PL213561B1 - Sposób otrzymywania plazmidu, plazmid oraz zastosowania - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania plazmidu zawartego w trudnej do rozdzielenia niejednorodnej frakcji plazmidowego DNA, zwłaszcza zawierającej różne plazmidy o zbliżonej wielkości. Kolejnym aspektem wynalazku są nowe plazmidy uzyskane sposobem według wynalazku, a także zastosowania tych produktów w biotechnologii i medycynie, zwłaszcza terapii genowej.

We współczesnej biotechnologii wprowadzając fragment DNA (gen) do komórek np. Escherichia coli zakładamy, że będzie w nich funkcjonował tzn. replikował się i podlegał ekspresji. Niczym niechroniony fragment obcego DNA wkrótce zostałby zdegradowany do pojedynczych nukleotydów. Fragmenty DNA, kodujące sekwencję ważnych biologicznie białek jak insulina, interferon czy hormon wzrostu wprowadzane są do komórek gospodarza za pośrednictwem wektorów. Wektory są cząsteczkami DNA, które mają zdolność do autonomicznej replikacji w określonym typie komórek i które zapewniają powielanie wprowadzanego fragmentu DNA, a w wielu przypadkach wydajną ekspresję genów.

Najczęściej wektory są pochodnymi naturalnie występujących plazmidów. Jednak by te ostatnie stały się użytecznymi wektorami plazmidowymi należy wprowadzić do nich szereg modyfikacji a mianowicie: wyposażyć w tzw. marker, czyli gen lub geny odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe jak np. oporność na antybiotyk, możliwie zredukować masę cząsteczkową (im mniejszy wektor, tym większa jego „pojemność oraz prościej nim manipulować), wprowadzić pojedyncze lub usunąć nadmierne ilości (więcej niż jedno) miejsc restrykcyjnych danego typu, które służyć będą do klonowania. Sekwencja nukleotydów wektora powinna być w pełni oznaczona, co umożliwia stwierdzenie czy nie zawiera on znanych lub zbliżonych genów, których rozpowszechnianie może stanowić zagrożenie dla zdrowia a nawet życia ludzi, zwierząt i roślin. Znajomość sekwencji pozwala również na usunięcie niekorzystnych lub dodanie pożądanych sekwencji nukleotydowych np. sekwencje immunogenne w szczepionkach DNA(1). Stwierdzono, że plazmidowe DNA wywołuje najsilniejszą odpowiedź immunologiczną gdy sekwencje CG sąsiadują z dwiema zasadami purynowymi (adenina lub guanina) po stronie „C” i dwiema pirymidynowymi (tymina lub cytozyna) po stronie „G (1) schematycznie oznaczona jako RRCGYY, a opisywana w dalszej części skrótem imm1. Szczególnym przypadkiem tej sekwencji, która wywołuje bardzo silny efekt immunogenny jest imm2, w której po stronie „G” występują dwie zasady tyminowe (1). Ponadto jednostki CG w plazmidach bakteryjnych nie mają dołączonych grup metylowych, podczas gdy u kręgowców jednostki te są zazwyczaj zmetylowane. Wysunięto hipotezę, że organizm kręgowców rozpoznaje dużą częstość nie metylowanych par CG jako sygnał zagrożenia. Stąd taka wzmożona odpowiedź immunologiczna. W procesie terapii genowej taka wzmożona odpowiedź immunologiczna jest niewskazana, ponieważ może dojść do zniszczenia białka terapeutycznego i plazmidu-wektora. Dlatego w terapii genowej korzystne jest stosowanie plazmidów o niskiej zawartości par GC.

Najbardziej użyteczne w biotechnologii są tzw. wektory ekspresyjne, pozwalające na bardzo wydajną syntezę białek kodowanych przez znajdujące się na nim geny. Wektory takie niosą sekwencje promotorowe umożliwiające transkrypcję i translację, a także sekwencje zapewniające stabilność wytwarzanego białka. Znane są wektory ekspresyjne z silnymi promotorami pod kontrolą, których synteza może doprowadzić do akumulacji określonego białka stanowiącego nawet lub ponad 30% ogólnych białek komórkowych. Tego rodzaju wektory ekspresyjne służą od lat produkcji wielu znanych i użytecznych białek, zwłaszcza białek posiadających pożądane właściwości farmakologiczne.

Wiadomo, że pewne złożone segmenty DNA, zwane transpozonami, wykazują zdolność do umiejscawiania się w wielu miejscach genomu organizmu gospodarza. Oznacza to, że pewne duże segmenty DNA, zwane sekwencjami insercyjnymi (ISs), gdy występują w bliskim sąsiedztwie, mogą przemieszczać się jako większa jednostka, obejmująca geny leżące pomiędzy nimi. Tego typu złożone jednostki stanowią transpozon. Występują one u Prokariota, takich jak bakterie, jak również u Eukariota.

W ostatnich latach odkryto i scharakteryzowano wiele użytecznych bakteryjnych transpozonów,

m.in. transpozon określony jako Tn5. Jest to 5.8 kilozasadowy (kz) segment bakteryjnego DNA, który może ulegać insercji w wielu miejscach chromosomu, w plazmidach oraz w „uśpionych fagach bakterii gram-ujemnych. Koduje on gen oporności bakterii na antybiotyki aminoglikozydowe, kanamycynę i neomycynę oraz oporność na gentycynę (G418) w komórkach eukariotycznych. Mapa restrykcyjna Tn5 przedstawiona została przez Berg i wsp., Genetics 105, 813-828 (1983). Dalsze informacje na temat stanu techniki dotyczącego Tn5 zawarte są w pracach przeglądowych według Berg i Berg, Bio/Technology 1, 417-435 (1983); oraz Berg i Berg, w Neidhardt i wsp., (wyd.), „Escherichia coli and

PL 213 561 B1

Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, ASM, Washington, D.C., Rozdz., 63, str. 1,071-1,109 (1987).

W oparciu o transpozony naturalnego pochodzenia uzyskano szereg sztucznych konstruktów przeznaczonych do stosowania w inżynierii genetycznej. Przykładowo, opis patentowy US5137829 prezentuje nowy transpozon DNA, pochodzący z transpozonu Tn5, i użyteczny w otrzymywaniu mutantów i szybkim skriningu długich sekwencji DNA. Opisywany transpozon, obejmuje częściową sekwencję transpozonu Tn5, wraz z oligonukleotydowymi primerami z faga SP6 i T7, dogodnie umieszczonymi w pobliżu przeciwległych końców omawianego transpozonu Tn5.

Klasyczne metody izolacji plazmidowego DNA, stosowane powszechnie w praktyce laboratoryjnej, opierają się zazwyczaj na technikach elektroforetycznych. Pomimo licznych zalet, które zadecydowały o ich rozpowszechnieniu, techniki te posiadają również pewne ograniczenia, w szczególności dotyczące rozdzielczości tych metod. Nie nadają się one do rozdzielania fragmentów DNA o zbliżonej wielkości, zwłaszcza gdy rozdzielana mieszanina zawiera zdecydowanie różne ilości poszczególnych fragmentów. W takim przypadku na żelu elektroforetycznym obydwa fragmenty migrują w postaci jednego prążka, a obecność fragmentu występującego w mniejszej ilości jest dodatkowo maskowana przez fragment liczniejszy.

W świetle powyżej opisanego stanu techniki można zdefiniować kilka obiektywnych problemów technicznych, oczekujących rozwiązania.

Celowe jest zatem poszukiwanie, w szczepach bakteryjnych izolowanych z różnych źródeł, naturalnych plazmidów o specyficznych i użytecznych właściwościach. Dla zrealizowania tego celu, pożądane jest także dostarczenie łatwego sposobu izolowania plazmidu zawartego w trudnej do rozdzielenia niejednorodnej frakcji plazmidowego DNA, zwłaszcza zawierającej różne plazmidy o zbliżonej wielkości.

W szczególności pożądane jest uzyskanie nowych plazmidów, które mogłyby posłużyć do otrzymywania różnorodnych konstruktów wykorzystywanych w biotechnologii, zwłaszcza pozwalających uzyskać stabilną, bądź też podlegającą regulacji, wydajną ekspresję pożądanych białek. W tym kontekście szczególnie pożądane jest także otrzymanie autonomicznych elementów funkcjonalnych, które mogłyby posłużyć do otrzymywania innych, użytecznych konstruktów. Przykładowo, ciągle pożądane jest dostarczanie elementów regulujących transkrypcję, takich jak silne promotory transkrypcji.

Ponadto pożądane jest uzyskanie nowych plazmidów, które posiadałyby obniżoną zawartość sekwencji immunogennych. Tego rodzaju plazmidy mogłyby stanowić dogodne źródło różnorodnych konstruktów przeznaczonych do stosowania w medycynie, zwłaszcza terapii genowej.

Określone powyżej problemy zostały rozwiązane w niniejszym wynalazku.

Dla lepszego zobrazowania istoty wynalazku jego opis uzupełniono o szczegółowe omówienie przykładowych realizacji i przykłady umieszczone w dalszej części opisu. Nie jest jednak intencją zgłaszającego ograniczanie zakresu wynalazku jedynie do opisanych realizacji ani treści poniższych przykładów, ponieważ w oparciu o ujawnienie istoty wynalazku wynikające z niniejszego opisu połączone z ogólnie dostępną wiedzą, specjalista będzie w stanie przygotować inne warianty objęte zakresem ochrony definiowanym w zastrzeżeniach.

W poszukiwaniu nowych plazmidów mogących posłużyć do konstrukcji przemysłowych lub terapeutycznych wektorów ekspresyjnych zbadano szereg szczepów bakteryjnych pochodzących z kolekcji szczepów izolowanych od pacjentów z Centrum Zdrowia Dziecka (CZD).

W szczepie klinicznym Klebsiella pneumoniae o numerze 287-w w numeracji IBA (2324 w numeracji CZD) stwierdzono przy pomocy elektroforezy w żelu agarozowym obecność frakcji plazmidowego DNA. Obraz elektroforetyczny wskazywał na obecność jednego wysokokopiowego plazmidu (ok. 2500 par zasad) oraz jednego niskokopiowego czterokrotnie większego (ok.10 000 par zasad). Nieoczekiwanie, wykorzystanie sposobu według wynalazku pozwoliło na stwierdzenie obecności dwóch różnych plazmidów o zbliżonej wielkości (ok. 2500 par zasad) w szczepie K.pneumoniae 287-w, mianowicie plazmidów pIGRK oraz pIGMS31. Wynalazek dostarcza zatem łatwego sposobu izolowania plazmidu zawartego w trudnej do rozdzielenia niejednorodnej frakcji plazmidowego DNA, zwłaszcza zawierającej różne plazmidy o zbliżonej wielkości. Stanowi to o jego przewadze wobec innych znanych sposobów izolowania plazmidów, zwłaszcza metod elektroforetycznych.

Przedmiotem według wynalazku jest sposób otrzymywania plazmidu zawartego w trudnej do rozdzielenia niejednorodnej frakcji plazmidowego DNA, zwłaszcza zawierającej różne plazmidy o zbliżonej wielkości, charakteryzujący się tym, że frakcję plazmidowego DNA zawartą w całkowitym DNA organizmu źródłowego kontaktuje się z enzymem transpozazy i DNA transpozonu zawierającym gen

PL 213 561 B1 markera selekcyjnego, transfekuje się komórkę gospodarza mikrobiologicznego plazmidem zawierającym transpozon, uzyskanego transformanta namnaża się w warunkach selekcyjnych dobranych dla zastosowanego genu markera selekcyjnego i następnie izoluje się plazmid zawierający transpozon zawarty w komórkach transformanta namnożonych w warunkach selekcyjnych.

Korzystnie, gdy dodatkowo w celu ustalenia cech charakterystycznych otrzymanego plazmidu analizuje się strukturę DNA plazmidu zawierającego transpozon. Korzystnie, gdy frakcja plazmidowego DNA zawiera plazmidy o zbliżonej wielkości obecne w zasadniczo różnej ilości kopii. Korzystnie, gdy DNA wyizolowanego plazmidu zawierającego transpozon poddaje się dalszym modyfikacjom, przy czym prowadzi się co najmniej jedną spośród następujących modyfikacji: usuwa się lub dodaje się miejsce restrykcyjne, wprowadza się gen markera selekcyjnego, wprowadza się gen kodujący obce białko, wprowadza się sekwencję regulatorową.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest plazmid pIGRK posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako nukleotydy znajdujące się w pozycjach od 1240 do 3578 sekwencji nr 1.

Korzystnie, gdy plazmid jest plazmidem wybranym z grupy zawierającej: pIGRKKAN posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 1, pIGRKKANde posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 1 pozbawioną zasad T i A znajdujących się w pozycjach 768 i 768 zgodnie z fig. 5, pIGRKCM posiadają cy sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 3, pIGRKKANT7 posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 4, pIGRKKHgh posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 5. Korzystnie, gdy plazmid jest promotorem zawierającym sekwencję nukleotydów o numerach od 1240 do 1367 sekwencji plazmidu pIGRKKAN przedstawionej jako sekwencja nukleotydowa nr 1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest plazmid pIGMS31 posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako nukleotydy znajdujące się w pozycjach od 1 do 2520 sekwencji nr 2. Korzystnie, gdy plazmid jest plazmidem wybranym z grupy zawierającej: pIGMS31KAN posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 2, pIGMS31PRH posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 6.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie plazmidu pIGRK albo pIGMS31 określonego powyżej do ekspresji sekwencji kodującej polipeptyd albo regulacji tego procesu. Korzystnie, gdy sekwencja kodująca polipeptyd koduje białko heterologiczne.

Korzystnie, gdy stosuje się plazmid wybrany z grupy zawierającej pIGMS31PRH posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 6, pIGRKKHgh posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 5.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie sekwencji nukleotydowej zawierającej sekwencję nukleotydów o numerach od 1240 do 1367 sekwencji plazmidu pIGRKKAN przedstawionej jako sekwencja nukleotydowa nr 1, do otrzymywania sekwencji promotorowej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie plazmidu pIGRK albo pIGMS31 określonych powyżej do otrzymywania plazmidu przeznaczonego do stosowania w medycynie, zwłaszcza terapii genowej.

Korzystnie, gdy otrzymywany plazmid posiada obniżoną zawartość sekwencji immunogennych. Korzystnie, gdy otrzymywany plazmid posiada mniej niż 20 sekwencji immunogennych, korzystnie mniej niż 10, najkorzystniej nie więcej niż 5 takich sekwencji.

Nowe plazmidy mogą posłużyć do otrzymywania różnorodnych konstruktów wykorzystywanych w biotechnologii. W jednym z zastosowań mogą one pozwalać uzyskać stabilną , bądź też podlegającą regulacji, wydajną ekspresję pożądanych białek. Plazmidy według wynalazku mogą być także wykorzystane jako elementy regulacyjne w bardziej złożonych systemach ekspresji. Przykładowo, plazmid według wynalazku może zawierać elementy regulacyjne mogące wywierać wpływ na ekspresję białek kodowanych w innym plazmidzie (np. wektorze innym niż pIG), ale znajdującym się w tej samej komórce. Plazmidy według wynalazku, zawierają znacznie mniej sekwencji immunogennych co czyni je lepszymi wektorami lub fragmentami wektorów dla zastosowań w medycynie, zwłaszcza terapii genowej. Przykładowo, w porównaniu z innymi znanymi popularnymi plazmidami stosowanymi jako wektory, pIGRKKAN i pIGMS31KAN zawierają po 5 takich niepożądanych sekwencji immunogennych, natomiast dla porównania popularny plazmid pBR322 zawiera 38 sekwencji, pUC18 zawiera 20, a pACYC184 zawiera 33 niekorzystnych sekwencji immunogennych.

Plazmidy uzyskane sposobem według wynalazku mogą być także źródłem użytecznych elementów funkcjonalnych, które mogą posłużyć do otrzymywania innych konstruktów. Przykładowo, opisano nowy element regulujący transkrypcję posiadający cechy silnego promotora transkrypcji.

PL 213 561 B1

Dla lepszego zilustrowania treści opisu uzupełniono ją figurami.

Figura 1 i fig. 2 przedstawiają, odpowiednio, mapę restrykcyjną i sekwencję nukleotydów (sekwencja nr 1 w wykazie sekwencji) plazmidu-wektora pIGRKKAN. Na mapie zaznaczono sekwencje immunogenne : imm1 i imm2. Nukleotydy od 1169 do 1199 obejmują obszar do klonowania tzw. multicloning site. Strzałki oznaczają otwarte ramki odczytu dla białek kodowanych przez plazmid. Ramka od nukleotydu 87 do 959 koduje fosotransferazę aminoglikozydową - białko związane z funkcją oporności na kanamycynę. Funkcje pozostałych ramek odczytu nie są znane.

Figura 3 i figura 4 przedstawiają, odpowiednio, mapę restrykcyjną i sekwencję nukleotydów (sekwencja nr 2 w wykazie sekwencji) plazmidu -wektora pIGMS31KAN; na mapie zaznaczono sekwencje immunogenne : imm1 i imm2. Nukleotydy od 3651 do 3723 obejmują obszar do klonowania tzw. multicloning site. Strzałki oznaczają otwarte ramki odczytu dla białek kodowanych przez plazmid. Ramka od nukleotydu 2667 do 3479 koduje fosotransferazę aminoglikozydową - białko związane z funkcją oporności na kanamycynę. Funkcje pozostałych ramek odczytu nie są znane.

Figura 5 prezentuje porównanie fragmentu sekwencji wektora pIGRKKAN zawierającego sekwencję nukleotydową rozpoznawaną przez enzym restrykcyjny NdeI z tym samym obszarem w wektorze pIGRKANde, w którym usunięto tą sekwencję. W plazmidzie - wektorze usunię to dwie zasady nukleotydowe T i A stanowiące tzw. lepkie końce sekwencji rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny NdeI.

Figura 6 i fig. 7 przedstawiają, odpowiednio, mapę restrykcyjną i sekwencję nukleotydów (sekwencja nr 3 w wykazie sekwencji) plazmidu pIGRKCM. Na mapie zaznaczono sekwencje immunogenne: imm1 i imm2. Strzałki oznaczają otwarte ramki odczytu dla białek kodowanych przez plazmid. Ramka od nukleotydu 1639 do 2236 koduje białko acetylotransferazy chloramfenikolowej (CAT) warunkujące oporność na chloramfenikol. Funkcje pozostałych ramek odczytu nie są znane.

Figura 8 i fig. 9 przedstawiają, odpowiednio, mapę restrykcyjną i sekwencję nukleotydów (sekwencja nr 4 w wykazie sekwencji) wektora ekspresyjnego pIGRKANT7. Nukleotydy od miejsca restrykcyjnego XbaI do miejsca PstI stanowią region „promotorowo-terminatorowy zawierający promotor i terminator transkrypcji dla genu kodującego polimerazę RNA w genomie bakteriofaga T7. Ramka od nukleotydu 147 do 960 koduje fosotransferazę aminoglikozydową - białko związane z funkcją oporności na kanamycynę. Funkcje pozostałych ramek odczytu nie są znane.

Figura 10 i figura 11 przedstawiają, odpowiednio, mapę restrykcyjną i sekwencję nukleotydów (sekwencja nr 5 w wykazie sekwencji) wektora ekspresyjnego pIGRKKHgh. Nukleotydy od miejsca restrykcyjnego BamHl (1169) do NdeI (2112) obejmują obszar promotora P1 i P2 z operonu deo E. coli. Strzałka od nukleotydu 2112 do 2921 obejmuje sekwencję genu fuzyjnego syntetycznej ubikwityny i ludzkiego hormonu wzrostu. Strzałka od nukleotydu 147 do nukleotydu 960 obejmuje gen oporności na kanamycynę.

Figura 12 i figura 13 przedstawiają, odpowiednio, mapę restrykcyjną i sekwencję nukleotydów (sekwencja nr 6 w wykazie sekwencji) plazmidu pIGMS31PRH. Sekwencja promotorowa znajduje się w pozycji 3699-3898, ramka kodująca białko fuzyjne znajduje się w pozycji 3918-4659.

Figura 14 prezentuje analizę elektroforetyczną lizatów komórkowych na 15% żelu poliakrylamidowych. 1. Marker wielkości (97,0, 66,0, 45,0, 30,0 20,1 14,4 kDa). 2. Szczep gospodarza DΗ5μ. 3 Szczep DH5p transformowany plazmidem pIGMS31PR. 4. Szczep DΗ5μ transformowany plazmidem pIGMS31PRH. Strzałka oznacza pozycję białka fuzyjnego.

Przykład 1. Wstawianie transpozonu EZ::TN™<kan-2> do plazmidów ze szczepu K.pneumoniae 287-w.

Szczep 287-w jest oporny na szereg antybiotyków. Nie udało się wykazać, że geny warunkujące oporność na antybiotyki znajdują się na którymś z plazmidów. Tak, więc plazmidy izolowane ze szczepu K. pneumoniae nie posiadały markera selekcyjnego jednej z podstawowych cech każdego wektora. Do plazmidów izolowanych z K. pneumoniae 287-w wstawiono przy pomocy enzymu transpozazy zmodyfikowany transpozon Tn5-EZ::TN™<kan-2> niosący gen oporności na kanamycynę.

Zmodyfikowariy transpozon EZ::TN™<kan-2>(Epicentre Technologies, Madison WI, USA) poza genem oporności na kanamycynę zawiera zgrupowanie pojedynczych miejsc rozpoznawanych przez enzymy często używane w procesie klonowania, czyli tzw.: „multicloning site. W skład zestawu firmy Epicentra Technologies poza transpozonem wchodzą enzym transpozaza oraz startery umożliwiające sekwencjonowanie fragmentu plazmidu ze wstawionym transpozonem. Warunki reakcji in vitro są tak dobrane przez producenta aby osiągnąć maksymalną częstość pojedynczego a zminimalizować częstość wielokrotnego włączania transpozonu do pojedynczej cząsteczki plazmidu. Komórki E.coli DH5a

PL 213 561 B1 z plazmidem zawierającym transpozon kanamycynowy selekcjonowano na podłożu LB z kanamycyną (50 μg/ml.

Przykład 2. Sekwencja nukleotydów plazmidów ze szczepu. K. pneumoniae 287-w.

Oznaczenie sekwencji plazmidów otaczającej wstawiony transpozon kanamycynowy pozwoliło na stwierdzenie obecności dwóch różnych plazmidów o zbliżonej wielkości (ok. 2500 par zasad) w szczepie K. pneumoniae 287-w. Tak więc wstawienie transpozonu kanamycynowego pozwala na zidentyfikowanie odmiennych plazmidów nie dających się zróżnicować metodą elektroforezy ze względu na nieznaczną różnicę wielkości oraz na występowanie jednego z plazmidów w przeważającej ilości kopii maskującej obecność plazmidu niskokopiowego. Plazmidy, w które wstawiono transpozon kanamycynowy mogą być przenoszone metodą transformacji do znanych szczepów E.coli stosując jako czynnik selekcyjny kanamycynę. Tą drogą można uzyskać szczepy E.coli niosące pojedyncze plazmidy, co umożliwia namnożenie ich DNA w celu użycia w szeroko pojętym procesie klonowania.

Ustalono pełną sekwencję obydwu plazmidów.

Mapa restrykcyjna oraz sekwencja nukleotydów mniejszego plazmidu noszącego symbol pIGRKKAN przedstawiono na figurach 1 i 2.

Mapę restrykcyjną, sekwencję nukleotydów większego plazmidu oznaczonego symbolem pIGMS31KAN przedstawiono na figurach 3 i 4.

Sekwencja plazmidu pIGRKKAN składa się z 3578 par zasad o zawartości par GC 33,4%. W sekwencji plazmidu zawarte są dwie sekwencje imm1 i trzy sekwencje imm2. W plazmidzie występują 2 sekwencje rozpoznawane przez enzym restrykcyjny SwaI, który rozpoznaje 8-mio nukleotydową sekwencję występującą statystycznie raz na 40 000 par zasad w genomie E.coli. Nukleotydy od 1-9 i od 1241-1249 są tzw. sekwencjami bezpośrednio powtórzonymi (ang. direct repeat), z których jedna powstaje dodatkowo przez powtórzenie 9 par zasad w miejscu włączania transpozonu. Nukleotydy od numeru 10 do numeru 1230 odpowiadają 1221 parom zasad włączonego transpozonu kanamycynowego EZ:: TN™<KAN-2>. Nukleotydy od numeru 1240 do 3578 odpowiadają sekwencji naturalnie występującego plazmidu w szczepie K.pneumoniae 287-w. Sekwencja naturalnie występującego plazmidu pIGRK wynosi 2338 par zasad.

Przy pomocy programu BLASTN porównano sekwencję plazmidu pIGRK z sekwencjami nukleotydowymi zawartymi w bazie danych NCBI. Homologia plazmidu pIGRK do sekwencji znajdujących się w bazie danych NCBI dotyczy krótkich odcinków DNA co pozwala opierając się na klasyfikacji opartej na podobieństwach sekwencji replikonów na stwierdzenie, że jest to nowy nie opisany plazmid (2). Przy pomocy programu BLASTX porównano przetłumaczoną na aminokwasy sekwencję nukleotydową plazmidu pIGRK z bazą danych sekwencji białkowych. Sekwencje aminokwasowe powstałe po translacji z otwartych ramek odczytu plazmidu pIGRK mają bardzo małe homologie do sekwencji białkowych znajdujących się w bazie danych SwissProt. Homologie te są na tak niskim poziomie, iż można uznać, białka, które koduje pIGRK są niepodobne do żadnych innych białek.

Sekwencja plazmidu pIGMS31KAN składa się z 3750 par zasad o zawartości par GC 36,8%. W sekwencji plazmidu zawarte są cztery sekwencje imm1 oraz jedna imm2. W plazmidzie występują 3 sekwencje rozpoznawane przez enzym restrykcyjny SwaI, który rozpoznaje 8-mio nukleotydową sekwencję występującą statystycznie raz na 40 000 par zasad w genomie E.coli. Nukleotydy od 1-9 i od 2521-2529 są tzw. sekwencjami bezpośrednio powtórzonymi (ang. direct repeat), z których jedna powstaje dodatkowo przez powtórzenie 9 par zasad w miejscu włączenia transpozonu. Nukleotydy od numeru 2530-3750 odpowiadają 1221 parom zasad włączonego transpozonu kanamycynowego EZ::TN™<KAN-2>. Sekwencja plazmidu występującego naturalnie w K. pneumoniae 287-w zawarta jest pomiędzy nukleotydami 1 i 2520. Sekwencja od nukleotydu 2521 do 2529 stanowi proste powtórzenie sekwencji od nukleotydu 1 do 9 powstające przy włączaniu się transpozonu do plazmidu.

Sekwencja naturalnie występującego plazmidu pIGMS31 wynosi 2520 par zasad.

Przy pomocy programu BLASTN porównano sekwencję plazmidu pIGMS31 z sekwencjami nukleotydowymi zawartymi w bazie danych NCBI. Homologia plazmidu pIGMS31 do sekwencji znajdujących się w bazie danych NCBI dotyczy krótkich odcinków DNA, co pozwala opierając się na klasyfikacji opartej na podobieństwach sekwencji replikonów na stwierdzenie, że jest to nowy nie opisany plazmid (2).

Przy pomocy programu BLASTX porównano przetłumaczoną na aminokwasy sekwencję nukleotydów plazmidu pIGMS31 z bazą danych sekwencji białkowych. Największa homologia składu aminokwasowego plazmidu była na poziomie 36% i dotyczyła tylko krótkich odcinków sekwencji przetłumaczonej na aminokwasy. Te nieznaczne podobieństwa dotyczą białek biorących udział w procesie

PL 213 561 B1 rekombinacji i procesie inicjacji replikacji. Homologie te są na tyle małe, że pozwalają również wnioskować, że pIGMS31 jest nowym nie opisanym plazmidem.

Plazmidy kryptyczne ze szczepu K.pneumoniae 287-w posłużyły do szeregu przekształceń i modyfikacji w celu uzyskania nowych wektorów.

Plazmidy pIGRKKAN i pIGMS31KAN mogą służyć jako wektory, ponieważ zawierają tzw. multicloning site czyli miejsce z sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne najczęściej stosowanymi w procesie klonowania. Gen oporności na kanamycynę, izolowany z transpozonu Tn903 zapewnia również oporność na neomycynę w E.coli. Poniżej podane są przykłady modyfikacji plazmidów pIGRKKAN i pIGMS31KAN.

Przykład 3. Usuwanie miejsca restrykcyjnego rozpoznawanego przez enzym NdeI.

Plazmid pIGRKAN zawiera jedno miejsce restrykcyjne NdeI. Jest to miejsce restrykcyjne często używane w procesie klonowania, ponieważ zawiera sekwencję ATG, kodon dla metioniny, aminokwasu od którego rozpoczyna się proces translacji większości białek. Miejsce restrykcyjne usunięto przy pomocy ograniczonego trawienia nukleazą z kiełków fasolki mung (Mung Bean Nuclease). Efektywność działania nukleazy sprawdzano metodą trawienia enzymem NdeI oraz poprzez oznaczenie obszaru sekwencji plazmidu, w którym znajdowało się miejsce rozpoznawane przez ten enzym. Sekwencję części plazmidu pIGRKKAN z której usunięto miejsce restrykcyjne NdeI, a oznaczoną jako pIGRKKANde przedstawiono na fig. 5. Z sekwencji usunięto dwie zasady T i A stanowiące tzw. lepkie końce po trawieniu NdeI, co spowodowało brak wrażliwości DNA plazmidu na ten enzym. Zmieniona została hipotetyczna ramka odczytu, co nie wpłynęło w widoczny sposób na poziom replikacji plazmidu.

Przykład 4. Modyfikacja plazmidu pIGRK polegająca na wprowadzeniu fragmentu DNA niosącego oporność na chloramfenikol.

Do sekwencji plazmidu pIGRK dodano fragment DNA z genem acetylotransferazy chloramienikolowej (CAT) warunkującym oporność na chloramfenikol. Plazmid pIGRK po trawieniu enzymem restrykcyjnym AsuII ligowano z fragmentem DNA o długości 952 par zasad zawierającym gen CAT trawiony również enzymem AsuII, pochodzący z plazmidu pBW4 (3). Plazmid pIGRKCM o długości 3298 par zasad, niosący gen oporności na chloramfenikol przedstawiono na figurach 6 i 7. Taki plazmid może posłużyć do konstrukcji wektora ekspresyjnego.

Przykład 5. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych zawierających promotor i terminator transkrypcji bakteriofaga T7.

Skonstruowano dwa wektory ekspresyjne zawierające promotor i terminator transkrypcji dla genu kodującego polimerazę RNA w genomie bakteriofaga T7 w oparciu o plazmidy pIGMS31KAN i pIGRKKAN. Mapy restrykcyjne tych plazmidów przedstawiono odpowiednio na figurach 8 i 9. Plazmid pIGMS31KAN i jego pochodna plazmid pIGMS31KANT7 są plazmidami niskokopiowymi w przeciwieństwie do plazmidu pIGRKKAN i pIGRKKANT7, które występują w wysokiej liczbie kopii w komórce bakteryjnej.

Przykład 6. Wykorzystanie plazmidu pIGMS31KAN do ekspresji genu kodującego ludzki hormon wzrostu

Na plazmidzie pIGMS3lKAN umieszczono sekwencję promotorową retronu Ec86 i następującą po niej sekwencję terminatora transkrypcji (4). Wykorzystano do tego celu miejsca restrykcyjne BamHI i HindIII. Powstał y plazmid nazwano pIGMS31PR. Plazmidu pIGMS31PR uż yto do klonowania genu kodującego białko fuzyjne złożone z ubikwityny drożdżowej i ludzkiego hormonu wzrostu. Do klonowania użyto miejsc restrykcyjnych NdeI i SalI Pełną sekwencję plazmidu pochodnego, pIGMS31PRH przedstawiono na figurach 12 i 13. Plazmidem transformowano komórki E.coli DH5a. Elektroforetyczna analiza lizatów komórkowych wykazała obecność białka o wielkości odpowiadającej białku fuzyjnemu ubikwityna hormon wzrostu (figura 14)

Przykład 7. Wykorzystanie plazmidu pIGRKKAN do ekspresji genu kodującego ludzki hormon wzrostu.

W plazmidzie pIGRKKAN sklonowano fragmenty DNA obejmujące promotory P1 i P2 z operonu deo E.coli K-12, fuzję genu hormonu wzrostu i zmodyfikowanego genu ubikwityny oraz sekwencję terminatora transkrypcji. Mapę restrykcyjną zrekombinowanego plazmidu oznaczonego symbolem pIGRKKHgh przedstawiono na fig. 10 i 11. Czynnikiem selekcyjnym w wektorze ekspresyjnym jest gen oporności na kanamycynę pochodzący z komercyjnego transpozonu EZ::TN™<KAN-2>. Plazmidem transformowano komórki E.coli DH5a. Elektroforetyczna analiza lizatów komórkowych wykazała obecność białka o wielkości niemal identycznej z wielkością wzorca UBI-Hgh.

PL 213 561 B1

Przykład 8. Wykorzystanie promotora z plazmidu pIGRKKAN do ekspresji genu kodującego ludzki hormon wzrostu w plazmidzie pIGMS31KAN.

Obszar plazmidu pIGRKKAN zawarty pomiędzy nukleotydami 1240-1367 przeniesiono do sekwencji polilinkera plazmidu pIGMS31KAN. Poniżej tej sekwencji umieszczono gen kodujący białko fuzyjne ubikwityny i ludzkiego hormonu wzrostu oraz terminator transkrypcji. Elektroforetyczna analiza lizatów komórek E.coli DH5a transformowanych tym plazmidem wykazała obecność znacznych ilości białka o wielkości odpowiadającej białku fuzyjnemu. Oznacza to, że w plazmidzie pIGRKKAN w obszarze od nukleotydu 1240 do 1367 zawarta jest sekwencja, która funkcjonuje jako bardzo wydajny promotor transkrypcji. Opisywany obszar zawiera polipurynową (AGGAGG) sekwencję Shine-Dalgarno pomiędzy nukleotydami 1356-1361 w pobliżu kodonu ATG będącego początkiem jednej z ramek odczytu w plazmidzie pIGRKAN.

Literatura

1. Roman, M., Martin-Orozoco, E., Goodman, J.S., Nguyen, M.D., Sato, Y., Ronaghy, A., Kornbluth, R.S., Richman, D. D., Carson, D. A., and Raz, E. (1997). Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants. Nat. Med. 8, 849-54.

2. Couturier, M., Bex, F., Bergquist, P. L., and Maas, W. K., (1988) Identification and classification of bacterial plasmids. Microbiol. Rev., 52, 375-395.

3. Mikiewicz, D., Wróbel, B., Węgrzyn, G., and Płucienniczak, A. (1997) Isolation and and characterization of a ColE1-Iike plasmid from Enterobacter agglomerans with a novel variant of rom gene. Plasmid, 38, 210-219.

4. Lim D., Maas W.K. (1989) Reverse transcriptase-dependent synthesis of a covalently linked, branched DNA-RNA compound in E.coli B. Cell 56, 891-904.

PL 213 561 B1

Wykaz sekwencji <110> INSTYTUT BIOTECHNOLOGII I ANTYBIOTYKÓW <120> Nowe plazmidy, ich pochodne i fragmenty, sposób ich otrzymywania oraz zastosowania <130> PK/0038/RW <160 6 <170> Patentln version 3.2 <210 1 <211> 3578 <212> DNA <213> Sztuczna <220>

<223> plazmid <400> 1 actctagccc tgtctcttat acacatctca accatcatcg atgaattgtg tctcaaaatc 60 tctgatgtta cattgcacaa gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa ctgtctgctt 120 acataaacag taatacaagg ggtgttatga gccatattca acgggaaacg tcttgctcga 180 ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata 240 atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt 300 tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac 360 taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg 420 atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccggaaaaac agcattccag gtattagaag 480 aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc 540 attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg 600 cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg 660 gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataaact tttgccattc tcaccggatt 720 cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa 780 taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc 840 tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg 900 gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct 960 aatcagaatt ggttaattgg ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact tgacgggacg 1020 gcggctttgt tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca cgcatcttcc 1080 cgacaacgca gaccgttccg tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact ggtccaccta 1140 caacaaagct ctcatcaacc gtggcgggga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 1200 cttcagggtt gagatgtgta taagagacag actctagcca gtttccaagt agaaactaca 1260 gtttctaaac tgcaactttt tctacttttt gcaacttaat ctattgacta gtcctttata 1320 aatgttaaaa catatatata gaaataaata aaaagaggag gtttctatgg atattggaaa 1380 tatattaaat gagagtttaa gtattgatta cgaaaaatta gatttgtttt tggaaaaata 1440 tgatttaaca ccagaacaaa aagttgcagt ttatgaattt cacgcaaaag cttataaaaa 1500 aaataaaact ttagttattt ctgaaacaaa agaaaataaa tttaaatcta tttccgaagg 1560 tgttgaatac gtgcatttat tcccaaaaaa tttaaaaatt ttaattaaaa aatatggttt 1620 aaatacaaac gaattattgg ttttaacgga aataatggag tcaatgcttt cacacggaaa 1680 tttattaatt aatttttcgc aaaaggcact ttgcgaatta acaggaatta ataaatctac 1740 aatgtgtaaa acatttaaaa ccctcaaaca aaagcagtgt ttaattgaga aaaacggaca 1800 tatttattta aattctgtga tatttatgaa agggttacct cataaattgt ttatgcaatt 1860 tagagatcat tttttaaatt ctatctcata taaattagat gatgaagaag aatttgaaaa 1920 agtcttcgac gataatttta ttaaagcata cgaaaaaaat ctcaaagaga ttaaaaagaa 1980 aaagcaacaa ataaaagaaa agaaaatatc aaaagcatta gataattttg aaaaagaaat 2040 ctcgaaagaa tggaaggaaa agtttaaaga cgaagaggaa aatttcgaat ttggttttga 2100 atcggaaata taaaaccgcc ctcgccgggc aggcgaatcc cttattgaaa tagaataaat 2160 tctattccac taagggattt tttttattca ttgtttctcc acatttgcaa tattgacatt 2220 aacttccacc cggatataac agtagtataa gttgttgttt caacccgtct ttttgggtgg 2280 aacaacaagg cattttaggg atagagcaaa gcgaaggcca taaaattgcc acccccaacc 2340 gggggtcgtt gttcgatttg agcgatagcg aaaaattgaa cataaggggg gagggtttgg 2400 gttttacggt atttcaaatt tgagcaaagc gaatttttga aatttccggt tcttttaatt 2460 tgcaatgagg aaaaatcaat atgggtaatt caaaaagaaa tataaaaaaa ctaaatgata 2520 attttagaga ggatatttta gattatgcga tcgcgcacaa tctaaaatgt gctaacgcac 2580 ttgctatttt atacgcaacg ggttgccgtc cggacgaact ccaaaccgga gttactgtaa 2640 actatgacag taaaaaaaat gaaattgaat ttagaataat tggatcaaaa ctaaatagaa 2700 gaatgagaag aggcataggg gttagaaaaa taaaagtaaa aatcaataat gaaaatgcca 2760

PL 213 561 B1 ggttttttaa aaacattgtt gataaattta ttgaaaaccc tcaaaattga aagtgccaaa gcattttccg ggtacataac ggcccaggaa aacctatcat gcttctgcat attcttttag taaaaaattc cgattatgat aaaatcgaaa tagctcagat gatctcagca gagttacgga agaaagagca aaaaaagcaa cagatgtcga aaccaatgtt aaaccccgtg gcggtgatag caaataaaaa caaagcagcg gcaaaaattg ccgatacttc cggctcccgt tcgtcgcttc aaaatgtgaa ccgtgagcag actgtgaagg gttggcccgt ccggtcagga cggttttaca gcagaagccc ggaacgggta actggatggt tttcccccgt gaaaaccaat gatcttaaaa gccatctcaa aagttgaaaa taaaattctt agatgttctt aggagttaaa aaactactct atttttaaaa aaggcagttg tcaaaaactt caaccgtagt gttgtcaaat tcgtcaactg aggttgtcaa atccgaca <210> 2 <211> 3750 <212> DNA <213> sztuczna <220>

<223> plazmid <400> 2 gtttataact gagttataaa tacttataac ttaattatta aaaataaatt agtaaataaa gaaaattact caatattaga tatttgaaaa taaatcgact ttagaaattg atttaaatca ttgcaaacga aactgtagaa gaacttataa taaaagaagt gcgataaaag caatggtgtt aatttaaatg caaaagttta cttcattaaa aaaagatttt gttattacat ttgtagataa taaatttaaa acctaatgag tttagaatta tcgtcgagat gaaatctaat taacctttca caatctacaa ttgcgaaaaa atgtaagtta ttattttaaa aaccttaaaa agaaaaatat acgtctttat gaatagtaat attttttcta aaggattagc aaagaaaaaa tttgaaatcc gcacaagtcg aagacgataa acccaacggg aaatttttca ctgtttcccg ttccgggctt cttattctgg ggtgtgtagt tattattttg ctgtttctgt tgcaatagca gcattgaaga gttgtttaaa ttctgccggt taaaacatca ctgttaattt tatatttttc atatctctga taactgcctt ttgtattcta ttatttccaa ctccatatct ttgaatgatt tgttcttgct cagccgtggc tctggccact tacccgttcc tggactcttc tgttgaagtt ctgacggaga atgctctaaa cggctcttaa acccgtttag acgagctata gtaaggtttt agagcctttc gtatgtaacg attaacctca cactacctcc ggatctctaa ataatttttt cttttcttct ttcaatttta ttattttcta tttctaattc ggtttcattc gtaaaattct ttaacttcct tatattctgc attcgaaacc taaacctaat ggcttattgt atttaaaata tatatcctgc atacgattta ttgtttagtt tatatattcc gtttttattt gtgaatatgt ggagtttgct cgtccaagtg taaaactgca ttcactttgc aaatattcca tttgaacttt aatccaatcc aaaaaattct ggggaagctg ttaaaactaa ttcattacaa agctttaaca ttggttgctt gaaaccttgc attaatatca gattaaaatt cggttttggg atttaaggtt aggatctgca catattgtga gaatttttcc cggcgattga agtatttttt tgcataagcc atattcgaaa acctcccgtt aaaagcagta cctgccaggc tcacaccgag atttctcggt atagtgagta aaatctataa atacatctac aataaaaaaa gcaaaagtca ggaaaattaa aatttcccct tactcacgat ttccaataaa agcaagtcaa aattttaatt ttggcttgtg aagggttgac aatctgcgca gatgcttatg tattgcccgg aacgggaaac aaacacatct cccggaacgg gggttttctt ttgcgtagcc ggaggtttgc accgtttact ctcttacttt cttattgttt agcccttgct attactgact taaatcaaaa aaaagttata tatagatttc tataacccca gttatagatt cctataaccc caacttctta taactaagtt ataaaaagtt gtaatcatgt

aatgtcatat	gatcacaaaa	2820
aaaaatatcg	aaaaagctat	2880
acatgcaaaa	gcaacggaat	2940
tatgggccat	gcctcagtta	3000
aggtggattt	gatgacatcg	3060
attattgaga	tttaagatcg	3120
cacccccagc	agtcctccac	3180
ttcaggaggt	tccctcctgg	3240
gcaaaatcct	ccatagcgaa	3300
gggggattga	tctgttactt	3360
tttcaccccc	ttagtgttct	3420
ctaaccattg	atattactgg	3480
tgtcaaattc	gtcaactcca	3540 3578

atggggtttt	aatatgaaaa	60
gactttgccg	gaagatccat	120
attcgattta	tttaatagaa	180
taacgatcct	aatgaccgaa	240
tgtagaaaaa	gaaaaaaaga	300
tcttgaggct	ttagcaaaat	360
tgtaaaggtt	atggaatacg	420
tttaaatctt	gcaaaatcaa	480
attagtagaa	aaagacggac	540
ccatcgtttg	gacgaagaaa	600
ttttaaaaac	tcattttaaa	660
tataatttta	aagcctttgg	720
gaatattcgg	catctgctgc	780
ttatgctctt	gtattagatc	840
gaaattgaag	cattttcctt	900
tttatttttc	tgtttttatt	960
gctaactttt	gctcctgttg	1020
tcagacaact	cagcctctga	1080
aggggctttc	gttcgttctt	1140
gctcctgtgt	agtgcttagg	1200
gtttcaacaa	ctctaatttt	1260
ttaatgtttt	taatatcgct	132C
tcttttttaa	tcccacggat	1380
attgtttcgt	attttttcat	1440
tcgattggtg	ttataaaggc	1500
ttaattgcat	tttccccata	1560
tccaattttt	tgttatttgc	1620
ataacagaag	tagaattacg	1680
gtccttaaat	caccagaacc	1740
ttatgtgttt	tcctcaatcg	1800
gttttttcca	ctcttaaaat	1860
aggttttttt	ctttttggcc	1920
taccttttct	gcaatattga	1980
acggctcaat	ccctcgcaag	2040
agaaaaaaga	cagaacgctg	2100
caagcgaagc	gcggtaggga	2160
gtctgttgta	gcggtagcga	2220
tggcaagttc	tgctcgatct	2280
taaatcttac	atacccctcc	2340
gattcctata	acctaaaagt	2400
ccctaagttg	gtcattcgac	2460
attgactagt	tgtatatttt	2520

PL 213 561 B1 gtttataacc tgtctcttat acacatctca accatcatcg atgaattgtg tctcaaaatc 2580 tctgatgtta cattgcacaa gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa ctgtctgctt 2640 acataaacag taatacaagg ggtgttatga gccatattca acgggaaacg tcttgctcga 2700 ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata 2760 atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt 2820 tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac 2880 taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg 2940 atgatgcatg gttactcacc actgcgatoc ccggaaaaac agcattccag gtattagaag 3000 aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc 3060 attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg 3120 cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg 3180 gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataaact tttgccattc tcaccggatt 3240 cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa 3300 taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc 3360 tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg 3420 gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct 3480 aatcagaatt ggttaattgg ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact tgacgggacg 3540 gcggctttgt tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca cgcatcttcc 3600 cgacaacgca gaccgttccg tggcaaagca aaagttcaaa atcacoaact ggtccaccta 3660 caacaaagct ctcatcaacc gtggcgggga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 3720 cttcagggtt gagatgtgta taagagacag 3750 <210> 3 <211> 3295 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 3 gatctcagca gagttacgga agaaagagca aaaaaagcaa aggtggattt gatgacatcg 60 cagatgtcga aaccaatgtt aaaccccgtg gcggtgatag attattgaga tttaagatcg 120 caaataaaaa caaagcagcg gcaaaaattg ccgatacttc cacccccagc agtcctccac 180 cggctcccgt tcgtcgcttc aaaatgtgaa ccgtgagcag ttcaggaggt tccctcctgg 240 actgtgaagg gttggcccgt ccggtcagga cggttttaca gcaaaatcct ccatagcgaa 300 gcagaagccc ggaacggtaa ctggatggtt ttcccccgtg ggggattgat ctgttacttg 360 aaaaccaatg atcttaaaag ccatctcaaa agttgaaaat ttcaccccct tagtgttctt 420 aaaattctta gatgttctta ggagttaaaa aactactctc taaccattga tattactgga 480 tttttaaaaa aggcagttgt caaaaacttc aaccgtagtt gtcaaattcg tcaactccag 540 ttgtcaaatt cgtcaactga ggttgtcaaa tccgacaact ctagccagtt tccaagtaga 600 aactacagtt tctaaactgc aactttttct actttttgca acttaatcta ttgactagtc 660 ctttataaat gttaaaacat atatatagaa ataaataaaa agaggaggtt tctatggata 720 ttggaaatat attaaatgag agtttaagta ttgattacga aaaattagat ttgtttttgg 780 aaaaatatga tttaacacca gaacaaaaag ttgcagttta tgaatttcac gcaaaagctt 840 ataaaaaaaa taaaacttta gttatttctg aaacaaaaga aaataaattt aaatctattt 900 ccgaagtgtt gaatacgtgc atttattccc aaaaaattta aaaattttaa ttaaaaaata 960 tggtttaaat acaaacgaat tattggtttt aacggaaata atggagtcaa tgctttcaca 1020 cggaaattta ttaattaatt tttcgcaaaa ggcactttgc gaattaacag gaattaataa 1080 atctacaatg tgtaaaacat ttaaaaccct caaacaaaag cagtgtttaa ttgagaaaaa 1140 cggacatatt tatttaaatt ctgtgatatt tatgaaaggg ttacctcata aattgtttat 1200 gcaatttaga gatcattttt taaattctat ctcatataaa ttagatgatg aagaagaatt 1260 tgaaaaagtc ttcgacgata attttattaa agcatacgaa aaaaatctca aagagattaa 1320 aaagaaaaag caacaaataa aagaaaagaa aatatcaaaa gcattagata attttgaaaa 1380 agaaatctcg aaagaatgga aggaaaagtt taaagacgaa gaggaaaatt tcgaataaat 1440 acctgtgacg gaagatcact tcgcagaata aataaatcct ggtgtccctg ttgataccgg 1500 gaagccctgg gccaactttt ggcgaaaatg agacgttgat cggcacgtaa gaggttccaa 1560 ctttcaccat aatgaaataa gatcactacc gggcgtattt tttgagttat cgagattttc 1620 aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg ttgatatatc 1680 ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca gttgctcaat gtacctataa 1740 ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa 1800 gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc cggaattccg 1860 tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt 1920 tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt gaataccacg acgatttccg 1980 gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt 2040 ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac 2100 cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg 2160

PL 213 561 B1 caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc cgtttgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat ttttttaagg cagttattgg tgcccttaaa cgcctggtgc tacgcctgaa taagtgataa taagcggatg aatggcagaa attcgaattt ggttttgaat cggaaatata aaaccgccct cgccgggcag gcgaatccct tattgaaata gaataaattc tattccacta agggattttt tttattcatt gtttctccac atttgcaata ttgacattaa cttccacccg gatataacag tagtataagt tgttgtttca acccgtcttt ttgggtggaa caacaaggca ttttagggat agagcaaagc gaaggccata aaattgccac ccccaaccgg gggtcgttgt tcgatttgag cgatagcgaa aaattgaaca taagggggga gggtttgggt tttacggtat ttcaaatttg agcaaagcga atttttgaaa tttccggttc ttttaatttg caatgaggaa aaatcaatat gggtaattca aaaagaaata taaaaaaact aaatgataat tttagagagg atattttaga ttatgcgatc gcgcacaatc taaaatgtgc taacgcactt gctattttat acgcaacggg ttgccgtccg gacgaactcc aaaccggagt tactgtaaac tatgacagta aaaaaaatga aattgaattt agaataattg gatcaaaact aaatagaaga atgagaagag gcataggggt tagaaaaata aaagtaaaaa tcaataatga aaatgccagg ttttttaaaa acattgttga taaatttatt gaaaacccaa tgtcatatga tcacaaaatc aaaattgaaa gtgccaaagc attttccggg tacataacaa aaatatcgaa aaagctatgg cccaggaaaa cctatcatgc ttctgcatat tcttttagac atgcaaaagc aacggaatta aaaaattccg attatgataa aatcgaaata gctcagatta tgggccatgc ctcag <210> 4 <211> 3694 <212> DNA <213> sztuczna <220>

<223> plazmid <400> 4 actctagccc tgtctcttat acacatctca accatcatcg atgaattgtg tctcaaaatc tctgatgtta cattgcacaa gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag taatacaagg ggtgttatga gccatattca acgggaaacg tcttgctcga ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccggaaaaac agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataaact tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aatcagaatt ggttaattgg ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact tgacgggacg gcggctttgt tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca cgcatcttcc cgacaacgca gaccgttccg tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact ggtccaccta caacaaagct ctcatcaacc gtggcgggga tcctctagag tcgagagatc taattaatac gactcactat agggagacca agaaggaaga attcatatgt cgtcgacgga tccgatatct agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctgc aggcatgcaa gcttcagggt tgagatgtgt ataagagaca gactctagcc agtttccaag tagaaactac agtttctaaa ctgcaacttt ttctactttt tgcaacttaa tctattgact agtcctttat aaatgttaaa acatatatat agaaataaat aaaaagagga ggtttctatg gatattggaa atatattaaa tgagagttta agtattgatt acgaaaaatt agatttgttt ttggaaaaat atgatttaac accagaacaa aaagttgcag tttatgaatt tcacgcaaaa gcttataaaa aaaataaaac tttagttatt tctgaaacaa aagaaaataa atttaaatct atttccgaag gtgttgaata cgtgcattta ttcccaaaaa atttaaaaat tttaattaaa aaatatggtt taaatacaaa cgaattattg gttttaacgg aaataatgga gtcaatgctt tcacacggaa atttattaat taatttttcg caaaaggcac tttgcgaatt aacaggaatt aataaatcta caatgtgtaa aacatttaaa accctcaaac aaaagcagtg tttaattgag aaaaacggac atatttattt aaattctgtg atatttatga aagggttacc tcataaattg tttatgcaat ttagagatca ttttttaaat tctatctcat ataaattaga tgatgaagaa gaatttgaaa aagtcttcga cgataatttt attaaagcat acgaaaaaaa tctcaaagag attaaaaaga aaaagcaaca aataaaagaa aagaaaatat caaaagcatt agataatttt gaaaaagaaa tctcgaaaga atggaaggaa aagtttaaag acgaagagga aaatttcgaa tttggttttg

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3295

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

PL 213 561 B1 aatcggaaat ataaaaccgc cctcgccggg caggcgaatc ccttattgaa atagaataaa 2280 ttctattcca ctaagggatt ttttttattc attgtttctc cacatttgca atattgacat 2340 taacttccac ccggatataa cagtagtata agttgttgtt tcaacccgtc tttttgggtg 2400 gaacaacaag gcattttagg gatagagcaa agcgaaggcc ataaaattgc cacccccaac 2460 cgggggtcgt tgttcgattt gagcgatagc gaaaaattga acataagggg ggagggtttg 2520 ggttttacgg tatttcaaat ttgagcaaag cgaatttttg aaatttccgg ttcttttaat 2580 ttgcaatgag gaaaaatcaa tatgggtaat tcaaaaagaa atataaaaaa actaaatgat 2640 aattttagag aggatatttt agattatgcg atcgcgcaca atctaaaatg tgctaacgca 2700 cttgctattt tatacgcaac gggttgccgt ccggacgaac tccaaaccgg agttactgta 2760 aactatgaca gtaaaaaaaa tgaaattgaa tttagaataa ttggatcaaa actaaataga 2820 agaatgagaa gaggcatagg ggttagaaaa ataaaagtaa aaatcaataa tgaaaatgcc 2880 aggtttttta aaaacattgt tgataaattt attgaaaacc caatgtcatg atcacaaaat 2940 caaaattgaa agtgccaaag cattttccgg gtacataaca aaaatatcga aaaagctatg 3000 gcccaggaaa acctatcatg cttctgcata ttcttttaga catgcaaaag caacggaatt 3060 aaaaaattcc gattatgata aaatcgaaat agctcagatt atgggccatg cctcagttag 3120 atctcagoag agttacggaa gaaagagcaa aaaaagcaaa ggtggatttg atgacatcgc 3180 agatgtcgaa accaatgtta aaccccgtgg cggtgataga ttattgagat ttaagatcgc 3240 aaataaaaac aaagcagcgg caaaaattgc cgatacttcc acccccagca gtcctccacc 3300 ggctcccgtt cgtcgcttca aaatgtgaac cgtgagcagt tcaggaggtt ccctcctgga 3360 ctgtgaaggg ttggcccgtc cggtcaggac ggttttacag caaaatcctc catagcgaag 3420 cagaagcccg gaacgggtaa ctggatggtt ttcccccgtg ggggattgat ctgttacttg 3480 aaaaccaatg atcttaaaag ccatctcaaa agttgaaaat ttcaccccct tagtgttctt 3540 aaaattctta gatgttctta ggagttaaaa aactactctc taaccattga tattactgga 3600 tttttaaaaa aggcagttgt caaaaacttc aaccgtagtt gtcaaattcg tcaactccag 3660 ttgtcaaatt cgtcaactga ggttgtcaaa taca 3694 <210> 5 <211> 5366 <212> DNA <213> sztuczna <220>

<223> plazmid <400> 5 actctagccc tgtctcttat acacatctca accatcatcg atgaattgtg tctcaaaatc 60 tctgatgtta cattgcacaa gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa ctgtctgctt 120 acataaacag taatacaagg ggtgttatga gccatattca acgggaaacg tcttgctcga 180 ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata 240 atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt 300 tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac 360 taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg 420 atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccggaaaaac agcattccag gtattagaag 480 aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc 540 attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg 600 cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg 660 gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataaact tttgccattc tcaccggatt 720 cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa 780 taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc 840 tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg 900 gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct 960 aatcagaatt ggttaattgg ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact tgacgggacg 1020 gcggctttgt tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca cgcatcttcc 1080 cgacaacgca gaccgttccg tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact ggtccaccta 1140 caacaaagct ctcatcaacc gtggcgggga tccggaccgt tggcgatgtg cggtttgcta 1200 cattcacaga tgttcttcgc cacttccagc agcaggtcat caggggtgat ttcaggatcg 1260 tagataaagg tcaggttcgg tgaaacctgc ttcaactctg catctgcacg taagatcgcg 1320 cgggtaatgg gcgaatcaga cgggccgata ttggcgtgca taaaggcgtc tggcagggtt 1380 ctgtcgaggt aacgccagaa acgttttatt cgaacatcga tctcgtcttg tgttagaatt 1440 aattctaaca tacggttgca acaacgcatc cagttgcccc aggtagaccg gcatcgatgt 1500 gaccgacggt acgtggtggt aaagaatggt cagcagagag agtgcgtcat caagatcttt 1560 cgcgccttcc agctccagcc attcggaacc gttcgccaga aaacgggcgt aatcgggtaa 1620 gacatagcgc ggtttgtacg gcgcatgacc ttcaaacata tcgcagatta caccttcatc 1680 cagcgcgcgg cgggcttcgg caggaagctg tgggtaaggc agattgtttt ctgcttccag 1740

PL 213 561 B1 tgccagaaaa tggcgcttct gctccgggct aagcactggg ctggtgacaa tttgctggca 1800 acgttgttgc agtgcatttt catgagaagt gggcatcttc ttttcctttt atgccgaagg 1860 tgatgcgcca ttgtaagaag tttcgtgatg ttcactttga tcctgatgcg tttgccacca 1920 ctgacgcatt catttgaaag tgaattattt gaaccagatc gcattacagt gatgcaaact 1980 tgtaagtaga tttccttaat tgtgatgtgt atcgaagtgt gttgcggagt agatgttaga 2040 atactaacaa actcgcaagg tgaattttat tggcgacaag cctaggtttg tttaacttta 2100 aggagaaatc atatgcaaat ttttgttaaa actttaactg gtaaaaccat taccttagaa 2160 gttgaatctt cagataccat tgataatgtt aaatctaaaa ttcaagataa agaaggtatt 2220 cctccagatc aacaacgtct aatatttgca ggtaaacagt tagaagatgg tcgtaccctg 2280 tctgattata acattcagaa agaatctacc ttacatctgg tcttacgtct ccgcggtggt 2340 ttcccaacca ttcccttaag taggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg 2400 caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cttatatccc aaaggaacag 2460 aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 2520 ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctcg agctgctccg catctccctg 2580 ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 2640 ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggg 2700 atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag 2760 cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 2820 gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 2880 cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttctaaaaag tcgacctgca ggcatgcaag 2940 cttagcccgc ttaatgagcg ggcttttttt tctcgacctg caggcatgca agcttcaggg 3000 ttgagatgtg tataagagac agactctagc cagtttccaa gtagaaacta cagtttctaa 3060 actgcaactt tttctacttt ttgcaactta atctattgac tagtccttta taaatgttaa 3120 aacatatata tagaaataaa taaaaagagg aggtttctat ggatattgga aatatattaa 3180 atgagagttt aagtattgat tacgaaaaat tagatttgtt tttggaaaaa tatgatttaa 3240 caccagaaca aaaagttgca gtttatgaat ttcacgcaaa agcttataaa aaaaataaaa 3300 ctttagttat ttctgaaaca aaagaaaata aatttaaatc tatttccgaa gtgttgaata 3360 cgtgcattta ttcccaaaaa atttaaaaat tttaattaaa aaatatggtt taaatacaaa 3420 cgaattattg gttttaacgg aaataatgga gtcaatgctt tcacacggaa atttattaat 3480 taatttttcg caaaaggcac tttgcgaatt aacaggaatt aataaatcta caatgtgtaa 3540 aacatttaaa accctcaaac aaaagcagtg tttaattgag aaaaacggac atatttattt 3600 aaattctgtg atatttatga aagggttacc tcataaattg tttatgcaat ttagagatca 3660 ttttttaaat tctatctcat ataaattaga tgatgaagaa gaatttgaaa aagtcttcga 3720 cgataatttt attaaagcat acgaaaaaaa tctcaaagag attaaaaaga aaaagcaaca 3780 aataaaagaa aagaaaatat caaaagcatt agataatttt gaaaaagaaa tctcgaaaga 3840 atggaaggaa aagtttaaag acgaagagga aaatttcgaa tttggttttg aatcggaaat 3900 ataaaaccgc cctcgccggg caggcgaatc ccttattgaa atagaataaa ttctattcca 3960 ctaagggatt ttttttattc attgtttctc cacatttgca atattgacat taacttccac 4020 ccggatataa cagtagtata agttgttgtt tcaacccgtc tttttgggtg gaacaacaag 4080 gcattttagg gatagagcaa agcgaaggcc ataaaattgc cacccccaac cgggggtcgt 4140 tgttcgattt gagcgatagc gaaaaattga acataagggg ggagggtttg ggttttacgg 4200 tatttcaaat ttgagcaaag cgaatttttg aaatttccgg ttcttttaat ttgcaatgag 4260 gaaaaatcaa tatgggtaat tcaaaaagaa atataaaaaa actaaatgat aattttagag 4320 aggatatttt agattatgcg atcgcgcaca atctaaaatg tgctaacgca cttgctattt 4380 tatacgcaac gggttgccgt ccggacgaac tccaaaccgg agttactgta aactatgaca 4440 gtaaaaaaaa tgaaattgaa tttagaataa ttggatcaaa actaaataga agaatgagaa 4500 gaggcatagg ggttagaaaa ataaaagtaa aaatcaataa tgaaaatgcc aggtttttta 4560 aaaacattgt tgataaattt attgaaaacc caatgtcatg atcacaaaat caaaattgaa 4620 agtgccaaag cattttccgg gtacataaca aaaatatcga aaaagctatg gcccaggaaa 4680 acctatcatg cttctgcata ttcttttaga catgcaaaag caacggaatt aaaaaattcc 4740 gattatgata aaatcgaaat agctcagatt atgggccatg cctcagttag atctcagcag 4800 agttacggaa gaaagagcaa aaaaagcaaa ggtggatttg atgacatcgc agatgtcgaa 4860 accaatgtta aaccccgtgg cggtgataga ttattgagat ttaagatcgc aaataaaaac 4920 aaagcagcgg caaaaattgc cgatacttcc acccccagca gtcctccacc ggctcccgtt 4980 cgtcgcttca aaatgtgaac cgtgagcagt tcaggaggtt ccctcctgga ctgtgaaggg 5040 ttggcccgtc cggtcaggac ggttttacag caaaatcctc catagcgaag cagaagcccg 5100 gaacggtaac tggatggttt tcccccgtgg gggattgatc tgttacttga aaaccaatga 5160 tcttaaaagc catctcaaaa gttgaaaatt tcaccccctt agtgttctta aaattcttag 5220 atgttcttag gagttaaaaa actactctct aaccattgat attactggat ttttaaaaaa 5280 ggcagttgtc aaaaacttca accgtagttg tcaaattcgt caactccagt tgtcaaattc 5340 gtcaactgag gttgtcaaat ccgaca 5366 <210> 6 <211> 4804

PL 213 561 B1 <212> DNA <213> sztuczna <220>

<223> plazmid <400> 6 aggtttataa ctgagttata aatacttata acttaattat taatggggtt ttaatatgaa 60 aaaaaataaa ttagtaaata aagaaaatta ctcaatatta gagactttgc cggaagatcc 120 attatttgaa aataaatcga ctttagaaat tgatttaaat caattcgatt tatttaatag 180 aattgcaaac gaaactgtag aagaacttat aataaaagaa gttaacgatc ctaatgaccg 240 aagcgataaa agcaatggtg ttaatttaaa tgcaaaagtt tatgtagaaa aagaaaaaaa 30C gacttcatta aaaaaagatt ttgttattac atttgtagat aatcttgagg ctttagcaaa 360 attaaattta aaacctaatg agtttagaat tatcgtcgag attgtaaagg ttatggaata 420 cggaaatcta attaaccttt cacaatctac aattgcgaaa aatttaaatc ttgcaaaatc 480 aaatgtaagt tattatttta aaaaccttaa aaagaaaaat atattagtag aaaaagacgg 540 acacgtcttt atgaatagta atattttttc taaaggatta gcccatcgtt tggacgaaga 600 aaaaagaaaa aatttgaaat ccgcacaagt cgaagacgat aattttaaaa actcatttta 660 aaacccaacg ggaaattttt cactgtttcc cgttccgggc tttataattt taaagccttt 720 ggcttattct ggggtgtgta gttattattt tgctgtttct gtgaatattc ggcatctgct 780 gctgcaatag cagcattgaa gagttgttta aattctgccg gtttatgctc ttgtattaga 840 tctaaaacat cactgttaat tttatatttt tcatatctct gagaaattga agcattttcc 900 tttaactgcc ttttgtattc tattatttcc aactccatat cttttatttt tctgttttta 960 ttttgaatga tttgttcttg ctcagccgtg gctctggcca ctgctaactt ttgctcctgt 1020 tgtacccgtt cctggactct tctgttgaag ttctgacgga gatcagacaa ctcagcctct 1080 gaatgctcta aacggctctt aaacccgttt agacgagcta taaggggctt tcgttcgttc 1140 ttgtaaggtt ttagagcctt tcgtatgtaa cgattaacct cagctcctgt gtagtgctta 1200 ggcactacct ccggatctct aaataatttt ttcttttctt ctgtttcaac aactctaatt 1260 ttttcaattt tattattttc tatttctaat tcggtttcat tcttaatgtt tttaatatcg 1320 ctgtaaaatt ctttaacttc cttatattct gcattcgaaa cctctttttt aatcccacgg 1380 attaaaccta atggcttatt gtatttaaaa tatatatcct gcattgtttc gtattttttc 1440 atatacgatt tattgtttag tttatatatt ccgtttttat tttcgattgg tgttataaag 1500 gcgtgaatat gtggagtttg ctcgtccaag tgtaaaactg cattaattgc attttcccca 1560 tattcacttt gcaaatattc catttgaact ttaatccaat cctccaattt tttgttattt 1620 gcaaaaaatt ctggggaagc tgttaaaact aattcattac aaataacaga agtagaatta 1680 cgagctttaa cattggttgc ttgaaacctt gcattaatat cagtccttaa atcaccagaa 1740 ccgattaaaa ttcggttttg ggatttaagg ttaggatctg cattatgtgt tttcctcaat 1800 cgcatattgt gagaattttt cccggcgatt gaagtatttt ttgttttttc cactcttaaa 1860 attgcataag ccatattcga aaacctcccg ttaaaagcag taaggttttt ttctttttgg 1920 cccctgccag gctcacaccg agatttctcg gtatagtgag tatacctttt ctgcaatatt 1980 gaaaatctat aaatacatct acaataaaaa aagcaaaagt caacggctca atccctcgca 2040 agggaaaatt aaaatttccc cttactcacg atttccaata aaagaaaaaa gacagaacgc 2100 tgagcaagtc aaaattttaa ttttggcttg tgaagggttg accaagcgaa gcgcggtagg 2160 gaaatctgcg cagatgctta tgtattgccc ggaacgggaa acgtctgttg tagcggtagc 2220 gaaaacacat ctcccggaac gggggttttc ttttgcgtag cctggcaagt tctgctcgat 2280 ctggaggttt gcaccgttta ctctcttact ttcttattgt tttaaatctt acatacccct 2340 ccagcccttg ctattactga cttaaatcaa aaaaaagtta tagattccta taacctaaaa 2400 gttatagatt tctataaccc cagttataga ttcctataac ccccctaagt tggtcattcg 2460 accaacttct tataactaag ttataaaaag ttgtaatcat gtattgacta gttgtatatt 2520 ttgtttataa cctgtctctt atacacatct caaccatcat cgatgaattg tgtctcaaaa 2580 tctctgatgt tacattgcac aagataaaaa tatatcatca tgaacaataa aactgtctgc 2640 ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa cgtcttgctc 2700 gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat gggctcgcga 2760 taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg atgcgccaga 2820 gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg agatggtcag 2880 actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc 2940 tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccggaaaa acagcattcc aggtattaga 3000 agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt 3060 gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc gtctcgctca 3120 ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa 3180 tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataaa cttttgccat tctcaccgga 3240 ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg aggggaaatt 3300 aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg atcttgccat 3360 cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata 3420 tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt 3480 ctaatcagaa ttggttaatt ggttgtaaca ctggcagagc attacgctga cttgacggga 3540

PL 213 561 B1 cggcggcttt gttgaataaa tcgaactttt gctgagttga aggatcagat cacgcatctt 3600 cccgacaacg cagaccgttc cgtggcaaag caaaagttca aaatcaccaa ctggtccacc 3660 tacaacaaag ctctcatcaa ccgtggcggg gatcgatctt agatccgttg tttctcgtct 3720 aataaatgaa cgaaaaatac ttcaaatgac tgatggttat caggtcactg ctttgggggc 3780 tagctatgtt aggagcgtct ttgatagaaa gacacttgac cgattgcggc ttgagattat 3840 gaattttgaa aaccgtagaa aatcaacatt taactatgat aagattccgt atgcgcacca 3900 agaaggaaga attccatatg cagattttcg tcaaaacttt gaccggtaaa accataacat 3960 tggaagttga atcttccgat accatcgaca acgttaagtc gaaaattcaa gacaaggaag 4020 gtatccctcc agatcaacaa agattgatct ttgccggtaa gcagctagaa gacggtagaa 4080 cgctgtctga ttacaacatt cagaaggagt ccaccttaca tcttgtctta agactccgcg 4140 gtggtttccc aaccattccc ttatccaggc tttttgacaa cgctagtctc cgcgcccatc 4200 gtctgcacca gctggccttt gacacctacc aggagtttga agaagcttat atcccaaagg 4260 aacagaagta ttcattcctg cagaaccccc agacctccct ctgtttctca gagtctattc 4320 cgacaccctc caacagggag gaaacacaac agaaatccaa cctcgagctg ctccgcatct 4380 ccctgctgct catccagtcg tggctggagc ccgtgcagtt cctcaggagt gtcttcgcca 4440 acagcctggt gtacggcgcc tctgacagca acgtctatga cctcctaaag gacctagagg 4500 aagggatcca aacgctgatg gggaggctgg aagatggcag cccccggact gggcagatct 4560 tcaagcagac ctacagcaag ttcgacacaa actcacacaa cgatgacgca ctactcaaga 4620 actacgggct gctctactgc ttcaggaagg acatggacaa ggtcgagaca ttcctgcgca 4680 tcgtgcagtg ccgctctgtg gagggcagct gtggcttcta aaaagtcgac gcggccgcaa 4740 gcttagcccg cttaatgagc gggctttttt ttagcttcag ggttgagatg tgtataagag 4800

Claims (16)

1. Sposób otrzymywania plazmidu zawartego w trudnej do rozdzielenia niejednorodnej frakcji plazmidowego DNA, zwłaszcza zawierającej różne plazmidy o zbliżonej wielkości, znamienny tym, że frakcję plazmidowego DNA zawartą w całkowitym DNA organizmu źródłowego kontaktuje się z enzymem transpozazy i DNA transpozonu zawierającym gen markera selekcyjnego, transfekuje się komórkę gospodarza mikrobiologicznego plazmidem zawierającym transpozon, uzyskanego transformanta namnaża się w warunkach selekcyjnych dobranych dla zastosowanego genu markera selekcyjnego i następnie izoluje się plazmid zawierający transpozon zawarty w komórkach transformanta namnożonych w warunkach selekcyjnych.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo w celu ustalenia cech charakterystycznych otrzymanego plazmidu analizuje się strukturę DNA plazmidu zawierającego transpozon.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że frakcja plazmidowego DNA zawiera plazmidy o zbliżonej wielkości obecne w zasadniczo róż nej ilości kopii.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że DNA wyizolowanego plazmidu zawierającego transpozon poddaje się dalszym modyfikacjom, przy czym prowadzi się co najmniej jedną spośród następujących modyfikacji: usuwa się lub dodaje się miejsce restrykcyjne, wprowadza się gen markera selekcyjnego, wprowadza się gen kodujący obce białko, wprowadza się sekwencję regulatorową.

5. Plazmid pIGRK posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako nukleotydy znajdujące się w pozycjach od 1240 do 3578 sekwencji nr 1.

6. Plazmid według zastrz. 5, znamienny tym, że jest plazmidem wybranym z grupy zawierającej: pIGRKKAN posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 1, pIGRKKANde posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 1 pozbawioną zasad TiA znajdujących się w pozycjach 768 i 768 zgodnie z fig. 5, pIGRKCM posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 3, pIGRKKANT7 posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 4, pIGRKKHgh posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 5.

7. Plazmid według zastrz. 5, znamienny tym, że jest promotorem zawierającym sekwencję nukleotydów o numerach od 1240 do 1367 sekwencji plazmidu pIGRKKAN przedstawionej jako sekwencja nukleotydową nr 1.

PL 213 561 B1

8. Plazmid pIGMS31 posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako nukleotydy znajdujące się w pozycjach od 1 do 2520 sekwencji nr 2.

9. Plazmid według zastrz. 8, znamienny tym, że jest plazmidem wybranym z grupy zawierającej: pIGMS31KAN posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 2, pIGMS31PRH posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 6.

10. Zastosowanie plazmidu pIGRK albo pIGMS31 określonych w zastrz. od 5 do 9 do ekspresji sekwencji kodującej polipeptyd albo regulacji tego procesu.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że sekwencja kodująca polipeptyd koduje białko heterologiczne.

12. Zastosowanie według zastrz. 10 albo 11, znamienne tym, że stosuje się plazmid wybrany z grupy zawierającej pIGMS31PRH posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 6, pIGRKKHgh posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekwencja nr 5.

13. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej zawierającej sekwencję nukleotydów o numerach od 1240 do 1367 sekwencji plazmidu pIGRKKAN przedstawionej jako sekwencja nukleotydową nr 1, do otrzymywania sekwencji promotorowej.

14. Zastosowanie plazmidu pIGRK albo pIGMS31 określonych w zastrz. od 5 do 9 do otrzymywania plazmidu przeznaczonego do stosowania w medycynie, zwłaszcza terapii genowej.

15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że otrzymywany plazmid posiada obniżoną zawartość sekwencji immunogennych.

16. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że otrzymywany plazmid posiada mniej niż 20 sekwencji immunogennych, korzystnie mniej niż 10, najkorzystniej nie więcej niż 5 takich sekwencji.