JP2005221725A - 焦点検出方法、自動細胞培養装置用自動焦点検出装置、自動細胞培養装置及び培養容器。 - Google Patents

Abstract

【課題】 培養容器の内部底面に容易に焦点合わせ可能にした焦点検出方法、自動細胞培養装置用自動焦点検出装置、自動細胞培養装置及び培養容器。
【解決手段】 内部底面４１に形成された凹凸形状の焦点検出マーカー４２を有する培養容器４の内部底面に対物レンズの焦点を合わせる焦点検出方法において、軸外れの特定の照明角で培養容器４の内部底面４１に形成された凹凸形状の焦点検出マーカー４２を照明し、焦点検出マーカー４２からの回折・散乱光を対物レンズを介して検出し、焦点検出マーカー４２のコントラスト値が極値になるように対物レンズと培養容器４の相対距離を変化させる焦点検出方法。
【選択図】 図１

Description

本発明は、焦点検出方法、自動細胞培養装置用自動焦点検出装置、自動細胞培養装置及び培養容器に関し、特に、培養容器内で培養された細胞を観察する際の自動焦点検出方法、自動焦点合わせ装置等に関するものである。

生体内から採取された細胞を培養・増殖させ、培養された細胞を医療や薬効試験に応用する研究が進められている。

細胞の培養は、細胞の培養工程に従って担当者が作業を進めている。しかし、培養作業に人が介在するとヒューマンエラーが発生する。このヒューマンエラーを低減するために、培養作業の自動化が進められている。

培養作業自体を自動化することでヒューマンエラーは低減されるが、培養細胞の状態の観察には、位相差顕微鏡や本発明者が特願２００３−１５１５０６号、特願２００３−４１４１５８号等で提案したデフォーカス法あるいは波面収差導入法を用いた目視観察が行われている。

培養作業の効率化とヒューマンエラーのさらなる低減を進めるため、培養細胞の状態の観察及び計測を自動化する検討も進められている。

培養細胞の状態の観察には、上記のように、位相差顕微鏡やデフォーカス法あるいは波面収差導入法が用いられている。これらの観察を自動化するためには、まず自動焦点検出と自動焦点位置合わせの機構が必要になってくる。

従来、特許文献１、特許文献２等で提案されているように、位相差顕微鏡や通常の顕微鏡にＣＣＤカメラを取り付け、その映像信号から観察物体の像コントラストを求め、その像コントラストが最良になるように対物レンズと観察物体の相対位置を変化させる方法がある。

また、金属や半導体の表面を観察する際には、金属や半導体の表面に種々のパターンを投影し、そのパターンの像コントラスト等を検出して焦点検出する方法が知られている。
特開平８−４３７２５号公報 特開平６−３１７７３９号公報 特開昭６１−１９８２０４号公報 「光学」３０巻９号（２００１）６０５（３３）〜６１２（４０）頁

位相差顕微鏡にＣＣＤカメラを取り付け、位相差像のコントラストから自動焦点検出する場合、焦点位置以外に擬似的にコントラストが良くなる位置があり、最良位置に到達する前に焦点検出が中断してしまう問題点がある。この擬似的にコントラストが良くなる位置は、観察する物体に依存して変化する。

したがって、位相差像のコントラストから自動焦点検出を行うと、焦点位置での観察ができなくなる可能性がある。

また、位相差顕微鏡は光学設計上の問題から低倍観察が難しく、培養容器全面を観察及び検査するのに時間がかかってしまう問題点もある。

また、デフォーカス法あるいは波面収差導入法では、原理的に焦点位置では位相差像のコントラストが得られない。

培養細胞は培養液中で生存し、細胞の多くは培養容器の底面に付着している。したがって、培養容器の内部底面に焦点を合わせる必要がある。観察面に所定のパターンを投影して焦点検出を行う方法では、観察面での反射率がある程度必要である。しかし、培養容器の材質と培養液の屈折率の差が少なく、培養容器の内部底面での反射率が小さく、焦点検出用のパターンがほとんど検出できなくなる。また、培養容器の外部底面は空気に接しているために、内部底面より反射率が高く、誤検出をする可能性が高くなるという問題点がある。

本発明は従来技術のこのような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、培養容器の底面に凹凸形状の焦点検出マーカーを設けておき、この凹凸形状の焦点検出マーカーをコントラスト像に変換する照明方法を採用することにより、培養容器の内部底面に容易に焦点合わせ可能にした焦点検出方法、自動細胞培養装置用自動焦点検出装置、自動細胞培養装置及び培養容器を提供することである。

上記目的を達成する本発明の焦点検出方法は、内部底面に形成された凹凸形状の焦点検出マーカーを有する培養容器の内部底面に対物レンズの焦点を合わせる焦点検出方法において、軸外れの特定の照明角で前記培養容器の内部底面に形成された凹凸形状の焦点検出マーカーを照明し、前記焦点検出マーカーからの回折・散乱光を前記対物レンズを介して検出し、前記焦点検出マーカーの像のコントラスト値が極値になるように前記対物レンズと前記培養容器の相対距離を変化させることを特徴とする方法である。

この場合に、照明角が暗視野照明となるように設定されており、焦点検出マーカーの像のコントラスト値が極大値になるように対物レンズと培養容器の相対距離を変化させるようにすることが望ましい。

また、焦点検出マーカーは格子状パターンからなることが望ましい。

本発明の自動細胞培養装置用自動焦点検出装置は、軸外れの特定の照明角で試料面を照明可能な開口が着脱可能に設けられた照明光学系と、内部底面に形成された凹凸形状の焦点検出マーカーを有する培養容器が載置されたステージと、前記焦点検出マーカーからの回折・散乱光を撮像素子に導く観察光学系と、前記撮像素子で撮像された前記焦点検出マーカーの像のコントラスト値が極値になるように前記観察光学系と前記培養容器の相対距離を変化させる合焦機構とを有することを特徴とするものである。

この場合に、培養容器の内部底面の２次元的に相互に離間した複数の位置に焦点検出マーカーが設けられていることが望ましい。

また、培養容器の内部底面の焦点検出マーカーの部分に細胞付着処理が施されていないことが望ましい。

また、観察光学系と培養容器の相対距離を計測する手段を備えることが望ましい。

また、複数の焦点検出マーカー位置での焦点検出結果から、複数の焦点検出マーカー間の観察光学系と培養容器の相対距離を補間する補間手段を備えることが望ましい。

本発明の自動細胞培養装置は、軸外れの特定の照明角で試料面を照明可能な開口が着脱可能に設けられた照明光学系と、内部底面の２次元的に相互に離間した複数の位置に凹凸形状の焦点検出マーカーが形成されており、その内部底面に沿って細胞が培養される培養容器と、前記培養容器が載置されるステージと、前記培養容器の焦点検出マーカーからの回折・散乱光を撮像素子に導く観察光学系と、前記撮像素子で撮像された前記焦点検出マーカーの像のコントラスト値が極値になるように前記観察光学系と前記培養容器の相対距離を変化させる合焦機構と、複数の前記焦点検出マーカー位置での焦点検出結果から、複数の前記焦点検出マーカー間の前記観察光学系と前記培養容器の相対距離を補間する補間手段とを備え、複数の前記焦点検出マーカー間の位置を観察する際に、前記補間手段により求められた相対距離位置へ前記観察光学系を移動させるように構成されていることを特徴とするものである。

本発明の培養容器は、透明体からなり、底面が平面状で皿状の培養容器であって、内部底面の２次元的に相互に離間した複数の位置に、凹凸形状の焦点検出マーカーが設けられていることを特徴とするものである。

この場合に、内部底面の焦点検出マーカーの部分に細胞付着処理が施されていないことが望ましい。

以上の本発明によると、凹凸形状の焦点検出マーカーを培養容器の内部底面に施し、この焦点検出マーカーの回折・散乱光をを利用することにより、培養細胞が存在する培養容器の内部底面の位置を検出することができる。そして、複数の焦点検出マーカーの位置検出を行い、焦点検出マーカー間の補間を行うことで、培養容器内部底面上の様子を高速に観察することができるようになる。なお、本発明は、特に培養容器内部底面の低倍観察時に有効なものである。

以下に、本発明の焦点検出方法、自動細胞培養装置用自動焦点検出装置、自動細胞培養装置及び培養容器の実施例を説明する。

まず、培養容器の実施例を説明する。

図１は、例えば人の細胞を培養するための透明体からなり、底面４１が平面状で皿状のシャーレ４の上面図（ａ）と図１（ａ）の二点鎖線Ａ−Ａ’に沿った断面図（ｂ）であり、このシャーレ４の内部底面４１全体の２次元的に相互に離間した複数の位置に、図では、中心と相互に略９０°離間した周辺４か所の合計５つの位置に、焦点検出マーカー４２が形成されている。これら複数の焦点検出マーカー４２は同一の格子状パターンからなり、各焦点検出マーカー４２は、図１（ｂ）の断面に示すように、シャーレ４の底面４１に直接形成した断面凹凸形状の一定周期のレリーフ型回折格子状のマーカーである。したがって、シャーレ４の内部底面４１には焦点検出マーカー４２の部分の含めて培養環境を汚染する物質は含まれていないので、好ましい培養容器として使用できる。

そして、焦点検出マーカー４２としてこのような断面凹凸形状の一定周期のレリーフ型回折格子状のマーカーを用いると、底面４１に特定の斜め方向から入射する照明光で照明した場合、その斜めの照明光の少なくとも一部が散乱あるいは回折されて正面に位置する観察光学系に入射するので、その結像面にその回折格子状のマーカー４２がコントラスト像として結像する。そのため、反射率の低い境界面（底面４１）でも位置が特定でき、容易にそのコントラスト像により観察光学系をシャーレ４の内部底面４２に合焦することが可能になる。この特定の斜め方向としては、観察光学系に対して暗視野照明あるいは限外照明となるような照明角のものとすることが望ましい。

また、焦点検出マーカー４２としてこのような一定周期の格子状マーカーを用いることにより、焦点検出マーカー４２からの回折・散乱光に方向性を持たせることができ、撮像素子上で焦点検出マーカー４２のコントラスト像を見つけやすくかつコントラスト値が計算しやくなる。

なお、シャーレ４は通常透明プラスチックで構成されるが、プラスチックは一般に疎水性であるので、細胞培養のためには底面４１にプラズマ放電等の親水処理をして培養された細胞が付着しやすくなる細胞付着処理を施すが、焦点検出マーカー４２の部分にもこのような細胞付着処理を施すと、焦点検出マーカー４２の位置検出に誤差が生じる恐れがある。そのため、焦点検出マーカー４２の部分を除いた底面４１の全面に上記のような細胞付着処理を施して、焦点検出マーカー４２には細胞が付着しないようにすることが望ましい。

さて、図２に、このようなシャーレ４を備えた本発明の自動細胞培養装置の１実施例の全体の概略図を示す。この実施例の自動細胞培養装置１は倒立型顕微鏡として構成されており、この倒立顕微鏡は、光源２と、光源２から発せられた光を導くための照明光学系３と、Ｘ−Ｙステージ４０上のシャーレ４の内部底面４１位置の物体像を形成するための観察光学系５と、シャーレ４の内部底面４１位置の物体像を拡大して目視観察するための接眼レンズ６と、シャーレ４の内部底面４１位置の物体像を撮像するための撮像素子７を有するＣＣＤカメラ８とから構成されている。また、ＣＣＤカメラ８には、撮像された画像を記憶し演算処理しその結果を記憶及び出力するパソコン２１とテレビモニター２２とが接続されている。パソコン２１からのＸ−Ｙステージ走査信号は駆動回路を経てＸ−Ｙステージ４０に送られ、また、パソコン２１からのフォーカス信号は駆動回路を経て対物レンズ移動機構４３に送られるように接続されている。

照明光学系３は、光源２側から順に、コレクターレンズ１０、照明光の光軸１１を偏向させるための偏向ミラー１２、光源２からの光を準単色とするための干渉フィルタ１３、及び、コンデンサレンズ１４により構成されている。

観察光学系５は、観察物体のシャーレ４側から順に、シャーレ４の内部底面４１位置の物体像を形成するための対物レンズ１５、第１のリレーレンズ１６、対物レンズ１５からの光を偏向するための偏向ミラー１７、第１のリレーレンズ１６と共に対物レンズ１５による像（シャーレ４の内部底面４１位置の物体像）を結像面に結像させるための第２のリレーレンズ１８により構成されている。

また、第２のリレーレンズ１８と結像面１９との間には、物体像を接眼レンズ６による目視観察とＣＣＤカメラ８による観察が同じ又は任意に切り換えることができるように、ハーフミラーである切り換えミラー２０が配置されている。

また、光源２からの光が投射されるコンデンサーレンズ１４の瞳位置２５には、図３に示したような限外照明あるいは暗視野照明用の輪帯開口２７を有する開口ユニット２８が、着脱自在に配置されている。輪帯開口２７は、瞳の中心に対して同軸の状態になるように配置されており、その径は、輪帯開口２７を経た照明光が、シャーレ４の内部底面４１に焦点検出マーカー４２が設けられていない位置を照明する場合には、コンデンサーレンズ１４の後側レンズ１４’を経て対物レンズ１５に入射しない大きさに設定されることが望ましいが、一部だけ対物レンズ１５に入射する大きさの径であってもよい。なお、開口ユニット２８の輪帯開口２７以外は、遮光性の遮光板から形成されている。

また、パソコン２１中には、例えば特許文献２、特許文献３等で開示されているような、ＣＣＤカメラ８で撮像された画像のコントラスト量が最大になるように対物レンズ移動機構４３を介して対物レンズ１５を光軸方向へ合焦する自動焦点検出（オートフォーカス）機能を備えている。さらに、パソコン２１の指令により、Ｘ−Ｙステージ４０は、照明光学系３及び観察光学系５に対して光軸に垂直な（Ｘ，Ｙ）面上を歩進的に２次元走査されるように構成されている。

この実施例はこのように構成されているので、光源２からの照明光は、コンデンサーレンズ１４の瞳位置２５に投射され、その位置に配置された開口ユニット２８の輪帯開口２７を照明する。輪帯開口２７を通った限外照明光は、コンデンサーレンズ１４の後側レンズ１４’を経て内部底面４１に沿って細胞が培養されたシャーレ４に入射する。Ｘ−Ｙステージ４０の歩進的な２次元走査によってシャーレ４の内部底面４１上の焦点検出マーカー４２が光路中に位置する場合には、焦点検出マーカー４２の一定周期の凹凸形状によって限外照明光の少なくとも一部が散乱あるいは回折されて対物レンズ１５の開口に入射するので、その光は対物レンズ１５と第１のリレーレンズ１６及び第２のリレーレンズ１８により結像面１９に焦点検出マーカー４２のコントラスト像を形成する。結像面１９に形成されたシャーレ４の焦点検出マーカー４２のコントラスト像は、接眼レンズ６に入射すると共に、切り換えミラー２０により、ＣＣＤカメラ８の撮像素子７の撮像面上に結像する。

ＣＣＤカメラ８で撮像された焦点検出マーカー４２のコントラスト像は、パソコン２１中でそのコントラスト量が演算され、演算されたコントラスト量が最大になるように、対物レンズ移動機構４３を介して対物レンズ１５を光軸方向へ移動させ、その検出された合焦位置（対物レンズ１５とシャーレ４の内部底面４１との相対位置）を焦点検出マーカー４２のＸ−Ｙステージ４０上の位置に対応させて記憶させておく。Ｘ−Ｙステージ４０の歩進的な２次元走査によって、同様にして、シャーレ４の内部底面４１における他の複数の焦点検出マーカー４２それぞれに対応した対物レンズ１５の合焦位置を検出して同様に記憶する。全ての焦点検出マーカー４２に対応した対物レンズ１５の合焦位置が求まると、パソコン２１は、対物レンズ１５に対するシャーレ４の内部底面４１の焦点検出マーカー４２間の合焦位置を補間して求め、シャーレ４の内部底面４１の何れの位置でも自動的に合焦位置に合わせられるようにする。この際、対物レンズ１５に対する合焦位置を焦点検出マーカー４２の各合焦位置を含む平面や２次曲面で近似して、焦点検出マーカー４２間の合焦位置を内部補間（内挿）することで、近似的に培養容器の内部底面４１全面の焦点検出を高速に行うことができるようになる。

以上のような補間処理によりシャーレ４の内部底面４１の全ての位置での合焦位置が求められるので、シャーレ４の内部底面４１の何れかの位置での細胞の培養状態を観察しようとする場合、パソコン２１を介して、顕微鏡に対してＸ−Ｙステージ４０を相対的にその位置へ移動させると共に、その位置での合焦位置へ移動機構４３により対物レンズ１５を移動させればよい。

そして、その位置でのシャーレ４の内部底面４１上の位相物体（培養された細胞）をコントラスト像として接眼レンズ６を通して観察したり、ＣＣＤカメラ８により撮像するには、位相差法や微分干渉法（非特許文献１）、本発明者が特願２００３−１５１５０６号、特願２００３−４１４１５８号等で提案したデフォーカス法あるいは波面収差導入法によればよい。

以下、それぞれの方法を簡単に説明する。位相差法で位相物体をコントラスト像にするには、コンデンサーレンズ１４の瞳位置２５に、開口ユニット２８の代わりに、輪帯開口２７より径の小さい輪帯開口を有する別の開口ユニットを挿入し、その輪帯開口の像が結像する対物レンズ１５の瞳面３０に、その輪帯開口の像に対応する輪帯状の位相膜３１を配置する。

また、微分干渉法で位相物体をコントラスト像にするには、コンデンサーレンズ１４の瞳位置２５に、開口ユニット２８の代わりに、ノマルスキープリズムやウォラストンプリズムの直交する偏光間にシャーを与える第１プリズムを挿入し、その第１プリズムと共役な対物レンズ１５の瞳面３０に、そのシャーを戻すノマルスキープリズムやウォラストンプリズムからなる第２ププリズムを配置し、第１プリズムの入射側にポーラライザーを、第２プリズムの射出側にアナライザーを配置する。

デフォーカス法で位相物体をコントラスト像にするには、コンデンサーレンズ１４の瞳位置２５に、開口ユニット２８の代わりに、部分開口を配置し、対物レンズ１５をその合焦位置から若干ずらすようにする。

波面収差導入法で位相物体をコントラスト像にするには、コンデンサーレンズ１４の瞳位置２５に、開口ユニット２８の代わりに、部分開口を配置し、対物レンズ１５の瞳面３０に、その瞳の径に応じて大きさが変化する波面を導入する。そのためには、例えば対物レンズ１５の瞳面３０と共役な位置の偏向ミラー１７の面形状を変形させる。

以上のようにしてコントラスト像にされた細胞の数やその占める面積等を計数することにより、自動細胞培養装置１で培養された細胞の状態を自動的に判定することができるようになる。

なお、シャーレ４の内部底面４１上に培養された細胞の明暗像自体を観察するには、コンデンサーレンズ１４の瞳位置２５、対物レンズ１５の瞳面３０に格別の光学素子を配置しなくてもよい。

本発明に基づく培養容器の１実施例の上面図（ａ）と断面図（ｂ）である。 本発明の自動細胞培養装置の１実施例の全体の概略図である。 本発明の自動細胞培養装置で用いる暗視野照明用の輪帯開口を有する開口ユニットの平面図である。

符号の説明

１…自動細胞培養装置
２…光源
３…照明光学系
４…シャーレ
５…観察光学系
６…接眼レンズ
７…撮像素子
８…ＣＣＤカメラ
１０…コレクターレンズ
１１…光軸
１２…偏向ミラー
１３…干渉フィルタ
１４…コンデンサレンズ
１４’…コンデンサーレンズの後側レンズ
１５…対物レンズ
１６…第１のリレーレンズ
１７…偏向ミラー
１８…第２のリレーレンズ
１９…結像面
２０…切り換えミラー
２１…パソコン
２２…テレビモニター
２５…コンデンサーレンズの瞳位置
２７…暗視野照明用の輪帯開口
２８…開口ユニット
３０…対物レンズの瞳面
３１…位相膜
４０…Ｘ−Ｙステージ
４１…内部底面
４２…焦点検出マーカー
４３…移動機構

Claims (11)

1. 内部底面に形成された凹凸形状の焦点検出マーカーを有する培養容器の内部底面に対物レンズの焦点を合わせる焦点検出方法において、軸外れの特定の照明角で前記培養容器の内部底面に形成された凹凸形状の焦点検出マーカーを照明し、前記焦点検出マーカーからの回折・散乱光を前記対物レンズを介して検出し、前記焦点検出マーカーの像のコントラスト値が極値になるように前記対物レンズと前記培養容器の相対距離を変化させることを特徴とする焦点検出方法。
2. 前記照明角が暗視野照明となるように設定されており、前記焦点検出マーカーの像のコントラスト値が極大値になるように前記対物レンズと前記培養容器の相対距離を変化させることを特徴とする請求項１記載の焦点検出方法。
3. 前記焦点検出マーカーが格子状パターンからなることを特徴とする請求項１又は２記載の焦点検出方法。
4. 軸外れの特定の照明角で試料面を照明可能な開口が着脱可能に設けられた照明光学系と、内部底面に形成された凹凸形状の焦点検出マーカーを有する培養容器が載置されたステージと、前記焦点検出マーカーからの回折・散乱光を撮像素子に導く観察光学系と、前記撮像素子で撮像された前記焦点検出マーカーの像のコントラスト値が極値になるように前記観察光学系と前記培養容器の相対距離を変化させる合焦機構とを有することを特徴とする自動細胞培養装置用自動焦点検出装置。
5. 前記培養容器の内部底面の２次元的に相互に離間した複数の位置に前記焦点検出マーカーが設けられていることを特徴とする請求項４記載の自動細胞培養装置用自動焦点検出装置。
6. 前記培養容器の内部底面の前記焦点検出マーカーの部分に細胞付着処理が施されていないことを特徴とする請求項４又は５記載の自動細胞培養装置用自動焦点検出装置。
7. 前記観察光学系と前記培養容器の相対距離を計測する手段を備えることを特徴とする請求項４から６の何れか１項記載の自動細胞培養装置用自動焦点検出装置。
8. 複数の前記焦点検出マーカー位置での焦点検出結果から、複数の前記焦点検出マーカー間の前記観察光学系と前記培養容器の相対距離を補間する補間手段を備えることを特徴とする請求項４から７の何れか１項記載の自動細胞培養装置用自動焦点検出装置。
9. 軸外れの特定の照明角で試料面を照明可能な開口が着脱可能に設けられた照明光学系と、内部底面の２次元的に相互に離間した複数の位置に凹凸形状の焦点検出マーカーが形成されており、その内部底面に沿って細胞が培養される培養容器と、前記培養容器が載置されるステージと、前記培養容器の焦点検出マーカーからの回折・散乱光を撮像素子に導く観察光学系と、前記撮像素子で撮像された前記焦点検出マーカーの像のコントラスト値が極値になるように前記観察光学系と前記培養容器の相対距離を変化させる合焦機構と、複数の前記焦点検出マーカー位置での焦点検出結果から、複数の前記焦点検出マーカー間の前記観察光学系と前記培養容器の相対距離を補間する補間手段とを備え、複数の前記焦点検出マーカー間の位置を観察する際に、前記補間手段により求められた相対距離位置へ前記観察光学系を移動させるように構成されていることを特徴とする自動細胞培養装置。
10. 透明体からなり、底面が平面状で皿状の培養容器であって、内部底面の２次元的に相互に離間した複数の位置に、凹凸形状の焦点検出マーカーが設けられていることを特徴とする培養容器。
11. 内部底面の前記焦点検出マーカーの部分に細胞付着処理が施されていないことを特徴とする請求項１０記載の培養容器。

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