JP2012165764A

JP2012165764A - 細胞を培養する改善された方法

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Publication number: JP2012165764A
Application number: JP2012133156A
Authority: JP
Inventors: Gerben Meile Zijlstra; ヘルベン，メイルジールストラ，; Robert Patrick Hof; ロベルト，パトリックホフ，; Jacob Schilder; ヤコブシルダー，
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2006-07-14
Filing date: 2012-06-12
Publication date: 2012-09-06
Anticipated expiration: 2027-07-04
Also published as: SI2634242T1; HUE032608T2; JP2009543565A; TW201604277A; JP5448010B2; US8222001B2; IL234890A; TWI627274B; SI2634250T1; AU2007272054C1; TW200813216A; PT2041259E; KR20130014640A; FI2343362T4; EP2343362B1; ES2579957T3; AU2007272054B2; CN102876628A; AR062072A1; JP2011067222A

Abstract

【課題】生物学的物質を細胞培養からより高濃度で得ることが可能な、真核細胞を培養する方法、並びに、細胞培養及び生体物質生産が長期間にわたってできるような、真核細胞を培養する方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、少なくとも１つの細胞培養液成分が細胞培養物に供給され、細胞、所望の生物学的物質、および細胞培養液を含んでなる細胞培養物がタンジェンシャルフローで、分離システム上で循環され、分離システムが、所望の生物学的物質よりも低い分子量を有する物質から所望の生物学的物質が分離されるフィルターを有し、所望の生物学的物質が反応器内に保持されまたはその中に送り戻され、上記反応器が、撹拌タンク容器、気泡ポンプ容器、または、揺動、振盪運動若しくは撹拌によって混合できる使い捨てバッグである、反応器内で細胞培養液中の懸濁状態の真核細胞を培養する方法を提供する。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

本発明は、反応器内で細胞培養液中の懸濁状態の細胞を培養する方法に関する。

このような方法については例えば国際公開第０４／０９９３９６号パンフレットから公知である。ここでは、流加工程中で生育条件を最適化することによって、どのようにして細胞培養物の細胞密度および所望の生体物質の収率を改善できるかについて記載されている。

さらに国際公開第０５／０９５５７８号パンフレットでは、細胞培養液が細胞培養物に添加され、細胞培養物が中空繊維を含んでなるフィルターモジュール上で循環されて、細胞培養物よりも低い細胞密度を有する液体の流出がもたらされ、フィルターモジュール内の流れが交互のタンジェンシャルフローであり、細胞が生物学的物質を産生する、細胞培養液および細胞を含んでなる細胞培養物の連続灌流培養によって細胞を培養する方法が開示されている。国際公開第０５／０９５５７８号パンフレットの実施例では、０．９ｇ／Ｌ／日の生成物が生じることが示され、これはおよそ０．３ｇ／Ｌの流出物中の生成物濃度に相当する。

生物学的物質を含有する液体の容積が大きいほど、生物学的物質の精製はより困難となる。国際公開第０４／０９９３９６号パンフレットおよび国際公開第０５／０９５５７８号パンフレットで開示されているような方法では、得られる生物学的物質の濃度はそれほど高くない。したがってさらなる精製ステップを適用する前に生物学的物質を濃縮させる必要があり、またはより大きな容積のより濃度が低い生物学的物質を精製しなくてはならないので、この生物学的物質の後処理プロセスは面倒である。さらにより低い細胞密度での細胞培養はより低い容積生産性をもたらし、したがってより大きなおよび／またはより多くの培養容器が必要であり、したがって所与の生産レベルに対してより高い設備投資が必要である。

したがって生成物を細胞培養からより高濃度で得る方法を提供することが、本発明の目的である。

本発明のさらなる目的は、細胞培養および生体物質生産が長期間にわたってできるようにすることである。

これらの目的は、細胞が生物学的物質を産生し、少なくとも１つの細胞培養液成分が細胞培養物に供給され、生物学的物質および細胞培養液を含んでなる細胞培養物が分離システム上で循環され、分離システムが生物学的物質よりも低い分子量を有する物質から生物学的物質を分離して、生物学的物質が反応器内に保持されまたはその中に送り戻される、反応器内で細胞培養液中の懸濁状態の細胞を培養する方法によって達成される。

例えば本発明は、細胞が生物学的物質を産生し、栄養素および／または細胞培養液が反応器に供給され、細胞および細胞培養液を含んでなる細胞培養物が５〜５００ｋＤの間の孔径または分画分子量を有するフィルター上で循環される、反応器内で細胞培養液中の細胞を培養する方法に関する。

生物学的物質よりも低い分子量を有する物質から生物学的物質を分離する分離システムを使用することで、細胞培養物中に生物学的物質をより高い濃度で蓄積できることが分かった。

したがって本発明は、先行技術で記載されている、細胞集団と共に所望の生体物質を蓄積させる細胞培養とは異なる。

本発明の好ましい実施態様では、より低い分子量の物質の一部が細胞培養物から連続的に除去される。

本発明の方法の追加的利点は、例えばバッチまたは流加法と比較して、より高い生存細胞密度を達成できることである。さらに例えばバッチまたは流加法と比較して、生産時間、すなわちその間に細胞が生物学的物質を産生する期間を延長できる。またバッチまたは流加法と比較して、より小型の反応器を使用することができる。より小型の反応器の使用は、装置および設備関連投資を低減させるので有利である。

またより高濃度の生物学的物質をより短時間で得られるかもしれない。

細胞生存度を急激に減少させることなく、したがって生産時間を制限することなしに、反応器内に高濃度の生物学的物質を得ることができることが分かった。当業者は生成物阻害、すなわち生物学的物質それ自体による生物学的物質の生成阻害、または細胞によって生成されるその他の高分子（例えば宿主細胞タンパク質、酵素または細胞残骸など）による阻害が起こり得ることを予期したであろう。さらに所望の生体物質の蓄積は、分離システムの機能を損なわないことが分かった。

本発明の方法は、国際公開第０５／０９５５７８号パンフレットおよび国際公開第０４／０９９３９６号パンフレットに従った方法と比較して、細胞密度、細胞培養物中の生成物濃度、および延長された培養期間の観点からかなりの利点を提供する。その結果、本方法は、所望の生体物質の改善された生成をもたらす。

生物学的物質を生成するのに使用できる細胞は、原則として、生物学的生成物を生成する能力を有する、当業者に知られている全ての細胞である。細胞は、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）などの糸状菌と、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クリヴェロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｌａｃｔｉｓ）、ファフィア・ロドチマ（Ｐｈａｆｆｉａｒｈｏｄｏｚｙｍａ）などの酵母と、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属からの酵母などの真核生物、または例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、例えばＢ．リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）などのバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種と、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などの原核生物であってもよい。真核細胞の例についてはまた、例えばＣｈｕ，Ｌ．、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．（２００１年）Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎ．、第１２巻、１８０〜１８７頁でも記載されている。好ましくは本発明の方法で使用される細胞は、動物細胞、特に哺乳類細胞である。哺乳類細胞の例としては、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞と、ハイブリドーマと、ＢＨＫ（幼若ハムスター腎臓）細胞と、骨髄腫細胞と、例えばＨＥＫ−２９３細胞、ヒトリンパ芽球腫細胞、Ｅ１不死化ＨＥＲ細胞などのヒト細胞と、例えばＮＳ０細胞などのマウス細胞とが挙げられる。より好ましくはＥ１不死化ＨＥＲ細胞、最も好ましくはＰＥＲ．Ｃ６細胞が使用される。

初代ヒト胚性網膜（ＨＥＲ）細胞は、胎児から単離できる（ＢｙｒｄＰ、Ｂｒｏｗｎ
ＫＷ、ＧａｌｌｉｍｏｒｅＰＨ、１９８２年、「クローン化アデノウィルス１２ＤＮＡによるヒト胚網膜芽細胞の悪性形質転換（Ｍａｌｉｇｎａｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｓｂｙｃｌｏｎｅｄａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ１２ＤＮＡ）」Ｎａｔｕｒｅ２９８：６９〜７１頁；ＢｙｒｄＰＪ、ＧｒａｎｄＲＪＡ、ＧａｌｌｉｍｏｒｅＰＨ、１９８８年、「アデノウィルスＥ１領域とＥ１Ａ＋ｒａｓの組み合わせとによる初代ヒト胚網膜細胞の異なる形質転換（ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍａｒｙｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｒｅｔｉｎａｌｃｅｌｌｓｂｙａｄｅｎｏｖｉｒｕｓＥ１ｒｅｇｉｏｎｓａｎｄｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｏｆＥ１Ａ
＋ｒａｓ）」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２：４７７〜４８４頁）。初代細胞は、数代にわたり継代培養すると死滅する。本発明の目的のためのＥ１−不死化ＨＥＲ細胞は、アデノウィルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質をコードするＤＮＡをその中で発現させて初代ＨＥＲ細胞から誘導することにより、不死化細胞が得られる。このような不死化細胞は、１００代以上の継代培養ができる。Ｅ１−不死化ＨＥＲ細胞を得るための方法については、例えば次で記載されている。米国特許第５，９９４，１２８号明細書、ＢｙｒｄＰ、ＢｒｏｗｎＫＷ、ＧａｌｌｉｍｏｒｅＰＨ、１９８２年、「クローン化アデノウィルス１２ＤＮＡによるヒト胚網膜芽細胞の悪性形質転換（Ｍａｌｉｇｎａｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｓｂｙｃｌｏｎｅｄａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ１２ＤＮＡ）」Ｎａｔｕｒｅ２９８：６９〜７１頁；ＢｙｒｄＰＪ、ＧｒａｎｄＲＪＡ、ＧａｌｌｉｍｏｒｅＰＨ、１９８８年、「アデノウィルスＥ１領域とＥ１Ａ＋ｒａｓの組み合わせとによる初代ヒト胚網膜細胞の異なる形質転換（ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍａｒｙｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｒｅｔｉｎａｌｃｅｌｌｓｂｙａｄｅｎｏｖｉｒｕｓＥ１ｒｅｇｉｏｎｓａｎｄｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｏｆＥ１Ａ＋ｒａｓ）」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２：４７７〜４８４頁；およびＧａｌｌｉｍｏｒｅ，Ｐ．Ｈ．、Ｇｒａｎｄ，Ｒ．Ｊ．Ａ．、およびＢｙｒｄ，Ｐ．Ｊ．（１９８６年）「シミアンウイルス４０、アデノウィルス、およびｒａｓ発癌遺伝子によるヒト胚網膜芽細胞の形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｓｗｉｔｈｓｉｍｉａｎｖｉｒｕｓ４０，ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓａｎｄｒａｓｏｎｃｏｇｅｎｅｓ）」ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒＲｅｓ．６、４９９〜５０８頁。例えばＰＥＲ．Ｃ１、ＰＥＲ．Ｃ３、ＰＥＲ．Ｃ４、ＰＥＲ．Ｃ５、ＰＥＲ．Ｃ６、ＰＥＲ．Ｃ８、およびＰＥＲ．Ｃ９細胞をはじめとする不死化ＨＥＲ細胞が、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（「ＰＧＫ」）プロモーターの制御下にあるアデノウィルス血清型５（Ａｄ５）Ｅ１Ａ−およびＥ１Ｂ−コード配列（Ａｄ５ヌクレオチド４５９〜３５１０）を含有するプラスミドを使用した、初代ＨＥＲ細胞の形質移入によって作り出された（米国特許第５，９９４，１２８号明細書参照）。

好ましい実施態様では、本発明の方法の細胞はＥ１−不死化ＨＥＲ細胞、より好ましくはＰＥＲ．Ｃ６細胞である（米国特許第５，９９４，１２８号明細書参照）。ＰＥＲ．Ｃ６細胞はＥＣＡＣＣ番号９６０２２９４０の下に寄託された細胞によって例示される（例えば米国特許第５，９９４，１２８号明細書、欧州特許第０８３３９３４Ｂ１号明細書参照）。

本発明の方法では、細胞は、例えば固定化細胞、単細胞としてまたは細胞クラスター内でまたはその組み合わせとしてなどの、あらゆる形態で懸濁状態で培養してもよい。好ましくは細胞は、単細胞としておよび／または細胞１００個以下の、より好ましくは細胞２０個以下の小型細胞集合クラスターとして培養される。細胞は、例えばＧＥヘルスケア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）から市販されるサイトデックス（Ｃｙｔｏｄｅｘ）などのマイクロキャリア上に固定化できる。

ここで定義される反応器は細胞培養物を含んでなるシステムであり、次にその細胞培養物は細胞および細胞培養液を含んでなる。それは好ましくはエアフィルターなどの無菌バリアを提供して、その他の細胞が所望の細胞を汚染するのを防ぎ、それは好ましくは混合、温度、ｐＨ、酸素濃度などの適切な培養条件を提供することで、細胞のための好ましい環境を維持する。

反応器は、例えばより恒久的な性質であることができ、例えば反応器はステンレス鋼またはガラスであることができ、または例えば使い捨ての性質であることができ、例えば反応器はプラスチックフラスコまたはバッグであることができる。本発明で使用するのに適した反応器の例としては、限定されるものではないが、撹拌タンク容器、気泡ポンプ容器、および揺動、振盪運動または撹拌によって混合できる使い捨てバッグが挙げられる。使い捨て（生物）反応器は、所要の投資費用が比較的小さく、運転上の柔軟性が大きく、納期は短く、工程に容易に合わせられるために都合が良いので、好ましくはそれらが使用される。使い捨て（生物）反応器は、例えばハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、アプリコン（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）またはウエーブ（Ｗａｖｅ）から市販される。

「分離システム」という用語は、本発明の枠内で、分子量に基づいて分離できるシステムと定義される。本発明の方法で使用される分離システムは、生物学的物質よりも低い分子量を有する物質から、生物学的物質を分離できる。換言すれば、分画分子量（ＭＷＣＯ）が、生物学的物質の分子量より小さくなり、より好ましくは少なくとも２分の１、最も好ましくは少なくとも３分の１になるように、分画分子量が選択される。典型的に、しかし、当然ながら、本発明の方法で生成される生物学的物質の分子量次第で、分離システムのＭＷＣＯは、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも３０ｋＤａ、および好ましくは最大限で５００ｋＤａ、より好ましくは最大限で３００ｋＤａ、最も好ましくは最大限で１００ｋＤａである。例えば分子量が１５０ｋＤａのＩｇＧには、最大限で５０ｋＤａまでのＭＷＣＯを有する分離システムが最も好ましい。

分離システムの例としては、限定されるものではないが、フィルター、遠心分離、および水性二相抽出システムが挙げられる。

「フィルター」という用語は、本願明細書での用法では、サイズまたは分子量に基づいて粒子を分離する能力がある全ての装置を含むことが意図される。原則として本発明の方法では、生物学的物質よりも低い分子量を有する物質から生物学的物質が分離されるように孔径またはＭＷＣＯを選択しさえすれば、いかなるフィルターを使用してもよく、典型的にこれは５〜５００ｋＤａの間の孔径またはＭＷＣＯになる。本発明での使用に適したフィルターの例としては、薄膜フィルター、セラミックフィルター、および金属フィルターが挙げられる。フィルターはあらゆる形状で使用されてもよく、フィルターは例えばらせん巻きまたは管状であってもよく、またはシートの形態で使用されてもよい。好ましくは本発明の方法では、使用されるフィルターは薄膜フィルター、好ましくは中空繊維フィルターである。「中空繊維」と言う用語は管状膜を意味する。管の内径は少なくとも０．１ｍｍ、より好ましくは少なくとも０．５ｍｍ、最も好ましくは少なくとも０．７５ｍｍであり、および好ましくは管の内径は最大限で１０ｍｍ、より好ましくは最大限で６ｍｍ、最も好ましくは最大限で１ｍｍである。中空繊維を含んでなるフィルターモジュールは、例えばゼネラル・エレクトリック（ＧｅｎｅｒａｌＥｌｅｃｔｒｉｃ）（ＧＥ、以前はアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））から市販される。

生物学的物質、細胞、および細胞培養液を含んでなる細胞培養物を分離システム上で循環させることで、生物学的物質および細胞は反応器内に保持され、したがって液体流出物は細胞培養物よりも低い生物学的物質濃度と低い細胞密度を有する。通常、本発明の方法では液体流出物は、いかなる生物学的物質および細胞も含有しないか、またはほとんど含有しない。通常、液体流出物は、本質的に生物学的物質よりも低い分子量を有する成分のみを含有する。したがって本質的に全ての細胞および本質的に全ての生物学的物質は、通常、反応器内に保持される。

好ましくは、フィルターの孔径またはＭＷＣＯが生成物の直径または分子量よりも小さくなり、より好ましくは少なくとも２分の１、最も好ましくは少なくとも３分の１になるように、フィルターの孔径またはＭＷＣＯを選択して、生成物の高保持率を確実にする。典型的に、しかし、当然ながら、生成物、すなわち本発明の方法で生成される生物学的物質のサイズまたは分子量次第で、フィルターの孔径またはＭＷＣＯは、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも３０ｋＤａであり、および／またはフィルター／膜の孔径またはＭＷＣＯは、好ましくは最大限で５００ｋＤａ、より好ましくは最大限で３００ｋＤａ、最も好ましくは最大限で１００ｋＤａである。

分画分子量（ＭＷＣＯ）とは、それを超えると少なくとも９０％の粒子が分離システムによって保持される分子量を意味する。

例えばフィルターなどの分離システム上での細胞培養物の循環とは、例えばフィルターなどの分離システムに細胞培養物を通過させて、液体流出およびその内容物が反応器内に保持されまたはその中に送り戻される流れをもたらすことを意味する。その内容物が反応器内に保持されまたはその中に送り戻される流れは、通常本質的に、生物学的物質の分子量と少なくとも等しいかそれ以上の分子量を有する成分のみを含有し、したがって前記流れは、液体流出物よりも多くの生物学的物質を含んでなる。

原則として本発明の方法において、分離システム上で細胞培養物の循環をいつ開始するかは重要でない。細胞培養物の循環は、例えば方法の最初から直ちに、または細胞の生存細胞密度が特定レベルに達した時点で開始してもよい。

フィルター上の細胞培養物の循環は、デッドエンドフローとしても知られている、フィルター表面に対して実質的に垂直の流れであっても、または例えば一方向タンジェンシャルフロー（ＴＦＦ）またはクロスフローなどのタンジェンシャルフローとしても知られている、実質的にフィルター表面に平行な流れであってもよい。ＡＴＦでは非常に高い細胞密度であっても、フィルター目詰まりが（すぐに）起きないことが分かったので、クロスフローの好ましい例は交互のタンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）である。深層濾過では、粗い前置フィルターによって最終小孔フィルターを目詰まりから保護する必要があることが、一般常識である。この慣習は、より小さい孔のまたはより小さいＭＷＣＯのフィルターはより目詰まりしやすく、それによって生産時間が制限されるという一般常識に基づく。ＡＴＦを使用すれば前置フィルターの使用は不要になる。

流れは、細胞培養物を動かすことで、フィルターを動かすことで、または双方によって誘導してもよい。フィルターは、例えば回転（回転フィルター）または振動（振動フィルター）によって動かしてもよい。代案としては、細胞培養物のみを動かすことで流れを誘導する場合、フィルターは静止させて、細胞培養物を例えばポンプまたは圧力によって動かしてもよい。

「交互のタンジェンシャルフロー」とは、フィルター表面と同一方向（すなわち接線方向）の行ったり来たりする１つの流れがあり、そして前記フィルター表面に実質的に垂直な方向の別の流れがあることを意味する。交互のタンジェンシャルフローは（例えば米国特許第６，５４４，４２４号明細書で記載されているように）当業者に知られている方法に従って達成できる。

細胞を培養する間に、例えば１つ以上の栄養素および／または細胞培養液などの少なくとも１つの細胞培養液成分を細胞に供給してもよい。本発明に従った方法では、枯渇栄養素または栄養素群を反応器へ供給する手段によって、枯渇栄養素の少なくとも１つを部分的にまたは好ましくは全体的に補給することが有利である。例えば完全な細胞培養液を反応器に供給してもよく、これは別の供給を別個に調製する必要がないので有利である。細胞培養液はまた、例えばより濃縮された形態で細胞に供給してもよく、これはより小さな容積は取り扱いがより容易なことから有利である。また１つ以上の栄養素を反応器に供給してもよい。例えばグルコースまたはフルクトースなどの炭水化物、グルタミンなどのアミノ酸および／またはペプチドを有利に反応器に供給してもよい。

本発明の好ましい実施態様では、細胞培養条件は、細胞生育速度および／または細胞比生産性が制限されないように、より好ましくは細胞培養液の成分の少なくとも１つの濃度が本質的に一定のままであるように選択される。細胞培養条件の制限の例は、栄養素制限と、アンモニア、二酸化炭素および乳酸などの阻害性代謝産物の形成である。例えば供給などの細胞培養条件は、例えば十分な栄養素を供給することによって、枯渇を代償し、および／または乳酸またはアンモニアなどの阻害代謝産物の生成を避けて、細胞生育速度が制限されないように選択してもよい。例えば曝気条件は、二酸化炭素形成が細胞生育速度を制限しないように選択してもよい。非制限条件下で細胞を生育させることは、１）定常的細胞培養環境を提供するかもしれず、それは多くの場合定常的で良好な生成物品質もまた提供するかもしれない、２）高い細胞生存度、場合によっては９８％を超える細胞生存度をもたらすかもしれないため、優良製造規範（ＧＭＰ）の観点から極めて有利である。高い細胞生存度は、宿主細胞タンパク質などの細胞関連汚染物質の放出を低下させ、それは生成物の精製を容易にする。さらに無制限の細胞生育速度および／または無制限の比生産性で細胞を生育させることは、工程のより初期により高い細胞密度に達するため、さらに短時間でより多くの生物学的物質を生成できるという商業的利点を有する。

細胞の「比生産性」は、単位時間あたり細胞毎に生成される所与の生物学的物質の質量であり、通常ｐｇ．細胞^−１日^−１で表現される。

例えば栄養素および／または細胞培養液などの少なくとも１つの細胞培養液成分の細胞培養物への添加速度（流入速度または灌流速度）は、細胞の生存度および密度に影響する。本発明の方法では、栄養素および／または細胞培養液などの細胞培養液成分は、例えば連続流と、例えば段階的流れまたは時差的流れなどの半連続流とで供給されてもよい。好ましくは例えば栄養素および／または細胞培養液などの細胞培養液成分は、連続流で添加される。

完全な細胞培養液および／または栄養素などの細胞培養液成分は、原則として工程内のいかなる時点で反応器に供給してもよい。好ましくは供給は、グルタミンおよびグルコースなどの基質が低レベルに達して細胞生育の停止を引き起こす前に、または例えば乳酸または、アンモニアなどの阻害性代謝産物が高レベルに達して生育が停止する前に、開始される。この時点以降、栄養素および／または完全な細胞培養液などの細胞培養液成分が、好ましくは基質要求を満たすような速度で反応器に供給される。

本発明の一実施態様では、細胞培養液は、式（１）、
供給速度＝ＳＦＲ×（総細胞培養物容積）×（生存細胞密度）（１）に従った供給速度で添加され、供給速度は一日当たりリットル数で表現されて、ＳＦＲは比供給速度、すなわち単位時間あたり生存細胞毎に添加される培地の容積として表現される細胞培養液が細胞培養物に供給される速度であり、生存細胞密度は単位容積あたりの生存細胞数である。生存細胞数は、例えばトリパンブルー排除法を通じて、当業者によって判定されることができる。比供給速度は、好ましくは０．０１〜０．３ｎＬ／細胞／日の間、より好ましくは０．０１〜０．２ｎＬ／細胞／日の間で選択される。

供給速度を調節する際に、例えば培養物に供給されるグルコース量および／または酸素取り込み速度などの追加的パラメーターを考慮することが有利かもしれない。例えばＰＥＲ．Ｃ６では、細胞培養液および／または栄養素の供給速度は、好ましくはグルコース濃度が３〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの間、より好ましくは５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌの間に保たれるように選択される。好ましくはグルコース濃度は、少なくとも３ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは少なくとも５ｍｍｏｌ／Ｌ、および好ましくは最大限で２０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは最大限で１５ｍｍｏｌ／Ｌである。

本発明の特定の実施態様では、（細胞、生物学的物質、および細胞培養液を含んでなる）細胞培養物が、反応器および液体から少なくとも１回除去され、例えば細胞培養液または栄養素供給が反応器に添加されて、細胞培養物の除去を代償する。細胞培養物の除去は、高細胞生存度と組み合わさった高細胞密度でのより長いプロセス時間をもたらしてもよく、より高い生産性が得られる。細胞培養物は、連続的にまたは段階的に除去されてもよい。

好ましい本発明の実施態様では、例えば少なくとも１０．１０^６個の生存細胞／ｍｌ、好ましくは少なくとも２０．１０^６個の生存細胞／ｍｌ、より好ましくは少なくとも３０．１０^６個の生存細胞／ｍｌの細胞密度、例えば最大限で２００．１０^６個の生存細胞／ｍｌの細胞密度の所望の細胞密度に達したらすぐに（細胞、細胞培養液、および生物学的物質を含んでなる）細胞培養物を反応器から除去し、例えば細胞培養液または栄養素供給などの液体を反応器に添加して、細胞培養物の除去を代償する。好ましくは細胞培養物は、細胞密度が所望の細胞密度範囲内で一定であるような速度で除去される。本発明のこの実施態様は、本発明の方法の利点と、より長く維持できる高い生存度とを組み合わせるので、従来のバッチまたは流加法と比較して極めて有利であり、さらにより高い総容積生産性が実現できるようになる。「容積生産性」とは、単位時間あたり単位反応器容積毎に生成される生物学的物質の量を意味し、通常ｇ．Ｌ^−１．日^−１で表現される。本発明のこの実施態様は、本発明の方法の利点と、高濃度の生物学的物質を有する細胞培養物除去流とを組み合わせるので、従来の灌流方法と比較してもまた、極めて有利である。細胞培養物除去流中の高濃度の生物学的物質は、それからの生物学的物質の収集を商業的に興味深いものにする。細胞培養物が除去される従来の灌流方法では、細胞培養物除去流は、それを、生物学的物質を収集するのに商業的に価値あるものにする十分な生物学的物質を含有せず、したがって細胞培養物除去流は通常無駄と見なされる。したがって本発明のこの実施態様では、理論上は、生成される全ての生物学的物質を単純明快で経済的に実行可能な簡単な様式で収集できる。

本発明の特に好ましい実施態様では、細胞培養条件は、細胞生育速度および／または細胞の比生産性が制限されないように、より好ましくはまた、グルコースまたはグルタミンなどの細胞培養液の成分の少なくとも１つの濃度が一定のままであるように選択され、所望の細胞密度に達したらすぐに、細胞培養物が少なくとも１回反応器から除去されて、例えば細胞培養液などの液体が反応器に添加されて細胞培養物の除去を代償する。

好ましくは流出速度は、例えば栄養素および／または細胞培養液などの少なくとも１つの細胞培養液成分の添加速度から、任意の細胞培養物の除去速度を差し引いたものと実質的に等しくなるように選択される。

生物学的物質を産生する細胞は、例えば生物学的物質をコードする遺伝子を発現できる細胞である。生物学的物質をコードする遺伝子を発現できる細胞は、例えば生物学的物質をコードする遺伝子、および例えばネオマイシン抵抗性をコードする遺伝子（Ｎｅｏマーカー遺伝子）などの適切な選択マーカーをコードする遺伝子を含有するプラスミドで、細胞を形質移入して調製してもよい。次に例えばＮｅｏマーカー遺伝子の場合はＧ４１８（ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））存在下で形質移入された細胞を培養して、即時に高レベルの生物学的物質発現を示す細胞について細胞をスクリーニングすることで、淘汰圧によって安定形質移入細胞を選択してもよい。タンパク質を発現するＥ１−不死化ＨＥＲ細胞のクローンを調製する方法、およびこのような細胞を培養してタンパク質を生成する方法については当業者によく知られており、例えば米国特許第６，８５５，５４４号明細書にある。

したがって例えば（組み換え）コード遺伝子を発現することで、細胞によって産生されてもよい生物学的物質は、例えば特に受容体、酵素、融合タンパク質などの（組み換え）タンパク質と、血液凝固カスケードからのタンパク質などの血液タンパク質と、例えばエリスロポエチンなどの多機能性タンパク質と、例えばワクチンで使用するためのウイルスまたは細菌タンパク質と、例えばＩｇＧまたはＩｇＭなどの抗体などの免疫グロブリンである。好ましくはタンパク質、より好ましくは抗体が細胞によって生成される。好ましくは細胞によって産生されるタンパク質またはワクチンなどの生物学的物質は、医薬品中の活性成分として使用できる。本発明の文脈で「生成物」および「生物学的物質」という用語は同義である。

本発明の枠組みの中で、医薬品とは、薬剤として、特にヒトにおける薬剤として使用できるあらゆる調製品を意味する。このような薬剤は、例えば診断のため、または例えばワクチンなどの予防目的のため、および／または例えば患者に不足している酵素またはタンパク質、または望ましくない細胞を殺傷する抗体などの治療目的のために使用してもよい。医薬品は薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含有してもよく、その例は当業者によく知られている。

ＰＥＲ．Ｃ６細胞系は、Ｅ１−消去アデノウィルス（例えば米国特許第６，９９４，１２８号明細書；ＣｕｒｉｅｌＤ、ＤｏｕｇｌａｓＪＴ編「遺伝子療法のためのアデノウイルスベクター（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ）よりＮｉｃｈｏｌｓら、２００２年「アデノウイルスベクターの増殖：ＰＥＲ．Ｃ６細胞の使用（Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｏｆａｄｅｎｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ：ｕｓｅｏｆＰＥＲ．Ｃ６ｃｅｌｌｓ）」ＳａｎＤｉｅｇｏ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１２９〜１６７頁を参照されたい）、その他のウイルス（例えば国際公開第０１／３８３６２号パンフレットを参照されたい）、または組み換えタンパク質（例えば米国特許第６，８５５，５４４号明細書；ＪｏｅｒｇＫｎａｅｂｌｅｉｎ（編）「現代生物医薬品：デザイン、開発、および最適化（ＭｏｄｅｒｎＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）全４巻よりＹａｌｌｏｐら、２００５年「生物医薬品タンパク質の製造のためのＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＰＥＲ．Ｃ６ｃｅｌｌｓｆｏｒｔｈｅｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｏｆ
ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ）」７７９〜８０７頁を参照されたい）などの生物学的物質を生成するために使用できる。

医薬品中で活性成分として使用できるタンパク質（括弧内は商品名）の例としては、テネクテプラーゼ（ＴＮＫアーゼ（ＴＮＫａｓｅ）（商標））、（組み換え）抗血友病因子（レファクト（ＲｅＦａｃｔｏ）（商標））、リンパ芽球腫インターフェロンα−ｎ１（ウェルフェロン（Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ）（商標））、（組み換え）凝固因子（ノボセブン（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）（商標））、エタネルセプト、（エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（商標））、インフリキシマブ（レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（商標））、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（商標））、バシリキシマブ（シムレクト（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）（商標））、ダクリズマブ（ゼナパックス（Ｚｅｎａｐａｘ）（商標））、リツキシマブ（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（商標））、（組み換え）凝固因子ＩＸ（Ｂｅｎｅｆｉｘ（商標））およびインターフェロンβ−１ａ（アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）（商標））が挙げられる。

医薬品中で活性成分として使用できるワクチンの例としては、単離タンパク質抗原が挙げられ、その例としては、限定されるものではないが、経口性の四価ロタウイルスワクチン（ロタシールド（ＲｏｔａＳｈｉｅｌｄ）（商標））、狂犬病ワクチン（（ＲａｂＡｖｅｒｔ）（商標））、インフルエンザワクチンおよび不活性化肝炎Ａワクチン（バクタ（ＶＡＱＴＡ）（商標））が挙げられる。

細胞培養液のｐＨ、温度、溶存酸素濃度および容積モル浸透圧濃度は原則として重要でなく、選択した細胞タイプに左右される。好ましくはｐＨ、温度、溶存酸素濃度、および容積モル浸透圧濃度は、それが細胞の生育および生産性に最適であるように選択される。当業者は、どのようにして培養のための最適ｐＨ、温度、溶存酸素濃度および容積モル浸透圧濃度を見いだすかを知っている（例えば国際公開第２００４／０９９３９６号パンフレットを参照されたい）。好ましくは本発明の方法のために、Ｅ１不死化ＨＥＲ細胞を使用する場合、ｐＨは６．６〜７．６間で選択され、および／または温度は３０〜３９℃の間で選択され、および／または容積モル浸透圧濃度は２６０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間で選択される。最適工程条件を維持するために、工程条件を制御する自動化が望ましい。例えば培養中に細胞生産性増大のために成長停止を得るためなど、工程条件を最適化するために、培養条件のシフトを適用できる。これは例えば温度シフト（３７〜３２℃など）、ｐＨシフトまたは容積モル浸透圧濃度シフトによって確立されてもよい。

本発明の方法は、原則として細胞の培養に適したいかなるタイプの細胞培養液内でも実施できる。細胞培養液および細胞培養条件を選択するガイドラインについてはよく知られており、例えばＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．「動物細胞の培養（基礎技術マニュアル）（Ｃｕｌｔｕｒｅｏｆａｎｉｍａｌｃｅｌｌｓ（ａｍａｎｕａｌｏｆｂａｓｉｃｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ））」第４版、２０００年、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓの第８および９章；およびＤｏｙｌｅ，Ａ．、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊ．Ｂ．、Ｎｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｇ．「細胞および組織培養：実験室手順（Ｃｅｌｌ＆Ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）」１９９３年、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓで提供される。

例えば細胞培養液は、例えば細胞培養液成分として、炭水化物源、塩および／またはアミノ酸および／またはビタミンおよび／または脂質および／または界面活性剤および／または緩衝液および／または成長因子および／またはホルモンおよび／またはサイトカインおよび／または微量元素を含んでなってもよい。炭水化物源の例としては、グルコース、フルクトース、ガラクトースおよびピルビン酸が挙げられる。塩の例としては、例えばＭｇＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ、ＭｇＳＯ_４、およびＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏなどのマグネシウム塩、例えばＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏなどの鉄塩、例えばＫＨ_２ＰＯ_４、ＫＣｌなどのカリウム塩、例えばＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４などのナトリウム塩、および例えばＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏなどのカルシウム塩が挙げられる。アミノ酸の例としては、例えばヒスチジン（ｈｙｓｔｉｄｉｎｅ）、グルタミン、スレオニン、セリン、メチオニンなどの全ての既知のタンパク新生有機アミノ酸が挙げられる。ビタミンの例としては、アスコルビン酸、ビオチン、コリンＣｌ、ミオ−イノシトール、Ｄ−パントテン酸、リボフラビンが挙げられる。脂質の例としては、例えばリノール酸およびオレイン酸などの脂肪酸が挙げられる。界面活性剤の例としては、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）８０およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標）Ｆ６８が挙げられる。緩衝液の例としては、ＨＥＰＥＳおよびＮａ_２ＣＯ_３が挙げられる。成長因子／ホルモン／サイトカインの例としては、ＩＧＦ（インシュリン様成長因子）、ヒドロコルチゾンおよび（組み換え）インシュリンが挙げられる。微量元素の例は当業者に知られており、Ｚｎ、Ｍｇ、およびＳｅが挙げられる。細胞培養液は、例えばダイズペプトンまたはエタノールアミンなどのその他の細胞培養液成分もまた含んでなってもよい。

本発明に従った生物学的物質の生成では、特に生物学的物質が医薬品中で活性成分として使用される場合は、血清源を含有する培地よりも血清を含まない培地が好ましい。この理由は、血清源培地がウイルスで汚染されているかもしれず、プリオン感染症の危険性をもたらし、生物医薬品の後処理プロセス（すなわち細胞培養物からの生物学的物質のさらなる精製）において重大な障害になり得るためである。したがって本発明の方法は、好ましくはヒトをはじめとする動物起源の血清を含まない細胞培養液中で実施される。哺乳類起源の化合物はまた、感染症の危険性ももたらすので、好ましくは細胞培養液は哺乳類起源でない（すなわち細胞培養液は哺乳類起源の血清または成分を含まない）。より好ましくは細胞培養液は動物起源でない（すなわち細胞培養液はヒトをはじめとする動物起源の血清または成分を含まない。ＰＥＲ．Ｃ６細胞を培養するのに使用できる血清を含まない培地の例としては、例えばＳＡＦＣからのＥＸ−Ｃｅｌｌ（商標）ＶＰＲＯ培地、ハイクローンからのＨｙＱ（登録商標）ＣＤＭ４Ｒｅｔｉｎｏ（商標）、アーバイン・サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からのＩＳＰｒｏＶｅｃＣＤ、インビトロジェン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの２９３−ＳＦＭＩＩなどの市販の培地が挙げられる。

好ましい実施態様では、本発明の方法で生成される生物学的物質は、その内容物が反応器内に保持されまたは好ましくはその中に送り戻される流れから、または反応器から除去される細胞培養物から、または双方から収集される。本発明の方法で生成される生物学的物質は、生物学的物質に左右される方法を使用して、いわゆる後処理プロセスにおいて細胞培養物からさらに収集でき、その方法は当業者によく知られている。後処理プロセスは、通常、様々な組み合わせと順序でいくつかの精製ステップを含んでなる。後処理プロセス中の精製ステップの例は、分離ステップ（例えば親和クロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーによる、および／または水性二相システムによる抽出および／または例えば硫酸アンモニウムによる沈殿）、生物学的物質の濃縮ステップ（例えば限外濾過またはダイアフィルトレーションによる）、緩衝液交換ステップ、および／またはウイルスを除去または不活性化するステップ（例えばウイルス濾過、ｐＨシフトまたは溶媒界面活性剤処理による）である。

一態様では、本発明は、少なくとも５０．１０^６個の細胞／ｍＬ、好ましくは少なくとも６０．１０^６個の細胞／ｍＬ、特に少なくとも９０．１０^６個の細胞／ｍＬの生存細胞密度、および少なくとも５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ、特に少なくとも１１ｇ／Ｌの生物学的物質濃度を有する、哺乳類細胞、好ましくはＥ１−不死化ＨＥＲ細胞、より好ましくはＰＥＲ．Ｃ６細胞を含んでなる細胞培養物に関する。原則として生物学的物質濃度は、生物学的物質の溶解度が許す程度に高くあることができる。生存細胞密度は典型的に２００．１０^６個の細胞／ｍＬ以下、好ましくは８０〜１５０．１０^６個の細胞／ｍＬの範囲内である。

生存細胞密度は、例えばイノバティス（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）から市販される細胞計数器（セデックス（Ｃｅｄｅｘ）細胞計数器）を使用して、例えばトリパンブルー（ｔｒｙｐｔａｎｂｌｕｅ）排除法を使用して判定できる。

細胞培養物とは、細胞培養液、細胞、および生物学的物質を含んでなる液体を意味し、その液体は、反応器内において細胞培養液中で細胞を培養する工程の結果であり、その中で細胞は生物学的物質を産生する。

工程Ａ（バッチ）、Ｂ（流加）、およびＣ１（本発明の工程）について、プロセス時間Ｘ（日間）に対してプロットした生存細胞密度Ｙ（１０^６．ｍｌ^−１）を示す。工程Ａ（バッチ）、Ｂ（流加）、およびＣ１（本発明の工程）について、反応器Ｚ内のＩｇＧ濃度（工程ＡのＩｇＧ濃度と比較した％）をプロセス時間Ｘ（日間）に対して示す。工程Ａ（バッチ）、Ｂ（流加）、Ｃ２（本発明の工程）について、プロセス時間Ｘ（日間）に対してプロットした生存細胞密度Ｙ（１０^６．ｍｌ^−１）を示す。工程Ａ（バッチ）、Ｂ（流加）、およびＣ２（本発明の工程）について、反応器Ｚ内のＩｇＧ濃度（工程ＡのＩｇＧ濃度と比較した％）をプロセス時間Ｘ（日間）に対して示す。工程Ａ（バッチ）、Ｂ（流加）、Ｃ３（本発明の工程）について、プロセス時間Ｘ（日間）に対してプロットした生存細胞密度Ｙ（１０^６．ｍｌ^−１）を示す。工程Ａ、およびＣ３について、反応器Ｚ内のＩｇＧ濃度（工程Ａ３のＩｇＧ濃度と比較した％）をプロセス時間Ｘ（日間）に対して示す。工程Ａ、Ｂ、およびＣ３について、プロセス時間Ｘ（日間）に対してプロットした累積収率Ｑを示す（工程Ａの反応器容積１Ｌあたりの収率と比較した％）。Ｃ４（本発明の工程）について、プロセス時間Ｘ（日間）に対してプロットした細胞数Ｙ（１０^６．ｍｌ^−１）を示す。工程Ｃ４（本発明の工程の一実施態様）について、反応器Ｚ中のＩｇＧ濃度（最大達成ＩｇＧ濃度と比較した％）をプロセス時間Ｘ（日間）に対して示す。

ここで限定を意図しない以下の実施例によって、本発明を解明する。

［実施例］
［実施例１：バッチ工程、流加工程、および本発明に従った工程間の比較］
この実施例では、本発明に従った方法の性能をバッチおよび流加工程と比較した。

図１は、工程Ａ（バッチ）、Ｂ（流加）、およびＣ１（本発明の工程）について、プロセス時間Ｘ（日間）に対してプロットした生存細胞密度Ｙ（１０^６．ｍｌ^−１）を示す。

図２は、工程Ａ（バッチ）、Ｂ（流加）、およびＣ１（本発明の工程）について、反応器Ｚ内のＩｇＧ濃度（工程ＡのＩｇＧ濃度と比較した％）をプロセス時間Ｘ（日間）に対して示す。

全ての発酵は、ザルトリウスバイオスタット（Ｂｉｏｓｔａｔ）Ｂコントローラーを使用して、温度を３６．５℃に、ｐＨを７．２〜６．８の間に、およびＤＯを５０％空気飽和率に調節して、２００ｒｐｍで実施した。同一のＩｇＧ産生ＰＥＲ．Ｃ６細胞系（国際公開第２００４／０９９３９６号パンフレット参照）を全ての実験で使用した。

［バッチ工程Ａ］
ザルトリウスＢ５容器内で、４Ｌの作業容積でバッチ工程を実行した。６ｍＭのＬ−グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎ）を添加したＳＡＦＣからのＶＰＲＯ培地に細胞を３×１０ｅ５細胞／ｍＬで接種し、続いて１７日間培養した。

［流加工程Ｂ］
ザルトリウスＢ５容器内で、４Ｌの作業容積で流加工程を実行した。６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎ）を添加したＳＡＦＣからのＶＰＲＯ培地に細胞を３×１０ｅ５細胞／ｍＬで接種した。培養中にグルコースおよびグルタミンを添加して、上の濃度をそれぞれ１５ｍＭおよび１ｍＭに保った。５日目からアミノ酸およびペプチドを添加して、消費されたアミノ酸を補給した。

［本発明の方法Ｃ１］
２Ｌアプリコン容器内で、本発明の工程を実施した。ＲｅｆｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＡＴＦ−２システムを用いて、ＡＴＦフローモードで操作される、ゼネラル・エレクトリック（ＧＥ）から得られた分画分子量（ＭＷＣＯ）１００ｋＤａの中空繊維膜を使用して、細胞およびＩｇＧ生成物を保持した。６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎ）を添加したＳＡＦＣからのＶＰＲＯ培地中で、３×１０ｅ５細胞／ｍＬで培養を開始した。０．０５〜０．２ｎＬ／細胞／日の間の比流速（ＳＦＲ）を使用して、懸濁細胞培養物を通して、６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎ）を添加したＳＡＦＣからのＶＰＲＯ培地を灌流した。得られた最大生成物濃度は１．４ｇ／Ｌであった。

下の図１および図２から分かるように、本発明の工程は、言及される培養様式と比較して、より短時間で、生存細胞密度の増大および生成物濃度の増大をもたらした。

［実施例２：バッチ工程、流加工程、および本発明に従った工程間の比較］
この実施例では、本発明に従った方法を再度バッチおよび流加工程と比較し、工程Ｃ２ではＣＯ２圧力を制御して５０ｋＤａ分離システムを使用した。

図３は、工程Ａ（バッチ）、Ｂ（流加）、Ｃ２（本発明の工程）について、プロセス時間Ｘ（日間）に対してプロットした生存細胞密度Ｙ（１０^６．ｍｌ^−１）を示す。

図４は、工程Ａ（バッチ）、Ｂ（流加）、およびＣ２（本発明の工程）について、反応器Ｚ内のＩｇＧ濃度（工程ＡのＩｇＧ濃度と比較した％）をプロセス時間Ｘ（日間）に対して示す。

全ての発酵は、ザルトリウスバイオスタットＢコントローラーを使用して、温度を３６．５℃に、ｐＨを７．２〜６．８の間に、およびＤＯを５０％空気飽和率に調節して、２００ｒｐｍで実施した。同一のＩｇＧ（およそ１５０ｋＤａ）産生ＰＥＲ．Ｃ６細胞系（国際公開第２００４／０９９３９６号パンフレット参照）を全ての実験で使用した。

［バッチ工程Ａ］
ザルトリウスＢ５容器内で、４Ｌの作業容積でバッチ工程を実行した。６ｍＭのＬ−グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎ）を添加したＳＡＦＣからのＶＰＲＯ培地に細胞を３．１０５細胞．ｍＬ−１で接種し、続いて１７日間培養した。

［流加工程Ｂ］
ザルトリウスＢ５容器内で、４Ｌの作業容積で流加工程を実行した。６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎ）を添加したＳＡＦＣからのＶＰＲＯ培地に細胞を３．１０^５細胞．ｍＬ^−１で接種した。培養中にグルコースおよびグルタミンを添加して、上の濃度をそれぞれ１５ｍＭおよび１ｍＭに保った。５日目からアミノ酸およびペプチドを添加して、消費されたアミノ酸を補給した。

［本発明の工程Ｃ２］
２Ｌアプリコン容器内で、本発明の工程を実施した。ＲｅｆｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＡＴＦ−２システムを用いて、ＡＴＦフローモード内で操作される、ＧＥからの分画分子量（ＭＷＣＯ）５０ｋＤａの中空繊維膜を使用して、細胞およびＩｇＧ生成物を保持した。６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎ）を添加したＳＡＦＣからのＶＰＲＯ培地中で、３×１０ｅ５細胞／ｍＬで培養を開始した。０．０５〜０．２ｎＬ．細胞^−１．日^−１の間のＳＰＲを使用して、懸濁細胞培養物を通して、６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎ）を添加したＳＡＦＣからのＶＰＲＯ培地を灌流した。ＣＯ_２圧力を１５％未満に制御した。

［結果］
図３および図４から分かるように、本発明に従った工程は、等しいかそれ以下の時間で（バッチ時間の１００％；流加時間の８１％）、顕著な生存細胞密度の増大および生成物濃度の増大をもたらした（２４１５％×バッチ収率；６９０％×流加収率）。

本発明の工程のｇ．Ｌ^−１．日^−１の総体的生産性増大は、ｇ．Ｌ^−１．日^−１のバッチ生産性の２３．９倍、およびｇ．Ｌ^−１．日^−１の流加生産性の８．５倍である。本発明の工程Ｃ２では、１１．１ｇの生成物／Ｌが生じた。細胞密度が非常に高くても、保持装置の目詰まりは１７日間の間に起きなかった。

［実施例３：バッチ工程、流加工程、および本発明に従った工程間の比較］
この実施例では、細胞培養物除去を伴う本発明に従った方法の性能を再度バッチおよび流加工程と比較する。工程Ｃ３では細胞培養物が除去された。

図５は、工程Ａ（バッチ）、Ｂ（流加）、Ｃ３（本発明の工程）について、プロセス時間Ｘ（日間）に対してプロットした生存細胞密度Ｙ（１０^６．ｍｌ^−１）を示す。

図６は、反応器Ｚ中のＩｇＧ濃度（工程Ａ３のＩｇＧ濃度と比較した％）を、工程Ａ、およびＣ３のプロセス時間Ｘ（日間）に対して示す。

図７は、工程Ａ、ＢおよびＣ３について、プロセス時間Ｘ（日間）に対してプロットした累積収率Ｑ（工程Ａの反応器容積１Ｌあたり収率と比較した％）を示す。

［本発明の工程Ｃ３］
２Ｌアプリコン容器内で、本発明の工程を実施した。ＲｅｆｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＡＴＦ−２システムを用いて、ＡＴＦフローモード内で操作される、ＧＥからの分画分子量（ＭＷＣＯ）１００ｋＤａの中空繊維膜を使用して、細胞およびＩｇＧ生成物を保持した。６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎ）を添加したＳＡＦＣからのＶＰＲＯ培地中で、３×１０ｅ５細胞／ｍＬで培養を開始した。０．０５〜０．２ｎＬ．細胞^−１．日^−１の間のＳＰＲを使用して、懸濁細胞培養物を通して、６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎ）を添加したＳＡＦＣからのＶＰＲＯ培地を灌流した。１０．１０^６細胞．ｍＬ^−１を超えたら１日あたり作業容積の１０％、生存細胞密度が３０．１０^６細胞．ｍＬ^−１を超えたらそれ以降は１日あたり作業容積の３０％の細胞培養を除去する。

［結果］
図５から分かるように、本発明の工程によってより高い生存細胞密度が迅速に達成される。さらに細胞密度が非常に高くても保持装置の目詰まりが起こらなかったため、工程Ｃ３は４０日間近い期間にわたり作動を維持されたので、図５はまた、本発明の工程によって細胞生存度がより長く維持できることも示す。

図６は、本発明の方法では、生成物濃度がバッチ工程の生成物濃度よりもはるかに高いことを示す。生成物を含有する生成物流は、バッチ工程Ａの最終濃度のおよそ２００％〜２５０％で工程Ｃ３から収集された。

図７は、ほとんどの生成物が本発明の方法によって形成され、本発明の工程がバッチ工程Ａまたは流加工程Ｂよりも長く維持できることを示す。１７日目には、工程Ｃ３の累積収率はバッチ工程（Ａ３）の累積収率の８．１倍であり、流加工程（Ｂ）の累積収率の２．１倍である。また１７日目には、バッチ工程が終了した。２１日目には、工程Ｃ３の累積収率は流加工程Ｂの累積収率の３．０倍である。２１日目には、流加工程が終了した。３９日後には、工程Ｃ３の総累積収率はバッチ工程Ａの累積収率の２５倍、および流加工程Ｂの収率の６倍である。

この実験から、本発明に従った方法における所望の生体物質の総収率は、細胞密度が特定の高レベルを超えた場合、細胞培養物をブリードすることでさらに改善できると結論できる。

［実施例４：ＣＨＯ細胞の培養およびそれによる生成］
この実施例では、ＩｇＧ産生ＣＨＯ細胞系に、本発明に従った方法を実施して温度低下を含めて細胞生育を低下させた。

図８は、Ｃ４（本発明の工程）について、プロセス時間Ｘ（日間）に対してプロットした細胞数Ｙ（１０^６．ｍｌ^−１）を示す。

図９は、工程Ｃ４（本発明の工程の一実施態様）について、反応器Ｚ内のＩｇＧ濃度（最大達成ＩｇＧ濃度と比較した％）をプロセス時間Ｘ（日間）に対して示す。

発酵は、ザルトリウスバイオスタットＢコントローラーを使用して、温度を３６．５℃に、ｐＨを７．１〜６．９の間に、およびＤＯを４０％空気飽和率に調節して、１００ｒｐｍで実施した。温度は５日目に３２℃に低下させた。

［本発明の工程Ｃ４］
２Ｌアプリコン容器内で、本発明の工程を実施した。細胞および生成物保持装置は、ＲｅｆｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＡＴＦ−２システムを用いて、ＡＴＦフローモードで操作されるゼネラル・エレクトリックからの５０ｋＤ分画分子量（ＭＷＣＯ）中空繊維膜である。ハイクローンからのＭＴＣＭ−４９培地中で、５．１０６細胞．ｍＬ−１で培養を開始した。０．１〜０．４ｎＬ．細胞^−１．日^−１の間のＳＰＲを使用して、懸濁細胞培養物を通して培地を灌流した。ＣＯ_２圧力は１５％未満に制御された。

［結果］
データは、本発明の工程が、タンパク質産生ＣＨＯ細胞系を使用した場合にも機能することを示す。達成された細胞密度および生成物濃度は、バッチ培養と比較して増大する。データはまた、本発明に従った方法で（例えば温度低下によって）細胞生育を抑止できる一方、培養システム中の生成物蓄積が継続することも示す。

［実施例５：骨髄腫細胞系で実施された本発明の工程］
本発明に従った方法はまた、骨髄腫細胞系にも適用できる。この目的でザルトリウスバイオスタットＢコントローラーを使用して、温度を３６．５℃に、ｐＨを７．２〜６．８の間に、およびＤＯを４０％空気飽和率に調節して、１００ｒｐｍで発酵を実施する。５Ｌザルトリウス容器内のハイクローンからのＳＦＭ４Ｍａｂ培地に、骨髄腫細胞を３×１０ｅ５細胞／ｍｌで接種して細胞培養を開始する。細胞および生成物保持装置は、ＲｅｆｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＡＴＦ−４システムを用いて、ＡＴＦフローモード内で操作されるゼネラル・エレクトリックからの３０ｋＤ分画分子量（ＭＷＣＯ）中空繊維膜である。０．１〜０．４ｎＬ．細胞^−１．日^−１の間のＳＰＲを使用し、懸濁細胞培養物を通して、ハイクローンからのＳＦＭ４Ｍａｂ培地を灌流させる。ＣＯ_２圧力は１５％未満に制御される。

［実施例６：ＭＤＣＫ細胞系で実施された本発明の工程］
本発明に従った方法はまた、懸濁状態の形質転換ＭＤＣＫ細胞系に適用できる。この目的でザルトリウスバイオスタットＢコントローラーを使用して、温度を３６．５℃に、ｐＨを７．２〜６．８の間に、およびＤＯを４０％空気飽和率に調節して、１００ｒｐｍで発酵を実施する。５Ｌザルトリウス容器内のインビトロジェンからのＶＰ−ＳＦＭ培地に、形質転換ＭＤＣＫ細胞を３×１０ｅ５細胞／ｍｌで接種して細胞培養を開始する。細胞および生成物保持装置は、ＲｅｆｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＡＴＦ−４システムを用いて、ＡＴＦフローモード内で操作されるゼネラル・エレクトリックからの３０ｋＤ分画分子量（ＭＷＣＯ）中空繊維膜である。０．１〜０．４ｎＬ．細胞^−１．日^−１の間のＳＰＲを使用し、懸濁細胞培養物を通して、インビトロジェンからのＶＰ−ＳＦＭ培地を灌流させる。ＣＯ_２圧力は１５％未満に制御される。

Claims

細胞が、形質移入された少なくとも１つの遺伝子によってコードされる所望の生物学的物質を産生することができ、少なくとも１つの細胞培養液成分が細胞培養物に供給され、
細胞、所望の生物学的物質、および細胞培養液を含んでなる細胞培養物がタンジェンシャルフローで、分離システム上で循環され、
分離システムが、所望の生物学的物質よりも低い分子量を有する物質から所望の生物学的物質が分離されるフィルターを有し、
フィルターからの液体流出物は、本質的に所望の生物学的物質よりも低い分子量の成分のみを含み、
所望の生物学的物質が反応器内に保持されまたはその中に送り戻され、
前記反応器が、撹拌タンク容器、気泡ポンプ容器、または、揺動、振盪運動若しくは撹拌によって混合できる使い捨てバッグである、反応器内で細胞培養液中の懸濁状態の真核細胞を培養する方法。
前記フィルターが、前記生物学的物質の分子量の２分の１以下の分画分子量を有するフィルターである、請求項１に記載の方法。
前記フィルターが、３０ｋＤａ〜１００ｋＤａの分画分子量を有するフィルターである、請求項１又は２に記載の方法。
所望の生物学的物質よりも低い分子量の物質の一部が細胞培養物から連続的に除去される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
所望の生物学的物質が組み換えタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
所望の生物学的物質が抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
分離システムが薄膜フィルターである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
分離システムが中空繊維フィルターである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
細胞培養物が交互のタンジェンシャルフローで、フィルター上で循環される、請求項７又は８に記載の方法。
細胞培養物が反応器から少なくとも１回除去され、液体が反応器に添加されて細胞培養物の除去を代償する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
細胞培養物が反応器から少なくとも１回除去され、細胞培養液が反応器に添加されて細胞培養物の除去を代償する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
細胞培養条件が、細胞培養液成分の少なくとも１つの濃度が一定のままであるように選択される、請求項１１に記載の方法。
枯渇栄養素を反応器に供給することで、これらの栄養素が少なくとも部分的に補給される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
所望の生物学的物質が細胞からおよび／または細胞培養物から収集される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。