold, Biochem. Biophys. Acta 24: 604, 957), O-Acetyl (Hestrin, J. Biol. Chem. 180: 249, 1949) und Protein (260 nm -Bestimmung) und das Molekulargewicht durch Gelfiltration geprüft.
Gruppe C Meningokokken-Kapselpolysaccharid (GCM CPS) wurde gleichzeitig depolymerisiert und über Natriumperjodat aktiviert (NaIO&sub4;)-Oxidation in wässerigem Puffer (Anderson et al., J. Immunol. 137: 1181-6, 1986; Eby et al., Pediat. Res. 20; 308A, 1986, Anderson et al., J. Pediatr. 111(5): 644-50, 1987; Anderson, US-A-4 762 713, 1988). Die Reaktion wurde durch Hochleistungs- Gelpermeationschromatographie (HPGPC) in wässerigem Eluent unter Verwendung von Ultraviolettlicht(UV)- und Brechungsindex(RI)- Detektion verfolgt. Die Reaktion wurde gestoppt und die aktivierten Oligosaccharide (GCM OS) wurden durch Niederdruck-Gelpermeation (GPC) in Wasser entsalzen und dann lyophilisiert. Eine Lösung wurde dann in Wasser hergestellt und anschließend zur temporären Lagerung eingefroren. GCM OS und Flagellin pCB12-10-6 wurden in wässerigem Neutralpuffer gemischt und die Konjugation wurde durch Zugabe von Natriumcyanoborhydrid (NaBH&sub3;CN) gestartet (Anderson, US-A-4 762 713, 1988, US-A-4 673 574, 1987; US-A-4 761 283, 1988). Die Reaktion wurde für 5 Tage ausgeführt, während sie durch HPGPC verfolgt wurde. Sie wurde schließlich durch Dialyse/Konzentration auf Zentrifugen-Mikrokonzentratoren gestoppt. Die letzte Präparation wurde in der Kälte gelagert, in Gegenwart von Thimerosal zur Verhinderung von Bakterienaufwuchs. Das erhaltene Glycokonjugat stellt nicht nur einen Mechanismus zur Präsentation der exprimierten VR1- und VR2- Meningokokkenepitope in dem Immunsystem bereit, sondern dient auch als Trägermolekül für die Präsentation eines Meningokokkenoligosaccharids.
Zur Zubereitung des Konjugats wurden die nachstehenden Bedingungen angewendet. Gereinigtes Flagellin pCB12-10-6 wurde in 15% Saccharose gelöst (3,5 mg/ml) und dann bei -20ºC gelagert. GCM CPS (9,7 mg; Endkonzentration: 5 mg/ml) wurde durch 100 mM NaIO&sub4; in 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,2 bis 6,5) bei Raumtemperatur in der Dunkelheit unter Bewegen oxidiert. Aliquote Mengen (100 ul) wurden in regelmäßigen Abständen entnommen, die Reaktion durch Zugabe von Ethylenglycol (10 ul) gestoppt und die Analyse wurde durch HPGPC auf Waters Ultrahydrogel (Milford, MA) 250 + 120 (2 Säulen gekuppelt; 2 · 300 mm · 7,8 mm) in 0,2 M Phosphatkochsalzpuffer (PBS; 0,2 M Natriumphosphat, 0,9% NaCl, pH 7,8) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,8 ml/min. unter Verwendung von UV (206 nm) und RI-Detektion ausgeführt. Nach 2 h 30 min wurde die Reaktion durch Zugabe von Ethylenglycol gestoppt (1/10 des Reaktionsvolumens) und GCM OS wurde durch GPC auf Bio- Rad Bio-GelR P-2 (Richmond, CA) (200 bis 400 Mesh, 30 cm · 1,5 cm) in Wasser bei etwa 18 ml/h entsalzen. Fraktionen wurden gesammelt (1,2 ml) und hinsichtlich Anwesenheit von NANA dem Kohlenhydrat N-Acetylneuraminsäure (NANA) analysiert (Barry et al., J. Gen. Microbiol. 29: 335-52, 1962) und Aldehyd (Porro et al., Anal. Biochem. 118 : 301-306, 1981). Positive Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert. Entsalzenes GCM OS (4,7 mg) wurde dann in Wasser gelöst (10 mg/ml) und bei -20ºC gefroren.
Sowohl GCM OS- als auch pCB12-10-6-Lösungen, wurden durch HPGPC analysiert (UV bei 206 beziehungsweise 280 nm) bevor sie eingefroren wurden und vor der Konjugation. Kein Abbau trat während der Lagerung ein, bestätigt durch die exakte Ähnlichkeit der Elutionsprofile.
GCM OS (2 mg; Endkonzentration: 2,6 mg/ml) und Flagellin pCB12-10-6 (2,3 mg; Endkonzentration: 3 mg/ml) wurden in einem Polypropylenröhrchen in 0,4 M Natriumphosphatpuffer vermischt (pH 7,0) und dann NaBH&sub3;CN zugegeben. (12 uMol) zum Start der Konjugation (Anderson, US-A-4 762 713, 1988; US-A-4 673 574; US-A-4 761 283). Das Reaktionsgemisch wurde für 1 Tag bei Raumtemperatur und dann 4 Tage bei 35ºC ohne Rühren belassen. Die Reaktion wurde durch HPGPC (UV bei 280 nm) bei verschiedenen Stufen ver folgt und schließlich durch Dialyse/Konzentration an Mikrokonzentratoren gestoppt. Die letztliche Zubereitung wurde hinsichtlich NANA verfolgt (Barry et al., J. Gen. Microbiol. 29: 335-353, 1962) (0,09 mg bei 0,12 mg/ml) und Protein (Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265 bis 275, 1951) (1,12 mg; 1,45 mg/ml)-Gehalt. Es wurde dann bei 4ºC in Gegenwart von Thimerosal (0,01% Gewicht/Volumen) zur Verhinderung von bakteriellem Aufwuchs gelagert.
Die Konjugatzubereitung wurde dann auch durch SDS-PAGE (Silbernitratfärbung) und Western-Blots-Analyse geprüft. Verschiedene Banden hohen Molekulargewichts erschienen auf dem Gel oberhalb der reinen pCB12-10-6-Bande und nahe dem Sammeleinschnitt; letzteres ist ein Beweis, daß Crosslinking unter der Konjugation auftrat. Western-Blot-Analysen zeigten, daß jede Bande mit den verwendeten Antisera reaktiv war (anti-GCM, -VR1 und -VR2), was die Kovalenz der Konjugatbindungen beweist.

Beispiel 11

Konjugation von Meningokokkenpeptiden von CRM und Rinderserumalbumin

Peptide, bezeichnet als M20 und M21, wurden auf einen ABI-Modell-Peptidsynthesizer durch Festphasensynthese unter Verwendung der tBoc-Chemie hergestellt und wurden an CRM&sub1;&sub9;&sub7; gekuppelt (hergestellt wie beschrieben von Anderson, US-A-4 762 713) unter Verwendung eines bifunktionellen Vernetzungsmittels, Sulfosuccinimidyl (4-Jodacetyl)aminobenzoat (Sulfo SIAB; erhältlich von Pierce), gemäß der Modifizierung einer veröffentlichten Verfahrensweise (Weltman, J. K. et al., (1983) Bio Techniques 1, 148 bis 152). Kurz gesagt, wurde CRM&sub1;&sub9;&sub7; durch Sulfo-SIAB aktiviert, was zur Bildung einer Amidbindung zwischen SIAB und Aminogruppen von CRM&sub1;&sub9;&sub7; führte. Nach Entfernen der nicht umgesetzten Crosslinker vom aktivierten CRM&sub1;&sub9;&sub7; zur Gelfiltration wurde Peptid (M20 oder M21), enthaltend Linkerspacer (repräsentiert durch unter strichene Buchstaben) mit carboxyterminalem Cysteinrest, mit aktiviertem CRM gemischt und bei Raumtemperatur für 2 bis 4 Stunden inkubiert. Nach der Reaktion wurde das konjugierte Material extensiv gegen PBS bei 4ºC dialysiert.
Die Sequenz von M20-Peptid (VR2-Epitop) ist wie nachstehend:
H-Tyr-Tyr-Thr-Lys-Asp-Thr-Asn-Asn-Asn-Leu-Thr-Leu-Val-Pro-Ala- Gly-Ala-Cys-OH.
Die Sequenz von M21-(VR1-Epitop) Peptid ist:
H-Ala-Gln-Ala-Ala-Asn-Gly-Gly-Ala-Ser-Gly-Gln-Val-Lys-Ala-Gly- Ala-Cys-OH.
Konjugierte Materialien wurden SDS-PAGE unterzogen, auf PVDF-Membranen überführt (Immobilon, Millipore) und mit spezifischen monoklonalen Antikörpern, die VR1- und VR2-Epitope erkennen, umgesetzt. Fig. 10a und 10b zeigen die Western-Blot-Analyse von M20- und M21-CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Konjugaten gegen einen Pool von VR1- und VR2-spezifischen monoklonalen Antikörpern (Adam I, G2-D12-8 (P1.7), MN5-C11-G (P1.16) und MN14-C11-6 (P1.7)).
Um die Antikörperantwort auf M20- und M21-Peptid durch enzymgebundenes Immungssayverfahren zu bestimmen, wurden BSA- Konjugate unter Verwendung eines anderen bifunktionellen Vernetzungsmittels hergestellt, N-Succinimidylbromacetat, wie beschrieben von Bernatowicz und Matsueda (Anal. Biochem. 155, 95 bis 10² (1986)).
Kovalente Kupplung von Peptid an Protein wurde durch Western-Blot von Elektrophorese behandelten Proben, wie beschrieben für CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Konjugate, bestätigt.

Beispiel 12

Zurückhalten von T-Zellen-Aktivität durch M20- und M21-CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Konjugate

Zur Bestimmung, ob die Konjugation von VR1- und VR2- Epitopen an CRM&sub1;&sub9;&sub7; die T-Zellen-Erkennung von CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Protein nachteilig beeinflußt, wurde T-Zellen-Vermehrungsbestimmung, wie bereits von Bixler und Atassi beschrieben (Immunol. Commun. 12: 593, 1983) ausgeführt. Kurz gesagt: SJL/j-Mäuse wurden mit 50 ug nativem CRM&sub1;&sub9;&sub7;, emulgiert in CFA, immunisiert. 7 Tage später wurden Lymphknoten entfernt, in RPMI gezüchtet und mit verschiedenen Konzentrationen von Proteinen (0,05-100,0 ug/ml) und Peptiden gereizt. Nach 3 Tagen Inkubieren wurden die Kulturen mit [³H]-Thymidin für 16 h gepulst und dann zum Zählen gesammelt. Tabelle 3
Wie in Tabelle 3 dargestellt, zeigt ein Vergleich von CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Pseudokonjugat, daß das Konjugationsverfahren selbst nicht die T-Zellenerkennung des Proteins änderte. Die T- Zellenreaktion, induziert durch M20- und M21-CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Konjugate, war im wesentlichen äquivalent oder größer als die Antwort, die hervorgerufen wurde durch CRM&sub1;&sub9;&sub7; selbst, was ausweist, daß die Erkennung der T-Zellen-Epitope auf CRM&sub1;&sub9;&sub7; nicht nachteilig durch Peptidkonjugation beeinflußt wurde. Die Antworten auf Kontrollmaterialien Con A, LPS und Tetanustoxoid waren wie erwartet.

Beispiel 13

Immunogenizität von Konjugat und rekombinanten Meningokokken b-Impfstoffen

Rekombinante Flagelline, die Meningokokken VR1- und/oder VR2-Epitope exprimieren, wurden hergestellt und wie in Beispielen 7, 8 und 9 beschrieben, gereinigt. Außerdem wurden synthetische Peptide, die Meningokokkenepitope VR1 und VR2 repräsentieren, hergestellt, kovalent an das Trägermolekül CRM&sub1;&sub9;&sub7; gekuppelt und wie in Beispiel 12 gereinigt. Impfstoffe wurden mit jedem dieser Materialien bei Proteinkonzentration von 10 oder 100 ptg/ml für jede der Komponenten formuliert. Die Impfstoffmittel enthielten auch Aluminiumphosphat bei 1 mg/ml oder, sofern nicht angegeben, wurden sie mit Freund'schem komplettem Adjuvans oder ohne zusätzlichen Stoff vermischt.
Zur Bewertung der Immunogenität wurden junge Swiss Webster-Mäuse intramuskulär zu den Wochen 0 und 2 mit 1 oder 10 ug Protein/Dosis immunisiert. Sera wurden in zweiwöchigen Intervallen gesammelt und zu einem Assay vereinigt und hinsichtlich Antikörperaktivität durch ELISA oder einen Außenmembrankomplex (OMC), gereinigtem OMP (P1.16), VR1-Peptid, gekuppelt an Rinderserumalbumin (M21-BSA), VR2-Peptid, gekuppelt an BSA (M20-BSA), Wildformflagellin und an CRM&sub1;&sub9;&sub7; abgesucht. Die Ergebnisse der ELISA, ausgeführt an Sera, gewonnen bei 6 Wochen, sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
¹ Alles Vorblutwerte bei oder unterhalb der untseren Grenze des Assays von einer 1/100-Verdünnung.
² Alle Impfstoffe wurden mit 1 mg/ml Aluminiumphosphat formuliert, soweit nicht andern ausgewiesen.
Alternativ dazu wurden die verschiedenen Impfstoffe hinsichtlich Immunogenizität bei 6 bis 8 Wochen alten NIH-Zucht- Mäusen bewertet. Die Mäuse wurden mit 100 ug (Gesamtprotein)/Dosis subcutan bei Woche 0 und 4 mit Impfstoff immunisiert und die Seren wurden nach 6 Wachen gesammelt. Die Seren wurden mit ELISA und unter Verwendung von Antigenen, wie in Beispiel 6 beschrieben, bewertet. Bakterizide Aktivität wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargelegt. Tabelle 5
Die rekombinanten Flagelline, die entweder ein VR1, VR2 oder eine Kassette, sowohl von VR1, als auch von VR2 enthielten, waren beim Hervorrufen einer Antikörperantwort wirksam, die zu den gereinigten P1.16 kreuzreaktiv war und in einem geringeren Ausmaß zu OMC. Seren von Tieren, die mit 10 gg von entweder pCB1- 4 oder pCB2-w immunisiert wurden, induzierten Antikörper, die an ihre entsprechenden Peptid-BSA-Konjugate gebunden waren sowie kreuzreagierten mit P1.16 und OMC. Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem konstruierten pCB12-10-6 erhalten, das beide Meningokokkenepitope enthielt. Außerdem induzierte jede Konstruktion signifikant auch anti-Flagellin-Titer. Im Gegensatz dazu induzierte das Kontrollwildtypflagellin nur eine Antikörperantwort auf Flagellin selbst. Seren, gesammelt vor der Immunisierung, zeigten keine vorher vorliegende Antwort auf die zu bewertenden Stoffe.
Die Daten zeigen auch die Vorteile der Formulierung der rekombinanten Flagelline mit Alum oder anderen Adjuvantien, wie CFA. Die Konstruktion pCB12-10-6 wurde mit und ohne Zugabe von Aluminiumphosphat formuliert. Wie in Tabelle 2 gezeigt, war pCB12-10-6 allein in der Lage, eine Antwort mit einem Antikörper hervorzurufen, der zu dem Peptidkonjugat sowie zu dem gereinigten P1.16 sowie auch zu OMC reagiert. Im Vergleich war dieselbe Kon struktion bei Formulierung mit Alum in der Lage, eine größere Antikörperantwort bei äquivalenter Dosis hervorzurufen. In ähnlicher Weise waren die rekombinanten Flagelline pCB1-4 und pCB2-w ebenfalls mit CFA formuliert. Wiederum wurden äquivalente oder höhere Antikörpertiter in Gegenwart von CFA beobachtet.
Die Ergebnisse der Immun.ogenizitätsuntersuchungen mit den Meningokokken VR1- und VR2-Konjugaten sind auch in Tabelle 4 dargestellt. Sowohl die M20- als auch die M21-CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Konjugate sowie ein Gemisch, enthaltend gleiche Mengen beider Konjugate, waren in der Lage, eine anti-CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Antwort sowie eine anti-Klasse 1-OMP- Antwort hervorzurufen.
Diese vorläufigen Daten weisen aus, daß Klasse 1-OMP variable Bereichsepitope, entweder chemisch konjugiert mit einem Träger oder genetisch fusioniert zu einem Träger, eine Immunantwort hervorrufen. Neue Epitopträgerkonjugate können unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt werden, um die Immunantwort im Impfstoff zu erhöhen, beispielsweise unter Verwendung von 1) größeren Epitopen, 2) Peptiden mit Mehrfach-Epitop-Wiederholung und/oder 3) verschiedenen Trägern.

Beispiel 14

Herstellung von Meningokokken-Humanserumalbuminglycokonjugat

GCM CPS wurde durch saure Hydrolyse depolymerisiert und erhaltenes GCM OS wurde anschließend über NaIO&sub4;-Oxidation in wässerigem Puffer aktiviert. Die Reaktionen wurden durch HPGPC in wässerigem Elutionsmittel unter Verwendung von W- und RI- Detektion verfolgt. Die Reaktionslösungen wurden in Wasser durch GPC entsalzen. GCM OS und Humanalbumin (HA) wurden vermischt und im wesentlichen, wie in Beispiel 10 beschrieben, für das Meningokokkenflagellinglycokonjugat konjugiert. Die letztliche Zubereitung wurde in der Kälte gelagert, in Gegenwart von Thimerosal, um bakteriellen Aufwuchs zu verhindern.
Bei der Präparation des Konjugats wurden die nachstehenden experimentellen Bedingungen angewendet. Humanalbumin (HA; SigmaR, St. Louis, MO) wurde in 15%-iger Saccharoselösung (10 mg/ml) gelöst und dann bei -20ºC gelagert. GCM CPS (lot Nr. 86 NM 01; 10&sup6; mg; Endkonzentration: 10 mg/ml) wurde in 0,1 N HCl bei 50ºC unter Rühren hydrolysiert. Aliquote Mengen (25 ul) wurden in regelmäßigen Abständen entnommen, die Reaktion durch Zugabe von Natriumhydroxid (NaOH) gestoppt und die Analyse wurde durch HPGPC wie beschrieben ausgeführt. Nach 3 h 40 Min. wurde die Reaktion durch Zugabe von NaOH gestoppt und GCM OS wurde durch GPC entsalzen. Fraktionen wurden gesammelt (1,2 ml) und wie vorstehend beschrieben analysiert. Positive Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert. Entsalzenes GCM OS (89 mg) wurde dann bei -20ºC gelagert. Aktiviertes OS wurde zubereitet durch Oxidation von GCM OS (11,8 mg; Endkonzentration: 5 mg/ml) mit 2 mM NaIO&sub4; in 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,2 bis 6,5) bei Raumtemperatur in der Dunkelheit, unter Rühren. Die Reaktion wurde nach 30 Min. durch Zugabe von Ethylenglycol gestoppt. HPGPC-Analysen zeigten keinen Abbau des Molekulargewichts von OS während der Aktivierung. Entsalzen und colorimetrische Analysen wurden dann in vorstehend beschriebener Weise ausgeführt. Die erhaltenen aktivierten GCM OS (8,8 mg) wurden in Wasser gelöst (10 mg/ml) und bei -20ºC gefroren.
Sowohl GCM OS- als auch HA-Lösungen wurden durch HPGPC (UV bei 206 beziehungsweise 280 nm) analysiert, bevor sie gefroren wurden, und vor der Konjugation. Kein Abbau trat während der Lagerung auf, was durch die exakte Ähnlichkeit der Elutionsprofile bestätigt wurde.
GCM OS (6 mg; Endkonzentration: 2,5 mg/ml) und HA (12 mg; Endkonzentration: 5 mg/ml) wurden in Propylenröhrchen in 0,4 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) vermischt und NaßH3CN (60 uMol) wurde zum Start der Konjugation zugegeben (Anderson, US-A-4 762 713, 1988; US-A-4 673 574, 1987; US-A-4 761 283, 1988). Das Reaktionsgemisch wurde einen Tag bei Raumtemperatur und dann 4 Tage bei 35ºC unter Rühren belassen. Die Reaktion wurde durch HPGPC (UV bei 280 nm) bei unterschiedlichen Stufen verfolgt und schließlich durch Dialyse/Konzentration an Mikrokonzentratoren gestoppt. Die letztliche Zubereitung wurde für NANA analysiert (Barry et al., J. Gen. Microbiol. 29: P335-51, 1962) (2,07 mg bei 0,86 mg/ml) und Protein (Lowry et al., J. Biol. Chem. 193 : 265-75, 1951) (9,51 mg bei 3,96 mg/ml)-Gehalt. Sie wurde dann bei 4ºC in Gegenwart von Thimerosal (0,01% Gewicht/Volumen) zur Verhinderung von bakteriellem Aufwuchs gelagert.
Die Konjugatzubereitung wurde auch hinsichtlich SDS-PAGE geprüft (Silbernitratfärbung) und Western-Blot-Analyse. Eine diffuse Bande erschien auf dem Gel, die einen signifikant breiteren Molekularbereich als reines HA überdeckte. Western-Blot-Analysen zeigten, daß diese Bande mit dem Antiserum, das verwendet wurde, (anti-GCM) reaktiv war, was die Kovalenz der Konjugatbindungen beweist.

Beispiel 15

Immunogenizität von Meningokokken-Oligosaccharid-rekombinanten Flagellinimpfstoffen

Ein Meningokokken-Oligosaccharid-rekombinanter Flagellinimpfstoff wurde, wie vorstehend beschrieben, hergestellt und bei 100 ug Protein/ml formuliert. Impfstoffmittel wurden auch hergestellt, die Aluminiumphosphat (1 mg/ml) oder komplettes Freundsches Adjuvans in Zusammenhang mit dem Glycokonjugat enthielten.
Zur Bewertung der Immunogenizität wurden junge Swiss Webster-Mäuse intramuskulär mit 10 ug Protein bei Woche 0 und 2 immunisiert. Die Sera wurden bei Wochen 0,2 gesammelt und dann in wöchentlichen Intervallen anschließend bis zu 6 Wochen. Nach dem Sammeln wurden die zusammengegebenen Serumproben hinsichtlich Antikörperaktivität durch ELISA auf Meningokokken-C-Oligosaccha ridkonjugat zu Humanserumalbumin, OMC, P1.16, CB1 und CB2-BSA- Konjugaten und Flagellin untersucht.
Das MenC-CB12-10-6-Glycokonjugat war beim Hervorrufen einer Immunantwort wirksam, die sowohl mit dem Oligosaccharid als auch Meningokokken B OMP-Epitopen, exprimiert in dem rekombinanten Flagellin, war. Wie in Tabelle 5B gezeigt, hatten bei nur 3 Wochen innerhalb der Untersuchung mit 1 zg MenC-CB12-10-6- Konjugat in komplettem Freund'schen Adjuvans immunisierte Mäuse nachweisbar Antikörper zu MenC-HSA, OMP und gegen beide, die CB1- und CB2-Epitope. Außerdem riefen alle der MenC-CB12-10-6-Zubereitungen, ungeachtet des Adjuvans, eine Antikörperantwort auf MenC- HSA hervor, was größer war als die Antwort, die beobachtet wurde in der nachfolgenden Immunisierung mit MenC-CRM&sub1;&sub9;&sub7;.

Tabelle 5B

Immunogenizität von Meningokokken C-rekombinantem Flagellinimpfstoff eine Woche nach der zweiten Immunisierung

1. Titer für Start-Vorblut-Proben (Woche 0), Proben waren < 100.
2. Aluminiumphosphat wurde als Adjuvans bei 1 mg/ml verwendet.

Beispiel 16

T-Zellen-Epitope von Klasse 1 OMP und deren Identifizierung

Ein wirksamer Impfstoff muß ein oder mehrere T-Zellen- Epitope enthalten. T-Zellen-Epitope innerhalb eines Proteins können wie von Margalit et al., J. Immunol. 138: 2213, (1987) oder Rothbard und Taylor, EMBO J. 7: 93, (1988) vorausgesagt werden. Diese Voraussagungsverfahren werden auf die Aminosäuresequenz der Klasse 1 OMP von N. meningitidis-Stämmen P1.7,16, P1.16 und P1.15 angewendet. Die Segmente der Sequenz, die potentielle T-Zellen- Epitope enthält, identifiziert durch diese Verfahren, sind in Tabellen 6 und 7 dargestellt. Die vorausgesagten Peptide wurden durch Standard-FMOC-Verfahren synthetisiert, durch Standardverfahren gereinigt und, wie in Tabelle 8 dargestellt, identifiziert.
Zur Bestimmung, welches der vorausgesagten Peptide tatsächlich die T-Zellen-Epitope enthält, deren Kapazität humanperiphere Blutlymphozyten (PBL) zu stimulieren, wurde durch Lymphozytenvermehrungsassay geprüft. Kurz gesagt, peripheres Blut wurde aus HLA-Typ Normalprobanden oder von Probanden, die vorher mit MPC-2 immunisiert wurden, gesammelt (Poolman, J. T. et al., Antonie von Leeuwenhoek, 53: 413 bis 419, 1987), die P1.16, 15, Klasse 4 OMP und Gruppe C Polysaccharid enthielten. Lymphozyten wurden aus dem peripheren Blut durch Isolierung an Ficoll-Hypaque (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) isoliert und bei 1 · 10&sup5;-Zellen/Vertiefung in ergänztem RPMI 1640 (Gibco Laboratories, Paisly, Schottland) gezüchtet, das 10% Hitze inaktiviertes, gesammeltes Human-AB-Serum enthielt. Die Kulturen wurden verschiedenen Konzentrationen der vorausgesagten T-Zellen-Epitope exponiert (0,05-10 ug/ml). Nach der in vitro-Exposition wurden die Kulturen für 6 Tage inkubiert und dann (18 h) mit 0,5 uCi [³H]- Thymidin gepulst. Kulturen wurden dann gesammelt und durch Flüssigszintillation gezählt. Die Daten wurden als Stimulierungsindizes ausgedrückt, die als Verhältnis von CPM, erhalten in Gegenwart von Antigen, zu CPM, erhalten in Abwesenheit von Antigen, berechnet wurden.
Wie in Tabelle 9 gezeigt, zeigten 10 der 16 vorausgesagten Peptide etwas Kapazität, T-Zellen zu stimulieren. Diese schließen die als 16-34, 47-59, 78-90, 103-121, 124-137, 151-158, 176-185, 223-245, 276-291 und 304-322 identifizierten Peptide ein. In einigen Fällen stimulierten Peptide eine Antwort sowohl immunisierter als auch nichtimmunisierter Individuen. Die Antwort der nichtimmunisierten Individuen mag einer vorangehenden asymptomatischen Infektion zuzuordnen sein.
Im Falle des T-Zellen-Epitops, identifiziert als Bereich 176-185, wurde Verstärkung der T-Zellenantwort nach Zugabe des monoklonalen Antikörpers MN5C11G (P1.16) beobachtet. Kurz gesagt, PBL wurde in vitro einem synthetischen Peptid, enthalten in dem Bereich 175-185, exponiert oder mit diesem Peptid in verschiedenen Verdünnungen von MN5C11G vermischt. Wie in Tabelle 10 dargestellt, wurde Verstärkung der T-Zellenantwort beobachtet, nach der Zugabe von MN5C11G, was ausweist, daß monoklonaler Antikörper ein B-Zellen-Epitop innerhalb des Bereiches 176-185 erkannte und die Präsentation des Peptids zu dem Immunsystem erleichtert. Somit wurde dargestellt, daß die T- und B-Zellen-Epitope entweder übereinstimmend waren oder bei angrenzenden Sequenzen innerhalb des Klasse 1 OMP gefunden wurden.
In verschiedenen Fällen wurden T-Zellinien und Klone hergestellt von Individuen, die verschiedene Peptide ansprechen. Kurz gesagt, T-Zellinien wurden erhalten durch Züchten isolierter Lymphozyten in 24-Vertiefungsplatten bei 1 · 10&sup6;-Zellen/ml. Das Kulturmedium, ergänzt mit RPMI-1640, mit 10% Humanserum, enthielt auch 12 U/ml rekombinantes IL-2 (Boehringer). Zusätzlich 5 x 10&sup4; homologe, bestrahlte (3000 R), Antigen-präsentierende Zellen (APC) wurden ebenfalls zu jeder Vertiefung gegeben. In einigen Fällen wurde APC aus HLA-kompatiblen Donoren erhalten. Aus den Linien wurden T-Zellenklone durch begrenzte Verdünnung bei einer Häufigkeit von 0,5 Zellen/Vertiefung isoliert. Klone wurden durch zweiwöchige Stimulierung mit Antigen in Gegenwart von bestrahltem APC und IL-2 (2 U/ml) gehalten. Klone wurden durch Lymphozytenvermehrungsassay im wesentlichen, wie vorstehend beschrieben, geprüft, mit der Abweichung, daß die Klone bei 1 · 10&sup4; Zellen/Vertiefung in Gegenwart von bestrahltem APC gezüchtet wurden.
Wie beschrieben erhaltene Klone wurden in vitro OMP von 7 verschiedenen Stämmen von Meningokokken exponiert. Wie in Tabelle 11 dargestellt, erkannten die Klone ein T-Zellen-Epitop oder Epitope, die 7 OMP, die geprüft wurden, gemeinsam waren. Obwohl die Reaktivität der Klone für verschiedene Peptide noch zu bestimmen verblieb, weisen die Daten trotzdem die Gemeinsamkeit von T- Zellen-Epitopen unter den verschiedenen Stämmen aus. Nachdem nun diese Klone dargestellt und identifiziert wurden, wird ihre Peptidreaktivität T-Zellen-Epitope für Impfstoffverwendung anzeigen. Tabelle 6 Analysesequenz von N. meningitidis P1.16 OMP zur Präsenz von amphipathischen α-Helices gemäß dem Verfahren von Margalit et al. (J. Immunol. 138: 2213, 1987) Tabelle 7 Vorliegen von Motiven (unterstrichene Bereiche), die potentielle T- Zellenepitope innerhalb der Sequenzen von N. Meningitidis P1.16 OMP darstellen, bestimmt nach dem Verfahren von Rothbard und Taylor (EMBO J. 7: 93, 1988) Tabelle 8 Zusammenfassung der vorausgesagten T-Zellen- Epitope, die synthetisiert wurden Tabelle 9 Zusammenfassung der Lymphozytenantworten für synthetische Meningokokkenpeptide in HLA-Probanden.
Die Antwort wurde wie folgt bewertet: -, SI < 2; ±, 2 < SI < 3 und +, SI > 3.
Tabelle 10
Präsentation eines synthetischen Peptids zu peripheren Blutlymphozyten, verstärkt durch einen monoklonalen Antikörper erkennenden Bereich: 179-184 von Meningokokken Klasse 1
* unterstrichener Bereich weist Sequenz, erkannt durch den monoklonalen Antikörper MN5C11G, aus. Tabelle 11 Erkennung von OMP von verschiedenen Meningokokkenstämmen durch Human-T-Zellen-Klone

Beispiel 17

Konstruktion eines Proteinmodells für Membrantopologie von Klasse 1 OMP und Vergleich von anderen pathogenen gramnegativen Porinproteinen für die Impfstoffentwicklung

Ein Modell unter Verwendung der für die Struktur verschiedene Escherichia coli Außenmembranproteine erkannten Prinzipien (Vogel, H. et al. (1986) supra Ferenci, T. et al. (1988) supra, und Tommassen, J. (1988) supra) wurde konstruiert. Die erstrangige Annahme ist, daß Proteinsequenzen die Außenmembranform überspannen β-Faltblätter bilden. Insbesondere im Fall von Klasse 1 Protein wurde die Unterteilung in exponierte und Transmembransegmente in folgender Weise erreicht:
1. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von Klasse 1 Protein (Subtyp P1.16) mit jenen von gonococcalen PIA- und PIB- Proteinen (Carbonetti, N. H. et al. (1987) PNAS 84: 9084; Carbonetti, N. H. et al. (1988) PNAS 85: 6841 und Gotschlich, E. C. et al. (1987) PNAS 84: 8135) zeigt 34% Identität. In dem Modell bilden variable Sequenzen die oberflächenexponierten Teile, wohingegen die konservierten Bereiche häufig in der Außenmembran und dem Periplasma angeordnet sind. Die letzteren 2 Bereiche bestehen somit für 58% aus Resten, die unter den gesamten Proteinen konserviert sind.
2. Die hydrophilen Maxima, beobachtet in einem hydropathischen Profil (Kyte, J. et al. (1982) J. Mol. Biol. 157: 105) entsprechend den exponierten Bereichen.
3. Die Transmembransegmente sollten vorzugsweise in der Lage sein, amphipathische β-Stränge von 9 bis 12 Resten zu bilden, mit mindestens einer Seite, die im wesentlichen vollständig aus hydrophoben Resten besteht. Diese Bedingungen werden bei 12 der 16 Membran umspannenden Segmente getroffen.
4. Die Zahl der Reste an der periplasmatischen Seite ist minimiert.
Fig. 11 zeigt das Modell der Faltung von Klasse 1 Protein in der Außenmembran. Die Sequenz ist für Subtyp P1.16 angegeben. Der obere Teil der Figur zeigt die oberflächenexponierten Bereiche, während der mittlere Teil die angenommenen Transmembransegmente zeigt, deren Länge einige Zehn ausmacht. Aminosäuren werden alternierend dargestellt, wenn sie einen amphipathischen β-Strang bilden. Dieses Modell enthält 8 Oberflächenschleifen, wobei die erste und die vierte Schleife die artspezifischen und schutzvariablen Bereichsepitope enthalten. Diese Epitope, wie gezeigt, können bei Formulierung zu einem Impfstoff eine Schutzimmunantwort hervorrufen. Schleife 5 ist konstant und wurde als kreuzreaktive Antikörper bei anderen OMP hervorrufend gezeigt und ist für Impfstofformulierungen geeignet.
Die ein oder zwei variablen Epitopbereiche der individuellen Proteine sind auf sogenannten Oberflächenschleifen dieser Membranproteine angeordnet. Solche Porinaußenmembranproteine enthalten mehr als zwei Oberflächenschleifen. Dies impliziert, daß es Oberflächenschleifen gibt, die eine nahezu identische Aminosäuresequenz auch in den unterschiedlichen Klasse-1-Außenmembranproteinen enthalten. Dies öffnet auch den Weg zur Verwendung von gemeinsamen Peptiden des Klasse-1-Außenmembranproteins für Impfzwecke. Insbesondere ist in Fig. 11 ein schematisches zwei dimensionales Modell von Meningokokken Klasse 1 Außenmembranprotein P1,16 erläutert. Dieses Modell enthält Oberflächenschleifen, wobei die erste und die vierte Schleife die artspezifischen Epitope, wie auf der Basis der Stammsubtypisierungsergebnisse gezeigt, enthalten. Die fünfte Oberflächenschleife repräsentiert den konstanten Bereich wie vorstehend beschrieben. Antikörper gegen den konstanten Bereich von Schleife 5 scheinen mit N. meningitidis OMP-Komplex zu reagieren. Die Aminosäuresequenz von OMP der Klasse 1, wie abgeleitet, wurde mit dem Klasse OMP von N, meningitidis (Murakami, K. et al., (1989), Infect. Immun., 57: 231ß) und mit Porin PIA und PIB-Proteinen von N. gonorrhoeae verglichen. Mit ähnlichen Ergebnissen für das Klasse-1-OMP-Modeling verwendet, wurden die Sequenzen wie nachstehend zusammengestellt: Schleife 1 Schleife 2 Schleife 3 Schleife 4
Sahleife 5 Schleife 6 Schleife 7 Schleife 8
Strukturelle Ähnlichkeiten werden bei Transmembran- und Oberflächenschleifenbereichen festgestellt. Mit der nun für Klasse-1-OMP verfügbaren Information und der Information auf der Basis der Oberflächenschleifengröße, sind Lokalisierung, Intraspe zies-Aminosäurehomologle oder -heterologie der Schleifenbereiche des bestimmten Porinproteins, Voraussagen von Epitopen für den Einsatz in Impfstoffen für andere pathogene gramnegative Bakterien, einschließlich N. gonorrhoeae, möglich. Unter Verwendung derselben für Klasse-1-OMP angewendeten Verfahren können diese Epitope für Impfzwecke bewertet werden.

Hinterlegung der Mikroorganismen

Der N. meningitidis-Stamm H4476 (B:15:P1.7,16) wurde am 11. Dezember 1989 im Centraal Bureau voor Schimmelculturen (CBS), Baarn, Niederlande, hinterlegt mit der Hinterlegungs-Nr. CBS 635.89. Der N. meningitidis Klasse 2/3 OMP-Mangelmutantenstamm HIII-5 wurde am 11. Dezember 1989 beim CBS, Baarn, Niederlande, Hinterlegungs-Nr. CBS 636.89 hinterlegt.

Äquivalente

Der Fachmann wird erkennen oder in der Lage sein, unter Anwendung von üblichen Experimenten zahlreiche Äquivalente der speziellen Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung zu bestimmen. Solche Äquivalente sind als durch die nachstehenden Ansprüche eingeschlossen anzusehen.

Claims

1. Impfstoff gegen eine Erkrankung an Meningokokken, umfassend eine wirksame Menge einer Außenmembranvesikel, isoliert aus einem gentechnisch hergestellten oder mutanten Meningokokkenstamm, wobei die Vesikel umfaßt: mindestens 1 Klasse 1 Außenmembranprotein, Fragment davon oder Oligopeptid, das ein Epitop davon enthält, von Meningokokken, wobei das Protein, Fragment davon oder Oligopeptid in der Lage ist, eine bakterizide Immunantwort in einem Wirt auszulösen und kein Klasse 2/3 Außenmembranprotein von Meningokokken umfaßt, und wobei das Außenmembranprotein der Meningokokken der Klasse I von einem mutanten Meningokokkenstamm herrührt, der sich hinsichtlich einem Außenmembranprotein der Masse 2/3 negativ verhält.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Klasse I Außenmembranprotein der Meningokokken abgeleitet ist von einem Meningococcus der Gruppe A, B, C, W-135 oder Y.

3. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das von Meningokokken stammende Klasse I Außenmembranproteinfragment erhalten wird durch a) Bromcyanbehandlung eines Außenmembranproteins der Klasse I oder b) Proteolyse mit einem Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus endoLys-C, endo-Arg-C, endoGlu-C und Staphylococcus-V8- Protease.

4. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Oligopeptid umfaßt a) mindestens einen bakteriziden Antikörper, der an ein Epitop von Klasse I Außenmembranproteinen von Meningokokken bindet oder b) mindestens eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP und HYTRQNNTDVF.

5. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Epitop in den Oberfläenscheifen von Klasse I Außenmembranproteinen von Meningokokken im Bereich der Aminosäuren 24 bis 34 und 176 bis 187 angeordnet ist.

6. Im wesentlichen gereinigtes Fragment von Klasse I Außenmembranprotein von Neisseria meningitidis, wobei das Fragment ein Molekulargewicht von etwa 25 kDa oder weniger aufweist und kontinuierliche oder diskontinuierliche Epitope enthält, die mit bakteriziden Antikörpern gegen N. meningitidis reaktiv sind, wobei die Epitope in den Oberflächenschleifen von Klasse I Außenmembranproteinen von Meningokokken im Bereich der Aminosäuren 24 bis 34 und 176 bis 187 angeordnet sind.

7. Fragment nach Anspruch 6, wobei das Außenmembranprotein dex Klasse I vom Subtyp P1.7.16. ist.

8. Im wesentlichen gereinigtes Oligopeptid nach Anspruch 6, enthaltend ein B- Zellenepitop eines Außenmembranproteins der Klasse I, das in der Aminosäuresequenz unter verschiedenen Porinproteinen von Meniagokokken variiert.

9. Oligopeptid nach Anspruch 8, enthaltend mindestens eine der Aminosäuresequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANG- GASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP und HYTRQNNTDVF.

10. Im wesentlichen gereinigtes Oligopeptid nach Anspruch 6, enthaltend ein B- Zellen- oder T-Zellenepitop eines Außenmembranproteins der Klasse I, das in der Anünosäuresequenz unter verschiedenen Porinproteinen von Meningokokken konserviert ist.

11. Im wesentlichen gereinigtes Oligopeptid nach Anspruch 6, enthaltend ein T- Zellenepitop eines Klasse I Außenmembranproteins von Meningokokken.

12. Isolierte Nucleinsäure, die für ein OMP-Protein der Klasse I in voller Länge kodiert, wie im folgenden gezeigt:

oder

13. Isoliertes Oligonucleotid, das für ein Epitop, angeordnet in den Oberflächenschleifen von Klasse I Außenmembranproteinen von Meningokokken in den Bereichen der Aminosäuren 24 bis 34 und 176 bis 187, kodiert.

14. Mittel zum Hervorrufen einer Schutzimmunantwort gegen Neisseria meningitidis, umfassend a) ein Liposom, umfassend eines oder mehrere Klasse I Außenmembranproteine oder Frägmenfe davon, die von Meningokokken stammen, jedoch nicht umfassend ein Masse 2/3 Außenmembranprotein oder Fragment davon, die von Meningokokken stammen, und gegebenenfalls ein Adjuvans in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder b) ein Liposom, umfassend mindestens ein Oligopeptid, das ein kontinuierliches oder diskontinuierliches Epitop eines mit bakteriziden Antikörpern gegen N. meningitidis reaktiven Außenmembranproteins der Klasse 1 enthält, jedoch kein Epitop eines Außenmembranproteins der Masse 2/3 umfaßt, und gegebenenfalls ein Adjuvans in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei das Klasse 1 Außenmembranprotein eine der zwei unten gezeigten Sequenzen hat:

15. Antigenes Konjugat, umfassend ein Trägerprotein oder Epitop davon, woran ein Fragment eines Klasse I Außenmembranproteins von Meningokokken mit einem Molekulargewicht von 25 kd oder weniger, enthaltend ein Epitop ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP und HYTRQNNTDVF, konjugiert ist, mit der Maßgabe, daß das Trägerprotein keine β- Galactosidase ist.

16. Antigenes Konjugat nach Anspruch 15, wobei das Antigenträgerprotein ein bakterielles Toxin; GRM oder ein Epitop davon ist.

17. Genfusionspeptid oder -protein, umfassend ein Trägerprotein, Peptid oder Epitop davon, an das ein Fragment eines Klasse I Außenmembranproteins von Meningokokken mit einem Molekulargewicht von 25 kd oder weniger, enthaltend ein Epitop ausgewählt ist aus dez Gruppe, bestehend aus QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP und HYTRQNNTDVF, fusioniert ist, mit der Maßgabe, daß das Trägerprotein keine β~Galactosidase ist.

18. Fusionsprotein, umfassend ein Flagellinprotein mit einer Aminosäuresequenz für ein Epitop eines Masse I Außenmembranproteins von Meningokokken darin inseriert.

19. Fusionsprotein nach Anspruch 18, wobei die Aminosäuresequenz a) in das Fla gellinproteim oei einem berelen, ocr ment wesentucn ist rar ute Funktion des Flagellinproteins, inseriert ist oder b) in den hypervariablen Bereich des Flagellinproteins inseriert ist.

20. Fusionsprotein nach Anspruch 18, zusätzlich umfassend ein Meningokokken- Kapseloligo- oder -polysaccharid daran konjugiert.

21. Rekombinantes Gen, für ein Fusionsprotein nach Anspruch 17 kodierend.

22. Rekombinanter Mikroorganismus, befähigt ein Fragment eines Außenmembranproteins der Klasse I von Neisseria meningitidis zu exprimieren, das ein Molekulargewicht von 25 kDa oder weniger aufweist und das ein kontinuierliches oder diskontinuierliches Epitop enthält, reaktiv mit OMP-spezifischen Antikörpern der Klasse I gegen N. meningitidis.

23. Mikroorganismus nach Anspruch 22, wobei das Epitop ausgegwählt ist aus der Gruppe, bestehend aus QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP und HYTRQNNTDVF.

24. Mikroorganismus nach Anspruch 22, der ein Pockenvirus, Adenovirus, Cytomegalovirus oder ein Bakterium der Gattung Salmonella ist.

25. Mikroorganismus nach Anspruch 22, wobei das Epitop des Klasse I Außenmembranproteins von Meningokokken als ein rekombinantes Flagellin exprimiert wird.

26. Mutanter Meningokokkenstamm, unfähig Außenmembranprotein der Klasse 2 und 3 zu erzeugen.

27. Mutanter Meningokokkenstamm HIIIS, CBS 636.89, unfähig Außenmembranprotein der Klasse 2 und Klasse 3 zu erzeugen.

28. Gentechnisch hergestellter Neisseria-Stamm, negativ für Außenmembranproteine der Masse 2/3 und befähigt, em intaKtes AulSenmembranprotem der Klasse 1 von Neisseria meningitidis, ein genetisches Fusionsprotein davon oder ein kontinuierliches oder diskontinuierliches Epitop, das mit Klasse 1 OMP-spezifischen Antikörpern gegen N. meningitidis reaktiv ist, zu exprimieren.

29. Gentechnisch hergestellter Mikroorganisiius, bestehend aus einem Neisseria- Stamm, befähigt zur Expression mehr als eines Außenmembranproteins der Klasse 1 von Neisseria meningitidis, wobei jedes Protein einzeln mindestens ein kontinuierliches oder diskontinuierliches Epitop, reaktiv mit OMP-spezifischen Antikörpern der Klasse I gegen N. meningitidis, umfaßt.

30. Impfstoff nach Anspruch 1, zusätzlich eine Mehrzahl von Außenmembranproteinen nach Anspruch 1 umfassend.

31. Impfstoff nach Anspruch 1, zusätzlich eine Mehrzahl von Klasse 1 Außenrnembranproteinfragmenten oder Oligopeptiden, die ein Epitop davon enthalten, von Meningokokken enthaltend.

32. Verfahren zur Expression mindestens eines Klasse I Außenmembranproteins von Meningokokken, befähigt zum Auslösen einer bakteriziden Immunantwort in einem Wirt, umfassend Insertieren mindestens eines Gens, das für ein Klasse I Außenmembranprotein von Meningokokken kodiert, in einen rekombinanten Mikroorganismus, ausgewählt aus a) einem mutanten Meningokokkenstamm, der für Außenmembranprotein der Klasse 2/3 negativ ist, oder b) einen Meningococcus der CJruppe A, B, C, W-135 oder Y, wobei der Mikroorganismus befähigt ist zur Expression des Gens als intaktes Protein, das befähigt ist, eine bakterizide Immunantwort in einem Wirt auszulösen.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei der Mikroorganismus ein Neisseria-Stamm ist.

34. Verfahren nach Anspruch 32, wobei der Meningokokkenstamm mehr als ein Klasse I Außenmembranprotein von Meningokokken exprimiert.

35. Gentechnisch hergestellter Neisseria-Stamm, befähigt zur Expression eines nichtnativen, intakten Außenmembranproteins der Klasse I von Neisseria meningitidis, eines genetischen Fusionsproteins davon oder eines kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Epitops, das mit OMP-spezifischen Klasse I Antikörpern gegen N. meningitidis reaktiv ist.

1. Verfahren zur Expression mindestens eines Klasse I Außenmembranproteins von Meningokokken, befähigt zum Auslösen einer bakteitiziden Immunantwort in einem Wirt, umfassend Insertieren mindestens eines Gens, das für ein Klasse I Außenmembranprotein von Meningokokken kodiert, in einen rekombinanten Mikroorganismus; ausgewählt aus a) einem mutanten Meningokokkenstamm, der Für Außenmembranprotein der Masse 2/3 negadv ist, oder b) einem Stamm, der ein Meningococcus der Gruppe A, B, C, W-135 oder Y ist, wobei der Mikroorganismus befähigt ist zur Expression des Gens als intaktes Protein, das befähigt ist, eine bakterizide Immunantwort in einem Wirt auszulösen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus ein Neisseria-Stamm ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der mutante Meningokokkenstamm, der unfähig ist zur Herstellung von Außenmembranprotein der Klasse 2 und 3, ein mutanter Meningokokkenstamm HIII5, CBS 636.89 ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das inserierte Gen für ein Außenmembran- I protein der Klasse F in voller Länge kodiert.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Meningokokkenstamm mehr als ein Klasse I Außenmembranprotein von Meningokokken exprimiert.

6. Verfahren zur Herstellung eines Fragments eines Masse I Außenmembranproteins von Meningokokken, befähigt zum Auslösen einer bakteriziden Immunantwort in einem Wirt, umfassend a) Behandeln eines Außenmembranproteins der Klasse I mit Bromcyan oder b) proteolytisches Abdauen eines Außenmembranproteins der Klasse I mit einem Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus endoLys-C, endo-Arg-C, endoGlu-C und Staphylococcus-V8-Protease, oder c) Gewinnen einer DNA-Sequenz, die für das ge wünschte Fragment kodiert, und Einführen derselben in ein geeigentes Vektor-/Wirts- Expressionssystem.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das erhaltene Fragment ein im wesentlichen gereinigtes Fragment eines Klasse I Außenrnembranproteins von Meningokokken von Neisseria meningitidis ist, wobei das Fragment ein Molekulargewicht von etwa 25 kD oder weniger aufweist und kontinuierliche oder dishontinuiefliche Epitope enthält, die mit bakteriziden Antikörpern gegen N. meningitidis reaktiv sind, wobei die Epitope in den Oberflächenschleifen von Klasse I Außenmembranproteinen von Meningokokken in dem Bereich der Aminosäuren 24 bis 34 und 176 bis 187 angeordnet sind.

8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Klasse I Außenmembranprotein der Meningokokken vom Subtyp P1.7.16 ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das erhaltene Fragment mindestens eine der Aminosäuresequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP und HYTRQNNTDVF, enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der rekombinante Mikroorganismus, der zur Expression des Fragmentes in der Lage ist, ein Pockenvirus, Adenovirus, Cytomegalovirus oder ein Bakterium der Gattung Salmonella ist.

11. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das erhaltene Fragment zusätzlich ein B- Zellenepitop eines Außenmembranproteins der Klasse I enthält, das in der Aminosäuresequenz unter verschiedenen Meningokokken Porinproteinen variiert.

12. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das erhaltene Fragment zusätzlich ein B- Zellen- oder T-Zellenepitop eines Außenmembranproteins der Klasse I enthält, das in der Aminosäuresequenz unter verschiedenen Meningokokken-Porinproteinen konserviert ist.

13 Verfahren nach Anspruch 6, wobei das erhaltene Fragment zusätzlich ein T- Zellenepitop eines Klasse I Außenmembranproteins von Meningokokken enthält.

14. Verfahren zur Herstellung eines Oligopeptids, enthaltend ein Epitop eines Klasse I Außenmembranproteins von Meningokokken, das befähigt ist zum Auslösen einer bakteriziden Immunantwort in einem Wirt, umfassend

a) proteolytisches Abdauen

i) eines Membranproteins der Klasse I oder

ü) eines Fragments, abgeleitet von der Aufspaltung eines Außenmembranproteins der Klasse I mit Bromcyan,

mit einem Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus endoLys-C, endo-Arg- C, endoGlu-C und Staphylococcus-V8-Protease; oder alternativ,

b) seine chemische Synthese durch übliche Festphasen-Peptidsynthese, Pepscansynthese oder Standard-Flüssigpeptidsynthese; oder alternativ

c) Gewinnen einer DNA-Sequenz die die gewünschte Oligopeptidsequenz kodiert, und Einführen derselben in ein geeignetes Vektor-/Wirtsexpressionssystem.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Oligopeptid a) mindestens ein Epitop, das einen bakteriziden Antikörper bindet, von Klasse I Außenmembranproteinen von Meningokokken oder b) mindestens eine Aminosäuresequenz umfaßt; ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL; YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP und HYTRQNNTDVF.

16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Epitop in den Oberflächenschleifen von Klasse I Außenmembranproteinen von Meningokokken in den Bereichen der Aminosäuren 24 bis 34 und 176 bis 187 angeordnet ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 6 oder 14, wobei das Außenmembranprotein der Klasse I, das Fragment davon oder das erhaltene Oligopeptid, außerdem gemischt, konjugiert oder fusioniert ist an Trägerpeptide oder Proteine, an andere Antigene von N. meningitidis oder Antigene von anderen Mikroorganismen durch chemische oder genetische Kupplungstechniken.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Außenmembranprotein der Klasse I, das Fragment davon oder das erhaltene Oligopeptid an ein Trägerprotein oder Epitop davon konjugiert ist, mit der Maßgabe, daß das Trägerprotein nicht β-Galactosidase ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Trägerprotein ein bakterielles Toxin, CRM oder ein Epitop davon ist.

20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Außenmembranprotein der Klasse I, das Fragment davon oder das erhaltene Oligopeptid a) über chemische Kupplung an ein T- Zellenepitop konjugiert ist oder b) ein Polysaccharid von Meningokokken A, B, C, W-135 und Y enthält, in Konjugatform mit dem Proteinprodukt.

21. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Außenmembranprotein der Klasse I, das Fragment davon oder das erhaltene Oligopeptid an ein Trägerprotein, Peptid oder Epitop davon fusioniert ist, mit der Maßgabe, daß das Trägerprotein nicht β-Galactosidase ist.

22. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins, umfassend ein Flagellinprotein mit einer Aminosäuresequenz für ein Epitop eines Klasse I Außenmembranproteins von Meningokokken darin inseriert, umfassend Expression eines rekombinanten Gens, das eine geeignet inserierte DNA-Sequenz enthält, die für ein Epitop eines Klasse I Außenmembranprotems von Meningokokken innerhalb des Gens, das für Flagellin kodiert.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das erhaltene Fusionsprotein die Aminosäuresequenz für ein Epitop eines Klasse I Außenmembranproteins von Meningokokken innerhalb des Flagellinproteins enthält (a) bei einem Bereich, der nicht wesentlich ist für die Funktion des Flagellinproteins, oder (b) in einem hypervariablen Bereich des Flagellinproteins.

24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das erhaltene Fusionsprotein zusätzlich ein Kapseloligo- oder -poiysaccharid von Menmgokokken, daran konjugiert, enthält.

25. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Meningokokken- Erkrankungen, umfassend Vermischen einer wirksamen Menge einer Außenmembranvesikel, isoliert aus gentechnisch hergestelltem oder mutantem Meningokokkenstamm, wobei die Vesikel umfaßt: mindestens ein Klasse I Außeiiirfembranprotein von Meningokokken, ein Fragment davon oder ein Oligopeptid, das ein Epitop davon enthält, wobei das Protein, Fragment davon oder Oligonucleotid in der Lage ist, eine bakterizide Immunantwort in einem Wirt auszulösen, und kein Klasse 2/3 Außenmembranprotein von Meningokokken umfaßt, mit einem geeigneten Adjuvans; wobei das Klasse I Außenmembranprotein von Meningokokken von einem mutanten Meningokokkenstamm stammt, der für Außenmembranprötein dei Klasse 2/3 negativ ist.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Impfstoff eine Vielzahl von Außenmembranproteinen der Klasse I umfaßt.

27. Verfahren nach Anspruch 25, wobei der erhaltene Impfstoff eine Vielzahl von Klasse I Außenmernbranproteinen, Fragmenten oder Öligopeptiden, die ein Epitog davon enthalten, von Meningokokken umfaßt.