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TWI699218B - 體外活化及/或擴增免疫細胞的方法 - Google Patents

體外活化及/或擴增免疫細胞的方法 Download PDF

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TWI699218B
TWI699218B TW107146291A TW107146291A TWI699218B TW I699218 B TWI699218 B TW I699218B TW 107146291 A TW107146291 A TW 107146291A TW 107146291 A TW107146291 A TW 107146291A TW I699218 B TWI699218 B TW I699218B
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江佩馨
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Abstract

所描述為一種體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，包括以下步驟：a) 提供磁性粒子，磁性粒子的表面為多突狀且修飾有至少一種免疫誘發物質，其中磁性粒子由內而外包括共聚物核心、高分子層、磁性物質層以及矽基層；b) 提供細胞溶液，細胞溶液中包括至少一種免疫細胞；c) 將磁性粒子與細胞溶液進行接觸，使磁性粒子的表面上的至少一種免疫誘發物質得以活化及/或擴增細胞溶液中的至少一種免疫細胞。

Description

體外活化及/或擴增免疫細胞的方法
本揭露是關於一種調控免疫細胞的方法，特別是關於一種體外活化及/或擴增免疫細胞的方法。
癌症免疫療法包括單株抗體藥物、免疫檢查點抑制劑、細胞免疫治療及癌症疫苗，其中細胞免疫治療的重大進展使其受到相當的矚目。
當免疫細胞從病人血液中純化分離出來後，如何能夠有效率且安全地活化及擴增免疫細胞是影響其療效的關鍵技術。一般來說，人體中是藉由抗原呈現細胞(antigen presenting cells,APC)來活化免疫細胞並引發免疫反應以毒殺外來物質，而其中，樹突狀細胞(dendritic cells,DC)為最重要的抗原呈現細胞。
細胞免疫治療技術發展至今是以人造抗原呈現細胞(artificial antigen presenting cells,aAPC)來達到體外活化及擴增免疫細胞的目的，其中利用基因工程改造的飼養細胞(feeder cells)作為aAPC由於存在操作不便及安全性的問題，因此具磁性且可快 速分離同時又修飾有特定抗體以作為免疫誘發物質的磁性粒子已成為市場主流。
目前應用於活化及擴增免疫細胞的市售磁性粒子幾乎皆為圓球形，且表面修飾的抗體也大多相同，主要皆應用於活化及擴增αβT細胞，而缺乏可應用於γδT細胞的相關產品。再者，近年來相關研究文獻也指出，磁性粒子本身的尺寸、彈性、表面抗體的組成及修飾方式都可能會影響其活化及擴增免疫細胞的效能。
因此，亟需開發一種可高效能活化及擴增免疫細胞的磁性粒子，且於表面刺激物質的提供選擇性上可更多元，以利進一步應用於γδT細胞。
本揭露提供一種體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其能以高效率活化及/或擴增免疫細胞。
本揭露的體外活化及擴增免疫細胞的方法包括以下步驟：a)提供磁性粒子，磁性粒子的表面為多突狀且修飾有至少一種免疫誘發物質，其中磁性粒子由內而外包括共聚物核心、高分子層、磁性物質層以及矽基層；b)提供細胞溶液，細胞溶液中包括至少一種免疫細胞；c)將磁性粒子與細胞溶液進行接觸，使磁性粒子的表面上的至少一種免疫誘發物質得以活化及/或擴增細胞溶液中的至少一種免疫細胞。
在本揭露的一實施例中，上述磁性粒子的表面包括多個形狀不規則的突起物。
在本揭露的一實施例中，上述多個突起物的平均高度為100nm~5000nm。
在本揭露的一實施例中，上述磁性粒子的平均直徑為1μm~50μm。
在本揭露的一實施例中，上述免疫細胞包括T細胞、NK細胞或前述之組合。
在本揭露的一實施例中，上述免疫細胞包括調節T細胞。
在本揭露的一實施例中，上述免疫細胞包括αβT細胞、γδT細胞或前述之組合。
在本揭露的一實施例中，上述免疫細胞包括γδT細胞。
在本揭露的一實施例中，上述至少一種免疫誘發物質可包括抗CD3抗體、抗CD28抗體、抗TCR γ/δ抗體、抗CD83抗體、抗CD137抗體、4-1BBL、抗CD2抗體、抗CD335抗體或前述之組合。
在本揭露的一實施例中，上述至少一種免疫誘發物質修飾至磁性粒子的表面的方式包括非共價鍵結(non-covalent binding)、共價鍵結(covalent binding)、生物素-親和素作用(avidin-biotin interaction)、靜電吸附作用(electrostatic adsorption)、疏水性吸附作用(hydrophobic adsorption)或前述之組合。
在本揭露的一實施例中，上述共聚物核心包括由單官能基單體與雙官能基單體共聚而成的共聚物。
在本揭露的一實施例中，上述的雙官能基單體相對於單官能基單體的體積百分比例為0.4%~2%。
在本揭露的一實施例中，上述共聚物核心包括苯乙烯/二乙烯苯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物或甲基丙烯酸甲酯/二乙烯苯共聚物。
在本揭露的一實施例中，上述高分子層包括帶有電荷的至少一官能基團。
在本揭露的一實施例中，上述的至少一官能基團包括羧基、胺基或前述之組合。
在本揭露的一實施例中，上述的磁性物質層包括順磁性材料(paramagnetic)、超順磁性材料(superpara magnetic)、鐵磁性材料(ferromagnetic)、鐵氧體磁性材料(ferritemagnetic)或前述之組合。
在本揭露的一實施例中，上述的磁性物質層包括鐵離子(Fe2+)、鈷離子(Co2+)、鎳離子(Ni2+)或前述之組合。
在本揭露的一實施例中，上述矽基層的厚度至少為1nm~50nm。
基於上述，相較於傳統的球體磁性粒子，本揭露實施例 所提供的磁性粒子因具有多突狀表面，在面對外表型態多屬不規則形之免疫細胞，甚至是近似神經細胞之具有不規則突起的樹突狀細胞時，於仿生的概念下，應可增加磁性粒子與免疫細胞接觸的表面積，進而提升磁性粒子活化免疫細胞及/或擴增免疫細胞數目的效能。
此外，在本揭露之另一實施例中，磁性粒子可於其表面藉由設計並修飾特定的免疫誘發物質種類，使得磁性粒子可應用於γδT細胞的活化及擴增，進而克服目前尚缺乏可應用於γδT細胞的相關產品的問題。如此一來，將有助免疫細胞應用於癌症免疫療法等技術的研究與發展。
為讓本揭露的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
100:磁性粒子
102a、102b:免疫誘發物質
110:多突狀共聚物核心
112:突起物
120:高分子層
130:磁性物質層
h:平均高度
圖1為本揭露一實施例的一種體外活化及/或擴增免疫細胞的方法的流程圖。
圖2為本揭露一實施例的一種用於體外活化及/或擴增免疫細胞的方法的磁性粒子的示意圖。
圖3A至圖3C依次是本揭露實驗例1中平均直徑分別為2.5μm、4.5μm以及8.5μm的多突狀磁性粒子的電子顯微鏡照片。
圖4為本揭露實驗例1的多突狀磁性粒子的磁滯曲線。
圖5A至5D分別顯示使用市售磁性粒子(圖5A)、平均直徑為2.5μm(圖5B)、4.5μm(圖5C)以及8.5μm(圖5D)的多突狀磁性粒子進行T細胞活化及/或擴增於不同培養天數的細胞數量，過程中於培養的第5天移除磁性粒子。其中，橫軸代表時間(天)，左方縱軸代表細胞數目，而右方縱軸代表細胞的擴增倍率。又，各長條圖中分別以斜線及空白代表活細胞數量及死細胞數量。另，以第0天之初始細胞數量作為對照基準，將其餘各天的活細胞數量分別除以第0天之初始細胞數量而獲得各天的活細胞數量的平均擴增倍率，並以虛線連結各天所計算之活細胞數量的平均擴增倍率，以顯示第0~12天培養過程中活細胞數量的擴增趨勢。
圖6A至6D分別顯示使用市售磁性粒子(圖6A)、表面修飾有抗體且抗CD3抗體與抗CD28抗體比例分別為1：2(圖6B)、1：6(圖6C)以及1：10(圖6D)的多突狀磁性粒子進行T細胞活化及/或擴增於不同培養天數的細胞數量，過程中於培養的第5天移除磁性粒子。其中，橫軸代表時間(天)，左方縱軸代表細胞數目，而右方縱軸代表細胞尺寸(μm)。又，各長條圖中分別以斜線及空白代表活細胞數量及死細胞數量。另，以第0天之初始細胞數量作為對照基準，將其餘各天的活細胞數量分別除以第0天之初始細胞數量而獲得各天的活細胞數量的平均擴增倍率，並以虛線連結各天所計算之活細胞數量的平均擴增倍率，以顯示第0~12天培養過程中活細胞數量的擴增趨勢。此外，更以實線顯示第0~12天 培養過程中平均細胞尺寸(μm)的增減態勢。
圖7A至7C分別顯示使用流式細胞儀對T細胞進行分析的結果，其中比較組1、比較組2以及實驗組依序為經市售商品TransActTM T Cell reagent、Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28以及表面修飾有抗體且抗CD3抗體與抗CD28抗體之比例為1：6的前述多突狀磁性粒子進行T細胞活化及/或擴增後的T細胞，並以未經處理之第0天之初始細胞作為對照組。其中，橫軸代表各組別，左方縱軸代表各種細胞在所有細胞中所佔的比例(%)，DN表示雙陰性(double negative)T細胞，Naive表示初始T細胞，TCM表示中央記憶T細胞(central memory T cells)，TEM表示效應記憶T細胞(effector memory T cells,TEM)，TEMRA表示效應記憶重新表現CD45RAT細胞(T effector memory re-expressing CD45RA(TEMRA))。
圖1為本揭露一實施例的一種體外活化及/或擴增免疫細胞的方法的流程圖。圖2為本揭露一實施例的一種用於體外活化及/或擴增免疫細胞的方法的磁性粒子的示意圖。請同時參照圖1與圖2，首先，進行步驟S10，提供磁性粒子100，磁性粒子100的表面為多突狀且修飾有至少一種免疫誘發物質102a、102b，其中磁性粒子100由內而外包括共聚物核心110、高分子層120、磁性物質層130以及矽基層140。在一實施例中，磁性粒子100具有平均直徑D，即磁性粒子100的最短直徑(例如D1)及最長直徑 (例如D2)的平均值，其範圍可為1μm~50μm。在一實施例中，磁性粒子100的平均直徑可為2μm~40μm。在另一實施例中，磁性粒子100的平均直徑可為3μm~30μm。在又一實施例中，磁性粒子100的平均直徑可為4μm~20μm。在再一實施例中，磁性粒子100的平均直徑可為2μm~10μm。
上述多突狀共聚物核心110為球形，其表面具有多個突起物112。突起物112的平均高度h，即各突起物112之頂端至各突起物112之兩底部連線的垂直距離(例如高度h1、h2、h3)的平均值，其範圍可為100nm~5000nm，例如為100nm~500nm、500nm~1000nm、1000nm~1500nm、1500nm~2000nm、2000nm~2500nm、2500nm~3000nm、3000nm~3500nm、3500nm~4000nm、4000nm~4500nm或4500nm~5000nm。在一實施例中，突起物112的平均高度h可為300nm~4000nm。在另一實施例中，突起物112的平均高度h可為500nm~3000nm。在又一實施例中，突起物112的平均高度h可為800nm~2000nm。在又另一實施例中，突起物112的平均高度h可為1000nm~1800nm。在一實施例中，突起物112可以是均勻地或不均勻地散布在表面上，以整體來看，突起物112實質上為不規則的突起。例如，突起物112可包括，但不限於乳突狀或球狀。
在一實施例中，上述多突狀共聚物核心110的形成方法為可包括，但不限於分散聚合法、懸浮聚合法或乳化聚合法，意即以上述聚合法將至少2種單體聚合成共聚物。在一實施例中， 至少2種單體可以是脂溶性單體，例如可包括單官能基單體、雙官能基單體或前述之組合。在一實施例中，若為單官能基單體與雙官能基單體之組合，則雙官能基單體相對於單官能基單體的體積百分比例可為0.4%~2%，例如是0.5%~1.8%或0.6%~1.5%。
此外，單官能基單體可為單乙烯基單體，諸如苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、氯乙烯或其他單官能基單體。雙官能基單體可為雙乙烯基單體，諸如二乙烯苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯或其他雙官能基單體。在一實施例中，共聚物可包括苯乙烯/二乙烯苯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物或甲基丙烯酸甲酯/二乙烯苯共聚物，但不以此為限。
在一實施例中，上述高分子層120可覆蓋多突狀共聚物核心110，且高分子層120包括至少一官能基團。其中，高分子層120的材料不同於多突狀共聚物核心110，且官能基團可帶有電荷，使得多突狀共聚物核心110的表面帶電，以利於後續吸附磁性物質層130的磁性物質前驅物。在一實施例中，上述官能基團可包括，但不限於帶負電。此外，官能基團可為羧基、胺基或其組合，但不限於此。特別一提的是，雖然在圖2中是將高分子層120與多突狀共聚物核心110繪示為可區別的膜層，然而，高分子層120與多突狀共聚物核心110實際上並不存在明顯的界線。再 者，雖然在本揭露中是以高分子層來統稱位於多突狀共聚物核心表面的具有官能基團的膜層，但實際上，高分子層120可為經官能基團修飾(modification)的多突狀共聚物核心的表面，而非具體形成一膜層。
上述磁性物質層130可覆蓋高分子層120。在本一實施例中，覆蓋有高分子層120的多突狀共聚物核心110可吸附磁性物質前驅物，以於高分子層120上形成磁性物質層130。在一實施例中，磁性物質前驅物可包括，但不限於鐵離子(Fe2+)、鈷離子(Co2+)、鎳離子(Ni2+)或其組合。具體而言，磁性物質前驅物可為前述金屬離子的鹽類，諸如氯化亞鐵、氯化亞鈷、氯化鎳等。在一實施例中，磁性物質層130的表面可具有小突起，意即具有粗糙表面。此外，磁性物質層130可包括，但不限於順磁性材料、超順磁性材料、鐵磁性材料、鐵氧體磁性材料或其組合。在一實施例中，磁性物質層130可以是鐵磁性材料。又，在一實施例中，磁性物質層130可具有實質上均一的厚度，且全面性地包覆共聚物核心110。舉例來說，磁性物質層130的厚度可為20nm~200nm，且例如是40nm~100nm。
上述矽基層140可覆蓋磁性物質層130。在一實施例中，矽基層140的材料可包括，但不限於矽氧烷、矽玻璃、氧化矽、矽酸鹽或其組合。具體而言，矽基層140可包括矽酸四甲酯(tetramethoxysilane,TMOS)、四乙氧基矽烷(tetraethoxysilane,TEOS)、3-氨基丙基三乙氧基矽烷(3-Aminopropyltriethoxysilane, APTES)、3-環氧丙氧丙基三甲氧基矽(3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane,GOPTS)等材料。又，在一實施例中，矽基層140的厚度可為1nm~50nm，且可為5nm~40nm、10nm~35nm、15nm~30nm或10nm~20nm。
在一實施例中，由於依序形成於多突狀共聚物核心110上的高分子層120、磁性物質層130以及矽基層140實質上不會改變多突狀共聚物核心110的型態，因此所形成的磁性粒子100仍具有多突狀的外表。如此一來，仍能大幅增加磁性粒子100可與免疫細胞的表面積，且有利於磁性粒子100的緊密堆積。
在一實施例中，上述免疫誘發物質102a、102b可以是任何可以引起免疫反應的物質，可包括但不限於特定類型的胜肽、蛋白質或片段。在一實施例中，針對所要擴增及/或活化的免疫細胞種類，可選擇特定類型的抗體作為免疫誘發物質102a、102b。舉例來說，免疫誘發物質102a、102b可為抗體，諸如抗CD3(anti-CD3)抗體、抗CD28(anti-CD28)抗體、抗TCR γ/δ(anti-TCR γ/δ)抗體、抗CD83(anti-CD83)抗體、抗CD137(anti-CD137)抗體、4-1BBL(4-1BB Ligand，或CD137 Ligand)、抗CD2(anti-CD2)抗體、抗CD335(anti-CD335)抗體或前述之組合。在一實施例中，為了活化T細胞，於免疫誘發物質102a、102b的選擇上可至少包括兩種不同抗體，諸如抗CD3抗體以及抗CD28抗體，但不限於此。特別注意的是，雖然在圖2中是繪示兩種不同免疫誘發物質102a、102b為例，但在其他實施例中，磁性粒子100的最外 表面上可以包括同一種免疫誘發物質或者是兩種以上不同免疫誘發物質。此外，圖2中的免疫誘發物質102a、102b的排列方式僅為例示，並非欲意限制免疫誘發物質的排列方式。
在一實施例中，免疫誘發物質102a、102b可以是均勻地分布於磁性粒子100的最外表面上，以利於與免疫細胞進行接觸。在另一實施例中，免疫誘發物質102a、102b亦可以是修飾於矽基層140的表面上。上述將免疫誘發物質102a、102b修飾至磁性粒子100的表面的方式可包括非共價鍵結、共價鍵結、生物素-親和素作用、靜電吸附作用、疏水性吸附作用或前述之組合，但不限於其他合適的結合方式。又，在另一實施例中，免疫誘發物質102a、102b可以是藉由耦合試劑修飾於矽基層140的表面上。耦合試劑可包括，但不限於3-縮水甘油丙氧基三甲氧基矽烷((3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane)、3-縮水甘油丙氧基三乙氧基矽烷((3-Glycidyloxypropyl)triethoxysilane)、三乙氧矽烷-聚乙二醇-N-羥基琥珀醯亞胺(triethoxysilane-polyethylene-glycol-N-hydroxysuccinimide)或前述之組合。
接著，請繼續參照圖1與圖2，進行步驟S20，提供細胞溶液，且此細胞溶液中包括至少一種免疫細胞。在一實施例中，免疫細胞可包括，但不限於αβT細胞、γδT細胞、調節T細胞、NK細胞或前述之組合。在另一實施例中，免疫細胞例如是γδT細胞。
其後，仍請繼續參照圖1與圖2，進行步驟S30，將磁性粒子100與細胞溶液進行接觸，使磁性粒子100的表面上的至少一種免疫誘發物質102a、102b得以活化及擴增細胞溶液中的至少一種免疫細胞。在一實施例中，以免疫細胞是γδT細胞為例，磁性粒子100的表面上的免疫誘發物質102a、102b可為抗TCR γ/δ(anti-TCR γ/δ)抗體及4-1BBL。在一實施例中，上述接觸可包括藉由將大約相等數量的磁性粒子100與免疫細胞進行混合來達到接觸的目的。
上述免疫細胞之活細胞數量的細胞擴增倍率會隨著細胞種類、個體間差異與培養環境的不同而有所差異。以培養環境而言，操作者可依實際需求選擇所需培養的規模，舉例來說，小規模培養環境(例如6孔培養盤)的免疫細胞之活細胞數量的細胞擴增倍率可為20~120倍，例如是30~110倍、40~100倍等，但不限於此。而大規模培養環境(例如生物反應器(bioreactor))的免疫細胞之活細胞數量的細胞擴增倍率可為100~8000倍，例如是500~7000倍、800~6000倍等，但不限於此。在特定實施例中，某些免疫細胞之活細胞數量的細胞擴增倍率甚至可達到上萬倍。一般而言，免疫細胞之活細胞數量的平均擴增倍率可為20~1000倍。在一實施例中，免疫細胞之活細胞數量的平均擴增倍率可為30~900倍。在另一實施例中，免疫細胞之活細胞數量的平均擴增倍率可為40~800倍。
此外，在一實施例中，磁性粒子100可具有殘磁性，也 就是說，當外加磁場去除後，磁性粒子100的磁性不會隨著消失，仍保有磁性。如此一來，在一實施例中，將磁性粒子100散佈於細胞溶液中時，磁性粒子100可透過殘磁性而彼此排列成一排，但不限於僅單一一排，而成排的磁性粒子100會因整體表面積較大而提高與免疫細胞接觸的機率。又，在一實施例中，多排的磁性粒子100可與免疫細胞聚集成群，以利於活化及/或擴增免疫細胞。
上述磁性粒子具有多突狀表面，相似於人體中效能最強的抗原遞呈細胞(antigen presenting cell,APC)，甚至是相似於樹突狀細胞(dendritic cell,DC)。因此，在仿生的概念下，可推測此多突狀磁性粒子能以較大的表面積與免疫細胞進行接觸，進而對於活化及/或擴增免疫細胞的效能有所助益。
以下例舉特定實驗例以具體說明體外活化及/或擴增免疫細胞的方法。
實驗例1：將免疫誘發物質修飾於多突狀磁性粒子的表面
(1)多突狀磁性粒子的表面官能化
首先，提供三種本揭露的多突狀磁性粒子，其平均直徑分別2.5μm、4.5μm以及8.5μm，在電子顯微鏡(10000×)下具有如圖3A至圖3C所示的型態。並且，以平均直徑為4.5μm的多突狀磁性粒子為例，其磁滯曲線分析圖如圖4所示。一般來說，當磁場強度為0時，若磁滯曲線重合且磁化強度為0，則表示為順磁性，若磁滯曲線無法重合，則表示為鐵磁性。由圖4可知，這 些多突狀磁性粒子具有鐵磁性。
將1克的多突狀磁性粒子、100mL的去離子水、500mL的乙醇、30mL的氨水(NH4OH)及0.1mL的3-氨基丙基三乙氧基矽烷(3-Aminopropyltriethoxysilane,APTES)置入反應器中，在室溫下攪拌反應1小時。反應完成後，以磁鐵收集多突狀磁性粒子。接著，移去反應溶液並加入去離子水清洗多突狀磁性粒子，重複以去離子水清洗三次後，得到表面修飾有胺基的多突狀磁性粒子。
(2)免疫誘發物質的修飾方法
首先，以100μL的4-嗎啉乙磺醯鈉鹽(4-Morpholineethanesulfonic acid,MES)緩衝溶液(25mM，pH 5.0)將如上述之約7×107顆表面修飾有胺基的多突狀磁性粒子清洗三次。接著，取20mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC)、20mg的N-羥基琥珀醯亞胺磺酸鈉鹽(N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt,NHS)及4mg的聚丙烯酸(poly acrylic acid,PAA，15kDa)溶解於400μL的MES緩衝溶液，再與清洗後的多突狀磁性粒子混合並於室溫下反應30分鐘。反應完成後，以磁鐵收集多突狀磁性粒子。
接著，移去反應溶液並以100μL的MES緩衝溶液清洗多突狀磁性粒子三次後，加入包含有10μL抗CD3抗體(廠牌ebioscience)、60μL抗CD28抗體(廠牌ebioscience)、以及130μL MES緩衝溶液的混合溶液，並在4℃下進行隔夜反應。其後，加入200μL人血清白蛋白(human serum albumin,HSA，廠牌Sigma)溶液(10mg/mL，以MES緩衝溶液配製)，並在4℃下再次進行隔夜反應。
待反應完成後，以磁鐵收集多突狀磁性粒子。接著，移去反應溶液，以包含有0.1% HSA及2mM乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)的PBS緩衝溶液清洗多突狀磁性粒子三次，每次至少停留5分鐘，再以含0.1% HSA的PBS緩衝溶液清洗多突狀磁性粒子三次。最後，將修飾完免疫誘發物質的多突狀磁性粒子分散在1.75mL的含0.1% HSA的PBS緩衝溶液中，以得到表面修飾有免疫誘發物質的多突狀磁性粒子且濃度為4×107顆/mL。
實驗2：以修飾有免疫誘發物質的多突狀磁性粒子活化及/或擴增T細胞
(1)自血液中分離T細胞
依商品手冊建議之比例將10mL血液與0.5mL T細胞分離試劑(名稱RosetteSep Human T Cell enrichment cocktail，廠牌Stemcell)混合並反應20分鐘後，以移液管(pipette)加入並混合等體積之含有2%胎牛血清的PBS緩衝溶液，以得到細胞溶液。接著，將細胞溶液加入含有15mL T細胞分離液的梯度密度離心管中，並以轉速為1200rcf離心20分鐘。其後，將細胞上清液移至新的離心管中，再以轉速為300rcf離心10分鐘。接著，於去 除上清液後，以5mL之含有2%胎牛血清的PBS緩衝溶液回溶細胞，並加入20mL的紅血球裂解溶液(名稱RBC lysis buffer，廠牌Stemcell)於4℃反應10分鐘，再以轉速為300rcf離心8分鐘。接著，以5mL細胞培養液(含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS，廠牌BI)的RPMI1640培養液，廠牌Gibco)回溶細胞，並於轉速為300rcf離心8分鐘後進行一次細胞清洗。最後，使用細胞培養液回溶細胞，以得到高純度(諸如90-97%)的T細胞溶液。
(2)T細胞的刺激與培養
以0.2mL的細胞培養液清洗由實驗例1所得的5×105顆表面修飾有免疫誘發物質的多突狀磁性粒子三次，之後將多突狀磁性粒子分散於0.15mL細胞培養液中。接著，將上述由實驗例2之(1)所獲得的5×105顆T細胞與前述分散於培養液中且表面修飾有免疫誘發物質的多突狀磁性粒子進行混合，並以細胞培養液將總體積補至0.5mL，以獲得T細胞液。同時，以市售圓球形磁性粒子(Dynabeads®)與上述實驗例2之(1)所獲得的5×105顆T細胞混合為T細胞液以作為比較組。然後，將實驗組與比較組的T細胞液分別放置於24孔培養盤中(廠牌Corning)，並在含5%二氧化碳之37℃培養箱中進行T細胞的刺激與培養(此時稱為培養的第0天)。
然後，於培養的第2天加入0.5mL細胞培養液，並於培養的第5天使用移液管沖散T細胞與磁性粒子。之後，將T細胞與磁性粒子的混合液移至微量試管中，並將微量試管置放到磁座 上，以將磁性粒子吸引到微量試管的管壁，而將已受到免疫誘發物質刺激但不含磁性粒子的懸浮細胞液移至新的6孔培養盤中(廠牌Corning)。接著，量測上述經刺激且不含磁性粒子的懸浮細胞液的總體積及細胞濃度，並於調整此細胞液濃度為0.5~1×106顆/mL後，置放至新的培養盤中並放回含5%二氧化碳之37℃培養箱中繼續培養。
此後，於培養的第6~8天，每天重複進行以下步驟，使用移液管將T細胞分散均勻後，量測細胞液的總體積及細胞濃度，並將刺激後的T細胞液濃度調整為0.5~1×106顆/mL後，放回培養箱中繼續培養。而於培養的第9~12天，每天重複進行以下步驟，使用移液管將T細胞分散均勻後，量測細胞液的總體積及細胞濃度，並以第0天之細胞濃度作為對照基準，來計算第9~12天之T細胞的平均擴增倍率。
圖5A至5D分別顯示使用市售磁性粒子、平均直徑為2.5μm、4.5μm以及8.5μm的多突狀磁性粒子進行T細胞活化及/或擴增於不同培養天數的細胞數量，其中以市售磁性粒子作為比較組。
依據圖5A至圖5D結果顯示，在第9天時，相較於比較組的T細胞的平均擴增倍率為26.64，以平均直徑為2.5μm、4.5μm以及8.5μm的多突狀磁性粒子處理的實驗組的T細胞的平均擴增倍率分別為29.20、31.39以及29.89。此外，在第9天之後，比較組的T細胞的平均擴增倍率逐漸下降或趨於平緩，而實驗組的T 細胞的平均擴增倍率則是持續增加，其中又以4.5μm的磁性粒子(即圖5C所示)所能達到的擴增效能最為顯著，可達90以上的擴增倍率。
實驗例3：以修飾有不同比例之兩種抗體的多突狀磁性粒子活化及/或擴增T細胞
實驗例3的操作流程與實驗例2相同，主要不同處在於實驗例3是使用4.5μm的磁性粒子為測試對象，以及在免疫誘發物質的修飾比例上，是將抗CD3抗體與抗CD28抗體以1：2、1：6以及1：10比例配製為抗體混合溶液，並分別用以修飾前述的4.5μm磁性粒子。在本實驗例中，同時以市售圓球形磁性粒子(Dynabeads®)作為比較組，但無法確知此市售圓球形磁性粒子上的抗體比例。
圖6A至6D分別顯示使用市售磁性粒子(Dynabeads®)、表面修飾有抗體且抗CD3抗體與抗CD28抗體比例分別為1：2、1：6以及1：10的多突狀磁性粒子進行T細胞活化及/或擴增於不同培養天數的細胞數量。依據圖6A至圖6D可知，相較於比較組(圖6A，Dynabeads®)，實驗組之表面具有不同比例之抗體修飾的磁性粒子(圖6B，抗CD3抗體：抗CD28抗體=1：2；圖6C，抗CD3抗體：抗CD28抗體=1：6；圖6C，抗CD3抗體：抗CD28抗體=1：10)皆可以有效地活化及/或擴增T細胞。
實驗例4：經活化及/或擴增之T細胞的特性分析
以流式細胞儀(SONY SA3800)對上述本發明之多突狀 磁性粒子活化及/或擴增後之T細胞進行特性分析，並以經兩種市售商品(包含磁性粒子及修飾抗體，商品中僅揭露其修飾抗體為抗CD3抗體與抗CD28抗體，但未提供所修飾抗體的比例)活化及/或擴增後之T細胞(比較組1及比較組2)同步進行比較。其中，比較組1為以市售商品TransActTM T Cell reagent(Miltenyi Biotec)活化及/或擴增後之T細胞，而比較組2為以市售商品Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28(ThermoFisher)活化及/或擴增後之T細胞。實驗組則為表面修飾有抗體且抗CD3抗體與抗CD28抗體比例為1：6的前述多突狀磁性粒子進行T細胞活化及/或擴增後的T細胞，並以未經處理之第0天之初始細胞作為對照組。結果如圖7A至7C所示。
由圖7A至7C可知，相較於比較組1(TransActTM)與比較組2(Dynabeads®)，實驗組的T細胞(即藉由本發明之多突狀磁性粒子經修飾後所活化及/或擴增的T細胞)具有以下特性：(1)CD4+T細胞與CD8+T細胞的比例最接近1：1(圖7A)；(2)中央記憶T細胞(central memory T cell,TCM)相對於效應記憶T細胞(effector memory T cells,TEM)佔有較高的比例(圖7B)；以及(3)帶有四種免疫抑制分子(PD-1(programmed cell death-1)、CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4)、TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3)及LAG-3(lymphocyte-activation gene 3))之T細胞的總數量最少(圖7C)。
綜上所述，本揭露的磁性粒子具有多突狀表面，相似於人體中效能最強的抗原遞呈細胞，甚至是樹突狀細胞。因此，在仿生的概念下，可推測此多突狀磁性粒子能以較大的表面積與免疫細胞進行接觸，進而對於活化免疫細胞及/或擴增免疫細胞數目的效能有所助益。
此外，本揭露實施例的磁性粒子可於其表面藉由設計並修飾特定的免疫誘發物質種類，使得磁性粒子可應用於γδT細胞的活化及擴增，進而克服目前尚缺乏可應用於γδT細胞的相關產品的問題。舉例來說，在一實施例中，以全血分離後的周邊單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)為來源，使用修飾有免疫誘發物質的多突狀磁珠可提升γδT細胞的擴增倍率約1.2-3.5倍。再者，由於磁性粒子具有磁性與特定免疫誘發物質，是以具有可快速分離與誘發免疫反應的優點，如此一來，將有助免疫細胞應用於癌症免疫療法等技術的研究與發展。
雖然本揭露已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本揭露，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本揭露的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本揭露的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
S10~S30‧‧‧步驟

Claims (15)

  1. 一種體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，包括：a)提供磁性粒子，所述磁性粒子的表面為多突狀且修飾有至少一種免疫誘發物質，其中所述磁性粒子由內而外包括共聚物核心、高分子層、磁性物質層以及矽基層，其中所述共聚物核心的表面包括多個形狀不規則的突起物，所述多個突起物的平均高度為100nm~5000nm，以及所述磁性粒子的平均直徑為1μm~50μm；b)提供細胞溶液，所述細胞溶液中包括至少一種免疫細胞；以及c)將所述磁性粒子與所述細胞溶液進行接觸，使所述磁性粒子的所述表面上的所述至少一種免疫誘發物質得以活化及/或擴增所述細胞溶液中的所述至少一種免疫細胞。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述免疫細胞包括T細胞、NK細胞或前述之組合。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述免疫細胞包括調節T細胞。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述免疫細胞包括αβT細胞、γδT細胞或前述之組合。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述免疫細胞包括γδT細胞。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述至少一種免疫誘發物質包括抗CD3抗體、抗CD28抗體、抗TCR γ/δ抗體、抗CD83抗體、抗CD137抗體、4-1BBL、抗CD2抗體、抗CD335抗體或前述之組合。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述至少一種免疫誘發物質修飾至所述磁性粒子的所述表面的方式包括非共價鍵結、共價鍵結、生物素-親和素作用、靜電吸附作用、疏水性吸附作用或前述之組合。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述共聚物核心包括由單官能基單體與雙官能基單體共聚而成的共聚物。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述雙官能基單體相對於所述單官能基單體的體積百分比例為0.4%~2%。
  10. 如申請專利範圍第1項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述共聚物核心包括苯乙烯/二乙烯苯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物或甲基丙烯酸甲酯/二乙烯苯共聚物。
  11. 如申請專利範圍第1項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述高分子層包括帶有電荷的至少一官能基團。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述至少一官能基團包括羧基、胺基或前述之組合。
  13. 如申請專利範圍第1項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述磁性物質層包括順磁性材料、超順磁性材料、鐵磁性材料、鐵氧體磁性材料或前述之組合。
  14. 如申請專利範圍第1項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述磁性物質層包括鐵離子(Fe2+)、鈷離子(Co2+)、鎳離子(Ni2+)或前述之組合。
  15. 如申請專利範圍第1項所述的體外活化及/或擴增免疫細胞的方法，其中所述矽基層的厚度至少為1nm~50nm。
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Vaine CA,et al." Tuning innate immune activation by surface texturing of polymer microparticles: the role of shape in inflammasome activation." J Immunol. 2013 Apr 1;190(7):3525-3532. *

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