JP2011526285A - ソマトスタチン免疫原性増進のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１不全の治療が必要な患者において、こうした治療を行うための組成物および方法を提供する。組成物および方法には、ソマトスタチンに関する免疫原性を提供し、そして内因性に産生される成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１の放出増加を生じる、新規ワクチンが含まれる。

Description

関連出願
[0001]本出願は、「Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ Ａｃｅｔｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ）−Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題され、２００８年６月２５日に出願され、そしてすべての目的のために本明細書に援用される、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／６８１９５号に関する。

技術分野
[0002]本発明は、成長ホルモン（ＧＨ）および／またはインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）不全を有する患者の治療に関する。より具体的には、本発明は、ソマトスタチンに基づく抗原／アジュバントワクチンの使用を通じて、ＧＨおよび／またはＩＧＦ−１不全を有する患者のための治療、ならびに前記治療に関与する組成物および方法に関する。

[0003]ワクチンを用いた感染性疾患の予防は、１７００年代の終わり（１７９８年の天然痘ワクチン）以来、実施されてきており、これには、ポリオ、Ｂ型肝炎、およびインフルエンザ予防のためのワクチンの使用が含まれる。より最近は、癌治療、すなわち、乳癌、結腸癌、皮膚癌等の治療に使用するためのワクチンであって、患者免疫系がターゲット腫瘍細胞を同定し、そして破壊するように誘導する、前記ワクチンが同定されてきている。侵入性または癌性の病原体を打ち負かすのに、患者自身の免疫系を用いるという利点のため、ワクチン治療のための他の新規でそして有用なターゲットが開発中である。大部分の例では、ワクチンは、免疫が求められる抗原、およびワクチンのレシピエントによるその抗原に対する応答を増進するアジュバントを組み合わせる。

[0004]成長ホルモンは、脳下垂体前葉から合成され、そして放出される１９１アミノ酸のポリペプチドホルモンである。成長ホルモンは、一般的に、小児における成長／身長、カルシウム保持増加（骨強度）、脂肪分解の促進、タンパク質合成増加、肝臓における糖新生促進および他の類似の機能に必要な同化ホルモンと見なされている。内因性成長ホルモン不全に罹患した患者は、しばしば、骨強度が劣り、除脂肪体重が減少し、エネルギーが減少し、そして他の類似の全身症状を有する。

[0005]現在、成長ホルモン不全に罹患した患者は、典型的には、遺伝子操作された細菌で発現される組換え成長ホルモンを用いる、成長ホルモン補充で治療されている。これらの治療プロトコルは、典型的には非常に費用が掛かり（年間１万〜３万ドルの範囲と概算される）、そしてホルモンの外因性の補充に頼る（毎日の注射が典型的であり、しばしば１８ヶ月〜患者の生涯に渡る）。その結果、成長ホルモン不全に罹患した患者には、新規の、非外因性で長時間作用し、そしてより費用が掛からない療法が必要である。

[0006]さらに、ベースラインレベルを超えた、さらなる成長ホルモンを必要とする患者を治療する療法もまた必要であり、例えばこれらの患者はしばしば、肥満治療、創傷治癒、火傷治癒等のために、さらなる成長ホルモンを必要とする。

[0007]本発明は、上に論じる１以上の問題を克服することに向けられる。

[0008]本発明の態様は、成長ホルモン不全の治療のための組成物および方法を提供する。本発明の目的のため、成長ホルモン不全は、適切な内因性成長ホルモン分泌および／またはレベルが欠けていることによる、疾患状態または成長不全に関与する、成長ホルモンレベル減少いずれかである。成長ホルモン不全にはまた、成長ホルモンの正常な内因性レベル（その患者に関して）が存在するが、疾患または状態の治療、例えば、肥満の治療、創傷の治療、および火傷の治療に、さらなる成長ホルモンが好適であると考えられる状況も含まれる。

[0009]本発明の態様はまた、インスリン様増殖因子１不全の治療のための組成物および方法も提供する。本発明の目的のため、インスリン様増殖因子１不全は、適切な内因性インスリン様増殖因子１分泌および／またはレベルが欠けていることによる、疾患状態または状態に関与する、インスリン様増殖因子１レベル減少いずれかである。インスリン様増殖因子１不全にはまた、インスリン様増殖因子１の正常な内因性レベルが存在するが、疾患または状態の治療、例えば、成長不全、１型および２型糖尿病、ならびに軟骨修復および／または置換に、さらなるインスリン様増殖因子１が好適であると考えられる状況が含まれる。

[0010]１つの態様において、成長ホルモン不全の治療が必要な患者において、こうした治療を行うための方法を提供する。方法には、ソマトスタチンに基づく本発明の抗原ワクチンの免疫原となる量を患者に投与し、そして患者の進行を監視する工程が含まれる。さらなるワクチン接種を投与して、患者の成長ホルモン不全の治療を促進してもよい。こうした治療が必要な患者には：内因性成長ホルモンの欠如を有し、不十分な成長、先天性心疾患または他の類似の心疾患を生じた成人および小児、肥満、火傷修復増進が必要な患者、ならびに創傷治癒増進が必要な患者が含まれる。

[0011]別の態様において、インスリン様増殖因子１不全の治療が必要な患者において、こうした治療を行うための方法を提供する。方法には、ソマトスタチンに基づく本発明の抗原ワクチンの免疫原となる量を患者に投与し、そして患者の進行を監視する工程が含まれる。さらなるワクチン接種を投与して、患者のインスリン様増殖因子１不全の治療を促進してもよい。こうした治療が必要な患者には：未熟児網膜症（ＲＯＰ）を有する乳児、肥満である成人および／または小児、１型または２型糖尿病を有する成人および／または小児、レット症候群を有する成人および／または小児、肥満であるイヌおよび／またはネコ、軟骨置換および／または修復、ならびに他の類似の治療を必要とするウマが含まれる。

[0012]本発明はまた、成長ホルモンまたはインスリン様増殖因子１不全を有する患者の治療において使用するための、免疫原性が増進したソマトスタチンを有する、新規ポリペプチド、および該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリペプチドには、機能的に最適化されたリンカーを通じて、不活性化されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質に融合されたソマトスタチン−１４が含まれる。本発明のポリペプチドは、ソマトスタチン−１４が非常に保存され、長期保存に安定であり、非常に免疫原性であり、そして患者における分解に耐性であるため、すべての脊椎動物種において有用である。こうしたものとして、本発明のキメラポリペプチドは、すべての脊椎動物において、成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１不全の治療において使用するための、非常に有効でそして低コストの材料を提供する。

[0013]本発明はまた、免疫原性応答が必要な患者の治療において、特に成長ホルモンまたはインスリン様増殖因子不全のいずれかの治療が必要な患者に関して使用するための、新規アジュバントも提供する。本明細書の新規アジュバントは、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ等を含む脊椎動物において使用するために、非常に有効でそして安全である。

[0014]本発明はまた、成長ホルモンまたはインスリン様増殖因子不全いずれかを有する患者の治療において使用するための新規ワクチンも提供する。ワクチンは、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ等を含む脊椎動物において使用するのに非常に有効でそして安全である。

[0015]本発明のこれらのおよび多様な他の特徴および利点は、以下の詳細な説明を読み、そして付随する請求項を精査することから明らかであろう。

[0016]図１は、本発明の態様にしたがったｐＥＴ３０ｂ ＣａｔＳｏｍプラスミドの例示的概略図である。該プラスミドには、すべて本発明の態様にしたがった、カナマイシン耐性マーカー、Ｌａｃオペレーター、Ｔ７プロモーター、ＣＡＴコード配列が含まれ、本明細書の本発明にしたがったリンカー領域、および本発明にしたがったソマトスタチンコード領域もまた含まれる。 [0017]図２は、例示的な染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、本発明のコドンが最適化されたＣＡＴ不完全ソマトスタチンポリペプチドの予測されたサイズに対応する２８ＫＤバンドを示す。レーン１はＬＢ＋ＩＰＴＧ、還元であり、レーン２はＬＢ、還元であり、レーン３は、ＬＢ＋ＩＰＴＧであり、そしてレーン４はＬＢである。 [0018]図３は、非近交系マウスに対するソマトスタチン含有ワクチン接種に対する、ベースライン重量パーセントの散布図である。 [0019]図４は、７日間の経過に渡る、マウス群あたりの食物摂取を示すグラフである。 [0020]図５は、３９日間の経過に渡る、マウス治療群の平均体重を示すグラフであり、試験した各群をエラーバーとともに示す。 [0021]図６は、３９日間の経過に渡る、マウス治療群のベースライン体重パーセントを示すグラフであり、試験した各群をエラーバーとともに示す。

配列および配列識別子の同定

[0037]本発明は、成長ホルモン不全を治療する必要がある患者において、こうした治療を行うための組成物および方法を提供する。本明細書の目的のため、そして先に記載するように、成長ホルモン不全は、患者において、適切な内因性成長ホルモン分泌および／またはレベルが欠けていることによる、疾患状態または状態に関与する、成長ホルモンレベル減少いずれかである。成長ホルモン不全にはまた、成長ホルモンの正常な内因性レベル、すなわち、その患者に関する正常レベルが存在するが、ターゲット疾患または状態の治療、例えば、肥満の治療、創傷の治療、および火傷の治療のため、患者に対して、さらなる成長ホルモンが好適であると考えられる状況も含まれる。

[0038]本発明はまた、インスリン様増殖因子１不全の治療が必要な患者において、こうした治療を行うための組成物および方法も提供する。本明細書の目的のため、インスリン様増殖因子１不全は、適切な内因性インスリン様増殖因子１分泌が欠けていることによる疾患状態に関与する、インスリン様増殖因子レベル不全いずれかである。インスリン様増殖因子１不全にはまた、インスリン様増殖因子の正常なレベル、すなわち、その患者に関する正常レベルが存在するが、疾患または状態、例えば、肥満、１型および２型糖尿病、ならびにレット症候群の治療のため、患者に対して、さらなるインスリン様増殖因子１が好適であると考えられる状況も含まれる。

[0039]１つの態様において、機能的に最適化されたリンカーを通じて、不活性化されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質に融合されたソマトスタチン−１４のポリペプチドを含む、新規ポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のキメラポリペプチドは、成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１不全の治療において使用するための、非常に有効でそして低コストの材料を提供する。

[0040]別の態様において、成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１不全を有する患者の治療において使用するための新規アジュバント組成物を提供する。１つの特定の態様において、ソマトスタチンに基づく抗原を新規アジュバントと組み合わせて、そして成長ホルモンまたはインスリン様増殖因子１不全に関連する疾患状態または状態、例えば、小児における成長不全、成人における成長不全、適切な内因性成長ホルモン分泌の欠如、火傷の治癒、肥満、心臓疾患等の治療において用いてもよい。本明細書のアジュバントは、脊椎動物、そして特にヒトにおける、最適な使用のために設計されている。本明細書のアジュバントは、慣用的なアジュバントに勝る免疫原性増進を提供し、それによって、ワクチンがより少量の抗原を含むことを可能にする。本明細書のアジュバント態様は、成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１不全の治療に有用なものを超えて、他の抗原との組み合わせで有用である。したがって、新規単独型アジュバント態様が本発明の範囲内であるが、本明細書のアジュバントは、主に、ソマトスタチンに基づく抗原にしたがって記載される。

[0041]さらに別の態様において、ソマトスタチンの減少を生じ、そしてそれによってソマトスタチンが成長ホルモン放出およびそれによるインスリン様増殖因子１放出に対して発揮する阻害の一部の除去を生じる、ソマトスタチンに対する免疫原性を生じるワクチンを提供する。本明細書のワクチン態様は、安全性および機能の両方に関して最適化されており、安全で、そして非常に有効なアジュバント組成物において、非常に高い免疫原性ソマトスタチン構築物を有する。本発明のワクチンは、（慣用的なワクチンに比較した際）比較的少量の抗原しか必要とせず、保存期間が増進され、そしてより低いコストを有する。

[0042]本発明は、ヒトにおける成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１不全の治療をターゲットとするが、他の脊椎動物におけるこれらの不全の治療が本発明の範囲内であると意図される。例えば、本明細書記載の組成物および方法を用いて、肥満の徴候を示すイヌおよびネコ、ならびに軟骨修復または置換を必要とするウマを治療してもよい。

[0043]本明細書で頻繁に用いられる特定の用語の理解を容易にするため、以下の定義を提供し、そしてこうした定義は本開示の範囲を限定することを意味しない。
定義
[0044]「アミノ酸」は、２０の天然存在アミノ酸のいずれかならびに修飾アミノ酸配列いずれかを指す。修飾には、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスが含まれてもよいし、または限定されるわけではないが、リン酸化、ユビキチン化、アセチル化、グリコシル化、フラビンの共有結合、ＡＤＰ−リボシル化、架橋、ヨード化、メチル化等が含まれてもよい。

[0045]「抗体」は、抗原結合部位、ヒンジ領域および定常領域の対を有するＹ型の分子を指す。抗体断片、例えば抗原結合性断片（Ｆａｂ）、キメラ抗体、ネズミ抗原結合性領域にカップリングしたヒト定常領域を有する抗体、およびその断片、ならびに他の周知の組換え抗体が、本発明にしたがった抗体の定義に含まれる。

[0046]「単離」は、天然環境の少なくとも１つの混入物質から分離されたかまたは回収された、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。いくつかの場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然環境の混入物質の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％から分離されるかまたは回収されている。通常、少なくとも１つの精製工程を用いて、単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが調製される。これに関連して、「精製する」または「精製」は、混入ポリペプチドの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含まないターゲットポリペプチドを指す。硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む、多くの周知の技術のいずれによって、混入ポリペプチドからのポリペプチドの精製を達成してもよい。

[0047]「肥満」は、理想体重を少なくとも２０％超えている被験体を指す。例えば、ヒトに関しては、理想体重は、被験体の身長、年齢、性別および体型によって決定される。本明細書の肥満には、用語：穏やかな肥満（理想体重を２０〜４０％超える）、中程度の肥満（理想体重を４０〜１００％超える）、および重度の肥満（理想体重の１００％を超える）が含まれる。

[0048]「患者」は、本発明の組成物および／または方法が必要な脊椎動物、典型的には哺乳動物を指し、例えば体重減少が必要な（例えば肥満の）ヒト、または軟骨修復が必要なウマを指す。

[0049]核酸またはアミノ酸配列同一性「パーセント」は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一の核酸配列またはアミノ酸残基の割合を説明する。いくつかの例において、配列を整列させ、そして最大配列同一性を達成するため、ギャップを導入する。いくつかの例において、コンピュータプログラム、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ， １９８１， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．， ２：４８２−４８９（各々、その全体が本明細書に援用される）のアルゴリズムを用いるＧａｐプログラム（ウィスコンシン配列分析パッケージ、Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、またはＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラム（ＷＯ ００／１５７９６を参照されたい）を使用して、同一性パーセントを計算する。

[0050]「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの直線配列を指す。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド、あるいは両方の混合物の直線配列いずれかである。本発明の背景のポリヌクレオチドの例には、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の混合物を有するハイブリッド分子が含まれる。ポリヌクレオチドには、１以上の修飾ヌクレオチドおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）もまた含まれる。

[0051]「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、交換可能に用いられて、アミノ酸ポリマーあるいは２以上の相互作用するかまたは結合したアミノ酸ポリマーのセットを意味する。

[0052]「治療」または「治療する」は、比較的同一の状況における、未治療被験体に比較した被験体の改善を指す。「治療」または「治療する」は、一般的に、本発明の組成物および方法を用いて、所望の薬理学的および／または生理学的効果が達成されていることを示す。「治療」または「治療する」には、予防的治療が含まれてもよい。

[0053]「ワクチン」は、ワクチン接種した被験体の免疫系を刺激して、本明細書記載の目的のための抗体を産生しうる、任意の組成物を指す。
成長ホルモン
[0054]成長ホルモンは、脳下垂体前葉の成長ホルモン分泌細胞から産生されそして放出される、１９１アミノ酸のペプチドである。体内の成長ホルモンレベルは、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）およびソマトスタチンによって制御される。ＧＨＲＨは、成長ホルモンの合成および放出を生じ（ストレス、運動等もまた、成長ホルモン放出の既知の刺激因子である）、一方、ソマトスタチンは、成長ホルモンの放出を阻害する。

[0055]成長ホルモン（ＧＨ）は、一般的に、体内の多様な生理学的機能に関与し、これには：小児期全体の身長増加、サルコメア過形成を通じた筋量の増加、脂肪分解の促進、肝臓における糖新生の促進、および燃料ホメオスタシスの関与が含まれる。成長ホルモン不全は、典型的には、多くの既知の疾患または生理学的状態の形で現れ、これには：小児期に不全が生じた場合には低身長／成長不全、体力不足、骨量損失、心臓血管リスク、例えば慢性心不全の増加（本明細書にその全体が援用される、Ｔｉｅｎら， Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ： Ａ Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆａｉｌｉｎｇ Ｈｅａｒｔ， ２０００， Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２０（９）： １０９６−１１０６）、および他の類似の状態が含まれる。さらに、被験体に対する補充成長ホルモンは、創傷、火傷、肥満等の治療に潜在的に有用である。各々、すべての目的のために、本明細書に援用される、Ｖｉｃｋｅｒｓら， ２００２， Ａｄｕｌｔ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｎ ａｄｖｅｒｓｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ， １７５（３）：６１５−６２３； Ｒａｍｉｒｅｚら， １９９８， Ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｒ ｂｕｒｎ ｉｎｊｕｒｉｅｓ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ ＩＧＦ Ｒｅｓ． Ｓｕｐｐｌ． Ｂ：９９−１０５；およびＬａｌら， ２０００， Ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ， ｂｕｒｎｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｈｅａｌｉｎｇ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ ＩＧＦ Ｒｅｓ． １０ Ｓｕｐｐｌ． Ｂ：５３９−５４３。

[0056]成長ホルモン不全と戦うための慣用的な療法には、罹患した個体への、組換えヒト成長ホルモンの補充が含まれる（例えば、米国特許第４，４４６，２３５号および第４，６０１，９８０号を参照されたい）。成長ホルモン補充療法は、典型的には、連続した組換え成長ホルモンの皮下注射を必要とし、すなわち、少なくとも１８ヶ月間、毎日注射するのが典型的であるが、かなりの数の個体が生涯の治療を必要とする。近年、成長ホルモン補充療法が，多発性硬化症（ＭＳ）の治療、線維筋痛症の治療、クローン病および／または潰瘍性大腸炎の治療、加齢の逆転効果に向けての治療、火傷の治療、および特発性低身長に対する治療に用いられてきている。しかし、組換え成長ホルモン療法での治療は、糖尿病、結腸癌等のリスクを潜在的に増加させることが示されてきている。さらに、組換えタンパク質での患者の治療は、典型的には、一定の監視および患者ケアの環境を提供する内部フィードバック対照を欠き、患者が活性悪性腫瘍を有する場合に関連するリスクが増加する。さらに、組換え成長ホルモンは、入手するのに非常に高価であり、そして１年以上の経過に渡る使用の費用は非常に高額であり、注射を介した毎日の投与の措置も同様である。こうしたものとして、本発明の態様は、これらの成長ホルモン不全関連疾患または状態の治療において、予想外でそして実質的な利益を提供する。

インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）
[0057]ＩＧＦ−１は、インスリンに対する構造が類似のポリペプチドタンパク質ホルモンである。ＩＧＦ−１は、成長ホルモンに応答して、肝臓および他のターゲット組織において産生され、そして一般的に、放出に際して同化効果を有する。典型的には、ＩＧＦ−１は、ＡＫＴシグナル伝達経路を通じて作用する（ＡＫＴは、セリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼのファミリーに相当する）。一般的に、ＩＧＦ−１同化効果には、細胞成長および増殖、ならびにターゲット部位でのアポトーシスの阻害が含まれる。

[0058]患者の循環におけるＩＧＦ−１レベルに影響を及ぼす際に：成長ホルモンレベル、遺伝的構成、１日の内の時間、年齢、性別、運動状態、ストレス、肥満度指数、および疾患状態を含む、多くの要因が関与する。ＩＧＦ−１不全を成長遅延または成長障害によって特徴付けることも可能であり、そしてこれは：肥満、１型および２型糖尿病、心臓血管疾患、多様なストレス障害等を含む、いくつかの状態と関連する。

[0059]組換えＩＧＦ−１は、これらの疾患のいくつかの治療に用いられてきており、混合した結果が得られている。現在、Ｉｎｃｒｅｌｅｘ（登録商標）（Ｔｅｒｃｉｃａによって製造される組換えＩＧＦ−１）が、ターゲット障害の治療のため、米国において入手可能であるが、臨床的結果は多様である。

ソマトスタチン
[0060]ソマトスタチンは、とりわけ、脳下垂体前葉からの成長ホルモンの放出を阻害する、ペプチドホルモンである。ソマトスタチンは、ターゲット内分泌細胞上のＧタンパク質共役型ソマトスタチン受容体との相互作用を通じて、多様な内分泌機能を制御する。ソマトスタチンは、視床下部、胃、腸および膵臓の部位から分泌される。ターゲット動物におけるソマトスタチンレベルの制御は、ごく最近、農場動物の生産性を増加させるための関心ポイントとして同定されており、すなわち、ソマトスタチンレベルの制御によって、乳牛ミルク産生または農場動物のサイズ等が増進される（すべての目的のため、本明細書に援用される、「Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ Ａｃｅｔｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ）−Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題される同時係属出願Ｓ／Ｎ １２／１９８，５７９を参照されたい）。

[0061]これらの研究において、農場動物の生産性は、ソマトスタチン抗原を用いたワクチン接種プロトコルの使用によって最適化された。一般的に、ソマトスタチンで免疫された農場動物は、１０〜２０％の平均一日増体重、９％の食欲減少、および食物利用効率の１１％の増加を有した。ソマトスタチンで免疫された動物、およびまたその子孫は、正しい比率（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ）を有し、そして筋肉、骨および脂肪の間の動物の重量分布は、対照動物におけるのと同じである（Ｒｅｉｃｈｌｉｎ、１９８７を参照されたい）。しかし、代替ソマトスタチン治療、例えば、抗ソマトスタチン抗体でのターゲット動物の直接治療は、過剰に費用が掛かり、そして機能的に劇的でなく、それによって直接抗体治療は非現実的であるとして排除されると立証されてきた。Ｍｕｒｏｍｔｓｅｖ Ｇ．Ｓ．ら， １９９０， Ｂａｓｉｃｓ ｏｆ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｇｒｏｐｒｏｍｉｚｄａｔ， モスクワ， ｐｐ １０２−１０６。したがって、これらの研究は、ターゲット動物におけるソマトスタチン免疫原性の誘導が安全でそして有効な結果を達成しうることを示す。

[0062]本明細書の発明者らは、これらのワクチン接種プロトコル（その中の方法および組成物を含む）の修飾を、ヒト疾患または生理学的状態の治療、そして特に、ヒト成長ホルモンおよび／またはＩＧＦ−１不全の治療に用いてもよいという、驚くべきそして予想外の結果を認識した。

[0063]本発明の態様は、脊椎動物における、そしてより詳細には、哺乳動物における、成長ホルモン不全のためのソマトスタチンに基づく治療を提供する。典型的な態様は、ヒト、イヌ、ネコおよびウマにおける治療に向けられる。ソマトスタチンで免疫するヒトおよび他の哺乳動物を、本発明のワクチン（以下を参照されたい）で治療して、天然ソマトスタチンが有する、成長ホルモン放出に対する効果を制限するかまたは阻害する。例えば、成長ホルモン不全であるか、または火傷、心臓療法、糖尿病等の治療のため、過剰な成長ホルモンを必要としている患者に、組換え成長ホルモンを投与する場合、本発明のワクチンを提供して、さらなる内因性成長ホルモン放出を生じる。脊椎動物で使用するため、特にヒトで使用し、そして疾患を治療するため、ワクチン抗原およびアジュバントを最適化する。ソマトスタチンは脊椎動物において非常に保存されているため、本発明の態様は、本明細書の方法および組成物を用いて、ワクチン接種したすべてのターゲット脊椎動物において、免疫応答を誘発するのに有用である。本発明の重要な利点は、ワクチン接種した患者において、ブースター事象間を数週間から数ヶ月間空けて、患者の免疫系が、系からソマトスタチンを制限するかまたは排除することを可能にしてもよいことである。

[0064]本発明の態様はまた、脊椎動物における、そして特に哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ等における、ＩＧＦ−１不全のための、ソマトスタチンに基づく治療も提供する。本発明のワクチンで免疫された脊椎動物は、その動物におけるＩＧＦ−１レベルに対してソマトスタチンが有する効果を制限するかまたは阻害する。ＩＧＦ−１不全と関連する多くの疾患および／または状態のいずれを治療するために、あるいは治療した動物の健康または状態を改善するためにさらなるＩＧＦ−１が必要である場合に、治療態様を用いてもよい。

[0065]こうしたものとして、本発明の側面は、疾患および／または他の状態の防止および治療において使用するための、非常に免疫原性の材料を提供することによって、ソマトスタチンに基づく免疫ワクチンを促進する。ソマトスタチンに基づくこれらの免疫化合物は、発現および抗原性に関して最適化されてきている。

[0066]いくつかの態様において、ソマトスタチン−１４は、コドンが最適化されたＣＡＴ不完全ソマトスタチンキメラポリペプチドとして発現される。これらの材料は、成長ホルモンおよびＩＧＦ−１不全に基づく疾患の治療において、ならびにさらなるレベルの成長ホルモンまたはＩＧＦ−１のいずれかが治療措置において有用である場合、予想外の療法剤を提供する。以下により詳細に記載するように、本発明はまた、コドンが最適化されたＣＡＴ不完全ソマトスタチンキメラポリペプチドの効果を最大にするための最適化されたアジュバントも提供する。本発明のソマトスタチンに基づく抗原は、より大きいサイズの分子（天然ソマトスタチンの１，６００に対して、２７，０００＋ダルトン）、免疫原性および分解に対する耐性を提供するよう設計される。この方式で、本発明のソマトスタチンに基づく抗原は、治療された患者において、より長期間（患者における、より長い半減期）、より強い効果（より強い免疫原性）で存在する。脊椎動物において使用するためのこれらの新規抗原は、患者の免疫系が応答するための最適な曝露を提供する。

成長ホルモン不全の治療において使用するための新規ワクチン態様
[0067]ソマトスタチンは、ポリペプチドの代替切断によって産生される、２つの活性型を有する。すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｃｏｓｔｏｆｆ Ａ． セクション５， 第４章： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ． Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ， １６ページ。いずれのソマトスタチン型も、本明細書のソマトスタチンに基づく抗原態様で使用可能であると意図されるが、ソマトスタチン−１４が詳細に記載されるであろう。ソマトスタチン−１４は、視床下部および胃腸管（胃、腸、および膵臓）において産生される生物学的に活性であるテトラデカペプチドである。該テトラデカペプチドのアミノ酸配列は、ＡＧＣＫＮＦＦＷＫＴＦＴＳＣ（配列番号１）である。ソマトスタチン−１４の配列は、脊椎動物間で非常に保存されている（Ｌｉｎ ＸＷら Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍｓ： ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ． Ｃｏｍｐ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １９９８ １１９（３）：３７５−８８．）。該テトラデカペプチドは、核酸配列：ＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＣＴＧＴ（配列番号１５）にコードされる（配列番号１をコードする他の核酸配列を用いてもよいが、配列番号１５が例示目的のために提供されていることに留意されたい）。

[0068]ソマトスタチン−１４は、動物において、成長および食物利用に関与する多数のホルモンに対して、強い阻害効果を有することが知られる。米国特許第６，３１６，００４号および米国特許出願第１２／１９８，５７９号（各々、すべての使用のため、本明細書に援用される）に先に記載されるように、毎日の体重増加および適切な場合はミルク産生の増加のために、ソマトスタチンおよびソマトスタチンのキメラ型を動物の免疫に用いてもよい。これらの免疫法は、慣用的なアジュバントを用いて行われた。ソマトスタチン−１４免疫は、いかなる特定の成長ホルモン不全状態の治療にも用いられてこなかった。

[0069]本発明の１つの側面は、最適化されたソマトスタチン免疫原性活性を有するキメラタンパク質をコードする単離核酸分子を提供する。特に、本発明の態様には、ソマトスタチンの免疫原性活性を有するＣＡＴ融合タンパク質をコードする新規核酸構築物が含まれる。これらのポリペプチドは、免疫法における最適な機能活性のため、そして成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１不全の治療において使用するため、そして特に、哺乳動物成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１不全の治療において使用するために同定されてきている。

[0070]１つの態様において、本発明のキメラポリペプチドをコードする、図１に示すような概略図を有する構築物を提供する。本発明の核酸構築物は、一般的に、１０のＣ末端アミノ酸を含まず、そして１つまたは２つのヒスチジン置換アミノ酸を含む、不活性ＣＡＴ酵素をコードする。ＣＡＴ酵素は、Ｈｉｓ１９３（規範的なＣＡＴ_ＩＩＩ変異体においてはＨｉｓ１９５）のイミダゾール基を除去することによって不活性化される。別の態様において、ＣＡＴ酵素は、Ｈｉｓ１９３および近くのＨｉｓ１９２の両方（ＣＡＴ_ＩＩＩに関しては、それぞれ、Ｈｉｓ１９５およびＨｉｓ１９４）のイミダゾール基を除去することによって不活性化される。ＣＡＴの活性部位から必須のＨｉｓ１９３（ＣＡＴ_ＩＩＩにおいてはＨｉｓ１９５）イミダゾール基を除去して、そしてアラニン、グリシンまたは他の類似のアミノ酸で置換すると、ＣＡＴ酵素の実質的な不活性化が生じる（例えば、各々、すべての目的のため、本明細書に援用される、Ｌｅｗｅｎｄｏｎ Ａら（１９９４）Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−１９５ ｏｆ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｂａｓｅ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｇｌｕｔａｍａｔｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ３３（７）：１９４４−５０； Ｗｈｉｔｅら， （２０００）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｎｄ Ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｂｏｖｉｎｅ Ｄｉａｒｒｈｅａ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏ ３８（１２） ｐ４５９３−４５９８）。最後に、本明細書の態様にはまた、Ｈｉｓ１９２（ＣＡＴ_ＩＩＩに関してはＨｉｓ１９４）のみのイミダゾール基を除去することによるＣＡＴ酵素不活性化も含まれてもよい。Ｈｉｓ１９３に関しては、置換は、アラニン、グリシン、または他の類似のアミノ酸を用いてもよい。

[0071]いくつかの側面において、１以上の置換ヒスチジンアミノ酸は、配列番号２の５７４〜５７６位および５７７〜５７９位に位置する核酸によってコードされる（配列番号３のアミノ酸１９２および１９３に対応する）。いくつかの態様において、本発明の核酸配列には、配列番号４、配列番号５および配列番号６が含まれる。本明細書のヒスチジン置換構築物を含む本発明のキメラタンパク質は、ほとんどまたはまったくＣＡＴ活性がない、非常に免疫原性のタンパク質を提供し、これは現存する技術に勝る有意な改善である。不活性化されたＣＡＴ酵素態様を、本発明のソマトスタチンポリペプチドに付着させる。この付着は、直接であってもまたはリンカーを用いて行われてもよい（以下により詳細に記載される）。

[0072]部位特異的突然変異誘発および合成遺伝子組み立てを含む、当業者に知られる多数の方法のいずれによって、ｈｉｓ１９２およびｈｉｓ１９３の部位でのＣＡＴ不活性化を達成してもよい。１つの態様において、アラニン、グリシンまたは他の類似のアミノ酸をコードするように、ヒスチジン１９３またはヒスチジン１９２をコードする核酸配列を修飾する。別の態様において、アラニン、グリシンまたは他の類似のアミノ酸をコードするように、ヒスチジン１９２および１９３の両方をコードする核酸配列を修飾する。１９２および１９３キメラポリペプチドに関する典型的な置換には：アラニン、アラニン、アラニン、グリシン、グリシン、アラニン、グリシン、グリシンが含まれる。

[0073]本発明の態様にはまた、本発明のＣＡＴ不完全ポリペプチドに関するアミノ酸配列も含まれ、配列番号７、８および３を有するアミノ酸配列が含まれる（１９３でのｈｉｓ→ｇｌｙ、１９３でのｈｉｓ→ａｌａ、１９２および１９３の両方でのｈｉｓ→ｇｌｙに対応する）。

[0074]ＣＡＴ酵素を不活性化して、そして特に哺乳動物における、本明細書の疾患および／または状態の治療において、ソマトスタチン−１４を提示するためのキャリアータンパク質として用いてもよいという認識は、本発明者らの予想外の発見である。不活性化されていないＣＡＴは、多数の世界中のグラム陰性細菌単離体において、クロラムフェニコールおよびフロルフェニコール（フッ素化類似体）に対するプラスミド仲介性細菌耐性の原因酵素として記載されてきている。ＵＳ ６３１６００４Ｂ１に記載されるような不活性化されていないＣＡＴの使用は、これらの科学的発見に先立つ。こうしたものとして、現在の理解および確立された標準にしたがって、不活性化されていないＣＡＴの使用は、安全性の懸念（すなわちより抗生物質耐性である宿主の生成）のため、望ましくないことが示される（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｅｄ）であろう。クロラムフェニコールは約６０年前に発見され、そして主に抗生物質として用いられてきた。薬剤のレシピエントが再生不良性貧血を発展させることを含め、この使用には、いくつかの健康上の懸念が生じた。さらに、抗生物質フッ素化類似体を、例えば家畜産業において、連続して用いる場合、プラスミドがコードする遺伝子のため、抗生物質に対して耐性となる細菌株数が増加する。クロラムフェニコールは、細菌性結膜炎を治療する点眼剤中で使用され続けているが、他の細菌性疾患を治療するためには、米国では用いられていない。こうしたものとして、哺乳動物、および特にヒトにおいて、いかなる問題においても、不活性化されたＣＡＴ酵素の使用の達成および開発は、驚くべきことであり、ここで、本明細書全体に記載するキャリアータンパク質に基づく利点を利用して、活性ＣＡＴの重要な健康上の懸念を回避しつつ、本明細書記載のワクチンへの有意な改善を提供する。

[0075]小分子とともに使用するためのＣＡＴのこれらの「キャリアー」に関連する改善は、同時係属および関連米国特許出願Ｓ／Ｎ ＰＣＴ／ＵＳ０８／６８１９５ならびに米国特許第６，３１６，００４号に論じられ、これらはどちらもすべての目的のため本明細書に援用されることに留意されたい。特に、本発明者らは、予期せぬことに、本明細書において、ソマトスタチン−１４のキャリアータンパク質としての不活性化されたＣＡＴ酵素が、免疫原性に関する能力が増進し、酵素分解に対する耐性が増進し、半減期が増加し、そして患者のマクロファージによる取り込みが増進したキメラタンパク質を利用しつつ、該酵素が関連する重要な健康上のリスクを回避することを見出した。

[0076]図１に示すように、活性でないＣＡＴ酵素を、多様な長さのリンカーまたはスペーサーを介して、ソマトスタチン−１４に連結してもよい。スペーサーは、球状の表面上に、コードされるソマトスタチンが提示されるのを確実にするために必要である。本明細書のスペーサー態様は、最適なプロテアーゼ耐性および最適なエピトープ曝露を提供し、そして本発明のリンカー配列（単数または複数）を持たない構築物に勝る、予想外の改善を示した。

[0077]したがって、スペーサー態様は、多様な微生物において、そして特に大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）において、ＣＡＴ不完全ソマトスタチン発現を確実にするように、長さおよび組成が最適化されてきた。米国特許第６，３１６，００４号に記載されるような元来の構築物には、稀な大腸菌コドンを有するスペーサーが含まれ、そして該構築物は、第二のまたはヘルパープラスミドからの稀なｔＲＮＡの同時発現を必要とした。本明細書のスペーサー態様は、これらの稀な大腸菌コドンを除去して、そしてそれによって、第二のヘルパープラスミドに関する必要性を取り除いて、先行技術に勝る改善を提供する。

[0078]典型的な態様において、スペーサーは、ｔｇｇｇａａｃｔｇｃａｃｃｇｔｔｃｔｇｇｔｃｃａｃｇｃｃｃｇｃｇｃｃｃｔｃｇｃｃｃａｃｇｔｃｃｇｇａａｔｔｃａｔｇ（配列番号９）の核酸配列を有する。本発明のスペーサーの１つの例は、ｗｅｌｈｒｓｇｐｒｐｒｐｒｐｒｐｅｆｍ（配列番号１０）のアミノ酸配列を有する。本発明のスペーサーの典型的なアミノ酸配列は、ｗｅｌｈｒｓｇｐ（ｒｐ）_ｎｅｆｍ、式中、ｎ＞ｌ（配列番号１１）である。上述のように、これらの新規スペーサー配列は、プロテアーゼ耐性の増進（それによって米国特許第６，３１６，００４号に開示される構築物に比較した際、増加した産生を可能にする）および最適なソマトスタチン−１４曝露を提供する。最適に構成されたリンカーによって、不活性化されたＣＡＴ酵素に付着したソマトスタチンのこの組み合わせは、疾患治療のためにターゲット患者を免疫するのに用いた際、予想外の改善を示した。これらの構築物は、成長ホルモンおよびインスリン様増殖因子１不全に基づく疾患の治療において、抗原として用いられる。

[0079]さらに、これらのキメラ構築物は、ソマトスタチン−１４単独に比較した際、保存安定性増進を示す。さらに、本発明のソマトスタチンに基づく抗原は、これらの材料の分解に対する耐性増進が提供されて、患者におけるより長い半減期を提供する。ソマトスタチンに付着するものとして、不活性化されたＣＡＴの代わりに他のキャリアーポリペプチドを用いてもよいことが留意される。例えば、ソマトスタチン−１４を、不活性化されたＣＡＴ酵素の代わりに、ＫＬＨ、破傷風毒素またはＣＲＭと組み合わせてもよい。

[0080]本発明の態様はまた、ターゲット患者における体液性免疫の誘導を増進させるための新規アジュバント組成物も提供する。これらのアジュバント組成物は、体液性応答の誘導のため、慣用的な材料に勝る有意な改善を提供し、そしてヒトターゲットにおいて使用するのに安全である。本明細書のアジュバント組成物を、ソマトスタチンに基づく抗原とともに用いて、本発明のワクチンを産生する。次いで、本発明のワクチンは、ＧＨおよび／またはＩＧＦ−１不全に基づく疾患または状態の治療において有用である。

[0081]本明細書の態様において、アジュバント組成物のすべての構成要素は、非動物起源であり、それによって、ワクチン接種されたヒトが、潜在的に汚染されているアジュバント構成要素によって交差汚染される可能性を排除する。例えば、本明細書の態様は、動物起源不含Ｔｗｅｅｎ８０を利用してもよい。驚くべきことに、動物起源不含Ｔｗｅｅｎ８０は、動物起源Ｔｗｅｅｎ８０に比較した際、本明細書のワクチンの使用において、有意により優れた結果を示し、そしてワクチン内への動物に基づく混入、例えばウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）の可能性を排除する。さらに、動物起源不含Ｔｗｅｅｎ８０は、動物起源Ｔｗｅｅｎ８０に比較した際、より優れた乳化能を示し、本明細書の態様にしたがった使用に関して、さらなる予想外の利点を提供する。

[0082]本明細書のアジュバント態様はまた、ベンゼンおよび他の類似の発癌性化合物も含まない。これらの態様は、大部分の慣用的アジュバント化合物では利用不能な、安全上の利点を提供する。例えば、本明細書の態様は、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐまたはベンゼン不含多塩基酸を利用する。

[0083]１つの態様において、免疫学的アジュバントは、ｃａｒｂｏｐｏｌ基剤、スクアレン基剤およびアラビノガラクタン溶液を含む。より詳細には、Ｃａｒｂｏｐｏｌ基剤は、水または生理食塩水中で、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐを用いて調製される。スクアレン基剤は、スクアレン、非動物起源Ｔｗｅｅｎ８０およびＳｐａｎ８５の組み合わせから調製される。いくつかの態様において、スクアレン基剤は、ＭＦ５９（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州エメリービル）である。アラビノガラクタンは、ＰＢＳまたは生理食塩水中に溶解される。アジュバント組成物を本発明のキメラポリペプチドと組み合わせて、本発明のワクチンを産生する。

[0084]さらに別の態様において、免疫学的アジュバントは、Ｃａｒｂｏｐｏｌ基剤、スクアレン基剤およびトラガカンチン溶液を含む。より詳細には、Ｃａｒｂｏｐｏｌ基剤は、水または生理食塩水中で、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐを用いて調製される。スクアレン基剤は、スクアレン、非動物起源Ｔｗｅｅｎ８０およびＳｐａｎ８５の組み合わせから調製される。精製トラガカンチンは、ＰＢＳまたは生理食塩水中に溶解される。アジュバント組成物を本発明のキメラポリペプチドと組み合わせて、本発明のワクチンを産生する。

[0085]特定のアジュバント組み合わせおよび濃度を実施例３に示す。本発明にしたがったアジュバントは、ヒト使用のために安全および有効であり、動物産物を回避し、石油に基づく炭水化物を回避し、そして発癌性化合物を回避する。

ベクターおよび宿主細胞
[0086]本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド分子を含むベクター、ならびにこうしたベクターで形質転換された宿主細胞にも関する。一般的に、関心対象の増殖宿主のための選択可能マーカーおよび複製起点を含むベクターに、本発明のポリヌクレオチド分子のいずれを連結してもよい。宿主細胞がこれらのベクターを含み、そしてそれによって本発明のポリペプチドを発現するように、宿主細胞を遺伝的に操作する。一般的に、本明細書のベクターには、微生物またはウイルス宿主細胞のためのものなどの、適切な転写または翻訳制御配列に機能可能であるように連結された、本発明のポリヌクレオチド分子が含まれる。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳を制御する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、本明細書の制御配列が、本発明のポリヌクレオチドをコードするキメラポリペプチドに機能的に関連している場合、機能可能であるように連結されている。

[0087]典型的なビヒクルには、プラスミド、酵母シャトルベクター、バキュロウイルス、不活性化アデノウイルス等が含まれる。１つの態様において、ビヒクルは修飾ｐＥＴ３０ｂ ＣａｔＳｏｍプラスミドである（図１を参照されたい）。本明細書で使用するためのターゲット宿主細胞には、細菌宿主、例えば大腸菌、酵母、ＳＦ−９昆虫細胞、哺乳動物細胞、緑色植物等が含まれる。

[0088]１つの態様において、制御配列には、大腸菌または他の類似の微生物における本発明のキメラポリペプチドの発現のためのＴ７ｌａｃ、ＣＡＴ、Ｔｒｐ、またはＴ５プロモーターが含まれる。これらの制御配列は当該技術分野に知られ、そして適切でそして既知の条件下で用いられる。

[0089]ターゲット制御配列の利用を通じて、本発明のキメラポリペプチドを発現させるための、本発明の多様なプラスミドが構築されてきている。例示的なプラスミドには、Ｔ７ｌａｃプロモーターが含まれてもよい（図１を参照されたい）。

[0090]ターゲットキメラポリペプチドの発現のための宿主細胞には、原核生物、酵母およびより高次の真核細胞が含まれる。例示的な原核宿主には、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ならびにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の細菌が含まれる。典型的な態様において、宿主細胞はエシェリキア属のものであり、そして大腸菌であってもよい。また、宿主細胞（酵母または細菌）を用いて、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として本発明のターゲットポリペプチドを産生してもよい。

[0091]以下の実施例に示すように、本発明の構築物は、多様な条件下で、最適なＣＡＴ不完全ソマトスタチン発現を提供する。これらの構築物は、原核宿主において、そして特に、エシェリキア属の細菌において発現させるのに特に効率的である。

本発明のワクチンにおいて使用するための内毒素不含融合タンパク質
[0092]本発明の側面には、内毒素不含でコドンが最適化されたＣＡＴ不完全ソマトスタチンの使用が含まれる。１つの態様において、適切なソマトスタチン含有ビヒクルでターゲット細胞を形質転換することによって、本発明のキメラ免疫原性ソマトスタチン含有タンパク質を調製する。上述のように、本明細書で使用するためのビヒクルには、選択したターゲット細胞において発現するのに適した既知のプラスミドおよびベクター系が含まれる。

[0093]本発明の１つの側面において、キメラ免疫原性ソマトスタチン含有タンパク質は、ターゲット宿主細胞において発現される。キメラタンパク質発現は、ターゲット制御配列を用いて行われる。いくつかの側面において、キメラポリペプチドは、大腸菌での発現のために最適化されてきている（特に、本明細書に開示するスペーサー配列に関して）。

[0094]次いで、例えば、リゾチーム溶解、封入体の分画遠心分離、篩クロマトグラフィー等を含む、既知のタンパク質精製技術にしたがって、キメラタンパク質を精製してもよい。アルカリｐＨの塩化グアニジンおよび尿素中での再フォールディング法を行い、その後、透析および凍結乾燥してもよい。

[0095]１つの態様において、コドンが最適化されたＣＡＴ不完全ソマトスタチン含有プラスミド−ｐＥＴ３０ｂ ＣａｔＳｏｍを用いて、大腸菌細胞を形質転換する； ｐＥＴ３０ｂ ＣａｔＳｏｍは、発現に適した大腸菌塩基制御配列を有する。いくつかの場合、これらの細胞をおよそ１０リットル発酵させると、少なくとも５００グラム、そしていくつかの場合、６００グラムの総バイオマスが提供され、約４〜６グラムの総タンパク質を生じる。銀およびクーマシーブルー染色から、タンパク質の約半量がターゲットキメラタンパク質であると概算される（実施例２および図２を参照されたい）。

[0096]本明細書のいくつかの態様において、本発明のキメラタンパク質を、実質的に内毒素不含状態で、形質転換宿主細胞から精製する。さらなる精製は、米国食品医薬品局標準にしたがって、ヒト使用のために許容されうるレベルまで、内毒素を除去するかまたは低下させるであろう。

[0097]こうしたものとして、本明細書のいくつかの態様は、ワクチンにおいて使用するための、実質的に内毒素不含のキメラタンパク質の産生に関する。特定の態様において、内毒素レベルは、１ＥＵ／ｍｌ以下であり、そして他の態様において、内毒素レベルは、実質的に除去され、すなわち、本発明のキメラポリペプチドは実質的に内毒素不含である。

[0098]１つの態様において、内毒素を欠く洗浄緩衝液を用いて、溶解した宿主細胞から回収したＩＢを数回洗浄する。内毒素レベルがおよそ１ＥＵ／ｍｌ未満になるまで、回収したＩＰペレットを、場合によって洗浄してもよい（ＭＰ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ等から商業的に入手可能な試験キットを含む、１以上の既知のアッセイを用いて、内毒素試験を行ってもよい）。いくつかの態様において、洗浄緩衝液は内毒素不含であり、そしてこれには、１以上のタンパク質分解性タンパク質阻害剤（単数または複数）、例えばフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）等が含まれる。いくつかの態様において、洗浄緩衝液は、ＰＭＳＦおよび／またはアミノエチル−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）の阻害有効量を有する、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。

[0099]いくつかの側面において、尿素を含有するｐＨ１２．５のタンパク質アンフォールディング溶液で、実質的に内毒素不含のペレットを処理して、そしてアルギニン、グリセロールおよび／またはスクロースとともに、減少したモル濃度の尿素を含有するタンパク質再フォールディング溶液中で再フォールディングさせてもよい。精製キメラタンパク質濃度を、１〜３ｍｇ／ｍｌ、そして典型的には約１．４〜１．８ｍｇ／ｍｌの間になるように修正する。いくつかの場合、実質的に内毒素不含のキメラタンパク質を約１．５〜５ｍｇ／２ｍｌ用量、そしてより典型的には、２．０〜３．５ｍｇ／２ｍｌ用量で、ワクチン配合物に提供する。他の内毒素除去法、例えば商業的に入手可能なイオン交換内毒素除去カラム、疎水性カラム等もまた、利用してもよい。

ワクチン
[00100]本発明のワクチンは、本明細書に記載するような免疫学的アジュバント、およびヒト疾患状態の防止または治療に有用なターゲット抗原の組み合わせである。

[00101]本明細書のワクチン態様のための薬学的投薬量には、１〜５ｍｇのキメラポリペプチドが含まれる。本明細書のすべての態様において、製造および保存条件下で、ワクチンは無菌で、液体でそして安定でなければならない。多様な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、ソルビン酸、チメロサール等の添加によって、微生物作用の防止を達成してもよい。

[00102]本明細書のワクチンには、典型的には、約１ｍｇ／２ｍｌ〜３ｍｇ／２ｍｌ用量の総タンパク質量の抗原が含まれ、ここで用量のおよそ５％〜２５％がアジュバントであり、そしてより典型的には、用量の約１０％〜２０％がアジュバントである。いくつかの態様において、アジュバントは、用量の約１８％を構成する。

[00103]例示目的のため、本発明のアジュバントを、ソマトスタチンに基づくポリペプチドと組み合わせて、ヒト成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１不全に基づく疾患および／または状態の治療において有用なワクチンを提供する。本明細書記載のアジュバントを他の抗原と組み合わせて、他のターゲットヒト疾患の治療に有用な新規ワクチンを産生してもよいことに留意されたい。

ヒト疾患の治療法
[00104]本発明は、本発明のキメラポリペプチドおよびアジュバントを含有する薬剤等級ワクチンを提供する。こうしたワクチンを、成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１不全を有する患者に投与して、患者における内因性供給源からの適切な放出を促進してもよい。

[00105]本発明のワクチンを、成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１不全を有する患者に提供する。１つの態様において、治療経過に渡って、３〜５回のブースターとともに、本発明のワクチンを１〜２回提供する。典型的なワクチン抗原量は、１〜５ｍｇ／ｍｌのキメラポリペプチドである。既知の技術によってワクチンを投与してもよい。１つの態様において、皮下注射を通じてワクチンを投与する。別の態様において、皮内注射、筋内注射または注入によって、ワクチンを投与する。

[00106]本発明のワクチン態様には、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、あるいは他の類似の材料がさらに含まれてもよい。例えば、態様には、無菌油、合成モノまたはジグリセリド、脂肪酸またはオレイン酸が含まれてもよい。

[00107]ワクチンは、典型的には、無菌水性溶液として調製される。これらの溶液は、製造および保存条件下で安定である。いくつかの側面において、ワクチン中に、微生物作用を防止する、さらなる剤、例えば抗細菌または抗真菌剤が含まれてもよい。

[00108]必要な量の材料（抗原、アジュバント、他の成分）を取り込むことによって本発明のワクチン溶液を調製し、そして最終滅菌、例えばＵＶ光またはオゾン処理を続けてもよい。あるいは、最終的に集合させる前に、個々に滅菌した構成要素を用いて、本発明のワクチン溶液を調製してもよい（この場合、最後の滅菌は必要でない）。

[00109]本発明のワクチン態様を投与される患者に関して、治療進行を監視して、そしてさらなる投与を提供してもよい。成長ホルモンレベルの増加、インスリン様増殖因子１レベルの増加、および機能的利点（例えば、肥満患者における許容されうる体重減少）はすべて、治療有効性の監視に関するターゲットである。さらに、１型または２型糖尿病あるいは肥満を治療する場合、血糖、ＩＧＦ−１レベル、脂質プロフィール、インスリンレベル、およびヘモグロビン結合性Ａ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）レベルを監視して、患者に対する治療の有効性を決定してもよい。個々の患者の進行に基づいて、本発明にしたがって、より多いまたはより少ない抗原を用いて、さらなるワクチン注射を行ってもよい。さらに、医療専門家によって決定されるように、別のアジュバント組み合わせを用いて、ワクチン接種に対する特定の患者の応答を修飾してもよい。

[00110]本明細書の態様を、ターゲット成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１不全疾患状態または状態のための他の慣用的な療法と組み合わせてもよい。例えば、本発明のワクチン接種を１型糖尿病治療において補充インスリンと組み合わせてもよいし、あるいはワクチン接種を、重度の肥満を患う患者において、減量手術または低カロリー食事療法と組み合わせてもよい。

[00111]本発明を一般的に記載してきたが、例示のために提供され、そして限定として意図されない、以下の実施例を参照することによって、本発明は、より容易に理解されるであろう。

[00112]以下の実施例は、例示目的のためのみに提供され、そして本発明の範囲を限定することを意図されない。
実施例１： ＣＡＴ不完全ソマトスタチン融合タンパク質の構築
[00113]本実施例は、本発明の態様にしたがった、ＣＡＴ不完全ソマトスタチン融合タンパク質の産生を例示する。プラスミドｐＥＴ３０ｂ−Ｃａｔ−Ｓｏｍに対して部位特異的突然変異誘発を行って、Ｈｉｓ１９２およびＨｉｓ１９３をグリシン残基で置換した（修飾後： Ｇｌｙ１９２およびＧｌｙ１９３）。Ｈｉｓ１９３（およびＨｉｓ１９２）残基を不活性化すると、ＣＡＴ酵素が陽子を受容する能力が排除され、それによってＣＡＴの完全な不活性化が提供される。

[00114]同じｐＥＴ３０ｂ−Ｃａｔ−Ｓｏｍ（Ｈｉｓ置換（単数または複数）を有する）中のスペーサーは、同時発現されるｔＲＮＡ分子の非存在下で、大腸菌による発現のため、コドンが最適化された。

[00115]修飾ＣＡＴ不完全ソマトスタチン核酸構築物を配列番号１２に示す。非修飾ＣＡＴ−ソマトスタチン融合タンパク質（配列番号１４）と比較して、ＣＡＴ不完全ソマトスタチン融合タンパク質配列を配列番号１３として開示する。

実施例２： ＣＡＴ不完全ソマトスタチン融合タンパク質は高レベルで発現させうる
[00116]実施例１に記載するような、コドンが最適化されたＣＡＴ不完全ソマトスタチン構築物を用いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において融合タンパク質を発現させた。形質転換細胞をＬＢ中で増殖させて、そして０．４ｍＭ ＩＰＴＧでおよそ３時間誘導した。ＯＤ０．７の密度の培養から１ミリリットルの細胞をペレットにし、そして１００μｌ ＳＤＳ試料緩衝液中で、７０℃で１０分間加熱した。ＳＤＳ ＰＡＧＥのため、レーンあたり４０μｌの細胞抽出物試料を装填した。

[00117]図２に示すように、コドンが最適化されたＣＡＴ不完全ソマトスタチン融合タンパク質の予測されるサイズに対応する２８ＫＤのバンドは、ＩＰＴＧでの誘導後、レーン１（ＬＢ＋ＩＰＴＧ、還元）およびレーン３（ＬＢ＋ＩＰＴＧ）で可視であった。対照レーン２（ＬＢ、還元）およびレーン４（ＬＢ）では発現はまったく見られない。予期されるように、標準的または還元条件下で泳動した際、融合タンパク質サイズには相違はなかった。

実施例３：内毒素不含でコドンが最適化されたＣＡＴ不完全ソマトスタチン含有ワクチン
[00118]本発明にしたがった例示的なワクチン：
試薬溶液：
１．Ｃａｒｂｏｐｏｌ基剤
ａ． ０．５ｇのＣａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐを水または生理食塩水中に溶解する
ｂ． 混合し、そして煮沸して溶解させる。その後、オートクレーブする。

ｃ． ４℃で保存する。
２．スクアレン基剤
ａ． ５８．１ｍｌのスクアレン、４．６ｍｌの非動物起源Ｔｗｅｅｎ８０および５．２ｍｌのＳｐａｎ８５を混合する。

ｂ． ０．２μフィルターを通じて混合物をろ過する。
ｃ． ４℃で保存する。
３．トラガカンチン溶液
ａ． メタノールを用いて、トラガカントゴムを抽出する。

ｂ． メタノール不溶性分画を収集する。
ｃ． 室温で乾燥させる。
ｄ． 乾燥状態で、室温で保存する
ｅ． 水または生理食塩水中で、１グラムの乾燥トラガカンチンを添加する。

ｆ． 混合し、そして煮沸して溶解させ、その後、オートクレーブする
ｇ． ４℃で保存する。
ワクチン調製
１． ５ｍｇ／ｍｌ以下で、生理食塩水またはＰＢＳ中、ワクチン抗原を調製する。

２． ６．７９ｍｌのスクアレン基剤を混合瓶に添加する。
３． １０ｍｌのＣａｒｂｏｐｏｌ基剤をスクアレン基剤に添加する（ＣＳ）。
４． よく混合する。

５． １０ｍｌのトラガカンチン溶液をＣＳ溶液に添加する。
６． よく混合する。
７． 使用のために生理食塩水またはＰＢＳ中で未希釈のまたは希釈されたワクチン抗原を、最終体積８２ｍｌまで添加する。

８． １ｍｌの１％チメロサール溶液を添加し、そしてよく混合する。
９． 使用するまで４℃でワクチンを保存する。
本発明にしたがった別の例示的ワクチン：
試薬溶液：
１．Ｃａｒｂｏｐｏｌ基剤：
ａ． ０．５ｇのＣａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐを水または生理食塩水中に溶解し；
ｂ． 混合し、そして煮沸して溶解させ；そしてオートクレーブし
ｃ． ４℃で保存する。

２．スクアレン基剤：
ａ． ５８．１ｍｌのスクアレン、４．６ｍｌの非動物起源Ｔｗｅｅｎ８０および５．２ｍｌのＳｐａｎ８５を混合し；そして０．２μフィルターを通じてろ過し
ｂ． ４℃で保存する。

３．アラビノガラクタン溶液：
ａ． ＰＢＳまたは生理食塩水中に、１〜１０グラムのアラビノガラクタンを添加し；
ｂ． 混合し、そして煮沸して溶解させ；そしてオートクレーブし
ｃ． ４℃で保存する。

ワクチン調製
１． ５ｍｇ／ｍｌ以下で、生理食塩水またはＰＢＳ中、ワクチン抗原を調製し；
２． ６．７９ｍｌのスクアレン基剤を混合瓶に添加し；
３． １０ｍｌのＣａｒｂｏｐｏｌ基剤をスクアレン基剤に添加し；
４． 完全に混合し、そして１０ｍｌのアラビノガラクタン溶液を添加し；
５． 使用のために生理食塩水またはＰＢＳ中で未希釈のまたは希釈された本発明の抗原を、最終体積８２ｍｌまで添加する。

６． １ｍｌの１％チメロサール溶液を添加し、そしてワクチンを混合し；そして
７． 使用するまで４℃でワクチンを保存する。
実施例４：実施例３のワクチンを用いた心臓血管疾患の治療
[00119]本実施例は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、１９９５において公表されたプロトコルで調製されるような左心室不全を持つラットを用いる。２群のラットを分離し（各群の各メンバーは、左冠状動脈が結紮されている）、第一の治療群には本発明のワクチン接種を投与し、そして第二の対照群にはワクチン接種しないが、それ以外は同じように処置する。治療群の各メンバーにワクチン接種を投与し、そして次いで、２１日後、第二のワクチン接種を筋内投与する（１ｍｌ／用量）。血清ＩＧＦ−１レベルおよび抗ソマトスタチン抗体を第０日、第２１日および第４２日に測定する。第４２日、両群で、血行力学的パラメーターもまた測定し、そして梗塞サイズおよび心係数を決定する。

[00120]実施例３に記載するように、２回のワクチン接種を投与されたラット群は、対照群に比較した際、実質的に改善された心機能（梗塞サイズの減少および心係数の改善）を有するであろう。

実施例５：実施例３のワクチンを用いた肥満の治療
[00121]Ｖｉｃｋｅｒｓら（２００１）に記載されるようなラット肥満モデルを用いて、本発明のワクチンが肥満に対して有する効果を決定する。ラットに高カロリー食餌を３０〜６０日間与える。高カロリーラットの体重を測定し、そして３群−高カロリー食餌を続ける生理食塩水対照群およびワクチン接種群、ならびに正常カロリー食餌群に分ける。ワクチン接種を受けるラットには、第０日および第２１日に、２ｘ１ｍｌ用量を筋内投与する。研究期間全体に渡って、すべてのラットの体重を毎週測定する。第４２日、すべてのラットの体重を測定し、そしてＩＧＦ−１分析、尿素分析および抗ソマトスタチン抗体レベルのために、血清を収集する。

[00122]実施例３に記載するようなワクチン接種を受けたラットは、生理食塩水対照群に勝る、実質的に改善された体重制御を有し、そして体重制御が成長ホルモン修正のためであることと相関する、対応する血清結果を示すであろう。ワクチン接種群は、正常カロリー摂取群と実質的に同じ体重制御を示すであろう。

実施例６：実施例３のワクチンを用いた成長不全の治療
[00123]１ｍｌ用量を用いて、３週齢のＣｏｘ（ＣＤ）ラットに３ヶ月間毎月ワクチン接種する。各ワクチン接種は筋内または皮下的に行う。対照ラットには、同じ投与様式および同体積の投与材料を用いて、生理食塩水注射を行う。すべてのラットの体重を測定して、毎週成長を測定し、そして第０週、第４週、第８週、第１２週および第１６週に採血した。類似のスケジュールで血清を収集し、そしてＩＧＦ−１、尿素および抗ソマトスタチン抗体レベルに関して分析する。

[00124]実施例３に記載するようにワクチン接種を受けたＣＤラットは、対照ＣＤラットに比較した際、実質的に改善された成長を有するであろうと予期される。治療ラットは、治療ラットに対するワクチン接種効果を確認する血清結果を示すはずである。

実施例７：ソマトスタチン増加は、マウスにおいて、体重増加を導く
[00125]外因性に投与されたソマトスタチンが、マウスにおいて体重増加を生じるかどうかを確認するため、マウス肥満研究を行った。非近交系マウスに対して７日間の研究を行い、ここで、３つの異なる本発明のアジュバントを組換えソマトスタチンと組み合わせた（アジュバントは、ＪＨ１４、ＪＨ１７およびＪＨ１８と称される）。各アジュバントに１ｍｇ／ｍｌの組換え産生ソマトスタチン（２００９年に産生）をスパイク処理し、そして１つのアジュバント（ＪＨ１４）にはまた、２００７年に産生したソマトスタチンを２．５７ｍｇ／ｍｌの濃度でスパイク処理した。対照群のマウスには、無菌生理食塩水注射を投与した。

[00126]研究開始時に各マウスの体重を測定して、ベースライン体重を決定した。各マウスに対して、０．５ｍｌのワクチンのＩＰ注射によって、第０日に、ワクチン接種を行った。ＪＨ１７および１８アジュバント中のソマトスタチンを雌マウスに投与し、そしてＪＨ１４を雄マウスに投与した。マウスに７日間の期間に渡って正常食餌を与え、第７日に、各マウスの体重を再度測定した。

[00127]図３に示すように、ソマトスタチンを投与された非近交系マウスは健康なままであり、そして１週間の研究から、副作用はほとんど示されなかった。ＪＨ１７群の雌マウスは体重増加を有し、一方、雌ＪＨ１８マウスは、体重増加が対照マウスと類似であった。２つのＪＨ１４群（２００７および２００９）の雄マウスは、どちらも対照群雄マウスよりも体重増加を示した。全般的に、図３の発見は、ＪＨ１４、ＪＨ１７およびＪＨ１８アジュバントがマウスで使用するのに安全であり、非常に一定であり、そして保存可能であり、そして外因性に投与されたソマトスタチンが、一般的に、ターゲットマウスにおいて、体重増加を生じることを例示し、ソマトスタチンが体重増加に関与するという証拠を提供する。ＩＰ免疫数日以内にこれらの効果がすべて生じた。これは、投与経路、キメラポリペプチドの性質およびアジュバント効果による、加速された速度での直接マクロファージプロセシングおよび抗原提示Ｂリンパ球のためである。

[00128]ＪＨ１４、１７および１８は、本明細書および「Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ Ａｃｅｔｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ）−Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題される米国出願Ｓ／Ｎ ＰＣＴ／ＵＳ０８／６８１９５に記載される通りである。最終配合物は、１ｍｌ用量あたり、１ｍｇタンパク質抗原を有した。この研究のための配合は以下の通りであった：
ＪＨ１７
再フォールディングしたタンパク質 １２ｍｌ（５．８６ｍｇ／ｍｌ）
ダルベッコのＰＢＳ ２４．５ｍｌ
ＪＨ１７プレブレンド １３．４ｍｌ
１％チメロサール ０．５ｍｌ
３７％ホルムアルデヒド ０．１ｍｌ
ＪＨ１８
再フォールディングしたタンパク質 １２ｍｌ（５．８６ｍｇ／ｍｌ）
ダルベッコのＰＢＳ ２４．５ｍｌ
ＪＨ１８プレブレンド １３．４ｍｌ
１％チメロサール ０．５ｍｌ
３７％ホルムアルデヒド ０．１ｍｌ
ＪＨ１４
再フォールディングしたタンパク質 １２ｍｌ（５．８６ｍｇ／ｍｌ）
ダルベッコのＰＢＳ ２７．８ｍｌ
ＪＨ１４プレブレンド １０ｍｌ
１％チメロサール ０．５ｍｌ
３７％ホルムアルデヒド ０．１ｍｌ
上記配合には、ワクチンの混入を制限するため、チメロサールおよびホルムアルデヒドが含まれることに留意されたい。これらの材料は、ワクチンを分配するための多用量の再注入瓶を用いる場合にのみ用いられ、典型的には、ヒトおよび動物治療プロトコルは、単回使用バイアル中にパッケージングされ、それによって、これらの保存剤に関する必要性を排除する。タンパク質分解を補填するため、２００７ ＪＨ１４ロットでは、より高いレベルの抗原を用いたことにもまた留意されたい。

実施例８：マウスにおける肥満の治療
[00129]Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メイン州バーハーバー由来のマウスを用いて、マウス肥満研究を行った。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統由来の多くの近交系マウス何匹かをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得て、マウスは：雄で、誘導された重度の肥満を示し、多遺伝子遺伝学を有し、そして成体発生型肥満を示した。先の試験では、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、この特定の系統のマウスが、高脂肪食餌を与えられると、ヒト集団で報告されるものと性質が非常に似た、メタボリックシンドローム表現型を発展させることを決定した。例えば、高脂肪食餌を与えられたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、内臓脂肪症、インスリン耐性、高インスリン血症、レプチン耐性および高血圧を示すであろう。

[00130]肥満の治療に関して、本明細書のワクチン態様の有効性を試験するための研究を行い、すなわち何匹かのマウスにおいて体重増加を制限して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて体重喪失を引き起こした。６週齢のマウスに、６０％ｋｃａｌ％脂肪食餌を６週間与えた。次いで、１２週齢のマウスを４群の内の１つに分けた：第１群には、ＪＨ１４含有ワクチンで治療したマウスが含まれ；第２群には、ＪＨ１７含有ワクチンで治療したマウスが含まれ、第３群には、ＪＨ１８含有ワクチンで治療したマウスが含まれ、そして第４群には、いかなるタイプの抗ソマトスタチン型抗原でもなく、ＰＢＳで治療した対照マウスが含まれた。ＩＰ経路を通じて、明記するワクチンまたはＰＢＳ ０．５ｍｌを用いて、各群のマウスにワクチン接種した。２２日後、０．１ｍｌのワクチンを用いて、第二のＩＰ用量で、マウスを再び治療した。

[00131]研究経過に渡って（６週間）、各マウスの重量を週２回測定し、そして食物摂取を監視し、すなわち重量変化が食物摂取の減少または増加のためではないことを確実にした（各４群内での累計食物摂取を示す、図４を参照されたい）。研究終了時に、各マウスに対して最後の採血を行い、そしてＩＧＦ−１レベルを決定した（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ． 活性マウス／ラットＩＧＦ−１ ＥＬＩＳＡ（ＤＳＬ−１０−２９２００）を用いて、ＩＧＦ−１血漿レベルを決定した）。

[00132]図５および６ならびに表１に示すように、ＪＨ１４、１７および１８で治療したマウスはすべて、パラメトリックまたはノンパラメトリック統計分析によって、最終体重対ベースライン体重パーセントにおいて、非常に有意な相違（ｐ＜０．０００１）を示した。各ワクチン接種群では、最初の７日間で有意な体重喪失が観察された一方、対照群で同じ期間に渡って、わずかな（ｓｌｅｉｇｈｔ）体重増加が示された。第２２日に、ＪＨ１４、ＪＨ１７およびＪＨ１８群に第二の用量のワクチン（第１日に提供したものの１／５用量）を投与した後もまた、わずかな体重喪失が観察された。

[00133]マウス肥満研究由来のデータは、以下の結論を提供した：（１）ＪＨ１８および対照の間には、ＩＧＦ−１ ｎｇ／ｍｌに関して、統計的に有意な相違はないが、最終体重対ベースライン体重パーセントにおいては、パラメトリックまたはノンパラメトリック統計分析によって、これらの群間に非常に有意な相違がある（Ｐ＜０．０００１）；（２）最終体重対ベースライン体重パーセントにおいて、ＪＨ１７対対照は、どちらの統計検定によっても、統計的に有意な相違を生じた；（３）ＪＨ１８（ＪＨ１７よりも１３５．８ｎｇ／ｍｌ多い平均ＩＧＦ−１レベルを有した）は、ベースライン体重パーセントにおいて、ＪＨ１７に対して統計的に有意な相違を示した（ノンパラメトリック検定によってのみ）；（４）ＪＨ１７およびＪＨ１８アジュバント中の両方の本発明のキメラソマトスタチン抗原は、最終体重対ベースライン体重パーセントにおいて、統計的に有意な相違を誘導した；（５）最終体重対ベースライン体重パーセントに関して、ノンパラメトリック分析によってＪＨ１７と比較した際、ＪＨ１８は統計的に有意であった；（６）ＩＧＦ−１レベルは、対照およびＪＨ１７ワクチン両方に対して、研究終了時に、より高い体重喪失と相関させることも可能である（表２を参照されたい）；（７）すべてのワクチンは、本発明のキメラソマトスタチン抗原の同じ用量を有するため、アジュバント効果が研究内で観察された；（８）６０％ｋｃａｌ脂肪食餌を与えられた近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスは、ＩＰワクチン接種後の１週目に、有意な体重喪失を示した；そして（９）本明細書に示す体重喪失は、マウスが研究期間中、６０ｋｃａｌ％脂肪食餌を食べている間であっても持続した。

[00134]
表１：最終体重対ベースライン体重

表２：ＩＧＦ−１統計分析

[00135]本開示の目的のため、本発明の範囲内であろう多様な変化および修飾を本発明に行ってもよいことが理解される。当業者に容易に示唆され、そして本明細書に開示し、そして付随する請求項に定義されるような、本発明の精神に含まれる、多くの他の変化を行ってもよい。本明細書は特許および刊行物に対する多くの引用を含有する。各々は、すべての目的のため、本明細書に援用される。

Claims (25)

1. 患者における成長ホルモン不全を治療するための方法であって：
   患者に免疫原となる量のワクチンを投与し、該ワクチンが、ソマトスタチンに基づく抗原およびアジュバントを含み、投与されるワクチンが、成長ホルモン不全を有する患者において成長ホルモンレベルの増加を生じる
   工程を含む、前記方法。
2. ワクチンが、実質的に不活性化されたＣＡＴ酵素に、機能可能であるように付着したソマトスタチン−１４のキメラポリペプチドを含む、請求項１の方法。
3. アジュバントが有効量のＣａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐを含む、請求項２の方法。
4. アジュバントが、スクアレンおよび非動物起源のＴｗｅｅｎ８０をさらに含む、請求項３の方法。
5. 患者が、成長不全を有する成人である、請求項１の方法。
6. 患者が、成長不全を有する小児である、請求項１の方法。
7. 成長ホルモン不全に関して治療中の患者が粘膜疾患を有する、請求項１の方法。
8. 成長ホルモン不全に関して治療中の患者が心臓疾患を有する、請求項１の方法。
9. 成長ホルモン不全に関して治療中の患者が肥満である、請求項１の方法。
10. 患者が肥満したイヌである、請求項１の方法。
11. 患者が肥満したネコである、請求項１の方法。
12. 患者が、軟骨修復が必要なウマである、請求項１の方法。
13. 患者におけるインスリン様増殖因子１不全を治療するための方法であって：
    患者に免疫原となる量のワクチンを投与し、該ワクチンが、ソマトスタチンに基づく抗原およびアジュバントを含み、投与されるワクチンが、インスリン様増殖因子１不全を有する患者においてインスリン様増殖因子１レベルの増加を生じる
    工程を含む、前記方法。
14. インスリン様増殖因子１不全に関して治療中の患者が１型または２型糖尿病を有する、請求項１３の方法。
15. インスリン様増殖因子１不全に関して治療中の患者がストレス障害を有する、請求項１３の方法。
16. インスリン様増殖因子１不全に関して治療中の患者が心臓疾患を有する、請求項１３の方法。
17. 脊椎動物を治療するためのワクチンにおいて使用するためのアジュバントであって：
    Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐ基剤；
    スクアレン基剤；および
    アラビノガラクタン溶液
    を含み；
    脊椎動物におけるヒト成長ホルモンまたはインスリン様増殖因子１不全の治療のため、ソマトスタチンに基づく抗原のキャリアーとして作用する
    前記アジュバント。
18. スクアレン基剤が、スクアレン、非動物起源Ｔｗｅｅｎ８０およびＳｐａｎ８５の組み合わせである、請求項１７のアジュバント。
19. ソマトスタチンに基づく抗原が、実質的に不活性化されたＣＡＴ酵素に連結されたソマトスタチン−１４である、請求項１７のアジュバント。
20. 不活性化されたＣＡＴ酵素が、アラニン、グリシンまたは他の類似のアミノ酸で置換された１以上の野生型ヒスチジン残基を有する、請求項１７のアジュバント。
21. 成長ホルモンおよび／またはインスリン様増殖因子１不全を有する患者の治療のためのワクチンであって：
    免疫原となる量のソマトスタチンに基づく抗原；ならびに
    少なくともＣａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐ、スクアレンおよびアラビノガラクタンを含むアジュバント
    を含む、前記ワクチン。
22. ソマトスタチンに基づく抗原が、不活性化されたＣＡＴ酵素に付着したソマトスタチン−１４である、請求項２１のワクチン。
23. 不活性化されたＣＡＴ酵素が、アラニン、グリシンまたは他の類似のアミノ酸で置換された１以上の野生型ヒスチジン残基を有する、請求項２２のワクチン。
24. 患者において肥満を治療するための方法であって：
    免疫原となる量のワクチンを肥満患者に投与し、ここでワクチンはソマトスタチンに基づく抗原およびアジュバントを含み；そして患者における治療進行を監視する
    工程を含む、前記方法。
25. 患者が、ヒト、イヌ、ネコまたはウマである、請求項２４の方法。

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