[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

JP2004512824A - 肺癌の治療および診断のための組成物および方法 - Google Patents

肺癌の治療および診断のための組成物および方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2004512824A
JP2004512824A JP2002509377A JP2002509377A JP2004512824A JP 2004512824 A JP2004512824 A JP 2004512824A JP 2002509377 A JP2002509377 A JP 2002509377A JP 2002509377 A JP2002509377 A JP 2002509377A JP 2004512824 A JP2004512824 A JP 2004512824A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
clone
cdna sequence
determined cdna
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2002509377A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2004512824A5 (ja
Inventor
ワン，　トントン
渡部　良広
ヘンダーソン，　ロバート　エイ．
ジョンソン，　ジェフリー　シー．
レッター，　マーク　ダブリュー．
マーネラキス，　マルガリータ
カーター，　ダリック
ファンガー，　ギャリー　リチャード
ヴェドヴィック，　トーマス　エス．
バンガー，　チャイタニャ　エス．
マクナブ，　アンドリア
ワン，　アイジュン
ファンガー，　ネイル
スウィッツァー，　アン
マクネイル，　パトリシア　ディー．
クラッパー，　ジョナサン　ディー．
Original Assignee
コリクサ　コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/614,124 external-priority patent/US6630574B1/en
Priority claimed from US09/651,563 external-priority patent/US6914132B1/en
Priority claimed from US09/658,824 external-priority patent/US6746846B1/en
Priority claimed from US09/671,325 external-priority patent/US6667154B1/en
Priority claimed from US09/702,705 external-priority patent/US6504010B1/en
Priority claimed from US09/736,457 external-priority patent/US6509448B2/en
Priority claimed from US09/849,626 external-priority patent/US20020197669A1/en
Application filed by コリクサ　コーポレイション filed Critical コリクサ　コーポレイション
Publication of JP2004512824A publication Critical patent/JP2004512824A/ja
Publication of JP2004512824A5 publication Critical patent/JP2004512824A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本発明によって、癌（特に、肺癌）の治療および診断のための組成物および方法が開示される。例示的な組成物は、１つ以上の肺癌ポリペプチド、その免疫原性部分、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、およびこのようなポリペプチドを発現する細胞に特異的なＴ細胞を含む。この開示される組成物は、例えば、疾患（特に、肺癌）の診断、予防、および／または処置において有用である。

Description

【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、一般に、癌（例えば、肺癌）の治療および診断に関する。本発明は、より具体的には、肺腫瘍タンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。このようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、薬学的組成物（例えば、ワクチン）およ肺癌の診断および処置のための他の組成物において有用である。
【０００２】
（参照によるＣＤ−ＲＯＭの配列表の包含）
本出願に関連する配列表は、ＡＩ§８０１（ａ）に基づくペーパーコピーの代わりにＣＤ−ＲＯＭで提供され、そしてこれは本明細書に参考として援用される。４枚のＣＤ−ＲＯＭが提供され、これは配列表の同一のコピーを含む：ＣＤ−ＲＯＭ　Ｎｏ．１は、「ＣＯＰＹ　１−ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＩＳＴＩＮＧ　ＰＡＲＴ」とラベルされ、２００１年７月１０日に作成された１．４ＭＢの４７８０２ｐｃ．ａｐｐ．ｔｘｔというファイルを含む；ＣＤ−ＲＯＭ　Ｎｏ．２は、「ＣＯＰＹ　２−ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＩＳＴＩＮＧ」とラベルされ、２００１年７月１０日に作成された１．４ＭＢの４７８０２ｐｃ．ａｐｐ．ｔｘｔというファイルを含む；ＣＤ−ＲＯＭ　Ｎｏ．３は、「ＣＯＰＹ　３−ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＩＳＴＩＮＧ　ＰＡＲＴ」とラベルされ、２００１年７月１０日に作成され、１．４ＭＢの４７８０２ｐｃ．ａｐｐ．ｔｘｔというファイルを含む；ＣＤ−ＲＯＭ　Ｎｏ．４は、「ＣＲＦ」とラベルされ、２００１年７月１０日に作成された１．４Ｍｂの４７８０２ｐｃ．ａｐｐ．ｔｘｔというファイルを含む。
【０００３】
（発明の背景）
癌は、世界中の重大な健康の問題である。癌の検出および治療において進歩はあったが、予防および処置のためのワクチンおよび他の普遍的に成功する方法は、現在利用可能でない。現在の治療（これは、一般に、化学療法または手術と放射線との組み合わせに基づく）は、多くの患者において不適切であるとの証明が続いている。
【０００４】
肺癌は、米国における男性および女性の両方における癌での死亡の主な原因であり、１９９４年には推定１７２，０００件の新たな症例が報告されている。全ての肺癌患者における５年間の生存率は、診断時における疾患の病期に関わらず、わずか１３％である。これは、この疾患がまだ局在している間に検出された症例における４６％の５年間生存率と対照的である。しかし、肺癌が広がる前に発見されるのはこの疾患の１６％に過ぎない。
【０００５】
早期発見は難しい。なぜなら、臨床症状は、この疾患が進行した病期に達するまでしばしばみられないからである。現在のところ、診断は、胸部Ｘ線、痰に含まれる細胞型の分析、および気管支道の光ファイバー試験の使用により補助される。処置レジメンは、癌の型および病期により決定され、そして手術、放射線治療および／または化学療法を含む。
【０００６】
この癌および他の癌についての治療におけるかなりの研究にも関わらず、肺癌は、診断および効果的に処置することが困難なままである。従って、当該分野において、このような癌を検出および処置するための改良された方法の必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
【０００７】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、以下：
（ａ）配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２において提供される配列；
（ｂ）配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２において提供される配列の相補体；
（ｃ）配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２において提供される配列のうち、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５および１００個連続した残基を含む配列；
（ｄ）配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２において提供される配列に、中程度〜高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｅ）配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２の配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列；
（ｆ）配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１、および１９７４〜２００２において提供される配列の縮重改変体、
からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド組成物を提供する。
【０００８】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド組成物は、試験した肺腫瘍サンプルの少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、そして最も好ましくは少なくとも５０％において、正常な組織よりも少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、そして最も好ましくは少なくとも約１０倍高いレベルで発現される。
【０００９】
本発明は、別の局面において、上記のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、配列番号３２４〜３４０、７８３、７８６、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７〜７９９、８０５、８０６、８０９、８２７、１６６７、１６７０〜１６７５、１６７７〜１６７９、１８０６〜１８２２、１８２５、１８３０〜１８３３、１８３４〜１８５６、１８６３、１８６４、１８６９〜１８７２、１８７４、１８７６、１８７８、１８８０、１８８２、１８８４〜１８９０、１９０１〜１９０９、１９１３、１９１７、１９２１、１９２５〜１９３０、１９３２、１９３４、１９３７、１９４０、および１９４２〜１９７３に列挙される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド組成物をさらに提供する。
【００１１】
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、免疫原性である（すなわち、これらは、免疫応答（特に、本明細書中にさらに記載されるような体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を惹起し得る）。
【００１２】
本発明は、開示されるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列のフラグメント、改変体および／または誘導体をさらに提供し、ここで、このフラグメント、改変体および／または誘導体は、好ましくは、配列番号３２４〜３４０、７８３、７８６、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７〜７９９、８０５、８０６、８０９、８２７、１６６７、１６７０〜１６７５、１６７７〜１６７９、１８０６〜１８２２、１８２５、１８３０〜１８３３、１８３４〜１８５６、１８６３、１８６４、１８６９〜１８７２、１８７４、１８７６、１８７８、１８８０、１８８２、１８８４〜１８９０、１９０１〜１９０９、１９１３、１９１７、１９２１、１９２５〜１９３０、１９３２、１９３４、１９３７、１９４０および１９４２〜１９７３に示されるポリペプチド配列、または配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列の免疫原性活性のうち、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の免疫原性活性レベルを有する。
【００１３】
本発明は、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞をさらに提供する。
【００１４】
他の局面において、本発明は、上記のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００１５】
本発明の関連する局面において、予防用途または治療用途のための薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）が提供される。このような組成物は、一般に、本発明の免疫原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および免疫刺激剤（例えば、アジュバント）を含む。
【００１６】
本発明は、以下を含む薬学的組成物をさらに提供する：（ａ）本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；および（ｂ）生理学的に受容可能なキャリア。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）上記のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリまたは賦形剤。例示的な抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞、およびＢ細胞が挙げられる。
【００１８】
関連する局面において、以下を含む薬学的組成物が提供される：（ａ）上記のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、および（ｂ）免疫刺激剤。
【００１９】
本発明は、他の局面において、代表的には生理学的に受容可能なキャリアおよび／または免疫刺激剤を含む薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）の形態で、少なくとも１つの上記ポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびにこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。この融合タンパク質は、本明細書中に記載される複数の免疫原性ポリペプチドまたはその部分／改変体を含み得、そしてこのポリペプチドの発現、精製、および／または免疫原性を促進するための１つ以上のポリペプチドセグメントをさらに含み得る。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、患者における免疫応答（好ましくは、ヒト患者におけるＴ細胞応答）を刺激するための方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する。この患者は、肺癌に罹患している患者であり得る（この場合、この方法はこの疾患の処置を提供する）か、またはこのような疾患の危険性があると考えられる患者は、予防的に処置され得る。
【００２１】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の発症を阻害するための方法を提供し、この方法は、上記に列挙される薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する。この患者は、肺癌に罹患している患者であり得る（この場合、この方法はこの疾患の処置を提供する）か、またはこのような疾患の危険性があると考えられる患者は、予防的に処置され得る。
【００２２】
本発明は、他の局面において、生物学的サンプルから腫瘍細胞を除去するための方法をさらに提供し、この方法は、本発明のポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞を、生物学的サンプルと接触させる工程を包含し、ここで、この接触させる工程は、このタンパク質を発現する細胞のこのサンプルからの除去を可能にするために十分な条件および時間で実施される。
【００２３】
関連する局面において、患者における癌の発症を阻害するための方法が提供され、この方法は、上記のように処理した生物学的サンプルを患者に投与する工程を包含する。
【００２４】
他の局面において、本発明のポリペプチドに特異的なＴ細胞を刺激および／または拡大するための方法がさらに提供され、この方法は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞の刺激および／または拡大を可能にするのに十分な条件下および時間で、以下のうち１つ以上と接触させる工程を包含する：（ｉ）上記のポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および／または（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞。上記のように調製されたＴ細胞を含む単離されたＴ細胞集団もまた、提供される。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の発症を阻害するための方法を提供し、この方法は、上記のようなＴ細胞集団の有効量を患者に投与する工程を包含する。
【００２６】
本発明は、患者における癌の発症を阻害するための方法をさらに提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）以下：（ｉ）本明細書中に開示されるポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、のうちの１つ以上と、患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞とをインキュベートする工程；ならびに（ｂ）増殖したＴ細胞の有効量をこの患者に投与し、そしてこれによってこの患者における癌の発症を阻害する工程。増殖した細胞は、この患者への投与の前にクローニングされ得るが、その必要はない。
【００２７】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌（好ましくは、肺癌）の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）上記のポリペプチドに結合する結合因子を、患者から得た生物学的サンプルに接触させる工程；（ｂ）この結合因子に結合したポリペプチドの量を、このサンプルにおいて検出する工程；および（ｃ）このポリペプチドの量と所定のカットオフ値とを比較して、それによってこの患者における癌の存在または非存在を決定する工程。好ましい実施形態において、この結合因子は、抗体であり、より好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２８】
本発明はまた、他の局面において、患者における癌の進行をモニタリングするための方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第１の時点で患者から得た生物学的サンプルを、上記ポリペプチドに結合する結合因子と接触させる工程；（ｂ）この結合因子に結合するポリペプチドの量を、このサンプル中で検出する工程；（ｃ）引き続く時点でこの患者から得た生物学的サンプルを使用して、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）において検出したポリペプチドの量を、工程（ｂ）において検出した量と比較し、それによってこの患者における癌の進行をモニタリングする工程。
【００２９】
本発明は、他の局面において、患者における癌の存在または非存在を決定するための方法をさらに提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から得た生物学的サンプルを、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（好ましくはｍＲＮＡ）のレベルを、このサンプルにおいて検出する工程；および（ｃ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのレベルを、所定のカットオフ値と比較し、それによってこの患者における癌の存在または非存在を決定する工程。特定の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、例えば、上記のようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこのようなポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を介して、検出される。他の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこのようなポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを利用するハイブリダイゼーション技術を使用して、検出される。
【００３０】
関連する局面において、患者における癌の進行をモニタリングするための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から得た生物学的サンプルを、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたポリヌクレオチドの量を、このサンプルにおいて検出する工程；（ｃ）引き続く時点でこの患者から得た生物学的サンプルを使用して、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）において検出したポリヌクレオチドの量を、工程（ｂ）において検出した量と比較し、それによってこの患者における癌の進行をモニタリングする工程。
【００３１】
さらなる局面において、本発明は、上記のポリペプチドに結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）、ならびにこのような抗体を含む診断キットを提供する。上記の１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを含む診断キットもまた、提供される。
【００３２】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明を参照して明らかとなる。本明細書中に開示される全ての参考文献は、その各々が別個に援用されるように、本明細書中でその全体において参考として援用される。
【００３３】
（配列識別子）
配列番号１は、クローン＃１９０３８（Ｌ８４５Ｐともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２は、クローン＃１９０３６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３は、クローン＃１９０３４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４は、クローン＃１９０３３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５は、クローン＃１９０３２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６は、クローン＃１９０３０（Ｌ５５９Ｓともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７は、クローン＃１９０２９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８は、クローン＃１９０２５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９は、クローン＃１９０２３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０は、クローン＃１８９２９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１は、クローン＃１９０１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２は、クローン＃１９００９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３は、クローン＃１９００５、１９００７、１９０１６、および１９０１７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４は、クローン＃１９００４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５は、クローン＃１９００２および１８９６５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６は、クローン＃１８９９８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７は、クローン＃１８９９７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８は、クローン＃１８９９６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９は、クローン＃１８９９５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０は、クローン＃１８９９４（Ｌ８４６Ｐとしても知られている）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１は、クローン＃１８９９２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２は、クローン＃１８９９１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３は、クローン＃１８９９０（クローン＃２０１１１ともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４は、クローン＃１８９８７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５は、クローン＃１８９８５（Ｌ８３９Ｐともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６は、クローン＃１８９８４（Ｌ８４７Ｐともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７は、クローン＃１８９８３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８は、クローン＃１８９７６および１８９８０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９は、クローン＃１８９７５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０は、クローン＃１８９７４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１は、クローン＃１８９７３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２は、クローン＃１８９７２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３は、クローン＃１８９７１（Ｌ８０１Ｐともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４は、クローン＃１８９７０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５は、クローン＃１８９６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６は、クローン＃１８９６４、１８９６８および１９０３９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７は、クローン＃１８９６０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８は、クローン＃１８９５９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９は、クローン＃１８９５８および１８９８２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０は、クローン＃１８９５６および１９０１５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１は、クローン＃１８９５４（Ｌ８４８Ｐともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２は、クローン＃１８９５１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３は、クローン＃１８９５０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４は、クローン＃１８９４９および１９０２４（Ｌ８４４Ｐともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５は、クローン＃１８９４８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６は、クローン＃１８９４７（Ｌ８４０Ｐともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７は、クローン＃１８９４６、１８９５３、１８９６９および１９０２７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８は、クローン＃１８９４２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９は、クローン＃１８９４０、１８９６２、１８９６３、１９００６、１９００８、１９０００および１９０３１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０は、クローン＃１８９３９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１は、クローン＃１８９３８および１８９５２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２は、クローン＃１８９３８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３は、クローン＃１８９３７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４は、クローン＃１８９３４、１８９３５、１８９９３および１９０２２（Ｌ５４８Ｓともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５は、クローン＃１８９３２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６は、クローン＃１８９３１および１８９３６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７は、クローン＃１８９３０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８は、クローン＃１９０１４について決定されたｃＤＮＡ配列である（この配列は、クローンＬ７７３Ｐ（これはまた、１９９９年４月２日出願の同時係属中の米国出願０９／２８５，４７９にもまた記載される）に対する相同性を有する）。
配列番号５９は、クローン＃１９１２７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６０は、クローン＃１９０５７および１９０６４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１は、クローン＃１９１２２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２は、クローン＃１９１２０および１８１２１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３は、クローン＃１９１１８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４は、クローン＃１９１１７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５は、クローン＃１９１１６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６は、クローン＃１９１１４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７は、クローン＃１９１１２（Ｌ５６１Ｓとしても知られている）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８は、クローン＃１９１１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９は、クローン＃１９１０７（Ｌ５５２Ｓともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０は、クローン＃１９１０６（Ｌ５４７Ｓともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１は、クローン＃１９１０５および１９１１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２は、クローン＃１９０９９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３は、クローン＃１９０９５、１９１０４および１９１２５（Ｌ５４９Ｓともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４は、クローン＃１９０９４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５は、クローン＃１９０８９および１９１０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６は、クローン＃１９０８８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７は、クローン＃１９０８７、１９０９２、１９０９６、１９１００および１９１１９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７８は、クローン＃１９０８６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７９は、クローン＃１９０８５（Ｌ５５０Ｓともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８０は、クローン＃１９０８４（クローン＃１９０７９ともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８１は、クローン＃１９０８２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８２は、クローン＃１９０８０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８３は、クローン＃１９０７７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８４は、クローン＃１９０７６（Ｌ５５１Ｓともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８５は、クローン＃１９０７４（クローン＃２０１０２ともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８６は、クローン＃１９０７３（Ｌ５６０Ｓともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８７は、クローン＃１９０７２および１９１１５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８８は、クローン＃１９０７１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８９は、クローン＃１９０７０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９０は、クローン＃１９０６９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９１は、クローン＃１９０６８（Ｌ５６３Ｓともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９２は、クローン＃１９０６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９３は、クローン＃１９０６５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９４は、クローン＃１９０６３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９５は、クローン＃１９０６１、１９０８１、１９１０８および１９１０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９６は、クローン＃１９０６０、１９０６７および１９０８３（Ｌ５４８Ｓともいわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９７は、クローン＃１９０５９および１９０６２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９８は、クローン＃１９０５８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９９は、クローン＃１９１２４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１００は、クローン＃１８９２９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０１は、クローン＃１８４２２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０２は、クローン＃１８４２５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０３は、クローン＃１８４３１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０４は、クローン＃１８４３３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０５は、クローン＃１８４４４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０６は、クローン＃１８４４９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０７は、クローン＃１８４５１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０８は、クローン＃１８４５２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０９は、クローン＃１８４５５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１０は、クローン＃１８４５７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１１は、クローン＃１８４６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１２は、クローン＃１８４６８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１３は、クローン＃１８４７１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１４は、クローン＃１８４７５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１５は、クローン＃１８４７６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１６は、クローン＃１８４７７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１７は、クローン＃２０６３１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１８は、クローン＃２０６３４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１９は、クローン＃２０６３５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２０は、クローン＃２０６３７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２１は、クローン＃２０６３８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２２は、クローン＃２０６４３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２３は、クローン＃２０６５２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２４は、クローン＃２０６５３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２５は、クローン＃２０６５７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２６は、クローン＃２０６５８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２７は、クローン＃２０６６０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２８は、クローン＃２０６６１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２９は、クローン＃２０６６３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３０は、クローン＃２０６６５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３１は、クローン＃２０６７０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３２は、クローン＃２０６７１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３３は、クローン＃２０６７２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３４は、クローン＃２０６７５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３５は、クローン＃２０６７９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３６は、クローン＃２０６８１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３７は、クローン＃２０６８２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３８は、クローン＃２０６８４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３９は、クローン＃２０６８５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４０は、クローン＃２０６８９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４１は、クローン＃２０６９９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４２は、クローン＃２０７０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４３は、クローン＃２０７０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４４は、クローン＃２０７０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４５は、クローン＃２０７１５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４６は、クローン＃２０７１６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４７は、クローン＃２０７１９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４８は、クローン＃１９１２９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４９は、クローン＃１９１３１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５０は、クローン＃１９１３２．２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５１は、クローン＃１９１３３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５２は、クローン＃１９１３４．２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５３は、クローン＃１９１３５．２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５４は、クローン＃１９１３７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５５は、クローン＃１９１３８．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。．
配列番号１５６は、クローン＃１９１３８．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５７は、クローン＃１９１３９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５８は、クローン＃１９１４０．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５９は、クローン＃１９１４０．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６０は、クローン＃１９１４１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６１は、クローン＃１９１４３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６２は、クローン＃１９１４４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６３は、クローン＃１９１４５．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６４は、クローン＃１９１４５．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６５は、クローン＃１９１４６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６６は、クローン＃１９１４９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６７は、クローン＃１９１５２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６８は、クローン＃１９１５３．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６９は、クローン＃１９１５３．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７０は、クローン＃１９１５５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７１は、クローン＃１９１５７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７２は、クローン＃１９１５９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７３は、クローン＃１９１６０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７４は、クローン＃１９１６１．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７５は、クローン＃１９１６１．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７６は、クローン＃１９１６２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７７は、クローン＃１９１６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７８は、クローン＃１９１６９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７９は、クローン＃１９１７１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８０は、クローン＃１９１７３．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８１は、クローン＃１９１７３．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８２は、クローン＃１９１７４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８３は、クローン＃１９１７５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８４は、クローン＃１９１７７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８５は、クローン＃１９１７８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８６は、クローン＃１９１７９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８７は、クローン＃１９１７９．２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８８は、クローン＃１９１８０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８９は、クローン＃１９１８２．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９０は、クローン＃１９１８２．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９１は、クローン＃１９１８３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９２は、クローン＃１９１８５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９３は、クローン＃１９１８７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９４は、クローン＃１９１８８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９５は、クローン＃１９１９０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９６は、クローン＃１９１９１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９７は、クローン＃１９１９２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９８は、クローン＃１９１９３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９９は、クローン＃１９１９４．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２００は、クローン＃１９１９４．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０１は、クローン＃１９１９７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０２は、クローン＃１９２００．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０３は、クローン＃１９２００．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０４は、クローン＃１９２０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０５は、クローン＃１９２０４．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０６は、クローン＃１９２０４．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０７は、クローン＃１９２０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０８は、クローン＃１９２０６．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０９は、クローン＃１９２０６．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１０は、クローン＃１９２０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１１は、クローン＃１９２０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１２は、クローン＃１９２１１．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１３は、クローン＃１９２１１．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１４は、クローン＃１９２１４．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１５は、クローン＃１９２１４．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１６は、クローン＃１９２１５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１７は、クローン＃１９２１７．２について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１８は、クローン＃１９２１７．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１９は、クローン＃１９２１８．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２０は、クローン＃１９２１８．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２１は、クローン＃１９２２０．１について決定された第１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２２は、クローン＃１９２２０．２について決定された第２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２３は、クローン＃２２０１５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２４は、クローン＃２２０１７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２５は、クローン＃２２０１９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２６は、クローン＃２２０２０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２７は、クローン＃２２０２３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２８は、クローン＃２２０２６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２９は、クローン＃２２０２７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３０は、クローン＃２２０２８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３１は、クローン＃２２０３２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３２は、クローン＃２２０３７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３３は、クローン＃２２０４５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３４は、クローン＃２２０４８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３５は、クローン＃２２０５０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３６は、クローン＃２２０５２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３７は、クローン＃２２０５３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３８は、クローン＃２２０５７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３９は、クローン＃２２０６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４０は、クローン＃２２０７７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４１は、クローン＃２２０８５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４２は、クローン＃２２１０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４３は、クローン＃２２１０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４４は、クローン＃２２１０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４５は、クローン＃２４８４２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４６は、クローン＃２４８４３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４７は、クローン＃２４８４５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４８は、クローン＃２４８５１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４９は、クローン＃２４８５２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５０は、クローン＃２４８５３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５１は、クローン＃２４８５４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５２は、クローン＃２４８５５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５３は、クローン＃２４８６０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５４は、クローン＃２４８６４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５５は、クローン＃２４８６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５６は、クローン＃２４８６７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５７は、クローン＃２４８６８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５８は、クローン＃２４８６９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５９は、クローン＃２４８７０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６０は、クローン＃２４８７２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６１は、クローン＃２４８７３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６２は、クローン＃２４８７５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６３は、クローン＃２４８８２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６４は、クローン＃２４８８５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６５は、クローン＃２４８８６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６６は、クローン＃２４８８７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６７は、クローン＃２４８８８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６８は、クローン＃２４８９０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６９は、クローン＃２４８９６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７０は、クローン＃２４８９７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７１は、クローン＃２４８９９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７２は、クローン＃２４９０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７３は、クローン＃２４９０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７４は、クローン＃２４９０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７５は、クローン＃２４９１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７６は、クローン＃２４９１３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７７は、クローン＃２４９２０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７８は、クローン＃２４９２７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７９は、クローン＃２４９３０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８０は、クローン＃２６９３８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８１は、クローン＃２６９３９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８２は、クローン＃２６９４３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８３は、クローン＃２６９４８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８４は、クローン＃２６９５１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８５は、クローン＃２６９５５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８６は、クローン＃２６９５６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８７は、クローン＃２６９５９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８８は、クローン＃２６９６１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８９は、クローン＃２６９６２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９０は、クローン＃２６９６４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９１は、クローン＃２６９６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９２は、クローン＃２６９６８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９３は、クローン＃２６９７２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９４は、クローン＃２６９７３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９５は、クローン＃２６９７４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９６は、クローン＃２６９７６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９７は、クローン＃２６９７７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９８は、クローン＃２６９７９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９９は、クローン＃２６９８０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３００は、クローン＃２６９８１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０１は、クローン＃２６９８４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０２は、クローン＃２６９８５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０３は、クローン＃２６９８６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０４は、クローン＃２６９９３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０５は、クローン＃２６９９４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０６は、クローン＃２６９９５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０７は、クローン＃２７００３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０８は、クローン＃２７００５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０９は、クローン＃２７０１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１０は、クローン＃２７０１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１１は、クローン＃２７０１３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１２は、クローン＃２７０１６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１３は、クローン＃２７０１７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１４は、クローン＃２７０１９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１５は、クローン＃２７０２８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１６は、クローン＃１９０６０についての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１７は、クローン＃１８９６４についての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１８は、クローン＃１８９２９についての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１９は、クローン＃１８９９１についての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２０は、クローン＃１８９９６についての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２１は、クローン＃１８９６６についての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２２は、クローン＃１８９５１についての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２３は、クローン＃１８９７３（またＬ５１６Ｓとしても知られている）についての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２４は、クローン＃１９０６０についてのアミノ酸配列である。
配列番号３２５は、クローン＃１９０６３についてのアミノ酸配列である。
配列番号３２６は、クローン＃１９０７７についてのアミノ酸配列である。
配列番号３２７は、クローン＃１９１１０についてのアミノ酸配列である。
配列番号３２８は、クローン＃１９１２２についてのアミノ酸配列である。
配列番号３２９は、クローン＃１９１１８についてのアミノ酸配列である。
配列番号３３０は、クローン＃１９０８０についてのアミノ酸配列である。
配列番号３３１は、クローン＃１９１２７についてのアミノ酸配列である。
配列番号３３２は、クローン＃１９１１７についてのアミノ酸配列である。
配列番号３３３は、クローン＃１９０９５（Ｌ５４９Ｓともいわれる）についてのアミノ酸配列である。
配列番号３３４は、クローン＃１８９６４についてのアミノ酸配列である。
配列番号３３５は、クローン＃１８９２９についてのアミノ酸配列である。
配列番号３３６は、クローン＃１８９９１についてのアミノ酸配列である。
配列番号３３７は、クローン＃１８９９６についてのアミノ酸配列である。
配列番号３３８は、クローン＃１８９６６についてのアミノ酸配列である。
配列番号３３９は、クローン＃１８９５１についてのアミノ酸配列である。
配列番号３４０は、クローン＃１８９７３についてのアミノ酸配列である。
配列番号３４１は、クローン２６４６１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４２は、クローン２６４６２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４３は、クローン２６４６３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４４は、クローン２６４６４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４５は、クローン２６４６５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４６は、クローン２６４６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４７は、クローン２６４６７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４８は、クローン２６４６８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４９は、クローン２６４６９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５０は、クローン２６４７０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５１は、クローン２６４７１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５２は、クローン２６４７２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５３は、クローン２６４７４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５４は、クローン２６４７５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５５は、クローン２６４７６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５６は、クローン２６４７７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５７は、クローン２６４７８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５８は、クローン２６４７９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５９は、クローン２６４８０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６０は、クローン２６４８１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６１は、クローン２６４８２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６２は、クローン２６４８３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６３は、クローン２６４８４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６４は、クローン２６４８５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６５は、クローン２６４８６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６６は、クローン２６４８７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６７は、クローン２６４８８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６８は、クローン２６４８９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６９は、クローン２６４９０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７０は、クローン２６４９１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７１は、クローン２６４９２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７２は、クローン２６４９３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７３は、クローン２６４９４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７４は、クローン２６４９５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７５は、クローン２６４９６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７６は、クローン２６４９７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７７は、クローン２６４９８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７８は、クローン２６４９９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７９は、クローン２６５００について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８０は、クローン２６５０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８１は、クローン２６５０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８２は、クローン２６５０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８３は、クローン２６５０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８４は、クローン２６５０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８５は、クローン２６５０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８６は、クローン２６５０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８７は、クローン２６５０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８８は、クローン２６５０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８９は、クローン２６５１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９０は、クローン２６５１３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９１は、クローン２６５１４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９２は、クローン２６５１５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９３は、クローン２６５１６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９４は、クローン２６５１７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９５は、クローン２６５１８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９６は、クローン２６５１９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９７は、クローン２６５２０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９８は、クローン２６５２１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９９は、クローン２６５２２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４００は、クローン２６５２３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０１は、クローン２６５２４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０２は、クローン２６５２６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０３は、クローン２６５２７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０４は、クローン２６５２８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０５は、クローン２６５２９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０６は、クローン２６５３０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０７は、クローン２６５３２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０８は、クローン２６５３３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０９は、クローン２６５３４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１０は、クローン２６５３５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１１は、クローン２６５３６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１２は、クローン２６５３７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１３は、クローン２６５３８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１４は、クローン２６５４０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１５は、クローン２６５４１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１６は、クローン２６５４２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１７は、クローン２６５４３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１８は、クローン２６５４４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１９は、クローン２６５４６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２０は、クローン２６５４７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２１は、クローン２６５４８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２２は、クローン２６５４９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２３は、クローン２６５５０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２４は、クローン２６５５１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２５は、クローン２６５５２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２６は、クローン２６５５３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２７は、クローン２６５５４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２８は、クローン２６５５６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２９は、クローン２６５５７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３０は、クローン２７６３１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３１は、クローン２７６３２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３２は、クローン２７６３３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３３は、クローン２７６３５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３４は、クローン２７６３６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３５は、クローン２７６３７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３６は、クローン２７６３８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３７は、クローン２７６３９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３８は、クローン２７６４０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３９は、クローン２７６４１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４０は、クローン２７６４２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４１は、クローン２７６４４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４２は、クローン２７６４６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４３は、クローン２７６４７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４４は、クローン２７６４９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４５は、クローン２７６５０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４６は、クローン２７６５１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４７は、クローン２７６５２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４８は、クローン２７６５４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４９は、クローン２７６５５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５０は、クローン２７６５７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５１は、クローン２７６５９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５２は、クローン２７６６５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５３は、クローン２７６６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５４は、クローン２７６６８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５５は、クローン２７６７０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５６は、クローン２７６７１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５７は、クローン２７６７２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５８は、クローン２７６７４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５９は、クローン２７６７７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６０は、クローン２７６８１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６１は、クローン２７６８２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６２は、クローン２７６８３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６３は、クローン２７６８６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６４は、クローン２７６８８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６５は、クローン２７６８９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６６は、クローン２７６９０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６７は、クローン２７６９３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６８は、クローン２７６９９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６９は、クローン２７７００について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７０は、クローン２７７０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７１は、クローン２７７０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７２は、クローン２７７０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７３は、クローン２７７０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７４は、クローン２７７０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７５は、クローン２７７０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７６は、クローン２７７１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７７は、クローン２７７１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７８は、クローン２７７１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７９は、クローン２７７１３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８０は、クローン２７７１４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８１は、クローン２７７１５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８２は、クローン２７７１６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８３は、クローン２７７１７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８４は、クローン２７７１８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８５は、クローン２７７１９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８６は、クローン２７７２０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８７は、クローン２７７２２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８８は、クローン２７７２３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８９は、クローン２７７２４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９０は、クローン２７７２６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９１は、クローン２５０１５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９２は、クローン２５０１６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９３は、クローン２５０１７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９４は、クローン２５０１８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９５は、クローン２５０３０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９６は、クローン２５０３３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９７は、クローン２５０３４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９８は、クローン２５０３５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９９は、クローン２５０３６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５００は、クローン２５０３７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０１は、クローン２５０３８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０２は、クローン２５０３９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０３は、クローン２５０４０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０４は、クローン２５０４２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０５は、クローン２５０４３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０６は、クローン２５０４４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０７は、クローン２５０４５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０８は、クローン２５０４７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０９は、クローン２５０４８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１０は、クローン２５０４９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１１は、クローン２５１８５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１２は、クローン２５１８６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１３は、クローン２５１８７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１４は、クローン２５１８８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１５は、クローン２５１８９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１６は、クローン２５１９０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１７は、クローン２５１９３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１８は、クローン２５１９４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１９は、クローン２５１９６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２０は、クローン２５１９８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２１は、クローン２５１９９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２２は、クローン２５２００について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２３は、クローン２５２０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２４は、クローン２５３６４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２５は、クローン２５３６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２６は、クローン２５３６７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２７は、クローン２５３６８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２８は、クローン２５３６９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２９は、クローン２５３７０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３０は、クローン２５３７１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３１は、クローン２５３７２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３２は、クローン２５３７３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３３は、クローン２５３７４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３４は、クローン２５３７６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３５は、クローン２５３７７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３６は、クローン２５３７８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３７は、クローン２５３７９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３８は、クローン２５３８０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３９は、クローン２５３８１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４０は、クローン２５３８２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４１は、クローン２５３８３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４２は、クローン２５３８５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４３は、クローン２５３８６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４４は、クローン２５３８７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４５は、クローン２６０１３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４６は、クローン２６０１４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４７は、クローン２６０１６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４８は、クローン２６０１７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４９は、クローン２６０１８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５０は、クローン２６０１９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５１は、クローン２６０２０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５２は、クローン２６０２１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５３は、クローン２６０２２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５４は、クローン２６０２７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５５は、クローン２６１９７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５６は、クローン２６１９９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５７は、クローン２６２０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５８は、クローン２６２０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５９は、クローン２６２０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６０は、クローン２６２０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６１は、クローン２６２０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６２は、クローン２６２０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６３は、クローン２６２０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６４は、クローン２６２１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６５は、クローン２６２１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６６は、クローン２６２１３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６７は、クローン２６２１４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６８は、クローン２６２１５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６９は、クローン２６２１６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７０は、クローン２６２１７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７１は、クローン２６２１８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７２は、クローン２６２１９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７３は、クローン２６２２０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７４は、クローン２６２２１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７５は、クローン２６２２４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７６は、クローン２６２２５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７７は、クローン２６２２６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７８は、クローン２６２２７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７９は、クローン２６２２８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８０は、クローン２６２３０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８１は、クローン２６２３１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８２は、クローン２６２３４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８３は、クローン２６２３６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８４は、クローン２６２３７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８５は、クローン２６２３９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８６は、クローン２６２４０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８７は、クローン２６２４１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８８は、クローン２６２４２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８９は、クローン２６２４６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５９０は、クローン２６２４７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５９１は、クローン２６２４８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５９２は、クローン２６２４９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５９３は、クローン２６２５０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５９４は、クローン２６２５１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５９５は、クローン２６２５２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５９６は、クローン２６２５３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５９７は、クローン２６２５４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５９８は、クローン２６２５５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５９９は、クローン２６２５６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６００は、クローン２６２５７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６０１は、クローン２６２５９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６０２は、クローン２６２６０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６０３は、クローン２６２６１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６０４は、クローン２６２６２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６０５は、クローン２６２６３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６０６は、クローン２６２６４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６０７は、クローン２６２６５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６０８は、クローン２６２６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６０９は、クローン２６２６８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１０は、クローン２６２６９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１１は、クローン２６２７１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１２は、クローン２６２７３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１３は、クローン２６８１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１４は、クローン２６８１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１５は、クローン２６８１２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１６は、クローン２６８１２．２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１７は、クローン２６８１３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１８は、クローン２６８１４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１９は、クローン２６８１５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２０は、クローン２６８１６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２１は、クローン２６８１８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２２は、クローン２６８１９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２３は、クローン２６８２０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２４は、クローン２６８２１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２５は、クローン２６８２２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２６は、クローン２６８２４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２７は、クローン２６８２５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２８は、クローン２６８２６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２９は、クローン２６８２７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３０は、クローン２６８２９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３１は、クローン２６８３０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３２は、クローン２６８３１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３３は、クローン２６８３２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３４は、クローン２６８３５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３５は、クローン２６８３６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３６は、クローン２６８３７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３７は、クローン２６８３９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３８は、クローン２６８４１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３９は、クローン２６８４３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４０は、クローン２６８４４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４１は、クローン２６８４５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４２は、クローン２６８４６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４３は、クローン２６８４７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４４は、クローン２６８４８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４５は、クローン２６８４９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４６は、クローン２６８５０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４７は、クローン２６８５１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４８は、クローン２６８５２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４９は、クローン２６８５３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５０は、クローン２６８５４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５１は、クローン２６８５６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５２は、クローン２６８５７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５３は、クローン２６８５８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５４は、クローン２６８５９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５５は、クローン２６８６０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５６は、クローン２６８６２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５７は、クローン２６８６３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５８は、クローン２６８６４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５９は、クローン２６８６５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６０は、クローン２６８６７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６１は、クローン２６８６８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６２は、クローン２６８７１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６３は、クローン２６８７３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６４は、クローン２６８７５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６５は、クローン２６８７６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６６は、クローン２６８７７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６７は、クローン２６８７８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６８は、クローン２６８８０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６９は、クローン２６８８２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７０は、クローン２６８８３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７１は、クローン２６８８４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７２は、クローン２６８８５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７３は、クローン２６８８６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７４は、クローン２６８８７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７５は、クローン２６８８８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７６は、クローン２６８８９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７７は、クローン２６８９０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７８は、クローン２６８９２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７９は、クローン２６８９４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８０は、クローン２６８９５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８１は、クローン２６８９７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８２は、クローン２６８９８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８３は、クローン２６８９９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８４は、クローン２６９００について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８５は、クローン２６９０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８６は、クローン２６９０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８７は、クローン２６９０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８８は、クローン２６９０６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８９は、クローン２６７０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９０は、クローン２６７０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９１は、クローン２６７１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９２は、クローン２６７１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９３は、クローン２６７１２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９４は、クローン２６７１３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９５は、クローン２６７１４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９６は、クローン２６７１５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９７は、クローン２６７１６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９８は、クローン２６７１７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９９は、クローン２６７１８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７００は、クローン２６７１９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０１は、クローン２６７２０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０２は、クローン２６７２１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０３は、クローン２６７２２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０４は、クローン２６７２３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０５は、クローン２６７２４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０６は、クローン２６７２５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０７は、クローン２６７２６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０８は、クローン２６７２７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０９は、クローン２６７２８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１０は、クローン２６７２９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１１は、クローン２６７３０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１２は、クローン２６７３１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１３は、クローン２６７３２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１４は、クローン２６７３３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１５は、クローン２６７３３．２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１６は、クローン２６７３４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１７は、クローン２６７３５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１８は、クローン２６７３６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１９は、クローン２６７３７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２０は、クローン２６７３８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２１は、クローン２６７３９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２２は、クローン２６７４１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２３は、クローン２６７４２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２４は、クローン２６７４３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２５は、クローン２６７４４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２６は、クローン２６７４５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２７は、クローン２６７４６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２８は、クローン２６７４７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２９は、クローン２６７４８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３０は、クローン２６７４９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３１は、クローン２６７５０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３２は、クローン２６７５１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３３は、クローン２６７５２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３４は、クローン２６７５３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３５は、クローン２６７５４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３６は、クローン２６７５５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３７は、クローン２６７５６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３８は、クローン２６７５７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３９は、クローン２６７５８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４０は、クローン２６７５９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４１は、クローン２６７６０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４２は、クローン２６７６１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４３は、クローン２６７６２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４４は、クローン２６７６３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４５は、クローン２６７６４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４６は、クローン２６７６５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４７は、クローン２６７６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４８は、クローン２６７６７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４９は、クローン２６７６８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５０は、クローン２６７６９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５１は、クローン２６７７０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５２は、クローン２６７７１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５３は、クローン２６７７２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５４は、クローン２６７７３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５５は、クローン２６７７４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５６は、クローン２６７７５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５７は、クローン２６７７６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５８は、クローン２６７７７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５９は、クローン２６７７８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６０は、クローン２６７７９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６１は、クローン２６７８１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６２は、クローン２６７８２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６３は、クローン２６７８３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６４は、クローン２６７８４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６５は、クローン２６７８５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６６は、クローン２６７８６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６７は、クローン２６７８７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６８は、クローン２６７８８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６９は、クローン２６７９０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７０は、クローン２６７９１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７１は、クローン２６７９２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７２は、クローン２６７９３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７３は、クローン２６７９４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７４は、クローン２６７９５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７５は、クローン２６７９６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７６は、クローン２６７９７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７７は、クローン２６７９８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７８は、クローン２６８００について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７９は、クローン２６８０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７８０は、クローン２６８０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７８１は、クローン２６８０３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７８２は、クローン２６８０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７８３は、Ｌ７７３Ｐについてのアミノ酸配列である。
配列番号７８４は、Ｌ７７３Ｐ発現構築物の決定されたＤＮＡ配列である。
配列番号７８５は、Ｌ７７３ＰＡ発現構築物の決定されたＤＮＡ配列である。
配列番号７８６は、Ｌ５５２Ｓについての推定アミノ酸配列である。
配列番号７８７は、Ｌ８４０Ｐについての推定アミノ酸配列である。
配列番号７８８は、Ｌ５４８Ｓについての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号７８９は、配列番号７８８によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号７９０は、Ｌ５５２Ｓについての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号７９１は、配列番号７９０のｃＤＮＡ配列によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号７９２は、Ｌ５５２Ｓのアイソフォームについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７９３は、配列番号７９２によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号７９４は、Ｌ８４０Ｐの伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号７９５は、配列番号７９４によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号７９６は、Ｌ８０１Ｐについての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号７９７は、配列番号７９６によってコードされる第１の推定アミノ酸配列である。
配列番号７９８は、配列番号７９６によってコードされる第２の推定アミノ酸配列である。
配列番号７９９は、配列番号７９６によってコードされる第３の推定アミノ酸配列である。
配列番号８００は、Ｌ８４４Ｐについて決定された全長配列である。
配列番号８０１は、Ｌ５５１Ｓについての５’コンセンサスｃＤＮＡ配列である。
配列番号８０２は、Ｌ５５１Ｓについての３’コンセンサスｃＤＮＡ配列である。
配列番号８０３は、ＳＴＹ８についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号８０４は、Ｌ５５１Ｓについての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号８０５は、ＳＴＹ８についてのアミノ酸配列である。
配列番号８０６は、Ｌ５５１Ｓについての伸長アミノ酸配列である。
配列番号８０７は、Ｌ７７３Ｐについて決定された全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号８０８は、Ｌ５５２Ｓについての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号８０９は、Ｌ５５２Ｓについての全長アミノ酸配列である。
配列番号８１０は、クローン５０９８９の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８１１は、クローン５０９９０の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８１２は、クローン５０９９２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８１３〜８２４は、肺腫瘍組織から単離されたクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８２５は、全長Ｌ５５１Ｓクローン５４３０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８２６は、全長Ｌ５５１Ｓクローン５４２９８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８２７は、Ｌ５５１Ｓについての全長アミノ酸配列である。
表１〜６は、配列番号８２８〜１６６４についての配列識別子を含む。
【００３４】
【表１】
Figure 2004512824
Figure 2004512824
【００３５】
【表２】
Figure 2004512824
【００３６】
【表３】
Figure 2004512824
【００３７】
【表４】
Figure 2004512824
【００３８】
【表５】
Figure 2004512824
【００３９】
【表６】
Figure 2004512824
【００４０】
【表７】
Figure 2004512824
【００４１】
【表８】
Figure 2004512824
Figure 2004512824
【００４２】
【表９】
Figure 2004512824
【００４３】
【表１０】
Figure 2004512824
【００４４】
【表１１】
Figure 2004512824
Figure 2004512824
【００４５】
【表１２】
Figure 2004512824
【００４６】
【表１３】
Figure 2004512824
Figure 2004512824
【００４７】
【表１４】
Figure 2004512824
配列番号１６６５および１６６６は、Ｌ５４８Ｓのコード領域の増幅の際に使用されるプライマーである。
配列番号１６６７は、発現した組換えＬ７５４８Ｓのタンパク質配列である。
配列番号１６６８は、発現した組換えＬ７５４８ＳのｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６６９は、クローン＃１８９７１（Ｌ８０１Ｐ）の伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６７０は、配列番号１６６９によってコードされるオープンリーディングフレームＯＲＦ４のアミノ酸配列である。
配列番号１６７１は、配列番号１６６９によってコードされるオープンリーディングフレームＯＲＦ５のアミノ酸配列である。
配列番号１６７２は、配列番号１６６９によってコードされるオープンリーディングフレームＯＲＦ６のアミノ酸配列である。
配列番号１６７３は、配列番号１６６９によってコードされるオープンリーディングフレームＯＲＦ７のアミノ酸配列である。
配列番号１６７４は、配列番号１６６９によってコードされるオープンリーディングフレームＯＲＦ８のアミノ酸配列である。
配列番号１６７５は、配列番号１６６９によってコードされるオープンリーディングフレームＯＲＦ９のアミノ酸配列である。
配列番号１６７６は、コンティグ１３９（配列番号１４６７）（Ｌ９８５Ｐとしても知られている）についての伸長ｃＤＮＡである。
配列番号１６７７は、配列番号１６７６によってコードされるＬ９８５Ｐアミノ酸配列である。
配列番号１６７８は、配列番号１６６９のオープンリーディングフレームＯＲＦ５Ｘのアミノ酸配列である。
配列番号１６７９は、コンティグ１３９（配列番号１４６７）についてのオープンリーディングフレームのアミノ酸配列である。
配列番号１６８０〜１７８８は、表９に示され、肺チップ５上のＳＱＬ１、ＳＣＬ１、ＳＣＬ３およびＳＣＬ４ライブラリーのマイクロアレイ分析によって同定されたｃＤＮＡクローンを表す。
【００４８】
【表１５】
Figure 2004512824
Figure 2004512824
Figure 2004512824
配列番号１７８９は、クローン＃４７９８８（Ｌ９７２Ｐ）のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７９０は、クローン＃４８００５（Ｌ９７９Ｐ）のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７９１は、クローン＃４８００５（Ｌ９７９Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７９２は、クローン＃４９８２６（配列番号１２７９；Ｌ９８０Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７９３は、クローン＃２０６３１（配列番号１１７；Ｌ９７３Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７９４は、クローン＃２０６６１（配列番号１２８；Ｌ９７４Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７９５は、クローン＃５０４３０（配列番号１４４２；Ｌ９９６Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７９６は、クローン＃２６９６１（配列番号２８８；Ｌ９７７Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７９７は、クローン＃２４９２８（配列番号１３３９；Ｌ９７８Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７９８は、クローン＃５０５０７（配列番号１４４６；Ｌ９８４Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７９９は、クローン＃５０６４５（配列番号１５３１；Ｌ９８８Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８００は、クローン＃５０６２８（配列番号１５３３；Ｌ１４２３Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８０１は、クローン＃５０５６０（配列番号１５２７；Ｌ９８７Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８０２は、クローン＃２７６９９（配列番号４６８；Ｌ９９８Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８０３は、クローン＃５９３０３（配列番号９４９；Ｌ１４２５Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８０４は、クローン＃５９３１４（配列番号１１５６；Ｌ１４２６Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８０５は、クローン＃５９２９８（配列番号９２１；Ｌ１４２７Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８０６は、配列番号１７９１によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８０７は、配列番号１７９２によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８０８は、配列番号１７９３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８０９は、配列番号１７９４によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８１０は、配列番号１７９５によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８１１は、配列番号１７９６によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８１２は、配列番号１７９７によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８１３は、配列番号１７９８によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８１４は、配列番号１７９９によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８１５は、配列番号１８００によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８１６は、配列番号１５２７（Ｌ９８７Ｐ）によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８１７は、配列番号１８２３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８１８は、配列番号１８０１によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８１９は、配列番号１８０２によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８２０は、配列番号１８０３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８２１は、配列番号１８０４によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８２２は、配列番号１８０５によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８２３は、クローン＃５０５６０（配列番号１５２７；Ｌ９８７Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８２４は、クローンＬ８７２Ｐ（配列番号３４）についての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８２５は、配列番号１８２４によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８２６は、Ｌ５５２ＳのＮ末端部分をコードするｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８２７〜１８２９は、Ｌ５５２Ｓの部分のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８３０は、Ｌ５５２ＳのＮ末端部分である。
配列番号１８３１〜１８３３は、それぞれ、配列番号１８２７〜１８２９によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８３４〜１８５６は、Ｌ５４８Ｓのペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１８５７〜１８６０は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号１８６１は、Ｐ８０１ＰのＲａ１２とＯＲＦ４との融合物について決定されたＤＮＡ配列である。
配列番号１８６２は、Ｐ８０１ＰのＲａ１２とＯＲＦ５との融合物について決定されたＤＮＡ配列である。
配列番号１８６３は、Ｐ８０１ＰのＲａ１２とＯＲＦ４との融合物のアミノ酸配列である。
配列番号１８６４は、Ｐ８０１ＰのＲａ１２とＯＲＦ５との融合物のアミノ酸配列である。
配列番号１８６５は、クローンＬ９８４Ｐ＿（５７３Ａ）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８６６は、クローンＬ９８４Ｐ＿（５１２Ａ）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８６７は、クローンＬ９８４Ｐ＿（ＮＣＩ−Ｈ１２８）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８６８は、クローンＬ９８４Ｐ＿（ＤＭＳ−７９）について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８６９は、配列番号１８６５によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８７０は、配列番号１８６６によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８７１は、配列番号１８６７によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８７２は、配列番号１８６８によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１８７３は、クローンＬ９８５Ｐ（配列番号１４６７において与えられる部分配列）についての全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８７４は、配列番号１８７３によってコードされるＬ９８５Ｐについてのアミノ酸配列である。
配列番号１８７５は、Ｒａ１２とＬ９８５Ｐとの融合物の推定および決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８７６は、Ｒａ１２と配列番号１８７５によってコードされるＬ９８５Ｐとの融合物の推定アミノ酸配列である。
配列番号１８７７は、Ｒａ１２ＳとＬ９８５Ｐとの融合物の推定ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８７８は、Ｒａ１２Ｓと配列番号１８７７によってコードされるＬ９８５Ｐとの融合物の推定アミノ酸配列である。
配列番号１８７９は、Ｒａ１２ＳとＬ９８５ＰＥｘとの融合物の推定ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８８０は、Ｒａ１２Ｓと配列番号１８７９によってコードされるＬ９８５ＰＥｘとの融合物の推定アミノ酸配列である。
配列番号１８８１は、Ｌ９８５Ｐの細胞外ループ２ペプチドについての推定ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８８２は、配列番号１８７５によってコードされるＬ９８５Ｐの細胞外ループ２ペプチドについての推定アミノ酸配列である。
配列番号１８８３は、クローン＃５９３１６（配列番号１１８０；Ｌ１４２８Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８８４は、配列番号１８８３によってコードされ、そしてＬ１４２８Ｐ−ＯＲＦ１と命名された第１の推定アミノ酸配列である。
配列番号１８８５は、配列番号１８８３によってコードされ、そしてＬ１４２８Ｐ−ＯＲＦ２と命名された第２の推定アミノ酸配列である。
配列番号１８８６は、配列番号１８８３によってコードされ、そしてＬ１４２８Ｐ−ＯＲＦ３と命名された第３の推定アミノ酸配列である。
配列番号１８８７は、配列番号１８８３によってコードされ、そしてＬ１４２８Ｐ−ＯＲＦ４と命名された第４の推定アミノ酸配列である。
配列番号１８８８は、配列番号１８８３によってコードされ、そしてＬ１４２８Ｐ−ＯＲＦ５と命名された第５の推定アミノ酸配列である。
配列番号１８８９は、配列番号１８８３によってコードされ、そしてＬ１４２８Ｐ−ＯＲＦ６と命名された第６の推定アミノ酸配列である。
配列番号１８９０は、配列番号１８８３によってコードされ、そしてＬ１４２８Ｐ−ＯＲＦ７と命名された第７の推定アミノ酸配列である。
配列番号１８９１〜１９００は、表１７に記載のデータベースヒットについてのヌクレオチド配列である。
配列番号１９０１〜１９０９は、表１７に記載のヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号１９１０は、クローンＬ１４３７Ｐ（配列番号１８９６において与えられる部分配列）についての全長ｃＤＮＡである。
配列番号１９１１は、クローンＬ５４８Ｓのコード領域についての順方向プライマーＰＤＭ−４３３である。
配列番号１９１２は、クローンＬ５４８Ｓのコード領域についての逆方向プライマーＰＤＭ−４３８である。
配列番号１９１３は、発現された組換えＬ５４８Ｓについてのアミノ酸配列である。
配列番号１９１４は、組換えＬ５４８ＳについてのＤＮＡコード配列である。
配列番号１９１５は、クローンＬ５５１Ｓのコード領域についての順方向プライマーＰＤＭ−４９８である。
配列番号１９１６は、クローンＬ５５１Ｓのコード領域についての逆方向プライマーＰＤＭ−４９９である。
配列番号１９１７は、発現された組換えＬ５５１Ｓについてのアミノ酸配列である。
配列番号１９１８は、組換えＬ５５１ＳについてのＤＮＡコード配列である。
配列番号１９１９は、クローンＬ５５２Ｓのコード領域についての順方向プライマーＰＤＭ−４７９である。
配列番号１９２０は、クローンＬ５５２Ｓのコード領域についての逆方向プライマーＰＤＭ−４８０である。
配列番号１９２１は、発現された組換えＬ５５２Ｓについてのアミノ酸配列である。
配列番号１９２２は、組換えＬ５５２ＳについてのＤＮＡコード配列である。
配列番号１９２３は、クローン＃１９０６９（配列番号９０において与えられる部分配列）についての推定全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９２４は、クローン＃１８９６５または＃１９００２（配列番号１５において与えられる部分配列）についての推定全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９２５は、配列番号１９２３によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号１９２６は、配列番号１９２４によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号１９２７は、第１のＬ５５２Ｓエピトープの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９２８は、第２のＬ５５２Ｓエピトープの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９２９は、第３のＬ５５２Ｓエピトープの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９３０は、Ｌ９８５Ｐペプチド＃３４８２についてのアミノ酸配列である。
配列番号１９３１は、クローン＃６１１４４（配列番号１７６１，Ｌ１４３９Ｐ）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９３２は、配列番号１９３１によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号１９３３は、ＮＵＦ２Ｒ遺伝子の全長ｃＤＮＡであり、これに対して配列番号１９３１はある程度の配列類似性を示す。
配列番号１９３４は、配列番号１９３３によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号１９３５は、クローンＬ５５２Ｓのコード領域についての順方向プライマーＰＤＭ−７３７である。
配列番号１９３６は、クローンＬ５５２Ｓのコード領域についての逆方向プライマーＰＤＭ−７３８である。
配列番号１９３７は、発現された組換えＬ５５２Ｓについてのアミノ酸配列である。
配列番号１９３８は、組換えＬ５５２ＳについてのＤＮＡコード配列である。
配列番号１９３９は、クローンＬ５５２Ｓのコード領域についての別の順方向プライマーＰＤＭ−７３６である。
配列番号１９４０は、発現された第２の組換えＬ５５２Ｓについてのアミノ酸配列である。
配列番号１９４１は、第２の組換えＬ５５２ＳについてのＤＮＡコード配列である。
配列番号１９４２は、第４のＬ５５２Ｓエピトープの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９４３は、第１のＸＡＧＥ−１エピトープの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９４４は、第２のＸＡＧＥ−１エピトープの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９４５は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基１〜２０に対応する第１の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９４６は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基６〜２５に対応する第２の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９４７は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基１１〜３０に対応する第３の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９４８は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基１６〜３５に対応する第４の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９４９は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基２１〜４０に対応する第５の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９５０は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基２６〜４５に対応する第６の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９５１は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基３１〜５０に対応する第７の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９５２は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基３６〜５５に対応する第８の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９５３は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基４１〜６０に対応する第９の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９５４は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基４６〜６５に対応する第１０の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９５５は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基５１〜７０に対応する第１１の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９５５は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基５６〜７５に対応する第１２の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９５６は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基６１〜８０に対応する第１３の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９５７は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基６６〜８５に対応する第１４の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９５８は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基７１〜９０に対応する第１５の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９５９は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基７６〜９５に対応する第１６の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９６１は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基８１〜１００に対応する第１７の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９６２は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基８６〜１０５に対応する第１８の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９６３は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基９１〜１１０に対応する第１９の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９６４は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基９６〜１１５に対応する第２０の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９６５は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基１０１〜１２０に対応する第２１の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９６６は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基１０６〜１２５に対応する第２２の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９６７は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基１１１〜１３０に対応する第２３の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９６８は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基１１６〜１３５に対応する第２４の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９６９は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基１２１〜１４０に対応する第２５の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９７０は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基１２６〜１４５に対応する第２６の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９７１は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基１３１〜１５０に対応する第２７の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９７２は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基１３６〜１５５に対応する第２８の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９７３は、全長Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基１４１〜１６０に対応する第２９の２０マーペプチドの決定されたアミノ酸配列である。
配列番号１９７４は、配列番号１９４５の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９７５は、配列番号１９４６の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９７６は、配列番号１９４７の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９７７は、配列番号１９４８の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９７８は、配列番号１９４９の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９７９は、配列番号１９５０の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９８０は、配列番号１９５１の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９８１は、配列番号１９５２の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９８２は、配列番号１９５３の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９８３は、配列番号１９５４の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９８４は、配列番号１９５５の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９８５は、配列番号１９５６の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９８６は、配列番号１９５７の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９８７は、配列番号１９５８の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９８８は、配列番号１９５９の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９８９は、配列番号１９６０の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９９０は、配列番号１９６１の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９９１は、配列番号１９６２の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９９２は、配列番号１９６３の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９９３は、配列番号１９６４の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９９４は、配列番号１９６５の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９９５は、配列番号１９６６の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９９６は、配列番号１９６７の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９９７は、配列番号１９６８の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９９８は、配列番号１９６９の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号１９９９は、配列番号１９７０の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号２０００は、配列番号１９７１の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号２００１は、配列番号１９７２の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
配列番号２００２は、配列番号１９７３の２０マーをコードするＤＮＡ配列である。
【００４９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般に、癌（特に、肺癌）の治療および診断における、組成物、ならびにその使用に関する。以下でさらに記載するように、本発明の例示的な組成物としては、以下を含むがこれらに限定されない：ポリペプチド、特に免疫原性ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗体および他の結合因子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）ならびに免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）。
【００５０】
本発明の実施は、特にそれと逆であることを示さない限り、当業者の範囲であるウイルス学、免疫学、細菌学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法（これらの多くは、例示目的で以下に記載される）を使用する。このような技術は、文献によって完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【００５１】
本明細書中で引用される、全ての刊行物、特許および特許出願は、上記または下記にかかわらず、全体が参考して本明細書によって援用される。
【００５２】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形、「１つの（ａ、ａｎ）」、および「この、その（ｔｈｅ）」は、文脈によって明らかに他の方法で示されていない限り、複数の言及を含む。
【００５３】
（ポリペプチド組成物）
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、その従来の意味、すなわちアミノ酸の配列として使用される。これらのポリペプチドは、特定の長さの生成物に限定されず；従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、このポリペプチドの定義に含まれ、そしてこのような用語は、別段示さない限り、本明細書中で交換可能に使用され得る。この用語はまた、このポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）ならびに天然および非天然の両方の、当該分野で公知の他の改変を称さないか、これらを除外する。ポリペプチドは、タンパク質全体でもあり、または部分配列でもあり得る。本発明の状況において特定の目的のポリペプチドは、エピトープ、すなわち、ポリペプチドの免疫原特性の実質的に原因となり、かつ免疫応答を誘起し得る抗原決定基を含むアミノ酸部分配列である。
【００５４】
本発明の特に例示的なポリペプチドとしては、配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２のいずれか１つに示されたポリヌクレオチド配列、あるいは中度のストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズする配列によってコードされるポリペプチドを含む。特定の他の例示的な本発明のポリペプチドとしては、配列番号３２４〜３４０、７８６、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７〜７９９、８０５、８０６、８０９、８２７、１６６７、１６７０〜１６７５、１６７７〜１６７９、１８０６〜１８２２、１８２５、１８３０〜１８３３、１８３４〜１８５６、１８６３、１８６４、１８６９〜１８７２、１８７４、１８７６、１８７８、１８８０、１８８２、１８８４〜１８９０、１９０１〜１９０９、１９１３、１９１７、１９２１、１９２５〜１９３０、１９３２、１９３４、１９３７、１９４０および１９４２〜１９７３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列が挙げられる。
【００５５】
本発明のポリペプチドは、これらの同定が肺腫瘍サンプルにおけるこれらの発現の増大したレベルに少なくとも部分的に基づくことの現れとして、本明細書中で時々、肺腫瘍タンパク質または肺腫瘍ポリペプチドとして参照される。従って、「肺腫瘍ポリペプチド」または「肺腫瘍タンパク質」は、一般に本発明のポリペプチド配列、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を示し、これらは、例えば、本明細書中で提供された代表的なアッセイを使用して決定されるように、正常組織での発現レベルより、少なくとも２倍高いレベル、および好ましくは５倍高いレベルで、試験された肺腫瘍サンプルの、好ましくは約２０％を超える、より好ましくは約３０％を超える、そして最も好ましくは約５０％以上を超える、肺腫瘍サンプルの実質的な部分において発現される。本発明の肺腫瘍ポリペプチド配列は、その腫瘍細胞での増大した発現レベルに基づき、以下にさらに記載されるように、診断マーカーならびに治療標的の両方として特定の有用性を有する。
【００５６】
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは免疫原性であり、すなわちこれらは、肺癌を有する患者からの抗血清および／またはＴ細胞を用いる免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＴ細胞刺激アッセイ）で検出可能に反応する。免疫原性活性についてのスクリーニングは、当業者に周知の技術を使用して実施され得る。例えば、このようなスクリーニングは、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載されるスクリーニングのような方法を使用して実施され得る。１つの例示的な例において、ポリペプチドは固体支持体に固定され得、そして患者の血清と接触され得、血清中の抗体の固定されたポリペプチドへの結合を可能にする。次いで、非結合血清は除去され、そして結合した抗体は、例えば、１２５Ｉ標識プロテインＡを用いて検出され得る。
【００５７】
当業者に認識されるように、本明細書中で開示されるポリペプチドの免疫原性部分もまた、本発明により包含される。本明細書中で用いられる場合、「免疫原性部分」は、それ自体が、本発明の免疫原性ポリペプチドを認識するＢ細胞および／またはＴ細胞表面抗原レセプターと免疫学的に反応性である（すなわち、特異的に結合する）、本発明の免疫原性ポリペプチドのフラグメントである。免疫原性部分は、一般に、周知の技術（例えば、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版、２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびこの文献で引用される参考文献に要約されている技術）を用いて同定され得る。このような技術は、抗原特異的抗体、抗血清、および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力について、ポリペプチドをスクリーニングすることを包含する。本明細書中で用いられる場合、抗血清および抗体は、これらが、抗原に特異的に結合する（すなわち、これらが、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてこのタンパク質と反応し、そして無関係のタンパク質とは検出可能に反応しない）場合に、「抗原特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書中に記載されるように、そして周知技術を用いて、調製され得る。
【００５８】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの免疫原性部分は、（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に低くないレベルで、抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。好ましくは、免疫原性部分の免疫原性活性のレベルは、全長ポリペプチドの免疫原性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは９０％より高い。いくつかの例において、対応する全長ポリペプチドよりも大きい免疫原性活性のレベルを有する（例えば、約１００％または１５０％もしくはそれより大きい免疫原性活性を有する）好ましい免疫原性部分が同定される。
【００５９】
特定の他の実施形態において、例示的な免疫原性部分は、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインが欠失されたペプチドを含み得る。他の例示的な免疫原性部分は、成熟タンパク質に対して小さなＮ末端および／またはＣ末端の欠失（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）を含む。
【００６０】
別の実施形態において、本発明のポリペプチド組成物また、Ｔ細胞および／または本発明のポリペプチド（特に、本明細書中に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそれらの免疫原性フラグメントもしくは改変体）に対して生成された抗体と免疫学的に反応性である１つ以上のポリペプチドを含み得る。
【００６１】
本発明の別の実施形態において、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドと免疫学的に反応性であるＴ細胞および／もしくは抗体を惹起し得る１つ以上のポリペプチド、または本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に含まれる連続した核酸配列によってコードされる１つ以上のポリペプチド、またはそれらの免疫学的フラグメントもしくは改変体、あるいは中程度〜高度なストリンジェンシーの条件下でこれらの配列の１つ以上ににハイブリダイズする１つ以上に核酸配列、を含むポリペプチドが提供される。
【００６２】
別の局面において、本発明は、本明細書中に示されるポリペプチド組成物（例えば、配列番号３２４〜３４０、７８６、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７〜７９９、８０５、８０６、８０９、８２７、１６６７、１６７０〜１６７５、１６７７〜１６７９、１８０６〜１８２２、１８２５、１８３０〜１８３３、１８３４〜１８５６、１８６３、１８６４、１８６９〜１８７２、１８７４、１８７６、１８７８、１８８０、１８８２、１８８４〜１８９０、１９０１〜１９０９、１９１３、１９１７、１９２１、１９２５〜１９３０、１９３２、１９３４、１９３７、１９４０および１９４２〜１９７３に示されるポリペプチド、または配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２の配列に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド）の少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、または１００連続するアミノ酸またはそれ以上（全ての中間の長さを含む）を含むポリペプチドフラグメントを提供する。
【００６３】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド組成物の改変体を提供する。一般的に本発明により包含されるポリペプチド改変体は、代表的に、本明細書中に示されるポリペプチド配列に対して、その長さに沿って、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％またはそれ以上の同一性（以下に記載するように決定された）を示す。
【００６４】
１つの好ましい実施形態において、本発明により提供されるポリペプチドフラグメントおよび改変体は、本明細書中に詳細に示される全長ポリペプチドと反応する抗体および／またはＴ細胞と免疫学的に反応性である。
【００６５】
別の好ましい実施形態において、本発明により提供されるポリペプチドフラグメントおよび改変体は、本明細書中に詳細に示される全長ポリペプチド配列により示される免疫原性活性のレベルの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％またはそれ以上の免疫原性活性のレベルを示す。
【００６６】
ポリペプチド「改変体」は、本明細書中でこの用語が使用される場合、代表的に、本明細書中で詳細に開示されるポリペプチドと１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入において異なるポリペプチドである。このような改変体は、天然に生じるか、または例えば、本発明の１つ以上の上記のポリペプチド配列を改変し、そして本明細書中に記載されるようなそれらの免疫学的活性を評価することにより、ならびに／または当該分野で周知の多くの技術のいずれかを用いて、合成的に作製され得る。
【００６７】
例えば、本発明のポリペプチドの特定の例示的な改変体として、１つ以上の部分（例えば、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン）が除去された改変体が挙げられる。他の例示的な改変体として、小さな部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から除去された改変体が挙げられる。
【００６８】
多くの例において、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換され、その結果、ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造および疎水的性質が実質的に変化していないことを期待するような置換である。上記のように、改変は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造においてなされ得、そしてなお所望の特性（例えば、免疫原性特性）を有する改変体ポリペプチドまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を獲得し得る。本発明のポリペプチドの等価物を（または本発明のポリペプチドの改善された免疫原性の改変体もしくは部分さえも）作製するようポリペプチドのアミノ酸配列が変更されることが所望される場合、当業者は、代表的に、表１０に基づくコードＤＮＡ配列の１つ以上のコドンを変更する。
【００６９】
例えば、特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上のの結合部位のような構造を有するタンパク質構造中の他のアミノ酸に、感知可能な相互作用的結合能の損失なしで、置換され得る。タンパク質の相互作用的な能力および性質がタンパク質の生物学的機能的活性を規定するので、特定のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列、および当然ながら、その根底にあるＤＮＡコード配列においてなされ得、そしてそれにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質が入手される。従って、種々の変化が、ペプチドの生物学的有用性または活性の感知可能な損失を伴わずに、開示された組成物のペプチド配列またはそのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列においてなされ得ることが意図される。
【００７０】
【表１６】
Figure 2004512824
このような変化を作製する際に、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般的に当該分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、本明細書中に参考として援用される）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性的性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これが次に、他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とのそのタンパク質の相互作用を規定することが受け入れられている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００７１】
特定のアミノ酸が類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そしてなお類似の生物学的活性を有するタンパク質を生じる（すなわち、生物学的に機能的に等価なタンパク質をなお入手する）ことが、当該分野において公知である。このような変化を作製する際に、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその疎水性親水性指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中に参考として詳細に援用される）は、そのタンパク質の最大局所的平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるので、そのタンパク質の生物学的特性と相関することを言及している。
【００７２】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性の値を有する別のアミノ酸に置換され得、そしてなお、生物学的な等価物（特に、免疫学的に等価なタンパク質）を得ることが理解される。このような変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。
【００７３】
上記で概説したように、従って、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさ、など）に基づく。前述の種々の特徴を考慮する典型的な置換は当業者に周知であり、そして以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【００７４】
さらに、任意のポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を増加させるためにさらに改変され得る。可能性のある改変として以下が挙げられるがこれらに限定されない：５’末端および／または３’末端での隣接配列の付加；骨格におけるホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；ならびに／あるいは従来とは異なる塩基（例えば、イノシン、キューオシン、およびワイブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および他の修飾形態）の含有。
【００７５】
アミノ酸置換はさらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性特性の類似性に基づいて作製され得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニン；そして類似の親水性値を有する非荷電性の極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン（スレオニン）、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他のグループとしては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変体はまた、またはあるいは、非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、５アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸の置換、欠失または付加によって、ネイティブの配列とは異なる。改変体はまた（またはあるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性特性に対する最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【００７６】
上記のように、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時に、または翻訳後に、そのタンパク質の転移を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするために、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列または他の配列（例えば、ポリＨｉｓ）に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
【００７７】
ポリペプチド配列が比較される場合、以下に記載されるように最大の一致で整列するときに２つの配列中のアミノ酸の配列が同じである場合、２つの配列は、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、代表的には、比較ウインドウによって配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行われる。本明細書中で使用される「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続する位置のセグメントをいう。ここで、配列は、２つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る。
【００７８】
比較のための配列の最適な整列は、生命情報科学ソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスート（ｓｕｉｔｅ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメータを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ　第５巻，補遺３，３４５〜３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｄｉｓｔａｎｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ　Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ　６２６〜６４５頁　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　第１８３巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ　５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ　Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ　４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ　１１：１０５；Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：７２６−７３０。
【００７９】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ　２：４８２の部分的同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【００８０】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを使用して使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公に利用可能である。アミノ酸配列について、スコアリングマトリクスは、累積スコアを算出するために使用され得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアリングの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。
【００８１】
好ましい１つのアプローチにおいて、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０位置の比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリペプチド配列の部分は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一のアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【００８２】
他の例示的実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび関連しない配列（例えば、公知の腫瘍タンパク質）を含む融合ポリペプチドであり得る。例えば、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供する際に補助し得るか（免疫学的融合パートナー）、またはネイティブの組換えタンパク質より高い収量でタンパク質を発現する際に補助し得る（発現エンハンサー）。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、ポリペプチドの溶解性を増加するように、またはポリペプチドが所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーとしては、親和性タグ（これは、ポリペプチドの精製を容易にする）が挙げられる。
【００８３】
融合ポリペプチドは、一般に、標準的な技術（化学的結合体化を含む）を使用して調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、発現系において、組換えポリペプチドとして発現され、非融合ポリペプチドと比較して、増加したレベルの産生を可能にする。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を、別々に組立て得、そして適切な発現ベクターに連結し得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、これらの配列のリーディングフレームが同位相にあるように連結される。このことによって、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポリペプチドへの翻訳が可能になる。
【００８４】
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド成分を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合ポリペプチド中に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）伸長した可変（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）コンホメーションを取る能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を取ることができないこと；ならびに（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の無いこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ　４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列が挙げられる。リンカー配列は、一般的に１から約５０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされない。
【００８５】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終結シグナルを終了するために必要とされる終止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【００８６】
融合ポリペプチドは、関連しない免疫原性タンパク質（例えば、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る免疫原性タンパク質）と共に、本明細書中に記載されるようなポリペプチドを含み得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を参照のこと）。
【００８７】
１つの好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲａ１２フラグメントのようにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．由来である。Ｒａ１２組成物、ならびに異種ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性を増強する際にＲａ１２を使用するための方法は、米国特許出願６０／１５８，５８５（この開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載されている。簡単には、Ｒａ１２は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＭＴＢ３２Ａ核酸のサブ配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの毒性菌株および無毒性菌株の遺伝子によってコードされる分子量３２ＫＤのセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、記載されている（例えば、米国特許出願６０／１５８，５８５；また、Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８〜４００７も参照のこと。これらは、本明細書中で参考として援用される）。驚いたことに、ＭＴＢ３２Ａコード配列の１４ＫＤのＣ末端フラグメントが、それぞれの上で高いレベルで発現し、精製プロセス全体にわたって可溶性ポリペプチドとして残存することが発見された。さらに、このフラグメントは、これが融合される異種抗原性ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。この１４ＫＤのＣ末端フラグメントは、本明細書中ではＲａ１２といわれ、そしてＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３のいくつかまたは全てを含むフラグメントを表す。
【００８８】
他の好ましいＲａ１２ポリヌクレオチドは、一般的に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部をコードする少なくとも約１５個の連続するヌクレオチド、少なくとも約３０個のヌクレオチド、少なくとも６０個のヌクレオチド、少なくとも約１００個のヌクレオチド、少なくとも約２００個のヌクレオチド、または少なくとも約３００個のヌクレオチドを含む。
【００８９】
Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブな配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードする内因性配列）を含んでもよいし、このような配列の改変体を含んでもよい。Ｒａ１２ポリヌクレオチド改変体は、１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得、その結果、コードされた融合ポリペプチドの生物学的活性が、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して、実質的に減少していない。好ましくは、改変体は、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
【００９０】
好ましい他の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性の細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｂの表面タンパク質である、プロテインＤ（ＷＯ　９１／１８９２６）に由来する。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、このタンパク質のほぼ３分の１（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基は、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するように、そしてＥ．ｃｏｌｉ中の発現レベルを増加するように、Ｎ末端に含まれる（従って、発現エンハンサーとして機能する）。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造的タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）を含む。代表的に、Ｎ末端の８１アミノ酸が用いられるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが使用され得る。
【００９１】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその部分（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ　４３：２６５〜２９２，１９８６）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）に対する親和性を担う。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ　Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために利用されてきた。アミノ末端でＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：７９５〜７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合ポリペプチドに組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
【００９２】
なお別の例示的な実施形態は、融合ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドを含み、ここでこの融合パートナーは、米国特許第５，６３３，２３４号に記載のようにポリペプチドをエンドソーム／リソソームコンパートメントへ指向させ得る標的シグナルを含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、この標的シグナルと融合する場合、より効率的にＭＨＣクラスＩＩ分子と結合し、これによってこのポリペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボでの増強された刺激が提供される。
【００９３】
本発明のポリペプチドは、周知の種々の合成技術および／または組換え技術のいずれかを使用して調製される。これらの技術の後者を以下でさらに記載する。一般的に約１５０アミノ酸よりも少ないポリペプチド、部分および他の改変体は、当業者に周知の技術を使用して、合成手段により作製され得る。例示的な１つの例において、このようなポリペプチドは、市販の固相技術のいずれか（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成方法）を使用して合成され、ここでアミノ酸は、成長しているアミノ酸鎖に連続的に付加される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６、１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動化された合成のための機器が、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などの供給業者から市販されており、そして製造者の指示に従って操作され得る。
【００９４】
一般に、本発明のポリペプチド組成物（融合ポリペプチドを含む）が単離される。「単離された」ポリペプチドは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドは、それが天然の系中で共存する物質のいくつかまたは全てから分離されている場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドはまた、精製され、例えば、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。
【００９５】
（ポリヌクレオチド組成物）
他の局面において、本発明は、ポリヌクレオチド組成物を提供する。用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で実質的に交換可能に使用され、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まない単離されたＤＮＡ分子をいう。本明細書中で使用される場合、「単離された」は、ポリヌクレオチドが、他のコード配列から実質的に分離されており、そしてＤＮＡ分子が、無関係のコードＤＮＡの大部分（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはポリペプチドコード領域）を含まないことを意味する。当然のことながら、これは、もともと単離されたＤＮＡ分子をいい、後で人工的にセグメントに付加された遺伝子またはコード領域を除外しない。
【００９６】
当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチド組成物は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現し得るように適応されたゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドにコードされる配列、ならびにより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、自然に単離され得るか、または人の手によって合成的に改変され得る。
【００９７】
当業者に認識されるように、本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子（これはイントロンを含み、そしてＤＮＡ分子に１対１の様式で対応する）、およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）を含み得る。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るがその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結され得るがその必要はない。
【００９８】
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、本発明のポリペプチド／タンパク質、またはその部分をコードする内因性配列）を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体または誘導体、そして好ましくは免疫原性改変体または誘導体をコードする配列を含み得る。
【００９９】
従って、本発明の別の局面に従い、配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列、配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の相補体、ならびに配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の縮重改変体のうちいくつかまたは全てを含むポリヌクレオチド組成物が提供される。特定の好ましい実施形態において、本明細書中に示されるポリヌクレオチド配列は、上記のような免疫原性ポリペプチドをコードする。
【０１００】
他の関連する実施形態において、本発明は、本明細書中で配列番号１〜５７、５９〜３２３、３４１〜７８２、７８４〜７８５、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、８００〜８０４、８０７、８０８、８１０〜８２６、８２８〜１６６４、１６６８、１６６９、１６７６、１６８０〜１８０５、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５、１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１８９１〜１９００、１９１０、１９１４、１９１８、１９２２〜１９２４、１９３１、１９３３、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２に開示される配列に実質的な同一性を有するポリヌクレオチド改変体を提供する。例えば、これらは、本明細書中で記載の方法（例えば、以下に記載のような標準的なパラメーターを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して本発明のポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より高い配列同一性を含む。当業者は、これらの値が、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置付けなどを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するように、適切に調整され得ることを理解する。
【０１０１】
代表的には、ポリヌクレオチド改変体は、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み、好ましくは、その結果、改変体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの免疫原性は、本明細書中に具体的に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対して実質的に減少されない。用語「改変体」はまた、異種起源の相同遺伝子を包含することが理解されるべきである。
【０１０２】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書中に開示される配列の１つ以上に同一であるかまたは相補的な配列の種々の長さの連続したストレッチを含むポリヌクレオチドフラグメントを提供する。例えば、本明細書中に開示される配列の１つ以上の、少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００以上連続したヌクレオチド、ならびにその間の全ての中間の長さの連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。この状況において、「中間の長さ」とは、示された値の間の任意の長さ（例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００〜５００；５００〜１，０００などの間の全ての整数を含む）を意味することが容易に理解される。
【０１０３】
本発明の別の実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントまたはその相補的な配列に対して、中程度〜高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド組成物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の当該分野において周知である。例示の目的であるが、他のポリヌクレオチドと本発明のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中の事前洗浄；５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣでの、一晩のハイブリダイゼーション；続いて、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた、６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションが実施される温度を変更することによって、容易に操作され得ることを理解する。例えば、別の実施形態において、適切な高いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件としては、ハイブリダイゼーションの温度が、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃に増大される点を除いて、上記の条件が挙げられる。
【０１０４】
特定の好ましい実施形態において、上記のポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド改変体、フラグメント、およびハイブリダイズする配列）は、本明細書中に具体的に示されるポリペプチド配列と免疫学的に交差反応するポリペプチドをコードする。他の好ましい実施形態において、このようなポリヌクレオチドは、本明細書中に具体的に示されるポリペプチド配列の免疫原性活性の、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の免疫原性活性レベルを有するポリペプチドをコードする。
【０１０５】
本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、そのコード配列自体の長さに関わらず、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組合わされ得、その結果、その全体の長さは、相当変化し得る。従って、ほとんどいずれの長さの核酸フラグメントをも使用し得ることが意図され、その全長は、好ましくは意図した組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対長など（全ての中間の長さを含む）の全長を有する例示的なポリヌクレオチドセグメントが、本発明の多くの実行において有用であることが意図される。
【０１０６】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、２つの配列におけるヌクレオチドの配列が、以下に記載されるように最大一致について整列されるのと同じ場合に、２つの配列が「同一」であるといわれる。２つの配列の間の比較は、代表的には、配列類似性の局部領域を同定および比較するために、比較ウインドウにわたって配列を比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０連続した位置のセグメントをいい、ここで、２つの配列が最適に整列された後に、配列は、連続した位置の同じ数の参照配列と比較され得る。
【０１０７】
比較のための配列の最適な整列は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）ソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ　ｓｕｉｔｅにおけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメーターを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ　Ｖｏｌ．５，補遺３，３４５−３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｄｉｓｔａｎｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ　Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ　６２６−６４５頁　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ　５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ　Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ　４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ　１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：７２６−７３０。
【０１０８】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ　２：４８２の局部同定アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【０１０９】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを用いて使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公に利用可能である。１つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基の対についての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ　ｓｃｏｒｅｄ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出され得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長さ（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１５を参照のこと）アラインメント、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【０１１０】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【０１１１】
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの用法における差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に意図される。さらに、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化する内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、有する必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
【０１１２】
従って、本発明の別の実施形態において、変異誘発アプローチ（例えば、部位特異的変異誘発）は、本明細書中に記載のポリペプチドの免疫原性改変体および／または誘導体の調製のために使用される。このアプローチによって、ポリペプチド配列における特定の改変が、これらをコードする、基礎となるポリヌクレオチドの変異誘発を介してなされ得る。これらの技術は、例えば、ポリヌクレオチド中に１つ以上のヌクレオチド配列変化を導入することによって先の考慮の１つ以上を組み込む、配列改変体を調製および試験するための直接的なアプローチを提供する。
【０１１３】
部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介して変異体の生成を可能にし、相対する欠失連結部の両側に安定な二重鎖を形成するために、十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を提供する。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、減少させるか、改変するか、さもなくば変化させるため、そして／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性または一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
【０１１４】
本発明の特定の実施形態において、本発明者らは、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、ポリペプチドワクチンの免疫原性）を変更するために、開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発を意図する。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野に周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を作製するために広範に使用される。例えば、部位特異的変異誘発は、しばしば、ＤＮＡ分子の特定部分を変更するために使用される。このような実施形態において、代表的に約１４ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長程度の長さを含むプライマーが使用され、配列の連結部の両側にある、約５残基〜約１０残基が変更される。
【０１１５】
当業者によって理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、しばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用してきた。部位特異的変異誘発において有用である代表的なベクターとしては、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は、一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージに転移する工程を除去する部位特異的変異誘発において慣用的に使用される。
【０１１６】
一般的に、本明細書に従う部位特異的変異誘発は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む一本鎖ベクターを最初に入手する工程、またはこの配列を含む二本鎖ベクターの２本の鎖を融解して分ける工程によって実行される。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に、合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖ベクターとともにアニーリングされ、そして変異を保有する鎖の合成を完了するために、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）に供される。このようにヘテロ二重鎖が形成され、ここで一方の鎖が変異を有さないもともとの配列をコードし、そして２つめの鎖は所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用され、そして、変異した配列配置を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【０１１７】
部位特異的変異誘発を使用する、選択されたペプチドコードＤＮＡセグメントの配列改変体の調製は、潜在的に有用な種を産生する手段を提供し、そしてこれは、限定を意味するものではない。なぜなら、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列を入手し得る他の方法が存在するからである。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、変異誘発剤（例えば、ヒドロキシルアミン）で処理されて、配列改変体を入手し得る。これらの方法およびプロトコルに関する具体的な詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ、１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２（各々がその目的のために本明細書中に参考として援用される）の教示において見出される。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」とは、テンプレート（鋳型）依存的プロセスおよびベクター媒介性増殖をいい、これは、その初期の濃度と比較して、特定の核酸分子の濃度の増加を生じるか、または検出可能なシグナルの濃度の増加（例えば、増幅）を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を含むプロセスをいうことが意図される。用語、鋳型依存的プロセスとは、新規に合成された核酸の鎖の配列が、相補的塩基対形成の周知の規則によって指示されるＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成をいう（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７を参照のこと）。代表的には、ベクター媒介性の方法論は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン性増幅、および増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。このような方法論の例は、その全体が具体的に参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，２３７，２２４号によって提供される。
【０１１９】
本発明のポリペプチド改変体の生成のための別のアプローチにおいて、米国特許第５，８３７，４５８号に記載のような、再帰的な配列組換えが使用され得る。このアプローチにおいて、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反復性のサイクルが実施されて、例えば、増強された免疫原性活性を有する本発明の個々のポリヌクレオチド改変体を「展開させる」。
【０１２０】
本発明の他の実施形態において、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、有利に使用され得る。このように、本明細書中に開示される１５ヌクレオチド長の連続配列と同じ配列か、またはこれに相補的な配列を有する、少なくとも約１５ヌクレオチド長の連続配列の配列領域を含む核酸セグメントが特定の有用性を見出すことが、意図される。例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（全ての中間的な長さのものを含む）およびまさに全長配列までの、より長い連続した同一配列または相補的な配列がまた、特定の実施形態において使用される。
【０１２１】
このような核酸プローブが目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力は、所定のサンプル中の相補的配列の存在を検出する際にこれらが使用されることを可能にする。しかし、他の用途（例えば、変異種プライマーまたは他の遺伝的構築物の調製の際の使用のためのプライマーを調製するための配列情報の使用）もまた意図される。
【０１２２】
１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、または１００〜２００ヌクレオチド程度（同様に中間的な長さを含む）の連続したヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有し、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に同一または相補的なポリヌクレオチド分子は、例えばサザンブロッティングまたはノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。これによって、遺伝子産物またはそのフラグメントの、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方における分析が可能となる。フラグメントの全サイズ、ならびに相補的ストレッチのサイズは、究極的には、特定の核酸セグメントの意図される用途または適用に依存する。より小さなフラグメントは、一般にハイブリダイゼーション実施形態における用途を見出し、ここで連続した相補領域の長さが変化され得る（例えば、約１５ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間）が、検出を望む相補配列の長さに従って、より長い連続した相補ストレッチが使用され得る。
【０１２３】
約１５〜２５ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定かつ選択的な二重鎖分子の形成を可能にする。しかし、１５塩基長より長いストレッチの連続した相補配列を有する分子が、ハイブリッドの安定性および選択性を増加するために一般に好ましく、それによって、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善される。１５〜２５の連続したヌクレオチド、または望まれる場合にはより長い遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計するのが一般には好ましい。
【０１２４】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に開示される配列のいずれかの、任意の部分から選択され得る。必要とされることの全ては、本明細書中に記載の配列、あるいはプローブまたはプライマーとしての利用を望む場合は、約１５〜２５ヌクレオチド長から全長配列まで、および全長配列を含む配列の任意の連続した部分までを再検討することである。プローブおよびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配され得る。例えば、全配列の末端に向かってプライマーを使用することが望まれ得る。
【０１２５】
小さなポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、通常は自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して行われるので、例えば化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲＴＭ技術）の適用によって、組換え産生のために選択配列を組換えベクターに導入することによって、および一般に分子生物学の分野の当業者に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、得られ得る。
【０１２６】
本発明のヌクレオチド配列は、目的の完全遺伝子または遺伝子フラグメントのいずれかの相補的ストレッチと、二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。想定される適用に依存して、代表的には、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度を達成するために、ハイブリダイゼーションの種々の条件を使用することが望ましい。高い選択性を必要とする適用について、代表的には、ハイブリッドを形成するための比較的ストリンジェントな条件を使用することが望ましく、例えば、比較的低濃度の塩、および／または高温の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩の塩濃度によって提供されるような）を選択する。このような選択条件は、存在する場合、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチにわずかに許容性であり、そして関連する配列の単離のために特に適切である。
【０１２７】
当然のことながら、いくつかの適用（例えば、潜在的なテンプレートにハイブリダイズする変異体プライマー鎖を使用する、変異体の調製が望ましい場合）について、低ストリンジェント（減少したストリンジェンシー）のハイブリダイゼーション条件が、ヘテロ二重鎖を形成するために代表的に必要とされる。これらの状況において、約２０℃〜約５５℃の温度範囲で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩の条件のような塩条件を使用することが望ましくあり得る。これによって、交差ハイブリダイズ種は、コントロールハイブリダイゼーションに関して、陽性ハイブリダイズシグナルとして容易に同定され得る。任意の場合において、ホルムアミド（これは、増加した温度と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化するように作用する）の増加した量の添加によって、条件がよりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、従って、一般に、所望の結果に依存する最良の方法である。
【０１２８】
本発明の別の実施形態に従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物が、提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の効果的かつ標識化インヒビターであることが実証され、結果として、疾患に寄与するタンパク質の合成を阻害することによって疾患が処置され得る治療的なアプローチを提供する。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力は、よく確立されている。例えば、ポリガラクタウロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）およびムスカリン２型アセチルコリンレセプターの合成は、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡレセプターおよびヒトＥＧＦを用いて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８８　Ｊｕｎ　１０；２４０（４８５８）：１５４４−６；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　Ｍｏｌ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．１９９８　Ｊｕｎ　１５；５７（２）３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；同第５，７８９，５７３号；同第５，７１８，７０９号および同第５，６１０，２８８号）。種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害しそして処置するために使用され得る、アンチセンス構築物もまた、記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；同第５，５９１，３１７号および同第５，７８３，６８３号）。
【０１２９】
従って、特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る任意の配列もしくはその相補体のすべてまたは一部を含む、オリゴヌクレオチド配列を提供する。１つの実施形態において、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはその誘導体を含む。第３の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート改変骨格を含む、改変ＤＮＡである。第４の実施形態において、そのオリゴヌクレオチド配列は、ペプチド核酸またはその誘導体を含む。各場合において、好ましい組成物は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドのうちの１つ以上の部分に相補的な、より好ましくは実質的に相補的な、そしてさらにより好ましくは完全に相補的な、配列領域を含む。所定の遺伝子配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択された標的配列の分析に基き、そして二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、および相対的安定性の決定に基く。アンチセンス組成物は、二量体、ヘアピン、または宿主細胞において標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少または妨げる他の二次構造をそれらが形成できない相対的能力に基づいて選択され得る。ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域と実質的に相補的な配列である。これらの二次構造分析および標的部位選択の考慮は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのｖ．４および／またはＢＬＡＳＴＮ　２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９−４０２）を使用して実施され得る。
【０１３０】
短いペプチドベクター（ＭＰＧ（２７残基）と称する）を使用するアンチセンス送達法の使用もまた意図される。このＭＰＧペプチドは、ＨＩＶ　ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメインと、ＳＶ４０　Ｔ抗原の核局在化配列由来の親水性ドメインとを含む（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９７　Ｊｕｌ　１５；２５（１４）：２７３０−６）。このＭＰＧペプチドのいくつかの分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドをコートし、そして比較的高効率（９０％）で１時間未満で培養哺乳動物細胞へと送達され得ることが示された。さらに、ＭＰＧとの相互作用は、ヌクレアーゼに対するそのオリゴヌクレオチドの安定性および形質膜を横切る能力の両方を強力に増加させる。
【０１３１】
本発明の別の実施形態に従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド組成物は、腫瘍細胞における腫瘍ポリペプチドおよび本発明のタンパク質の発現を阻害するためのリボザイム分子の設計および調製に使用される。リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特定の触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．１９８７　Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ．１９８７　Ａｐｒ　２４；４９（２）２１１−２０）。例えば、多数のリボザイムが、高い程度の特異性でホスホエステル転移反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中の数個のホスホエステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら、Ｃｅｌｌ．１９８１　Ｄｅｃ；２７（３　Ｐｔ　２）：４８７−９６；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．１９９０　Ｄｅｃ　５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、Ｎａｔｕｒｅ．１９９２　Ｍａｙ　１４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、この基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）との特異的塩基対形成相互作用を介して結合するという要件に帰せられている。
【０１３２】
天然に存在する酵素的ＲＮＡの６つの基本的変種が、現在公知である。各々が、生理学的条件下で、トランスで、ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得る（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得る）。一般に、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡへの結合によって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。従って、その酵素的核酸はまず、標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対形成を介してその標的ＲＮＡに結合し、そして一旦正確な部位に結合すると、その標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされるタンパク質を直接合成する標的ＲＮＡの能力を破壊する。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合しそして切断した後、その酵素的核酸は、別の標的を探索するためにそのＲＮＡから離れ、そして繰り返し、新しい標的に結合しそして切断し得る。
【０１３３】
リボザイムの酵素特性は、多くの技術（例えば、アンチセンス技術（ここで、核酸分子は、翻訳を阻害するために核酸標的に簡単に結合する））に対して有利である。なぜなら、治療的処置に影響を与えるのに必要であるリボザイムの濃度は、アンチセンスオリゴヌクレオチの濃度よりも低いからである。この利点は、酵素学的に作用するリボザイムの能力を反映する。従って、単一のリボザイム分子は、標的ＲＮＡの多くの分子を切断し得る。さらに、このリボザイムは、高度に選択的なインヒビターであり、この阻害の特異性は、標的ＲＮＡに結合する塩基対形成の機構に依存するだけでなく、標的ＲＮＡの切断の機構にも依存する。切断部位付近の１個のミスマッチまたは塩基置換により、リボザイムの触媒活性が完全になくなり得る。アンチセンス分子内の同様のミスマッチでは、それらの作用は妨げられない（Ｗｏｏｌｆら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．１９９２　Ａｕｇ　１５；８９（１６）：７３０５−９）。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の特異性よりも高い。
【０１３４】
この酵素学的核酸分子は、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）モチーフ、ヘアピンモチーフ、δ型肝炎ウイルスモチーフ、Ｉ群イントロンモチーフまたはＲＮａｓｅＰ　ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ誘導配列に関連する）あるいはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ＶＳ　ＲＮＡモチーフに形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９２　Ｓｅｐ　１１；２０（１７）：４５５９−６５に記載される。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開番号ＥＰ　０３６０２５７）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９８９　Ｊｕｎ　１３；２８（１２）：４９２９−３３）、Ｈａｍｐｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９０　Ｊａｎ　２５；１８（２）：２９９−３０４および米国特許第５，６３１，３５９号に記載される。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２　Ｄｅｃ　１；３１（４７）：１１８４３−５２に記載される；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら，Ｃｅｌｌ．１９８３　Ｄｅｃ；３５（３　Ｐｔ　２）：８４９−５７に記載される；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ＶＳ　ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９９０　Ｍａｙ　１８；６１（４）：６８５−９６；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．１９９１　Ｏｃｔ　１；８８（１９）：８８２６−３０；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３　Ｍａｒ　２３；３２（１１）：２７９５−９）に記載される；そしてＩ群イントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載される。本発明の酵素学的核酸分子において重要であることは、１以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である特定の基質結合部位を有すること、およびこの分子にＲＮＡ切断活性を付与する、基質結合部位内のヌクレオチド配列またはこの基質結合部位の周囲のヌクレオチド配列を有することが全てである。従って、リボザイム構築物は、本明細書中に記載される特定のモチーフに限定される必要はない。
【０１３５】
リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ　９３／２３５６９および国際特許出願公開番号ＷＯ　９４／０２５９５（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に記載されるように設計され得、そして記載されるようにインビトロおよびインビボにおいて試験するために合成され得る。このようなリボザイムはまた、送達するために最適化され得る。特定の例が提供されるが、当業者は、他の種において等価なＲＮＡ標的が、必要な場合に利用され得ることを理解する。
【０１３６】
リボザイムの活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更することにより、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐ改変（例えば、国際特許出願番号ＷＯ　９２／０７０６５；国際特許公開番号ＷＯ　９３／１５１８７；国際特許出願公開番号ＷＯ　９１／０３１６２；欧州特許出願公開番号９２１１０２９８．４；米国特許第５，３３４，７１１号、および国際特許出願公開番号ＷＯ　９４／１３６８８（これには、酵素学的ＲＮＡ分子の糖部分に対して成され得る、種々の化学的修飾が記載される）を参照のこと）、細胞中でのリボザイムの有効性を増強する改変、ならびにＲＮＡの合成時間を短縮および化学的必要性を低下させるための幹（ｓｔｅｍ）ＩＩ塩基の除去を用いて、リボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。
【０１３７】
Ｓｕｌｌｉｖａｎら（国際特許出願公開番号ＷＯ　９４／０２５９５）は、酵素学的ＲＮＡ分子の送達のための一般的な方法を記載する。リボザイムは、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与され得、これらには、リポソームへのカプセル化、イオン泳動法、あるいは、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性ミクロスフィアのような他のビヒクルへの取り込みによるもの、が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの適応症については、リボザイムは、エキソビボで細胞または組織に、上記のビヒクルを使用してか、または使用せずに直接送達され得る。あるいは、ＲＮＡ／ビヒクルの組合せは、直接的な吸入、直接的な注射、またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により、局所的に送達され得る。他の送達経路としては、血管内注射、筋内注射、皮下注射または関節注射、エアロゾル吸入、経口送達（錠形態または丸薬形態）、局所送達、全身送達、眼送達、腹腔内送達および／またはくも膜下腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイム送達および投与のより詳細な記載は、国際特許出願公開番号ＷＯ　９４／０２５９５および国際特許出願公開番号ＷＯ　９３／２３５６９（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に提供される。
【０１３８】
高濃度のリボザイムを細胞内に蓄積する別の手段は、リボザイムコード配列をＤＮＡ発現ベクターに組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ　Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ　ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ　ＩＩＩ）のためのプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ　ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞内で高レベルで発現される；所定の細胞型における所定のｐｏｌ　ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用され得るが、但し、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素は、適切な細胞において発現される。このようなプロモーターから発現するリボザイムは、哺乳動物細胞において機能することが示されている。このような転写ユニットは、哺乳動物細胞内への導入のための種々のベクター（プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター）が挙げられるがこれらに限定されない）に組み込まれ得る。
【０１３９】
本発明の別の実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）組成物が提供される。ＰＮＡは、ＤＮＡ模倣物であり、核酸塩基は、偽ペプチド骨格に結合される（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖ．１９９７　７（４）４３１〜３７）。ＰＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡを伝統的に使用した多くの方法において利用され得る。しばしば、ＰＮＡ配列は、対応するＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列よりも技術的により良く機能し、そしてＲＮＡにもＤＮＡにも固有でない有用性を有する。産生方法、特徴、および使用方法を含むＰＮＡの総説は、Ｃｏｒｅｙ（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１９９７　６月；１５（６）：２２４〜９）によって提供される。このように、特定の実施形態において、ＡＣＥ　ｍＲＮＡ配列の１以上の部分に相補的であるＰＮＡ配列を調製し得、そしてこのようなＰＮＡ組成物は、ＡＣＥ−特異的ｍＲＮＡの翻訳を調節、変更、減少、または低下させるために使用され得、これにより、このようなＰＮＡ組成物が投与された宿主細胞におけるＡＣＥ活性のレベルを変更する。
【０１４０】
ＰＮＡは、ＤＮＡの正常なホスホジエステル骨格を置換する２−アミノエチル−グリシン連結を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９１　Ｄｅｃ　６；２５４（５０３７）：１４９７〜５００；Ｈａｎｖｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２　Ｎｏｖ　２７；２５８（５０８７）：１４８１〜５；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ．１９９６　Ｊａｎ；４（１）：５〜２３）。この化学は、３つの重要な結果を有する。第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとは対照的に、ＰＮＡは、中性の分子であり；第２に、ＰＮＡは、アキラル（立体選択的な合成を開発する必要を避ける）であり；そして第３に、ＰＮＡ合成は、標準的なＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルを、固相ペプチド合成に使用する。一方、改良型Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を含む他の方法が使用されている。
【０１４１】
ＰＮＡモノマーまたは既製のオリゴマーは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）から市販されている。ＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡの合成は、手動プロトコルまたは自動プロトコルを使用して簡単に実施される（Ｎｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ．１９９５　Ａｐｒ；３（４）：４３７〜４５）。この手動（マニュアル）プロトコルは、それ自体で、化学的に修飾されたＰＮＡの産生または密接に関係するＰＮＡのファミリーの同時合成を導く。
【０１４２】
ペプチドの合成に関して、特定のＰＮＡ合成の成功は、選択した配列の特性に依存する。例えば、理論上、ＰＮＡは、ヌクレオチド塩基の任意の組合せを取り込み得るが、隣接するプリンの存在は、産物中に１以上の残基の欠失を導き得る。この困難性の見込みにおいて、隣接するプリンを有するＰＮＡを産生する際に、付加されているようである残基の連結を非効率的に繰り返すべきであることが示唆される。この後、ペプチド合成の間に観測されるのと類似する産物の収率および純度を提供する逆相高圧液体クロマトグラフィーによってＰＮＡを精製するべきである。
【０１４３】
所与の適用のためのＰＮＡの修飾が、固相合成の間にアミノ酸を連結することによって、または露出されたＮ末端アミンにカルボン酸基を含む化合物を付加することによって達成され得る。あるいは、ＰＮＡは、導入されたリジンまたはシステインに連結することによって合成した後に修飾され得る。ＰＮＡが修飾され得る簡便さによって、より良い溶解度または特定の機能的必要条件の最適化が容易になる。一旦合成されると、ＰＮＡおよびそれらの誘導体の同定は、質量分析法によって確認され得る。いくつかの研究は、ＰＮＡの修飾物を作製および利用した（例えば、Ｎｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ．１９９５　Ａｐｒ；３（４）：４３７〜４５；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｊ　Ｐｅｐｔ　Ｓｃｉ．１９９５　Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１（３）１７５〜８３；Ｏｒｕｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９５　Ｓｅｐ；１９（３）：４７２〜８０；Ｆｏｏｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９６　Ａｕｇ　２０；３５（３３）：１０６７３〜９；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９９５　Ａｕｇ　１１；２３（１５）：３００３〜８；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　１９９５　Ｊｕｎ　６；９２（１２）：５５９２〜６；Ｂｏｆｆａら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　１９９５　Ｍａｒ　１４；９２（６）：１９０１〜５；Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉら、Ｂｌｏｏｄ、１９９６　Ａｕｇ　１５；８８（４）：１４１１〜７；Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、１９９７　Ｎｏｖ　１１；９４（２３）：１２３２０〜５；Ｓｅｅｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９７　Ｓｅｐ；２３（３）：５１２〜７）。米国特許第５，７００，９２２号は、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラ分子および診断におけるその分子の使用、生物体におけるタンパク質の調節、ならびに治療に対して影響を受け易い状態の処置について議論する。
【０１４４】
ＰＮＡのアンチセンス結合特性を特徴付けする方法は、Ｒｏｓｅ（Ａｎａｌ　Ｃｈｅｍ、１９９３　Ｄｅｃ．１５；６５（２４）：３５４５〜９）およびＪｅｎｓｅｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７　Ａｐｒ　２２；３６（１６）：５０７２〜７）において議論される。Ｒｏｓｅは、キャピラリーゲル電気泳動を使用して、相対的な結合速度論および化学量論を測定することで、ＰＮＡのそれらの相補的オリゴヌクレオチドに対する結合を決定する。同様のタイプの測定が、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ　技術を使用してＪｅｎｓｅｎらによってなされた。
【０１４５】
記載され、そして当業者に明らかであるＰＮＡの他の適用には、ＤＮＡ鎖の侵入、アンチセンス阻害、変異分析、転写のエンハンサー、核酸の精製、転写活性遺伝子の単離、転写因子結合の阻害、ゲノムの切断、バイオセンサー、インサイチュハイブリダイゼーションなどにおける使用が挙げられる。
【０１４６】
（ポリヌクレオチドの同定、特徴づけおよび発現）
本発明のポリヌクレオチド組成物は、種々の十分に確立された技術のいずれかを使用して、同定、調製および／または操作され得る（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９、および他の類似の参考文献を参照のこと）。例えば、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡのマイクロアレイを腫瘍に関連する発現（すなわち、本明細書中で提供される代表的なアッセイを使用して決定する場合、正常な組織における発現よりも、腫瘍での少なくとも２倍高い発現）についてスクリーニングすることによって、以下にさらに詳細に記載されるように、同定され得る。このようなスクリーニングは、例えば、製造者の指示に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ、ＣＡ）のマイクロアレイ技術を使用して、（そして本質的にＳｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１０６１４〜１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：２１５０〜２１５５，１９９７に記載されるように）、行われ得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるタンパク質を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）から調製されるｃＤＮＡから増幅され得る。
【０１４７】
多数の鋳型（テンプレート）依存性プロセスが、サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載され、これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＰＣＲＴＭにおいては、標的配列の向かい合った相補鎖上の領域に対して相補的な２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合液に添加する。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはその標的に結合し、そしてポリメラーゼは、ヌクレオチドを付加することによって標的配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合液の温度を上昇および下降させることによって、伸長したプライマーは、標的から解離して反応生成物を形成し、過剰のプライマーは標的および反応生成物に結合し、そしてこのプロセスが反復される。好ましくは、逆転写およびＰＣＲＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
【０１４８】
多くの他のテンプレート依存性プロセスのいずれか（この多くは、ＰＣＲＴＭ増幅技術のバリエーションである）は、当該分野で容易に知られており、利用可能である。例示として、いくつかのこのような方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲともいわれる）（例えば、欧州特許出願公開番号３２０，３０８号、米国特許第４，８８３，７５０号において記載される）；Ｑβレプリカーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載される）；鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）および修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）が挙げられる。なお他の増幅法は、英国特許出願番号２　２０２　３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５において記載される。他の核酸増幅手順には、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ　８８／１０３１５）が挙げられ、これには、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲが含まれる。欧州特許出願公開番号３２９，８２２は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をサイクル的に合成する工程を包含する核酸増殖プロセスを記載する。ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ　８９／０６７００は、プロモーター／プライマー配列の標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーションに基づく核酸配列増幅スキーム、引き続くこの配列の多くのＲＮＡコピーの転写を記載する。「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ」（Ｏｈａｒａ、１９８９）のような他の増幅方法がまた、当業者に周知である。
【０１４９】
本発明のポリヌクレオチドの増幅した部分を使用して、適切なライブラリー（例えば、腫瘍ｃＤＮＡライブラリー）から周知の技術を使用して全長遺伝子を単離し得る。このような技術において、増幅に適した１以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）をスクリーニングする。好ましくは、ライブラリーはより大きな分子を含むようにサイズが選択される。ランダムプライムしたライブラリー（ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｄ　ｌｉｂｒａｒｙ）もまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定ために好ましくあり得る。ゲノムライブラリーは、イントロンを入手することおよび５’配列を伸長させることについて好ましい。
【０１５０】
ハイブリダイゼーション技術に関して、部分配列は、周知の技術を使用して標識（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐでの末端標識）され得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、一般に、標識プローブと、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターとをハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーまたはプラークを選択し、そして増殖させる。そしてそのＤＮＡをさらなる分析のために単離する。ｃＤＮＡクローンを、付加配列の量を決定するために、例えば、部分配列由来のプライマーおよびそのベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析し得る。制限酵素地図および部分配列を作成して、１以上の重複クローンを同定し得る。次いで、標準的な技術（これは、一連の欠失クローンを作製することを包含し得る）を使用して完全配列を決定し得る。次いで、得られた重複配列を１つの連続配列中に構築し得る。周知の技術を使用して、適切なフラグメントを連結することにより全長ｃＤＮＡ分子を生成し得る。
【０１５１】
あるいは、上記のような増幅技術は、部分的なｃＤＮＡ配列から全長コード配列を得るために有用であり得る。このような増幅技術の１つは、逆（インバース）ＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。この技術は、制限酵素を使用して、その遺伝子の既知の領域内にフラグメントを生成する。次いで、このフラグメントを分子内連結により環化し、そして既知の領域に由来する多岐したプライマーを用いたＰＣＲのためのテンプレート（鋳型）として使用する。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接した配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを使用する増幅により取り出し得る。この増幅した配列を、代表的に、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な第２のプライマーを使用する２回目の増幅に供する。既知の配列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを使用するこの手順についての改変は、ＷＯ　９６／３８５９１に記載される。そのような別の技術は、「迅速なｃＤＮＡ末端の増幅」またはＲＡＣＥとして公知である。この技術は、公知配列の５’および３’である配列を同定するために、内部プライマーおよび外部プライマー（これらは、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズする）の使用を含む。さらなる技術としては、キャプチャーＰＣＲ（Ｌａｎｇｅｒｓｔｒｏｍら，ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げられる。増幅を利用する他の方法もまた使用して、全長ｃＤＮＡ配列を入手し得る。
【０１５２】
特定の場合において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋより利用可能のもの）に提供される配列の分析により、全長ｃＤＮＡ配列を入手することが可能である。重複ＥＳＴの検索は、一般に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ検索）を使用して行われ得、そしてこのようなＥＳＴを使用して連続した全長配列を生成し得る。全長ＤＮＡ配列はまた、ゲノムフラグメントの分析により入手され得る。
【０１５３】
本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現を指向するように組換えＤＮＡ分子において使用され得る。遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じか、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列を使用して所定のポリペプチドをクローニングし、そして発現させ得る。
【０１５４】
当業者によって理解されるように、いくつかの場合において、天然に存在しないコドンを所有するポリペプチドコードヌクレオチド配列を作製することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンは、タンパク質発現の速度を増加させるためか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物の半減期よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように選択され得る。
【０１５５】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変更する改変が挙げられるが、それらに限定されない）のためにポリペプチドコード配列を変更するために、当該分野において一般的に公知の方法を使用して操作され得る。例えば、無作為断片化によるＤＮＡシャッフリングならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再アセンブリを使用して、ヌクレオチド配列を操作し得る。さらに、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、新たな制限部位を挿入し得るか、グリコシル化パターンを改変し得るか、コドンの優先度（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させ得るか、スプライス改変体を作製し得るか、または変異の導入などを行い得る。
【０１５６】
本発明の別の実施形態において、天然の核酸配列、改変された核酸配列、または組換え核酸配列は、融合タンパク質をコードする異種配列に連結され得る。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識され得るキメラタンパク質をコードすることが有用であり得る。融合タンパク質はまた、ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作され得、その結果そのポリペプチドは、切断されて、そして異種部分から精製されて取り出され得る。
【０１５７】
所望のポリペプチドをコードする配列が、当該分野において周知の化学的方法を使用して、全体または部分的に合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５〜２２３、Ｈｏｒｎ，Ｔ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５〜２３２を参照のこと）。あるいは、タンパク質自体は、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部を合成するための化学的方法を使用して産生され得る。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を使用して実施され得（Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙ．ら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：２０２〜２０４）、そして自動化合成は、例えば、ＡＢＩ　４３１Ａ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して達成され得る。
【０１５８】
新たに合成されたペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　Ｍｏｌｃｕｌａｒ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ　Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）または当該分野において利用可能な他の同等技術により実質的に精製され得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）により確認され得る。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその任意の部分は、直接合成の間改変されて、そして／または化学的方法を使用して、他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と組み合わせられて、改変体ポリペプチドを産生し得る。
【０１５９】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的等価物は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）内に挿入され得る。当業者に周知である方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載される。
【０１６０】
種々の発現ベクター／宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含み、そして発現させるように利用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌）；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは動物細胞系。
【０１６１】
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するように宿主細胞タンパク質と相互作用する、それらのベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その長さおよび特異性を変更し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導性プロモーター（例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーター）が使用され得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが、一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要とされる場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターが、適切な選択マーカーと共に有利に使用され得る。
【０１６２】
細菌系において、多数の発現ベクターのいずれかが、発現されるポリペプチドに対して意図される使用に依存して選択され得る。例えば、大量に必要とされる場合（例えば、抗体の誘導のために）、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが使用され得る。そのようなベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ここでは目的のポリペプチドをコードする配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに引続く７残基についての配列とインフレームでベクター内に連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ　Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次に遊離のグルタチオンの存在下において溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製され得る。そのような系において作製されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され得、その結果、クローニングされた目的のポリペプチドが、随意にＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１６３】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含む多数のベクターが使用され得る。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌら、（前出）およびＧｒａｎｔら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと。
【０１６４】
植物発現ベクターを使用する場合において、ポリペプチドをコードする配列の発現は、任意の多数のプロモーターにより駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーター）は、単独でか、またはＴＭＶに由来するωリーダー配列と組み合わせて使用され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：３０７−３１１）。あるいは、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーター）を使用し得る（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、（１９８４）ＥＭＢＯ　Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒ．ら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊら、（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって植物細胞内に導入され得る。そのような技術は、多数の一般的に入手可能な概説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，Ｓ．またはＭｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．，ＭｃＧｒａｗ　Ｈｉｌｌ　Ｙｅａｒｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ　Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；１９１−１９６頁を参照のこと）。
【０１６５】
昆虫系はまた、目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。例えば、そのような１つの系において、オートグラファカリフォルニア核発汗病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現させるベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域内（例えば、ポリへドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）にクローニングされ得て、ポリへドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。ポリペプチドコード配列の首尾良い挿入は、ポリへドリン遺伝子を不活性化し、そしてコートタンパク質を欠損している組換えウイルスを産生する。次いで、この組換えウイルスを使用して、例えば、目的のポリペプチドが発現され得る、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｌａｒｖａｅに感染させ得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
【０１６６】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系が一般的に利用可能である。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合において、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体内に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現し得る、生存可能ウイルスを入手し得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させ得る。
【０１６７】
特定の開始シグナルはまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合において、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要とされなくとも良い。しかし、コード配列のみ、またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、正確なリーディングフレーム内にあるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）に由来し得る。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適切なエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら、（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されるエンハンサー）の封入によって増大され得る。
【０１６８】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式において発現されたタンパク質をプロセシングするその能力について選択され得る。ポリペプチドのそのような改変としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピデーション（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能を促進させるために使用され得る。異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）（これらは、そのような翻訳後活性についての特定の細胞機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）および特徴的機構（ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）を有する）は、正確な改変および外来タンパク質のプロセシングを確実にするように選択され得る。
【０１６９】
長期間の組換えタンパク質の高収率の産生のために、安定な発現が一般的に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株が、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントならびに同じかもしくは別個のベクター上の選択マーカー遺伝子を含み得る、発現ベクターを使用して形質転換され得る。そのベクターの導入後、細胞は、それらが選択培地に切換えられる前に、富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地において１〜２日間の増殖が可能とされ得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、そしてその存在は、導入された配列を首尾良く発現する細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して、増殖され得る。
【０１７０】
多数の選択系を使用して、形質転換細胞株を回収し得る。これらの選択系としては、それぞれ、ｔｋ．ｓｕｐ．−細胞またはａｐｒｔ．ｓｕｐ−細胞において使用され得る、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９７７）Ｃｅｌｌ　１１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら、（１９９０）Ｃｅｌｌ　２２：８１７−２３）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性は、選択のための基礎として使用され得る；例えば、ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０））；ｎｐｔ（これは、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与する（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４））；ならびにａｌｓまたはｐａｔ（これらは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Ｍｕｒｒｙ、前出））。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）またはｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）。アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンのようなマーカーを用いる、可視マーカーの使用の人気が高くなっており、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に起因し得る一過性のタンパク質発現または安定なタンパク質発現の量を定量するためにもまた広範に使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【０１７１】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子もまた存在するということを示唆しているが、その存在および発現は、確認されることを必要とし得る。例えば、ポリペプチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、１つのプロモーターの制御下にポリペプチドコード配列と直列に配置され得る。誘導または選択に応じてのマーカー遺伝子の発現は、通常、その直列遺伝子の発現も同様に示す。
【０１７２】
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含み、かつ発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の手順によって同定され得る。これらの手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：核酸またはタンパク質の検出および／または定量化のための、例えば、膜ベースの技術、溶液ベースの技術、またはチップベースの技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション技術もしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術およびタンパク質バイオアッセイ技術またはイムノアッセイ技術。
【０１７３】
ポリヌクレオチドコード化産物に特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、ポリヌクレオチドコード化産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野において公知である。例としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する２つの部位の、モノクローナルベースのイムノアッセイが、いくつかの適用のために好まれ得るが、競合的結合アッセイもまた、利用され得る。これらのアッセイおよび他のアッセイは、とりわけＨａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら、（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ　Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら、（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）に記載される。
【０１７４】
広範な種々の標識技術および結合技術が、当業者に公知であり、そして種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製するための手段としては、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識または標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの産生のために、配列またはその任意の部分が、ベクター内にクローニングされ得る。そのようなベクターは、当該分野において公知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを添加することにより、ＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用され得る。これらの手順は、種々の市販キットを使用して実施され得る。使用され得る適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素形成剤ならびに基質、コファクター（補因子）、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【０１７５】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、タンパク質の発現および細胞培養物からの回収に適した条件下において培養され得る。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、細胞内に分泌され得るかまたは含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を介して、コードされたポリペプチドの分泌を指向するシグナル配列を含むように設計され得る。他の組換え構築物を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させ得る。そのような精製促進ドメインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固定された金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）において利用されるドメイン。精製ドメインとコードされるポリペプチドとの間への、切断可能なリンカー配列（例えば、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに対して特異的な配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））の封入を使用して、精製を促進させ得る。そのような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドを含む融合タンパク質およびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前に６つのヒスチジン残基をコードする核酸の発現を提供する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ら、（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載されるように、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上での精製を促進する一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら、（１９９３；ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｏｉｌ．１２：４４１−４５３）において提供される。
【０１７６】
組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントは、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を使用する、直接的ペプチド合成によって産生され得る。タンパク質合成は、手動技術を使用してか、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を使用して、達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別々に化学的に合成されて、そして全長分子を産生するために化学的方法を使用して組み合わせられ得る。
【０１７７】
（抗体組成物、そのフラグメントおよび他の結合因子）
別の局面によると、本発明はさらに、本明細書中で開示される腫瘍ポリペプチドに対して、またはその一部の改変体もしくは誘導体に対して免疫学的結合を示す結合因子（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）を提供する。抗体、またはその抗原結合フラグメントとは、本発明のポリペプチドに対して、「特異的に結合する」こと、「免疫学的に結合する」ことを言い、そして／または、それが（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて）検出可能なレベルでそのポリペプチドと反応し、かつ類似の条件下で非関連ポリペプチドと検出可能に反応しない場合、「免疫学的に反応性」であると言う。
【０１７８】
この文脈で使用される場合、免疫学的結合は、一般に、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンが特異的な抗原との間で起こるタイプの非共有結合的な相互作用をいう。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点から表現され得、ここで、より小さいＫｄは、より大きな親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して、定量され得る。１つのこのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定する工程を必要とし、ここで、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方の方向における速度に等しく影響を与える幾何学的パラメータに依存する。従って、「会合速度定数（ｏｎ　ｒａｔｅ　ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｎ）および「解離速度定数（ｏｆｆ　ｒａｔｅ　ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｆｆ）の両方が、濃度ならびに会合および解離の実際の速度を計算することによって決定され得る。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関係しない全てのパラメータの排除を可能にし、そして従って、解離定数Ｋｄに等しい。一般的には、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３を参照のこと。
【０１７９】
抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関係する免疫グロブリン分子の部分をいう。この抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチが、「超可変領域」といわれ、これは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接ストレッチの間に挿入される。従って、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンの超可変領域の間で、それに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、３次元空間において互いに相対的に配置されて、抗原結合表面を形成する。この抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、そして重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」またたは「ＣＤＲ」といわれる。
【０１８０】
結合因子は、本明細書中に提供される代表的なアッセイを使用して、癌（例えば、肺癌）を有する患者と有さない患者との間をさらに区別し得る。例えば、腫瘍タンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、好ましくは、この疾患を有する患者の少なくとも約２０％、より好ましくは患者の少なくとも約３０％において、癌の存在を示すシグナルを生成する。あるいは、または加えて、この抗体は、癌を有さない個体の少なくとも約９０％において、この疾患の非存在を示す陰性シグナルを生成する。結合因子が、この要求を満たすか否かを決定するために、癌（標準的な臨床試験によって決定されるような）を有する患者および有さない患者からの生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿および／または腫瘍生検）が、この結合因子に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載されるようにアッセイされ得る。好ましくは、疾患を有するサンプルおよび有さないサンプルの統計的に有意な数が、アッセイされる。各結合因子は、上記の基準を満足すべきである；しかし、当業者は、結合因子が、組合せて使用されて、感度を改善し得ることを認識する。
【０１８１】
上記の要求を満たす任意の薬剤は、結合因子であり得る。例えば、結合因子は、ペプチド成分を含むか含まないリボソーム、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって、調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般に、抗体は、細胞培養技術（本明細書に記載されるようなモノクローナル抗体の生成を含む）によって、または組換え抗体の生成を可能にするために、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、生成され得る。１つの技術において、このポリペプチドを含む免疫原が、最初に、広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変を有さない免疫原として機能し得る。あるいは、特に、比較的短いポリペプチドについて、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合される場合に、優れた免疫応答が惹起され得る。この免疫原は、好ましくは、１回以上のブースト免疫を組み込む所定のスケジュールに従って、動物宿主に注射され、そしてこれらの動物が、定期的に採血される。このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、次いで、例えば、適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製され得る。
【０１８２】
目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体が、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６の技術およびその改善物を使用して、調製され得る。簡潔には、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を生成し得る不死細胞株の調製を含む。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫された動物から得られる脾臓細胞から生成され得る。次いで、この脾臓細胞が、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは、免疫された動物と同系であるものとの融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、数分間、非イオン性界面活性剤と組合され、次いで、ハイブリッド細胞の増殖は支持するが、骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地に低密度でプレートされ得る。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間の後、通常、約１〜２週間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーを選択し、そしてそれらの培養上清を、このポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０１８３】
モノクローナル抗体は、増殖しているハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術が、収量を増加させるために使用され得、この技術は、例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔へのハイブリドーマ細胞株の注入である。次いで、モノクローナル抗体が、腹水または血液から回収され得る。混入物が、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、および抽出）によって抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティートクロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて使用され得る。
【０１８４】
抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む多くの治療的に有効な分子が、当該分野で公知である。このタンパク質分解性酵素パパインは、優先的に、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメントを生じさせ、これら（「Ｆ（ａｂ）フラグメント」）のうちの２つの各々は、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合ヘテロダイマーを含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメント（両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含む）を提供し得る。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ、および稀有な場合にはＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解的切断によって生成され得る。しかし、Ｆｖフラグメントは、当該分野で公知の組換え技術を使用して、より一般的に誘導される。Ｆｖフラグメントは、非共有結合的なＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを含み、このへテロダイマーは、ネイティブな抗体分子の抗原認識および結合能力のほとんどを保持する抗原結合部位を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ　１５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９：４０９１−４０９６。
【０１８５】
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、このヘテロダイマーは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨをコードする遺伝子およびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５（１６）：５８７９−５８８３。抗体Ｖ領域からの自然に凝集する（ただし、化学的に分離された）ポリペプチド軽鎖および重鎖を、ｓＦｖ分子に転換するための化学構造を識別するための多くの方法が記述され、このｓＦｖは、抗原結合部位の構造に実質的に類似する３次元構造に折り畳まれる。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号（Ｈｕｓｔｏｎら）；ならびに米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒら）を参照のこと。
【０１８６】
上記分子の各々は、重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含み、各々は、ＣＤＲＳへの支持を提供し、そして互いに対してＣＤＲの空間的関係を規定する重鎖および軽鎖ＦＲセットの間に挿入される。本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤＲセット」は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域をいう。重鎖または軽鎖のＮ末端から進んで、これらの領域は、各々、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表記される。従って、抗原結合部位は、６つのＣＤＲを含み、この６つのＣＤＲは、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む。単一ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書中で「分子認識ユニット」といわれる。多くの抗原−抗体複合体の結晶学的分析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原との広範な接触を形成することが立証され、ここで、最も広範な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３とである。従って、分子認識ユニットは、主に、抗原結合部位の特異性の原因である。
【０１８７】
本明細書中で使用される場合、用語「ＦＲセット」は、重鎖または軽鎖のＶ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを構成する、４つの隣接アミノ酸配列をいう。いくつかのＦＲ残基は、結合抗原と接触し得る；しかし、ＦＲは、主に、Ｖ領域を抗原結合部位、特にＣＤＲＳに直接隣接するＦＲ残基に折り畳む原因である。ＦＲにおいて、特定のアミノ酸残基および特定の構造特徴が、非常に高度に保存される。この点において、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が、結合部位に折り畳まれる場合、このＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして表示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関わらず、特定の「正準」構造に折り畳まれたＣＤＲループの形状に影響するＦＲの保存された構造領域が存在することが一般的に認識される。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合的なドメイン間接触に関係することが知られている。
【０１８８】
非ヒト免疫ブログリン由来の抗原結合部位を含む、多くの「ヒト化」抗体分子が記載され、この抗体分子には、げっ歯類Ｖ領域およびヒト定常領域に融合されたそれらの会合ＣＤＲ（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３４９：２９３−２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：４２２０−４２２４；Ｓｈａｗら（１９８７）Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８；およびＢｒｏｗｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３）、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前に、ヒト支持ＦＲにグラフトされたげっ歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４−１５３６；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−５２５）、ならびに組換えベニアリングされた（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ　ｖｅｎｅｅｒｅｄ）げっ歯類ＦＲによって支持されるげっ歯類ＣＤＲ（欧州特許公開番号５１９，５９６（１９９２年１２月２３日公開）を含むキメラ抗体が挙げられる。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的適用の持続期間および有効性を制限するげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する所望されない免疫学的応答を最小化するように設計される。
【０１８９】
本明細書中で使用される場合、用語「ベニアリングされたＦＲ」および「組換えベニアリングされたＦＲ」は、ネイティブのＦＲポリペプチド折り畳み構造の実質的に全てを保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供するために、例えば、げっ歯類重鎖または軽鎖のＶ領域からのＦＲ残基のヒトＦＲ残基での選択的置換をいう。ベニアリング技術は、抗原結合部位のリガンド結合特徴が、主に抗原結合表面内の重鎖および軽鎖のＣＤＲセットの構造および相対的な配置によって決定されるという理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３。従って、抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造、互いとのそれらの相互作用、およびＶ領域ドメインの残りとのそれらの相互作用が注意深く維持されるヒト化抗体のみにおいて保存され得る。ベニアリング技術を使用することによって、外部（例えば、溶媒がアクセス可能な）ＦＲ残基（これは、免疫系に容易に遭遇する）は、ヒト残基と選択的に置換されて、弱い免疫原性ベニアリング表面または実質的に非免疫原性のベニアリング表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。
【０１９０】
ベニアリングのプロセスは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第４版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　Ｏｆｆｉｃｅ，１９８７）において、Ｋａｂａｔらによって編集されたヒト抗体可変ドメインについての利用可能な配列データを使用し、Ｋａｂａｔデータベース、ならびに他の米国および海外のアクセス可能なデータベース（核酸およびタンパク質の両方）に更新される。Ｖ領域アミノ酸の溶媒アクセス可能性は、ヒトおよびマウス抗体フラグメントについての既知の３次元構造から推定され得る。マウス抗原結合部位をベニアリングする際に２つの一般的な工程が存在する。最初に、目的の抗体分子の可変ドメインのＦＲが、上記の供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較される。次いで、最も相同的なヒトＶ領域が、対応するマウスアミノ酸と、残基ごとに比較される。ヒト対応物とは異なるマウスＦＲにおける残基は、当該分野において周知の組換え技術を使用して、ヒト部分に存在する残基によって置換される。残基スイッチングは、少なくとも部分的に露出した（溶媒アクセス可能である）部分を用いて実施されるのみであり、そしてＶ領域ドメインの三次構造に対する有意な効果を有し得るアミノ酸残基（例えば、プロリン、グリシンおよび荷電したアミノ酸）の置換において、注意がなされる。
【０１９１】
この様式において、得られた「ベニアリングされた」マウス抗原結合部位は、従って、マウスＣＤＲ残基、ＣＤＲに実質的に隣接する残基、埋没したかほとんど埋没した（溶媒のアクセスが不可能）として同定された残基、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの間の非共有結合的な（例えば、静電的および疎水的）接触に関係すると考えられる残基、およびＣＤＲループの「正準」三次構造に影響を与えると考えられるＦＲの保存された構造領域からの残基を保持するように設計される。次いで、これらの設計基準は、ヒト様ＦＲへのマウス抗原結合部位の軽鎖および重鎖の両方のＣＤＲを組合せる組換えヌクレオチド配列を調製するために使用され、このヒト様ＦＲは、マウス抗体分子の抗原特異性を示す組換えヒト抗体の発現のために哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用され得る。
【０１９２】
本発明の別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療剤に結合され得る。この点に関して、適切な薬剤としては、放射性核種、分化インデューサー、薬物、毒素、およびそれの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化インデューサーとしては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
【０１９３】
治療剤は、適切なモノクローナル抗体に直接的または間接的に（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が他のものと反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の上の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、酸無水物または酸ハロゲン化物）または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応し得る。
【０１９４】
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とを結合させることが所望され得る。リンカー基は、結合の可能性を妨げることを回避するために、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるように働き得、従って結合効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使用（さもなければ、可能ではない）を促進し得る。
【０１９５】
種々の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【０１９６】
本発明の免疫結合体の抗体部分がないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインターナリゼーションの間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断を含む。
【０１９７】
１つより多い薬剤を抗体に結合させることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、薬剤の複数の分子が１つの抗体分子に結合される。別の実施形態において、１つより多い型の薬剤が１つの抗体に結合され得る。特定の実施形態に関わらず、１つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つより多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
【０１９８】
キャリアは、種々の方法（直接的にかまたはリンカー基を介するかのいずれかの共有結合を含む）で薬剤を保有し得る。適切なキャリアとしては、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらへの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（例えば、Ｓｈｉｈらへの米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、例えばリポソーム小胞内に、非共有結合によってかまたはカプセル化によって、薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３、０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むものを含む、キレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらへの米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
【０１９９】
（Ｔ細胞組成物）
別の局面において、本発明は、本明細書中に開示される腫瘍ポリペプチドに特異的なＴ細胞、または本明細書中に開示される腫瘍ポリペプチドの改変体もしくは誘導体に特異的なＴ細胞を提供する。このような細胞は、一般的に標準的手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例えば、ＩｓｏｌｅｘＴＭシステム（Ｎｅｘｅｌｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）から入手可能）を使用して、患者の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分中から単離され得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連または無関連のヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物から誘導され得る。
【０２００】
Ｔ細胞は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激され得る。このような刺激は、目的のポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を可能にする条件下および十分な時間、行われる。好ましくは、本発明の腫瘍ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）中に存在して、特定のＴ細胞の生成を容易にする。
【０２０１】
Ｔ細胞は、このＴ細胞が、特異的に増殖するか、サイトカインを分泌するか、または本発明のポリペプチドで被覆されるか、もしくはこのポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、本発明のポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、種々の標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブコントロールと比較して、溶解および／または増殖における２倍を超える増加の刺激指標は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４に記載されるように、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度の増加を測定することによって検出され得る（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）。３〜７日間の腫瘍ポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触は、代表的に、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加を生じる。２〜３時間の上記のような接触は、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定されるように（ここで、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す）、Ｔ細胞の活性化を生じるはずである（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ　１９９８）を参照のこと）。腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。腫瘍ポリペプチド特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して拡大され得る。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者、関連するドナーまたは無関連のドナーに由来し、そして刺激および拡大後にその患者に投与される。
【０２０２】
治療目的で、腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで大量に拡大され得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は、種々の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）の添加を伴うか、または伴わずに、腫瘍ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチドに対して再曝露され得、そして／または腫瘍ポリペプチドを合成する刺激細胞に対して再曝露され得る。あるいは、腫瘍ポリペプチドの存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニングによって数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、限界希釈が挙げられる。
【０２０３】
（Ｔ細胞レセプター組成物）
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、ジスルフィド結合によって連結されている、２つの異なる、非常に可変性のポリペプチド鎖（Ｔ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖と呼ばれる）からなる（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、１４８〜１５９．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。このα／βヘテロダイマー（異種二量体）は、細胞膜で不変のＣＤ３鎖と複合体化する。この複合体は、ＭＨＣ分子に結合した特定の抗原性ペプチドを認識する。ＴＣＲ特異性の膨大な多様性は、体細胞遺伝子再配列により、まるで免疫グロブリンの多様性のように生成される。このβ鎖遺伝子は、５０を超える可変性領域（Ｖ）、２つの多様性領域（Ｄ）、１０を超える連結セグメント（Ｊ）、および２つの定常領域セグメント（Ｃ）を含む。α鎖遺伝子は、７０を超えるＶセグメント、および６０を超えるＪセグメントを含むが、Ｄセグメントを含まず、そして１つのＣセグメントを含む。胸腺におけるＴ細胞発達の間、β鎖のＤ〜Ｊ遺伝子再配列が生じ、続いて、Ｖ遺伝子セグメントのＤＪへの再配列が生じる。この機能的ＶＤＪβエキソンは、転写され、そしてスプライシングされてＣβに連結される。α鎖に関しては、Ｖα遺伝子セグメントは、Ｊα遺伝子セグメントに再配列して、機能的エキソンを形成し、これが次に転写され、Ｃαにスプライシングされてる。多様性は、さらにβ鎖のＶセグメントと、Ｄセグメントと、Ｊセグメントとの間、そしてα鎖のＶセグメントと、Ｊセグメントとの間のＰおよびＮ−ヌクレオチドの無作為な付加によって、組み換えプロセスの間にさらに増大する（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、９８および１５０．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。
【０２０４】
本発明は、別の局面において、本明細書に開示のポリペプチド、またはその改変体もしくは誘導体に特異的なＴＣＲを提供する。本発明に従って、本明細書に記載の腫瘍ポリペプチドを認識する、Ｔ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖について、Ｖ−ＪもしくはＶ−Ｄ−Ｊ接合領域、またはその部分について、ポリヌクレオチドおよびアミノ酸の配列が提供される。一般に、本発明のこの局面は、ＭＨＣの文脈において提示される腫瘍ポリペプチドを認識するか、またはそれに結合するＴ細胞レセプターに関する。好ましい実施形態において、Ｔ細胞レセプターによって認識される腫瘍抗原は、本発明のポリペプチドを含む。例えば、腫瘍ペプチドに特異的なＴＣＲをコードするｃＤＮＡは、標準的な分子生物学技術および組み換えＤＮＡ技術を用いて、腫瘍ポリペプチドに特異的なＴ細胞から単離され得る。
【０２０５】
本発明はさらに、腫瘍ポリペプチドを認識するか、またはそれに結合する、本発明のＴ細胞レセプターと実質的に同じ機能または活性を有する、Ｔ細胞レセプターまたはそのアナログを包含する。このようなレセプターとしては、本明細書に提供されるＴ細胞レセプターの、レセプターフラグメント、または本明細書に提供されるＴ細胞レセプターの、置換、付加、もしくは欠失の変異体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明はまた、本明細書に提供されるＴ細胞レセプターに実質的に相同であるか、または実質的に同じ活性を保持する、ポリペプチドまたはペプチドを包含する。用語「アナログ」とは、本明細書に提供されるＴ細胞レセプターと実質的に同一のアミノ酸残基配列（ここで、１つ以上の残基、好ましくは５残基以下、より好ましくは、２５残基以下が、機能的に類似の残基で保存的に置換されている）を有し、そして本明細書に記載のようなＴ細胞レセプターの機能的局面を示す、任意のタンパク質またはポリペプチドを含む。
【０２０６】
本発明はさらに、適切な哺乳動物宿主細胞であって、本明細書に記載のポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされている（これによって、この宿主細胞はこのポリペプチドに特異的にされる）、適切な哺乳動物宿主細胞、例えば、非特異的Ｔ細胞を提供する。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、別々の発現ベクターに含まれ得るか、または単一の発現ベクター（これはまた、リボソーム内侵入部位（ＩＲＥＳ）の下流の遺伝子のｃａｐ依存性翻訳のためのＩＲＥＳを含む）に含まれ得る。このポリペプチドに特異的なＴＣＲを発現するこの宿主細胞は、例えば、以下にさらに考察されるような肺癌の養子免疫療法のために、用いられ得る。
【０２０７】
本発明のさらなる局面において、本明細書に挙げたポリペプチドに特異的なクローニングされたＴＣＲは、肺癌の診断のためのキットに用いられ得る。例えば、腫瘍特異的ＴＣＲの核酸配列またはその一部は、生物学的サンプル中で、特定のＴＣＲをコードする再配列された遺伝子の発現を検出するためのプローブまたはプライマーとして用いられ得る。従って、本発明はさらに、ポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするメッセンジャーＲＮＡまたはＤＮＡを検出するためのアッセイを提供する。
【０２０８】
（薬学的組成物）
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または動物への投与のための、単独でかまたは治療の１つ以上の他の様相と組合わせてかのいずれかでの、薬学的に受容可能なキャリア中の本明細書中に開示される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞および／または抗体組成物の処方物に関する。
【０２０９】
所望される場合、本明細書中に開示される組成物が、他の薬剤（例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な薬剤など）と組合わせても同様に投与され得ることが、理解される。事実、さらなる薬剤が標的細胞または宿主細胞と接触した際に有意な有害な影響をもたらさないとすれば、さらに含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。従って、この組成物は、特定の例において必要とされる種々の他の薬剤と共に送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは、本明細書中に記載されるように化学的合成され得る。同様に、このような組成物はさらに、置換または誘導体化されたＲＮＡ組成物またはＤＮＡ組成物を含み得る。
【０２１０】
従って、本発明の別の局面において、生理学的に受容可能なキャリアと組合わせた、本明細書中に記載される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはＴ細胞組成物を含む薬学的組成物が、提供される。特定の好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、予防ワクチン適用および治療ワクチン適用における使用のための、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド組成物および／または免疫原性ポリペプチド組成物を含む。ワクチン調製物は、一般的に、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、「Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ａｎｄ　ａｄｊｕｖａｎｔ　ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ，１９９５）に記載される。一般的にこのような組成物は、１つ以上の免疫刺激剤と組合わせた、本発明のポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物の１つ以上を含む。
【０２１１】
本明細書中に記載される任意の薬学的組成物が、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることは、明らかである。このような塩は、例えば、薬学的に受容可能な非毒性の塩基（有機塩基（例えば、一級アミン、二級アミンおよび三級アミンならびに塩基性アミノ酸の塩）および無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩）を含む）から調製され得る。
【０２１２】
別の実施形態において、本発明の例示的な免疫原性組成物（例えば、ワクチン組成物）は、上記のようなポリペプチドの１つ以上をコードするＤＮＡを含み、その結果このポリペプチドは、インサイチュで生成される。上記のように、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の種々の送達系の内のいずれかで投与され得る。実際、多数の遺伝子送達技術（例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　１５：１４３−１９８，１９９８およびこの中に引用される参考文献に記載される遺伝子送達技術）が、当該分野で周知である。当然、適切なポリヌクレオチド発現系は、患者における発現のための必要な調節性のＤＮＡ調節配列（例えば、適切なプロモーターおよび終結シグナル）を含む。あるいは、細菌送達系は、その細胞表面上にポリペプチドの免疫原性部分を発現するか、またはエピトープなどを分泌する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含み得る。
【０２１３】
従って、特定の実施形態において、本明細書中に記載される免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多数の公知のウイルスに基づく系のうちのいずれかを用いて、発現のための適切な哺乳動物宿主細胞に導入される。１つの例示的な実施形態において、レトロウイルスが、遺伝子送達系のための簡便かつ有効な基盤を提供する。本発明のポリペプチドをコードする選択されたヌクレオチド配列は、当該分野で公知の技術を用いて、ベクターに挿入され得、そしてレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが、単離され、そして被験体に送達され得る。多数の例示的なレトロウイルス系が、記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９）。
【０２１４】
さらに、多数の例示的なアデノウイルスに基づく系もまた、記載されている。宿主ゲノムに組込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に残り、このようにして、挿入変異誘発に関連する危険性を最小化する（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　４：４６１−４７６）。
【０２１５】
種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系もまた、ポリヌクレオチド送達に関して開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を用いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ　９２／０１０７０およびＷＯ　９３／０３７６９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ　９０（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【０２１６】
遺伝子移入による、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達するのに有用なさらなるウイルスベクターとしては、ポックスウイルスのファミリー（例えば、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルス）から誘導されるものが挙げられる。例として、新規分子を発現するワクシニアウイルスの組換え体は、以下のように構築され得る。ポリペプチドをコードするＤＮＡを最初に、ワクシニアプロモーターおよび隣接ワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接するように、適切なベクターに挿入する。次いで、このベクターを使用して、ワクシニアで同時に感染させる細胞にトランスフェクトする。相同組換えによって、ワクシニアプロモーターおよび目的のポリペプチドをコードする遺伝子を、ウイルスゲノムに挿入する。生じるＴＫ．ｓｕｐ．（−）組換え体を、５−ブロモデオキシウリジンの存在下でこの細胞を培養し、そして５−ブロモデオキシウリジンに耐性のウイルスプラークをピックアップすることによって、選択し得る。
【０２１７】
ワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系は、生物の宿主細胞における、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドの誘導可能な一過性発現または同時発現を提供するために、好都合に使用され得る。この特定の系において、細胞を最初に、インビトロで、バクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルスの組換え体で感染させる。このポリメラーゼは、それがＴ７プロモーターを保有する鋳型のみを転写する点で、鋭敏な特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターによって駆動される目的のポリヌクレオチドでトランスフェクトさせる。ワクシニアウイルスの組換え体から細胞質中で発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、このＲＮＡは次いで、宿主翻訳機構によってポリペプチドに翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の、高レベルで一過性の細胞質産生を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８１２６を参照のこと。
【０２１８】
あるいは、アビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）もまた使用されて、目的のコード配列を送達し得る。哺乳動物病原体由来の免疫原を発現する組換えアビポックスウイルスは、非鳥類種に投与された場合に、防御免疫を与えることが公知である。アビポックスベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、アビポックス属のメンバーは、感受性の鳥類種においてのみ生産的に複製し得、故に、哺乳動物細胞において感染性ではないからである。組換えアビポックスウイルスを産生するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上記に記載されるように、遺伝子組換えを使用する。例えば、ＷＯ　９１／１２８８２；ＷＯ　８９／０３４２９；およびＷＯ　９２／０３５４５を参照のこと。
【０２１９】
多数のアルファウイルスベクターのいずれかもまた、本発明のポリヌクレオチド組成物の送達のために使用され得、これらとしては、米国特許第５，８４３，７２３号；同第６，０１５，６８６号；同第６，００８，０３５号および同第６，０１５，６９４号に記載されるベクターが挙げられる。ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）に基づく特定のベクターもまた、使用され得、この例示的な例は、米国特許第５，５０５，９４７号および同第５，６４３，５７６号に見出され得る。
【０２２０】
さらに、分子結合体化ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６〜６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９〜６１０３に記載のアデノウイルスキメラベクター）がまた、本発明における遺伝子送達に用いられ得る。
【０２２１】
これらおよび他の公知のウイルスベースの送達系に対するさらなる例示的情報は、例えば、以下に見出され得る：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：３１７〜３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６〜１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ　８：１７〜２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ　２，２００，６５１：ＥＰ　０，３４５，２４２号；ＷＯ　９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：６１６〜６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：４３１〜４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：２１５〜２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１１４９８〜１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８８：２８３８〜２８４８、１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７、１９９３。
【０２２２】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを標的細胞のゲノムに組み込み得る。この組み込みは、相同組み換え（遺伝子置換）を介して特定の位置および方向であり得るか、または無作為な非特異的位置に組み込まれ得る（遺伝子増大）。なおさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡの別のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持され得る。このようなポリヌクレオチドセグメントすなわち「エピソーム」は、宿主細胞の周期に独立してまたは同調して維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞に送達され、そしてこの細胞中にこのポリヌクレオチドが残る様式は、使用される発現構築物のタイプに依存する。
【０２２３】
本発明の別の実施形態において、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：１７４５〜１７４９、１９９３に記載され、そしてＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：１６９１〜１６９２、１９９３によって概説されるように、ポリヌクレオチドは、「裸の」ＤＮＡとして投与／送達される。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に効率的に輸送される）上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。
【０２２４】
なお別の実施形態において、本発明の組成物は、微粒子銃アプローチ（その多くが記載されている）を介して送達され得る。１つの代表的な例において、ガス駆動粒子加速（ｇａｓ−ｄｒｉｖｅｎ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）は、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　ＰＬＣ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）およびＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって製造されたデバイスのようなデバイスで達成され得る。そのいくつかの例は、米国特許第５，８４６，７９６号；同第６，０１０，４７８号；同第５，８６５，７９６号；同第５，５８４，８０７号；および欧州特許番号第０５００７９９号に記載されている。このアプローチは、注射針のない（無注射針）（ニードルフリー）送達アプローチを提供する。ここでは、微視的な粒子（例えば、ポリヌクレオチド粒子、またはポリペプチド粒子）の乾燥粉末処方物を、手持ちデバイスによって生成されたヘリウムガスジェット内で高速に加速し、目的の標的組織内へ粒子を噴射する。
【０２２５】
関連の実施形態において、本発明の組成物のガス駆動注射針なし注入に有用であり得る他のデバイスおよび方法は、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）によって提供されるものが挙げられ、そのいくつかの例は、米国特許第４，７９０，８２４号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３９９，１６３号；同第５，５２０，６３９号；および同第５，９９３，４１２号に記載されている。
【０２２６】
別の実施形態に従って、本明細書に記載される薬学的組成物は、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、Ｔ細胞および／またはＡＰＣ組成物に加えて、１つ以上の免疫賦活剤（免疫刺激因子）を含む。免疫賦活剤とは、本質的に、外因性抗原に対する免疫応答（抗原および／または細胞媒介）を増大または増強する任意の物質をいう。免疫賦活剤の１つの好ましい型は、アジュバントを含む。多くのアジュバントは、迅速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答の刺激物質（例えば、脂質Ａ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ誘導化タンパク質）を含む。特定のアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　６５（Ｍｅｒｃｋ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム）；カルシウム，鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アセチル化糖；カチオンの誘導化多糖またはアニオンの誘導化多糖；ポリフォスファーゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）；生分解性ミクロスフェア：モノホスホリル脂質Ａおよびモノホスホリルクイル（ｑｕｉｌ）Ａとして、市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２および成長因子のような他のもの）もまた、アジュバントとして使用され得る。
【０２２７】
本発明の特定の実施形態において、アジュバント組成物は、Ｔｈ１型の免疫応答を優勢に誘導するものが好ましい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与される抗原に対する細胞媒介性応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３、１９８９を参照のこと。
【０２２８】
Ｔｈ１型優勢の応答を誘発するための特定の好ましいアジュバントは、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組み合わせを含む。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）はまた、Ｔｈ１優勢の応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、そして例えばＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載される。免疫賦活剤ＤＮＡ配列がまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７３：３５２，１９９６によって記載される。別の好ましいアジュバントは、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ　Ａ）、またはその誘導体（ＱＳ２１およびＱＳ７（Ａｑｕｉｌａ　Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を含む）；Ｅｓｃｉｎ；Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ（ジキトニン）；またはＧｙｐｓｏｐｈｉｌａもしくはＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ　ｑｕｉｎｏａサポニンを含む。他の好ましい処方物としては、本発明のアジュバントの組み合わせ、例えば、ＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ　Ａ、β−エスシン、またはジギトニンを含む以下の群のうち少なくとも２つの組み合わせ、において１つより多いサポニンを含む。
【０２２９】
あるいは、このサポニン処方物は、キトサン、または他のポリカチオン性ポリマーからなるワクチンビヒクル、ポリラクチドおよびポリラクチド−ｃｏ−グリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、ポリサッカライドまたは化学的に改変されたポリサッカライドからなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子、などと組み合わせられ得る。サポニンはまた、コレステロールの存在下で処方されて、リポソームまたはＩＳＣＯＭのような粒子構造を形成し得る。さらに、サポニンは、非粒子的溶液もしくは懸濁液で、または小数層リポソームもしくはＩＳＣＯＭのような粒子状構造で、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと一緒に処方され得る。サポニンはまた、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）のような賦形剤と一緒に処方されて、粘度を増大され得るか、またはラクトースのような粉末賦形剤とともに乾燥粉末形態に処方され得る。
【０２３０】
１つの好ましい実施形態において、アジュバント系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、ＷＯ９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントとの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）される、あまり反応発生的（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）でない組成物）を含む。他の好ましい処方物は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油型エマルジョン中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびトコフェロールを使用する、別の特に好ましいアジュバント処方物は、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
【０２３１】
別の強化されたアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組み合わせを含み、特にＣｐＧとＱＳ２１の組み合わせがＷＯ００／０９１５９に開示されている。好ましくは、この処方物は、さらに、水中油型エマルジョンおよびトコフェノールを含む。
【０２３２】
本発明の薬学的組成物における使用のためのさらなる代表的アジュバントとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、アジュバントのＳＢＡＳシリーズ（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）（例えば、係属中の米国出願登録番号０８／８５３，８２６および０９／０７４，７２０（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるアジュバント）、ならびにＷＯ　９９／５２５４９Ａ１に記載のポリオキシエチレンエーテルアジュバントのようなアジュバントが挙げられる。
【０２３３】
他の好ましいアジュバントは、一般式（Ｉ）：ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒのアジュバント分子を含み、
ここで、ｎは、１〜５０であり、Ａは、結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒは、Ｃ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである。
【０２３４】
本発明の１つの実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン処方物からなり、ここで、ｎは、１と５０との間、好ましくは４〜２４、最も好もしくは９であり、このＲ成分は、Ｃ１〜５０、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキル、そして最も好ましくはＣ１２アルキルであり、そしてＡは、結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲、好ましくは０．１〜１０％、そして最も好ましくは０．１〜１％の範囲にあるべきである。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウロイルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋインデックス（第１２版、７７１７項目）に記載される。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載される。
【０２３５】
上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、所望の場合、別のアジュバントと組み合わせられ得る。例えば、好ましいアジュバントの組み合わせは、好ましくは、係属中の英国特許出願第ＧＢ９８２０９５６．２号に記載されるようなＣｐＧとの組み合わせである。
【０２３６】
本発明の別の実施形態に従って、本明細書に記載される免疫原性組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、および有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）を介して宿主に送達される。このような細胞は、抗原を提示する能力を増大するように、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を改良するように、それ自体で抗腫瘍効果を有するように、そして／あるいは受け手と免疫学的に適合性（すなわち、一致するＨＬＡハプロタイプ）であるように遺伝学的に改変されてもよいが、改変される必要はない。ＡＰＣは、一般に、種々の生物学的な流体および器官（腫瘍および腫瘍周辺組織を含む）のいずれかから単離されてもよいし、そして自己細胞、同種異系細胞、同系細胞、または異種細胞であってもよい。
【０２３７】
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ　３９２：２４５−２５１、１９９８）、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫性を誘発するための生理学的アジュバントとして有効であることが示されてきた（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９を参照のこと）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは目に見える顕著な細胞質プロセス（樹状突起）を有する）、高い効率で抗原を取り込み、プロセシングし、そして提示するそれらの能力、および未処理のＴ細胞応答を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。もちろん樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このような改変樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替として、分泌小胞抗原装荷樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ　ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．４：５９４−６００，１９９８を参照のこと）。
【０２３８】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または任意の他の適切な組織もしくは流体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを添加することによって、樹状細胞に分化され得る。
【０２３９】
樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として都合良く分類され、このことは、２つの充分に特徴付けられた表現型の間を単純な方法で区別することを可能にする。しかしこの命名は、あらゆる可能な分化の中間段階を排除すると解釈されるべきではない。未熟な樹状細胞は、抗原の取り込みおよびプロセシングの高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高度な発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、クラスＩおよびクラスＩＩ　ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化を担う細胞表面分子の高度な発現ではなく、これらのマーカーのより低い発現によって特徴付けられる。
【０２４０】
ＡＰＣは、一般に、本発明のポリヌクレオチド（またはその部分もしくは他の改変体）を用いてトランスフェクトされ得、その結果、このコードされたポリペプチドまたはその免疫原性部分が細胞表面上に発現される。このようなトランスフェクションはエキソビボで生じ得、次いでこのようなトランスフェクトされた細胞を含む薬学的組成物は、本明細書中に記載されるように、治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与され得、インビボで起こるトランスフェクションを生じる。樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、例えば、ＷＯ９７／２４４４７に記載される方法、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　７５：４５６−４６０、１９９７によって記載される遺伝子銃アプローチのような当該分野で公知の任意の方法を使用して一般に実施され得る。樹状細胞の抗原ローディングは、樹状細胞または前駆細胞を、腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸のもしくはプラスミドベクター中の）またはＲＮＡ；あるいは抗原発現性組換え細菌またはウイルス（例えば、牛痘、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクター）とインキュベートすることによって達成され得る。ローディングの前に、ポリペプチドは、Ｔ細胞補助を提供する免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に共有結合され得る。あるいは、樹状細胞は、別々にまたはポリペプチドの存在下で、結合していない免疫学的パートナーでパルスされ得る。
【０２４１】
当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明の薬学的組成物において使用され得るが、このタイプのキャリアは、代表的に投与の様式に依存して変化する。本発明の組成物は、投与の任意の適切な様式、例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、粘膜投与、静脈投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、および筋肉内投与を含む様式のために処方され得る。
【０２４２】
このような薬学的組成物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた生分解性であり得る。特定の実施形態において、好ましくは、この処方物は比較的一定レベルの活性成分の放出を提供する。しかし、他の実施形態において、投与直後のより迅速な放出速度が所望され得る。このような組成物の処方は十分に、公知の技術を使用する当業者のレベル内である。この点に関して有用な例示的なキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の例示的な徐放性キャリアとしては、非液性（ｎｏｎ−ｌｉｑｕｉｄ）親水性コア（例えば、架橋ポリサッカリドまたはオリゴサッカリド）を含む超分子バイオベクター、ならびに必要に応じて、両親媒性化合物を含む外部層（例えば、リン脂質）（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ９６／０６６３８を参照のこと）を含む超分子バイオベクターが挙げられる。徐放性処方物内に含まれる活性な化合物の量は、移植の部位、放出の速度および予期される持続期間、ならびに処置または予防されるべき状態の性質に依存する。
【０２４３】
別の例示的な実施形態において、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコレート）は、本発明の組成物のためのキャリアとして使用される。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号；同第５，４０７，６０９号および同第５，９４２，２５２号に開示される。改変Ｂ型肝炎コアタンパク質キャリア系（例えば、ＷＯ／９９　４０９３４およびそこで引用される参考文献に記載されるような系）もまた、多くの用途に有用である。別の例示的なキャリア送達系（システム）は、キャリア含有粒子−タンパク質複合体（例えば、米国特許第５，９２８，６４７号に記載される複合体）を使用し、これは、宿主においてクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
【０２４４】
本発明の薬学的組成物はしばしば、１つ以上の、緩衝剤（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）；糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；抗酸化剤；静菌剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；処方物をレシピエントの血液に対して等張性、低張性または弱く高張性にする溶質；懸濁剤；濃化剤および／または保存剤をさらに含む。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。
【０２４５】
本明細書中に記載される薬学的組成物は、単回用量容器または多用量容器（例えば、密閉アンプルまたはバイアル）中に存在し得る。このような容器は、代表的に、使用まで処方物の無菌性および安定性を維持するような様式で、密封される。一般に、処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の、懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保存され得る。あるいは、薬学的組成物は、使用の直前に無菌水性キャリアの添加のみを必要とする、凍結乾燥状態で保存され得る。
【０２４６】
様々な処置レジメンにおいて本明細書中で記載される特定の組成物を使用するための適切な投薬レジメンおよび処置レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋肉内の投与および処方を含む）の開発は、当該分野で周知であり、これらのいくつかは、一般的な例示目的のために以下で簡単に考察される。
【０２４７】
特定の用途において、本明細書中で開示される薬学的組成物は、経口投与によって動物に送達され得る。このように、これらの組成物は、不活性希釈剤と共にかまたは同化可能食用キャリアと共に処方され得るか、あるいはこれらの組成物は、硬質または軟質殻ゼラチンカプセルに入れられ得るか、あるいはこれらの組成物は錠剤に圧縮され得るか、あるいはこれらの組成物は食餌の食品に直接組み込まれ得る。
【０２４８】
活性化合物は、さらに賦形剤と共に組み込まれ得、そして経口摂取錠剤、経頬粘膜錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハ剤などの形態で使用される（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ　１９９７　Ｍａｒ　２７；３８６（６６２３）：４１０−４；Ｈｗａｎｇら、Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｔｈｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔ　１９９８；１５（３）：２４３−８４；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号を参照のこと）。錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などはまた、任意の種々のさらなる成分を含み得、例えば、結合因子（例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトデンプン、アルギン酸など）；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；および甘味料（例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリン）または香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香料）が添加され得る。投薬量単位形態がカプセル剤である場合、これは上記のタイプの材料に加えて液体キャリアを含み得る。様々な他の材料が、コーティングとして存在し得るか、またはそうでなければ投薬単位の物理的形態を改変し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、セラック、糖またはその両方でコーティングされ得る。もちろん、任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋でありかつ用いられる量で実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物が、持続性放出調製物および処方物に組み込まれ得る。
【０２４９】
代表的に、これらの処方物は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い活性化合物を含み得るが、活性成分の割合は、もちろん、変化し得、そして好都合には、全処方物の重量または体積の約１または２％と、約６０％または７０％以上のとの間であり得る。当然、治療的に有用な組成物の各々の中の活性化合物の量は、適切な投薬量が、化合物の任意の所定の単位用量において得られるような様式で、調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期限のような因子、および他の薬理学的考慮が、このような薬学的処方物を調製する分野の当業者によって意図され、そしてそのようなものとして、種々の投薬量および処置レジメンが所望され得る。
【０２５０】
あるいは、経口投与について、本発明の組成物は、うがい薬、歯みがき剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与処方物の形態で、１つ以上の賦形剤と混合され得る。あるいは、活性成分は、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む溶液）に組み込まれ得るか、または歯みがき剤に分散され得るか、または治療的有効量で、水、結合因子、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に添加され得る。あるいは、これらの組成物は、舌下に置かれ得るか、そうでなければ口の中で溶解され得る錠剤形態または溶液形態に成形され得る。
【０２５１】
特定の状況において、本明細書中で開示される薬学的組成物を、非経口送達、静脈内送達、筋肉内送達またはさらに腹腔内送達することが所望される。このようなアプローチは、当業者に周知であり、これらのいくつかは例えば、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号にさらに記載される。特定の実施形態において、遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびにオイル中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防止するために、防腐剤を含む。
【０２５２】
注入用途のために適切な例示的な薬学的形態として、滅菌水性液剤または分散物および滅菌注射用液剤または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、その形態は、滅菌でなけらばならず、そして容易に注射することができる程度に、流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／もしくは植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして／または界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが、望ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物中での吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって、もたらされ得る。
【０２５３】
一実施形態において、水溶液の非経口投与のために、必要ならばその溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤が、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または注入予定部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化が、処置される被験体の状態に依存して必然的に生じる。さらに、ヒト投与について、調製物は、もちろん、ＦＤＡ　Ｏｆｆｉｃｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性標準および純度標準を好ましく満たす。
【０２５４】
本発明の別の実施形態において、本明細書中で開示される組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、そしてこれらの塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸など）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。処方の際に、溶液は、投薬処方物と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。
【０２５５】
キャリアは、任意および全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収を遅延させる薬剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどをさらに含み得る。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いては、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生じない分子実体および組成物をいう。
【０２５６】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、核酸およびペプチド組成物を、経鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、Ｊ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　１９９８　Ｍａｒ　２；５２（１−２）：８１−７）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）を使用する薬物の送達はまた、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での例示的な経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号に記載される。
【０２５７】
特定の実施形態において、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞などを、適切な宿主細胞／生物への本発明の組成物の導入のために使用する。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化して送達するために処方され得る。あるいは、本発明の組成物は、このようなキャリアビヒクルの表面に、共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合され得る。
【０２５８】
潜在的な薬物キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様調製物の形成および使用は一般に、当業者に公知である（例えば、Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１９９８　Ｊｕｌ；１６（７）：３０７−２１；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎｉｐｐｏｎ　Ｒｉｎｓｈｏ　１９９８　Ｍａｒ；５６（３）：６９１−５；Ｃｈａｎｄｒａｎら、Ｉｎｄｉａｎ　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ．１９９７　Ａｕｇ；３５（８）：８０１−９；Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｔｈｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔ．１９９５；１２（２−３）：２３３−６１；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号（これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として詳細に援用される）を参照のこと）。
【０２５９】
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順によるトランスフェクションが通常困難である多くの細胞型とともに、首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．１９９０　Ｓｅｐ　２５；２６５（２７）：１６３３７−４２；Ｍｕｌｌｅｒら、ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１９９０　Ａｐｒ；９（３）：２２１−９）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長の制限がない。リポソームは、遺伝子、種々の薬物、放射線治療剤、酵素、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターなどを、種々の培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソームの使用は、全身送達後の、自己免疫応答にも受容不可能な毒性にも関連しないようである。
【０２６０】
特定の実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、そして多層同心性二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。
【０２６１】
あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは一般に、化合物を安定かつ再現可能な様式で捕獲し得る（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖ　Ｉｎｄ　Ｐｈａｒｍ．１９９８　Ｄｅｃ；２４（１２）：１１１３−２８を参照のこと）。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計され得る。このような粒子は、例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｔｈｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔ．１９８８；５（１）：１−２０；ｚｕｒ　Ｍｕｈｌｅｎら、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１９９８　Ｍａｒ；４５（２）：１４９−５５；Ｚａｍｂａｕｘら、Ｊ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ．１９９８　Ｊａｎ　２；５０（１−３）：３１−４０；および米国特許第５，１４５，６８４号に記載されるようにして作製され得る。
【０２６２】
（癌治療法）
癌治療への免疫学的アプローチは、癌細胞が、異常な細胞および分子または外来の細胞および分子に対する人体の防御をしばしば回避し得、そしてこれらの防御が、失った基盤（ｇｒｏｕｎｄ）を取り戻すために免疫的に刺激され得るという認識に基づく（例えば、Ｋｌｅｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８２）、６２３〜６４８頁）。種々の免疫エフェクターが腫瘍の増殖を直接的または間接的に阻害し得るという多数の最近の知見は、癌治療に対するアプローチにおける更新された関心を導いた（例えば、Ｊａｇｅｒら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　２００１；６０（１）：１−７；Ｒｅｎｎｅｒら、Ａｎｎ　Ｈｅｍａｔｏｌ　２０００　Ｄｅｃ；７９（１２）：６５１−９）。
【０２６３】
抗腫瘍細胞の免疫および人体からの腫瘍細胞の除去に関連する機能を有する４つの基本的な細胞型は、以下の通りである：ｉ）非自己侵入細胞を認識および標識するために免疫グロブリンを血漿に分泌するＢ−リンパ球；ｉｉ）免疫グロブリンでコーティングされた標的侵入細胞の溶解および処理を担う補体タンパク質を分泌する単球；ｉｉｉ）腫瘍細胞の破壊、抗体依存性細胞傷害およびナチュラルキリング（ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｌｉｎｇ）のための２種類の機構を有するナチュラルキラーリンパ球；ならびにｉｖ）抗原特異的レセプターを保持し、そして相補的マーカー分子を保有する腫瘍細胞を認識する能力を有するＴ−リンパ球（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｈ．、１９８９、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（編）、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ、９２３〜９５５頁）。
【０２６４】
癌の免疫治療は、一般に、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはそれらの両方を誘導することに焦点が当てられている。さらに、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の誘導は、抗体または細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかを二次的に誘導するために必要であることが十分に確立されている。癌細胞、特に、肺癌細胞に対して選択的であるか、または理想的には特異的であるポリペプチド抗原は、肺癌に対する免疫応答を誘導するための強力なアプローチを提供し、そして本発明の重要な局面である。
【０２６５】
従って、本発明のさらなる局面において、本明細書に記載される薬学的組成物は、癌を処置するため、特に、肺癌の免疫治療のために使用され得る。このような方法において、本明細書中に記載される薬学的組成物は、患者、代表的には、温血動物、好ましくはヒトに投与される。患者は、癌に罹患していてもしていなくてもよい。従って、上記薬学的組成物は、癌の発症を予防するため、または癌に罹患した患者を処置するために使用され得る。薬学的組成物およびワクチンは、原発性腫瘍の外科的除去および／または放射線治療剤もしくは従来の化学療法剤の投与のような処置の前、あるいはその後のいずれかに投与され得る。上記のように、薬学的組成物の投与は、任意の適切な方法（静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、肛門、膣、局所的および経口経路による投与を含む）によってであり得る。
【０２６６】
特定の実施形態において、免疫療法は、能動的免疫療法であり得、この療法にける処置は、免疫応答改変剤（例えば、本明細書中で提供されるポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与を用いる、腫瘍に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
【０２６７】
他の実施形態において、免疫療法は、受動的免疫療法であり得、この療法における処置は、確立された腫瘍免疫反応性を有する因子（例えば、エフェクター細胞または抗体）（これらは、抗腫瘍効果を直接的または間接的に媒介し得、そして必ずしもインタクトな宿主免疫系に依存しない）の送達を含む。エフェクター細胞の例としては、上記のようなＴ細胞、本明細書中に提供されるポリペプチドを発現するＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤性リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫療法のために他のベクターまたはエフェクター細胞中にクローニングされ、発現され、そして移入され得る。本明細書に提供されるポリペプチドはまた、受動免疫療法のための抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載される）を生成するために用いられ得る。
【０２６８】
モノクローナル抗体は、検出、診断アッセイまたは治療適用において、所望される選択的な利用のために、任意の種々の標識で標識され得る（米国特許第６，０９０，３６５号；同第６，０１５，５４２号；同第５，８４３，３９８号；同第５，５９５，７２１号；および同第４，７０８，９３０号（各々が個々に援用されるかのように、本明細書中でこれらの全体が参考として援用されている）に記載されている）。各々の場合において、抗原の決定部位への標識されたモノクローナル抗体の結合は、特定の治療剤の検出または異常な細胞上の抗原決定部位への特定の治療剤の送達を示す。本発明のさらなる目的は、このようなモノクローナル抗体の所望される選択的な利用を達成するために適切に標識される、特定のモノクローナル抗体を提供することである。
【０２６９】
エフェクター細胞は、一般に、本明細書中に記載されるように、インビトロでの増殖により養子免疫治療のために十分な量で得られ得る。単一の抗原特異的エフェクター細胞を、インビボでの抗原認識を保持しながら数十億まで増殖させるための培養条件は当該分野で周知である。このようなインビトロの培養条件は代表的に、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および分裂しない支持細胞の存在下で、抗原での間欠刺激を用いる。上で述べたように、本明細書中で提供される免疫反応性ポリペプチドは、抗原特異的Ｔ細胞培養物を急速に増殖するために用いられ、免疫治療に十分な数の細胞を生成し得る。詳細には、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、および／またはＢ細胞）は、当該分野で周知の標準的技術を用いて、免疫反応性ポリペプチドでパルスされ得るか、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増大するのに適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療において使用するための培養されたエフェクター細胞は、インビボで増殖されかつ広範に分散され得、そして長期間生存し得なければならない。培養されたエフェクター細胞が、インビボで増殖し、そしてＩＬ−２を補充された抗原での反復刺激によって、長期間、多数生存するように誘導され得ることが研究で示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　１５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
【０２７０】
あるいは、本明細書において列挙されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から得られた抗原提示細胞に導入され得、そして同じ患者に戻す移植のためにエキソビボでクローン的に増殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で公知の任意の手段（好ましくは、静脈投与、腔内投与、腹腔内投与、または腫瘍内投与による滅菌形態）を用いて患者に再導入され得る。
【０２７１】
本明細書中に記載される治療的組成物の投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個々人で異なり、そして標準的技術を用いて容易に確立され得る。概して、薬学的組成物およびワクチンは、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、または皮下）により、経鼻的に（例えば、吸引により）または経口的に、投与され得る。好ましくは、５２週間にわたって１〜１０用量の間が投与され得る。好ましくは、１ヶ月の間隔で６用量が投与され、そしてブースター（追加）ワクチン接種がその後定期的に与えられ得る。交互のプロトコルが個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与された場合、抗腫瘍免疫応答を促進し得、そして基底（すなわち、未処置）レベルより少なくとも１０〜５０％上である、化合物の量である。このような応答は、患者内の抗腫瘍抗体を測定することによってか、または患者の腫瘍細胞をインビトロで殺傷し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性の生成によってモニターされ得る。このようなワクチンはまた、ワクチン接種されていない患者と比較すると、ワクチン接種された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全もしくは部分的に疾患を有さないか、またはより長く疾患を有さない生存）を導く免疫応答を生じ得るはずである。一般に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主の体重（ｋｇ）あたり、約２５μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量サイズは、患者の大きさで変化するが、代表的には約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【０２７２】
一般に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的および／または予防的利点を提供するのに十分な量の活性化合物を提供する。このような応答は、処置されていない患者と比較して、処置された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全なまたは部分的な、あるいはより長い疾患なしでの生存）を確立することによってモニターされ得る。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答における増加は、一般的に、改善された臨床的結果と関連する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞障害性アッセイまたはサイトカインアッセイを使用して評価され得、これは、処置の前または後に患者から得られるサンプルを使用して行われ得る。
【０２７３】
（癌の検出および診断組成物、方法およびキット）
一般的に、癌は、患者から得られた生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿、および／または腫瘍生検）における１つ以上の肺腫瘍タンパク質および／またはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいてこの患者において検出され得る。言い換えると、このようなタンパク質は、肺癌のような癌の存在または非存在を示すためのマーカーとして使用され得る。さらに、このようなタンパク質は、他の癌の検出のために有用であり得る。本明細書中で提供される結合因子は、一般に、生物学的サンプル中で、この薬剤に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。
【０２７４】
ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、癌の存在または非存在もまた示す、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得る。一般に、腫瘍の配列は、腫瘍が発生するのと同一の型の正常な組織よりも、腫瘍組織において、少なくとも２倍、好ましくは３倍、そしてより好ましくは５倍以上のレベルで存在するはずである。この腫瘍が発生するのとは異なる細胞型の特定の腫瘍配列の発現レベルは、特定の診断実施形態において無関係である。なぜならば、この腫瘍細胞の存在は、同一の型の正常組織における発現レベルに対する、腫瘍組織において予め決定された異なる発現レベル（例えば、２倍、５倍など）の観測により確認され得るからである。
【０２７５】
他の異なる発現パターンは、診断目的のために有利に利用され得る。例えば、本発明の１つの局面において、同一の型だが他の正常組織の型ではない、腫瘍組織および正常組織（例えば、ＰＢＭＣ）における腫瘍配列の過剰発現は、診断的に開発され得る。この場合において、例えば、循環組織部位または腫瘍が発生する組織部位とは異なるいくつかの組織部位から採取されたサンプル中における転移性腫瘍細胞の存在は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、このサンプル中の腫瘍配列の発現を検出することによって同定および／または確認され得る。多くの場合において、目的のサンプル中の腫瘍細胞（例えば、ＰＢＭＣ）を、細胞捕獲（ｃｅｌｌ　ｃａｐｔｕｒｅ）技術または他の類似の技術を使用して、富化することが所望される。
【０２７６】
サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するために結合因子を使用するための、当業者に公知の種々のアッセイ型式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般的に、患者における癌の存在または非存在は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを結合因子と接触させる工程；（ｂ）この結合因子に結合するポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出する工程；および（ｃ）ポリペプチドのレベルと所定のカットオフ値とを比較する工程によって決定され得る。
【０２７７】
好ましい実施形態において、このアッセイは、ポリペプチドに結合するためおよびサンプルの残りからポリペプチドを除くために固体支持体上に固定された結合因子の使用を含む。次いで、結合されたポリペプチドは、レポーター基を含み、結合因子／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出され得る。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体に特異的に結合する結合因子あるいは結合因子に特異的に結合する他の薬剤（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチン）を含み得る。あるいは、競合アッセイが、使用され得、ここで、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そしてサンプルと結合因子のインキュベーション後にその固定された結合因子に結合される。サンプルの成分が、標識ポリペプチドの結合因子への結合を阻害する程度は、サンプルの固定された結合因子との反応性を示す。このようなアッセイにおける使用に適切なポリペプチドは、上記のような、全長肺腫瘍タンパク質および結合因子が結合するそのポリペプチド部分を含む。
【０２７８】
固体支持体は、腫瘍タンパク質が付着され得る当業者に公知の任意の材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートにおける試験ウェルあるいはニトロセルロースまたは他の適切な膜であり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス）、ファイバーグラス、ラテックス、またはプラスチック物質（例えば、ポリスチレン、またはポリ塩化ビニル）であり得る。その支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に記載のような）であり得る。この結合因子は、当業者に公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定され得、これらは特許および科学文献に十分に記載されている。本発明の状況において、用語「固定化」とは、非共有結合的な会合（例えば、吸着）および共有結合的な付着（これは、薬剤と支持体上の官能基との間で直接結合され得るかまたは架橋剤を用いる結合であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートのウェル、または膜への吸着による固定化が好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中で固体支持体を用いて適切な時間量で結合因子に接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度によって変化するが、代表的には、約１時間から約１日の間である。一般的には、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、そして好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合因子とプラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルを接触させることは、適切な量の結合因子を固定化するのに十分である。
【０２７９】
固体支持体への結合因子の共有結合的付着は、一般に、支持体および結合因子上の官能基（例えば、水酸基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と支持体を最初に反応させることによって達成され得る。例えば、この結合因子は、ベンゾキノンを用いるかまたは結合パートナー上のアミンおよび活性水素と支持体上のアルデヒド基との縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、共有結合的に付着され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃａｔａｌｏｇ　ａｎｄ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２−Ａ１３を参照のこと）。
【０２８０】
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。本アッセイは、最初に、固体支持体（一般に、マイクロタイタープレートのウェル）上で固定されている抗体をサンプルに接触させて、その結果、サンプル内のポリペプチドを固定された抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、非結合サンプルは固定されたポリペプチド−抗体複合体から除去され、そして検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体（レポーター基を含む））が添加される。次いで、固体支持体に結合したままである検出試薬の量が、特定のレポーター基に関して適切な方法を用いて決定される。
【０２８１】
より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的にはブロックされる。任意の適切なブロック剤（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））は、当業者に公知である。固定された抗体は次いで、サンプルとインキュベートされ、そしてポリペプチドをこの抗体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。概して、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、肺癌を有する個体から得られたサンプル内のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、この接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡で達成される結合レベルの少なくとも約９５％である結合レベルを達成するのに十分な時間である。当業者は、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。
【０２８２】
次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去される。次いで、レポーター基を含む第２の抗体が固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基は、上記の基を含む。
【０２８３】
次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な量の時間、固定された抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートされる。適切な量の時間は、一般に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、非結合の検出試薬は除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般には、特定の時間の間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。
【０２８４】
癌（例えば、肺癌）の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルが、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施形態において、癌の検出のためのカットオフ値は、固定された抗体を、癌を有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られる平均シグナル値である。概して、所定のカットオフ値を３標準偏差上回るシグナルを生じるサンプルが、癌に対して陽性とみなされる。代替の好ましい実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｂａｓｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｏｗｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｏｒ　Ｃａｒｖｅ）を使用して決定される。簡単に言うと、本実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果についての各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方左手の角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが、癌に対して陽性と見なされる。
【０２８５】
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行される（ここで、結合因子は、ニトロセルロースのような膜上で固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過するにつれて固定された結合因子に結合する。次いで、第２の標識化された結合因子が、この第２の結合因子を含む溶液がその膜を介して流れるにつれて、結合因子−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の結合因子の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、結合因子が結合される膜の一端を、サンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の結合因子を含む領域を通って、そして固定された結合因子の領域まで移動する。固定された抗体の領域での第２の結合因子の濃度が、癌の存在を示す。代表的には、その部位での第２の結合因子の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このようなパターンを示さないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される結合因子の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおける使用に好ましい結合因子は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。
【０２８６】
もちろん、本発明の腫瘍タンパク質または結合因子との使用に適する多数の他のアッセイプロトコルが存在する。上記の記載は、例示であることを意図するにすぎない。例えば、上記プロトコルが、腫瘍ポリペプチドを使用するために容易に改変され得て、生物学的サンプル内でこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出し得ることが当業者に明かである。このような腫瘍タンパク質特異的抗体の検出は、癌の存在と相関し得る。
【０２８７】
癌もまた、あるいは癌は、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法では、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルは、腫瘍ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法によって）患者から単離され得る。Ｔ細胞は、２〜９日間（代表的に４日間）、３７℃にてポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともにインビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立てるために、腫瘍ポリペプチドの非存在下でインキュベートすることが所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して、活性化は好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては、活性化は好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患のない患者におけるよりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルは、患者における癌の存在を示す。
【０２８８】
上記のように、癌もまた、あるいは癌は、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて用いて、生物学的サンプルに由来する腫瘍ｃＤＮＡの一部を増幅し得、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、増幅されたｃＤＮＡが、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を用いて分離され、そして検出される。
【０２８９】
同様に、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いて、生物学的サンプル中でこの腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出し得る。
【０２９０】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さの、本発明の腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記に規定されるような、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に用いられ得るオリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示される配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも１０の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
【０２９１】
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを用い、ＲＴ−ＰＣＲでは、ＰＣＲは、逆転写と組み合わせて適用される。代表的に、ＲＮＡは生物学的サンプル（例えば、生検組織）から抽出され、そして逆転写されてｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生成し、このｃＤＮＡ分子は、例えば、ゲル電気泳動を用いて分離および可視化され得る。増幅は、試験患者および癌に罹患していない個体から採取された生物学的サンプルについて行われ得る。増幅反応は、２桁の大きさに及ぶいくつかのｃＤＮＡ希釈物について行われ得る。試験患者サンプルのいくつかの希釈物における発現の増加が、癌のないサンプルの同一希釈の物と比較して２倍以上である場合、これは、代表的に、陽性とみなされる。
【０２９２】
本発明の別の局面において、細胞捕獲技術は、例えば、リアルタイムＰＣＲと組み合わせて使用されて、肺腫瘍抗原を発現する転移細胞の検出のためのより感度の高いツールを提供し得る。生物学的サンプル（例えば、骨髄サンプル、末梢血、および小針吸引サンプル）における肺癌細胞の検出は、肺癌患者の診断および予後判定に望ましい。
【０２９３】
細胞表面マーカーに対する特異的モノクローナル抗体または４量体抗体複合体でコーティングされた免疫磁性ビーズを用いて、サンプル中の癌細胞を最初に富化し得るか、またはサンプル中の癌細胞をポジティブに選択し得る。種々の市販のキットが用いられ得る。これらのキットとしては、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈ（Ｄｙｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）、ＳｔｅｍＳｅｐＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）、およびＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。当業者は、他の方法論およびキットが用いられて、所望の細胞集団が富化またはポジティブに選択され得ることを認識する。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈは、正常上皮組織および新生物上皮組織上で発現された２つの糖タンパク質膜抗原に特異的なｍＡｂでコーティングされた磁性ビーズを含む。このコーティングされたビーズをサンプルに添加し得、次いで、このサンプルを磁石に接触させ得、それによりこのビーズに結合した細胞を捕獲し得る。所望でない細胞は洗い流され、磁石により単離された細胞は、ビーズから溶出され、さらなる分析において用いられる。
【０２９４】
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐは、血液サンプルから直接細胞を富化するために用いられ得、そして種々の所望でない細胞を標的とし、サンプル中に存在する赤血球（ＲＢＣ）上のグリコホリンＡにそれらを架橋して、ロゼットを形成する４量体の抗体のカクテルからなる。Ｆｉｃｏｌｌ上で遠心分離すると、標的とした細胞は、遊離のＲＢＣとともにペレットを形成する。枯渇カクテルにおける抗体の組み合わせは、どの細胞が除去され、そして結果的にどの細胞が回収されるかを決定する。利用可能な抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩｇＥ、およびＴＣＲαβ。
【０２９５】
さらに、本発明において、肺腫瘍抗原に特異的なｍＡｂが生成され得、そして同様な様式で用いられ得ることが意図される。例えば、腫瘍特異的細胞表面抗原に結合するｍＡｂは、磁性ビーズに結合体化され得るか、または４量体抗体複合体に処方され得、そしてサンプルから転移性の肺腫瘍細胞を富化するか、またはポジティブに選択するために用いられ得る。一旦、サンプルが富化されるか、またはポジティブに選択されると、細胞は溶解され得、そしてＲＮＡが単離され得る。次いで、ＲＮＡは、本明細書中に記載のようにリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて肺腫瘍特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ分析に供され得る。当業者は、富化されたかまたは選択された集団の細胞が他の方法（例えば、インサイチュハイブリダイゼーションまたはフローサイトメトリー）によって分析され得ることを認識する。
【０２９６】
別の実施形態において、本明細書中に記載された組成物は、癌の進行についてのマーカーとして使用され得る。この実施形態において、癌の診断について上記に記載されるようなアッセイは、経時的に実行され得、そして反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化を評価し得る。例えば、このアッセイは、６ケ月〜１年の期間、２４〜７２時間毎に実行され得、そしてその後、必要に応じて実行され得る。一般に、癌は、検出されるこのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが経時的に増大する患者において進行している。対照的に、癌は、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが一定のままであるか、または時間とともに減少するかのいずれかである場合、進行していない。
【０２９７】
特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍上で直接実施され得る。１つのこのようなアッセイは、腫瘍細胞を結合因子と接触させる工程を包含する。次いで、結合された結合因子は、レポーター基によって直接的または間接的に検出され得る。このような結合因子はまた、組織学的な用途において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブは、このような用途において使用され得る。
【０２９８】
上記のように、感度を改善するために、複数の腫瘍タンパク質マーカーは、所定のサンプル内でアッセイされ得る。本明細書中に提供される異なるタンパク質に特異的な結合因子が単一のアッセイにおいて組み合わせられ得ることは明かである。さらに、複数のプライマーまたはプローブが同時に用いられ得る。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、最適な感度をもたらす組み合わせを決定する慣用実験に基づき得る。さらに、または代替として、本明細書中に提供される腫瘍タンパク質のアッセイは、他の公知の腫瘍抗原に対するアッセイと組み合わせられ得る。
【０２９９】
本発明はさらに、上記の診断方法のうちのいずれかにおいて使用するためのキットを提供する。このようなキットは代表的に、診断アッセイを行うのに必要な２以上の構成要素を備える。構成要素は、化合物、試薬、容器および／または器具であり得る。例えば、キット内の１つの容器は、腫瘍タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のように支持体材料に付着されて提供され得る。１以上のさらなる容器は、アッセイにおいて使用される要素（例えば、試薬または緩衝液）を封入し得る。このようなキットもまた、あるいはこのようなキットは、抗体結合の直接的または間接的な検出に適切なレポーター基を含む上記のような検出試薬を備え得る。
【０３００】
あるいは、キットは、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出するように設計され得る。このようなキットは一般に、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、上記のような、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーを備える。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いられ得る。このようなキット内に存在し得るさらなる構成要素としては、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にする、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬もしくは容器が挙げられる。
【０３０１】
以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のためではない。
【０３０２】
（実施例１）
（肺腫瘍ｃＤＮＡの同定および特徴付け）
本実施例は、肺腫瘍タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の同定を説明する。
【０３０３】
（Ａ．従来のｃＤＮＡライブラリーサブトラクションを使用する、肺腺癌ライブラリーからのｃＤＮＡ配列の単離）
ヒト肺腺癌ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇキット（ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して製造業者のプロトコールに従って、患者組織（＃４００３１４８６）由来のポリＡ＋ＲＮＡから構築した。詳細には、肺癌腫組織を、ポリトロン（ｐｏｌｙｔｒｏｎ；Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で均質化し、そして全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して製造業者の指示に従って抽出した。次いで、ポリＡ＋ＲＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されているように、オリゴｄＴセルロースカラムを使用して精製した。１本鎖のｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ／Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ１８プライマーを使用して合成した。２本鎖のｃＤＮＡを合成し、ＢｓｔＸＩ／ＥｃｏＲＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と連結し、そしてＮｏｔＩで消化した。ｃＤＮＡサイズ分画カラム（ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのサイズ分画後、ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｓｔＸＩ／ＮｏｔＩ部位に連結し、そしてエレクトロポレーションによってＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ１０Ｂ細胞（ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。全部で３×１０６個の独立コロニーを生成させた。
【０３０４】
同じ手順を使用して、正常なヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーを、肺、肝臓、膵臓、皮膚、腎臓、脳、および休止ＰＢＭＣを含む正常な組織標本のパネルから調製した。
【０３０５】
ｃＤＮＡライブラリーサブトラクションを、いくつかの改変を用いてＨａｒａら（Ｂｌｏｏｄ、８４：１８９−１９９、１９９４）に記載されているように、肺腺癌および正常組織のｃＤＮＡライブラリーを使用して行った。詳細には、肺腺癌特異的サブトラクトｃＤＮＡライブラリーを、以下のように作成した。正常組織のｃＤＮＡライブラリー（８０μｇ）を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、続いてＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントでのフィルイン反応を行った。フェノール−クロロホルム抽出、およびエタノール沈殿後、ＤＮＡを１３３μｌのＨ２Ｏ中に溶解させ、熱変性させ、そして１３３μｌ（１３３μｇ）のＰｈｏｔｏｐｒｏｂｅビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と混合した。製造業者によって推奨されているように、得られた混合物を２７０Ｗの太陽灯で２０分間、氷上で照射した。さらにＰｈｏｔｏｐｒｏｂｅビオチン（６７μｌ）を添加し、そしてビオチニル化反応を繰り返した。５倍のブタノールでの抽出後、ＤＮＡをエタノール沈殿させ、そして２３μｌのＨ２Ｏ中に溶解させた。得られたＤＮＡ、および以前の肺サブトラクションにおいて頻繁に回収された他の非常に豊富なｃＤＮＡクローンによって、ドライバーＤＮＡを形成した。
【０３０６】
トレーサーＤＮＡを形成するために、１０μｇの肺腺癌ｃＤＮＡライブラリーを、ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩで消化し、フェノールクロロホルムで抽出し、そしてＣｈｒｏｍａ　ｓｐｉｎ−４００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）を通過させた。典型的には、５μｇのｃＤＮＡをカラムのサイジング後に回収した。エタノール沈殿後、トレーサーＤＮＡを５μｌのＨ２Ｏ中に溶解させた。トレーサーＤＮＡを、１５μｌのドライバーＤＮＡおよび２０μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（１．５ＭのＮａＣｌ／１０ｍＭのＥＤＴＡ／５０ｍＭのＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５／０．２％のドデシル硫酸ナトリウム）と混合し、ミネラルオイルで重層し、そして完全に熱変性させた。サンプルを、すぐに６８℃の水浴に移し、そして２０時間インキュベートした（長いハイブリダイゼーション［ＬＨ］）。次いで、反応混合物をストレプトアビジン処理、続いてフェノール／クロロホルム抽出に供した。このプロセスをさらに３回繰り返した。サブトラクトＤＮＡを沈殿させ、１２μｌのＨ２Ｏ中に溶解させ、８μｌのドライバーＤＮＡおよび２０μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、そして６８℃で２時間の間、６８℃でハイブリダイゼーションに供した（短いハイブリダイゼーション［ＳＨ］）。ビオチニル化した２本鎖ＤＮＡの除去後、サブトラクトｃＤＮＡを、クロラムフェニコール耐性ｐＢＣＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＮｏｔＩ／ＳｐｅＩ部位に連結し、そしてエレクトロポレーションによってＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ１０Ｂ細胞中に形質転換して、ＬＡＴ−Ｓ１と呼ぶ肺腺癌特異的サブトラクトｃＤＮＡライブラリーを作成した。同様に、ＬＡＴ−Ｓ２を、さらなるドライバーとして、トレーサー中に過剰発現される２３個の遺伝子を含むことによって、作成した。
【０３０７】
第２のヒト肺腺癌ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、第２の患者（＃８６−６６）由来の腺癌組織を使用して構築し、そして正常組織の同じパネルおよびＬＡＴ−Ｓ１中で過剰発現されるさらなる遺伝子を使用して、上記のように、第２の肺腺癌特異的サブトラクトｃＤＮＡライブラリー（ＬＡＴ２−Ｓ２と呼ぶ）を調製するために使用した。
【０３０８】
第３のヒト転移性肺腺癌ライブラリーを、肺および胃の腺癌に起源する２つの肺胸膜滲出液のプールから構築した。サブトラクトｃＤＮＡライブラリー（Ｍｅｔｓ−ｓｕｂ２と呼ぶ）を、正常組織の同じパネルを使用して上記のように作成した。Ｍｅｔｓ−ｓｕｂ３サブトラクトライブラリーを、ドライバーとして５１個のさらなる遺伝子を含むことによって構築した。これらの５１個の遺伝子を、テスター中に過剰発現されるハウスキーピング（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ）遺伝子を提示するＭｅｔｓ−ｓｕｂ２中に回収した。
【０３０９】
上記の、ＬＡＴ−Ｓ１から単離した全部で１６個のｃＤＮＡフラグメント、ＬＡＴ−Ｓ２から単離した５８５個のｃＤＮＡフラグメント、ＬＡＴ２−Ｓ２に由来する５６８個のｃＤＮＡクローン、Ｍｅｔｓ−ｓｕｂ２に由来する１５個のｃＤＮＡクローン、およびＭｅｔｓ−ｓｕｂ３に由来する３４３個のｃＤＮＡクローンを、コロニーＰＣＲで増幅し、そして肺腫瘍、正常な肺、ならびに種々の他の正常組織および腫瘍組織中でのそれらのｍＲＮＡの発現レベルを、マイクロアレイ技術（Ｉｎｃｙｔｅ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して決定した。簡潔には、ＰＣＲ増幅産物を、それぞれの産物がアレイ中の特有の位置を占有するアレイ形式でスライド上に点在させた。ｍＲＮＡを、試験する組織サンプルから抽出し、逆転写し、そして蛍光標識したｃＤＮＡプローブを生成した。マイクロアレイを標識したｃＤＮＡプローブでプローブし、スライドをスキャンし、そして蛍光強度を測定した。この強度は、ハイブリダイゼーション強度と相関する。７３個の豊富ではないｃＤＮＡクローン（そのうちの４２が固有であることを見出した）は、肺腫瘍中で過剰発現を示し、試験した正常組織（肺、皮膚、リンパ節、結腸、肝臓、膵臓、乳房、心臓、骨髄、大腸、腎臓、胃、脳、小腸、膀胱、および唾液腺）中での発現は検出不可能であるか、または肺腺癌腫瘍と比較して有意に低いレベルのいずれかであった。これらのクローンをさらに、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｄｉｖｉｓｏｎ　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　３７３Ａおよび／またはＭｏｄｅｌ　３７７（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いるＤＮＡ配列決定によって特徴付けた。
【０３１０】
配列を、ＥＭＢＬ　ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｒｅｌｅａｓｅ　９６）を使用して遺伝子バンク中の既知の配列と比較した。配列番号６７に提供する配列に対しては有意な相同性は見られず、以前に同定された発現された配列タグ（ＥＳＴ）に対する明らかな相同性はなかった。配列番号６０、６２、６５、６６、６９〜７１、７４、７６、７９、８０、８４、８６、８９〜９２、９５、９７、および９８の配列が、以前に同定された発現された配列タグ（ＥＳＴ）に対していくらかの相同性を示すことを見出した。配列番号５９、６１、６３、６４、６７、６８、７２、７３、７５、７７、７８、８１〜８３、８５、８７、８８、９３、９４、９６、９９、および１００のｃＤＮＡ配列は、以前に同定された遺伝子に対して相同性を示した。配列番号９６および１００のクローンの全長のｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号３１６および３１８に提供する。配列番号５９、６１、６３、６４、６８、７３、８２、８３、９４、９６、および１００のクローンのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３３１、３２８、３２９、３３２、３２７、３３３、３３０、３２６、３２５、３２４、および３３５に提供する。配列番号６９の配列（Ｌ５５２Ｓと呼ぶ）によってコードされるアミノ酸配列を、配列番号７８６に提供する。
【０３１１】
さらなる研究によって、Ｌ５５２Ｓ（配列番号７９０）の延長したｃＤＮＡ配列およびオープンリーディングフレームの単離を導いた。配列番号７９０のｃＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を、配列番号７９１に提供する。続く研究によって、Ｌ５５２Ｓの全長のｃＤＮＡ配列の単離を導いた（配列番号８０８）。Ｌ５５２Ｓの全長のｃＤＮＡ配列は、４８０塩基対のオープンリーディングフレーム（配列番号７９０）を有し、そして１６０個のアミノ酸の推定のポリペプチド（配列番号８０９）をコードする。
【０３１２】
最初のデータベース検索は、データベース中のタンパク質と相同である任意の配列を検出することができず、Ｌ５５２Ｓが未知の機能の新規のタンパク質をコードすることを示唆している。最近、精巣癌抗原ＸＡＧＥ−１が、ユーイング肉腫（Ｅｗｉｎｇ’ｓ　ｓａｒｃｏｍａ）中で過剰発現されることが見出された（Ｌｉｕら、２０００　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．６０：４７５２−４７５５）。ＸＡＧＥ−１の決定されたｃＤＮＡ配列を配列番号７９２に提供し、対応するアミノ酸配列を配列番号７９３に提供する。Ｌ５５２ＳとＸＡＧＥ−１との配列比較は、顕著な同一性ならびに差異を明らかにする。Ｃ末端配列の大部分は互いに同一である。Ｌ５５２ＳとＸＡＧＥ−１から推定されるポリペプチドは、異なるＮ末端配列を有する。Ｌ５５２Ｓアミノ酸の親水性分析は、推定される膜貫通ドメインを有さない極めて親水性であるタンパク質を示唆した。Ｌ５５２ＳのＰＳＯＲＴ分析は同じ結果を明らかにした。Ｌ５５２ＳもまたＸ番染色体中に配置されるので、これはおそらく、精巣癌抗原ＸＡＧＥ−１の新しいイソ型である。遺伝子配列分析は、両方の遺伝子がＸ番染色体の同じ領域に配置され、そして両方ともが４個のエキソンを有することを明らかにした。後ろの３個のエキソンは、Ｌ５５２ＳおよびＸＡＧＥ−１について同一である。しかし、ＸＡＧＥ−１についての第１のエキソンは、Ｌ５５２Ｓについての第１のエキソンの上流に存在し、そしてこれによって、Ｌ５５２ＳおよびＸＡＧＥ−１の異なる５’ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を生じる。従って、Ｌ５５２ＳおよびＸＡＧＥ−１は代替的にスプライシングされるアイソタイプである。
【０３１３】
Ｌ５５２ＳのこのＮ末端部分のアミノ酸配列を配列番号１８３０に提供し、対応するｃＤＮＡ配列を配列番号１８２６に提供する。配列番号１８２７〜１８２９に提供するｃＤＮＡ配列は、配列番号８０８のｂｐ　３９４〜６８１、配列番号８０８のｂｐ３９４〜５３４、および配列番号７９２のｂｐ２１４〜３９４をそれぞれ示す。対応するアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１８３１〜１８３３に提供する。
【０３１４】
Ｌ５５２Ｓについて全長をクローニングする試みによって、転移性肺癌腫ライブラリーからの３個のさらなるｃＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号８１０〜８１２；クローン５０９８９、５０９９０、および５０９９２と呼ぶ）の単離を導いた。配列番号８１０の配列が、以前に同定されたヒトＤＮＡ配列のいくらかの相同性を示すことを見出した。配列番号８１１の配列が、以前に同定されたＤＮＡ配列といくらかの相同性を示すことを見出した。配列番号８１２の配列が、以前に同定されたＥＳＴといくらか相同性を示すことを見出した。
【０３１５】
配列番号８４（Ｌ５５１Ｓと呼ぶ）の遺伝子が、９個の原発性腺癌のうちの２個において過剰発現され、そして２個の転移性腺癌のうちの２個および２個の扁平上皮細胞癌のうちの１個において低いレベルで発現されることを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＴ分析によって決定した。正常な胃中での非常に低い発現を除いて、正常な組織中では発現は観察されなかった。Ｌ５５１Ｓについてのさらなる研究によって、配列番号８０１および８０２にそれぞれ提供する、５’および３’ｃＤＮＡコンセンサス配列の単離を導いた。Ｌ５５１Ｓの５’配列が、以前に同定された遺伝子ＳＴＹ８（配列番号８０３に提供するｃＤＮＡ配列；対応するアミノ酸配列を配列番号８０５に提供する）（これは、有糸分裂促進因子活性化プロテインキナーゼホスファターゼである）に対していくらかの相同性を示すことを見出した。しかし、Ｌ５５１Ｓの３’配列に対しては、有意な相同性は見出せなかった。続いて、Ｌ５５１Ｓについての延長したｃＤＮＡ配列を単離した（配列番号８０４）。対応するアミノ酸配列を、配列番号８０６に提供する。さらなる研究によって、Ｌ５５１Ｓの２つの独立した全長クローンの単離を導いた（５４２９８および５４３０５と呼ぶ）。これらの２つのクローンは、ＳＴＹ８　ＤＮＡ配列と比較して５個のヌクレオチドの差異を有する。これらの差異のうちの２つは、単一のヌクレオチド多形性である。これはコードされるアミノ酸配列には影響を与えない。他の３個のヌクレオチドの差異は、２つのＬ５５１Ｓクローンの間で一致するが、ＳＴＹ８タンパク質配列とは異なるコードされるアミノ酸配列を導く。Ｌ５５１Ｓの全長クローン５４３０５および５４２９８について決定したｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号８２５および８２６に提供し、Ｌ５５１Ｓのアミノ酸配列を配列番号８２７に提供する。
【０３１６】
（Ｂ．ＰＣＲに基づくｃＤＮＡライブラリーサブトラクションを使用する、肺腺癌ライブラリーからのｃＤＮＡ配列の単離）
皮膚、結腸、肺、食道、脳、腎臓、脾臓、膵臓、および肝臓を含む９個の正常なヒト組織のｃＤＮＡのプールに対してサブトラクトした２つのヒト肺原発性腺癌のプール由来のｃＤＮＡを含有している、サブトラクトライブラリー由来のｃＤＮＡクローン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、初回のＰＣＲ増幅に供した。このライブラリー（ＡＬＴ−１と呼ぶ）を、製造業者のプロトコールに従って２回目のＰＣＲ増幅に供した。肺腫瘍、正常な肺、ならびに種々の他の正常組織および腫瘍組織中の７６０個のｃＤＮＡクローンの発現レベルを、上記のようなマイクロアレイ技術を使用して試験した。全部で１１８個のクローン（そのうちの５５個が固有であった）が、肺腫瘍組織中で過剰発現され、試験した正常組織（肺、皮膚、リンパ節、結腸、肝臓、膵臓、乳房、心臓、骨髄、大腸、腎臓、胃、脳、小腸、膀胱、および唾液腺）中での発現は検出不可能であるかまたは有意に低いレベルで発現されるかのいずれかであることを見出した。配列を、ＥＭＢＬおよびＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｒｅｌｅａｓｅ　９６）を使用して遺伝子バンク中の既知の配列と比較した。配列番号４４に提供する配列に対する有意な相同性（ＥＳＴを含む）は見出せなかった。配列番号１、１１、１３、１５、２０、２３〜２７、２９、３０、３３、３４、３９、４１、４３、４５、４６、５１、および５７の配列が、以前に同定された発現された配列タグ（ＥＳＴ）に対していくらかの相同性を示すことを見出した。配列番号２〜１０、１２、１４、１６〜１９、２１、２２、２８、３１、３２、３５〜３８、４０、４２、４４、４７〜５０、５２〜５６、および５８のｃＤＮＡ配列は、以前に同定された遺伝子に対する相同性を示した。配列番号１８、２２、３１、３５、３６、および４２のクローンの全長のｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号３２０、３１９、３２３、３２１、３１７、３２１、および３２２に提供し、対応するアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３３７、３３６、３４０、３３８、３３４、および３３９に提供する。
【０３１７】
さらなる研究によって、配列番号３３のクローンについての延長したｃＤＮＡ配列（Ｌ８０１Ｐと呼ぶ）の単離を導いた。この延長したｃＤＮＡ配列（配列番号７９６に提供する）が、３個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む可能性があることを見出した。これらの３個のＯＲＦによってコードされる推定のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７９７〜７９９に提供する。全長をクローニングするさらなる努力によって、配列番号１６６９に示す、Ｌ８０１Ｐのさらに延長されたｃＤＮＡ配列、延長されたｃＤＮＡ配列によってコードされるさらなる５個の可能性のあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ　４〜９と呼ぶ；それぞれ、配列番号１６７０〜１６７５）を導いた。Ｌ８０１Ｐを、染色体領域２０ｐ１３にマップし、そしてＯＲＦ４に対応するこの遺伝子領域による１３７アミノ酸のＯＲＦを同定した（配列番号１６７０）。このことは、これがおそらくＬ８０１Ｐの確実なＯＲＦであることを示唆している。
【０３１８】
マイクロアレイ分析によって、Ｌ８０１Ｐが、正常組織と比較して、肺腫瘍組織中で２倍またはそれ以上過剰発現されることを見出した。リアルタイムＰＣＲ分析によると、肺腺癌の５０％より多く、および試験した肺扁平上皮細胞性癌腫腫瘍サンプルの３０％より多くが、正常な肺組織と比較して上昇したＬ８０１Ｐの発現を有した。上昇したＬ８０１Ｐを示したこれらのうちでは、発現レベルは、正常な肺組織サンプル中よりも１０倍以上大きかった。さらに、Ｌ８０１Ｐの低い発現または発現がないことを、正常組織のＲＮＡの大量のパネルにおいて検出した。
【０３１９】
Ｌ８０１Ｐの発現をまた、乳房、前立腺、卵巣、および結腸の腫瘍を含む多数の他の腫瘍型において検出し、従って、Ｌ８０１Ｐの発現は、これらの型の癌における診断および／または治療上の有用性を有し得る。
【０３２０】
続く研究において、配列番号４４のクローン（Ｌ８４４Ｐと呼ぶ）の全長のｃＤＮＡ配列を単離した（配列番号８００に提供する）。この配列の公開されているデータベース中の配列との比較によって、配列の５’末端の４７０塩基が、既知の遺伝子ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼに対して相同性を示すことを明らかにした。従って、このことは、Ｌ８８４Ｐが以前に同定された３’非翻訳領域の２００７塩基対を有しているジヒドロジオールデヒドロゲナーゼファミリーの新規の転写物であることを示している。
【０３２１】
配列番号４６の配列（Ｌ８４０Ｐと呼ぶ）によってコードされる推定されるアミノ酸配列を、配列番号７８７に提供する。Ｌ８４０Ｐについての延長したｃＤＮＡ配列（これは、オープンリーディングフレームを含むと決定した）を配列番号７９４に提供する。配列番号７９４のｃＤＮＡ配列によってコードされる推定されたアミノ酸配列を、配列番号７９５に提供する。配列番号５４のクローン（Ｌ５４８Ｓと呼ぶ）についての全長のｃＤＮＡ配列を、配列番号７８８に提供し、対応するアミノ酸配列を配列番号７８９に提供する。
【０３２２】
配列番号２５および４６の遺伝子（それぞれ、Ｌ８３９ＰおよびＬ８４０Ｐと呼ぶ）のノーザンブロット分析は顕著に類似していた。両方の遺伝子は、２個の肺腺癌のうちの１個において、３．６ｋｂおよび１．６ｋｂの２つのバンドとして発現された。Ｌ８３９Ｐの発現は、正常な肺または気管では観察されなかった。Ｌ８４０Ｐの発現は、正常な骨髄、休止ＰＢＭＣまたは活性化ＰＢＭＣ、食道、あるいは正常な肺では観察されなかった。同様の発現パターンを仮定すると、Ｌ８３９ＰおよびＬ８４０Ｐは同じ遺伝子に由来し得る。
【０３２３】
さらなる肺腺癌ｃＤＮＡクローンを、以下のように単離した。ｃＤＮＡライブラリーを、２つの肺腺癌のプールから調製し、そして肺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、心臓、および脾臓を含む正常組織のパネル由来のｃＤＮＡに対してサブトラクトした。サブトラクションを、より大きなフラグメントを作成するように改変したＰＣＲに基づくプロトコール（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して行った。このプロトコールにおいては、テスターおよびドライバーの２本鎖ｃＤＮＡを、６ヌクレオチドの制限部位（ＭｌｕＩ、ＭｓｃＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｌＩ、およびＳｔｕＩ）を認識する５個の制限酵素で別々に消化した。この消化によって、Ｃｌｏｎｔｅｃｈプロトコールに従うＲｓａＩでの消化によって生じる平均３００ｂｐの大きさのｃＤＮＡではなく、平均６００ｂｐのｃＤＮＡの大きさを生じた。制限消化したテスターｃＤＮＡの末端をフィルインしてアダプターの連結のための平滑末端を作成した。この改変は、サブトラクションの効率には影響を与えなかった。次いで、２つのテスターの集団を異なるアダプターを用いて作成し、そしてドライバーのライブラリーはアダプターを有さないままにした。次いで、テスターおよびドライバーのライブラリーを過剰なドライバーｃＤＮＡを使用してハイブリダイズさせた。最初のハイブリダイゼーション工程においては、ドライバーを、２つのテスターｃＤＮＡの集団のそれぞれと別々にハイブリダイズさせた。これによって、（ａ）ハイブリダイズしていないテスターｃＤＮＡ、（ｂ）他のテスターｃＤＮＡにハイブリダイズしたテスターｃＤＮＡ、（ｃ）ドライバーｃＤＮＡにハイブリダイズしたテスターｃＤＮＡ、および（ｄ）ハイブリダイズしていないドライバーｃＤＮＡの集団を生じた。次いで、２つの別々のハイブリダイゼーション反応物を混合し、そしてさらなる変性させたドライバーｃＤＮＡの存在下で再度ハイブリダイズさせた。この２回目のハイブリダイゼーション後、集団（ａ）から（ｄ）に加えて、１つのアダプターを有するテスターｃＤＮＡが第２のアダプターを有するテスターｃＤＮＡにハイブリダイズした第５の集団（ｅ）を作成した。従って、第２のハイブリダイゼーション工程によって、アダプター特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として使用され得る、異なって発現される配列の富化を生じた。
【０３２４】
次いで、末端をフィルインし、そしてＰＣＲ増幅を、アダプター特異的プライマーを使用して行った。ドライバーｃＤＮＡにハイブリダイズしていないテスターｃＤＮＡを含む集団（ｅ）だけが、指数関数的に増幅した。次いで、第２回目のＰＣＲ増幅工程を行って、バックグラウンドを減少させ、そして異なって発現された配列をさらに富化させた。
【０３２５】
５７個のｃＤＮＡクローンをサブトラクトライブラリー（ＬＡＰ１と呼ぶ）から単離し、そして配列決定した。これらのクローンのうちの１６個について決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１０１〜１１６に提供する。配列番号１０１および１１４の配列は、以前に同定された配列に対して有意な相同性は示さなかった。配列番号１０２〜１０９および１１２の配列は、以前に同定された配列に対していくらかの類似性を示し、一方、配列番号１１３、１１５、および１１６の配列は、以前に同定されたＥＳＴに対していくらかの類似性を示した。
【０３２６】
ＬＡＰ１ライブラリーから分析したさらなる５０２個のクローンを配列決定し、そして決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号８２８〜１２３９および１５６４〜１６５３に示す。
【０３２７】
（Ｃ．ＰＣＲに基づくｃＤＮＡライブラリーサブトラクションを使用する、小細胞性肺癌腫ライブラリーからのｃＤＮＡ配列の単離）
小細胞性肺癌腫のサブトラクトｃＤＮＡライブラリー（ＳＣＬ１と呼ぶ）を、本質的には、上記の改変したＰＣＲに基づくサブトラクションプロセスを使用して調製した。小細胞性肺癌腫由来のｃＤＮＡを、正常な肺、脳、腎臓、肝臓、膵臓、皮膚、心臓、リンパ節、および脾臓を含む正常組織のパネル由来のｃＤＮＡに対してサブトラクトした。テスターおよびドライバーの両方のポリＡ＋ＲＮＡを、最初に、ＳＭＡＲＴ　ＰＣＲ　ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して増幅した。テスターおよびドライバーの２本鎖ｃＤＮＡを５個の制限酵素（ＤｒａＩ、ＭｓｃＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｍａＩ、およびＳｔｕＩ）で別々に消化した。これらの制限酵素は平滑な末端切断を作成し、そして消化によって６００ｂｐの平均の挿入物の大きさを生じた。このセットの制限酵素での消化によって、ｃＤＮＡ末端をフィルインすることによる平滑末端を作成するために必要とされる工程を排除した。これらの改変は、サブトラクションの効率には影響を与えなかった。
【０３２８】
８５個のクローンを単離し、そして配列決定した。これらのクローンのうちの３１個についての決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１１７〜１４７に提供する。配列番号１２２、１２４、１２６、１２７、１３０、１３１、１３３、１３６、１３９、および１４７の配列は、以前に同定された配列に対して有意な相同性は示さなかった。配列番号１２０、１２９、１３５、１３７、１４０、１４２、１４４、および１４５の配列は、以前に同定された遺伝子配列に対していくらかの類似性を示し、一方、配列番号１１４、１１８、１１９、１２１、１２３、１２５、１２８、１３２、１３４、１３８、１４１、１４３、および１４７の配列は、以前に単離されたＥＳＴに対していくらかの類似性を示した。
【０３２９】
さらなる研究において、３個のさらなるｃＤＮＡライブラリーを、９個の正常組織（肺、脳、腎臓、肝臓、膵臓、皮膚、心臓、唾液腺、および脾臓）由来のポリＡ＋ＲＮＡのプールに対してサブトラクトした単一の小細胞性肺腺癌サンプル由来のポリＡ＋ＲＮＡより作成した。第１のライブラリー（ＳＣＬ２と呼ぶ）については、サブトラクションを、テスターおよびドライバーをＰｖｕＩＩ、ＳｔｕＩ、ＭｓｃＩおよびＤｒａＩで消化したことを除いて、本質的にはＬＡＰ１ライブラリーについての上記のように行った。使用したテスターｃＤＮＡとドライバーｃＤＮＡとの比は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって推奨されている通りであった。第２のライブラリー（ＳＣＬ３と呼ぶ）については、サブトラクションを、ＳＣＬ２ライブラリーから同定した非常に豊富なクローンのｃＤＮＡをドライバーｃＤＮＡ中に含んだことを除いて、本質的にはＳＣＬ２と同様に行った。ＳＣＬ４ライブラリーの構築を、テスターに対するドライバーのより高い比を使用したことを除いて、本質的にはＳＣＬ３ライブラリーについて記載したように行った。
【０３３０】
それぞれのライブラリーを、ＤＮＡ配列決定およびデータベース分析によって特徴付けた。ＳＣＬ２ライブラリーから単離した３５個のクローンについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号２４５〜２７９に提供し、ＳＣＬ３ライブラリーから単離した２１個のクローンについて決定したｃＤＮＡ配列、およびＳＣＬ４ライブラリーから単離した１５個のクローンについて決定したｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号２８０〜３００および３０１〜３１５に提供する。配列番号２４６、２５４、２６１、２６２、３０４、３０９、および３１１の配列は、以前に同定された配列に対して有意な相同性を示さなかった。配列番号２４５、２４８、２５５、２６６、２７０、２７５、２８０、２８２、２８３、２８８〜２９０、２９２、２９５、３０１、および３０３の配列は、以前に単離されたＥＳＴに対したいくらかの相同性を示し、一方、配列番号２４７、２４９〜２５３、２５６〜２６０、２６３〜２６５、２６７〜２６９、２７１〜２７４、２７６〜２７９、２８１、２８４〜２８７、２９１、２９３、２９４、２９６〜３００、３０２、３０５〜３０８、３１０、および３１２〜３１５の配列は、以前に同定された遺伝子配列に対していくらかの相同性を示した。
【０３３１】
本明細書中に開示する配列を、マイクロアレイ分析によって特異的腫瘍組織中での過剰発現についてさらに（ｆｉｒｔｊｅｒ）評価した。このアプローチを使用して、ｃＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅し、そして腫瘍および正常組織中でのそれらのｍＲＮＡ発現プロフィールを、本質的には記載されているようにｃＤＮＡマイクロアレイ技術を使用して試験した（Ｓｈｅｎａ，Ｍ．ら、１９９５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：４７６〜７０）。簡潔には、クローンを複数のレプリカとして、ガラススライド上に並べた。それぞれの位置は固有のｃＤＮＡクローンに対応する（５５００個程度の多くのクローンを１つのスライドまたはチップ上に並べることができる）。それぞれのチップを、Ｃｙ３およびＣｙ５で蛍光標識したｃＤＮＡプローブの対と、それぞれハイブリダイズさせる。典型的には、１μｇのポリＡ＋ＲＮＡを、それぞれのｃＤＮＡプローブを作成するために使用した。ハイブリダイゼーション後、チップをスキャンし、そしてＣｙ３およびＣｙ５チャンネルの両方についての蛍光強度を記録した。複数の内部品質管理（ｂｕｉｌｔ−ｉｎ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ）工程が存在した。第１に、プローブの品質を、偏在して発現される遺伝子のパネルを使用してモニターした。第２に、対照プレートもまた、酵母ＤＮＡフラグメントを含み得る。酵母ＤＮＡフラグメントの相補性ＤＮＡは、プローブの品質および分析の感度を測定するためのプローブ合成をスパイクし得る。一般に、この技術は、ｍＲＮＡの１００，０００コピー分の１の感度を提供する。最後に、この技術の再現性は、種々の位置に２連の対照ｃＤＮＡ成分を含むことによって確実にされ得る。
【０３３２】
３個のＰＣＲに基づくサブトラクトｃＤＮＡライブラリー由来の３２６４個のｃＤＮＡクローンを、上記のｃＤＮＡマイクロアレイ技術によって分析した。ｃＤＮＡクローンを、Ｌｕｎｇ　Ｃｈｉｐ　５上に並べた。これらのｃＤＮＡクローンのうち、９６０個のクローンがＳＱＬ１ライブラリー由来であり、７６８個のクローンがＳＣＬ１ライブラリー由来であり、そして１５３６個のクローンがＳＣＬ３およびＳＣＬ４ライブラリー由来であった。蛍光標識したｃＤＮＡプローブの３５個の対を、マイクロアレイ分析に使用した。それぞれのプローブの対は、正常組織プローブと対にした肺腫瘍プローブを含んだ。発現データを分析した。４９８個のｃＤＮＡクローンが、正常組織のプローブ群と比較して、小細胞性および／または非小細胞性肺腫瘍プローブ群において２倍またはそれよりも大きく過剰発現されることを見出した。また、正常組織中でのこれらのクローンの平均の発現値は、０．１未満であった（発現の範囲は、０．００１から１０まで）。配列番号１２４０〜１５６３に開示したｃＤＮＡ配列は、３２４個の豊富ではないクローンを示す。
【０３３３】
以下の配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎｅＳｅｑを含むデータベース分析に基づくと新規であった：配列番号１２４０、１２４３、１２４７、１２６９、１２７２、１２８０、１２８３、１２８５、１２８６、１２８９、１３００、１３０９、１３１８、１３１９、１３２７、１３３５、１３３９、１３４６、１３５９、１３６９、１３７０、１３７１、１３９３、１３９８、１４０５、１４０８、１４１３、１４１４、１４１７、１４２２、１４２９、１４３２、１４３５、１４３６、１４３８〜１４４２、１４４７、１４５０、１４５３、１４６３、１４６７、１４７０、１４７３、１４７５、１４８２、１４８６、１４９１〜１４９４、１５０１、１５０５、１５０６、１５１４〜１５１７、１５２０、１５２２、１５２４、１５３５、１５３８、１５４２、１５４３、１５４７、１５５４、１５５７、１５５９、１５６１、および１５６３。
【０３３４】
コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）１３９（配列番号１４６７）の一部の配列の延長したｃＤＮＡ配列（Ｌ９８５Ｐとしてもまた公知）を、問い合わせ配列として配列番号１４６７を使用して公開されているデータベースを検索することによって推定した。このアプローチによって、配列番号１４６７が、細胞表面免疫調節因子−２（ＣＳＩＭＭ−２）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１６７６）に対して相同性を有することを見出した。配列番号１６７６のｃＤＮＡ配列は、配列番号１６７７に示す配列を有しているタンパク質をコードする。
【０３３５】
マイクロアレイ分析によると、Ｌ９８５Ｐは、正常組織のプローブ群と比較して、肺腫瘍プローブ群において２倍またはそれより大きく過剰発現された。さらに、正常組織中でのＬ９８５Ｐの平均の発現値は、０．２未満であった（発現の範囲は、０．０１から１０であった）。リアルタイムＰＣＲ分析によると、試験した小細胞性肺癌腫肺腫瘍サンプルの４０％以上が、正常な肺組織と比較して増大したＬ９８５Ｐの発現を有した。増大したＬ９８５Ｐを示したこれらについて、発現レベルは、正常な肺組織サンプル中よりも３倍以上高かった。Ｌ９８５Ｐの低い発現または発現がないことを、正常組織のＲＮＡの大量のパネル中で検出した。Ｌ９８５Ｐについてのこれらの知見は、患者における肺癌の存在を検出するための診断マーカーとして、および／または肺癌の処置のための免疫治療用の標的としての両方のその用途を支持する。
【０３３６】
（Ｄ．ＰＣＲに基づくｃＤＮＡライブラリーサブトラクションを使用する、神経内分泌ライブラリーからのｃＤＮＡ配列の単離）
改変したＰＣＲに基づくサブトラクションプロセスを使用して、本質的には、ＬＡＰ１サブトラクトライブラリーについて上記のように、サブトラクトｃＤＮＡライブラリー（ＭＬＮ１と呼ぶ）を、正常な肺、脳、腎臓、肝臓、膵臓、皮膚、心臓、リンパ節、および脾臓を含む９個の正常組織のパネルを用いるサブトラクションによって、下方気管竜骨リンパ節（ｓｕｂｃａｒｉｎａｌ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ）に転移した肺神経内分泌癌腫から誘導した。
【０３３７】
９１個の独立クローンを単離し、そして配列決定した。これらのクローンの５８個について決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１４７〜２２２に提供する。配列番号１５０、１５１、１５４、１５７、１５８、１５９、１６０、１６３、１７４、１７５、１７８、１８６〜１９０、１９２、１９３、１９５〜２００、２０８〜２１０、２１２〜２１５、および２２０の配列は、以前に同定された配列に対して有意な相同性は示さなかった。配列番号１５２、１５５、１５６、１６１、１６５、１６６、１７６、１７９、１８２、１８４、１８５、１９１、１９４、２２１、およ２２２の配列は、以前に同定された遺伝子配列に対していくらかの類似性を示し、一方、配列番号１４８、１４９、１５３、１６４、１６７〜１７３、１７７、１８０、１８１、１８３、２０１〜２０７、２１１、および２１６〜２１９の配列は、以前に単離されたＥＳＴに対していくらかの類似性を示した。
【０３３８】
ＭＬＮ１ライブラリーから単離したさらなる４４２個のクローンの決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号３４１〜７８２に提供し、ＭＬＮ１ライブラリーから単離したさらなる１１個のクローンの決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１６５４〜１６６４に提供する。
【０３３９】
（Ｅ．ＰＣＲに基づくｃＤＮＡライブラリサブトラクションを使用する、扁平上皮細胞性肺癌腫ライブラリーからのｃＤＮＡ配列の単離）
扁平上皮細胞性肺癌腫についてのサブトラクトｃＤＮＡライブラリー（ＳＱＬ１と呼ぶ）を、テスターおよびドライバーの２本鎖ｃＤＮＡを４個の制限酵素（ＤｒａＩ、ＭｓｃＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＳｔｕＩ）で別々に消化したことを除いて、本質的には上記の改変したＰＣＲに基づくサブトラクションプロセスを使用して調製した。２つの扁平上皮細胞性肺癌腫のプールに由来するｃＤＮＡを、正常な肺、脳、腎臓、肝臓、膵臓、皮膚、心臓、脾臓、食道、および気管を含む１０個の正常組織のプール由来のｃＤＮＡに対してサブトラクトした。
【０３４０】
７４個のクローンを単離し、そして配列決定した。これらのクローンの２２個について決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号２２３〜２４４に提供する。配列番号２４１の配列は、以前に同定された配列に対して有意な相同性は示さなかった。配列番号２２３、２２５、２３２、２３３、２３５、２３８、２３９、２４２、および２４３の配列は、以前に同定された遺伝子配列に対していくらかの類似性を示し、一方、配列番号２２４、２２６〜２３１、２３４、２３６、２３７、２４０、２４１、および２４４の配列は、以前に単離されたＥＳＴに対していくらかの類似性を示した。
【０３４１】
肺腫瘍組織から調製したｃＤＮＡライブラリーの特徴付けの間に単離したさらなる１２個のクローンの配列を、配列番号８１３〜８２４に提供する。これらの配列のＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ　ＤＮＡデータベースとの比較は、以前に同定された配列に対する有意な相同性は明らかにしなかった。
【０３４２】
（実施例２）
（ポリペプチドの合成）
ポリペプチドを、ＨＰＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニンヘキサフルオロホスフェート）活性化を用いてＦＭＯＣ化学を使用して、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　４３０Ａペプチド合成装置上で合成し得る。Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ配列を、固定化表面への共役、結合、またはペプチドの標識の方法を提供するために、ペプチドのアミノ末端に付着させ得る。固体支持体からのペプチドの切断は、以下の切断混合物を使用して行うことができる：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（４０：１：２：２：３）。２時間の切断後、ペプチドを冷却したメチル−ｔ−ブチルエーテル中で沈殿させ得る。次いで、ペプチドのペレットを、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有している水中に溶解させ得、そしてＣ１８逆相ＨＰＬＣによる精製の前に凍結乾燥させ得る。水中（０．１％のＴＦＡを含有している）の０％〜６０％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含有している）の勾配を、ペプチドを溶出させるために使用し得る。純粋な画分の凍結乾燥後、ペプチドを、電気スプレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）または他のタイプの質量スペクトル分析を使用し、そしてアミノ酸分析によって特徴付け得る。
【０３４３】
（実施例３）
（Ｌ５４８Ｓ　Ｈｉｓタグ融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ中での発現）
Ｌ５４８Ｓコード領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
アミノ酸２で開始する順方向プライマー：
ＰＤＭ−４３３：５’　ｇｃｔａａａｇｇｔｇａｃｃｃｃａａｇａａａｃｃａａａｇ　３’　Ｔｍ　６０℃（配列番号１６６５）
終結コドンの後にＸｈｏＩ部位を作成する逆方向プライマー：
ＰＤＭ−４３８：５’　ｃｔａｔｔａａｃｔｃｇａｇｇｇａｇａｃａｇａｔａａａｃａｇｔｔｔｃｔｔｔａ　３’　Ｔｍ　６１℃（配列番号１６６６）。
次いで、ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、次いでｐＰＤＭ　Ｈｉｓ中（Ｅｃｏ７２ＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化した、インフレームでＨｉｓタグを有する改変型ｐＥＴ２８ベクター）にクローニングした。正確な構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認し、次いでＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ　ＳおよびＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ　ＲＩＬ発現宿主中に形質転換した。発現した組換えＬ５４８Ｓのタンパク質配列を、配列番号１６６７に示し、そして発現した組換えＬ７５４８ＳのＤＮＡ配列を、配列番号１６６８に示す。
【０３４４】
（実施例４）
（肺チップ５、ＳＱＬ１、ＳＣＬ１、ＳＣＬ３、およびＳＣＬ４ライブラリーのさらなる分析）
さらなる分析を、正常組織に対して、腫瘍プローブ群中での２倍以上の過剰発現および０．２以下の正常組織中での平均の発現という判断基準を使用して、肺チップ５について行った。これによって、肺癌腫中で過剰発現される１０９個の豊富ではないクローンの同定を得た。以下の表１１にまとめるように、１９個のｃＤＮＡクローンを肺扁平上皮癌サブトラクトライブラリーＳＱＬ１から回収し、９個のｃＤＮＡクローンを小細胞性肺癌腫ライブラリーＳＣＬ１から回収し、そして８１個のｃＤＮＡクローンを、小細胞性肺癌腫ライブラリーＳＣＬ３およびＳＣＬ４から回収した。
【０３４５】
【表１７】
Figure 2004512824
Figure 2004512824
Figure 2004512824
上記の表中のシグナル２に対するシグナル１の比は、正常組織に対して腫瘍中で同定された配列の発現レベルの測定値を提供する。例えば、配列番号１６６９については、腫瘍特異的シグナルは、試験した正常組織についてのシグナルの３．０９倍であり；配列番号１６７０については、腫瘍特異的シグナルは、正常組織についてのシグナルの２．３１倍であったなど。
【０３４６】
（実施例５）
（肺腫瘍配列のリアルタイムＰＣＲ分析）
リアルタイムＰＣＲを、種々の腫瘍および正常組織中でのそれらの発現プロフィールをさらに評価するために、本明細書中で開示した肺腫瘍配列のサブセットに対して行った。簡潔には、ＰＣＲ産物の定量は、数回のサイクルによる。ここでは、ＤＮＡの量は、バックグラウンドをかろうじて上回るところからプラトーにまで対数的に増幅する。連続的な蛍光モニタリングを使用して、閾値サイクル数（ここでは、ＤＮＡが対数的に増幅する）をそれぞれのＰＣＲ反応において容易に決定する。２つの蛍光検出システムが存在する。１つは、２本鎖ＤＮＡ特異的結合色素ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ色素に基づく。他方は、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ色素を５’末端（ＦＡＭ）に、そしてＱｕｅｎｃｈｅｒ色素を３’末端（ＴＡＭＲＡ）に含有しているＴａｑＭａｎプローブ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｄｉｖｉｓｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用する。標的特異的ＰＣＲ増幅によって、ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＧｏｌｄＴＭ（Ｐｅｒｌｉｎ　Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のヌクレアーゼ活性により、Ｑｕｅｎｃｈｅｒ含有プローブからのＲｅｐｏｒｔｅｒ色素の切断および放出を生じる。このように、放出されたレポーター色素から生じる蛍光シグナルは、ＰＣＲ産物の量に比例する。両方の検出方法によって、比較可能な結果を生じることが見出されている。複数の組織サンプル中での遺伝子発現の相対的なレベルを比較するために、組織および／または細胞株由来のＲＮＡを使用してｃＤＮＡのパネルを構築し、そしてリアルタイムＰＣＲを、それぞれのｃＤＮＡサンプル中のコピー数を定量するために遺伝子特異的プライマーを使用して行う。それぞれのｃＤＮＡサンプルについて、一般的には、２連で行い、そしてそれぞれの反応を２連のプレートで繰り返した。最終的なリアルタイムＰＣＲの結果を、典型的には、それぞれのｃＤＮＡサンプル中の内部アクチン数に対して基準化した目的の遺伝子のコピー数の平均として報告する。リアルタイムＰＣＲ反応を、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ色素を使用するＧｅｎｅＡｍｐ　５７００　ＤｅｔｅｃｔｏｒまたはＴａｑＭａｎプローブ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用するＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ上で行い得る。
【０３４７】
本明細書中で開示する多数の肺腫瘍特異的配列のリアルタイムＰＣＲ分析によって得た結果を、以下の表にまとめる。さらに、これらのクローンの多くについての延長したｃＤＮＡ配列を、公開されている配列データベースを検索することによって得た。延長した配列、およびこれらの配列によってコードされるタンパク質を、以下の表１２に配列番号によって同定する。
【０３４８】
【表１８】
Figure 2004512824
Figure 2004512824
Figure 2004512824
（実施例６）
（肺腫瘍抗原に由来するＣＤ４免疫原性Ｔ細胞エピトープの同定）
抗原Ｌ５４８Ｓ（配列番号７８９）に特異的なＣＤ４　Ｔ細胞株を、以下のように作製した。
【０３４９】
Ｌ５４８Ｓ配列全体にまたがる一連の重複する２０マーのペプチドを合成した（それぞれ、配列番号１８３４〜１８５６）。初回免疫のために、ペプチドを４〜５個のペプチドのプールに合わせて、そして９６ウェルＵ底プレート中で、樹状細胞および精製したＣＤ４＋Ｔ細胞とともに２μｇ／ｍｌで培養した。１００個の培養物を、それぞれのペプチドのプールについて作製した。培養物を、ペプチドのプールで充填した新しい樹状細胞で毎週再刺激した。全部で３回の刺激サイクルの後、細胞をさらに１週間休ませ、そしてインターフェロン−γ　ＥＬＩＳＡおよび増殖アッセイを使用して、ペプチドプールでパルスした抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する特異性について試験した。これらのアッセイのために、関連ペプチドのプール、組換えＬ５４８Ｓ、または無関係なペプチドのいずれかで充填した接着性の単球を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。以下の表１３に示すように、多数のＣＤ４　Ｔ細胞株が、初回免疫ペプチドならびに組換えＬ５４８Ｓタンパク質との反応性を示した。これらの株を、プール由来の個々のペプチドの認識について、ならびに組換えＬ５４８Ｓの認識について試験するために、さらに増殖させた。
【０３５０】
これらの株の優位な反応性は、ペプチド２１（配列番号１８５４）（これは、Ｌ５４８Ｓのアミノ酸１６１〜１８０に対応する）とであるようである。
【０３５１】
【表１９】
Figure 2004512824
（実施例７）
（患者の血清中の肺腫瘍抗原に対する抗体の検出）
肺腫瘍抗原Ｌ５４８Ｓ（配列番号７８９）およびＬ５５２Ｓ（配列番号８０９）に特異的な抗体が、肺癌患者の滲出液または血清中に存在するが、正常なドナーには存在しないことを示した。より詳細には、肺癌患者から得た滲出液中および正常なドナーに由来する血清中のＬ５４８Ｓ、Ｌ５５１Ｓ（配列番号８２７）およびＬ５５２Ｓに対する抗体の存在を、組換えタンパク質およびＨＲＰ結合体化抗ヒトＩｇを使用してＥＬＩＳＡによって試験した。簡潔には、それぞれのタンパク質（１００ｎｇ）を、ｐＨ９．５で９６ウェルプレート中に被覆した。平行して、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）をもまた対照タンパク質として被覆した。ＢＳＡ（［Ｎ］）に対するシグナル（［Ｓ］、４０５ｎｍで測定した吸光度）を決定した。これらの研究の結果を、表１４に示す。ここでは、−は［Ｓ］／［Ｎ］＜２を示し；＋／−は［Ｓ］／［Ｎ］＞２を示し；＋＋は［Ｓ］／［Ｎ］＞３を示し；そして＋＋＋は［Ｓ］／［Ｎ］＞５を示す。
【０３５２】
【表２０】
Figure 2004512824
ウェスタンブロット分析を使用して、Ｌ５５２Ｓに対する抗体が、肺癌患者に由来する滲出液の４個のサンプルのうちの１個に存在し、Ｌ５５２Ｓ抗体は、試験した正常な血清の３個のサンプル中では検出されないことを見出した。
【０３５３】
（実施例８）
（肺腫瘍抗原の融合タンパク質）
全長のＲａ１２の、Ｌ８０１Ｐ　ＯＲＦ４（配列番号１６７０）またはＬ８０１Ｐ　ＯＲＦ５（配列番号１６７１）のいずれかとの融合タンパク質を調製し、そして以下のようにＥ．ｃｏｌｉ中で１つの組換えタンパク質として発現させた。
【０３５４】
Ｌ８０１ＰのＯＲＦ４のｃＤＮＡを、全長のＬ８０１ＰのｃＤＮＡ、ならびに配列番号１８５７および１８５８のプライマーを用いてＰＣＲによって得た。Ｌ８０１ＰのＯＲＦ５のｃＤＮＡを、全長のＬ８０１ＰのｃＤＮＡ、ならびに配列番号１８５９および１８６０のプライマーを用いてＰＣＲによって得た。予想された大きさを有するＰＣＲ産物をアガロースゲルから回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、そして続くＥ．ｃｏｌｉ中での発現のために、発現ベクターｐＣＲＸ１中の対応する部位にクローニングした。Ｒａ１２とＯＲＦ４との融合体について、最良の発現を、２×ＹＳ培地中のＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中で、約３時間３７℃でＩＰＴＧを使用して誘導した組換えタンパク質を用いて得た。Ｒａ１２のＯＲＦ５との融合体については、最良の発現を、２×ＹＳ培地中のＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中で、再び、約３時間３７℃でＩＰＴＧを使用して誘導した組換えタンパク質を用いて得た。融合タンパク質の産生のために使用したプラスミドを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ＯＦＲ４およびＯＲＦ５の融合体について決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１８６１および１８６２にそれぞれ提供し、対応するアミノ酸配列を、配列番号１８６３および１８６４にそれぞれ提供する。
【０３５５】
（実施例９）
（全長のＬ９８４ＰをコードするｃＤＮＡのクローニング）
本実施例は、４個の異なるｃＤＮＡ供給源からの、ＰＣＲ増幅によるＬ９８４ＰをコードするｃＤＮＡ配列の単離を説明する。簡潔には、クローンＬ９８４Ｐの先に単離したｃＤＮＡ配列を、ヒトａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅホモログ１（ＡＳＨ１）をコードするＤＮＡ配列に対して相同性を有しているとして同定した。遺伝子特異的プライマーを、ＡＳＨ１について、公開されているドメイン中に存在する配列情報（ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ−００４３１６）を使用して作製した。これらの遺伝子特異的プライマーをＰＣＲ増幅において使用して、Ｌ９８４Ｐを、４個の異なるｃＤＮＡ供給源からクローニングした。４個のｃＤＮＡ供給源は、小細胞性肺癌腫初代腫瘍サンプル（ＲＮＡ　Ｉｄ．５７３Ａ）、ＭＥＴ神経内分泌異型類癌腫サンプル（ＲＮＡ　Ｉｄ．５１２Ａ）、および２つの小細胞性肺癌腫細胞株（細胞株Ｉｄ．ＮＣＩ　Ｈ１２８およびＤＭＳ７９）であった。これらの４個のクローンについて決定したｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号１８６５〜１８６８に提供する。ｃＤＮＡのコード領域は、ヒトゲノムＤＮＡ中で多型を示すトリプレットＣＡＧの繰り返しを含む。この多型は、４個の異なる供給源から、ならびにＡＳＨ１のｃＤＮＡからクローニングされたＬ９８４Ｐにおいて観察することができ、そしてヒト第４染色体に由来する。ｇｅｎｂａｎｋデータベースに寄託されたＡＳＨ１のｃＤＮＡ（ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ−００６６８８）は、１４コピーのトリプレットＣＡＧを含むが、ヒト第４染色体の配列に由来するｃＤＮＡ配列（ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＸＭ＿００６６８８）は、１２コピーのトリプレットを含む。５７３Ａおよび５１２Ａの両方からクローニングしたｃＤＮＡは、１２コピーのＣＡＧトリプレットを含む。小細胞性肺癌腫細胞株ＤＭＳ７９からクローニングしたｃＤＮＡは、１３コピーのトリプレットＣＡＧを含み、一方、小細胞性肺癌腫細胞株ＮＣＩ　Ｈ１２８からクローニングしたｃＤＮＡは、わずか１０コピーのトリプレットＣＡＧを含む。多型はコード領域中に存在するので、これによって同様にタンパク質配列において多型を生じる（配列番号１８６９〜１８７２を参照のこと）。
【０３５６】
（実施例１０）
（全長のＬ９８５ＰをコードするｃＤＮＡのクローニング）
実施例１Ｃに先に開示したように、コンティグ１３９（配列番号１４６７、Ｌ９８５Ｐとしてもまた既知である）の配列を問い合わせとして使用して公開データベースの検索を行い、そしてこの配列が、細胞表面免疫調節因子−２（ＣＳＩＭＭ−２、Ｇｅｎｅｓｅｑデータベースから得られた配列）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１６７６）に対して相同性を有することを示した。このクローンの全長の配列を、元々クローニングされた配列（配列番号１４６７）の放射標識プローブを用いて、小細胞性肺癌腫ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得た。ｃＤＮＡライブラリーから約５００，０００個のクローンをスクリーニングし、そして１．３５ｋｂのｃＤＮＡ挿入物を含有している２個の異なるクローンを単離した。全長のｃＤＮＡ配列を配列番号１８７３に提供し、そしてコードされたアミノ酸配列を、配列番号１８７４に提供する。驚くべきことに、Ｌ９８５Ｐの単離された全長のｃＤＮＡ配列（配列番号１８７３）の、ＣＳＩＭＭ−２についてのＧｅｎｅｓｅｑデータベース配列とのアラインメントは、Ｌ９８５Ｐが、１つのヌクレオチドによってＧｅｎｅＳｅｑデータベース配列とは異なることを示した。このヌクレオチドの差異は、配列番号１８７４の１１９位での１つのアミノ酸残基の変化（ＧからＥ）を生じる。
【０３５７】
Ｌ９８５Ｐの推定されるタンパク質構造および配列は、これが最近記載されたＭＳ４Ａ（膜を貫通する４個のドメイン、サブファミリーＡ）遺伝子ファミリー（ＬｉａｎｇおよびＴｅｄｄｅｒ、２００１、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　７２：１１９〜１２７）のメンバーであることを示す。ＭＳ４Ａ遺伝子ファミリーは、現在、少なくとも２１個の異なるヒトおよびマウスのタンパク質から構成され、そのうちの９個のメンバーはヒト由来である。これらには、ＣＤ２０、ＦｃεＲＩβ、ＨＴｍ４、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＭＳ４Ａ５、ＭＳ４Ａ６Ａ、ＭＳ４Ａ７、ＭＳ４Ａ８Ｂ（Ｌ９８５Ｐと同じ）、およびＭＳ４Ａ１２が含まれる。ＭＳ４Ａファミリーのメンバーは、４個の膜貫通ドメインを含有している、細胞表面で発現されるタンパク質であり、Ｎ末端領域およびＣ末端領域は細胞の細胞質側に面している。ヒトＭＳ４Ａファミリーのメンバーは、タンパク質レベルで２０〜４０％の全体的な相同性を示し、これらは、たいてい膜貫通ドメインに限定される。Ｌ９８５Ｐの膜貫通ドメインは、ＣＤ２０に対して最も高い相同性を共有し、この領域の２つのタンパク質配列間で、約４０％の同一性および６０％の類似性を有する。ＭＳ４Ａファミリーのメンバーは、広範囲の組織分布を示し、発現は、造血組織または非造血組織中の多様な細胞型において観察される。しかし、いくつかのＭＳ４Ａファミリーのメンバー（例えば、ＣＤ２０）の発現は、特定の細胞型に高く制限される。ＣＤ２０は、Ｂ細胞上でのみ発現される。実施例１Ｃにもまた記載したように、Ｌ９８５Ｐ（ＭＳ４Ａ８Ｂ）は、定量的リアルタイムＰＣＲによって決定されるように、小細胞性肺癌腫（ＳＣＬＣ）において過剰発現される。低いレベルの発現が、肺、脳下垂体、胃、結腸、および気管を含むいくつかの正常組織中で見られ、一方、調べた他の正常組織中での発現は、無視できるかまたは検出不可能であった（実施例１Ｃを参照のこと）。
【０３５８】
ＭＳ４Ａファミリーのメンバーのほとんどについての生理学的機能は、解明されるべきままである。以前の研究によって、ＣＤ２０が細胞増殖および分化の調節、ならびにＢ細胞中でのシグナル伝達に機能的に重要であることが示された。ＣＤ２０が、ホモ−またはヘテロ−四量体複合体を形成することによってカルシウムチャンネルとして機能し得るという証拠もまた、存在する。ＥｃεＲＩβは、四量体レセプター複合体の一部である。これは、肥満細胞の顆粒消失のような細胞性応答を導く、ＩｇＥ結合抗原との相互作用を媒介する。ＭＳ４Ａファミリーのメンバーの間での配列および構造の相同性に起因して、これらは、重複している機能的特性を共有している可能性が高い。
【０３５９】
ＭＳ４Ａファミリーのメンバーのいくつかは、癌に関係していることが見出されている。ＣＤ２０は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の９０％以上において発現され、このことによって、ＣＤ２０はＢ細胞悪性腫瘍の処置のための免疫治療アプローチのための理想的な標的とされた。抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、未処理の（ｎａｉｖｅ）の形態および放射標識した形態の両方で、非ホジキンリンパ腫の処置において高い成功を伴って使用されている。抗ＣＤ２０　ＭＡｂは、補体媒介性細胞崩壊、抗体媒介性細胞性細胞傷害性、ならびに抗体媒介性の細胞周期の停止およびアポトーシスを含む、いくつかの経路を通じてそれらの抗腫瘍効果を発揮することが示されている。ヒトＥＳＴデータベースの分析は、ＭＳ４Ａ遺伝子ファミリーの他のメンバー（ＭＳ４Ａ４Ａ、Ａ６Ａ、Ａ７、およびＡ８Ｂを含む）もまた、肺、乳房、膵臓、結腸、卵巣、腎臓、および脳を含む種々の癌において発現されることを示す。ＣＤ２０との比較によって、ＭＳ４Ａファミリーの遺伝子の１つ以上が、造血性および非造血性の悪性疾患の処置のための免疫治療アプローチについての標的として使用される。
【０３６０】
ＭＳ４Ａタンパク質ファミリーのメンバーは、４個の膜貫通ドメインを有する他のメンバーのタンパク質ファミリーと構造的に類似している。これらには、テトラスパニン（Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ）タンパク質ファミリー（ＴＭ４ＳＦ）およびＧＡＢＡ−Ａレセプタータンパク質ファミリーが含まれる。テトラスパニンは癌に関係し、そして腫瘍の進行を制御することにおいて直接的な役割を果たし得る。ＣＤ９の発現は、Ｂ細胞の移動にポジティブな影響を与えるが、ＣＤ９の過剰発現は癌腫細胞においては運動性および転移を抑制し、そして黒色腫中では転移と逆の相関関係が存在する。しかし、ＣＤ９はまた、非Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞の９０％、および慢性リンパ性白血病の５０％について発現される。ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用する、バーキットリンパ腫細胞株中でのテトラスパニン発現の最近の研究は、これらの株のうちの９０％が、ＣＤ５３、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ８２、およびＳＡＳを高いレベルで発現することを見出した。ＣＤ１５１／ＰＥＴＡ３は、転移および細胞の移動のエフェクターであり、そしてこの活性をブロックするＭＡｂが開発されている。同様に、テトラスパニンＣＯ−０２９／Ｄ６．１の過剰発現は、細胞株の転移能力を増大させる。テトラスパニンは、ＭＡｂによって調節され得る多様なセットの生物学的機能を制御する。テトラスパニンの機能は、一般的には、細胞の活性化および増殖、ならびに接着および運動性に影響を与える作用に分類され得る。これらの機能は、インテグリンとのそれらの会合によって実行される傾向にある。テトラスパニンの機能的活性は、例えば、細胞増殖を制御するように、ＭＡｂを用いて調節され得る。例えば、ＣＤ８１／ＴＡＰＡ−１は、Ｂ細胞の活性化および増大した増殖（ＭＡｂでブロックされ得る活性）に関係する。抗増殖活性を有するＭＡｂは、テトラスパニンファミリーのメンバーであるＣＯ−０２９／Ｄ６．１に対して作製されている。
【０３６１】
上記のように、Ｌ９８５Ｐは、小細胞性肺癌腫において特異的に過剰発現される。この事実、ならびにＣＤ２０、テトラスパニン、およびＨｅｒ２（癌におけるそれらの過剰発現が癌治療の標的としてそれらを有効にする）との比較は、Ｌ９８５Ｐが小細胞性肺癌腫の処置のための免疫治療アプローチの良好な標的であり得ることを示す。
【０３６２】
Ｌ９８５Ｐに対するＭＡｂの作成、精製、および評価を容易にするために、Ｌ９８５Ｐタンパク質の推定されるアミノ酸配列全体、Ｌ９８５Ｐ由来のペプチド、または化学的に産生された（合成の）Ｌ９８５Ｐペプチドに対するＭＡｂが使用される。また、Ｒａ１２タンパク質（長い形態（Ｒａ１２−これは、Ｒａ１２の最初の１２８アミノ酸である）および／もしくは短い形態（Ｒａ１２Ｓ）のいずれか）に融合したか、またはポリヒスチジンペプチドに対して融合したＬ９８５Ｐタンパク質分子のキメラ形態に対して、あるいは、これらの分子の任意の組合せに対して惹起されたＭＡｂを使用することもできる。Ｈｉｓタグ化Ｌ９８５Ｐ−Ｒａ１２融合分子についての推定されるｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を提供する：Ｒａ１２−Ｌ９８５Ｐ＿ｃＤＮＡ（配列番号１８７５）、Ｒａ１２−Ｌ９８５Ｐ＿Ｐｒｏｔｅｉｎ（配列番号１８７６）、Ｒａ１２Ｓ−Ｌ９８５Ｐ＿ｃＤＮＡ（配列番号１８７７）、およびＲａ１２Ｓ−Ｌ９８５Ｐ＿Ｐｒｏｔｅｉｎ（配列番号１８７８）；ならびに、Ｌ９８５Ｐ由来ペプチド：ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ　Ｒａ１２Ｓ−Ｌ９８５ＰＥｘ＿ｃＤＮＡ（配列番号１８７９））、ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ　Ｒａ１２Ｓ−Ｌ９８５ＰＥｘ＿Ｐｒｏｔｅｉｎ（配列番号１８８０）、Ｌ９８５Ｐ＿Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ＿Ｌｏｏｐ−２＿ｃＤＮＡ（配列番号１８８１）、およびＬ９８５Ｐ＿Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ＿Ｌｏｏｐ−２＿Ｐｅｐｔｉｄｅ（配列番号１８８２）。
【０３６３】
（実施例１１）
（Ｈｉｓタグ化Ｒａ１２−Ｌ９８５Ｐ融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉにおける発現）
本実施例は、Ｒａ１２とＬ９８５Ｐとの間での融合の特定の実施形態、およびＥ．ｃｏｌｉにおけるその発現を示す。長い形態のＲａ１２と、Ｌ９８５Ｐの最初の３個のアミノ酸残基を除く全てとのＨｉｓタグ化融合タンパク質を、Ｅ．ｃｉｌｉ中で単一の組換えタンパク質として発現させた。長い形態のＲａ１２を、ＭＴＡ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３のもともとの配列から改変した。ここでは、推定トロンビン切断部位をＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で置換した。Ｌ９８５Ｐを、ｐＣＲＸ１ベクター中のＲａ１２配列の下流に融合した。Ｒａ１２配列を、ＲＢＳの下流にクローニングした。結果として、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質は、組換えベクターがＥ．ｃｏｌｉ中で発現される場合に産生される。長い形態のＲａ１２とＬ９８５Ｐとの融合体の配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１８７５に提供する。この配列は、実施例１０で推定したものと同じである。
【０３６４】
（実施例１２）
（全長のＬ１４２８ＰをコードするｃＤＮＡのクローニング）
実施例５に先に開示したように、種々の腫瘍および正常組織中でのそれらの発現プロフィールをさらに評価するために、リアルタイムＰＣＲを、本明細書中に開示した肺腫瘍配列のサブセットに対して行った。結果を、上記の表１２に提供する。分析した配列のうちの１つは、クローン＃５９３１６由来であり（配列番号１１８０、Ｌ１４２８Ｐ）、そして肺腺癌のサブセットにおいて発現されることが示された。
【０３６５】
さらなる研究によって、＃５９３１６（配列番号１１８０、Ｌ１４２８Ｐ）のクローニングした配列についての全長のｃＤＮＡを単離した。この遺伝子の転写物の大きさを決定するために、複数の組織のノーザンブロットを、放射標識した元々クローニングされた配列（配列番号１１８０）を用いてプローブした。ノーザンブロットは、肺腺癌および正常組織のサンプルに由来する約２０μｇの全ＲＮＡを含んだ。露光したフィルムの視覚的分析によって、約６．５〜７．０ｋｂの単一の転写物が明らかとなった。このクローンの全長の配列を、肺腺癌初代腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを、元々クローニングされた配列（配列番号１１８０）の放射標識プローブでスクリーニングすることによって得た。ｃＤＮＡライブラリー由来の約５００，０００個のクローンをスクリーニングし、そして６．８ｋｂのｃＤＮＡ挿入物を含有している５個の独立のクローンを単離した。この挿入物の大きさは、ノーザンブロット分析によって概算した大きさと類似である。全長の配列を、配列番号１８８３に提供する。異なるＯＲＦを同定することはできなかったが、７個の可能性のあるＯＲＦを推定することができ、そしてこれらの可能性のあるＯＲＦのアミノ酸配列（Ｌ１４２８Ｐ＿ＯＲＦ１〜ＯＲＦ７と命名した）を、それぞれ、配列番号１８８４〜１８９０に提供する。全長のＬ１４２８Ｐの発現を、実施例５に示すように、肺の腺癌および扁平上皮癌の両方の延長したｃＤＮＡのパネルについて、リアルタイムＰＣＲによって再度分析した。肺腺癌の延長したパネルのリアルタイムの結果によって、腺癌中でのＬ１４２８Ｐの発現を再び確認する。腺癌サンプルの約４０〜５０％が、様々なレベルの発現を示す。扁平上皮細胞癌の延長したパネルからのリアルタイムの結果は、Ｌ１４２８Ｐがまた、肺扁平上皮癌においても発現されることを示す。しかし、発現は、ごく少ない肺扁平上皮癌サンプルにおいてであり、そして低いレベルであった。
【０３６６】
（実施例１３）
（マイクロアレイによって示されるような、肺腫瘍中で過剰発現されるｃＤＮＡ配列のリアルタイムＰＣＲ分析）
表１５に列挙する以下のクローンが肺腫瘍中で過剰発現されることが、マイクロアレイ分析（実施例２Ｃ、および実施例６、表１１を参照のこと）によって先に示された。このマイクロアレイ分析の結果を、以下の表１５にまとめる。
【０３６７】
【表２１】
Figure 2004512824
リアルタイムＰＣＲ分析を、実施例７に記載するように、小細胞性肺癌腫のパネル上でこれらの配列について行った。リアルタイムＰＣＲ分析から得た結果を、表１６にまとめる。
【０３６８】
【表２２】
Figure 2004512824
Figure 2004512824
次いで、これらの配列を利用可能なデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ、ＧｅｎｅＳｅｑ、ｈｕＥＳＴなど）中の既知の配列と比較した。これらの配列のうちの９個が、利用可能なデータベース中の既知の配列に対していくらかの程度の類似性を示した。これらの９個のヒットの結果を、表１７にまとめ、これらの一致のＤＮＡ配列およびそれぞれのコードされたアミノ酸配列（入手可能である場合）についての配列表識別子を一緒に提供する。配列番号１５６１および１７８６は、いずれの既知の配列に対しても有意な類似性を示さなかった。
【０３６９】
【表２３】
Figure 2004512824
さらなる研究によって、クローン＃６１０９３（配列番号１７３５、Ｌ１４３７Ｐ）のクローニングされた配列の全長のｃＤＮＡ配列の単離を生じた。遺伝子の転写物の大きさを決定するために、複数の組織のノーザンブロットを、放射標識した元々クローニングされた配列（配列番号１７３５）でプローブした。ノーザンブロットは、小細胞性肺癌腫および正常組織のサンプルに由来する２０μｇの全ＲＮＡを含んだ。露光させたフィルムの視覚的分析によって、約１．２ｋｂの単一の転写物が明らかとなった。全長の配列を、小細胞性肺癌腫腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを、元々クローニングされた配列（配列番号１７３５）の放射標識プローブでスクリーニングすることによって得た。ｃＤＮＡライブラリー由来の約１２０，０００個のクローンをスクリーニングし、そして９３１塩基のｃＤＮＡ挿入物を含有している２個の異なるクローンを単離した。この挿入物は、ノーザンブロット分析によって概算した大きさと類似である。全長のｃＤＮＡ配列を、配列番号１９１０に提供する。全長のｃＤＮＡと以前に公開された配列との間に１つのヌクレオチドの差異が存在することを発見した。しかし、このヌクレオチドの変化は、推定アミノ酸配列には変化を生じない。全長のｃＤＮＡによってコードされる推定アミノ酸配列は、配列番号１９０４にすでに提供したものと同じであり、そしてこのｃＤＮＡが、既知のタンパク質である、ユビキチン結合酵素Ｅ２（ＡＦ１６０２１５、配列番号１９０４）をコードするという以前の予測を確認する。配列番号１９１０（Ｌ１４３７Ｐ）が肺小細胞性肺癌腫において過剰発現されることを、マイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ、およびノーザンブロット分析によって示した。
【０３７０】
（実施例１４）
（Ｌ５４８Ｓ　Ｈｉｓタグ融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ中での発現）
ＰＣＲを、以下のプライマーを用いてＬ５４８Ｓコード領域について行った：
順方向プライマー　ＰＤＭ−４３３　５’ｇｃｔａａａｇｇｔｇａｃｃｃｃａａｇａａａｃｃａａａｇ　３’（配列番号１９１１）　Ｔｍ　６０℃
逆方向プライマー　ＰＤＭ−４３８　５’ｃｔａｔｔａａｃｔｃｇａｇｇｇａｇａｃａｇａｔａａａｃａｇｔｔｔｃｔｔｔａ　３’（配列番号１９１２）　Ｔｍ　６１℃。
【０３７１】
ＰＣＲ条件は以下であった：
１０μｌ　１０×Ｐｆｕ緩衝液
１．０μｌ　１０ｍＭのｄＮＴＰ
２．０μｌ　１０μＭのそれぞれのプライマー
８３μｌ　滅菌水
１．５μｌ　Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇ　ＤＮＡ
９６℃で２分間、９６℃で２０秒間、６１℃で１５秒間、７２℃で１分３０秒間を４０サイクル、次いで７２℃で４分間。
【０３７２】
ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、次いでｐＰＤＭ　Ｈｉｓ（Ｅｃｏ７２ＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化した、インフレームでＨｉｓタグを有する改変型ｐＥＴ２８ベクター）にクローニングした。正確な構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認し、次いで発現のためにＢＬ２１　ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）細胞およびＢＬ２１　ｐＬｙｓ　Ｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）細胞中に形質転換した。
【０３７３】
発現した組換えＬ５４８Ｓのアミノ酸配列を、配列番号１９１３に示し、そしてＤＮＡコード領域の配列を、配列番号１９１４に示す。
【０３７４】
（実施例１５）
（Ｌ５５１Ｓ　Ｈｉｓタグ融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ中での発現）
ＰＣＲを、以下のプライマーを用いてＬ５５１Ｓコード領域について行った：
順方向プライマー　ＰＤＭ−４９８　５’ｇｔｇａｃｇａｔｇｇａｇｇａｇｃｔｇｃｇｇｇａｇａｔｇｇ　３’（配列番号１９１５）　Ｔｍ６７℃
逆方向プライマー　ＰＤＭ−４９９　５’ｃｇｃｃｔａａｃｔｃｇａｇｔｃａｃｔａａｃａｇｃｔｇｇｇａｇ　３’（配列番号１９１６）　Ｔｍ６６℃。
【０３７５】
ＰＣＲ条件は以下であった：
１０μｌ　１０×Ｐｆｕ緩衝液
１．０μｌ　１０ｍＭのｄＮＴＰ
２．０μｌ　１０μＭのそれぞれのプライマー
８３μｌ　滅菌水
１．５μｌ　Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇ　ＤＮＡ
９６℃で２分間、９６℃で２０秒間、６６℃で１５秒間、７２℃で２分間２０秒間を４０サイクル、次いで７２℃で４分間。
【０３７６】
ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、次いでｐＰＤＭ　Ｈｉｓ中（Ｅｃｏ７２ＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化した、インフレームでＨｉｓタグを有する改変型ｐＥＴ２８ベクター）にクローン化した。正確な構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認し、次いで発現のためにＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ　ＳおよびＢＬＲ（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ　ＲＰ細胞中に形質転換した。
【０３７７】
発現した組換えＬ５５１Ｓのアミノ酸配列を、配列番号１９１７に示し、そしてＤＮＡコード領域の配列を、配列番号１９１８に示す。
【０３７８】
（実施例１６）
（Ｌ５５２Ｓ　Ｈｉｓタグ融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ中での発現）
ＰＣＲを、以下のプライマーを用いてＬ５５２Ｓコード領域について行った：
順方向プライマー　ＰＤＭ−４７９　５’ｃｇｇｔｇｃｃａｃｇｃｃｃａｔｇｇａｃｃｔｔｃ　３’（配列番号１９１９）　Ｔｍ６４℃
逆方向プライマー　ＰＤＭ−４８０　５’ｃｔｇａｇａａｔｔｃａｔｔａａａｃｔｔｇｔｇｇｔｔｇｃｔｃｔｔｃａｃｃ　３’（配列番号１９２０）　Ｔｍ６２℃。
【０３７９】
ＰＣＲ条件は以下であった：
１０μｌ　１０×Ｐｆｕ緩衝液
１．０μｌ　１０ｍＭのｄＮＴＰ
２．０μｌ　１０μＭのそれぞれのプライマー
８３μｌ　滅菌水
１．５μｌ　Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇ　ＤＮＡ
９６℃で２分間、９６℃で２０秒間、６３℃で１５秒間、７２℃で１分間を４０サイクル、次いで７２℃で４分間。
【０３８０】
ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、次いでｐＰＤＭ　Ｈｉｓ中（Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した、インフレームでＨｉｓタグを有する改変型ｐＥＴ２８ベクター）にクローン化した。正確な構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認し、次いで発現のためにＢＬ２１　ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）細胞中に形質転換した。
【０３８１】
発現した組換えＬ５５２Ｓのアミノ酸配列を、配列番号１９２１に示し、そしてＤＮＡコード領域の配列を、配列番号１９２２に示す。
【０３８２】
（実施例１７）
（全長クローン＃１９０６９およびクローン＃１８９６５または＃１９００２をコードするｃＤＮＡのクローニング）
２つの肺抗原（クローン＃１９０６９（配列番号９０）および＃１８９６５または＃１９００２（両方とも、配列番号１５））の部分的な配列は、先に提供した。これらの部分的な配列を、公に利用可能なデータベースを検索することによって、単離しクローン化し配列決定した全長のｃＤＮＡ配列を推定するための問い合わせ配列として使用した。配列番号９０の単離しクローン化した配列の推定される全長のｃＤＮＡ配列を、配列番号１９２３に提供する。配列番号１５の単離したクローン化した配列についての推定される全長のｃＤＮＡ配列を、配列番号１９２４に提供する。２つの抗原の推定されるアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１９２５および１９２６に提供する。次いで、これらの配列を、ＧｅｎｅＳｅｑデータベース中の既知の配列と比較した。両方の配列が、ＧｅｎｅＳｅｑデータベース中の既知の配列に対していくらかの程度の類似性を示した。配列番号１９２３は、リポホスファチジン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＧｅｎｅＳｅｑ　Ｚ２５０００およびＺ６５０３８）に対して類似性を示し、そして配列番号１９２４は、亜鉛／鉄調節輸送体様タンパク質（Ｇｅｎｅｓｅｑ　Ｚ３８３３３およびＡ１４９９５）に対して類似性を示す。
【０３８３】
（実施例１８）
（Ｌ５５２Ｓ特異的抗体のエピトープマッピング）
候補の抗原のペプチドを、前臨床研究および臨床研究の両方において、抗体応答の評価のために使用し得る。これらのデータは、特定の候補の抗原に対する抗体応答をさらに確認することを可能にする。競合ペプチドを用いるおよびそれを用いないタンパク質に基づくＥＬＩＳＡ、ならびにペプチドに基づくＥＬＩＳＡを、これらの抗体応答を評価するために使用し得る。ペプチドＥＬＩＳＡは、それがタンパク質に基づくＥＬＩＳＡにおいて観察される抗体力価の擬陽性をさらに排除し得ること、ならびに候補の抗原に対する抗体応答を試験するための最も単純なアッセイシステムを提供するので、特に有用である。本実施例において、個々の癌患者が、Ｌ５５２Ｓの以下の３個のエピトープを主に認識するＬ５５２Ｓ特異的抗体を産生することを示すデータを、Ｌ５５２Ｓペプチドを使用して得た：
（１）ａａ２１−３５：ＧＰＲＳＧＧＡＱＡＫＬＧＣＣＷ（配列番号１９２７）
（２）ａａ１１６−１３５：ＫＶＩＣＫＳＣＩＳＱＴＰＧＩＮＬＤＬＧＳ（配列番号１９２８）
（３）ａａ１４１−１６０：ＩＩＰＫＥＥＨＣＫＭＰＥＡＧＥＥＱＰＱＶ（配列番号１９２９）。
【０３８４】
さらなる研究においては、配列番号１９２９から作成した親和性精製した抗体がＬ５５２Ｓタンパク質を認識し得、そして患者の肺の複数の滲出液（ＬＰＥ）の全イムノグロブリンκの約０．６％を占めることを見出した。配列番号１９２９がＬ５５２Ｓタンパク質に特異的なウサギポリクローナル抗体の優性エピトープであることもまた、見出した。
【０３８５】
（実施例１９）
（Ｌ９８５Ｐの発現）
哺乳動物細胞中での組換え発現のために、全長のＬ９８５Ｐ　ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に、ＦＬＡＧエピトープタグを付けてまたはそれを付けずにサブクローン化した。両方の構築物を、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）中に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした。次いで、ウェスタンブロット分析を、組換えＬ９８５Ｐが一時的に発現されるかどうかを決定するために、これらのトランスフェクトした細胞について行った。
【０３８６】
簡潔には、トランスフェクションを以下のように行った。ＨＥＫ細胞を、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有しているＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に３５０，０００細胞／ウェル（６ウェルプレート）の密度でプレートし、そして一晩増殖させた。翌日、２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＦＢＳを含まない５０μｌのＯｐｔｉｍｅｎ　１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加し、そして室温で５分間インキュベートした。別のチューブのセットにおいては、５０μｌのＯｐｔｉｍｅｎ　１を、０．８μｇのＬ９８５Ｐ（ＦＬＡＧとともにおよびそれを伴わずに）／プラスミドＤＮＡと混合し、そして混合物をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００／Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物に移した。組合せた混合物を、室温で２０分間インキュベートし、そして０．５ｍｌのＤＭＥＭ　１０％　ＦＢＳを含有しているＨＥＫ２９３細胞に移した。次いで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００／ＤＮＡ混合物をＨＥＫ２９３細胞に添加し、そして３７℃で１６〜２４時間の間、７％のＣＯ２でインキュベートした。細胞をＰＢＳでリンスし、次いで回収し、そして遠心分離によってペレット化した。
【０３８７】
ウェスタンブロット分析のために、全細胞溶解物を、氷上で３０分間、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有している溶解緩衝液中で細胞をインキュベートすることによって作成した。次いで、溶解物を１５，０００ｒｐｍで５分間、４℃での遠心分離によって明澄化した。サンプルを、β−メルカプトエタノールを含有しているＳＤＳ−ＰＡＧＥ充填緩衝液で稀釈し、次いで１０分間沸騰させ、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に充填した。このタンパク質をニトロセルロースに移し、そして１：１０００希釈で精製した抗Ｌ９８５Ｐウサギポリクローナル血清を使用してプローブした。ブロットを、ＨＲＰに結合させたロバ抗ウサギＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用い、続くＥＣＬ基質中でのインキュベーションによって明らかにした。ブロットの結果は、組換えＬ９８５Ｐ（ＦＬＡＧを伴うおよびそれを伴わない）がＨＥＬ２９３細胞中で発現されることを示す。
【０３８８】
（実施例２０）
（肺腫瘍抗原に対するポリクローナル抗体の作成）
３個の肺抗原（Ｌ５４８Ｓ（配列番号７８９）、Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）、およびＬ９８５Ｐペプチド＃３４８２（配列番号１９３０））を発現させ、そして抗体作成における使用のために精製した。
【０３８９】
Ｌ５４８ＳおよびＬ５５２Ｓを、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現システムにおいて発現させ、そして適切な抗生物質を有するＬＢ培地中で、振盪インキュベーターの中で３７℃で一晩増殖させた。翌朝、１０ｍｌの一晩培養物を、２Ｌのバッフル三角フラスコ中の適切な抗生物質を有する５００ｍｌの２×ＹＴに添加した。培養物の光学密度が５６０ｎｍで０．４〜０．６に達したときに、細胞をＩＰＴＧ（１ｍＭ）で誘導した。ＩＰＴＧでの誘導の４時間後、細胞を遠心分離によって回収した。
【０３９０】
次いで、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、そして再び遠心分離した。上清を廃棄し、そして細胞を、将来の使用のために凍結または即時処理のいずれかを行った。２０ｍｌの溶解緩衝液を細胞ペレットに添加し、そしてボルテックスした。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を破裂させて開くために、この混合物を１６，０００ｐｓｉの圧力のフレンチプレス（ｆｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓ）を通過させた。次いで細胞を再び遠心分離し、そして上清およびペレットを、組換えタンパク質の分配のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックした。
【０３９１】
細胞ペレットに局在化されたタンパク質については、ペレットを１０ｍＭのＴｒｉｓ　ｐＨ８．０、１％のＣＨＡＰＳ中に再懸濁し、そして封入体ペレットを洗浄し、そして再び遠心分離した。この手順をさらに２回繰り返した。洗浄した封入体ペレットを、８Ｍの尿素、または１０ｍＭのＴｒｉｓ　ｐＨ８．０および１０ｍＭのイミダゾールを含有している６ＭのグアニジンＨＣｌのいずれかで可溶化した。可溶化したタンパク質を、５ｍｌのニッケルキレート樹脂（Ｑｉａｉｇｅｎ）に添加し、そして持続的に攪拌しながら室温で４５分から１時間の間インキュベートした。
【０３９２】
インキュベーション後、この樹脂およびタンパク質混合物を、使い捨てカラムを通じて注ぎ、そしてフロースルーを回収した。次いで、カラムを、１０〜２０倍のカラム容量の可溶化緩衝液で洗浄した。次いで、抗原を、８Ｍの尿素、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、および３００ｍＭのイミダゾールを使用してカラムから溶出させ、そして３ｍｌの画分中に回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、どの画分をさらなる精製のためにプールするかを決定するために行った。
【０３９３】
最後の精製工程として、強力な陰イオン交換樹脂（この場合は、Ｈｉ−Ｐｒｅｐ　Ｑ（Ｂｉｏｒａｄ））を適切な緩衝液を用いて平衡化し、そして上記からプールした画分をカラム上に充填した。それぞれの抗原を、漸増塩勾配を用いてカラムから溶出させた。画分をカラムを流出させるとともに回収し、そして別のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、カラムに由来するどの画分をプールするかを決定するために行った。
【０３９４】
プールした画分を、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に対して透析した。放出基準は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＨＰＬＣによって決定する場合には純度、Ｌｏｗｒｙアッセイまたはアミノ酸分析によって決定する場合には濃度、アミノ末端のタンパク質配列によって決定する場合には同一性であり、そして内毒素レベルをＬｉｍｕｌｕｓ（ＬＡＬ）アッセイによって決定した。次いで、タンパク質を、０．２２ミクロンのフィルターを通じる濾過後にバイアルに入れ、そして抗原を免疫化のために必要とされるまで凍結させた。
【０３９５】
Ｌ９８５Ｐペプチド＃３４８２を合成し、そしてＫＬＨに結合させ、そして免疫化のために必要とされるまで凍結させた。
【０３９６】
ポリクローナル抗血清を、１００μｇのムラミルジペプチド（ＭＤＰ）と混合した４００μｇのそれぞれの肺抗原を使用して作成した。等量の不完全なフロイトのアジュバント（ＩＦＡ）を添加し、次いで混合し、そしてウサギに皮下（Ｓ．Ｃ．）注射した。４週間後、ウサギを、等量のＩＦＡと混合した２００μｇの抗原を用いて、Ｓ．Ｃ．で追加免疫した。その後、ウサギを、１００μｇの抗原を用いてＩ．Ｖ．で追加免疫した。それぞれの追加免疫の７日後に、動物を放血させた。次いで、血液を４℃で１２〜２４時間の間インキュベートし、その後遠心分離して血清を作成した。
【０３９７】
ポリクローナル抗血清を、抗原でコートした９６ウェルプレートを使用し、そして５０μｌ（典型的には、１μｇ／μｌ）のポリクローナル抗血清とともに４℃で２０時間の間インキュベートすることによって特徴付けた。
【０３９８】
２５０μｌのＢＳＡブロッキング緩衝液をウェルに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎで６回洗浄した。ウサギ血清をＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ／０．１％のＢＳＡ中に稀釈した。５０μｌの稀釈した血清をそれぞれのウェルに添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、次いで、１：１００００希釈の５０μｌのヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を添加し、そして室温で３０分間インキュベーションした。
【０３９９】
プレートを上記のように洗浄し、そして１００μｌのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）をそれぞれのウェルに添加した。室温で暗所での１５分のインキュベーション後、比色定量反応を、１００μｌの１ＮのＨ２ＳＯ４を用いて停止させ、そして直ちに４５０ｎｍで読み取った。全てのポリクローナル抗体が、適切な抗原に対する免疫反応性を示した。
【０４００】
表１８〜２０は、３個の肺抗原（Ｌ５４８Ｓ、Ｌ５５２Ｓ、およびＬ９５８Ｐペプチド＃３４８２）に対する、段階稀釈物中のウサギ抗血清の抗体反応性を示す。第１列目は抗体稀釈を示す。列「予備免疫血清」は、予備免疫血清を使用した２つの実験についてのＥＬＩＳＡのデータを示す。これらの結果を、４列目で平均する。列「抗Ｌ５４８Ｓ、Ｌ５５２Ｓ、または＃３４８２」は、それぞれの抗原（表中でＬ５４８Ｓ、Ｌ５５２Ｓ、または＃３４８２のいずれかと呼ぶ）を使用して、上記に記載したように免疫したウサギ由来の血清を使用した２つの実験のＥＬＩＳＡデータを示す。
【０４０１】
【表２４】
Figure 2004512824
【０４０２】
【表２５】
Figure 2004512824
【０４０３】
【表２６】
Figure 2004512824
表２１は、肺抗原Ｌ５４８Ｓに対する抗体のプロテインＡ精製を示す。
【０４０４】
【表２７】
Figure 2004512824
表２２は、肺抗原Ｌ５５２Ｓに対する抗体の親和性精製を示す。
【０４０５】
【表２８】
Figure 2004512824
表２３Ａおよび２３Ｂは、肺抗原Ｌ９８５Ｐペプチド＃３４８２に対する抗体の親和性精製およびプロテインＡ精製を示す。
【０４０６】
【表２９】
Figure 2004512824
【０４０７】
【表３０】
Figure 2004512824
（実施例２１）
（Ｌ１４３９Ｐの延長したｃＤＮＡ配列のクローニング）
クローン＃６１１４４の部分的なｃＤＮＡ配列（配列番号１７６１、クローンＬ１４３９Ｄとも呼ぶ）を、肺チップ５についての小細胞性肺癌腫のＰＣＲに基づくサブトラクションライブラリーから同定した。実施例４に先に開示したように、マイクロアレイ分析を、種々の腫瘍および正常組織中でのそれらの発現プロフィールをさらに評価するために、肺腫瘍配列のこのサブセットについて行い、その結果を表１１に提供する。クローンＬ１４３９Ｐが、正常組織に対して、腫瘍プローブ群中での２倍以上の過剰発現を有し、そして正常組織中での平均の発現は０．２未満であることを見出した。さらなる研究は、この同じクローンが小細胞性肺癌腫のサブセットにおいて過剰発現されることを示した（表１６を参照のこと）。
【０４０８】
さらなる研究によって、Ｌ１４３９Ｐのクローン化された配列の全長のｃＤＮＡの単離を得た。遺伝子の転写物の大きさを決定するために、複数の組織のノーザンブロットを、放射標識した最初にクローン化した配列（配列番号１１８０）でプローブした。ノーザンブロットには、小細胞性肺癌腫および正常組織のサンプルに由来する約１０μｇの全ＲＮＡを含んだ。露光させたフィルムの視覚的な分析によって、約２．４ｋｂの単一の転写物が明らかとなった。このクローンの延長した配列を、小細胞性肺癌腫腫瘍のｃＤＮＡライブラリーを、最初にクローン化した配列（配列番号１７６１）の放射標識プローブを用いてスクリーニングすることによって得た。ｃＤＮＡライブラリー由来の約１２０，０００個のクローンをスクリーニングし、そして１．５ｋｂのｃＤＮＡ挿入物を含有している１個の固有のクローンを単離した。この延長したｃＤＮＡ配列を、配列番号１９３１に提供し、そしてこの延長したｃＤＮＡ配列によってコードされる推定されるアミノ酸配列を、配列番号１９３２に提供する。この延長したｃＤＮＡ配列を、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに対して分析し、そしてＮＵＦ２Ｒ遺伝子（ＡＦ３２６７３１）に対して類似性を示すことを見出した。ＮＵＦ２Ｒの全長のｃＤＮＡ配列を、配列番号１９３３に提供する。そしてＮＵＦ２Ｒによってコードされる推定されるアミノ酸配列を、配列番号１９３４に提供する。
【０４０９】
（実施例２２）
（ヒスチジンタグを含まないＬ５５２Ｓ融合タンパク質のＭｅｇａｔｅｒｉｕｍ中での発現）
ＰＣＲを、以下のプライマーを用いてＬ５５２Ｓコード領域について行った：
順方向プライマー　ＰＤＭ−７３７　５’ｃｔａｔｇｔｔｇｇｃａｔｇｃｇｇｔｇｃｃａｃｇｃｃｃ　３’（配列番号１９３５）　Ｔｍ６６℃
逆方向プライマー　ＰＤＭ−７３８　５’ｃａｃｇｃｃｔａａｇａｔｃｔｔｃａｔｔａａａｃｔｔｇｔｇｇｔｔｇ　３’（配列番号１９３６）　Ｔｍ６０℃。
【０４１０】
ＰＣＲ条件は以下であった：
１０μｌ　１０×Ｐｆｕ緩衝液
１．０μｌ　１０ｍＭのｄＮＴＰ
２．０μｌ　１０μＭのそれぞれのプライマー
８３μｌ　滅菌水
１．５μｌ　Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇ　ＤＮＡ
９６℃で２分間、９６℃で２０秒間、６３℃で１５秒間、７２℃で１分間を４０サイクル、次いで７２℃で４分間。
【０４１１】
ＰＣＲ産物を、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、次いでｐＭＥＧ−３中（ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素で消化した）にクローン化した。正確な構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認し、次いで発現のためにＭｅｇａｔｅｒｉｕｍ細胞中に形質転換した。
【０４１２】
発現した組換えＬ５５２Ｓのアミノ酸配列を、配列番号１９３７に示し、そしてＤＮＡコード領域の配列を、配列番号１９３８に示す。
【０４１３】
（実施例２３）
（ヒスチジンタグを含まないＬ５５２Ｓ融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ中での発現）
ＰＣＲを、以下のプライマーを用いてＬ５５２Ｓコード領域について行った：
順方向プライマー　ＰＤＭ−７３６　５’ｃｔａｔｇｔｔｇｃａｔａｔａｔｇｃｇｇｔｇｃｃａｃｇｃｃ　３’（配列番号１９３９）　Ｔｍ６４℃
逆方向プライマー　ＰＤＭ−４８０　５’ｃｔｇａｇａａｔｔｃａｔｔａａａｃｔｔｇｔｇｇｔｔｇｃｔｃｔｔｃａｃｃ　３’（配列番号１９２０）　Ｔｍ６２℃。
【０４１４】
ＰＣＲ条件は以下であった：
１０μｌ　１０×Ｐｆｕ緩衝液
１．０μｌ　１０ｍＭのｄＮＴＰ
２．０μｌ　１０μＭのそれぞれのプライマー
８３μｌ　滅菌水
１．５μｌ　Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇ　ＤＮＡ
９６℃で２分間、９６℃で２０秒間、６３℃で１５秒間、７２℃で１分間を４０サイクル、次いで７２℃で４分間。
【０４１５】
ＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、次いでｐＰＤＭ中（ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した改変型ｐＥＴ２８ベクター）にクローン化した。正確な構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認し、次いで発現のためにＢＬＲ　ｐＬｙｓ　ＳおよびＨＭＳ　１７４　ｐＬｙｓＳ細胞中に形質転換した。
【０４１６】
発現した組換えＬ５５２Ｓのアミノ酸配列を、配列番号１９４０に示し、そしてＤＮＡコード領域の配列を、配列番号１９４１に示す。
【０４１７】
（実施例２４）
（インビトロの全遺伝子感作を使用するＬ５５２Ｓ特異的ＣＴＬ株の作成）
腫瘍抗原ワクシニア感染ＤＣを用いるインビトロでの全遺伝子感作（Ｙｅｅら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５７（９）：４０７９−８６、１９９６）を使用して、インターフェロンγ　ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定したＬ５５２Ｓ腫瘍抗原で形質導入した自己由体繊維芽細胞を特異的に認識する、ヒトＣＴＬ株を導いた。詳細には、樹状細胞（ＤＣ）を、１０％のヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦ、および３０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４を含有しているＲＰＭＩ培地中で５日間増殖させることによって正常なヒトドナーのＰＢＭＣから誘導した、Ｐｅｒｃｏｌｌ精製した単球から分化させた。培養後、ＤＣを、５の感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）でＬ５５２Ｓを発現する組換えアデノウイルスとともに一晩感染させ、そして２μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドの添加によって一晩成熟させた。次いで、ウイルスを、ＵＶ照射によって不活化させた。ＣＤ８＋細胞を、ＣＤ４＋およびＣＤ１４＋細胞の除去によって富化させた。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気ビーズシステムを使用して単離し、そして培養物の感作を、サイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１２を用いて６個の９６ウェルプレートの個々のウェル中で開始した。培養物を、Ｌ５５２ＳおよびＩＬ−２の存在下での同時刺激分子ＣＤ８０でレトロウイルスによって形質導入した自己由来の初代繊維芽細胞を使用して、７〜１０日毎に再刺激した。３回の刺激サイクルの後、２個のＣＤ８＋Ｔ細胞株（２−１２Ｇおよび４−７Ａ）を、インターフェロン−γ　ＥＬＩＳＰＯＴ分析（これにより、Ｌ５５２Ｓ腫瘍抗原で形質導入した自己由来繊維芽細胞で刺激した場合に、特異的にインターフェロンγを生じるが、対照抗原を用いた場合には生じない）を使用して同定した。両方の株を再刺激し、そして特異的ＨＬＡに対する拘束を決定するために、抗体ブロッキングアッセイにおいて再度試験した。株２−１２Ｇは、ＨＬＡ−Ｂ／Ｃ拘束のようであるが、一方、株４−７ＡはＨＬＡ−Ａ拘束のようである。株２−１２Ｇを、抗ＣＤ３およびフィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌ）を使用してクローン化し、１４個の特異的クローンを回収した。これらのクローンは、、抗体ブロッキングアッセイにおいて親のＬ２−１２Ｇ　ＣＴＬ株と同じパターンの反応性を有する。さらに、Ｌ５５２Ｓを発現するベクターで形質導入したＨＬＡ不適合Ｂ−ＬＣＬ株のパネルの使用、およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＣＴＬ株によるインターフェロンγの産生の測定によると、これらのＣＴＬはＨＬＡ−Ｂ＊４４０２によって拘束されるようである。
【０４１８】
（実施例２５）
（Ｌ５５２Ｓ−およびＸＡＧＥ−１−特異的抗体のエピトープマッピング）
Ｌ５５２ＳがＸＡＧＥ−１の別のスプライシングアイソフォームであることを先に見出した。本実施例においては、Ｌ５５２ＳおよびＸＡＧＥ−１についてそれぞれ特異的な抗体についての肺癌患者の血清をスクリーニングするために、Ｌ５５２ＳまたはＸＡＧＥ−１のいずれかについて特異的な２０マーのペプチドを使用して、データを得た。個々の癌患者が、Ｌ５５２ＳならびにＸＡＧＥ−１に特異的な両方の抗体を産生することを見出した。これらの特異的抗体は、Ｌ５５２Ｓの以下のさらなるエピトープおよびＸＡＧＥ−１の２個のエピトープを主に認識する：
Ｌ５５２Ｓ特異的：
ａａ３１−５０：ＬＧＣＣＷＧＹＰＳＰＲＳＴＷＮＤＲＰＦ（配列番号１９４２）
ＸＡＧＥ−１特異的：
ａａ１１−３０：ＣＳＬＧＶＦＰＳＡＰＳＰＶＷＧＴＲＲＳＣ（配列番号１９４３）
ａａ４１−５０：ＩＬＳＰＬＬＲＨＧＧＨＴＱＴＱＮＨＴＡＳ（配列番号１９４４）。
【０４１９】
（実施例２６）
（Ｌ５５２Ｓの免疫組織化学的分析）
種々の正常組織および肺癌組織中でのＬ５５２Ｓタンパク質の発現を決定するために、免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析を、親和性精製したＬ５５２Ｓポリクローナル抗体を使用して行った。詳細には、組織サンプルを。１２〜２４時間の間ホルマリン溶液中に固定し、そしてパラフィン中に包埋し、その後８ミクロンの切片に薄く切断した。０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中の蒸気熱で誘導したエピトープ読み出し（ｓｔｅａｍ　ｈｅａｔ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｅｐｉｔｏｐｅ　ｒｅｔｒｉｅｖａｌ（ＳＨＩＥＲ））を、最適な染色条件に使用した。切片を１０％の血清／ＰＢＳとともに５分間インキュベートした。一次抗体を、示した濃度で２５分間それぞれの切片に対して添加し、その後、抗ウサギまたは抗マウスビオチニル化抗体のいずれかとともに２５分間インキュベートした。内因性のペルオキシダーゼ活性を、過酸化水素との３回の１．５分間のインキュベーションによってブロックした。アビジンビオチン複合体／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＢＣ／ＨＲＰ）システムを、Ｌ５５２Ｓの発現を視覚化するために、ＤＡＢ色素原とともに使用した。スライドを、細胞核を視覚化するためにヘマトキシリンで対比染色した。
【０４２０】
Ｌ５５２ＳのＩＨＣ分析を表２４に開示する：
【０４２１】
【表３１】
Figure 2004512824
（実施例２７）
（Ｌ５５２Ｓ由来のＣＤ４免疫原性Ｔ細胞エピトープの同定）
抗原Ｌ５５２Ｓ（配列番号８０９）に特異的なＣＤ４　Ｔ細胞株を以下のように作成した。全長のＬ５５２Ｓ（配列番号８０９）のアミノ酸残基に対応している１５個のアミノ酸によって重複している、全部で３０個の２０マーのペプチドを合成した。３０個の２０マーのペプチドのそれぞれのアミノ酸配列、およびこれらのペプチドのそれぞれをコードするそれぞれのＤＮＡ配列を、表２５に提供する。樹状細胞（ＤＣ）を、可塑性接着剤によって正常な雄性ヒトドナーのＰＢＭＣから誘導したＰｅｒｃｃｏｌｌ精製した単球から分化させ、そして１０％のヒト血清、５０ｎｇのヒトＧＭ−ＣＳＦ、および３０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４を含有しているＲＰＭＩ培地中で５日間増殖させた。精製したＣＤ４　Ｔ細胞を、ＭＡＣビーズおよびＰＢＭＣのネガティブ選択を使用してＤＣとして同じドナーから作成した。ＤＣを、０．５μｇ／ｍＬの個々の濃度で各ペプチドを用いて、２０マーのペプチドのプールを用いて一晩パルスした。パルスしたＤＣを洗浄し、そして９６ウェル丸底プレートの１つのウェルあたり１０，０００個の細胞でプレートし、そして精製したＣＤ４　Ｔ細胞を、１つのウェルあたり１００，０００個の細胞で添加した。培養物に、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６および５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２を補充し、そして３７℃でインキュベートした。
【０４２２】
培養物を、１０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２および５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７を補充した、ＡＰＣについての上記と同様に作成しそしてパルスしたＤＣを使用して１週間の基準で上記のように再刺激した。３回のインビトロでの刺激サイクル（最初の感作＋２回の再刺激）の後、株（それぞれの株が１つのウェルに対応する）を、分類した無関係な抗原に由来するペプチドの無関係なペプチドのプールに対して、刺激プールに応答する特異的増殖およびサイトカインの産生について試験した。個々のＣＤ４　Ｔ細胞株の数（ＩＦＮγによって４９／５７６、増殖によって６３／５７６）が、Ｌ５５２Ｓペプチドのプールに応答して有意なサイトカインの放出（ＩＦＮγ）および増殖を示したが、対照ペプチドのプールについてはそうではなかった。特異的活性を示したＴ細胞株のうちの２５個を、Ｌ５５２Ｓペプチドの適切なプールについて再刺激し、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で作成した個々のペプチドまたは組換えタンパク質でパルスした自己由来ＤＣについて再度アッセイした。約１３個の免疫原性ペプチドが、試験したペプチド抗原の全てのセットに由来するＴ細胞によって認識された。これらの１３個のペプチド（＊）を表２５に示す。
【０４２３】
いくつかの場合においては、Ｔ細胞株のペプチド反応性は、単一のペプチドに対してマップされ得るが、いくつかはそれぞれのプール中の１つ以上のペプチドに対してマップされ得る。この結果は、１３個のペプチドの全てが、Ｌ５５２Ｓタンパク質の本来保有しているエピトープであり得ることを示す。
【０４２４】
【表３２】
Figure 2004512824
Figure 2004512824
（実施例２８）
（Ｌ５５２ＳのＨＬＡ拘束）
ＨＬＡ拘束を決定するために、１個または２個のＨＬＡ対立遺伝子と適合する繊維芽細胞のパネルを、ｐＢＩＢ　Ｌ５５２で形質導入したか、または５０：１のＭＯＩでアデノウイルスＬ５５２で感染させた。これらの標的を、１ウェルあたり１００００個の繊維芽細胞、１００００個のＴ細胞、および５Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＤ７７　Ｌ５５２　ＣＤ８クローンに対して試験した。結果は、拘束が、Ｂ＊４４０２またはＣｗ＊０５０１のいずれかであることを示す。
【０４２５】
２つの間を決定するために、ＣＯＳ−７細胞を、ｐｃＤＮＡ３　Ｌ５５２Ｓと、ｐｃＤＮＡ３　Ｂ＊４４０２またはｐＢＩＢ　Ｃｗ＊０５０１との組合せでトランスフェクトした。これらの標的を、再び、１ウェルあたり１００００個のＣＯＳ−７、１００００個のクローン１４、および５Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、上記のように同じＤ７７　Ｌ５５２　ＣＤ８クローンに対して試験した。クローンは、Ｌ５５２およびＢ＊４４０２でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を認識した。
【０４２６】
さらなる研究においては、３個の異なる腫瘍（６５９−２２、３−９０Ｔ、およびＨＴＢ　１８３）（これらは、Ｌ５５２メッセージレベルについてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって先に分析した）を選択し、そしてＢ＊４４０２、または対照としてのＣｗ＊０５０１で形質導入した。６５９−２２および３−９０Ｔは、Ｌ５５２メッセージを含むが、ＨＴＢ　１８３はネガティブコントロールであった。２回の選択の後、腫瘍を、それらのＢ４４の発現レベルについてＦＡＣＳによって分析した。６５９−２２が、Ｂ４４を内因的に高いレベルで発現することを見出したが、Ｂ４４、Ｂ＊４４０２、Ｂ＊４４０４などのうちのどれが発現されるかは決定できなかった。約２０％の３−９０ＴがＢ４４を発現した。ＨＴＢ１８３はＢ４４を極めて十分に発現する。上記のクローンを、これらの腫瘍に対して試験した場合には、Ｂ＊４４０２で形質導入した６５９−２２が認識された。従って、結果は、Ｌ５５２がＨＬＡ−Ｂ＊４４０２によって拘束されることを示す。
【０４２７】
（実施例２９）
（Ｌ５５２ＳおよびＸＡＧＥ−１の発現）
本実施例においては、肺癌のＸＡＧＥ−１によるＬ５５２Ｓの発現を正確に説明するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を、Ｌ５５２Ｓの５’固有の領域、ＸＡＧＥ−１の５’固有の領域、および３’共通の領域に配置される特異的プライマーを使用して行った。Ｌ５５２ＳおよびＸＡＧＥ−１についての特異的なメッセージを、２つの肺腫瘍サンプル中で検出したが、正常な肺サンプル中では検出できなかった。
【０４２８】
同一の発現プロフィールを、Ｌ５５２Ｓの５’固有領域と、共通の３’配列との間で観察した。ＸＡＧＥ−１の５’固有プライマーを使用して肺腫瘍中で検出したＸＡＧＥ−１のメッセージレベルは、Ｌ５５２Ｓと比較してはるかに低かった。しかし、ＸＡＧＥ−１によって保有される極端な二次構造は、ＸＡＧＥ−１に固有の５’配列のｃＤＮＡ合成を阻止し得る。従って、ＸＡＧＥ−１がより豊富なアイソフォームであり得ることが、ノーザン分析によって明らかである。
【０４２９】
（実施例３０）
（Ｌ５５２ＳおよびＸＡＧＥ−１のＥＳＴ発現プロフィール）
Ｌ５５２ＳおよびＸＡＧＥ−１の発現プロフィールをさらに評価するために、電気的発現プロファイリングを、それぞれの抗原について行った。これを、公開されているＥＳＴデータベースに対して、実施例２９に開示するものと同じ特異的プライマーを用いる検索によって行った。このプロファイリングの結果によって、遺伝子の２つのアイソフォームが存在することを確認する。Ｌ５５２ＳとＸＡＧＥ−１との間での発現の比は、約１：５である。さらに、Ｌ５５２ＳおよびＸＡＧＥ−１は、肝細胞癌、ＣＭＬ、生殖細胞腫瘍、ユーイング肉腫、およびＡｌｖｅｏｌａｒ　Ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ中で発現されるようである。
【０４３０】
（実施例３１）
（Ｌ９８５Ｐ肺腫瘍抗原の表面発現）
小細胞性肺癌腫（ＳＣＬＣ）細胞株、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ１２８、ＨＴＢ−１７１、ＨＴＢ−１７３、ＨＴＢ−１７５、およびＤＭＳ　７９を、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有しているＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で３７℃にて、７％のＣＯ２を用いて増殖させた。次いで、これらの増殖しているＳＣＬＣ細胞株を、Ｌ９８５ＰがこれらのＳＣＬＣ細胞株の表面上で発現されるかどうかを決定するために、Ｌ９８５Ｐの予想される細胞外領域に対して惹起させたＬ９８５Ｐペプチドポリクローナル血清を使用してＦＡＣＳ分析に供した。
【０４３１】
ＦＡＣＳ分析のために、細胞を回収し、そして氷冷した染色緩衝液（ＰＢＳ＋１％のＢＳＡ＋Ａｚｉｄｅ＋１０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ）で洗浄した。次に、細胞を、一次抗体なしで、無関係なウサギＩｇＧとともに、最終濃度２０μｇ／ｍｌで全分子を用いて、またはＬ９８５Ｐペプチド＃３４８２（配列番号１９３０）に対して惹起させた親和性精製したウサギポリクローナル血清を最終濃度２０μｇ／ｍｌで用いてのいずれかで、氷上で１時間インキュベートした。Ｌ９８５Ｐペプチド＃３４８２の配列（配列番号１９３０）は、Ｌ９８５Ｐタンパク質の推定される細胞外領域を示す。細胞を、染色緩衝液で２回洗浄し、次いで１：１００稀釈のヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに氷上で３０分間インキュベートした。２回の洗浄後、細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有している染色緩衝液中に再懸濁した、浸透性の細胞の同定を可能にするバイアル染色を行い、そしてＦＡＣＳによって分析した。
【０４３２】
さらに、リアルタイムＰＣＲを、Ｌ９８５Ｐ　ｍＲＮＡがこれらのＳＣＬＣ細胞株中で発現されるかどうかを決定するために行った。ＦＡＣＳ分析およびｍＲＮＡの発現のリアルタイムＰＣＲの結果を、表２６に示す。
【０４３３】
【表３３】
Figure 2004512824
本発明の特定の実施形態が、説明の目的のために本明細書中に記載されているが、種々の改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行われ得ることが、上記から明らかである。従って、本発明は、添付される特許請求の範囲による場合を除いて、限定されない。

Claims (19)

  1. 単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
    （ａ）配列番号８７８〜１２３９、１２４０、１２４３、１２４７、１２６９、１２７２、１２８０、１２８３、１２８５、１２８６、１２８９、１３００、１３０９、１３１８、１３１９、１３２７、１３３５、１３３９、１３４６、１３５９、１３６９、１３７０、１３７１、１３９３、１３９８、１４０５、１４０８、１４１３、１４１４、１４１７、１４２２、１４２９、１４３２、１４３５、１４３６、１４３８〜１４４２、１４４７、１４５０、１４５３、１４６３、１４６７、１４７０、１４７３、１４７５、１４８２、１４８６、１４９１〜１４９４、１５０１、１５０５、１５０６、１５１４〜１５１７、１５２０、１５２２、１５２４、１５３５、１５３８、１５４２、１５４３、１５４７、１５５４、１５５７、１５５９、１５６１、１５６３〜１６６４、１６６８、１６６９、１６８０〜１７０６、１７０８〜１７３２、１７３４、１７３６〜１７５７、１７５９〜１７６５、１７６７〜１７７０、１７７２〜１７７４、１７７６〜１７８９、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５〜１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１９１８、１９２２、１９３１、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２において提供される配列；
    （ｂ）配列番号８７８〜１２３９、１２４０、１２４３、１２４７、１２６９、１２７２、１２８０、１２８３、１２８５、１２８６、１２８９、１３００、１３０９、１３１８、１３１９、１３２７、１３３５、１３３９、１３４６、１３５９、１３６９、１３７０、１３７１、１３９３、１３９８、１４０５、１４０８、１４１３、１４１４、１４１７、１４２２、１４２９、１４３２、１４３５、１４３６、１４３８〜１４４２、１４４７、１４５０、１４５３、１４６３、１４６７、１４７０、１４７３、１４７５、１４８２、１４８６、１４９１〜１４９４、１５０１、１５０５、１５０６、１５１４〜１５１７、１５２０、１５２２、１５２４、１５３５、１５３８、１５４２、１５４３、１５４７、１５５４、１５５７、１５５９、１５６１、１５６３〜１６６４、１６６８、１６６９、１６８０〜１７０６、１７０８〜１７３２、１７３４、１７３６〜１７５７、１７５９〜１７６５、１７６７〜１７７０、１７７２〜１７７４、１７７６〜１７８９、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５〜１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１９１８、１９２２、１９３１、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２において提供される配列の相補体；
    （ｃ）配列番号８７８〜１２３９、１２４０、１２４３、１２４７、１２６９、１２７２、１２８０、１２８３、１２８５、１２８６、１２８９、１３００、１３０９、１３１８、１３１９、１３２７、１３３５、１３３９、１３４６、１３５９、１３６９、１３７０、１３７１、１３９３、１３９８、１４０５、１４０８、１４１３、１４１４、１４１７、１４２２、１４２９、１４３２、１４３５、１４３６、１４３８〜１４４２、１４４７、１４５０、１４５３、１４６３、１４６７、１４７０、１４７３、１４７５、１４８２、１４８６、１４９１〜１４９４、１５０１、１５０５、１５０６、１５１４〜１５１７、１５２０、１５２２、１５２４、１５３５、１５３８、１５４２、１５４３、１５４７、１５５４、１５５７、１５５９、１５６１、１５６３〜１６６４、１６６８、１６６９、１６８０〜１７０６、１７０８〜１７３２、１７３４、１７３６〜１７５７、１７５９〜１７６５、１７６７〜１７７０、１７７２〜１７７４、１７７６〜１７８９、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５〜１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１９１８、１９２２、１９３１、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２において提供される配列のうち、少なくとも２０個連続した残基を含む配列；
    （ｄ）配列番号８７８〜１２３９、１２４０、１２４３、１２４７、１２６９、１２７２、１２８０、１２８３、１２８５、１２８６、１２８９、１３００、１３０９、１３１８、１３１９、１３２７、１３３５、１３３９、１３４６、１３５９、１３６９、１３７０、１３７１、１３９３、１３９８、１４０５、１４０８、１４１３、１４１４、１４１７、１４２２、１４２９、１４３２、１４３５、１４３６、１４３８〜１４４２、１４４７、１４５０、１４５３、１４６３、１４６７、１４７０、１４７３、１４７５、１４８２、１４８６、１４９１〜１４９４、１５０１、１５０５、１５０６、１５１４〜１５１７、１５２０、１５２２、１５２４、１５３５、１５３８、１５４２、１５４３、１５４７、１５５４、１５５７、１５５９、１５６１、１５６３〜１６６４、１６６８、１６６９、１６８０〜１７０６、１７０８〜１７３２、１７３４、１７３６〜１７５７、１７５９〜１７６５、１７６７〜１７７０、１７７２〜１７７４、１７７６〜１７８９、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５〜１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１９１８、１９２２、１９３１、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２において提供される配列に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
    （ｅ）配列番号８７８〜１２３９、１２４０、１２４３、１２４７、１２６９、１２７２、１２８０、１２８３、１２８５、１２８６、１２８９、１３００、１３０９、１３１８、１３１９、１３２７、１３３５、１３３９、１３４６、１３５９、１３６９、１３７０、１３７１、１３９３、１３９８、１４０５、１４０８、１４１３、１４１４、１４１７、１４２２、１４２９、１４３２、１４３５、１４３６、１４３８〜１４４２、１４４７、１４５０、１４５３、１４６３、１４６７、１４７０、１４７３、１４７５、１４８２、１４８６、１４９１〜１４９４、１５０１、１５０５、１５０６、１５１４〜１５１７、１５２０、１５２２、１５２４、１５３５、１５３８、１５４２、１５４３、１５４７、１５５４、１５５７、１５５９、１５６１、１５６３〜１６６４、１６６８、１６６９、１６８０〜１７０６、１７０８〜１７３２、１７３４、１７３６〜１７５７、１７５９〜１７６５、１７６７〜１７７０、１７７２〜１７７４、１７７６〜１７８９、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５〜１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１９１８、１９２２、１９３１、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２の配列に対して、少なくとも７５％の同一性を有する配列；
    （ｆ）配列番号８７８〜１２３９、１２４０、１２４３、１２４７、１２６９、１２７２、１２８０、１２８３、１２８５、１２８６、１２８９、１３００、１３０９、１３１８、１３１９、１３２７、１３３５、１３３９、１３４６、１３５９、１３６９、１３７０、１３７１、１３９３、１３９８、１４０５、１４０８、１４１３、１４１４、１４１７、１４２２、１４２９、１４３２、１４３５、１４３６、１４３８〜１４４２、１４４７、１４５０、１４５３、１４６３、１４６７、１４７０、１４７３、１４７５、１４８２、１４８６、１４９１〜１４９４、１５０１、１５０５、１５０６、１５１４〜１５１７、１５２０、１５２２、１５２４、１５３５、１５３８、１５４２、１５４３、１５４７、１５５４、１５５７、１５５９、１５６１、１５６３〜１６６４、１６６８、１６６９、１６８０〜１７０６、１７０８〜１７３２、１７３４、１７３６〜１７５７、１７５９〜１７６５、１７６７〜１７７０、１７７２〜１７７４、１７７６〜１７８９、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５〜１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１９１８、１９２２、１９３１、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２の配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する配列；ならびに
    （ｇ）配列番号８７８〜１２３９、１２４０、１２４３、１２４７、１２６９、１２７２、１２８０、１２８３、１２８５、１２８６、１２８９、１３００、１３０９、１３１８、１３１９、１３２７、１３３５、１３３９、１３４６、１３５９、１３６９、１３７０、１３７１、１３９３、１３９８、１４０５、１４０８、１４１３、１４１４、１４１７、１４２２、１４２９、１４３２、１４３５、１４３６、１４３８〜１４４２、１４４７、１４５０、１４５３、１４６３、１４６７、１４７０、１４７３、１４７５、１４８２、１４８６、１４９１〜１４９４、１５０１、１５０５、１５０６、１５１４〜１５１７、１５２０、１５２２、１５２４、１５３５、１５３８、１５４２、１５４３、１５４７、１５５４、１５５７、１５５９、１５６１、１５６３〜１６６４、１６６８、１６６９、１６８０〜１７０６、１７０８〜１７３２、１７３４、１７３６〜１７５７、１７５９〜１７６５、１７６７〜１７７０、１７７２〜１７７４、１７７６〜１７８９、１８２４、１８２６〜１８２９、１８６５〜１８６８、１８７３、１８７５〜１８７７、１８７９、１８８１、１８８３、１９１８、１９２２、１９３１、１９３８、１９４１および１９７４〜２００２において提供される配列の、縮重改変体、
    からなる群より選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  2. 単離されたポリペプチドであって、以下：
    （ａ）配列番号１６６７、１６７０〜１６７５、１６７８、１８０６〜１８２２、１８２５、１８３０〜１８３３、１８３４〜１８５６、１８６３、１８６９〜１８７２、１８７４、１８７６、１８７８、１８８０、１８８４〜１８９０、１９１３、１９１７、１９２１、１９２７〜１９３０、１９３２、１９３４、１９３７、１９４０および１９４２〜１９７３；
    （ｂ）配列番号１６６７、１６７０〜１６７５、１６７８、１８０６〜１８２２、１８２５、１８３０〜１８３３、１８３４〜１８５６、１８６３、１８６９〜１８７２、１８７４、１８７６、１８７８、１８８０、１８８４〜１８９０、１９１３、１９１７、１９２１、１９２７〜１９３０、１９３２、１９３４、１９３７、１９４０および１９４２〜１９７３において提供されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有する配列；
    （ｃ）配列番号１６６７、１６７０〜１６７５、１６７８、１８０６〜１８２２、１８２５、１８３０〜１８３３、１８３４〜１８５６、１８６３、１８６９〜１８７２、１８７４、１８７６、１８７８、１８８０、１８８４〜１８９０、１９１３、１９１７、１９２１、１９２７〜１９３０、１９３２、１９３４、１９３７、１９４０および１９４２〜１９７３において提供されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する配列；
    （ｄ）請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列；
    （ｅ）請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有する配列；ならびに
    （ｆ）請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する配列、
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  3. 発現制御配列に作動可能に連結した請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  4. 請求項３に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトした、宿主細胞。
  5. 単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、以下：
    （ａ）請求項２に記載のポリペプチド；ならびに
    （ｂ）配列番号１９４８〜１９５１、１９５９、１９６２〜１９６８および１９７１において提供されるポリヌクレオチド配列またはその相補体によってコードされるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド、
    からなる群より選択されるポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. 前記ポリペプチドが、配列番号１９２７〜１９２９および１９４２〜１９７３において提供される、請求項５に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  7. 患者における癌の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）該患者から、生物学的サンプルを得る工程；
    （ｂ）該生物学的サンプルを、以下：
    （ｉ）請求項２に記載のポリペプチド、
    （ｉｉ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９２５、１９２６および１９３４において提供されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （ｉｉｉ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９２５、１９２６および１９３４において提供されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド、
    （ｉｖ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９２５、１９２６および１９３４において提供されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド、
    （ｖ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４および１９３３において提供されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、ならびに
    （ｖｉ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４および１９３３において提供される配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、
    からなる群より選択されるポリペプチドに結合する結合因子と接触させる工程；
    （ｃ）該結合因子に結合するポリペプチドの量を、該サンプルにおいて検出する工程；ならびに
    （ｄ）該ポリペプチドの量を、所定のカットオフ値と比較し、それにより該患者における癌の存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  8. 融合タンパク質であって、以下：
    （ｉ）請求項２に記載のポリペプチド、
    （ｉｉ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９２５、１９２６および１９３４において提供されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （ｉｉｉ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９２５、１９２６および１９３４において提供されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド、
    （ｉｖ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９２５、１９２６および１９３４において提供されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド、
    （ｖ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６、１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４および１９３３において提供されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、ならびに
    （ｖｉ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４および１９３３において提供される配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
    からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む、融合タンパク質。
  9. 請求項８に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記少なくとも１つのポリペプチドが、以下：
    （ａ）配列番号１８７６、１８７８、１９１３、１９１７、１９２１、１９３７、および１９４０；ならびに
    （ｂ）配列番号１８７５、１８７７、１９１４、１９１８、１９２２、１９３８および１９４１において提供されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
    において提供される、融合タンパク質。
  10. オリゴヌクレオチドであって、以下：
    （ａ）請求項１に記載の配列；ならびに
    （ｂ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３において提供される配列、
    からなる群より選択される少なくとも１つの配列に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
  11. 腫瘍タンパク質に特異的なＴ細胞を刺激および／または拡大するための方法であって、該方法は、Ｔ細胞を、以下：
    （ａ）請求項２に記載のポリペプチド；
    （ｂ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９０１〜１９０９、１９２５、１９２６、および１９３４において提供されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （ｃ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９０１〜１９０９、１９２５、１９２６、および１９３４に対して、少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （ｄ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９０１〜１９０９、１９２５、１９２６および１９３４に対して少なくとも９５％の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （ｅ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；
    （ｆ）（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）において提供されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｇ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３において提供される配列を有するポリヌクレオチド；
    （ｈ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３において提供される配列の相補体；
    （ｉ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３において提供される配列に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
    （ｊ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３の配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する配列；
    （ｋ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列；
    （ｌ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３において提供される配列の縮重改変体；ならびに
    （ｍ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
    からなる群より選択される少なくとも１つの成分と、Ｔ細胞の刺激および／または拡大を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる工程を包含する、方法。
  12. 請求項１１に記載の方法に従って調製されるＴ細胞を含む、単離されたＴ細胞集団。
  13. 第１成分および第２成分を含む組成物であって、該第１成分は、生理学的に受容可能なキャリアおよび免疫刺激剤からなる群より選択され、そして第２の成分は、以下：
    （ａ）請求項２に記載のポリペプチド；
    （ｂ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９０１〜１９０９、１９２５、１９２６、および１９３４において提供されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （ｃ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９０１〜１９０９、１９２５、１９２６、および１９３４のうちの１つに対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （ｄ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９０１〜１９０９、１９２５、１９２６および１９３４のうちの１つに対して、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （ｅ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；
    （ｆ）（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に提供されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｇ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３において提供される配列を有するポリヌクレオチド；
    （ｈ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３において提供される配列の相補体；
    （ｉ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３において提供される配列に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
    （ｊ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３の配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する配列；
    （ｋ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列；
    （ｌ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４および１９３３において提供される配列の縮重改変体；
    （ｍ）請求項５に記載の抗体；
    （ｎ）請求項８に記載の融合タンパク質；
    （ｏ）請求項１２に記載のＴ細胞集団；ならびに
    （ｐ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
    からなる群より選択される、組成物。
  14. 患者における免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、請求項１３に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
  15. 患者における肺癌を処置するための方法であって、該方法は、請求項１３に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
  16. 患者における癌の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）該患者から生物学的サンプルを得る工程；
    （ｂ）請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドと、該生物学的サンプルとを接触させる工程；
    （ｃ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、該サンプルにおいて検出する工程；ならびに
    （ｄ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした該ポリヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値と比較し、それによって該患者における該癌の存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  17. 請求項１０に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、診断キット。
  18. 請求項５に記載の少なくとも１つの抗体および検出試薬を備える診断キットであって、ここで、該検出試薬は、レポーター基を含む、診断キット。
  19. 患者における肺癌の発症を阻害するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）患者から単離したＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、以下：
    （ｉ）請求項２に記載のポリペプチド２、
    （ｉｉ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９０１〜１９０９、１９２５、１９２６、および１９３４において提供されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （ｉｉｉ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９０１〜１９０９、１９２５、１９２６、および１９３４のうちの１つに対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （ｉｖ）配列番号１６７７、１６７９、１８０６〜１８２２、１９０１〜１９０９、１９２５、１９２６、および１９３４のうちの１つに対して、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （ｖ）請求項１に記載のポリヌクレオチド、
    （ｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）において提供されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （ｖｉｉ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３において提供される配列を有するポリヌクレオチド、
    （ｖｉｉｉ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３において提供される配列の相補体、
    （ｉｘ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３において提供される配列に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列、
    （ｘ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３の配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する配列、
    （ｘｉ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４、および１９３３の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列、
    （ｘｉｉ）配列番号１２４１、１２４２、１２４４〜１２４６、１２４８〜１２６８、１２７０、１２７１、１２７３〜１２７９、１２８１、１２８２、１２８４、１２８７、１２８８、１２９０〜１９９．、１３０１〜１３０８、１３１０〜１３１７、１３２０〜１３２６、１３２８〜１３３４、１３３６〜１３３８、１３４０〜１３４５、１３４７〜１３５８、１３６０〜１３６８、１３７２〜１３９７、１３９９〜１４０４、１４０６、１４０７、１４０９〜１４１２、１４１５、１４１６、１４１８〜１４２１、１４２３〜１４２８、１４３０、１４３１、１４３３、１４３４、１４３７、１４４３〜１４４６、１４４８、１４４９、１４５１、１４５２、１４５４〜１４６２、１４６４〜１４６６、１４６８、１４６９、１４７１、１４７２、１４７４、１４７６〜１４８１、１４８３〜１４８５、１４８７〜１４９０、１４９５〜１５００、１５０２〜１５０４、１５０７〜１５１３、１５１８、１５１９、１５２１、１５２３、１５２５〜１５３４、１５３６、１５３７、１５３９〜１５４１、１５４４〜１５４６、１５４８〜１５５３、１５５５、１５５６、１５５８、１５６０、１５６２、１６７６、１７０７、１７３３、１７３５、１７５８、１７６６、１７７１、１７７５、１７９０〜１８０５、１８２３、１９１０、１９２３、１９２４および１９３３において提供される配列の縮重改変体、ならびに
    （ｘｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
    からなる群より選択される少なくとも１つの成分と共に、Ｔ細胞が増殖するようにインキュベートする工程；
    （ｂ）該増殖したＴ細胞の有効量を該患者に投与し、これによって該患者における癌の発症を阻害する工程、
    を包含する、方法。
JP2002509377A 2000-07-11 2001-07-10 肺癌の治療および診断のための組成物および方法 Pending JP2004512824A (ja)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/614,124 US6630574B1 (en) 1999-06-30 2000-07-11 Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US09/651,563 US6914132B1 (en) 1999-06-30 2000-08-29 Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US09/658,824 US6746846B1 (en) 1999-06-30 2000-09-08 Methods for diagnosing lung cancer
US09/671,325 US6667154B1 (en) 1999-06-30 2000-09-26 Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US67741900A 2000-10-06 2000-10-06
US09/702,705 US6504010B1 (en) 1999-06-30 2000-10-30 Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US09/736,457 US6509448B2 (en) 1999-06-30 2000-12-13 Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US09/849,626 US20020197669A1 (en) 2000-12-13 2001-05-03 Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
PCT/US2001/022058 WO2002004514A2 (en) 2000-07-11 2001-07-10 Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2004512824A true JP2004512824A (ja) 2004-04-30
JP2004512824A5 JP2004512824A5 (ja) 2008-10-16

Family

ID=27575493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002509377A Pending JP2004512824A (ja) 2000-07-11 2001-07-10 肺癌の治療および診断のための組成物および方法

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1343886A2 (ja)
JP (1) JP2004512824A (ja)
AR (1) AR031250A1 (ja)
AU (1) AU2002218770A1 (ja)
CA (1) CA2415544A1 (ja)
WO (1) WO2002004514A2 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009505633A (ja) * 2005-07-29 2009-02-12 オンコセラピー・サイエンス株式会社 Ｃｄｃａ１−ｋｎｔｃ２複合体を標的とするスクリーニングおよびｎｓｃｌｃの治療方法
US8598125B2 (en) 2007-08-20 2013-12-03 Onco Therapy Science, Inc. CDCA1 peptide and pharmaceutical agent comprising the same
US9387238B2 (en) 2008-06-19 2016-07-12 Oncotherapy Science, Inc. CDCA1 epitope peptides and vaccines containing the same

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030170255A1 (en) * 1999-06-30 2003-09-11 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20030211510A1 (en) 1999-06-30 2003-11-13 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US6893818B1 (en) 1999-10-28 2005-05-17 Agensys, Inc. Gene upregulated in cancers of the prostate
EP1666495A1 (en) * 1999-12-01 2006-06-07 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030166300A1 (en) * 2000-08-30 2003-09-04 Tang Y. Tom Growth-related inflammatory and immune response protein
ZA200204907B (en) * 2001-06-26 2003-03-03 Univ Nat Taiwan Collapsin Response Mediator Protein-1.
AU2003256106A1 (en) * 2002-08-14 2004-03-03 Lg Life Sciences Ltd. Gene families associated with liver cancer
AU2003263045A1 (en) * 2002-09-26 2004-04-19 Genentech, Inc. Novel compositions and methods for the treatment of psoriasis
TW200413725A (en) * 2002-09-30 2004-08-01 Oncotherapy Science Inc Method for diagnosing non-small cell lung cancers
US7449291B1 (en) 2003-01-13 2008-11-11 University Of Washington Methods for identifying subjects susceptible to Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 1C
WO2004070058A1 (en) * 2003-02-03 2004-08-19 Bayer Healthcare Ag Methods and compositions for the prediction, diagnosis, prognosis, prevention and treatment of copd
US20070042368A1 (en) * 2003-03-24 2007-02-22 Corixa Corporation Detection and monitoring of lung cancer
JP4643450B2 (ja) 2003-08-08 2011-03-02 株式会社ペルセウスプロテオミクス 癌高発現遺伝子
TW200512298A (en) 2003-09-24 2005-04-01 Oncotherapy Science Inc Method of diagnosing breast cancer
JP4428995B2 (ja) 2003-12-03 2010-03-10 関東化学株式会社 金属膜のエッチング液組成物
WO2006131783A2 (en) * 2004-01-27 2006-12-14 Compugen Usa, Inc. Polynucleotides, polypeptides, and diagnosing lung cancer
US20050186577A1 (en) 2004-02-20 2005-08-25 Yixin Wang Breast cancer prognostics
KR101300544B1 (ko) 2004-03-31 2013-09-02 히로유키 아브라타니 항ｒｏｂｏ1항체를 이용하는 암의 진단 및 치료
US8940488B2 (en) 2004-03-31 2015-01-27 Hiroyuki Aburatani Cancer diagnosis and treatment of cancer using anti-robo 1 antibody
JP2010512786A (ja) * 2006-12-21 2010-04-30 イントラダイム コーポレイション ガンを処置するための抑制性ポリヌクレオチドの組成物および方法
JP5117765B2 (ja) 2007-05-28 2013-01-16 国立大学法人 東京大学 抗ｒｏｂｏ１抗体を含むｐｅｔ用腫瘍診断剤
JP5709108B2 (ja) * 2009-05-22 2015-04-30 国立大学法人 岡山大学 ＸＡＧＥ−１ｂ特異的免疫反応を誘導するペプチドおよびその利用
EP2872532A4 (en) 2012-07-10 2016-04-13 Oncotherapy Science Inc CDCA1-EPITOPPEPTIDES FOR TH1 CELLS AND VACCINES THEREWITH
CN114102955B (zh) * 2020-08-31 2024-05-07 天津科技大学 一种采用常温发泡技术制备发泡聚乳酸的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10139800A (ja) * 1996-11-15 1998-05-26 Santen Pharmaceut Co Ltd シェーグレン症候群治療剤
JP2004500029A (ja) * 1999-06-30 2004-01-08 コリクサ　コーポレイション 肺癌の治療および診断のための組成物および方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ID27813A (id) * 1998-01-28 2001-04-26 Corixa Corp Senyawa-senyawa untuk terapi dan diagnosa kanker paru-paru dan metoda untuk penggunaannya
AU3899700A (en) * 1999-03-17 2000-10-04 Alphagene, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10139800A (ja) * 1996-11-15 1998-05-26 Santen Pharmaceut Co Ltd シェーグレン症候群治療剤
JP2004500029A (ja) * 1999-06-30 2004-01-08 コリクサ　コーポレイション 肺癌の治療および診断のための組成物および方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009505633A (ja) * 2005-07-29 2009-02-12 オンコセラピー・サイエンス株式会社 Ｃｄｃａ１−ｋｎｔｃ２複合体を標的とするスクリーニングおよびｎｓｃｌｃの治療方法
US8598125B2 (en) 2007-08-20 2013-12-03 Onco Therapy Science, Inc. CDCA1 peptide and pharmaceutical agent comprising the same
JP5493076B2 (ja) * 2007-08-20 2014-05-14 オンコセラピー・サイエンス株式会社 Ｃｄｃａ１ペプチド及びこれを含む薬剤
US9387238B2 (en) 2008-06-19 2016-07-12 Oncotherapy Science, Inc. CDCA1 epitope peptides and vaccines containing the same
US10711047B2 (en) 2008-06-19 2020-07-14 Oncotherapy Science, Inc. CDCA1 epitope peptides and vaccines containing the same

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002004514A8 (en) 2002-12-27
WO2002004514A2 (en) 2002-01-17
CA2415544A1 (en) 2002-01-17
AR031250A1 (es) 2003-09-17
WO2002004514A3 (en) 2003-06-19
EP1343886A2 (en) 2003-09-17
AU2002218770A1 (en) 2002-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6504010B1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US7425607B2 (en) Compositions comprising a lung tumor antigen
JP2004512022A (ja) 結腸癌の治療および診断のための組成物および方法
JP2004512824A (ja) 肺癌の治療および診断のための組成物および方法
JP2004512023A (ja) 結腸癌の治療および診断のための組成物および方法
JP2004511212A (ja) 卵巣癌の治療および診断のための組成物および方法
JP2004522412A (ja) Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ−関連悪性腫瘍の治療および診断のための組成物および方法
US7749505B2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US6509448B2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20080206244A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US20020172952A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US6858204B2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20070292415A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US20030170255A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
JP2010227112A (ja) 肺癌の治療および診断のための組成物および方法
US20020197669A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
JP2004537966A (ja) 卵巣癌の治療および診断のための組成物および方法
JP2004508812A (ja) 乳癌の治療および診断のための組成物および方法
US20050031634A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
JP2004513615A (ja) 肺癌の治療および診断のための組成物および方法
JP4180919B2 (ja) 肺癌の治療および診断のための組成物および方法
US20060083749A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
JP2007534929A (ja) 肺癌の治療および診断のための組成物および方法
JP2008178413A (ja) 肺癌の治療および診断のための組成物および方法
JP2008289482A (ja) 卵巣癌の治療および診断のための組成物および方法

Legal Events

Date Code Title Description
RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20080401

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080707

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080826

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20090109

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110104

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20111025