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KR101300544B1 - 항ｒｏｂｏ1항체를 이용하는 암의 진단 및 치료 - Google Patents

항ｒｏｂｏ1항체를 이용하는 암의 진단 및 치료 Download PDF

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KR101300544B1
KR101300544B1 KR1020067022602A KR20067022602A KR101300544B1 KR 101300544 B1 KR101300544 B1 KR 101300544B1 KR 1020067022602 A KR1020067022602 A KR 1020067022602A KR 20067022602 A KR20067022602 A KR 20067022602A KR 101300544 B1 KR101300544 B1 KR 101300544B1
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히로유키 아브라타니
요시타카 히포
아키라 와타나베
마사시 후카야마
유키오 이토
마사히로 아라이
히로타카 이토
토시히코 오토모
신이치 후나하시
야스코 기노시타
Original Assignee
히로유키 아브라타니
추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

ROBO1 단백질을 검출하는 것을 특징으로 하는 암의 진단방법이 개시된다. 또한, ROBO1에 결합하는 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 비정상인 세포증식에 기인하는 질환을 치료하는 방법, 및 ROBO1에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 의약 조성물, 세포증식 억제제 및 항암제가 개시된다. 또한, ROBO1 발현세포와 ROBO1에 결합하는 항체를 접촉시켜 ROBO1 발현세포에 세포장해를 일으키는 방법 및 ROBO1 발현세포의 증식을 억제하는 방법이 개시된다. 또한, ROBO1 단백질을 검출하여 간염악화를 모니터링하는 방법이 개시된다.
암, ROBO1 단백질,세포독성

Description

항ＲＯＢＯ1항체를 이용하는 암의 진단 및 치료{Cancer Diagnosis and Treatment Using Anti-ROBO1 Antibody}
본 발명은 암의 진단 및 치료방법, 간염 악화의 모니터링 방법 및 세포증식 억제제 및 항암제에 관한 것이다.
초파리의 유전적 스크리닝 연구에서, ROBO1는 축색돌기(axon)의 정중앙 교차를 제어하는 분자로 동정된 후, 슬릿(Slit) 단백질의 수용체로 작용하는 것이 보고되었다(참조; Kidd 등, Cell, 92, 205-215, 1998; Wang 등, Cell, 96, 771-784, 1999; Kidd 등, Cell, 96, 785-794, 1999; Brose 등, 96, 795-806, 1999). 또한, ROBO1와 암과의 관련에 관해서는, 사람 ROBO1 유전자가 존재하는 염색체 영역 3p12가 폐암에 있어서 크게 결손되어 있는 것이나, 유방암이나 신장암에 있어서 ROBO1의 프로모터 영역이 메틸화되는 것으로 발현이 억제되는 등 암 억제 유전자의 가능성이 나타났다(참조: Dallol 등, Oncogene, 21, 3020-3028, 2000). 실제로, 폐암환자에게 관찰된 ROBO1 유전자에 있어서의 최소의 결손과 마찬가지로, 마우스에서 ROBO1의 Ｎ말단에 존재하는 최초의 면역글로블린(immunoglobulin) 영역을 결손시키 고, 기관 표피세포의 과형성(hyperplasia)이 관찰되었다(참조: Xian J 등, PNAS, 98, 15062-15066, 2001). 또한, ROBO1가 암의 신생혈관에 발현하며, 암세포 옆에 ROBO1의 리간드(ligand)인 Slit2의 발현이 증대되어 암의 혈관신생을 유도하고, 반대로 암의 증식을 지시한다는 보고도 있다(참조: Wang 등, Cancer Cell, 4, 19-29, 2003).
　한편, ROBO1의 리간드인 Slit2 유전자도 많은 암종으로 메틸화 등에 의해 발현억제되거나 Slit2를 강제발현시키는 사실, 또는 Slit2를 가하는 사실, 폐암세포, 유방암세포 및 대장암세포에 있어서 증식억제 작용, 세포자멸(apoptosis) 유도작용이 관찰되는 사실로부터, ROBO1의 리간드인 Slit2도 이와 같이 암억제 유전자인 것으로 여겨지고 있다(참조: Dallol 등, Cancer Research, 62, 5874-5880, 2002; Dallol 등, Cancer Research, 63, 1054-1058, 2003). 그러나, 이 보고에서는 Slit2에 의한 세포증식 억제작용이 실제로 어느 수용체를 통하고 있는지 밝혀지지 않고, ROBO1과 암의 관련성 또한 밝혀지지 않았다.
원발성(primary) 간세포암은 2001년에 일본국내 사망원인 중 가장 많은 암으로 인한 사망(cancer death) 원인 중에서 남성은 제 3위(13%), 여성은 제 4위(9.0%)를 차지하는 예후가 나쁜 암종 중의 하나이다(참조: 후생노동성 대신관방 통계정보부 「인구동태통계」발췌). 바이러스 감염에 의한 만성 환자가 해마다 증가하여, 대부분은 간경변(hepatic cirrhosis), 그리고 간세포암에 이르는 경우가 많은 것으로부터, 간경변에서 간세포암에 있어서의 단계의 조기진단법과 간세포암의 치료법은 매우 강력하게 요망되고 있고, 획기적인 해결이 없는 경우는 향후 10 내지 15년간은 사망이 증가하는 추세로 진행할 것이라고 여겨지고 있다.
　간세포암의 진단법에 관해서는, 혈청 중의 ＧＯＰ/ＧＴＰ, 알칼리성 포스파타제, 알부민 등이나 종양마커(marker)인 ＡＦＰ(α-페토프로테인(fetoprotein))의 값 등의 생화학적 데이터, 및 화상진단(photoligical judgment)에 기초하여 종합적으로 평가한 후, 필요한 경우, 침생검(needle biopsy)에 의해 소량의 조직편을 수득하여 병리학적 판단에 기초하여 확정진단이 수행되고 있다. 현재, 특히 간세포암의 진단에 사용되고 있는 것은 종양마커이고, 그 중에 가장 많이 사용되고 있는 알파 페토프로틴(alpha fetoprotein, AFP)의 간세포암 환자의 양성율은 6 내지 7할 정도이나, 만성 간질환 환자나 임산부도 양성이 되기도 한다. 또한, 간암 종양마커인 PIVKA-II의 양성율은 5할이 약간 안될 정도로 낮으나, 간세포암에의 특이성은 AFP보다도 높다고 여겨질 수 있어 현재 이 두 검사가 주로 실시되고 있다. 결국, 위양성(false positive) 또는 양음성(double negative)의 증상의 예가 존재하는 것으로부터, 특이성이 높은 종양마커의 존재가 기대되고 있다.
　침생검에 의해 수득된 검체(sample)의 병리조직검사는, 간질환의 확정진단에 있어서 중요한 검사이다. 특히, 수득량이 한정되기도 해서 보다 확실한 진단 기술이 필요하게 되었다. 병리학적 특징뿐만 아니라, 조기의 간세포암을 비암부 조직으로부터 식별할 수 있는 간암 특이적 발현 항원에 대한 항체의 개발이 바람직하다.
　간장 질환의 진단·모니터링은, 많은 종류의 마커에 의한 검사 및 생검법에 의한 검사에서 염증, 섬유화(fibrosis) 및 암화(maligant transformation)에의 이행을 진단하고 있는 것이 현재 상태이다. 많은 간암 환자에 있어서는, 바이러스 감염, 간염, 만성 간염, 간경변 그리고 간암으로 이행한다. 따라서, 간장질환의 진단·모니터링을 간편하게 실행할 수 있는 방법의 개발은, 의료경제의 측면 뿐만아니라, 환자의 부담 경감 및 적절한 의료지침을 얻기 위해서도 유용하다.
　간세포암의 치료법에 관하여는, 주로 외과적 절제, 간동맥색전요법(transcatheter arterial embolization), 경피적 에탄올 주입요법의 3요법이 중심이 되는 의료시설이 많다. 어느 방법도 장점·단점이 있고, 비교적 응용범위의 넓으며, 연명효과(survival advantage)가 있는 간동맥색전요법을 선택해도 완전 치유율은 현재 10% 정도이고, 신규한 치료법이 상당히 바람직한 상황이다.
　간세포암의 임상에의 응용예는 아직 없으나, 유방암 또는 림포마(lymphoma) 등에 있어서 암특이적인 종양항원에 대한 단클론 항체에 의한 표적요법에 의하여, 종래의 화학요법제 치료와는 다른 작용기작에 의해 반응율(response rate)을 높이고 있다. 그 항체의약품의 작용차이로 효과기(effector) 세포를 통한 항체의존성 세포독성(antibody dependent cytotoxicity, ADCC) 또는 보체(complement)에 의한 보체의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC), 및 항체 자체의 기능에 의한 작동(agonistic) 작용, 또는 항체의 중화활성능(neutralization capability)을 이용한 것이 존재한다. 현재, 분자표적 요법은 임상에서 응용하기 시작하여, 이 분자표적 요법(molecular therapy)을 응용하여 간세포 암세포에 대한 종양 특이적 발현분자를 표적으로 한 항체 의약품 요법은 향후 상당히 기대되는 것이라고 여겨진다.
본 발명에 관련하는 선행기술문헌정보는 이하와 같다：
WO99/20764；WO98/48051；WO01/46697；WO03/29488；WO01/00828；WO01/57207；WO01/92581；WO02/04514；WO02/14500；WO02/29103.
본 발명은 암진단 및 치료하는 신규한 방법, 및 신규한 세포증식 억제제 및 항암제를 제공하고, 간장질환의 진단 및 모니터링 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 발명자들은 ROBO1가 간세포암, 폐암, 유방암, 자궁암, 위암, 뇌종양, 대장암 등의 암세포에서 높게 발현하는 것을 발견하였다. 또한, 항ROBO1항체의 보체의존성 세포독성(CDC)을 측정하였는 바, 항ROBO1항체는 ROBO1 발현세포에 대하여 CDC활성을 가지는 것을 발견하였다. 한편, 간장질환의 악화에 의해 혈중 ROBO1 농도가 상승하는 것을 발견하였다. 이상의 지견에 의하여, 본 발명의 발명자들은 항ROBO1항체가 간세포암을 필두로 하여 ROBO1의 발현이 증대되는 암의 진단, 예방 및 치료에 유효하다는 사실, 또한, 간장질환의 진단 및 모니터링 방법을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 ROBO1 단백질을 검출하는 것을 특징으로 하는 암의 진단방법을 제공한다. 본 발명의 방법으로는, 바람직하게는, ROBO1 단백질 세포외 영역을 검출한다. 또한, 바람직하게는, 본 발명의 방법은 ROBO1 단백질을 인식하는 항체를 이용하여 수행한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 대해서는 혈액 중, 혈청 중 또는 혈장 중의 ROBO1 단백질, 또는 세포로부터 분리한 ROBO1 단백질을 검출한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은
(ａ) 피험자로부터 시료를 채취하는 단계；및,
(ｂ) 채취된 시료에 포함되는 ROBO1 단백질을 검출하는 단계
를 포함하는 암의 진단방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 ROBO1 단백질과 결합하는 항체를 함유하는, 암을 진단용 키트를 제공한다. 바람직하게는, 암은 간세포암이다. 또한, 바람직하게는, 본 발명의 키트에 있어서, 항체는 ROBO1 단백질의 세포외 영역과 결합하는 항체이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 ROBO1에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 의약 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 ROBO1에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 세포증식 억제제를 제공한다. 또한, 본 발명은 ROBO1에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공한다. 바람직하게는, ROBO1에 결합하는 항체는 세포독성을 가지는 항체이다. 또한, 바람직하게는, 암은 간세포암이다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 ROBO1에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 의약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 비정상적 세포증식에 기인하는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 ROBO1에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 의약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암치료방법을 제공한다. 바람직하게는, 암은 간세포암이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 ROBO1 발현세포와 ROBO1에 결합하는 항체를 접촉시켜 ROBO1 발현세포에 세포장해(cell damage)를 일으키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 ROBO1 발현세포와 ROBO1에 결합하는 항체를 접촉시켜 ROBO1 발현세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, ROBO1에 결합하는 항체는 세포독성을 가지는 항체이다. 또한, 바람직하게는, ROBO1 발현세포는 암세포이다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 ROBO1에 결합하고, ROBO1 발현세포에 대하여 세포독성을 가지는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 항ROBO1항체를 함유하는 간염악화(aggravation)를 모니터링하기 위한 키트를 제공한다. 바람직하게는, 항ROBO1항체는 ROBO1를 특이적으로 인식하는 항체이다. 바람직하게는, 본 발명의 키트는 간염 또는 간경변(hepatic cirrhosis)으로 간암으로의 이행을 예측하는 것이다. 바람직한 태양으로는, 본 발명의 키트는 지지체(support)에 고정한 제１의 항ROBO1항체와 표지물질(labeling substane)로 표지된 제２의 항ROBO1항체를 포함한다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 피검시료 중의 ROBO1를 측정하는 것을 특징으로 하는 간염악화를 모니터링하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 피검시료 중의 ROBO1는 항ROBO1항체를 이용하여 측정한다. 바람직하게는, 항ROBO1항체는 ROBO1를 특이적으로 인식하는 항체이다. 또한, 바람직하게는, 피검시료는 혈액, 혈청 또는 혈장이다. 바람직하게는, 본 발명의 모니터링 방법은 간염 또는 간경변에서 간암으로의 이행을 예측하는 것이다. 바람직한 태양으로는, 본 발명의 모니터링 방법은 지지체에 고정한 제１의 항ROBO1항체와 표지물질로 표지된 제２의 항ROBO1항체를 이용하여 수행된다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 방법은 ROBO1 단백질을 검출하는 것을 특징으로 한다. ROBO1(Roundabout1)은 축색유도 수용체 단백질(axon guidance receptor protein)이고, 그의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 유전자 서열은 변이체(variant) 1에 대해서는 GenBank 번호 NM_002941(서열번호 9 및 10), 변이체 2에 대해서는 GenBank 번호 NM_133631(서열번호 11 및 12)에 개시되어 있다. 본 발명에 있어서, 'ROBO1 단백질(ROBO1 protein)'이란, 전장 단백질 및 그의 단편 모두 포함하는 것을 의미한다. '단편(fragment)'이란 ROBO1 단백질의 임의의 영역을 포함하는 폴리펩티드이고, 천연의 ROBO1 단백질의 기능을 가지지 않아도 무방하다. 단편의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니나, ROBO1 단백질의 세포외 영역을 포함하는 단편을 들 수 있다. ROBO1 단백질의 세포외 영역은 서열번호 11의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 859번째가 해당한다. 또한, 막관통 영역(membrane spanning region)은 서열번호 11의 아미노산 서열에 있어서 860 내지 880번째가 해당한다(참조: Sundaresan, et al., Molecular and Cellular Neuroscience, 11, 29-35, 1998).
본 발명에서는 간세포암에 있어서 상당히 빈번히 ROBO1가 유전자 수준 및 단백질 수준에서 발현이 증대된다는 것이 발견되었다. 또한, 다른 암종의 임상검체 및 암세포주의 분석으로부터, 간세포암뿐만 아니라, 폐암, 유방암, 자궁암, 위암, 뇌종양, 대장암 등에 있어도 발현이 증대되고 있을 가능성이 나타났다. 또한, ROBO1에 특이적인 단클론 항체를 이용하여, 면역조직진단이 가능하다는 것이 나타났다. 또한, ROBO1가 생체 내에서 쉐딩(shedding)되어, 가용형(soluble) ROBO1(sROBO1)가 암환자 혈액 중에 존재하는 것이 발견되었다. 즉, sROBO1는 암의 혈청 진단마커로서 유용하다.
ROBO1 의 검출
본 발명에서 검출하는 ROBO1 단백질은 사람 ROBO1 단백질이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 개 ROBO1, 고양이 ROBO1, 마우스 ROBO1, 햄스터 ROBO1 등 어떠한 ROBO1라도 무방하다.
본 발명에서 '검출(detection)'이란, 정량적 또는 비정량적인 검출을 포함하고, 비정량적인 검출로는 단순히 ROBO1 단백질이 존재하는지 존재하지 않는지의 측정, ROBO1 단백질이 일정한 양 이상 존재하는지 존재하지 않는지의 측정, ROBO1 단백질의 양을 다른 시료(예를 들면, 대조군 시료 등)와 비교하는 측정 등을 예로 들 수 있으며, 정량적인 검출로는 ROBO1 단백질의 농도의 측정, ROBO1 단백질의 양의 측정 등을 예로 들 수 있다.
피검시료로는, ROBO1 단백질이 포함될 가능성이 있는 시료라면 특별히 제한되지 않으나, 포유류 등의 생물의 몸으로부터 수득된 시료가 바람직하고, 보다 바람직하게는 사람으로부터 수득된 시료이다. 피검시료의 구체적인 예로는, 혈액, 간질액(interstitial tissue fluid), 혈장, 혈관외액, 뇌척수액, 활액(synovial fluid), 흉막액(pleural fluid), 혈청, 림파액, 타액, 뇨 등을 예로 들 수 있으나, 바람직한 것은 혈액, 혈청 또는 혈장이다. 또한, 생물의 몸으로부터 수득된 세포의 배양액 등의 피검시료로부터 얻어진 시료도 본 발명의 피검시료에 포함된다.
진단되는 암은 특별히 제한되지 않고 어떠한 암이라도 무방하나, 구체적으로는, 간암, 췌장암, 폐암, 대장암, 유방암, 신장암, 뇌종양, 자궁암, 폐암, 위암, 전립선암, 백혈병, 임파종 등을 들 수 있다. 바람직한 것은 간암이고, 특히 바람직한 것은 간세포암이다.
본 발명에 있어서, 피험시료 중에 ROBO1 단백질이 검출되었을 경우, 음성 대조군 또는 정상인과 비교하여 피험시료 중에 검출되는 ROBO1 단백질의 양이 많다고 판단되는 경우에, 피험자가 암이거나, 또는 암이 될 가능성이 높다고 판정된다.
또한, 간질환을 가지는 환자의 ROBO1 단백질 농도를 측정하여 간질환의 악화를 모니터링할 수 있다.
본 발명의 진단방법의 바람직한 태양으로는, 세포로부터 유리하여, 혈중에 존재하는 ROBO1 단백질을 검출하는 것을 특징으로 하는 진단방법을 들 수 있다. 특히 바람직하게는, 혈중에 존재하는 ROBO1 단백질의 세포외 영역을 포함하는 단편을 검출한다.
피검시료에 포함되는 ROBO1 단백질의 검출방법은 특별히 이에 한정되는 것은 아니나, 항ROBO1항체를 이용한 면역학적 방법에 의해 검출하는 것이 바람직하다. 면역학적 방법으로는, 방사선면역측정법(radioimmunoassay), 효소면역측정법(enzyme immunoassay), 형광 면역측정법, 발광 면역측정법, 면역침강법, 면역비탁법(immunonephelometry), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역염색, 면역확산법 등을 예로 들 수 있으나, 바람직하게는 효소면역측정법이고, 특히 바람직하게는 효소결합 면역흡착 정량법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)(예를 들면, sandwich ELISA)이다. ELISA 등의 상술한 면역학적 방법은 당업자에게 공지된 방법에 의하여 실시할 수 있다.
항ROBO1항체를 이용한 일반적인 검출방법으로는, 항ROBO1항체를 지지체에 고정하여, 여기에 피검시료를 가하고 배양하여 항ROBO1항체와 ROBO1 단백질을 결합시킨 후에 세정하고, 항ROBO1항체를 통하여 지지체에 결합한 ROBO1 단백질을 검출하여 피검시료 중의 ROBO1 단백질을 검출하는 방법을 예로 들 수 있다.
본 발명에 대해 항ROBO1항체를 고정하기 위해서 이용되는 지지체로는, 아가로스(agarose), 셀룰로스 등의 불용성의 다당류, 실리콘 수지(resin), 폴리스티렌 수지, 폴리아크릴아미드 수지, 나일론 수지, 폴리카보네이트 수지 등의 합성 수지나, 유리 등의 불용성의 지지체를 예로 들 수 있다. 이러한 지지체는, 비즈(beads)나 플레이트(plate) 등의 형상으로 이용할 수 있다. 비즈의 경우, 이들이 충전된 컬럼 등을 이용할 수 있다. 플레이트의 경우, 멀티 웰 플레이트(96 구멍 멀티 웰 플레이트 등)이나 바이오센서 칩(chip) 등을 이용할 수 있다. 항ROBO1항체와 지지체의 결합은 화학결합이나 물리적인 흡착 등의 통상적으로 이용되는 방법에 의해 결합할 수 있다. 이들 지지체는 모두 시판되는 것을 이용할 수 있다.
항ROBO1항체와 ROBO1 단백질의 결합은 통상적으로 완충용액 중에서 수행된다. 완충용액으로는, 예를 들면, 인산 완충용액, Tris 완충용액, 구연산 완충용액, 붕산염 완충용액, 탄산염 완충용액 등이 사용된다. 또한, 배양조건으로는, 이미 잘 이용되는 조건, 예를 들면, ４℃ 내지 실온에서 １시간 내지 24시간 동안 배양한다. 배양 후의 세정은 ROBO1 단백질과 항ROBO1항체의 결합을 방해하지 않는 것이라면 어떤 것이든지 무방하고, 예를 들면, Tween20 등의 계면활성제를 포함하는 완충용액 등이 사용된다.
본 발명의 ROBO1 단백질 검출방법에 있어서는, ROBO1 단백질을 검출하려 하는 피검시료 외에, 대조군 시료를 준비하여도 무방하다. 대조군 시료로는, ROBO1 단백질을 포함하지 않는 음성 대조군 시료나 ROBO1 단백질을 포함한 양성 대조군 시료 등이 있다. 이 경우, ROBO1 단백질을 포함하지 않는 음성 대조군 시료로 얻어진 결과, ROBO1 단백질을 포함한 양성 대조군 시료로 얻어진 결과와 비교하여 피검시료 중의 ROBO1 단백질을 검출할 수 있다. 또한, 농도를 단계적으로 변화시킨 일련의 대조군 시료를 제조하여 각 대조군 시료에 대한 검출결과를 수치로 얻고, 표준곡선을 작성하여, 피검시료의 수치로부터 표준곡선에 기초하여 피검시료에 포함되는 ROBO1 단백질을 정량적으로 검출할 수 있다.
항ROBO1항체를 통하여 지지체에 결합한 ROBO1 단백질의 검출이 바람직한 태양으로서, 표지물질로 표지된 항ROBO1항체를 이용하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 지지체에 고정된 항ROBO1항체에 피검시료를 접촉시켜 세정한 후에, ROBO1 단백질을 특이적으로 인식하는 표지항체를 이용하여 검출한다.
항ROBO1항체의 표지는 통상적으로 알려져 있는 방법에 의해 수행할 수 있다. 표지물질로는, 형광색소, 효소, 조효소(coenzyme), 화학 발광 물질, 방사성 물질 등의 당업자에게 공지된 표지물질을 이용하는 것이 가능하고, 구체적인 예로는, 방사성 동위원소(32P, 14C, 125I, 3H, 131I 등), 플루오레세인(fluorescein), 로다민, 댄실클로리드(dansyl chloride), 움벨리페론(umbelliferone), 루시페라제, 퍼옥시다제, 알칼리포스파타제, β-갈락토시다제, β-글루코시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish perroxidase), 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제(saccharide oxidase), 마이크로퍼옥시다제, 비오틴(biotin) 등을 들 수 있다. 표지물질로서 비오틴을 이용하는 경우에는, 비오틴 표지항체를 가한 후에, 알칼리포스파타제 등의 효소를 결합시킨 아비딘(avidin)을 추가로 가하는 것이 바람직하다. 표지물질과 항ROBO1항체의 결합에는, 글루탈알데히드(glutaraldehyde)법, 말레이미드(maleimide)법, 피리딜디설피드(pyridyl disulphide)법, 과옥소산(periodic acid)법 등 공지된 방법을 이용할 수 있다.
구체적으로는, 항ROBO1항체를 포함하는 용액을 플레이트 등의 지지체에 가하고, 항ROBO1항체를 지지체에 고정한다. 플레이트를 세정한 후, 단백질의 비특이적(non-specific) 결합을 막기 위해, 예를 들면 BSA, 젤라틴, 알부민 등으로 블로킹(block)한 다음, 다시 세정하여, 피검시료를 플레이트에 가한다. 배양한 후, 세정하여 표지 항ROBO1항체를 가한다. 적절히 배양한 후, 플레이트를 세정하여, 플레이트에 남은 표지 항ROBO1항체를 검출한다. 검출은 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행할 수 있고, 예를 들면, 방사성 물질에 의한 표지의 경우에는 액체 신틸레이션(scintillation)법이나 RIA법에 의해 검출할 수 있다. 효소에 의한 표지의 경우에는 기질(substrate)을 가하고, 기질의 효소적 변화, 예를 들면 발색을 흡광도계에 의해 검출할 수 있다. 기질의 구체적인 예로는, 2,2-아지노비스(azinobis)(3-에틸벤조티아졸린(ethylbenzothiazolin)-6-설폰산) 디암모늄염(diammonium)(ABTS), 1,2-페닐렌 디아민(오르토-페닐렌디아민(ortho-phenylene diamine)), 3,3＇,5,5＇-테트라메틸벤진(TMB)등을 예로 들 수 있다. 형광물질의 경우에는 형광광도계(spectrofluorimeter)에 의해 검출할 수 있다.
본 발명의 ROBO1 단백질 검출방법의 특히 바람직한 태양으로, 비오틴으로 표지된 항ROBO1항체 및 아비딘을 이용하는 방법을 들 수 있다.
구체적으로는, 항ROBO1항체를 포함하는 용액을 플레이트 등의 지지체에 가하고, 항ROBO1항체를 고정한다. 플레이트를 세정한 후, 단백질의 비특이적인 결합을 막기 위해, 예를 들면 BSA등에서 블로킹한 다음, 다시 세정하여, 피검시료를 플레이트에 가한다. 배양한 후, 세정하여 비오틴 표지 항ROBO1항체를 가한다. 적절히 배양한 후, 플레이트를 세정하여, 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제 등의 효소와 결합한 아비딘을 가한다. 배양한 후, 플레이트를 세정하고, 아비딘에 결합하고 있는 효소에 대응한 기질을 가하여 기질의 효소적 변화 등을 지표로 ROBO1 단백질을 검출한다.
본 발명의 ROBO1 단백질 검출방법의 다른 태양으로, ROBO1 단백질을 특이적으로 인식하는 1차항체를 한 종류 이상, 및 전기 1차항체를 특이적으로 인식하는 2차항체를 한 종류 이상 이용하는 방법을 들 수 있다.
예를 들면, 지지체에 고정된 한 종류 이상의 항ROBO1항체에 피검시료를 접촉시켜 배양한 후, 세정하고, 세정 후에 결합하고 있는 ROBO1 단백질을 일차 항ROBO1항체 및 전기 1차 항체를 특이적으로 인식하는 한 종류 이상의 2차 항체에 의해 검출한다. 이 경우, 2차 항체는 바람직하게는 표지물질에 의해 표지된다.
본 발명의 ROBO1 단백질의 검출방법의 본 발명의 다른 측면에 의하면, 응집반응을 이용한 검출방법을 들 수 있다. 전기 방법에 있어서는, 항ROBO1항체를 감작된(sensitized) 담체(carrier)를 이용하여 ROBO1를 검출할 수 있다. 항체를 감작하는 담체로는, 불용성이고 비특이적인 반응을 일으키지 않으며, 안정되는 한 어떠한 담체를 사용하여도 무방하다. 예를 들면, 라텍스 입자, 벤토나이트(bentonite), 콜로디온(collodion), 카올린(kaolin), 고정화 양적혈구(immobillized sheep red blood cell) 등을 사용할 수 있으나, 라텍스 입자를 사용하는 것이 바람직하다. 라텍스 입자로는, 예를 들면, 폴리스틸렌(polystyrene) 라텍스 입자, 스틸렌-부타디엔 공중합체(styrene-butadiene copolymer) 라텍스 입자, 폴리비닐톨루엔(polyvinyl toluene) 라텍스 입자 등을 사용할 수 있으나, 폴리스틸렌 라텍스 입자를 사용하는 것이 바람직하다. 감작한 입자를 시료와 혼합하고 일정시간 동안 교반한다. 시료 중에 항ROBO1항체가 고농도로 포함되는 만큼 입자의 응집도가 커지므로, 응집을 육안으로 보는 것으로 ROBO1를 검출할 수 있다. 또한, 응집에 의한 탁도(turbidity)를 분광 광도계(spectrophotomer) 등에 의해 측정하여도 검출할 수 있다.
본 발명의 ROBO1 단백질의 검출방법의 본 발명의 다른 측면에 의하면, 표면 플라스몬(plasmon) 공명현상(resonange phenomenon)을 이용한 바이오센서를 이용한 방법을 예로 들 수 있다. 표면 플라스몬 공명현상을 이용한 바이오센서는 단백질-단백질 간의 상호작용을 미량의 단백질을 이용하고 표지할 것 없이, 표면 플라스몬 공명시그널로서 실시간으로 관찰할 수 있다. 예를 들면, BIAcore(아머샴 바이오사이언스사제) 등의 바이오센서를 이용하여 ROBO1 단백질과 항ROBO1항체의 결합을 검출할 수 있다. 구체적으로는, 항ROBO1항체를 고정화한 센서 칩에 피검시료를 접촉시켜, 항ROBO1항체에 결합하는 ROBO1 단백질을 공명시그널의 변화로서 검출할 수 있다.
본 발명의 검출방법은 여러 가지의 자동검사장치를 이용하여 자동화할 수도 있고, 한번에 대량의 시료에 대하여 검사할 수도 있다.
본 발명은 암의 진단을 위한 피검시료 중의 ROBO1 단백질을 검출하기 위한 진단약 또는 키트의 제공도 목적으로 하나, 전기 진단약 또는 키트는 적어도 항ROBO1항체를 포함한다. 전기 진단약 또는 키트가 ELISA법 등의 EIA법에 기초하는 경우는, 항체를 고상(solid-phase)화하는 담체를 포함하여도 무방하고, 항체가 미리 담체에 결합하여도 무방하다. 전기 진단약 또는 키트가 라텍스 등의 담체를 이용한 응집법에 기초하는 경우는, 항체가 흡착한 담체를 포함하여도 무방하다. 또한, 전기 키트는 블로킹용액, 반응용액, 반응정지액, 시료를 처리하기 위한 시약 등을 적당히 포함하여도 무방하다.
항 ROBO1 항체의 제조
　
본 발명에서 이용되는 항ROBO1항체는 ROBO1 단백질에 특이적으로 결합하면 무방하고, 그의 유래, 종류(단클론, 다클론) 및 형상을 불문한다. 구체적으로는, 마우스 항체, 랫트 항체, 사람항체, 키메라 항체, 사람화 항체 등의 공지된 항체를 이용할 수 있다. 항체는 다클론 항체이어도 무방하나, 단클론 항체인 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 항ROBO1항체는 공지된 수단을 이용하여 다클론 또는 단클론 항체로서 얻어진다. 본 발명에서 사용되는 항ROBO1항체로서 특히 포유동물 유래의 단클론 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 단클론 항체는 하이브리도마(hybridoma)에 의해 생산되는 것, 및 유전공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환한 숙주에 의해 생산되는 것 등을 포함한다.
단클론 항체생산 하이브리도마는, 기본적으로는 공지된 기술을 사용하여 이하와 같이 제조할 수 있다. 즉, ROBO1를 감작항원으로 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라서 면역화하여 얻어진 면역세포를 통상의 세포융합법에 따라 공지된 친세포(parental cell)와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의해 단클론인 항체생산 세포를 스크리닝하여 제조할 수 있다.
구체적으로는, 단클론 항체를 제조하려면, 다음과 같이 하면 좋다. 우선, 항체 수득의 감작항원으로 사용되는 ROBO1를 GenBank 수탁번호(accession number) BF059159(NM_133631)에 개시된 ROBO1 유전자/아미노산 서열을 발현하여 얻는다. 즉, ROBO1를 암호화하는 유전자 서열을 공지된 발현벡터계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는 배양상등액 중으로부터 목적하는 사람 ROBO1 단백질을 공지된 방법으로 정제한다. 또한, 천연의 ROBO1를 정제하여 이용할 수도 있다.
다음으로, 이 정제 ROBO1 단백질을 감작항원으로 이용한다. 또는, ROBO1의 부분 펩티드를 감작항원으로 사용할 수도 있다. 이 때, 부분 펩티드는 사람 ROBO1의 아미노산 서열로부터 화학합성에 의해 얻을 수도 있고, ROBO1 유전자의 일부를 발현벡터에 혼입(incorporation)하여 발현시켜 얻을 수도 있고, 천연의 ROBO1를 단백질 분해효소에 의해 분해하여도 얻을 수 있다. 부분 펩티드로 이용하는 ROBO1의 영역 및 크기는 한정되지 않는다.
감작항원으로 면역되는 포유동물로는, 특별히 한정되는 것은 아니나, 세포융합에 사용하는 친세포(parental cell)와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로 설치류(rodent)의 동물, 예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터, 또는 토끼, 원숭이 등이 사용된다.
감작항원을 동물에 면역화하는 것은 공지된 방법에 따라서 수행된다. 예를 들면, 일반적 방법으로서 감작항원을 포유동물의 복강 내 또는 피하에 주사하여 수행된다. 구체적으로는, 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리 식염수 등으로 적당량으로 희석, 현탁한 것에 원하는 바에 따라 통상의 어쥬번트(adjuvant), 예를 들면 프레운드(Freund) 완전 어쥬번트를 적당량 혼합하여, 유화(emulsification)한 후, 포유동물에게 4 내지 21일 마다 수차례 투여한다. 또한, 감작항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수도 있다. 특히 분자량이 작은 부분 펩티드를 감작항원으로 이용하는 경우에는, 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin) 등의 담체 단백질과 결합시켜 면역화하는 것이 바람직하다.
이와 같이 포유동물을 면역화하여, 혈청 중에 원하는 항체수준이 상승하는 것을 확인한 후에, 포유동물로부터 면역세포를 수득하고, 세포융합에 영향을 받지으나, 바람직한 면역세포로는, 특히 비장세포(splenic cell)를 들 수 있다.
전기 면역세포와 융합되는 다른 친세포로서, 포유동물의 골수종(myeloma)세포를 이용한다. 이 골수종 세포는, 공지된 여러가지의 세포주, 예를 들면, P3(P3x63Ag8.653)(참조: J. Immnol., (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1(참조: Current Topics in Microbiology and Immunology, (1978) 81, 1-7), NS-1 (참조: Kohler.G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol., (1976) 6, 511-519), MPC-11(참조: Margulies. D.H. et al., Cell, (1976) 8, 405-415), SP2/0 (참조: Shulman, M. et al., Nature, (1978) 276, 269-270), FO(참조: de St.groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods, (1980) 35, 1-21), S194(참조: Trowbridge, I. S. J. Exp. Med., (1978) 148, 313-323), R210(참조: Galfre, G. et al., Nature, (1979) 277, 131-133) 등이 적합하게 사용된다.
전기 면역세포와 골수종 세포와의 세포융합은, 기본적으로는 공지된 방법, 예를 들어, 콜러와 밀스테인 등의 방법(참조: Kohler.G. and Milstein, C., Methods Enzymol., (1981) 73, 3-46) 등에 준하여 수행할 수 있다.
보다 구체적으로는, 전기 세포융합은, 예를 들면 세포융합 촉진제의 존재 하에 통상의 영양 배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로는, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 센다이 바이러스(hemagglutinating virus of Japan, HVJ) 등이 사용되고, 원하는 바에 따라 융합효율을 높이기 위해서 디메틸설폭시드 등의 어쥬번트를 첨가 사용할 수도 있다.
면역세포와 골수종 세포의 사용비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면, 골수종 세포에 대해서 면역세포를 1 내지 10배로 하는 것이 바람직하다. 전기 세포융합에 이용하는 배양액으로는, 예를 들면, 전기 골수종 세포주의 증식에 매우 적합한 RPMI 1640 배양액, MEM 배양액, 기타 이러한 종류의 세포배양에 이용되는 통상의 배양액이 사용가능하고, 우태아 혈청(fetal calf serum, FCS) 등의 혈청보조액(serum fluid replacement)을 병용할 수도 있다.
세포융합은, 전기 면역세포와 골수종 세포의 소정량을 전기 배양액 중에서 잘 혼합하여, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액(예를 들면, 평균 분자량 1000 내지 6000 정도)를 통상 30 내지 60%(w/v)의 농도로 가하고, 혼합하여 목적으로 하는 융합세포(하이브리도마)를 형성한다. 그런 다음, 적당한 배양액을 순서대로 가하고, 원심분리하여 상등액을 제거하는 조작을 반복하여 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등을 제거한다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 데옥시티미딘(deoxythymidine)을 포함한 배양액)으로 배양하여 선택된다. 상기 HAT 배양액으로의 배양은, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하는데 충분한 시간(통상 수일 내지 수주간) 동안 계속한다. 그런 다음, 통상의 한계 희석법을 수행하여, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 수행한다.
또는, ROBO1를 인식하는 항체의 제조는 국제공개 WO 03/104453에 기재된 방법을 이용하여 제조하여도 무방하다.
목적으로 하는 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝은 공지된 항원 항체반응에 기초하는 스크리닝 방법으로 수행하면 좋다. 예를 들면, 폴리스틸렌 등으로 완성된 비즈나 시판되는 96 웰의 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 등의 담체에 항원을 결합시키고, 하이브리도마의 배양상등액과 반응시켜 담체를 세정한 후, 효소표지 제 ２차 항체 등을 반응시켜, 배양상등액 중에 감작항원과 반응하는 목적으로 하는 항체가 포함되는지를 결정할 수 있다. 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 한계 희석법 등에 의해 클로닝할 수 있다. 이 때, 항원으로는 면역화(immunization)에 사용된 것을 이용하면 좋다.
또한, 사람 이외의 동물에 항원을 면역화하여 상기 하이브리도마를 얻는 것 이외에, 사람 림파구를 실험실 조건에서 ROBO1에 감작하여, 감작 임파구를 사람 유래의 영구 분열능(capability of dividing permanently)을 가지는 골수종 세포와 융합시켜서, ROBO1에의 결합활성을 가지는 것을 원하는 사람항체를 얻을 수 있다(특공평1-59878호공보 참조). 또한 사람항체 유전자의 모든 레파토리(repertoire)를 가지는 형질전환(transgenic) 동물에 항원이 되는 ROBO1를 투여하여 항ROBO1항체생산세포를 수득하고, 이것을 불멸화(immortalization)시킨 세포로부터 ROBO1에 대한 사람항체를 수득하여도 무방하다(국제공개 WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602 참조).
이와 같이 하여 제조되는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마는, 통상의 배양액 중에서 계대배양할 수 있고, 또한, 액체 질소 중에서 장기보존할 수 있다.
당해 하이브리도마로부터 단클론 항체를 수득하려면, 해당 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하여 그의 배양상등액으로서 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시켜, 그 복수(ascite)로서 얻는 방법 등이 사용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻는데 적합한 반면, 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적절하다.
본 발명에서는 단클론 항체로서 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여, 적당한 벡터에 혼입하고, 이것을 숙주에게 도입하여, 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산시킨 재조합형인 것을 이용할 수 있다(예를 들면, Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem., (1990) 192, 767-775, 1990 참조). 구체적으로는, 항ROBO1항체를 생산하는 하이브리도마로부터, 항ROBO1항체의 가변(V)영역을 암호화하는 mRNA를 분리한다. mRNA의 분리는 공지된 방법, 예를 들면, 구아니딘 초원심분리법(guanidine ultracentrifugation method)(참조: Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry, (1979) 18, 5294-5299), AGPC법(참조: Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem., (1987) 162, 156-159) 등에 의해 수행되어 전RNA(total RNA)를 제조하고, mRNA Purification Kit (Pharmacia제) 등을 사용하여 목적하는 mRNA를 제조한다. 또한, QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia제)를 이용하여 mRNA를 직접 제조할 수도 있다.
얻어진 mRNA로부터 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 항체 V영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학공업사제) 등을 이용하여 실시한다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 수행하려면, 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech제) 및 PCR를 이용한 5'-RACE법(참조: Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res., (1989) 17, 2919-2932) 등을 사용할 수 있다.
얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 정제하고, 벡터 DNA와 연결한다. 또한, 이로부터 재조합 벡터를 제조하고, 대장균 등에 도입하여 콜로니를 선택하여 원하는 재조합 벡터를 제조한다. 그리고, 목적으로 하는 DNA의 염기서열을 공지된 방법, 예를 들면, 디데옥시누클레오티드 사슬종결법(dideoxynucleotide chain termination method) 등에 의하여 확인한다. 목적으로 하는 항ROBO1항체의 V영역을 암호화하는 DNA를 얻은 후, 이것을 원하는 항체의 불변(constant) 영역(Ｃ영역)을 암호화하는 DNA를 함유하는 발현벡터에 혼입한다.
　본 발명에서 사용되는 항ROBO1항체를 제조하려면, 항체 유전자를 발현제어영역, 예를 들면, 인핸서(enhancer), 프로모터의 제어 하에서 발현하도록 발현벡터에 혼입한다. 그런 다음, 이 발현벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여 항체를 발현시킨다.
　항체 유전자의 발현은 항체중쇄(antibody heavy chain)(H쇄) 또는 경쇄(light)(L쇄)를 암호화하는 DNA를 각각 발현벡터에 혼입하여 숙주세포를 동시에 형질전환시켜도 무방하고, 또는 H쇄 및 L쇄을 암호화하는 DNA를 단일의 발현벡터에 혼입하여 숙주세포를 형질전환시켜도 무방하다(국제공개 WO 94/11523 참조).
항체 유전자를 일단 분리하고 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제조하는 경우에는, 적당한 숙주과 발현벡터의 조합을 사용할 수 있다. 진핵세포를 숙주로 사용하는 경우, 동물세포, 식물세포, 진균류세포를 이용할 수 있다. 동물세포로는, (1) 포유류세포, 예를 들면, CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero, (2) 양서류세포, 예를 들면, 제노푸스 래비스 난모세포(Xenopus laevis oocyte), 또는 (3) 곤충세포, 예를 들면, sf9, sf21, Tn5 등이 알려져 있다. 식물세포로는, 니코티아나(Nicotiana)속, 예를 들면 니코티아나·타바캄(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 알려져 있고, 이것을 칼루스(callus) 배양하면 좋다. 진균류 세포로는, 효모, 예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 예를 들면 사카로마이세스·세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들면, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 예를 들면 아스퍼질러스·니거(Aspergillus niger) 등이 알려져 있다. 원핵세포(prokaryotic cell)를 사용하는 경우, 세균 세포를 이용하는 생산계(production system)가 있다. 세균 세포로는, 대장균(E. coli), 고초균(Bacillus subtilis)이 알려져 있다. 이들 세포에 목적으로 하는 항체 유전자를 형질전환에 의해 도입하여, 형질전환된 세포를 실험실 조건에서 배양하여 항체가 얻어진다.
　또한, 재조합형 항체의 생산에는 상기 숙주세포뿐만이 아니라, 형질전환(transgenic) 동물을 사용할 수 있다. 예를 들면, 항체 유전자를 유즙(milk) 중에 고유하게 생산되는 단백질(염소β의 카세인 등)을 암호화하는 유전자에 삽입하여 융합 유전자로서 제조된다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함한 DNA 단편을 염소의 배에 주입하여, 이 배를 암컷의 염소에 도입한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소 또는 그 자손이 생산하는 젖으로부터 원하는 항체를 얻는다. 또한, 형질전환 염소로부터 생산되는 원하는 항체를 포함한 젖량을 증가시키기 위해서, 적당 호르몬을 형질전환 염소에 사용해도 무방하다(참조: Ebert, K.M. et al., Bio/Technology, (1994) 12, 699-702).
　본 발명에서는 사람에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변시킨 유전자 재조합형 항체, 예를 들면, 키메라(Chimeric) 항체, 사람화(humanized) 항체 등을 사용할 수 있다. 이러한 개변 항체는 기존의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 키메라 항체는 사람 이외의 포유동물, 예를 들면, 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변영역과 사람항체의 중쇄, 경쇄의 불변영역으로 구성되는 항체이고, 마우스 항체의 가변영역을 암호화하는 DNA를 사람항체의 불변영역을 암호화하는 DNA와 연결하여, 이것을 발현벡터에 혼입하고 숙주에게 도입하여 생산시켜 얻을 수 있다.
키메라 항체 및 사람화 항체의 Ｃ영역에는, 사람항체가 사용되어 예를 들면 Ｈ쇄에서는 Ｃγ１, Ｃγ２, Ｃγ３, Ｃγ４을, Ｌ쇄에서는 Ｃκ, Ｃλ을 사용할 수 있다. 또한, 항체 또는 그 생산의 안정성을 개선하기 위해서, 사람항체 Ｃ영역을 수식하여도 무방하다.
　키메라 항체는 사람 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 사람항체 유래의 불변영역으로 구성된다. 한편, 사람화 항체는 사람 이외의 포유동물 유래 항체의 상보성 결정영역과 사람항체 유래의 프레임워크(framework) 영역 및 Ｃ영역으로 구성된다. 사람화 항체는 사람의 체내에서 항원성이 저하되고 있기 때문에, 본 발명의 치료제의 유효성분으로 유용하다.
　사람화 항체는 재구성(reshaped) 사람항체라고도 일컬어지고, 사람 이외의 포유동물, 예를 들어 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR; complementarity determining region)을 사람항체의 상보성 결정영역에 이식(transplantation)한 것이고, 그의 일반적인 유전자 재조합 방법도 알려져 있다. 구체적으로는, 마우스 항체의 CDR와 사람항체의 프레임워크 영역(framework region, FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을 말단부에 겹치는 부분을 가지도록 제조한 몇 개의 올리고누클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 사람항체 불변영역을 암호화하는 DNA와 연결한 다음 발현벡터에 혼입하고, 이것을 숙주에게 도입하여 생산시켜 얻어진다(유럽특허공개 EP 239400 , 국제공개 WO 96/02576 참조).
　CDR를 통하여 연결되는 사람항체의 프레임워크 영역은 상보성 결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 의하여, 재구성 사람항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록 항체의 가변영역의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환하여도 무방하다(참조: Sato, K.et al., Cancer Res., 1993, 53, 851-856.).
　또한, 사람항체의 수득방법도 알려져 있다. 예를 들면, 사람 임파구를 실험실 조건에서 원하는 항원 또는 원하는 항원을 발현하는 세포로 감작하고, 감작 임파구를 사람 골수종 세포, 예를 들면 U266와 융합시켜, 항원에의 결합활성을 가지는 원하는 사람항체를 얻을 수도 있다(특공평1-59878 참조). 또한, 사람항체 유전자의 모든 레파토리(repertoire)를 가지는 형질전환 동물을 원하는 항원으로 면역화하여 원하는 사람항체를 수득할 수 있다(국제공개 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조). 또한, 사람항체 라이브러리를 이용하고, 패닝(panning)에 의해 사람항체를 수득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 사람항체의 가변영역을 단쇄항체(single chain antibody, scFv)로서 파지 디스플레이법(phage display method)에 의해 파지의 표면에 발현시켜, 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 분석하면, 항원에 결합하는 사람항체의 가변영역을 암호화하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 밝혀지면, 당해 서열을 적당한 발현벡터를 제조하여 사람항체를 수득할 수 있다. 이러한 방법은 이미 알려져 있고, 국제공개 WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388를 참고로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체는 항체의 전체 분자에 한정되지 않고, ROBO1에 결합하는 한, 항체의 단편 또는 그의 수식물이어도 무방하고, 2가(bivalent)항체도 일가(monovalent)항체도 포함된다. 항체의 단편으로는 Fab, F(ab')2, Fv, 1개의 Fab와 완전한 Fc를 가지는 Fab/c, 또는 Ｈ쇄 또는 Ｌ쇄의 Fv를 적당한 링커(linker)로 연결시킨 단쇄(single chain) Fv(scFv)를 예로 들 수 있다.
항체의 단편은 항체를 효소, 예를 들면 파파인(papain), 펩신으로 처리하여 항체 단편을 생성시키든지, 또는, 이들 항체 단편을 암호화하는 유전자를 구축하여 이것을 발현벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포로 발현시킨다(예를 들면, Co, M.S. et al., J. Immunol., (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology, (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology, (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymology, (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al. Methods in Enzymology, (1989) 121, 663-669; Bird, R. E. et al., TIBTECH(1991) 9, 132-137 참조).
scFv는 항체의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 연결하여 얻어진다. 이 scFv에 있어서, H쇄 V영역과 L쇄 V영역은 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 통하여 연결된다(참조: Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad., Sci., U.S.A, 1988, 85, 5879-5883). scFv에 있어서의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은, 본 명세서에 항체로 기재된 것 중 어느 것으로부터 유래되어도 무방하다. V영역을 연결하는 펩티드 링커로는, 예를 들면 3 내지 25잔기 정도로 구성되는 임의의 단쇄 펩티드가 이용된다. scFv를 암호화하는 DNA는 전기 항체의 H쇄 또는 H쇄 V영역을 암호화하는 DNA, 및 L쇄 또는 L쇄 V영역을 암호화하는 DNA 중에, 그들의 서열 중 전부 또는 원하는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 부분을 주형(template)으로 하고, 그 양단(both extremity)을 규정하는 프라이머대(pair)를 이용하여 PCR법에 의해 증폭한 다음, 펩티드 링커 부분을 암호화하는 DNA, 및 그 양단이 각각 H쇄, L쇄과 연결되도록 규정하는 프라이머대를 조합하여 증폭하여 얻어진다. 또한, 일단 scFv를 암호화하는 DNA가 제조되면, 그들을 함유하는 발현벡터, 및 전기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주를 당업계의 통상의 방법에 따라서 얻어지고, 그의 숙주를 이용하여 통상의 방법에 따라서 scFv를 얻을 수 있다. 이들 항체 단편은 전기와 동일하게 하여 유전자를 수득해 발현시키고, 숙주에 의해 생산시킬 수 있다.
항체의 수식물로서 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다. 또한, 항체에 방사성 동위원소, 화학요법제, 세균유래의 독소(toxin) 등의 세포독성 물질(cytotoxic substance) 등을 결합할 수 있다. 이러한 항체 수식물은 얻어진 항체에 화학적인 수식을 수행하여 얻을 수 있다. 또한, 항체의 수식방법은 이 분야에 있어 이미 확립되었다. 본 발명에서의 「항체」에는 이러한 항체도 포함된다.
또한, 본 발명에서 사용되는 항체는 이중특이성 항체(bispecific antibody)이어도 무방하다. 이중특이성 항체는 ROBO1 분자상이 다른 에피토프(epitope)를 인식하는 항원결합 부위를 가지는 이중 특성 항체(dual specific actibody)이어도 무방하며, 한 쪽의 항원결합 부위가 ROBO1를 인식하고, 한 쪽의 항원결합 부위가 방사성 물질, 화학요법제, 세포유래 독소 등의 세포 독성 물질을 인식하여도 무방하다. 이 경우, ROBO1를 발현하고 있는 세포에 직접세포 독성물질을 작용시켜 종양세포에 특이적으로 장해를 주어 종양세포의 증식을 억제할 수 있다. 이중특이성 항체는 2 종류의 항체의 HL대(pair)를 결합시켜 제조할 수도 있고, 다른 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 융합시키고, 이중특이성 항체생산 융합세포를 제조하여 얻을 수도 있다. 또한, 유전공학적 방법에 의해 이중특이성 항체를 제조할 수도 있다.
전술한 바와 같이 구축한 항체 유전자는 공지된 방법에 의해 발현시켜 수득할 수 있다. 포유류 세포의 경우, 상업적으로 입수가능한 유용한 프로모터, 발현시키는 항체 유전자, 그의 3'측 하류에 폴리 A시그널을 기능적으로 결합시켜 발현시킬 수 있다. 프로모터/인핸서로는, 사람 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 예로 들 수 있다.
또한, 그 외에 본 발명에서 사용되는 항체 발현에 사용할 수 있는 프로모터/인핸서로서 레트로바이러스(retrovirus), 폴리오마바이러스(polyomavirus), 아데노바이러스(adenovirus), 시미안바이러스(simian virus) 40(SV40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서, 또는 사람 신장인자(elongation factor) 1α(HEF1α) 등의 포유류 세포 유래의 프로모터/인핸서 등을 들 수 있다.
SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우는 멀리건(Mulligan) 등의 방법(참조: Nature(1979) 277, 108)에 의하고, HEF1α프로모터/인핸서를 사용하는 경우는 미즈시마(Mizushima) 등의 방법(참조: Nucleic Acids Res., (1990) 18, 5322)에 의하여 용이하게 유전자 발현을 수행할 수 있다.
대장균의 경우, 당업계의 통상의 방법에 따라서 유용한 프로모터, 항체분비를 위한 시그널 서열 및 발현시키는 항체 유전자를 기능적으로 결합시켜 해당 유전자를 발현시킬 수 있다. 프로모터로는 lacz 프로모터, araB 프로모터를 예로 들 수 있다. lacz 프로모터를 사용하는 경우는 워드(Ward) 등의 방법(참조: Nature, (1098) 341, 544-546; FASEB J.(1992) 6, 2422-2427)에 의하고, araB 프로모터를 사용하는 경우는 베터(Better) 등의 방법(참조: Science, (1988) 240, 1041-1043)에 의하여 발현할 수 있다.
항체분비를 위한 시그널 서열로는 대장균의 세포질(periplasm)에서 생산시키는 경우, pelB 시그널 서열(참조: Lei, S. P. et al J. Bacteriol., (1987) 169, 4379)를 사용하는 것이 좋다. 그리고, 세포질에 생산된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적절히 복원시켜(refold) 사용한다.
복제기원으로는, SV40, 폴리오마바이러스(polyomavirus), 아데노바이러스(adenovirus), 소 파필로마바이러스(bovin papillomavirus, BPV) 등으로부터 유래한 것을 이용할 수 있고, 숙주세포계로 유전자 카피수의 증폭때문에, 발현벡터는 선택마커로서 아미노글리코시드 트랜스퍼라제(aminoglycoside transferase, APH) 유전자, 티미딘키나제(thymidine kinase, TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아 포스포리보실 트랜스퍼라제(E. coli xanthine guaninephosphoribosyl transferase, Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase, dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체의 제조를 위해서, 임의의 발현계, 예를 들면 진핵세포 또는 원핵세포계를 사용할 수 있다. 진핵세포로는, 수립된 포유류 세포계, 곤충 세포계, 진사상균 세포 및 효모 세포 등의 동물세포 등을 예로 들 수 있고, 원핵세포로는, 대장균 세포 등의 세균 세포를 예로 들 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 항체는, 포유류 세포, 예를 들면 CHO, COS, 골수종, BHK, Vero, HeLa 세포 중에서 발현된다.
다음으로, 형질전환된 숙주세포를 실험실 조건 또는 생체조건(생체조건)에서 배양하여 목적으로 하는 항체를 생산한다. 숙주세포는 공지된 방법에 따라 배양한다. 예를 들면, 배양액으로 DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM를 사용할 수 있어, 우태아 혈청(FCS) 등의 혈청대체물(serum fluid relpacement)을 함께 사용할 수도 있다.
상술한 바와 같이, 발현, 생산된 항체는 통상의 단백질의 정제로 사용되고 있는 공지된 방법에 의하여 정제할 수 있다. 예를 들면, 프로테인 A컬럼 등의 친화성(affinity) 컬럼, 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외여과법(ultra filtration), 염석법(salt precipitation), 투석법(dialysis) 등을 적절히 선택, 조합하여 항체를 분리, 정제할 수 있다(참조: Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
항체의 항원결합 활성(참조: Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)의 측정에는 공지된 수단을 사용할 수 있다. 예를 들면, ELISA(효소결합 면역흡착 검정법), EIA(효소면역 측정법), RIA(방사면역 측정법) 또는 형광면역법 등을 이용할 수 있다.
의약 조성물
다른 관점으로는, 본 발명은 ROBO1에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 의약조성물을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 ROBO1에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 세포증식 억제제, 특히 항암제를 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 'ROBO1에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유한다(comprising an antibody binding to ROBO1 as an active ingredient)'란, 항ROBO1항체를 주요한 활성성분으로 포함한다는 의미로서, 항ROBO1항체의 함유율이 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포증식 억제제로 함유되는 항체는 ROBO1와 결합하는 한, 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, ROBO1와 특이적으로 결합하는 항체이고, 보다 바람직하게는, 세포독성을 가지는 항체이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 항체는 당쇄(carbohydrate chain)가 개변된 항체여도 무방하다. 항체의 당쇄를 개변하여, 항체의 세포독성을 증강시킬 수 있음이 알려져 있다. 당쇄가 개변된 항체로는, 예를 들면, 글리코실화(glycosylation) 항체(참조: WO 99/54342 등), 당쇄에 부가하는 퓨코스가 결손된 항체(참조: WO 00/61739, WO 02/31140 등)), 이등분(bisecting) glcNAc를 가지는 당쇄를 가지는 항체(참조: WO 02/79255 등) 등이 알려져 있다.
본 발명에서 '세포독성(cytotocxity)'이란, 항체의존성 세포매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC), 보체의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 등을 예로 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 'CDC 활성(CDC activity)'이란, 보체계(complement system)에 의한 세포독성을 의미하고, ADCC 활성과는 표적세포의 세포표면 항원에 특이적 항체가 부착했을 경우, 그의 Fc부분에 Fcｒ수용체 보유세포(면역세포 등)가 Fcｒ수용체를 통하여 결합하여, 표적세포에 장해를 주는 활성을 의미한다.
항ROBO1항체가 ADCC 활성을 가지는지 가지지 않는지, 또는 CDC 활성을 가지는지 가지지 않는지는 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다(예를 들면, Current Protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic Studies in Humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993) 등).
구체적으로는, 우선, 효과기(effector) 세포, 보체용액, 표적세포를 제조한다.
(１) 효과기 세포의 제조
CBA/N마우스 등에서 비장을 적출하고, RPMI 1640 배지(GIBCO사제) 중으로 비장세포를 분리한다. 10% 소 태아 혈청(FBS, HyClone사제)을 포함하는 같은 배지에서 세정한 후, 세포농도를 5×106/ml로 제조하여 효과기 세포를 제조한다.
(２) 보체용액의 제조
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE사제)를 10% FBS 함유배지(GIBCO사제)에서 10배로 희석하여 보체용액을 제조한다.
　(３) 표적세포의 제조
ROBO1를 발현하는 세포(ROBO1를 암호화하는 유전자로 형질전환된 세포, 간암세포, 폐암세포, 유방암세포, 자궁암세포, 위암세포, 대장암세포 등)를 0.2ｍCi의 51Cr-크롬산나트륨(Amersham Pharmacia Biotech사제)과 함께, 10% FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37℃에서 1시간 동안 배양하여 방사성 표지한다. 방사성 표지 후, 세포를 10% FBS 함유 RPMI 1640 배지에서 3회 세정하고, 세포농도를 2×105/ml로 제조하여 표적세포를 제조한다.
그런 다음, ADCC 활성, 또는 CDC 활성을 측정한다. ADCC 활성의 측정의 경우는, 96 웰 U바닥 플레이트(Beckton Dickinson사제)에, 표적세포와 항ROBO1항체를 50μl씩 가하여 얼음 속에서 15분간 반응시킨다. 그런 다음, 효과기 세포 100μl를 가하여 탄산가스 배양기 내에서 4시간 동안 배양한다. 항체의 최종농도(final concentration)는 0 또는 10μg/ml로 한다. 배양한 후, 100μl 상등액을 회수하여, 감마 카운터(COBRAIIAUTO-GMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company사제)에서 방사활성을 측정한다. 세포독성(%)은 (A-C)/(B-C)×100에 의해 구할 수 있다. A는 각 시료에서의 방사활성(cpm), B는 1% NP-40(나카라이사제)를 가한 시료에서의 방사활성(cpm), C는 표적세포만을 포함한 시료의 방사활성(cpm)을 나타낸다.
한편, CDC 활성의 측정의 경우는, 96 웰 평저(flat bottomed) 플레이트(Becton Dickinson사제)에 표적세포와 항ROBO1항체를 50μl씩 가하여 얼음 속(on ice)에서 15분간 반응시킨다. 그런 다음, 보체용액 100μl를 가하여 탄산가스 배양기 내에서 4시간 동안 배양한다. 항체의 최종농도는 0 또는 3μg/ml로 한다. 배양한 후, 100μl 상등액을 회수하여, 감마 카운터에서 방사활성을 측정한다. 세포독성은 ADCC 활성의 측정과 같은 방법으로 구할 수 있다.
항ROBO1항체가 증식을 억제하는 세포는 ROBO1가 발현하고 있는 세포라면 특별히 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 암세포이고, 보다 바람직하게는 간암세포, 폐암세포, 유방암세포, 자궁암세포, 위암세포, 뇌종양세포, 대장암세포이다. 따라서, 항ROBO1항체는 세포증식에 기인하는 질환, 예를 들면 간세포암, 폐암, 유방암, 자궁암, 위암, 뇌종양, 대장암 등의 치료, 예방을 목적으로 하여 사용할 수 있다.
본 발명의 세포증식 저해제 및 항암제는 경구, 비경구 투여 중 어느 것도 가능하나, 바람직하게는 비경구 투여이고, 구체적으로는, 주사제형, 경비투여제형(nasal administration agent type), 경폐투여제형(pulmonary administration agent type), 경피투여형(percutaneous) 등을 들 수 있다. 주사제형으로는, 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사 등에 의해 전신 또는 국부적(local)으로 투여할 수 있다. 또한, 환자의 연령, 증상에 의해 적절히 투여 방법을 선택할 수 있다. 투여량으로는, 예를 들면, 1회에 대해 체중 1kg당 0.0001mg부터 1000mg의 범위에서 선택할 수 있다. 또는, 예를 들면, 환자당 0.001 내지 100000mg/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명의 치료약은 이의 투여량에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포증식 억제제 및 항암제는 당업계의 통상의 방법에 따라서 제제화(formulated)될 수 있고(예를 들면, Remington＇s Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A), 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 포함하는 것이어도 무방하다. 예를 들면 계면활성제, 부형제, 착색료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제(flavoring agent) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 기타 상용되는 담체를 적절히 사용할 수 있다. 구체적으로는, 경질무수규산(light anhydrous silicec acid), 유당(lactose), 결정 셀룰로스(crystalline cellulose), 만니톨(mannitol), 전분(starch), 카멜로스(carmellose) 칼슘, 카멜로스 나트륨, 히드록시 프로필 셀룰로스, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스, 폴리비닐아세탈 디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄지방산 트리글리세라이드(medium chain fatty acid triglyceride), 폴리옥시에틸렌 경화(hardened) 피마자유 60, 백 설탕, 카복시메틸 셀룰로스, 옥수수 전분, 무기염류 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 ROBO1 발현세포와 ROBO1에 결합하는 항체를 접촉시켜 ROBO1 발현세포에 장해를 일으키는 방법 또는 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. ROBO1에 결합하는 항체는 본 발명의 세포증식 억제제로 함유되는 ROBO1에 결합하는 항체로서 상술했던 바와 같다. 항ROBO1항체가 결합하는 세포는 ROBO1을 발현하는 세포라면 특별히 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 암세포이고, 보다 바람직하게는 간암세포, 폐암세포, 유방암세포, 자궁암세포, 위암세포, 뇌종양세포, 대장암세포이다.
본 명세서에서 명시적으로 인용되는 모든 특허 및 참고 문헌의 내용은 모두 본 명세서의 일부로서 여기에서 인용한다. 또한, 본 출원이 가지는 우선권 주장의 기초가 되는 출원인 일본특허출원 제２００４-１０２８６２호, 제２００４-２２７８９９호 및 제２００５-００４０２４호의 명세서 및 도면에 기재된 내용은 모두 본 명세서의 일부로서 여기에서 인용한다.
도 1은 geneChipU133를 이용한 ROBO１ 유전자 발현의 분석결과를 나타낸 그래프이다. 도 1a： 정상조직·비암부(non-cancer site)에 있어서의 ROBO1 유전자의 발현분석, 도 1b：임상검체에서의 ROBO1 유전자의 발현분석, 도 1c：암세포주에 있어서의 ROBO1 유전자의 발현분석.
도 2는 geneChipU95를 이용한 ROBO1 유전자 발현의 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 전장(full length) ROBO1 유전자의 일과성 발현(transient expression)에 의한 COS7 세포 및 HEK293 세포의 용혈물(lysate)에 있어서의 웨스턴 분석결과, 및 그 배양 상등액에 있어서의 웨스턴 분석결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 항ROBO1 단클론 항체 A7241A를 이용한 간암세포주 용혈물에 있어서의 웨스턴 분석결과를 나타낸 그래프 및 사진이다.
도 5는 항ROBO1 단클론 항체 A7241A를 이용한 간세포암 파라핀 표본의 면역조직염색 분석결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 항ROBO1 단클론 항체 A7241A를 이용한 환자혈청 중의 가용형(soluble) ROBO1의 웨스턴 분석결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 sROBO1 면역 토끼혈청을 이용한, 전장 ROBO1 유전자 강제발현 HEK293 세포의 용혈물에 있어서의 웨스턴 분석결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 sROBO1 면역 토끼혈청을 이용한, 전장 ROBO1 유전자 강제발현 HEK293 세포의 용혈물에 있어서의 FACS 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 sROBO1 면역 토끼혈청을 이용한, HepG2 세포의 용혈물에 있어서의 FACS 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 토끼 항 sROBO1 항체를 이용한 효소 면역분석(enzyme immunoassay)에 의한 ROBO1 측정의 표준곡선(standard curve)을 나타낸 그래프이다.
도 11은 ROBO1 농도와 간질환의 악화의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 12는 간질환 환자의 ROBO1 농도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 항ROBO1항 혈청의 ROBO1 발현 HEK293 세포에 대한 CDC 활성의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 항ROBO1 단클론 항체의 ROBO1 발현 HEK293 세포에 대한 CDC 활성을 나타낸 그래프이다.
도 15는 항ROBO1 단클론 항체의 ROBO1 발현 알렉산더(Alexander) 세포에 대한 CDC 활성을 나타낸 그래프이다.
도 16은 항ROBO1 단클론 항체의 ROBO1 발현 HEK293 세포에 대한 ADCC 활성을 나타낸 그래프이다.
후술하는 실시예에서 본 발명을 보다 상세하게 설명하였으나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 １
각 암종에 대한 ROBO1 의 mRNA 발현분석
1-1. gene chip 을 이용한 ROBO1 유전자 발현분석
암세포에 있어서 발현이 증대하는 유전자를 탐색하기 위해서, 표 1에 나타낸 각종 RNA 및 각종 적출조직보다 ISOGEN(일본진사제)를 이용하여 당업계의 통상의 방법에 따라서 제조한 전RNA를 이용하여 검토하였다.
ROBO1 유전자 발현분석에 이용한 조직 및 세포주
조직 입수처 로트
전뇌(whole brain) Clontech 64020-1 101041
편도선 Clontech 6574-1 1030830
뇌량(callosal body) Clontech 6577-1 1010486
미상핵(caudate nucleus) Clontech 6575-1 120289
시상(thalamus) Clontech 6582-1 1070147
해마(hippocampus) Clontech 6578-1 1050638
뇌하수체 Clontech 6584-1 2010981
소뇌 Clontech 64035-1 1010033
갑상선 Stratagene 735040 510225
침샘 Clontech 64026-1 1011322
폐 임상검체 14887
기관 Clontech 64091-1 110201
골격근 Ambion 7982 091P0101C
심장 Ambion 7966 110P43B
신장 Ambion 7976 071P04B
부신 Clontech 64096-1 2020671
간장 임상검체(Surgery) N4
췌장 Ambion 7954 091P0104A
비장 Ambion 7970 061P18A
위 임상검체(Surgery) MN15
소장 Ambion 7984 091P0201A
대장 Ambion 7986 071P10B
방광 Ambion 7990 81P0101A
골수 Clontech 64106-1 1110932
말초혈단핵구세포
(periphral mononuclear blood cell)		 임상검체 -
정소(testis) Clontech 64027-1 6120257
전립선 Ambion 7988 081P0103A
난소 Ambion 7974 051P42A
자궁 Stratagene 735042 1100640
태반 Ambion 7950 061P33B
간경변 임상검체 -
태아뇌 Clontech 64094-1 2020902
태아간장(embryo liver) CHEMICON 356 21060678
조직 입수처 예수(Number of cases)
아교모세포종(glioblastoma) 임상검체 3
폐암(선암(adenocarcinoma)) 임상검체 12
간암(중분화) 임상검체 3
간암(고분화) 임상검체 3
위암 임상검체 3
폐암(소세포암) 임상검체 1
폐암(소세포암) 임상검체 1
폐암(소세포암) 임상검체 1
폐암(소세포암) 임상검체 1
폐암(소세포암) 임상검체 1
폐암(소세포암) 임상검체 1
폐암(소세포암) 임상검체 1
폐암(소세포암) 임상검체 1
폐암(소세포암) 임상검체 1
폐암(소세포암) 임상검체 1
폐암(편평상피암(squamous cell)) 임상검체 1
폐암(편평상피암) 임상검체 1
폐암(편평상피암) 임상검체 1
폐암(편평상피암) 임상검체 1
폐암(편평상피암) 임상검체 1
신장암 임상검체 1
신장암 임상검체 1
대장암 임상검체 1
대장암 임상검체 1
대장암 임상검체 1
대장암 임상검체 1
대장암 임상검체 1
대장암 임상검체 1
대장암_간전이 임상검체 1
대장암_간전이 임상검체 1
대장암_간전이 임상검체 1
대장암_간전이 임상검체 1
대장암_간전이 임상검체 1
대장암_간전이 임상검체 1
대장암_간전이 임상검체 1
대장암 임상검체 1
대장암 임상검체 1
췌장암 임상검체 1
췌장암 임상검체 1
췌장암 임상검체 1
췌장암 임상검체 1
암종 세포주 배지 혈청(%)
뇌종양 US51 DMEM 10
유방암 MCF7 RPMI1640 10
식도암 TE2 RPMI1640 10
위암 AGS RPMI1640 10
GT3 DMEM 10
KatoIII RPMI1640:DMEM=1:1 10
MKN45 RPMI1640 10
MKN74 RPMI1640 10
2M DMEM 10
2MD3 DMEM 10
대장암 CACO2 DMEM 20
DLD1 RPMI1640 10
hCT116 McCoy5A 10
LOVO HamF12:DMEM=1.1 10
SW480 RPMI1640 10
간암 Alexander DMEM 10
HepG2 DMEM 10
HLE DMEM 10
HuH6 DMEM 10
HuH7 DMEM 10
췌장암 Capan1 DMEM 20
KLM1 RPMI1640 10
Panc1 RPMI1640 10
Paca2 RPMI1640 10
신장암 Caki2 RPMI1640 10
폐암 A549 DMEM 10
Lu130 RPMI1640 10
H1359 RPMI1640 10
H157 RPMI1640 10
H1648 HamF12:DMEM=1.1 10
H2009 HamF12:DMEM=1.1 10
H23 RPMI1640 10
H2347 RPMI1640 10
H522 RPMI1640 10
자궁경암 Hela DMEM 10
상기 전RNA를 각 10ng씩 이용하여 geneChip U-133(Affymetrix사제)에 제공하고 Expression Analysis Technical Manual(Affymetrix사제)에 준하여 유전자 발현분석을 수행하였다. 전유전자의 발현 스코어(expression score)의 평균치를 100으로 하고, 암세포에 있어서 발현이 증대하는 유전자를 탐색한 바, ROBO1 mRNA(프로브 ID： 213194_at HG-U133A)가 정상 간(9.1)과 비교하고, 중분화형(moderately-differentiated) 간세포암(236.4)으로 26배, 저분화형(poorly-differentiated) 간세포암(563)으로 62배로 현저하게 발현이 증대된 것이 밝혀졌다. 또한, ROBO1 mRNA는 대장암에 대해도 발현이 증대되었고, 정상 대장(21.4)과 비교하여 원발성(primary large) 대장암에 8예 중 5예에 있어서 2배 이상 증대하였다. 또한, 대장암의 전이성 간암에 있어서는, 7예 중 3예에 있어서 정상 간장 및 대장과 비교해도 현저하게 증대하였다. 또한, ROBO1는 폐소세포암(pulmonary parvicellular cancer)에 대해도 정상 폐와 비교하여 2배 이상 증대한 예가 1예 존재하였다(참조: 도 1a, b).
암세포주의 분석에 있어서는, ROBO1의 발현은 사람 뇌종양 유래 세포주인 U251, 사람 간암세포주 유래의 알렉산더(Alexander), HLE, HuH6, HuH7, HepG2, 사람 폐암세포주 유래의 Lu1320, H522, 그리고 사람 자궁경부암 유래의 Hela 등에서 스코어 100을 나타내고, ROBO1가 상술한 간세포암, 대장암, 그리고 폐암 뿐만 아니라, 뇌종양이나 자궁경부암 등 광범위한 암에 있어서 발현이 증대되고 있을 가능성이 나타났다(참조: 도 1 c).
또한, 간세포암에 관하여 고분화형, 중분화형(HBV, 또는 HCV 바이러스 감염에 기인하는 것), 저분화형 간세포암, 및 비암부(non-cancer site)인 간염 부위, 간경변 부위, 및 정상 간에 관하여 상술한 바와 같이 geneChipTM HG-U95B Target(Affymetrix사제)를 이용하여 분석하였다. 각각 3예분의 적출조직으로부터 전RNA를 제조하고, 5μg씩의 전RNA를 3예분 혼합한 것을 geneChip 분석하도록 하였다. 전칩(total chip) 스코어의 평균치를 100으로 표준화한 값을 나타내었다.
　그 결과, ROBO1 유전자(프로브 ID：55461_at_HG-U95B)는 정상 간, 비암부에서 발현량이 상당히 낮은데 대하여, 고분화형 간세포암으로부터 저분화형 간세포암에 있어서 현저한 발현상승이 확인되고, 간세포암으로 발현이 증대한 것이 밝혀졌다(참조: 도 2).
실시예 ２
1-2. 정량적( quantitative ) PCR 에 의한 ROBO1 mRNA 발현분석
정상 간, 간염 부위, 간경변 부위, 및 간암 적출조직, 및 동일 조직의 비암부에서 제조한 RNA를 이용하여 정량적 PCR를 실시하였다. 즉, 각 조직으로부터 제조한 전RNA에서 역전사 효소 SuperscriptII(GIBCO BRL사제)를 이용하고, 합성한 단쇄 cDNA를 주형(template) DNA로 이용하여 iCycleriQ 실시간 PCR 분석 시스템(BIO-RAD사제)에 의해 PCR 반응을 수행하고, ｍRNA 발현량을 정량하였다. ROBO1의 프라이머는 GenBank번호(NM_133631)의 서열로부터 설계하였다. 각 25μL의 PCR 반응액은 500mM KCl, 100mM Tris-HCl(pH 8.3), 20mMmgCl2, 0.1% 젤라틴, 각 1.25mM dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1μL의 각 단쇄 cDNA, 5pmole 씩 ROBO1 센스 프라이머(sense primer)(서열번호 1), ROBO1 안티센스 프라이머(서열번호 2), 0.75μL의 SYBRgreen I(1000배 희석용액, 타카라주조사제), 0.25μL의 recombinant Taq polymerase Mix(참조: FG Pluthero, Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase, Nucl. Acids. Res. 1993 21: 4850-4851)를 포함하도록 제조한 후, 처음에 94 ℃에서 3분간 일차변성(primary denaturation)을 수행하고, 94 ℃에서 15초, 63 ℃에서 15초, 72 ℃에서 30초로 구성되는 사이클을 40회 수행하였다. 각 표품(authentic preparation) 중의 발현량은 iCycler iQ 실시간 분석 시스템 부속 소프트를 이용하여 계산하였다. 또한, 개개의 RNA 중의 사람 β-액틴(actin) 유전자 발현량도 사람 β-액틴에 특이적인 센스 프라이머(서열번호 3) 및 안티센스 프라이머(서열번호 4)를 이용하여 상술한 바와 같이 분석하여, ROBO1의 분석결과를 사람 β-액틴의 분석결과로 보정한 값(ROBO1/β-액틴×100)을 ROBO1mRNA 발현량으로 하였다.
그 결과, geneChip 분석의 결과와 마찬가지로, 정상 간이나 간염 부위, 및 간경변 부위에 있어서 ROBO1 mRNA의 발현은 거의 관찰되지 않은 것에 비하여, 많은 간세포암부위에 있어서 ROBO1 mRNA의 발현의 증대가 관찰되었다. 특히, 동일 조직 내에서의 암부와 비암부의 비교에 있어서는, ９예 분석 중 8예에 있어서는 2배 이상의 발현증대가 관찰되었다(참조: 표 2).
정량적 PCR 분석에 의한 ROBO1 유전자의 발현증대율 정량적 PCR 분석(대 베타-액틴(beta-actin)(%))
환자 No. 스테이지 비암부 암부 발현상승률
#1 중분화형 16 712 44.5
#12 중분화형 62 488 7.9
#15 중분화형 19 40 2.1
#21 중분화형 19 64 3.4
#30 중분화형 46 118 2.6
#22 중분화형 16 304 19.0
#104 중분화형 N/A 826 -
#108 중분화형 15 32 2.1
#111 중분화형 161 43 0.3
#115 중분화형 154 685 4.4
2배이상의 차가 있는 쌍(pair): 8예
실시예 ３
항 ROBO1 항체의 제작
항ROBO1항체를 이용한 암의 검출이 가능할지, 불가능할지를 분명히 하기 위해서, 항ROBO1항체를 작제하였다.
3-1.항원의 제조
3-1-1. ROBO1 cDNA 의 분리
　ROBO1의 발현을 수행하기 위해서, 우선 ROBO1의 cDNA를 후술한 바와 같이 분리하였다. Hep3B 세포로부터 전술한 방법에 따라 단쇄 cDNA를 제조하고, 그것을 주형으로 프라이머 RBV2F-TA(서열번호: 5)와 RBR-TA(서열번호: 6)를 이용하여 PCR법에 의한 증폭을 수행하였다. 프라이머 RBV2F-TA는 ROBO1 유전자(GenBank: NM_133631)의 5＇-말단에 혼성화(hybridization)하도록 하고, RBR-TA는 3＇-말단에 혼성화하도록 설계하였다. PCR법은 LA-PCR 키트(TAKARA사제)의 프로토콜(protocol)에 준하여 반응액을 제조하고, 처음에 95 ℃에서 2분간 일차변성을 수행하고, 94 ℃에서 15초, 63 ℃에서 15초, 72 ℃에서 5분으로 구성되는 사이클을 30회 수행한 후, 마지막 신장반응을 72 ℃에서 10분간으로 구성되는 조건으로 실시하였다. 그 결과, ROBO1 예측서열과 일치하는 약 5 kbp 부근의 밴드의 검출에 성공하였다. PCR법으로 얻어진 특이적 증폭단편을 TA클로닝법에 의해 pcDNA3.1/V5-His TOPO(Invitrogen사제)에 삽입하고, 염기서열을 당업계에 알려진 방법에 의해 관찰한 바, 분리한 cDNA가 ROBO1인 것이 밝혀졌다.
3-1-2. ROBO1 의 N말단 부위를 발현하는 재조합 배큘로바이러스(baculovirus)의 작제
ROBO1의 N말단으로부터 최초의 면역글로블린 영역(Ig1)을 포함하는 영역에 관하여 배큘로바이러스의 막단백질 gp64와의 융합 단백질로서 발현시켰다. 즉, 상술한 ROBO1 cDNA를 주형으로 RB_BVF 프라이머(서열번호: 7), 및 RB_BVR 프라이머(서열번호: 8)를 이용하여 PCR법으로 ROBO1의 N말단으로부터 최초의 면역글로블린 영역(Ig1)을 포함하는 영역을 암호화하는 유전자를 증폭한 다음, pGEM-Te벡터(프로메가사제)에 삽입하였다. 염기서열을 당업계에 알려진 방법으로 관찰한 후, 제한효소 KpnI를 이용하여 절단한 유전자 단편을 pBucSurf 벡터(Novagen사제)에 삽입하고, 트랜스퍼 벡터 ROBO1N/pBS를 구축하였다. 그런 다음, 4μg의 ROBO1N/pBS를 제한효소 BplI(Fermentas사제)를 이용하여 절단하고 선형화한(linerized) 후, Invitrogen사의 지시서에 따라 Bac-N-Blue DNA와 함께 Sf9 세포에 도입하고, ROBO1-Ig1와 gp64의 융합 단백질 발현 재조합 배큘로바이러스를 제조하였다.
상술한 바에 의하여 제조한 재조합 바이러스를 Sf9 세포(2×106개 세포/mL)에 MOI가 5가 되도록 가하여 감염시킨 후, 27℃에서 3일 동안 배양하였다. ROBO1-Ig1와 gp64의 융합 단백질을 발현하는 발아형(budding) 배큘로바이러스(BV)는 3일 동안 배양한 후의 배양상등액으로부터 회수하였다. 즉, 배양액을 800×g으로 15분간 원심분리하여 세포 및 세포파쇄물을 제거한 후, 회수한 배양상등액을 45,000×g으로 30분간 원심분리하였다. 침전물을 PBS에 현탁시키고, 800×g으로 원심분리하여 세포성분을 제거하고, 상등액을 다시 45,000×g으로 원심분리하여 얻어진 침전물을 PBS로 현탁한 것을 BV분획이라 명명하고, 항원으로서 면역화에 이용하였다.
3-2. 항 ROBO1 단클론 항체의 작제
상술한 바에 의하여 제조한 ROBO1-Ig1 발현 BV를 항원으로서 이용하여 항ROBO1 단클론 항체를 작제하였다. 즉, PBS에 현탁시킨 1mg의 단백질에 상당하는 ROBO1-Ig1 발현 BV를 200ng의 백일해 독소(pertussis toxin)를 혼합한 것을 gp64 형질전환 마우스(참조: WO 03/104453)에 피하주사하여 초기 면역화(initial immunization)하였다. 이후의 면역에서는 500μｍg의 단백질 상당의 ROBO1-Ig1 발현 BV만을 피하주사하였다. 최종 면역으로서 250μg의 ROBO1-Ig1 발현 BV를 정맥 내에 투여하고, 3일 후에 마우스로부터 비장세포를 분리하고, 당업계의 통상의 방법에 의해 마우스 P3U1 세포와의 세포융합을 실시하여 하이브리도마 세포주를 수립하였다. 항ROBO1항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 면역화에 이용한 항원인 ROBO1-Ig1 발현 BV를 고체상(solid phase)에 고정시킨 ELISA에서 선별하였다. ELISA법은 ROBO1-Ig1 발현 BV를 최종농도 10μg/ml가 되도록 96 웰 평저 플레이트(팔콘사제)에 4℃에서 하룻 동안 방치하고 나서, 40% 블록에이스(Block Ace) 시약(다이닛폰제약사제)을 포함하는 TBS 완충용액을 이용하여 블로킹한 후, 하이브리도마 배양상등액을 가하여 실온에서 １시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 실온에서 １시간 동안 HRP 표지 항마우스 IgG 항체(잭슨사제)를 반응시키고, ４회 세정한 후, 실온에서 １시간 동안, 3,3',5,5'-테트라메틸벤진(TMB) 시약(Sigma제)을 반응시켰다. 0.5Ｎ황산으로 반응을 정지시키고, 마이크로플레이트·리더 Multickan JX(Labsystems사제)로 492nm에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, ROBO1에 결합하는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 A7241A 및 A7225A의 수립에 성공하였다. 각 단클론 항체는 생산 하이브리도마 세포의 배양상등액으로부터 암모늄설페이트 침전법(ammonium sulfate precipitation)에 의하여 제조하였다.
실시예 ４
항 ROBO1 항체를 이용한 ROBO1 단백질 분자의 검출
상술한 바에 의해 제조한 항ROBO1항체의 반응성을 확인하기 위해서, ROBO1 강제발현 세포주 및 각종 암세포주의 세포 용혈물을 이용하여 ROBO1을 검출하였다. 먼저, ROBO1 강제발현 HEK293 세포를 이용하여 웨스턴 분석에 의해 항ROBO1항체 A7241A의 반응성을 확인하였다. 동물세포 발현벡터는 전술한 ROBO1를 암호화하는 cDNA를 pcDNA3.1/V5-His TOPO(Invitrogen사제)에 삽입한 전장 ROBO1 유전자 발현벡터(ROBO1/pcDNA3.1)를 사용하였다. 그런 다음, 1μg의 ROBO1/psDNA3.1 또는 음성 대조군으로서 pcDNA3.1(Mock)을 5×104개의 COS7 세포 또는 2×10５개 HEK293 세포에 FuGene6 시약(로슈다이다이아그노스틱사제)을 이용하여 도입하고, ROBO1를 일과성 발현시켰다. 발현벡터 도입 3일 후의 세포를 회수하고, 배양세포를 RIPA 완충용액(150mM 염화나트륨, 1% NP-40, 0.5% 디옥시콜산, 0.1% SDS, 50mM 트리스-히드록시메틸-아미노메탄 염산염(pH 8.0))에서 가용화하여 세포 용혈물을 제조하였다.
각각의 3μg 단백질 상당양의 용혈물을 SDS-폴리아크릴 아미드겔에 가하고, SDS-PAGE에 의해 단백질을 분리한 후, Hybond-P(아머샴 바이오사이언스사제)에 전이시켰다. 그런 다음, 1차항체로 항His항체(Sigma사제) 또는 A7241A항체(1μg/mL)를 이용하고, 2차항체로 HRP 표지 항마우스 IgG 항체(잭슨사제)를 이용하여 ECL 플러스(아머샴 바이오사이언스사제)에 의하여 검출하였는 바, 항His항체와 특이적으로 반응하는 분자량 약 260kd의 밴드가 검출되었다. 이것은 전장의 ROBO1이라고 여겨지나, 항ROBO1항체 A7241A에 있어서도 같은 분자량의 밴드가 세포 용혈물 중에 관찰되었다. 이상의 결과로부터, 항ROBO1항체 A7241A는 전장의 ROBO1 단백질을 특이적으로 검출할 수 있음이 보여졌다. 또한, A7241A에 있어서 분자량이 작은 몇개의 밴드도 상술한 바와 같이 검출되었으나, 이들 밴드는 항His항체에서는 검출되지 않는 것보다 C말단 부위가 결손된 분해물일 가능성도 고려되고, 실제로 배양상등액 중에 분자량 약 120kd의 밴드가 특이적으로 검출되었다(참조: 도 3). 전장 ROBO1의 추정 분자량은 190kd이나, 당쇄 등의 수식(modofication)에 의해 미리 착색시킨(prestained) 분자량 마커(Bio-Rad사제)의 250kd보다 상부의 위치(약 260kd)에서 검출되었다. 또한, HEK293 세포의 pcDNA3.1을 이용한 Mock 시험에서도 ROBO1라고 여겨지는 밴드가 검출되고 있으나, 이것은 ROBO1가 태아기에 발현하기 때문에, 사람 태아 신장 유래의 HKE293 세포가 ROBO1를 발현하는 것으로 여겨진다.
이어서, 각종 암세포주의 세포 용혈물에 관해서 상술한 바와 같이 웨스턴 분석을 수행하였다. 그 결과, geneChipU133의 분석결과와 일치하고, mRNA 발현 스코어가 높은 세포주에 있어서만 분자량 약 260kd의 전장의 ROBO1라고 여겨지는 밴드를 검출하는 것에 성공하였다(참조: 도 4). 또한, 분자량이 작은 복수의 밴드도 이와 같이 검출된 것과 달리 , 세포주에 의해 당쇄의 결합량이 다르거나, 분해물이나 스플라이싱(splicing)에 차이에 의해 분자량이 다른 ROBO1의 존재가 시사되었다.
　또한, ROBO1를 발현하는 암세포주에 있어서도 가용형의 ROBO1 단편이 배양상등액 중에 검출할 수 있는지를 확인한 바, ROBO1를 고발현하는 간암세포주의 배양상등액 중에도 강제발현 세포의 배양상등액과 같은 분자량의 밴드가 항ROBO1항체에 의해 검출되었다(참조: 도 3).
　이상의 결과에 의하여, ROBO1 단클론 항체 A7241A는 ROBO1를 특이적으로 검출할 수 있다는 사실, 및 geneChip 분석에 의한 mRNA 발현의 정도와 ROBO1 단백질의 발현의 정도가 일치한다는 사실이 밝혀졌다. 또한, 항ROBO1항체를 이용한 검토로부터 ROBO1 발현 세포의 배양상등액 중에 가용형의 ROBO1 단편이 존재하는 것이 밝혀져, 가용형 ROBO1를 검출하여 암세포의 유무를 판단할 수 있는 가능성이 강하게 시사되었다.
실시예 ５
간세포암의 면역조직 염색
　
항ROBO1 단클론 항체를 이용하여 간세포암의 임상검체의 면역조직 염색의 분석을 수행하였다.
　간세포암 적출조직의 고정 파라핀 포매(embeded) 표본을 4μｍ로 얇게 썰은 절편을 슬라이드 글라스에 붙여 37℃에서 16시간 정도 두어 충분히 건조시켰다. 100% 크실렌(xylene)에 ５분씩 ３회 담가서 탈파라핀한 다음, 100% 알코올에 ５분간 ３회, 70% 에탄올로 ５분간 담가서 친수화(hydrophylization)를 수행하였다. 그런 다음, 50mM TBS 완충용액(50mM Tris, pH 7.4, 150mM NaCl)로 ５분간, ３회 세정한 후, 구연산 완충용액(10mM, pH 7.0) 중으로 120℃, 10분간 반응시켜 항원을 활성화(activation)시켰다. 이어, TBS 완충용액을 이용하여 ５분씩 ３회 세정한 후, 10μｇ/mL에 희석한 A7241A 항체를 실온에서 １시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 0.3%의 과산화 수소로 15분간, 실온에서 작용시켜 내재성(endogenous)의 퍼옥시다제를 실활화시켰다(inactivated). 또한, TBS 완충용액으로 ３회 세정한 후, 2차항체로서 ENVISION+키트/HRP(DAKO사제)를 １시간 동안 작용시켰다. TBS 완충용액으로 ５분씩 ３회 세정한 후, DAB(3,3＇-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드)를 이용하여 발색시켰다. 또한, 핵의 대비염색(contrast staining)에는 헤마토크실린(hematoxylyin)을 이용하였다.
　그 결과, 간세포암이 특이적으로 항ROBO1항체에 의해 염색되어, ROBO1 단백질이 간세포암으로 특이적으로 발현이 증대되는 것이 밝혀졌다.(참조: 도 5)) 또한, 항ROBO1항체가 간세포암 등의 ROBO1 고발현암의 면역조직화학 진단에 이용가능하다는 것이 밝혀졌다.
실시예 6
간세포암 환자혈청 중의 가용형 ROBO1 단백질( sROBO1 )의 검출
실시예 ４에서 ROBO1 단백질의 단편이 유리되고(released) 가용형 ROBO1로 존재하는 것으로 나타난 결과로부터, 간세포암 환자 등의 ROBO1를 고발현하는 암환자 혈청 중에도 가용형 ROBO1 단백질(sROBO1)이 존재할 가능성이 고려되고, 진단마커로 유용하다고 여겨진다. 그래서, 간세포암 환자 24예 및 간경변 환자 6예, 그리고 간염 환자 6예의 각 혈청 중에서의 가용형 ROBO1의 존재를 A7241A 항체를 이용한 웨스턴 분석에 의해 검토하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 분석은 상술한 바와 같이 수행하고, 환자혈청은 각각 5μl씩 이용하고, 양성 대조군으로서 간암세포주 Alexander(ALX)의 배양상등액을 이용하였다. 그 결과, 24예 중 23예의 간세포암 환자혈청에서 sROBO1가 검출된 것에 비하여, 간경변 및 간염 환자혈청에서는 검출되지 않았다(참조: 도 5). 이로부터, sROBO1는 ROBO1 발현암 환자의 혈청 중에서도 존재하는 것이 보여짐과 동시에, sROBO1의 검출이 간세포암 등의 ROBO1 발현암의 혈청 진단마커로 상당히 유효하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 7
가용형 ROBO1 ( sROBO1 - His )의 제조
ROBO1의 세포외 영역의 C말단에 His 태그를 부가한 가용형 ROBO1(sROBO1-His)를 이하에서와 같이 제조하였다.
ROBO1 cDNA를 주형으로 하고 프라이머 RBV2F-TA(서열번호: 13)와 프라이머 RB_SH_TA(서열번호: 14)를 이용하여 PCR법에 의해 세포외 영역을 암호화하는 유전자를 증폭하였다. PCR 산물을 pBlueBack4.5-TOPO 벡터에 직접 삽입하고, 서열분석을 수행한 후, 올바른 염기서열을 가지는 트랜스퍼 벡터 sROBO1/pBB를 작제하였다. 4μg의 sROBO1/pBB를 이용하여 실시예 ３의 방법과 같이 재조합 배큘로바이러스를 작제하였다.
그런 다음, sROBO1-His는 이하와 같이 제조하였다. 즉, 2×106개/mL의 Sf9 세포에 MOI가 5가 되도록 sROBO1-His 발현 재조합 배큘로바이러스를 감염시키고, 27℃에서 3일간 배양하여 그 배양상등액을 회수하였다. 배양상등액 중에 포함되는 sROBO1-His는 Ni-NTA superflow(QIAGEN사)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 정제하였다. 정제품을 Centircon-10(Amicon사제)을 이용하여 농축하고, PBS로 완충용액 교환하여 sROBO1-His를 제조하였다.
실시예 8
sROBO1 면역화 토끼혈청의 평가
8-1. 웨스턴 분석에 의한 ROBO1 단백질 분자의 검출
뉴질랜드 화이트종 토끼(10주령 암컷, 일본크레아사제)에 PBS에 현탁시킨 sROBO1 정제항원 100μg/0.5mL/마리를 프레운드(Freund) 완전 어쥬번트(DIFCO사제) 0.5mL와 혼합하여 유탁액(emulsion)으로 제조한 것을 피하주사에 의해 투여하여 초기 면역화하였다. 이후 2주 간격으로 PBS에 현탁시킨 sROBO1 정제항원 100μg/0.5mL를 프레운드 불완전 어쥬번트 0.5mL와 혼합하여 유탁액으로 제조한 것을 피하주사에 의해 투여하여 합계 4회 면역화하였다. 면역 전 및 3회, 4회째 면역화 후에 각각 채혈하고, sROBO1에 대한 항체값 상승을 ELISA법으로 확인하였다. 즉, sROBO1를 ELISA용 폴리스틸렌 플레이트에 고상화하여, 토끼 항혈청을 단계적으로 희석시켜 가한 후, 호스래디쉬퍼옥시다제(horseradish peroxidase)를 표지한 항토끼 IgG 항체(카펠사제)와 반응시켜, 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 시약(TMB시약, 사이테크사제)으로 발색시켜 항체역가(antibody titer)를 검정하였다. 항체값의 상승을 확인한 후, 전채혈하여 항ROBO1 토끼 항혈청을 얻었다.
sROBO1 면역 토끼혈청을 이용하고, 웨스턴 분석에 의한 전장 ROBO1 분자의 검출을 수행하였다. 상술한 바와 같이, 전장의 ROBO1를 강제발현시킨 HEK293 세포로부터 RIPA 완충용액을 이용하여 제조한 세포 용혈물의 10μg단백질 상당량을 SDS-폴리아크릴 아미드겔에 가하여, 단백질을 분리한 다음, Hybond-P(아머샴 바이오사이언스사제)에 전이시켰다. 그런 다음, 1차항체로 sROBO1 면역 토끼혈청을 100배 희석으로 사용하고, 2차항체로 HRP 표지 항토끼 IgG 항체(아머샴 바이오사이언스사제)를 이용하여 ECL 플러스(아머샴 바이오사이언스사제)에 의한 검출을 수행하였는 바, 양성 대조군인 A7241A 항체와 같이 전장 ROBO1 분자로 여겨지는 분자량 약 260kd의 밴드를 검출할 수 있었다(참조: 도 ７). 이상의 결과로부터, sROBO1 면역 토끼혈청을 가지고 웨스턴 분석으로 전장 ROBO1 분자를 검출할 수 있다는 사실이 밝혀졌다.
8-2. FACS 분석에 의한 ROBO1 단백질의 검출
ROBO1 강제발현 HEK293 세포를 이용하여 sROBO1 면역 토끼혈청이 세포표면의 ROBO1를 검출할 수 있을지, 없을지를 평가하기 위하여 FACS 분석을 실시하였다. 즉, ROBO1 강제발현 HEK293 세포 또는 음성 대조군인 HEK293 세포를 FACS 용액(1% 알부민, 0.1% NaN3함유 PBS)에 현탁하였다. 세포 현탁액에 sROBO1 면역 토끼혈청을 가하여 4℃에서 60분간 반응시키고, FACS 용액으로 2회 세정한 후, FITC 표지 항토끼 F(ab)2 항체(DAKO사제)를 가하여 4℃에서 30분간 반응시켰다. 그런 다음, FACS 용액으로 2회 세정한 후, 사용 설명서에 따라 FACScalibur(벡톤딕킨슨사제)에 의한 FACS 분석을 실시하였다. 이번 실험의 양성 대조군으로 항V5태그 항체(anti-V5-tag antibody, Invtrogen사제)를 이용하고, 그 2차항체로 FITC 표지 항마우스 IgG 항체(잭슨사제)를 사용하였다. V5태그는 ROBO1 세포내 영역의 C말단에 부가했기 때문에, 항체가 세포 내의 V5태그를 검출할 수 있도록 1차항체 첨가시에 0.1% 사포닌(saponin)을 포함하는 FACS 용액을 이용하였다.
　그 결과, 양성 대조군의 항V5항체로의 피크이동(peak shift)과 같이, sROBO1 면역 토끼혈에 있어서도 ROBO1 강제발현 HEK293 세포에 있어서만 특이적인 피크이동이 관찰되었다(참조: 도 8).
　또한, ROBO1를 원래 발현하고 있는 간암세포주 HepG2 세포에 있어서도 상술한 방법으로 FACS 분석을 수행한 결과, sROBO1 면역 토끼혈청에 있어서 특이적인 피크의 이동이 관찰된 것으로부터, 세포표면상의 본래의 구조를 가지는 ROBO1 분자도 검출할 수 있다는 사실이 밝혀졌다(참조: 도 9).
실시예 9
항 사람 ROBO1 토끼 다클론 항체의 정제
상기 sROBO1 면역 토끼혈청으로부터 작제한 항 사람 ROBO1 토끼·다클론 항체를 이하와 같이 ROBO1를 고상화한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 즉, 첨부된 설명서에 따라 CNBr-Activated Sepharose 4B(Amasham Pharmacia Biotec #17-0430-02)를 이용하고, 겔１mL당에 대하여, 0.7mg의 정제 sROBO1-His 항원을 고정화하고, sROBO1-His 친화성 컬럼을 제조하였다. 그런 다음, 당업계의 통상의 방법에 따라 실시예 ８에서 수득한 토끼혈청으로부터 항ROBO1 토끼·다클론 항체를 정제하였다.
실시예 10
ELISA 에 의한 ROBO1 측정 시스템의 확립 및 혈중 ROBO1 의 검출
실시예 9에서 수득한 항ROBO1 토끼 다클론 항체를 이용하여 ELISA 검출 시스템을 구축하였다. 즉, 항ROBO1 토끼 다클론 항체를 PBS 중에 5μg/mL의 농도로 희석하여, 96 웰의 면역플레이트에 1웰당 50μL씩 분주하였다. 2 내지 8 ℃에서 하룻밤 방치한 후, 0.05%의 Tween 20을 포함하는 PBS로 ３회 세정하고, 1웰당 150μL의 Immunoassay Stabilizer(ABI #10-601-001)로 １시간 동안 오버코트를 수행하였다. 그런 다음, 용액을 버리고, 37℃에서 ２시간 동안 건조시켜, 항ROBO1항체 고상화 플레이트(solid-phased anti-ROBO1 antibody plate)를 제조하였다. 검출에 이용하는 비오틴 표지 항ROBO1항체는 pH 8.5의 50mM 탄산 완충용액을 이용하고, 항ROBO1 토끼 다클론 항체 및 Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce #21335)가 각각 0.12mg/mL 및 46μg/mL가 되도록 제조하여, 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 미반응된 비오틴 시약은 PD-10(Pharmacia #17-0851-01)를 이용하여 제외하고, 비오틴 표지 항ROBO1항체는 1μg/mL가 되도록 30%의 송아지 혈청을 포함하는 PBS로 희석하여 제조하였다. 또한, 비오틴 표지 항ROBO1항체는 30%의 송아지 혈청을 포함하는 트리스 완충 생리식염수 중에 3μg/mL가 되도록 희석한 스트렙트아비딘(streptavidin) 표지 퍼옥시다제(peroxidase)(Vector #SA-5004)를 이용하여 검출하고, 퍼옥시다제의 검출의 기질로서 TMB 시약(사이테크 #TM490041) 및 기질반응의 정지제로 TMB 정지제(사이테크 #TSB999)를 이용하였다.
계속하여 정상인 72예, 간암 환자 79예, 간경변/만성 간염 환자 67예 및 기타 암환자 22예의 혈청 중의 ROBO1 농도를 측정하였다. ROBO1 농도측정 시의 표준(standard)으로는 정제 sROBO1-His를 이용하였다. 혈청 또는 sROBO1-His를 각각 20% 토끼혈청, 1% BSA를 포함한 트리스 완충용액에 90배로 희석하여, 상술한 항체 고상화 플레이트의 각 웰에 100μL씩 투여하였다. 실온에서 ２시간 동안 배양 한 후, 각 웰에 25μL씩의 비오틴 표지 항ROBO1항체를 투여하였다. 또한, 실온에서 ２시간 동안 배양한 후, 각 웰의 반응액을 제거하고, 100μL씩 스트렙트아비딘 표지 퍼옥시다제 시약을 분주하였다. 실온에서 30분 동안 배양한 후, 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS로 5회 세정하였다. 각 웰에 100μL의 TMB 시약을 투여하고, 실온에서 30분 동안 배양한 후, 100μL의 TMB 정지제를 가하여 EIA 플레이트 리더(코로나전자 #MTP-120)에 의해, 450nm 파장의 흡수를 측정하였다. 또한, 630nm의 파장을 대조로 이용하였다.
　그 결과, sROBO1-His를 이용한 경우에 농도의존적인 흡수치의 증가가 관찰되고, 표준(standard) 각 농도의 흡수치로부터 회귀(regression)에 의해(참조: 도 10), 각 혈청 중의 농도를 구하였다. 결과를 표 3, 4, 5 및 6에 나타내었다.
정상인의 혈중 ROBO1 농도
ID
번호		 ROBO1
(ng/ml)
1 1210 44
2 1211 44
3 1212 37
4 1213 39
5 1214 56
6 1215 39
7 1216 41
8 1217 38
9 1218 33
10 1219 38
11 1220 42
12 1221 41
13 1222 33
14 1223 39
15 1224 30
16 1225 38
17 1226 30
18 1227 44
19 1228 36
20 1229 37
21 1230 43
22 1231 44
23 1232 38
24 1233 40
25 1234 22
26 1235 26
27 1236 35
28 1237 40
29 1238 41
30 1239 42
31 1240 36
32 1241 45
33 1242 19
34 1243 35
35 1244 39
36 1245 36
37 1246 36
38 1247 39
39 1248 42
40 1249 27
41 1250 34
42 1251 34
43 1252 29
44 1253 30
45 1254 33
46 1255 23
47 1256 15
48 1257 28
49 1258 39
50 1259 41
ID
번호		 ROBO1
(ng/ml)
51 1260 40
52 1261 43
53 1262 35
54 1263 34
55 1264 36
56 1265 34
57 1266 22
58 1267 21
59 1268 35
60 1269 31
61 1270 29
62 1271 27
63 1272 33
64 1273 28
65 1274 29
66 1275 36
67 1276 47
68 1277 41
69 1278 33
70 1279 38
71 1280 33
72 1281 56
Mean 36
SD 8
Mean+3SD 58
Mean+6SD 81
간암환자의 혈중 ROBO1 농도
ID
번호		 AFP
(ng/ml)		 PIVKA
(U-ml)		 AFP-L3
(%)		 ROBO1
(ng/ml)
1 428 2647 1292 75
2 442 1976 31.8 163
3 275 1670 130 79.4 152
4 538 168 226
5 229 146 30.6 196
6 381 125 17 11.6 170
7 159 101 13 143
8 168 82.7 2.4 112
9 545 73.3 17.9 176
10 585 60.7 50 49.4 58
11 42 56.3 10 12.6 83
12 512 48.5 41 47.1 70
13 360 47.9 10 3.9 83
14 356 39 1565 76
15 520 36.9 10 7.2 81
16 66 34 89 139
17 337 32.5 1.7 79
18 510 30.6 1.5 92
19 322 30 1824 83
20 225 29 19 80
21 231 28 160
22 314 28 2.1 103
23 350 26 18 98
24 402 25 2117 80
25 289 22 10 7.8 107
26 549 21 893 75
27 155 21 26 5.8 80
28 527 19 14 47
29 122 19 167 60
30 151 17 559 72
31 5 16.4 8.8 100
32 481 14.2 315 2 129
33 330 14 91 147
34 359 13 14 37
35 196 12 10 2 152
36 425 11.9 892 0.5 157
37 28 10.7 31 2.4 92
38 271 10.1 13.8 63
39 108 9 33 57
40 453 8 12 0 105
41 346 7 10 93
42 221 7 16 0 51
43 333 6.9 12 0 50
44 584 6.9 19 0 51
45 95 6 42 6.7 91
46 82 5.7 15 0 51
47 340 5.6 16 0 42
48 264 5 13 83
49 4 5 26 0 52
50 130 4.8 15 0 58
ID
번호		 AFP
(ng/ml)		 PIVKA
(U/ml)		 AFP-L3
(%)		 ROBO1
(ng/ml)
51 23 4 14 45
52 256 4 25 - 44
53 341 3 73
54 483 3 17 41
55 466 3 15 43
56 228 2 15 36
57 36 1 14 47
58 426 56
59 251 53
60 141 53
61 230 31
62 366 27
63 452 115
64 328 111
65 429 47 111
66 507 108
67 239 15 77
68 41 70
69 203 14 67
70 50 65
71 457 64
72 266 63
73 32 21 60
74 279 50
75 255 49
76 534 47
77 395 44
78 487 - - - 80
79 175 - - - 56
양성 n 27 16 6 36
% 46 30 18 46
주: 표 중 빈 칸은 미측정
간경변 및 만성간염환자의 혈중 ROBO1 농도
ID
번호		 진단 AFP
(ng/ml)		 PIVKA
(U/ml)		 AFP-L3
(%)		 ROBO1
(ng/ml)
1 791 LC 59.8 9.8 112
2 515 LC 41 - -- 129
3 740 LC 36 16 2.1 95
4 71 LC 33 125
5 187 LC 24.4 12 5.6 107
6 443 LC 22 - - 106
7 20 LC 20 94
8 777 LC 20 92
9 675 LC 17 95
10 601 LC 16 10 - 87
11 445 LC 13 - - 88
12 378 LC 13 23 - 87
13 940 LC 9 75
14 628 LC 8 57
15 260 LC 6.3 10 0 61
16 245 LC 6 19 - 82
17 67 LC 6 18 79
18 776 LC 6 61
19 932 LC 6 35 58
20 137 LC 6 60
21 574 LC 6 - 50
22 220 LC 5.7 0 87
23 533 LC 5 105
24 1165 LC 5 57
25 59 LC 5 11 59
26 62 LC 4 11 110
27 1149 LC 4 10 101
28 80 LC 4 - - 77
29 375 LC 4 - - 48
30 878 LC 4 46
31 1128 LC 4 47
32 69 LC 3 10 76
33 138 LC 3 74
34 513 LC 3 - - 66
35 105 LC 3 12 54
36 570 LC 3 50
37 561 LC 2 13 - 40
38 1030 LC 2 14 28
39 671 LC 1 87
40 1198 LC 1 26 81
41 479 LC 1 - - 59
42 172 LC 1 21 - 50
43 49 LC 1 - - 47
44 409 LC 1 - - 45
45 374 LC - 12 - 105
46 222 LC - - - 102
47 1143 LC 11 91
48 565 LC 87
49 870 LC 15 83
50 380 LC 80
ID
번호		 진단 AFP
(ng/ml)		 PIVKA
(U/ml)		 AFP-L3
(%)		 ROBO1
(ng/ml)
51 193 LC 76
52 169 LC 66
53 921 LC 10 62
54 922 LC 14 50
55 691 LC 48
56 981 LC 30
57 116 LC 66
58 1035 LC 10 53
59 192 CH 17 43
60 458 CH 15 43
61 378 CH 6 14 32
62 772 CH 4 14 28
63 421 CH 3 32
64 568 CH - 39
65 1090 CH 13 33
66 302 CH 17 59
67 285 CH 45

n 8 0 0 15
% 15 0 0 22
주: 표 중 빈 칸은 미측정
간암 이외의 암환자의 ROBO1 혈중 농도
ID
번호
진단		 ROBO1
(ng/ml)
1 43 백혈병 27
2 58 백혈병 61
3 84 백혈병 56
4 182 백혈병 64
5 204 백혈병 52
6 159 폐암 128
7 161 폐암 57
8 76 뇌종양 15
9 29 담낭암
(gallbladder cancer)		 41
10 175 담관암
(cholangiocarcinoma)		 53
11 168 대장암 50
12 68 췌장암 54
13 71 식도암 10
14 106 골수종 31
15 49 위암 1
16 50 위암 80
17 69 위암 43
18 70 위암 67
19 105 위암 18
20 113 위암 39
21 147 위암 128
22 48 하악선암
(submandibular
gland cancer)		 30
양성 n 2
% 9.1
정상인 혈청 72예의 ROBO1 농도측정에 있어서, 평균치 및 표준편차가 36ng/mL 및 8ng/mL인 것으로부터, 평균치＋(６×표준편차)의 81ng/mL를 컷오프값(cutoff value)으로 하였다. 그 결과, 정상인 혈청검체는 모든 예에서 이 컷오프값 이하로 나타났는데 비하여, 간암 환자검체, 간경변/만성 간염 환자검체 및 기타 암환자검체에 있어서 각각 46%(79예 중 36예), 22%(67예 중 15예) 및 ９%(22예 중 2예)로 컷오프값 이상의 값을 나타내어 ROBO1 양성이라고 여겨졌다. 한편, 간암의 진단법으로서 일반적으로 이용되고 있는 AFP의 양성율(positive rate)은, 간암 환자검체 및 간경변/만성 간염 환자검체로 각각 46%(59예 중 27예) 및 15%(52예 중 8예)인 것으로부터, 간암진단에 있어서의 감도(sensitivity) 및 특이성은 AFP와 ROBO1와 거의 동등하였다. 그러나, AFP 음성의 간암 환자검체 32예 중에 있어서, ROBO1 양성 검체가 10예 있고, 그들 10예 중 5예는 PIVKA도 음성인 것으로부터, ROBO1를 이용하여 기존의 진단법으로 간암이라고 진단할 수 없었던 경우에도 진단가능하다고 여겨졌다. 실제로, AFP 단독으로의 검출에서는 46%인 양성율이 ROBO1를 함께 사용하여 63%로 상승하였다.
이상으로부터, 간암의 진단에 있어서 ROBO1 측정 시스템은 현재 이용되고 있는 AFP 측정 시스템과 거의 동등한 성능이 있고, 더욱 기존의 암마커와의 병용에 의해 감도 및 특이성이 높은 암진단법을 확립할 수 있었다.
또한, 표 3, 4, 5 및 6에 나타난 값을 질환별로 구분한 결과를 도 11에 나타내었다. 정상인(NHS), 만성 간염(CH), 간경변(LC) 및 간암(HCC)에 있어서 혈청 중 ROBO1 농도는, 평균치로 각각 34.8, 39.3, 74.0 및 84.4ng/mL였다. 이 결과로부터, 정상인, 만성 간염, 간경변 및 간암 환자 각 군에 있어서의 혈청 중 ROBO1 농도가 간질환의 악화에 비례하여 상승하는 것이 밝혀졌다.
다음으로, 각 개인의 경시적인 측정에 있어서도, ROBO1 농도가 변화하는지 변화하지 않는지를 확인하기 위하여, 간암 발생(on set) 전의 채혈 검체에서의 ROBO1 농도를 측정하였다. 그 결과, ３예 중 2예에 있어서 악화에 비례하여 혈중 ROBO1 농도가 상승하고 있는 것이 관찰되었다(참조: 도 12). １예에 있어서는 악화에 비례한 상승은 관찰되지 않았으나, 정상인 30 내지 40ng/mL보다 고가인 것으로부터 최대치에 다다른 것이라고 추측되었다.
　이러한 결과는 간질환 혈청 중 ROBO1 농도를 경시적으로 측정하여, 즉 모니터링하여, 간암의 진단뿐만 아니라 환자의 간질환의 정도를 관리할 수 있음을 나타내었다.
실시예 11
보체의존성 세포독성( CDC 활성)의 측정
사람 알부민· 베로날 ·완충용액( HAVB )의 작제
NaCl(특급, 와코쥰야쿠공업주식회사) 12.75g, Na-바비탈(특급, 와코쥰야쿠공업주식회사) 0.5625g, 바비탈(특급, 와코쥰야쿠공업주식회사) 0.8625g을 밀리 Ｑ수(milli Q water)에 용해하여 200mL로 한 후, 가압멸균(autoclave) 처리(121℃, 20분간)를 수행하였다. 가압멸균 처리한 100mL의 핫밀리 Ｑ수(hot milli Q water)를 가하여 pH 7.43을 확인하였고(추천 pH 7.5), 이것을 5×베로날 완충용액로 하였다. CaCl2·2 H2O(특급, 쥰세이화학주식회사) 0.2205g을 50mL의 밀리 Ｑ수에 용해하여 0.03 mol/L로 하고, CaCl2 용액으로 하였다. MgCl2·6H2O(특급, 쥰세이화학주식회사) 1.0165g을 50mL의 밀리 Ｑ수에 용해하여 0.1 mol/L로 하고, MgCl2 용액으로 하였다. 5×베로날 완충용액 100mL, 사람 혈청알부민(부미네이트(Buminate)(등록상표) 25%, 사람 혈청알부민 농도 250mg/mL, 백스터주식회사) 4mL, CaCl2 용액 2.5mL, MgCl2 용액 2.5mL, KCl(특급, 쥰세이화학주식회사) 0.1g, 글루코스 (D(+)-글루코스, 포도당무수, 특급, 와코쥰야쿠공업주식회사) 0.5g을 밀리 Ｑ수에 용해하여 500mL로 하였고, 이것을 HAVB로 하였다. 여과 멸균한 후, 설정온도 5℃에서 보존하였다.
표적세포의 제조
ROBO1 강제발현 HEK293 세포는, 10%FBS(Thermo Trace)와 0.5mg/mLgeneticin(GIBCO)를 가한 DMEM 배지(SIGMA)에서 배양하고, 세포박리 완충용액(cell detachment buffer solution, GIBCO)을 이용하여 디쉬(dish)에서 분리하고, 96 웰 U바닥 플레이트(BECTON DICKINSON)의 각 웰에 1×104 세포/웰로 분주하여 하룻밤 동안 배양하였다. 배양한 후, 5.55 MBq의 크롬-51을 가하여 5% 탄산가스 배양기 중 37℃ 1시간 동안 배양하고, 이 세포를 HAVB로 ２회 세정하고, 50μL의 HAVB를 가하여 표적세포를 수득하였다.
새끼토끼 보체의 제조
시험시 사용하기 전에 제조해 둔 새끼토끼 보체(BABY RABBIT COMPLEMENT, CEDARLANE)를, 1 바이알(vial) 당 1mL의 주사용 증류수(후소약품공업주식회사)에 용해하여 보체용액으로 하였다.
크롬 유리시험( CDC 활성)
항ROBO1항 혈청(항ROBO1 토끼 다클론 항체)을 HAVB로 희석하여 50배, 500배의 항체용액으로 하였다. 표적세포에 항체용액을 50μL씩 가하여, 얼음 속에서 15분간 정치하였다. 그런 다음, 각 웰에 보체용액을 100μg/mL씩 가하여(항체의 최종 희석율 200배, 2000배), 5% 탄산가스 배양기 중에 37℃에서 90분간 정치하였다. 플레이트를 원심분리한 후, 각 웰에서 상등액을 100μL씩 회수하여, 감마 카운터에서 방사활성을 측정하였다. 하기 식에 의해 특이적 크롬 유리율(specific chromium release rate)을 구하였다.
　　
　특이적 크롬 유리율(%) = (A-C)/(B-C)×100
A는 각 웰에 있어서의 방사활성(cpm), B는 표적세포에 2% NP-40 수용액(Nonidet　P-40, 나칼라이테스크주식회사)를 100μL, HAVB를 50μL 가한 웰에 있어서의 방사활성(cpm)의 평균치, C는 표적세포에 HAVB를 150μL 가한 웰에 있어서의 방사활성(cpm)의 평균치를 나타낸다. 시험은 각 3회 실시하여, CDC 활성(%)에 대하여 평균치 및 표준편차를 산출하였다.
　그 결과를 도 13에 나타내었다. 항ROBO1항 혈청, 즉, 항ROBO1 다클론 항체가 ROBO1 발현 HEK293 세포에 대해 용량의존적으로 CDC 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다. 또한, 토끼 pre혈청(preserum)을 이용했을 경우는 항체를 첨가하지 않았을 경우와 마찬가지로 CDC 활성을 보이지 않았다.
실시예 12
ROBO1 의 세포외 영역과 결합하는 단클론 항체의 작제
12-1. ROBO1 의 N말단 부위를 발현하는 재조합 배큘로바이러스의 작제
ROBO1의 세포외 영역에 존재하는 피브로넥틴(fibronectin) III 영역(FnIII)을 배큘로바이러스의 막단백질 gp64와의 융합 단백질로서 발현시켰다. 즉, 상술한 ROBO1 cDNA를 주형으로 gp4F 프라이머(서열번호: 15), 및 gp4R 프라이머(서열번호: 16)를 이용하여 PCR법에서 ROBO1의 3번째의 피브로넥틴 영역을 암호화하는 유전자를 증폭한 다음, pGEM-Te벡터(프로메가사제)에 삽입하였다. 염기서열을 당업계에 알려진 방법으로 관찰한 후, 제한효소 KpnI를 이용하여 절단한 유전자 단편을 pBucSurf 벡터(Novagen사제)에 삽입하고, 트랜스퍼 벡터 ROBO1gp4/pBS를 구축하였다. 그런 다음, 4μg의 ROBO1gp4/pBS를 제한효소 BplI(Fermentas사제)를 이용하여 절단하고 선형화한 후, Invitrogen사의 지시서에 따라 Bac-N-Blue DNA와 함께 Sf9 세포에 도입하고, ROBO1의 FnIII와 gp64와의 융합 단백질 발현 재조합 배큘로바이러스를 제조하였다.
서열번호 15：GGTACCCGCACCCAGTGCCCCACCCCAAGG
서열번호 16：GGTACCGCATCTGAAATCTGCTGAGCGAGG
상술한 바에 의하여 제조한 재조합 바이러스를 Sf9 세포(2×106개 세포/mL)에 MOI가 5가 되도록 가하여 감염시킨 후, 27℃에서 3일 동안 배양하였다. ROBO1-FnIII와 gp64와의 융합 단백질을 발현하는 발아형 배큘로바이러스(BV)는 3일간 배양한 후의 배양상등액으로부터 회수하였다. 즉, 배양액을 800×g으로 15분간 원심분리하여 세포 및 세포파쇄물을 제거한 후, 회수한 배양상등액을 45,000×g으로 30분간 원심분리하였다. 침전물을 PBS에 현탁시키고, 800×g으로 원심분리하여 세포 성분을 제거하고, 상등액을 다시 45,000×g으로 원심분리하여 얻어진 침전물을 PBS로 현탁한 것을 BV분획이라 명명하고, 항원으로서 면역화에 이용하였다.
12-2. 항 ROBO1 단클론 항체의 작제
상술한 방법에 의하여 제조한 ROBO1-FnIII 발현 BV를 항원으로서 이용하여 항ROBO1 단클론 항체를 작제하였다. 즉, PBS에 현탁시킨 1mg의 단백질에 상당하는 ROBO1-FnIII 발현 BV를 200ng의 백일해(pertussis) 독소와 혼합한 것을 gp64 형질전환 마우스(참조: WO 03/104453)에 피하주사하여 초기 면역화하였다. 이후의 면역에서는 500μｍg의 단백질 상당의 ROBO1-FnIII 발현 BV만을 피하주사하였다. 최종 면역으로서 250μg의 ROBO1-FnIII 발현 BV를 정맥 내에 투여하고, 3일 후에 마우스로부터 비장세포를 분리하고, 당업계의 통상의 방법에 의해 마우스 NS-1 세포와의 세포융합을 실시하여, 하이브리도마 세포주를 수립하였다. 항ROBO1항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 면역화에 이용한 항원인 ROBO1-FnIII 발현 BV를 고체상에 고정시킨 ELISA에서 선별하였다. ELISA법은 ROBO1-FnIII 발현 BV를 최종농도 10μｇ/ｍL가 되도록 96 웰 평저 플레이트(팔콘사제)에 4 ℃에서 하룻 동안 방치하고 나서, 40% 블록에이스 시약(다이닛폰제약사제)을 포함하는 TBS 완충용액을 이용하여 블로킹한 후, 하이브리도마 배양상등액을 가하여 실온에서 １시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 실온에서 １시간 동안 HRP 표지 항마우스 IgG 항체(잭슨사제)를 반응시키고,４회 세정한 후, 실온에서 １시간 동안, 3,3',5,5'-테트라메틸벤진(TMB) 시약(Sigma제)을 반응시켰다. 0.5Ｎ황산으로 반응을 정지시키고, 마이크로플레이트·리더 Multickan JX(Labsystems사제)로 492nm에서의 흡광도를 측정하였다.
　그 결과, ROBO1에 결합하는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 B2318C의 수립에 성공하였다. 단클론 항체는 생산 하이브리도마 세포의 배양상등액으로부터 암모늄설페이트 침전법에 의하여 제조하였다.
실시예 13
보체의존성 세포독성( CDC 활성)의 측정
사람 알부민·베로날·완충용액(HAVB)의 작제, 표적세포의 제조 및 새끼토끼 보체는 실시예 11에서와 같이 제조하였다.
B2318C 항체(항ROBO1 단클론 항체)를 HAVB로 희석하여, 표적세포에 50μL씩 가하고, 얼음 속에서 15분간 정치하였다. 그런 다음, 각 웰에 보체용액을 100μg/mL씩 가하여(항체의 최종농도는 1μｇ/ｍL, 10μｇ/ｍL로 제조), 5% 탄산가스 배양기 중에 37℃에서 90분간 정치하였다. 플레이트를 원심분리한 후, 각 웰에서 상등액을 100μL씩 회수하여, 감마 카운터에서 방사활성을 측정하였다. 하기 식에 의해 특이적 크롬 유리율을 구하였다.
　　　
특이적 크롬 유리율(%)= (A-C)/(B-C)×100
A는 각 웰에 있어서의 방사활성(cpm), B는 표적세포에 2% NP-40 수용액(Nonidet　P-40, 나칼라이테스크주식회사)를 100μL, HAVB를 50μL 가한 웰에 있어서의 방사활성(cpm)의 평균치, C는 표적세포에 HAVB를 150μL 가한 웰에 있어서의 방사활성(cpm)의 평균치를 나타낸다. 시험은 각 3회 실시하여, CDC 활성(%)에 대하여 평균치 및 표준편차를 산출하였다.
그 결과를 도 13에 나타내었다. B2318C 항체, 즉, 항ROBO1 단클론 항체가 ROBO1 발현 HEK293 세포에 대해 용량의존적으로 CDC 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다.
마찬가지로, 간암세포주인 Alexander(PLC/PRF/5) 세포에 대한 CDC 활성 시험을 시도하였는데, ROBO1 발현 HEK293 세포에 대한 효과와 마찬가지로, B2318C 항체, 즉, 항ROBO1 단클론 항체가 용량의존적으로 CDC 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다(참조: 도 15).
실시예 14
마우스 골수 유래 효과기 세포를 이용한 ADCC 활성의 측정
14-1.　마우스 골수 유래 효과기 세포용액의 제조
SCID 마우스(일본클레어·수컷·10주령)의 대퇴골로부터 골수세포를 수득하여 FBS/RPMI 1640 배지 중 5×105개/mL가 되도록 현탁시키고, 마우스 gM-CSF(PeproTech) 및 사람 IL-2(PeproTech)를 각각 10ng/mL, 50ng/mL가 되도록 가하여 5% 탄산가스 배양기 중 37℃에서 5일 동안 배양하였다. 배양한 후, 스크레이퍼(scraper)에서 벗겨내어 배지에서 1회 세정하고, 10% FBS/RPMI 1640 배지 중 5×106/mL가 되도록 현탁시켜 마우스 골수 유래 효과기 세포용액을 제조하였다.
14-2. 표적세포의 제조
ROBO1 강제발현 HEK293 세포는 10% FBS(ThermoTrace사제) 및 500ng/mL Geneticine(Invitrogen)를 포함하는 DMEM 배지(SIGMA사제)에서 유지계대 배양하고, Cell Dissociation Buffer(Invitrogen사)를 이용하여 디쉬에서 분리하고, 96 웰 U자 바닥 플레이트(Falcon)의 각 웰에 1×104 세포/웰로 분주하여 하룻밤 동안 배양하였다. 배양한 후, 5.55 MBq의 크롬-51을 가하여 5% 탄산가스 배양기 중 37℃에서 ４시간 동안 배양하고, 이 세포를 배지에서 ３회 세정하고, 50μL의 10% FBS/RPMI 1640 배지를 가하여 표적세포를 수득하였다.
14-3. 크롬 유리시험( ADCC 활성)
B2318C 항체(항ROBO1 단클론 항체) 용액을 표적세포에 50μL를 가하여, 얼음 속에서 15분간 반응시킨 후에, 마우스 골수 유래 효과기 세포용액 100μL(５×105 세포/웰)를 가하여 5% 탄산가스 배양기 중 37℃에서 4시간 동안 배양하였다(항체의 최종농도는 1μｇ/ｍL, 10μｇ/ｍ로 제조). 그런 다음, 플레이트를 원심분리하여 배양상등액 100μL 중의 방사활성을 감마 카운터에서 측정하였다. 하기 식에 의해 특이적 크롬 유리율을 구하였다.
　　　　특이적 크롬 유리율(%)=(A-C)×100/(B-C)
A는 각 웰에 있어서의 방사활성(cpm)의 평균치, B는 표적세포에 2% NP-40 수용액(Nonidet　P-40, Code No. 252-23, 나칼라이테스크주식회사)를 100μL, 10% FBS/RPMI 배지를 50μL 가한 웰에 있어서의 방사활성(cpm)의 평균치, C는 표적세포에 10% FBS/RPMI 배지를 150μL 가한 웰에 있어서의 방사활성(cpm)의 평균치를 나타낸다. 시험은 각 3회 실시하여, ADCC 활성(%)에 대하여 평균치 및 표준편차를 산출하였다.
그 결과를 도 16에 나타내었다. B2318C 항체, 즉, 항ROBO1 단클론 항체가 ROBO1 발현 HEK293 세포에 대해 용량의존적으로 ADCC 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다.
이상으로부터, 항ROBO1 단클론 항체를 이용한 ROBO1 발현 암세포에 대한 치료의 유효성이 나타났다.
본 발명은 암의 진단 및 치료, 및 간염 악화의 모니터링에 유용하다.
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Gln Pro Ala Ile Phe Trp 370 375 380 Arg Arg Glu Gly Ser Gln Asn Leu Leu Phe Ser Tyr Gln Pro Pro Gln 385 390 395 400 Ser Ser Ser Arg Phe Ser Val Ser Gln Thr Gly Asp Leu Thr Ile Thr 405 410 415 Asn Val Gln Arg Ser Asp Val Gly Tyr Tyr Ile Cys Gln Thr Leu Asn 420 425 430 Val Ala Gly Ser Ile Ile Thr Lys Ala Tyr Leu Glu Val Thr Asp Val 435 440 445 Ile Ala Asp Arg Pro Pro Pro Val Ile Arg Gln Gly Pro Val Asn Gln 450 455 460 Thr Val Ala Val Asp Gly Thr Phe Val Leu Ser Cys Val Ala Thr Gly 465 470 475 480 Ser Pro Val Pro Thr Ile Leu Trp Arg Lys Asp Gly Val Leu Val Ser 485 490 495 Thr Gln Asp Ser Arg Ile Lys Gln Leu Glu Asn Gly Val Leu Gln Ile 500 505 510 Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Asp Thr Gly Arg Tyr Thr Cys Ile Ala Ser 515 520 525 Thr Pro Ser Gly Glu Ala Thr Trp Ser Ala Tyr Ile Glu Val Gln Glu 530 535 540 Phe Gly Val Pro Val Gln Pro Pro Arg Pro Thr Asp Pro Asn Leu Ile 545 550 555 560 Pro Ser Ala Pro Ser Lys Pro Glu Val Thr Asp Val Ser Arg Asn Thr 565 570 575 Val Thr Leu Ser Trp Gln Pro Asn Leu Asn Ser Gly Ala Thr Pro Thr 580 585 590 Ser Tyr Ile Ile Glu Ala Phe Ser His Ala Ser Gly Ser Ser Trp Gln 595 600 605 Thr Val Ala Glu Asn Val Lys Thr Glu Thr Ser Ala Ile Lys Gly Leu 610 615 620 Lys Pro Asn Ala Ile Tyr Leu Phe Leu Val Arg Ala Ala Asn Ala Tyr 625 630 635 640 Gly Ile Ser Asp Pro Ser Gln Ile Ser Asp Pro Val Lys Thr Gln Asp 645 650 655 Val Leu Pro Thr Ser Gln Gly Val Asp His Lys Gln Val Gln Arg Glu 660 665 670 Leu Gly Asn Ala Val Leu His Leu His Asn Pro Thr Val Leu Ser Ser 675 680 685 Ser Ser Ile Glu Val His Trp Thr Val Asp Gln Gln Ser Gln Tyr Ile 690 695 700 Gln Gly Tyr Lys Ile Leu Tyr Arg Pro Ser Gly Ala Asn His Gly Glu 705 710 715 720 Ser Asp Trp Leu Val Phe Glu Val Arg Thr Pro Ala Lys Asn Ser Val 725 730 735 Val Ile Pro Asp Leu Arg Lys Gly Val Asn Tyr Glu Ile Lys Ala Arg 740 745 750 Pro Phe Phe Asn Glu Phe Gln Gly Ala Asp Ser Glu Ile Lys Phe Ala 755 760 765 Lys Thr Leu Glu Glu Ala Pro Ser Ala Pro Pro Gln Gly Val Thr Val 770 775 780 Ser Lys Asn Asp Gly Asn Gly Thr Ala Ile Leu 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Ser Asn Leu Thr Thr 995 1000 1005 Tyr Ser Arg Pro Ala Asp Cys Ile Ala Asn Tyr Asn Asn Gln Leu Asp 1010 1015 1020 Asn Lys Gln Thr Asn Leu Met Leu Pro Glu Ser Thr Val Tyr Gly Asp 1025 1030 1035 1040 Val Asp Leu Ser Asn Lys Ile Asn Glu Met Lys Thr Phe Asn Ser Pro 1045 1050 1055 Asn Leu Lys Asp Gly Arg Phe Val Asn Pro Ser Gly Gln Pro Thr Pro 1060 1065 1070 Tyr Ala Thr Thr Gln Leu Ile Gln Ser Asn Leu Ser Asn Asn Met Asn 1075 1080 1085 Asn Gly Ser Gly Asp Ser Gly Glu Lys His Trp Lys Pro Leu Gly Gln 1090 1095 1100 Gln Lys Gln Glu Val Ala Pro Val Gln Tyr Asn Ile Val Glu Gln Asn 1105 1110 1115 1120 Lys Leu Asn Lys Asp Tyr Arg Ala Asn Asp Thr Val Pro Pro Thr Ile 1125 1130 1135 Pro Tyr Asn Gln Ser Tyr Asp Gln Asn Thr Gly Gly Ser Tyr Asn Ser 1140 1145 1150 Ser Asp Arg Gly Ser Ser Thr Ser Gly Ser Gln Gly His Lys Lys Gly 1155 1160 1165 Ala Arg Thr Pro Lys Val Pro Lys Gln Gly Gly Met Asn Trp Ala Asp 1170 1175 1180 Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala His Pro Pro Pro His Ser Asn Ser Glu 1185 1190 1195 1200 Glu 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gatatggata cggatgcgcc agaagaggaa gaagacgaag ccgacatgga ggtagccaag 4020 atgcaaacca gaaggctttt gttacgtggg cttgagcaga cacctgcctc cagtgttggg 4080 gacctggaga gctctgtcac ggggtccatg atcaacggct ggggctcagc ctcagaggag 4140 gacaacattt ccagcggacg ctccagtgtt agttcttcgg acggctcctt tttcactgat 4200 gctgactttg cccaggcagt cgcagcagcg gcagagtatg ctggtctgaa agtagcacga 4260 cggcaaatgc aggatgctgc tggccgtcga cattttcatg cgtctcagtg ccctaggccc 4320 acaagtcccg tgtctacaga cagcaacatg agtgccgccg taatgcagaa aaccagacca 4380 gccaagaaac tgaaacacca gccaggacat ctgcgcagag aaacctacac agatgatctt 4440 ccaccacctc ctgtgccgcc acctgctata aagtcaccta ctgcccaatc caagacacag 4500 ctggaagtac gacctgtagt ggtgccaaaa ctcccttcta tggatgcaag aacagacaga 4560 tcatcagaca gaaaaggaag cagttacaag gggagagaag tgttggatgg aagacaggtt 4620 gttgacatgc gaacaaatcc aggtgatccc agagaagcac aggaacagca aaatgacggg 4680 aaaggacgtg gaaacaaggc agcaaaacga gaccttccac cagcaaagac tcatctcatc 4740 caagaggata ttctacctta ttgtagacct acttttccaa catcaaataa tcccagagat 4800 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7475 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 accatgattg cggagcccgc tcac 24 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 ggccggctgc ttcaccacat 20 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 ggtacccgca cccagtgccc caccccaagg 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 ggtaccgcat ctgaaatctg ctgagcgagg 30

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  15. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 단백질에 결합하고 세포독성을 가지는 항체를 유효성분으로 함유하는 항암제.
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  17. 제 15항에 있어서,
    암이 간세포암인 것을 특징으로 하는
    항암제.
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  39. 제 15항에 있어서,
    항체는 사람화 항체인 것을 특징으로 하는
    항암제.
  40. 제 15항 또는 제 39항에 있어서,
    세포독성은 항체의존성 세포매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)인 것을 특징으로 하는
    항암제.
  41. 제 15항 또는 제 39항에 있어서,
    세포독성은 보체의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)인 것을 특징으로 하는
    항암제.
  42. 제 17항에 있어서,
    항체는 사람화 항체인 것을 특징으로 하는
    항암제.
  43. 제 17항 또는 제 42항에 있어서,
    세포독성은 항체의존성 세포매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)인 것을 특징으로 하는
    항암제.
  44. 제 17항 또는 제 42항에 있어서,
    세포독성은 보체의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)인 것을 특징으로 하는
    항암제.
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